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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-18
(54)【発明の名称】トリペプチドを含む酵母抽出物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20240111BHJP
C12N 1/16 20060101ALN20240111BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 G
C12N1/16 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540047
(86)(22)【出願日】2021-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-06-29
(86)【国際出願番号】 KR2021019679
(87)【国際公開番号】W WO2022145868
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】10-2020-0188450
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500578515
【氏名又は名称】サムヤン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジンハ
(72)【発明者】
【氏名】クォン，スンギュ
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ウンス
(72)【発明者】
【氏名】パク，ブス
(72)【発明者】
【氏名】アン，シンヘ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CE08
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA73X
4B065AC14
4B065BD16
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、トリペプチドを含む酵母菌体を利用して、トリペプチド含有量が高く、乾燥質量含量が高い酵母エキス、およびその調製方法に関する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の水で抽出して溶媒抽出物を得る工程を含む、固形分含量を基準にして０．５～２０重量％のグルタチオンを含有する酵母抽出物の製造方法。
【請求項2】
前記溶媒抽出物を得る工程は、グルタチオンを含有する酵母の菌体を温度６０～９０℃の水で抽出して得られた１次抽出物と、前記１次抽出物から回収された菌体をタンパク質分解酵素で処理して水で抽出して得られた２次抽出物を得る工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記製造方法は、溶媒抽出物を乾燥して乾燥物を得る工程を追加的に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
前記酵母抽出物の乾燥物収率は、２０重量％～６５重量％である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項5】
前記溶媒抽出物を得る工程で、水で抽出する時間は１０分～１２０分である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項6】
前記菌体懸濁液の菌体濃度は、６００ｎｍで測定された光学密度（ＯＤ）値が５０～５００である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項7】
前記酵母は、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記タンパク質分解酵素は、エンドプロテアーゼ、またはエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼの混合酵素である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項9】
前記タンパク質分解酵素の処理量は、０．５～５μｌ／ｍｌである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項10】
グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の水を用いた溶媒抽出物を含み、固形分含量を基準にして０．５～２０重量％のグルタチオンを含む酵母抽出物。
【請求項11】
前記溶媒抽出物は、タンパク質分解酵素で処理された酵母の菌体または菌体の懸濁液を水で抽出したものである、請求項１０に記載の酵母抽出物。
【請求項12】
前記溶媒抽出物は、グルタチオンを含有する酵母の菌体を温度６０～９０℃の水を用いた１次抽出物と、前記１次抽出物から回収された菌体をタンパク質分解酵素で処理して水で抽出した２次抽出物を含む、請求項１１に記載の酵母抽出物。
【請求項13】
前記タンパク質分解酵素は、エンドプロテアーゼ、またはエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼの混合酵素である、請求項１１に記載の酵母抽出物。
【請求項14】
前記タンパク質分解酵素の処理量は、０．５～５μｌ／ｍｌである、請求項１１に記載の酵母抽出物。
【請求項15】
前記酵母は、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である、請求項１０に記載の酵母抽出物。
【請求項16】
前記酵素抽出物は、溶媒抽出物を乾燥した乾燥物である、請求項１０に記載の酵母抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トリペプチドを含有する酵母菌体を用いて、高い含量のトリペプチドおよび高い乾燥物含量を有する酵母抽出物、およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
グルタチオン（Ｌ－γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、ＧＳＨ）は、細胞内存在する生理活性物質であって、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）、およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）の３つのアミノ酸から構成されたトリペプチド形態である。体内では還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の二つの形態で存在する。グルタチオンは、動物、植物、および微生物の細胞内で０．１～１０ｍＭの濃度で存在し、細胞の総非タンパク質性活成分の９０％以上を占めている。グルタチオンの多様な機能は、農業分野だけでなく、酵素学、輸送、薬物学、治療、毒物学、内分泌学、および微生物学を含む多くの医学分野で重要である。
【0003】
グルタチオンは主に微生物を用いた発酵または酵素合成工程で生産可能であり、現在高い生産単価によって酵素合成工程はまだ商用化されていない反面、産業的に微生物を培養して菌体から抽出する方法が広く用いられている。グルタチオン生産のための微生物菌株は、細胞内に高い含量のグルタチオンを含有し食品生産に安全な微生物と認識される酵母が広く用いられており、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌株とＣａｎｄｉｄａ属菌株が代表的である。この酵母種の野生型菌株の場合、グルタチオン濃度が細胞乾燥重量の０．１－１％程度で既に非常に高く、低価の培地で高密度細胞培養および速い成長が可能であるという長所は、酵母を用いた発酵的生産が競争力を有するようにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の一例は、高い含量のトリペプチドを有するトリペプチド抽出物、例えばグルタチオン抽出物、およびその製造方法に関するものである。
【0005】
本発明の追加一例は、トリペプチドの含量を維持しながら、高い乾燥物含量を有する酵母抽出物、およびその製造方法に関するものである。
【0006】
本発明の追加一例は、高い含量のトリペプチドおよび高い乾燥物含量を有する酵母抽出物を用いた食品、食品添加剤、飲料、飲料添加剤、健康機能性食品、または薬剤を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一例は、高い含量のトリペプチドを含む酵母菌体から得られるトリペプチド抽出物、例えばグルタチオン抽出物およびその製造方法に関するものである。
【0008】
本発明の追加一例は、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を、温度６０～９０℃の水を用いて抽出して得られた溶媒抽出物を含み、グルタチオンを含有する酵母抽出物に関するものであって、好ましくは、固形分含量を基準にしてグルタチオン含量が０．５～２０重量％のグルタチオンを含有するものである。
【0009】
本発明の追加一例は、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の水を用いて抽出して得られた溶媒抽出物を得る工程を含むグルタチオンを含有する酵母抽出物の製造方法に関するものであって、好ましくは、固形分含量を基準にしてグルタチオン含量が０．５～２０重量％のグルタチオンを含有するものである。
【0010】
また他の一例で、前記溶媒抽出物は、酵母の菌体をタンパク質分解酵素で処理して水で抽出するものであってもよく、詳しくは、グルタチオンを含有する酵母の菌体を６０～９０℃の熱水で抽出して得られた１次抽出物と、前記１次抽出物から回収された酵母の菌体をタンパク質分解酵素で処理した後に、水で抽出して得られた２次抽出物を含むものであってもよい。
【0011】
本発明は、グルタチオンを含有する酵母を用いたグルタチオン抽出およびこれから製造されたグルタチオン抽出物に関するものであって、熱水抽出法を用いて高い収率で酵母抽出物を製造し、選択的に熱水抽出と共にタンパク質分解酵素処理を行ってさらに高い収率で抽出物を得ることができ、高いタンパク質含量を有する酵母抽出物を製造して、食品および健康機能性製品などの様々な応用分野に多様に活用可能である。
【0012】
酵母抽出物の場合、核酸および調味素材への適用などに関心を持って生産することによって、本発明は酵母菌体の熱処理と酵素処理の効果的抽出を通じてトリペプチド（トリペプチド（グルタチオン）含有酵母抽出物を製造する方法を提供しようとする。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、グルタチオンを含有する酵母を用いたグルタチオン抽出、およびこれから製造されたグルタチオン抽出物に関するものであって、熱水抽出法を用いて高い収率で抽出物を製造し、さらに熱水抽出と共に酵素処理を行って６０％以上の乾燥物収率で抽出物を得ることができ、食品および健康機能性製品など様々な応用分野に多様に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の一例によって９０℃の熱水を用いた抽出時、時間経過によるトリペプチド（グルタチオン）含量パターンを示す。
【図2】本発明の一例によって８０℃の熱水を用いた抽出時、時間経過によるトリペプチド（グルタチオン）含量パターンを示す。
【図3】本発明の一例によって７０℃の熱水を用いた抽出時、時間経過によるトリペプチド（グルタチオン）含量パターンを示す。
【図4】本発明の一例によって６５℃の熱水を用いた抽出時、時間経過によるトリペプチド（グルタチオン）含量パターンを示す。
【図5】本発明の一例によって６０℃の熱水を用いた抽出時、時間経過によるトリペプチド（グルタチオン）含量パターンを示す。
【図6】本発明の一例によってＰｒｏｔｅａｓｅの種類および濃度による抽出乾燥物の収率（ｗ／ｗ％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一例は、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の熱水で抽出する溶媒抽出物を含むグルタチオンを含有する酵母抽出物に関するものである。
本発明の一例は、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の熱水で抽出する溶媒抽出物を含むグルタチオンを含有する酵母抽出物に関するものである。
【0016】
本発明の追加一例は、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の熱水で抽出する溶媒抽出物を得る工程を含むグルタチオン抽出物、またはグルタチオンを含有する酵母抽出物に関するものである。
【0017】
前記酵母抽出物は、固形分含量を基準にして、グルタチオン含量が、０．５～２０重量％、１～２０重量％、１．５～２０重量％、２．０～２０重量％、２．５～２０重量％、３．０～２０重量％、３．５～２０重量％、４．０～２０重量％、４．５～２０重量％、０．５～１８重量％、１～１８重量％、１．５～１８重量％、２．０～１８重量％、２．５～１８重量％、３．０～１８重量％、３．５～１８重量％、４．０～１８重量％、０．５～１６重量％、１～１６重量％、１．５～１６重量％、２．０～１６重量％、２．５～１６重量％、３．０～１６重量％、３．５～１６重量％、４．０～１６重量％、４．５～１６重量％、０．５～１５重量％、１～１５重量％、１．５～１５重量％、２．０～１５重量％、２．５～１５重量％、３．０～１５重量％、３．５～１５重量％、４．０～１５重量％、０．５～１４重量％、１～１４重量％、１．５～１４重量％、２．０～１４重量％、２．５～１４重量％、３．０～１４重量％、３．５～１４重量％、４．０～１４重量％、または４．５～１４重量％のグルタチオンを含有することができる。本発明による酵母抽出物は、トリペプチド、例えばグルタチオン生性能を有して酵母菌体内にグルタチオンを含有する酵母を抽出原料として使用して、高い含量と収率でグルタチオンを抽出して、グルタチオン含量の高い酵母抽出物を製造することができる。
【0018】
前記酵母抽出物は、溶媒抽出物自体、または濃縮物の液状であるか、または乾燥工程を追加的に行って得られた乾燥物であってもよい。濃縮および乾燥工程は特に制限されないが、ペプチドおよびタンパク質などを含むので、低温処理が好ましく、例えば熱風乾燥または凍結乾燥などを含む。
【0019】
前記酵母抽出物を製造する抽出原料は、グルタチオンを含有する酵母であってもよく、詳しくは、酵母菌体または菌体の懸濁液であってもよい。前記酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌株（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ属菌株（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、およびＰａｃｈｉａ属菌株からなる群より選択された１種以上であってもよく、摂取可能性を考慮して食用可能な酵母を選択することが好ましく、さらに好ましくは、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓであってもよい。
【0020】
前記抽出原料として酵母菌体を懸濁液を使用する場合、菌体濃度は６００ｎｍで測定された光学密度（ＯＤ）値が５０～５００、５０～４５０、５０～４００、５０～３５０、１００～５００、１００～４５０、１００～４００、１００～３５０、１５０～５００、１５０～４５０、１５０～４００、または１５０～３５０であってもよい。または、前記菌体濃度は、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）を基準にして、４０～２００ｇ／Ｌ、または４０～１６０ｇ／Ｌであってもよい。前記菌体懸濁液は、菌体を水に懸濁して製造されたものであってもよく、具体的に、菌体培養液から菌体を回収して水に懸濁して製造されるものであってもよい。
【0021】
前記溶媒抽出物は、６０～９０℃の水を用いて抽出したものであり、エタノールを抽出溶媒として使用する場合、食品または医薬として使用される酵母抽出物は、エタノールを除去する工程が必須的であるので、産業的適用の限界があり、生産性も低いという問題点がある。本発明で水を抽出溶媒として使用して酵母抽出物を直ちに摂取可能であり、単純に乾燥することによって抽出溶媒を容易に除去することができて、産業的適用に長所を有する。
【0022】
前記酵母抽出物の抽出温度は、６０～９０℃の水を使用して調節することができ、例えば、６０～９０℃、６２～９０℃、６４～９０℃、６０～９８℃、６２～８０℃、６４～８０℃、６０～７５℃、６２～７５℃、６４～７５℃、または６５～７５℃範囲であってもよいが、これに限定されない。
【0023】
本発明の追加的な一例で、グルタチオンを含有する酵母の菌体または菌体の懸濁液を温度６０～９０℃の水を用いて抽出する溶媒抽出物を得る工程は、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）で菌体を処理して水で抽出することで得られたものであってもよい。
【0024】
具体的に、前記溶媒抽出物は、グルタチオンを含有する酵母の菌体を６０～９０℃の水で抽出して得られた１次抽出物と、前記１次抽出物から回収された菌体をタンパク質分解酵素で処理して水で抽出することで得られた２次抽出物を含むものであってもよい。さらに詳しくは、グルタチオンを含有する酵母の菌体を６０～９０℃の水で抽出して得られた１次抽出物から得られた上澄み液と、前記１次抽出物から回収された菌体をタンパク質分解酵素で処理して６０～９０℃温度の水で抽出することで得られた２次抽出物の上澄み液を混合したものであってもよい。
【0025】
前記タンパク質分解酵素は、ペプチド結合を切断する活性を有している限り特に限定されないが、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼまたはこれらの混合酵素または前記二つの活性を全て有する複合活性酵素を使用することができ、好ましくは、エンドプロテアーゼ、またはエンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼの混合酵素であってもよい。エキソプロテアーゼアミノ末端に作用するアミノ末端加水分解酵素とカルボキシ末端に作用するカルボキシ末端加水分解酵素を含み、エンドプロテアーゼは、活性中心のアミノ酸種類によって、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを全て含む。
【0026】
本発明のタンパク質加水分解酵素は、食品用材料のタンパク質を加水分解する酵素を意味する。好ましくは、タンパク質加水分解酵素は、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｐｒｏｔａｍｅｘ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、およびＦｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅからなる群より選択されたものであってもよい。Ａｌｃａｌａｓｅは、セリン類型のエンドプロテアーゼであり、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴはメタロプロテアーゼである。本発明のエンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）およびエキソペプチダーゼ（ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）複合活性酵素は、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼ活性を同時に示すペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を意味する。好ましくは、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、およびＦｕｎｇａｌｐｒｏｔｅａｓｅからなる群より選択されたものであってもよく、さらに好ましくは、Ａｌｃａｌａｓｅ、またはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅであってもよい。
【0027】
本発明で水を用いた菌体の溶媒抽出を行った後に菌株内有用成分の追加的な抽出のためにタンパク質分解酵素で処理して追加抽出を行って酵母抽出物の乾燥物の収率を高める長所がある。前記酵母抽出物の乾燥物収率は、抽出溶媒である水で溶出される水溶性成分で主にタンパク質およびペプチドを含む。本明細書で、酵母抽出物は、溶媒抽出物を含むので、酵母菌体から溶出されて水に溶解される水溶性物質、例えばタンパク質、ペプチドなどを含む。よって、本発明による酵母抽出物は、タンパク質およびペプチド含量が、固形分基準で酵母抽出物１００％を基準にして、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上を含むことができ、上限として９５重量％以下、９０重量％以下、８５重量％以下、８０重量％以下、７５重量％以下、または７０重量％以下に含むことができる。
【0028】
前記酵素処理工程で、適した酵素量は０．５～５μｌ／ｍｌであってもよいが、これに限定されない。
【0029】
本発明による酵母抽出物の製造方法において、酵母抽出物の乾燥物収率は２０重量％～６５重量％、具体的に３０～４５重量％であってもよい。
【0030】
本発明による酵母抽出物の製造方法または溶媒抽出物において、水で抽出する工程は、３分～２４０分、３分～２２０分、３分～２１０分、３分～２００分、５分～２４０分、５分～２２０分、５分～２１０分、５分～２００分、７分～２４０分、７分～２２０分、７分～２１０分、７分～２００分、９分～２４０分、９分～２２０分、９分～２１０分、９分～２００分、９分～１９０分、９分～１８０分、９分～１７０分、９分～１６０分、９分～１５０分、９分～１４０分、９分～１３０分、または９分～１２５分であってもよく、例えば１０分～１２０分であってもよい。
【0031】
本発明による酵母抽出物の製造方法または溶媒抽出物において、酵母抽出物はタンパク質およびペプチドなどを多量に含むので、水で抽出する時間と抽出温度は、好ましくは高温で抽出する場合には抽出時間を短時間と設定し、比較的低温で抽出する場合には長時間と設定して抽出収率を最大に確保することができる。例えば、８０～９０℃の水を使用して抽出する場合、比較的短時間である６０分以下と設定することができ、例えば３分～６０分、または５分～３０分で行うことができる。または、８５℃以下の温度条件、例えば６０～８５℃、６０～８０℃または６０～７５℃の抽出温度で抽出を行う場合、７分～２４０分、９分～２４０分、または１０分～２４０分などで前記温度条件を適切に選択して行うことができる。
【0032】
本発明による酵母抽出物の製造方法または溶媒抽出物において、抽出液量によって抽出時間を適切に調節して行うことができ、例えば抽出液量１０～１０００ｍｌ抽出時、約２５分内外、１０００～２０００ｍｌ抽出時、約３５分で抽出することができ、これに限定される意図ではない。
【0033】
本発明による酵母抽出物の製造方法または溶媒抽出物において、抽出過程で抽出液を攪拌または混合しながら行うことができ、例えばＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｔｉｒｒｅｒを使用して１００～１０００ｒｐｍで溶液がよく混合されるように攪拌しながら抽出を行うことができる。
【0034】
本発明は、グルタチオンを含有する酵母を用いたグルタチオン抽出およびこれから製造されたグルタチオン抽出物に関するものであって、熱水抽出法を用いて２０重量％以上、２２重量％以上、または２５重量％以上、例えば２０重量％～４５重量％の収率で抽出物を製造することができる。さらに、熱水抽出と共に酵素処理を行って、４２重量％以上、４５重量％、６０重量％以上の高収率で抽出物を得ることができ、６５％以上の高いタンパク質含量を有する酵母抽出物を製造して、食品および健康機能性製品など様々な応用分野に多様に活用可能である。
【実施例】
【0035】
下記実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明が下記実施例で限定される意図ではない。
【0036】
実施例１： グルタチオン生成微生物の準備
１－１： 菌株準備
グルタチオンを生産する微生物を探索するために、全国の伝統市場で販売するマッコリ、麹、伝統醤類などを購入して試料として使用した。試料１ｇを０．８５％のＮａＣｌ １０ｍＬに懸濁し、懸濁液１００μＬをＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５～６．８）寒天プレート（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に塗抹した後、３０℃で２日間固体培養を実施した。固体培地で育ったコロニーの中から形状と大きさがそれぞれ異なるものを選別して１５０個の単一コロニーを分離した後、ＹＰＤ ｂｒｏｔｈ（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ）を用いて、Ｔｅｓｔ ｔｕｂｅで３０℃で２４時間振とう培養して菌株培養物を得た。
前記菌株培養物に対して６００ｎｍで吸光度を測定して菌体濃度を測定し、その結果からｃｅｌｌ ＯＤ値を測定した。前記測定された吸光度（ｃｅｌｌ Ｏ．Ｄ）は１７．８であった。
１－１： 菌株準備
グルタチオンを生産する微生物を探索するために、全国の伝統市場で販売するマッコリ、麹、伝統醤類などを購入して試料として使用した。試料１ｇを０．８５％のＮａＣｌ １０ｍＬに懸濁し、懸濁液１００μＬをＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５～６．８）寒天プレート（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に塗抹した後、３０℃で２日間固体培養を実施した。固体培地で育ったコロニーの中から形状と大きさがそれぞれ異なるものを選別して１５０個の単一コロニーを分離した後、ＹＰＤ ｂｒｏｔｈ（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ）を用いて、Ｔｅｓｔ ｔｕｂｅで３０℃で２４時間振とう培養して菌株培養物を得た。
前記菌株培養物に対して６００ｎｍで吸光度を測定して菌体濃度を測定し、その結果からｃｅｌｌ ＯＤ値を測定した。前記測定された吸光度（ｃｅｌｌ Ｏ．Ｄ）は１７．８であった。
【0037】
１－２： グルタチオン含量分析
前記菌株培養液を遠心分離して上澄み液を除去し、蒸留水で１回洗浄して菌体を回収した。回収した菌体に４０～７０％エタノールを投入し、ｆｉｎｅ ｍｉｘｅｒを使用して１０～３０分間細胞内グルタチオンを抽出した。前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取って０．５Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ８．０バッファーに溶解させた１０ｍＭ ＤＴＮＢ（５，５’－Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ））と４０℃で２０分間反応して４１２ｎｍで吸光度を測定してグルタチオン含量を確認し、前記グルタチオン含量（ＧＳＨ ｍｇ／Ｌ）を測定した。グルタチオン分析に主に使用されるＤＴＮＢは、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔと知られており、チオール（ｔｈｉｏｌ）化合物を検出するために考案された試薬である。ＤＴＮＢとＧＳＨの反応で黄色の２－ｎｉｔｒｏ－５－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄとＧＳＳＧが生成され、４１２ｎｍでＯＤ値を測定することによってＧＳＨの濃度を計算することができる。前記測定されたグルタチオン含量は１１２ｍｇ／Ｌであった。
前記菌株培養液を遠心分離して上澄み液を除去し、蒸留水で１回洗浄して菌体を回収した。回収した菌体に４０～７０％エタノールを投入し、ｆｉｎｅ ｍｉｘｅｒを使用して１０～３０分間細胞内グルタチオンを抽出した。前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取って０．５Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ８．０バッファーに溶解させた１０ｍＭ ＤＴＮＢ（５，５’－Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ））と４０℃で２０分間反応して４１２ｎｍで吸光度を測定してグルタチオン含量を確認し、前記グルタチオン含量（ＧＳＨ ｍｇ／Ｌ）を測定した。グルタチオン分析に主に使用されるＤＴＮＢは、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔと知られており、チオール（ｔｈｉｏｌ）化合物を検出するために考案された試薬である。ＤＴＮＢとＧＳＨの反応で黄色の２－ｎｉｔｒｏ－５－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄとＧＳＳＧが生成され、４１２ｎｍでＯＤ値を測定することによってＧＳＨの濃度を計算することができる。前記測定されたグルタチオン含量は１１２ｍｇ／Ｌであった。
【0038】
１－３： 菌体乾燥重量（ｇ）当りグルタチオン含量測定
前記菌株培養液を遠心分離して上澄み液を除去し、蒸留水で１回洗浄して菌体を回収した。前記回収された菌体に対して吸光度を測定し、吸光度による乾燥菌体濃度を計算した。具体的に、菌体乾燥重量（ｇ）は前記培養液を遠心分離後に上澄み液を除去して菌体のみ回収し、回収した菌体を０．９％ＮａＣｌで洗浄し、蒸留水で希釈して吸光度０．１～１の間になるようにサンプルを準備した。前記希釈した菌体試料に対して６００ｎｍで吸光度を測定し、吸光度による乾燥菌体重量を計算した。前記吸光度を測定した後に、前記菌体を０．２μｍのろ過紙で減圧下でろ過した。菌体がろ過されたろ過紙は６０℃で１２時間以上乾燥し、シリカゲルが入っているデシケーターで６時間以上放置した後、重量を測定した。空のろ過紙と菌体がろ過されたろ過紙の重量差を計算して乾燥菌体量を確認した。したがって、吸光度値による乾燥菌体濃度（ｇ／Ｌ）を確認することができた。
前記吸光度測定後菌体に対して前記実施例１－２と実質的に同様な方法でグルタチオンを抽出し、前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取ってグルタチオン生成量（ｇ／Ｌ）を測定した。測定されたグルタチオン生成量を前記計算された乾燥菌体濃度（ｇ／Ｌ）で割った後に１００をかけて、乾燥菌体重量（ｇ）当りＧＳＨ％を計算した。前記菌体乾燥重量（ｇ）当りグルタチオン含量を測定して乾燥菌体重量（ｇ）当りＧＳＨ含量（％）をＧＳＨ（％）／ｇ－ｃｅｌｌで示す。前記菌株は、グルタチオン収率（生産量、ＧＳＨ（％）／ｇ－ｃｅｌｌが１．６％を有する。
前記菌株培養液を遠心分離して上澄み液を除去し、蒸留水で１回洗浄して菌体を回収した。前記回収された菌体に対して吸光度を測定し、吸光度による乾燥菌体濃度を計算した。具体的に、菌体乾燥重量（ｇ）は前記培養液を遠心分離後に上澄み液を除去して菌体のみ回収し、回収した菌体を０．９％ＮａＣｌで洗浄し、蒸留水で希釈して吸光度０．１～１の間になるようにサンプルを準備した。前記希釈した菌体試料に対して６００ｎｍで吸光度を測定し、吸光度による乾燥菌体重量を計算した。前記吸光度を測定した後に、前記菌体を０．２μｍのろ過紙で減圧下でろ過した。菌体がろ過されたろ過紙は６０℃で１２時間以上乾燥し、シリカゲルが入っているデシケーターで６時間以上放置した後、重量を測定した。空のろ過紙と菌体がろ過されたろ過紙の重量差を計算して乾燥菌体量を確認した。したがって、吸光度値による乾燥菌体濃度（ｇ／Ｌ）を確認することができた。
前記吸光度測定後菌体に対して前記実施例１－２と実質的に同様な方法でグルタチオンを抽出し、前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取ってグルタチオン生成量（ｇ／Ｌ）を測定した。測定されたグルタチオン生成量を前記計算された乾燥菌体濃度（ｇ／Ｌ）で割った後に１００をかけて、乾燥菌体重量（ｇ）当りＧＳＨ％を計算した。前記菌体乾燥重量（ｇ）当りグルタチオン含量を測定して乾燥菌体重量（ｇ）当りＧＳＨ含量（％）をＧＳＨ（％）／ｇ－ｃｅｌｌで示す。前記菌株は、グルタチオン収率（生産量、ＧＳＨ（％）／ｇ－ｃｅｌｌが１．６％を有する。
【0039】
１－４： アルコール分解酵素（ＡＤＨ）活性分析
ＡＤＨ活性は、ＡＤＨ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用して分析した。具体的に、温度３０℃、ＹＰＤ培地で２４～４８時間培養した後、ｃｅｌｌが１＊１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように回収した。蒸留水で回収したｃｅｌｌを洗浄した後、ＡＤＨ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒを使用して細胞壁を破砕した。反応液組成は、ＡＤＨ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ８２μｌ、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ８μｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ １０μｌにサンプルまたはＮＡＤＨ標準物質を濃度別に５０μｌ混合した。３７℃で３分間反応後、４５０ｎｍで実験区（Ａ０）と対照区吸光度を測定した。３７℃で３０分間追加反応後、４５０ｎｍで吸光度の変化を測定した後に単位時間当り生成されたＮＡＤＨ濃度を計算した。
したがって、前記菌株は、菌体ＯＤ値が高いながらもグルタチオン生産量が高いＳＹＣ－ＰＲ２０菌株であり、これは受託番号ＫＣＣＭ１２７７７Ｐを有するＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＳＹＣ－ＰＲ２０である。前記菌株は、グルタチオン収率１．６％、ＡＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ０．２６ｍＵ／ｍｌで優れた特性を有し、配列番号１の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する。
ＡＤＨ活性は、ＡＤＨ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用して分析した。具体的に、温度３０℃、ＹＰＤ培地で２４～４８時間培養した後、ｃｅｌｌが１＊１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように回収した。蒸留水で回収したｃｅｌｌを洗浄した後、ＡＤＨ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒを使用して細胞壁を破砕した。反応液組成は、ＡＤＨ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ８２μｌ、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ８μｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ １０μｌにサンプルまたはＮＡＤＨ標準物質を濃度別に５０μｌ混合した。３７℃で３分間反応後、４５０ｎｍで実験区（Ａ０）と対照区吸光度を測定した。３７℃で３０分間追加反応後、４５０ｎｍで吸光度の変化を測定した後に単位時間当り生成されたＮＡＤＨ濃度を計算した。
したがって、前記菌株は、菌体ＯＤ値が高いながらもグルタチオン生産量が高いＳＹＣ－ＰＲ２０菌株であり、これは受託番号ＫＣＣＭ１２７７７Ｐを有するＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＳＹＣ－ＰＲ２０である。前記菌株は、グルタチオン収率１．６％、ＡＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ０．２６ｍＵ／ｍｌで優れた特性を有し、配列番号１の１８Ｓ ｒＤＮＡ配列を有する。
【0040】
１－５： 菌体獲得
種培養液で、前記菌株培養物３ｍｌを測量して、ＹＰＤ培地５０ｍｌが入っている三角フラスコに全て接種した。前記３０℃で４８時間振盪培養し、培養液１ｍｌをサンプリングして１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記上澄み液の培地成分を除去し、同量の蒸留水で菌体を洗浄し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を獲得した。
種培養液で、前記菌株培養物３ｍｌを測量して、ＹＰＤ培地５０ｍｌが入っている三角フラスコに全て接種した。前記３０℃で４８時間振盪培養し、培養液１ｍｌをサンプリングして１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記上澄み液の培地成分を除去し、同量の蒸留水で菌体を洗浄し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を獲得した。
【0041】
実施例２：抽出温度によるグルタチオン抽出
２－１： 抽出試料
菌体内に存在するトリペプチド（グルタチオン）の回収のための方法で菌体に蒸留水を添加し懸濁して一定濃度の菌体濃度に調節し、多様な抽出温度条件で抽出を行って、トリペプチド（グルタチオン）の最適抽出条件を確認しようとした。
グルタチオン生産菌株は、実施例１で得られたＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＳＹＣ－ＰＲ２０を使用し、実施例１と同様な方法で菌体を獲得し、蒸留水に懸濁してＯＤ６００値が１００になるように合わせて菌体希釈液を製造した。前記菌体希釈液を熱水抽出のための試料として使用した。
２－１： 抽出試料
菌体内に存在するトリペプチド（グルタチオン）の回収のための方法で菌体に蒸留水を添加し懸濁して一定濃度の菌体濃度に調節し、多様な抽出温度条件で抽出を行って、トリペプチド（グルタチオン）の最適抽出条件を確認しようとした。
グルタチオン生産菌株は、実施例１で得られたＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＳＹＣ－ＰＲ２０を使用し、実施例１と同様な方法で菌体を獲得し、蒸留水に懸濁してＯＤ６００値が１００になるように合わせて菌体希釈液を製造した。前記菌体希釈液を熱水抽出のための試料として使用した。
【0042】
２－２： グルタチオン抽出
前記準備された蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００になるように合わせて菌体希釈液を抽出試料として使用して、９０℃、８０℃、７０℃、６５℃、または６０℃温度を有する５つの温度条件の熱水を用いてグルタチオン抽出を行った。
具体的に、抗温水槽を用いて抽出温度を調節し、抽出液量を１００ｍＬにして抽出を行い、前記抽出過程でＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｔｉｒｒｅｒを使用して１００～１０００ｒｐｍで溶液がよく混合されるように攪拌した。前記抽出過程で、５分または１０分間隔で試料を採取して抽出液に含まれているグルタチオン含量を、ＤＴＮＢ発色法で定量した。
前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取って０．５Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ８．０バッファーに溶解させた１０ｍＭ ＤＴＮＢ（５，５’－Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ））と４０℃で２０分間反応して４１２ｎｍで吸光度を測定してグルタチオン含量を確認し、前記グルタチオン含量（ＧＳＨ ｍｇ／Ｌ）を測定した。グルタチオン分析に主に使用されるＤＴＮＢはＥｌｌｍａｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔと知られており、チオール（ｔｈｉｏｌ）化合物を検出するために考案された試薬である。ＤＴＮＢとＧＳＨの反応で黄色の２－ｎｉｔｒｏ－５－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄとＧＳＳＧが生成され、４１２ｎｍでＯＤ値を測定することによってＧＳＨの濃度を計算することができる。ＧＳＳＧはｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅによってＧＳＨに還元されて再びＤＴＮＢと反応するｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを成すようになる。熱水温度による抽出液に含まれているグルタチオン含量分析結果を、図１～図５にそれぞれ示した。前記図１～図５に記載された熱水温度によるグルタチオン最大抽出含量と最大抽出含量に到達する時間を下記表１に記載した。
前記準備された蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００になるように合わせて菌体希釈液を抽出試料として使用して、９０℃、８０℃、７０℃、６５℃、または６０℃温度を有する５つの温度条件の熱水を用いてグルタチオン抽出を行った。
具体的に、抗温水槽を用いて抽出温度を調節し、抽出液量を１００ｍＬにして抽出を行い、前記抽出過程でＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｔｉｒｒｅｒを使用して１００～１０００ｒｐｍで溶液がよく混合されるように攪拌した。前記抽出過程で、５分または１０分間隔で試料を採取して抽出液に含まれているグルタチオン含量を、ＤＴＮＢ発色法で定量した。
前記抽出溶液を遠心分離後、上澄み液を取って０．５Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ８．０バッファーに溶解させた１０ｍＭ ＤＴＮＢ（５，５’－Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－（２－Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ））と４０℃で２０分間反応して４１２ｎｍで吸光度を測定してグルタチオン含量を確認し、前記グルタチオン含量（ＧＳＨ ｍｇ／Ｌ）を測定した。グルタチオン分析に主に使用されるＤＴＮＢはＥｌｌｍａｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔと知られており、チオール（ｔｈｉｏｌ）化合物を検出するために考案された試薬である。ＤＴＮＢとＧＳＨの反応で黄色の２－ｎｉｔｒｏ－５－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄとＧＳＳＧが生成され、４１２ｎｍでＯＤ値を測定することによってＧＳＨの濃度を計算することができる。ＧＳＳＧはｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅによってＧＳＨに還元されて再びＤＴＮＢと反応するｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを成すようになる。熱水温度による抽出液に含まれているグルタチオン含量分析結果を、図１～図５にそれぞれ示した。前記図１～図５に記載された熱水温度によるグルタチオン最大抽出含量と最大抽出含量に到達する時間を下記表１に記載した。
【0043】
【表1】
【0044】
上記表１および図１～図５の抽出結果によれば、８０℃および９０℃の抽出温度で最大ＧＳＨ含量に到達する抽出時間は約５分であり、抽出時間が経過するほどグルタチオン含量が多少減少した。したがって、高温および短時間でグルタチオンを抽出することが好ましいのを確認した。また、抽出温度が低くなるほど最大ＧＳＨ含量に到達する抽出時間は増加する傾向であり、６０℃以下の温度ではグルタチオン最大抽出含量が次第に減少した。
したがって、グルタチオン最大抽出含量と最大抽出含量に到達する時間を考慮し、産業的に適用時温度上昇による費用、高温で短時間抽出時温度調節の容易性などを考慮して、抽出温度は７０℃が好ましいことを確認した。抽出温度が７０℃である条件で、抽出時間が１０分以上経過される時点でグルタチオンの最大抽出含量を示し、２０分まではほとんど一定の抽出含量を示した。
したがって、グルタチオン最大抽出含量と最大抽出含量に到達する時間を考慮し、産業的に適用時温度上昇による費用、高温で短時間抽出時温度調節の容易性などを考慮して、抽出温度は７０℃が好ましいことを確認した。抽出温度が７０℃である条件で、抽出時間が１０分以上経過される時点でグルタチオンの最大抽出含量を示し、２０分まではほとんど一定の抽出含量を示した。
【0045】
実施例３： 菌体濃度による乾燥物収率測定
本実施例では、抽出に使用された試料の菌体濃度による酵母抽出物の乾燥物含量、乾燥物収率、およびＧＳＨ含量を測定して、最適抽出条件を確立しようとした。
具体的に、実施例２－１で製造した抽出試料の準備過程で、菌体を蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００～５００になるように合わせて、相異なる菌体濃度を有する６つの菌体希釈液を製造した（表２）。
前記準備された菌体希釈液を用いて、７０℃温度の熱水を用いて実施例２－２と実質的に同様な方法でグルタチオンを抽出し、得られた抽出液からＰＡＳＴＥを除去して粗抽出液を得て粗抽出液の体積を測定して表２に示した。前記粗抽出液を凍結乾燥して粗抽出物の乾燥粉末を製造し、前記粗抽出液１０ｍｌ ｓｐｅｅｄ ｖａｃを凍結乾燥した後、得られた乾燥粉末の重量を測定して乾燥物重量（ｇ／Ｌ）として下記表２に示した。前記乾燥物重量に回収液量をかけて粗抽出液の乾燥物の総乾燥物重量（ｇ）として表２に示した。前記得られた総乾燥物重量（ｇ）を下記数式１に代入して乾燥物収率を得て、下記表２にｗ／ｗ％で表した。下記数式１中、ＯＤは、波長６００ｎｍで測定されたＯｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙとして菌体濃度を意味する。
本実施例では、抽出に使用された試料の菌体濃度による酵母抽出物の乾燥物含量、乾燥物収率、およびＧＳＨ含量を測定して、最適抽出条件を確立しようとした。
具体的に、実施例２－１で製造した抽出試料の準備過程で、菌体を蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００～５００になるように合わせて、相異なる菌体濃度を有する６つの菌体希釈液を製造した（表２）。
前記準備された菌体希釈液を用いて、７０℃温度の熱水を用いて実施例２－２と実質的に同様な方法でグルタチオンを抽出し、得られた抽出液からＰＡＳＴＥを除去して粗抽出液を得て粗抽出液の体積を測定して表２に示した。前記粗抽出液を凍結乾燥して粗抽出物の乾燥粉末を製造し、前記粗抽出液１０ｍｌ ｓｐｅｅｄ ｖａｃを凍結乾燥した後、得られた乾燥粉末の重量を測定して乾燥物重量（ｇ／Ｌ）として下記表２に示した。前記乾燥物重量に回収液量をかけて粗抽出液の乾燥物の総乾燥物重量（ｇ）として表２に示した。前記得られた総乾燥物重量（ｇ）を下記数式１に代入して乾燥物収率を得て、下記表２にｗ／ｗ％で表した。下記数式１中、ＯＤは、波長６００ｎｍで測定されたＯｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙとして菌体濃度を意味する。
【0046】
［数式１］
乾燥物収率＝総乾燥物重量（ｇ）／（ＯＤ＊０．４）＊１００
乾燥物収率＝総乾燥物重量（ｇ）／（ＯＤ＊０．４）＊１００
【0047】
【表2】
【0048】
上記表２に示したように、ＯＤ600が５００である条件では酵母抽出物の乾燥物収率が２３．９２％（ｗ／ｗ）であり、菌体濃度ＯＤ600値が２５０である条件で酵母抽出物の乾燥物収率が最も高いのを確認することができた。よって、総乾燥物含量およびＧＳＨ含量％は、菌体濃度が高まるほど高まるので菌体濃度（ＯＤ）値が高まるほど有利であるが、但し菌体ＯＤ値が増加するほど回収液量が減少して乾燥物収率が減少するので、乾燥物収率を共に考慮して適切な菌体濃度を調節することが好ましい。よって、前記実験結果乾燥物収率とＧＳＨ含量を考慮して、ＯＤ値が５０～５００で抽出を行うことができ、好ましくは１００～４００であってもよい。
【0049】
実施例４： タンパク質分解酵素を用いたグルタチオン抽出
本実施例では、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理してグルタチオンの抽出含量を高め、酵母抽出物の乾燥収率を高めようとした。よって、熱水抽出を行う前段階で、菌体希釈液を酵素で処理して、酵素の効果を直接的に確認しようと抽出されて溶出されるＧＳＨ含量で測定指標を確認した。プロテアーゼを使用時、菌体分解が促進されて細胞内グルタチオンが急速に溶出され、溶出されたグルタチオンが時間経過によって分解されて含量が低まるようになる。したがって、時間経過および酵素量増加によるグルタチオン含量減少が大きい酵素を選定しようとした。
前記タンパク質分解酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社のＡｌｃａｌａｓｅ（商標名）とＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標名）の２種とｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（商標名）およびｐａｐａｉｎの２種を選択して総４種に対して実験を行った。Ｐｒｏｔｅａｓｅの一般的な特徴は、ｅｎｄｏ－ｔｙｐｅ（Ａｌｃａｌａｓｅ）とｅｘｏ－ｔｙｐｅ（ｐａｐａｉｎ）の二つとして作用し、二つが混合されたＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅがある。
具体的に、酵素処理および抽出のための試料は前記実施例２－１と同一方法で製造した。前記製造された菌体希釈液試料を１．５ｍｌ容量のＥ－Ｔｕｂｅに１ｍｌ反応体積で分注し、前記分注された菌体希釈液に前記４種酵素を反応体積に対比して０、１、２、５、１０、および１５μｌ／ｍｌでそれぞれ添加して、温度５０℃で１２０分間酵素反応を行いながら、３０分、６０分および１２０分で試料を採取して、実施例２－２と実質的に同様な方法でＤＴＮＢ発色法でグルタチオンの含量を分析した。４つの酵素の酵素種類および使用量（μｌ／ｍｌ）によるＧＳＨ含量（μＭ）を下記表３に示す。
本実施例では、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理してグルタチオンの抽出含量を高め、酵母抽出物の乾燥収率を高めようとした。よって、熱水抽出を行う前段階で、菌体希釈液を酵素で処理して、酵素の効果を直接的に確認しようと抽出されて溶出されるＧＳＨ含量で測定指標を確認した。プロテアーゼを使用時、菌体分解が促進されて細胞内グルタチオンが急速に溶出され、溶出されたグルタチオンが時間経過によって分解されて含量が低まるようになる。したがって、時間経過および酵素量増加によるグルタチオン含量減少が大きい酵素を選定しようとした。
前記タンパク質分解酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社のＡｌｃａｌａｓｅ（商標名）とＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標名）の２種とｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（商標名）およびｐａｐａｉｎの２種を選択して総４種に対して実験を行った。Ｐｒｏｔｅａｓｅの一般的な特徴は、ｅｎｄｏ－ｔｙｐｅ（Ａｌｃａｌａｓｅ）とｅｘｏ－ｔｙｐｅ（ｐａｐａｉｎ）の二つとして作用し、二つが混合されたＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅがある。
具体的に、酵素処理および抽出のための試料は前記実施例２－１と同一方法で製造した。前記製造された菌体希釈液試料を１．５ｍｌ容量のＥ－Ｔｕｂｅに１ｍｌ反応体積で分注し、前記分注された菌体希釈液に前記４種酵素を反応体積に対比して０、１、２、５、１０、および１５μｌ／ｍｌでそれぞれ添加して、温度５０℃で１２０分間酵素反応を行いながら、３０分、６０分および１２０分で試料を採取して、実施例２－２と実質的に同様な方法でＤＴＮＢ発色法でグルタチオンの含量を分析した。４つの酵素の酵素種類および使用量（μｌ／ｍｌ）によるＧＳＨ含量（μＭ）を下記表３に示す。
【0050】
【表3】
【0051】
タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）４種でグルタチオン含有菌体を処理する場合、ｐｒｏｔｅａｓｅ濃度変化によるＧＳＨ含量変化を確認しようとした。Ａｌｃａｌａｓｅ、およびＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅが濃度によってＧＳＨ含量変化が測定されて細胞壁に作用することを間接的に確認した。反面、ｍｕｌｔｉｆｅｃは酵素濃度による変化がなく、ｐａｐａｉｎはＧＳＨ発色法に影響を与えるため実験から除外し、ＧＳＨ含量の有意な変化がある２種（Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）を選定した。
【0052】
実施例５： タンパク質分解酵素および熱水抽出を用いたグルタチオン抽出
熱水を用いた菌体の溶媒抽出を行った後に菌株内有用成分の追加的な抽出のためにタンパク質分解酵素で処理して追加抽出を行って、酵母抽出物の乾燥物の収率を高めようとした。前記酵母抽出物の乾燥物収率は、抽出溶媒である水で溶出される水溶性成分で主にタンパク質およびペプチドを含む。
具体的に、酵素処理および抽出のための試料は、実施例２－１と同一方法で菌体を蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００になるように合わせて菌体希釈液試料１００ｍＬを製造した。前記製造された試料を３０～３５ｍｌ ｆｌａｃｏｎ ｔｕｂｅ３個にそれぞれ分注した。実施例２と実質的に同様な方法で、前記ｆｌａｃｏｎ ｔｕｂｅに分注された菌体希釈液を７０℃温度条件で熱水を用いて２５分間グルタチオンを抽出した。前記抽出液を遠心分離し上澄み液を回収して粗抽出液を製造した。
前記上澄み液を回収してから残った菌体ペースト（ｐａｓｔｅ）に蒸留水９０ｍＬを添加した後に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社のＡｌｃａｌａｓｅとＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ２種を酵素濃度１μｌ／ｍｌ（０．００１％）、５μｌ／ｍｌ（０．００５％）、および１０μｌ／ｍｌ（０．０１％）でそれぞれ処理し、温度５０℃で１２０分間酵素反応を行った。
前記酵素反応生成液に対して７０℃温度条件で熱水を用いて２５分間グルタチオンを２次抽出した。前記２次抽出液を遠心分離し、上澄み液を回収して２次粗抽出液を製造した。
前記１次粗抽出液と２次粗抽出液を混合した抽出液試料に含まれているグルタチオン含量を実施例２－２と実質的に同様な方法でＤＴＮＢ発色法で分析した。
また前記混合試料を凍結乾燥して粗抽出物の乾燥粉末を製造し、前記粗抽出液１０ｍｌ ｓｐｅｅｄ ｖａｃを凍結乾燥した後に得られた乾燥粉末の重量を測定して乾燥物重量（ｇ／Ｌ）を得て、前記乾燥物重量に回収液量をかけて粗抽出液乾燥物の総乾燥物重量（ｇ）を計算した。前記得られた総乾燥物重量（ｇ）を前記数式１に代入して乾燥物収率（ｗ／ｗ％）を得て下記表４にｗ／ｗ％で表わした。また、Ｐｒｏｔｅａｓｅ種類および濃度別抽出物の乾燥物収率を図６に示す。
熱水を用いた菌体の溶媒抽出を行った後に菌株内有用成分の追加的な抽出のためにタンパク質分解酵素で処理して追加抽出を行って、酵母抽出物の乾燥物の収率を高めようとした。前記酵母抽出物の乾燥物収率は、抽出溶媒である水で溶出される水溶性成分で主にタンパク質およびペプチドを含む。
具体的に、酵素処理および抽出のための試料は、実施例２－１と同一方法で菌体を蒸留水に懸濁してＯＤ600値が１００になるように合わせて菌体希釈液試料１００ｍＬを製造した。前記製造された試料を３０～３５ｍｌ ｆｌａｃｏｎ ｔｕｂｅ３個にそれぞれ分注した。実施例２と実質的に同様な方法で、前記ｆｌａｃｏｎ ｔｕｂｅに分注された菌体希釈液を７０℃温度条件で熱水を用いて２５分間グルタチオンを抽出した。前記抽出液を遠心分離し上澄み液を回収して粗抽出液を製造した。
前記上澄み液を回収してから残った菌体ペースト（ｐａｓｔｅ）に蒸留水９０ｍＬを添加した後に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社のＡｌｃａｌａｓｅとＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ２種を酵素濃度１μｌ／ｍｌ（０．００１％）、５μｌ／ｍｌ（０．００５％）、および１０μｌ／ｍｌ（０．０１％）でそれぞれ処理し、温度５０℃で１２０分間酵素反応を行った。
前記酵素反応生成液に対して７０℃温度条件で熱水を用いて２５分間グルタチオンを２次抽出した。前記２次抽出液を遠心分離し、上澄み液を回収して２次粗抽出液を製造した。
前記１次粗抽出液と２次粗抽出液を混合した抽出液試料に含まれているグルタチオン含量を実施例２－２と実質的に同様な方法でＤＴＮＢ発色法で分析した。
また前記混合試料を凍結乾燥して粗抽出物の乾燥粉末を製造し、前記粗抽出液１０ｍｌ ｓｐｅｅｄ ｖａｃを凍結乾燥した後に得られた乾燥粉末の重量を測定して乾燥物重量（ｇ／Ｌ）を得て、前記乾燥物重量に回収液量をかけて粗抽出液乾燥物の総乾燥物重量（ｇ）を計算した。前記得られた総乾燥物重量（ｇ）を前記数式１に代入して乾燥物収率（ｗ／ｗ％）を得て下記表４にｗ／ｗ％で表わした。また、Ｐｒｏｔｅａｓｅ種類および濃度別抽出物の乾燥物収率を図６に示す。
【0053】
【表4】
【0054】
上記表４に示したように、タンパク質分解酵素で処理して２次熱水抽出物を製造する場合、グルタチオンの含量減少なく、酵母抽出物の乾燥物を高い収率で獲得可能であるという長所があり、タンパク質分解酵素としてはＡｌｃａｌａｓｅがさらに好ましい。前記実験範囲内では処理した酵素量が増加するほど酵母抽出物の乾燥物収率も増加した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】