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特表2024-502371抗－４－１ＢＢ抗体およびＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-18
(54)【発明の名称】抗－４－１ＢＢ抗体およびＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240111BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240111BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240111BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240111BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240111BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240111BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240111BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240111BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240111BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240111BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240111BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240111BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240111BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240111BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C07K19/00
C07K16/28
C07K14/705
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12P21/02 C
A61K39/395 N
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541864
(86)(22)【出願日】2022-01-11
(85)【翻訳文提出日】2023-07-10
(86)【国際出願番号】 IB2022000009
(87)【国際公開番号】W WO2022149050
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】63/135,812
(32)【優先日】2021-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519001408
【氏名又は名称】ユーティレックス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】クォン、ビョンエス．
(72)【発明者】
【氏名】リー、ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】パク、ジンソン
(72)【発明者】
【氏名】ハン、スンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ヒョンテ
(72)【発明者】
【氏名】イム、スンウ
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヒョクジュン
(72)【発明者】
【氏名】ユ、ウンヘ
(72)【発明者】
【氏名】パク、スンミン
(72)【発明者】
【氏名】オー、ヨンジ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗－４－１ＢＢ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）抗体およびＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供する。二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞とともに、４－１ＢＢ上方調節されたＴ細胞、特に、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞と結合する、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に同時に独立して結合する。このような相互作用は、マウスモデルでＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－媒介された抑制シグナル伝達を遮断し、４－１ＢＢ－媒介された同時刺激シグナル伝達を活性化することで、抗－腫瘍エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性活性の強力な活性化を誘導する。このような二重特異的エピトープ結合タンパク質は、それぞれの成分単独に比べて遥かに強力な腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）効果を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ＶＨ）、（ＶＬ）、（Ｘ）、（ＶＨ）ｎ、（ＶＬ）ｎ、（Ｘ）ｎ、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの組み合わせを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、前記ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し、
Ｘは、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり、
Ｙは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる群より選択される１つ以上のドメインを含む重鎖不変領域または軽鎖不変領域の断片を指称し、
ｎおよびｍは、それぞれ１～５の整数である、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項2】
（ＶＨ）、（ＶＬ）、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍは、存在する場合、Ｎ－末端からＣ－末端への任意の順に示され得る、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項3】
Ａｎ－Ａ’ｎ’－Ｂ－Ｃｍ－Ｃ’ｍ’の構造を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、ここで：
Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’：ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸであり、
Ｂ：Ｙであり、
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結され、
ｎ’およびｍ’は、独立して、１～５の整数である、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項4】
Ａｎ－Ｂ－Ｃｍの構造を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、ここで：
ＡまたはＣ：ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸであり、
Ｂ：Ｙであり、
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項5】
ＣＨ１ドメインは、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ、または（Ｘ）ｎに直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーによってＣ－末端に連結され、ＣＨ２／ＣＨ３ドメインは、（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、（Ｘ）ｍに直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーによってＮ－末端に連結され、前記ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項6】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、－ＣＨ２に直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結されたＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨ、Ｘ、および／またはＶＨ－ＣＨ１を含み、独立して、ＣＨ３は、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸに直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結された、重鎖および
－直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じてＣＬに連結されたＶＬを含む軽鎖を含み、
前記ＶＨ、ＶＬ、およびＸは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項7】
（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎ－Ｙおよび／またはＹ－（Ｘ）ｍを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項8】
（Ｘ）ｍ－Ｙおよび／またはＹ－（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項9】
前記４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨを含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項10】
前記４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項11】
前記４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項12】
前記ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の配列を含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項13】
前記４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含み、前記ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の配列を含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項14】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有するか、または前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項15】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項16】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項17】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有する、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項18】
前記二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項19】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項20】
前記シグナルペプチドは、１２～４０個のアミノ酸を含むＮ－末端シグナルペプチドである、請求項１９に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項21】
前記ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、親和性成熟した、請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【請求項22】
請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項23】
請求項２２に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項24】
請求項２２に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項25】
二重特異的エピトープ結合タンパク質の生産方法であって、前記方法は、二重特異的エピトープ結合タンパク質を生産するに十分な条件下で培養培地で請求項２２に記載の細胞を培養するステップ；および細胞および／または培養培地から二重特異的エピトープ結合タンパク質を回収するステップを含む、方法。
【請求項26】
請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬学組成物。
【請求項27】
これを必要とする対象体でがんを治療する方法であって、前記方法は、有効量の請求項１に記載の二重特異的エピトープ結合タンパク質を含むか、伝達する組成物を対象体に投与するステップを含む、方法。
【請求項28】
前記対象体は、がんを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記対象体は、がんの発病する危険がある、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファローピウス管がん、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵臓がん、腎臓細胞がん腫、膠芽腫、前立腺がん、およびそれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１１日に出願された米国仮出願第６３／１３５，８１２号の優先権を主張し、その全体内容が本願に引用されて含まれる。
本出願は、２０２１年１月１１日に出願された米国仮出願第６３／１３５，８１２号の優先権を主張し、その全体内容が本願に引用されて含まれる。
【0002】
配列リストに対する参照
３７ ＣＦＲ §１．５２（ｅ）（５）によって、本明細書は、「５４０４６９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の．ｔｘｔファイルにて電子的に提出された配列リストを参照する。．ｔｘｔファイルは、２０２２年１月１０日に生成され、サイズが１２０，０９５バイトである。配列リストの全体内容が本願に引用されて含まれ、本出願の開示内容の必須な部分を形成する。
３７ ＣＦＲ §１．５２（ｅ）（５）によって、本明細書は、「５４０４６９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の．ｔｘｔファイルにて電子的に提出された配列リストを参照する。．ｔｘｔファイルは、２０２２年１月１０日に生成され、サイズが１２０，０９５バイトである。配列リストの全体内容が本願に引用されて含まれ、本出願の開示内容の必須な部分を形成する。
【0003】
本発明の技術分野
本発明は、抗－４－１ＢＢ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）抗体およびＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供する。二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞とともに、４－１ＢＢ上方調節されたＴ細胞、特に、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞と結合する、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に同時に独立して結合する。このような相互作用は、マウスモデルでＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－媒介された抑制シグナル伝達を遮断し、４－１ＢＢ－媒介された同時刺激シグナル伝達を活性化することで、抗－腫瘍エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性活性の強力な活性化を誘導する。このような二重特異的エピトープ結合タンパク質は、それぞれの成分単独に比べて遥かに強力な腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）効果を有する。
本発明は、抗－４－１ＢＢ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）抗体およびＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供する。二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞とともに、４－１ＢＢ上方調節されたＴ細胞、特に、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞と結合する、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に同時に独立して結合する。このような相互作用は、マウスモデルでＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－媒介された抑制シグナル伝達を遮断し、４－１ＢＢ－媒介された同時刺激シグナル伝達を活性化することで、抗－腫瘍エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性活性の強力な活性化を誘導する。このような二重特異的エピトープ結合タンパク質は、それぞれの成分単独に比べて遥かに強力な腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）効果を有する。
【背景技術】
【0004】
がんは、依然として世界の主要な死亡原因のうち１つである。最近の統計によれば、世界人口の１３％が、がんで死亡する。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）の推定によると、２０２０年に世界中で１，９３０万件の新たながん症例が発生して１，０００万人が、がんで死亡した。２０３０年までに、全世界的に人口増加と高齢化および喫煙、不健康な食事および身体不活動のような危険要素に対する露出によって新たながん症例が２，１７０万件であり、がんによる死亡が１，３００万人に増えるものと予想される。また、がん治療による痛みと医療費によって、がん患者とその家族の両方の生活の質を低下している。よって、増加し続いているがん危機に対処するために、医療専門家が使用できる武器庫を拡張しなければならない重要な必要性が残っている。
【0005】
４－１ＢＢは、免疫反応でＴ細胞と抗原提示細胞の表面に発現される同時刺激分子の一種であって、細胞膜タンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）受容体群の一種と知られている。４－１ＢＢの発現は、抗原－またはマイトジェン－誘導活性化後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面で速く誘導される。４－１ＢＢは、５５ｋＤａの同種二量体であり、マウスのＴ細胞株、胸腺細胞、成熟したＴ細胞のような様々な部位で発現し、ＣｏｎＡ、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ：ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、イノマイシン、抗－ＣＤ３抗体または分子などによって活性化されることと知られている。また、４－１ＢＢの一部は、細胞内部に存在してタンパク質キナーゼの一種であるｐ５６１と結合し、したがって、これは、４－１ＢＢを通じて細胞外シグナルが細胞内に伝達されるものと推論されることができる。
【0006】
予定された細胞死滅タンパク質１（ＰＤ－１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、様々ながん、例えば、悪性黒色腫、非－小細胞肺がん、および腎臓細胞がん腫の治療でがん免疫療法に対する優れた標的タンパク質である免疫チェックポイント受容体である。ＰＤ－１は、Ｔ細胞の表面上に存在する受容体であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＰＤ－１が予定された死滅リガンド１（ＰＤ－Ｌ１：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）または予定された死滅リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）に結合する場合、ＰＤ－１と関連するシグナル伝達が活性化され、Ｔ細胞増殖、インターフェロンガンマおよびインターロイキン２生成、およびＴ細胞受容体シグナル伝達が抑制され、Ｔ細胞活性化が抑制される。様々な種類のがん細胞がＰＤ－Ｌ１を発現してＴ細胞の機能を喪失させることと知られており、これは、がん細胞が免疫係の攻撃を回避する機序として作用する。
【0007】
４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド）は刺激シグナルを提供する一方、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１はＴリンパ球に抑制シグナルを提供する。４－１ＢＢに対する様々な形態の作用剤またはＰＤ－Ｌ１に対する遮断剤は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞を調節するのに強力な抗－腫瘍活性を示す。よって、４－１ＢＢの作用剤とＰＤ－Ｌ１遮断剤とを結合してシナジーまたは付加的な抗－腫瘍効果が達成されることができる。
【0008】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、治療候補物質の全サイズを考慮して、抗体とタンパク質の様々な組み合わせを試験し、最上の抗－腫瘍活性を示す二重特異的エピトープ結合タンパク質を選択することで、本発明を開発した。
【発明の概要】
【0009】
４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬは、刺激シグナルを提供する一方、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１は、Ｔリンパ球に抑制シグナルを提供する。４－１ＢＢに対する様々な形態の作用剤またはＰＤ－Ｌ１に対する遮断剤は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞を調節するのに強力な抗－腫瘍活性を示す。よって、本発明者らは、４－１ＢＢの作用剤とＰＤ－Ｌ１遮断剤とを結合してシナジーまたは付加的な抗－腫瘍効果が達成されることができると推測する。
【0010】
このような点に鑑みて、本出願の発明者らは、治療候補物質の全サイズを考慮して、抗体とタンパク質の様々な組み合わせを試験し、最上の抗－腫瘍活性を示す二重特異的エピトープ結合タンパク質を選択することで、本発明を開発した。
【0011】
本発明の目的は、優れた抗－腫瘍活性を示す二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供することである。
【0012】
このような目的を達成するために、本発明は、（ＶＨ）、（ＶＬ）、（Ｘ）、（ＶＨ）ｎ、（ＶＬ）ｎ、（Ｘ）ｎ、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの組み合わせを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供する。本発明において、ドメインは単一ポリペプチドにあってよいか、「重鎖」および「軽鎖」は別個のポリペプチドにあってよい。
【0013】
前記において、ＶＨ、ＶＬ、および／またはＸは、直接的に、あるいはＮ－末端側面またはＣ－末端側面のヒンジおよび／またはリンカーを通じてＹに連結される。
【0014】
前記において、ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域をそれぞれ指称する。
【0015】
前記において、Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片である。
【0016】
前記において、Ｙは、重鎖不変領域または軽鎖不変領域の断片を指称する。重鎖不変領域の断片は、３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片のうち１つ以上を含むことができる。軽鎖不変領域の断片は、不変領域ドメインＣＬまたはその断片を含むことができる。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む断片である。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＨ１を含む断片である。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＬドメインを含む断片である。
【0017】
前記において、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１、２、３、４、または５のすべての整数を含む、１～５の整数である。
【0018】
本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、Ｎ－末端シグナルペプチドを含むことができる。本発明において使用されてよいシグナルペプチドは、一般的に長さが１２～４０、１５～３５、または１６～３０アミノ酸であり、細胞がタンパク質を、一般的に細胞膜に転位するように促進する機能をする。本発明において使用するためのシグナルペプチドの具体的な配列は、特に制限されず、例えば、任意の公知のシグナルペプチド配列を含むことができる。適合したＮ－末端シグナルペプチドの非－制限的な例は、次の配列を有する：ＭＥＷＳＷＶＦＬＶＴＬＬＮＧＩＱＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）。あまり好ましくはないが、シグナルペプチドがＣ－末端に位置できることもまた可能である。
【0019】
本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４（Ｓ０１－Ｓ１０）である。好ましい実施形態において、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（Ｓ０３）の配列を有する。
【0020】
それらの確認された例示的な二重特異的エピトープ結合タンパク質と関連して、二重特異的結合が保存される限り、配列の変異が許容されるものと理解される。よって、本発明の配列は、少なくとも約３０～４０％の全配列同一性、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または８５％以上の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を保有する。
【0021】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ヒト化された抗体である。
【0022】
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質を発現するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞である。
【0023】
次を含む薬学組成物が本願に提供される：二重特異的エピトープ結合タンパク質、本願に記述された核酸分子のうち任意の１つ、本願に記述された組換えベクターのうち任意の１つ、または本願に記述された細胞のうち任意の１つ；および薬学的に許容される担体。
【0024】
本願に記述された薬学組成物のうち任意の１つを含むキットが本願に提供される。
【0025】
二重特異的エピトープ結合タンパク質の生産方法が本願において提供され、前記方法は、次のステップを含む：二重特異的エピトープ結合タンパク質を生成するに十分な条件下で培養培地において本願に記述された細胞のうち任意の１つを培養するステップ；および細胞および／または培養培地から二重特異的エピトープ結合タンパク質を回収するステップ。
【0026】
これを必要とする対象体の治療方法が本願において提供され、前記方法は、次のステップを含む：本願に記述された二重特異的エピトープ結合タンパク質のうち任意の１つ、本願に記述された核酸分子のうち任意の１つ、本願に記述された組換えベクターのうち任意の１つ、または本願に記述された細胞のうち任意の１つを含むか伝達する組成物を対象体に投与して、疾患または状態を治療するステップ。いくつかの実施形態において、対象体は、がんを有するか、またはがんの発病する危険がある。いくつかの実施形態において、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファローピウス管がん、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵臓がん、腎臓細胞がん腫、膠芽腫、前立腺がん、およびそれらの組み合わせを含む。
【0027】
前記目的は、本発明の特定様態を強調する。本発明の追加的な目的、様態および実施形態は、本発明の次の詳細な説明で確認される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
以下の詳細な説明とともに以下の図面を参照すると、本発明とそれに伴う多くの利点は、それがより一層理解できることによって容易に得られるだろう。
【図1】Ｔ細胞エンゲージャーおよびチェックポイント抑制剤の二重機能に対する二重特異的エピトープ結合タンパク質の作用方式を図示する。
【図2】実施例１に記述された二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１に対する設計を図示する。
【図3】非－還元および還元条件下で二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（実施例２参照）の結果を図示する。
【図4】二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１に対するサイズ－排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（実施例３参照）の結果を図示する。
【図5A】ＰＤ－Ｌ１に対するヒトＰＤ１－Ｆｃ結合に対する表面プラズモン共鳴分析の結果を図示する。
【図5B】ＰＤ－Ｌ１に対するＳＯ３結合に対する表面プラズモン共鳴分析の結果を図示する。(実施例４参照）
【図6A】実施例５において、単一抗原結合ＥＬＩＳＡに対する分析方法を図示する。
【図6B】４－１ＢＢに結合する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１の結果を図示する。
【図6C】ＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１の結果を図示する。
【図6D】二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３およびｎｕｌｌ変異体Ｓ１２（４－１ＢＢ ｎｕｌｌ）およびＳ１３（ＰＤ－Ｌ１ ｎｕｌｌ）の二重特異的抗体設計を図示する。
【図6E】４－１ＢＢに結合する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３、およびｎｕｌｌ変異体Ｓ１２およびＳ１３の結果を図示する。
【図6F】ＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３、およびｎｕｌｌ変異体Ｓ１２およびＳ１３の結果を図示する。
【図7A】実施例６の二重抗原結合ＥＬＩＳＡに対する分析方法を図示する。
【図7B】二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１に対する二重抗原結合ＥＬＩＳＡの結果を図示する。
【図7C】二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３、ｎｕｌｌ変異体Ｓ１２（４－１ＢＢ ｎｕｌｌ）およびＳ１３（ＰＤ－Ｌ１ ｎｕｌｌ）に対する二重抗原結合ＥＬＩＳＡの結果を図示する。
【図9A】（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ）はＰＤ－Ｌ１陽性細胞株を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対するＦＡＣＳ分析結果を図示する。
【図9B】（ＦａＤｕ）はＰＤ－Ｌ１陽性細胞株を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対するＦＡＣＳ分析結果を図示する。
【図9C】４－１ＢＢ陽性細胞株を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対するＦＡＣＳ分析結果を図示する。
【図9D】（ＭＣＦ－７）はＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢ陰性細胞株を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対するＦＡＣＳ分析結果を図示する。（実施例７参照）
【図10】二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１～Ｓ１１について実施例８における４－１ＢＢ生物分析結果を図示する。
【図11A】実施例９に記述された４－１ＢＢ／ＰＤ－１組合生物分析を図示する。
【図11B】抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４および２１）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ、ＭＳＤ）、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、Ｒｏｃｈｅ）、およびｅｕＰＤ－１ Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、および抗－４－１ＢＢ抗体とｅｕＰＤ－１ Ｆｃの特定組み合わせと比較して二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３に対する４－１ＢＢ／ＰＤ－１組合生物分析の結果を図示する。
【図12A】ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対するヒトＰＤ１－Ｆｃの結合を試験するＥＬＩＳＡ分析結果を図示する。
【図12B】ＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗－ＰＤ－Ｌ２抗体の結合を試験するＥＬＩＳＡ分析結果を図示する。
【図12C】ＰＤ－Ｌ２に対する二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０３、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗－ＰＤ－Ｌ２抗体の結合を試験するＥＬＩＳＡ分析結果を図示する。（実施例１０参照）
【図13】実施例１１の細胞毒性分析結果を図示する。
【図14】実施例１２のＩＦＮ－γ分析結果を図示する。
【図15A】４－１ＢＢ陽性細胞株に対する実施例１３の抗体－依存的細胞細胞毒性分析結果を図示する。
【図15B】ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株に対する実施例１３の抗体－依存的細胞細胞毒性分析結果を図示する。
【図16】実施例１４の補体－依存的細胞毒性分析結果を図示する。
【図17A】実施例１５に記述されたようにｈ４－１ＢＢノック－イン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）マウスを使用したＳ０３、Ｓ０５およびＳ０７のインビボ効能に対する分析を示す。
【図17B】腫瘍サイズと関連してｈ４－１ＢＢノック－インマウスを使用したＳ０３、Ｓ０５およびＳ０７のインビボ効能研究結果を図示する。
【図18A】実施例１６に記述されたように腫瘍サイズと関連してｈ４－１ＢＢノック－インマウスを使用したＳ０３のインビボ効能研究結果を図示する。
【図18B】血液内Ｔ細胞集団に対するｈ４－１ＢＢノック－インマウスを使用したＳ０３のインビボ効能研究結果を図示する。
【図19】実施例１７に記述されたように腫瘍サイズについてｈ４－１ＢＢおよびｈＰＤ－１二重ノック－インマウスを使用したＳ０３のインビボ効能研究結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【0029】
別に定義されない限り、本願において使用されたすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野（例えば、酵素学、生化学、細胞生物学、分子生物学および医療科学分野）の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本願で使用される命名法は、当業界によく知られており、一般的に使用される。
【0030】
本願に記述されたものと類似するか同等なすべての方法および材料は、本発明の実施または試験に使用されることができ、適合した方法および材料は本願に記述されている。本願に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全体内容が引用されて含まれる。衝突する場合、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法、および例は、例示であるだけであって、別に明示されない限り、制限しようとする意図ではない。
【0031】
本発明は、（ＶＨ）、（ＶＬ）、（Ｘ）、（ＶＨ）ｎ、（ＶＬ）ｎ、（Ｘ）ｎ、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの組み合わせを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を提供する。本発明において、ドメインは、単一ポリペプチドにあってよいか、「重鎖」および「軽鎖」は別個のポリペプチドにあってよい。
【0032】
前記において、ＶＨ、ＶＬ、および／またはＸは、直接的に、あるいはＮ－末端側面またはＣ－末端側面のヒンジおよび／またはリンカーを通じてＹに連結される。例えば、ＶＨ、ＶＬ、および／またはＸは、直接的に、あるいはヒンジまたはリンカーを通じてＣＨ２に連結され、独立して、ＣＨ３は、直接的に、あるいはヒンジまたはリンカーを通じてＶＨ、ＶＬ、および／またはＸに連結される。
【0033】
前記において、ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称する。
【0034】
前記において、Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片である。
【0035】
前記において、Ｙは、重鎖不変領域または軽鎖不変領域の断片を指称する。重鎖不変領域の断片は、３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片のうち１つ以上を含むことができる。軽鎖不変領域の断片は、不変領域ドメインＣＬを含むことができる。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む断片である。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＨ１を含む断片である。本発明の実施形態において、Ｙは、ＣＬドメインを含む断片である。
【0036】
本発明の実施形態において、Ｙは、ヒトＩｇＧ抗体から誘導される。
【0037】
３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片と関連して、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、ＩｇＧ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、ＩｇＧ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、およびＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）のそれぞれに対する重鎖不変領域は、当業界によく知られている。本発明において、３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片のうち１つ以上が使用されることができる。そのために、Ｙ（１つ以上の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片を含む）は、任意のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３４、３５または３６、あるいは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する配列から誘導されることができる。好ましい実施形態において、Ｙ（１つ以上の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片を含む）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性である配列を有するＩｇＧ１重鎖不変領域から誘導され、ここで、前記変異体は、付加、欠失、および／または置換を含む。変形された重鎖不変領域の例は、本発明において使用するための不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、およびその断片のうち１つ以上が誘導され得るＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３である。
【0038】
不変領域ＣＬ、およびその断片と関連して、免疫グロブリンカッパ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、免疫グロブリンラムダ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、および免疫グロブリンラムダ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）に対する軽鎖不変領域が当業界によく知られている。そのために、Ｙは、任意のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～３９または少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する配列から誘導されることができる。好ましい実施形態において、Ｙは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７の配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性である配列を有する免疫グロブリンカッパ軽鎖不変領域から誘導され、ここで、前記変異体は、付加、欠失、および／または置換を含む。
【0039】
前記において、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１、２、３、４、または５のすべての整数を含む、１～５の整数である。
【0040】
（ＶＨ）、（ＶＬ）、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの領域は、存在する場合、Ｎ－末端からＣ－末端の任意の順に示され得る。また、（ＶＨ）、（ＶＬ）、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの多数のコピーが存在する場合、これらは、他の領域に対して任意の順で存在することができ、類似した種類の領域に直接隣接する必要はない。
【0041】
本発明の実施形態において、二重特異的エピトープ結合タンパク質は、Ａｎ－Ａ’ｎ’－Ｂ－Ｃｍ－Ｃ’ｍ’の構造を有し、
ここで：
Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’：ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで連結される。値’ｎ’およびｍ’は、独立して、１、２、３、４、または５のすべての整数を含む１～５の整数である。
ここで：
Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’：ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで連結される。値’ｎ’およびｍ’は、独立して、１、２、３、４、または５のすべての整数を含む１～５の整数である。
【0042】
本発明の実施形態において、二重特異的エピトープ結合タンパク質は、Ａｎ－Ｂ－Ｃｍの構造を有し、
ここで：
ＡまたはＣ：ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで連結される。
ここで：
ＡまたはＣ：ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで連結される。
【0043】
本発明の実施形態において、ＣＨ１ドメインは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで（ＶＨ－ＶＬ）ｎ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ、または（Ｘ）ｎにＣ－末端に連結され、ＣＨ２／ＣＨ３ドメインは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジで（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、（Ｘ）ｍにＮ－末端に連結される。また、このような実施形態において、ＣＨ１ドメインは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジでＣＨ２／ＣＨ３ドメインに連結される。前記において、ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである。
【0044】
本発明はまた、二重特異的エピトープ結合タンパク質が別個のポリペプチド上にそれぞれ重鎖および軽鎖を有する実施形態を含む。このような実施形態において、重鎖は、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じてＣＨ２に連結されたＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨ、Ｘ、および／またはＶＨ－ＣＨ１を含み、独立して、ＣＨ３は、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じてＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸに連結される。このような実施形態において、軽鎖は、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジでＣＬに連結されたＶＬを含む。ＶＨ、ＶＬ、およびＸは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結される。このような実施形態の例として、Ｓ０９およびＳ１０（図２参照）が参照され、ここで、前記Ｓ０９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の軽鎖を有し、Ｓ１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の軽鎖を有する。
【0045】
二重特異的エピトープ結合タンパク質がｓｃＦｖ形態であることが好ましい。
【0046】
本発明の例示的な実施形態において、（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎ－Ｙおよび／またはＹ－（Ｘ）ｍを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質が提供され、
ここで：
Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり；
ＶＨ、およびＶＬ、およびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーで連結され；
ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し；
Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり；
ｎおよびｍは、それぞれ１、２、３、４、または５のすべての整数を含む、１～５の整数である。
ここで：
Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり；
ＶＨ、およびＶＬ、およびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーで連結され；
ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し；
Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり；
ｎおよびｍは、それぞれ１、２、３、４、または５のすべての整数を含む、１～５の整数である。
【0047】
このような実施形態の特定例は、Ｎ－末端からＣ－末端に記載された（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ３－（Ｘ）ｍで配列されたｓｃＦｖである。ＶＬ、ＶＨ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである。このような例の実施形態において、ＶＬおよびＶＨは、リンカーによって連結され、ＶＨおよびＣＨ２は、リンカーによって連結され、ＣＨ３および（Ｘ）ｍは、リンカーによって連結され／されるか、またはＣＨ２およびＣＨ３は、リンカーによって連結される。このような実施形態において、リンカーのうち１つ以上は、ヒンジが後に続けられるか、または後に続く。代替的に、前述した連結のうち１つ以上は、直接連結されるか、またはヒンジによって連結されることができる。
【0048】
本発明のまた他の例示的な実施形態は、（Ｘ）ｍ－Ｙおよび／またはＹ－（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であり、
ここで：
Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり；
ＶＨ、およびＶＬ、およびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し；
Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり；
ｎおよびｍは、それぞれ１、２、３、４、または５のすべての整数を含む１～５の整数である。
ここで：
Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり；
ＶＨ、およびＶＬ、およびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し；
Ｘは、変形されたまたは操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されたＰＤ－１タンパク質またはその断片を含み、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり；
ｎおよびｍは、それぞれ１、２、３、４、または５のすべての整数を含む１～５の整数である。
【0049】
この実施形態の特定例は、Ｎ－末端からＣ－末端に記載された（Ｘ）ｍ－ＣＨ２－ＣＨ３－（ＶＨ－ＶＬ）ｎで配列されたｓｃＦｖである。ＶＬ、ＶＨ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである。このような例の実施形態において、（Ｘ）ｍおよびＣＨ２は、リンカーによって連結され、ＣＨ３およびＶＨは、リンカーによって連結され、ＶＨおよびＶＬは、リンカーによって連結され／されるか、またはＣＨ２およびＣＨ３はリンカーによって連結される。このような実施形態において、リンカーのうち１つ以上は、ヒンジが後に続けられるか、またはヒンジが後に続ける。代替的に、前述した連結のうち１つ以上は、直接的であってよいか、ヒンジによるものであってよい。
【0050】
本発明の実施形態において、ｎおよびｍのそれぞれは、個別的に整数１、２、３、４、または５から選択され、このような整数値を有するｎおよびｍの任意の組み合わせが存在することができる。多数のＶＨ、ＶＬ、および／またはＸが存在する場合（すなわち、ｎおよび／またはｍは、１より大きい値である）、これは、直接的に連結されることができるか、またはコピーがヒンジおよび／またはリンカー配列によって分離されることができる。好ましい実施形態において、多重コピーは、リンカー配列によって分離される。
【0051】
本発明による（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎ－Ｙおよび／またはＹ－（Ｘ）ｍを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質は、二重特異的治療剤の第１のアーム（ａｒｍ）であり、第２のアームであって、同一の（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎ－Ｙおよび／またはＹ－（Ｘ）ｍを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質を有して対を形成する。対の第１のアームが（Ｘ）ｍ－Ｙおよび／またはＹ－（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎである場合、二重特異的エピトープ結合タンパク質の第２のアームが同一の（Ｘ）ｍ－Ｙおよび／またはＹ－（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎを含む場合も同様である。すなわち、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質を構成する生成された抗体は、対の他のアームと一つのアームで同一の配列を有さなければならない。
【0052】
ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結されることができる。システイン残基は、ヒンジおよび／またはリンカーを通じた連結のために連結部品に含まれることができる。システイン残基が二硫化結合を形成する間、ＶＨおよびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結されることができる。
【0053】
治療候補物質の全サイズと抗体とタンパク質の様々な組み合わせを考慮すると、抗４－１ＢＢ抗体断片とＰＤ－１に高親和性で結合する可溶性ＰＤ－１の組み合わせを通じて最高の抗－腫瘍活性が示された。
【0054】
本発明の実施形態において、ＶＨ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む。本発明の実施形態において、ＶＬ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５を含む。本発明の実施形態において、抗－４－１ＢＢは、抗体断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含むＶＨ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５を含むＶＬ領域を有する。
【0055】
本発明の実施形態において、抗－４－１ＢＢ抗体断片は、ｓｃＦｖ形態である。
【0056】
本発明の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の配列である。本発明の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の配列である。
【0057】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＧＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＦＫＴＡＲＡＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0058】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４：
ｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｃｇａａｇｔｇａａａａａａｃｃｔｇｇｇｇｃａａｇｔｇｔｃａａｇｃｔｇｔｃｃｔｇｔａａｇｇｃｃａｇｃｇｇｔｔａｔａｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃａｔａｔｔｇｇａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇａｇｇｃａａｇｃｃｃｃｔｇｇａｃａａｇｇｇｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｃｇｇｔｇａａａｔｔａａｔｃｃｃｇｇａａａｔｇｇｃｃａｔａｃａａａｃｔａｃａａｔｇａａａａａｔｔｃａａａａｇｔｃｇａｇｔｇａｃｃａｔｇａｃａｃｇｇｇａｃａｃａｔｃｃａｃｔｔｃｃａｃｔｇｃａｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｔｔｃｇａｇｔｃｔｇｃｇｃｔｃｃｇａｇｇａｔａｃａｇｃｔｇｔｃｔａｔｔａｃｔｇｃｇｃａｃｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｃｔｇｃｃａｇａｇｃｃｔｔｔｇｃｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｔａｇｃａｇｃ
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【0059】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＱＴＩＳＤＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＤＧＨＳＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
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【0060】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６：
ｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇａｃａｃａｇｔｃｃｃｃｔｇｃｔｔｔｃｃｔｇａｇｃｇｔｔａｃａｃｃｃｇｇｃｇａａａａｇｇｔｇａｃｔａｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｇｃｔａｇｔｃａｇａｃｃａｔｃｔｃａｇａｃｔａｃｃｔｔｃａｔｔｇｇｔａｔｃａａｃａｇａａｇｃｃａｇａｃｃａｇｇｃｔｃｃｔａａｇｔｔｇｃｔｇａｔａａａｇｔａｃｇｃｃｔｃｃｃａａｔｃｃａｔｔｔｃｃｇｇｃａｔｔｃｃｔｔｃｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｔａｃｇｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｔｔｃｔｔｔｇｇａｇｇｃｔｇａａｇａｃｇｃａｇｃｔａｃｃｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｇａｔｇｇｔｃａｃａｇｃｔｇｇｃｃａｃｃａａｃｔｔｔｃｇｇｇｃａａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａａ
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【0061】
ＰＤ－１タンパク質または断片は、ＰＤ－Ｌ１に結合する限り、親和性成熟とともに／なしに使用されることができる。よって、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、天然ＰＤ－１またはその断片であってよい。代替的に、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は変形されるか操作されることができ、親和性成熟され／されるか突然変異されることができる。分子的に進化されたＰＤ－１を得るために、先にＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の３Ｄ複合体が使用され、主要寄与ＰＤ－１アミノ酸が選択され、選択されたアミノ酸で無作為突然変異が構成され、スクリーニングのために酵母表面ディスプレイが使用された。親和性成熟したＰＤ－１をｅｕＰＤ－１と指称した。少なくとも約３０～４０％全配列同一性、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または８５％以上の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する、ＰＤ－１タンパク質またはその断片の突然変異と関連して、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合親和性を保有する。
【0062】
本発明の実施形態において、ｅｕＰＤ－１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の配列を含むことができる。前述の説明と一貫して、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に対して少なくとも約３０～４０％全配列同一性を有することができ、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または８５％以上の配列同一性を有することができ、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有することができ、ここで、前記ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合親和性を保有する。
【0063】
本発明の実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の配列である。
【0064】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７：
ＦＬＥＳＰＤＲＰＷＮＡＰＴＦＳＰＡＬＬＬＶＡＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＡＳＥＳＦＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＨＲＦＲＶＴＲＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＱＲＮＤＳＧＴＹＶＣＧＶＩＳＬＡＰＫＩＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＶＧ
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【0065】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８：
ｔｔｔｃｔｃｇａａｔｃａｃｃｇｇａｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａｔｇｃｇｃｃｃａｃａｔｔｃｔｃａｃｃａｇｃａｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｔａｇｃａｇａｇｇｇｃｇａｔａａｔｇｃｔａｃａｔｔｃａｃｇｔｇｔｔｃｃｔｔｃａｇｔａａｔｇｃａａｇｃｇａｇｔｃａｔｔｔｃａｔｇｔｇｇｔｔｔｇｇｃａｔｃｇａｇａｇｔｃａｃｃｔａｇｔｇｇｇｃａｇａｃｔｇａｔａｃａｃｔｔｇｃｃｇｃａｔｔｃｃｃｇｇａａｇａｔｃｇｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃａｇｇａｔｃａｃｃｇｇｔｔｃａｇｇｇｔａａｃｃｃｇａｃｔｇｃｃｇａａｔｇｇｇｃｇｃｇａｔｔｔｃｃａｔａｔｇａｇｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇｇｃｇｃａａｃｇｇａａｃｇａｔａｇｔｇｇａａｃａｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇｔａａｔａｔｃｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃａａａａｔａｃａａａｔａａａｇｇａｇｔｃｔｃｔｇａｇａｇｃａｇａｇｃｔｇａｇａｇｔｇａｃａｇａａｃｇａｃｇｇｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｃａｃｇｇｃｔｃａｔｃｃｇｔｃａｃｃａａｇｔｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃａｇｇｃｃａａｔｔｔｃａａａｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔａｇｇｃ
ｔｔｔｃｔｃｇａａｔｃａｃｃｇｇａｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａｔｇｃｇｃｃｃａｃａｔｔｃｔｃａｃｃａｇｃａｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｔａｇｃａｇａｇｇｇｃｇａｔａａｔｇｃｔａｃａｔｔｃａｃｇｔｇｔｔｃｃｔｔｃａｇｔａａｔｇｃａａｇｃｇａｇｔｃａｔｔｔｃａｔｇｔｇｇｔｔｔｇｇｃａｔｃｇａｇａｇｔｃａｃｃｔａｇｔｇｇｇｃａｇａｃｔｇａｔａｃａｃｔｔｇｃｃｇｃａｔｔｃｃｃｇｇａａｇａｔｃｇｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃａｇｇａｔｃａｃｃｇｇｔｔｃａｇｇｇｔａａｃｃｃｇａｃｔｇｃｃｇａａｔｇｇｇｃｇｃｇａｔｔｔｃｃａｔａｔｇａｇｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇｇｃｇｃａａｃｇｇａａｃｇａｔａｇｔｇｇａａｃａｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇｔａａｔａｔｃｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃａａａａｔａｃａａａｔａａａｇｇａｇｔｃｔｃｔｇａｇａｇｃａｇａｇｃｔｇａｇａｇｔｇａｃａｇａａｃｇａｃｇｇｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｃａｃｇｇｃｔｃａｔｃｃｇｔｃａｃｃａａｇｔｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃａｇｇｃｃａａｔｔｔｃａａａｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔａｇｇｃ
【0066】
本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、シグナルペプチド、例えば、Ｎ－末端シグナルペプチドを含むことができる。本発明において使用され得るシグナルペプチドは、一般的に長さが１２～４０、１５～３５、または１６～３０アミノ酸であり、細胞にしてタンパク質を、一般的に細胞膜に転位するように促進する機能をする。本発明において我らのためのシグナルペプチドの具体的な配列は特に制限されず、例えば、任意の知られたシグナルペプチド配列を含むことができる。適合したＮ－末端シグナルペプチドの非－制限的な例は、次の配列を有する：ＭＥＷＳＷＶＦＬＶＴＬＬＮＧＩＱＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）。あまり好ましくはないが、シグナルペプチドがＣ－末端に位置し得ることもまた可能である。
【0067】
本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４（Ｓ０１～Ｓ１０）である。好ましい実施形態において、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列（Ｓ０３）を有する。
【0068】
このような確認された例示的な二重特異的エピトープ結合タンパク質と関連して、二重特異的結合が保存される限り、配列の変異が許容されるものと理解される。よって、４－１ＢＢとＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を保有する本発明の配列は、少なくとも約３０～４０％の全配列同一性、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または８５％以上の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。
【0069】
細胞結合および二重抗原分析を通じて、Ｓ０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が２つの標的に同時に独立して結合することを確認した。
【0070】
４－１ＢＢ生物分析の結果、生物学的に関連したＭＯＡ－基盤分析は、Ｓ０３による強力なＰＤ－Ｌ１－依存性Ｔ細胞活性化を示した。
【0071】
４－１ＢＢノック－インマウスモデルでヒトＰＤ－Ｌ１－発現腫瘍細胞に対して試験したとき、Ｓ０３は、各成分単独およびＳ０５またはＳ０７のような他の候補に比べて遥かに強力な腫瘍溶解効果を示した。
【0072】
また、Ｓ０３が注入される場合、末梢血液でＴ細胞、特に、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が増加して、その結果、腫瘍のサイズが減少した。Ｓ０３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を促進して２つの異なる標的である４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に同時に結合することで腫瘍部位でその場でＴ細胞を活性化する有望な抗－腫瘍剤である。
【0073】
その結果、Ｓ０３は、抗－４－１ＢＢ抗体およびｅｕＰＤ－１を含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であり、次の特性を示す：
１．Ｆｃ操作を通じた減少したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性；
２．天然ＰＤ－１より強力な結合親和性；
３．インビトロ前臨床研究でＰＤ－Ｌ１－良性腫瘍－指示的Ｔ－細胞反応を選択的に活性化して強化する。
４．対照群抗体に比べて腫瘍除去にさらによい効果。
１．Ｆｃ操作を通じた減少したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性；
２．天然ＰＤ－１より強力な結合親和性；
３．インビトロ前臨床研究でＰＤ－Ｌ１－良性腫瘍－指示的Ｔ－細胞反応を選択的に活性化して強化する。
４．対照群抗体に比べて腫瘍除去にさらによい効果。
【0074】
「二重特異的（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二重特異的（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、標的に特異的に結合して２つの異なる標的の活性を調節することができる結合タンパク質の特性であり、製造は、抗体または各標的に特異的に結合するタンパク質によって遂行されるか、またはその断片、およびこれに結合する各抗原に対して１価である２つの別個の抗原－結合がん（がん：２つの標的に対する特異性）を保有する。特に、本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質は、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１の特異的結合または４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する特異的親和性を有することに関する。
【0075】
本願で使用されたように、用語「抗体」は、４－１ＢＢに特異的に結合する抗－４－１ＢＢ抗体を指称する。本発明の範疇は、４－１ＢＢに特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、抗体分子の抗原－結合断片もまた含む。
【0076】
用語「ＰＤ－１タンパク質」は、ＰＤ－１タンパク質またはＰＤ－Ｌ１に結合する断片を含む。本発明の範疇は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する完全な組換えタンパク質形態だけでなく、組換えタンパク質分子のＰＤ－１－結合断片もまた含む。また、前記言及したように、ＰＤ－１タンパク質または断片は、これがＰＤ－Ｌ１に結合する限り、親和性成熟とともに／親和性成熟なしに使用されることができる。よって、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、天然ＰＤ－１またはその断片であってよい。代替的に、ＰＤ－１タンパク質またはその断片は、前記説明と一致するように変形または操作された、親和性成熟した、および／または突然変異されることができる。
【0077】
完全な抗体は、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖を有する構造を有し、それぞれの軽鎖は、二硫化結合によって重鎖に連結される。
【0078】
本願で使用されたように、用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与する十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、および３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全長重鎖、およびその断片を指称する。また、本願で使用されたように、用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与する十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖、およびその断片を指称する。
【0079】
全体（ｗｈｏｌｅ）抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧの下位類型または変異体を含み、特に、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびエプシロン（ε）類型および下位部類ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）類型を含む。
【0080】
抗体の抗原－結合断片または抗体断片は、抗原－結合機能を有する断片を指称し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどを含む。抗体断片のうちから、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域および重鎖の第１の不変領域（ＣＨ１）を有する構造を有し、１つの抗原－結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ－領域を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’のヒンジ領域におけるシステイン残基が二硫化結合を形成するとき形成される。
【0081】
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片に相当する。二重－鎖Ｆｖ（２－鎖Ｆｖ）においては、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が非－共有結合で連結されており、単一－鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）においては、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がペプチドリンカーを通じて共有結合で連結されるか、またはＣ－末端から直接的に連結されて二重鎖Ｆｖのような二量体と同じ構造を形成する。このような抗体断片は、タンパク質分解酵素によって製造されることができるか（例えば、パパインで完全な抗体を制限分解してＦａｂを生成し、ペプシンで分解すればＦ（ａｂ’）２を生成する）、遺伝子組換え技術によって製造されることができる。
【0082】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識および結合部位を含む抗体断片である。このような領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが連結された二量体である。
【0083】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および不変ドメインおよび重鎖の可変および第１の不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般的にＦａｂ’断片のＣ－末端に存在するヒンジ領域でシステインによって共有連結された一対のＦａｂ’断片を含む。
【0084】
「単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖で構成された作製物である。ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成するようにするポリペプチドリンカーは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に追加で含まれることができる。
【0085】
本発明において、「ヒンジ」は特に制限されず、当業界によく知られている。ヒンジは、二硫化結合によってこれら２つの鎖を連結する、ＩｇＧおよびＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖中央部分にある柔軟なアミノ酸ストレッチを指称する。これは、システインとプロリンアミノ酸が豊かで、アミノ酸配列が非常に多様であり、任意の他の免疫グロブリン領域と類似していない。ヒンジ領域は長さが多様であってよく、一般的に１０～５０個のアミノ酸残基範囲である。文献［Ａｄｌｅｒｓｂｅｒｇ ＪＢ、Ｒｉｃ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ．Ｊｕｌ－Ｓｅｐ １９７６；６（３）：１９１－２０５］のレビューを参照する。例として、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）のヒンジ配列に対する言及が行われる。
【0086】
ヒンジがリンカー配列を後に続けるようにすることが、本発明において特に有利である。リンカー配列の前にヒンジが来てもよい。
【0087】
本発明の抗体は、モノクロナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化された抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ断片ｓ、Ｆ（ａｂ’）２断片、二硫化－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）および抗－イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）（抗－Ｉｄ）抗体、または抗体のエピトープ－結合断片、などを含むが、これに制限されない。
【0088】
重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはエプシロン（ε）のうち任意の１つのイソ型より選択されることができる。例えば、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ類型であってよい。
【0089】
モノクロナル抗体は、抗体の実質的に均質な集団から修得された抗体を指称する。すなわち、これは、抗体のうち少量で存在することができる天然的な突然変異を除いては同一のものを意味する。モノクロナル抗体は特異性が高いため、単一抗原部位に対して誘導される。一般的に異なる結晶基（エピトープ）に対して異なる抗体を含む既存の（ポリクロナル）抗体とは異なり、各モノクロナル抗体は、抗原の単一結晶基に対して指示される。
【0090】
用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合することができるタンパク質結晶基を指称する。エピトープは、一般的にアミノ酸または糖側鎖のような化学的活性表面分子群で構成され、一般的に特定三次元構造的特性と特定電荷特性を有している。
【0091】
「ヒト化された」形態の非－ヒト（例えば、マウス）抗体は、非－ヒト免疫グロブリンに由来した最小配列を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化された抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が所望の特異性、親和性および能力を保持するマウス、レット、ウサギ、または非－ヒト霊長類のような非－ヒト種の超可変領域（供与者抗体）の残基に代替されたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。
【0092】
用語「ヒト抗体」は、相補性決定領域および構造的領域を含んで抗体を構成する全アミノ酸配列がヒト免疫グロブリンで構成された、ヒト免疫グロブリンに由来した分子を指称する。
【0093】
キメラ抗体（免疫グロブリン）および所望の生物学的活性を示す抗体の断片である、化学抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するか、または特定抗体部類または下位部類に属する抗体の相応する配列と同一または相同である一方、残りの鎖は、他の種に由来するか他の抗体部類または下位部類に属する抗体の相応する配列と同一または相同である。
【0094】
本願で使用された抗体の「可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指称する。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指称する。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指称する。
【0095】
用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原結合に必要な実体である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指称する。それぞれの可変ドメインは、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と確認された３つのＣＤＲ領域を有する。
【0096】
「フレームワーク領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的に４個のＦＲを有する：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４。
【0097】
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む単一ポリペプチド鎖からなる作製物である抗体断片である。これは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することができるようにＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【0098】
本発明の特に好ましい実施形態において、二重特異的エピトープ結合タンパク質は、単一ポリペプチドである。
【0099】
リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、引用されたようにそれぞれの整数値を含んで約１０～２５ａａ、約１０～２０ａａ、または約１２～１９ａａの長さを有してよい。例えば、グリシンおよび／またはセリンのような親水性アミノ酸が含まれてよいが、これに制限されるものではない。
【0100】
特に、リンカーは、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎおよびｍはそれぞれ１～１０である、すなわち、ｎおよびｍは、独立して任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってよい）を含むことができるが、リンカーは、例えば（ＧｎＳ）ｍ（ｎおよびｍはそれぞれ１～１０である、すなわち、ｎおよびｍは、独立して任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってよい）と言える。特定参照が（Ｇ４Ｓ）３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）リンカーに対して与えられる。リンカーはまた２１８リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）または２１８Ｓリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の１つ以上のコピーであってよい。もちろん、本発明において、また前述したリンカーの組み合わせが考慮される。
【0101】
実施形態において、本発明は、二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする核酸に関する。二重特異的エピトープ結合タンパク質は、核酸を単離して組換えで生産されることができる。すなわち、二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする核酸、二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、および核酸および／またはベクターを含む細胞が本発明に含まれる。
【0102】
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含むものと解析され、核酸の基本構成単位であるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけでなく糖または塩基部位が変形された類似体も含むものと解析される。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、変形されることができる。このような変形は、ヌクレオチドの付加、欠失または非－保存的または保存的置換を含む。
【0103】
ＤＮＡは、既存の分子生物学的技術を使用して容易に単離されるか、合成されることができ、核酸は、単離されて複製可能なベクターに挿入されて追加クローニング（ＤＮＡ増幅）または追加発現が可能である。これに基づいて、本発明は、他の様態の核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
【0104】
本願で使用されたように、用語「ベクター」は、宿主細胞で標的遺伝子を発現させる手段として、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ－関連ウイルスベクターなどを含む。ベクターの成分は、一般的に非制限的にシグナル配列、複製基点、１つ以上の抗生剤耐性マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列のうち１つ以上を含む。二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする核酸は、プロモーター、転写終結配列などと作動可能に連結される。
【0105】
用語「作動可能に連結された」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列または転写モジュレーター結合部位のアレイ）とまた他の核酸配列との間の機能的連結を指称し、これで調節配列はまた他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節する。
【0106】
原核細胞が宿主である場合、これは、一般的に転写を伝播できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結配列を含む。また、例えば、真核細胞が宿主として使用される場合、哺乳類細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、巨大細胞ウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ：ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）のプロモーター）が使用されることができ、一般的に転写終結配列としてポリアデニル化配列が含まれる。
【0107】
状況によって、ベクターは、これから発現された二重特異的エピトープ結合タンパク質の精製を容易にするために他の配列と融合されることができる。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国素材）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、米国素材）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、米国素材）、６ｘ Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｉａｇｅｎ、米国素材）などを含む。
【0108】
ベクターは、選択マーカーとして当業界で一般的に使用される抗生剤耐性遺伝子を含む。例えば、これらは、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに耐性がある遺伝子である。
【0109】
また他の様態で、本発明は、組換え発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞に関する。本発明の二重特異的エピトープ結合タンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、非制限的に原核細胞、酵母または高等真核細胞であってよい。
【0110】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞が使用されることができる。
【0111】
しかし、動物細胞が最も関心があり、有用な宿主細胞株の例は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＦａＤｕ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＣ３８、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、またはＨＴ１０８０であってよいが、これに制限されない。
【0112】
また他の様態で、本発明は、次のステップを含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質の製造方法に関する：宿主細胞を培養して二重特異的エピトープ結合タンパク質を生成するステップ；および生成された二重特異的エピトープ結合タンパク質を単離および精製するステップ。
【0113】
宿主細胞は、様々な培地で培養されることができる。培養培地として市販される培地が制限なく使用されることができる。当業者に公知の他のすべての必須補充剤は、適切な濃度で含まれることができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に既に使用され、当業者にとって自明であるはずである。
【0114】
二重特異的エピトープ結合タンパク質の回収のために、遠心分離または限外濾過を通じて不純物が除去されることができ、結果物は、親和性クロマトグラフィーと同じ方法を使用して精製されることができる。アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのような他の追加的な精製技術が使用されることができる。
【0115】
また他の様態において、本発明は、二重特異的エピトープ結合タンパク質を含む、腫瘍またはがんの予防または治療のための組成物に関する。
【0116】
用語「予防」は、画期的な症例の絶対的な除去を要求しない。よって、用語「予防」は、本発明による組成物の投与によって疾病の臨床症状を抑制するか、または進行を遅延させる任意の作用を指称し、用語「治療」は、疾病の臨床症状の発達を抑制するか、または臨床症状の緩和または除去を指称する。
【0117】
本発明の組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、剤形で通常的に使用され、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを含むが、これに制限されない。本発明の組成物は、前記成分の外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【0118】
本発明の薬学組成物は、経口でまたは非経口で投与されることができ、非経口投与の場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉内注入、腹腔内注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸投与を通じて投与されることができる。
【0119】
タンパク質またはペプチドは、経口投与時に消化されるため、経口組成物は活性剤をコートするか、または胃で分解から保護するように剤形化されなければならない。また、薬学組成物は、活性物質を標的細胞に輸送できる任意の装置によって投与されることができる。
【0120】
本発明による組成物の適切な投与量は、剤形化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄率および反応敏感度のような因子によって変わる。熟練した医師は、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。例えば、本発明の薬学組成物の一日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇであり、ここで、前記「ｋｇ」は、対象体の体重を指称する。一日投与量の下限は、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３５、３７．５、および４０ｍｇ／ｋｇであってよい。一日投与量の上限は、１００、９７．５、９５、９２．５、９０、８７．５、８５、８２．５、８０、７７．５、７５、７２．５、７０、６７．５、６５、６２．５、６０、５７．５、５５、５２．５、５０、４７．５、４５、４２．５、および４０ｍｇ／ｋｇであってよい。また前述したことより選択される下限および上限によって限定された任意の範囲、および下限として言及された値が上限で作用できる範囲（例えば、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲が本発明によって含まれる）および上限として言及された値が下限として作用することができる範囲（例えば、４５～７５ｍｇ／ｋｇの範囲が本発明によって含まれる）が本発明によって含まれる。本願で使用されたように、用語「薬学的に有効な用量」は、がんを予防または治療するに十分な用量を指称する。
【0121】
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を使用して剤形化して単位用量で製造されることができるか、または本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって多回－容量容器に内在化して製造されることができる。この場合、剤形はオイルまたは水性媒質、懸濁液またはエマルジョン中の溶液の形態であってよいか、抽出物、粉末、坐剤、顆粒、錠剤またはカプセル剤の形態であってよい。分散剤または安定化剤が追加で含まれることができる。
【0122】
いくつかの実施形態において、二重特異的エピトープ結合タンパク質、単一－鎖キメラポリペプチド、または本願に記述された核酸作製物がこれを必要とする対象体を治療するのに使用されることができる。
【0123】
いくつかの実施形態において、二重特異的エピトープ結合タンパク質、単一－鎖キメラポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学組成物は、疾患または病態で診断された対象体に投与されることができる。
【0124】
いくつかの実施形態において、対象体は、がんを有するか、またはがんの発病する危険がある。
【0125】
いくつかの実施形態において、薬学組成物は、イオン化放射線、化学療法剤、治療抗体およびチェックポイント抑制剤を含むが、これに制限されない１つ以上の追加の抗－腫瘍療法とともに投与されることができる。
【0126】
がんは、身体の非正常的な細胞が統制されない成長を特徴とする広範囲な疾患群を指称することができる。調節されない細胞分裂と成長は周辺組織を侵す悪性腫瘍の形成を招き、リンパ係や血流を介し身体の離れた部位に転移することもある。がんまたはがん組織は腫瘍を含み得る。
【0127】
この開示内容の方法による治療に適合したがんは、非制限的に膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファローピウス管がん、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵臓がん、および前立腺がんを含むことができる。いくつかの実施形態において、この開示内容の方法による治療のためのがんは、非制限的にがん腫、リンパ種（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むことができる。いくつかの実施形態において、がんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非－小細胞肺がん、肺線がん腫、肺の扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん腫、胃がん、膵臓がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝細胞がん腫、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん腫、唾液がん腫、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓がん、白血病およびその他のリンパ増殖性障害、および様々な類型の頭頸部がんを含むことができる。
【0128】
本願に記述された任意の二重特異的エピトープ結合タンパク質、単一－鎖キメラポリペプチド、任意の細胞、または任意の核酸のうち少なくとも１つを含む組成物（例えば、薬学組成物）がまた本願に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、本願に記述された任意の二重特異的エピトープ結合タンパク質単一－鎖キメラポリペプチドのうち少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、任意の免疫細胞（例えば、本願に記述された任意の免疫細胞、例えば、本願に記述された任意の方法を使用して生産された任意の免疫細胞）を含む。
【0129】
いくつかの実施形態において、薬学組成物は、異なる投与経路（例えば、静脈内、皮下）用で剤形化される。いくつかの実施形態において、薬学組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸塩緩衝された塩水）を含むことができる。
【0130】
薬学組成物の単一または多重投与は、例えば、対象によって要求されて許容される投与量および頻度によってこれを必要とする対象体に提供されることができる。剤形は、状態、疾患、または症状を効果的に治療、予防、または改善するに十分な量の活性剤を提供しなければならない。
【0131】
本願に記述された任意の二重特異的エピトープ結合タンパク質、単一－鎖キメラポリペプチド、組成物、核酸、または細胞（例えば、免疫細胞）を含むキットがまた本願で提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本願に記述された任意の方法を遂行するための指針を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、任意の本願に記述された薬学組成物の少なくとも１つの用量を含むことができる。
【0132】
定義：
約：用語「約」は、本願で値に関して使用されるとき、言及された値と関連して類似する値を指称する。一般的に、文脈に精通する当業者であれば、その文脈において「約」によって含まれる適切な程度の変動の程度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、用語「薬」は、言及された値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはその以下以内である値の範囲を含むことができる。
約：用語「約」は、本願で値に関して使用されるとき、言及された値と関連して類似する値を指称する。一般的に、文脈に精通する当業者であれば、その文脈において「約」によって含まれる適切な程度の変動の程度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、用語「薬」は、言及された値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはその以下以内である値の範囲を含むことができる。
【0133】
投与：本願で使用されたように、用語「投与」は、典型的に組成物や組成物に含まれた製剤の伝達を達成するために対象体またはシステムに組成物を投与することを指称する。当業者は、適切な状況で対象体、例えば、ヒトに投与するために使用されることができる様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、投与は、経眼、経口、非経口、局所などであってよい。いくつかの特定の実施形態において、投与は、気管支（例えば、気管支点滴による）、頬側、経皮（例えば、真皮、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、経皮などの１つ以上の局所部位であってよいか、これを含むことができる）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内 、髄腔内、静脈内、脳室内、特定の臓器内（例えば、肝内）、粘膜、鼻腔、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内点滴によって）、膣、硝子体などであってよい。いくつかの実施形態において、投与は、単一用量のみを含むことができる。いくつかの実施形態において、投与は、固定された数の用量の適用を伴い得る。いくつかの実施形態において、投与は、断続的（例えば、時間で隔てられた複数の用量）および／または定期的（例えば、共通の時間期間で隔てられた個々の用量）投与である投与を含むことができる。いくつかの実施形態において、投与は、少なくとも選択された時間期間の間の持続的投与（例えば、灌流）を含むことができる。
【0134】
親和性：当業界で知られているように「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーと結合する強さの尺度である。親和性は、様々の方法で測定することができる。いくつかの実施形態において、親和性は定量的アッセイによって測定される。このようないくつかの実施形態において、結合パートナー濃度は、生理学的条件を模倣するためにリガンド濃度を超過して固定され得る。代替的または追加的に、いくつかの実施形態において、結合パートナー濃度および／またはリガンド濃度が変わることがある。このようないくつかの実施形態において、親和性は、比較可能な条件（例えば、濃度）で基準と比較されることができる。
【0135】
抗体製剤：本願で使用されたように、用語「抗体製剤」は、特定の抗原に特異的に結合する製剤を指称する。いくつかの実施形態において、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を含む。例示的な抗体製剤は、モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体、およびその断片を含むが、これに制限されない。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、当業界に公知のようにヒト化、霊長類化、キメラなどの１つ以上の配列要素を含むことができる。多くの実施形態において、用語「抗体製剤」は、代替的提示における抗体の構造的および機能的特徴を利用するための、当業界に公知または開発された作製物または形式のうち１つ以上を指称するために使用される。例えば、実施形態において、本発明に従って使用される抗体製剤は、非制限的に完全なＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重－または多重－特異的抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、など）；抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそのセット、単一鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合；単一ドメイン抗体（例えば、サメ単 一ドメイン抗体、例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片）；カメロイド抗体；遮蔽抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；小型モジュール型免疫薬剤（「ＳＭＩＰｓＴＭ」：Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；単一鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ－類似抗体；、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；マイクロタンパク質；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）より選択される形式である。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、天然に生成される場合に有する共有変形（例えば、グリカンの付着）を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、共有変形（例えば、グリカンの付着、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など］、またはその他のペンダント基［例えば、ポリ－エチレングリコールなど］を含むことができる。多くの実施形態において、抗体製剤は、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１つ以上の構造的要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む；いくつかの実施形態において抗体製剤は、アミノ酸配列が参照抗体において見出されるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して、配列が同一であるか、または１～５個のアミノ酸置換を含むという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％ ８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、付加または置換されるが、含まれるＣＤＲが参照ＣＤＲとは異なり、同一のアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して含まれるＣＤＲの１～５個のアミノ酸が欠失、付加、または置換されるが、含まれるＣＤＲが参照ＣＤＲとは異なり、同一のアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して置換されるが、含まれるＣＤＲが参照ＣＤＲとは異なり、同一のアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１～５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加、または置換されるが、含まれるＣＤＲが参照ＣＤＲとは異なり、同一のアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造的要素を含むポリペプチドであるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、免疫グロブリン－結合ドメインと相同であるまたは大部分が相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの実施形態において、抗体製剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の少なくとも一部であるか、またはこれを含む。
【0136】
抗原：本願で使用されたように、用語「抗原」は、抗体製剤に結合する製剤を指称する。いくつかの実施形態において、抗原は抗体製剤に結合し、有機体における特定の生理学的反応を誘導してもよく、または誘導しなくてもよい。一般的に、抗原は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ポリマー（生物学的ポリマー［例えば、核酸および／またはアミノ酸ポリマー］および生物学的ポリマー以外のポリマー［例えば、核酸またはアミノ酸ポリマー以外のポリマー］）などのような任意の化学的実体であってよいか、またはそれらを含むことができる。いくつかの実施形態において、抗原は、ポリペプチドであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、グリカンであるか、またはそれらを含む。当業者は、一般的に、抗原が、単離または純粋な形態で提供されてもよく、または代替的に、粗形態で提供されてもよいことを理解するであろう（例えば、他の物質とともに、例えば、細胞抽出物のような抽出物でまたは抗原－含有供給源の他の相対的に粗い調製で）。いくつかの特定の実施形態において、抗原は、細胞の状況で存在する（例えば、抗原は、細胞の表面上で発現されるか、または細胞で発現される）。いくつかの実施形態において、抗原は、組換え抗原である。
【0137】
抗原結合ドメイン：本願に使用されたように、標的部分または実体に特異的に結合する抗体製剤またはその一部を指称する。典型的に、抗原結合ドメインとその標的との間の相互作用は、非－共有的である。いくつかの実施形態において、標的部分または実体は、例えば、炭水化物、脂質、核酸、金属、ポリペプチド、または小分子を含む、任意の化学的クラスであってよい。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ポリペプチド（またはその複合体）またはそれを含んでよい。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、融合ポリペプチドの一部である。
【0138】
～と関連する：２つの事象または実体は、１つの存在、レベルおよび／または形態が他方の存在、レベルおよび／または形態と相関関係にある場合、その用語が本願で使用されたように互い「関連」する。例えば、特定実体（例えば、ポリペプチド、遺伝的特徴、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が、疾患、障害、または病態の発病率および／またはそれに対する感受性と相関する場合（例えば、関連人口集団全体にわたって）、特定疾患、障害、または病態と関連すると見なされる。いくつかの実施形態において、２つ以上の実体は、互いに物理的に近接しており／いるか保持されるように直接または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「関連」している。いくつかの実施形態において、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は互いに共有的に連結している；いくつかの実施形態において、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有的に連結していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびそれらの組み合わせにより、非－共有的に関連している。
【0139】
結合：本願で使用されたように、用語「結合」は、一般的に２つ以上の実体の間またはそれらの間の非－共有結合を指称するものと理解されるであろう。「直接」結合は、実体または部分の間の物理的接触を含む；間接結合は、１つ以上の中間実体との物理的接触を通じた物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、一般的に相互作用する実体または部分が個別的に研究される場合、またはさらに複雑なシステムの文脈（例えば、担体実体および／または生物学的システムまたは細胞と共有的に、もしくは他の形で結合されている間）を含み、任意の様々な文脈で評価されることができる。
【0140】
がん：用語「がん」、「悪性」、「新生物」、「腫瘍」および「がん腫」は、本願で相対的に非正常的であり、調節されずに／されないか、自律的な成長を示し、細胞増殖制御の顕著な喪失を特徴とする非正常的な成長表現型を示す細胞を指称する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、前がん性（例えば、良性）、悪性、前－転移性、転移性および／または非－転移性である細胞であってよいか、これを含むことができる。この開示内容は、その教示が特に関連され得る特定のがんを具体的に識別する。いくつかの実施形態において、関連がんは固形腫瘍を特徴とすることができる。いくつかの実施形態において、関連がんは血液腫瘍を特徴とすることができる。一般的に、当業界に公知の様々な類型のがんの例は、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性障害を含む血液がん；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織のがん腫、口腔、咽喉、咽頭、および肺の扁平上皮がん、肝がん、泌尿生殖器がん、例えば、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、子宮がん、および子宮内膜がんおよび腎臓細胞がん腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚または眼球内黒色腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状線がん、頭頸部がん、乳がん、胃腸がんおよび神経系がん、良性病変、例えば、乳頭種などを含む。
【0141】
化学療法剤：本願で使用された用語「化学療法剤」は、１つ以上のアポトーシス促進剤、細胞増殖抑制剤および／または細胞毒性剤を指称する当業界で理解される意味を有し、例えば、好ましくない細胞増殖と関連する１つ以上の疾病、障害または病態を治療するのに使用および／または推奨される製剤を具体的に含む。多くの実施形態において、化学療法剤は、がん治療に有用である。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、１つ以上のアルキル化剤（例えば、二機能性アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、およびメルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）および一機能性アルキル化剤、例えば、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ニトロソウレア（Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａｓ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ））、１つ以上のアントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、およびミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ））、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）１つ以上の細胞骨格破壊剤（例えば、微小管標的化剤、例えば、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびそれらの類似体、具体的な例は、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、アブラキサン（Ａｒａｂａｘａｎｅ）、およびタキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）を含む）、１つ以上のエポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、１つ以上のヒストンデアセチラーゼ抑制剤（ＨＤＡＣ）、１つ以上のトポイソメラーゼ抑制剤（例えば、トポイソメラーゼＩおよび／またはトポイソメラーゼＩＩの抑制剤）、１つ以上のキナーゼ抑制剤、１つ以上のヌクレオチド類似体またはヌクレオチド前球体類似体、１つ以上のペプチド抗生剤、１つ以上の白金－基盤製剤、１つ以上のレチノイド、１つ以上のビンカアルカロイド、および／または１つ以上の次のうち１つ以上の類似体（すなわち、関連抗－増殖活性を共有する）であってよいか、またはこれを含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、化学療法剤は、１つ以上のアクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、オール－トランスレチノイン酸（Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アウリスタチン（Ａｕｉｒｉｓｔａｔｉｎ）、アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、アザチオプリン（Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、クルクミン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エポチロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、マイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）および／またはそれらの類似体（例えば、ＤＭ１）メクロレタミン（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、マイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、およびそれらの組み合わせであってよいか、またはこれを含むことができる。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、抗体－薬物接合体の文脈で利用されることができる。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、次からなる群より選択される抗体－薬物接合体で見出されるものである：ｈＬＬ１－ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ｈＲＳ７－ＳＮ－３８、ｈＭＮ－１４－ＳＮ－３８、ｈＬＬ２－ＳＮ－３８、ｈＡ２０－ＳＮ－３８、ｈＰＡＭ４－ＳＮ－３８、ｈＬＬ１－ＳＮ－３８、ｈＲＳ７－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＭＮ－１４－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＬＬ２－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＡ２０－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＰＡＭ４－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＬＬ１－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、Ｐ４／Ｄ１０－ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、トラスツズマブエムタンシン（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、イノツズマブオゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、グレンバツムマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｏｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＳＡＲ３４１９、ＳＡＲ５６６６５８、ＢＩＩＢ０１５、ＢＴ０６２、ＳＧＮ－７５、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＭＧ－１７２、ＡＭＧ－５９５、ＢＡＹ－９４－９３４３、ＡＳＧ－５ＭＥ、ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＳＧ－１６Ｍ８Ｆ、ＭＤＸ－１２０３、ＭＬＮ－０２６４、抗－ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ＲＧ－７４５０、ＲＧ－７４５８、ＲＧ－７５９３、ＲＧ－７５９６、ＲＧ－７５９８、ＲＧ－７５９９、ＲＧ－７６００、ＲＧ－７６３６、ＡＢＴ－４１４、ＩＭＧＮ－８５３、ＩＭＧＮ－５２９、ボルセツズマブマホドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、およびロルボツズマブメルタンシン（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）。
【0142】
操作された：一般的に、用語「操作された」は、人の手によって操作された様態を指称する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド配列が人の手によって操作されるとき、「操作された」ものと見なされる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、人の手によって参照ポリペプチド配列で導入された１つ以上のアミノ酸突然変異、欠失および／または挿入を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、人の手によって１つ以上の追加ポリペプチドに融合（すなわち、共有結合）されてインビボで天然に発生しない融合ポリペプチドを形成したポリペプチドを含む。類似するように、細胞や有機体は、遺伝情報が変更されるように操作された場合、「操作された」ものと見なされる（例えば、以前に存在しなかった新たな遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、またはその他の機序によって導入されるか、または以前から存在した遺伝物質が、例えば、置換もしくは欠失突然変異、または交配プロトコルによって変更されるか、または除去される）。一般的な慣行であり、当業者によって理解されるように、操作されたポリペプチドまたは細胞の誘導体および／または子孫は、たとえ実際操作が以前個体で遂行されたにもかかわらず、一般的に依然として「操作された」と称される。
【0143】
薬学組成物：本願で使用されたように、用語「薬学組成物」は、活性剤が１つ以上の薬剤学籍に許容される担体とともに剤形化される組成物を指称する。いくつかの実施形態において、組成物は、ヒトまたは動物対象体に投与するのに適合した。いくつかの実施形態において、活性剤は、関連集団に投与されるとき、所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療療法で投与するのに適切な単位投与量で存在する。
【0144】
薬学的に許容される担体：前記与えられた例に追加して、本願で使用されたように、用語「薬学的に許容される担体」は、一般的に薬学的に許容される物質、組成物または担体、例えば、液体または固体充填剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒またはカプセル化物質、意図された機能を遂行することができるように患者内に、または患者に本発明内で有用な化合物を運搬するか、または輸送するのに関与する当業界で認める意味を有する。典型的に、このような作製物は、ある器官または身体の一部から他の器官または身体の一部へ運搬されるか、または輸送される。各担体は、本発明内で有用な化合物を含む、剤形の他の成分と両立することができ、患者に害を及ぼさないという意味で「許容」されなければならない。本願で使用されたように、「薬学的に許容される担体」は、また本発明内で有用な化合物の活性と両立可能で患者に生理学的に許容される任意のおよびすべてのコート、抗菌剤および抗真菌剤、および吸収遅延剤などを含む。用語「薬学的に許容される担体」は、本発明内で有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。本発明の実施に使用される薬学組成物に含まれることができる他の追加成分は、例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９８５、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）］に記述されており、これは、本願に引用されて含まれる。「薬学的に許容される担体」は、一般的に組成物の他の成分と相容性であり、レシピエントに有害でなく、生物学的または別に好ましくないものではない薬学組成物の製造に有用である。「薬学的に許容される担体」は、１つ以上の担体を含む。実施形態は、局所、眼球、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、鼻腔または経口投与のための担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、また水性分散液および注射または分散液のための滅菌粉末製造用製剤を含む。
【0145】
薬学的に許容される塩：本願で使用されたように、用語「薬学的に許容される塩」は、一般的に当業界で認める意味を有し、親化合物が存在する酸または塩基部分をその塩形態に転換させることで変形された本願に提供された化合物の誘導体を指称する。薬学的に許容される塩の例は、非制限的にアミンのような塩基残基のミネラルまたは有機酸塩；カルボン酸のような酸性残基のアルカリまたは有機塩；などを含む。本願に提供された化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、無毒性無機酸または有機酸から形成された親化合物の通常の無毒性塩を含む。本願に提供された化合物の薬学的に許容される塩は、通常の化学的方法によって塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成されることができる。一般的に、このような塩は、このような化合物の遊離酸または塩基形態を水または有機溶媒、あるいは２つの混合物で化学量論的量の適切な塩基または酸と組み合わせることで製造されることができ；一般的にエーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパンオルまたはアセトニトリルのような非水性媒質が使用されることができる。適合した塩のリストは、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、ｐ．１４１８］および文献［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、２（１９７７）］で確認され、これらのそれぞれは、その全体内容が本願に引用されて含まれる。
【0146】
賦形剤：本願で使用されたように、用語「賦形剤」は、一般的に当業界で認める意味を有し、薬学組成物の製造で有用な生理学的に両立可能な添加剤を指称する。薬学的に許容される担体および賦形剤の例は、例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６ｔｈＥｄ］で確認することができる。
【0147】
ポリペプチド：本願で使用されたように、用語「ポリペプチド」は、一般的に少なくとも３つのアミノ酸のポリマーの当業界で認める意味を有する。当業者は、用語「ポリペプチド」が本願に引用された完全な配列を有するポリペプチドを含むだけでなく、このような完全なポリペプチドの機能的な断片（すなわち、１つ以上の活性を保持する断片）を示すポリペプチドを含むように十分に一般的に意図されるということを理解するであろう。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般的に活性を破壊することなく、一部置換を許容するということを理解する。よって、活性を保持し、少なくとも約３０～４０％の全配列同一性、しばしば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または８５％以上を共有し、さらに一般的に１つ以上の高度に保存された領域で遥かに高い同一性の少なくとも１つの領域、しばしば少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上を含み、一般的に少なくとも３～４個およびしばしば最大２０個以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチドは、同一の部類のまた他のポリペプチドとともに、本願で使用される関連用語「ポリペプチド」に含まれる。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、または両方ともを含むことができ、当業界に公知の任意の様々なアミノ酸変形または類似体を含むことができる。有用な変形は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非－天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含むことができる。用語「ペプチド」は、一般的に約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、または１０個未満のアミノ酸長さを有するポリペプチドを指称するために使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体製剤、抗体断片、その生物学的活性部分、および／またはその特徴部分である。
【0148】
組換え：本願で使用されたように、宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチドのような組換え手段によって、設計、操作、調製、発現、生成、製造および／または単離されたポリペプチド；組換え、コンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド；形質転換されたか、または別にポリペプチドまたはその１つ以上の成分、部分、要素、またはドメインをコードして／するか発現を指示する遺伝子または遺伝子あるいは遺伝子成分を発現するように操作された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚類など）から単離されたポリペプチド；および／または選択された核酸配列要素を互いにスプライシングまたはライゲーションし、選択された配列要素を化学的に合成し／するか、ポリペプチドまたはその１つ以上の成分、部分、要素、またはドメインをコードし／するか発現を指示する核酸を別に生成することを伴う任意の他の手段によって、製造、発現、生成または単離されたポリペプチドを指称することと意図される。いくつかの実施形態において、このような選択された配列要素のうち１つ以上は、天然から発見される。いくつかの実施形態において、このような選択された配列要素のうち１つ以上は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で設計される。いくつかの実施形態において、１つ以上のこのような選択された配列要素は、例えば、関心供給源有機体（例えば、ヒト、マウスなどのこと）の生殖系列のような天然または合成供給源から公知の配列要素の突然変異誘発（例えば、インビボまたはインビトロ）から発生する。
【0149】
特異的結合：本願で使用されたように、用語「特異的結合」は、結合が生じる環境で、可能な結合パートナーを区別する能力を指称する。他の潜在的な標的が存在するときに１つの特定の標的と相互作用する結合剤は、それが相互作用する標的に「特異的に結合」すると言う。いくつかの実施形態において、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の関連程度を検出するか、または測定することによって評価され；いくつかの実施形態において、特異的結合は、結合剤－パートナー複合体の解離の程度を検出するか、または測定することによって評価され；いくつかの実施形態において、特異的結合は、そのパートナーと別の実体との間の代替的な相互作用を競合する結合剤の能力を検出するか測定することによって評価される。いくつかの実施形態において、特異的結合は、濃度範囲にわたってそのような検出または測定を遂行することによって評価される。
【0150】
対象体：本願で使用されたように、用語「対象体」は、有機体、典型的に哺乳類（例えば、ヒト、いくつかの実施形態においては出生前ヒト形態を含む）を指称する。いくつかの実施形態において、対象体は、関連疾病、障害または病態を患っている 。いくつかの実施形態において、対象体は、疾病、障害または病態に脆弱である。いくつかの実施形態において、対象体は、疾患、障害または病態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態において、対象体は、疾病、障害または病態の如何なる症状または特徴も示さない 。いくつかの実施形態において、対象体は、疾病、障害または病態に対する感受性または危険の特徴である１つ以上の特徴を有する人である。いくつかの実施形態において、対象体は患者である。いくつかの実施形態において、対象体は、診断および／または療法が投与され／されるか投与された個体である。
【0151】
治療剤：本願で使用されたように、語句「治療剤」は、一般的に有機体に投与されるときに所望の薬理学的効果を誘導する任意の製剤を指称する。いくつかの実施形態において、製剤が適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示す場合、製剤は治療剤と見なされる。いくつかの実施形態において、適切な集団は、モデル有機体の集団であってよい。いくつかの実施形態において、適切な集団は、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などのような様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態において、治療剤は、疾病、障害、および／または病態の１つ以上の症状または特徴を緩和、改善、軽減、抑制、予防、発病遅延、重症度減少、および／または発病率減少に使用されることができる物質である。いくつかの実施形態において、「治療剤」は、ヒトに投与するために販売され得る前に、政府機関によって承認されたか、または承認を受けなければならない製剤である。いくつかの実施形態において、「治療剤」は、ヒトに投与するために医学的処方が必要な製剤である。
【0152】
治療有効量：本願で使用されたように、用語「治療有効量」は、疾病、障害および／または病態を治療するために、治療的投与療法によって疾病、障害および／または病態を患う、またはそれに感受性を有する集団に投与される際に、十分な量を意味する。いくつかの実施形態において、治療有効量は、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状の発病率および／または重症度を減少させ、その１つ以上の特徴を安定化させ／させるか、発病を遅延させる量である。当業者は、「治療有効量」という用語が、実際に、特定の個人において達成された成功した治療を必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、このような治療を必要とする患者に投与したときに、かなりの数の対象体に特定の所望の薬理学的反応を提供する量であってよい。例えば、いくつかの実施形態において、用語「治療有効量」は、本発明の療法の文脈において、これを必要とする個体に投与される際に、前記個体で発生するがん－支持過程を遮断、安定化、減弱、もしくは反転する量を指称するか、または前記個体でがん－抑制過程を向上、または増加させる量を指称する。がん治療の文脈において、「治療有効量」は、がんと診断された個体に投与された場合に、個体におけるがんのさらなる発達を予防、安定化、抑制、または減少する量である。本願に記述された組成物の特に好ましい「治療有効量」は、（治療的治療で）膵臓がん腫のような悪性腫瘍の発病を逆転させるか、または悪性腫瘍の寛解を達成するか、または延長するのに役立つ。個体にがんを治療するために投与される治療有効量は、寛解を促進するか、または転移を抑制するために投与される治療学的有効量と同じまたは異なってよい。ほとんどのがん治療法と同様に、本願に記述された治療方法は、がんに対する「治療」として解析されるか、またはこれに制限されるか、あるいは別に制限されてはならない；むしろ、治療方法は、がんを「治療」するための、すなわち、がんを有する個体の健康に好ましいか、または有益な変化をもたらすための、記述された組成物の使用に関する。このような利点は、腫瘍学分野の熟練した医療提供者によって認められ、非制限的に患者状態の安定化、腫瘍サイズの減少（腫瘍退縮）、生命機能の改善（例えば、がん性組織または臓器の機能改善）、追加転移の減少または抑制、日和見感染の減少、生存率の増加、疼痛の減少、運動機能の改善、認知機能の改善、気力の改善（活力、倦怠感の減少）、幸福感の改善、正常な食欲の回復、健康的な体重増加の回復、並びにそれらの組み合わせを含む。これに加えて、個体の特定の腫瘍の退縮（例えば、本願に記述された治療の結果として）は、また膵臓線がん腫のような腫瘍の部位からがん細胞の試料を採取することで評価されることができ（例えば、治療の過程にわたって）、代謝およびシグナル伝達マーカーのレベルについてがん細胞を試験して、がん細胞の状態をモニタリングし、分子レベルで、がん細胞が不十分に悪性表現型へ退縮するかを確認する。例えば、本発明の方法を用いて誘導された腫瘍退縮は、前記議論された血管新生促進マーカーのうち任意のものの減少、本願に記述された抗－血管新生マーカーの増加、代謝経路、細胞間シグナル伝達経路、またはがんと診断された個体で非正常的な活性を示す細胞内シグナル伝達経路の正常化（すなわち、がんを患っていない正常な個体において見出される状態への変更）の発見によって示される。当業者は、いくつかの実施形態において、治療有効量が単回用量で剤形化および／または投与され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、治療有効量は、例えば、投与療法の一部として、複数の用量で剤形化および／または投与されることができる。
【0153】
変異体：分子、例えば、核酸、タンパク質、または小分子の文脈で本願に使用されたように、用語「変異体」は、基準分子とかなりの構造的同一性を示すが、例えば、参照実体と比較して１つ以上の化学的部分の存在若しくは不在、又はそのレベルにおいて基準分子と構造的に異なる分子を指称する。いくつかの実施形態において、変異体はまた、その基準分子と機能的に異なる。一般的に、特定の分子が基準分子の「変異体」と適切に見なされるか否かは、基準分子との構造的同一性程度に基づく。当業者によって理解するであろうが、任意の生物学的または化学的な基準分子は、特定の特徴的な構造要素を有する。定義によれば、変異体は、１つ以上のこのような特徴的な構造要素を共有するが、基準分子と少なくとも一側面で異なる別個の分子である。いくつかの例を挙げると、ポリペプチドは、線形または三次元空間において互いに対して指定された位置を有し／有するか、特定の構造的モチーフおよび／または生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸で構成された特徴的な配列要素を有してよい；核酸は、線形または三次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基で構成された特徴的な配列要素を有してよい。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸またはヌクレオチド配列の１つ以上の違いの結果として、参照ポリペプチドまたは核酸と異なってよい。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドまたは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である参照ポリペプチドまたは核酸との全配列同一性を示す。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と少なくとも１つの特徴的な配列要素を共有しない。いくつかの実施形態において、参照ポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。
【0154】
ベクター：本願で使用されたように、そしてさらに前記開示内容に使用されたように、連結されたまた他の核酸を輸送することができる核酸分子を指称する。ベクターの１つの類型は、追加ＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の類型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで追加ＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞で自律複製することができる（例えば、バクテリア複製基点を有するバクテリアベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非－エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。また、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において「発現ベクター」と称される。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用され得る。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様に従って、または当業界で一般的に達成されるように、または本願に記載したように遂行され得る。前述の技術および手順は、一般的に、当業界によく知られた通常の方法によって遂行されることができ、本明細書の全体にわたって引用されて議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように、遂行されることができる。例えば、文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））］を参照し、これは、任意の目的のために本願に引用されて含まれる。
【0155】
本明細書の文脈において、本願に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、別に表示されない限り、完全に説明されたように、すべての目的のためにその全体の内容が本願に引用されて明示的に含まれ、その全体が本開示内容の一部として見なされなければならない。
【0156】
別に定義されない限り、本願で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示内容の属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。衝突する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【0157】
本発明に対する前記記載された説明は、当業者がこれを製造および使用できるように製造および使用する方式および過程を提供し、このような、可能にすることは、特に本来の説明の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題に対して提供される。
【0158】
本願で使用されたように、語句「～からなる群より選択される」、「～より選択される」などは、特定物質の混合物を含む。
【0159】
数値的限界または範囲が本願に明示された場合、終点が含まれる。また、数値限界または範囲内のすべての値および下位範囲は、明示的に作成されたように具体的に含まれる。
【0160】
上記の説明は、当業者が本発明を作って、使用できるようにするために提供され、特定適用およびその要求事項の文脈で提供される。好ましい実施形態に対する様々な修正は、当業者にとって容易に明白であり、本願に定義された一般的な原理は、本発明の思想および範囲を外れず、他の実施形態および適用に適用されることができる。よって、本発明は、提示された実施形態に制限されるものと意図されず、本願に開示された原理および特徴と一致する最も広い範囲が付与されなければならない。
【0161】
下記特定の実施形態に拘束されず、本発明は、下記によって例示される：
（１）（ＶＨ）、（ＶＬ）、（Ｘ）、（ＶＨ）ｎ、（ＶＬ）ｎ、（Ｘ）ｎ、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの組み合わせを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質、
ここで、前記ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し、
Ｘは、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり、
Ｙは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる群より選択される１つ以上のドメインを含む重鎖不変領域または軽鎖不変領域の断片を指称し、
ｎおよびｍは、それぞれ１～５の整数である。
（１）（ＶＨ）、（ＶＬ）、（Ｘ）、（ＶＨ）ｎ、（ＶＬ）ｎ、（Ｘ）ｎ、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの組み合わせを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質、
ここで、前記ＶＨおよびＶＬは、４－１ＢＢに結合する抗体またはその抗原－結合断片の可変重鎖領域および可変軽鎖領域のそれぞれを指称し、
Ｘは、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１タンパク質またはその断片であり、
Ｙは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる群より選択される１つ以上のドメインを含む重鎖不変領域または軽鎖不変領域の断片を指称し、
ｎおよびｍは、それぞれ１～５の整数である。
【0162】
（２）（１）において、（ＶＨ）、（ＶＬ）、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍは、存在する場合、Ｎ－末端からＣ－末端へ任意の順に示され得る、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0163】
（３）（１）または（２）において、（ＶＨ）、（ＶＬ）、（ＶＨ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＨ－ＶＬ）ｎ－Ｙ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－Ｙ、（Ｘ）ｎ－Ｙ、Ｙ－（ＶＨ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、Ｙ－（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、および／またはＹ－（Ｘ）ｍの多重コピーが存在する場合、これらは、他の領域に対して任意の順で存在することができ、類似する種類の領域に直接接する必要がない、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0164】
（４）（１）～（３）のいずれか１つにおいて、二重特異的エピトープ結合タンパク質がｓｃＦｖ形態である、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0165】
（５）（１）～（４）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＡｎ－Ａ’ｎ’－Ｂ－Ｃｍ－Ｃ’ｍ’の構造を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、
ここで：
Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’：ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結され、
ｎ’およびｍ’は、独立して、１～５の整数である、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
ここで：
Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’：ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結され、
ｎ’およびｍ’は、独立して、１～５の整数である、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0166】
（６）（１）～（４）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＡｎ－Ｂ－Ｃｍの構造を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、
ここで：
ＡまたはＣ：ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
ここで：
ＡまたはＣ：ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸ
Ｂ：Ｙ
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、Ｙは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0167】
（７）（１）～（４）のいずれか１つにおいて、ＣＨ１ドメインが（ＶＨ－ＶＬ）ｎ、（ＶＬ－ＶＨ）ｎ、または（Ｘ）ｎに直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーによってＣ－末端に連結され、ＣＨ２／ＣＨ３ドメインが（ＶＨ－ＶＬ）ｍ、（ＶＬ－ＶＨ）ｍ、（Ｘ）ｍに直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーによってＮ－末端に連結され、前記ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍが前記定義されたとおりである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0168】
（８）（７）において、ＣＨ１ドメインがＣＨ２／ＣＨ３ドメインに直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーによって連結される、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0169】
（９）（１）～（３）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質が次を含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質
－ＣＨ２に直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結されたＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨ、Ｘ、および／またはＶＨ－ＣＨ１を含み、独立して、ＣＨ３は、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸに直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結された、重鎖および
－リンカーおよび／またはヒンジを通じてＣＬに連結されたＶＬを含む軽鎖
ここで、前記ＶＨ、ＶＬ、およびＸは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される。
－ＣＨ２に直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結されたＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨ、Ｘ、および／またはＶＨ－ＣＨ１を含み、独立して、ＣＨ３は、ＶＨ－ＶＬ、ＶＬ－ＶＨまたはＸに直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジを通じて連結された、重鎖および
－リンカーおよび／またはヒンジを通じてＣＬに連結されたＶＬを含む軽鎖
ここで、前記ＶＨ、ＶＬ、およびＸは、前記定義されたとおりであり、それぞれのＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬは、直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結される。
【0170】
（１０）（１）～（４）のいずれか１つにおいて、（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎ－Ｙおよび／またはＹ－（Ｘ）ｍを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、
ここで、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインで、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたところのような二重特異的エピトープ結合タンパク質。
ここで、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインで、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたところのような二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0171】
（１１）（１）～（４）および（１０）のいずれか１つにおいて、二重特異的エピトープ結合タンパク質がＮ－末端からＣ－末端に記載された（ＶＬ－ＶＨ）ｎ－ＣＨ２－ＣＨ３－（Ｘ）ｍのように配列されたｓｃＦｖである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0172】
（１２）（１１）において、ＶＬおよびＶＨ、ＶＨおよびＣＨ２、ＣＨ３および（Ｘ）ｍ、および／またはＣＨ２およびＣＨ３が直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結された、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0173】
（１３）（１）～（４）のいずれか１つにおいて、（Ｘ）ｍ－Ｙおよび／またはＹ－（ＶＨおよびＶＬ、如何なる順でも）ｎを含む二重特異的エピトープ結合タンパク質であって、
ここで、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
ここで、前記Ｙは、独立してＣＨ２またはＣＨ３ドメインであり、ＶＨ、およびＶＬおよびＣＨ２および／またはＣＨ３、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３およびＸは、直接的に、あるいはヒンジおよび／またはリンカーを通じて連結され；
ＶＨ、ＶＬ、Ｘ、ｎ、およびｍは、前記定義されたとおりである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0174】
（１４）（１３）において、二重特異的エピトープ結合タンパク質がＮ－末端からＣ－末端に記載された（Ｘ）ｍ－ＣＨ２－ＣＨ３－（ＶＨ－ＶＬ）ｎのように配列されたｓｃＦｖである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0175】
（１５）（１４）において、（Ｘ）ｍおよびＣＨ２、ＣＨ３およびＶＨ、およびＶＨおよびＶＬ、および／またはＣＨ２およびＣＨ３が直接的に、あるいはリンカーおよび／またはヒンジによって連結された、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0176】
（１６）（１）～（１５）のいずれか１つにおいて、それぞれのｎおよびｍが個別的に１、２、３、４、または５の整数から選択されてこのような整数値を有するｎおよびｍの任意の組み合わせが存在することができる、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0177】
（１７）（１）～（１６）のいずれか１つにおいて、多重ＶＨ、ＶＬ、および／またはＸが存在する場合（すなわち、ｎおよび／またはｍが１超えの値である場合）コピーが直接的に連結されるか、ヒンジおよび／またはリンカー配列によって分離される、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0178】
（１８）（１７）において、コピーがリンカー配列によって分離される、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0179】
（１９）（５）～（１８）のいずれか１つにおいて、リンカーが約１０～２５個のアミノ酸残基、１０～２０個のアミノ酸残基、または１２～１９個のアミノ酸残基を含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0180】
（２０）（５）～（１９）のいずれか１つにおいて、リンカーが（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎまたは（ＧｎＳ）ｍ（ｎおよびｍは、それぞれ１～１０である））、２１８リンカー、または２１８Ｓリンカーより選択される少なくとも１つである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0181】
（２１）（５）～（２０）のいずれか１つにおいて、リンカーが（Ｇ４Ｓ）３リンカー、（Ｇ４Ｓ）２リンカー、２１８リンカー、または２１８Ｓリンカーである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0182】
（２２）（１）～（２１）のいずれか１つにおいて、４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨを含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0183】
（２３）（１）～（２２）のいずれか１つにおいて、４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0184】
（２４）（１）～（２１）のいずれか１つにおいて、４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0185】
（２５）（１）～（２４）のいずれか１つにおいて、ＰＤ－１タンパク質またはその断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の配列を含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0186】
（２６）（１）～（２１）のいずれか１つにおいて、４－１ＢＢ－結合抗体またはその抗原－結合断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＬを含み、ＰＤ－１タンパク質またはその断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の配列を含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0187】
（２７）（１）～（２６）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有するか、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0188】
（２８）（１）～（２６）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0189】
（２９）（１）～（２６）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０および１４からなる群より選択される配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0190】
（３０）（１）～（２６）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0191】
（３１）（１）～（２６）のいずれか１つにおいて、前記二重特異的エピトープ結合タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有する二重特異的エピトープ結合タンパク質と少なくとも８０％配列同一性を有し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する二重特異的結合親和性を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0192】
（３２）（１）～（３１）のいずれか１つにおいて、シグナルペプチドをさらに含む、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0193】
（３３）（３２）において、前記シグナルペプチドが１２～４０個のアミノ酸を含むＮ－末端シグナルペプチドである、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0194】
（３４）（５）～（３３）のいずれか１つにおいて、ヒンジがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の配列を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0195】
（３５）（５）～（３４）のいずれか１つにおいて、ヒンジがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の配列を有する、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0196】
（３６）（１）～（３５）のいずれか１つにおいて、ＰＤ－１タンパク質またはその断片が親和性成熟した、二重特異的エピトープ結合タンパク質。
【0197】
（３７）（１）～（３６）のいずれか１つの二重特異的エピトープ結合タンパク質対として、対の両メンバーともが同一である、二重特異的エピトープ結合タンパク質対。
【0198】
（３８）（１）～（３６）のいずれか１つの二重特異的エピトープ結合タンパク質をコードする核酸分子。
【0199】
（３９）（３８）の核酸分子を含む組換えベクター。
【0200】
（４０）（３８）の核酸分子または（２８）の組換えベクターを含む細胞。
【0201】
（４１）二重特異的エピトープ結合タンパク質の生産方法であって、前記方法は、二重特異的エピトープ結合タンパク質を生産するに十分な条件下で培養培地で（４０）の細胞を培養するステップ；および細胞および／または培養培地から二重特異的エピトープ結合タンパク質を回収するステップを含む、方法。
【0202】
（４２）（１）～（３６）のいずれか１つの二重特異的エピトープ結合タンパク質、（３８）の核酸、（３９）の組換えベクター、または（４０）の細胞および薬学的に許容される担体を含む、薬学組成物。
【0203】
（４３）（４２）の医薬学組成物を含むキット。
【0204】
（４４）これを必要とする対象体でがんを治療する方法であって、前記方法は、（１）～（３６）の二重特異的エピトープ結合タンパク質、（３７）の核酸、（３８）の組換えベクター、または（４０）の細胞の有効量を含むか、伝達する組成物を対象体に投与するステップを含む、方法。
【0205】
（４５）（４４）において、対象体が、がんを有する、方法。
【0206】
（４６）（４４）において、対象体が、がんの発病する危険がある、方法。
【0207】
（４７）（４４）～（４６）のいずれか１つにおいて、がんが膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファローピウス管がん、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵臓がん、腎臓細胞がん腫、膠芽腫、前立腺がん、およびそれらの組み合わせを含む、方法。
【0208】
（４８）これを必要とする対象体でがんを予防する方法であって、前記方法は、（１）～（３６）の二重特異的エピトープ結合タンパク質、（３８）の核酸、（３９）の組換えベクター、または（４０）の細胞の有効量を含むか、伝達する組成物を対象体に投与するステップを含む、方法。
【0209】
（４９）（４８）において、対象体が、がんを有する、方法。
【0210】
（５０）（４８）において、対象体が、がんの発病する危険がある、方法。
【0211】
（５１）（４８）～（５０）のいずれか１つにおいて、がんが膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ファローピウス管がん、胆嚢がん、胃腸がん、頭頸部がん、血液がん、咽頭がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん、甲状腺がん、膵臓がん、腎臓細胞がん腫、膠芽腫、前立腺がん、およびそれらの組み合わせを含む、方法。
【0212】
（５２）（４８）～（５１）のいずれか１つにおいて、予防が、がんの臨床的症状の発病を抑制する、方法。
【0213】
（５３）（４８）～（５１）のいずれか１つにおいて、予防が、がんと関連する臨床的症状の緩和である、方法。
【0214】
（５４）（４７）～（５０）のいずれか１つにおいて、予防が、がんと関連する臨床的症状の除去である、方法。
【0215】
本発明を一般的に説明したが、特定具体的な実施例を参照して追加理解を得ることができ、これは、単に例示の目的で本願に提供され、他に明示されない限り、制限しようとする意図ではない。
【実施例】
【0216】
本開示内容は、特許請求の範囲に記述された開示内容の範囲を制限しない下記実施例で追加的に説明される。
【0217】
実施例１：二重特異的抗体（ＢｓＡＢ）設計および生産
抗－４－１ＢＢ抗体の場合、９４ｋｖｔクローンを使用し（国際公開ＷＯ２０１８－１２７７８７号に記述されたＥＵ１０１、その全体内容が本願に引用されて含まれる）、抗－ＰＤ－Ｌ１タンパク質の場合、親和性成熟したＰＤ－１タンパク質（ｅｕＰＤ－１、米国特許第１７／４６９，５４９号に記述されたＥＵ１３１、その全体内容が本願に引用されて含まれる）を使用した。配列を変更して計１０個の（Ｓ０１～Ｓ１０）抗－４－１ＢＢ抗体×ｅｕＰＤ－１変異体（本願において、「二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体」と称される）を設計（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０、１４；それぞれ二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１－Ｓ１０および９４ｋｖｔ軽鎖）して、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２、および２１８または２１８Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８）を各部分を連結するためのリンカーとして使用した。９４ｋｖｔの場合、ｓｃＦｖ形態を使用した。操作されたＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ部分をｅｕＰＤ－１と連結するために使用した。Ｆｃの場合、点突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ）を導入してＡＤＣＣおよびＣＤＣを減少させた。（図２）
抗－４－１ＢＢ抗体の場合、９４ｋｖｔクローンを使用し（国際公開ＷＯ２０１８－１２７７８７号に記述されたＥＵ１０１、その全体内容が本願に引用されて含まれる）、抗－ＰＤ－Ｌ１タンパク質の場合、親和性成熟したＰＤ－１タンパク質（ｅｕＰＤ－１、米国特許第１７／４６９，５４９号に記述されたＥＵ１３１、その全体内容が本願に引用されて含まれる）を使用した。配列を変更して計１０個の（Ｓ０１～Ｓ１０）抗－４－１ＢＢ抗体×ｅｕＰＤ－１変異体（本願において、「二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体」と称される）を設計（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０、１４；それぞれ二重特異的エピトープ結合タンパク質Ｓ０１－Ｓ１０および９４ｋｖｔ軽鎖）して、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）２、および２１８または２１８Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８）を各部分を連結するためのリンカーとして使用した。９４ｋｖｔの場合、ｓｃＦｖ形態を使用した。操作されたＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ部分をｅｕＰＤ－１と連結するために使用した。Ｆｃの場合、点突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ）を導入してＡＤＣＣおよびＣＤＣを減少させた。（図２）
【0218】
また、Ｓ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）抗体を抗体のＣ－末端にｓｃＦｖ形態で市販許可された抗－ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を付着して対照群として使用するように開発した。（図２）
【0219】
生成された二重特異的抗体の発現をＥｘｐｉ２９３Ｆ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して遂行した。ＡｋｔａＰｕｒｅ（ｃｙｔｉｖａ）機器、タンパク質Ａコラム（Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ｃｙｔｉｖａ、Ｃａｔ．ｎｏ．１１００３４９５）および脱塩コラム（Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、Ｃｙｔｉｖａ Ｃａｔ．ｎｏ．１７５０８７０２）を使用して精製を遂行した。
【0220】
実施例２：二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を還元および非－還元条件下に二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を分析するために遂行した。還元条件は、サンプル還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００９）とともにＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００７）に１μｇの二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を添加するものである。続いて９５℃で３分間煮込みを遂行した。非－還元条件の場合、ただＬＤＳサンプル緩衝液のみを添加して使用した。ＴＧＸステイン－フリーゲル（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｓｔａｉｎ－ｆｒｅｅ ｇｅｌ）上に生成されたサンプルをゲルにローディングした後、１ｘ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１０７３２）中で１２５Ｖで３０分間ランニングさせた。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して結果を分析して図３に図示した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を還元および非－還元条件下に二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を分析するために遂行した。還元条件は、サンプル還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００９）とともにＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００７）に１μｇの二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を添加するものである。続いて９５℃で３分間煮込みを遂行した。非－還元条件の場合、ただＬＤＳサンプル緩衝液のみを添加して使用した。ＴＧＸステイン－フリーゲル（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｓｔａｉｎ－ｆｒｅｅ ｇｅｌ）上に生成されたサンプルをゲルにローディングした後、１ｘ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１０７３２）中で１２５Ｖで３０分間ランニングさせた。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して結果を分析して図３に図示した。
【0221】
実施例３：二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体のサイズ－排除クロマトグラフィー分析
ＨＰＬＣ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ ＬＣシステム）およびサイズ排除コラム（Ｔｏｓｏｈ、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、Ｐａｒｔ Ｎｏ．０００８５４１、コラムＮｏ．００４Ｅ０４３２０Ｅ）を使用して二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をまたＳＥＣ分析に適用した。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｃａｔ ｎｏ．１５１１９０１）を対照群として使用した。結果を図４に図示した。
ＨＰＬＣ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ ＬＣシステム）およびサイズ排除コラム（Ｔｏｓｏｈ、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、Ｐａｒｔ Ｎｏ．０００８５４１、コラムＮｏ．００４Ｅ０４３２０Ｅ）を使用して二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をまたＳＥＣ分析に適用した。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｃａｔ ｎｏ．１５１１９０１）を対照群として使用した。結果を図４に図示した。
【0222】
実施例４：二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体の親和性分析
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体の親和性を分析するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用した。
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体の親和性を分析するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用した。
【0223】
４－１ＢＢに対する親和性
４－１ＢＢ親和性決定のために、５μｇ／ｍｌで希釈された二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をｈｕｍａｎ ｃａｐｔｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９）を利用してＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＲ－１００５－３０）に固定した。４－１ＢＢ抗原（ａｂｃｌｏｎ）を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの濃度で注入し、結合時間を１５０秒に設定し、解離時間を２４０秒に設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ｃｙｔｉｖａ）を分析装備として使用した。表１は、４－１ＢＢ親和性評価の結果である：
４－１ＢＢ親和性決定のために、５μｇ／ｍｌで希釈された二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をｈｕｍａｎ ｃａｐｔｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９）を利用してＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＲ－１００５－３０）に固定した。４－１ＢＢ抗原（ａｂｃｌｏｎ）を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの濃度で注入し、結合時間を１５０秒に設定し、解離時間を２４０秒に設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ｃｙｔｉｖａ）を分析装備として使用した。表１は、４－１ＢＢ親和性評価の結果である：
【表1】
【0224】
ＰＤ－Ｌ１に対する親和性
ＰＤ－Ｌ１親和性決定のために、１０μｇ／ｍｌで希釈された二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をｈｕｍａｎ ｃａｐｔｕｒｅを利用してＣＭ５チップに固定した。ＰＤ－Ｌ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８４－Ｈ０８Ｈ）を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの濃度で注入し、後続手続きは、４－１ＢＢ親和性分析手続きと同一であった。表２は、ＰＤ－Ｌ１親和性評価の結果である：
ＰＤ－Ｌ１親和性決定のために、１０μｇ／ｍｌで希釈された二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体をｈｕｍａｎ ｃａｐｔｕｒｅを利用してＣＭ５チップに固定した。ＰＤ－Ｌ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８４－Ｈ０８Ｈ）を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの濃度で注入し、後続手続きは、４－１ＢＢ親和性分析手続きと同一であった。表２は、ＰＤ－Ｌ１親和性評価の結果である：
【表2】
【0225】
天然ＰＤ－１とＳ０３との間のＰＤ－Ｌ１に対する結合差、およびマウスＰＤ－１およびヒトＰＤ－Ｌ１の結合を比較するために、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）およびマウスＰＤ－１ Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．５０１２４－Ｍ０２Ｈ）を１５μｇ／ｍｌで希釈してｈｕｍａｎ ｃａｐｔｕｒｅとともにＣＭ５チップに固定した。ＰＤ－Ｌ１抗原を２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの濃度で注入し、後続手続きは、４－１ＢＢ親和性分析手続きと同一であった。結果をヒト天然ＰＤ１－Ｆｃの場合、図５ａに図示し、Ｓ０３の場合、図５ｂに図示した。Ｓ０３は、天然ＰＤ－１より約９３倍さらに強力にＰＤ－Ｌ１に結合するものと確認された。また、ヒトＰＤ－Ｌ１に対するマウスＰＤ－１の親和性は確認されなかった（表３参照）。
【0226】
【表3】
【0227】
実施例５：単一抗原結合ＥＬＩＳＡ
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体が各標的抗原に結合するかを確認するために、単一抗原結合ＥＬＩＳＡを遂行した。分析方法を図６ａに図示のとおり遂行した。
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体が各標的抗原に結合するかを確認するために、単一抗原結合ＥＬＩＳＡを遂行した。分析方法を図６ａに図示のとおり遂行した。
【0228】
４－１ＢＢ結合を確認するために、９６－ウェル免疫プレートを４℃で１μｇ／ｍｌの４－１ＢＢ抗原（ａｂｃｌｏｎ）で終夜コートし、１５０μｌの１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１時間の間処理して、非－特異的結合を遮断した。二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を３ｎＭで４倍ずつ４個の箇所に対して希釈した後、ウェル当たり１００μｌを２時間の間処理した。次に、ＨＲＰ－接合された抗－ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０－０３５－００８）を２０００倍希釈して各ウェルに１００μｌずつ添加して１時間の間インキュベーションした。ＴＭＢで発色させた後、硫酸を使用して反応を停止させた。ＴＭＢ処理後工程を除いた全工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、コート工程を除いたすべての工程を室温で進行した。（図６ｂ）
【0229】
ＰＤ－Ｌ１結合を確認するために、９６－ウェル免疫プレートを４℃で１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）で終夜コートし、１５０μｌの１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１時間の間添加して非－特異的結合を遮断した。二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を３００ｎＭで１０倍ずつ４個の箇所に対して希釈した後、ウェル当たり１００μｌを２時間の間処理した。以後の別の手続きは、４－１ＢＢ結合ＥＬＩＳＡのものと同一であった（図６ｃ）。
【0230】
また、各抗原結合部位による特異的結合可否を確認するために、ｉ）４－１ＢＢに対する結合を防止するために、Ｓ０３の抗－４－１ＢＢ抗体をヒト生殖系列抗体（ＤＰ４７）に置換してＳ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を製作し、ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１に対する結合を防止するために、Ｓ０３のｅｕＰＤ－１を点突然変異させ、これをｅｕＰＤ－１ｎに置換してＳ１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を製作し、４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１に対する単一抗原結合ＥＬＩＳＡを遂行した。（図６ｄ）
【0231】
４－１ＢＢ結合の場合、Ｓ０３、Ｓ１２、Ｓ１３を０．５μｇ／ｍｌで２倍ずつ希釈して計１１箇所を確認した。抗－４－１ＢＢ抗体がないＳ１２は、４－１ＢＢに結合することができず、Ｓ０３とＳ１３は、４－１ＢＢに用量依存的に結合することを確認した。（図６ｅ）
【0232】
ＰＤ－Ｌ１結合の場合、Ｓ０３、Ｓ１２およびＳ１３を１００μｇ／ｍｌで４倍ずつ希釈して計１１箇所を確認した。ＰＤ－Ｌ１に結合することができないように点突然変異されたＳ１３は、ＰＤ－Ｌ１に結合しない一方、Ｓ０３およびＳ１２は、ＰＤ－Ｌ１に用量依存的に結合することに注目した。（図６ｆ）
【0233】
実施例６：二重抗原結合ＥＬＩＳＡ
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体が抗原４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１両方に結合するということを確認するために、二重結合分析を遂行した。
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体が抗原４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１両方に結合するということを確認するために、二重結合分析を遂行した。
【0234】
分析方法は、図７ａに図示されたように遂行した。要約すると、９６－ウェル免疫プレートに１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を４℃で終夜コートし、１５０μｌの１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１時間の間処理して非－特異的結合を遮断した。二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を１０ｎＭから５倍ずつ４箇所に対して希釈して遂行し、ウェル当たり１００μｌを２時間の間処理し、０．１μｇ／ｍｌ濃度の１００μｌのビオチン化された４－１ＢＢ抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００４１－Ｈ０８Ｈ－Ｂ）を各ウェルに添加して１時間の間インキュベーションした。次に、アビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．７９００４）を１／１０００で希釈して、各ウェルに１００μｌずつ添加して３０分間処理した後、ＴＭＢで発色させた後、硫酸を使用して反応を停止させた。ＴＭＢ添加後工程を除いたすべての工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、コート工程を除いたすべての工程は室温で進行した。（図７ｂ）
【0235】
Ｓ０３、Ｓ１２およびＳ１３に対する二重抗原ＥＬＩＳＡもまた各抗原結合部分による特異的結合を確認するために、１００μｇ／ｍｌで５倍ずつ１２箇所に対して希釈して遂行した。抗－４－１ＢＢ抗体がないＳ１２とＰＤ－Ｌ１に対する結合を行えないという点突然変異されたＳ１３は二重抗原結合を見せず、Ｓ０３が用量依存的に結合することが分かる。（図７ｃ）
【0236】
実施例７：細胞結合分析
ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ（ヒト乳がん細胞、ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ１５５９）、ＦａＤｕ（ヒト扁平上皮がん細胞、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－４３）、４－１ＢＢ陽性細胞株である４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ（自体製作）、およびＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢ陰性細胞株であるＭＣＦ－７（ヒト乳がん細胞）を分析のために使用した。図８は、それぞれの細胞株で４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。これは、２次抗体によって背景シグナルがほとんどないことと決定された。
ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ（ヒト乳がん細胞、ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ１５５９）、ＦａＤｕ（ヒト扁平上皮がん細胞、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－４３）、４－１ＢＢ陽性細胞株である４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ（自体製作）、およびＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢ陰性細胞株であるＭＣＦ－７（ヒト乳がん細胞）を分析のために使用した。図８は、それぞれの細胞株で４－１ＢＢおよびＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。これは、２次抗体によって背景シグナルがほとんどないことと決定された。
【0237】
各細胞株から２×１０５個細胞に５０、５、０．５、および０．０５ｎＭの最終濃度で二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体を処理し、続いて４℃で２０分間インキュベーションした。次に、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液を使用して１回洗浄を遂行し、１μｌ／チューブの抗－ｈＦＣ－４８８の２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を２０分間処理した。２回洗浄した後、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ、ＢＤ）を使用して分析を遂行した。
【0238】
ＦＡＣＳ分析結果、二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体は、ＰＤ－Ｌ１（図９ａ～９ｂ）および４－１ＢＢ陽性細胞株（図９ｃ）に用量依存的に結合することが明かされた。また、４－１ＢＢとＰＤ－Ｌ１をすべて発現しない細胞には結合しなかった（図９ｄ）。
【0239】
実施例８：４－１ＢＢ生物分析
４－１ＢＢ活性効果を検証するために、４－１ＢＢエフェクター細胞が活性化されれば、ルシフェラーゼが発現するという原理によって４－１ＢＢ生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｊ２３３２）を遂行した。
４－１ＢＢ活性効果を検証するために、４－１ＢＢエフェクター細胞が活性化されれば、ルシフェラーゼが発現するという原理によって４－１ＢＢ生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｊ２３３２）を遂行した。
【0240】
生物検定およびルシフェラーゼ分析をメーカーのプロトコルによって遂行した。ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６－ウェル白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分注した。３７℃ ＣＯ２インキュベーターで終夜インキュベーションした後、二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体および４－１ＢＢエフェクター細胞を処理した。抗体１００ｎｇ／ｍｌから２倍ずつ希釈して４箇所に対して遂行した。４－１ＢＢエフェクター細胞で処理した後、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで６時間の間インキュベーションして、ルミノメーター（Ｆｌｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して発光強度を測定した。結果は図１０に示されている。
【0241】
実施例９：４－１ＢＢ／ＰＤ－１組合生物分析
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対するエフェクター細胞の結合が遮断され、４－１ＢＢが活性化されるとき、ルシフェラーゼが発現されるという原理によってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合抑制効果と４－１ＢＢ活性の効果を検証するために、４－１ＢＢ／ＰＤ－１組合生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９７８Ｉ１０）を遂行した。（図１１ａ）
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対するエフェクター細胞の結合が遮断され、４－１ＢＢが活性化されるとき、ルシフェラーゼが発現されるという原理によってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合抑制効果と４－１ＢＢ活性の効果を検証するために、４－１ＢＢ／ＰＤ－１組合生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９７８Ｉ１０）を遂行した。（図１１ａ）
【0242】
生物分析およびルシフェラーゼ分析をメーカーのプロトコルによって遂行した。ＰＤ－Ｌ１を発現するＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６－ウェル白色プレートに分注した。これを３７℃ ＣＯ２インキュベーターで終夜培養して抗体およびエフェクター細胞を処理した。Ｓ０３、抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４および２１）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ、ＭＳＤ）、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、Ｒｏｃｈｅ）、およびｅｕＰＤ－１ Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を使用した。１４７ｎＭで３倍ずつ７箇所で希釈して遂行した。処理のために４－１ＢＢエフェクター細胞を添加し、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで６時間の間インキュベーションし、ルミノメーター（Ｆｌｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して発光強度を測定した。
【0243】
実験結果（図１１ｂ）、ＰＤ－Ｌ１発現細胞およびエフェクター細胞に結合することができるＳ０３によって発光が強く検出されることを確認した。
【0244】
実施例１０：ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に対する親和性
ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のすべてに結合することと知られている。Ｓ０３は、ＰＤ－１の親和性成熟した形態であるｅｕＰＤ－１を含む。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対するＳ０３の結合をＥＬＩＳＡと確認した。
ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のすべてに結合することと知られている。Ｓ０３は、ＰＤ－１の親和性成熟した形態であるｅｕＰＤ－１を含む。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対するＳ０３の結合をＥＬＩＳＡと確認した。
【0245】
９６－ウェル免疫プレートを２μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－１－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３７７－Ｈ０２Ｈ）でウェル当たり１００μｌを４℃で終夜コートし、１５０μｌの１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１時間の間処理して非－特異的結合を遮断した。ビオチン化されたＰＤ－Ｌ１（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８４－Ｈ０８Ｈ－Ｂ）およびビオチン化されたＰＤ－Ｌ２（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２９２－Ｈ０８Ｈ－Ｂ）を１μｇ／ｍｌから３倍ずつ５箇所希釈してウェル当たり１００μｌを１時間の間処理した。以後、アビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．７９００４）を１／１０００で希釈して、ウェル当たり１００ｕｌずつ３０分間添加した後、ＴＭＢで発色させた後、硫酸で反応を停止させた。ＴＭＢ処理後に工程を除いたすべての工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、抗体コート工程を除いたすべての工程は、室温で進行した。
【0246】
また、Ｓ０３、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｒｏｃｈｅ）、および抗ＰＤ－Ｌ２抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２９２－Ｒ０１８）を０．１μｇ／ｍｌで４倍ずつ４箇所希釈し、９６－ウェル免疫プレートにウェル当たり１００μｌを添加した後４℃で終夜コートした。次に、非－特異的結合を遮断するために１時間の間処理のために１５０μｌの１ｘ分析緩衝液を処理した。ビオチン化されたＰＤ－Ｌ１およびビオチン化されたＰＤ－Ｌ２ １００μｌを各ウェルに０．１μｌ／ｍｌの濃度で１時間の間処理した。以後の別の手続きは、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ ＥＬＩＳＡと同一であった。
【0247】
実験結果、ヒトＰＤ－１－Ｆｃは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のすべてに結合するが（図１２ａ）、対照群として使用した抗－ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１にのみ結合することと示され、抗－ＰＤ－Ｌ２抗体は、ＰＤ－Ｌ２にのみ結合することと示された。試験物質Ｓ０３は、ＰＤ－Ｌ１にのみ結合された。（図１２ｂ～ｃ）
【0248】
実施例１１：細胞毒性分析
Ｓ０３の標的細胞に対するＴ細胞媒介細胞毒性効果を確認するために、細胞毒性分析を遂行した。ヒト末梢血液単核細胞からパン（ｐａｎ）Ｔ陰性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０－０９６－５３５）によって分離されたＴ細胞を４日間抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）でコートされたプレートで活性化させた。Ｔ細胞および抗体処理の一日前に、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＧＦＰ（自体製作）を４×１０４細胞／ウェルに分注した。抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ、ＭＳＤ）およびＳ０３を１．６６７ｎＭで３倍ずつ４箇所希釈して遂行した。活性化されたＴ細胞を収穫した後、腫瘍細胞と１：１割合で処理した。ＧＦＰシグナルは生きている細胞分析システム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１１７時間の間１時間の間隔で測定した。
Ｓ０３の標的細胞に対するＴ細胞媒介細胞毒性効果を確認するために、細胞毒性分析を遂行した。ヒト末梢血液単核細胞からパン（ｐａｎ）Ｔ陰性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０－０９６－５３５）によって分離されたＴ細胞を４日間抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）でコートされたプレートで活性化させた。Ｔ細胞および抗体処理の一日前に、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＧＦＰ（自体製作）を４×１０４細胞／ウェルに分注した。抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１）、抗－ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ、ＭＳＤ）およびＳ０３を１．６６７ｎＭで３倍ずつ４箇所希釈して遂行した。活性化されたＴ細胞を収穫した後、腫瘍細胞と１：１割合で処理した。ＧＦＰシグナルは生きている細胞分析システム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１１７時間の間１時間の間隔で測定した。
【0249】
実験結果は、１．６６７ｎＭに対するデータであって、対照群として使用した抗－４－１ＢＢ抗体および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体に比べてＳ０３によるＴ細胞－媒介された細胞毒性効果に優れるものと確認された。（図１３）
【0250】
実施例１２：ＩＦＮ－γ分析
Ｔ細胞で生成されるＩＦＮ－γのレベルを細胞毒性分析（実施例１１）で得た上澄液を使用して測定した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１０１）をメーカーのプロトコルによって使用し、要約すると、捕獲抗体で終夜コートされたプレートに１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１５０μｌを１時間処理した。標準品の場合、５００ｐｇ／ｍｌから２倍ずつ７箇所希釈して使用し、上澄液は、５０倍希釈して各ウェルに１００μｌずつ２時間の間処理した。検出抗体１００μｌを１時間の間処理した後、アビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．７９００４）を１／１０００で希釈して各ウェルに１００μｌずつ３０分間処理した。ＴＭＢで発色させた後、硫酸を使用して反応を停止させた。ＴＭＢ処理後工程を除いたすべての工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、抗体コート工程を除いたすべての工程は、室温で進行した。
Ｔ細胞で生成されるＩＦＮ－γのレベルを細胞毒性分析（実施例１１）で得た上澄液を使用して測定した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１０１）をメーカーのプロトコルによって使用し、要約すると、捕獲抗体で終夜コートされたプレートに１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１５０μｌを１時間処理した。標準品の場合、５００ｐｇ／ｍｌから２倍ずつ７箇所希釈して使用し、上澄液は、５０倍希釈して各ウェルに１００μｌずつ２時間の間処理した。検出抗体１００μｌを１時間の間処理した後、アビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．７９００４）を１／１０００で希釈して各ウェルに１００μｌずつ３０分間処理した。ＴＭＢで発色させた後、硫酸を使用して反応を停止させた。ＴＭＢ処理後工程を除いたすべての工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、抗体コート工程を除いたすべての工程は、室温で進行した。
【0251】
実験結果、抗体処理濃度によってＴ細胞によるＩＦＮ－γ生産が増加することを観察することができる。（図１４）
【0252】
実施例１３：抗体－依存的細胞細胞毒性分析
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対してＩｇＧ１－Ｆｃ操作を使用して抗体－依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体－依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を減少させた。ＡＤＣＣ減少有無を確認するために、Ｓ０３を使用してＡＤＣＣ生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７０１Ａ）を遂行した。
二重特異的エピトープ結合タンパク質変異体に対してＩｇＧ１－Ｆｃ操作を使用して抗体－依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体－依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を減少させた。ＡＤＣＣ減少有無を確認するために、Ｓ０３を使用してＡＤＣＣ生物分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７０１Ａ）を遂行した。
【0253】
Ｓ０３の抗－４－１ＢＢ抗体結合によるＡＤＣＣを確認するために、白色９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４－１ＢＢ陽性細胞株（４－１ＢＢ ＮＦ－ｋＢ ＨＥＫ２９３）を分注して終夜培養した。。翌日、抗－４－１ＢＢ抗体である、Ｓ０３（操作されたＩｇＧ１、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ）、９４ｋｖｔ－ＩｇＧ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４および２０）、および９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ）を２９４ｎＭから３倍ずつ８箇所希釈して遂行した。ＡＤＣＣエフェクター細胞を添加して３７℃のインキュベーターで６時間の間インキュベーションした。以後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を添加してルミノメーター（Ｇｌｏ－ｍａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光強度を測定した。陽性対照群として使用された９４ｋｖｔ－ＩｇＧ１はＡＤＣＣを誘導する一方、陰性対照群である９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１とＳ０３はＡＤＣＣを誘導しないことを観察することができる。（図１５ａ）
【0254】
Ｓ０３のｅｕＰＤ－１によるＡＤＣＣを確認するために、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を白色９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分注して終夜培養した。翌日、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体である、Ｓ０３とアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）（Ｐｆｉｚｅｒ、ＩｇＧ１）とアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（Ｒｏｃｈｅ、操作されたＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）を５．８８ｎＭから６箇所に対して４倍ずつ希釈した。ＡＤＣＣエフェクター細胞を添加して３７℃のインキュベーターで６時間の間インキュベーションした。以後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を添加してルミノメーター（Ｇｌｏ－ｍａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光強度を測定した。陽性対照群として使用されたアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）は、ＡＤＣＣを誘導するものと認められるが、陰性対照群であるアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）とＳ０３は、ＡＤＣＣを誘導しないことを観察することができる。（図１５ｂ）
【0255】
実施例１４：補体－依存的細胞毒性分析
Ｃ１ｑ ＥＬＩＳＡを遂行してＣＤＣがＳ０３に使用された操作されたＩｇＧ１によって減少したことを確認した。
Ｃ１ｑ ＥＬＩＳＡを遂行してＣＤＣがＳ０３に使用された操作されたＩｇＧ１によって減少したことを確認した。
【0256】
９６－ウェル免疫プレート（ＮＵＮＣ）を７５ｎＭのＳ０３、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を１ｘコート緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して４℃で終夜コートした後、１ｘ分析緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１５０μｌを１時間の間添加して非－特異的結合を遮断した。ビオチン化キット（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ２０１７９５）を使用してビオチン化されたＣ１ｑ（ｃｏｍｐ Ｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０９９）タンパク質を２μｇ／ｍｌから２倍ずつ７箇所希釈して、ウェル当たり１００μｌで２時間の間処理した。次に、アビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ．７９００４）を１／１０００で希釈して、各ウェルに１００μｌずつ添加して１時間の間処理した後、ＴＭＢで発色させた後、硫酸を使用して反応を停止させた。ＴＭＢ処理後工程を除いたすべての工程で洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、抗体コート工程を除いたすべての工程は室温で進行した。陽性対照群として使用したアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）はＣ１ｑに結合するが、Ｓ０３と陰性対照群であるアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）はＣ１ｑに結合しないことを観察することができる。（図１６）
【0257】
実施例１５：インビボ効能研究１－４－１ＢＢ ＫＩ
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。
【0258】
ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞を図１７ａに図示されたように腫瘍細胞として使用し、個体当たり５×１０５腫瘍細胞を皮下に投与した。投与１週間後、腫瘍のサイズを測定して類似する平均（１００ｍｍ３以内）と標準偏差を基準に投与群を分けた。各群に対して５匹のマウスを使用した。
【0259】
Ｓ０３、Ｓ０５およびＳ０７を静脈内に注入した。賦形剤ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を陰性対照群として使用した。抗体用量を２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇに設定した。投与は１００μｌで遂行し、３日間隔で５回投与した。また腫瘍サイズも３日間隔で測定し、最後の投与後２日まで腫瘍サイズを測定した。
【0260】
腫瘍サイズ観察の結果、図１７ｂに図示されたとおり、陰性対照群に比べてＳ０３、Ｓ０５、Ｓ０７のいずれも腫瘍成長を抑制することを確認し、その中Ｓ０３の腫瘍減少効果に最も優れることが分かる。また、試験された抗体に対して用量－依存的反応が観察された。
【0261】
実施例１６：インビボ効能研究２－４－１ＢＢ ＫＩ
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。試験方法は図１７ａと同一である。
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。試験方法は図１７ａと同一である。
【0262】
Ｓ０３、抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１）、および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）を静脈内に注入した。賦形剤ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を陰性対照群として使用した。抗体用量をＳ０３を基準に５ｍｇ／ｋｇ（５．８８μＭ）に設定し、５．８８μＭの抗－４－１ＢＢ抗体および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体をまた投与した。投与は、１００μｌで遂行し、３日間隔で５回投与した。また、腫瘍サイズも３日間隔で測定し、最後の投与後２日まで腫瘍サイズを測定した。また実験終了当日に血液を採取して、血液内ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））、ＡＳＴ（アスパテートアミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））、ＢＵＮ（血清尿素窒素（ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ））の濃度を生化学的分析機を使用して確認して毒性を確認した。
【0263】
腫瘍サイズの観察結果、図１８ａに図示されたように、陰性対照群に比べてＳ０３、抗－４－１ＢＢ抗体、および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれも腫瘍成長を抑制することを確認し、そのうち、Ｓ０３の腫瘍－減少効果（約９８％減少）に最も優れることが分かる。
【0264】
図１８ｂに示されたように、血液内Ｔ細胞集団を分析した結果、血液内ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞がＳ０３によって増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞でエフェクターＴ細胞の増加が観察された。
【0265】
表４に示されたように、肝毒性指数分析結果、投与群の４種指標のいずれも正常範囲（ＡＬＴ：１７～７７Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ：５４～２９８Ｕ／Ｌ、ＢＵＮ：８～３３ｍｇ／ｄＬ）以内であり、実験条件では肝に肝毒性がないものと確認された。
【表4】
【0266】
実施例１７：インビボ効能研究３－ｈ４－１ＢＢ／ｈＰＤ－１ ＤＫＩ
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢおよびｈＰＤ－１二重ノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。
Ｓ０３の効能を検証するために、ｈ４－１ＢＢおよびｈＰＤ－１二重ノック－インマウス（背景：Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を使用してインビボ研究を遂行した。
【0267】
ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞を図１７ａに示したように腫瘍細胞として使用し、個体当たり５×１０５腫瘍細胞を皮下に投与した。投与１週間後、腫瘍のサイズを測定し、類似した平均（約１００ｍｍ３）と標準偏差を基準に投与群を分けた。各群で６匹のマウスを使用した。
【0268】
抗体Ｓ０３、抗－４－１ＢＢ抗体（９４ｋｖｔ－操作されたＩｇＧ１）、および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）を静脈内に注入した。賦形剤ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を陰性対照群として使用した。抗体用量は、Ｓ０３基準に５ｍｇ／ｋｇ（５．８８μＭ）に設定し、５．８８μＭの抗－４－１ＢＢ抗体および抗－ＰＤ－Ｌ１抗体も投与した。投与は、１００μｌで遂行し、３日間隔で５回投与した。腫瘍サイズも３日間隔で測定し、最後の投与後に２日まで腫瘍サイズを測定した。
【0269】
腫瘍サイズを観察した結果、図１９に図示したように、陰性対照群の投与に比べてＳ０３、抗－４－１ＢＢ抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のすべてで腫瘍成長が抑制されることを確認した（約７３％減少）。
【0270】
すべてのデータは、平均ＳＥＭ、一元ＡＮＯＶＡ統計検定でグラフで表示される。すべての統計は、動物当たりまたはサンプル当たりの平均データを使用して計算した。
【0271】
以上、本発明の内容の具体的な部分について説明した。このような具体的な説明は、当業者において好ましい実施形態に過ぎず、本発明の範囲がこれに限定されるものではないことは自明である。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって定義されるものと意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-C】
【図6D-F】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】