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特表2024-502387核酸を検出するための方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-18

(54)【発明の名称】核酸を検出するための方法

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/6844 20180101AFI20240111BHJP

C12Q 1/6876 20180101ALI20240111BHJP

C12N 15/09 20060101ALN20240111BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6876 Z ZNA

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565125

(86)(22)【出願日】2022-01-05

(85)【翻訳文提出日】2023-08-29

(86)【国際出願番号】 US2022011241

(87)【国際公開番号】W WO2022150336

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】63/199,515

(32)【優先日】2021-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523256225

【氏名又は名称】マーチ・セラピューティクス，インコーポレーテッド

(71)【出願人】

【識別番号】523256236

【氏名又は名称】ディーエックスラボ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰寿孝

(72)【発明者】

【氏名】ファルザードファード，ファヒム

(72)【発明者】

【氏名】ワッシー，アスママウ

(72)【発明者】

【氏名】カング，ジョン・ソク

(72)【発明者】

【氏名】スーク，ホ－ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ヴォデナル，ケイラ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】ミン，ジャンホン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ06

4B063QQ10

4B063QR08

4B063QR39

4B063QR40

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS26

4B063QS36

(57)【要約】

本発明は、等温核酸増幅を使用した、生物学的または環境学的試料中におけるウイルスまたは細菌などの生物の、迅速、低費用、臨床現場の検出のための方法、キット、および関連組成物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料または前記試料を含む器具を、緩衝剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、および非イオン性界面活性剤を含む溶解緩衝液と接触させて、溶解試料を生成することによって、生体試料を化学的溶解に供するステップと、
前記溶解試料を、
生物の核酸である第１の標的核酸に向けられた、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の組、ヒト対象の核酸である第２の標的核酸に向けられた、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組、
増幅された標的核酸の独立検出に適切な少なくとも２つの異なる試薬、
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物、マグネシウムイオン供給源、任意選択の逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼまたは二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ、
を含む反応混合物中で行う等温核酸増幅反応に供するステップと
増幅された標的核酸の検出のための前記少なくとも２つの異なる試薬のそれぞれからのシグナルを検出することによって、前記反応混合物中の増幅された標的核酸を検出するステップとを含み、
少なくとも２つの異なるシグナルの検出が前記試料中の前記生物の存在を示す、
ヒト対象の生体試料中において生物を検出する方法。

【請求項2】

前記等温核酸増幅が、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）またはＲＴ－ＬＡＭＰ反応である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

増幅された標的核酸の独立検出に適切な前記少なくとも２つの異なる試薬が、クエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた少なくとも１つの検出プライマー組を含み、前記検出プライマー組が、前記第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第２の標的核酸が、ヒト細胞中で構成的に発現されるヒト遺伝子のポリヌクレオチドであり、任意選択でＲＮａｓｅＰまたはベータ－アクチンのＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記増幅された標的核酸の検出のための前記１つまたは複数の試薬が、ＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩ、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、およびＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅからなる群から任意選択で選択される蛍光ＤＮＡ挿入色素を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記反応混合物が、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩などの還元剤、ならびにウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記反応混合物を凍結乾燥させ、本方法は、前記反応混合物を一定体積の水溶液中で再構成するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記凍結乾燥した反応混合物が、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記等温核酸増幅反応が、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、または７２℃の一定温度で起こる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

１０～４５分間の一定期間以内で行う、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記等温核酸増幅反応を行う前に、１つまたは複数の追加のステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、前記１つまたは複数の追加のステップが、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップ、および／または熱処理のうちの１つまたは複数を含む、方法。

【請求項12】

前記清澄化ステップが、約１０，０００～１００，０００×ｇ、または１０，０００～２０，０００×ｇ、または１４，０００～１５，０００×ｇの速度で５～２０分間の遠心分離を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記清澄化ステップが、約１ｋＤａ～３００ｋＤａ、好ましくは３ｋＤａ～２００ｋＤａ、最も好ましくは１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を含むフィルターを通した限外濾過を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＮａｓｅ阻害剤がポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタン、およびｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドから選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記熱処理が、前記試料を約９５℃まで、３０秒間～１０分間、好ましくは３０秒間～５分間、最も好ましくは１分間～３分間の一定期間の間加熱するステップを含む、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記標的核酸が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物から選択される生物の、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記標的核酸がウイルスのものである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ウイルスがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組が、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）、または、セット１の配列番号１～４、セット２の配列番号７～１０、セット３の配列番号７、１３、９、および１４、もしくはセット４の配列番号７～１０ならびに配列番号１６および１７によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記生体試料が上気道試料であり、任意選択で、前記上気道試料が、上咽頭（ＮＰ）スワブ、口咽頭（ＯＰ）スワブ、鼻腔スワブ、鼻腔吸引液、または鼻腔洗浄液から得られ、さらに任意選択で、鼻腔スワブが前鼻腔スワブまたは中鼻甲介鼻腔スワブである、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ヒト対象から得られた上気道試料中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する方法であって、前記試料を逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）に供して、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組を利用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の標的核酸を増幅するステップと、前記増幅された第１の標的核酸を検出するステップとを含み、前記増幅された第１の標的核酸の検出が、前記生体試料中における前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を示す、方法。

【請求項24】

前記ＲＴ－ＬＡＭＰ反応が、オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１の組と、前記ヒト対象の核酸である第２の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組とを含む反応混合物中で行われ、任意選択で、前記第２の標的核酸がベータ－アクチンＲＮＡ分子のポリヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記反応混合物が、クエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた検出プライマー組をさらに含み、前記検出プライマー組が、前記第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記反応混合物が、前記検出プライマー中のフルオロフォアとは異なる波長で蛍光シグナルを発する蛍光ＤＮＡ挿入色素をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記反応混合物が、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物、マグネシウムイオン供給源、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたは二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩などの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記反応混合物を凍結乾燥させ、本方法は、前記反応混合物を一定体積の水溶液中で再構成するステップをさらに含み、任意選択で、前記凍結乾燥した反応混合物が、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出のためのキットであって、
試料の溶出および溶解のための第１の試薬の組を含む第１の容器と、
逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を行うための第２の試薬の組を含む第２の容器と
を含み、
前記第２の試薬の組が、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第１の組と、ヒト対象の第２の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組とを含み、任意選択で、前記第２の標的核酸がベータ－アクチンＲＮＡ分子のポリヌクレオチドである、
キット。

【請求項30】

前記第１の試薬の組がＲＮａｓｅ阻害剤をそれぞれ含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

前記第２の試薬の組が、ＲＮａｓｅ阻害剤、ｄＵＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２９または３０に記載のキット。

【請求項32】

前記第２の試薬の組が、蛍光ＤＮＡ挿入剤およびクエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた検出プライマー組をさらに含み、前記検出プライマー組が、前記第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

前記第２の試薬の組が、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩などの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項34】

前記第２の試薬の組が凍結乾燥されている、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項35】

前記第２の試薬の組が、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項３４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[01]本開示は、病原体関連核酸を生物学的または環境学的試料中で直接、迅速検出するための方法およびキットに関する。
関連出願
[02]本出願は、その内容全体が、その全体で本明細書中に参照により組み込まれている、２０２１年１月５日に出願の米国仮出願第６３／１９９，５１５号の優先権の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）の下、主張するものである。
配列表の参照による組込み
[03]２０２１年１２月２８日に作成された、４，０９６バイトのサイズである、「０５７９３０－５０１００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の配列表テキストファイルの内容は、その全体で本明細書中に参照により組み込まれている。

【背景技術】

【0002】

[04]２０１９年に、重症急性呼吸器症候群－ＣｏＶ－２ｓ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と命名された新型コロナウイルスが、全世界的な流行病を引き起こしているコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と命名された重篤な急性呼吸器感染症の原因物質として同定された。対象中におけるウイルスの存在は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＲＮＡゲノムの検出によって決定される。ＣＯＶＩＤ－１９の大流行と十分に闘って社会を再開するために、良好な性能特徴（たとえば感度および特異性）を有し、自宅を含む任意の低設備設定において操作することができる迅速な臨床現場（ＰＯＣ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験が必要である。

【0003】

[05]現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の拡大を検出およびモニタリングするための多数の診断的試験が開発されている。しかし、米国では、疾病管理センター（ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ、ＣＤＣ）に認定されたほとんどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）診断的試験は、研究室においてのみ有効に行うことができ、およそ４～６時間の応答時間を有し、輸送要件が原因で結果は試料採取から２４時間よりも後まで遅延する場合がある。現在の技術で高感度の検出を達成するために、ウイルスＲＮＡを試料から抽出および精製しなければならず、このことは、これらの方法を真にＰＯＣの応用に不適切にしている。さらに、ＲＴ－ｑＰＣＲに依存する方法は、熱サイクラーおよび比較的高価な試薬、ならびに高レベルの技術的専門知識を必要とし、これは低設備設定およびＰＯＣにおいて利用可能でない場合があり、したがって、これらの試験の広範な使用が妨げられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

[06]したがって、拡張性があり、手頃な料金であり、使用が容易なＰＯＣ試験が、依然として、ＣＯＶＩＤ－１９に対して闘うための差し迫った必要性を有する。本発明はこの必要性に取り組む。

【課題を解決するための手段】

【0005】

[07]本発明は、対象、好ましくはヒト対象の生体試料中において生物を検出するための、方法および関連組成物およびキットを提供する。実施形態では、本方法は、試料または試料を含む器具を、緩衝剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、および非イオン性界面活性剤を含む溶解緩衝液と接触させて、溶解試料を生成することによって、生体試料を化学的溶解に供するステップと、溶解試料を、（ｉ）生物の核酸である第１の標的核酸に向けられた、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の組、（ｉｉ）ヒト対象の核酸である第２の標的核酸に向けられた、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組、（ｉｉｉ）増幅された標的核酸の独立検出に適切な少なくとも２つの異なる試薬、（ｉｖ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物、（ｖ）マグネシウムイオン供給源、（ｖｉ）任意選択の逆転写酵素、および（ｖｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたは二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中で行う等温核酸増幅反応に供するステップと、増幅された標的核酸の検出のための少なくとも２つの異なる試薬のそれぞれからのシグナルを検出することによって、反応混合物中の増幅された標的核酸を検出するステップとを含み、少なくとも２つの異なるシグナルの検出が試料中の生物の存在を示す。実施形態では、少なくとも２つの異なるシグナルの検出は、５～３０分間の一定期間以内に起こる。

【0006】

[08]本発明のコンテキストにおいて、用語「溶解試料」とは、試料、またはアプリケーターもしくはスワブなどの試料を含有する採取器具を、化学的溶解のための試薬を含む緩衝液と接触させることによって得られた、溶解試料をいう。

【0007】

[09]実施形態では、等温核酸増幅は、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）またはＲＴ－ＬＡＭＰ反応である。

【0008】

[10]実施形態では、増幅された標的核酸の独立検出に適切な少なくとも２つの異なる試薬は、クエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた少なくとも１つの検出プライマー組を含み、検出プライマー組は、第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている。実施形態では、増幅された標的核酸の独立検出に適切な少なくとも２つの異なる試薬は、それぞれクエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた２組の検出プライマーを含み、それぞれのフルオロフォアは、異なる波長のシグナルを発し、それぞれの検出プライマー組は、異なる標的核酸に向けられている。

【0009】

[11]実施形態では、第２の標的核酸は、ヒト細胞中で構成的に発現されるヒト遺伝子のポリヌクレオチドである。実施形態では、ヒト遺伝子は、アクチン遺伝子、ユビキチン遺伝子、または他の適切なハウスキーピング遺伝子から選択される。実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＰまたはベータ－アクチンのＤＮＡまたはＲＮＡである。

【0010】

[12]実施形態では、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、ＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩ、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、およびＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅからなる群から任意選択で選択される蛍光ＤＮＡ挿入色素を含む。

【0011】

[13]実施形態では、反応混合物は、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン（たとえばウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む。

【0012】

[14]実施形態では、反応混合物を凍結乾燥させる。実施形態では、本方法は、反応混合物を一定体積の水溶液中で再構成するステップをさらに含む。実施形態では、凍結乾燥した反応混合物を再構成するために利用する水溶液は、本明細書中に記載の溶解試料を含む。実施形態では、反応混合物は、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含む。実施形態では、反応混合物は、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数を含む。

【0013】

[15]実施形態では、等温核酸増幅反応は、６０～７５℃、または約６０～７２℃、または好ましくは６３～６９℃、または約６４～６９℃の範囲の温度から選択される一定温度で起こる。たとえば、核酸増幅は、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、または７２℃の温度で起こる。

【0014】

[16]実施形態では、本方法は、１０～３０分間の一定期間以内で行う。

【0015】

[17]実施形態では、本方法は、等温核酸増幅反応を行う前に１つまたは複数の追加のステップをさらに含み、１つまたは複数の追加のステップは、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップ、化学的溶解ステップ、ならびに／または熱処理のうちの１つまたは複数を含む。実施形態では、本方法は化学的溶解ステップを含む。

【0016】

[18]実施形態では、清澄化ステップは、約１０，０００～１００，０００×ｇ、または１０，０００～２０，０００×ｇ、または１４，０００～１５，０００×ｇの速度で５～２０分間の遠心分離を含む。

【0017】

[19]実施形態では、清澄化ステップは、約１ｋＤａ～３００ｋＤａ、好ましくは３ｋＤａ～２００ｋＤａ、最も好ましくは１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を含むフィルターを通した限外濾過を含む。

【0018】

[20]実施形態では、化学的溶解は、試料を溶解緩衝液と接触させるステップを含み、任意選択で、溶解緩衝液は、ＲＮａｓｅ阻害剤、任意選択でポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）を含む。

【0019】

[21]実施形態では、溶解緩衝液は、非イオン性界面活性剤、塩酸グアニジン、およびチオシアン酸グアニジンから選択される溶解試薬を含む。実施形態では、溶解試薬は非イオン性界面活性剤である。実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）－フェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）もしくはＴｗｅｅｎ８０などの同様のＴｗｅｅｎ（商標）洗剤等のポリソルベート型非イオン性界面活性剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドから選択される。

【0020】

[22]実施形態では、熱処理は、試料を約９５℃まで、３０秒間～１０分間、好ましくは３０秒間～５分間、最も好ましくは１分間～３分間の一定期間の間加熱するステップを含む。

【0021】

[23]実施形態では、標的核酸は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物から選択される生物の、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。

【0022】

[24]実施形態では、標的核酸はウイルスのものである。

【0023】

[25]実施形態では、ウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から選択される。

【0024】

[26]実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である。

【0025】

[27]実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組は、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される。ウイルスがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である本方法の実施形態では、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、表１に記載の配列識別子によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群（ループＦおよびループＢのプライマーは非存在）、すなわち、セット１の配列番号１～４、セット２の配列番号７～１０、セット３の配列番号７、１３、９、および１４、またはセット４の配列番号７～１０ならびに配列番号１６および１７から選択される。実施形態では、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの遺伝子Ｎまたは遺伝子Ｍとハイブリダイズする。

【0026】

[28]実施形態では、生体試料は上気道試料であり、任意選択で、上気道試料は、上咽頭（ＮＰ）スワブ、口咽頭（ＯＰ）スワブ、鼻腔スワブ、鼻腔吸引液、または鼻腔洗浄液から得られ、さらに任意選択で、鼻腔スワブは前鼻腔スワブまたは中鼻甲介鼻腔スワブである。

【0027】

[29]ヒト対象から得られた上気道試料中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する方法であって、試料を逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）に供して、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組を利用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の標的核酸を増幅するステップと、増幅された第１の標的核酸を検出するステップとを含み、増幅された第１の標的核酸の検出が、生体試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を示す、方法も提供する。

【0028】

[30]実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の組と、ヒト対象の核酸である第２の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組とを含む反応混合物中で行われ、任意選択で、第２の標的核酸は、ベータ－アクチンまたはＲＮａｓｅＰのＲＮＡまたはＤＮＡである。

【0029】

[31]実施形態では、反応混合物は、クエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた検出プライマー組をさらに含み、検出プライマー組は、第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている。

【0030】

[32]実施形態では、反応混合物は、検出プライマー中のフルオロフォアとは異なる波長で蛍光シグナルを発する蛍光ＤＮＡ挿入色素をさらに含む。

【0031】

[33]実施形態では、反応混合物は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物、マグネシウムイオン供給源、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼまたは二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む。

【0032】

[34]実施形態では、反応混合物を凍結乾燥させ、本方法は、反応混合物を一定体積の水溶液中で再構成するステップをさらに含む。実施形態では、水溶液は、本明細書中に記載の溶解試料を含み、任意選択で、凍結乾燥した反応混合物は、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数を含む。実施形態では、凍結乾燥した反応混合物は、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数を含む。

【0033】

[35]（ｉ）試料の溶出および溶解のための第１の試薬の組を含む第１の容器と、（ｉｉ）逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を行うための第２の試薬の組を含む第２の容器とを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出のためのキットも提供する。実施形態では、第２の試薬の組は、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第１の組と、ヒト対象の第２の標的核酸に向けられたオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組とを含む。実施形態では、第２の標的核酸は、ヒト細胞中で構成的に発現されるヒト遺伝子のポリヌクレオチドである。実施形態では、ヒト遺伝子は、アクチン遺伝子、ユビキチン遺伝子、または他の適切なハウスキーピング遺伝子から選択される。実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＰまたはベータ－アクチンのＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。実施形態では、第１の試薬の組は、ＲＮａｓｅ阻害剤および化学的溶解試薬を含む。実施形態では、第２の試薬の組は、ｄＵＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。実施形態では、第２の試薬の組は、蛍光ＤＮＡ挿入剤およびクエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた検出プライマー組をさらに含み、検出プライマー組は、第１または第２の標的核酸のどちらかに向けられている。実施形態では、第２の試薬の組は、それぞれクエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた２組の検出プライマーを含み、それぞれのフルオロフォアは、異なる波長のシグナルを発し、それぞれの検出プライマー組は、異なる標的核酸に向けられている。実施形態では、第２の試薬の組は、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンおよびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数を含む。実施形態では、第２の試薬の組を凍結乾燥させる。実施形態では、第２の試薬の組は、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含む。実施形態では、第２の試薬の組は、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1A】[36]図１Ａ～Ｃ：（Ａ）試験プライマーセットｉ～ｖｉｉｉ（プライマーセット１を矢印によって示す）、（Ｂ）プライマーセットｉｘ～ｘｖｉ（プライマーセット２を矢印によって示す）、および（Ｃ）プライマーセット３、のＲＴ－ＬＡＭＰ増幅プロファイルを示す線プロットである。ｙ軸は、相対的蛍光単位として測定した、増幅された生成物を示し、ｘ軸は、０～１２０の１分間サイクルの数を示す。プライマーセット１、２、および３のＣｑ値はそれぞれ４２、３７、および３５であった。Ｃｑ値は、最大半減高さに到達するまでに必要な時間である。

【図1B】図１Ａ～Ｃ：（Ａ）試験プライマーセットｉ～ｖｉｉｉ（プライマーセット１を矢印によって示す）、（Ｂ）プライマーセットｉｘ～ｘｖｉ（プライマーセット２を矢印によって示す）、および（Ｃ）プライマーセット３、のＲＴ－ＬＡＭＰ増幅プロファイルを示す線プロットである。ｙ軸は、相対的蛍光単位として測定した、増幅された生成物を示し、ｘ軸は、０～１２０の１分間サイクルの数を示す。プライマーセット１、２、および３のＣｑ値はそれぞれ４２、３７、および３５であった。Ｃｑ値は、最大半減高さに到達するまでに必要な時間である。

【図1C】図１Ａ～Ｃ：（Ａ）試験プライマーセットｉ～ｖｉｉｉ（プライマーセット１を矢印によって示す）、（Ｂ）プライマーセットｉｘ～ｘｖｉ（プライマーセット２を矢印によって示す）、および（Ｃ）プライマーセット３、のＲＴ－ＬＡＭＰ増幅プロファイルを示す線プロットである。ｙ軸は、相対的蛍光単位として測定した、増幅された生成物を示し、ｘ軸は、０～１２０の１分間サイクルの数を示す。プライマーセット１、２、および３のＣｑ値はそれぞれ４２、３７、および３５であった。Ｃｑ値は、最大半減高さに到達するまでに必要な時間である。

【図2A】[37]図２Ａ～Ｂ：プライマーセット１（Ａ）およびプライマーセット３（Ｂ）について、他の呼吸器ウイルスに対するＲＴ－ＬＡＭＰＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの交差反応性を示す図である。それぞれの反応を４つの複製組で行った。初期増幅（パネルＡのサイクル１５～２５およびパネルＢのサイクル２５～３５）を示す、それぞれのパネル中の４本の線は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増幅プロファイルを表す。ｙ軸は、相対的蛍光単位として測定した、増幅された生成物を示し、ｘ軸は、０～９０の１分間サイクルの数を示す。プライマーセット１および３のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的増幅を実証し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料を他の呼吸器ウイルスから識別することを可能にした。

【図2B】図２Ａ～Ｂ：プライマーセット１（Ａ）およびプライマーセット３（Ｂ）について、他の呼吸器ウイルスに対するＲＴ－ＬＡＭＰＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの交差反応性を示す図である。それぞれの反応を４つの複製組で行った。初期増幅（パネルＡのサイクル１５～２５およびパネルＢのサイクル２５～３５）を示す、それぞれのパネル中の４本の線は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増幅プロファイルを表す。ｙ軸は、相対的蛍光単位として測定した、増幅された生成物を示し、ｘ軸は、０～９０の１分間サイクルの数を示す。プライマーセット１および３のそれぞれは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的増幅を実証し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料を他の呼吸器ウイルスから識別することを可能にした。

【図3】[38]図３：溶解ステップを用いたＲＴ－ＬＡＭＰによる、不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子の検出限界（ＬＯＤ）を示す図である。唾液およびＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標）を含有する通常生理食塩水に５０個（左のひげプロット、淡色）または１００個（右のひげプロット、より濃い色）のビリオン／１マイクロリットルの不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンのいずれかを添加し、その後、試料をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）緩衝液（３分間、９５℃）中に溶解させた。溶解試料はＲＴ－ＬＡＭＰ反応において鋳型として使用した。

【図4】[39]図４：遠心濾過が、ＲＴ－ＬＡＭＰを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出の感度の増加を可能にすることを示す図である。プロットは、生理食塩水試料中に添加した１０個（左のひげプロット、淡色）または２０個（右のひげプロット、濃い色）のビリオン／１マイクロリットルの不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンのいずれか（ｎ＝３、ｓ．ｔ．ｄ）を用いた、濾過あり（右の箱）または濾過なし（左の箱）のＲＴ－ＬＡＭＰの性能を示す。唾液およびリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標））を含有する通常の生理食塩水に様々な濃度の不活性化ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ビリオンを添加し、その後、試料をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ緩衝液中の熱処理（３分間、９５Ｃ）によって溶解させた。溶解試料はＲＴ－ＬＡＭＰ反応において鋳型として使用した。

【図5】[40]図５：遠心濾過ステップなしのアッセイ（それぞれの対の右のバー）と比較した、遠心濾過ステップを行ったアッセイ（それぞれの対の左のバー）についてのＣｔ時間（分）を示す、ＲＴ－ＬＡＭＰによる不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子の検出限界（ＬＯＤ）を示す図である。唾液およびリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標））を含有する通常の生理食塩水に、１個のコピー／μｌ、５個のコピー／μｌ、および２０個のコピー／μｌに対応する濃度の不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンを添加した。鋳型なしの対照（ＮＴＣ）を陰性対照として使用した。エラーバーは、４つの複製組の標準偏差を示す。これらの結果は、濾過ステップをプロトコル内に組み入れることによってＬｏＤ＝１個のコピー／μｌを達成できることを示す。

【図6】[41]図６：緩衝液チューブ（Ａ）、滅菌スワブ（Ｂ）、ならびにホールピペット（Ｃ１）およびチューブアセンブリ（Ｃ２）を含有する試験パウチ（Ｃ）を含む試験キットの代表的な構成要素を示す図である。

【図7A】[42]図７Ａ～Ｄ：鼻腔スワブ試料ありまたはなしの、陰性および陽性試料の増幅曲線を示す図である。Ａ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。Ｂ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。２６分以内にＦＡＭおよびＨＥＸチャネル増幅の両方の非存在は、試料中のウイルスの非存在を示す。Ｃ、鼻腔スワブ試料ありでは、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ベータアクチンおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全体的な存在を表す。Ｄ、鼻腔スワブ試料ありでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）およびＨＥＸチャネル増幅が遅いまたはないことは、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがない鼻腔スワブ試料を示す。Ｔ_ｄ：本発明者らの試験アルゴリズムによって、試験を「陽性」または「陰性」と呼ぶ判断が下される時点、ＦＡＭ：ピーク吸収波長４９５ｎｍおよびピーク発光波長５２０ｎｍを有するフルオロフォア、ＨＥＸ：ピーク吸収波長５３５ｎｍおよびピーク発光波長５５６ｎｍを有するフルオロフォア。

【図7B】図７Ａ～Ｄ：鼻腔スワブ試料ありまたはなしの、陰性および陽性試料の増幅曲線を示す図である。Ａ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。Ｂ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。２６分以内にＦＡＭおよびＨＥＸチャネル増幅の両方の非存在は、試料中のウイルスの非存在を示す。Ｃ、鼻腔スワブ試料ありでは、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ベータアクチンおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全体的な存在を表す。Ｄ、鼻腔スワブ試料ありでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）およびＨＥＸチャネル増幅が遅いまたはないことは、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがない鼻腔スワブ試料を示す。Ｔ_ｄ：本発明者らの試験アルゴリズムによって、試験を「陽性」または「陰性」と呼ぶ判断が下される時点、ＦＡＭ：ピーク吸収波長４９５ｎｍおよびピーク発光波長５２０ｎｍを有するフルオロフォア、ＨＥＸ：ピーク吸収波長５３５ｎｍおよびピーク発光波長５５６ｎｍを有するフルオロフォア。

【図7C】図７Ａ～Ｄ：鼻腔スワブ試料ありまたはなしの、陰性および陽性試料の増幅曲線を示す図である。Ａ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。Ｂ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。２６分以内にＦＡＭおよびＨＥＸチャネル増幅の両方の非存在は、試料中のウイルスの非存在を示す。Ｃ、鼻腔スワブ試料ありでは、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ベータアクチンおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全体的な存在を表す。Ｄ、鼻腔スワブ試料ありでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）およびＨＥＸチャネル増幅が遅いまたはないことは、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがない鼻腔スワブ試料を示す。Ｔ_ｄ：本発明者らの試験アルゴリズムによって、試験を「陽性」または「陰性」と呼ぶ判断が下される時点、ＦＡＭ：ピーク吸収波長４９５ｎｍおよびピーク発光波長５２０ｎｍを有するフルオロフォア、ＨＥＸ：ピーク吸収波長５３５ｎｍおよびピーク発光波長５５６ｎｍを有するフルオロフォア。

【図7D】図７Ａ～Ｄ：鼻腔スワブ試料ありまたはなしの、陰性および陽性試料の増幅曲線を示す図である。Ａ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。Ｂ、鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。遅いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される。２６分以内にＦＡＭおよびＨＥＸチャネル増幅の両方の非存在は、試料中のウイルスの非存在を示す。Ｃ、鼻腔スワブ試料ありでは、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ベータアクチンおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全体的な存在を表す。Ｄ、鼻腔スワブ試料ありでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す。速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）およびＨＥＸチャネル増幅が遅いまたはないことは、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがない鼻腔スワブ試料を示す。Ｔ_ｄ：本発明者らの試験アルゴリズムによって、試験を「陽性」または「陰性」と呼ぶ判断が下される時点、ＦＡＭ：ピーク吸収波長４９５ｎｍおよびピーク発光波長５２０ｎｍを有するフルオロフォア、ＨＥＸ：ピーク吸収波長５３５ｎｍおよびピーク発光波長５５６ｎｍを有するフルオロフォア。

【図8】[43]図８：検出限界（ＬＯＤ）研究を示す図である。範囲発見実験を、１５００、３０００、および６０００個のウイルスコピー／スワブについて行った。１５００個のコピー／スワブの試料で１つ、および３０００個のコピー／スワブの試料で１つが、ＨＥＸチャネルＴ_ｄ＞２６分を有し、これは、本発明者らの試験アルゴリズムによって「陰性」と呼ばれる。２３個のうち２２個の複製組が本発明者らの試験アルゴリズムによって「陽性」と正しく呼ばれた後に、３０００個のコピー／スワブがＬＯＤであると決定された（＞９５％、閾値は米国食品医薬品局によって設定）。Ｔ_ｄ：本発明者らの試験アルゴリズムによって、試験を「陽性」または「陰性」と呼ぶ判断が下される時点、ＦＡＭおよびＨＥＸは上記図７の凡例中に定義した通りである。

【発明を実施するための形態】

【0035】

[44]本開示は、等温核酸増幅反応および生物の核酸、たとえば生物の特定のＲＮＡまたはＤＮＡ分子に向けられた少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、病原体、たとえば、ウイルス、細菌、または他の病原体などの生物の、生物学的または環境学的試料中での直接の迅速検出に適した方法および関連組成物を提供する。さらに、本方法は、蛍光発生ＤＮＡ挿入色素などの検出可能なＤＮＡ挿入剤と、標的配列の増幅の際に蛍光などの検出可能なシグナルを生じる１組または複数組の検出プライマーとの組合せを使用した、単一の反応混合物中の２つ以上の増幅された核酸標的の同時検出を提供する。本明細書に記載する本方法の実施形態では、本方法は、生物の核酸の検出、およびアクチンＲＮＡまたは類似の遍在的に発現されるヒトＲＮＡなどのヒト核酸の同時検出を提供する。

【0036】

[45]本明細書に記載する方法は、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）、高性能ＬＡＭＰ（ＨＰ－ＬＡＭＰ）、逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）などの等温核酸増幅反応、および以下に記載の他の同様の反応、ならびに適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、１つまたは複数の標的核酸の、オリゴヌクレオチドに導かれた増幅を含む。このコンテキストにおいて、「プライマー」とは、その配列または配列の特定の部分が標的核酸と相補的であり、したがってワトソン－クリック塩基対合を介してそれとハイブリダイズする、短い、通常は約１５～６０個のヌクレオチドの長さ（または約１５～２５個のヌクレオチドの長さ）の、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列をいう。たとえば、ＬＡＭＰ反応のコンテキストにおいて、順方向内部プライマー（ＦＩＰ）および逆方向内部プライマー（ＢＩＰ）のプライマーは、標的核酸に対して相補的でない架橋領域を含有することが理解されよう。本明細書に記載する方法のコンテキストにおいて、標的核酸「に向けられた」プライマーとは、標的核酸の配列に対して相補的なものであり、「プライマーセット」とは、増幅されている標的核酸配列の逆末端での互いに向かうＤＮＡの伸長を指示することを標的とした、一対のプライマーをいう。

【0037】

[46]「検出プライマー」とは、標的核酸の増幅産物を検出するために有用な検出可能なシグナルを生じるプライマーをいう。好ましい実施形態では、検出プライマーは、鎖分離の際に蛍光シグナルを発し、それによって、プライマーによって標的とされる核酸の増幅産物の検出を可能にする、クエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させたＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰプライマーからなる。これらの修飾されたプライマーは「ＤＡＲＱ」プライマー（「クエンチングの開放による増幅の検出（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＲｅｌｅａｓｉｎｇｏｆＱｕｅｎｃｈｉｎｇ）」）と呼ばれ、ＴａｎｎｅｒＮＡら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０１２）５３：８１～８９中に記載されている。手短に述べると、ＤＡＲＱプライマーセットは、一方が長く他方が短い、一対のオリゴヌクレオチドプライマーからなる。長い方のプライマーは約３０～６０個のヌクレオチドの長さであり、短い方のプライマーは約１５～３０個のヌクレオチドの長さである。短い方のプライマーは長い方のプライマーに対して完全に相補的であり、短い方のプライマーに対して相補的でない、長い方のプライマーの一部分は、標的核酸、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡの一部分に対して相補的である。それぞれのＤＡＲＱプライマーは、オリゴヌクレオチド配列の逆末端上で、フルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかで修飾されている（たとえば、長い方のプライマーでは５’末端にフルオロフォア、短い方のプライマーでは３’末端にクエンチャー）。この立体配置は、プライマーが二重ヘリックスとして一緒に塩基対合されている場合に、フルオロフォアおよびクエンチャーを互いに近接させて保つ。この立体配置では、クエンチャーは、フルオロフォアが検出可能なシグナルを発することを妨げる。ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰ増幅が起こるにつれて、長い方のＤＡＲＱプライマーが増幅産物内に取り込まれ、短い方のＤＡＲＱプライマーが長い方のプライマーから追放されてフルオロフォアをクエンチャーから離し、フルオロフォアが検出可能なシグナルを発することが可能となる。実施形態では、本方法において、ＤＡＲＱプライマーは、それが対となっているプライマーセット、たとえば表１中に記載のプライマーセット４の増幅の成功を特異的に同定するために使用する。

【0038】

[47]本明細書に記載する本方法の実施形態では、たとえば２つの異なる標的核酸の増幅を検出するために、複数の検出プライマー組を使用し得る。そのような実施形態に従って、それぞれの異なる検出プライマー組は、それぞれの増幅された標的核酸の独立検出を提供するために、同じアッセイ中の任意のその他の検出プライマー組の波長とは異なる波長で、比色または蛍光シグナルなどのシグナルを発する。一部の実施形態では、１組または複数組の蛍光検出プライマーが存在する場合、それぞれの独立シグナルの同時検出が達成されるように、それぞれは、反応中に含まれる任意の蛍光発生ＤＮＡ挿入色素によって発せられる波長とも異なる波長のシグナルを発する。複数の増幅された標的核酸の同時検出は、たとえば構成的に発現されたヒト遺伝子の検出によって、アッセイの忠実度のための内部対照を含む選択肢を有利に提供する。たとえば、十分な量のヒト細胞物質が、試験する生体試料中に採取されていたことを確実にするために、ヒトＲＮＡを標的とする第２のプライマーセットが含まれ得る。実施形態では、第２のプライマーセットは、ヒト「ハウスキーピング」遺伝子、またはヒト細胞中において比較的高い存在量で構成的に発現される他のヒト遺伝子のＲＮＡを標的とする。これにより、採取したすべての生体試料が病原体の試験および診断のために十分な遺伝物質を含有することが確実となり、たとえば生体試料の過小採取から生じる偽陰性結果を減らす役割を果たす。

【0039】

[48]有利なことに、本明細書中に記載する方法は、シリカマトリックスを用いた固相抽出などの標準の核酸精製ステップ、またはフェノール－クロロホルム抽出もしくは冷アルコール沈降のステップの必要なしに実施することができる。その代わりに、生体試料から得られた細胞の化学的溶解に次いで、たとえば、スワブなどの採取器具の先端を、試料の溶出および溶解のための緩衝液中に入れて、本明細書中に記載の溶解試料を生成することによって、等温核酸増幅反応を行うことができる。実施形態では、溶出および溶解緩衝液は、界面活性剤、好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシド等の非イオン性界面活性剤；緩衝剤、たとえば、トリス、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥ、ＴＥＳ、またはトリシン；ＲＮａｓｅ阻害剤、たとえばポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）を含む。一部の実施形態では、本方法は、等温核酸増幅の前に、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップを含む。

【0040】

[49]本明細書中で使用する用語「検出すること」および「検出」とは、定量的および／または定性的な決定を含む。この用語は、純粋に観念的なステップを排除し、その代わりに、試料中における生物（たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の存在を決定するための１つまたは複数の研究室アッセイの使用をいうことを意図する。そのような方法としては、たとえば試料中の増幅された標的核酸の量を含む、試料中の、核酸、たとえばＲＮＡもしくはＤＮＡの量、またはタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドの量などの分析物の量を決定するためのコンピュータ支援ステップを挙げ得る。

【0041】

[50]一部の実施形態では、試料中の標的核酸の検出は指定した検出限界（ＬＯＤ）を有する。本明細書に記載する方法のコンテキストにおいて、ＬＯＤとは、反復測定の９５％以上において検出することができる標的核酸の最も低い濃度である。一般的に認められている標準に従って、ＬＯＤは、ゲノムＲＮＡもしくはＤＮＡのコピー数／マイクロリットルの輸送培地、または具体的な実施形態では、ウイルスゲノムＲＮＡのコピー数／マイクロリットルの輸送培地（コピー数／μＬ）の単位で記載し得る。臨床応用には、ＬＯＤは、好ましくは、０．１～１０個のコピー／μＬもしくは約０．１～１個のコピー／μＬ（または約１００～１０，０００もしくは１００～１，０００個のコピー／ミリリットル）の範囲である。本明細書に記載する一部の実施形態では、ＬＯＤは、単位体積あたり、または反応あたりのゲノムＲＮＡまたはウイルス粒子のコピー数として定義し得る。一部の態様では、ＬＯＤは、「ゲノム当量」に関して記載してよく、これは、すべての遺伝子が存在することを保証するために精製試料中に存在する必要がある、ＤＮＡの量として定義される。他の実施形態では、ＬＯＤは、核酸に基づく増幅試験（ＮＡＡＴ）で検出可能な単位（ＮＤＵ）／ミリリットルの試料に関して定義し得る。一部の実施形態では、ＮＤＵは、約１０～２０００、５０～５００、または１００～３００ＮＤＵ／ｍｌの試料である。他の実施形態では、ＮＤＵ／ｍＬは、約６００～１８００、または１８００ＮＤＵ／ｍＬより高い。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のものなどの小さい大きさのウイルスゲノムでは、ＬＯＤおよびＮＤＵは本質的に等しい。

【0042】

[51]特定の実施形態では、本明細書に記載する方法は、約９０％～約１００％、好ましくは約９５％～約１００％、最も好ましくは少なくとも約９７％の感度を有する。本明細書中で使用する「感度」とは、核酸検出方法によって陽性として同定された陽性対照試料（すなわち、特定の標的核酸を含有することが知られている試料）の数として定義する（たとえば、３０個のうち２９個の陽性対照試料が核酸検出方法によって陽性として同定される場合、前記検出方法は９７％の感度を有する）。

【0043】

[52]実施形態では、本明細書中に記載する方法は、約９０％～約１００％、好ましくは約９５％～約１００％、最も好ましくは少なくとも約９９％の特異性を有する。本明細書中で使用する用語「特異性」とは、核酸検出方法によって陰性として同定された陰性対照試料（すなわち、特定の標的核酸を含有しないことが知られている試料）の数として定義する（たとえば、３０個のうち２９個の陰性対照試料が核酸検出方法によって陰性として同定される場合、前記検出方法は９７％の特異性を有する）。したがって、特異性は、試料中における非特異的な増幅の非存在の測度である。

【0044】

[53]本明細書に記載する方法に従って使用する試料は、遺伝物質を含有する任意の試料、たとえば、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは両方を含有する任意の試料であることができる。

【0045】

[54]実施形態では、試料は環境学的試料である。特定の態様では、環境学的試料としては、それだけには限定されないが、固形表面、液体、および一定体積の空気から採取した粒子が挙げられる。

【0046】

[55]他の実施形態では、試料は生体試料である。本明細書中で使用する用語「生体試料」とは、組織の生検試料、または浸出液、胃洗浄液、唾液、血清、血漿、粘液、血液、もしくは尿試料などの他の生体試料、または対象から採取した経口スワブ、頬スワブ、鼻腔スワブ、咽頭スワブ、口咽頭スワブ、中鼻甲介スワブ、もしくは上咽頭スワブなどのスワブを含む、試料をいい得る。一部の実施形態では、試料は、組織試料、たとえば、肺組織試料、胃もしくは胃粘膜組織試料、または、血清もしくは血漿試料を含む血液試料である。特定の態様では、生体試料としては、それだけには限定されないが、対象から得られた唾液、粘液、血液、または血清が挙げられる。具体的な態様では、生体試料は上気道試料である。実施形態では、上気道試料は、上咽頭（ＮＰ）スワブ、口咽頭（ＯＰ）スワブ、鼻腔スワブ、鼻腔吸引液、または鼻腔洗浄液から得られる。実施形態では、鼻腔スワブは前鼻腔スワブまたは中鼻甲介鼻腔スワブである。

【0047】

[56]用語「等温核酸増幅反応」とは、一定温度で起こる任意の核酸増幅技法をいう。したがって、一連の交互する温度ステップまたはサイクルを用いて反応を実施する他の核酸増幅技術（たとえばポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ）とは対照的に、等温核酸増幅は一定温度で実施し、熱サイクラーを必要としない。実施形態では、等温核酸増幅反応は、４０～１００℃、５０～７２℃、５５～６５℃、または５５～７０℃、または６０～７２℃の範囲の温度から選択され得る一定温度で起こる。具体的な実施形態では、等温核酸増幅反応は、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、または７２℃の一定温度で起こる。一実施形態では、等温核酸増幅反応は、６５または６７℃の一定温度で起こる。

【0048】

[57]実施形態では、等温核酸増幅反応は、ループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）、高性能ＬＡＭＰ（ＨＰ－ＬＡＭＰ）、逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）、ミスマッチ耐性ＲＴ－ＬＡＭＰ、ワンポットＲＴ－ＬＡＭＰ、統合ＲＴ－ＬＡＭＰおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２方法、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポーターアンロッキング）、ＳＴＯＰ（ワンポットにおけるＳＨＥＲＬＯＣＫ試験）、ＣＯＶＩＤ－１９のための等温ＬＡＭＰに基づく方法（ｉＬＡＣＯ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌＬＡＭＰｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒＣＯＶＩＤ－１９））、およびＰｅｎｎ－ＲＡＭＰであり得る。実施形態では、等温核酸増幅反応は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、または転写媒介増幅（ＴＭＡ）であり得る。

【0049】

[58]実施形態では、等温核酸増幅はループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）である。具体的な態様では、標的核酸はＲＮＡであり、ＬＡＭＰは逆転写（ＲＴ－ＬＡＭＰ）をさらに含む。一実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応は、６５または６７℃の一定温度で起こる。

【0050】

[59]特定の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰは、少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含む反応混合物中で起こる。実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、表１に記載のプライマーの組から選択される。実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、ループＦおよび／またはループＢプライマーを含まない組以外の、表１に記載のプライマー組から選択され、それによって４つのプライマーの組が提供される。実施形態では、少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、生物の標的核酸とハイブリダイズする。実施形態では、反応混合物は、ベータ－アクチンまたはヒト細胞中で構成的に発現される同様のヒト遺伝子などの標的ヒト核酸とハイブリダイズする、少なくとも１つの追加の４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組をさらに含む。適切なヒト核酸標的に対して向けられたＲＴ－ＬＡＭＰおよびＬＡＭＰプライマーセットは当分野で知られており、たとえば、ＺｈａｎｇおよびＴａｎｎｅｒ（２０２０）によって記載されているベータアクチンプライマーセットである。本明細書に記載する本方法の実施形態では、４～６個のオリゴヌクレオチドのＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰプライマーの組のうちの少なくとも１つを、同じ核酸を標的とするＤＡＲＱプライマーセットと対にする。一部の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰプライマーセットのそれぞれは、それ自身のＤＡＲＱプライマーセットと対になっており、単一の反応混合物中の２つ以上の増幅産物の同時検出を可能にするために、それぞれのユニークなＤＡＲＱプライマーセットは、異なる波長で蛍光シグナルを発するように適応されている。

【0051】

[60]実施形態では、少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、それだけには限定されないが、遺伝子Ｎ（Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２ヌクレオプラスミドをコード化する）、遺伝子Ｍ（Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２膜タンパク質をコード化する）、遺伝子Ｅ（Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２エンベロープタンパク質をコード化する）、遺伝子Ｓ（Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質をコード化する）、ＯＲＦ１ａｂ（ｏｒｆ１ａｂポリタンパク質をコード化する）、Ｏｒｆ３ａ（アクセサリータンパク質をコード化する）、Ｏｒｆ６ａ（アクセサリータンパク質をコード化する）、Ｏｒｆ７ａ（アクセサリータンパク質をコード化する）、Ｏｒｆ７ｂ（アクセサリータンパク質をコード化する）、Ｏｒｆ８（アクセサリータンパク質をコード）、およびＯｒｆ１０（アクセサリータンパク質をコード化する）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの特異的遺伝子とハイブリダイズする。特定の実施形態では、少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの遺伝子Ｎまたは遺伝子Ｍとハイブリダイズする。特定の実施形態では、少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、９、１１、１３～１５（セット３）、および配列番号７～１２、１６、１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３およびセット４からなる群から選択される。セット１、２、３、および４からのオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下の表１に示す。

【0052】

【表1-1】

【0053】

【表1-2】

[61]実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰは、生物の標的核酸に向けられた４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組と、ヒト核酸、たとえば、ヒトアクチンＲＮＡ、たとえばベータアクチンなどの、すべてのヒト細胞中において一貫して発現されるヒトＲＮＡに向けられた４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組とを含む、反応混合物中で起こる。

【0054】

[62]特定の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応は、１つまたは複数の増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬を含む、閉じた容器中の反応混合物中で起こる。実施形態では、１つまたは複数の増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示薬を含む。用語「指示薬」とは、検出可能なシグナルを生じる分子をいい、それだけには限定されないが、蛍光、可視色、化学発光、および放射活性が挙げられる。

【0055】

[63]一部の態様では、１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示薬としては、それだけには限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ６４、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、ＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅ、ＹＯＰＲＯ１、ＳＹＴＯ６２、ＴＯＰＲＯ３、ＳＹＴＯ６０、ＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＰＯＰＯ３、ＮＧ－ＤＣＳ１、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、ＢＯＢＯ３、ＴＯＴＯ３、Ｐｉｃｏ４８８、ＴＯＴＯ１、およびＳＹＴＯ２４が挙げられる。

【0056】

[64]実施形態では、１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示薬は、蛍光ＤＮＡ挿入色素、たとえば、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎもしくはＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、またはＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩなどの同様の色素、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、あるいはＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅから選択される。

【0057】

[65]特定の態様では、増幅された標的核酸の検出は、経時的に試料中で増加した蛍光シグナルを含む。

【0058】

[66]実施形態では、１つまたは複数の増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、比色指示薬などの非蛍光ＤＮＡ指示薬を含む。特定の態様では、比色指示薬としては、マラカイトグリーン、カルセイン、およびヒドロキシナフトールブルーのうちの１つまたは複数を挙げ得る。

【0059】

[67]実施形態では、２つ以上の異なる標的核酸の増幅産物を反応混合物中で同時に検出し得るように、それぞれのプライマーセットのオリゴヌクレオチドプライマーを異なる比色または蛍光指示薬で標識し得る。

【0060】

[68]実施形態では、反応混合物は、ｐＨ感受性比色指示薬をさらに含み得る。用語「ｐＨ感受性指示薬」とは、等温核酸増幅の進行に伴った反応混合物のｐＨの低下に応答して、色の可視変化（たとえば赤色から黄色）を生じる分子をいう。特定の態様では、１つまたは複数のｐＨ感受性比色指示薬としては、それだけには限定されないが、フェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、およびｍ－クレゾールパープルが挙げられる。

【0061】

[69]ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応混合物は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ酵素から選択される１つまたは複数の酵素をさらに含む。典型的には、逆転写酵素は約３７℃～約４２℃で活性である。一部の実施形態では、逆転写酵素は熱安定性逆転写酵素である。熱安定性逆転写酵素とは、一般的に高温下でその触媒活性の一部または全部を保持する逆転写酵素をいう。典型的には、熱安定性逆転写酵素は５０℃以上で活性である。一部の実施形態では、逆転写酵素は野生型酵素である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、１つまたは複数の単一点突然変異を含む。他の実施形態では、逆転写酵素は切断されている。一部の実施形態では、逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ^－突然変異体である。

【0062】

[70]例示的な逆転写酵素としては、それだけには限定されないが、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＦｅＬＶ逆転写酵素、ＥｘｃｅｌｌＳｃｒｉｐｔ熱安定性Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲａｐｉＤｘＦｉｒｅ（商標）熱安定性逆転写酵素、ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ（商標）熱安定性逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＭａｘｉｍａＨｍｉｎｕｓ逆転写酵素、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴｘ逆転写酵素が挙げられる。様々な逆転写酵素が様々な特徴を有しており、一部のものが他のものよりも特定の応用に適している。下流の応用、標的ＲＮＡの長さ、複雑なＲＮＡ二次構造の存在、および酵素のＲＮａｓｅＨ活性のレベルはすべて、正しい逆転写酵素を選択する際の考慮事項である。

【0063】

[71]一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは当分野において一般的に使用されており、ＤＮＡ鋳型上での伸長反応を触媒することができる。一部の実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびＺ０５ポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは野生型酵素である。他の実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、１つまたは複数の単一点突然変異を含む。一部の実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない。他の実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ｅｘｏ＋ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる。

【0064】

[72]一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換ポリメラーゼである。鎖置換ポリメラーゼは、熱サイクリング、または反応の温度を周期的な様式で５０℃～７０℃に調節する必要なしに、ＤＮＡ鋳型上での伸長反応を触媒する。その代わりに、鎖置換ポリメラーゼは、一定温度で鋳型ＤＮＡ鎖に沿って移動するにつれて、相補的ＤＮＡ鎖を除去し、それを新しく合成された鎖で置き換えることができる。実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼおよび熱安定性ポリメラーゼの両方である。適切な例としては、ＢｓｔポリメラーゼおよびＰｈｉ－２９ポリメラーゼが挙げられる。

【0065】

[73]一部の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＵＴＰの混合物であり得るデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。追加の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応混合物は、マグネシウムイオン供給源をさらに含む。実施形態では、マグネシウムイオン供給源は、ＭｇＣｌ_２およびＭｇＳＯ_４のうちの一方または両方である。また、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ）、および硫酸アンモニウム［（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４］などの１つまたは複数の追加の塩も反応混合物中に存在し得る。また、塩は、任意選択で、必要に応じて溶出／溶解緩衝液中にも含ませることができる。

【0066】

[74]特定の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰは、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８、または６９℃の一定温度で、生物の標的核酸に向けられた少なくとも１つの４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組と、任意選択で、ベータアクチンなどの標的ヒト核酸に向けられた４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の組、ｄＵＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、少なくとも１組のＤＡＲＱプライマーおよび蛍光ＤＮＡ挿入剤を含み得る増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬、ならびに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ酵素から選択される１つまたは複数の酵素とを含む、反応混合物中で起こる。反応混合物はまた、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、緩衝剤、（ＮＨ４）_２ＳＯ_４およびＫＣｌなどの塩、ならびに非イオン性界面活性剤のうちの１つまたは複数も含有し得る。実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドから選択され得る。実施形態では、反応混合物を凍結乾燥させ、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、マルトデキストリン、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールのうちの１つまたは複数をさらに含有し得る。実施形態では、凍結乾燥した反応混合物は、トレハロース、ラクトース、および／またはラクチトールを含む。

【0067】

[75]本明細書中で使用する用語「標的核酸」とは、本明細書中に記載する等温核酸増幅反応による増幅の標的である生物の核酸、または生物の核酸の一部（たとえば遺伝子）をいう。特定の態様では、標的核酸は、生物の１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。他の態様では、標的核酸は、生物の１つまたは複数の遺伝子を含む。本明細書中で使用する用語「生物」としては、それだけには限定されないが、細菌、ウイルス、真菌、藻類、原虫、およびプリオン遺伝子を含む微生物、ならびに寄生生物などの生物が挙げられ、これには、それだけには限定されないが、特定の種類の蠕虫（たとえば、鈎虫、白癬）、植物、および昆虫の幼虫が挙げられる。

【0068】

[76]特定の実施形態では、標的核酸は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物から選択される生物の、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。具体的な実施形態では、生物はウイルスである。特定の事例では、ウイルスとしては、それだけには限定されないが、ライノウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エンテロウイルスＤ６８、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス、ジカウイルス、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、クリミア－コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）オルソナイロウイルス（ＣＣＨＦＶ）、黄熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）、キャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）、フニンウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、グアナリトウイルス、ガリッサウイルス、イレシャウイルス、ラッサ熱ウイルス、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）－ＨＫＵ－１、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、およびＨＣｏＶ－２２９Ｅ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ならびに重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が挙げられる。特定の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される。具体的な実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

【0069】

[77]本明細書中で使用する「対象」とは、生物（たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの微生物）に感染した、または感染が疑われる、または感染のリスクがある、任意の哺乳動物をいう。本開示の方法は、ヒト対象に適用可能として全般的に記載されているが、本方法は他の哺乳動物対象に適用し得る。したがって、特定の実施形態では、本明細書中に記載する方法は、任意の哺乳動物、たとえば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、またはブタを含み得る「対象」に対して行い得る。具体的な実施形態では、対象または必要としている対象は、ヒト乳児、小児、青年、または成人などのヒトである。

【0070】

[78]実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＲＮａｓｅ阻害剤を、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ反応混合物に加えるステップをさらに含む。実施形態では、本方法が化学的溶解ステップを含む場合、ＲＮａｓｅ阻害剤が任意選択で溶解緩衝液中に存在する。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤を、清澄化ステップを行う前および任意の熱処理ステップの前に試料に加える。用語「阻害剤」とは、標的分子の発現、量、または活性の直接または間接的な変更、干渉、低下、下方制御、遮断、抑止、または分解を生じる薬剤（たとえば化学分子または生体分子）をいい、変更、干渉、低下、下方制御、遮断、抑止、または分解は、統計的、生物学的、または臨床的に有意である。用語「ＲＮａｓｅ阻害剤」とは、通常はＲＮＡ分子を断片化させるために機能するＲＮａｓｅ酵素の活性を遮断、不活性化、低下、または最小限にし得る薬剤をいう。ＲＮａｓｅ阻害剤は、試料中のＲＮａｓｅ汚染物質を阻害および制御するために、本明細書中に記載する方法におけるものなどのＲＮＡの酵素操作における予防策として一般的に使用する。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、約６０℃～約１００℃、好ましくは約６５℃～約９５℃、最も好ましくは約９５℃の高温で活性であり続ける。

【0071】

[79]本明細書に記載するアッセイ方法において使用し得る例示的なＲＮａｓｅ阻害剤としては、それだけには限定されないが、ブタ肝臓ＲＮａｓｅ阻害剤、ヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、ネズミＲＮａｓｅ阻害剤、ラット肺ＲＮａｓｅ阻害剤、およびラット肝臓ＲＮａｓｅ阻害剤が挙げられる。例示的なＲＮａｓｅ阻害剤としては、それだけには限定されないが、ＲｉｂｏｐｒｏｔｅｃｔＨｕ、ＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標）、ＲＮａｓｉｎ（商標）もしくはＲＮａｓｉｎ（商標）Ｐｌｕｓ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ、ＲｉｂｏＳｈｉｅｌｄ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、またはＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ（商標）が挙げられる。実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤の最終濃度は約０．０１Ｕ／μｌ～２．０Ｕ／μｌ、好ましくは約０．５Ｕ／μｌ～約２．０Ｕ／μｌである。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤はポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）である。

【0072】

[80]特定の実施形態では、本明細書に記載する方法は、増幅された標的核酸の迅速検出を可能にする。本明細書中で使用する用語「迅速検出」とは、等温核酸増幅反応が、標的核酸を、当分野で知られている１つまたは複数の手順によって定量的および／または定性的に検出されるように（たとえば蛍光および／または比色検出）、約１分間～約６０分間、好ましくは約５分間～約４５分間、または約５分間～３０分間、またはより好ましくは約１０分間～約３０分間、または約１０分間～約２６分間、または約１５分間～約３０分間の期間以内に十分に増幅することを示す。好ましくは、本明細書に記載する方法によれば、等温核酸増幅反応は、標的核酸が検出されるように５～２６分間の期間以内に十分に増幅する。

【0073】

[81]したがって、特定の実施形態では、本方法は、約５～３０分間、または約１０～３０分間、または約１０～約２６分間、または１０～２０分間、または約１５～約３０分間、または約１５分間～２０分間の以内の期間に、増幅された標的核酸の迅速検出を可能にする。追加の実施形態では、本明細書中に記載する方法を行うために必要な総時間は、約５分間～約６０分間、または約２５分間～約６０分間、または約３０分間～約６０分間である。

【0074】

[82]一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、等温核酸増幅反応の前に行う１つまたは複数の追加のステップさらに含み得る。１つまたは複数の追加のステップとしては、同時の限外濾過および濃縮を含む清澄化ステップ、化学的溶解、ならびに熱処理のうちの１つまたは複数を挙げ得る。

【0075】

[83]本明細書中で使用する用語「化学的溶解」とは、生物からの遺伝物質（たとえばＲＮＡまたはＤＮＡ）の放出を容易にするために、前記生物の細胞膜（またはウイルスの外部タンパク質コート）を透過処理するプロセスをいう。適切な溶解剤の例としては、それだけには限定されないが、様々な細胞種、たとえば、グラム陽性または陰性細菌、植物、酵母、哺乳動物の溶解に使用される溶解酵素などの生物活性試薬、たとえば、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、リゾスタフィン、ラビアーゼ、キタラーゼ、リチカーゼ、および様々な他の市販の溶解酵素が挙げられる。実施形態では、溶解試薬は、非イオン性界面活性剤、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、およびチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）から選択される。実施形態では、溶解試薬は非イオン性界面活性剤である。実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドから選択される。

【0076】

[84]試料中に存在する生物の透過処理を容易にするために、他の溶解剤を、追加でまたは代替として試料に加えることができる。たとえば、界面活性剤に基づく溶解溶液は、生物を溶解するために使用することができる。溶解溶液としては、たとえば、サルコシルおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のイオン性界面活性剤、またはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは他の同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシド等の非イオン性界面活性剤を挙げることができる。より一般的には、化学的溶解剤としては、それだけには限定されないが、有機溶媒、キレート化剤、洗剤、界面活性剤、およびカオトロピック剤を挙げることができる。

【0077】

[85]一実施形態では、化学的溶解は、試料を、非イオン性界面活性剤、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、およびチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）から選択される溶解試薬と、緩衝溶液中で接触させるステップを含む。実施形態では、溶解試薬は非イオン性界面活性剤である。実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドから選択される。実施形態では、緩衝溶液はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をさらに含む。

【0078】

[86]実施形態では、生物は、非化学的透過処理方法によって透過処理することができる。使用することができる例示的な非化学的透過処理方法としては、それだけには限定されないが、電気穿孔などの物理的溶解技法、機械的透過処理方法（たとえば、試料の組織構造を機械的に破壊するための、ホモジナイザーおよび粉砕ボールを使用したビーズ打ち）、音波透過処理（たとえば超音波処理）、ならびに生物の熱透過処理を誘導するための加熱などの熱溶解技法が挙げられる。

【0079】

[87]実施形態では、培地、溶液、または透過処理溶液は、１つまたは複数のプロテアーゼを含有し得る。一部の実施形態では、ヒストンタンパク質を分解することができるプロテアーゼで処理した生体試料は、断片化されたゲノムＤＮＡの生成をもたらす場合がある。

【0080】

[88]本明細書中で使用する用語「熱処理」とは、試料の温度の増加をもたらす熱源を前記試料に施用するプロセスをいう。特定の実施形態では、熱処理は、約２０℃～約５０℃、好ましくは約２０℃～約４０℃、最も好ましくは約３０℃～約４０℃の、試料の温度の増加をもたらす。特定の実施形態では、試料を熱処理に供するステップは、試料を、約８０℃～約１００℃、好ましくは約９０℃～約９８℃、最も好ましくは約９５℃の温度まで、約３０秒間～約１０分間、好ましくは約３０秒間～約５分間、最も好ましくは約１分間～約３分間の一定期間の間、加熱するステップを含む。具体的な実施形態では、試料を熱処理に供するステップは、試料を９５℃まで３分間加熱するステップを含む。

【0081】

[89]実施形態では、本方法は、等温核酸増幅反応の前に行う、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップを含み得る。本明細書中で使用する用語「清澄化」とは、細胞タンパク質および脂質、細胞細片、ならびに試料からの他の汚染粒子を除去するが、検出する分析物は除去せずに、「清澄化した」試料を生じるプロセスをいう。特定の実施形態では、試料の清澄化は、試料の濾過、限外濾過、遠心分離、超遠心分離、および超音波処理を含む１つまたは複数のステップを含む。ステップは同時または別々であり得る。用語「同時」とは、同じ時に起こる２つ以上のステップ（たとえば清澄化ステップ）をいう。

【0082】

[90]用語「限外濾過」とは、圧力または濃度勾配などの力が、半透膜を通した分離をもたらす、様々な膜濾過装置をいう。限外濾過膜は、使用する膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）によって定義される。例示的な限外濾過ユニットとしては、それだけには限定されないが、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外濾過ユニットが挙げられる。特定の態様では、フィルターは、コポリマースチレンフィルターおよびブタジエンフィルターからなる群から選択される。具体的な実施形態では、膜はセルロース膜である。特定の実施形態では、膜は、約１ｋＤａ～約３００ｋＤａ、好ましくは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａ、最も好ましくは約１００ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。

【0083】

[91]実施形態では、清澄化ステップは、分析物、たとえばウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子がフィルターを通過することを許可しない一方で、他の分子および不純物が通過する膜を有するフィルターを通した、試料の遠心分離を含む。一部の実施形態では、遠心分離は、約１０，０００×ｇ～１５０，０００×ｇ、１０，０００～１００，０００×ｇ、１０，０００～２０，０００×ｇ、または１４，０００～１５，０００×ｇの速度で、約５分間～３０分間、好ましくは１０分間～２０分間、最も好ましくは約２０分間の一定期間行う。具体的な実施形態では、遠心分離は、１０，０００～２０，０００×ｇの速度で２０分間行う。

【0084】

[92]特定の実施形態では、試料の同時の限外濾過および濃縮の終わりまでに、フィルター中に残る清澄化した試料の体積は、約１μｌ～約２５μｌ、好ましくは５μｌ～約２０μｌ、最も好ましくは約１０μｌ～約１５μｌである。特定の態様では、同時の限外濾過および濃縮ステップは、試料の体積を約９０％～約９９％、より好ましくは約９５％～約９８％、最も好ましくは約９７％～約９８％低下させる。具体的な実施形態では、同時の限外濾過および濃縮ステップは、試料の体積を約５００μｌ～約１５～２０μｌ低下させる。

【0085】

[93]一部の実施形態では、清澄化ステップは、化学的溶解および／または熱処理を行う前に行う。試料を化学的溶解に供するステップおよび試料を熱処理に供するステップからなる群から選択される１つまたは複数の追加のステップを行う前に清澄化ステップを行うことが、本明細書中に記載する方法の一部の実施形態について感度の著しい改善をもたらしたことが、予想外に見出された。特定の態様では、試料を化学的溶解に供するステップおよび試料を熱処理に供するステップからなる群から選択される１つまたは複数の追加のステップを行う前に清澄化ステップを行うことは、本方法を清澄化ステップなしで実施した場合、または清澄化ステップを、試料を化学的溶解に供するステップおよび試料を熱処理に供するステップからなる群から選択される１つまたは複数の追加のステップを行った後に行った場合と比較して、記載した方法のＬＯＤを約２倍～約２０倍、好ましくは約４倍～約１０倍低下させた。

【0086】

[94]特定の実施形態では、本方法は、等温核酸増幅反応を実施する前に、清澄化した試料を２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の部分に分けるステップをさらに含み得る。一部の態様では、本方法は、清澄化した試料の２、３、４、５、６、７、８、９、および／または１０番目の部分を等温核酸増幅反応に供して標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとをさらに含む。特定の実施形態では、異なる標的核酸は、清澄化した試料のそれぞれの部分中で増幅される。他の実施形態では、同じ標的核酸を、清澄化した試料中の少なくとも２つの部分で増幅させる。したがって、一部の実施形態では、本方法は、清澄化した試料の第２の部分を等温核酸増幅反応に供して標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとをさらに含む。特定の態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第２の部分中で増幅された標的核酸は同じである。他の態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第２の部分中で増幅された標的核酸は異なる。さらに他の実施形態では、本方法は、清澄化した試料の第３の部分を等温核酸増幅反応に供して第３の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとをさらに含む。

【0087】

[95]特定の態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第３の部分中で増幅された標的核酸は同じである。他の態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第３の部分中で増幅された標的核酸は異なる。追加の態様では、試料の第２の部分中で増幅された標的核酸および試料の第３の部分中で増幅された標的核酸は同じである。他の態様では、試料の第２の部分中で増幅された標的核酸および試料の第３の部分中で増幅された標的核酸は異なる。さらなる態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第２および第３の部分中で増幅された標的核酸は同じである。追加の態様では、試料の第１の部分中で増幅された標的核酸および試料の第２および第３の部分中で増幅された標的核酸は異なる。
キット
[96]本開示はまた、試料中の生物の検出のためのキットも提供する。実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出のためのキットを提供する。実施形態では、キットは、試料の溶出および溶解のための緩衝液を含み、任意選択で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの通過を許可しない膜を有するフィルターを含む遠心フィルターアセンブリを収容する第１の容器と、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、１３、９、１４、１１、および１５（セット３）、または配列番号７～１２ならびに配列番号１６および１７（セット４）によって同定されるプライマーセットのうちの任意の１つから選択される４～６個の凍結乾燥したオリゴヌクレオチドプライマーの組を含む第２の容器と、逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を行うための試薬とを含む。実施形態では、膜は、約１ｋＤａ～約３００ｋＤａ、好ましくは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａ、より好ましくは約１００ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含む。実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬のうちの１つまたは複数を凍結乾燥させる。実施形態では、凍結乾燥試薬は、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む。実施形態では、キットは、ＲＮａｓｅ阻害剤、陽性対照試料、陰性対照試料、および増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の蛍光または比色指示薬のうちの１つまたは複数をさらに含む。

【0088】

[97]特定の態様では、フィルターは、コポリマースチレンフィルターおよびブタジエンフィルターからなる群から選択される。具体的な実施形態では、膜はセルロース膜である。特定の実施形態では、膜は、約１ｋＤａ～約３００ｋＤａ、好ましくは約３ｋＤａ～約２００ｋＤａ、最も好ましくは約１００ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。他の態様では、膜は、約０．００１～約０．１ミクロン、好ましくは約０．００１～約０．００４ミクロン、最も好ましくは０．００１～約０．００２ミクロンの孔径を有する。

【0089】

[98]一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の陽性対照試料および陰性対照試料をさらに含む。他の実施形態では、キットは、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の蛍光または比色指示薬をさらに含む。

【0090】

[99]特定の実施形態では、キットは、緩衝剤、（ＮＨ４）_２ＳＯ_４およびＫＣｌなどの塩、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）などのマグネシウムイオン供給源、逆転写酵素、ならびにＤＮＡポリメラーゼを含む、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬のうちの１つまたは複数を凍結乾燥させる。用語「凍結乾燥した」とは、貯蔵寿命を延長する、または材料を輸送用により都合よくするために、腐敗しやすい材料（たとえば酵素）を保存するために典型的に使用される、水除去プロセスをいう。凍結乾燥は、材料を凍結し、その後、減圧し、熱を加えて、材料中の凍結水を昇華させることによって機能する。これは、ほとんどの慣用方法による、熱を使用して水を蒸発させる脱水とは対照的である。

【0091】

[100]実施形態では、凍結乾燥試薬は、界面活性剤、緩衝剤、（ＮＨ４）_２ＳＯ_４およびＫＣｌなどの塩、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）などのマグネシウムイオン供給源、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰの混合物、好ましくは４～６個のＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰプライマーとＤＡＲＱプライマーセットとを含む、標的核酸配列の増幅のための少なくとも１つのプライマーセット、ならびに蛍光ＤＮＡ挿入色素を含む。

【0092】

[101]実施形態では、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシド等の非イオン性界面活性剤である。

【0093】

[102]実施形態では、緩衝剤は、トリス、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥ、ＴＥＳ、またはトリシンである。実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤はポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）である。

【0094】

[103]実施形態では、硫酸マグネシウムは、再構成した溶液中において２～２０ｍＭまたは４～１０ｍＭの濃度を提供するために適切な量で存在する。

【0095】

[104]実施形態では、逆転写酵素は低下したＲＮａｓｅＨ活性を有する。

【0096】

[105]実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ボガジシ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｏｇａｚｉｃｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑＤＮＡポリメラーゼから選択される。

【0097】

[106]実施形態では、ｄＮＴＰの混合物は、再構成した溶液中においてそれぞれ独立して約０．２８～７ｍＭまたは０．７～２．８ｍＭの範囲で存在する、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＵＴＰを含む。

【0098】

[107]実施形態では、少なくとも１つのプライマーセットは、表１に記載のプライマーセットである。実施形態では、凍結乾燥試薬は、ヒトアクチンなどの対照配列の増幅のための第２のプライマーセットを含む。好ましくは、反応混合物は少なくとも１つのＤＡＲＱプライマーセットを含む。

【0099】

[108]実施形態では、蛍光ＤＮＡ挿入色素は、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎもしくはＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、またはＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩなどの同様の色素、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、ＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅである。

【0100】

[109]実施形態では、凍結乾燥試薬は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清、またはヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンのうちの１つまたは複数、たとえば再構成した溶液中において１ｍｇ／ｍｌまでの血清アルブミン；トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、たとえば再構成した溶液中において４ｍＭまで；トレハロース、ラクトース、およびラクチトールのうちの１つまたは複数、再構成した溶液中において約５～５０％ｗ／ｖ、または約１０～４５％ｗ／ｖ、または１０～２０％ｗ／ｖ；熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）；ならびにＲｉｂｏｐｒｏｔｅｃｔＨｕ（Ｂｌｉｒｔ）、ＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、ＲＮａｓｉｎ（商標）、またはＲＮａｓｉｎ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ（商標）、ＲｉｂｏＬｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲｉｂｏＳｈｉｅｌｄ（ＰＣＲＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。実施形態では、凍結乾燥試薬はまた、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、および／またはマルトデキストリンのうちの１つまたは複数も含み得る。

【0101】

[110]一実施形態では、キットは、採取チューブ（Ａ）、滅菌スワブ（Ｂ）、および試験パウチ（Ｃ）を含む。試験パウチは、ホールピペット（Ｃ１）およびチューブアセンブリ（Ｃ２）を含有する。採取チューブ（Ａ）は、試料の溶出および溶解のための緩衝液を含有する。実施形態では、緩衝液は、界面活性剤、好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシド等の非イオン性界面活性剤、；緩衝剤、たとえば、トリス、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥ、ＴＥＳ、またはトリシン；ＲＮａｓｅ阻害剤、たとえばポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）；およびヌクレアーゼを含まない水を含む。チューブアセンブリ（Ｃ２）は、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬の凍結乾燥混合物、およびＲＴ－ＬＡＭＰ反応中に試験管内の溶液を混合するために使用するステンレス鋼ボールベアリングなどの磁気ビーズを含有する。たとえば、試薬は、トリス緩衝液などの適切な緩衝液；Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００もしくは同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシド等の非イオン性界面活性剤；（ＮＨ４）_２ＳＯ_４およびＫＣｌなどの塩、再構成した溶液中において２～２０ｍＭまたは４～１０ｍＭの濃度を提供するための硫酸マグネシウム；たとえば再構成した溶液中においてそれぞれ独立して約０．２８～７ｍＭまたは０．７～２．８ｍＭの範囲で存在する、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＵＴＰを含む、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の混合物；本明細書中に記載するプライマーセットなどの、標的配列、たとえば標的ウイルス配列の増幅のための少なくとも１つのプライマーセット；任意選択の、ヒトベータ－アクチンなどの対照配列の増幅のための第２のプライマーセット；１組または複数組の検出プライマー；増幅されたＤＮＡの検出に適した色素、たとえば蛍光ＤＮＡ挿入色素、たとえば、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎもしくはＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、またはＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩなどの同様の色素、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、ＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅ；ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば、ゲオバチルス・ボガジシＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（たとえばＢＳＴ２．０）、またはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ；ならびに逆転写酵素、好ましくは低下したＲＮａｓｅＨ活性を有するものを含み得る。また、追加の試薬、たとえば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清、またはヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンのうちの１つまたは複数、たとえば再構成した溶液中において１ｍｇ／ｍｌまでの血清アルブミン；ＴＣＥＰなどの還元剤、たとえば再構成した溶液中において４ｍＭまで；トレハロース、ラクトース、およびラクチトールのうちの１つまたは複数、再構成した溶液中において約５～５０％ｗ／ｖ、または約１０～４５％ｗ／ｖ、または１０～２０％ｗ／ｖ；熱不安定性ＵＤＧ；ならびにＲｉｂｏｐｒｏｔｅｃｔＨｕ（Ｂｌｉｒｔ）、ＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、ＲＮａｓｉｎ（商標）、またはＲＮａｓｉｎ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ（商標）、ＲｉｂｏＬｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲｉｂｏＳｈｉｅｌｄ（ＰＣＲＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＲＮａｓｅ阻害剤も、存在し得る。実施形態では、凍結乾燥試薬はまた、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、および／またはマルトデキストリンのうちの１つまたは複数も含み得る。

【0102】

[111]一部の実施形態では、本発明は、試料を、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップに供するステップと、続いて、清澄化した試料の第１の部分を第１の等温核酸増幅反応に供して生物の第１の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとを含み、増幅された標的核酸の検出が試料中の生物の存在を示す、試料中の生物を検出するための方法を提供する。

【0103】

[112]一実施形態では、本方法は、２０～１２０分間、好ましくは２０～９０分間、最も好ましくは２０～４０分間の一定期間以内で行う。特定の実施形態では、本方法は、５～４５分間、好ましくは１０～３０分間、最も好ましくは１５～２０分間の一定期間以内に行う。

【0104】

[113]一実施形態では、本方法は、清澄化した試料の第２の部分を第２の等温核酸増幅反応に供して第２の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとをさらに含む。一実施形態では、第１および第２の標的核酸は同じまたは異なる。一実施形態では、２つの異なるプライマーセットを使用して、第１および第２の標的核酸を増幅させる。

【0105】

[114]一実施形態では、本方法は、等温核酸増幅反応を行う前に、試料を化学的溶解に供するステップおよび試料を熱処理に供するステップからなる群から選択される１つまたは複数の追加のステップをさらに含む。

【0106】

[115]一実施形態では、試料を化学的溶解に供するステップは、試料を、非イオン性界面活性剤、塩酸グアニジン、およびチオシアン酸グアニジンから選択される溶解試薬と接触させるステップを含む。

【0107】

[116]一実施形態では、試料を熱処理に供するステップは、試料を約９５℃まで、３０秒間～１０分間、好ましくは３０秒間～５分間、最も好ましくは１分間～３分間の一定期間の間加熱するステップを含む。一実施形態では、試料を熱処理に供するステップは、試料を９５℃まで３分間加熱するステップを含む。

【0108】

[117]一実施形態では、清澄化ステップを行う前にＲＮａｓｅ阻害剤を試料に加える。

【0109】

[118]一実施形態では、清澄化ステップは、遠心分離を含む方法によって行う。一実施形態では、清澄化ステップは、約１ｋＤａ～３００ｋＤａ、好ましくは３ｋＤａ～２００ｋＤａ、最も好ましくは１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を含むフィルターを通した限外濾過を含む方法によって行う。一実施形態では、フィルターは、コポリマースチレンフィルターおよびブタジエンフィルターから選択される。一実施形態では、膜はセルロース膜である。一実施形態では、遠心分離は約１４，０００～１５，０００×ｇの速度で約１０～２０分間行う。

【0110】

[119]前述の方法のうちの任意のものの一実施形態では、等温核酸増幅はループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）である。一実施形態では、標的核酸はＲＮＡであり、ＬＡＭＰは逆転写（ＲＴ－ＬＡＭＰ）をさらに含む。一実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰは、６５または６７℃の一定温度で、６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬、ならびに逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および二重特異性逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼ酵素から選択される１つまたは複数の酵素を含む反応混合物中で起こる。

【0111】

[120]一実施形態では、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示分子を含む。一実施形態では、１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示分子は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ６４、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、ＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅ、ＹＯＰＲＯ１、ＳＹＴＯ６２、ＴＯＰＲＯ３、ＳＹＴＯ６０、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、ＰＯＰＯ３、ＮＧ－ＤＣＳ１、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、ＢＯＢＯ３、ＴＯＴＯ３、Ｐｉｃｏ４８８、ＴＯＴＯ１、およびＳＹＴＯ２４からなる群から選択される。一実施形態では、増幅された標的核酸の検出は、一定期間にわたる試料中の蛍光シグナルの増加を検出することを含む。一実施形態では、増幅された核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、マラカイトグリーン、カルセイン、およびヒドロキシナフトールブルーからなる群から選択される１つまたは複数の比色指示薬を含む。一実施形態では、増幅された核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、フェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、およびｍ－クレゾールパープルからなる群から選択されるｐＨ感受性比色指示薬を含む。

【0112】

[121]前述の方法のうちの任意のものの一実施形態では、試料中の標的核酸の検出は、１～１００個のコピー、好ましくは１～５個のコピーの標的核酸／マイクロリットル（μｌ）の検出限界（ＬＯＤ）を有する。一実施形態では、試料中の標的核酸の検出は、１個のコピーの標的核酸／マイクロリットル（μｌ）の検出限界（ＬＯＤ）を有する。一実施形態では、本方法は、約９０％～約１００％、好ましくは約９５％～約１００％、最も好ましくは少なくとも約９７％の感度を有する。一実施形態では、本方法は、約９０％～約１００％、好ましくは約９５％～約１００％、最も好ましくは少なくとも約９９％の特異性を有する。

【0113】

[122]前述の方法のうちの任意のものの一実施形態では、標的核酸は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物から選択される生物の、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、標的核酸はウイルスのものである。実施形態では、ウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）から選択される。実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である。

【0114】

[123]ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である方法の一実施形態では、４～６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、表１に記載の配列識別子によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群（ループＦおよびループＢのプライマーは非存在）、すなわち、セット１の配列番号１～４、セット２の配列番号７～１０、セット３の配列番号７、１３、９、および１４、またはセット４の配列番号７～１０ならびに配列番号１６および１７から選択される。実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの遺伝子Ｎまたは遺伝子Ｍとハイブリダイズする。ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、表１に記載の配列識別子、すなわち、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、１３、９、１４、１１、および１５（セット３）、または配列番号７～１２ならびに配列番号１６および１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される。実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの遺伝子Ｎまたは遺伝子Ｍとハイブリダイズする。

【0115】

[124]ウイルスがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの組は、表１、配列番号７～１２ならびに配列番号１６および１７において同定されるセット４である。

【0116】

[125]前述の方法のうちの任意のものの一実施形態では、試料は、生体試料または環境学的試料である。実施形態では、生体試料は、唾液、粘液、血液、または血清を含む。実施形態では、環境学的試料は、固形表面、液体、または一定体積の空気から採取した粒子を含む。実施形態では、生体試料は上気道試料である。実施形態では、上気道試料は、上咽頭（ＮＰ）スワブ、口咽頭（ＯＰ）スワブ、鼻腔スワブ、鼻腔吸引液、または鼻腔洗浄液から得られ、さらに任意選択で、鼻腔スワブは前鼻腔スワブまたは中鼻甲介鼻腔スワブである。

【0117】

[126]本開示は、試料を、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップに供するステップと、続いて、清澄化した試料の第１の部分を第１の逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）に供して、遺伝子Ｍおよび遺伝子Ｎから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの第１の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとを含み、増幅された標的核酸の検出が、生体試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を示す、対象から得られた生体試料中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する方法を提供する。実施形態では、生体試料は、ヒト対象の唾液または粘液試料である。実施形態では、本方法は、清澄化した試料の第２の部分を第２の等温核酸増幅反応に供して第２の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された第２の標的核酸を検出するステップとをさらに含む。実施形態では、第１および第２の標的核酸は同じまたは異なる。実施形態では、２つの異なるプライマーセットを使用して、第１および第２の標的核酸を増幅させる。実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、６５℃または６７℃の一定温度で、６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、増幅された標的核酸を検出するための１つまたは複数の試薬、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中で起こる。実施形態では、本方法は、上述のように、等温核酸増幅を行う前に１つまたは複数の追加のステップをさらに含む。

【0118】

[127]実施形態では、４または６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの遺伝子Ｎまたは遺伝子Ｍとハイブリダイズする。実施形態では、４または６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、１３、９、１４、１１、および１５（セット３）、ならびに配列番号７～１２および配列番号１６および１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される。実施形態では、組中のそれぞれのプライマーを１つまたは複数の比色指示薬で標識する。実施形態では、増幅された標的核酸の検出のための１つまたは複数の試薬は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ６４、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、ＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅ、ＹＯＰＲＯ１、ＳＹＴＯ６２、ＴＯＰＲＯ３、ＳＹＴＯ６０、ＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＰＯＰＯ３、ＮＧ－ＤＣＳ１、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、ＢＯＢＯ３、ＴＯＴＯ３、Ｐｉｃｏ４８８、ＴＯＴＯ１、およびＳＹＴＯ２４からなる群から選択される１つまたは複数の蛍光ＤＮＡ指示薬を含む。

【0119】

[128]特定の実施形態では、本開示は、ｉ）生体試料をＲＮａｓｅ阻害剤で処理するステップと、ｉｉ）生体試料を、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化に供するステップと、ｉｉｉ）清澄化した試料の第１の部分を、試料を溶解緩衝液で処理するステップを含む化学的溶解、続いて、試料を９５℃まで３分間加熱するステップを含む熱処理に供するステップと、ｉｖ）溶解試料を、逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）に供して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡのＮおよびＭ遺伝子からなる群から選択される第１の標的核酸を増幅させるステップであって、ＲＴ－ＬＡＭＰが、６５℃または６７℃の一定温度で、４または６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、増幅された標的核酸を検出するための１つまたは複数の試薬、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中で起こる、ステップと、ｖ）１つまたは複数の蛍光または比色指示薬を使用して、増幅された標的核酸を検出するステップであって、等温核酸増幅反応は増幅された存在する標的核酸の検出を約１０～約２０分以内に可能とし、増幅された標的核酸の検出が、生体試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す、ステップとを含む、対象から得られた生体試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速検出のための方法を提供する。

【0120】

[129]一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速検出のための方法は、清澄化した試料の第２の部分を第２の等温核酸増幅反応に供して第２の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された第２の標的核酸を検出するステップとをさらに含み得る。他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速検出のための方法は、清澄化した試料の第３の部分を第３の等温核酸増幅反応に供して第３の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された第３の標的核酸を検出するステップとをさらに含み得る。

【0121】

[130]追加の実施形態では、本開示は、試料を、同時の限外濾過および濃縮を含んで清澄化した試料を生成する清澄化ステップに供するステップと、続いて、清澄化した試料の第１の部分を逆転写およびループ媒介等温核酸増幅反応（ＲＴ－ＬＡＭＰ）に供して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡのＮおよびＭ遺伝子からなる群から選択される標的核酸を増幅させるステップと、増幅された標的核酸を検出するステップとを含み、増幅された標的核酸の検出が、生体試料中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す、対象から得られた生体試料中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための方法を提供する。

【0122】

[131]本明細書に記載する方法のうちの任意のものの実施形態に従って、４または６個のオリゴヌクレオチドプライマーの組は、配列番号１～６（セット１）、配列番号７～１２（セット２）、配列番号７、１３、９、１４、１１、および１５（セット３）、ならびに配列番号７～１２、１６、および１７（セット４）によって同定される、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される。実施形態では、本方法は、清澄化した試料の第２の部分を第２の等温核酸増幅反応に供して第２の標的核酸を増幅させるステップと、増幅された第２の標的核酸を検出するステップとをさらに含む。実施形態では、第１および第２の等温核酸増幅反応は、セット１、セット２、セット３、およびセット４からなる群から選択される異なるプライマーの組を用いて行う。

【0123】

[132]さらなる実施形態は、本発明をその主要な態様のうちの一部において例示するが、いかなる様式でもその範囲を限定することを意図しない、以下の実施例から明らかとなるであろう。

【実施例】

【0124】

実施例１：プライマー設計。

【0125】

[133]プライマー設計は、ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの重大な態様であり、アッセイの感度および特異性、ならびにアッセイの頑健性および速度に重要である。プライマー設計は、ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの感度および特異性に影響を与える最も大きな要因の１つである。１つのチューブ中に６個のプライマーが非常に高濃度で存在することは、非特異的な増幅の危険性の増加を意味し、これは注意深いプライマー設計および推定上のプライマーセットのスクリーニングによって排除しなければならない。ＬＡＭＰプライマー設計を支援するために限定的なソフトウェアの選択肢が存在するが、これらのプログラムは単独では頑強なプライマー設計をもたらさない。特に臨床アッセイのための、適切なプライマーの組に到達するために、多くの様々なプライマーセットを経験的に試験し、最良の性能のプライマーを同定することが必要である。ここでは、オープンリーディングフレーム１ａ、１ｂ、Ｍ、およびＮを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノム全体にわたる様々な標的遺伝子に対して、１６個の異なるＲＴ－ＬＡＭＰプライマーセットを設計および試験した。合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ゲノムＲＮＡを使用してプライマーセットを系統的に試験した。プライマーセットの、その対応する標的領域を増幅させる能力を、サイクル閾値（「Ｃｔ」）値を増幅速度の指標として使用して評価した。Ｃｔ値は、増幅された核酸産物の検出可能なシグナルがバックグラウンドよりも有意に高い、最初のサイクル数を表す。典型的には、これは蛍光シグナルである。また、他の呼吸器ウイルスを反応における鋳型ＤＮＡとして使用した非特異的な増幅の量を評価することによって、プライマーセットを、感度および標的核酸に対するその特異性の指標であるその検出限界（ＬＯＤ）を決定するためにも評価した。本発明者らは、上位の性能のプライマーセットを、少なくとも１０個のコピーの合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡ／マイクロリットルを検出することができるものとして同定した。上位の性能のプライマーセットを、増幅速度を増加させ、交差反応性を低下させるために当該セットの１つまたは複数のプライマーを再設計することによって、さらに最適化した。上位の性能のプライマーセットをセット１、２、および３と命名し、上記表１中に記載する。

【0126】

[134]図１Ａ～図１Ｂは、経験的に試験した１６個の異なるプライマーセットの代表的な増幅プロファイルを示す。パネルＡおよびＢでは、矢印はそれぞれ上位の性能のプライマーセット１および２を示す。図１Ｃは、プライマーセット２の最適化によって設計したプライマーセット３の増幅プロファイルを示す。反応は、６５℃で１時間、合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ゲノムＲＮＡを鋳型として、約１００個のコピー／マイクロリットルの最終濃度で使用して行った。蛍光ＤＮＡ挿入色素を使用して増幅されたＤＮＡを検出した。

【0127】

[135]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＲＴ－ＬＡＭＰプライマーの特異性を、呼吸器ウイルスのパネルに対して試験することによって特徴づけた。これらは、インフルエンザＡＨ１Ｎ１（Ａ／ＮＹ／０２／０９）、パラインフルエンザ４Ａ型、パラインフルエンザ４Ｂ型、ライノウイルス（１Ａ）、アデノウイルス３型、インフルエンザＡＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）、呼吸器合胞体ウイルスＡ、パラインフルエンザ１型、コロナウイルスＮＬ６３、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ１２９）、インフルエンザＡＨ３（Ａ／ブリズベン／１０／０７）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＣＨ９３（１８）－１８）、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＨＫＵ－１、インフルエンザＢ（Ｂ／フロリダ／０２／０６）、パラインフルエンザ３型、ヒトメタニューモウイルス（ペルー６－２００３）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（フィラデルフィア）、パラインフルエンザ２型、コロナウイルス２２９Ｅ、ヒトボカウイルス肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＣＷＬ－０２９）を含んでいた。図２Ａ～図２Ｂに示すように、プライマーセット１および３はそれぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的増幅を実証し、他の呼吸器ウイルスに対する交差反応性はわずかであった。

【0128】

実施例２：ＲＴ－ＬＡＭＰによる不活性化ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス粒子の検出限界（ＬｏＤ）。

【0129】

[136]本発明者らは、唾液試料中におけるＲＮａｓｅの存在により、標的ＲＮＡの増幅の成功のためにはＲＮａｓｅ阻害剤の使用を要すると最初に決定した。本発明者らは、ＲＮａｓｅ阻害剤の添加が、疑似唾液試料中、１時間まで、室温で、ＲＮＡを完全に保存することができると決定した。疑似唾液は、様々な濃度の不活性化ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ビリオンを添加した、唾液およびＲＮａｓｅ阻害剤を含有する通常生理食塩水からなる。ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に直接加えた、ＲＮａｓｅ阻害剤を含有する疑似唾液を使用した直接アッセイは、１００個のコピーのＲＮＡまたはウイルス粒子／マイクロリットルを使用して、合成ＲＮＡまたは不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子のいずれかを、ＬＯＤ９５％で検出することができた。ＬＯＤ９５％は、試験の９５％がアッセイによって正確に検出される、単位体積あたり（または反応あたり）のゲノムＲＮＡ（またはウイルス粒子）のコピー数として定義される。試料の凍結または熱処理は回避した。ＲＮＡ鋳型を単回使用のチューブ内に分取し（たとえば１０００個のコピー／μｌ）、使用時まで－８０℃に保った。ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬は、適切な緩衝液、たとえば生理食塩水、上述のプライマーセット１、２、または３から選択されるオリゴヌクレオチドプライマーの組、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン供給源（たとえばＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）、ＤＮＡ挿入色素（たとえばＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）またはＥｖａＧｒｅｅｎ（商標））、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。

【0130】

[137]それぞれのＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬、および事前に決定した量のウイルス粒子（５０または１００個のビリオン／マイクロリットルのどちらか）を含有する約１％の疑似唾液試料を含有していた。反応を６５℃で１時間インキュベートした。シグナルをＦＩＴＣチャネルにおいてモニタリングして、挿入ＤＮＡ色素の取り込みを介して増幅された生成物を検出した。陽性試料について、Ｃｑまでの時間は１５～２５分間であった。Ｃｑは、最大半減シグナルに到達するために必要な時間である。陰性試料中におけるシグナルは６０分後に現れたが、時折、シグナルは３０分後に生じた。結果を以下の表２および図３中に要約する。これらの結果は、このプロトコルのＬｏＤ９５％が約１００個のコピー／ｕｌであることを示す。アッセイは、ウイルス量＝５０個のコピー／ｕｌで、陽性試料の７５％を依然として正しく検出することができる。

【0131】

【表2】

唾液試料採取：
[138]ＲＮａｓｅ阻害剤を唾液試料に、採取後にできるだけ早く加えるべきである。唾液試料は、ＲＮａｓｅ阻害剤を添加した生理食塩水、水、またはウイルス移動培地中に採取することができる。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前、試料は、４℃で保存してよく、室温で１時間まで安定であるが、理想的には、試料採取からＲＴ－ＬＡＭＰアッセイまでの時間は最小限にするべきである。

【0132】

実施例３：溶解ステップの追加でＬＯＤが改善
[139]不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を使用してＬＯＤを改善させるためのアッセイのさらなる洗練において、本発明者らは、別の溶解ステップを加えることによって、ＬＯＤを５～１０倍（１０～２０個のビリオン／μｌ）低下させることができると決定した。最適な溶解は、ＲＮａｓｅ阻害剤（たとえばＲｉｂｏＧｕａｒｄ（商標））を含有する溶解緩衝液（たとえばＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出緩衝液）を試料に加え、続いて、９５℃で３分間の熱処理で起こると決定された。その後、溶解試料を、以前の実施例において記載したものと同じ試薬を含有していたＲＴ－ＬＡＭＰ反応に直接加えた。結果を以下の表３および図４中に要約する。これらの結果は、この改変されたプロトコルのＬｏＤ９５％を約２０個のコピー／ｕｌまで改善させることができることを示す。プロトコルは、ウイルス量＝１０個のコピー／ｕｌで、陽性試料の７５％を依然として正しく検出することができる。

【0133】

【表3】

実施例４：遠心濾過ステップの追加でＬＯＤがさらに改善
[140]ＬＡＭＰ、ＲＴ－ＬＡＭＰ、ＲＰＡなどの等温ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅方法が、研究室およびＰＯＣ設定の両方において、様々な種類の試料（血液、唾液、組織、環境学的試料など）中における様々な病原体の検出のために以前に使用されている（Ｓｈｉ，Ｌｉら、２０１１、ＰａｎｅｋおよびＦｒａｃ、２０１９、Ｓｉｌｖａ，Ｐａｉｖａら、２０１９）。しかし、これらの方法による良好な感度を達成するためには、ＰＣＲに基づく手法と同様に、核酸（ＲＮＡ／ＤＮＡ）精製ステップが必要である（すなわち、シリカビーズまたはカラムに基づく精製、フェノール－クロロホルム抽出、エタノール沈殿など）。精製ステップはしばしば、研究室設定において訓練を受けた人員で行う必要があるため、ＰＯＣアッセイはしばしば、操作の容易性のために感度を犠牲にする。

【0134】

[141]本ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの感度をさらに増加させ、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ（分子診断学的アッセイの至適基準）と同等にするために、出発物質をさらに精製する必要があった。ほとんどの高感度の研究室アッセイでは、高感度を達成するために、ＲＮＡ精製を、そのワークフロー中の重大なステップとして使用する。ＲＮＡ精製は、細胞性不純物、ならびにＲＮＡを分解し得るおよび／またはアッセイの酵素反応を阻害し得る阻害剤、たとえば、ＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおける逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ反応の除去を可能にする。しかし、シリカビーズおよびカラムまたはフェノール－クロロホルム抽出を使用した最先端のＲＮＡ精製プロトコルは、膨大な実践時間、専門知識、および高価な試薬を要する。これらのワークフローは研究室設定において訓練を受けた人員によって行う必要があり、拡大するまたはＰＯＣ設定において使用するためには困難な課題である。

【0135】

[142]これらの課題に取り組み、本発明者らのアッセイの感度を増加させるために、本発明者らは、標準のＲＮＡ抽出／精製ステップを、開始生体試料中の不純物と比較したビリオンの物理特性の差異を活用することによって、ウイルス粒子を捕捉するように設計された新しいステップで置き換えた。様々な戦略を試験した後、ウイルス粒子を有効に精製および濃縮するために、空気圧および遠心力による同時限外濾過を使用した（たとえば２００ＭＷＣＯのフィルターを使用した）方法に到達した。驚くべきことに、試料を化学的溶解および９５℃の熱処理に供するステップの前に、同時の限外濾過および遠心分離のこのステップを行うことで、標準のＲＮＡ抽出ステップを必要とせずに、アッセイの感度が著しく改善された。この最適化されたアッセイは、１～５個のコピー／μｌのＬＯＤ（９５％）で行われ、これは、実施例３のアッセイと比較して約４～１０倍の低下を印す。図５はこれらの結果を例示し、遠心濾過がＲＴ－ＬＡＭＰを用いた高感度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を可能にすることを示す。

【0136】

実施例５：例示的臨床プロトコル
[143]実施例４に記載のアッセイを使用した臨床プロトコルの例示的な一実施形態では、デスクトップｑＰＣＲ装置と適合性のある２７個の８本チューブＰＣＲ条片に、上述のようにＲＴ－ＬＡＭＰ試薬を満たす。それぞれのＰＣＲ条片は単一の患者試料のためを意図する。２つの異なるＲＴ－ＬＡＭＰ反応を使用し、異なるプライマーセットをそれぞれ含有する。これは、臨床的使用のために高い信頼度の頑強な結果を提供することを意図する。したがって、それぞれの条片中の最初の４本のチューブは、それぞれのＲＴ－ＬＡＭＰ反応について１つずつの、２つの陽性対照および２つの陰性対照を含有する。残りの４本のチューブは、患者試料用に確保されている２つのＲＴ－ＬＡＭＰ反応のそれぞれの二つ組を含有し得る。実際には、行う必要があるステップが、患者の試料採取および前処理ステップ、続いて、患者試料を患者試料チューブのそれぞれ内に分取するステップだけとなるように、ＰＣＲ条片は、所要のＲＴ－ＬＡＭＰ試薬および対照をチューブに事前にロードして提供し得る。

【0137】

【表4】

試料採取および前処理
[144]試料は、採取スワブを、１ｍｌの生理食塩水およびＲＮａｓｅ阻害剤を含有する第１の採取チューブ内に浸漬することによって、生理食塩水中に採取する。その後、生理食塩水試料のアリコート、たとえば５００μＬを、第２の採取チューブ、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＶｉｖａｓｐｉｎ遠心フィルターアセンブリ、１００ｋＤａのＭＷＣＯ中に含有されるフィルターアセンブリ上に加える。試料およびフィルターアセンブリを含有する第２の採取チューブを、たとえば１４，０００×ｇまたは１５，０００×ｇで２０分間、遠心分離に供する。遠心分離の後、約１０～１５μＬの試料濃縮物がフィルターアセンブリ中に保持され、残りの流通液を廃棄する。試料濃縮物を、溶解緩衝液を含有する調製ＰＣＲチューブ内に、たとえば４μｌの濃縮物を１６μｌの溶解緩衝液内に分取する。溶解緩衝液は、市販の緩衝液または標準の細胞溶解緩衝液、たとえば、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４などの適切なトリス緩衝液中に、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘなどの界面活性剤および４Ｍの塩酸グアニジンを含有するものであり得る。また、他の同様のＴｒｉｔｏｎ（商標）洗剤、またはＴｗｅｅｎ２０もしくはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（商標）洗剤、またはｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシドなどのマルトシドも使用し得る。同様に、トリスに加えて、他の適切な緩衝剤としては、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥ、ＴＥＳ、またはトリシンを挙げ得る。任意選択で、追加のＲＮａｓｅ阻害剤を溶解緩衝液に加え得る。その後、試料を、たとえば熱サイクラーまたは熱ブロックを使用して、９５℃で３分間の熱処理に供する。熱処理の直後に、試料のアリコート、たとえば５μＬをＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に加える、または４℃で保存する。ＲＴ－ＬＡＭＰを６５℃で９０サイクル（１分間／サイクル）行う。

【0138】

[145]プライマーセット１、２、または３を使用して、研究室設定下で、陽性はＣｑ＝１０～３０分間で増幅され、陰性はより後の時間、３０分間より長くまたは５０分間より長くのどちらかで増幅された。また、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を阻害する追加の物質を含有し得る患者試料も、さらなる時間を要し得る。たとえば、患者試料は、陽性試験には約３０～５０分間を要し得る一方で、陰性試験は９０分間より長い時間でシグナルを生じるであろう。

【0139】

実施例６：鼻腔スワブ試料のための例示的なプロトコルおよびキット
[146]実施形態では、本開示は、鼻腔スワブからの試料の採取に適したキットを提供する。一実施形態では、キットは、反応チューブと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの多重鎖の検出に必要な試薬およびベータ－アクチン（ＡｃｔＢ）ＲＮＡなどの内部対照ヒトＲＮＡを含む凍結乾燥試薬とを含む、チューブアセンブリを含有する。内部対照は、試料中の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの存在または非存在とは独立して、採取した鼻腔検体中におけるヒト細胞物質の存在を確認し、さらに、正しいアッセイの実行を管理する。

【0140】

[147]実施形態では、凍結乾燥試薬は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの膜タンパク質（Ｍ）領域およびＡｃｔＢ（ベータアクチン）ＲＮＡなどの内部対照ヒトＲＮＡの逆転写およびＤＮＡ増幅のためのプライマーと、任意選択で、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、ならびにＫＣｌおよび硫酸アンモニウムなどの塩のうちの１つまたは複数とを含む。実施形態では、凍結乾燥試薬は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。実施形態では、プライマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡのＭ領域に向けられた４～６個のプライマーの組、およびＤＡＲＱプライマーなどの少なくとも１つの検出プライマーを含む。実施形態では、プライマーは、表１に記載のプライマーセット４を含む。実施形態では、凍結乾燥試薬は、蛍光発生ＤＮＡ挿入色素、たとえば、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎもしくはＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）、またはＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩおよびＩＩなどの同様の色素、ＳＹＢＲＳａｆｅ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、オキサゾール黄色系シアニン色素（たとえば、ＹＯＹＯ－１、ＤｉＹＯ－１、ＴＯＴＯ－１、ＤｉＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８２、Ｂｏｘｔｏ、ＭｉａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｉａｍｉＹｅｌｌｏｗ、あるいはＭｉａｍｉＯｒａｎｇｅをさらに含んで、膜タンパク質（Ｍ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの標的領域、および／またはヒトＡｃｔＢ（ベータアクチン）ＲＮＡなどの内部対照ＲＮＡの逆転写およびＤＮＡ増幅が成功した際に蛍光シグナルを生じる。ＤＡＲＱプライマーおよび蛍光発生ＤＮＡ挿入色素の両方を含む実施形態によれば、ＤＡＲＱおよびＤＮＡ挿入色素の蛍光波長は、両方のシグナルの同時検出が反応中で可能であるように、異なる。蛍光発生ＤＮＡ挿入色素は、アッセイ中の試薬の完全性が損なわれていないことを確実にするための測度として役割を果たす。他の実施形態では、凍結乾燥試薬混合物は、緩衝剤、塩（たとえばＫＣｌおよび（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、ならびに非イオン性界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ２０）をさらに含む。実施形態では、凍結乾燥試薬混合物は、ＲＮａｓｅ阻害剤、血清アルブミン（たとえばウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩、たとえばＴＣＥＰ－ＨＣｌなどの還元剤、ならびに熱不安定性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）のうちの１つまたは複数をさらに含む。

【0141】

[148]キットはまた、任意選択で、採取スワブ、試料の溶出および溶解のための緩衝液を含有する採取チューブ、ならびにホールピペットのうちの１つまたは複数もさらに含有し得る。一実施形態では、緩衝液は、洗剤、緩衝液、およびＰＶＳＡなどのＲＮａｓｅ阻害剤、ならびにヌクレアーゼを含まない水を含む。例示的なキットを図６に例示する。

【0142】

[149]以下に、試料の採取および処理のための例示的なワークフローを例示する。

【0143】

[150]前鼻腔（ＡＮ）スワブ試料採取：滅菌スワブを一方の鼻孔内に抵抗を感じるまで挿入し、鼻孔の側壁に約１０秒間こすりつける。同じプロセスを他方の鼻孔で繰り返す（これは、自己採取または医療従事者の施行のどちらであることもできる）。

【0144】

[151]試料の溶出：スワブを緩衝液中で回転させることによって、たとえば３０回回転させることによって、ＡＮスワブ試料を溶出緩衝液中で溶出させる。

【0145】

[152]試料の移動：単回使用ホールピペットを使用して、７５～２００ｕＬ、たとえば約１００ｕＬの溶出試料を、ＲＴ－ＬＡＭＰを行うための試薬の凍結乾燥混合物と、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応中に試験管内の溶液を混合するために使用するステンレス鋼ボールベアリングとを含有するチューブアセンブリに移す。

【0146】

[153]ＲＴ－ＬＡＭＰ＋シグナルの読み取り：試験管を、６７℃で２５～３０分間の反応のために適切な機器内に挿入する。反応中、ＦＡＭおよびＨＥＸチャネル中の蛍光シグナルを２０秒ごとに一回測定する。

【0147】

実施例７：プライマーセット４の結果
[154]以下の実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの膜タンパク質（Ｍ）領域を第１の標的として、およびヒトベータアクチン（ＡｃｔＢ）ＲＮＡを第２の標的として用いた、単一の反応混合物中における２つの異なる核酸標的の増幅および検出の成功を実証する。本技法では、ＤＮＡ挿入色素、この事例ではＣｈａｉＧｒｅｅｎ（商標）と、ＤＡＲＱプライマーと呼ばれるプライマーの増幅した標的の検出のための、鎖分離の際に蛍光シグナルを発するクエンチャー－フルオロフォア二重鎖領域を含有するように適応させた検出プライマーとの両方を利用した。ＤＮＡ挿入色素の蛍光シグナルの増加は、２つの異なる核酸標的のうちのどちらかまたは両方が増幅されたことを示す一方で、ＤＡＲＱプライマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの膜タンパク質（Ｍ）領域などの２つの核酸標的のうちの一方が増幅された場合にのみ、シグナルを生じるように設計されている。これらの実験では、ＤＡＲＱプライマーおよびＤＮＡ挿入色素は、その蛍光シグナルを異なる波長で発し、２つのシグナルが別々に検出されることを可能にする。

【0148】

[155]鼻腔スワブ試料ありまたはなしの、陰性および陽性試料の増幅曲線を、図７に示す。鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表し、遅いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される（図７Ａ）。鼻腔スワブ試料なしでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる、速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表す一方で、遅いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＞２６分）は偽の増幅を示し、無視される（図７Ｂ）。鼻腔スワブ試料なしでは、２６分以内のＦＡＭチャネルシグナルおよびＨＥＸチャネルシグナルの両方の非存在は、試料中のウイルスの非存在を示す。鼻腔スワブ試料ありでは、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ベータアクチンおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全体的な存在を表す（図７Ｃ）。鼻腔スワブ試料ありでは、１個のウイルスコピー／μＬの試験において見られる、速いＨＥＸチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの存在を表し、速いＦＡＭチャネル増幅（Ｔ_ｄ＜２６分）およびＨＥＸチャネル増幅が遅いまたはないことは、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがない鼻腔スワブ試料を示す（図７Ｄ）。

【0149】

[156]要約すると、ＨＥＸが、増幅されたウイルスを検出し、ＦＡＭが、ウイルスまたは内部対照であるベータ－アクチン（ＡｃｔＢ）のどちらかである可能性がある増幅されたＤＮＡを検出する場合、以下がアッセイ結果の解釈を記載する：
ＨＥＸ＋ＦＡＭ＋：ウイルスの存在を示す、
ＨＥＸ－ＦＡＭ＋：ウイルスが存在しないことを示す、
ＨＥＸ－ＦＡＭ－：不確定、アッセイを再実行するべきである、および
ＨＥＸ＋ＦＡＭ－：不確定、アッセイを再実行するべきである。

【0150】

[157]図８に示す検出限界（ＬＯＤ）研究は、アッセイのＬＯＤが３０００個のウイルスコピー／スワブであることを示す。範囲発見実験を、１５００、３０００、および６０００個のウイルスコピー／スワブについて行った。１５００個のコピー／スワブの試料で１つ、および３０００個のコピー／スワブの試料で１つが、ＨＥＸチャネルＴ_ｄ＞２６分を有し、これは、本発明者らの試験アルゴリズムによって「陰性」と呼ばれる。２３個のうち２２個の複製組が本発明者らの試験アルゴリズムによって「陽性」と正しく呼ばれた後に、３０００個のコピー／スワブがＬＯＤであると決定された（＞９５％、閾値は米国食品医薬品局によって設定）。

【0151】

[158]交差反応性。潜在的に交差反応性のある生物を用いて試験を実行した。それぞれの生物を表５に列挙した濃度で、陰性臨床的鼻腔マトリックス中で調製し、５０μＬをピペットで新しい未使用の鼻腔スワブ上に載せた。それぞれの生物を３回繰り返して試験した。どの生物も交差反応性があると判明しなかった。

【0152】

【表5-1】

【0153】

【表5-2】

[159]妨害物質。それぞれの妨害物質について３つの陽性および３つの陰性の複製組を用いて試験を実行した。それぞれの物質を表６に列挙した濃度で、陰性臨床的鼻腔マトリックス中で調製し、５０μＬをピペットで新しい未使用の鼻腔スワブ上に載せた。陽性複製組を調製するために、不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子を、妨害物質含有陰性臨床的マトリックス中に添加し、５０μＬの添加した臨床的マトリックスをピペットで新しい未使用の鼻腔スワブ上に載せた。試験が無効な結果を返した場合、試験を新しい試験キットで繰り返した。試験が無効な結果を返し続けた場合、妨害物質を希釈し、試験プロセスを繰り返した。どの物質も試験した濃度で異常な結果を生じなかった。