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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-19
(54)【発明の名称】がん治療のための鋳型指向性免疫調節
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20240112BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240112BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240112BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240112BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240112BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240112BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K9/51
A61K47/02
A61K47/36
A61P35/00
A61P43/00 105
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540752
(86)(22)【出願日】2021-12-29
(85)【翻訳文提出日】2023-08-28
(86)【国際出願番号】 US2021065580
(87)【国際公開番号】W WO2022147177
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】63/132,315
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523248736
【氏名又は名称】トランスコード セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ダドリー， ロバート マイケル
(72)【発明者】
【氏名】リウ， チヨン ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ゴーシュ， スブラタ クマール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA65
4C076BB11
4C076CC50
4C076DD29
4C076EE38H
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA38
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
(57)【要約】
がんを処置するための組成物および方法であって、非腫瘍環境と比較して腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的な一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、組成物および方法が、本明細書に記載される。ある特定の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、対象に治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんを処置するための方法であって、対象に治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法。
【請求項2】
腫瘍または腫瘍微小環境中のＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、対象に、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、前記腫瘍または腫瘍微小環境中で発現されるｍｉＲＮＡと相補的である配列を含み、前記ＲＩＧ－Ｉが、前記ｍｉＲＮＡ．３を発現する前記腫瘍または腫瘍微小環境中で選択的に活性化される、方法。
【請求項3】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、前記ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｍｉＲＮＡが発癌性ｍｉＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ｍｉＲＮＡが腫瘍関連ｍｉＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記二重鎖がＡＧＯ２によって切断されない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記二重鎖がＲＩＧ－Ｉを活性化する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＲＩＧ－Ｉ活性化が、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＲＩＧ－Ｉ活性化が、腫瘍特異的免疫応答を惹起する、請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記腫瘍特異的免疫応答が、Ｉ型ＩＦＮ、ＤＡＭＰ（危険関連分子パターン）、および／または腫瘍抗原の放出を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記腫瘍または腫瘍微小環境に対する免疫記憶を誘導する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記がんが、固形腫瘍である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記固形腫瘍が、肉腫、癌、およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記がんが、非固形腫瘍である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記非固形腫瘍が、白血病、骨髄腫、およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記がんが、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、結腸がん、子宮頸がん、腎臓がん、食道がん、肝臓がん、肺がん、甲状腺がん、皮膚がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、胃がん、子宮がん、神経膠芽腫、または頭頸部がんからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。請求項１６．前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、他のいかなる修飾も含まない、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、最大で４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記２’－Ｆリボース修飾が、前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端から１０または１１番目のヌクレオチドに存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含まない、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含まない、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、シュードウリジン（Ψ）を含まない、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）修飾を含まない、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）修飾を含まない、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）修飾を含まない、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）修飾を含まない、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１９ヌクレオチド長である配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、１５～３０ヌクレオチド長である配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、１６～２７ヌクレオチド長である配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、前記ｍｉＲＮＡと完全に相補的である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性ｍＲＮＡと競合して、前記ｍｉＲＮＡに結合する、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記二重鎖が、０～５個のミスマッチ塩基対を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
配列番号６の核酸配列を有する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
配列番号６の核酸が、ｍｉＲ－２１と相補的である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記がんが、乳房、卵巣、子宮頸部、結腸、肺、肝臓、脳、食道、前立腺、膵臓、および甲状腺のがんからなる群から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項41】
配列番号１の核酸配列を有する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
配列番号１の核酸が、ｍｉＲ－１０ｂと相補的である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記がんが、非小細胞肺がんまたは子宮頸がんである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項44】
前記がんが、転移性がんである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
シトシンおよびウラシルが、前記ＡＧＯ２切断部位に存在する、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記転移性がんが、乳房、リンパ節、肺、骨、脳、肝臓、卵巣、腹膜、筋肉組織、膵臓、前立腺、食道、結腸、直腸、胃、鼻咽頭または皮膚に局在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた処置が、単剤治療である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、静脈内投与、皮下投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または局部投与によって投与される、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
がんを処置するための方法であって、対象に、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ；
デキストランコーティング；および
一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド
を含む磁性ナノ粒子の治療有効量を投与することを含み、
前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法。
【請求項53】
前記磁性ナノ粒子が、約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記磁性ナノ粒子が、約８～約１４の範囲の非線形性指数を有する、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項55】
前記磁性ナノ粒子が、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記磁性ナノ粒子が、少なくとも２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記磁性ナノ粒子が、少なくとも３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記磁性ナノ粒子が、少なくとも４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記磁性ナノ粒子が、少なくとも５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記磁性ナノ粒子が、最大で４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される、請求項５２から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記ｍｉＲＮＡが発癌性ｍｉＲＮＡである、請求項５２から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記ｍｉＲＮＡが腫瘍関連ｍｉＲＮＡである、請求項５２から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
支持治療または補助治療を投与することをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記補助治療が、放射線治療、凍結治療、および超音波治療を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
追加の治療剤を投与することを含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項67】
前記追加の治療剤が、ｍｉＲＮＡを含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
請求項６７に記載のｍｉＲＮＡが、前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドと相補的である、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記追加の治療剤が、標的化治療、化学療法剤、免疫治療剤、免疫原性細胞死誘導剤（ＩＣＤｉ）、およびｓｉＲＮＡ治療からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項70】
外科手術をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記化学療法剤が、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、オールトランスレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびベバシズマブからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項72】
前記標的化治療が、トラスツズマブ、ジオトリフ、プロロイキン、アレクチニブ、キャンパス、アテゾリズマブ、アベルマブ、アキシチニブ、ベリムマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベルケイド、カナキヌマブ、セリチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ダサチニブ、デノスマブ、エロツズマブ、エナシデニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、ザイデリグ、イマチニブ、レンバチニブ、ミドスタウリン、ネシツムマブ、ニラパリブ、オビヌツズマブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、トシリズマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項73】
前記免疫治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６９に記載の方法。
【請求項74】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記補助治療が、前記ｍｉＲＮＡの発現を誘導する、請求項６４から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項76】
前記追加の治療剤が、前記ｍｉＲＮＡの発現を誘導する、請求項６６から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項77】
前記ＩＣＤｉが、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、およびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項78】
前記ｓｉＲＮＡ治療が、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＧＦ－β、および／またはＶＥＧＦを標的とする、請求項７３に記載の方法。
【請求項79】
前記支持治療または補助治療が、前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される、請求項６４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
非腫瘍組織と比較して腫瘍組織中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項81】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される、請求項８０に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項82】
前記ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成することができる、請求項８０または８１に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項83】
前記二重鎖がＡＧＯ２によって切断されない、請求項８０から８２のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項84】
前記二重鎖がＲＩＧ－Ｉを活性化する、請求項８０から８３のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項85】
前記ＲＩＧ－Ｉ活性化が、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい、請求項８４に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項86】
前記ＲＩＧ－Ｉ活性化が、腫瘍特異的免疫応答を惹起する、請求項８４または８５に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項87】
前記腫瘍特異的免疫応答が、Ｉ型ＩＦＮ、ＤＡＭＰ（危険関連分子パターン）、および／または腫瘍抗原の放出を含む、請求項８６に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項88】
他のいかなる修飾も含まない、請求項８０から８７のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項89】
２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾をさらに含む、請求項８０から８８のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項90】
２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含まない、請求項８０から８９のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項91】
Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含まない、請求項８０から９０のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項92】
シュードウリジン（Ψ）を含まない、請求項８０から９１のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項93】
Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）修飾を含まない、請求項８０から９２のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項94】
５－メチル－シチジン（５ｍＣ）修飾を含まない、請求項８０から９２のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項95】
５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）修飾を含まない、請求項８０から９４のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項96】
５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）修飾を含まない、請求項８０から９５のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項97】
前記ｍｉＲＮＡと完全に相補的である、請求項８０から９６のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項98】
内因性ｍＲＮＡと競合して、前記ｍｉＲＮＡに結合する、請求項８０から９７のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項99】
前記二重鎖が、０～５個のミスマッチ塩基対を含む、請求項８２から９８のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項100】
配列番号１～１３のいずれか１つの核酸配列を含む、請求項８０から９９のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項101】
ナノ粒子にさらに連結されている、請求項８０から１００のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項102】
前記ナノ粒子が、磁性ナノ粒子である、請求項１０１に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項103】
前記磁性ナノ粒子が、ポリマーコーティングでコーティングされている、請求項１０２に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項104】
前記ポリマーコーティングが、デキストランである、請求項１０３に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項105】
前記磁性ナノ粒子が、酸化鉄；および１つまたは複数のアミン基で官能化されたデキストランコーティングを含み、前記１つまたは複数のアミン基の数が、約５個～約１０００個の範囲である、請求項１０２から１０４のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項106】
前記磁性ナノ粒子の鉄含量が、約５０重量％（ｗｔ）～約１００％ｗｔの鉄（ＩＩＩ）および約０％ｗｔ～約５０％ｗｔの鉄（ＩＩ）を含む、請求項１０２から１０５のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項107】
前記磁性ナノ粒子が、約５個～約１５０個のアミノ基を含む、請求項１０２から１０６のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項108】
磁性ナノ粒子が、１つまたは複数のそのような修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項109】
塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ；デキストランコーティング；および
一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド
を含む磁性ナノ粒子であって、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、磁性ナノ粒子。
【請求項110】
約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する、請求項１０９に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項111】
約８～約１４の範囲の非線形性指数を有する、請求項１０９または１１０に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項112】
約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む、請求項１０９から１１１のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項113】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される、請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項114】
前記ｍｉＲＮＡが発癌性ｍｉＲＮＡである、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項115】
前記ｍｉＲＮＡが腫瘍関連ｍｉＲＮＡである、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項116】
２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０９から１１５のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項117】
前記２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、異なるｍｉＲＮＡと相補的である、請求項１１６に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項118】
前記２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、同じｍｉＲＮＡと相補的である、請求項１１６に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項119】
請求項８０から１０８のいずれか一項に記載の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは請求項１０９から１１８のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項120】
送達剤をさらに含む、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項121】
前記送達剤が、ミセル、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ）、球状核酸（ＳＮＡ）、細胞外ベシクル、合成ベシクル、エキソソーム、リピドイド、リポソーム、およびリポプレックスからなる群から選択される、請求項１２０に記載の医薬組成物。
【請求項122】
前記リポソームが、脂質二重層から形成される、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項123】
前記脂質二重層が、リン酸脂質、ホスホグリセロール脂質、ホスホコリン脂質、およびホスホエタノールアミン脂質からなる群から選択される１つまたは複数のリン脂質を含む、請求項１２２に記載の医薬組成物。
【請求項124】
前記リン脂質が、ＰＥＧ化されている、請求項１２３に記載の医薬組成物。
【請求項125】
前記送達剤が、リポソームまたは脂質ナノ粒子である、請求項１２１に記載の医薬組成物。
【請求項126】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が、追加の治療剤をさらに送達する、請求項１２５に記載の医薬組成物。
【請求項127】
前記追加の治療剤が、ＩＣＤｉ（例えば、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、およびパクリタキセル）である、請求項１２６に記載の医薬組成物。
【請求項128】
前記追加の治療剤が、ｓｉＲＮＡ（例えば、がんと関連する遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ）である、請求項１２６に記載の医薬組成物。
【請求項129】
前記追加の治療剤が、化学療法剤である、請求項１２６に記載の医薬組成物。
【請求項130】
少なくとも１つの追加の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項131】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１９から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項132】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１９から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項133】
前記修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１９から１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，３１５号の優先権の利益を主張する。前記出願の明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，３１５号の優先権の利益を主張する。前記出願の明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
がんは、全体的なヒトの健康に対する継続的かつ重大な脅威を表す。がんを処置するための新規メカニズムの利用は、有効ながん処置のための進行中かつ緊急の必要性を満たす治療剤を送達する有望な手段を表す。最近の研究により、合成ＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ）アゴニストの全身送達が腫瘍成長を阻害することが示されている。ＲＩＧ－Ｉは、ウイルスＲＮＡ中に典型的に見出される共通モチーフである、非キャップ付加５’－三リン酸部分を有する短い二本鎖ＲＮＡを感知する。ＲＩＧ－Ｉは、腫瘍細胞を含む多数の細胞型において発現され、がん治療のための有望な標的として役立つ。したがって、がんを処置するために腫瘍微小環境中のＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための組成物および方法を提供することが本開示の目的である。ＲＩＧ－Ｉを活性化するための手段として内因性ｍｉＲＮＡを利用する治療方法は、腫瘍微小環境を標的とし、種々の関連するがんを処置するための非常に有望な手法を提供する。
がんは、全体的なヒトの健康に対する継続的かつ重大な脅威を表す。がんを処置するための新規メカニズムの利用は、有効ながん処置のための進行中かつ緊急の必要性を満たす治療剤を送達する有望な手段を表す。最近の研究により、合成ＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ）アゴニストの全身送達が腫瘍成長を阻害することが示されている。ＲＩＧ－Ｉは、ウイルスＲＮＡ中に典型的に見出される共通モチーフである、非キャップ付加５’－三リン酸部分を有する短い二本鎖ＲＮＡを感知する。ＲＩＧ－Ｉは、腫瘍細胞を含む多数の細胞型において発現され、がん治療のための有望な標的として役立つ。したがって、がんを処置するために腫瘍微小環境中のＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための組成物および方法を提供することが本開示の目的である。ＲＩＧ－Ｉを活性化するための手段として内因性ｍｉＲＮＡを利用する治療方法は、腫瘍微小環境を標的とし、種々の関連するがんを処置するための非常に有望な手法を提供する。
【0003】
本開示の組成物および方法は、非腫瘍環境と比較して腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的な一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用して腫瘍微小環境中のＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の概要
ある特定の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、対象に治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法に関する。
ある特定の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、対象に治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法に関する。
【0005】
ある特定の態様では、本開示は、腫瘍または腫瘍微小環境中のＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、対象に、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、腫瘍または腫瘍微小環境中で発現されるｍｉＲＮＡと相補的である配列を含み、ＲＩＧ－Ｉが、ｍｉＲＮＡを発現する前記腫瘍または腫瘍微小環境中で選択的に活性化される、方法に関する。
【0006】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは腫瘍関連ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、二重鎖はＡＧＯ２によって切断されない。一部の実施形態では、二重鎖はＲＩＧ－Ｉを活性化する。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、腫瘍特異的免疫応答を惹起する。一部の実施形態では、腫瘍特異的免疫応答は、Ｉ型ＩＦＮ、ＤＡＭＰ（危険関連分子パターン）、および／または腫瘍抗原の放出を含む。一部の実施形態では、方法は、腫瘍または腫瘍微小環境に対する免疫記憶を誘導する。
【0007】
一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一部の実施形態では、固形腫瘍は、肉腫、癌、およびリンパ腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、結腸がん、子宮頸がん、腎臓がん、食道がん、肝臓がん、肺がん、甲状腺がん、皮膚がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、胃がん、子宮がん、神経膠芽腫、または頭頸部がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、他のいかなる修飾も含まない。
【0008】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【0009】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾をさらに含む。一部の実施形態では、２’－Ｆリボース修飾は、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端から１０または１１番目のヌクレオチドに存在する。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）修飾を含まない。
【0010】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１９ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１５～３０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１６～２７ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的である。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡと競合して、ｍｉＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、二重鎖は、０～５個のミスマッチ塩基対を含む。
【0011】
一部の実施形態では、方法は、配列番号６の核酸配列を有する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含む。一部の実施形態では、配列番号６の核酸は、ｍｉＲ－２１と相補的である。一部の実施形態では、がんは、乳房、卵巣、子宮頸部、結腸、肺、肝臓、脳、食道、前立腺、膵臓、および甲状腺のがんからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、配列番号１の核酸配列を有する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含む。一部の実施形態では、配列番号１の核酸は、ｍｉＲ－１０ｂと相補的である。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんまたは子宮頸がんである。一部の実施形態では、がんは、転移性がんである。一部の実施形態では、シトシンおよびウラシルは、ＡＧＯ２切断部位に存在する。一部の実施形態では、転移性がんは、乳房、リンパ節、肺、骨、脳、肝臓、卵巣、腹膜、筋肉組織、膵臓、前立腺、食道、結腸、直腸、胃、鼻咽頭または皮膚に局在する。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた処置は、単剤治療である。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、静脈内投与、皮下投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または局部投与によって投与される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0012】
ある特定の態様では、本開示は、がんを処置するための方法であって、対象に、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ；デキストランコーティング；および一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む磁性ナノ粒子の治療有効量を投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、方法に関する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８～約１４の範囲の非線形性指数を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは腫瘍関連ｍｉＲＮＡである。
【0013】
一部の実施形態では、方法は、支持治療または補助治療を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、補助治療は、放射線治療、凍結治療、および超音波治療を含む。
【0014】
一部の実施形態では、方法は、追加の治療剤を投与することを含む。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、標的化治療、化学療法剤、免疫治療剤、免疫原性細胞死誘導剤（ＩＣＤｉ）、およびｓｉＲＮＡ治療からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、外科手術をさらに含む。一部の実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、オールトランスレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびベバシズマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化治療は、トラスツズマブ、ジオトリフ、プロロイキン、アレクチニブ、キャンパス、アテゾリズマブ、アベルマブ、アキシチニブ、ベリムマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベルケイド、カナキヌマブ、セリチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ダサチニブ、デノスマブ、エロツズマブ、エナシデニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、ザイデリグ、イマチニブ、レンバチニブ、ミドスタウリン、ネシツムマブ、ニラパリブ、オビヌツズマブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、トシリズマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））からなる群から選択される。一部の実施形態では、補助治療は、ｍｉＲＮＡの発現を誘導する。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ｍｉＲＮＡの発現を誘導する。一部の実施形態では、ＩＣＤｉは、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、およびパクリタキセルからなる群から選択される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ治療は、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＧＦ－β、および／またはＶＥＧＦを標的とする。一部の実施形態では、支持治療または補助治療は、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される。
【0015】
ある特定の態様では、本開示は、非腫瘍組織と比較して腫瘍組織中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、前記ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成することができる。一部の実施形態では、二重鎖はＡＧＯ２によって切断されない。一部の実施形態では、二重鎖はＲＩＧ－Ｉを活性化する。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、腫瘍特異的免疫応答を惹起する。一部の実施形態では、腫瘍特異的免疫応答は、Ｉ型ＩＦＮ、ＤＡＭＰ（危険関連分子パターン）、および／または腫瘍抗原の放出を含む。
【0016】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、他のいかなる修飾も含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾をさらに含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）修飾を含まない。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと完全に相補的である。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡと競合して、ｍｉＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、二重鎖は、０～５個のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0017】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子にさらに連結されている。一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性ナノ粒子である。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、ポリマーコーティングでコーティングされている。一部の実施形態では、ポリマーコーティングは、デキストランである。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、酸化鉄；および１つまたは複数のアミン基で官能化されたデキストランコーティングを含み、１つまたは複数のアミン基の数が、約５個～約１０００個の範囲である。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子の鉄内容物（iron content）は、約５０重量（ｗｔ）％～約１００％ｗｔの鉄（ＩＩＩ）および約０％ｗｔ～約５０％ｗｔの鉄（ＩＩ）を含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約５個～約１５０個のアミノ基を含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１つまたは複数のそのような修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【0018】
ある特定の態様では、本開示は、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ；デキストランコーティング；および一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む磁性ナノ粒子を含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍または非腫瘍微小環境と比較して腫瘍または腫瘍微小環境中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、組成物に関する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８～約１４の範囲の非線形性指数を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは腫瘍関連ｍｉＲＮＡである。
【0019】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、異なるｍｉＲＮＡと相補的である。一部の実施形態では、２個またはそれより多い修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、同じｍｉＲＮＡと相補的である。
【0020】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは磁性ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、送達剤をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、ミセル、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ）、球状核酸（ＳＮＡ）、細胞外ベシクル、合成ベシクル、エキソソーム、リピドイド、リポソーム、およびリポプレックスからなる群から選択される。一部の実施形態では、リポソームは、脂質二重層から形成される。一部の実施形態では、脂質二重層は、リン酸脂質、ホスホグリセロール脂質、ホスホコリン脂質、およびホスホエタノールアミン脂質からなる群から選択される１つまたは複数のリン脂質を含む。一部の実施形態では、リン脂質は、ＰＥＧ化されている。一部の実施形態では、送達剤は、リポソームまたは脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、追加の治療剤をさらに送達する。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＩＣＤｉ（例えば、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、およびパクリタキセル）である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ｓｉＲＮＡ（例えば、がんと関連する遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤である。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0021】
一部の実施形態では、５’二リン酸（５’ｐｐ抗ｍｉＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）または５’三リン酸修飾（５’ｐｐｐ抗ｍｉＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）を有する、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡであって、好ましくは、それぞれ、表１、表２、または表３に列挙されるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡと相補的である配列を含む一本鎖アンチセンスＲＮＡが本明細書で提供される。また、内因性（好ましくは、腫瘍特異的）ＲＮＡ配列と相補的である少なくとも１０ヌクレオチド長の５’二リン酸（５’ｐｐ）または５’三リン酸（５’ｐｐｐ）修飾ＲＮＡを含むＲＩＧ－Ｉアゴニストも提供される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドである。
【0022】
一部の実施形態では、例えば、がんを処置するため、およびがんを発症するリスクを低減させるために、特異的ＲＮＡ、例えば、内因性ＲＮＡ配列に対する免疫応答を惹起するための５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ抗ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡを含む組成物および方法が、本明細書で提供される。
【0023】
一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、ナノ粒子に連結され、前記ナノ粒子は、１０ｎｍ～３０ｎｍの直径を有し、ポリマーコーティングを含む。
【0024】
一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、ナノ粒子に連結され、前記ナノ粒子は、１０ｎｍ～３０ｎｍの直径を有し、ポリマーコーティングを含む。一部の実施形態では、ポリマーコーティングは、デキストランを含む。
【0025】
一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む化学部分を介してナノ粒子に３’末端において共有結合で連結される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性である。
【0026】
また、本明細書に記載される一本鎖アンチセンスＲＮＡを含む医薬組成物も本明細書で提供される。さらに、対象におけるがんを処置するため、またはがんを発症するリスクを低減させるための方法が、本明細書で提供される。方法は、治療有効量の本明細書に記載の一本鎖アンチセンスＲＮＡを、がんを有する、またはがんを発症するリスクがある対象に投与することを含む。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、血液がん、骨のがん、脳がん、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、胃がん、甲状腺がん、および子宮がんからなる群から選択される。
【0027】
一部の実施形態では、投与は、対象のリンパ節における腫瘍サイズの低下もしくは安定化、または転移性腫瘍成長の速度の低下をもたらす。一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、２またはそれより多い用量で対象に投与される。一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、少なくとも週１回、対象に投与される。一部の実施形態では、一本鎖アンチセンスＲＮＡは、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、または腹腔内投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、対象は、化学療法剤をさらに投与される。
【0028】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明における使用のための方法および材料が、本明細書に記載される；当技術分野で公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定的であることを意図したものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１は、本明細書に記載のナノ粒子送達システムを使用して腫瘍および転移物に送達される、５’三リン酸化アンチセンスｔｓＲＮＡの送達の概略図である。アンチセンスｔｓＲＮＡおよび腫瘍特異的ｔｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーションによって、強力なＲＩＧ－Ｉアゴニストである５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡを産生する。ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路の活性化は、腫瘍微小環境に特異的なＩ型ＩＦＮ誘導性免疫応答をもたらす。この免疫応答は、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、およびマクロファージの活性化を特徴とする。このプロセスは、活性化されたＤＣおよびマクロファージによる有効な腫瘍抗原提示ならびにＴ細胞の成熟、活性化および腫瘍細胞殺傷を伴う。同時に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が阻害され、抗腫瘍免疫応答に対するその免疫抑制作用を低減させる。重要なことに、再チャレンジの際に外来のものとして腫瘍の完全な免疫拒絶を誘発する記憶Ｔ細胞サブ集団が生成される。合わせて、これらのプロセスは、完全な寛解およびがん再発に対する耐性をもたらす。
【0030】
【図2A-2B】図２は、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がヒトＲＩＧ－Ｉルシフェラーゼリポーター細胞系ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩにおいてＲＩＧ－Ｉ活性化を誘導する能力を示す概要データを提供する。細胞におけるＲＩＧ－Ｉの高発現を、ウェスタンブロットを使用して確認した（図２Ａ）。ヌル細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ過剰発現細胞においてルシフェラーゼ活性の非常に有意な増強が観察された（図２Ｂ）。２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、および８μｇ／ｍＬの用量レベルのｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を、ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにおいて評価した。試験したｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１の３つ全ての用量レベルで、有意なＲＩＧ－Ｉ活性化が観察された（図２Ｃ）。用量依存的なカスパーゼ３／７の活性化が観察され、これは５’－ｐｐｐの存在下でより顕著であった（図２Ｄ）。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１ ＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用した場合、腫瘍細胞生存能力の用量依存的低下も観察された（図２Ｅ）。
【図2C-2D】図２は、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がヒトＲＩＧ－Ｉルシフェラーゼリポーター細胞系ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩにおいてＲＩＧ－Ｉ活性化を誘導する能力を示す概要データを提供する。細胞におけるＲＩＧ－Ｉの高発現を、ウェスタンブロットを使用して確認した（図２Ａ）。ヌル細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ過剰発現細胞においてルシフェラーゼ活性の非常に有意な増強が観察された（図２Ｂ）。２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、および８μｇ／ｍＬの用量レベルのｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を、ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにおいて評価した。試験したｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１の３つ全ての用量レベルで、有意なＲＩＧ－Ｉ活性化が観察された（図２Ｃ）。用量依存的なカスパーゼ３／７の活性化が観察され、これは５’－ｐｐｐの存在下でより顕著であった（図２Ｄ）。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１ ＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用した場合、腫瘍細胞生存能力の用量依存的低下も観察された（図２Ｅ）。
【図2E】図２は、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がヒトＲＩＧ－Ｉルシフェラーゼリポーター細胞系ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩにおいてＲＩＧ－Ｉ活性化を誘導する能力を示す概要データを提供する。細胞におけるＲＩＧ－Ｉの高発現を、ウェスタンブロットを使用して確認した（図２Ａ）。ヌル細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ過剰発現細胞においてルシフェラーゼ活性の非常に有意な増強が観察された（図２Ｂ）。２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、および８μｇ／ｍＬの用量レベルのｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を、ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにおいて評価した。試験したｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１の３つ全ての用量レベルで、有意なＲＩＧ－Ｉ活性化が観察された（図２Ｃ）。用量依存的なカスパーゼ３／７の活性化が観察され、これは５’－ｐｐｐの存在下でより顕著であった（図２Ｄ）。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１ ＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用した場合、腫瘍細胞生存能力の用量依存的低下も観察された（図２Ｅ）。
【0031】
【図3A】図３は、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞におけるｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導を示す概要データを提供する。細胞に、０ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、および３００ｎｇ／ｍＬ濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした；ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された；５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合のｍｉＲＮＡ－２１模倣体の８３．４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０が決定された；対照的に、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の算出されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。増加する濃度のＲＩＧ－Ｉアゴニストを用いたＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞の処置は、ＩＦＮ－β分泌の用量依存的増加を引き起こした；対照的に、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡアゴニストは、ＩＦＮ－β分泌を刺激することができなかった（図３Ｃ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのカスパーゼ３／７活性化を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス（muring）黒色腫細胞において測定した；カスパーゼ３／７活性化の用量依存的増加が観察され、その効果は、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１と比較してｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞において有意に高く、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照と同等であった（図３Ｄ）。図３Ｅは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞が、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドに関して見られたレベルを超えるＲＩＧ－Ｉの劇的な上方調節を示したウェスタンブロットである。図３Ｆは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞における反応性の増加は、ｐ６５の発現の増加と関連しなかったことを示すウェスタンブロットであり、これは、反応性の増加が標的リン酸化を特異的に反映したことを示している。
【図3B-3C】図３は、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞におけるｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導を示す概要データを提供する。細胞に、０ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、および３００ｎｇ／ｍＬ濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした；ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された；５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合のｍｉＲＮＡ－２１模倣体の８３．４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０が決定された；対照的に、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の算出されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。増加する濃度のＲＩＧ－Ｉアゴニストを用いたＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞の処置は、ＩＦＮ－β分泌の用量依存的増加を引き起こした；対照的に、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡアゴニストは、ＩＦＮ－β分泌を刺激することができなかった（図３Ｃ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのカスパーゼ３／７活性化を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス（muring）黒色腫細胞において測定した；カスパーゼ３／７活性化の用量依存的増加が観察され、その効果は、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１と比較してｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞において有意に高く、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照と同等であった（図３Ｄ）。図３Ｅは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞が、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドに関して見られたレベルを超えるＲＩＧ－Ｉの劇的な上方調節を示したウェスタンブロットである。図３Ｆは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞における反応性の増加は、ｐ６５の発現の増加と関連しなかったことを示すウェスタンブロットであり、これは、反応性の増加が標的リン酸化を特異的に反映したことを示している。
【図3D-3E】図３は、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞におけるｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導を示す概要データを提供する。細胞に、０ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、および３００ｎｇ／ｍＬ濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした；ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された；５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合のｍｉＲＮＡ－２１模倣体の８３．４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０が決定された；対照的に、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の算出されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。増加する濃度のＲＩＧ－Ｉアゴニストを用いたＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞の処置は、ＩＦＮ－β分泌の用量依存的増加を引き起こした；対照的に、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡアゴニストは、ＩＦＮ－β分泌を刺激することができなかった（図３Ｃ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのカスパーゼ３／７活性化を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス（muring）黒色腫細胞において測定した；カスパーゼ３／７活性化の用量依存的増加が観察され、その効果は、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１と比較してｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞において有意に高く、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照と同等であった（図３Ｄ）。図３Ｅは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞が、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドに関して見られたレベルを超えるＲＩＧ－Ｉの劇的な上方調節を示したウェスタンブロットである。図３Ｆは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞における反応性の増加は、ｐ６５の発現の増加と関連しなかったことを示すウェスタンブロットであり、これは、反応性の増加が標的リン酸化を特異的に反映したことを示している。
【図3F】図３は、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞におけるｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導を示す概要データを提供する。細胞に、０ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、および３００ｎｇ／ｍＬ濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした；ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された；５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合のｍｉＲＮＡ－２１模倣体の８３．４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０が決定された；対照的に、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の算出されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。増加する濃度のＲＩＧ－Ｉアゴニストを用いたＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞の処置は、ＩＦＮ－β分泌の用量依存的増加を引き起こした；対照的に、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡアゴニストは、ＩＦＮ－β分泌を刺激することができなかった（図３Ｃ）。ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのカスパーゼ３／７活性化を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス（muring）黒色腫細胞において測定した；カスパーゼ３／７活性化の用量依存的増加が観察され、その効果は、５’－ｐｐｐ欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１と比較してｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞において有意に高く、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照と同等であった（図３Ｄ）。図３Ｅは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞が、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドに関して見られたレベルを超えるＲＩＧ－Ｉの劇的な上方調節を示したウェスタンブロットである。図３Ｆは、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処置した細胞における反応性の増加は、ｐ６５の発現の増加と関連しなかったことを示すウェスタンブロットであり、これは、反応性の増加が標的リン酸化を特異的に反映したことを示している。
【発明を実施するための形態】
【0032】
詳細な説明
１．概説
がんにおけるｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれるリボ核タンパク質複合体内からその調節機能を発揮する。ＲＩＳＣのコアサブユニットは、アルゴノートファミリーのタンパク質のメンバーに結合した低分子ＲＮＡである。アルゴノートは、様々な機構を介してサイレンシングのための相補的な標的転写物を同定するためのガイドとして低分子ＲＮＡを使用する。ｍｉＲＮＡは一般に、ヒトアルゴノート２タンパク質（ＡＧＯ２）によって捕捉され、ＡＧＯ２と会合しながら、相補的ｍＲＮＡ標的と塩基対合することによって遺伝子発現を調節することができる。ＡＧＯ２によって捕捉されたｍｉＲＮＡは、相補的ＲＮＡ標的を受容し、それとハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するためのガイドＲＮＡとして働く。高度に相補的なＲＮＡ標的は、ＡＧＯ２からのガイドＲＮＡ：標的ＲＮＡ二重鎖の放出を容易にすることが示された。
１．概説
がんにおけるｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれるリボ核タンパク質複合体内からその調節機能を発揮する。ＲＩＳＣのコアサブユニットは、アルゴノートファミリーのタンパク質のメンバーに結合した低分子ＲＮＡである。アルゴノートは、様々な機構を介してサイレンシングのための相補的な標的転写物を同定するためのガイドとして低分子ＲＮＡを使用する。ｍｉＲＮＡは一般に、ヒトアルゴノート２タンパク質（ＡＧＯ２）によって捕捉され、ＡＧＯ２と会合しながら、相補的ｍＲＮＡ標的と塩基対合することによって遺伝子発現を調節することができる。ＡＧＯ２によって捕捉されたｍｉＲＮＡは、相補的ＲＮＡ標的を受容し、それとハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するためのガイドＲＮＡとして働く。高度に相補的なＲＮＡ標的は、ＡＧＯ２からのガイドＲＮＡ：標的ＲＮＡ二重鎖の放出を容易にすることが示された。
【0033】
レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）は、重要なＲＮＡセンサーであり、抗ウイルス宿主応答を集合的に確立するＩ型インターフェロンおよび他の遺伝子の転写誘導を媒介する（Yong HY, Luo D. 2018;9:1379）。ＲＩＧ－Ｉは、腫瘍細胞を含む実質的に全ての細胞型において発現され、ＩＣＩ（免疫チェックポイント阻害剤）の有効性を増強するための有望な代替手段である（Heidegger S. et al., 2019. EBioMedicine. 41:146、Poeck H., et al. 2008. Nat. Med. 14:1256）。前臨床試験により、合成ＲＩＧ－Ｉアゴニストの全身送達が、ウイルス感染細胞の除去を誘発したものと類似する機構によって腫瘍成長を阻害することが示された（Poeck H., et al. 2008. 5’-triphosphate-siRNA: turning gene silencing and Rig-I activation against melanoma. Nat. Med. 14:1256）。ＲＩＧ－Ｉの関与は、優先的な腫瘍細胞死（内因性または外因性アポトーシス、およびインフラマソーム誘導性ピロトーシスによる）、ならびに自然免疫系および適応免疫系のＩＦＮ－Ｉ媒介性活性化（Elion DL., et al. 2018. Oncotarget. 9:29007の図１を参照されたい）をもたらす。特異的なＲＩＧ－ＩアゴニストであるＲＧＴ１００は、現在、進行性固形腫瘍およびリンパ腫の処置のための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験にある（ＮＣＴ０３０６５０２３）（Elion DL., et al. 2018. Oncotarget. 9:29007）。
【0034】
理論によって束縛されるものではないが、ＲＩＧ－Ｉ経路は、がん細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡ（５’ｐｐｐ抗ｍｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡと相補的な５’ｐｐｐ ＲＮＡの導入後の５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕでの生成によって、本開示の方法および組成物に記載のこれらの細胞において選択的に活性化することができる（図１）。ＲＩＧ－Ｉ経路の同じか、または類似する選択的活性化は、５’ｐｐ－ｄｓＲＮＡから予想される。結果として、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の抗腫瘍免疫能力を、単に一本鎖ＲＮＡを使用することによる、ある特定の腫瘍抑制遺伝子（複数可）の同時活性化と併せて、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路の活性化によって明らかにすることができる。
【0035】
黒色腫治療のためのＲＩＧ－Ｉアゴニスト三リン酸ＲＮＡの有用性が最近検証された（Helms MW. et al. 2019. Utility of the RIG-I Agonist Triphosphate RNA for Melanoma Therapy. Mol Cancer Ther. 2019;18(12):2343-2356）。また、ＲＩＧ－Ｉの天然のリガンドである三リン酸ＲＮＡ（５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ）（および５’ｐｐ）と、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）との類似性が、発癌性または免疫抑制性標的の同時サイレンシングならびにＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路の活性化のための二機能性ｓｉＲＮＡの開発をもたらしたことも留意される（Poeck H., et al. 2008. Nat. Med. 14:1256、Ellermeier J. et al. 2013. 2013;73(6):1709-1720）。組み合わせた手法は、腫瘍細胞に対する２つの標的の攻撃を開始し、有望な結果を示す。
【0036】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、様々な標的遺伝子を調節することができる低分子非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相補配列との塩基対合によって転写後レベルで遺伝子発現を調節する。この相互作用は、ｍＲＮＡ鎖の切断、そのポリＡ尾部の短縮によるｍＲＮＡの不安定化、またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の阻害によって遺伝子サイレンシングをもたらす。ｍｉＲＮＡは、約６０％のタンパク質コード遺伝子の発現を制御し、細胞の代謝、増殖、分化、およびアポトーシスを調節する（Huang Z, Shi J, Gao Y, et al. HMDD v3.0: a database for experimentally supported human microRNA-disease associations. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D1013-D1017）。
【0037】
正常な生理的条件下で、ｍｉＲＮＡは、細胞の増殖、分化およびアポトーシスを含む重要な生物学的プロセスを保護することによるフィードバック機構において機能する（Reddy, K.B., Cancer Cell International, 2015, 15:38）。ｍｉＲＮＡは、様々な臓器および細胞において発現され、炎症促進作用と抗炎症作用との両方を調節する。ｍｉＲＮＡは、広範囲のヒト疾患における炎症応答の重要な調節因子として明らかになってきた（Tahamtan, A., et al., Front Immunol. 2018; 9: 1377）。
【0038】
ｍｉＲＮＡ発現の調節不全は、がんなどの種々の疾患の兆候と関連している。５０％を超えるｍｉＲＮＡ遺伝子が、がん関連ゲノム領域中に位置することが示された（Di Leva, G., et al., Annu Rev Pathol. 2014; 9():287-314）。ｍｉＲＮＡの調節不全は、いくつかの型のがんの開始、進行および播種において基礎的な役割を果たすことが示されている。例えば、ｍｉＲＮＡ調節不全は、慢性リンパ球性白血病と関連することが知られており、ｍｉＲ－１５ａおよびｍｉＲ－１６－１は、慢性リンパ球性白血病を有する患者の大部分において下方調節されるか、または欠失していることが示された（Calin G.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA; 2002; pp. 15524-15529）。ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２６、およびｍｉＲ－２９ａなどの他のｍｉＲＮＡは、がん細胞および／または腫瘍細胞微小環境中で優先的に発現されることが示されている（Chakraborty, C., et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Jun 5; 20: 606-620）。したがって、内因性ｍｉＲＮＡに対する治療方法は、腫瘍微小環境を標的とし、ｍｉＲＮＡ調節不全と関連する種々のがんを処置するための非常に有望な手法を提供する。
【0039】
ＲＩＧ－Ｉ媒介性ＲＮＡ誘導性免疫原性細胞死
パターン認識受容体であるレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）は、Ｉ型インターフェロンを誘導するためのウイルスＲＮＡの特異的分子パターンを認識する。ＲＩＧ－Ｉは、２つのＮ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、中央のＲＮＡヘリカーゼドメイン、およびＣ末端ＲＮＡ結合ドメインからなる。ＲＩＧ－ＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）は、非自己ＲＮＡの５’－ｐｐｐ基を認識し、コンフォメーション変化を受けて、ＩＦＮ－β産生を誘導する（Lee, M., et al., Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 17）。構造および生化学研究により、ＲＩＧ－Ｉ ＣＴＤが５’－ｐｐｐを含有する平滑末端ｄｓＲＮＡに結合することができることが示された。試験により、５’－ｐｐｐ ｄｓＲＮＡがＲＩＧ－Ｉ ＣＴＤに強く結合し、５’－ＯＨ ｄｓＲＮＡと比較してより効率的にインターフェロン産生を刺激することが示された（Pichlmair, A., et al., 2006, Science, 314, 997-1001；Vela, A., et al., 2012, J. Biol. Chem., 287, 42564-42573）。
パターン認識受容体であるレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）は、Ｉ型インターフェロンを誘導するためのウイルスＲＮＡの特異的分子パターンを認識する。ＲＩＧ－Ｉは、２つのＮ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、中央のＲＮＡヘリカーゼドメイン、およびＣ末端ＲＮＡ結合ドメインからなる。ＲＩＧ－ＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）は、非自己ＲＮＡの５’－ｐｐｐ基を認識し、コンフォメーション変化を受けて、ＩＦＮ－β産生を誘導する（Lee, M., et al., Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, No. 17）。構造および生化学研究により、ＲＩＧ－Ｉ ＣＴＤが５’－ｐｐｐを含有する平滑末端ｄｓＲＮＡに結合することができることが示された。試験により、５’－ｐｐｐ ｄｓＲＮＡがＲＩＧ－Ｉ ＣＴＤに強く結合し、５’－ＯＨ ｄｓＲＮＡと比較してより効率的にインターフェロン産生を刺激することが示された（Pichlmair, A., et al., 2006, Science, 314, 997-1001；Vela, A., et al., 2012, J. Biol. Chem., 287, 42564-42573）。
【0040】
ＲＩＧ－Ｉ様受容体リガンドは、前臨床モデルにおいて黒色腫、膵がんおよび乳がんを含む固形悪性腫瘍の処置のための有望な戦略として使用されてきた。ＲＩＧ－Ｉの大きな特徴は、その遍在性発現およびシグナル伝達の結果、とりわけ、ＩＦＮ－Ｉ産生および優先的な腫瘍細胞死であり、これらは強力なＴ細胞応答における２つの重要な因子である。ＲＩＧ－Ｉ手法の潜在的な成功にも拘わらず、免疫系は強力であり、不完全に理解されており、自己免疫の起こり得るオンタあり得るーゲット誘導、または患者の安全性に対する脅威をもたらし得るサイトカイン「ストーム」の誘導を含む、自然免疫活性化と関連する注意事項の慎重な楽観論および完全な検査を保証する。ＲＩＧ－Ｉはヒト体内の多くの細胞において発現されるため、ＲＩＧ－Ｉ活性化の結果は広範囲であり、疲労、抑鬱および認知機能障害のような症状を駆動し得ることに留意することが重要である。
【0041】
本開示は、ＲＩＧ－Ｉ活性化を腫瘍微小環境に制限することによって、ＲＩＧ－Ｉ治療と関連する潜在的な副作用を軽減するための戦略を提示する。具体的には、腫瘍特異的ｍｉＲＮＡは、５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ ＲＩＧ－Ｉアゴニストのアセンブリーのための鋳型として使用される。これを達成するために、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡと相補的である、外因的に供給された５’ｐｐｐ一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）を導入する。相補的ｍｉＲＮＡ（内因性）および一本鎖５’ｐｐｐオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）（外因性）は、ハイブリダイズし、ＡＧＯ２からの放出を促進する５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡを形成する。放出された５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の強力な活性化を容易にする。このプロセスによって、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、がん細胞に限定され、本質的には、体内の他の箇所での非特異的な免疫系の活性化を排除する。外因性一本鎖５’ｐｐｐオリゴヌクレオチドを、腫瘍微小環境に優先的に局在化するナノ粒子担体とカップリングさせることによって、さらなるレベルの特異性を達成することができる。図１に示されるように、標的ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡをサイレンシングするための標準的なＲＮＡｉ技術についての、本明細書に記載の５（ｐ）ｐｐ－抗ｍＲＮＡまたは－ｍｉＲＮＡ手法の置換は、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達および細胞死を誘発するＲＩＧ－Ｉ活性化を促進し、それによって、処置の結果を改善することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、５’（ｐ）ｐｐ－抗ｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、これをサイレンシングし、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に結合し、これを活性化する５’（ｐ）ｐｐ－ｄｓ－ｍＲＮＡ／－ｍｉＲＮＡの形成をもたらし、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達およびがん細胞死をもたらすことができる。
【0042】
２．定義
本明細書で使用される用語は一般に、当技術分野における、本開示の文脈内で、およびそれぞれの用語が使用される特定の文脈における、その通常の意味を有する。ある特定の用語は、本開示の組成物および方法ならびにそれらを作製および使用する方法を記述する際のさらなる指針を実行者に提供するために、以下で、または明細書中の他の箇所で考察される。用語のいずれかの使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
本明細書で使用される用語は一般に、当技術分野における、本開示の文脈内で、およびそれぞれの用語が使用される特定の文脈における、その通常の意味を有する。ある特定の用語は、本開示の組成物および方法ならびにそれらを作製および使用する方法を記述する際のさらなる指針を実行者に提供するために、以下で、または明細書中の他の箇所で考察される。用語のいずれかの使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【0043】
「約」および「およそ」は、一般的には、測定値の性質または正確さを考慮して測定された量に関する許容される程度の誤差を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内である。
【0044】
あるいは、および特に、生物系では、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内である値を意味してもよい。本明細書で与えられる数量は、別途記述しない限り、近似であり、明示的に記述されない場合、用語「約」または「およそ」を推測できることを意味する。
【0045】
用語「ａ」および「ａｎ」は、その用語が使用される文脈が別途明確に区別しない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１または複数」および「少なくとも１」は、本明細書では互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合、「および／または」は、他方を含む、または含まない、２つまたはそれより多い特定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示と取られるべきである。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ(のみ)」、および「Ｂ(のみ)」を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される用語「および／または」は、以下の態様のそれぞれ：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(のみ)；Ｂ(のみ)；およびＣ(のみ)を包含することが意図される。
【0046】
本明細書で開示される数値範囲は、その範囲を規定する数を包含する。
【0047】
用語「核酸」は、任意の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、半合成、または合成起源の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ）を意味する。用語「核酸」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、塩基における修飾および／もしくは糖における修飾を含有する）ならびに／または２つのヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合における修飾を含有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸は、２’－フルオロ（２’－Ｆ）などの少なくとも１つの修飾リボースを含有してもよい。一部の実施形態では、核酸は、５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸を含有してもよい。核酸の非限定例は、本明細書に記載される。核酸のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【0048】
本明細書に開示される核酸は、天然に存在しないオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなバリアントは必然的に、出発分子との１００％未満の配列同一性または類似性を有する。ある特定の実施形態では、バリアントは、例えば、バリアント分子の長さにわたって、出発（例えば、天然に存在する、または野生型）オリゴヌクレオチドの核酸配列との約７５％～１００％未満、より好ましくは、約８０％～１００％未満、より好ましくは、約８５％～１００％未満、より好ましくは、約９０％～１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、最も好ましくは、約９５％～１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性の核酸配列を有する。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチド配列は、標的配列と完全に相補的である。換言すれば、オリゴヌクレオチドおよびその標的によって形成される二重鎖領域は、オーバーハングを考慮に入れなければ、完全に相補的な配列を示す（すなわち、いかなる塩基対ミスマッチまたはギャップも含まない）。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドおよび標的配列は、二重鎖領域中に０～５個を超える塩基対ミスマッチを含まない。
【0049】
本開示の腫瘍特異的ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含んでもよい。本開示のｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、発癌性ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを含んでもよい。発癌性ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、腫瘍／複数の腫瘍および／またはがんに関与する、またはそれと関連すると考えられるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【0050】
用語「反磁性」は、１未満または１に等しい相対透磁率を有し、磁場によって反発される組成物を記述するために使用される。
【0051】
用語「常磁性」は、外部的に印加された磁場の存在下でのみ磁気モーメントを生じる組成物を記述するために使用される。
【0052】
用語「強磁性」は、磁場に対して強く影響を受けやすく、外部的に印加された磁場が除去された後も、磁気特性（磁気モーメント）を保持することができる組成物を記述するために使用される。
【0053】
用語「ナノ粒子」は、約２ｎｍ～約２００ｎｍ（例えば、１０ｎｍ～２００ｎｍ、２ｎｍ～１００ｎｍ、２ｎｍ～４０ｎｍ、２ｎｍ～３０ｎｍ、２ｎｍ～２０ｎｍ、２ｎｍ～１５ｎｍ、１００ｎｍ～２００ｎｍ、および１５０ｎｍ～２００ｎｍ）の直径を有する物体を意味する。ナノ粒子の非限定例としては、本明細書に記載のナノ粒子が挙げられる。
【0054】
用語「磁性ナノ粒子」は、磁性である（本明細書で定義される）ナノ粒子（例えば、本明細書に記載のナノ粒子のいずれか）を意味する。磁性ナノ粒子の非限定例は、本明細書に記載される。さらなる磁性ナノ粒子は、当技術分野で公知である。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、本開示の組成物または方法を、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的で投与することができる任意の哺乳動物（例えば、ヒトまたは獣医学的対象、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、もしくはウサギ）を指す。対象は、特定の疾患または状態のための、処置を求めるか、または必要とし得る、処置を要求し得る、処置を受けている、処置を受けるであろう、または訓練された専門家による看護の下にある。
【0056】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」とは、固形の塊（例えば、固形腫瘍におけるような）または流体の塊（例えば、血液がんにおけるような）の両方または腫瘍内に見出される任意のがん細胞を含む、塊の成長が、正常組織の成長を上回り、それと調和していない、組織および／または細胞の異常な塊を指す。腫瘍は、固形（例えば、リンパ腫、肉腫もしくは癌）または非固形（例えば、血液、骨髄、もしくはリンパ節の腫瘍、例えば、白血病）であってもよい。腫瘍は、以下の特性：形態および機能を含む細胞分化の程度、成長の速度、局部侵襲および転移に応じて、「良性」または「悪性」と定義することができる。「良性」腫瘍は、高分化型であり、悪性腫瘍よりも特徴的に遅い成長を有し、発生部位に局在化したままであり得る。さらに、ある場合には、良性腫瘍は、浸潤する、侵襲する、または遠隔部位に転移する能力を有しない。「悪性」腫瘍は、低分化型（退形成）であり、進行的浸潤、侵襲、および周囲の組織の破壊を伴う特徴的に急速な成長を有し得る。さらに、悪性腫瘍は、遠隔部位に転移する能力を有し得る。したがって、がん細胞は、成長が正常組織の成長と調和していない組織の異常な塊内に見出される細胞である。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「微小環境」とは、組織の他の領域または身体の領域との一定の、または一時的な、物理的または化学的相違を有する組織または身体の任意の部分または領域を意味する。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍微小環境」とは、腫瘍内の非細胞領域および腫瘍性組織のすぐ外側の領域であるが、がん細胞自体の細胞内区画に属しない、腫瘍が存在する環境を指す。それはまた、腫瘍微小環境内に見出される細胞、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、周皮細胞、神経内分泌細胞、または腫瘍微小環境中の免疫細胞（マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞など）も指す。腫瘍および腫瘍微小環境は密接に関連し、定常的に相互作用する。腫瘍は、その微小環境を変化させ、微小環境は、腫瘍がどのように成長し、拡散するかに影響し得る。典型的には、腫瘍微小環境は、５．０～７．０の範囲、または５．０～６．８の範囲、または５．８～６．８の範囲、または６．２～６．８の範囲の低いｐＨを有する。他方で、正常な生理的ｐＨは、７．２～７．８の範囲である。腫瘍微小環境は、血漿と比較して、より低い濃度のグルコースおよび他の栄養素を有するが、より高い濃度の乳酸を有することも知られている。さらに、腫瘍微小環境は、正常な生理的温度よりも０．３～１℃高い温度を有し得る。
【0059】
用語「非腫瘍微小環境」とは、腫瘍以外の部位での微小環境を指す。
【0060】
用語「転移」とは、対象における、原発腫瘍に存在するがん細胞の、二次的な、非隣接組織への遊走を指す。転移の非限定例としては、原発腫瘍から、リンパ節（例えば、所属リンパ節）、骨組織、肺組織、肝臓組織、および／または脳組織への転移が挙げられる。用語 転移 はまた、リンパ節に見出される転移性がん細胞の、二次組織（例えば、骨組織、肝臓組織、または脳組織）への遊走も含む。一部の非限定的実施形態では、原発腫瘍に存在するがん細胞は、乳がん細胞、結腸がん細胞、腎臓がん細胞、肺がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、直腸がん細胞、胃がん細胞、甲状腺がん細胞、または子宮がん細胞である。転移のさらなる態様および例は、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される。
【0061】
用語「原発腫瘍」とは、腫瘍進行が開始し、進行して、がんの塊をもたらした解剖学的部位に存在する腫瘍を指す。一部の実施形態では、医師は、対象における原発腫瘍の部位を明確に同定することができない場合がある。
【0062】
用語「転移性腫瘍」とは、対象における原発腫瘍から転移した腫瘍細胞を起源とする対象における腫瘍を指す。一部の実施形態では、医師は、対象における原発腫瘍の部位を明確に同定することができない場合がある。
【0063】
好ましい方法および材料を本明細書に記載するが、本明細書に記載のものと類似するか、または等価な方法および材料も、本開示の方法および組成物の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【0064】
３．内因性腫瘍特異的ＲＮＡ
内因性腫瘍特異的ＲＮＡによって免疫応答を惹起するための組成物および方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、本開示は、がんを処置するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含み、腫瘍特異的ＲＮＡが、腫瘍細胞に特異的であり、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を提供する。本開示の内因性腫瘍特異的ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡから選択することができる。本開示の内因性腫瘍特異的ＲＮＡを、発癌性ｍｉＲＮＡまたは発癌性ｍＲＮＡからさらに選択することができる。発癌性ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、がんに関与すると考えられるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
内因性腫瘍特異的ＲＮＡによって免疫応答を惹起するための組成物および方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、本開示は、がんを処置するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含み、腫瘍特異的ＲＮＡが、腫瘍細胞に特異的であり、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を提供する。本開示の内因性腫瘍特異的ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡから選択することができる。本開示の内因性腫瘍特異的ＲＮＡを、発癌性ｍｉＲＮＡまたは発癌性ｍＲＮＡからさらに選択することができる。発癌性ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、がんに関与すると考えられるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【0065】
ｍｉＲＮＡは、多くのがんにおける構成要素であることが示されており、がん処置のための新しい手段を提供することができる。本開示の方法および組成物のｍｉＲＮＡは、限定されるものではないが、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－１７；ｍｉＲ－１８；ｍｉＲ－１９ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－２６ａ；ｍｉＲ－２９ａ；ｍｉＲ－９２ａ；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１；ｍｉＲ－２２２；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；およびｍｉＲ－１８１／３４０を含む。配列を含む完全な一覧は、ＯｎｃｏｍｉＲＤＢ（Wang et al. Bioinformatics. 2014;30(15):2237-2238；mircancer.ecu.edu/browse.jsp；ＵＳ２０１５０００４２２１Ａ１）；表１および表２も参照されたい）で入手可能である。
【0066】
１つのそのようなｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲ－１０ｂである。ｍｉＲ－１０ｂの上方調節は、転移性腫瘍細胞の遊走および侵襲ならびにこれらの細胞の生存能力を担うことが示されている（Tian Y., et al., J. Biol. Chem. 2010; 285:7986-7994）。４０個のヒト食道がん試料およびその対になった正常隣接組織におけるｍｉＲ－１０ｂレベルの分析により、試料採取されたがん組織の９５％（４０のうちの３８）におけるｍｉＲ－１０ｂの発現の上昇が示された（Tian Y., et al., J. Biol. Chem. 2010; 285:7986-7994）。関連する標的である発癌においても役割を果たす多くの他のｍｉＲＮＡが存在する；これらの、および他のｍｉＲＮＡは、治療的阻害のための潜在的な新しいクラスの標的である（Nguyen DD, Chang S. Int J Mol Sci. 2017;19(1):65）。例えば、ｍｉＲ－２１は、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、膵がん、皮膚がん、肝臓がん、胃がん、子宮頸がん、および甲状腺がん、ならびに種々のリンパがん、および造血がんおよび神経芽腫に限定されない、様々ながん細胞および組織に関与することが示されている。ｍｉＲ－２１は、複数の発癌シグナル伝達カスケードを標的とし、がん細胞における遺伝子発現ネットワークの全体的な調節不全を引き起こす単一のｍｉＲＮＡの代表例である（Pan, X., et al., Cancer Biol. Ther. 2010; 10:1224-1232）。ｍｉＲ－２１発現の増加は、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＰＤＣＤ４、ＲＥＣＫ、ＴＰＭ１などの様々な必須の腫瘍抑制因子を標的とし、細胞の増殖、生存、転移、および化学耐性表現型の獲得を容易にすることがわかった(Meng, F., et al., Gastroenterology. 2007; 133:647-658; Peralta-Zaragoza O., et al., BMC Cancer. 2016; 16:215; Zhang, X., et al., BMC Cancer. 2016;16:86; Reis ST., et al., BMC Urol. 2012;12:14; Zhu S., et al., J. Biol. Chem. 2007;282:14328-14336).。
【0067】
ｍｉＲ－１５５は、ＢＲＣＡ１によってエピジェネティックに制御され、乳がん、卵巣がん、および肺がんにおいて過剰発現される。ｍｉＲ－１５５は、Ｂ細胞がんのための潜在的なバイオマーカーとして調査されてきた。ｍｉＲ－１５５の過剰発現は、ＳＨＩＰ１およびＣ／ＥＢＰβ遺伝子の下方調節によってＢ細胞分化を遮断し、ＰＩ３Ｋ－ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路の活性化に起因して細胞生存の改善をもたらす。神経膠腫などの他のがんでは、ｍｉＲ－１５５の過剰発現は、神経膠腫組織中での尾側型ホメオボックス１タンパク質（ＣＤＸ１）発現との負の相関を介して腫瘍形成の進行を促進する。
【0068】
ｍｉＲ－２１０は、がんの発達、進行および転移の様々な態様に関与する十分に裏付けられたｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ－２１０発現の増加は、骨転移性および非骨転移性前立腺がん組織において観察された。発現は、非骨転移性前立腺がん組織と比較して骨転移性前立腺がん組織において上昇していることが見出され、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路によって前立腺がん細胞の上皮間葉移行および骨転移を促進することが示された（Ren D., et al., Mol Cancer. 2017; 16: 117）。ｍｉＲＮＡ－２２１などの他のｍｉＲＮＡは、乳がん、神経膠腫、肝細胞癌、膵臓腺癌、黒色腫、慢性リンパ球性白血病、および甲状腺乳頭癌において上方調節されることが見出された（Brognara E., et al., Int J Oncol. 2012 Dec;41(6):2119-27）。
【0069】
一部の実施形態では、本開示は、がんを処置するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含み、腫瘍特異的ＲＮＡが、腫瘍細胞に特異的であり、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、発癌性ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、発癌性ｍｉＲＮＡではない。
【0070】
一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－１７；ｍｉＲ－１８；ｍｉＲ－１９ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－２６ａ；ｍｉＲ－２９ａ；ｍｉＲ－９２ａ；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１；ｍｉＲ－２２２；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；およびｍｉＲ－１８１／３４０からなる群から選択されるｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－９である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１０ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１７である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１８である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１９ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２１である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２６ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２９ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－９２ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１０６ｂ／９３である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１２５ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１３０ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１５５である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１８１ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２００ｓである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２１０である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２１０－３ｐである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２２１である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２２２である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２２１／２２２である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－３３５である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－４９８である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－５０４である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１８１０である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１９０８である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－２２４／４５２である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－１８１／３４０である。
【0071】
本開示の好ましい実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択される。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１０ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１７である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１８ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１８ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１９ｂである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ２１である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ２６ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ２９ａである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ９２ａ－１である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ９２ａ－２である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ１５５である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ２１０である。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ２２である。
【0072】
一部の実施形態では、腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－１７；ｍｉＲ－１８；ｍｉＲ－１９ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－２６ａ；ｍｉＲ－２９ａ；ｍｉＲ－９２ａ；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１；ｍｉＲ－２２２；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；およびｍｉＲ－１８１／３４０からなる群から選択される。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、骨および非骨転移性がん、乳がん、神経膠腫、肝細胞癌、膵臓腺癌、黒色腫、慢性リンパ球性白血病、甲状腺乳頭癌、神経膠芽腫、結腸直腸がん、肺がん、腎臓がん、膵がん、皮膚がん、肝臓がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、リンパがん、造血がん、神経芽腫、急性骨髄性白血病、食道がん、骨肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ性白血病、卵巣がん、口腔がん、膀胱がん、腺様嚢胞癌、未分化甲状腺癌、星状細胞腫、髄膜腫、網膜芽腫と関連する。
【0073】
一部の実施形態では、腫瘍細胞は、骨転移性がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、非骨転移性がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、乳がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、神経膠腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、肝細胞癌と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、膵臓腺癌と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、黒色腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、慢性リンパ球性白血病と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、甲状腺乳頭癌と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、神経膠芽腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、腎臓がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、膵がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、皮膚がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、肝臓がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、胃がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、子宮頸がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、甲状腺がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、リンパがんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、造血がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、神経芽腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、食道がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、骨肉腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、Ｂ細胞リンパ腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、リンパ性白血病と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、卵巣がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、口腔がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、膀胱がんと関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、腺様嚢胞癌と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、未分化甲状腺癌と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、星状細胞腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、髄膜腫と関連する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、網膜芽腫と関連する。
【0074】
ヒトのがんに関与するマイクロＲＮＡを同定するための多くのウェブベースのツールが利用可能である。総説については、Mar-Aguilar F, Rodriguez-Padilla C, Resendez-Perez D. Web-based tools for microRNAs involved in human cancer, Oncol Lett. 2016;11(6):3563-3570を参照されたい。特定の型のがんと関連するｍｉＲＮＡについて、または同時に異なる悪性腫瘍における特定のｍｉＲＮＡの挙動についてデータベースをマイニングすることができ、および特定のｍｉＲＮＡの配列を種々のデータベースから容易に回収することができる。例えば、ｍｉＲＣａｎｃｅｒ（mircancer.ecu.edu）は、データマイニングによって収集されたｍｉＲＮＡとがんの関連の記録を保存するデータベースである。２６，４１４の刊行物（２０１６）の表題および要約を分析し、ｍｉＲＮＡおよびがん型の名称、および任意の表現用語を含む完全な文または語句を見出すための規則に基づく手法を考案した。次いで、このデータマイニングプロセスの結果を、手作業で裏付けた。ｍｉＲＣａｎｃｅｒは、２，６１１の刊行物からの３，７６４を超えるｍｉＲＮＡ－がん関連の記録を有し、これは、１７６のヒトがんに由来する２３６のｍｉＲＮＡ発現プロファイルになる。ｍｉＲＣａｎｃｅｒは、オンラインで自由にアクセス可能であり、ｍｉＲＮＡ名もしくはがん型、または両方の組合せによって、データベースを検索することができる（Xie B, Ding Q, Han H, Wu D. miRCancer: a microRNA- cancer association database constructed by text mining on literature. Bioinformatics. 2013;29(5):638-644）。
【0075】
例として、データベース（２０２０年１２月１６日）のマイニングにより、ｍｉＲ－１０ｂが、急性骨髄性白血病、膀胱がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、食道扁平上皮癌、胃がん、胃がん、神経膠芽腫、神経膠腫、肝細胞癌、肺がん、悪性黒色腫、髄芽腫、鼻咽頭癌、非小細胞肺がん、口腔がん、骨肉腫、膵がん、および膵管腺癌を含む２０種のがんにおいて上方調節されることが見出された。同様に、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９６－５ｐを含め、ｍｉＲ－１０ｂを含む１００種を超えるｍｉＲＮＡが、乳がんに関連することが見出された。
【0076】
ｍｉＲ－１０ｂの配列または目的の任意の配列を、ｍｉＲｂａｓｅ、マイクロＲＮＡデータベース（mirbase.org/）から回収することができる：
＞ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ ＭＩＭＡＴ００００２５４
ＵＡＣＣＣＵＧＵＡＧＡＡＣＣＧＡＡＵＵＵＧＵＧ
＞ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－３ｐ ＭＩＭＡＴ０００４５５６
ＡＣＡＧＡＵＵＣＧＡＵＵＣＵＡＧＧＧＧＡＡＵ。
＞ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ ＭＩＭＡＴ００００２５４
ＵＡＣＣＣＵＧＵＡＧＡＡＣＣＧＡＡＵＵＵＧＵＧ
＞ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－３ｐ ＭＩＭＡＴ０００４５５６
ＡＣＡＧＡＵＵＣＧＡＵＵＣＵＡＧＧＧＧＡＡＵ。
【0077】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0078】
【表2】
【0079】
本開示の方法および組成物を、がんの発達を促進するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどの他のＲＮＡ標的に拡張することができる。一部の実施形態では、本開示は、がんを処置するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含み、腫瘍特異的ＲＮＡが、腫瘍細胞に特異的であり、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍＲＮＡではない。
【0080】
いくつかのｍＲＮＡが、がんに関与すると考えられる。ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡのアンチセンス鎖の全部または一部を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によってＤＮＡ鋳型から生成し、５’（ｐ）ｐｐで修飾することができる。５’（ｐ）ｐｐ－抗ｍＲＮＡ配列を、ＲＮＡ安定性を増加させる配列エレメントを含有するように最適化することができる。抗ｍＲＮＡを、脂質と共に製剤化して、ＲＮＡ－脂質ナノ粒子製剤を得ることができる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、５’（ｐ）ｐｐ－抗ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、これをサイレンシングし、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に結合し、これを活性化する５’（ｐ）ｐｐ－ｄｓ－ｍＲＮＡの形成をもたらし、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達およびがん細胞死をもたらすことができる。例示的なｍＲＮＡ転写物の一覧については、表３を参照されたい。
【0081】
【表3-1】
【表3-2】
【0082】
例えば、周知のがん治療標的であるサバイビン（ＢＩＲＣ５とも称される）を、この手法を使用して標的とすることができる。細胞周期およびアポトーシスのマルチレギュレータであるサバイビンは、全てのヒトがんにおいて過剰発現されるが、正常組織中では低発現を示す。その発現の増加は、原発性乳がんの９０％において検出されており、臨床転帰の不良と相関する。さらに、サバイビン（surviving）レベルの増加は、負のホルモン受容体状態と有意に関連することが示されている。重要なことに、高レベルのサバイビンは、膵がんなどの他のがんにおいて検出されたが、それは細胞増殖とアポトーシスとの両方と相関し、この抗アポトーシスマーカーの起こり得る遍在的な役割を指摘している。化学耐性を克服する手段としてサバイビン発現を低下させる、または無効化する潜在的な価値を考慮すると、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のプロセスが価値があると証明することができる。実際、ＲＮＡｉによるＢＩＲＣ５の下方調節は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの急性リンパ芽球性白血病、肺癌および子宮頸癌ならびにｉｎ ｖｉｖｏの乳がんにおいて有望性を示した（Ghosh SK, Yigit MV, Uchida M, et al. Sequence-dependent combination therapy with doxorubicin and a survivin-specific small interfering RNA nanodrug demonstrates efficacy in models of adenocarcinoma. Int J Cancer. 2014;134(7):1758-1766）。ドキソルビシンとの配列依存的併用療法およびサバイビン特異的低分子干渉ＲＮＡナノドラッグは、腺癌のモデルにおいて有効性を示す。
【0083】
サバイビンをサイレンシングするための標準的なｓｉＲＮＡ技術に代えての現在の５（ｐ）ｐｐ－抗ｍＲＮＡ手法の使用は、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達および細胞死を誘発するＲＩＧ－Ｉ活性化を促進し、それによって、処置の転帰を改善することができる。
【0084】
４．オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド修飾
ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法および組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含む、方法および組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法および組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含む、方法および組成物を提供する。
【0085】
５’三リン酸（ｐｐｐ）を含む外因性ＲＮＡは、異なる腫瘍実体において免疫原性形態の細胞死を誘導することが示された（Elion, DL., et al Cancer Res. 2018 Nov 1; 78(21):6183-6195；Besch, R., et al, J Clin Investig. 2009;119:2399-411；Duewell, P., et al., Cell Death Differ. 2014;21:1825-37；Kuber, K., et al., Cancer Res. 2010;70:5293-304）。５’二リン酸（５’ｐｐ）または５’三リン酸（５’ｐｐｐ）修飾は、本明細書では、それぞれ、５’ｐｐおよび５’ｐｐｐ抗ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡと称することができる。５’－ｐｐｐ－ＲＮＡは、免疫細胞によるウイルスＲＮＡの直接感知と共に、サイトカイン放出を誘導し、腫瘍細胞に対する適応細胞免疫応答を促進することが示された（Poeck, H., et al., Nat Med. 2008 Nov; 14(11):1256-63）。パターン認識受容体ＲＩＧ－Ｉは、非キャップ付加５’ｐｐｐまたは５’ｐｐを含有する平滑末端ｄｓＲＮＡに結合することができる。本明細書に開示されるように、非キャップ付加とは、５’→５’三リン酸結合によってｍＲＮＡの５’末端に連結された７－メチルグアノシン（methylguansine）三リン酸からなる５’キャップ構造を欠くＲＮＡを指す。本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含む、方法を提供する。本開示はまた、非腫瘍組織と比較して腫瘍組織中で高度に発現されるｍｉＲＮＡと相補的である、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドも提供する。５’三リン酸構造は、以下に示される：
【化1】
【0086】
好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、非キャップ付加５’三リン酸を含む。好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、非キャップ付加５’二リン酸を含む。
【0087】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性ｍｉＲＮＡと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－１７；ｍｉＲ－１８；ｍｉＲ－１９ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－２６ａ；ｍｉＲ－２９ａ；ｍｉＲ－９２ａ；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１；ｍｉＲ－２２２；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；およびｍｉＲ－１８１／３４０からなる群から選択される発癌性ｍｉＲＮＡと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－９と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１０ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１７と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１８と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１９ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２６ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２９ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－９２ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１０６ｂ／９３と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２５ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３０ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１８１ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２００ｓと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１０と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１０－３ｐと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２２１と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２２２と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２２１／２２２と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－３３５と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－４９８と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－５０４と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１８１０と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１９０８と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－２２４／４５２と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１８１／３４０と相補的である配列を含む。
【0088】
本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１０ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１７と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１８ａと相補的である配列を含む。 一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１８ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１９ｂと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ２１と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ２６ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ２９ａと相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ９２ａ－１と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ９２ａ－２と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１５５と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ２１０と相補的である配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ２２と相補的である配列を含む。
【0089】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する。好ましい実施形態では、二重鎖は、５’平滑末端を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－１７；ｍｉＲ－１８；ｍｉＲ－１９ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－２６ａ；ｍｉＲ－２９ａ；ｍｉＲ－９２ａ；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１；ｍｉＲ－２２２；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；およびｍｉＲ－１８１／３４０からなる群から選択されるｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する。好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ１０ｂ、ｍｉＲ１７、ｍｉＲ１８ａ、ｍｉＲ１８ｂ、ｍｉＲ１９ｂ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２６ａ、ｍｉＲ２９ａ、ｍｉＲ９２ａ－１、ｍｉＲ９２ａ－２、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ２１０、およびｍｉＲ２２１からなる群から選択されるｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、前記ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成することができ、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１３個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１７個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２２個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２３個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２４個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２５個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２６個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２７個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２８個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも２９個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ｍｉＲＮＡ内の少なくとも３０個の連続するヌクレオチドと相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも１００％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも５０％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも６０％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも７０％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも７５％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも８０％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも８５％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも９０％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも９５％相補的である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、前記ｍｉＲＮＡと少なくとも１００％相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、０～５個のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、５個未満のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、４個未満のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、３個未満のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、２個未満のミスマッチ塩基対を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、１個未満のミスマッチ塩基対を含む。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分は、ミスマッチ塩基対を含まない。
【0090】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成することができ、内因性ｍＲＮＡと競合して、前記ｍｉＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、二重鎖は、ＡＧＯ２によって切断されない。一部の実施形態では、二重鎖は、ＲＩＧ－Ｉを活性化する。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または２００％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも２０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも２５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも３０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも３５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも４０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも４５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも４５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも６０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも６５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも７０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも７５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも８０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも８５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも９０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも９５％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１００％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１１０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１２０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１３０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１４０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも１５０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも２００％大きい。好ましい実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、腫瘍特異的免疫応答を惹起する。
【0091】
本明細書で提供される方法および組成物のオリゴヌクレオチドは、修飾を含んでもよい。本明細書に開示されるように、修飾は、核酸リン酸骨格、核酸糖、核酸塩基、および／またはオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端の化学的修飾、付加、欠失、置換、または操作を含んでもよい。オリゴヌクレオチド、特に、治療剤中に、または治療剤として実装されるものは、一般的には、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、標的ＲＮＡに対する親和性を増強するためにリン酸骨格および／またはリボース糖上で修飾される。ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾は、非架橋酸素原子を硫黄原子で置き換え、血漿中でのオリゴヌクレオチドの半減期を数分から数日まで延長させる。タンパク質結合の増強は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合を有するものと比較してＰＳ修飾を有するオリゴヌクレオチドについても報告されている。オリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡに対するヌクレアーゼ安定性および結合親和性のさらなる改善を、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－エチル（ｃＥｔ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）などの２’リボース修飾によって得ることができる。オリゴヌクレオチド配列内の２’修飾の位置は、タンパク質－オリゴヌクレオチド相互作用にさらに影響し得る。ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である、方法および組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む方法および組成物であって、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと相補的である配列を含む、方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、他の修飾を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の他の修飾を含まない。
【0092】
一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾をさらに含む。一部の実施形態では、２’－Ｆリボース修飾は、対応する塩基がシトシンまたはウラシルである場合に存在する。一部の実施形態では、２’－Ｆリボース修飾は、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端から１０または１１番目のヌクレオチドに存在する。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾をさらに含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）リボース修飾およびホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾をさらに含む。
【0093】
好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の他の修飾を含まない。好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）、または５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）からなる群から選択される任意の他の修飾を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）を含まない。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）を含まない。
【0094】
一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）、または５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボース修飾を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｎ－１－メチルシュードウリジン（ｍΨ）を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（５ｍＣ）を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチル－シチジン（５ｈｍＣ）を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５－メトキシシチジン（５ｍｏＣ）を含む。
【0095】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１７ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１８ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１９ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２１ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２２ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２３ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２４ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２５ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２６ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２７ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２８ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２９ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～５０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～３０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～２９ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～２８ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～２７ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～２６ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～２５ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～５０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～３０ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～２９ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～２８ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～２７ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～２６ヌクレオチド長である配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６～２５ヌクレオチド長である配列を含む。
【0096】
５’ｐｐおよび５’ｐｐｐ抗ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ内の少なくとも１０個（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個）の連続するヌクレオチドと相補的である配列を含む。例示的なｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１０ｂ；ｍｉＲ－２１；ｍｉＲ－１０６ｂ／９３；ｍｉＲ－１２５ｂ；ｍｉＲ－１３０ａ；ｍｉＲ－１５５；ｍｉＲ－１８１ａ；ｍｉＲ－２００ｓ；ｍｉＲ－２１０－３ｐ；ｍｉＲ－２２１／２２２；ｍｉＲ－３３５；ｍｉＲ－４９８；ｍｉＲ－５０４；ｍｉＲ－１８１０；ｍｉＲ－１９０８；ｍｉＲ－２２４／４５２；またはｍｉＲ－１８１／３４０（例えば、Nguyen and Chang, Int J Mol Sci. 2017;19(1):65の表１を参照のこと）および本明細書の表１および表２に列挙されたものが挙げられる。例示的なｍＲＮＡとしては、本明細書の表２に列挙されたものが挙げられる。
【0097】
ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0098】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0099】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％ ｉ％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0100】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号３から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0101】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号４から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0102】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号５から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0103】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0104】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号７から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0105】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号８から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0106】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号９から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0107】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１０から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0108】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１１から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0109】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも７５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１２から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0110】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、一本鎖５’非キャップ付加二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本開示の好ましい実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも75％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、98％、99%または100％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも80％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも85％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも90％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも95％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも97％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも98％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも99％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列と同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１３から選択される核酸配列と同一である核酸配列からなる。
【0111】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、遺伝子サイレンシングを媒介する細胞内でその標的ＲＮＡ配列に結合する小さいサイズの一本鎖核酸（ｍｉＲＮＡについては、典型的には、少なくとも８または１０ｎｔであり、最大で約３０ｎｔであるか、または全長ｍＲＮＡアンチセンスＲＮＡについてはそれよりはるかに長い）である。ＡＳＯに基づく戦略は、タンパク質に関与する下流のプロセスを標的とするよりもむしろ、ＲＮＡレベルで疾患源を標的とする。タンパク質は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に保存された情報を解読することによって産生される。いくつかの破壊的な疾患および障害と関連する、異常なタンパク質産生を、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の作用によってｍＲＮＡを標的とすることによって調節することができる。ｎｃＲＮＡのうち、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ、偽遺伝子、ＰＩＷＩ－相互作用ＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、および環状ＲＮＡは、遺伝子発現のモジュレーションによる生物学的機能の調節因子として同定された。したがって、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含むｎｃＲＮＡを標的化することを含むアンチセンス戦略は、治療介入のために疾患を引き起こすタンパク質の産生を変更させることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、遺伝子サイレンシングを媒介する細胞内でその標的ＲＮＡ配列に結合する小さいサイズの一本鎖核酸（ｍｉＲＮＡについては、典型的には、少なくとも８または１０ｎｔであり、最大で約３０ｎｔであるか、または全長ｍＲＮＡアンチセンスＲＮＡについてはそれよりはるかに長い）である。ＡＳＯに基づく戦略は、タンパク質に関与する下流のプロセスを標的とするよりもむしろ、ＲＮＡレベルで疾患源を標的とする。タンパク質は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に保存された情報を解読することによって産生される。いくつかの破壊的な疾患および障害と関連する、異常なタンパク質産生を、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の作用によってｍＲＮＡを標的とすることによって調節することができる。ｎｃＲＮＡのうち、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ、偽遺伝子、ＰＩＷＩ－相互作用ＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、および環状ＲＮＡは、遺伝子発現のモジュレーションによる生物学的機能の調節因子として同定された。したがって、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含むｎｃＲＮＡを標的化することを含むアンチセンス戦略は、治療介入のために疾患を引き起こすタンパク質の産生を変更させることができる。
【0112】
低分子に基づくタンパク質標的化と違って、アンチセンス薬物は、標的ＲＮＡ配列とのワトソン・クリック塩基対合規則によってその効果を示す。ワトソン・クリックの分子認識のこの原理は、アンチセンス分野に、ＲＮＡに基づく薬物設計におけるより高い自由度をもたらし、その開発を促進する。しかしながら、ＡＳＯ設計中に、結合親和性を最適化するための必要な修飾は、ヌクレアーゼ耐性を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達を考慮することができる。高い結合親和性、高い特異性、および拡張された機能性を有するＡＭＯを開発する試みと共に数世代の設計が存在していた（Ochoa S, Milam VT. Modified Nucleic Acids: Expanding the Capabilities of Functional Oligonucleotides. Molecules. 2020;25(20):4659）。
【0113】
ＲＮＡヌクレオチドを、骨格、核酸塩基、リボース糖および２’－リボース置換で化学的に修飾することができる。Roberts, T.C., Langer, R. & Wood, M.J.A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov 19, 673-694 (2020)の図３を参照されたい。
【0114】
一部のＡＳＯ（第１世代と称されることが多い）では、ヌクレオチドを連結するリン酸骨格が修飾される。ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子の１つが、硫黄、メチルまたはアミン基によって置き換えられ、それぞれ、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチル－ホスホネート、およびホスホロアミデートを生成する。これらの修飾は、同等ではなく、それぞれ、それ自身の特定の特徴を有する。ＰＳオリゴヌクレオチドは、この第１世代を高度に代表するものであり、最も広く使用されている。これらの化学的修飾は、ヌクレアーゼに対するＡＳＯの耐性を増加させることによって、安定性を改善し、一定の目標は、ＡＳＯの半減期を拡大することである。ＰＳ修飾は、半減期を数分から数日まで変える。重要なことに、これらの修飾は、ＲＮＡｓｅＨを活性化する。ＲＮＡｓｅＨは、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖を切断する遍在的に発現される酵素である。したがって、ＲＮＡｓｅＨは、ＡＳＯ／ｍＲＮＡ複合体内の標的ｍＲＮＡを分解し、コードされたタンパク質の合成を制限することができる。残念ながら、生物学的に活性な修飾ＡＳＯ（ＰＳ）は、特に、タンパク質へのその非特異的結合のため、毒性が高い。これにより、研究者が、毒性が低く、かつより特異的である新世代のＡＳＯを開発することにつながった。
【0115】
別のクラスのＡＳＯ（第２世代のＡＳＯと称されることもある）は、リボースの２’位でのアルキル修飾を特徴とする。酸素化された基の導入は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭＥ）および２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ヌクレオチドの形成をもたらす。これらのＡＳＯは、ＰＳよりも毒性が低く、その標的に対するわずかにより高い親和性を有する。しかしながら、これらの修飾は、ＲＮＡｓｅＨの動員およびそれによる切断と適合しない。この型のＡＳＯのアンチセンス効果はおそらく、翻訳の立体的遮断に起因する。標的ＲＮＡが分解されてはならない場合、そのような修飾は潜在的に興味深い。
【0116】
さらなるクラスのＡＳＯ（第３世代のＡＳＯと称されることもある）は、結合親和性、ヌクレアーゼに対する耐性、および薬物動態プロファイルを改善することを目的とする多数の修飾を含む、より異種性のものである。最も一般的な修飾としては、リボースの２’－酸素と４’－炭素とを接続するメチレン架橋に対応する、ロックド核酸（ＬＮＡ）；リボースがモルホリン部分によって置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合によって置き換えられた、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）；およびリボース－リン酸骨格が、塩基が連結されているＮ－（２－アミノエチルグリシンユニット（N-(2-aminothyl)glycine unit）の反復からなるポリアミド骨格によって置き換えられた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる（Papargyri N, Pontoppidan M, Andersen MR, Koch T, Hagedorn PH. Chemical Diversity of Locked Nucleic Acid-Modified Antisense Oligonucleotides Allows Optimization of Pharmaceutical Properties. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;19:706-717）。これらの最後の２つの構造物は荷電せず、荷電したＡＳＯよりも低い親和性で血漿タンパク質に結合し、尿中でのその分布および除去を増加させる。除去される画分は、投与される量のおよそ１０～３０％に相当し、組織蓄積に寄与することが示されている。これらの修飾は、高い安定性をもたらすが、ＲＮＡｓｅＨの動員を惹起しない。この第３世代のＡＳＯは、その標的ｍＲＮＡと安定なハイブリッドを形成し、それによって、そのプロセシングまたは翻訳を阻害する。
【0117】
接続している架橋によって課されるＬＮＡ修飾の構造的拘束およびそのメチル化されたアナログのそれ（「拘束エチル」：ｃＥＴとして知られる）は、化学療法剤における新しい機会を創出した。トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）は、結合特性が増強された、このクラスの構造的に拘束されたＤＮＡアナログに属する。それらは、ＲＮＡｓｅＨ活性を惹起しないが、安定性の増加および細胞取込みの改善を示し、それらに、上記のＡＳＯを超える実質的な治療利益をもたらす。
【0118】
以前に強調されたように、大部分の第２および第３世代の化学的修飾を担持するＡＳＯは、ＲＮＡｓｅＨ活性を惹起しない。しかしながら、ＲＮＡｓｅＨ活性は、ＡＳＯの末端での一対の非ＲＮＡｓｅＨ感受性配列の間に一連の非修飾またはＰＳ－ＤＮＡ切断感受性配列を挿入することによって回復させることができる。得られた構造物は、「ギャップマー」として公知である（例えば、Quemener, Wiley Interdiscip Rev RNA. 2020;11(5):e1594を参照されたい）。
【0119】
全体として、ＡＳＯの構造と共に、化学的修飾のそのような多様性は、選択された標的および作用機構に従って治療手法の適合化のためのかなりの自由度を提供する。いくつかの核酸に基づく薬物の最近の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認は、アンチセンス研究への関心をさらに刺激した。現在、多数のアンチセンス薬物候補が、心血管疾患、代謝疾患、内分泌疾患、神経疾患、神経筋肉疾患、炎症性疾患、および感染性疾患を処置するための臨床試験中である。
【0120】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴは、修飾がＲＩＧ－Ｉヘリカーゼとの相互作用を阻害しない限り、例えば、当技術分野で公知のように、または本明細書に記載のように、塩基、２’位、骨格／リン酸、またはリボース中に、１つまたは複数の修飾を含む。
【0121】
抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）
上記のように、マイクロＲＮＡは、遺伝子発現を厳密に調節することによって、多くの生理学的機能を制御している。それらは重要な調節因子であるため、それらは疾患とも関連する。したがって、その活性の阻害は、有効な治療戦略であり得る。ＡＭＯは、標的化された内因性ｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するＡＳＯであり、安定な、高親和性の結合を形成する。ＡＳＯと同様、それらを、上記のような、様々な化学的特徴を用いて合成することができる。これらの合成的に設計された分子は、立体遮断機構ならびにｍｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって所望の応答のために細胞中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を中和するために使用される。特に、ＡＭＯは、ｍｉＲＮＡの５’末端から２～８個の塩基に及ぶｍｉＲＮＡ「シード領域」に高い親和性で結合することが必須である。
上記のように、マイクロＲＮＡは、遺伝子発現を厳密に調節することによって、多くの生理学的機能を制御している。それらは重要な調節因子であるため、それらは疾患とも関連する。したがって、その活性の阻害は、有効な治療戦略であり得る。ＡＭＯは、標的化された内因性ｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するＡＳＯであり、安定な、高親和性の結合を形成する。ＡＳＯと同様、それらを、上記のような、様々な化学的特徴を用いて合成することができる。これらの合成的に設計された分子は、立体遮断機構ならびにｍｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって所望の応答のために細胞中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を中和するために使用される。特に、ＡＭＯは、ｍｉＲＮＡの５’末端から２～８個の塩基に及ぶｍｉＲＮＡ「シード領域」に高い親和性で結合することが必須である。
【0122】
５．処置方法
部分的に、本開示は、がんを処置するための方法であって、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）と相補的である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）と相補的である配列を含み、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を企図する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号１～１３からなる群から選択される。
部分的に、本開示は、がんを処置するための方法であって、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現される内因性腫瘍特異的ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）と相補的である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）と相補的である配列を含み、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を企図する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号１～１３からなる群から選択される。
【0123】
本明細書で使用される用語「処置」、「処置すること」、「軽減すること」などは、一般的に、所望の薬物動態的および／または生理的効果を得ることを意味し、処置される状態（例えば、がん）の１つまたは複数の臨床的合併症の重症度を改善すること、軽減すること、および／または低下させることを指すために使用することもできる。その効果は、疾患、状態、もしくは合併症の開始もしくは再発を完全に、もしくは部分的に遅延させる観点から予防的であってよい、ならびに／または疾患もしくは状態の部分的もしくは完全な治癒および／もしくは疾患もしくは状態に起因する有害作用の観点から治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「処置」は、哺乳動物、特に、ヒトの疾患または状態の任意の処置を包含する。本明細書で使用される場合、障害または状態を「防止する」治療剤とは、統計学的試料において、未処置の対照試料と比較して、処置された試料において障害もしくは状態の発生を低減させる、または未処置の対照試料と比較して、疾患もしくは状態の開始を遅延させる化合物を指す。
【0124】
一般に、本開示に記載される疾患または状態（例えば、がん）の処置または防止は、本開示の１つまたは複数の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを「有効量」で投与することによって達成される。薬剤の有効量とは、所望の治療または予防結果を達成するのに必要な用量で、および期間にわたって有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の病態（disease state）、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起する薬剤の能力などの因子に応じて変化してもよい。「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な投与量で、および期間にわたって有効な量を指す。
【0125】
ある特定の態様では、本開示は、疾患または状態（例えば、がん）を処置または防止するための１つまたは複数の追加の活性薬剤または他の支援治療と組み合わせた、１つまたは複数の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用を企図する。本明細書で使用される場合、「と組み合わせた」、「の組合せ」、「と併用した」、または「共同の」投与とは、追加の活性薬剤または支援治療（例えば、第２、第３、第４など）が体内で依然として有効である（例えば、複数の化合物がいくらかの期間にわたって患者において同時に有効であり、これらの化合物の相乗効果を含んでもよい）ような、任意の形態の投与を指す。有効性は、血液、血清、または血漿中の薬剤の測定可能な濃度と相関しなくてもよい。例えば、異なる治療化合物を、同じ製剤中で、または別の製剤中で、同時に、または逐次的に、および異なるスケジュールで投与することができる。したがって、そのような処置を受ける対象は、異なる活性薬剤または治療剤の併用効果から恩恵を受けることができる。本開示の１つまたは複数の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを、本明細書に開示されるものなどの、１つまたは複数の他の追加の薬剤または支援治療と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、それぞれの活性薬剤または治療は、その特定の薬剤について決定された用量で、および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて用いるための特定の組合せは、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドと、追加の活性薬剤もしくは治療および／または所望の効果との適合性を考慮に入れる。
【0126】
本明細書に記載の方法は、がんを処置するための方法であって、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現されるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡと相補的である、方法を含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、腫瘍特異的ＲＮＡと二重鎖を形成し、それによって、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路を介する腫瘍特異的免疫応答を惹起する。そのため、必要に応じて、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを阻害しながら（例えば、内因性ｍｉＲ２１と相補的である５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用）、腫瘍細胞に対するＲＩＧ－Ｉ媒介性免疫活性化を組み合わせることによって、がんを処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、内因性に発現されるｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、発癌性である。一部の実施形態では、内因性に発現されるｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、腫瘍特異的である。本明細書で使用される場合、「腫瘍特異的ＲＮＡ」とは、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高度に発現されるＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。
【0127】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内で調節機能を発揮することが多い。ＲＩＳＣのコアサブユニットは、ＡＧＯ２（アルゴノートファミリーのタンパク質のメンバー）に結合したｍｉＲＮＡである。ＲＩＳＣ複合体内のｍｉＲＮＡは、一方のＲＮＡ鎖が、複合体を標的ｍＲＮＡに導くｍｉＲＮＡ－ガイドであり、他方のＲＮＡ鎖が、複合体から除去され、分解されるパッセンジャー鎖である、二本鎖ｍｉＲＮＡを含む。ＡＧＯ２は、抑制のための相補的標的転写物を同定するためにｍｉＲＮＡ－ガイドを使用する。
【0128】
一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性腫瘍特異的ＲＮＡと二重鎖を形成する。一部の実施形態では、内因性腫瘍特異的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡから選択される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、発癌性である。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡと二重鎖を形成する。一部の実施形態では、二重鎖は、ＡＧＯ２によって切断されない。一部の実施形態では、二重鎖は、ＡＧＯ２によって放出される。一部の実施形態では、二重鎖は、０～５個のミスマッチ塩基対を含む。
【0129】
一部の実施形態では、二重鎖は、ＲＩＧ－Ｉを活性化する。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、対応する非修飾一リン酸ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる活性化よりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、腫瘍特異的免疫応答を惹起する。一部の実施形態では、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡと競合して、ｍｉＲＮＡに結合する。
【0130】
本明細書に開示される方法は、異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する障害、例えば、細胞増殖障害または細胞分化障害、例えば、固形腫瘍と造血がんとの両方を含む、がんの処置を含む。ある特定の実施形態では、方法は、腫瘍特異的免疫活性化と、ｍｉＲＮＡもしくはｍＲＮＡの阻害との組合せを含む、二重の処置方法に関する。前記方法を使用して、発達中のがん細胞を標的とする免疫応答を誘発することによって、異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する障害を発症するリスクを低減させることもできる。一部の実施形態では、障害は、固形腫瘍、例えば、乳がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、肺がん、腎臓がん、皮膚がん、または結腸がんである。一般に、方法は、本明細書に記載の処置の治療有効量を、そのような処置を必要とする対象、またはそのような処置を必要とすると決定された対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、例えば、ナノ粒子に連結された、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）を含む処置の治療有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性ナノ粒子である。
【0131】
この文脈で使用される場合、「処置する」とは、異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する障害の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。例えば、処置は、腫瘍サイズまたは成長速度の低減をもたらすことができる。異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する状態（例えば、がん）の処置のための、本明細書に記載の化合物の治療有効量の投与は、とりわけ、腫瘍サイズの低減もしくは成長速度の低下、再発のリスクもしくは頻度の低減、再発の遅延、転移の低減、生存率の増加、ならびに／または罹患率および死亡率の低下をもたらす。
【0132】
細胞増殖および／または分化障害の例としては、がん、例えば、癌、肉腫、転移性障害または造血系新生物障害、例えば、白血病が挙げられる。転移性腫瘍は、限定されるものではないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓起源のものを含む、多数の原発腫瘍型から生じ得る。
【0133】
本明細書で使用される場合、用語「がん」、「過剰増殖性」および「新生物性」とは、自律的成長の能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状況または状態を指す。過剰増殖性および新生物性病態は、病原性、すなわち、病態を特徴付けるか、もしくは構成すると分類することができるか、または非病原性、すなわち、病態と関連するのではなく、正常からの逸脱と分類することができる。この用語は、組織病理型または侵襲性のステージに関係なく、あらゆる型のがん性成長または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、もしくは臓器を含むことを意味する。「病原性過剰増殖」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする病態で生じる。非病原性過剰増殖細胞の例としては、創傷修復と関連する細胞の増殖が挙げられる。
【0134】
用語「がん」または「新生物」は、罹患している膀胱、骨、肺、腎臓、乳房、甲状腺、リンパ、消化管、および尿生殖路などの種々の臓器系の悪性腫瘍、ならびに多くの結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／もしくは精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。他の型のがんとしては、限定されるものではないが、胆道がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃（gastric）がん、神経膠芽腫、上皮内新生物、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、黒色腫、骨髄腫、神経芽腫、口腔がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、肉腫、皮膚がん、胃（stomach）がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、および腎がんが挙げられる。ある特定の実施形態では、がんは、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia）、皮膚Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia）、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝細胞癌、基底細胞腫、結腸癌、子宮頸部異形成、およびカポジ肉腫（ＡＩＤＳ関連および非ＡＩＤＳ関連）から選択される。
【0135】
用語「癌」は、当技術分野で認識されており、呼吸器系の癌、消化管系の癌、尿生殖路系の癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系の癌、および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。一部の実施形態では、疾患は、腎癌または黒色腫である。例示的な癌としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成するものが挙げられる。この用語はまた、例えば、癌性および肉腫性の組織から構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌、または腫瘍細胞が認識可能な腺状構造を形成する癌を指す。
【0136】
用語「肉腫」は、当技術分野で認識されており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
【0137】
増殖性障害のさらなる例としては、造血系新生物障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「造血系新生物障害」は、例えば、骨髄系列、リンパ系列もしくは赤血球系列、またはその前駆細胞から生じる、造血起源の過形成／新生物細胞を含む疾患を含む。好ましくは、疾患は、低分化型急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。さらなる例示的な骨髄性障害としては、限定されるものではないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97において概説されている）；リンパ性悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）ならびにワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。さらなる形態の悪性リンパ腫としては、限定されるものではないが、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・スタンバーグ病が挙げられる。
【0138】
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、がんを有する（例えば、原発性がんまたは転移性がんを有する）と診断された対象に投与される。一部の実施形態では、対象は、乳がん（例えば、転移性乳がん）を有する。一部の非限定的な実施形態では、対象は、男性または女性、成人、青年、または小児である。一部の実施形態では、対象は、がんまたは転移性がん（例えば、リンパ節における転移性がん）の１つまたは複数の症状を有する。一部の実施形態では、対象は、重症の、または進行ステージのがん（例えば、原発性がんまたは転移性がん）を有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つのリンパ節に存在する転移性腫瘍を有する。一部の実施形態では、対象は、乳房温存術（lymphectomy）および／または乳腺切除術を受けたことがある。
【0139】
ＲＩＧ－Ｉ受容体活性化免疫応答
以前に記載されたように、ＲＩＧ－Ｉは、自然免疫系のパターン認識受容体（ＰＲＲ）を感知する細胞質核酸である。それは、５’三リン酸シグナチャーを用いてＲＮＡ構造（ウイルスのような）を認識するために必須である。ＲＩＧ－Ｉ活性化を、がんに対する免疫応答としてプログラミングすることができる。重要なことに、ＲＩＧ－Ｉによる腫瘍細胞死は、免疫記憶を構築することが示されており、これは、一度、身体の免疫系が活性化されたら、身体は免疫となり、腫瘍は「外来」として拒絶されることを意味する。
以前に記載されたように、ＲＩＧ－Ｉは、自然免疫系のパターン認識受容体（ＰＲＲ）を感知する細胞質核酸である。それは、５’三リン酸シグナチャーを用いてＲＮＡ構造（ウイルスのような）を認識するために必須である。ＲＩＧ－Ｉ活性化を、がんに対する免疫応答としてプログラミングすることができる。重要なことに、ＲＩＧ－Ｉによる腫瘍細胞死は、免疫記憶を構築することが示されており、これは、一度、身体の免疫系が活性化されたら、身体は免疫となり、腫瘍は「外来」として拒絶されることを意味する。
【0140】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞においてＲＩＧ－Ｉを選択的に活性化するための方法であって、治療有効量の一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、内因性腫瘍特異的ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）と相補的である配列を含み、ＲＩＧ－Ｉが、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞において選択的に活性化される、方法を企図する。理論によって束縛されることを望むものではないが、一本鎖５’非キャップ付加三リン酸または二リン酸修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが腫瘍特異的ＲＮＡと二重鎖を形成し、それによって、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路を介して腫瘍特異的免疫応答を惹起する場合、免疫系はがん細胞において選択的に活性化される。一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与は、抗ウイルス応答、特に、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導する。一部の実施形態では、Ｉ型ＩＦＮ応答は、ＩＦＮ－α応答である。一部の実施形態では、ＲＩＧ－Ｉ活性化は、腫瘍特異的免疫応答（例えば、腫瘍特異的ＲＮＡを高度に発現する腫瘍細胞に対する応答）を惹起する。一部の実施形態では、腫瘍特異的免疫応答は、Ｉ型ＩＦＮ、ＤＡＭＰ（危険関連分子パターン）、および／または腫瘍抗原の放出を含む。一部の実施形態では、方法は、前記腫瘍細胞に対する免疫記憶を誘導する。
【0141】
一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与は、（ａ）抗ウイルス応答、特に、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導する、および（ｂ）脊椎動物、特に、哺乳動物において腫瘍特異的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ２１）を下方調節する。本出願は、脊椎動物、特に、哺乳動物において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための医薬組成物の調製のための少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用をさらに提供する。
【0142】
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの投与によって腫瘍特異的免疫応答を惹起し、それによって、身体の免疫系を活性化して、所望の処置応答をもたらす（例えば、動物における抗腫瘍免疫記憶を扱う、および／または創出する）ための方法および／または組成物が、本明細書に記載される。理論によって束縛されることを望むものではないが、図１に示されるように、ＲＩＧ－Ｉ経路は、がん細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡと相補的な５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入後の５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕでの生成によって、これらの細胞において選択的に活性化される；同じこと、または類似することは、５’ｐｐ－ｓｓＲＮＡからも予想される。結果として、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の抗腫瘍免疫能力を、単に一本鎖ＲＮＡを使用することによる、ある特定の腫瘍抑制遺伝子（複数可）の同時活性化と併せて、ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達経路の活性化によって明らかにすることができる。
【0143】
６．医薬組成物および投与様式
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、医療従事者（例えば、医師、フィジシャン アシスタント、看護師、または検査室もしくは診療所従事者）、対象（すなわち、自己投与）、または対象の友人もしくは家族によって投与され得る。投与を、臨床現場（例えば、診療所もしくは病院）、介護付き住宅、または薬局において実施することができる。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、医療従事者（例えば、医師、フィジシャン アシスタント、看護師、または検査室もしくは診療所従事者）、対象（すなわち、自己投与）、または対象の友人もしくは家族によって投与され得る。投与を、臨床現場（例えば、診療所もしくは病院）、介護付き住宅、または薬局において実施することができる。
【0144】
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０）用量の、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）のいずれかの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）を含有する組成物を投与される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、少なくとも１つの磁性粒子または医薬組成物（例えば、本明細書に記載の磁性粒子または医薬組成物のいずれか）を、対象に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの磁性粒子または医薬組成物は、対象のリンパ節に直接投与（注射）される。
【0145】
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０）用量の、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）のいずれかの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）を含有する組成物を投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．２ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．３ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．４ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．６ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．７ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．８ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、０．９ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、４ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、６ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、７ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、８ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、９ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ．の用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、６０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、７０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、８０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、９０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１００ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１１０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１２０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１３０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１４０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１５０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１６０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１７０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１８０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１９０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。
【0146】
一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ．用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．７ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも０．９ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１１０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１３０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１４０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１７０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１８０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１９０ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。一部の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ用量で投与される。
【0147】
ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１日１回投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１日２回投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、週１回投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、週２回投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、週３回投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２週毎に投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３週毎に投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、４週毎に投与される。ある特定の実施形態では、本開示の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、毎月投与される。
【0148】
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０）用量の、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）のいずれかの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）を含有する組成物を投与される。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。 ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で１０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、最大で２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、１個の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【0149】
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０）用量の、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）のいずれかの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）を含有する組成物を投与される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、少なくとも１つの磁性粒子または医薬組成物（例えば、本明細書に記載の磁性粒子または医薬組成物のいずれか）を、対象に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの磁性粒子または医薬組成物は、対象のリンパ節に直接投与（注射）される。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、４～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、５～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、６～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、７～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、８～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、９～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１０～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１１～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１２～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１３～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１４～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１５～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１６～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１７～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１８～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１９～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２０～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２１～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２２～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２３～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。 一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２４～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２５～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２６～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２７～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２８～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２９～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３０～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３１～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３２～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３３～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３４～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３５～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３６～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３７～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３８～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３９～最大４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【0150】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも４０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも２０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１１個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１０個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも９個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも８個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも７個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも６個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも５個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも４個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも３個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも２個の異なる修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【0151】
一部の実施形態では、少なくとも１つの上記の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞、特に、細胞の細胞質ゾルへのオリゴヌクレオチドの送達を容易にする剤をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、本明細書に記載される剤（例えば、ミセル、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、球状核酸（ＳＮＡ）、細胞外ベシクル、合成ベシクル、エキソソーム、リピドイド、リポソーム、およびリポプレックス）である。
【0152】
医薬組成物は、オリゴヌクレオチドを安定化する剤などの別の剤をさらに含んでもよい。安定化剤の例としては、オリゴヌクレオチドと複合体化して、ｉＲＮＰを形成するタンパク質、ＥＤＴＡなどのキレート剤、塩、およびＲＮａｓｅ阻害剤が挙げられる。
【0153】
ある特定の実施形態では、医薬組成物、特に、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に活性な治療剤をさらに含む。薬学的に活性な薬剤の例としては、免疫刺激剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗腫瘍剤、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、抗血管新生因子、化学療法剤、抗体および遺伝子サイレンシング剤が挙げられる。好ましくは、薬学的に活性な薬剤は、免疫刺激剤、抗ウイルス剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される。１つより多い薬学的に活性な薬剤は、同じか、または異なるカテゴリーのものであってよい。
【0154】
ある特定の実施形態では、医薬組成物、特に、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、抗原、抗ウイルスワクチン、抗細菌ワクチン、および／または抗腫瘍ワクチンをさらに含み、ここで、ワクチンは、予防的および／または治療的であってもよい。
【0155】
ある特定の実施形態では、医薬組成物、特に、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、レチノイド酸（retinoid acid）、ＩＦＮ－αおよび／またはＩＦＮ－βをさらに含む。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、レチノイド酸、ＩＦＮ－αおよび／またはＩＦＮ－βは、おそらく、ＲＩＧ－Ｉ発現の上方調節によって、ＩＦＮ－α産生のために細胞を感作させることができる。
【0156】
医薬組成物を、意図された投与経路、送達形式および所望の投与量を含む、その治療適用と適合する任意の方法で製剤化することができる。当業者であれば、最適な医薬組成物を、当技術分野における共通一般知識に従って製剤化することができる。
【0157】
医薬組成物を、即時放出、制御放出、時限放出、持続放出、徐放、または連続放出のために製剤化することができる。
【0158】
医薬組成物を、それが意図された適用と適合するという条件で、限定されるものではないが、局所、経腸および非経口経路を含む当技術分野で公知の任意の経路によって投与することができる。局所投与としては、限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻内、経膣投与、浣腸、点眼、および点耳が挙げられる。経腸投与としては、限定されるものではないが、経口、直腸投与および栄養管による投与が挙げられる。非経口投与としては、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、経皮、経粘膜、および吸入投与が挙げられる。医薬組成物を、予防および／または治療目的で使用することができる。
【0159】
当業者であれば、処置しようとする疾患または状態、疾患または状態の重症度、患者の年齢、性別および身体状態、ならびに以前の処置の存在または非存在などの因子に基づいて、投与の最適な投与量、頻度、タイミングおよび経路を容易に決定することができる。
【0160】
一部の実施形態では、対象は、少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）または医薬組成物（例えば、５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかまたは本明細書に記載の医薬組成物）および少なくとも１つの追加の治療剤を投与される。少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、サリノスポラミドＡ、オールトランスレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）および／または鎮痛剤（例えば、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ブプレノルフィン、ブトルファノール、コデイン、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、モルヒネ、ナルブフィン、オキシコドン、オキシモルホン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、およびトラマドール）であってもよい。
【0161】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、免疫原性細胞死誘導剤（ＩＣＤｉ）（例えば、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、およびパクリタキセル）である。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ｓｉＲＮＡ治療である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ治療は、がんと関連する遺伝子（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＧＦ－β、および／またはＶＥＧＦ）を標的とする。
【0162】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、標的化治療である。標的化治療は、ヒトの遺伝子およびタンパク質に関する情報を使用して、疾患を防止し、診断し、処置する医療の形態である、精密医療とも称されるものの基礎である。そのような治療剤は、「分子標的化薬」または類似の名称で呼ばれることもある。それらを探索するプロセスは、「合理的薬物設計」と称されることが多い。この概念は、「個別化医療」と称されることもある。
【0163】
分子標的化薬は、経路中の、特定の標的分子、または構造的に関連する標的分子のセットと相互作用し、したがって、疾患関連プロセスなどの、その経路の終点効果をモジュレートし、したがって、治療利益を得る。
【0164】
分子標的化薬は、低分子またはバイオ医薬品、通常、抗体であってもよい。それらは、単独で、または他の治療剤および方法と組み合わせて有用であり得る。
【0165】
それらは特定の分子、または関連する分子のセットを標的とし、通常、他の分子とのそれらの相互作用を最小化するように設計されるため、標的化治療薬は、より少ない有害副作用を有し得る。標的化がん薬物は、広く言えば、がんの成長、進行、抑制もしくは除去の欠如、または拡散に関与する特定の分子または構造的に関連する分子のセット（まとめて、「分子標的」）と相互作用することによって、がんの成長および拡散を遮断する。そのような分子標的は、例えば、限定されるものではないが、シグナル伝達、遺伝子発現モジュレーション、アポトーシスの誘導もしくは抑制、血管新生阻害、または免疫系モジュレーションを含む、１つまたは複数の細胞機能に関与するタンパク質または遺伝子を含んでもよい。
【0166】
標的化治療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および標的化低分子は、がんの処置として使用されている。それらは、単剤治療として、または特に、処置下にある疾患が従来の技術のみを使用する治療に対して不応性である場合、他の従来の治療モダリティと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、分子標的化治療である。一部の実施形態では、分子標的化治療は、トラスツズマブ、ジオトリフ、プロロイキン、アレクチニブ、キャンパス、アテゾリズマブ、アベルマブ、アキシチニブ、ベリムマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベルケイド、カナキヌマブ、セリチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ダサチニブ、デノスマブ、エロツズマブ、エナシデニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、ザイデリグ、イマチニブ、レンバチニブ、ミドスタウリン、ネシツムマブ、ニラパリブ、オビヌツズマブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、トシリズマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される。
【0167】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、免疫治療である。本明細書で使用される場合、用語「免疫治療」とは、がん細胞に対する身体の免疫応答を間接的もしくは直接的に増強する、刺激する、もしくは増加させる、および／または他の抗がん治療の副作用を減少させる化合物、組成物または処置を指す。免疫治療は、したがって、がん細胞に対する免疫系の応答を直接的もしくは間接的に刺激もしくは増強する、および／または他の抗がん剤によって引き起こされ得る副作用を減少させる治療である。免疫治療はまた、免疫原性治療、生物学的治療、生物応答調節剤治療および生物治療と当技術分野で称される。当技術分野で公知の一般的な免疫治療剤の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、がんワクチン、モノクローナル抗体および非サイトカインアジュバントが挙げられる。あるいは、免疫治療処置は、ある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）を対象に投与することからなってもよい。
【0168】
免疫治療剤は、非特異的であってもよく、すなわち、ヒトの身体ががん細胞の成長および／もしくは拡散と戦うのにより有効になるように、免疫系を全般的にブーストしてもよいか、またはそれらは特異的、すなわち、がん細胞自体を標的とすることができ、免疫治療レジメンは、非特異的免疫治療剤および特異的免疫治療剤の使用を組み合わせてもよい。
【0169】
非特異的免疫治療剤は、免疫系を刺激するか、または間接的に改善する物質である。非特異的免疫治療剤は、がんの処置のための主要な治療として単独で、ならびに非特異的免疫治療剤が他の治療（例えば、がんワクチン）の有効性を増強するためのアジュバントとして機能する場合、主要な治療に加えて使用されてきた。非特異的免疫治療剤はまた、この後者の文脈では、他の治療の副作用、例えば、ある特定の化学療法剤によって誘導される骨髄抑制を低減させるように機能することもできる。非特異的免疫治療剤は、重要な免疫系の細胞に対して作用し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生の増加などの二次的応答を引き起こすことができる。あるいは、薬剤はそれ自体、サイトカインを含んでもよい。非特異的免疫治療剤は一般に、サイトカインまたは非サイトカインアジュバントとして分類される。
【0170】
一部の実施形態では、免疫治療は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４治療を受けたことがあるか、または受けている。あるいは、いずれかの方法は、対象に、有効量の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４治療を投与することをさらに含んでもよい。一部の例では、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４治療は、それぞれ、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４抗体を含んでもよい。例示的な抗ＰＤ－１抗体としては、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、およびＡＭＰ－２２４、またはその抗原結合性断片が挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、イピリムマブ、およびトレメリムマブ、またはその抗原結合性断片が挙げられる。例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、およびアベルマブ、またはその抗原結合性断片が挙げられる。
【0171】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、同じ組成物（例えば、同じ医薬組成物）で投与される。「少なくとも１つ」とは、同じか、または異なるオリゴヌクレオチド（複数可）の１つまたは複数の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを一緒に使用することができることを意味する。
【0172】
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、異なる投与経路を使用して対象に投与される（例えば、経口投与により送達される少なくとも１つの追加の治療剤および静脈内投与により送達される少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド）。
【0173】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいては、少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物（例えば、本明細書に記載の５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物のいずれか）および必要に応じて、少なくとも１つの追加の治療剤を、週に少なくとも１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回、または１日３回）、対象に投与することができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの追加の治療剤は、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの追加の治療剤は、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する液体組成物および少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体経口組成物）で投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、持続放出経口製剤で投与される。
【0174】
一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤を、少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物（例えば、本明細書に記載の５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物のいずれか）を投与する前に対象に投与することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤を、少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物（例えば、本明細書に記載の磁性粒子または医薬組成物のいずれか）を投与した後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤および少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物（例えば、本明細書に記載の５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物のいずれか）は、対象における１つまたは複数の追加の治療剤および少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのいずれか）の生物活性期間に重複が存在するように対象に投与される。
【0175】
一部の実施形態では、対象に、長期間にわたって（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、または１０年間にわたって）、少なくとも１つの５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物（例えば、本明細書に記載の５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物のいずれか）を投与することができる。知識のある医療従事者であれば、処置の有効性を診断または追跡するための本明細書に記載の方法のいずれかを使用して（例えば、上記の方法および当技術分野で公知の方法を使用して）、処置期間の長さを決定することができる。本明細書に記載される場合、知識のある医療従事者であれば、対象に投与される５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（および／または１つもしくは複数の追加の治療剤）の同一性および数を変化させる（例えば、増加または減少させる）こともでき、処置の有効性の評価（例えば、本明細書に記載の方法および当技術分野で公知の方法のいずれかを使用する）に基づいて、対象への少なくとも１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（および／または１つもしくは複数の追加の治療剤）の投与の投与量または頻度を調整する（例えば、増加または減少させる）こともできる。知識のある医療従事者であれば、処置を中止すべきとき（例えば、対象の症状が有意に減少したとき）をさらに決定することができる。
【0176】
７．送達
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）を、当技術分野で利用可能な種々の公知かつ好適な方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞または対象に送達することができる。本明細書で提供される場合、リポプレックス、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、球状核酸(ＳＮＡ）、ナノ粒子、および当技術分野で公知の他の方法を含む送達システムを、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの送達のために使用することができる。
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）を、当技術分野で利用可能な種々の公知かつ好適な方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞または対象に送達することができる。本明細書で提供される場合、リポプレックス、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、球状核酸(ＳＮＡ）、ナノ粒子、および当技術分野で公知の他の方法を含む送達システムを、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの送達のために使用することができる。
【0177】
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する様々な送達システム（例えば、リポソーム、ナノ粒子）を、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞への送達のために生物に投与するか、またはｅｘ ｖｉｖｏで細胞もしくは細胞培養物に投与することもできる。投与は、限定されるものではないが、注射、注入、局所的適用および電気穿孔を含む、ある分子を、血液、流体、または細胞との最終的な接触に導入することのために通常使用される任意の経路による。そのようなオリゴヌクレオチドを投与する好適な方法は、当業者には利用可能であり、周知である。
【0178】
オリゴヌクレオチド送達戦略
オリゴヌクレオチド治療剤の分野は、ここ数年にわたって顕著な進歩を見せている。しかしながら、オリゴヌクレオチドの、その細胞内の作用部位への有効な送達は、依然として大きな問題である。オリゴヌクレオチド送達の生物学的基礎は、様々な組織障壁の性質およびオリゴヌクレオチドの細胞取込みのメカニズムおよび細胞内輸送を含む。オリゴヌクレオチドの送達を増強するための現在の手法としては、オリゴヌクレオチド送達を改善する、分子規模の標的化リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、脂質およびポリマーに基づくナノ粒子、球状核酸（核酸でコーティングされた無機ナノ粒子）、ミセル、細胞外ベシクル、合成ベシクル、エキソソーム、リピドイド、抗体コンジュゲートおよび低分子が挙げられる。これらの手法の利点および不利な点は、基礎となる基本生物学の文脈に置かれる。これらの送達方法の一部は、以下により詳細に記載される。
オリゴヌクレオチド治療剤の分野は、ここ数年にわたって顕著な進歩を見せている。しかしながら、オリゴヌクレオチドの、その細胞内の作用部位への有効な送達は、依然として大きな問題である。オリゴヌクレオチド送達の生物学的基礎は、様々な組織障壁の性質およびオリゴヌクレオチドの細胞取込みのメカニズムおよび細胞内輸送を含む。オリゴヌクレオチドの送達を増強するための現在の手法としては、オリゴヌクレオチド送達を改善する、分子規模の標的化リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、脂質およびポリマーに基づくナノ粒子、球状核酸（核酸でコーティングされた無機ナノ粒子）、ミセル、細胞外ベシクル、合成ベシクル、エキソソーム、リピドイド、抗体コンジュゲートおよび低分子が挙げられる。これらの手法の利点および不利な点は、基礎となる基本生物学の文脈に置かれる。これらの送達方法の一部は、以下により詳細に記載される。
【0179】
リポプレックス、リポソーム、および脂質ナノ粒子
脂質を含む製剤は、核酸送達を増強するための最も一般的な手法の１つである。ポリアニオン性核酸薬物と脂質との混合は、より好ましい表面電荷を有し、エンドサイトーシスによる取込みを誘発するのに十分に大きい（直径約１００ｎｍ）ナノ粒子への核酸の凝縮をもたらす。リポプレックスは、ポリアニオン性核酸と、カチオン性脂質との間の直接的な静電相互作用の結果であり、典型的には、比較的不安定な複合体の異種集団である。リポプレックス製剤は、使用の直前に調製する必要があり、局部送達適用のために成功裏に使用されている。対照的に、リポソームは、脂質二重層を含み、核酸薬物は封入された水性空間に存在する。リポソームは、より複雑であり（典型的には、カチオン性または融合性脂質［エンドソーム脱出を促進する］およびコレステロールＰＥＧ化脂質からなる）、リポプレックスよりも一貫した物理特性を示し、より高い安定性を示す。例えば、安定な核酸脂質粒子としても公知の、一部の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、規定の比のイオン化可能な脂質、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含有し、複数の例において成功裏に使用されているリポソームである。ランドマーク例は、前臨床動物試験におけるｓｉＲＮＡによるＢ型肝炎ウイルスおよびＡＰＯＢのサイレンシングならびに、より最近では、ＬＮＰ製剤として送達されるｓｉＲＮＡであるパチシランの承認である。核酸カーゴの封入は、循環およびエンドソーム中でのヌクレアーゼ消化からの保護手段を提供する。さらに、イオン化可能なＬＮＰはまた、ＡＰＯＥと会合し、ＬＤＬＲ媒介性エンドサイトーシスによる肝臓取込みをさらに容易にする。同様に、リピドイドまたは脂質様材料を含有するＬＮＰは、齧歯類および非ヒト霊長類におけるロバストなｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングを示した。
脂質を含む製剤は、核酸送達を増強するための最も一般的な手法の１つである。ポリアニオン性核酸薬物と脂質との混合は、より好ましい表面電荷を有し、エンドサイトーシスによる取込みを誘発するのに十分に大きい（直径約１００ｎｍ）ナノ粒子への核酸の凝縮をもたらす。リポプレックスは、ポリアニオン性核酸と、カチオン性脂質との間の直接的な静電相互作用の結果であり、典型的には、比較的不安定な複合体の異種集団である。リポプレックス製剤は、使用の直前に調製する必要があり、局部送達適用のために成功裏に使用されている。対照的に、リポソームは、脂質二重層を含み、核酸薬物は封入された水性空間に存在する。リポソームは、より複雑であり（典型的には、カチオン性または融合性脂質［エンドソーム脱出を促進する］およびコレステロールＰＥＧ化脂質からなる）、リポプレックスよりも一貫した物理特性を示し、より高い安定性を示す。例えば、安定な核酸脂質粒子としても公知の、一部の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、規定の比のイオン化可能な脂質、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質コンジュゲートを含有し、複数の例において成功裏に使用されているリポソームである。ランドマーク例は、前臨床動物試験におけるｓｉＲＮＡによるＢ型肝炎ウイルスおよびＡＰＯＢのサイレンシングならびに、より最近では、ＬＮＰ製剤として送達されるｓｉＲＮＡであるパチシランの承認である。核酸カーゴの封入は、循環およびエンドソーム中でのヌクレアーゼ消化からの保護手段を提供する。さらに、イオン化可能なＬＮＰはまた、ＡＰＯＥと会合し、ＬＤＬＲ媒介性エンドサイトーシスによる肝臓取込みをさらに容易にする。同様に、リピドイドまたは脂質様材料を含有するＬＮＰは、齧歯類および非ヒト霊長類におけるロバストなｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングを示した。
【0180】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチドカーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示される５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの送達のために使用することができる。ＬＮＰの欠点は、その送達が主に肝臓および細網内皮系に限定されることであり、これは、この組織中での洞様毛細血管上皮がこれらの比較的大きいナノ粒子の進入を可能にするのに十分に大きい空間を提供するからである。しかしながら、ＬＮＰの局部送達は、脳室内注射後にｓｉＲＮＡをＣＮＳに上手く送達するために使用されてきた。逆に、大きいサイズのナノ粒子は、本質的に腎臓濾過を不可能にし、より高いペイロードの送達を可能にするため、それは有利である。
【0181】
一部の実施形態では、本明細書に開示される５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを宿主細胞または対象に送達するための方法であって、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドがＬＮＰを介して送達される、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性のイオン化可能な脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートまたは別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５５９、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、およびＷＯ２０１４／１３６０８６、ならびにその中で提供される参考文献の脂質を参照されたい。一部の実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈におけるカチオン性およびイオン化可能という用語は、互換的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。
【0182】
一部の実施形態では、本明細書に開示される５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中で製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与される；例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１７／１７３０５４を参照されたい。本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかを、ＬＮＰによって送達することができる。一部の例では、脂質成分は、生分解性のイオン化可能な脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
【0183】
球状核酸(ＳＮＡ）
代替的なナノ粒子に基づく送達戦略は、ＳＮＡ手法である。ＳＮＡ粒子は、チオール結合によって表面上に密に充填された親水性オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド）で装飾された疎水性コアナノ粒子（金、シリカまたは他の様々な材料を含む）からなる。他のナノ粒子設計とは対照的に、ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドは、コア構造から外に向かって放射状に広がる。立体障害、高い局部塩濃度、およびコロナタンパク質との相互作用の結果として、露出されている間、オリゴヌクレオチドは核酸分解からある程度保護される。
代替的なナノ粒子に基づく送達戦略は、ＳＮＡ手法である。ＳＮＡ粒子は、チオール結合によって表面上に密に充填された親水性オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド）で装飾された疎水性コアナノ粒子（金、シリカまたは他の様々な材料を含む）からなる。他のナノ粒子設計とは対照的に、ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドは、コア構造から外に向かって放射状に広がる。立体障害、高い局部塩濃度、およびコロナタンパク質との相互作用の結果として、露出されている間、オリゴヌクレオチドは核酸分解からある程度保護される。
【0184】
ナノ粒子
一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２０１３／０１６１２６に記載されたように、ナノ粒子に連結またはコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２ｎｍ～約２００ｎｍ（例えば、約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約２５ｎｍ、約１０ｎｍ～約２５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２５ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、約２５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍ、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ）の直径を有し、ポリマーコーティングを含有する。
一部の実施形態では、５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２０１３／０１６１２６に記載されたように、ナノ粒子に連結またはコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２ｎｍ～約２００ｎｍ（例えば、約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約２５ｎｍ、約１０ｎｍ～約２５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２５ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、約２５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍ、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ）の直径を有し、ポリマーコーティングを含有する。
【0185】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるナノ粒子は、球状もしくは楕円状であってよいか、または不定形の形状を有してもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供されるナノ粒子は、約２ｎｍ～約２００ｎｍ（例えば、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約２５ｎｍ、約１０ｎｍ～約２５ｎｍ、約１５ｎｍ～約２５ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍ、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ）の直径（ナノ粒子の外表面上の任意の２つの点の間）を有してもよい。一部の実施形態では、約２ｎｍ～約３０ｎｍの直径を有するナノ粒子は、対象のリンパ節に局在化する。一部の実施形態では、約４０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有するナノ粒子は、肝臓に局在化する。
【0186】
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、磁性材料を含有しない。一部の実施形態では、ナノ粒子は、部分的に、ポリマー（例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸））を含有するコアを含有してもよい。当業者であれば、限定されるものではないが、ゴム（例えば、アカシア、グアー）、キトサン、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、およびアルブミンを含む、任意の数の当技術分野で公知の材料を使用して、ナノ粒子を調製することができることを理解する。本明細書に記載のナノ粒子を生成するために使用することができるさらなるポリマーは、当技術分野で公知である。例えば、ナノ粒子を生成するために使用することができるポリマーとしては、限定されるものではないが、セルロース系、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレートおよびポリカプロラクトンが挙げられる。
【0187】
当業者であれば、ナノ粒子の組成物中で使用される材料、ナノ粒子を調製し、コーティングするための方法、およびナノ粒子のサイズを制御するための方法が実質的に変化してもよいことを理解する。しかしながら、これらの方法は、当業者には周知である。重要な問題は、ナノ粒子の生分解性、毒性プロファイル、および薬物動態／薬力学を含む。ナノ粒子の組成物および／またはサイズは、その生物学的運命の重要な決定因子である。例えば、より大きいナノ粒子は、典型的には、肝臓によって取り込まれ、分解されるが、より小さいナノ粒子（直径３０ｎｍ未満）は、典型的には、長時間（時には、ヒトにおける２４時間を超える血中半減期）にわたって循環し、リンパ節および腫瘍などの高浸透性血管系を有する臓器の間質に蓄積する。
【0188】
磁性ナノ粒子
一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性であってもよい（例えば、磁性材料のコアを含有する）。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子としては、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ、およびデキストランコーティングが挙げられる。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、本明細書に記載の２つまたはそれより多い異なるナノ粒子組成物の混合物を含有する。一部の実施形態では、組成物は、調整可能な表面官能化を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子、および調整可能な磁気特性を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子を含有する。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、磁性であってもよい（例えば、磁性材料のコアを含有する）。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子としては、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せ、およびデキストランコーティングが挙げられる。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、本明細書に記載の２つまたはそれより多い異なるナノ粒子組成物の混合物を含有する。一部の実施形態では、組成物は、調整可能な表面官能化を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子、および調整可能な磁気特性を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子を含有する。
【0189】
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子のいずれかは、磁性材料のコアを含有してもよい（例えば、治療的磁性ナノ粒子）。一部の実施形態では、磁性材料または粒子は、磁場に反応する、反磁性、常磁性、超常磁性、または強磁性材料を含有してもよい。治療的磁性ナノ粒子の非限定例は、マグネタイト；フェライト（例えば、マンガン、コバルト、およびニッケルのフェライト）；Ｆｅ（ＩＩ）酸化物、およびヘマタイトの群から選択される金属酸化物、ならびにその金属合金を含有する磁性材料のコアを含有する。磁性材料のコアを、当技術分野で公知の方法（例えば、Kieslich et al., Inorg. Chem. 2011）を使用して金属塩を金属酸化物に変換することによって形成させることができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、シクロデキストリン金または量子ドットを含有する。治療的磁性ナノ粒子を生成するために使用することができる方法の非限定例は、Medarova et al., Methods Mol. Biol. 555:1-13, 2009；およびMedarova et al., Nature Protocols 1:429-431, 2006に記載されている。さらなる磁性材料および磁性材料を作製する方法は、当技術分野で公知である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、治療的磁性ナノ粒子の位置または局在化を、対象中でイメージング（例えば、１つまたは複数の用量の治療的磁性ナノ粒子の投与後に対象中でイメージング）することができる。
【0190】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子を、１つまたは複数のアミン基で官能化することができる。一部の実施形態では、官能化は、磁性ナノ粒子の表面で起こる。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミン基は、デキストランコーティングに共有結合で連結される。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミン基は、デキストランコーティングの１つまたは複数のヒドロキシル基を置換する。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミン基の数は、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せの濃度に基づいて調整可能である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約５～約１０００個のアミン基を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約５～２５、２５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、または９５０～１０００個のアミン基を含む。
【0191】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性材料（例えば、塩化第２鉄および／または塩化第１鉄）のコアを含有してもよい。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約０．６０ｇ～約０．７０ｇの塩化第２鉄および約０．３ｇ～約０．５ｇの塩化第１鉄を含む。一部の実施形態では、約０．６０ｇ～約０．７０ｇの塩化第２鉄および約０．３ｇ～約０．５ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約５～１５０個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約０．６５ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約６０～９０個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約０．６５ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約５～１５０個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約０．６５ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約１～１５０個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約０．６５ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、少なくとも約１～１０個のアミン基、１０～２０個のアミン基、約２０～３０個のアミン基、約３０～４０個のアミン基、約４０～５０個のアミン基、約５０～６０個のアミン基、約６０～７０個のアミン基、約７０～８０個のアミン基、約８０～９０個のアミン基、約９０～１００個のアミン基、約１００～１１０個のアミン基、約１１０～１２０個のアミン基、約１２０～１３０個のアミン基、約１３０～１４０個のアミン基、または約１４０～１５０個のアミン基で官能化される。
【0192】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約１ｇ～約１．４ｇの塩化第２鉄を含む。一部の実施形態では、約１ｇ～約１．４ｇの塩化第２鉄を含む磁性ナノ粒子は、約２４６～５００個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約１．２ｇの塩化第２鉄を含む磁性ナノ粒子は、約２４６～５００個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約２４６～５００個のアミン基で官能化された磁性ナノ粒子は、塩化第２鉄を含まない。一部の実施形態では、約１．２ｇの塩化第２鉄を含む磁性ナノ粒子は、約２００～６００個のアミン基で官能化される。一部の実施形態では、約１．２ｇの塩化第２鉄を含む磁性ナノ粒子は、少なくとも約２００～２５０個のアミン基、２５０～３００個のアミン基、約３００～３５０個のアミン基、約３５０～４００個のアミン基、約４００～４５０個のアミン基、約４５０～５００個のアミン基、約５００～５５０個のアミン基、約５５０～６００個のアミン基、またはそれより多いアミン基で官能化される。
【0193】
したがって、一部の実施形態では、磁性ナノ粒子を調製するために使用される、塩化第２鉄および塩化第１鉄の濃度を制御することによって、デキストランコーティングにコンジュゲートされるアミン基の数を微調整することができる。
【0194】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、塩化第２鉄、塩化第１鉄、またはその組合せの濃度に基づいて調整可能である磁性強度を有する磁性ナノ粒子を含む。
【0195】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、ＭＮＰあたり、全鉄中、約０．１％～約９９．９％の第２鉄イオンおよび約９９．９％～約０．１％の第１鉄イオンを含む。一部の実施形態では、約６０％～約８０％の塩化第２鉄および約２０％～約４０％の塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約８０％より高い塩化第１鉄量を有するナノ粒子組成物よりも強い磁気特性を有する。一部の実施形態では、約７０％の第２鉄イオンおよび約３０％の第１鉄イオンを含む磁性ナノ粒子は、約３０％より高い第１鉄イオン量を有する磁性ナノ粒子よりも強い磁気特性を有する。
【0196】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６～約４０の範囲の非線形性指数（ＮＬＩ）を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６～約７０の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８．５～約１４．８の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８～約１４の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約１４のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約６７のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１６～１７、１７～１８、１８～１９、１９～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、または６０～７０の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約８．５～約１４．８の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．２ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約１２のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子の磁性強度を、ＷＯ２０２１／１１３８２９に記載された磁性粒子分光法によって非線形性指数（ＮＬＩ）を測定することによって定量することができる。
【0197】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８０％～約１００％の塩化第２鉄および約２０％～約０％の塩化第１鉄を含む。一部の実施形態では、約０％～約５０％の塩化第２鉄および約１００％～約５０％の塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約０．４ｇより少ない塩化第１鉄量を有する磁性ナノ粒子よりも弱い磁気特性を有する。一部の実施形態では、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約０．２ｇより少ない塩化第１鉄量を有する磁性ナノ粒子よりも弱い磁気特性を有する。一部の実施形態では、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約５０～約１２０の範囲のＮＬＩを有する。一部の実施形態では、約０．５４ｇの塩化第２鉄および約０．４ｇの塩化第１鉄を含む磁性ナノ粒子は、約６７のＮＬＩを有する。
【0198】
したがって、一部の実施形態では、磁性ナノ粒子を調製するために使用される、塩化第２鉄および塩化第１鉄の濃度を制御することによって、磁性ナノ粒子の磁気特性（例えば、磁気強度）を微調整することができる。
【0199】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８ｍＭ～約２１７ｍＭの範囲の鉄濃度を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約８ｍＭ～約１５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約２５ｍＭ～約５０ｍＭ、５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約６０ｍＭ～約７０ｍＭ、約７０ｍＭ～約８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約９０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１１０ｍＭ、約１１０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１３０ｍＭ、約１３０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約１６０ｍＭ～約１７０ｍＭ、約１７０ｍＭ～約１８０ｍＭ、約１８０ｍＭ～約１９０ｍＭ、約１９０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約２１０ｍＭおよび約２１０ｍＭ～約２２０ｍＭの範囲の鉄濃度を有する。
【0200】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの範囲の鉄濃度を有する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、約１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの範囲の鉄濃度を有する。
【0201】
一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の本明細書に記載の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で使用されるＲＮＡオリゴヌクレオチド）のいずれかを含有する組成物を送達するために使用される。「少なくとも１つ」とは、同じか、または異なるオリゴヌクレオチド（複数可）の１つまたは複数の５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを一緒に使用することができることを意味する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、１つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、２つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、３つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、４つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、５つの５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達する。
【0202】
ナノ粒子のポリマーコーティング
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、コア磁性材料にわたって（例えば、磁性材料の表面にわたって）ポリマーコーティングを含有する。ポリマー材料は、１つまたは複数の生物剤（例えば、本明細書に記載の核酸、フルオロフォア、または標的化ペプチドのいずれかなど）を結合またはカップリングさせるのに好適であり得る。１つまたは複数の（one of more）生物剤（例えば、核酸、フルオロフォア、または標的化ペプチド）を、化学的カップリング（共有結合）によってポリマーコーティングに固定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、コア磁性材料にわたって（例えば、磁性材料の表面にわたって）ポリマーコーティングを含有する。ポリマー材料は、１つまたは複数の生物剤（例えば、本明細書に記載の核酸、フルオロフォア、または標的化ペプチドのいずれかなど）を結合またはカップリングさせるのに好適であり得る。１つまたは複数の（one of more）生物剤（例えば、核酸、フルオロフォア、または標的化ペプチド）を、化学的カップリング（共有結合）によってポリマーコーティングに固定することができる。
【0203】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、水中で比較的安定であるポリマーで磁性材料のコアをコーティングすることを含む方法によって形成される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーで磁性材料をコーティングすること、またはその上に還元基を有する熱可塑性ポリマー樹脂中に磁性材料を吸収させることを含む方法によって形成される。コーティングを、米国特許第５，８３４，１２１号、第５，３９５，６８８号、第５，３５６，７１３号、第５，３１８，７９７号、第５，２８３，０７９号、第５，２３２，７８９号、第５，０９１，２０６号、第４，９６５，００７号、第４，７７４，２６５号、第４，７７０，１８３号、第４，６５４，２６７号、第４，５５４，０８８号、第４，４９０，４３６号、第４，３３６，１７３号、および第４，４２１，６６０号；ならびにＷＯ１０／１１１０６６（それらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用して磁性材料に適用することもできる。
【0204】
酸化鉄ナノ粒子の合成のための方法としては、例えば、物理的および化学的方法が挙げられる。例えば、酸化鉄を、水性溶液中でのＦｅ２＋およびＦｅ３＋塩の共沈降によって調製することができる。得られるコアは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）またはその２つの混合物からなる。水性溶液中のアニオン性塩内容物（塩化物、硝酸塩、硫酸塩など）、Ｆｅ２＋およびＦｅ３＋比、ｐＨおよびイオン強度は全て、サイズを制御する役割を果たす。窒素またはアルゴンなどの不活性ガス下の無酸素環境中で反応を実行することによって、合成されたナノ粒子の酸化を防止し、その磁気特性を保護することが重要である。酸化鉄ナノ粒子のマイクロ粒子への凝集を防止するために、共沈降プロセスの間にコーティング材料を添加することができる。当業者であれば、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、脂肪酸、ポリペプチド、キトサン、および／またはゼラチンなどの合成および天然ポリマーのうち、任意の数の当技術分野で公知の表面コーティング材料を、酸化鉄ナノ粒子を安定化するために使用することができることを理解する。
【0205】
例えば、米国特許第４，４２１，６６０号は、無機材料のポリマーコーティングされた粒子が、（１）無機固体を、酸、酸と塩基との組合せ、アルコールまたはポリマー溶液で処理すること；（２）処理された無機固体の水性分散体中に追加の重合可能なモノマーを分散させること、および（３）得られた分散体を乳化重合条件にかけることによって従来通り調製されることを記載している（ｃｏｌ．１、ｌｉｎｅｓ ２１～２７）。米国特許第４，４２１，６６０号はまた、ポリマーを用いて無機ナノ粒子をコーティングするための方法であって、（１）無機固体の個別粒子の水性コロイド分散体中で疎水性の乳化重合性モノマーを乳化するステップおよび（２）得られたエマルジョンを乳化重合条件にかけて、疎水性モノマーの水に不溶性のポリマーのマトリックス中に分散させた無機固体粒子の安定な、流体の水性コロイド分散体を形成させるステップを含む、方法を開示している（ｃｏｌ．１、ｌｉｎｅｓ ４２～５０）。
【0206】
あるいは、サイズの出発要件を満たすポリマーコーティングされた磁性材料を、商業的に取得することができる。例えば、商業的に入手可能な超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子としては、ＮＣ１００１５０ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｅａｌｔｈ）およびＦｅｒｕｍｏｘｙｔｏｌ（ＡＭＡＧ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【0207】
磁性材料のコアをコーティングするために使用することができる好適なポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエーテルウレタン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、およびポリプロピレンなどのフッ素化または塩素化ポリマー、ポリカーボネート、ならびにポリエステルが挙げられる。磁性材料のコアをコーティングするために使用することができるポリマーのさらなる例としては、ポリオレフィン、例えば、ポリブタジエン、ポリジクロロブタジエン、ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ハロゲン化ポリビニリデン、ポリビニリデンカーボネート、およびポリフッ素化エチレンが挙げられる。スチレン／ブタジエン、アルファ－メチルスチレン／ジメチルシロキサン、または他のポリシロキサンを含むいくつかのコポリマーを、磁性材料（例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリフェニルメチルシロキサン、およびポリトリフルオロプロピルメチルシロキサン）のコアをコーティングするために使用することもできる。磁性材料のコアをコーティングするために使用することができるさらなるポリマーとしては、ポリアルファ－アクリルニトリルコポリマー、アルキドまたはテルペノイド樹脂、およびポリアルキレンポリスルホネートなどのポリアクリロニトリルまたはアクリロニトリル含有ポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、ポリマーコーティングは、デキストランである。
【実施例】
【0208】
本発明はここで一般的に記載されており、本発明のある特定の実施形態の例示を単に目的として含まれ、本発明を限定することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、それはより容易に理解される。
【0209】
（実施例１）
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計、合成、および試験
本実施例では、強力なアゴニスト応答のために５’末端に二リン酸（ｐｐ）三リン酸（ｐｐｐ）、および送達のための磁性ナノ粒子（ＭＮ）へのコンジュゲーションのために３’末端にチオ－ＭＣ６－Ｄの修飾を含むその標的ｍｉＲＮＡと完全に相補的になるようにｍｉＲＮＡ阻害剤を設計する。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ修飾は、対照オリゴについては省略される。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－抗ｍｉＲＮＡ－３’－チオ－ＭＣ６－Ｄを、ＭＮにコンジュゲートすることもできる相補的ｍｉＲＮＡとアニーリングさせることによって、平滑末端二本鎖構造物を生成する。全てのカスタムＲＮＡオリゴヌクレオチドを、公知の方法を使用して合成する。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計、合成、および試験
本実施例では、強力なアゴニスト応答のために５’末端に二リン酸（ｐｐ）三リン酸（ｐｐｐ）、および送達のための磁性ナノ粒子（ＭＮ）へのコンジュゲーションのために３’末端にチオ－ＭＣ６－Ｄの修飾を含むその標的ｍｉＲＮＡと完全に相補的になるようにｍｉＲＮＡ阻害剤を設計する。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ修飾は、対照オリゴについては省略される。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－抗ｍｉＲＮＡ－３’－チオ－ＭＣ６－Ｄを、ＭＮにコンジュゲートすることもできる相補的ｍｉＲＮＡとアニーリングさせることによって、平滑末端二本鎖構造物を生成する。全てのカスタムＲＮＡオリゴヌクレオチドを、公知の方法を使用して合成する。
【0210】
ナノコンジュゲートの合成および特性評価
手順は、刊行物（Medarova Z. et al., 2016. Controlling RNA Expression in Cancer Using Iron Oxide Nanoparticles Detectable by MRI and In Vivo Optical Imaging. Methods Mol Biol. 2016;1372:163-179）から適応され、以下に簡単にまとめられる。オリゴヌクレオチド上のジスルフィドを、３％Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって活性化した後、酢酸アンモニウム／エタノール沈降処理を用いて精製した後、ナノ粒子にコンジュゲートする。アミン化された磁性ナノ粒子を合成する。２０＋ｎｍのサイズを有するナノ粒子を、オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションのために使用する。磁性ナノ粒子を、ヘテロ二機能性リンカーであるＮ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオン酸（ＳＰＤＰ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および活性化されたオリゴヌクレオチドに順次コンジュゲートする。簡単に述べると、ＳＰＤＰを無水ＤＭＳＯ中に溶解し、磁性ナノ粒子と共にインキュベートする。ヌクレアーゼ非含有ＰＢＳ中での３％ＴＣＥＰ処理によって、オリゴの３’－チオＭＣ６を活性化して、チオールを放出させる。オリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム／エタノール沈降法を使用して精製する。ＴＣＥＰ活性化および精製の後、オリゴヌクレオチドを水中に溶解し、ＳＰＤＰ修飾された磁性ナノ粒子と共に一晩インキュベートする。磁性ナノ粒子あたりのオリゴヌクレオチドの数を、電気泳動分析法を使用して決定する。
手順は、刊行物（Medarova Z. et al., 2016. Controlling RNA Expression in Cancer Using Iron Oxide Nanoparticles Detectable by MRI and In Vivo Optical Imaging. Methods Mol Biol. 2016;1372:163-179）から適応され、以下に簡単にまとめられる。オリゴヌクレオチド上のジスルフィドを、３％Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって活性化した後、酢酸アンモニウム／エタノール沈降処理を用いて精製した後、ナノ粒子にコンジュゲートする。アミン化された磁性ナノ粒子を合成する。２０＋ｎｍのサイズを有するナノ粒子を、オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションのために使用する。磁性ナノ粒子を、ヘテロ二機能性リンカーであるＮ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオン酸（ＳＰＤＰ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および活性化されたオリゴヌクレオチドに順次コンジュゲートする。簡単に述べると、ＳＰＤＰを無水ＤＭＳＯ中に溶解し、磁性ナノ粒子と共にインキュベートする。ヌクレアーゼ非含有ＰＢＳ中での３％ＴＣＥＰ処理によって、オリゴの３’－チオＭＣ６を活性化して、チオールを放出させる。オリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム／エタノール沈降法を使用して精製する。ＴＣＥＰ活性化および精製の後、オリゴヌクレオチドを水中に溶解し、ＳＰＤＰ修飾された磁性ナノ粒子と共に一晩インキュベートする。磁性ナノ粒子あたりのオリゴヌクレオチドの数を、電気泳動分析法を使用して決定する。
【0211】
（実施例２）
タンパク質の発現および精製
全長ヒトＲＩＧ－Ｉを大腸菌中にクローニングし、報告されたようにＨｉｓ－ＳＵＭＯタグを有する組換え形態で発現させる（Kwok J. et al. 2014. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of full-length human RIG-I. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 70(Pt 2):248-251）。タンパク質の発現および精製を、以下にまとめられるように、公開された手順から適合させ、改変する（Rawling DC. et al. 2020. Small-Molecule Antagonists of the RIG-I Innate Immune Receptor. ACS Chemical Biology.15(2):311-317）。ＲＩＧ－Ｉ発現プラスミドを、１５０ｎｇ／２５ｕＬの市販の細胞ストックを使用してＲｏｓｅｔｔａ ＩＩ（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換し、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４および１％グリセロールを補充したＬＢ培地中で成長させる。０．５ｍＭの最終濃度でイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって発現を誘導する。細胞を１６℃で２４ｈ成長させた後、遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ β－メルカプトエタノール（βＭＥ））に再懸濁して５０ｍｌの最終体積にし、－８０℃で凍結する。溶解のために、凍結したペレットを室温で解凍した後、ペレット４Ｌあたりさらなる２００ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁する。１５，０００ｐｓｉでのマイクロフルイダイザーを介する通過または選り抜きの方法によって細胞を溶解し、溶解物を１００，０００×ｇで３０ｍｉｎの超遠心分離によって明澄化する。可溶性溶解物を、２．５ｍｌのＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）上でインキュベートし、さらなる４０ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液で洗浄した後、Ｎｉ溶出緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、５ｍＭ βＭＥ）で溶出する。溶出したタンパク質をＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄し、０．６５Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出する。次いで、４℃で２ｈ、ＳＵＭＯプロテアーゼと共にインキュベートすることによって、ＳＵＭＯタグを除去する。最後に、ゲル濾過緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ βＭＥ）中、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させることによって、モノマータンパク質を収集する。５０ｋＤの分子量カットオフを有する遠心分離濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ピーク画分を１０～２０μＭに濃縮する。
タンパク質の発現および精製
全長ヒトＲＩＧ－Ｉを大腸菌中にクローニングし、報告されたようにＨｉｓ－ＳＵＭＯタグを有する組換え形態で発現させる（Kwok J. et al. 2014. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of full-length human RIG-I. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 70(Pt 2):248-251）。タンパク質の発現および精製を、以下にまとめられるように、公開された手順から適合させ、改変する（Rawling DC. et al. 2020. Small-Molecule Antagonists of the RIG-I Innate Immune Receptor. ACS Chemical Biology.15(2):311-317）。ＲＩＧ－Ｉ発現プラスミドを、１５０ｎｇ／２５ｕＬの市販の細胞ストックを使用してＲｏｓｅｔｔａ ＩＩ（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換し、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４および１％グリセロールを補充したＬＢ培地中で成長させる。０．５ｍＭの最終濃度でイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって発現を誘導する。細胞を１６℃で２４ｈ成長させた後、遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ β－メルカプトエタノール（βＭＥ））に再懸濁して５０ｍｌの最終体積にし、－８０℃で凍結する。溶解のために、凍結したペレットを室温で解凍した後、ペレット４Ｌあたりさらなる２００ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁する。１５，０００ｐｓｉでのマイクロフルイダイザーを介する通過または選り抜きの方法によって細胞を溶解し、溶解物を１００，０００×ｇで３０ｍｉｎの超遠心分離によって明澄化する。可溶性溶解物を、２．５ｍｌのＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）上でインキュベートし、さらなる４０ｍＭイミダゾールを含有する溶解緩衝液で洗浄した後、Ｎｉ溶出緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、５ｍＭ βＭＥ）で溶出する。溶出したタンパク質をＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄し、０．６５Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出する。次いで、４℃で２ｈ、ＳＵＭＯプロテアーゼと共にインキュベートすることによって、ＳＵＭＯタグを除去する。最後に、ゲル濾過緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ βＭＥ）中、ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させることによって、モノマータンパク質を収集する。５０ｋＤの分子量カットオフを有する遠心分離濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ピーク画分を１０～２０μＭに濃縮する。
【0212】
（実施例３）
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－ｄｓ－ｍｉＲＮＡ模倣体によるＲＩＧ－Ｉ活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＡＴＰａｓｅ活性に関するＡＴＰ／ＮＡＤＨ共役アッセイは、加水分解されたＡＴＰの再生がＮＡＤＨの酸化と共役する反応に基づく。ＡＴＰ加水分解の各サイクルの後、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）からなる再生系は、ＡＤＰが変換されてＡＴＰに戻るときに、１分子のＰＥＰをピルビン酸に変換する。ピルビン酸は続いて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によって乳酸に変換され、１分子のＮＡＤＨの酸化をもたらす。このアッセイは、定常状態のＡＴＰ加水分解の速度と比例する、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ吸光度の低下の速度を測定する。ＡＴＰの定常的な再生は、アッセイの全過程にわたるＡＴＰの加水分解速度のモニタリングを可能にする。９６ウェルのマイクロプレート形式のリーダーは、最大で９６個の試料の同時分析を可能にする。ＲＩＧ－Ｉは、ＡＴＰ依存的ＲＮＡヘリカーゼである。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－ｄｓ－ｍｉＲＮＡ模倣体による結合および活性化は、このタンパク質に対してＡＴＰａｓｅ活性を付与する。酵素アッセイを、都合良く使用して、ＲＩＧ－Ｉ受容体のためのアゴニストまたはアンタゴニストを試験および／またはスクリーニングすることができる。
５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－ｄｓ－ｍｉＲＮＡ模倣体によるＲＩＧ－Ｉ活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＡＴＰａｓｅ活性に関するＡＴＰ／ＮＡＤＨ共役アッセイは、加水分解されたＡＴＰの再生がＮＡＤＨの酸化と共役する反応に基づく。ＡＴＰ加水分解の各サイクルの後、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）からなる再生系は、ＡＤＰが変換されてＡＴＰに戻るときに、１分子のＰＥＰをピルビン酸に変換する。ピルビン酸は続いて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によって乳酸に変換され、１分子のＮＡＤＨの酸化をもたらす。このアッセイは、定常状態のＡＴＰ加水分解の速度と比例する、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ吸光度の低下の速度を測定する。ＡＴＰの定常的な再生は、アッセイの全過程にわたるＡＴＰの加水分解速度のモニタリングを可能にする。９６ウェルのマイクロプレート形式のリーダーは、最大で９６個の試料の同時分析を可能にする。ＲＩＧ－Ｉは、ＡＴＰ依存的ＲＮＡヘリカーゼである。５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－ｄｓ－ｍｉＲＮＡ模倣体による結合および活性化は、このタンパク質に対してＡＴＰａｓｅ活性を付与する。酵素アッセイを、都合良く使用して、ＲＩＧ－Ｉ受容体のためのアゴニストまたはアンタゴニストを試験および／またはスクリーニングすることができる。
【0213】
ＮＡＤＨ共役ＡＴＰａｓｅアッセイのための例示的な手順は、以下に記載される（Rawling DC. et al. 2020. Small-Molecule Antagonists of the RIG-I Innate Immune Receptor. ACS Chemical Biology.15(2):311-317）。ＮＡＤＨ共役アッセイのために、ＲＩＧ－Ｉタンパク質を、初期化合物については１０ｎＭ、次いで、より強力な阻害剤を可視化するためには２０ｎＭの最終濃度に、ＡＴＰａｓｅアッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ）で希釈する。この場合、ＲＩＧ－Ｉを、２５０ｎＭの最終濃度になるように添加される所望のＲＮＡオリゴまたは対照によって活性化する（wis activated）。１ｍＭ ＮＡＤＨ、１００Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、５００Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸からなる共役アッセイ混合物を、試料に添加する。試料を、ＲＴで少なくとも１時間インキュベートする。５ｍＭの最終濃度で１：１のＡＴＰ／ＭｇＣｌ２ミックスを添加することによって、反応を開始させる。
【0214】
ＲＮＡアゴニスト誘導性ＲＩＧ－Ｉ活性化を、容易に入手可能な細胞系に基づく細胞に基づくリポーター遺伝子アッセイを使用してＩ型インターフェロンを測定することによって評価する。ＩＦＮ曝露に応答するリポーター遺伝子アッセイのために開発された市販の細胞系がますます利用可能である。これらの細胞は、マルチウェルプレート分光光度計または照度計を使用して容易に定量することができる可溶性遺伝子産物を産生する。
【0215】
ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞を、分泌型Ｌｕｃｉａルシフェラーゼリポーター遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３由来細胞であるＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ細胞から生成した。このリポーター遺伝子は、マルチマーＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）によって増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞は、高レベルのヒトＲＩＧ－Ｉを安定に発現し、３ｐ－ｈｐＲＮＡおよび５’ｐｐまたは５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡなどの非キャップ付加５’－三リン酸末端を有する細胞質ゾルの二本鎖ＲＮＡに強く応答する。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ細胞を使用して、ＩＲＦ誘導性Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによってＲＩＧ－Ｉの役割を試験することができる。細胞培養上清中のＩＲＦ誘導性Ｌｕｃｉａのレベルを、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ検出試薬（これもＩｎｖｉｖｏＧｅｎからのもの）であるＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）を使用して容易にモニタリングすることができる。裸の５’ｐｐもしくは５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡまたは細胞質中に送達される必要がある対照を使用してＲＩＧ－Ｉの刺激を達成するために、ＬｙｏＶｅｃ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）などのトランスフェクション剤を使用することができる。
【0216】
（実施例４）
動物モデル
同所性モデルは、生きたイメージング技術を用いて容易にモニタリングされる組織特異的腫瘍埋込みを特徴とし、診療所へのより良好な橋渡しのための疾患関連腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を作出する。同所性モデルは、動物モデルにおける対応する組織への腫瘍細胞系の播種を含む。この戦略により、本発明者らは、関連する環境中で腫瘍発達を評価し、ヒトにおける疾患プロセスを模倣する前臨床腫瘍モデルにおける有効性を評価することができる。同所性モデルを用いた場合、疾患進行は、臨床兆候、生存試験設計、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の能力を有するイメージングプラットフォームを含む、様々な方法によってモニタリングされる。試験設計の例は、以下に記載される。
動物モデル
同所性モデルは、生きたイメージング技術を用いて容易にモニタリングされる組織特異的腫瘍埋込みを特徴とし、診療所へのより良好な橋渡しのための疾患関連腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を作出する。同所性モデルは、動物モデルにおける対応する組織への腫瘍細胞系の播種を含む。この戦略により、本発明者らは、関連する環境中で腫瘍発達を評価し、ヒトにおける疾患プロセスを模倣する前臨床腫瘍モデルにおける有効性を評価することができる。同所性モデルを用いた場合、疾患進行は、臨床兆候、生存試験設計、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の能力を有するイメージングプラットフォームを含む、様々な方法によってモニタリングされる。試験設計の例は、以下に記載される。
【0217】
使用することができる例示的な転移性乳がん細胞系としては、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＧＦＰ、４Ｔ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）が挙げられる。これらの細胞系は、供給業者によって推奨される通りに使用される。６週齢のメスのヌードマウス（ｎｕ／ｎｕまたはＮＩＨ ＩＩＩヌード）に、ヒト乳腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞系（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を同所的に埋め込む。このモデルでは、同所的に埋め込まれた腫瘍は、腫瘍接種後４週までに局在化した疾患からリンパ節転移まで進行する。腫瘍細胞は、ルシフェラーゼを発現し、腫瘍負荷の相関分析のための非侵襲性生物発光イメージングによって検出することができる。全ての動物実験は、施設内指針を順守して実施され、Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＳＲＡＣ）によって承認されている。
【0218】
転移の防止：６週齢のｎｕ／ｎｕマウスの右上の乳腺脂肪体に、２×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ）を注射する。動物を、腫瘍埋込みの１４日後に実験で使用する。
【0219】
転移の停止：６週齢のＮＩＨ ＩＩＩヌードマウスの左下の乳腺脂肪体に、２×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ）を注射する。動物を、腫瘍埋込みの２８日後に実験で使用する。ＭＮ－５’ｐｐまたはＭＮ－５’ｐｐｐ－抗ｍｉＲ１０ｂおよびＭＮ－５’ｐｐ－またはＭＮ－５’ｐｐｐ－ｓｃｒ－ｍｉＲによる処置は、４週間にわたって週１回の１０ｍｇ Ｆｅ／ｋｇの用量での尾静脈を介する全身投与を含む。
【0220】
（実施例５）
鋳型特異的ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ｓｓ－ｐｐｐｍｉＲＮＡ－２１の設計
鋳型特異的ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１は、黒色腫細胞においてＲＩＧ－Ｉを効率的に刺激し、アポトーシスを誘導する
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がＲＩＧ－Ｉ活性化を誘導する能力を、ヒトＲＩＧ－Ｉルシフェラーゼリポーター細胞系であるＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉで試験した。この市販の細胞系は、高レベルのヒトＲＩＧ－Ｉおよび分泌型Ｌｕｃｉａルシフェラーゼリポーター遺伝子を安定に発現する。このリポーター遺伝子は、マルチマーＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）によって増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ対照細胞を使用して、ＩＲＦ誘導性Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによってＲＩＧ－Ｉの役割を試験することができる。細胞におけるＲＩＧ－Ｉの高発現を、ウェスタンブロットを使用して確認した（図２Ａ）。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ対照細胞の識別感度を、５’三リン酸二本鎖ＲＮＡ１９マー（ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ）からなる、市販の従来のＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用して検証した。ヌル細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ過剰発現細胞においてルシフェラーゼ活性の非常に有意な増強が観察された（図２Ｂ）。
鋳型特異的ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ｓｓ－ｐｐｐｍｉＲＮＡ－２１の設計
鋳型特異的ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１は、黒色腫細胞においてＲＩＧ－Ｉを効率的に刺激し、アポトーシスを誘導する
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がＲＩＧ－Ｉ活性化を誘導する能力を、ヒトＲＩＧ－Ｉルシフェラーゼリポーター細胞系であるＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉで試験した。この市販の細胞系は、高レベルのヒトＲＩＧ－Ｉおよび分泌型Ｌｕｃｉａルシフェラーゼリポーター遺伝子を安定に発現する。このリポーター遺伝子は、マルチマーＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）によって増強されたＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ対照細胞を使用して、ＩＲＦ誘導性Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによってＲＩＧ－Ｉの役割を試験することができる。細胞におけるＲＩＧ－Ｉの高発現を、ウェスタンブロットを使用して確認した（図２Ａ）。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ対照細胞の識別感度を、５’三リン酸二本鎖ＲＮＡ１９マー（ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ）からなる、市販の従来のＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用して検証した。ヌル細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ過剰発現細胞においてルシフェラーゼ活性の非常に有意な増強が観察された（図２Ｂ）。
【0221】
鋳型特異的ＲＩＧ－Ｉアゴニストであるｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がＲＩＧ－Ｉを活性化する能力を評価した。ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌ対照細胞を、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１ならびに５’－ｐｐｐを含まないことを除いて、本発明者らのＲＩＧ－Ｉアゴニストと同一の一本鎖オリゴヌクレオチドで処理した。試験したｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１の３つ全ての用量レベルで、有意なＲＩＧ－Ｉ活性化が観察された（図２Ｃ）。ＲＩＧ－Ｉ活性化のためのＲＮＡ二重鎖の形成に関する厳密な要件を考慮すると、これらの結果は、特に、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドのｍｉＲ－２１相補体が外因的に供給されなかったため、ＲＩＧ－Ｉアゴニズムの鋳型指向性のメカニズムを支持する。興味深いことに、５’－ｐｐｐの非存在下であっても、中程度のＲＩＧ－Ｉ活性化が存在していた（図２Ｃ）。
【0222】
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１がＲＩＧ－Ｉを過剰発現するＨＥＫ－Ｌｕｃｉａリポーター細胞においてＲＩＧ－Ｉを誘導することができることが確立されたら、出願人は、鋳型特異的ＲＩＧ－ＩアゴニストがＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞系中でアポトーシス促進シグナル伝達の活性化を媒介することができるかどうかを決定するための実験を行った。Ｂ１６－Ｆ１０黒色腫細胞は、ｍｉＲ－２１を発現し、評価項目としての細胞死と共に内因性ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達を試験するために使用されてきた（Bek et al., 2019）。カスパーゼ－３／７活性化を、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１または５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１で処理したＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞において測定した。用量依存的なカスパーゼ３／７の活性化が観察され、これは５’－ｐｐｐの存在下でより顕著であった（図２Ｄ）。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１ ＲＩＧ－Ｉアゴニストを使用した場合、腫瘍細胞生存能力の用量依存的低下も観察された（図２Ｅ）。腫瘍細胞生存能力のこの低下は、５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用して観察されたものよりも有意に大きかった。
【0223】
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１によるＲＩＧ－Ｉアゴニズムは、鋳型依存性を示す
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の観察されたＲＩＧ－Ｉ活性化の鋳型依存性をさらに精査するために、ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞に、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトした。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された（図３Ａ）。驚くべきことに、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導は、わずか１０，０００個の細胞の培養物中で観察された。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１による活性化のレベルは、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドについて観察されたものと類似していた（図３Ａ）。５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。さらに、ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合、８３．４ｎｇ／ｍｌのｍｉＲＮＡ－２１模倣体のＥＣ５０が決定された。対照的に、５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の計算されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。
ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の観察されたＲＩＧ－Ｉ活性化の鋳型依存性をさらに精査するために、ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉ細胞に、増加する濃度の合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトした。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の非常に有意な誘導が、３０および３００ｎｇ／ｍｌの合成成熟ｍｉＲＮＡ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において観察された（図３Ａ）。驚くべきことに、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストによるＲＩＧ－Ｉシグナル伝達の誘導は、わずか１０，０００個の細胞の培養物中で観察された。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１による活性化のレベルは、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドについて観察されたものと類似していた（図３Ａ）。５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１は、検出可能なＲＩＧ－Ｉ活性化を引き起こすことができなかった（図３Ａ）。さらに、ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのＲＩＧ－Ｉ活性化の用量依存性の分析により、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合、８３．４ｎｇ／ｍｌのｍｉＲＮＡ－２１模倣体のＥＣ５０が決定された。対照的に、５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１を使用した場合の計算されたＥＣ５０は、３５７．９ｎｇ／ｍｌであった（図３Ｂ）。
【0224】
ＩＦＮ－Ｉ応答を誘導する鋳型特異的ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１アゴニストの能力を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞において評価した。増加する濃度のＲＩＧ－Ｉアゴニストによる処理は、ＩＦＮ－β分泌の用量依存的増加を引き起こした。成熟ｍｉＲ－２１模倣体をトランスフェクトした細胞において、その効果は増幅されたが、これは、アゴニストによるＩＦＮ－Ｉ刺激の鋳型特異的増強を示唆している。対照的に、市販のｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡアゴニストは、ＩＦＮ－β分泌を刺激することができなかった（図３Ｃ）。
【0225】
ｍｉＲＮＡ－２１模倣体濃度の関数としてのカスパーゼ３／７活性化を測定して、ｍｉＲＮＡ－２１模倣体を一過的にトランスフェクトしたＢ１６－Ｆ１０細胞における腫瘍細胞内在性ＲＩＧ－Ｉシグナル伝達によるアポトーシス誘導の公知のメカニズムとの一貫性を決定した。驚くべきことに、カスパーゼ３／７活性化の用量依存的増加が観察され、その効果は、５’－ｐｐｐ－欠損ｓｓ－ｍｉＲＮＡ－２１と比較して、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処理した細胞において有意に高く、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照と同等であった（図３Ｄ）。
【0226】
ＲＩＧ－Ｉ活性化に加えて、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処理したＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＲＩＧ－Ｉ上方調節の証拠も存在するかどうかを決定するために、ＲＩＧ－Ｉの発現レベルを評価した。低レベルのＲＩＧ－ＩがＢ１６－Ｆ１０細胞において検出された。しかしながら、ｍｉＲ－２１をトランスフェクトし、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処理した細胞において、ｄｓ－ｐｐｐ－ＲＮＡ陽性対照オリゴヌクレオチドに関して見られたレベルを超えるＲＩＧ－Ｉの劇的な上方調節があった（図３Ｅ）。
【0227】
ＲＩＧ－Ｉアゴニズムによる免疫活性化のメカニズムの１つは、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を含む。本発明者らの研究では、Ｓ５３６でのＮＦ－κＢサブユニットｐ６５のリン酸化を、ＮＦ－κＢトランス活性化を測定するために分析した。ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１で処理したＢ１６－Ｆ１０細胞に由来する溶解物中で強力なホスホ－Ｐ６５反応性が観察され、その強力な反応性は、細胞にｍｉＲ－２１模倣体もトランスフェクトした場合にさらに増幅された。反応性の増加は、ｐ６５の発現の増加と関連しなかったが、これは、反応性の増加が標的リン酸化を特異的に反映したことを示している（図３Ｆ）。この驚くべき知見は、ｓｓ－ｐｐｐ－ｍｉＲＮＡ－２１による有効な鋳型依存的免疫刺激のためのメカニズムをさらに支持する。
【0228】
主題の特定の実施形態を考察してきたが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を再検討すれば、多くの変形形態が当業者には明らかである。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を、等価物のその全範囲と共に、および明細書を、そのような変形形態と共に参照することによって決定されるべきである。
【図1】
【図2A-2B】
【図2C-2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B-3C】
【図3D-3E】
【図3F】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】