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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-22
(54)【発明の名称】新規再構成高密度リポタンパク質ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20240115BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240115BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240115BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240115BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240115BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240115BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240115BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240115BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240115BHJP
C07K 14/775 20060101ALN20240115BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P21/00
A61P25/08
A61P9/10
A61K38/17
C07K14/775
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518282
(86)(22)【出願日】2022-12-06
(85)【翻訳文提出日】2023-03-17
(86)【国際出願番号】 KR2022019747
(87)【国際公開番号】W WO2023106807
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】10-2021-0173303
(32)【優先日】2021-12-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523098924
【氏名又は名称】メプスゲン カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100202603
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 智史
(72)【発明者】
【氏名】ロ フン スク
(72)【発明者】
【氏名】キム ヒョク
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA29
4C076CC01
4C076CC29
4C076DD63
4C076EE59
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA18
4C084DC50
4C084MA41
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA061
4C084ZA062
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZA221
4C084ZA222
4C084ZA401
4C084ZA402
4C084ZA941
4C084ZA942
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045EA21
(57)【要約】
本開示は、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）ナノ粒子、及びそれを含む神経変性疾患の予防または治療用組成物に関する。さらに詳しくは、本開示は、リン脂質及びアポリポタンパク質を混合することによって製造されるｒＨＤＬナノ粒子に関し、本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、アミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項2】
リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとを０．２５：１～２．５：１の重量比で含む混合物から生成されることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項3】
リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとを０．５：１～１．５：１の重量比で含む混合物から生成されることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項4】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～２．５：１であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項5】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～１．５：１であることを特徴とする、請求項４に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項6】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～０．５：１であることを特徴とする、請求項５に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項7】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．１～２．０ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項8】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．２～１．５ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項７に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項9】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．３～１．２ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項８に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項10】
アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３、またはＥ２及びＥ３の両方を含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項11】
アポリポタンパク質Ａ１をさらに含むことを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項12】
アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３またはＡ１以外のアポリポタンパク質を含まないことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項13】
アポリポタンパク質Ｅ４を含まないことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項14】
前記リン脂質が、１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２－ジエイコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド）（ＶＬ－５）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン ４－トリフルオロ酢酸（ＤＯＧＳ）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、（１，２－ジオレイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ｂｉｓ（ドデシルオキシ）－１－プロパンアンモニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ′－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオンアミジン（ｄｉＣ１４－ａｍｉｄｉｎｅ）、エチルホスホコリン（Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、及びＤ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ-ＫＣ２-ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ-ＤＭＡからなる群から少なくとも１つ選択されることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項16】
アポリポタンパク質Ｅ２を含む再構成高密度リポタンパク質の第１のセット、及びアポリポタンパク質Ｅ３を含む再構成高密度リポタンパク質の第２のセットを含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項17】
アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の両方が包含された再構成高密度リポタンパク質を含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質を含む、神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項19】
前記再構成高密度リポタンパク質が、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集を阻害し、脳組織の恒常性を維持できることを特徴とする、請求項１８に記載の神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項20】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルーゲーリッグ病、脊髄小脳変性症、脊髄小脳失調症、プリオン病、認知機能障害、老年性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、アルコール性認知症、初老期認知症、マシャド・ジョセフ病、筋異緊張症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、フリードライヒ運動失調症、側頭葉てんかん、及び脳卒中からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項21】
以下のステップを備える、リン脂質と、アポリポタンパク質Ｅとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。第１のアポリポタンパク質を含む第１の親水性溶液を、３つの入口及び１つの出口を有するマイクロ流体装置の第１の入口に注入するステップと、
リン脂質溶液を、マイクロ流体装置の第２の入口に注入するステップと、
第２のアポリポタンパク質を含む第２の親水性溶液を、マイクロ流体装置の第３の入口に注入するステップ。
【請求項22】
マイクロ流体装置が、マイクロ流体装置の中央に位置する第２の入口と、両側に位置する第１及び第３の入口とを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項23】
第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ２であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項24】
第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ３であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項25】
第１のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ２であり、第２のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ３であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項26】
第１のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３であり、第２のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ａ１であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項27】
第１の親水性溶液、リン脂質溶液、及び第２の親水性溶液が同時に注入されることを特徴とする、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項28】
再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を出口から収集するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項29】
マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質とアポリポタンパク質Ｅの重量比が０．２５：１～２．５：１であることを特徴とする、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項30】
マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質とアポリポタンパク質Ｅの重量比が０．５：１～１．５：１であることを特徴とする、請求項２９に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項31】
請求項２１～３０のいずれか一項に記載の製造方法により製造された再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ；ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ナノ粒子、及びそれを含む神経変性疾患の予防または治療用組成物に関する。さらに詳しくは、本開示は、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）及びアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅを主成分として含むｒＨＤＬナノ粒子に関し、本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、優れたアミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を有する。
【背景技術】
【0002】
近年、高齢者人口の急増に伴い、様々な神経変性疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）を患っている患者が増えており、それに対する治療や予防への関心が高まっている。神経変性疾患は、神経細胞の機能の低下や喪失による運動障害、記憶障害、認知障害など、様々な症状を引き起こす質病である。神経系疾患のみならず、正常な成人の脳でも毎日多数の神経細胞が死んでおり、加齢に伴って死ぬ神経細胞の数は指数関数的に増加する。
【0003】
神経変性疾患に属する主な質病としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲーリック病、ハンチントン病などがあり、現在までその疾患の病因が十分に解明されていない。アルツハイマー病の治療薬としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤またはＮＭＤＡ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体拮抗薬などが用いられ、パーキンソン病の治療薬としては、Ｌ－ドーパ（ｄｏｐａ）、ドーパミン作動薬、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、またはＣＯＭＴ阻害剤などが用いられており、ハンチントン病の治療薬としては、ドーパミンＤ２受容体などが挙げられるが、前述の治療薬は、根本的な治療法ではなく、症状の発症を遅らせたり、症状を緩和する方法に過ぎないことが知られている。それによって、これらの疾患を根本的に予防または治療することができる新薬が引き続き求められている。
【0004】
特に、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は、認知症の最も一般的な形態であり、代表的な神経変性疾患である。８０歳以上の高齢者の２０％以上がアルツハイマー病の影響を受けているものと推定されており、高齢化社会の進展に伴いその数は急速に増加している。アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）がβ－セクレターゼ及びγ－セクレターゼによって連続切断されることで産生されるアミロイドベータ（Ａβ）が脳組織に沈着する老人斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ）と、微小管関連タンパク質であるタウ（Ｔａｕ）タンパク質の過剰リン酸化によって引き起こされる神経原線維濃縮体（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ；ＮＴＦ）が主な病理学的特徴である。特に、タンパク質の一種であるＡβが脳に蓄積すると、血液脳関門（ＢＢＢ；Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ）を損傷させ、脳血管から神経細胞への必須栄養素の送達が遅くなるばかりか、神経の持続的な炎症を引き起こすことでミクログリア細胞などの免疫細胞の活動を妨害し、最終的に神経細胞が信号を送受信する領域であるシナプスの役割を果たせなくなる。そのような一連の病態生理学的要因が最終的に人間の記憶、判断力、言語能力などの知的な機能と日常生活機能を徐々に低下させ、パーソナリティ行動障害を引き起こすことが知られている。よって、脳内における過剰なＡβの産生を阻害したり、産生されたＡβの凝集を防いだり、あるいは凝集したＡβ構造体を効果的に減少させることは、アルツハイマー病の予防と治療において重要な部分であると考えられている。
【0005】
一方、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、アポリポタンパク質ベースに形成される体内の主要なコレステロールキャリアであり、高密度（＞１．０６３ｇ／ｍＬ）及び小さいサイズ（ストローク直径＝５～１７ｎｍ）が特徴である。成熟したＨＤＬ粒子は、コレステロール、リン脂質、及び様々なアポリポタンパク質などを含む球状の形態で存在する。極性脂質、リン脂質、遊離コレステロールは、これらの粒子の外層に存在し、より疎水性の脂質、例えば、エステル化コレステロール及びトリグリセリドは、粒子の中心に存在する。肝臓や腸内で新たに形成された、または初期のＨＤＬ粒子は脂質が乏しく、円盤（ｄｉｓｃｏｉｄａｌ）の形態で存在する。タンパク質成分は外層に含まれ、主要なタンパク質成分であるアポリポタンパク質としては、体内の主要タンパク質として知られるアポリポタンパク質Ａ１（Ａｐｏ Ａ１）を始めとし、その機能に応じて、Ａｐｏ Ａ２、Ａｐｏ Ａ４、Ａｐｏ Ｃ３、Ａｐｏ Ｄ、Ａｐｏ Ｅ、Ａｐｏ Ｊ、Ａｐｏ Ｍなどが含まれることが知られている。
【0006】
Ａｐｏ Ａ１は、肝臓や腸で合成され、血液中のＨＤＬの生理作用をコントロールし、周囲の組織からコレステロールを除去してから、それをコレステロール逆輸送（ＲＣＴ；ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）機構によって、再び肝臓または他のリポタンパク質に運ぶ役割を果たす。そのようなＡｐｏ Ａ１に基づく血液中のＨＤＬの生理機能により、動脈硬化を引き起こす多くの危険因子を予防及び治療できることが知られており、そのことから、再構成高密度リポタンパク質の研究は、何十年にわたりＡｐｏ Ａ１に基づいて行われてきた。
【0007】
それに対して、Ａｐｏ Ｅは、肝臓と神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａ）で合成され、脳内のコレステロール及び脂質の恒常性をコントロールする役割を担っていることが知られている。ヒトの場合、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）タンパク質の種類としては、Ａｐｏ Ｅ２、Ａｐｏ Ｅ３、Ａｐｏ Ｅ４が挙げられ、これらの組み合わせが老化する脳の恒常性に影響を与えることで、アルツハイマー病の発生率が変化することが知られている。主にＡｐｏ Ｅ４がアルツハイマー病を引き起こすことが報告されており、それはアミロイドベータ（Ａβ）の凝集に関与し、最終的にＢＢＢを損傷することが知られている。一方、Ａｐｏ Ｅ２とＡｐｏ Ｅ３は保護的な役割を果たすことが報告されている。Ａｐｏ Ｅ２、Ａｐｏ Ｅ３、Ａｐｏ Ｅ４は、２つのアミノ酸の突然変異によって形成され、これらの遺伝子変異により脂質化パターン及び受容体結合親和性が変化することが知られている。Ａｐｏ Ｅが主に結合するＬＤＬＲ（Ｌｏｗ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）受容体グループは、ＢＢＢに多く分布しており、Ａｐｏ Ｅの脳への出入りに大きな影響を与えられる。
【0008】
認知障害やアルツハイマー病の患者は、正常な人に比べてＨＤＬレベルが著しく低いことが知られており、そのことから、ＨＤＬを用いてアルツハイマー病をはじめとする認知障害を予防しようとする試みがなされていた。しかしながら、ＨＤＬは体内で様々なアポリポタンパク質と動的に反応して互いに共存し、またヒト血漿から分離されたＨＤＬの多様性が分析的なメカニズムの研究を困難にしていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、治療効果を有し、生体内で毒性を示さないｒＨＤＬを提供することを目的とする。
【0010】
また、本発明は、ｒＨＤＬを含む、神経変性疾患の予防または治療用組成物を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本発明は、神経変性疾患を患っている患者にｒＨＤＬを投与することを含む、神経変性疾患の治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示は、リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ（例えば、Ａｐｏ Ｅ２及び／またはＡｐｏ Ｅ３）のうち少なくとも１つとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を提供する。
【0013】
本開示は、リン脂質と、アポリポタンパク質Ｅとを含み、前記リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとを０．２５：１～２．５：１、好ましくは０．５：１～１．５：１の重量比で含む混合物から生成されることを特徴とする、再構成高密度リポタンパク質を提供する。
【0014】
一実施形態において、前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比は、０．２：１～２．５：１、好ましくは０．２：１～２．５：１であり、より好ましくは０．２：１～０．５：１である。
【0015】
一実施形態において、前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度は、０．１～２．０ｇ／ｍＬ、好ましくは０．２～１．５ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．３～１．２ｇ／ｍＬである。
【0016】
一実施形態において、前記アポリポタンパク質Ｅは、アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３、またはＥ２及びＥ３である。
【0017】
一実施形態において、前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ１をさらに含む。
【0018】
本開示は、前記再構成高密度リポタンパク質を含む、神経変性疾患の予防または治療用組成物を提供する。一実施形態において、前記再構成高密度リポタンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集を阻害し、脳組織の恒常性を維持できるものである。
【0019】
本開示は、前記再構成高密度リポタンパク質を神経変性疾患の患者に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法を提供する。
【0020】
本開示は、リン脂質溶液を、３つの入口（ｉｎｌｅｔ）及び１つの出口（ｏｕｔｌｅｔ）を有するマイクロ流体装置の中央に位置する第２の入口に注入し、アポリポタンパク質溶液を、両側に位置する第１の入口及び第３の入口に注入することで、リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅとの少なくとも１つを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法を提供する。一実施形態において、前記マイクロ流体装置は、マイクロピラーを含んでもよい。
【0021】
一実施形態において、前記リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの合成配合重量比は、０．２５：１～２．５：１、好ましくは０．５：１～１．５：１である。
【0022】
本開示は、前記製造方法によって製造された再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を提供する。
【発明の効果】
【0023】
本開示のｒＨＤＬナノ粒子及びｒＨＤＬナノ粒子を含む組成物は、アミロイドベータ（Ａ）の凝集を阻害する効果を有する。よって、本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、神経変性疾患の予防または治療に用いることができる。
【0024】
さらに、本開示のｒＨＤＬは、マイクロ流体装置を用いて製造することができるので、単一ステップ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ）による連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）合成によって一貫した特性（ｎｏ ｂａｔｃｈ－ｔｏ－ｂａｔｃｈ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を有するｒＨＤＬの大量生産が可能である。従来のｒＨＤＬと比較して界面活性剤などの他の追加成分を含まないため、生体内で毒性を示すことがない。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ｒＨＤＬを製造するためのマイクロ流体装置に対する概略図であり、親水性溶液に溶解したアポリポタンパク質と親油性溶液に溶解したリン脂質がマイクロピラーによって引き起こされる、継続的に伝播するマイクロボルテックスを通過しながら強く混合される効果を利用している。
【図2】図１に示したｒＨＤＬナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置において、マイクロピラーの有無による生産収率及び粒子サイズの均一性を示すグラフであり、連続的に伝搬するマイクロボルテックスがナノ粒子の形成に与える影響を示す。
【図3】図１に示したｒＨＤＬナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置において、マイクロピラーの有無による生産収率及び粒子サイズの均一性を示すグラフであり、連続的に伝搬するマイクロボルテックスがナノ粒子の形成に与える影響を示す。
【図4】リン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、並びにそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図5】リン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、並びにそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図6】リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、及びそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図7】リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、及びそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図8】リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、及びそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図9】リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合比率によるナノ粒子のサイズと分布、及びそれらによる生成量（体積）を示す図である。
【図10】アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３のサイズ分布と、それらを用いて形成されたｒＨＤＬナノ粒子のサイズ分布を比較するためのＤＬＳ測定結果図である。アポリポタンパク質Ｅ２とＥ３はサイズに差がなく、それによって形成されたｒＨＤＬナノ粒子は、リン脂質との結合により５～１０ｎｍ程度の大きな粒子を形成し、それらもまたアポリポタンパク質による差がない。
【図11】リン脂質とアポリポタンパク質の合成配合重量比０．７５：１で製造したアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図12】リン脂質とアポリポタンパク質の合成配合重量比１．２５：１で製造したアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図13】リン脂質とアポリポタンパク質の合成配合重量比２．５：１で製造したアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図14】アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を同時に含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を製造したとき、均一な分布を確認するＤＬＳ測定結果図である。
【図15】アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の分子形態の構造解析に応じて、リン脂質を比較的少量及び多量含めることを示す結果図である。
【図16】リン脂質を比較的少量及び多量含む場合において、合成後のアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子のサイズに対する合成後の結果図である。
【図17】アポリポタンパク質Ｅ２を含むｒＨＤＬナノ粒子の濃度ごとのＡβ凝集阻害効果を経時的に示すグラフである。
【図18】アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の濃度ごとのＡβ凝集阻害効果を経時的に示すグラフである。
【図19】アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を同時に含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の濃度ごとのＡβ凝集阻害効果を経時的に示すグラフである。
【図20】ｒＨＤＬナノ粒子に含まれるアポリポタンパク質の種類によるｒＨＤＬナノ粒子の濃度ごとのＡβ凝集阻害効果を経時的に示すグラフである。
【図21】純粋なアポリポタンパク質Ｅ３とそれを用いて形成されたｒＨＤＬナノ粒子との間のＡβ凝集阻害効果を経時的に比較するグラフである。
【図22】アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、脳微小血管内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ＢＭＥＣ）を介した脳組織への経細胞輸送（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）を表すために、細胞内への吸収量を実験した結果を示すグラフである。
【図23】アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、血液脳関門の星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）を介した輸送を表すために、細胞内への吸収量を実験した結果を示すグラフである。
【図24】アルツハイマー病動物モデル（５ｘＦＡＤ）に生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を３ヶ月間投与し、その後アミロイドの脳組織分布を撮影した結果図である。
【図25】アルツハイマー病モデル動物（５ｘＦＡＤ）にアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を３ヶ月投与し、その後アミロイドの脳組織分布を撮影した結果図である。
【図26】正常マウス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）及びアルツハイマー病モデル動物（５ｘＦＡＤ）にアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を３ヶ月間投与し、その後ＣＳＦ中のアミロイド濃度を示す結果図である。
【図27】正常マウス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）及びアルツハイマー病モデル動物（５ｘＦＡＤ）にアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を３ヶ月間投与し、その後血漿中のアミロイド濃度を示す結果図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、添付図面を参照して、本開示が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本開示の実施形態及び実施例について詳しく説明する。しかしながら、本開示は、様々な形態で実施され得るので、以下に説明する実施形態及び実施例に限定されるものではない。
【0027】
本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。
【0028】
「アポリポタンパク質Ｅ」なる用語は、ＡＰＯＥ遺伝子またはその機能的な変異体によってコードされる哺乳動物タンパク質を意味する。好ましい実施形態において、アポリポタンパク質Ｅは、１９番染色体上のヒトＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるヒトタンパク質である。アポリポタンパク質Ｅは、ＡＰＯＥ遺伝子産物のアイソフォームのいずれか１つ、例えば、アポリポタンパク質Ｅ２（「ＡＰＯＥ２」）、アポリポタンパク質Ｅ３（「ＡＰＯＥ３」）及びアポリポタンパク質Ｅ４（ＡＰＯＥ４）であってもよい。ＡＰＯＥは、３つの主な対立遺伝子（イプシロン２、イプシロン３、及びイプシロン４）を有する多形体である。任意の対立遺伝子は、本発明の様々な実施形態で用いることができる。その「機能的な変異体」とは、ＡＰＯＥ遺伝子産物と同じであるか、あるいは類似の生物学的機能を維持するＡＰＯＥ遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の変異体を意味する。一部の場合、機能的な変異体は、ヒトＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して、アミノ酸の挿入、欠失、及び／または置換を含む。一部の場合、機能的な変異体は、ヒトＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるタンパク質のフラグメントである。
【0029】
一部の実施形態において、アポリポタンパク質Ｅ２は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＲＱ７９４５９で開示されているタンパク質またはそれと少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性である。一部の実施形態において、アポリポタンパク質Ｅ３は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＲＱ７９４６１．１で開示されているタンパク質またはそれと少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性である。
【0030】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ｅは、遺伝子工学によって生成された組換えタンパク質、または化学合成によって生成された合成タンパク質である。
【0031】
「アポリポタンパク質Ａ１」なる用語は、ＡＰＯＡ１遺伝子またはその機能的な変異体によってコードされる哺乳動物タンパク質を意味する。好ましい実施形態において、アポリポタンパク質Ａ１は、１１番染色体上のヒトＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされるヒトタンパク質である。その「機能的な変異体」とは、ＡＰＯＡ１遺伝子産物と同じであるか、あるいは類似の生物学的機能を維持するＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の変異体を意味する。一部の場合、機能的な変異体は、ヒトＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して、アミノ酸の挿入、欠失、及び／または置換を含む。一部の場合、機能的な変異体は、ヒトＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質のフラグメントである。
【0032】
一部の実施形態において、アポリポタンパク質Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＡＳ６８２２７．１で開示されているタンパク質またはそれと少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性である。
【0033】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ａ１は、遺伝子工学によって生成された組換えタンパク質、または化学合成によって生成された合成タンパク質である。
【0034】
本開示は、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅのうち少なくとも１つとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を提供する。
【0035】
本願に用いられる「再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ；ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）」なる用語は、リン脂質及びアポリポタンパク質を含む非自然発生ＨＤＬ様粒子を意味する。
【0036】
一実施形態において、アポリポタンパク質Ｅは、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３である。別の実施形態において、前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を同時に含み、さらにアポリポタンパク質Ａ１を含んでもよい。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３、及びＡ１を含む。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３及びＡ１を含む。
【0037】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｅ２及び／またはＥ３を含み、他のアポリポタンパク質を含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ａ１、Ｅ２及び／またはＥ３を含み、他のアポリポタンパク質を含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ｅ４を含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、エステル型コレステロールまたはトリグリセリドを含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ｃ３、Ｄ、ＪまたはＭを含まない。
【0038】
本願に用いられる「リン脂質」なる用語は、具体的に、１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２－ジエイコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド）（ＶＬ－５）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン ４－トリフルオロ酢酸（ＤＯＧＳ）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、（１，２－ジオレイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ｂｉｓ（ドデシルオキシ）－１－プロパンアンモニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ′－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオンアミジン（ｄｉＣ１４－ａｍｉｄｉｎｅ）、エチルホスホコリン（Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、またはＤ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ-ＫＣ２-ＤＭＡ、ＤＬｉｎ-ＤＭＡからなる群から少なくとも１つ選択されてもよいが、それらに限定されるものではない。
【0039】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２－ジエイコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド）（ＶＬ－５）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン ４－トリフルオロ酢酸（ＤＯＧＳ）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、（１，２－ジオレイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ｂｉｓ（ドデシルオキシ）－１－プロパンアンモニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ′－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオンアミジン（ｄｉＣ１４－ａｍｉｄｉｎｅ）、エチルホスホコリン（Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、またはＤ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ-ＫＣ２-ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ-ＤＭＡから選択された１、２、３または４つのリン脂質を含む。
【0040】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質はＤＭＰＣを含む。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質はＤＰＰＣを含む。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質はＰＯＰＣを含む。
【0041】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、ＤＭＰＣを含み、他のリン脂質を含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、ＤＰＰＣを含み、他のリン脂質を含まない。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、ＰＯＰＣを含み、他のリン脂質を含まない。
【0042】
本開示は、リン脂質と、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ）とを含むことを特徴とする、再構成高密度リポタンパク質を提供する。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質のための合成配合は、リン脂質とアポリポタンパク質Ｅを０．２５：１～２．５：１、好ましくは０．５：１～１．５：１の重量比で有する。一実施形態において、前記アポリポタンパク質Ｅは、アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３、またはＥ２及びＥ３である。
【0043】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、リン脂質及びアポリポタンパク質Ｅを０．２５：１～２．５：１の重量比で含む混合物から生成された。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、リン脂質及びアポリポタンパク質Ｅを０．５：１～１．５：１の重量比で含む混合物から生成された。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、リン脂質及びアポリポタンパク質Ｅを０．１：１～５：１の重量比で含む混合物から生成された。
【0044】
本開示は、リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅの少なくとも１つを含む再構成高密度リポタンパク質を提供する。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比は、０．１：１～５：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比は、０．１：１～３：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比は、０．２：１～１．５：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比は、０．２：１～０．５：１である。
【0045】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質、アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、１：５：５～３０：５：５である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質、アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、２：５：５～１５：５：５である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質、アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、２：５：５～５：５：５である。
【0046】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、１：１０～１０：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、１：５～５：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、１：２～２：１である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のアポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の重量比は、１：１である。
【0047】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度は、０．１～２．０ｇ／ｍＬである。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度は、０．２～１．５ｇ／ｍＬである。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度は、０．３～１．２ｇ／ｍＬである。
【0048】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、５０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満の長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、または１０ｎｍ超えの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、１～１００ｎｍ、５～５０ｎｍ、５～２５ｎｍ、または５～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。
【0049】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）は、５～２００ｋＤａ、５～１５０ｋＤａ、５～１００ｋＤａ、または５～６０ｋＤａのナノ粒子である。
【0050】
一態様において、本開示は、本願に記載の再構成高密度リポタンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【0051】
一部の実施形態において、薬学的組成物は、アポリポタンパク質Ｅ２を含む再構成高密度リポタンパク質の第１のセット、及びアポリポタンパク質Ｅ３を含む再構成高密度リポタンパク質の第２のセットを含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の両方が包含された再構成高密度リポタンパク質を含む。
【0052】
一部の実施形態において、薬学的組成物は、アポリポタンパク質Ｅ２を含む再構成高密度リポタンパク質の第１のセット、アポリポタンパク質Ｅ３を含む再構成高密度リポタンパク質の第２のセット、及びアポリポタンパク質Ａ１を含む再構成高密度リポタンパク質の第３のセットを含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３及びＡ１を含む再構成高密度リポタンパク質を含む。
【0053】
一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも８０％は、１０～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも７０％は、１０～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも６０％は、１０～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも５０％は、１０～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも４０％は、１０～２０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。
【0054】
一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも８０％は、５～５０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも７０％は、５～５０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも６０％は、５～５０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも５０％は、５～５０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。一部の実施形態において、薬学的組成物中の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の少なくとも４０％は、５～５０ｎｍの長軸長を有するナノ粒子である。
【0055】
別の様態において、本開示は、前記再構成高密度リポタンパク質を含む、神経変性疾患の予防または治療用組成物を提供する。一実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集を阻害してもよい。一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質は、脳組織の恒常性を維持できる。
【0056】
本願に用いられる「予防」なる用語は、組成物の投与により疾患の発症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」なる用語は、組成物の投与により疾患が疑われるか、あるいは罹患している個体の症状を改善または有益に変化するあらゆる行為を意味する。
【0057】
一実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルーゲーリッグ病、脊髄小脳変性症、脊髄小脳失調症、プリオン病、認知機能障害、老年性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、アルコール性認知症、初老期認知症、マシャド・ジョセフ病、筋異緊張症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、フリードライヒ運動失調症、側頭葉てんかん、または脳卒中であるが、それらに限定されるものではない。
【0058】
本開示は、リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅのうち少なくとも１つとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法を提供する。その方法は、アポリポタンパク質Ｅを含む親水性溶液をマイクロ流体装置の第１の入口に注入するステップと、リン脂質溶液をマイクロ流体装置の第２の入口に注入するステップと、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）をマイクロ流体装置の出口から収集するステップとを備えてもよい。
【0059】
本開示はまた、第１のアポリポタンパク質を含む第１の親水性溶液を、３つの入口及び１つの出口を有するマイクロ流体装置の第１の入口に注入するステップと、リン脂質溶液を、マイクロ流体装置の第２の入口に注入するステップと、第２のアポリポタンパク質を含む第２の親水性溶液を、マイクロ流体装置の第３の入口に注入するステップとを備える、リン脂質と、アポリポタンパク質とのうち少なくとも１つを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法を提供する。
【0060】
一部の実施形態において、マイクロ流体装置は、マイクロ流体装置の中央に位置する第２の入口と、両側のうち１つに位置する第１及び第３の入口とを含む。一部の実施形態において、マイクロ流体装置は、リン脂質溶液及び親水性溶液を混合するように構成されたマイクロピラーをさらに含む。
【0061】
一部の実施形態において、第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ２である。一部の実施形態において、第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ３である。一部の実施形態において、第１のアポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｅ２であり、第２のアポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｅ３である。一部の実施形態において、第１のアポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３であり、第２のアポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ａ１である。
【0062】
一部の実施形態において、第１の親水性溶液、リン脂質溶液、及び第２の親水性溶液が同時に注入される。
【0063】
一部の実施形態において、前記方法は、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を出口から収集するステップをさらに備える。
【0064】
一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１及び第２のアポリポタンパク質との重量比は、０．２５：１～２．５：１である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１及び第２のアポリポタンパク質との重量比は、０．５：１～１．５：１である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１及び第２のアポリポタンパク質との重量比は、０．１：１～５：１である。
【0065】
一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１のアポリポタンパク質と、第２のアポリポタンパク質との重量比は、１：２：２～１０：２：２である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１のアポリポタンパク質と、第２のアポリポタンパク質との重量比は、１：１：１～３：１：１である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１のアポリポタンパク質と、第２のアポリポタンパク質との重量比は、１：５：５～３０：５：５である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１のアポリポタンパク質と、第２のアポリポタンパク質との重量比は、２：５：５～１５：５：５である。一部の実施形態において、マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質と、第１のアポリポタンパク質と、第２のアポリポタンパク質との重量比は、２：５：５～５：５：５である。
【0066】
一部の実施形態において、前記方法は、リン脂質溶液を、３つの入口（ｉｎｌｅｔ）及び１つの出口（ｏｕｔｌｅｔ）を有するマイクロ流体装置の中央に位置する第２の入口に注入するステップと、アポリポタンパク質溶液を、両側に位置する第１及び第３の入口に注入するステップとを備える。一実施形態において、前記マイクロ流体装置は、マイクロピラーを含んでもよい。
【0067】
本願に用いられる「マイクロ流体装置」なる用語は、有機高分子物質を含むプラスチック、ガラス、金属、またはシリコンを含む様々な素材から製造された基板上に、流体を流すことができるように設けられたマイクロチャネルを含んでいる装置を意味する。
【0068】
本願に用いられる「マイクロピラー」または「マイクロピラー構造」なる用語は、マイクロ流体装置内に渦流を形成することで、マイクロ流体装置に注入された異なる種類の流体を効率的に混合するための柱状構造物を意味する。
【0069】
一部の実施形態において、前記方法は、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を遠心分離によって精製するステップをさらに備える。
【0070】
一態様において、本開示は、本願に記載の製造方法によって製造された再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を提供する。
【0071】
別の態様において、本開示は、本願に記載の再構成高密度リポタンパク質または本願に記載の薬学的組成物を対象体に投与することを含む、対象体の神経変性疾患を予防または治療する方法を提供する。一部の実施形態において、前記疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルーゲーリッグ病、脊髄小脳変性症、脊髄小脳失調症、プリオン病、認知機能障害、老年性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、アルコール性認知症、初老期認知症、マシャド・ジョセフ病、筋異緊張症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、フリードライヒ運動失調症、側頭葉てんかん、及び脳卒中からなる群から選択される。
【0072】
一部の実施形態において、再構成高密度リポタンパク質または薬学的組成物は、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集を阻害するか、または脳組織の恒常性を維持するのに十分な量で投与される。
【0073】
以下、実施例を挙げて本開示をさらに詳しく説明するが、下記の実施例は説明を目的とするものに過ぎず、本開示の範囲を限定しようとする意図ではない。
【実施例1】
【0074】
マイクロ流体装置を用いたｒＨＤＬナノ粒子の製造方法
１－１．ｒＨＤＬナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置の設計
リン脂質及びアポリポタンパク質を混合することにより、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ；ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）を設計した（図１）。マイクロ流体装置は、３つの入口（ｉｎｌｅｔ）及び１つの出口（ｏｕｔｌｅｔ）を有し、３つの入口のうち中央に位置する入口からは疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）のリン脂質及び疎水性の薬物を、両側に位置する２つの入口からは親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）のアポリポタンパク質及び親水性の薬物を注入した。さらに、脂質及びアポリポタンパク質を効果的に混合するために、マイクロ流体装置の内部にマイクロピラー（ｍｉｃｒｏｐｉｌｌａｒ）構造が導入された。
１－１．ｒＨＤＬナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置の設計
リン脂質及びアポリポタンパク質を混合することにより、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ；ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ナノ粒子を製造するためのマイクロ流体装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）を設計した（図１）。マイクロ流体装置は、３つの入口（ｉｎｌｅｔ）及び１つの出口（ｏｕｔｌｅｔ）を有し、３つの入口のうち中央に位置する入口からは疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）のリン脂質及び疎水性の薬物を、両側に位置する２つの入口からは親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）のアポリポタンパク質及び親水性の薬物を注入した。さらに、脂質及びアポリポタンパク質を効果的に混合するために、マイクロ流体装置の内部にマイクロピラー（ｍｉｃｒｏｐｉｌｌａｒ）構造が導入された。
【0075】
１－２．ｒＨＤＬナノ粒子の製造１
マイクロ流体装置を用いて、以下の方法でリン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
マイクロ流体装置を用いて、以下の方法でリン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
【0076】
無水エタノール中のＤＭＰＣ（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）溶液及びＰＢＳ中のアポリポタンパク質溶液を用意した。その後、１本の注射器に、約０．８ｍＬの無水エタノールに対して０．８３ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＭＰＣ溶液を充填し、他の２本の注射器に、同量のＰＢＳに対して０．２ｍｇ／ｍＬの濃度のアポリポタンパク質溶液約１．２５ｍＬ（合計約２．５ｍＬ）をそれぞれ充填してから、すべての注射器の泡を除去した。
【0077】
各注射針とマイクロ流体装置の入口をチューブで接続し、マイクロ流体装置を洗浄するために、ＰＢＳを１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。その後、シリンジポンプを用いて、ＤＭＰＣ溶液の注入流速を０．８ｍＬ／ｍｉｎに、アポリポタンパク質溶液の注入流速を２．２ｍＬ／ｍｉｎに設定した。マイクロ流体装置の出口から製造されたｒＨＤＬナノ粒子を収集し、得られたナノ粒子をＰＢＳと混合してから、１０Ｋフィルターを用いて遠心分離機の最大速度で４℃で２０分間、３回精製した。最後の精製後に残留物に約２５０μＬのナノ粒子溶液を残し、４℃で保存した。
【0078】
１－３．ｒＨＤＬナノ粒子の製造２
１－２と同様の方法で、リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
１－２と同様の方法で、リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
【0079】
１－４．ｒＨＤＬナノ粒子の製造３
１－２と同様の方法で、リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
１－２と同様の方法で、リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
【0080】
１－５．マイクロピラー構造の効果
マイクロピラー構造の有無による脂質及びアポリポタンパク質の混合効率性を確認するため、シミュレーションと赤インクを用いてマイクロ流体装置内のリン脂質の分布を観察した。その結果、図１に示すように、マイクロピラー構造によりマイクロボルテックス（ｍｉｃｒｏｖｏｒｔｅｘ）が発生し、リン脂質とアポリポタンパク質がより効率的に混合されることを確認した。また、ＢＣＡタンパク質の定量化によりｒＨＤＬナノ粒子の生産収率を確認したところ、図２に示すように、マイクロピラーがない場合と比較して、マイクロピラーがある場合は生産収率が向上することを確認した。
マイクロピラー構造の有無による脂質及びアポリポタンパク質の混合効率性を確認するため、シミュレーションと赤インクを用いてマイクロ流体装置内のリン脂質の分布を観察した。その結果、図１に示すように、マイクロピラー構造によりマイクロボルテックス（ｍｉｃｒｏｖｏｒｔｅｘ）が発生し、リン脂質とアポリポタンパク質がより効率的に混合されることを確認した。また、ＢＣＡタンパク質の定量化によりｒＨＤＬナノ粒子の生産収率を確認したところ、図２に示すように、マイクロピラーがない場合と比較して、マイクロピラーがある場合は生産収率が向上することを確認した。
【0081】
また、図３に示すように、２種類のマイクロ流体装置で製造したｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解させた後のＤＬＳデータを測定したところ、マイクロピラーがない場合と比較して、マイクロピラーのあるマイクロ流体装置で製造したｒＨＤＬナノ粒子のサイズがはるかに均一であり、凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）度が減少したため、粒子サイズの均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）が向上したことを確認した。
【実施例2】
【0082】
リン脂質及びアポリポタンパク質Ｅ３の配合比率の最適化
ｒＨＤＬナノ粒子の製造に用いられるリン脂質及びアポリポタンパク質の合成配合比を最適化するために、以下の方法で合成配合比によるｒＨＤＬナノ粒子の平均サイズ及びサイズ分布を比較した。
ｒＨＤＬナノ粒子の製造に用いられるリン脂質及びアポリポタンパク質の合成配合比を最適化するために、以下の方法で合成配合比によるｒＨＤＬナノ粒子の平均サイズ及びサイズ分布を比較した。
【0083】
２－１．リン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子
実施例１－２と同様の方法で、リン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。その結果を強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、体積（ｖｏｌｕｍｅ）、及び個数（ｎｕｍｂｅｒ）によってプロットした。
実施例１－２と同様の方法で、リン脂質（ＤＭＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。その結果を強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、体積（ｖｏｌｕｍｅ）、及び個数（ｎｕｍｂｅｒ）によってプロットした。
【0084】
人工的に安定したＨＤＬを製造するためには、ｒＨＤＬを高密度かつ小粒にする必要があり、医薬品として用いるためには、安定したｒＨＤＬを大量に製造する必要がある。
【0085】
図４に示すように、リン脂質（ＤＭＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＲＱ７９４６１．１）の合成配合重量比が０．７５：１の場合を１．２５：１及び２．５：１の場合と比較すると、合成配合重量比が０．７５：１の場合、ナノ粒子のサイズが小さく均一な最終生成物であるｒＨＤＬが得られることを確認した。
【0086】
人体で自然に産生されるＨＤＬは直径が２０ｎｍ以下であるが、本開示のｒＨＤＬの粒子は、ほとんど２０ｎｍ以下のサイズを有することが分かる。具体的には、図５に示すように、１０～２０ｎｍの安定した粒子サイズを有するＨＤＬの分布を計算したところ、合成配合重量比が０．７５：１の場合に７０％以上であり。合成配合重量比が１．２５：１の場合に２０％以上であったが、合成配合重量比が２．５：１の場合は５％未満であることを確認した。
【0087】
リン脂質（ＤＭＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が２．５：１を超えると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも多量のリン脂質が含まれ、残りのリン脂質が安定に形成されたｒＨＤＬ同士を結合することでクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を形成するか、あるいはさらに凝集することでリン脂質集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を生成することが分かる。
【0088】
また、リン脂質（ＤＭＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が０．２５：１未満であると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも多量のアポリポタンパク質が含まれ、ナノ粒子に形成されていないアポリポタンパク質が凝集することを確認した。
【0089】
一般的に、アポリポタンパク質はリン脂質に比べて比較的高価であるため、合成時にアポリポタンパク質を必要量を超えて含ませない方が大量生産の面でより好ましい。よって、効率的な大量生産のためには、比較的安価なリン脂質を必要量を超えて含ませて合成し、その後にリン脂質を有機溶媒と共に除去することが好ましい。
【0090】
よって、ナノ粒子を合成した後、有機溶媒を除去するステップを経て、ナノ粒子に合成されずに残っているリン脂質を最大限除去することで、均一で安定したｒＨＤＬが製造されるため、最終生成物であるｒＨＤＬナノ粒子に含まれるリン脂質とアポリポタンパク質の重量比は、合成配合重量比よりもさらに小さい。
【0091】
２－２．リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子
実施例１－３と同様の方法で、リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。
実施例１－３と同様の方法で、リン脂質（ＤＰＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。
【0092】
図６に示すように、リン脂質（ＤＰＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が１．１：１の場合、ナノ粒子のサイズが小さく均一な最終生成物であるｒＨＤＬが得られることを確認した。
【0093】
具体的には、図７に示すように、４０ｎｍ以下の粒子サイズを有するＨＤＬの分布を計算したところ、合成配合重量比が１．１：１の場合に５０％以上であることを確認した。
【0094】
リン脂質（ＤＰＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が２．５：１を超えると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも多量のリン脂質が含まれ、残りのリン脂質が安定に形成されたｒＨＤＬ同士を結合することでクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を形成するか、あるいはさらに凝集することでリン脂質集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を生成することが確認された。
【0095】
また、リン脂質（ＤＰＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が０．５：１未満であると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも少量のリン脂質が含まれるため、構成物質の不安定性が増し、凝集体のサイズ分布が不均一になることを確認した。
【0096】
２－３．リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬナノ粒子
実施例１－４と同様の方法で、リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。
実施例１－４と同様の方法で、リン脂質（ＰＯＰＣ）及びアポリポタンパク質の配合比率を変化させて製造されたｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるナノ粒子の凝集現象による粒子サイズ分布の変化を測定した。
【0097】
図８に示すように、リン脂質（ＰＯＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が１．２：１の場合を１．３５：１の場合を比較すると、合成配合重量比が１．２：１の場合、ナノ粒子のサイズが小さく均一な最終生成物であるｒＨＤＬが得られることを確認した。
【0098】
具体的には、図９に示すように、４０ｎｍ以下の粒子サイズを有するＨＤＬの分布を計算したところ、合成配合重量比が１．２：１の場合に６０％以上であり、合成配合重量比が１．３５：１の場合に２０％以上であることを確認した。
【0099】
リン脂質（ＰＯＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が２．５：１を超えると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも多量のリン脂質が含まれ、残りのリン脂質が安定に形成されたｒＨＤＬ同士を結合することでクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を形成するか、あるいはさらに凝集することでリン脂質集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を生成することが確認された。
【0100】
また、リン脂質（ＰＯＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比が０．５：１未満であると、ナノ粒子の形成に必要な量よりも少量のリン脂質が含まれるため、構成物質の不安定性が増し、凝集体のサイズ分布が不均一になることを確認した。
【実施例3】
【0101】
アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の製造
実施例１及び２のアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の製造方法と同様にして、アポリポタンパク質Ｅ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＡＲＱ７９４５９）を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。その後、実施例２と同様の方法でＤＬＳを用いて粒子のサイズ分布を測定し、それをアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子と比較した。
実施例１及び２のアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の製造方法と同様にして、アポリポタンパク質Ｅ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＡＲＱ７９４５９）を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造した。その後、実施例２と同様の方法でＤＬＳを用いて粒子のサイズ分布を測定し、それをアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子と比較した。
【0102】
図１０に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子とアポリポタンパク質Ｅ２を含むｒＨＤＬナノ粒子との間の形状差はほとんどなく、同じ条件下でナノ粒子を作製できることが確認された。
【実施例4】
【0103】
アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の形態
実施例１の製造方法に従って、リン脂質（ＤＭＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比０．７５：１のｒＨＤＬナノ粒子を製造し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いてその形態学的特徴を観察した。ｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、その後ニッケルグリッド上に置き、ネガティブ染色し、十分に乾燥させてから、写真を撮影した。
実施例１の製造方法に従って、リン脂質（ＤＭＰＣ）に対するアポリポタンパク質Ｅ３の合成配合重量比０．７５：１のｒＨＤＬナノ粒子を製造し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いてその形態学的特徴を観察した。ｒＨＤＬナノ粒子をＰＢＳに溶解し、その後ニッケルグリッド上に置き、ネガティブ染色し、十分に乾燥させてから、写真を撮影した。
【0104】
図１１に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子は、２層のアポリポタンパク質がリン脂質に帯状に巻き付いた円盤状（ｄｉｓｃｏｉｄａｌ ｓｈａｐｅ）を示すことが確認された。
【0105】
【0106】
重量比が２．５：１を超えると、残ったリン脂質が既に生成済みの安定したｒＨＤＬを雲のように結びつけ、ｒＨＤＬの粒子サイズを大きくするが、その場合、ｒＨＤＬは不安定な形態を有するため、体内で一定濃度のｒＨＤＬを維持することができない。さらに、アポリポタンパク質（ＡｐｏＥ）は、体内においてＬＤＬＲ（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介してＢＢＢを通過するか、あるいはアミロイドベータを脳外に輸送する役割を果たすが、リン脂質がそれらのアポリポタンパク質を雲のように取り囲んでおり、ｒＨＤＬがその機能を果たすことを困難にする可能性がある。
【実施例5】
【0107】
複種類のアポリポタンパク質を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の製造
本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、リン脂質を取り囲むアポリポタンパク質の種類及び構成に応じて、異なる機能及び効果を有する。よって、本実施例では、リン脂質を取り囲むアポリポタンパク質が複種類で構成されているハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、リン脂質を取り囲むアポリポタンパク質の種類及び構成に応じて、異なる機能及び効果を有する。よって、本実施例では、リン脂質を取り囲むアポリポタンパク質が複種類で構成されているハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
【0108】
生体適合性に優れたアポリポタンパク質Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＳ６８２２７．１）及びアポリポタンパク質Ｅ３の両方を含むｒＨＤＬナノ粒子を製造するために、濃度１．８ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣ溶液、濃度０．２ｍｇ／ｍＬのアポリポタンパク質Ａ１溶液及びアポリポタンパク質Ｅ３溶液を共に用いて、実施例１に従ってｒＨＤＬナノ粒子を製造した。
【0109】
また、アポリポタンパク質Ｅ２溶液及びアポリポタンパク質Ｅ３溶液を併用すると、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子が製造できることを確認した。本開示のハイブリッドナノ粒子を製造するために、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＡｐｏＥ２及びＡｐｏＥ３溶液１．２５ｍＬずつを用意して混合し、０．８３ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＭＰＣ溶液０．８ｍＬを用意して、実施例１に従ってナノ粒子を製造した。その結果、図１０に示すように、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を均一なナノ材料として製造できることが確認された。
【0110】
アポリポタンパク質Ａ１溶液及びアポリポタンパク質Ｅ３溶液を併用すると、製造直後にアポリポタンパク質Ａ１を含むｒＨＤＬナノ粒子、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ａ１及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子がいずれも存在することができる。また、ＥＬＩＳＡで確認したところ、ハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子は、全ナノ粒子に対して約１０％の割合で生成されていることが確認された。
【0111】
結局、従来のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）法では、アポリポタンパク質をリン脂質キャリアと混合して放置するが、アポリポタンパク質は互いに凝集しているため、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を同時に培養皿に添加しても、Ｅ２及びＥ３タンパク質が相互自発的に融合し、ハイブリッドｒＨＤＬが生成されない。しかしながら、本開示の製造方法によると、ハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子が生成されることが分かる。
【実施例6】
【0112】
アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子におけるリン脂質及びアポリポタンパク質の構成
実施例１及び２に従って製造されたｒＨＤＬナノ粒子の最終的なリン脂質及びアポリポタンパク質の組成比を確認するために、ＢＣＡアッセイ及びＬｉｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて定量した。その結果を表１に示す。
実施例１及び２に従って製造されたｒＨＤＬナノ粒子の最終的なリン脂質及びアポリポタンパク質の組成比を確認するために、ＢＣＡアッセイ及びＬｉｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて定量した。その結果を表１に示す。
【0113】
【表1】
【0114】
表１に示すように、異なる時期に製造した合計６グループのｒＨＤＬナノ粒子のリン脂質：アポリポタンパク質の割合が０．２：１～０．５：１であることを確認した。すなわち、リン脂質：アポリポタンパク質の合成配合重量比０．７５：１で製造されたｒＨＤＬにおいて、合成後のリン脂質：タンパク質は、０．２：１～０．５：１であることが分かる。よって、ｒＨＤＬの製造過程で過剰なリン脂質が有機溶媒と共に除去されることで、最終生成物であるｒＨＤＬ中のリン脂質含有量が減少することが分かる。
【0115】
本開示のｒＨＤＬは、２つの層を形成するアポリポタンパク質構造中にリン脂質が含まれているため、大量生産に最適な合成混合比で製造されたｒＨＤＬの合成後のリン脂質：アポリポタンパク質は、０．２：１～０．５：１であることが確認された。
【0116】
ただし、ｒＨＤＬの製造過程で過剰のリン脂質が有機溶媒と共に除去されずに残る場合、ｒＨＤＬの合成後のリン脂質：アポリポタンパク質比は０．２：１～２．５：１であってもよく、過剰のリン脂質が有機溶媒と一緒に完全に除去されずに残る場合、その割合は０．２：１～１．５：１であってもよい。
【実施例7】
【0117】
ｒＨＤＬナノ粒子の密度の測定及び計算
合成に用いられたアポリポタンパク質Ｅ３の分子量と、合成に用いられた物質の長さと、ＤＬＳ測定結果による最終合成産物の体積範囲に基づいて、ｒＨＤＬナノ粒子の密度を計算した。
合成に用いられたアポリポタンパク質Ｅ３の分子量と、合成に用いられた物質の長さと、ＤＬＳ測定結果による最終合成産物の体積範囲に基づいて、ｒＨＤＬナノ粒子の密度を計算した。
【0118】
ｒＨＤＬナノ粒子の質量情報は以下のとおりである。アポリポタンパク質Ｅ３の分子量は３５．２０ｋＤａであり、最終合成産物には、アポリポタンパク質Ｅ３が２つの層を形成するため、構成タンパク質の総質量は７０．４０ｋＤａと計算される。さらに、実施例１及び２に従って製造されたｒＨＤＬナノ粒子の好ましい最終的な脂質：アポリポタンパク質の割合は、０．２：１～０．５：１であることが確認された。故に、最終合成産物に含まれている脂質の質量は、１４．０８～３５．２０ｋＤａと計算された。よって、最終的なｒＨＤＬナノ粒子の分子量は、構成タンパク質と脂質の合計である８４．４８～１０５．６０ｋＤａ（１４０．２４×１０-21～１７５．３０×１０-21ｇ）の値であると計算された。
【0119】
ｒＨＤＬナノ粒子の体積情報は以下のとおりである。シミュレーションによってｒＨＤＬナノ粒子の形態を推測した。その結果を図１４～１６に示す。図１４～１６に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子の長軸（ｄｉａｍｅｔｅｒ）長さが８～１５ｎｍの分布を有することが確認された。円盤状（ｄｉｓｃｏｉｄａｌ ｓｈａｐｅ）のｒＨＤＬナノ粒子の短軸（ｈｅｉｇｈｔ）を２．５ｎｍと仮定すると、球状または楕円体の体積は１２５．６～４４１．６ｎｍ3と計算された。
よって、ｒＨＤＬナノ粒子の密度は、実験データから推定された質量と体積から０．３～１．２ｇ／ｍＬの密度分布として計算された。
よって、ｒＨＤＬナノ粒子の密度は、実験データから推定された質量と体積から０．３～１．２ｇ／ｍＬの密度分布として計算された。
【0120】
［試験例１］
ｒＨＤＬナノ粒子のＡβ凝集阻害効果の確認
実施例で製造したｒＨＤＬナノ粒子のアミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を確認するために、以下の実験を行った。
ｒＨＤＬナノ粒子のＡβ凝集阻害効果の確認
実施例で製造したｒＨＤＬナノ粒子のアミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を確認するために、以下の実験を行った。
【0121】
４８８蛍光で標識された１μＭのＡβ１-４２及び３つの濃度（０．０１、０．１、０．５μＭ）のｒＨＤＬナノ粒子を用意し、９６ウェルプレートに同時に処理し、その後０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０、１５０、２４０、３００、３６０、７２０、及び１４４０分経過後の蛍光値をそれぞれ撮影した。比較のため、４８８－Ａβ単独で処理したしたプレートの蛍光値を合わせて確認した。４８８－Ａβは凝集すると自己消光（ｓｅｌｆ－ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、蛍光値が低下するため、ｒＨＤＬナノ粒子を合わせて処理した時の蛍光値は、４８８－Ａβ単独で処理した場合よりも高ければ、Ａβ凝集阻害効果があると解釈できる。
【0122】
１－１．アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子
図１７、１８に示すように、４８８-Ａβ単独で処理した場合、４８８-Ａβが経時的に凝集して自己消光し、蛍光値が低下することを確認した。また、４８８－Ａβ単独で処理した場合よりも、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を合わせて処理した場合の蛍光値が高いことを確認した。さらに、ｒＨＤＬナノ粒子の濃度が増加するにつれて、蛍光値がより高いことを確認した。
図１７、１８に示すように、４８８-Ａβ単独で処理した場合、４８８-Ａβが経時的に凝集して自己消光し、蛍光値が低下することを確認した。また、４８８－Ａβ単独で処理した場合よりも、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を合わせて処理した場合の蛍光値が高いことを確認した。さらに、ｒＨＤＬナノ粒子の濃度が増加するにつれて、蛍光値がより高いことを確認した。
【0123】
よって、本開示のｒＨＤＬナノ粒子は、優れたＡβ凝集阻害効果を有することが分かる。
【0124】
１－２．アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を同時に含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子
図１９に示すように、４８８－Ａβ単独で処理した場合よりも、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を併せて処理した場合の蛍光値が高いことを確認した。ハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の濃度が増加するにつれて、蛍光値がより高く測定され、特に、０．５μＭのハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子で処理すると、蛍光値はほとんど減少せず、Ａβ凝集阻害において顕著な効果を有することが確認された。
図１９に示すように、４８８－Ａβ単独で処理した場合よりも、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子を併せて処理した場合の蛍光値が高いことを確認した。ハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の濃度が増加するにつれて、蛍光値がより高く測定され、特に、０．５μＭのハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子で処理すると、蛍光値はほとんど減少せず、Ａβ凝集阻害において顕著な効果を有することが確認された。
【0125】
［試験例２］
ｒＨＤＬナノ粒子に含まれるアポリポタンパク質の種類によるＡβ凝集阻害効果の比較
ｒＨＤＬナノ粒子に含まれるアポリポタンパク質の種類による効果の違いを比較するために、同じ濃度０．５μＭのアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子と、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子のアミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を試験例１と同様に比較した。
ｒＨＤＬナノ粒子に含まれるアポリポタンパク質の種類によるＡβ凝集阻害効果の比較
ｒＨＤＬナノ粒子に含まれるアポリポタンパク質の種類による効果の違いを比較するために、同じ濃度０．５μＭのアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子と、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子のアミロイドベータ（Ａβ）凝集阻害効果を試験例１と同様に比較した。
【0126】
図２０に示すように、アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子とアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子のいずれも優れたＡβ凝集阻害効果を示し、特に１０時間が経過した後にはハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子が最も高い効果を示すことが確認された。最初の２０分以内には、実験開始前に凝集したＡβが脱凝集（ｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）し、蛍光値が一時的に上昇する現象が観察された。
【0127】
［試験例３］
純粋なアポリポタンパク質とｒＨＤＬナノ粒子とのＡβ凝集阻害効果の比較
本開示のｒＨＤＬナノ粒子ではなく、アポリポタンパク質単独で処理することでもＡβ凝集阻害効果が発揮されるか否かを確認するために、Ａβとアポリポタンパク質Ｅ３で処理するか、あるいはＡβとアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を１：０．１で処理し、試験例１と同様の方法で蛍光値の変化を確認した。
純粋なアポリポタンパク質とｒＨＤＬナノ粒子とのＡβ凝集阻害効果の比較
本開示のｒＨＤＬナノ粒子ではなく、アポリポタンパク質単独で処理することでもＡβ凝集阻害効果が発揮されるか否かを確認するために、Ａβとアポリポタンパク質Ｅ３で処理するか、あるいはＡβとアポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を１：０．１で処理し、試験例１と同様の方法で蛍光値の変化を確認した。
【0128】
図２１に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３で処理した場合でも、Ａβ単独で処理した場合に比べて蛍光値が高くなったが、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子で処理した場合の蛍光値が有意に高く、本開示のｒＨＤＬナノ粒子のＡβ凝集阻害効果が非常に優れていることを確認した。
【0129】
［試験例４］
血液脳関門内皮細胞におけるｒＨＤＬナノ粒子の輸送量比較
アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、脳微小血管内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ＢＭＥＣ）を介した脳組織への経細胞輸送（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の程度に関する実験を行った。その結果を図２２に示す。
血液脳関門内皮細胞におけるｒＨＤＬナノ粒子の輸送量比較
アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、脳微小血管内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ＢＭＥＣ）を介した脳組織への経細胞輸送（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の程度に関する実験を行った。その結果を図２２に示す。
【0130】
図２２に示すように、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の場合、血液脳関門の脳微小血管内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；ＢＭＥＣ）を介した脳組織内への輸送（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が、単一のアポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノタンパク質と比較して優れているっことが確認された。これは、Ｅ２及びＥ３がそれぞれ反応する脳微小血管内皮細胞の受容体に同量のナノ材料が細胞に供給されると、単一のアポリポタンパク質（Ｅ２またはＥ３）ｒＨＤＬよりも、ハイブリッドｒＨＤＬがより効果的に細胞に吸収できることを意味する。
【0131】
よって、将来ｒＨＤＬが治療剤または送達剤として使用される場合、最低の用量でもより効率的に脳微小血管内皮細胞関門を通過することができ、それによってより効果的な薬効発現及び薬物送達が可能であることが分かる。
【0132】
［試験例５］
血液脳関門の星状膠細胞におけるｒＨＤＬナノ粒子の輸送量比較
アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、血液脳関門の星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）を介した輸送の程度に関する実験を行った。その結果を図２３に示す。
血液脳関門の星状膠細胞におけるｒＨＤＬナノ粒子の輸送量比較
アポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３を含むｒＨＤＬナノ粒子、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子に対して、血液脳関門の星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）を介した輸送の程度に関する実験を行った。その結果を図２３に示す。
【0133】
図２３に示すように、アポリポタンパク質Ｅ２及びＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子の場合、単一のアポリポタンパク質（Ｅ２またはＥ３）ｒＨＤＬと比較して血液脳関門の星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）を介する輸送においてより優れており、脳組織内の恒常性維持に対してより優れた効果を発揮することが分かる。
【0134】
これは、Ｅ２及びＥ３がそれぞれ反応する星状膠細胞の受容体に同量のナノ材料が細胞に供給されると、アポリポタンパク質Ｅ２とＥ３を含むハイブリッドｒＨＤＬナノ粒子が受容体に最大限に反応できることを意味する。よって、最小の投与量で最大の効果を発揮できることが分かる。
【0135】
［試験例６］
アルツハイマー病動物モデルにおける脳組織アミロイドベータの除去量比較
アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子について、アルツハイマー病動物モデルにおける脳組織アミロイドベータの除去に関する実験を行った。その結果を図２４～２７に示す。
アルツハイマー病動物モデルにおける脳組織アミロイドベータの除去量比較
アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子について、アルツハイマー病動物モデルにおける脳組織アミロイドベータの除去に関する実験を行った。その結果を図２４～２７に示す。
【0136】
同数の雌雄の正常マウス及びアルツハイマー病動物モデル（５ｘＦＡＤ）を、それぞれ対照群とｒＨＤＬナノ粒子投与群に分け、対照群には生理食塩水をｉ．ｖ．注射で投与し、ｒＨＤＬナノ粒子を投与した群には、アポリポタンパク質Ｅ３を含む本開示のｒＨＤＬナノ粒子（２．５ｍｇ／ｋｇ）を３日に１回、合計３３回投与した。最終投与から２４時間後に、脳を摘出し、左脳を４％ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で固定し、固定した脳組織をＯＣＴ化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で凍結してから、ミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）で４μｍの厚さに切断した。切断した組織切片をスライドに貼り付け、Ａβ特異的抗体とＤＡＢ（３，３‘－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓａｌｔ）発色剤を用いて反応させた。共焦点顕微鏡を用いて、染色されたスライドを撮影した。その結果を図２４及び２５に示す。
【0137】
図２４に示すように、生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を３ヶ月間投与したアルツハイマー病動物モデル（５ｘＦＡＤ）では、脳内に過剰なＡβ沈着が観察された。しかしながら、図２５に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を投与すると、Ａβ沈着が著しく減少することが分かる。それで、Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子が、アルツハイマー病の原因となる脳組織内のＡβタンパク質を効果的に除去できることが分かる。
【0138】
また、各実験群の脳脊髄液中のＡβ濃度を比較するために、マウスの脳摘出前にマウスに麻酔をかけ、その後小脳（ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）と延髄（ｍｅｄｕｌｌａ Ｏｂｌｏｎｇａｔａ）の間の大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ）を介して脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ＣＳＦ）を採取した。血漿中のＡβ濃度を比較するために、脳脊髄液を採取し、その後頸静脈より採血を行い、ヘパリン（５ＩＵ／ｍＬ）処理したチューブに約０．１３ｍＬの全血を得た。採取した血液を遠心分離し、血漿を分離した。
【0139】
その結果、図２６及び２７に示すように、アポリポタンパク質Ｅ３を含むｒＨＤＬナノ粒子を投与したアルツハイマー病動物モデル（５ｘＦＡＤ）の脳脊髄液及び血漿中のＡβ濃度が、生理食塩水を投与した群と比較して有意に減少することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リン脂質と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項2】
リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとを０．２５：１～２．５：１の重量比で含む混合物から生成されることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項3】
リン脂質とアポリポタンパク質Ｅとを０．５：１～１．５：１の重量比で含む混合物から生成されることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項4】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～２．５：１であることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項5】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～１．５：１であることを特徴とする、請求項４に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項6】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）中のリン脂質とアポリポタンパク質Ｅとの重量比が０．２：１～０．５：１であることを特徴とする、請求項５に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項7】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．１～２．０ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項8】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．２～１．５ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項７に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項9】
前記再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の密度が０．３～１．２ｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項８に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項10】
アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３、またはＥ２及びＥ３の両方を含むことを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項11】
アポリポタンパク質Ａ１をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項12】
アポリポタンパク質Ｅ２、Ｅ３またはＡ１以外のアポリポタンパク質を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項13】
アポリポタンパク質Ｅ４を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項14】
前記リン脂質が、１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２－ジエイコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド）（ＶＬ－５）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン ４－トリフルオロ酢酸（ＤＯＧＳ）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、（１，２－ジオレイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ｂｉｓ（ドデシルオキシ）－１－プロパンアンモニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ′－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオンアミジン（ｄｉＣ１４－ａｍｉｄｉｎｅ）、エチルホスホコリン（Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、及びＤ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ-ＫＣ２-ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ-ＤＭＡからなる群から少なくとも１つ選択されることを特徴とする、請求項１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項16】
アポリポタンパク質Ｅ２を含む再構成高密度リポタンパク質の第１のセット、及びアポリポタンパク質Ｅ３を含む再構成高密度リポタンパク質の第２のセットを含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項17】
アポリポタンパク質Ｅ２及びアポリポタンパク質Ｅ３の両方が包含された再構成高密度リポタンパク質を含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項18】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の再構成高密度リポタンパク質を含む、神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項19】
前記再構成高密度リポタンパク質が、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集を阻害し、脳組織の恒常性を維持できることを特徴とする、請求項１８に記載の神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項20】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ルーゲーリッグ病、脊髄小脳変性症、脊髄小脳失調症、プリオン病、認知機能障害、老年性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、アルコール性認知症、初老期認知症、マシャド・ジョセフ病、筋異緊張症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、フリードライヒ運動失調症、側頭葉てんかん、及び脳卒中からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の神経変性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項21】
以下のステップを備える、リン脂質と、アポリポタンパク質Ｅとを含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。第１のアポリポタンパク質を含む第１の親水性溶液を、３つの入口及び１つの出口を有するマイクロ流体装置の第１の入口に注入するステップと、
リン脂質溶液を、マイクロ流体装置の第２の入口に注入するステップと、
第２のアポリポタンパク質を含む第２の親水性溶液を、マイクロ流体装置の第３の入口に注入するステップ。
【請求項22】
マイクロ流体装置が、マイクロ流体装置の中央に位置する第２の入口と、両側に位置する第１及び第３の入口とを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項23】
第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ２であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項24】
第１のアポリポタンパク質及び第２のアポリポタンパク質の両方がアポリポタンパク質Ｅ３であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項25】
第１のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ２であり、第２のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ３であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項26】
第１のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ｅ２またはＥ３であり、第２のアポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ａ１であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項27】
第１の親水性溶液、リン脂質溶液、及び第２の親水性溶液が同時に注入されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項28】
再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を出口から収集するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項29】
マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質とアポリポタンパク質Ｅの重量比が０．２５：１～２．５：１であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項30】
マイクロ流体装置の入口に注入されるリン脂質とアポリポタンパク質Ｅの重量比が０．５：１～１．５：１であることを特徴とする、請求項２９に記載の再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の製造方法。
【請求項31】
請求項２１または２２に記載の製造方法により製造された再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）。
【国際調査報告】