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▶ ヴェーエルゲー セラピューティクス コルラートルト フェレレーシュシェーギュー タールシャシャーグの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-22
(54)【発明の名称】クロロトキシン誘導体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/435 20060101AFI20240115BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240115BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240115BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240115BHJP
【ＦＩ】
C07K14/435 ZNA
C12N15/62 Z
C12N5/078
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023540726
(86)(22)【出願日】2021-12-28
(85)【翻訳文提出日】2023-08-28
(86)【国際出願番号】 HU2021050075
(87)【国際公開番号】W WO2022144560
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】P2000455
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU
(31)【優先権主張番号】P2100353
(32)【優先日】2021-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523248242
【氏名又は名称】ヴェーエルゲー セラピューティクス コルラートルト フェレレーシュシェーギュー タールシャシャーグ
【氏名又は名称原語表記】ＶＲＧ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＫＦＴ．
(74)【代理人】
【識別番号】110003292
【氏名又は名称】弁理士法人三栄国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シャーンドール ファルカシュ
(72)【発明者】
【氏名】ゾルターン タカーチュ
(72)【発明者】
【氏名】ヤーノシュ ナクチャ
(72)【発明者】
【氏名】ガーボル ラーツ
(72)【発明者】
【氏名】ペーテル ホルンヤーク
(72)【発明者】
【氏名】ゾルターン フイベル
(72)【発明者】
【氏名】ダーニエル ツィオカ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA10
4H045BA19
4H045CA50
4H045DA83
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、一般的な配列Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、ここで、（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され；（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。本発明はさらに、前記クロロトキシン誘導体を含むコンジュゲートおよびその調製方法、前記コンジュゲートからなるセラノスティック対、前記コンジュゲートまたは前記セラノスティック対を含むキット、前記コンジュゲートを含む医薬組成物、癌の治療方法、前記クロロトキシン誘導体を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、前記核酸を含むベクター、および前記ベクターによりトランスフェクションまたは形質導入されたヒト集団に関する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般的な配列のアミノ酸配列Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含む、クロロトキシン誘導体であって、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターが、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され；
（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターが、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され；
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターが、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターが、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す、クロロトキシン誘導体。
【請求項2】
一般的な配列のアミノ酸配列Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＴＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号３５）
を含み、
（ｉ）前記Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターが、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され；
（ｉｉ）前記Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターが、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｉｉ）前記Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターが、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す、請求項１に記載のクロロトキシン誘導体。
【請求項3】
前記内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターがＤＫＲである、請求項１または２に記載のクロロトキシン誘導体。
【請求項4】
配列番号３～配列番号１８、および配列番号３６～配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される、請求項１に記載のクロロトキシン誘導体。
【請求項5】
配列番号４または配列番号４２に記載の配列を有する、請求項１に記載のクロロトキシン誘導体。
【請求項6】
環状である、請求項１～５のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体および補欠分子族を含む、コンジュゲート。
【請求項8】
前記補欠分子族が以下の剤：（ｉ）可視化剤であって、好ましくは蛍光標識、放射性標識、磁気共鳴イメージング標識、および標識分子への高親和性結合により間接的標識を可能にする剤から選択される可視化剤；
（ｉｉ）治療剤であって、好ましくは化学療法剤、および生物学的治療剤から選択される治療剤；
（ｉｉｉ）標的化剤であって、好ましくは抗体、ポリペプチド、多糖および核酸から選択される標的化剤；
（ｉｖ）循環半減期を増加させる部分、好ましくはＰＥＧ部分、グリコシル部分、グリコシルＰＥＧ部分およびリンカー延長を介して請求項１～６のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体の環状化を可能にする部分から選択される部分
から選択される、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
前記クロロトキシン誘導体と前記補欠分子族との間に、１つまたは複数のリンカー（複数可）および任意に１つまたは複数のスペーサー（複数可）を含む、請求項７または８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
前記リンカーが、ペプチド、ジメチルジスルフィドリンカー、グルタリルリンカー、カテプシン切断性リンカーの群から選択される、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項11】
第１のコンジュゲートおよび第２のコンジュゲートを含むコンジュゲートのセラノスティック対であって、前記第１のコンジュゲートが請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートであり、前記第２のコンジュゲートが請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートである、コンジュゲートのセラノスティック対。
【請求項12】
ａ）前記第１のコンジュゲートおよび前記第２のコンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分が同じアミノ酸配列を有し、前記２つのコンジュゲートが異なる補欠分子族を有するか；またはｂ）前記第１のコンジュゲートおよび前記第２のコンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分が異なるアミノ酸配列を有し、前記第１のコンジュゲートおよび前記第２のコンジュゲートが、同じまたは異なる補欠分子族を有する、請求項１１に記載のセラノスティック対。
【請求項13】
請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび使用説明書を含む、キット。
【請求項14】
請求項１１または１２に記載のセラノスティック対および使用説明書を含む、キット。
【請求項15】
請求項８～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、前記コンジュゲートの前記補欠分子族が治療剤または可視化剤であり、前記医薬組成物がさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項16】
癌の治療に使用するための、請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項17】
癌の診断に使用するための、請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項18】
前記補欠分子族が可視化剤であり、癌性組織の可視化に使用するためのものである、請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項19】
前記癌が、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫の群から選択される；より好ましくは、前記癌が、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される、請求項１６または１７に記載のコンジュゲート。
【請求項20】
前記癌性組織が、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫の群から選択される；より好ましくは、前記癌性組織が、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項21】
請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートを有効量投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法であって、前記補欠分子族が前記癌の治療に適切な治療剤である、方法。
【請求項22】
前記癌が、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫の群から選択される；より好ましくは、前記癌が、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される、請求項２１に記載の癌に罹患している患者の治療方法。
【請求項23】
請求項１５に記載の医薬組成物を投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法であって、前記コンジュゲートの前記補欠分子族が、前記癌の治療に適切な治療剤である、方法。
【請求項24】
前記癌が、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫の群から選択される；より好ましくは、前記癌が、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される、請求項２３に記載の癌に罹患している患者の治療方法。
【請求項25】
コンジュゲートの調製方法であって、以下のａ）請求項１～６のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体を提供する工程；
ｂ）任意に、リンカー基を工程ａ）の前記クロロトキシン誘導体に結合させる工程；
ｃ）補欠分子族を工程ｂ）で形成された化合物のリンカー部分に結合させるか、またはリンカー非存在下で工程ａ）のタンパク質に直接結合させる、工程を含む、方法。
【請求項26】
癌性組織を可視化する方法であって、検査する組織を請求項７～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させる工程を含み、前記コンジュゲートの前記補欠分子族が、前記癌性組織の前記可視化に適切な可視化剤である、方法。
【請求項27】
キメラ抗原受容体をコードする核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体が、ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体；
ｂ）任意に、前記クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）１つまたは２つの共刺激ドメイン；
ｅ）シグナル伝達ドメインを含み、
前記クロロトキシン誘導体が、前記キメラ抗原受容体がＴ細胞の表面に発現された際に、Ｔ細胞活性を癌細胞に向けることを可能にする、核酸分子。
【請求項28】
前記クロロトキシン誘導体が、配列番号３～配列番号１８、および配列番号３６～配列番号４２、好ましくは配列番号４または配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項29】
ｉ）膜貫通ドメインが、ＣＤ４膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、およびＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；ｉｉ）１つまたは２つの共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインまたはそのバリアント、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはそのバリアント、およびＯＸ４０共刺激ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；および
ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントである、請求項２７または２８に記載の核酸分子。
【請求項30】
請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項31】
ヒト細胞の集団であって、ｉ）請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセットを含むＲＮＡまたはＤＮＡベクターによりトランスフェクションされ、前記トランスフェクションがｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる、または
ｉｉ）請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセットを含むウイルスベクターによって形質導入され、前記形質導入がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われ、前記ウイルスベクターが好ましくはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり；
前記ヒト細胞が、自家ヒトＴ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、自家ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、同種ヒトＴ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、自家初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、同種初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－９２細胞株の同種細胞、自家ヒト単球、自家ヒトマクロファージ、同種ヒト単球、同種ヒトマクロファージからなるリストから選択される、ヒト細胞の集団。
【請求項32】
請求項３１に記載のヒト細胞の１つまたは複数の集団を投与することを含む、患者の癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クロロトキシン誘導体に関する。特に、本発明は、哺乳動物、特にヒトの癌性細胞を標的とするのに有用な新規のクロロトキシン誘導体に関する。本発明はまた、新規クロロトキシン誘導体を用いて癌性細胞を標的化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
クロロトキシン特性
クロロトキシン（以下、ＣＴＸと称する）は、３６アミノ酸の小さなタンパク質で、シスチンノットミニタンパク質［Ｍｏｏｒｅ ２０１２］であり、４つのジスルフィド結合によって安定化されたコンパクトな三次構造を有する。ＣＴＸはサソリであるレイウルス・クインケストリアトゥス（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）の毒から最初に単離され、クロライドチャネルを遮断する能力から名付けられた。ＣＴＸは節足動物において神経毒性を引き起こすことがある［ＤｅＢｉｎ １９９３］。クロロトキシンまたはＣＴＸという用語では、配列番号１に示される野生型タンパク質を指す。野生型ＣＴＸおよびいくつかのＣＴＸバリアント／誘導体のジスルフィドパターンを図１に示す。野生型ＣＴＸのジスルフィドパターンは以下の通りである：Ｃ２－Ｃ１９、Ｃ５－Ｃ２８、Ｃ１６－Ｃ３３、およびＣ２０－Ｃ３５である。
クロロトキシン（以下、ＣＴＸと称する）は、３６アミノ酸の小さなタンパク質で、シスチンノットミニタンパク質［Ｍｏｏｒｅ ２０１２］であり、４つのジスルフィド結合によって安定化されたコンパクトな三次構造を有する。ＣＴＸはサソリであるレイウルス・クインケストリアトゥス（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）の毒から最初に単離され、クロライドチャネルを遮断する能力から名付けられた。ＣＴＸは節足動物において神経毒性を引き起こすことがある［ＤｅＢｉｎ １９９３］。クロロトキシンまたはＣＴＸという用語では、配列番号１に示される野生型タンパク質を指す。野生型ＣＴＸおよびいくつかのＣＴＸバリアント／誘導体のジスルフィドパターンを図１に示す。野生型ＣＴＸのジスルフィドパターンは以下の通りである：Ｃ２－Ｃ１９、Ｃ５－Ｃ２８、Ｃ１６－Ｃ３３、およびＣ２０－Ｃ３５である。
【0003】
神経膠腫特異的なクロライド電流を研究していた際に、ＣＴＸが正常脳組織の細胞とは対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで神経膠腫細胞に特異的および選択的な結合を示すことが見出された［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８］。この発見は、１３１Ｉヨウ素放射性同位元素に基づく殺細胞放射線療法を標的腫瘍細胞に集中させる標的分子としてＣＴＸを使用する概念を提起した［Ｍａｍｅｌａｋ ２００６］。また、免疫組織化学的研究により、蛍光標識またはビオチン標識を有するＣＴＸ様分子が神経膠腫の免疫組織化学的標識にうまく使用できることが示された［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８］。その後、ＣＴＸによる腫瘍特異的結合は、神経外胚葉由来腫瘍に分類される様々な種類の腫瘍でより広範に観察された［Ｌｙｏｎｓ ２００２］。多形膠芽腫（ＧＢＭ）、退形成性星状細胞腫、星状細胞腫、および乏突起膠腫を含む神経膠腫の他に、ＬｙｏｎｓらはＣＴＸ陽性（すなわち特異的結合体）として、膠肉腫、神経節膠腫、髄膜腫、上衣腫等の多数の他の原発性脳腫瘍、ならびに髄芽腫、神経芽細胞腫、神経節腫、黒色腫（原発性および転移性）、褐色細胞腫、ユーイング肉腫、小細胞肺癌腫、およびシュワン細胞腫等の末梢神経外胚葉腫瘍を記載している。Ｌｙｏｎｓらはまた、７つの膠芽腫細胞株および６つの末梢神経外胚葉腫瘍細胞株を含む異なるヒト腫瘍起源の不死化細胞株へのビオチン化ＣＴＸの高い特異的結合を示した。また、生理的温度の生細胞では、ＣＴＸは異なる細胞局在パターンをもたらす異なる内在化プロセスによって、腫瘍細胞および非腫瘍細胞に取り込まれることが示された［Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ ２０１１］。この研究では、ＣＴＸは、神経膠腫細胞ではエンドソームコンパートメントでリソソームに処理されるために受容体介在性（クラスリン性とも呼ばれる）エンドサイトーシスによって取り込まれ、その結果、細胞内に長く保持されることが証明された。一方、正常細胞（星状細胞および線維芽細胞）では、ＣＴＸは非受容体介在性のマクロピノサイトーシスによって取り込まれ、その後急速に放出されるため、正味の取込みは少なく、保持は延長されなかった。これらの特徴は、ＣＴＸの選択的腫瘍標的化特性に重要な役割を果たしている可能性がある。
【0004】
本来の毒由来のＣＴＸはＣ末端にカルボキサミドを持つが（すなわち、ＣＴＸと表記されるネイティブなタンパク質）、組換えにより産生されたＣＴＸのバリアント（以下、ｒＣＴＸと表記される）はＣ末端のアルギニンのカルボキシル基で終わっている。
【0005】
ＣＴＸの腫瘍選択性は、元来神経膠腫細胞のクロライドイオンチャネルに結合することに起因していた。その後、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２）がＣＴＸの受容体として、単独で、またはＭＭＰ－１４（マトリックスメタロプロテイナーゼ１４、膜型－１マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１－ＭＭＰ）としても知られる）、ＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２）、およびａｖβ３インテグリンとのタンパク質複合体として同定された［Ｄｅｓｈａｎｅ ２００３］。このＭＭＰ－ＴＩＭＰ－インテグリン複合体は、細胞表面に結合および放出された活性型ＭＭＰ－２の制御（成熟、固定、活性化、および阻害）に重要な役割を果たすと考えられており、これらの因子が協調して腫瘍浸潤、転移、および血管新生を促進し得る［Ｙｏｓｅｆ ２０１８］。
【0006】
それにもかかわらず、その後の研究において、ＣＴＸと組換え産生されたＭＭＰ－２との直接的および特異的な相互作用は、プルダウンアッセイでは確立できなかった［Ｖｅｉｓｅｈ ２００７］。この曖昧さに促され、他の研究グループは、アフィニティーカラム、架橋試薬、および質量分析を用いて神経膠腫ＣＴＸ受容体の同定を再調査し、ＣＴＸ受容体を含む直接結合パートナータンパク質はおそらくアネキシン２（Ａｎｘ２）であろうと結論づけたが［Ｋｅｓａｖａｎ ２０１０］；彼らは他の結合パートナータンパク質の可能性を認め、組換え産生および精製されたＡｎｘ２タンパク質を用いてＣＴＸ－Ａｎｘ２タンパク質－タンパク質相互作用を直接証明はしなかった。
【0007】
さらに他の研究グループは、腫瘍細胞および内皮細胞のエンドサイトーシス受容体であるニューロピリン－１（ＮＲＰ１）を新規ＣＴＸ標的として同定した［ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ ２０１９］。彼らは、ＮＲＰ１と結合するのはｒＣＴＸだけであり、ネイティブ（すなわち、Ｃ末端がカルボキサミドである）ＣＴＸはＮＲＰ１と結合しないが、細胞環境で脱アミド化によってカルボキシルバリアントに代謝されることを発見した。
【0008】
このように、議論の余地がある提案を鑑みると、ＣＴＸの真の標的タンパク質は、未だ不明な点が多いままである。ＣＴＸと特異的に結合する標的タンパク質のドメインまたは部位は、しばしばＣＴＸ受容体と呼ばれ［例えばＳｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８；Ｄａｒｄｅｖｅｔ ２０１５］、本明細書では簡略化のためにこの用語も使用する。
【0009】
前臨床試験および臨床試験におけるＣＴＸ含有構築物およびＣＴＸバリアント
特異的抗体標的分子と比較して、小タンパク質ＣＴＸは脳血液関門を通過することができる。このため、ＣＴＸは新しい標的化分子を創製する出発点として有望である。
特異的抗体標的分子と比較して、小タンパク質ＣＴＸは脳血液関門を通過することができる。このため、ＣＴＸは新しい標的化分子を創製する出発点として有望である。
【0010】
いくつかの初期の前臨床研究では、合成的に製造されたＣＴＸ（ＴＭ－６０１）が、単独またはテモゾロミドとの組合せで、ｉｎ ｖｉｖｏのマウスにおける膠芽腫異種移植片腫瘍増殖に有効であることが、いくつかの特許出願により報告されている［米国特許公開第２０１００２１５５７５号広報および米国特許公開第２０１００２１０５４６号広報］。しかし、これらの知見は、後に科学論文または追跡臨床試験で明らかに確認されることはなく、むしろ標的分子としてのＣＴＸの利用に興味が向かうようになった。
【0011】
ＣＴＸの真の標的が明確になっていないにもかかわらず、この分子は、診断もしくは治療ツールとしての利用、またはそのような利用を組み合わせたセラノスティクスとして、癌研究分野で多くの関心を集めている。［Ｄａｒｄｅｖｅｔ ２０１５］で概説されている複数の利用は、ＣＴＸのアミノ酸配列が有用な化学改変のためのいくつかの機会を提供することによって可能となる。このような改変には、多くの化合物とのコンジュゲーション、またはコンジュゲーションもしくは環状化のためのリンカーとしてのさらなるペプチド配列の付加が含まれ、これらの改変により、ＣＴＸを標的化キャリア分子として使用することが可能になる。標的化の利用は、このような改変がしばしば改変ＣＴＸ化合物の標的認識（ＣＴＸ受容体結合）特性を有意に変化させないという明白な特徴によって可能になる。例えば、ＣＴＸはヨウ素化に使用できる２９位のチロシン残基を１つ含んでおり［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８］、特定の放射性ヨウ素同位体（１２３Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉ）は、標的化分子に結合して、様々な前臨床研究（例えば、結合研究における１２５Ｉ）または臨床イメージング（例えば、ガンマスキャンまたは単一光子放出コンピュータ断層撮影－ＳＰＥＣＴまたはＳＰＥＣＴ／ＣＴ）または放射線治療応用のいずれかに日常的に使用されている。１３１Ｉ標識ＣＴＸ（関連文献ではＴＭ－６０１と表記）を用いた臨床第１／２相試験が、局所（腫瘍部位内）治療投与および静脈内イメージング（低用量）投与の両方で開始された。治療試験の第１相の結果は、有効性および安全性に関して有望なシグナルを示すものとして発表された［Ｍａｍｅｌａｋ ２００６］が；承認された第２相の治療試験および診断薬の開発は、結果を何ら発表することなく中止された。第１相診断（イメージング）試験は明らかに早期に中止された［ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの参照番号ＮＣＴ００６８３７６１］。
【0012】
国際公開第ＷＯ２０１１０９４６７１号広報には、Ｎ末端にコンジュゲートしたポリペプチドが記載されており、ポリペプチドはＣＴＸであっても、またはそのバリアントであっても良い。ここでは、ＣＴＸが癌性細胞の集団にコンジュゲートを標的化するのに役立ち、ＣＴＸがＭＭＰ－２に特異的に結合できることが記載されている。
【0013】
ＣＴＸ分子のリジン残基は、幅広い架橋試薬の利用可能性により、活性物質のコンジュゲーションを容易に行うためにも利用できる。ＣＴＸの１５、２３、および２７位には３つのリジン残基があり、これらはＮＨＳ－エステル改変シアニン５．５（Ｃｙ５．５）および他の蛍光分子とのコンジュゲーションに利用されている［Ａｋｃａｎ ２０１１；国際公開第ＷＯ２０１１１４２８５８号広報］。しかし、野生型ＣＴＸには３つのリジン残基が存在するため、様々な単一部位および複数部位のコンジュゲーション生成物の混合物ではなく、特定の位置（複数可）で均一なコンジュゲート誘導体を高収率で再現性よく生産するために、ＣＴＸのいくつかの改変が妥当であると考えられた。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および他の類似の規制機関から承認された混合物を使用することは可能であるが、モノ、ジ、およびトリ標識バッチの比率を合わせるのが高価かつ困難であるため、商業化の妨げになる可能性がある。そこで、Ｏｌｓｏｎと共同研究者らはＣＴＸのリエンジニアリングの例を発表した。彼らは、リジン１５および２３をアラニンまたはアルギニンのいずれかで置換することにより、得られるバッチ中の混合バイオコンジュゲート種が排除される一方、ＣＴＸと比較して変異ＣＴＸタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍染色活性は保持されることを示した［Ａｋｃａｎ ２０１１；国際公開第ＷＯ２０１１１４２８５８号広報］。その結果、１５位および２３位のリジン－アルギニン置換（Ｋ１５Ｒ、Ｋ２３Ｒ）により、ＣＴＸのモノリジン（Ｋ２７）変異体（以下、ｍＣＴＸと呼ぶ；配列番号２）が得られた。このｍＣＴＸタンパク質にＢＬＺ－１００（ＩＮＮ名 トズレリスチド；ＣＡＳ登録番号： １６７３５６５－４０－６）と表記されるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）をコンジュゲートさせた。これは現在、ヒト腫瘍の術中可視化［Ｄｉｎｔｚｉｓ ２０１９；Ｐａｔｉｌ ２０１９］、すなわち「腫瘍ペイント」として、第２相臨床開発［ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの参照番号ＮＣＴ０３５７９６０２］中である。ＣＴＸおよびｍＣＴＸの蛍光コンジュゲートを研究している間に、これらのコンジュゲートがＨｅＬａ（子宮頸癌）細胞によって内在化されること、およびｍＣＴＸのＣｙ５．５－およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲートの細胞内取込みが、ＣＴＸの類似コンジュゲートのそれよりも１．５倍および２倍高いことが観察された［Ｏｊｅｄａ ２０１７］。しかし、この差はフルオロフォアにコンジュゲートさせたＣＴＸの特徴であり、必ずしもコンジュゲートさせていない標的化ＣＴＸのバリアントの特徴ではない。しかし、術中可視化（「蛍光ガイド下手術」）には、上記のＣｙ５．５およびＩＣＧ以外に、例えばＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０、またはＶｉｖｏＴａｇ－Ｓ ７５０を含むいくつかの他のフルオロフォアコンジュゲートＣＴＸバリアントを使用してもよく、近赤外色素の使用が最も好ましい［Ｓｔｒｏｕｄ ２０１１］。
【0014】
国際公開第ＷＯ２０１５０４２２０２号広報は、ＣＴＸバリアントを含むコンジュゲートおよびキットを開示している。いくつかの実施形態によれば、ＣＴＸバリアントは蛍光部分とコンジュゲートを形成する。ここに記載されたコンジュゲートは、腫瘍の治療およびイメージングに有用である。
【0015】
ＣＴＸ特異的な発明に関する総説が２０１４年に発表された［Ｃｈｅｎｇ ２０１４］。ここでは、ＣＴＸが神経膠腫細胞の増殖および転移を特異的に阻害し、腫瘍のアポトーシスを加速し得ることが記載されている。ＣＴＸバイオコンジュゲートに関するいくつかの文献が提供されている。ここにはＣＴＸがＭＭＰ－２レセプターに特異的に結合することも記載されている。
【0016】
環状化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血中血清中のポリペプチド薬剤候補の半減期を延長するためにしばしば用いられる方法である。Ａｋｃａｎらは、ＣＴＸの環状バリアントが悪性組織に結合する能力を保持していることを示した［Ａｋｃａｎ ２０１１］。この環状バリアントは、Ｃ末端アルギニンをＮ末端メチオニンへとヘプタペプチド（ＧＡＧＡＡＧＧ）リンカーを介して連結することにより作製された。この改変は血漿中での半減期を延長するだけでなく、単独部位コンジュゲートを促進した。したがって、いくつかの伸長するペプチドセグメントを用いた、または余分なジスルフィド架橋を組み込んだ環状化は、当業者にとってＣＴＸバリアント親タンパク質の明らかな改変であり、そのような改変は親タンパク質の標的化能を保持するであろう。
【0017】
標的化分子としてのＣＴＸの他の利用は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法に、特異的タンパク質認識抗体の代わりにＣＴＸを適用することである。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に腫瘍細胞表面に存在する特定のタンパク質を標的とする新しい能力を与えるように遺伝子操作された受容体タンパク質である。受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を１つの受容体に組み込んだものであるためにキメラである。したがって、ＣＡＲは、細胞外腫瘍認識／標的化ドメイン、細胞外のリンカー／スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞活性化および共刺激シグナル伝達ドメインから構成される。特許出願である国際公開第ＷＯ２０１７／０６６４８１号広報は、細胞外腫瘍認識／標的化ドメインがＣＴＸ、関連毒素、またはＣＴＸバリアントであるＣＡＲ－Ｔ構築物を記載している。現在、ＣＴＸを腫瘍標的化ドメインとして使用するＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法の開発が、ＭＭＰ－２陽性膠芽腫患者の治療のために臨床第１相［ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖのＮＣＴ０４２１４３９２］にある。
【0018】
標的化分子としてのＣＴＸの他の利用は、ＣＴＸを抗増殖性または細胞傷害性ペイロード分子に結合させることである。標的化分子による特異性を達成するために、様々な抗増殖薬剤が抗体、またはより小さな標的化ポリペプチドに結合されてきた。当初、この試みはビンカアルカロイドおよびドキソルビシン等の既存の化学療法薬剤の特異性を高めることに向けられた。しかし、抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は近年大きな進化を遂げ、ＦＤＡの承認に至ったものもあれば、臨床開発中のものもかなりある［Ｌａｍｂｅｒｔ ２０１８］。現在臨床開発中のＡＤＣのほとんどに使用されている細胞傷害性化合物は、強力な抗有糸分裂微小管破壊剤であるドラスタチン１０（アウリスタチン）もしくはメイタンシンの誘導体、または細胞傷害性の高いいくつかのＤＮＡ損傷剤：カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、およびインドリノベンゾジアゼピン偽二量体の１つの誘導体のいずれかである［Ｌａｍｂｅｒｔ ２０１８］。これらのキャリア－リンカー－ペイロード構築物は、細胞傷害性化合物が細胞内標的に作用し、標的化分子が細胞特異的な標的タンパク質の表面存在によって認識される細胞への特異的な内在化を促進するという前提に基づいている。内在化は、エンドソーム－リソソーム経路を介して行われ、そこでリンカーが切断され、および／または抗体が分解されてペイロードが放出される。したがって、このようなＡＤＣ構築物は、リソソーム酵素切断可能または切断不可能リンカーのいずれかで組み立てられていた［Ｌａｍｂｅｒｔ ２０１８］。特許出願である国際公開第ＷＯ２０１７／１３６７６９号広報には、ＣＴＸとクリプトフィシン誘導体のコンジュゲートが、有効な抗癌治療薬剤として記載されている。アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥまたはＦ－ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ）およびメイタンシンの他に、クリプトフィシンも他の微小管破壊剤である。この特許出願の顕著な例は、リジン２７において、切断可能なジメチルジスルフィドリンカーを介してクリプトフィシンのアナログにコンジュゲートしたＣＴＸのキャリア－リンカー－ペイロード構築物である。この化合物は、神経膠芽腫、膵臓癌、前立腺癌および乳癌のマウス皮下異種移植モデルにおいて、ＣＴＸを含まない同様のリンカー－ペイロード構築物の有効性と比較して、優れた強力な抗腫瘍活性を有する。
【0019】
さらに、ＣＴＸを標的化分子として利用した診断および治療応用として、白金（ＩＶ）－ＣＴＸ；ポリマードットバイオコンジュゲート用コンジュゲート；コンジュゲートアップコンバージョンナノプローブ；Ａｇ－Ｉｎ－Ｓ／ＺｎＳ量子ドット；癌細胞標的化、イメージングおよびｓｉＲＮＡ送達の組合せに適合したガドリニウム磁性ナノベクターを有するデンドリグラフトポリリジン；ナノベクターベースの標的化遺伝子送達；薬剤送達およびＣＴＸ－コンジュゲート酸化鉄ナノ粒子によるＭＲＩ造影剤の増強の組合せ； ＣＴＸ－改変ドキソルビシン充填リポソーム；［Ｄａｒｄｅｖｅｔ ２０１５；Ｃｏｈｅｎ ２０１８］で総説されているような、他のナノ粒子およびナノプローブが提案および開発されている。
【0020】
既存のＣＴＸ構築物およびバリアントの欠点
ＣＴＸを診断または治療の標的化剤として利用する試みは、初期段階の臨床開発も含めて数多く行われているが、これまでのところ医療現場への導入の認可（販売承認）に至った開発物はない。ＣＴＸを標的化薬剤として使用する２つのアプローチ（ＣＡＲ－Ｔおよびトズレリスチド）は、近年活発に開発されているようである。他の開発物のいくつかは、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ等の必須の臨床試験データベースにおいて公開されている情報によれば、明らかに中止されていると考えられる。しかし、失敗または中止の理由は開示されておらず、推測の余地しかない。潜在的な財政的または経営的な問題に加えて、失敗の明らかな理由の１つは、ＣＴＸの有用な受容体に対する親和性または強度が不十分であったこと、および／または他の分子または細胞標的に対する望ましくない結合または効果に対して、選択性が不十分であったことであろう。
ＣＴＸを診断または治療の標的化剤として利用する試みは、初期段階の臨床開発も含めて数多く行われているが、これまでのところ医療現場への導入の認可（販売承認）に至った開発物はない。ＣＴＸを標的化薬剤として使用する２つのアプローチ（ＣＡＲ－Ｔおよびトズレリスチド）は、近年活発に開発されているようである。他の開発物のいくつかは、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ等の必須の臨床試験データベースにおいて公開されている情報によれば、明らかに中止されていると考えられる。しかし、失敗または中止の理由は開示されておらず、推測の余地しかない。潜在的な財政的または経営的な問題に加えて、失敗の明らかな理由の１つは、ＣＴＸの有用な受容体に対する親和性または強度が不十分であったこと、および／または他の分子または細胞標的に対する望ましくない結合または効果に対して、選択性が不十分であったことであろう。
【0021】
Ｕ２５１ＭＧ、Ｄ５４ＭＧおよびＵ８７ＭＧの神経膠腫細胞株の浸潤および遊走に対してＣＴＸで観察された５０％の阻害効果（ＩＣ５０）をもたらす濃度は約６００ｎＭ［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９９］であり、これは本発明者らのＭＭＰ－２結合および置換実験で測定された約５００～７００ｎＭの範囲のＥＣ５０およびＩＣ５０値と一致している（下記参照）。このような中程度の効力と高いサブマイクロモル有効濃度レベルは、治療または標識に十分有効な全身濃度をｉｎ ｖｉｖｏで達成することが困難であることを意味する。それにもかかわらず、健常な正常細胞よりも腫瘍細胞により多くのペイロード分子をもたらす標的化分子の選択性は、標的化分子の効果的な診断および／または治療応用にとってさらに重要である。したがって、悪性腫瘍の診断および治療のためのＣＴＸ関連研究分野における膨大なアンメットニーズは、標的タンパク質関連または細胞結合および機能的効果のいずれかの点で、より強力なおよび／またはより選択的な化合物によって、よりよく満たされるかもしれないということは、当技術分野の当業者にとって明白な仮定である。さらに、同じ種類の腫瘍でも、腫瘍細胞株によって示すマーカータンパク質の発現は多種多様である。したがって、異なる認識プロファイルを有する多種多様な新しい腫瘍細胞マーカー認識分子、およびまた、細胞特異的診断ツールと、共通のパターン認識標的分子によって連結されたマッチング治療ツールとの結合、すなわち「セラノスティクス」が必要である。特異的抗体はこのような目的のために広く使用されているが、より小さなサイズの特異的標的化分子は、より優れた浸透特性および生産コスト効果等、抗体を上回る利点がある可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0022】
本発明の背景にある考えは、本発明のＣＴＸ誘導体（以下、ＣＴＸＤまたはクロロトキシン誘導体と称する）がＣＴＸよりも強くマトリクスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２）タンパク質に結合することである。その結果、これらの化合物は、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌を含むがこれらに限定されない、ＭＭＰ－２を過剰発現する多数の神経外胚葉腫瘍細胞により強力に取り込まれる。驚くべきことに、フルオロフォアとコンジュゲートした本発明の代表的化合物（すなわちＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８、表ＩＩ参照）は、線維芽細胞、星状細胞および内皮細胞のような非腫瘍細胞と比較して、試験した神経外胚葉腫瘍細胞に対して、より強い細胞取込みだけでなく、より高い選択性を示した。さらに、精製された形態で、想定される標的タンパク質のパネルとの結合を調べたところ、驚くべきことに、ＣＴＸはＭＭＰ－２以外の他のタンパク質、すなわちＮＲＰ－１ともほぼ同様の強度で結合し、ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ－２、およびクロライドチャネルＣＬＣ３とも中程度に結合し、同時に、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８も標的タンパク質選択性の増加を示し、ＭＭＰ－２にのみ明白な結合を示し、ＴＩＭＰ－２およびＣＬＣ３に対しては非常に弱い結合を示すことが明らかになった。さらに、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８の主要標的タンパク質であるＭＭＰ－２に対する親和性は、設計したリンカー構造を有する化学療法用細胞分裂阻害化合物または蛍光標識フルオロフォア化合物のような比較的大きな分子とリジン残基でコンジュゲートしても有意には変化しなかった。これらの観察を合わせると、本発明の化合物は、単独で、または診断、もしくは治療、または診断と治療の組合せである、ＣＴＸのこのような仮定された利用に関連する先行技術から明らかであろう「セラノスティック」とも呼ばれる応用を可能にする付加的な特徴を提供する他の分子、ナノ粒子、ＣＡＲ－Ｔ細胞構築物とコンジュゲートされた状態で有用であり、標的化分子としてＣＴＸまたはｍＣＴＸよりも優れている、という結論がもたらされる。本発明のタンパク質は、当業者にとって、血中血清中におけるタンパク質薬剤候補の半減期を延長するための環状化等、ＣＴＸ誘導体のさらなる改変または拡張の出発点となり得る。
【課題を解決するための手段】
【0023】
上記の観点から、本発明は、一般的な配列
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして、
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして、
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
【0024】
好ましい実施態様によれば、本発明は、一般的な配列
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＴＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号３５）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｉｉ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＴＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号３５）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｉｉ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
【0025】
好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体の内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターはＤＫＲである。
【0026】
より好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は、配列番号３～配列番号１８および配列番号３６～配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される。さらにより好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は、配列番号４または配列番号４２に記載の配列を有する。
【0027】
他の好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は環状である。
【0028】
本発明はさらに、コンジュゲートに関し、ここで、コンジュゲートは、本発明のクロロトキシン誘導体および補欠分子族を含む。
【0029】
補欠分子族は、好ましくは以下の薬剤から選択される：
（ｉ）可視化剤であって、好ましくは蛍光標識、放射性標識、磁気共鳴イメージング標識、および標識分子への高親和性結合により間接的標識を可能にする薬剤から選択される可視化剤；
（ｉｉ）治療剤であって、好ましくは化学療法剤、および生物学的治療剤から選択される治療剤；
（ｉｉｉ）標的化剤であって、好ましくは抗体、ポリペプチド、多糖および核酸から選択される標的化剤；
（ｉｖ）循環半減期を増加させる部分であって、好ましくはＰＥＧ部分、グリコシル部分、グリコシルＰＥＧ部分およびリンカー延長を介して請求項１～５のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体の環状化を可能にする部分から選択される部分。
（ｉ）可視化剤であって、好ましくは蛍光標識、放射性標識、磁気共鳴イメージング標識、および標識分子への高親和性結合により間接的標識を可能にする薬剤から選択される可視化剤；
（ｉｉ）治療剤であって、好ましくは化学療法剤、および生物学的治療剤から選択される治療剤；
（ｉｉｉ）標的化剤であって、好ましくは抗体、ポリペプチド、多糖および核酸から選択される標的化剤；
（ｉｖ）循環半減期を増加させる部分であって、好ましくはＰＥＧ部分、グリコシル部分、グリコシルＰＥＧ部分およびリンカー延長を介して請求項１～５のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体の環状化を可能にする部分から選択される部分。
【0030】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、コンジュゲートは、クロロトキシン誘導体と補欠分子族との間に、１つ以上のリンカー（複数可）と、任意に１つ以上のスペーサー（複数可）とを含む。リンカーは、好ましくは、ペプチド、ジメチルジスルフィドリンカー、グルタリルリンカー、カテプシン切断性リンカーの群から選択される。
【0031】
本発明はさらに、第１のコンジュゲートと第２のコンジュゲートを含むコンジュゲートのセラノスティック対に関し、ここで両方のコンジュゲートが本発明のコンジュゲートである。本発明の好ましい実施形態によれば、前記２つのコンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分は同じアミノ酸配列を有し、前記２つのコンジュゲートは異なる補欠分子族を有する。他の好ましい実施形態によれば、前記第１のコンジュゲートおよび前記第２のコンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分は、異なるアミノ酸配列を有し、前記第１のコンジュゲートおよび前記第２のコンジュゲートは、同一または異なる補欠分子族を有する。
【0032】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートおよび使用説明書を含むキットに関する。他の実施形態によれば、キットは、本発明のセラノスティック対および使用説明書を含む。
【0033】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関し、コンジュゲートの補欠分子族は治療剤または可視化剤であり、医薬組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0034】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートに関し、このコンジュゲートは、癌の治療における使用、または癌の診断における使用のためのものである。好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫および小細胞肺癌腫の群から選択される。最も好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される。
【0035】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートに関し、このコンジュゲートは、癌性組織の可視化における使用のためのものである。好ましい実施形態によれば、癌性組織は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫および小細胞肺癌腫の群から選択される。最も好ましい実施形態によれば、癌性組織は、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される。
【0036】
本発明はさらに、本発明によるコンジュゲートを有効量で投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法に関し、ここで、補欠分子族は癌の治療に適した治療剤である。好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫および小細胞肺癌腫の群から選択される。最も好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される。
【0037】
本発明はさらに、本発明による医薬組成物を投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法に関し、ここで、コンジュゲートの補欠分子族は、癌の治療に適した治療剤である。好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫の群から選択される。最も好ましい実施形態によれば、癌は、乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌の群から選択される。
【0038】
本発明はさらに、コンジュゲートの調製方法であって、
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体を提供する工程；
ｂ）任意にリンカー基を工程ａ）のクロロトキシン誘導体に結合させる工程；
ｃ）工程ｂ）で形成された化合物のリンカー部分に補欠分子族を結合させるか、またはリンカー非存在下で工程ａ）のタンパク質に直接結合させる工程を含む、方法に関する。
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体を提供する工程；
ｂ）任意にリンカー基を工程ａ）のクロロトキシン誘導体に結合させる工程；
ｃ）工程ｂ）で形成された化合物のリンカー部分に補欠分子族を結合させるか、またはリンカー非存在下で工程ａ）のタンパク質に直接結合させる工程を含む、方法に関する。
【0039】
本発明はさらに、癌性組織を可視化する方法であって、検査される組織を本発明のコンジュゲートに接触させる工程を含み、前記コンジュゲートの補欠分子族が癌性組織の可視化に適した可視化剤である、方法に関する。
【0040】
本発明は、さらに、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関し、ここで、キメラ抗原受容体は：
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体；
ｂ）任意に、クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）１つまたは２つの共刺激ドメイン；
ｅ）シグナル伝達ドメイン
を含み、
ここで、クロロトキシン誘導体は、キメラ抗原受容体がＴ細胞の表面に発現された場合に、Ｔ細胞の活性を癌性細胞に向けることを可能にする。
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体；
ｂ）任意に、クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）１つまたは２つの共刺激ドメイン；
ｅ）シグナル伝達ドメイン
を含み、
ここで、クロロトキシン誘導体は、キメラ抗原受容体がＴ細胞の表面に発現された場合に、Ｔ細胞の活性を癌性細胞に向けることを可能にする。
【0041】
好ましい実施形態によれば、本発明の核酸分子はキメラ抗原受容体をコードし、ここでクロロトキシン誘導体は、配列番号３～配列番号１８、および配列番号３６～配列番号４２、好ましくは配列番号４または配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される。
【0042】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の前記核酸分子はキメラ抗原受容体をコードし、ここで、
ｉ）膜貫通ドメインはＣＤ４膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、およびＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；
ｉｉ）１つまたは２つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインまたはそのバリアント、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはそのバリアント、およびОＸ４０共刺激ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；ならびに
ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントである。
ｉ）膜貫通ドメインはＣＤ４膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、およびＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；
ｉｉ）１つまたは２つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインまたはそのバリアント、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはそのバリアント、およびОＸ４０共刺激ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択され；ならびに
ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントである。
【0043】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【0044】
本発明はさらに、ヒト細胞の集団であって、
ｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むＲＮＡまたはＤＮＡベクターによりトランスフェクションされ、ここでトランスフェクションがｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる；または
ｉｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むウイルスベクターにより形質導入され、ここで形質導入がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ヒト細胞の集団に関し、
ここでウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであり；前記ヒト細胞は、自家ヒトＴ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、自家ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞との任意の割合の混合物、同種ヒトＴ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、自家初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、同種初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－９２細胞株の同種細胞、自家ヒト単球、自家ヒトマクロファージ、同種ヒト単球、同種ヒトマクロファージからなるリストから選択される。
ｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むＲＮＡまたはＤＮＡベクターによりトランスフェクションされ、ここでトランスフェクションがｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる；または
ｉｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むウイルスベクターにより形質導入され、ここで形質導入がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ヒト細胞の集団に関し、
ここでウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであり；前記ヒト細胞は、自家ヒトＴ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、自家ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞との任意の割合の混合物、同種ヒトＴ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、自家初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、同種初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－９２細胞株の同種細胞、自家ヒト単球、自家ヒトマクロファージ、同種ヒト単球、同種ヒトマクロファージからなるリストから選択される。
【0045】
本発明はさらに、本発明によるヒト細胞の１つまたは複数の集団を投与することを含む、患者の癌を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】ジスルフィドパターンも示すいくつかのＣＴＸバリアント／誘導体の配列を示し、ここでＣＴＸおよびｒＣＴＸの配列は配列番号１に記載され；ｍＣＴＸの配列は配列番号２に記載され；ＣＴＸＤ５の配列は配列番号４に記載され；ＣＴＸＤ８の配列は配列番号４２に記載されている。
【図2】モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）と形成されたＣＴＸＤ５の切断性細胞分裂阻害コンジュゲートを示す。
【図3】Ｃｏ－ｂｅａｄ試験におけるファージ提示ＣＴＸおよびＣＴＸＤのＭＭＰ－２およびＮＲＰ１結合強度を示す。
【図4】Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸのＣＴＸ－Ｃｙ５置換によるＭＭＰ－２結合親和性を示す。
【図5】Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ８－Ｃｙ５およびＣＴＸ－Ｃｙ５のＭＭＰ－２結合を示す。
【図6】Ｃｏ－ｂｅａｄ試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５の仮定標的タンパク質への結合を示す。
【図7】Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸ－Ｃｙ５のＮＲＰ１結合を示す。
【図8】Ｕ２５１細胞およびＰａｎｃ－１細胞におけるＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸ－Ｃｙ５の濃度－取込み関係を示す。
【図9】１：１のエフェクター対標的細胞比で、ＣＴＸＤ８－ＣＡＲおよびＣＴＸ－ＣＡＲならびに非形質導入（ＮＴ）対照Ｔリンパ球に曝露したＭＤＡ－ＨＥＲ２乳癌由来細胞の生存率を示す。
【図10】異なるエフェクター細胞数でＣＴＸＤ８－ＣＡＲおよびＣＴＸ－ＣＡＲならびに対照Ｔリンパ球に曝露したＭＤＡ－ＨＥＲ２乳癌由来細胞の生存率を示す。
【図11】ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0047】
本明細書の文脈において、「バリアント」、「クロロトキシンバリアント」または「ＣＴＸバリアント」という用語の下では、これらのタンパク質は、野生型ＣＴＸとは異なるタンパク質であり、当技術分野の一部であると理解される。
【0048】
本明細書の文脈において、「誘導体」、「クロロトキシン誘導体」、「ＣＴＸ誘導体」、または「ＣＴＸＤ」という用語の下では、これらのタンパク質は、本発明をもたらすプロジェクトの間に開発されたものと理解される。
【0049】
末尾に通し番号の付いたＣＴＸＤという用語は、クロロトキシン誘導体（タンパク質）または前記クロロトキシン誘導体を産生するファージクローンを指す。本明細書で言及される各特定のＣＴＸＤは、特定のアミノ酸配列を有する。例えば、本明細書におけるＣＴＸＤ５は配列番号４による配列を有するタンパク質を指し、本明細書におけるＣＴＸＤ１は配列番号１７による配列を有するタンパク質を指す。
【0050】
「癌」という用語は、異常な細胞が制御されずに分裂し、近傍の組織に浸潤し得る疾患に対して使用される（この定義は、本願特許出願日のｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ／ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｒｍｓ／ｄｅｆ／ｃａｎｃｅｒの記述に基づく）。癌細胞はまた、血液およびリンパ系を介して体の他の部分に広がることができる。癌にはいくつかの主な種類がある。癌腫は、皮膚または内臓を裏打ちするか、もしくは覆う組織から始まる癌である。肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、他の結合組織または支持組織から始まる癌である。白血病は、骨髄等の造血組織から始まり、異常な血液細胞が作られすぎる癌である。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞から始まる癌である。中枢神経系の癌は、脳および脊髄の組織から始まる癌である。癌は悪性腫瘍とも呼ばれる。
【0051】
「癌性」という用語では、哺乳動物またはヒトの患者の状態であって、癌を含む状態と理解される。
【0052】
「セラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）」という用語は、治療学（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と診断学（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の組合せに由来する。この用語は、診断技術と治療技術の特有の組合せを指し、これによって特定の診断技術と治療のための方法または製品との組合せが、適切な治療に感受性の患者、組織または細胞集団を同定するためのガイダンスを提供する［Ｊｅｅｌａｎｉ ２０１４］。
【0053】
本発明のクロロトキシン誘導体は、以下の一般的なアミノ酸配列：
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含み、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含み、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
【0054】
好ましい実施形態によれば、本発明は、一般的な配列のアミノ酸配列
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＴＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号３５）
を含むクロロトキシン誘導体に関し、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｉｉ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＴＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号３５）
を含むクロロトキシン誘導体に関し、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、
（ｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｉｉ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示す。
【0055】
配列表に示される配列番号３５および配列番号４３の全ての可能なバリエーションが本発明の範囲内に入るわけではなく、上記のクラスターの定義を満たすもののみが本発明の範囲内に入ることに留意されたい。
【0056】
一般的な配列である配列番号３５および配列番号４３は、それぞれ３つおよび４つの可変クラスターを有する。Ｎ末端のＮ末端クラスター（Ｘ０Ｘ１クラスター）、溶解性クラスター（ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスター、配列番号４３のみ）、内部クラスター（Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスター）、およびＣ末端のＣ末端クラスター（Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスター）がある。これらのクラスターは全て、特定の限られたアミノ酸組成を有する。しかし、クラスターの組成は互いに独立していることが明らかになった。
【0057】
Ｎ末端クラスターは２つの位置、すなわちＸ０およびＸ１の位置からなる。Ｎ末端クラスターの組成はＡＭ、０Ｍ、または００であり得る。ここで、Ａはアラニン（Ａｌａ）を表し、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）を表す。０はアミノ酸が存在しない位置を示す。したがって、Ｎ末端クラスターは、Ａｌａ－Ｍｅｔ二量体、またはＭｅｔ単量体のみを有していても、またはこのＮ末端クラスターは空のまま、すなわちこれらの位置にアミノ酸を有しないままであってもよい。
【0058】
溶解性クラスターは、Ｎ末端に近いＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスター（配列番号４３のみ）である。これは、ＸＳ１、ＸＳ２、ＸＳ３、ＸＳ４およびＸＳ５の５つの位置からなり、ここで、添字の「Ｓ」は「溶解性」の特徴を指す。溶解性クラスターを形成するアミノ酸は、必ずしも配列中で隣り合うアミノ酸とは限らず、２つのサブクラスター、すなわちＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３およびＸＳ４ＸＳ５が存在することは明らかである。溶解性クラスターは以下の組成：ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳを有し得る。例えば、ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５溶解性クラスターの組成がＦＴＴＱＴである場合、ＸＳ１位のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を示すＦであり、ＸＳ２、ＸＳ３およびＸＳ５位のアミノ酸はスレオニン（Ｔｈｒ）を示すＴであり、ＸＳ４位のアミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）を示すＱであると理解される。この溶解性クラスターに見出し得るさらなるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）を示すＥ、およびセリン（Ｓｅｒ）を示すＳである。
【0059】
内部クラスターはアミノ酸配列のほぼ中央にあるＸ２Ｘ３Ｘ４クラスターであり、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の３つの位置からなる。内部クラスターを形成しているアミノ酸は、配列の中で必ずしも隣り合うアミノ酸ではないことは明らかである。Ｘ２位とＸ３位のアミノ酸は隣接しているが、Ｘ４位のアミノ酸はＣ末端方向に位置が７つ離れている。内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは以下の組成：ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫを有し得る。例えば、内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターの組成がＤＫＲ（これは本発明の好ましい実施形態の１つである）と言われる場合、Ｘ２位のアミノ酸はアスパラギン酸（Ａｓｐ）を示すＤであり、Ｘ３位のアミノ酸はリジン（Ｌｙｓ）を示すＫであり、Ｘ４位のアミノ酸はアルギニン（Ａｒｇ）を示すＲであると理解される。この内部クラスターに見出し得るさらなるアミノ酸は、イソロイシン（Ｉｌｅ）を示すＩ、チロシン（Ｔｙｒ）を示すＹ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）を示すＨ、トリプトファン（Ｔｒｐ）を示すＷ、ロイシン（Ｌｅｕ）を示すＬ、およびグルタミン（Ｇｌｎ）を示すＱである。
【0060】
Ｃ末端クラスターは４つの位置、すなわちＸ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８からなる。Ｃ末端クラスターの組成は、Ｎ０００、Ｒ００Ｄ、ＮＲ００、ＮＲＧ０、またはＮＲＧＹであり得る。ここで、Ｎはアスパラギン（Ａｓｎ）を示し、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）を示し、Ｇはグリシン（Ｇｌｙ）を示し、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）を示す。０はアミノ酸が存在しない位置を示す。このＣ末端クラスターは、１つのアミノ酸ＮまたはＲのみを有することができ（すなわち、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８の意味がＮ０００またはＲ００Ｄである場合）、これらの場合、本発明のクロロトキシン誘導体は、Ｘ５位を有するＣ末端で終了することが明らかである。さらに、Ｃ末端クラスターは、２つのアミノ酸（すなわち、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８の意味がＮＲ００である場合）、または３つのアミノ酸（すなわち、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８の意味がＮＲＧ０である場合）、または４つのアミノ酸（すなわち、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８の意味が配列番号３５の場合にはＮＲＧＹであり、配列番号４３の場合にはＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲである場合）を有し得る。
【0061】
本発明の好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は、配列番号３～配列番号１８および配列番号３６～配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される。配列番号４３によって定義される化学的空間は、配列番号３～配列番号１８および配列番号３６～配列番号４２に記載の全てのクロロトキシン誘導体をカバーする。配列表の記載とは別に、これらの配列に対応するクロロトキシン誘導体を表Ｉおよび表ＩＩに示す。
【0062】
本発明のより好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は、配列番号３～配列番号１８に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される。配列番号３５によって定義される化学的空間は、配列番号３～配列番号１８に記載の全てのクロロトキシン誘導体をカバーする。配列リストとは別に、これらの配列に対応するクロロトキシン誘導体を表Ｉに示す。
【0063】
本発明のさらにより好ましい実施形態によれば、クロロトキシン誘導体は、配列番号４または配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する。配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質は、本明細書においてＣＴＸＤ５とも称する。配列番号４２のアミノ酸配列を有するタンパク質は、本明細書においてＣＴＸＤ８とも称する。
【0064】
本発明のクロロトキシン誘導体は環状タンパク質であり得る。タンパク質は、直鎖形態よりも環状化された方がより安定になり得ることは、当技術分野の当業者には周知である。上述のように、ＣＴＸの環状バリアントは悪性組織に結合する能力を維持していた［Ａｋｃａｎ ２０１１］。したがって、任意のクロロトキシン誘導体を環状化することができ、それによって半減期を長くできることは当技術分野の当業者には明らかに予想されることである。タンパク質の環状化方法は、当技術分野の当業者にとって周知である［Ｄｉ ２０１５］。本発明の範囲内において、用語「環状」は、それ自体で、またはリンカーを挿入することによって環状にされたクロロトキシン誘導体を指し、ただし、所与の環状化は、クロロトキシン誘導体の所望の効果、例えば、ＭＭＰ－２タンパク質に対するクロロトキシン誘導体の親和性に負の様式で有意に影響しないことを条件とする。
【0065】
本発明のクロロトキシン誘導体は、癌性細胞を効果的に認識および結合し得る。したがって、これらは、化学的実体を前記癌性細胞に送達するのに適しており、この化学的実体は、一旦癌性細胞によって結合されると、所望の機能を発揮することができる。本発明の範囲内において、「コンジュゲート」という用語の下では、構築物は、少なくともクロロトキシン誘導体および補欠分子族を含むものと理解される。本発明によれば、前記化学的実体は補欠分子族の形態である。本発明の範囲内において、「補欠分子族」という用語の下では、任意の化学的実体は、一次結合（すなわち共有結合またはイオン結合）を介して本発明によるクロロトキシン誘導体に結合するものと理解される。補欠分子族の範囲は、単一原子から大きなタンパク質まで及ぶことができる。
【0066】
補欠分子族は、好ましくは可視化剤である。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、本発明によるクロロトキシン誘導体は、補欠分子族とのコンジュゲートを形成しており、ここで補欠分子族は可視化剤である。それによって、このようなコンジュゲートは、前記クロロトキシン誘導体と結合する身体（例えば、ヒト身体）の部分を可視化するために使用し得る。可視化剤および特定のタンパク質への化学的結合のための方法は、当技術分野の当業者に公知である。本発明の意味で好ましい可視化剤は
ｉ）シアニン色素（例えばインドシアニングリーン）のような蛍光標識；
ｉｉ）１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉのヨウ素同位体のような放射性標識；
ｉｉｉ）これらのナノ粒子またはポリマーのいずれかはさらにガドリニウムを含む、ホウ素ナノ粒子、ホウ素および炭素ナノ粒子、炭化ホウ素ナノ粒子、ホウ素含有ポリマー、ホウ素および炭素含有ポリマー、炭化ホウ素ポリマーのような磁気共鳴イメージング標識；
ｉｖ）ビオチン、アビジン、ｈｉｓタグのような標識分子への高親和性結合による間接的標識を可能にする剤、である。
ｉ）シアニン色素（例えばインドシアニングリーン）のような蛍光標識；
ｉｉ）１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉのヨウ素同位体のような放射性標識；
ｉｉｉ）これらのナノ粒子またはポリマーのいずれかはさらにガドリニウムを含む、ホウ素ナノ粒子、ホウ素および炭素ナノ粒子、炭化ホウ素ナノ粒子、ホウ素含有ポリマー、ホウ素および炭素含有ポリマー、炭化ホウ素ポリマーのような磁気共鳴イメージング標識；
ｉｖ）ビオチン、アビジン、ｈｉｓタグのような標識分子への高親和性結合による間接的標識を可能にする剤、である。
【0067】
可視化剤が蛍光標識の場合、蛍光ガイド下外科手術に好ましいように使用し得る。この外科手術の過程で、本発明のコンジュゲートは、クロロトキシン誘導体部分を介してコンジュゲートと結合する細胞または組織の一部を可視化する。それにより、これらの細胞または組織の一部は、外科手術を実施する医師にとって可視化される。好ましくは、インドシアニングリーン、シアニン５．５、ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷ、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０またはＶｉｖｏＴａｇ－Ｓ ７５０を含むがこれらに限定されない近赤外色素をこの目的のために使用し得る。
【0068】
補欠分子族が蛍光標識である本発明のコンジュゲートを使用する他の好ましい例は、フローサイトメトリー法または組織学的染色プロセスの過程で標的細胞を解析する場合である。このような場合、本発明のコンジュゲートは診断剤として使用される。
【0069】
他の好ましい実施形態によれば、補欠分子族は治療剤である。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、本発明によるクロロトキシン誘導体は、補欠分子族とのコンジュゲートを形成しており、ここで補欠分子族は治療剤である。それによって、このようなコンジュゲートは治療のために使用することができ、ここで、コンジュゲートのクロロトキシン部分は癌組織を認識し、それに結合する。コンジュゲートの治療的部分は、それによって前記癌性組織に近接するか、またはその細胞に内在化し、治療効果を発揮する。治療剤および特定のタンパク質への化学的結合のための方法は、当技術分野の当業者に公知である。本発明の意味において好ましい治療剤は、
ｉ）アウリスタチン、クリプトフィシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン偽二量体、メイタンシン、メトトレキセート、ドセタキセル、シスプラチンおよびエトポシドのような化学療法剤；
ｉｉ）ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉのような生物学的治療剤である。
ｉ）アウリスタチン、クリプトフィシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン偽二量体、メイタンシン、メトトレキセート、ドセタキセル、シスプラチンおよびエトポシドのような化学療法剤；
ｉｉ）ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉのような生物学的治療剤である。
【0070】
モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）と形成されたコンジュゲートは、治療目的に適した本発明のコンジュゲートの例である（詳細については、例えば、以下の「化学的ツールボックス」、項目３．３．または実施例４を参照のこと）。
【0071】
さらに好ましい実施形態によれば、補欠分子族は標的化剤である。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、本発明によるクロロトキシン誘導体は、補欠分子族とコンジュゲートを形成しており、ここで補欠分子族は他の標的化剤である。それによって、標的細胞上の二重結合部位を有するこのようなコンジュゲートは、標的化された細胞または組織に対してさらに高い親和性を有する標的化分子を提供する。標的化剤および特定のタンパク質への化学的結合のための方法は、当技術分野の当業者に公知である。本発明の意味において好ましい標的化剤は、抗体、ポリペプチド、多糖および核酸である。
【0072】
他の好ましい実施形態によれば、補欠分子族は、循環半減期を増加させる部分である。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、本発明によるクロロトキシン誘導体は、補欠分子族とコンジュゲートを形成しており、ここで、補欠分子族は、循環半減期を増加させる部分である。これにより、このようなコンジュゲートは、ＣＴＸＤの代謝を緩和することができる。循環半減期を増加させる部分および特定のタンパク質への化学的結合の方法は、当技術分野の当業者に公知である。本発明の意味で循環半減期を増加させる好ましい部位は、ＰＥＧ部分、グリコシル部分、グリコシルＰＥＧ部分、およびリンカー延長を介して本発明のクロロトキシン誘導体の環状化を可能にする部分である。
【0073】
クロロトキシン誘導体および補欠分子族は一緒になって本発明のコンジュゲートを形成する。場合によっては、クロロトキシン誘導体と補欠分子族の間にリンカー部分を構築する必要がある。例えば、補欠分子族がクロロトキシン誘導体に直接化学的に結合できない場合には、リンカーを使用しなければならない。補欠分子族が、例えば癌性細胞のような標的部位に到達した時点で放出される必要がある場合には、特別に切断性のリンカーを使用することができる。リンカーは当技術分野の当業者に公知であり、リンカーの例はペプチド、ジメチルジスルフィドリンカー、グルタリルリンカー、カテプシン切断性リンカーである。当技術分野の当業者には明らかなように、特定のクロロトキシン誘導体－補欠分子族構築物において２つ以上のリンカーを使用することが可能である。
【0074】
１つまたは複数のリンカーが存在するにもかかわらず、いくつかの種類の補欠分子族は、その効果を発揮するためにクロロトキシン誘導体から離れて伸長される必要がある。この目的のために、クロロトキシン誘導体と補欠分子族の間に１つまたは複数のスペーサー（複数可）を適用することができる。スペーサー部分は、一次結合（すなわち、共有結合またはイオン結合）を介して、補欠分子族、リンカー、またはクロロトキシン誘導体に結合される。
【0075】
当技術分野の当業者には、補欠分子族、リンカーおよびスペーサーは場合によっては厳密に区別できないことがあり、それらの境界は場合によっては厳密ではないことは明らかである。例えば、いくつかの補欠分子族はリンカーとして機能し得るテール領域を有し得る。
【0076】
セラノスティック対は、本発明のコンジュゲートから選択することができる。これら２つのコンジュゲート、すなわち第１のコンジュゲートおよび第２のコンジュゲートは、同一であっても、または異なっていてもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、前記２つのコンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分は、同一のアミノ酸配列を有し、前記２つのコンジュゲートは、異なる補欠分子族を有する。
【0077】
「セラノスティック」という用語は、当技術分野の当業者に公知であるように、診断と治療応用の組合せを指す。簡潔に言えば、セラノスティック対のメンバーの一方は診断目的に適しており、セラノスティック対の他方のメンバーは治療目的に適している。
【0078】
セラノスティック対のメンバーは、空間的および／もしくは時間的に別々に、または同時に使用することができる。本発明のセラノスティック対は、典型的には同じクロロトキシン誘導体（すなわち同じアミノ酸配列）を有し、それによって両方のコンジュゲートが同じ癌性組織に結合する。しかしながら、本発明の典型的なセラノスティック対は、異なる補欠分子族を有し、一方は診断目的（例えば可視化剤のような）であり、他方は治療目的（例えば化学療法剤のような）である。当技術分野の当業者には明らかなように、本発明の同じコンジュゲートもまたセラノスティック対を形成することができ、ここで、前記コンジュゲートの補欠分子族は診断および治療の両方の特徴を有する。他方、本発明のセラノスティック対のメンバーは、クロロトキシン誘導体部分において異なるアミノ酸配列を有していてもよく、同様に異なる補欠分子族を有していてもよい。
【0079】
本発明はまた、本発明のコンジュゲートおよび使用説明書を含むキットに関する。本発明のコンジュゲートは、溶液または凍結乾燥物の形態でキットに提供することができる。使用説明書には、当技術分野の当業者が理解できるレベルでキットのコンジュゲートの使用が記載されている。使用説明書は、紙、電子データキャリアの形態であってもよく、またはオンラインで入手可能であってもよい。キットはさらに、溶液、緩衝液、試薬、実験器具の使い捨て部品を含むことができる。
【0080】
本発明はまた、本発明のセラノスティック対および使用説明書を含むキットに関する。本発明のセラノスティック対は、溶液または凍結乾燥物の形態でキット中に提供することができる。使用説明書には、当技術分野の当業者が理解できるレベルでキットのセラノスティック対の使用が記載されている。使用説明書は紙、電子データキャリアの形態であってもよく、またはオンラインで入手可能であってもよい。キットはさらに、溶液、緩衝液、試薬、実験器具の使い捨て部品を含むことができる。
【0081】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関し、ここで、前記コンジュゲートの補欠分子族は治療剤または可視化剤である。本発明の医薬組成物が治療に使用される場合、補欠分子族は治療剤とする。本発明の医薬組成物が可視化に使用される場合、補欠分子族は可視化剤とする。
【0082】
本発明の医薬組成物は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮または頬側経路で投与することができる。本医薬組成物は腫瘍の治療に適しているため、好ましい投与方法は、治療すべき腫瘍に局所的に適用される微量注入である。投与される医薬組成物の用量は、腫瘍の種類、患者の年齢、健康状態、および体重、任意の同時治療の種類、治療の頻度、ならびに達成される効果の性質に依存する。上記のデータを考慮して投与量を決定できるのは当業者である。典型的な投与量は、１．０ｐｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。全身投与のための好ましい投与量は、１００．０ｎｇ／ｋｇ体重～１０．０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。微量注入を介した部位への直接投与のための好ましい投与量は、１ｎｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【0083】
本発明の医薬組成物中の薬学的に許容される賦形剤は、作用部位への送達のために薬学的に使用できる製剤へのコンジュゲートの加工を容易にする。非経口投与に適した製剤としては、水溶性の形態（例えば、水溶性塩）のコンジュゲートの水溶液が挙げられる。さらに、コンジュゲートの懸濁液（例えば、油性注射懸濁液）を投与してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えばゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチル）またはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含むことができる。任意で、懸濁液は安定剤も含むことができる。腫瘍細胞への送達のためにコンジュゲートをカプセル化するためにリポソームを使用してもよい。
【0084】
本発明による全身投与用の医薬製剤は、経腸、非経口または局所投与用に製剤化することができる。溶液、懸濁液、ゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）または軟膏（ｓａｌｖｅ）等の任意の一般的な局所製剤を採用することができる。このような局所製剤の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ， １９９５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に記載されている。局所適用のために、医薬組成物はまた、粉末またはスプレーとして、特にエアロゾルの形態で投与し得る。医薬組成物は、吸入によって投与し得る。吸入療法のためには、コンジュゲートは、定量吸入器による投与に有用な溶液であっても、または乾燥粉末吸入器に適した形態であってもよい。医薬組成物は、気管支洗浄による投与にも適している。
【0085】
経口投与に適した製剤としては、硬質または軟質のゼラチンカプセル、丸剤、錠剤、例えばコーティング錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤または吸入剤、およびそれらの放出制御形態が挙げられる。
【0086】
本発明のＣＴＸＤコンジュゲートは、癌の診断、癌性組織の可視化、および癌の治療に使用することができる。これらの使用は全て、コンジュゲートが癌性組織／細胞に選択的に結合するという現象に基づいている。そのような細胞は、ＭＭＰ－２タンパク質を過剰発現している細胞であり得る。一度コンジュゲートが癌性細胞に結合すると、コンジュゲートの補欠分子族の機能に応じて、特異的結合を診断目的、可視化に使用したり、細胞を死滅させたりすることができる（すなわち、癌の治療）。診断的使用は、体内または上皮表面（皮膚または粘膜）上の癌性細胞／組織の存在を確認または位置決定すること、またはＣＴＸＤ受容体を標的化モチーフとして使用する特異的治療に感受性を示し得る癌性組織の種類を同定することのいずれかに役立ち得る。コンジュゲートが可視化剤を補欠分子族として有する場合、癌性組織を可視化することができる。可視化は、例えば蛍光ガイド下外科手術において、癌性細胞または組織を周囲の健常な（非癌性）細胞／組織と区別するのに役立ち得る。特定のタンパク質および適切な補欠分子族とのコンジュゲートによる癌性細胞および組織の診断、可視化、および治療は、当技術分野の当業者に周知である。
【0087】
本発明のコンジュゲートは、ＣＴＸ結合部位を発現する実質的に全ての種類の悪性癌の診断および治療に有用である。これらの種類の癌としては、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄芽腫、脈絡叢癌腫、上衣腫、髄膜腫、神経膠芽腫、ガングリオーマ、褐色細胞腫、および転移性脳腫瘍、他の脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、小細胞肺癌腫、乳癌、腸癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、肉腫（３０種類超）、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、リンパ腫、甲状腺癌、肛門癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、喉頭癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胃癌、精巣癌およびウィルムス腫瘍が挙げられる。本発明のコンジュゲートは、以下の群：乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節膠腫、神経節腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫および小細胞肺癌腫から選択される癌の治療および診断に特に有用である。本発明の実験では、したがって本発明による最も好ましい癌性組織である乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌細胞への本発明のＣＴＸＤの特に高い強度の取込みが証明された。
【0088】
本発明のコンジュゲートは、ＣＴＸ結合部位を発現する実質的に全ての種類の悪性癌の可視化に有用である。本発明のコンジュゲートは、癌性組織の可視化において特に有用であり、組織は以下の癌：乳癌、子宮頸癌、結腸癌、上衣腫、ユーイング肉腫、神経節腫、神経節膠腫、神経膠腫、神経膠肉腫、髄芽腫、髄膜腫、神経芽腫、黒色腫（原発性および転移性）、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、シュワン腫、小細胞肺癌腫に由来し；乳癌、神経膠芽腫、黒色腫および膵臓癌は、本発明による最も好ましい癌性組織である。
【0089】
本発明はさらに、癌に罹患している患者の治療方法に関する。この意味において、「患者」という用語の下では、任意の動物、例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスと理解される。本発明は、癌に罹患しているヒト患者の治療に特に有用である。前記方法は、有効量の本発明によるコンジュゲートを前記患者に投与することを含む。癌性患者の治療を目的とするコンジュゲートは、前記癌の治療に適した治療剤の補欠分子族を有する。好ましい実施形態において、治療方法に使用されるコンジュゲートは、本発明の医薬組成物の形態である。
【0090】
本発明の好ましい実施形態によれば、コンジュゲートで、または本発明の医薬組成物で治療される患者は、神経膠腫、膵臓癌、黒色腫および乳癌の群から選択される癌に罹患している。
【0091】
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートの調製方法に関する。この方法は、少なくとも以下の工程：
ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体を提供する工程；
ｂ）任意にリンカー基を工程ａ）のクロロトキシン誘導体に結合させる工程；
ｃ）補欠分子族を、工程ｂ）で形成された化合物のリンカー部分に結合させるか、またはリンカー非存在下で工程ａ）のタンパク質に直接結合させる工程を含む。
ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のクロロトキシン誘導体を提供する工程；
ｂ）任意にリンカー基を工程ａ）のクロロトキシン誘導体に結合させる工程；
ｃ）補欠分子族を、工程ｂ）で形成された化合物のリンカー部分に結合させるか、またはリンカー非存在下で工程ａ）のタンパク質に直接結合させる工程を含む。
【0092】
簡潔に言えば、調製方法の出発物質は本発明のクロロトキシン誘導体である（すなわち、工程「ａ」）。これらのタンパク質は、タンパク質を構成する通常のアミノ酸からなる単純なアミノ酸配列を構成するため、前記クロロトキシン誘導体の合成は、当技術分野の周知の方法および試薬を用いて実施することができる。
【0093】
調製方法の次の工程は任意であり、これは、コンジュゲート中のリンカーの存在が任意であるためである。すなわち、調製するコンジュゲートが、クロロトキシン誘導体と補欠分子族との間にリンカーを有するコンジュゲートである場合には、前記工程「ｂ」を実施しなければならない。リンカーは、当技術分野で周知の方法でタンパク質に結合させることができる。
【0094】
次の工程「ｃ」として、リンカー非存在下でクロロトキシン誘導体であるか、または工程「ｂ」の結果である構築物に補欠分子族を結合させる。補欠分子族のタンパク質への結合は、補欠分子族それ自体に強く依存する。しかし、このような構築物を構成することは当技術分野の当業者に公知である。
【0095】
コンジュゲートの調製方法は、単離、精製、解析等のような周知の工程をさらに含んでいてもよく、これらは全て当技術分野の当業者のタンパク質化学者にとって一般的に公知である。
【0096】
本発明はさらに、癌性組織を可視化する方法に関し、前記方法は、検査する組織を本発明のコンジュゲートに接触させる工程を含み、ここで、コンジュゲートの補欠分子族は、癌性組織の可視化に適した可視化剤である。このような組織は、ＭＭＰ－２タンパク質を過剰発現している組織であり得る。
【0097】
上記で詳述したように、本発明のコンジュゲートの補欠分子族が可視化剤である場合、前記コンジュゲートは、コンジュゲートのクロロトキシン誘導体部分が結合する組織を可視化するために使用し得る。この方法を行うことにより、クロロトキシン誘導体が癌性組織に特異的に結合する場合、前記癌性組織を可視化することができる。この方法により、腫瘍を可視化することができ、これは前記腫瘍の除去を目的とする外科手術に大いに役立つ。
【0098】
上記の可視化方法によって、特定の腫瘍を患者の体内で位置特定することができる。この方法は、特定の種類の腫瘍の局在が定かでない場合、または確認する必要がある場合に有用である。本発明によって提供される可視化および位置特定ツールを使用することにより、医師は癌性組織を除去する外科的工程の間、サポートされる。
【0099】
上述の可視化方法のさらなる有用な応用は、患者の体内に特定の腫瘍があるかどうかを調べるために前記患者を検査することである。すなわち、本発明は、本発明のコンジュゲートの選択的結合の助けによって癌性組織を検出することにより、癌の診断のための有用なツールを提供する。
【0100】
上記の可視化方法の他の有用な応用は、腫瘍細胞を位置決定することであり、これにより医師は腫瘍が患者から完全に除去されたかどうかを確認することができる。
【0101】
本発明はさらに、本発明によるクロロトキシン誘導体由来の細胞外ドメインを組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。クロロトキシンまたは類似の毒素を用いて構築されたＣＡＲは、国際特許出願である国際公開第ＷＯ２０１７／０６６４８１号広報に開示されている。クロロトキシンドメインを含むＣＡＲの合成方法、特徴および使用に関しては、この国際特許出願は当技術分野の当業者によって公知の情報として参照される。ＣＡＲは遺伝子改変Ｔ細胞の表面に発現する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するように方向転換することができる。
【0102】
簡潔に言えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞は、その特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することにより、様々な腫瘍細胞株を特異的に認識し、殺傷することができる。ＣＡＲは、分子標的への特異的かつ効率的な結合を提供する本発明によるクロロトキシン誘導体である細胞外ＴＡＡ認識／標的化ドメインと、Ｔリンパ球の効率的な活性化が可能な細胞内エフェクタードメイン（通常はＴＣＲゼータ（ＴＣＲζ）鎖）を発現する膜貫通型キメラタンパク質である［Ｊｕｎｅ ２０１８］。Ｔ細胞は、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入後に、対応する核酸によってコードされたＣＡＲを有する場合、ＣＡＲを発現することができる。
【0103】
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体、すなわちＣＡＲをコードする核酸が提供され、このＣＡＲは、少なくとも以下の構成要素：
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体；
ｂ）任意に、クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）１つまたは２つの共刺激ドメイン；
ｅ）シグナル伝達ドメイン；を含み、
ここで、クロロトキシン誘導体は、Ｔ細胞の表面上で発現される場合に、ＣＡＲをＴ細胞の活性を癌性細胞に向けることを可能にする。
ａ）本発明によるクロロトキシン誘導体；
ｂ）任意に、クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）１つまたは２つの共刺激ドメイン；
ｅ）シグナル伝達ドメイン；を含み、
ここで、クロロトキシン誘導体は、Ｔ細胞の表面上で発現される場合に、ＣＡＲをＴ細胞の活性を癌性細胞に向けることを可能にする。
【0104】
この構築物によれば、本発明の核酸によってコードされるＣＡＲは、本発明のクロロトキシン誘導体に対応する細胞外クロロトキシン誘導体ドメインを有する。このクロロトキシン誘導体は、細胞外認識ドメインとして機能する細胞外ドメインを形成するか、またはその一部である。その認識エレメントは標的細胞の細胞表面に存在する分子に特異的に結合する。細胞外認識ドメインは、ヒンジ（リンカーまたはスペーサーとしても公知である）および関連する膜貫通ドメインによって細胞内エフェクタードメインに連結されている。すなわち、膜貫通ドメインはＣＡＲを前記Ｔ細胞の膜に固定する。細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、その機能は当技術分野の当業者に周知である。
【0105】
細胞外ドメイン、言い換えれば細胞外認識ドメインは、本発明の１つまたは複数の、同じまたは異なるクロロトキシン誘導体を含み得る。好ましい実施形態によれば、ＣＡＲ構築物は１つのクロロトキシン誘導体を含む。
【0106】
クロロトキシン誘導体は、好ましくは、配列番号３～配列番号１８および配列番号３６～配列番号４２、好ましくは配列番号４または配列番号４２に記載の配列のいずれかを有するクロロトキシン誘導体から選択される。
【0107】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲ構築物は、任意に、クロロトキシン誘導体と膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域を含む。当技術分野の当業者に明らかなように、スペーサー領域は、ＣＡＲ構築物が適切に機能するために、膜貫通ドメインおよびクロロトキシン誘導体が互いの間に一定の空間的配置を有する必要がある場合に必要とされる。スペーサー領域の組成および長さは、抗原認識ドメインの可動性、ならびにＴ細胞と標的との間の物理的距離を決定する。スペーサー領域は、５～３００残基の長さのアミノ酸を含み得る。例えば、スペーサー領域はＩｇＧ（ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）またはＣＤ８ヒンジ領域を含み得る。
【0108】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲ構築物の膜貫通ドメインは、好ましくは、ＣＤ４膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはそのバリアント、およびＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択される［Ｆｕｊｉｗａｒａ ２０２０］。膜貫通ドメインに関連する「バリアント」という用語の下では、タンパク質は、システイン残基が改変されていないことを条件として、元のタンパク質と比較して１～５つのアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、欠失）を有すると理解される。
【0109】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲ構築物の共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインまたはそのバリアント、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはそのバリアント、およびＯＸ４０共刺激ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択されることが好ましい［Ｚｈｏｎｇ ２０１０］。共刺激ドメインに関する「バリアント」という用語の下では、タンパク質は、システイン残基が改変されていないことを条件として、元のタンパク質と比較して１～５つのアミノ酸改変（例えば置換）を有すると理解される。
【0110】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲ構築物のシグナル伝達ドメインは、好ましくはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントからなる群から選択される。シグナル伝達ドメインに関連する「バリアント」という用語の下では、タンパク質は、システイン残基が改変されていないことを条件として、元のタンパク質と比較して１～５つのアミノ酸改変（例えば置換）を有すると理解される。
【0111】
共刺激ドメインとシグナル伝達ドメインは、その間に短い（すなわち１０アミノ酸未満）リンカーアミノ酸配列を有し得る。
【0112】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲ構築物のクロロトキシン誘導体は、Ｔ細胞の表面上に発現された場合に、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性を癌性細胞、好ましくは膠芽腫細胞に方向転換することを可能にする。
【0113】
本発明の核酸は、当技術分野の当業者に公知の分子クローニングの標準的技術によって調製し、完全なコード配列に組み立てることができる。
【0114】
本発明はさらに、本発明のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を含むベクターに関する。ベクターは、プラスミド、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子であってもよく、これは、他の細胞において外来性遺伝物質を運ぶためのビヒクルとして使用される。この場合、前記外来性遺伝物質は、前記ＣＡＲ構築物をコードする本発明の核酸であり、前記他の細胞は、前記目的に適した特定の免疫細胞である（適した免疫細胞は、自家ヒトＴ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、自家ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、同種ヒトＴ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、自家初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、同種ヒト初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－９２細胞株の同種細胞、自家ヒト単球、自家ヒトマクロファージ、同種ヒト単球、同種ヒトマクロファージである）。このベクターは、前記免疫細胞をトランスフェクションし、それによって本発明の核酸分子を前記免疫細胞に導入するのに適している。トランスフェクションされた免疫細胞は、その後、前記ＣＡＲ構築物をその表面に発現することができる。ベクターの導入は、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬によって容易に行うことができる。外来性遺伝物質の宿主細胞への侵入および宿主細胞の遺伝物質への組込みは、ウイルスベクターによっても促進することができ、この場合、このプロセスはトランスフェクションの代わりに形質導入と呼ばれる。
【0115】
本発明はさらに、ヒト細胞の集団に関し、前記細胞は、ｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むＲＮＡまたはＤＮＡベクターによってトランスフェクションされ、ここでトランスフェクションはｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われるか；またはｉｉ）本発明の核酸を含む発現カセットを含むウイルスベクターによって形質導入され、ここで形質導入は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。形質導入の場合、ウイルスベクターは、好ましくはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、これは、この種類のウイルスベクターが広く使用されており、前記形質導入目的に有用であることが証明されているためである。形質導入の場合、本発明のヒト細胞の集団は、好ましくはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであるウイルスベクターによって形質導入され、前記ベクターは、本発明の核酸を含む発現カセットを含む。ここで、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、トランスフェクションの代わりに形質導入という用語が使用される。このウイルス形質導入されたヒト細胞の集団は、形質導入された細胞の表面に前記ＣＡＲ構築物を発現できるようになる。形質導入はｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。
【0116】
当技術分野の当業者にとって明らかなように、ｉｎ ｖｉｖｏという用語は、この文脈において、トランスフェクションまたは形質導入が、生きているヒトに存在する細胞上で行われることを意味する。当技術分野の当業者には明らかであるが、ｅｘ ｖｉｖｏという用語は、この文脈において、トランスフェクションまたは形質導入が、生きているヒトから抽出された細胞上で行われることを意味し、これらの細胞は、後に、前記生きているヒトに戻しても、または他の生きているヒトに導入してもよい。前記ヒト細胞は、以下のヒト細胞種：自家ヒトＴ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、自家ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、自家ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、同種ヒトＴ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、同種ヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と同種ヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の任意の割合の混合物、自家初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、同種初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－９２細胞株の同種細胞、自家ヒト単球、自家ヒトマクロファージ、同種ヒト単球、同種ヒトマクロファージからなるリストから選択するものとする。
【0117】
上記のリスト化した細胞は、本発明の目的に有用であるが、これは以下の理由によるものである：
ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に起因することが最も多く、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、そのヘルパー機能で知られており、サイトカイン産生を通じてＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増強することによって、本質的に細胞溶解活性を誘発することが証明されている［Ｚｈａｎｇ ２０２０］。
ｉｉ）キメラ抗原受容体改変ナチュラルキラー（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞ベースの免疫療法は、固形腫瘍、または血液悪性腫瘍のいずれかの癌免疫療法の文脈において、有望および先進的な選択肢であることが証明されている［Ｍａｒｏｆｉ ２０２１］。
ｉｉｉ）ＮＫ－９２細胞株は、非ホジキンリンパ腫患者由来であり、その特徴は末梢血から得られた活性化ヒト初代ＮＫ細胞に類似している。しかし、初代細胞の単離およびｅｘ ｖｉｖｏ増殖は困難である。したがって、ＮＫ－９２細胞株は、ＩＬ－２添加環境で容易に増殖できるため、貴重な代替を提供する。
ｉｖ）さらに、キメラ抗原受容体改変マクロファージは固形腫瘍組織に浸潤し、腫瘍微小環境（腫瘍細胞、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および他の常在非免疫細胞等）のほとんど全ての細胞成分と相互作用できることが証明されている［Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ２０２０］。単球は血液中に存在するマクロファージの前駆体と考えられている。
ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に起因することが最も多く、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、そのヘルパー機能で知られており、サイトカイン産生を通じてＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増強することによって、本質的に細胞溶解活性を誘発することが証明されている［Ｚｈａｎｇ ２０２０］。
ｉｉ）キメラ抗原受容体改変ナチュラルキラー（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞ベースの免疫療法は、固形腫瘍、または血液悪性腫瘍のいずれかの癌免疫療法の文脈において、有望および先進的な選択肢であることが証明されている［Ｍａｒｏｆｉ ２０２１］。
ｉｉｉ）ＮＫ－９２細胞株は、非ホジキンリンパ腫患者由来であり、その特徴は末梢血から得られた活性化ヒト初代ＮＫ細胞に類似している。しかし、初代細胞の単離およびｅｘ ｖｉｖｏ増殖は困難である。したがって、ＮＫ－９２細胞株は、ＩＬ－２添加環境で容易に増殖できるため、貴重な代替を提供する。
ｉｖ）さらに、キメラ抗原受容体改変マクロファージは固形腫瘍組織に浸潤し、腫瘍微小環境（腫瘍細胞、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および他の常在非免疫細胞等）のほとんど全ての細胞成分と相互作用できることが証明されている［Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ２０２０］。単球は血液中に存在するマクロファージの前駆体と考えられている。
【0118】
ヒト細胞の前記集団は、本発明の核酸を含む発現カセットを含む前記ベクターによってトランスフェクションまたは形質導入される。本発明のヒト細胞の集団は、発現カセットの形態で本発明の核酸を担持する。これらのヒト細胞は、治療するヒト患者から適切な細胞を単離し、これらの適切なヒト細胞を、前記核酸を含む発現カセットを含むベクターでトランスフェクションまたは形質導入することにより作製することができる。トランスフェクションまたは形質導入はｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。
【0119】
本発明はさらに、患者の癌を治療する方法に関する。この方法は、本発明のヒト細胞の集団を投与する工程を含む。本発明によれば、患者の癌を治療する目的で、本発明のヒト細胞の異なる集団の組合せを投与することもできる。
【0120】
癌を治療する方法は、例えば、本発明の核酸を含む発現カセットを含むベクターによって形質導入された自家または同種ヒトＴ細胞の集団を投与する工程を含む。
【0121】
癌を治療する方法は、例えば、本発明の核酸を含む発現カセットを含むベクターにより形質導入された自家もしくは同種ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ－９２細胞株の集団を投与する工程を含む。
【0122】
この方法は、本発明の核酸を含む発現カセットを含むベクターにより形質導入された自家または同種ヒト単球またはマクロファージの集団を投与する工程を含む。
【0123】
本発明者らのアプローチ（本発明へのプロセス）
本発明者らの目標は、腫瘍細胞を健常組織の細胞と区別するために使用される、ＭＭＰ－２に対する親和性および選択性が改善された新しいＣＴＸ誘導体を見出すことであった。ＭＭＰ－２がＣＴＸの真の結合タンパク質の標的であることは、背景となる科学から強く示唆されていたが、この知見は組換え産生されたＭＭＰ－２を用いたプルダウンアッセイではこれまで確認されていなかった［Ｖｅｉｓｅｈ ２００７］。そこで、本発明者らは最初に、組換え産生された精製ＭＭＰ－２タンパク質へのＣＴＸの結合を評価するための定量的フローサイトメトリー方法である「Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験」を確立した。この新規の試験を用いて、本発明者らは、フルオロフォア標識ＣＴＸが、抗ＭＭＰ－２抗体によってビーズに固定されたＭＭＰ－２でカバーされたビーズに特異的に結合することを確認した。この結合は、ビーズ上に蓄積した蛍光強度の測定によって検出され、標識ＣＴＸのインキュベーション濃度を上昇させることによって飽和し、過剰量の非標識ＣＴＸとインキュベーションすることによって完全に消失（「置換」）され、したがって、これによって、ＭＭＰ－２タンパク質上のＣＴＸ受容体に特異的に結合することが示されている。
本発明者らの目標は、腫瘍細胞を健常組織の細胞と区別するために使用される、ＭＭＰ－２に対する親和性および選択性が改善された新しいＣＴＸ誘導体を見出すことであった。ＭＭＰ－２がＣＴＸの真の結合タンパク質の標的であることは、背景となる科学から強く示唆されていたが、この知見は組換え産生されたＭＭＰ－２を用いたプルダウンアッセイではこれまで確認されていなかった［Ｖｅｉｓｅｈ ２００７］。そこで、本発明者らは最初に、組換え産生された精製ＭＭＰ－２タンパク質へのＣＴＸの結合を評価するための定量的フローサイトメトリー方法である「Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験」を確立した。この新規の試験を用いて、本発明者らは、フルオロフォア標識ＣＴＸが、抗ＭＭＰ－２抗体によってビーズに固定されたＭＭＰ－２でカバーされたビーズに特異的に結合することを確認した。この結合は、ビーズ上に蓄積した蛍光強度の測定によって検出され、標識ＣＴＸのインキュベーション濃度を上昇させることによって飽和し、過剰量の非標識ＣＴＸとインキュベーションすることによって完全に消失（「置換」）され、したがって、これによって、ＭＭＰ－２タンパク質上のＣＴＸ受容体に特異的に結合することが示されている。
【0124】
精製ＭＭＰ－２が単独で、すなわち必ずしもタンパク質複合体中ではなくとも、ＣＴＸと特異的に結合することが確認されたため、本発明者らはより強力なＭＭＰ－２結合ＣＴＸＤのスクリーニングプログラムを開始した。この目的のために、本発明者らは、デザイナー毒素プラットフォーム技術を適用した［Ｔａｋａｃｓら， ２００９］。この技術は、１９８５年にＧ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈが発明したファージ提示と呼ばれる方法［Ｓｍｉｔｈ １９８５］を用いて、既存の毒素タンパク質配列を利用して、糸状バクテリオファージＭ１３の表面に提示される毒素タンパク質のライブラリーを作成し、高親和性結合体を反復選択によって同定するものである。本発明者らは、ＣＴＸのジスルフィド架橋のパターンを保持したまま、３２種のサソリに由来する１，３７６，２５４の順列誘導体のライブラリーを設計および構築した。提示されたタンパク質は、ＧＳＡＳＳＡ（ペプチド配列）リンカーを介してＣ末端でＰ３コートタンパク質に融合した。本発明者らは、このライブラリーをヒト組換えＭＭＰ－２に対してスクリーニングし、ＣＴＸよりもＭＭＰ－２に強く結合する新規化合物（以下、ＣＴＸＤ１または配列番号１７と称する）を同定した。
【0125】
ファージ上に提示されたタンパク質の相対的結合強度を定量的に評価するために、本発明者らは「コバルトビーズ試験」または簡潔には「Ｃｏ－ｂｅａｄ試験」と呼ばれる新しいフローサイトメトリーベースのアッセイを開発した（未発表）。このアッセイは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の原理にしたがって、ｈｉｓタグ化タンパク質を単離することを目的とした、工場で事前に製造されたコバルトコートビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤｙｎａｂｅａｄｓ－Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＆ Ｐｕｌｌｄｏｗｎ）の使用に基づいている。これらのビーズによって、異なるｈｉｓタグ化標的タンパク質をその表面に固定化し、それによってファージのＭ１３抗原に対する蛍光染色の後、標的タンパク質に結合したリガンドペプチドを提示するファージ粒子の量を評価することが可能になった。この方法によって、合成または組換え産生された精製およびフルオロフォア標識されたリガンドペプチドの、様々なｈｉｓタグ化標的タンパク質への結合を調べることも可能になった。この新規フローサイトメトリーベースの方法の詳細は、実施例５に記載されており；Ｃｏ－ｂｅａｄ試験で試験したファージの調製は、実施例７に記載されている。
【0126】
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験の支援を用いて、構造活性関係（ＳＡＲ）を明らかにするために、ＣＴＸＤ１の配列から始まる意識的変異導入試験を行い、参照としてＣＴＸ提示ファージと比較して、異なるＣＴＸＤ提示ファージのＭＭＰ－２結合の優劣（「相対的結合」）を定量化した。相対的結合は、等濃度のＣＴＸＤおよびＣＴＸ発現ファージとインキュベートし、Ｍ１３抗原検出のための染色を行った後、ＭＭＰ－２でコーティングしていないビーズからの蛍光シグナルに対する、ＭＭＰ－２でコーティングしたビーズ上のＭ１３関連蛍光増加の相対量を測定することにより評価した。これらのＳＡＲ試験で検討したアミノ酸配列およびその結果を表Ｉに示す。
【表1】
【0127】
ＣＴＸ自体よりも実質的に強力な結合体ではないＣＴＸＤタンパク質は、配列番号１９～配列番号３４に列挙されている。配列の中間の「－」は、配列を互いに整列させるための見かけ上の単なるギャップである。「Ｎ＝」は、相対的ＭＭＰ－２結合の測定回数を指し、「相対的ＭＭＰ－２結合」は、Ｎ回行われた実験に基づく平均である。配列番号４によりコードされるタンパク質は、本明細書においてＣＴＸＤ５と称し、配列番号１７によりコードされるタンパク質はＣＴＸＤ１と称する。
【0128】
モノリジンＣＴＸＤタンパク質は、標識または標的化送達のための、コンジュゲート生成物の目的に有利である可能性があるため、最初に、本発明者らは、３つのリジン残基のうち２つを置換することによって、ＣＴＸＤ１の様々なモノリジン誘導体を検討した。驚くべきことに、ＣＴＸＤ１のモノリジン誘導体の中で、ＣＴＸＤ１よりも実質的に強力なＭＭＰ－２結合性体である７つの誘導体（配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６）を発見した。次に、本発明者らは、ジスルフィド架橋パターンを維持しながら、観察された優れたＭＭＰ－２結合強度に不可欠な最小タンパク質長を決定することを目的とした。そのため、ＣＴＸＤ５をさらなる改変について選択し、最初のシステイン残基までのＮ末端およびＣ末端の切断（欠失変異）の影響を調べた。Ｃ末端を段階的に切断しても、最後のシステインに続くグルタミンが除去されるまでは、ＣＴＸ誘導体の優れた結合能が失われることはないと考えられ、これは図３に示されている。この図面において、棒グラフは、Ｃｏ－ｂｅａｄ試験を用いたファージ提示試験によって示される、ＭＭＰ－２およびＮＲＰ１標的タンパク質に対するＣＴＸおよび異なるＣＴＸＤ５誘導体の異なる結合強度および選択性を示す。この実験はＣＴＸＤ５のＣ末端改変の影響を調べることを目的としていたため、試験したＣＴＸおよびＣＴＸＤ５由来のタンパク質の最後のシステイン残基から始まる異なるＣ末端配列も示す。対照ビーズ（ＣＯＮＴ）はファージには暴露しなかったが、標的タンパク質でコーティングされ、全染色手順に供した。他のビーズは、均一なファージ濃度２．６×１０１４ファージ粒子／ｍＬで、示すペプチド提示ファージに暴露した。
【0129】
Ｃ末端切断変異体を用いた本発明の定量的ファージ結合試験は、ＮＲＰ１タンパク質への結合の測定にも拡張されたが、これは、ＭｃＧｏｎｉｇｌｅらの論文［ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ ２０１９］が、ｒＣＴＸのＣ末端部分がＮＲＰ１との結合において重要な役割を果たすことを示唆しているためである。その結果、ファージ提示されたＣＴＸは、ＭＭＰ－２とＮＲＰ１の両方に対してほぼ同等の結合を示したが、ＣＴＸＤ５およびその切断変異体は、Ｃ末端部分をシステイン残基まで切断した場合を除いて、ＭＭＰ－２に対して選択的であり、ＮＲＰ１には結合しなかった。しかし、システイン以降のアミノ酸を全て欠失させると、ＮＲＰ１との結合が再び出現し、相対的に減少したＭＭＰ－２結合（図３）またはＣＴＸのＮＲＰ１結合とほぼ同等のレベルに達した。したがって、これらのファージ提示の結果は、ＣＴＸＤ５、およびシステインで終わるものを除いたその切断誘導体は、ＣＴＸよりもＭＭＰ－２に対する強い結合体であるだけでなく、ＮＲＰ１に対する結合に比べてＭＭＰ－２に対して選択的であることを示していた。ファージ提示試験からのこの予測は、組換え産生された純粋なＣＴＸＤ５タンパク質物質を調べることによっても確認された（下記参照）。
【0130】
ＣＴＸＤ５（すなわち配列番号４）のＮ末端アミノ酸を１つまたは２つ欠失させると、それぞれ配列番号６および配列番号８のクロロトキシン誘導体が得られた（表Ｉ参照）。しかし、これらの変異は、得られたクロロトキシン誘導体の結合強度を有意に変化させなかった。
【0131】
ＣＴＸＤ１（すなわち配列番号１７）のＮ末端アラニンの欠失は、配列番号１８のクロロトキシン誘導体をもたらした。この変異はまた、得られたタンパク質の結合強度を有意に変化させなかった。
【0132】
ファージ提示された化合物の標的タンパク質結合の定量的評価から得られたＳＡＲの結果に基づいて、一連のクロロトキシン誘導体が同定され、これらの誘導体は、ＣＴＸまたはｍＣＴＸよりも、ＭＭＰ－２に対する結合の点で実質的に強力であり、標的タンパク質選択性の点でもより選択的であり、これは、正常細胞／組織と比較して腫瘍細胞／組織に対する選択性の向上をもたらし得る。
【0133】
ファージ提示試験から予測されるタンパク質の特徴を確認するため、ＣＴＸＤ５を組換え産生し、精製クロロトキシン誘導体として得た。ＣＴＸＤ５をリード化合物として用い、本発明者らは、単独またはコンジュゲート形態のいずれかのＣＴＸおよび／またはｍＣＴＸと比較して、その標的タンパク質および細胞結合特性を特性評価した。しかし、このリード化合物の水溶性は中程度であり、様々なコンジュゲーションによりさらに低下し得るため、非経口使用のための診断薬剤または治療薬剤の製剤化の阻害要因となる可能性があった。
【0134】
そこで本発明者らは、リード化合物である配列番号４（ＣＴＸＤ５）および配列番号１０の計画的溶解性向上変異の影響を調べた。公開された科学文献データ［Ｔｒｅｖｉｎｏ ２００７］に基づき、７位および１２位のアミノ酸位置から始まるＦＴＴおよびＱＴの配列をそれぞれＳＳＳおよびＥＳの配列に置換し、さらにＣ末端領域にポリアルギニン配列を適用することで、リード化合物のＭＭＰ－２親和性を増強させたまま、得られたＣＴＸＤタンパク質の溶解性を有意に改善し得ると仮定した。新しい溶解性増強変異体のＭＭＰ－２親和性を評価するために、本発明者らは上記のように、ＣＴＸ提示ファージに対して、異なる溶解性向上ＣＴＸＤ提示ファージのＭＭＰ－２結合の優位性（「相対的ＭＭＰ－２結合」）を定量化した。この相対的ＭＭＰ－２結合に関する、この溶解性増強変異体ファージ－提示試験の結果を表ＩＩに示す。
【表2】
【0135】
その結果、設計した溶解性増強変異体は全て、ＣＴＸの約３倍、またはそれよりもやや高い結合強度を示していたことから、高いＭＭＰ－２結合性を維持していた。そこで、本発明者らは、試験した全ての溶解性増強変異体を含むタンパク質（配列番号４２）を二次リード化合物として試験物質産生用に選択し、ＣＴＸＤ８と命名した。ＣＴＸＤ５を一次リード化合物として、ＣＴＸＤ８を二次リード化合物として使用し、本発明者らは、単独またはコンジュゲート形態でＣＴＸおよび／またはｍＣＴＸと比較して、標的タンパク質および細胞結合特性を特性評価した。
【0136】
これらの検討のための化学的ツールボックスには以下の化合物が含まれていた。
【0137】
【0138】
合成ＣＴＸはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ（ドイツ）から購入した。ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸは実施例１に記載するように組換え産生した。
【0139】
２．非コンジュゲートＣＴＸＤ誘導体：
ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、実施例１に記載するように組換え産生した。
ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、実施例１に記載するように組換え産生した。
【0140】
３．コンジュゲートＣＴＸおよびＣＴＸＤ誘導体
以下のコンジュゲーション生成物は、購入、または上記の非コンジュゲートＣＴＸおよびクロロトキシン誘導体との化学反応をコンジュゲートすることによって産生した。
以下のコンジュゲーション生成物は、購入、または上記の非コンジュゲートＣＴＸおよびクロロトキシン誘導体との化学反応をコンジュゲートすることによって産生した。
【0141】
３．１． シアニン－５（－Ｃｙ５）コンジュゲート
本発明者らは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ｒＣＴＸ－Ｃｙ５、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５を本試験で用いた。これらは全て、ＨＰＬＣ分離により選択されたモノコンジュゲートＣＴＸ誘導体であった。ＣＴＸ－Ｃｙ５およびｒＣＴＸ－Ｃｙ５は、ＣＴＸの３つのリジン残基のうちの１つでランダムにモノコンジュゲートした分子の混合物であった。ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびｍＣＴＸの場合は、１つのリジン残基のみで連結したコンジュゲートを分離して使用した。コンジュゲーション反応は、実施例２に記載したように、シアニン５ ＮＨＳエステルを適用した。
本発明者らは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ｒＣＴＸ－Ｃｙ５、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５を本試験で用いた。これらは全て、ＨＰＬＣ分離により選択されたモノコンジュゲートＣＴＸ誘導体であった。ＣＴＸ－Ｃｙ５およびｒＣＴＸ－Ｃｙ５は、ＣＴＸの３つのリジン残基のうちの１つでランダムにモノコンジュゲートした分子の混合物であった。ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびｍＣＴＸの場合は、１つのリジン残基のみで連結したコンジュゲートを分離して使用した。コンジュゲーション反応は、実施例２に記載したように、シアニン５ ＮＨＳエステルを適用した。
【0142】
３．２．Ａｌｅｘａ ４８８（－Ａ４８８）コンジュゲート
ＣＴＸのＣＴＸ－Ａ４８８コンジュゲートを、異なるＣｙ５標識および非標識のＣＴＸおよびＣＴＸＤリガンドの置換強度（親和性）を、他の（Ｃｙ５）フルオロフォアとの干渉なしに比較評価できるように、十分に異なる励起／発光波長で作用する蛍光標識リガンドとして適用した。Ａ４８８およびＣｙ５の励起／発光極大は、それぞれ４９５／５１９および６４７／６６５である。
ＣＴＸのＣＴＸ－Ａ４８８コンジュゲートを、異なるＣｙ５標識および非標識のＣＴＸおよびＣＴＸＤリガンドの置換強度（親和性）を、他の（Ｃｙ５）フルオロフォアとの干渉なしに比較評価できるように、十分に異なる励起／発光波長で作用する蛍光標識リガンドとして適用した。Ａ４８８およびＣｙ５の励起／発光極大は、それぞれ４９５／５１９および６４７／６６５である。
【化1】
【0143】
３．３．モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）をペイロードとして有する切断性細胞分裂阻害コンジュゲート
広く用いられているバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＶＣ－ＰＡＢＣ）ジペプチドリンカーは、リソソーム分解経路の細胞内プロテアーゼであるカテプシンＢによって優先的に切断され得る特異的標的化抗体へのペイロード薬剤の安定的な共有結合を維持する方法として普及してきた［Ｄｏｒｏｎｉｎａ ２００８］。ｍＣＴＸと比較した、ＣＴＸＤ５のこの種の標的化有用性を示すために、本発明者らはグルタリルリンカーを介して標的化タンパク質に結合した切断性細胞分裂阻害コンジュゲートを合成した。ｍＣＴＸ－グルタリル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－ＭＭＡＦ（ｍＣＴＸ－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）およびＣＴＸＤ５－グルタリル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－ＭＭＡＦ（ＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）の両方を、ｌｘコンジュゲートおよび２ｘコンジュゲートの両方の形態、すなわちｍＣＴＸ（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２およびＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２が、最終精製工程で回収されるように合成した。第２のコンジュゲーション部位はＮ末端アミンである。Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦコンジュゲートの合成は実施例４に記載されている。
広く用いられているバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＶＣ－ＰＡＢＣ）ジペプチドリンカーは、リソソーム分解経路の細胞内プロテアーゼであるカテプシンＢによって優先的に切断され得る特異的標的化抗体へのペイロード薬剤の安定的な共有結合を維持する方法として普及してきた［Ｄｏｒｏｎｉｎａ ２００８］。ｍＣＴＸと比較した、ＣＴＸＤ５のこの種の標的化有用性を示すために、本発明者らはグルタリルリンカーを介して標的化タンパク質に結合した切断性細胞分裂阻害コンジュゲートを合成した。ｍＣＴＸ－グルタリル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－ＭＭＡＦ（ｍＣＴＸ－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）およびＣＴＸＤ５－グルタリル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－ＭＭＡＦ（ＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）の両方を、ｌｘコンジュゲートおよび２ｘコンジュゲートの両方の形態、すなわちｍＣＴＸ（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２およびＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２が、最終精製工程で回収されるように合成した。第２のコンジュゲーション部位はＮ末端アミンである。Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦコンジュゲートの合成は実施例４に記載されている。
【0144】
ＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦコンジュゲートの構造を図２に示す。この構築物は、本発明のコンジュゲートの好ましい例である。すなわち、クロロトキシン誘導体部分はＣＴＸＤ５（配列番号４）である。このコンジュゲートは２つのリンカー、すなわちグルタリルリンカーおよびカテプシン切断性リンカーを有する。これはさらにスペーサーを有する。このコンジュゲートの補欠分子族はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
【0145】
３．４．ビオチンコンジュゲートＣＴＸおよびＣＴＸ誘導体
ビオチン化ＣＴＸおよびＣＴＸＤ５は細胞化学および組織化学の用途に使用された。ランダムにモノビオチン化したＣＴＸはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ（ドイツ）から購入した。モノビオチン化ＣＴＸＤ５は、慣用的なビオチン化手順で作製し、唯一のリジン残基におけるモノコンジュゲートをＨＰＬＣで精製し、実施例３に記載したように凍結乾燥した。
ビオチン化ＣＴＸおよびＣＴＸＤ５は細胞化学および組織化学の用途に使用された。ランダムにモノビオチン化したＣＴＸはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ（ドイツ）から購入した。モノビオチン化ＣＴＸＤ５は、慣用的なビオチン化手順で作製し、唯一のリジン残基におけるモノコンジュゲートをＨＰＬＣで精製し、実施例３に記載したように凍結乾燥した。
【0146】
標的化分子としてのＣＴＸと比較したＣＴＸＤ５のプロファイリング
本発明者らは、上記の詳細な化学的ツールボックスの化合物を用いて、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８および関連する例のコンジュゲートの主要な特徴を調べ、ＣＴＸと、いくつかの局面ではｍＣＴＸおよびそれらのコンジュゲートと比較した。
本発明者らは、上記の詳細な化学的ツールボックスの化合物を用いて、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８および関連する例のコンジュゲートの主要な特徴を調べ、ＣＴＸと、いくつかの局面ではｍＣＴＸおよびそれらのコンジュゲートと比較した。
【0147】
選択した標的タンパク質に対する試験物質の結合親和性を調べるために、Ｃｏ－ｂｅａｄ試験に加えて、フローサイトメトリーベースの他のアッセイである「Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験」を確立した。この試験は、標的タンパク質をビーズ表面に固定化するために特異的抗体を使用し、Ｃｏ－ｂｅａｄ試験と比較して利点および欠点を有する。利点は、感度がより高いこと、すなわち低有効濃度で作用すること、およびブロッキングインキュベーション工程なしで、非特異的結合のレベルが有意ではないことである。欠点は、ファージ提示されたタンパク質の結合試験、または固定化された標的タンパク質の広範のパネルに対する標識リガンドの結合の均一な調査には適用できないことであった。Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験は、２つの異なる試験モード、すなわち結合および置換で、リガンドの親和性を調べるために使用した。ＣＴＸ受容体に対するフルオロフォア標識リガンドの親和性を評価するためには、「結合モード」が適用され、それによって様々な標識リガンド濃度でインキュベートした後の蛍光強度から、結合リガンドの量を直接推定した。非標識リガンドのＣＴＸ受容体に対する親和性を評価するために、「置換モード」が適用され、これによって、試験した非標識リガンドと事前インキュベートおよび共インキュベートした後、ビーズを一定濃度の標識リガンド（１μＭ ＣＴＸ－Ｃｙ５）に曝露し、結合した蛍光を測定した。非標識リガンドの相対的親和性は、試験リガンドの５０％置換濃度（ＩＣ５０値）を特性評価する濃度置換試験によって推定した。ＭＭＰ－２およびＮＲＰ１タンパク質に対する標識および非標識ＣＴＸおよびＣＴＸＤの結合親和性の比較測定のためのＭａｇｎａｂｅａｄ試験の詳細なプロトコルは、実施例６に記載されている。
【0148】
ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸと比較したＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＭＭＰ－２結合親和性
ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸの結合親和性を、１μＭの標識リガンドＣＴＸ－Ｃｙ５を置換することによって得られた非標識リガンドの濃度応答試験によって比較した（図４）。図４は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験における置換リガンドとしての１μＭ ＣＴＸ－Ｃｙ５に対するＣＴＸ、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８の濃度－置換関係を示しており、ＭＭＰ－２タンパク質に対する親和性の違いを示している。結果は、２つの化合物を比較した２つの独立した実験の平均±ＳＤ、および平均値に対するシグモイド曲線フィッティングとして示す。
ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸの結合親和性を、１μＭの標識リガンドＣＴＸ－Ｃｙ５を置換することによって得られた非標識リガンドの濃度応答試験によって比較した（図４）。図４は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験における置換リガンドとしての１μＭ ＣＴＸ－Ｃｙ５に対するＣＴＸ、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８の濃度－置換関係を示しており、ＭＭＰ－２タンパク質に対する親和性の違いを示している。結果は、２つの化合物を比較した２つの独立した実験の平均±ＳＤ、および平均値に対するシグモイド曲線フィッティングとして示す。
【0149】
ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸの結合親和性は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＭＭＰ－２からの１μＭ ＣＴＸ－Ａ４８８の置換によっても比較された。結果を表ＩＩＩに示す。
【表3】
【0150】
後者の実験では、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸに対する比較も行った。標識ＣＴＸの結合の強度は、５つのリガンド全てによって濃度依存的に置換された。阻害はシグモイド濃度応答関係をたどり、完全な置換に達したことから、５つのタンパク質リガンドに共通の結合部位があることが示唆された。しかし、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、ＣＴＸよりも４．４倍強力に標識リガンドＣＴＸ－Ｃｙ５を置換し、それぞれＩＣ５０値は０．１６μＭ、０．１６μＭ、および０．７１μＭであった（図４参照）。ＣＴＸ－Ａ４８８置換試験によれば、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸのＩＣ５０値は、ＣＴＸと実質的には異ならず、それぞれＩＣ５０値は０．６８μＭ、０．７７μＭおよび０．６８μＭであった。したがって、この結果から、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＭＭＰ－２結合親和性が、ファージ提示試験から予測されるように、ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸとほぼ同等の高さであることが確認された。
【0151】
コンジュゲート誘導体ＣＴＸＤ５、ＣＴＸおよびｍＣＴＸのＭＭＰ－２結合親和性
ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ８－Ｃｙ５およびＣＴＸ－Ｃｙ５の結合親和性は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるこれらの標識リガンドのＭＭＰ－２への結合の濃度応答試験により比較した（図５）。この図は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８フルオロフォア標識リガンドのＭＭＰ－２結合濃度－蛍光の関係を示しており、これらのフルオロフォア標識リガンドのＭＭＰ－２タンパク質に対する親和性の違いを示している。結果は、３つの化合物を比較した３回の独立実験の平均±ＳＤおよび平均値に対するシグモイド曲線フィッティングで示す。濃度応答関係はシグモイド曲線によくフィットし、同程度のレベルで飽和に達したことから、ＭＭＰ－２上のほぼ同数の結合部位に結合することが示唆された。ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５は、ＣＴＸ－Ｃｙ５よりも３．７倍および３．１倍強力であり、それぞれＥＣ５０値は０．１５μＭ、０．１８μＭ、および０．５６μＭであった。これらの結果は、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸのコンジュゲートリガンドは全て、非標識タンパク質の親和性を維持していることを示している。この結論は、ＣＴＸ－Ａ４８８（１μＭ）が標識リガンドである置換試験でも確認され、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５のＩＣ５０値は、それぞれ２２μＭ、１８μＭ、１８μＭ、および１８μＭであった。比較のため、ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸの非標識およびＣｙ５標識誘導体も検討した（表ＩＩＩ参照）。その結果、ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸのＭＭＰ－２親和性には実質的な差はなく、Ｃｙ５コンジュゲートは類似の、またはわずかに高い親和性を示したが、標識タンパク質と非標識タンパク質の間で最も大きな差が認められ、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５のＩＣ５０値は、ｍＣＴＸの０．７７μＭに対し、０．４０μＭであった。
ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ８－Ｃｙ５およびＣＴＸ－Ｃｙ５の結合親和性は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるこれらの標識リガンドのＭＭＰ－２への結合の濃度応答試験により比較した（図５）。この図は、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８フルオロフォア標識リガンドのＭＭＰ－２結合濃度－蛍光の関係を示しており、これらのフルオロフォア標識リガンドのＭＭＰ－２タンパク質に対する親和性の違いを示している。結果は、３つの化合物を比較した３回の独立実験の平均±ＳＤおよび平均値に対するシグモイド曲線フィッティングで示す。濃度応答関係はシグモイド曲線によくフィットし、同程度のレベルで飽和に達したことから、ＭＭＰ－２上のほぼ同数の結合部位に結合することが示唆された。ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５は、ＣＴＸ－Ｃｙ５よりも３．７倍および３．１倍強力であり、それぞれＥＣ５０値は０．１５μＭ、０．１８μＭ、および０．５６μＭであった。これらの結果は、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８およびＣＴＸのコンジュゲートリガンドは全て、非標識タンパク質の親和性を維持していることを示している。この結論は、ＣＴＸ－Ａ４８８（１μＭ）が標識リガンドである置換試験でも確認され、ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ８、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５のＩＣ５０値は、それぞれ２２μＭ、１８μＭ、１８μＭ、および１８μＭであった。比較のため、ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸの非標識およびＣｙ５標識誘導体も検討した（表ＩＩＩ参照）。その結果、ＣＴＸ、ｒＣＴＸおよびｍＣＴＸのＭＭＰ－２親和性には実質的な差はなく、Ｃｙ５コンジュゲートは類似の、またはわずかに高い親和性を示したが、標識タンパク質と非標識タンパク質の間で最も大きな差が認められ、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５のＩＣ５０値は、ｍＣＴＸの０．７７μＭに対し、０．４０μＭであった。
【0152】
ＣＴＸＤ５の細胞分裂阻害コンジュゲート、すなわちＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２とのＭＭＰ－２結合親和性の維持は、ＣＴＸ－Ｃｙ５を置換リガンドとして用いた置換試験でも確認された。ＣＴＸＤ５、ＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ、およびＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２のＩＣ５０値は、同等、すなわち、それぞれ０．２０μＭ、０．２３μＭ、および０．２２μＭであった。
【0153】
ＣＴＸと比較したＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８の標的タンパク質選択性の変化
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験を用いて、本発明者らは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５の、ＣＴＸの直接的または間接的な結合パートナーとして示唆されている標的タンパク質のパネルへの結合を調べた。パネルには、ｈｉｓタグ化タンパク質ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１４、ＴＩＭＰ－２、αｖβ３インテグリン、Ａｎｘ２、ＮＲＰ１、ＣＬＣ３（クロライドチャネル）、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれ、後者は一種の陰性対照であった。結果を図６に示す。ここで棒グラフは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５標識試験物質（全て１μＭ）の、Ｃｏ－ｂｅａｄ試験におけるビーズ結合蛍光強度によって測定される、様々な仮定標的タンパク質への異なる結合強度を示す。列のトリプレットは、どの標的タンパク質でもコーティングしていないが、ＭＭＰ－２、ＮＲＰ１、ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ－２、ＭＭＰ－１４、Ａｎｘ２、αｖβ３インテグリン（ＩＮＴ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびＣＬＣ３クロライドチャネルでコーティングした他の全ての標的タンパク質コーティングビーズと同様に、カゼインでブロッキングした対照ビーズ（ＣＯＮＴ）を示す。結果は３回の実験の平均±ＳＤで示す。図６に示した結果から、ＣＴＸ－Ｃｙ５は１μＭの試験濃度でＭＭＰ－２およびＮＲＰ１にほぼ等しい強度で結合し、ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ－２およびＣＬＣ３にも弱いながらも明白な結合を示した。それにもかかわらず、ＣＴＸ－Ｃｙ５の、ＭＭＰ－１４、αｖβ３インテグリン、Ａｎｘ２およびＨＳＡに対する結合はごくわずかであった。対照的に、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５は、ＣＴＸ－Ｃｙ５よりも少なくとも３倍強くＭＭＰ－２に結合したが、ＣＬＣ３およびＴＩＭＰ－２を除く試験パネルの他の全てのタンパク質に対する結合はごくわずかであった。ＣＬＣ３およびＴＩＭＰ－２に対する微量の結合でさえもＣＴＸ－Ｃｙ５より明らかに弱かった。２つのリード化合物の標的タンパク質パネル結合および選択性プロファイルは、質的にも量的にも同等に見えた。ＣＴＸ－Ｃｙ５がＮＲＰ－１に対して顕著な親和性を示したため、本発明者らは、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の結合濃度－応答関係を比較した。結果を図７に示す。この図は、ＣＴＸ－Ｃｙ５フルオロフォア標識リガンドに対するＮＲＰ１結合濃度－蛍光関係を示しており、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験においてＣＴＸＤ５－Ｃｙ５のＮＲＰ１への明白な結合が見られなかったことを示している。結果は、２つの化合物を比較する２つの独立した実験の平均±ＳＤ、およびＣＴＸ－Ｃｙ５の相対的蛍光強度の平均値に対するシグモイド曲線フィッティングとして、ＮＲＰ１に対するＣＴＸ－Ｃｙ５の親和性を特徴付けるＥＣ５０の計算値と共に示されている。図７に示す結果から、ＣＴＸ－Ｃｙ５は濃度依存的にＮＲＰ１に結合し、ＥＣ５０値は０．４１μＭであったのに対し、ＣＴＸＤ５は試験濃度１０μＭまで全くＮＲＰ１に結合を示さなかった。非標識ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＮＲＰ１への結合が見られないことは、ＣＴＸ－Ｃｙ５置換試験でも確認された（図示しない）。
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験を用いて、本発明者らは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５の、ＣＴＸの直接的または間接的な結合パートナーとして示唆されている標的タンパク質のパネルへの結合を調べた。パネルには、ｈｉｓタグ化タンパク質ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１４、ＴＩＭＰ－２、αｖβ３インテグリン、Ａｎｘ２、ＮＲＰ１、ＣＬＣ３（クロライドチャネル）、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれ、後者は一種の陰性対照であった。結果を図６に示す。ここで棒グラフは、ＣＴＸ－Ｃｙ５、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５標識試験物質（全て１μＭ）の、Ｃｏ－ｂｅａｄ試験におけるビーズ結合蛍光強度によって測定される、様々な仮定標的タンパク質への異なる結合強度を示す。列のトリプレットは、どの標的タンパク質でもコーティングしていないが、ＭＭＰ－２、ＮＲＰ１、ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ－２、ＭＭＰ－１４、Ａｎｘ２、αｖβ３インテグリン（ＩＮＴ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびＣＬＣ３クロライドチャネルでコーティングした他の全ての標的タンパク質コーティングビーズと同様に、カゼインでブロッキングした対照ビーズ（ＣＯＮＴ）を示す。結果は３回の実験の平均±ＳＤで示す。図６に示した結果から、ＣＴＸ－Ｃｙ５は１μＭの試験濃度でＭＭＰ－２およびＮＲＰ１にほぼ等しい強度で結合し、ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ－２およびＣＬＣ３にも弱いながらも明白な結合を示した。それにもかかわらず、ＣＴＸ－Ｃｙ５の、ＭＭＰ－１４、αｖβ３インテグリン、Ａｎｘ２およびＨＳＡに対する結合はごくわずかであった。対照的に、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５は、ＣＴＸ－Ｃｙ５よりも少なくとも３倍強くＭＭＰ－２に結合したが、ＣＬＣ３およびＴＩＭＰ－２を除く試験パネルの他の全てのタンパク質に対する結合はごくわずかであった。ＣＬＣ３およびＴＩＭＰ－２に対する微量の結合でさえもＣＴＸ－Ｃｙ５より明らかに弱かった。２つのリード化合物の標的タンパク質パネル結合および選択性プロファイルは、質的にも量的にも同等に見えた。ＣＴＸ－Ｃｙ５がＮＲＰ－１に対して顕著な親和性を示したため、本発明者らは、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の結合濃度－応答関係を比較した。結果を図７に示す。この図は、ＣＴＸ－Ｃｙ５フルオロフォア標識リガンドに対するＮＲＰ１結合濃度－蛍光関係を示しており、Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験においてＣＴＸＤ５－Ｃｙ５のＮＲＰ１への明白な結合が見られなかったことを示している。結果は、２つの化合物を比較する２つの独立した実験の平均±ＳＤ、およびＣＴＸ－Ｃｙ５の相対的蛍光強度の平均値に対するシグモイド曲線フィッティングとして、ＮＲＰ１に対するＣＴＸ－Ｃｙ５の親和性を特徴付けるＥＣ５０の計算値と共に示されている。図７に示す結果から、ＣＴＸ－Ｃｙ５は濃度依存的にＮＲＰ１に結合し、ＥＣ５０値は０．４１μＭであったのに対し、ＣＴＸＤ５は試験濃度１０μＭまで全くＮＲＰ１に結合を示さなかった。非標識ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＮＲＰ１への結合が見られないことは、ＣＴＸ－Ｃｙ５置換試験でも確認された（図示しない）。
【0154】
ＣＴＸ－Ｃｙ５およびｍＣＴＸ－Ｃｙ５と比較したＣＴＸＤ５－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ８－Ｃｙ５の腫瘍細胞の選択的染色についての有用性
本発明者らは、より高いＭＭＰ－２結合親和性および選択性が、腫瘍細胞対非腫瘍細胞に対する細胞取込み強度および選択性にどのように反映されるかを検討した。この目的のために、蛍光顕微鏡および画像解析による定性的および半定量的な特性評価および、フローサイトメトリーによる定量的な特性評価のために、いくつかの代表的な腫瘍細胞株を検討した。
本発明者らは、より高いＭＭＰ－２結合親和性および選択性が、腫瘍細胞対非腫瘍細胞に対する細胞取込み強度および選択性にどのように反映されるかを検討した。この目的のために、蛍光顕微鏡および画像解析による定性的および半定量的な特性評価および、フローサイトメトリーによる定量的な特性評価のために、いくつかの代表的な腫瘍細胞株を検討した。
【0155】
細胞培養画像結果
ｍＣＴＸ－Ｃｙ５またはＣＴＸＤ５－Ｃｙ５（２μＭ）と３７℃で１時間インキュベートしたヒトＵ２５１ＭＧ神経膠芽腫細胞およびＨＤＦａ線維芽細胞の接着性培養の蛍光顕微鏡画像をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｎａｎｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて調査し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で解析した。細胞体および核を可視化するために、培養物をそれぞれカルセイン ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｃ１４３０）およびヘキスト ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ｈ３５７０）で染色した。その結果、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５は共に細胞に取り込まれ、Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａら［Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ ２０１１］が記載した特徴的な細胞内分布、すなわち、神経膠芽腫細胞ではトランスゴルジ蓄積を伴うクラスリン介在性エンドサイトーシスと一致する核周囲大顆粒局在を示したが、線維芽細胞ではマイクロピノサイトーシスと一致する拡散性細胞質分布を示した。半定量的解析によって、神経膠芽腫細胞では線維芽細胞よりも両方の標識ＣＴＸＤの取込みが高いこと、両方の細胞種でＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の取込みがｍＣＴＸ－Ｃｙ５よりも高いこと、およびまた、神経膠芽腫細胞では線維芽細胞よりもＣＴＸＤ５／ｍＣＴＸの取込み比率が高いことが示された。
ｍＣＴＸ－Ｃｙ５またはＣＴＸＤ５－Ｃｙ５（２μＭ）と３７℃で１時間インキュベートしたヒトＵ２５１ＭＧ神経膠芽腫細胞およびＨＤＦａ線維芽細胞の接着性培養の蛍光顕微鏡画像をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｎａｎｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて調査し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で解析した。細胞体および核を可視化するために、培養物をそれぞれカルセイン ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｃ１４３０）およびヘキスト ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ｈ３５７０）で染色した。その結果、ｍＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５は共に細胞に取り込まれ、Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａら［Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ ２０１１］が記載した特徴的な細胞内分布、すなわち、神経膠芽腫細胞ではトランスゴルジ蓄積を伴うクラスリン介在性エンドサイトーシスと一致する核周囲大顆粒局在を示したが、線維芽細胞ではマイクロピノサイトーシスと一致する拡散性細胞質分布を示した。半定量的解析によって、神経膠芽腫細胞では線維芽細胞よりも両方の標識ＣＴＸＤの取込みが高いこと、両方の細胞種でＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の取込みがｍＣＴＸ－Ｃｙ５よりも高いこと、およびまた、神経膠芽腫細胞では線維芽細胞よりもＣＴＸＤ５／ｍＣＴＸの取込み比率が高いことが示された。
【0156】
フローサイトメトリーによる解析
細胞取込みのフローサイトメトリー調査の詳細なプロトコルは、実施例８に示されている。簡潔に述べると、試験細胞を生存率マーカー（ＰＯ－ＰＲＯ－１色素）およびＣｙ５標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５、またはＣＴＸＤ８と共にインキュベート（二重染色）した。Ｃｙ５コンジュゲートタンパク質の取込みを、ＰＯ－ＰＲＯ－１取込みの高さに基づいて非生存細胞をゲーティングした後、Ｃｙ５タンパク質未染色細胞に対する蛍光強度の中央値（ΔＭＦＩ）の増加として測定した。代表的な腫瘍細胞株のセットとして、本研究では、ヒト神経膠芽腫（Ｕ２５１ ＭＧおよびＵ８７ ＭＧ）、膵臓癌（Ｐａｎｃ－１）、黒色腫（Ａ３７５）および乳癌（ＳＫ－Ｂｒ）細胞が挙げられ、これらは以前の研究で「ＣＴＸ陽性」と分類されている［Ｌｙｏｎｓ ２００２］。さらに、「ＣＴＸ陰性」と報告されている悪性腫瘍細胞株ＴＥ ６７１ヒト横紋筋肉腫［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８］、および正常な非腫瘍細胞、すなわちラット星状細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）も、腫瘍選択性の変化を明らかにするために調査した。まず、本発明者らは、フルオロフォア標識したＣＴＸＤ５およびＣＴＸを用いた、Ｕ２５１ ＭＧ細胞およびＰａｎｃ－１細胞に対する比較濃度取込み試験を行った。その結果、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５は両細胞株においてＣＴＸ－Ｃｙ５よりも４倍強力に、すなわち４倍低い等有効濃度で取り込まれた（図８）。この図は、フローサイトメトリーで測定した細胞染色強度試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５フルオロフォア標識リガンドの細胞内取込み濃度－蛍光の関係を示している。データは、２つの悪性腫瘍細胞株：Ｕ２５１およびＰａｎｃ－１における２つの化合物の染色強度を比較する、Ｎ＝２およびＮ＝３の実験の平均±ＳＤとして示した。濃度－取込み関係に基づいて、３００ｎＭを固定試験濃度として選択し、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、ＣＴＸ－Ｃｙ５およびｍＣＴＸ－Ｃｙ５のコンジュゲートタンパク質の取込みを、選択した細胞株のセットにおける同時比較実験で調べた。その結果、比較的多量の標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤ５が「ＣＴＸ陽性」の腫瘍細胞：神経膠芽腫、黒色腫、膵臓癌および乳癌細胞に取り込まれ、「正常細胞」および「ＣＴＸ陰性」の横紋筋肉腫細胞株への取込みははるかに少なかったことが示された（表ＩＶ参照）。
細胞取込みのフローサイトメトリー調査の詳細なプロトコルは、実施例８に示されている。簡潔に述べると、試験細胞を生存率マーカー（ＰＯ－ＰＲＯ－１色素）およびＣｙ５標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５、またはＣＴＸＤ８と共にインキュベート（二重染色）した。Ｃｙ５コンジュゲートタンパク質の取込みを、ＰＯ－ＰＲＯ－１取込みの高さに基づいて非生存細胞をゲーティングした後、Ｃｙ５タンパク質未染色細胞に対する蛍光強度の中央値（ΔＭＦＩ）の増加として測定した。代表的な腫瘍細胞株のセットとして、本研究では、ヒト神経膠芽腫（Ｕ２５１ ＭＧおよびＵ８７ ＭＧ）、膵臓癌（Ｐａｎｃ－１）、黒色腫（Ａ３７５）および乳癌（ＳＫ－Ｂｒ）細胞が挙げられ、これらは以前の研究で「ＣＴＸ陽性」と分類されている［Ｌｙｏｎｓ ２００２］。さらに、「ＣＴＸ陰性」と報告されている悪性腫瘍細胞株ＴＥ ６７１ヒト横紋筋肉腫［Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ １９９８］、および正常な非腫瘍細胞、すなわちラット星状細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）およびヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）も、腫瘍選択性の変化を明らかにするために調査した。まず、本発明者らは、フルオロフォア標識したＣＴＸＤ５およびＣＴＸを用いた、Ｕ２５１ ＭＧ細胞およびＰａｎｃ－１細胞に対する比較濃度取込み試験を行った。その結果、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５は両細胞株においてＣＴＸ－Ｃｙ５よりも４倍強力に、すなわち４倍低い等有効濃度で取り込まれた（図８）。この図は、フローサイトメトリーで測定した細胞染色強度試験におけるＣＴＸ－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５フルオロフォア標識リガンドの細胞内取込み濃度－蛍光の関係を示している。データは、２つの悪性腫瘍細胞株：Ｕ２５１およびＰａｎｃ－１における２つの化合物の染色強度を比較する、Ｎ＝２およびＮ＝３の実験の平均±ＳＤとして示した。濃度－取込み関係に基づいて、３００ｎＭを固定試験濃度として選択し、ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５、ＣＴＸ－Ｃｙ５およびｍＣＴＸ－Ｃｙ５のコンジュゲートタンパク質の取込みを、選択した細胞株のセットにおける同時比較実験で調べた。その結果、比較的多量の標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤ５が「ＣＴＸ陽性」の腫瘍細胞：神経膠芽腫、黒色腫、膵臓癌および乳癌細胞に取り込まれ、「正常細胞」および「ＣＴＸ陰性」の横紋筋肉腫細胞株への取込みははるかに少なかったことが示された（表ＩＶ参照）。
【表4】
【0157】
ＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の取込みは、ＣＴＸ－Ｃｙ５よりも全ての細胞種で高かった。しかし、ＣＴＸＤ５／ＣＴＸ取込み比率から、ＣＴＸＤ５はＣＴＸよりも、腫瘍細胞には２．４～３．５倍多く取り込まれたが、正常細胞には１．１～１．９倍しか取り込まれないことが示され、このことは、フルオロフォア標識ＣＴＸＤ５が、標識ＣＴＸよりも腫瘍細胞を強く染めるだけでなく、調べた腫瘍細胞を正常細胞に対してより選択的に染めることを明らかに示している。ｍＣＴＸ－Ｃｙ５の細胞取込み強度は、試験した全ての細胞株でＣＴＸ－Ｃｙ５と実質的には異ならなかった。
【0158】
２つの標識リード化合物ＣＴＸＤ８－Ｃｙ５およびＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の細胞内取込みを比較するために、２回目の一連の実験を行った。この比較試験の結果を表Ｖに示す。
【表5】
【0159】
その結果、この新しい試験におけるＣＴＸＤ５－Ｃｙ５の取込み強度は、以前の試験と非常に類似していることが示された（表ＩＶ参照）。さらに、ＣＴＸＤ８－Ｃｙ５の取込み強度はＣＴＸＤ５－Ｃｙ５とほぼ同じであり、これは非常に類似した細胞取込みおよび腫瘍対非腫瘍の選択性プロファイルを示している。
【0160】
化学療法薬剤の標的化細胞内送達におけるＣＴＸＤ５の使用
化学療法薬剤とコンジュゲートしたｍＣＴＸよりもＣＴＸＤ５の標的化効力が向上していることを調べるため、本発明者らは、２つの標的タンパク質ＣＴＸＤ５およびｍＣＴＸの細胞内切断性ＭＭＡＦコンジュゲートの増殖阻害効力を比較した。－ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦとの、ＣＴＸＤ５およびｍＣＴＸのモノコンジュゲートおよびバイコンジュゲート形態の両方を試験した。調査のプロトコルは実施例９に記載されている。その結果、ＩＣ５０が５８５ｎＭのモノコンジュゲートＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦは、モノコンジュゲートｍＣＴＸ－ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦよりもＵ２５１ ＭＧ細胞増殖に対して２．４倍強力な阻害剤であることが示された。ＩＣ５０が２３５ｎＭのバイコンジュゲートＣＴＸＤ５－（ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２は、バイコンジュゲートｍＣＴＸ－（ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２よりも９．７倍強力であった。２つの標的化タンパク質の違いは、最小有効濃度の比較においてより顕著であり、これは、ＣＴＸＤ５バイコンジュゲート化合物の最小有効濃度は１０ｎＭであったのに対し、より優れたｍＣＴＸコンジュゲート、すなわちｍＣＴＸモノコンジュゲートは最小有効濃度１０００ｎＭを有し、これはＣＴＸＤ５の化学療法コンジュゲートがはるかに低い濃度レベルで所望の治療効果を有し始めることを意味している。
化学療法薬剤とコンジュゲートしたｍＣＴＸよりもＣＴＸＤ５の標的化効力が向上していることを調べるため、本発明者らは、２つの標的タンパク質ＣＴＸＤ５およびｍＣＴＸの細胞内切断性ＭＭＡＦコンジュゲートの増殖阻害効力を比較した。－ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦとの、ＣＴＸＤ５およびｍＣＴＸのモノコンジュゲートおよびバイコンジュゲート形態の両方を試験した。調査のプロトコルは実施例９に記載されている。その結果、ＩＣ５０が５８５ｎＭのモノコンジュゲートＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦは、モノコンジュゲートｍＣＴＸ－ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦよりもＵ２５１ ＭＧ細胞増殖に対して２．４倍強力な阻害剤であることが示された。ＩＣ５０が２３５ｎＭのバイコンジュゲートＣＴＸＤ５－（ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２は、バイコンジュゲートｍＣＴＸ－（ＧＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２よりも９．７倍強力であった。２つの標的化タンパク質の違いは、最小有効濃度の比較においてより顕著であり、これは、ＣＴＸＤ５バイコンジュゲート化合物の最小有効濃度は１０ｎＭであったのに対し、より優れたｍＣＴＸコンジュゲート、すなわちｍＣＴＸモノコンジュゲートは最小有効濃度１０００ｎＭを有し、これはＣＴＸＤ５の化学療法コンジュゲートがはるかに低い濃度レベルで所望の治療効果を有し始めることを意味している。
【0161】
ＣＡＲ Ｔ細胞療法におけるＣＴＸＤ８の有用性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＣＴＸＤ８または古典的ＣＴＸ認識ドメインリダイレクトエフェクター細胞が、標的細胞の細胞溶解を誘導する可能性が高いかを調べるため、本発明者らは、ＣＴＸＤ８－ＣＡＲまたはＣＴＸ－ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを作製し、３人のヒトドナーから得た血液から単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の初代ヒトＴリンパ球を形質導入した。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－ＣＡＲの両方がＴ細胞上で安定的に発現することが見出された。平均発現効率はＣＴＸＤ８－、およびＣＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞で５４．４％および５１．２％であった。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－リダイレクトＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能および潜在的細胞傷害性を調べるため、本発明者らは、高ＭＭＰ－２発現を示すＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌由来細胞株（ＭＤＡ－ＨＥＲ２）を標的として用いた。また、公知のＣＴＸ－ＣＡＲ非感受性対照としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に対する細胞傷害性も調べた［国際公開第ＷＯ２０１７／０６６４８１号広報］。それらのエフェクター機能および細胞傷害活性を評価するために、ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－発現ＣＡＲ Ｔ（「エフェクター」）細胞を、異なるエフェクター対標的細胞比率でＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞と共培養した。本発明者らは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）サイトカインの産生を決定することで、エフェクター機能を調べた。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－由来のＣＡＲ Ｔ細胞は、有意な量のＩＦＮγを産生した。非改変Ｔ細胞（ＮＴ）または標的抗原非存在下（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株）では、サイトカイン産生は観察されなかった。ＣＴＸＤ８－またはＣＴＸ－ＣＡＲエフェクターで処理した腫瘍細胞の生存率は、非形質導入（「ＮＴ」）リンパ球との共培養で測定した平均生存率に対して正規化した腫瘍細胞の平均生存率のパーセンテージで示した。調査のプロトコルは実施例１０および１１に記載されている。図９および図１０に示す結果は、ＣＴＸ－およびＣＴＸＤ８－ＣＡＲの両方が、エフェクター対標的比率に依存する顕著な細胞傷害性効果（生存率の低下）を誘導することを示した。ＮＴ対照Ｔ細胞との共培養では細胞傷害性は見られなかった。しかし、ＣＴＸＤ８－またはＣＴＸ－リプログラミングＣＡＲ Ｔリンパ球は、いずれもＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して細胞傷害性効果を示さなかった。本発明者らは、ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ Ｔ細胞はＣＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大きな細胞傷害性を誘導すると結論づけた。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ Ｔ細胞の効果は、統計学的に有意であった（二元配置分散分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定、図１０）。
ＣＴＸＤ８または古典的ＣＴＸ認識ドメインリダイレクトエフェクター細胞が、標的細胞の細胞溶解を誘導する可能性が高いかを調べるため、本発明者らは、ＣＴＸＤ８－ＣＡＲまたはＣＴＸ－ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを作製し、３人のヒトドナーから得た血液から単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の初代ヒトＴリンパ球を形質導入した。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－ＣＡＲの両方がＴ細胞上で安定的に発現することが見出された。平均発現効率はＣＴＸＤ８－、およびＣＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞で５４．４％および５１．２％であった。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－リダイレクトＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能および潜在的細胞傷害性を調べるため、本発明者らは、高ＭＭＰ－２発現を示すＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌由来細胞株（ＭＤＡ－ＨＥＲ２）を標的として用いた。また、公知のＣＴＸ－ＣＡＲ非感受性対照としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に対する細胞傷害性も調べた［国際公開第ＷＯ２０１７／０６６４８１号広報］。それらのエフェクター機能および細胞傷害活性を評価するために、ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－発現ＣＡＲ Ｔ（「エフェクター」）細胞を、異なるエフェクター対標的細胞比率でＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞と共培養した。本発明者らは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）サイトカインの産生を決定することで、エフェクター機能を調べた。ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－由来のＣＡＲ Ｔ細胞は、有意な量のＩＦＮγを産生した。非改変Ｔ細胞（ＮＴ）または標的抗原非存在下（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株）では、サイトカイン産生は観察されなかった。ＣＴＸＤ８－またはＣＴＸ－ＣＡＲエフェクターで処理した腫瘍細胞の生存率は、非形質導入（「ＮＴ」）リンパ球との共培養で測定した平均生存率に対して正規化した腫瘍細胞の平均生存率のパーセンテージで示した。調査のプロトコルは実施例１０および１１に記載されている。図９および図１０に示す結果は、ＣＴＸ－およびＣＴＸＤ８－ＣＡＲの両方が、エフェクター対標的比率に依存する顕著な細胞傷害性効果（生存率の低下）を誘導することを示した。ＮＴ対照Ｔ細胞との共培養では細胞傷害性は見られなかった。しかし、ＣＴＸＤ８－またはＣＴＸ－リプログラミングＣＡＲ Ｔリンパ球は、いずれもＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して細胞傷害性効果を示さなかった。本発明者らは、ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ Ｔ細胞はＣＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大きな細胞傷害性を誘導すると結論づけた。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ Ｔ細胞の効果は、統計学的に有意であった（二元配置分散分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定、図１０）。
【0162】
本発明のＣＴＸＤの使用の結論
要約すると、本発明者らは、デザイナー毒素およびファージ提示技術を用いて、ＣＴＸおよびｍＣＴＸよりもＭＭＰ－２タンパク質に対して実質的に高い親和性を有する新規ＣＴＸＤリード化合物（すなわちＣＴＸＤ１）を開発した。異なるファージ提示ＣＴＸＤタンパク質のＭＭＰ－２および他の潜在的標的タンパク質との結合強度の定量的評価に適した新規フローサイトメトリー法を用いて、本発明者らは、このリード化合物周辺の構造－活性関係を確立した。これらの構造－活性相関研究により、ＣＴＸおよびｍＣＴＸと比較してＭＭＰ－２への結合についてさらに効力が強く、ＮＲＰ１には結合しないため、より選択的でもあるＣＴＸＤ化合物のセットが明らかになった。ファージ提示タンパク質を調査することによって得られた観察結果は、２つの選択した例示的なクロロトキシン誘導体、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８を組替え産生し、精製試験物質として用いた調査によってさらに確認された。これらの検討はファージ提示の結果と一致し、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＭＭＰ－２活性および選択性が３～４倍高いことを示した。驚くべきことに、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８はＮＲＰ１だけでなく、ＣＴＸがある程度の結合を示す他の標的タンパク質に対してもより選択的であることが証明された。リード化合物のフルオロフォアおよび化学療法薬剤コンジュゲート誘導体は、親タンパク質のＭＭＰ－２結合親和性を維持していた。さらに、フルオロフォア標識したＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、ＣＴＸよりもはるかに高い強度で腫瘍細胞に取り込まれ、正常細胞に対する腫瘍細胞への選択性が上昇していた。さらに、ＣＴＸＤ５の試験化学療法コンジュゲートは、ｍＣＴＸの同様のコンジュゲートよりも高い効力で、神経膠芽腫細胞の増殖を阻害した。ＣＴＸＤ８またはＣＴＸを抗原認識ドメインとして組み立てられたＣＡＲ Ｔ細胞は、高ＭＭＰ－２発現乳癌由来細胞株に対して選択的細胞傷害効果を示したが、対照細胞株に対しては非傷害性であった。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ細胞の選択的細胞傷害効果は、ＣＴＸ－ＣＡＲ細胞よりも大きかった。これらの観察を合わせると、本発明の化合物は、単独で、または他の分子、ナノ粒子とコンジュゲートして、またはＣＴＸのそのような推定される用途に関連する先行技術から明らかであり得る診断、治療、または診断と治療を組み合わせたセラノスティック応用とも呼ばれる付加的な特徴を提供するＣＡＲ細胞構築物中の標的認識ドメインとして適用した場合に、標的化分子としてＣＴＸまたはｍＣＴＸよりも有用であり、優れているという結論に至った。本発明のクロロトキシン誘導体は、さらなる改変の出発点となり得る。
要約すると、本発明者らは、デザイナー毒素およびファージ提示技術を用いて、ＣＴＸおよびｍＣＴＸよりもＭＭＰ－２タンパク質に対して実質的に高い親和性を有する新規ＣＴＸＤリード化合物（すなわちＣＴＸＤ１）を開発した。異なるファージ提示ＣＴＸＤタンパク質のＭＭＰ－２および他の潜在的標的タンパク質との結合強度の定量的評価に適した新規フローサイトメトリー法を用いて、本発明者らは、このリード化合物周辺の構造－活性関係を確立した。これらの構造－活性相関研究により、ＣＴＸおよびｍＣＴＸと比較してＭＭＰ－２への結合についてさらに効力が強く、ＮＲＰ１には結合しないため、より選択的でもあるＣＴＸＤ化合物のセットが明らかになった。ファージ提示タンパク質を調査することによって得られた観察結果は、２つの選択した例示的なクロロトキシン誘導体、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８を組替え産生し、精製試験物質として用いた調査によってさらに確認された。これらの検討はファージ提示の結果と一致し、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８のＭＭＰ－２活性および選択性が３～４倍高いことを示した。驚くべきことに、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８はＮＲＰ１だけでなく、ＣＴＸがある程度の結合を示す他の標的タンパク質に対してもより選択的であることが証明された。リード化合物のフルオロフォアおよび化学療法薬剤コンジュゲート誘導体は、親タンパク質のＭＭＰ－２結合親和性を維持していた。さらに、フルオロフォア標識したＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、ＣＴＸよりもはるかに高い強度で腫瘍細胞に取り込まれ、正常細胞に対する腫瘍細胞への選択性が上昇していた。さらに、ＣＴＸＤ５の試験化学療法コンジュゲートは、ｍＣＴＸの同様のコンジュゲートよりも高い効力で、神経膠芽腫細胞の増殖を阻害した。ＣＴＸＤ８またはＣＴＸを抗原認識ドメインとして組み立てられたＣＡＲ Ｔ細胞は、高ＭＭＰ－２発現乳癌由来細胞株に対して選択的細胞傷害効果を示したが、対照細胞株に対しては非傷害性であった。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲ細胞の選択的細胞傷害効果は、ＣＴＸ－ＣＡＲ細胞よりも大きかった。これらの観察を合わせると、本発明の化合物は、単独で、または他の分子、ナノ粒子とコンジュゲートして、またはＣＴＸのそのような推定される用途に関連する先行技術から明らかであり得る診断、治療、または診断と治療を組み合わせたセラノスティック応用とも呼ばれる付加的な特徴を提供するＣＡＲ細胞構築物中の標的認識ドメインとして適用した場合に、標的化分子としてＣＴＸまたはｍＣＴＸよりも有用であり、優れているという結論に至った。本発明のクロロトキシン誘導体は、さらなる改変の出発点となり得る。
【0163】
このような利用には、術中可視化のための眼内腫瘍染色、または皮膚もしくは粘膜表面の腫瘍染色、または放射線学的およびイメージング応用、または組織化学的染色のための様々なコンジュゲート形態の診断標的化分子としての本発明のクロロトキシン誘導体の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【0164】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例1】
【0165】
ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８の組換え産生および精製
クローニング
ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸ誘導体をコードするＤＮＡ配列を、Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ化融合パートナーであるＤｓｂＣ（ジスルフィド結合異性化酵素Ｃ）もコードするｐＥＴベースの発現ベクターにクローニングした。ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位とＳｐｌＢ（セリンプロテアーゼ様タンパク質Ｂ）の切断部位（ＷＥＬＱ）のアミノ酸配列を含むフォワードプライマーを用いて、ＣＴＸ誘導体をＰＣＲ反応で増幅した。リバースプライマーは２つの終止コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含んでいた。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤｓｂＣ融合パートナータンパク質コードセグメントの下流の線状化ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応は、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ）に形質転換した。構築物のＤＮＡ配列はサンガーシーケンシングで決定した。
クローニング
ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸ誘導体をコードするＤＮＡ配列を、Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ化融合パートナーであるＤｓｂＣ（ジスルフィド結合異性化酵素Ｃ）もコードするｐＥＴベースの発現ベクターにクローニングした。ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位とＳｐｌＢ（セリンプロテアーゼ様タンパク質Ｂ）の切断部位（ＷＥＬＱ）のアミノ酸配列を含むフォワードプライマーを用いて、ＣＴＸ誘導体をＰＣＲ反応で増幅した。リバースプライマーは２つの終止コドンおよびＸｈｏＩの認識部位を含んでいた。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤｓｂＣ融合パートナータンパク質コードセグメントの下流の線状化ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応は、化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ）に形質転換した。構築物のＤＮＡ配列はサンガーシーケンシングで決定した。
【0166】
発現
化学的にコンピテントなＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をプラスミドで形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地にストリークした。翌日、単一のコロニーをアンピシリン添加ＬＢ培地２０ｍＬに接種し、１６０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、アンピシリン添加自己誘導テリフィックブロス１Ｌに一晩の培養物１ｍＬを接種し、Ｕｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）中で３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。３０時間のインキュベート後、７４６０×ｇで１０分間遠心分離して細菌細胞を回収した。組換えＣＴＸの細胞ペレットを１４０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に再懸濁した。組換えＣＴＸ誘導体の細胞ペレットを１４０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール、および０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁した。サンプルは－２０℃で保存した。
化学的にコンピテントなＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をプラスミドで形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地にストリークした。翌日、単一のコロニーをアンピシリン添加ＬＢ培地２０ｍＬに接種し、１６０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、アンピシリン添加自己誘導テリフィックブロス１Ｌに一晩の培養物１ｍＬを接種し、Ｕｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）中で３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。３０時間のインキュベート後、７４６０×ｇで１０分間遠心分離して細菌細胞を回収した。組換えＣＴＸの細胞ペレットを１４０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に再懸濁した。組換えＣＴＸ誘導体の細胞ペレットを１４０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール、および０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁した。サンプルは－２０℃で保存した。
【0167】
ｒＣＴＸの精製
解凍後、超音波処理により細胞を破砕した。細胞残屑を４８４００×ｇで２０分間遠心分離してペレット化し、上清を蠕動ポンプを用いて、１７ｍＬのＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムにロードし、６ｘＨｉｓタグ化ＤｓｂＣ－ＣＴＸ融合タンパク質を捕捉した。５カラム容積のＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール）でカラムからサンプルを溶出した。溶出液を２Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液に対して２５℃で一晩透析した。透析したサンプルを２００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍメンブレンで濾過し、Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムに接続した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液（緩衝液Ａ）で予め平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。緩衝液Ａで洗浄後、ＤｓｂＣ－ＣＴＸ融合タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の０～５０％直線勾配で２５分かけて２ｍＬ／分の流速で溶出した。溶出した画分を１０％トリシン－ＳＤＳゲルで解析した。ＤｓｂＣ－ＣＴＸを含む画分をプールし、ＳｐｌＢプロテアーゼ（非切断性Ｈｉｓタグ化）を融合タンパク質：プロテアーゼ比率２：１で添加し、ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を最終濃度１００μＭで添加した。サンプルを２５℃で一晩インキュベートした。翌日、１０％ トリシン－ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で切断率を決定した。サンプルにＮａＣｌおよびイミダゾールをそれぞれ最終濃度０．５Ｍおよび１５ｍＭになるように添加し、溶液を孔径０．２μｍのシリンジフィルタで濾過した。次に、Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムを用いて、サンプルを８ｍｌ ＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣ樹脂に２ｍｌ／分でアプライした。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１５ｍＭイミダゾール緩衝液で洗浄し、フロースルーを回収した。６ｘＨｉｓ－ＤｓｂＣおよび６ｘＨｉｓ－ＳｐｌＢタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ イミダゾール緩衝液を用いてカラムから溶出した。標的（ｒＣＴＸ）タンパク質を含むフロースルーをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルタユニット（ＭＷＣＯ＝３０００Ｄａ）を用いて濃縮した。このフィルタユニットは、その後のサイズ排除クロマトグラフィーのために、洗浄緩衝液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に交換するためにも使用した。Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムに接続したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化した。サンプルを１ｍＬ／分で１ｍＬのアリコートでカラムにアプライした。その後、１ｍＬ／分の流速でカラム１容量分の緩衝液でサンプルを溶出し、吸光度を２８０ｎｍでモニターした。クロロトキシンを含む画分は、１０％トリシン－ＳＤＳゲル上のＰＡＧＥによって決定された。クロロトキシン含有画分のＴｒｉｓ－ＨＣｌおよびＮａＣｌ含量は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルタユニット（ＭＷＣＯ＝３０００Ｄａ）で繰り返しサンプルを濃縮し、ＵＳＰ試験ＷＦＩ水で希釈することにより、それぞれ０．０１ｍＭおよび０．５ｍＭ未満に減少させた。サンプルの濃度は、凍結乾燥に供する前に、２１４ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。タンパク質の純度と分子量は、その後のＨＰＬＣ－ＵＶ／ＭＳ測定により決定した。
解凍後、超音波処理により細胞を破砕した。細胞残屑を４８４００×ｇで２０分間遠心分離してペレット化し、上清を蠕動ポンプを用いて、１７ｍＬのＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムにロードし、６ｘＨｉｓタグ化ＤｓｂＣ－ＣＴＸ融合タンパク質を捕捉した。５カラム容積のＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール）でカラムからサンプルを溶出した。溶出液を２Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液に対して２５℃で一晩透析した。透析したサンプルを２００００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍメンブレンで濾過し、Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムに接続した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０緩衝液（緩衝液Ａ）で予め平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。緩衝液Ａで洗浄後、ＤｓｂＣ－ＣＴＸ融合タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の０～５０％直線勾配で２５分かけて２ｍＬ／分の流速で溶出した。溶出した画分を１０％トリシン－ＳＤＳゲルで解析した。ＤｓｂＣ－ＣＴＸを含む画分をプールし、ＳｐｌＢプロテアーゼ（非切断性Ｈｉｓタグ化）を融合タンパク質：プロテアーゼ比率２：１で添加し、ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を最終濃度１００μＭで添加した。サンプルを２５℃で一晩インキュベートした。翌日、１０％ トリシン－ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で切断率を決定した。サンプルにＮａＣｌおよびイミダゾールをそれぞれ最終濃度０．５Ｍおよび１５ｍＭになるように添加し、溶液を孔径０．２μｍのシリンジフィルタで濾過した。次に、Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムを用いて、サンプルを８ｍｌ ＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣ樹脂に２ｍｌ／分でアプライした。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１５ｍＭイミダゾール緩衝液で洗浄し、フロースルーを回収した。６ｘＨｉｓ－ＤｓｂＣおよび６ｘＨｉｓ－ＳｐｌＢタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ イミダゾール緩衝液を用いてカラムから溶出した。標的（ｒＣＴＸ）タンパク質を含むフロースルーをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルタユニット（ＭＷＣＯ＝３０００Ｄａ）を用いて濃縮した。このフィルタユニットは、その後のサイズ排除クロマトグラフィーのために、洗浄緩衝液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に交換するためにも使用した。Ａｋｔａピュアクロマトグラフィーシステムに接続したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化した。サンプルを１ｍＬ／分で１ｍＬのアリコートでカラムにアプライした。その後、１ｍＬ／分の流速でカラム１容量分の緩衝液でサンプルを溶出し、吸光度を２８０ｎｍでモニターした。クロロトキシンを含む画分は、１０％トリシン－ＳＤＳゲル上のＰＡＧＥによって決定された。クロロトキシン含有画分のＴｒｉｓ－ＨＣｌおよびＮａＣｌ含量は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルタユニット（ＭＷＣＯ＝３０００Ｄａ）で繰り返しサンプルを濃縮し、ＵＳＰ試験ＷＦＩ水で希釈することにより、それぞれ０．０１ｍＭおよび０．５ｍＭ未満に減少させた。サンプルの濃度は、凍結乾燥に供する前に、２１４ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。タンパク質の純度と分子量は、その後のＨＰＬＣ－ＵＶ／ＭＳ測定により決定した。
【0168】
ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤの精製
解凍後、サンプルに最終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤）を添加し、超音波処理により細胞を破砕した。細胞残屑を４８４００×ｇで２０分間遠心分離してペレット化し、上清を２５ｍＬ ＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムに蠕動ポンプを用いてロードし、６ｘＨｉｓタグ化ＤｓｂＣ－ＣＴＸ誘導体融合タンパク質を捕捉した。５カラム容積のＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ イミダゾール）でカラムからサンプルを溶出した。溶出液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ＭＷＣＯ：１２０００Ｄａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、２Ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５緩衝液に対して２５℃で一晩透析した。透析後、サンプルにＳｐｌＢプロテアーゼおよびＴＣＥＰ（ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン）を融合タンパク質：プロテアーゼ：ＴＣＥＰのモル比率３：１：１で添加し、２５℃で一晩インキュベートした。翌日、切断の程度を１０％トリシン－ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで検査した。消化したサンプルを２００００×ｇで１０分間遠心分離した後、０．２μｍのメンブレンで濾過した後、Ａｋｔａピュアシステムで行われる陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。サンプルを、洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）で予め平衡化した５ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、カラムを５カラム容積の洗浄緩衝液で洗浄した。次に、２５分かけて０～５０％の溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ）の直線勾配を２ｍＬ／分の流速で用いて、サンプルを溶出した。溶出した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで解析した。ＣＴＸ誘導体を含む画分をプールし、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＪｕｐｉｔｅｒ １０μ Ｃ５ ３００Åカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にロードした。移動相には、０．１％ギ酸を添加したＨＰＬＣグレードの水（緩衝液Ａ）および０．１％ギ酸を添加したアセトニトリル（緩衝液Ｂ）が含まれた。タンパク質は、２ｍｌ／分で３０分かけて１５～４５％の緩衝液Ｂの直線勾配でカラムから溶出した。溶出した画分を１０％トリシン－ＳＤＳゲルで解析し、ＣＴＸＤを含む画分をプールした。サンプルの濃度は、凍結乾燥に供する前に、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。タンパク質の純度および分子量は、その後のＨＰＬＣ－ＵＶ／ＭＳ測定により決定した。
解凍後、サンプルに最終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤）を添加し、超音波処理により細胞を破砕した。細胞残屑を４８４００×ｇで２０分間遠心分離してペレット化し、上清を２５ｍＬ ＢｉｏＲａｄ Ｎｕｖｉａ ＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムに蠕動ポンプを用いてロードし、６ｘＨｉｓタグ化ＤｓｂＣ－ＣＴＸ誘導体融合タンパク質を捕捉した。５カラム容積のＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および３０ｍＭ イミダゾール）で洗浄後、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ イミダゾール）でカラムからサンプルを溶出した。溶出液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ＭＷＣＯ：１２０００Ｄａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、２Ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５緩衝液に対して２５℃で一晩透析した。透析後、サンプルにＳｐｌＢプロテアーゼおよびＴＣＥＰ（ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン）を融合タンパク質：プロテアーゼ：ＴＣＥＰのモル比率３：１：１で添加し、２５℃で一晩インキュベートした。翌日、切断の程度を１０％トリシン－ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで検査した。消化したサンプルを２００００×ｇで１０分間遠心分離した後、０．２μｍのメンブレンで濾過した後、Ａｋｔａピュアシステムで行われる陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。サンプルを、洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）で予め平衡化した５ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、カラムを５カラム容積の洗浄緩衝液で洗浄した。次に、２５分かけて０～５０％の溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ）の直線勾配を２ｍＬ／分の流速で用いて、サンプルを溶出した。溶出した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで解析した。ＣＴＸ誘導体を含む画分をプールし、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＪｕｐｉｔｅｒ １０μ Ｃ５ ３００Åカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にロードした。移動相には、０．１％ギ酸を添加したＨＰＬＣグレードの水（緩衝液Ａ）および０．１％ギ酸を添加したアセトニトリル（緩衝液Ｂ）が含まれた。タンパク質は、２ｍｌ／分で３０分かけて１５～４５％の緩衝液Ｂの直線勾配でカラムから溶出した。溶出した画分を１０％トリシン－ＳＤＳゲルで解析し、ＣＴＸＤを含む画分をプールした。サンプルの濃度は、凍結乾燥に供する前に、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。タンパク質の純度および分子量は、その後のＨＰＬＣ－ＵＶ／ＭＳ測定により決定した。
【0169】
実施例２～４では、コンジュゲートＣＴＸ、ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８の合成を示す。
【実施例2】
【0170】
フルオロフォア標識ＣＴＸ、ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８の合成
シアニン５標識ＣＴＸ、およびＣＴＸバリアントおよび誘導体の合成
０．１ＮのＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸ（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したシアニン５Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｙ５－ＮＨＳエステル、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）の混合物を用いて、ＣＴＸ－Ｃｙ５（モノコンジュゲート）を合成した。染料溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：０．９（ＣＴＸ／染料）および溶媒比１／１０（重炭酸塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは、室温で１時間行った。反応後のサンプルは、逆相クロマトグラフィーを用いて均質になるように精製した。サンプルを、ＰＤＡ ９９６検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ ＨＰＬＣシステムに接続したＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（３．５μｍ ４．６×５０ｍｍ）にロードした。移動相は０．１％ギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水（緩衝液Ａ）とアセトニトリル（緩衝液Ｂ）を含んでいた。ＣＴＸ－Ｃｙ５は、２０秒間の画分を回収することにより、２ｍＬ／分の流速で０．５分～４．５分、５～７０％の緩衝液Ｂの直線勾配を用いてカラムから溶出した。吸光度クロマトグラムは６５０ｎｍでモニターした。関連する画分サンプルを質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＳＱＤ；イオン化：ＥＳ＋／ＥＳ－、ソースブロック温度：１５０℃、脱溶媒温度：２５０℃、脱溶媒ガス：６５０Ｌ／ｈ、コーンガス：８０Ｌ／ｈ、キャピラリー：３０００Ｖ、コーン：３０Ｖ、エクストラクタ：６Ｖ、Ｒｆレンズ：０．１Ｖ、スキャン：１秒あたり８０～１０００ｍ／ｚ、スキャン間遅延：０．１秒）で解析し、純粋なモノコンジュゲートＣＴＸ－Ｃｙ５を含む画分をプールし、サンプルの分子量および純度をＨＰＬＣ質量分析で確認した。最後に、得られたサンプルを凍結乾燥した。Ｃｙ５標識ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、基本的に同じプロセスで合成した。
シアニン５標識ＣＴＸ、およびＣＴＸバリアントおよび誘導体の合成
０．１ＮのＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸ（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したシアニン５Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｙ５－ＮＨＳエステル、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）の混合物を用いて、ＣＴＸ－Ｃｙ５（モノコンジュゲート）を合成した。染料溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：０．９（ＣＴＸ／染料）および溶媒比１／１０（重炭酸塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは、室温で１時間行った。反応後のサンプルは、逆相クロマトグラフィーを用いて均質になるように精製した。サンプルを、ＰＤＡ ９９６検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ ＨＰＬＣシステムに接続したＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（３．５μｍ ４．６×５０ｍｍ）にロードした。移動相は０．１％ギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水（緩衝液Ａ）とアセトニトリル（緩衝液Ｂ）を含んでいた。ＣＴＸ－Ｃｙ５は、２０秒間の画分を回収することにより、２ｍＬ／分の流速で０．５分～４．５分、５～７０％の緩衝液Ｂの直線勾配を用いてカラムから溶出した。吸光度クロマトグラムは６５０ｎｍでモニターした。関連する画分サンプルを質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＳＱＤ；イオン化：ＥＳ＋／ＥＳ－、ソースブロック温度：１５０℃、脱溶媒温度：２５０℃、脱溶媒ガス：６５０Ｌ／ｈ、コーンガス：８０Ｌ／ｈ、キャピラリー：３０００Ｖ、コーン：３０Ｖ、エクストラクタ：６Ｖ、Ｒｆレンズ：０．１Ｖ、スキャン：１秒あたり８０～１０００ｍ／ｚ、スキャン間遅延：０．１秒）で解析し、純粋なモノコンジュゲートＣＴＸ－Ｃｙ５を含む画分をプールし、サンプルの分子量および純度をＨＰＬＣ質量分析で確認した。最後に、得られたサンプルを凍結乾燥した。Ｃｙ５標識ｒＣＴＸ、ｍＣＴＸ、ＣＴＸＤ５およびＣＴＸＤ８は、基本的に同じプロセスで合成した。
【0171】
Ａｌｅｘａ ４８８標識ＣＴＸ、およびＣＴＸバリアントならびに誘導体の合成
Ａｌｅｘａ ４８８標識ＣＴＸ（ＣＴＸ－Ａ４８８）も、出発反応性色素化合物がＡｌｅｘａ ４８８テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルであることを除き、同様のプロセスで合成した。
Ａｌｅｘａ ４８８標識ＣＴＸ（ＣＴＸ－Ａ４８８）も、出発反応性色素化合物がＡｌｅｘａ ４８８テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルであることを除き、同様のプロセスで合成した。
【実施例3】
【0172】
ビオチン化ＣＴＸＤの合成
０．１ＮのＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸＤ（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡを添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したビオチン３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）との混合物を用いて、ビオチン化ＣＴＸＤ（モノコンジュゲート）を合成した。活性化ビオチン溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：１（ＣＴＸ／ビオチン）および溶媒比１：１０（炭酸水素塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは室温で１時間行った。反応後のサンプルは、逆相クロマトグラフィーを用いて均一に精製した。サンプルをＰＤＡ ９９６検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ ＨＰＬＣシステムに接続したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５カラム（３００Å ４．６×２５０ｍｍ）にロードした。移動相は０．１％ギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）を含んでいた。ＣＴＸＤ－ビオチンは、２７秒の画分を回収することによって、１．８ｍＬ／分の流速で、５分～１２分で７分間、溶出液Ｂの５～７０％直線勾配を用いてカラムから溶出した。吸光度クロマトグラムは２８０ｎｍでモニターした。関連する画分サンプルを質量分析計で解析し、純粋なモノコンジュゲートＣＴＸＤ－ビオチンを含む画分をプールし、サンプルの分子量および純度をＨＰＬＣ質量分析で確認した。最後に、得られたサンプルを凍結乾燥した。
０．１ＮのＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸＤ（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡを添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したビオチン３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）との混合物を用いて、ビオチン化ＣＴＸＤ（モノコンジュゲート）を合成した。活性化ビオチン溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：１（ＣＴＸ／ビオチン）および溶媒比１：１０（炭酸水素塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは室温で１時間行った。反応後のサンプルは、逆相クロマトグラフィーを用いて均一に精製した。サンプルをＰＤＡ ９９６検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ ＨＰＬＣシステムに接続したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５カラム（３００Å ４．６×２５０ｍｍ）にロードした。移動相は０．１％ギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）を含んでいた。ＣＴＸＤ－ビオチンは、２７秒の画分を回収することによって、１．８ｍＬ／分の流速で、５分～１２分で７分間、溶出液Ｂの５～７０％直線勾配を用いてカラムから溶出した。吸光度クロマトグラムは２８０ｎｍでモニターした。関連する画分サンプルを質量分析計で解析し、純粋なモノコンジュゲートＣＴＸＤ－ビオチンを含む画分をプールし、サンプルの分子量および純度をＨＰＬＣ質量分析で確認した。最後に、得られたサンプルを凍結乾燥した。
【実施例4】
【0173】
ＣＴＸＤ５－グルタリル－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびｍＣＴＸ－グルタリル－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦの合成
ＣＴＸ受容体ベースの標的化化学療法剤が設計され、これは、標的化タンパク質としてＣＴＸ誘導体、細胞内切断カテプシンＢ酵素感受性リンカー（グルタリル－バリン－シトルリン－Ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル、略称Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ）およびペイロードとして細胞分裂阻害モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む。試験のために、Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦコンジュゲートを、ＣＴＸＤ５またはｍＣＴＸのいずれかを標的分子として用いて以下の手順にしたがって合成した：
ＣＴＸ受容体ベースの標的化化学療法剤が設計され、これは、標的化タンパク質としてＣＴＸ誘導体、細胞内切断カテプシンＢ酵素感受性リンカー（グルタリル－バリン－シトルリン－Ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル、略称Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ）およびペイロードとして細胞分裂阻害モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む。試験のために、Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦコンジュゲートを、ＣＴＸＤ５またはｍＣＴＸのいずれかを標的分子として用いて以下の手順にしたがって合成した：
【0174】
工程１：ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦの合成
出発物質は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入したＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル保護基；ＰＮＰ＝パラニトロフェニル）およびＭＭＡＦ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）であった。出発物質（Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ ２８ｍｇおよびＭＭＡＦ ２７ｍｇ、モル比１．２５：１）を、５．６ｍｇの１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および３μＬのＤＩＰＥＡを含む３．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。室温で１時間反応させた後、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンを添加し、室温で２０分間反応させてＦｍｏｃ保護基を除去し、サンプルを２４８７二波長吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ６００半分取逆相ＨＰＬＣシステムに接続したＳｕｎ Ｆｉｒｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）で精製した。
出発物質は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入したＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル保護基；ＰＮＰ＝パラニトロフェニル）およびＭＭＡＦ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）であった。出発物質（Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ ２８ｍｇおよびＭＭＡＦ ２７ｍｇ、モル比１．２５：１）を、５．６ｍｇの１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および３μＬのＤＩＰＥＡを含む３．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。室温で１時間反応させた後、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンを添加し、室温で２０分間反応させてＦｍｏｃ保護基を除去し、サンプルを２４８７二波長吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ６００半分取逆相ＨＰＬＣシステムに接続したＳｕｎ Ｆｉｒｅ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）で精製した。
【0175】
移動相は０．１％ギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）を含んでいた。生成物は、１３ｍＬ／分の流速で、５分～１６分、５～７０％の溶出液Ｂの直線勾配を用いてカラムから溶出した。吸光度クロマトグラムは２８０ｎｍでモニターした。関連する画分サンプルを質量分析計で解析し、純粋に標的化合物（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）を含む画分をプールし、凍結乾燥した。
【0176】
工程２：ＮＨＳ－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦの合成
この反応の出発物質は、先に合成したＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびＳｉｇｍａから購入したグルタル酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）である。両方の出発物質を４－４ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、前者には３μＬのＤＩＰＥＡを添加した。次に、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ溶液をグルタル酸ジスクシンイミジル溶液に約３０分かけて滴加し、一晩反応させた。翌日、標的化合物を上記のようにＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ＣＴＸＤとカップリングするまで－２０℃で保存した。
この反応の出発物質は、先に合成したＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびＳｉｇｍａから購入したグルタル酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）である。両方の出発物質を４－４ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、前者には３μＬのＤＩＰＥＡを添加した。次に、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ溶液をグルタル酸ジスクシンイミジル溶液に約３０分かけて滴加し、一晩反応させた。翌日、標的化合物を上記のようにＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ＣＴＸＤとカップリングするまで－２０℃で保存した。
【0177】
工程３：Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦとＣＴＸ誘導体へのカップリング
カップリング反応は、ＣＴＸＤ５またはｍＣＴＸを用いて同一の方法で行った。カップリング反応は、０．１Ｎ ＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸＤ５（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）ＤＩＰＥＡを添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮＨＳ－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦの混合物を用いて行った。リンカーペイロード溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：２（ＣＴＸＤ／リンカーペイロード）および溶媒比１：１０（炭酸水素塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは室温で１時間行った。反応したサンプルは、Ｃｙ５コンジュゲート反応について上述したように、逆相クロマトグラフィーを用いて均質に精製した。ＮＨＳエステルリンカー－ペイロード分子は、モノリジンＣＴＸ誘導体中の唯一のリジン残基の一級アミンと主にコンジュゲートできるが、二次的にＮ末端アミンともコンジュゲートできるため、モノコンジュゲート（例えばＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）およびバイコンジュゲート（ＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２）誘導体の両方が形成された。したがって、モノコンジュゲート化合物とバイコンジュゲート化合物の両方を精製プロセスで別々に回収し、凍結乾燥後に生物学的調査に供した。
カップリング反応は、ＣＴＸＤ５またはｍＣＴＸを用いて同一の方法で行った。カップリング反応は、０．１Ｎ ＨＣ１でｐＨ８に調整した０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解したＣＴＸＤ５（１０ｍｇ／ｍＬ）と、０．１％（ｖ／ｖ）ＤＩＰＥＡを添加した無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮＨＳ－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦの混合物を用いて行った。リンカーペイロード溶液の濃度を設定し、２つの溶液をモル比１：２（ＣＴＸＤ／リンカーペイロード）および溶媒比１：１０（炭酸水素塩／ＤＭＦ）になるように混合した。コンジュゲートは室温で１時間行った。反応したサンプルは、Ｃｙ５コンジュゲート反応について上述したように、逆相クロマトグラフィーを用いて均質に精製した。ＮＨＳエステルリンカー－ペイロード分子は、モノリジンＣＴＸ誘導体中の唯一のリジン残基の一級アミンと主にコンジュゲートできるが、二次的にＮ末端アミンともコンジュゲートできるため、モノコンジュゲート（例えばＣＴＸＤ５－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）およびバイコンジュゲート（ＣＴＸＤ５（－Ｇ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）２）誘導体の両方が形成された。したがって、モノコンジュゲート化合物とバイコンジュゲート化合物の両方を精製プロセスで別々に回収し、凍結乾燥後に生物学的調査に供した。
【0178】
実施例５～９では、いくつかの試験プロトコルを示す。
【実施例5】
【0179】
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験は、様々な標的タンパク質に対するファージ提示または精製ＣＴＸＤリガンドタンパク質の結合強度の測定に使用した。この試験は、固定化コバルトコーティングしたＨｉｓ－Ｔａｇ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＆ Ｐｕｌｌｄｏｗｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１０１０４Ｄ）に様々なＨｉｓタグ化標的タンパク質（受容体）を固定化し、フルオロフォア標識リガンドを標的タンパク質に結合させ、フローサイトメトリーでビーズ結合蛍光強度を測定するという原理に基づいている。
Ｃｏ－ｂｅａｄ試験は、様々な標的タンパク質に対するファージ提示または精製ＣＴＸＤリガンドタンパク質の結合強度の測定に使用した。この試験は、固定化コバルトコーティングしたＨｉｓ－Ｔａｇ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＆ Ｐｕｌｌｄｏｗｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１０１０４Ｄ）に様々なＨｉｓタグ化標的タンパク質（受容体）を固定化し、フルオロフォア標識リガンドを標的タンパク質に結合させ、フローサイトメトリーでビーズ結合蛍光強度を測定するという原理に基づいている。
【0180】
Ｃｏ－ｂｅａｄの調製
各反応チューブ中で体積０．５μＬのビーズ（直径１μｍと特定）をピペッティングし、３回の洗浄を行った。各回の洗浄は、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含む２ｍＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液（ＴＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの２０ｘＴＢＳ、カタログ番号：２８３６０）（以下、洗浄液をＴＴと略する）にビーズを（再）懸濁し、チューブを磁気濃縮器（ＤｙｎａＭａｇ－５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１２３０３Ｄ）に入れ、１０分後に上清を捨てることを含む。その後、ビーズを５０μＬの標的タンパク質溶液中で４℃で一晩インキュベートした。本願で報告された研究では、全ての標的タンパク質を同一のモル濃度である０．１６μＭでアプライし：これは活性ＭＭＰ－２（ＭＷ ６２ｋＤａ）の場合、１０μｇ／ｍＬに相当する。標的タンパク質溶液はＴＢＳに溶解または希釈した。陰性対照ビーズは、標的タンパク質を含まないＴＢＳで同時にインキュベートした。使用した標的タンパク質は以下の通りである（ＮＣＢＩアクセッション番号［セグメントアミノ酸配列］；ｈｉｓ－ｔａｇの位置：Ｃ末端またはＮ末端；供給元；およびカタログ番号＃を括弧内に記載）：ＭＭＰ２（ＮＰ＿００４５２１．１［１１０－６６０］；Ｎ－；ＰｒｏＳｐｅｃ、＃ＥＮＺ－７６９）；ＮＲＰ１（ＮＰ＿００１０１９７９９．１［１－６４４］；Ｃ－；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；＃１００１１－Ｈ０８Ｈ）；ＭＭＰ－９（ＮＰ＿００４９８５．２［２０－７０１］；Ｃ－；ＰｒｏＳｐｅｃ；＃ＥＮＺ－１０９１）、ＴＩＭＰ－２ （ＮＰ＿００３２４６．１［２７－２２０］；Ｎ－；ＰｒｏＳｐｅｃ；＃ＥＮＺ－６４６）、ＭＭＰ－１４（ＮＰ＿００４９８６［２４－５２４］；Ｃ－；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；＃ＲＰ７７５３３）、Ａｎｘ２（ＮＰ＿００１００２８５７．１［１－３３９］；Ｎ－；ＰｒｏｓＰｅｃ；＃ＰＲＯ－７７７）、αｖβ３インテグリン（ＡＡＡ５２５８９．１＆ＮＰ＿００２１９６．４ヘテロ二量体；共にＣ－末端ｈｉｓ－タグを有する；Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ；＃ＲＥＣ３１７１９－１００）、ＣＬＣ３（ＮＰ＿００１８２０．２［１－８１８］；Ｃ－；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｌ）での組換え発現によるカスタムメイド）、ヒト血清アルブミン（ＮＰ＿０００４６８．１［２５－６０９］；Ｃ－；Ａｂｃａｍ；＃ａｂ２１７８１７）。標的タンパク質のインキュベート後、ビーズを３回洗浄し、次いで１００μＬのＣａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｓｉｇｍａ、＃Ｂ６４２９）で室温で１時間インキュベートしてブロッキングした後、３回洗浄した。その後のプロセスは、ファージ提示タンパク質、ならびに精製および標識タンパク質試験物によって異なる。
各反応チューブ中で体積０．５μＬのビーズ（直径１μｍと特定）をピペッティングし、３回の洗浄を行った。各回の洗浄は、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含む２ｍＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液（ＴＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの２０ｘＴＢＳ、カタログ番号：２８３６０）（以下、洗浄液をＴＴと略する）にビーズを（再）懸濁し、チューブを磁気濃縮器（ＤｙｎａＭａｇ－５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１２３０３Ｄ）に入れ、１０分後に上清を捨てることを含む。その後、ビーズを５０μＬの標的タンパク質溶液中で４℃で一晩インキュベートした。本願で報告された研究では、全ての標的タンパク質を同一のモル濃度である０．１６μＭでアプライし：これは活性ＭＭＰ－２（ＭＷ ６２ｋＤａ）の場合、１０μｇ／ｍＬに相当する。標的タンパク質溶液はＴＢＳに溶解または希釈した。陰性対照ビーズは、標的タンパク質を含まないＴＢＳで同時にインキュベートした。使用した標的タンパク質は以下の通りである（ＮＣＢＩアクセッション番号［セグメントアミノ酸配列］；ｈｉｓ－ｔａｇの位置：Ｃ末端またはＮ末端；供給元；およびカタログ番号＃を括弧内に記載）：ＭＭＰ２（ＮＰ＿００４５２１．１［１１０－６６０］；Ｎ－；ＰｒｏＳｐｅｃ、＃ＥＮＺ－７６９）；ＮＲＰ１（ＮＰ＿００１０１９７９９．１［１－６４４］；Ｃ－；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；＃１００１１－Ｈ０８Ｈ）；ＭＭＰ－９（ＮＰ＿００４９８５．２［２０－７０１］；Ｃ－；ＰｒｏＳｐｅｃ；＃ＥＮＺ－１０９１）、ＴＩＭＰ－２ （ＮＰ＿００３２４６．１［２７－２２０］；Ｎ－；ＰｒｏＳｐｅｃ；＃ＥＮＺ－６４６）、ＭＭＰ－１４（ＮＰ＿００４９８６［２４－５２４］；Ｃ－；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；＃ＲＰ７７５３３）、Ａｎｘ２（ＮＰ＿００１００２８５７．１［１－３３９］；Ｎ－；ＰｒｏｓＰｅｃ；＃ＰＲＯ－７７７）、αｖβ３インテグリン（ＡＡＡ５２５８９．１＆ＮＰ＿００２１９６．４ヘテロ二量体；共にＣ－末端ｈｉｓ－タグを有する；Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ；＃ＲＥＣ３１７１９－１００）、ＣＬＣ３（ＮＰ＿００１８２０．２［１－８１８］；Ｃ－；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｌ）での組換え発現によるカスタムメイド）、ヒト血清アルブミン（ＮＰ＿０００４６８．１［２５－６０９］；Ｃ－；Ａｂｃａｍ；＃ａｂ２１７８１７）。標的タンパク質のインキュベート後、ビーズを３回洗浄し、次いで１００μＬのＣａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｓｉｇｍａ、＃Ｂ６４２９）で室温で１時間インキュベートしてブロッキングした後、３回洗浄した。その後のプロセスは、ファージ提示タンパク質、ならびに精製および標識タンパク質試験物によって異なる。
【0181】
ファージ提示の暴露および染色
ファージ提示タンパク質（ＣＴＸおよびＣＴＸＤ）のリガンドを試験する場合、調製したビーズを試験モノクローナルファージ溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。ファージは、０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（以下ＴＢＴと略記）を含むファージおよび抗体インキュベート緩衝液ＴＢＳに溶解した。ファージ暴露後、ビーズを３回洗浄した後、１：２００希釈のマウスモノクローナル抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１１９７３－ＭＭ０５）を含む５０μＬのＴＢＴ中で、４℃で３０分間インキュベートした。その後、ビーズを３回洗浄し、１：１０００に希釈したＣｙ５標識ヤギ抗マウス二次抗体を含む５０μＬのＴＢＴ中、４℃で３０分間インキュベートした。３回の最終洗浄後、ビーズを２ｍＬのＴＴに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
ファージ提示タンパク質（ＣＴＸおよびＣＴＸＤ）のリガンドを試験する場合、調製したビーズを試験モノクローナルファージ溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。ファージは、０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０（以下ＴＢＴと略記）を含むファージおよび抗体インキュベート緩衝液ＴＢＳに溶解した。ファージ暴露後、ビーズを３回洗浄した後、１：２００希釈のマウスモノクローナル抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１１９７３－ＭＭ０５）を含む５０μＬのＴＢＴ中で、４℃で３０分間インキュベートした。その後、ビーズを３回洗浄し、１：１０００に希釈したＣｙ５標識ヤギ抗マウス二次抗体を含む５０μＬのＴＢＴ中、４℃で３０分間インキュベートした。３回の最終洗浄後、ビーズを２ｍＬのＴＴに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
【0182】
フルオロフォア標識試験物質曝露
フルオロフォア標識試験物質（例えば、ＣＴＸ－Ｃｙ５またはＣＴＸＤ－Ｃｙ５）を試験するため、標的タンパク質でコーティングし、カゼインでブロッキングしたビーズを、標識試験物質を特定の濃度で含む５０μＬの試験溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。試験溶液は、例えば、１０～１４％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水に溶解した１００μＭの試験物質のストック溶液をＴＴで希釈することにより調製した。試験溶液とインキュベートした後、ビーズを３回洗浄し、２ｍＬのＴＴに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
フルオロフォア標識試験物質（例えば、ＣＴＸ－Ｃｙ５またはＣＴＸＤ－Ｃｙ５）を試験するため、標的タンパク質でコーティングし、カゼインでブロッキングしたビーズを、標識試験物質を特定の濃度で含む５０μＬの試験溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。試験溶液は、例えば、１０～１４％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水に溶解した１００μＭの試験物質のストック溶液をＴＴで希釈することにより調製した。試験溶液とインキュベートした後、ビーズを３回洗浄し、２ｍＬのＴＴに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
【0183】
フローサイトメトリーによるビーズ結合蛍光強度の測定
フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）を用い、励起のために６３５ｎｍの赤色レーザー、およびパルスエリアモードでの蛍光強度測定のためにＲ１チャンネルを使用してフローサイトメトリー解析を行った。吸引容積は１サンプルあたり２００μＬで、穏やかに混合するように設定し、１サンプルあたり１００００イベントを収集した。流速は遅く設定され、最大イベント数は毎秒５００であった。この包括的な楕円ゲートは、主要ビーズ集団の周辺で適用され、これは、陰性対照ビーズで得られた前方散乱対側方散乱のドットプロットに基づいて設定し、ダブレットおよびマルチプレットに関連するイベントが解析から除外されるようにした。ゲーティングは、同じ種類のビーズを用いた全ての実験を通して一定に保った。結合の定量的特性評価には、ゲーティングされたイベントの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を用いた。結果はＭＦＩまたは相対蛍光強度（ＲＦＩ）で表され、後者は同時に処理した関連する陰性対照サンプルのＭＦＩに対するサンプルのＭＦＩの比として定義される。陰性対照サンプルは、ビーズが標的タンパク質でコーティングされていないことを除き、全ての調製、ブロッキング、および染色の手順に供した。結合強度（すなわち、ビーズに結合したファージ／タンパク質の数／量）の評価には、デルタＭＦＩ値またはデルタＲＦＩ値を用い、これらは陰性対照サンプルの値に対する増加（差）を意味する。
フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）を用い、励起のために６３５ｎｍの赤色レーザー、およびパルスエリアモードでの蛍光強度測定のためにＲ１チャンネルを使用してフローサイトメトリー解析を行った。吸引容積は１サンプルあたり２００μＬで、穏やかに混合するように設定し、１サンプルあたり１００００イベントを収集した。流速は遅く設定され、最大イベント数は毎秒５００であった。この包括的な楕円ゲートは、主要ビーズ集団の周辺で適用され、これは、陰性対照ビーズで得られた前方散乱対側方散乱のドットプロットに基づいて設定し、ダブレットおよびマルチプレットに関連するイベントが解析から除外されるようにした。ゲーティングは、同じ種類のビーズを用いた全ての実験を通して一定に保った。結合の定量的特性評価には、ゲーティングされたイベントの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を用いた。結果はＭＦＩまたは相対蛍光強度（ＲＦＩ）で表され、後者は同時に処理した関連する陰性対照サンプルのＭＦＩに対するサンプルのＭＦＩの比として定義される。陰性対照サンプルは、ビーズが標的タンパク質でコーティングされていないことを除き、全ての調製、ブロッキング、および染色の手順に供した。結合強度（すなわち、ビーズに結合したファージ／タンパク質の数／量）の評価には、デルタＭＦＩ値またはデルタＲＦＩ値を用い、これらは陰性対照サンプルの値に対する増加（差）を意味する。
【0184】
ＣＴＸＤを提示するファージの結合強度を評価する間（例えば、表Ｉおよび表ＩＩに示す結果）、ＣＴＸ発現ファージ溶液も同じ実験で同一のファージ濃度（１．０８～４．０８×１０１４ファージ粒子／ｍＬの範囲）で試験し、ＣＴＸＤの相対的ＭＭＰ－２結合強度（デルタＲＦＩ）をＣＴＸのデルタＲＦＩで正規化（除算）した。表Ｉに示した相対的ＭＭＰ－２結合強度の値は、Ｎ回の実験の平均である。Ｎは、ｍＣＴＸおよび特許請求される化合物（化合物３～１８）について少なくとも３であった。
【実施例6】
【0185】
Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験
Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験は、ＭａｇｎａＢｉｎｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：２１３５６）、すなわちヤギ抗ウサギ抗体を工場でコーティングしたマイクロビーズに標的タンパク質特異的ウサギＩｇＧ抗体を介して標的タンパク質を固定し、フルオロフォア標識リガンドを標的タンパク質に結合させ、ビーズ結合蛍光強度をフローサイトメトリーで測定するという原理に基づいている。ＭＭＰ－２およびＮＲＰ－１標的タンパク質に対するフルオロフォア標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤリガンドタンパク質の濃度－結合関係の特性評価にＭａｇｎａｂｅａｄ試験を使用し、それによって半最大有効濃度（ＥＣ５０値）の測定による相対的結合親和性を特性評価した。この方法は、ＭＭＰ－２またはＮＲＰ１標的タンパク質上の受容体からのフルオロフォア標識ＣＴＸの結合の置換（阻害）を測定することにより、非標識ＣＴＸＤおよびコンジュゲートＣＴＸ誘導体の相対的親和性を特性評価するためにも有用である。このようにして、種々のＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤ誘導体の親和性を比較するために、半最大阻害濃度（ＩＣ５０値）を測定した。
Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験は、ＭａｇｎａＢｉｎｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：２１３５６）、すなわちヤギ抗ウサギ抗体を工場でコーティングしたマイクロビーズに標的タンパク質特異的ウサギＩｇＧ抗体を介して標的タンパク質を固定し、フルオロフォア標識リガンドを標的タンパク質に結合させ、ビーズ結合蛍光強度をフローサイトメトリーで測定するという原理に基づいている。ＭＭＰ－２およびＮＲＰ－１標的タンパク質に対するフルオロフォア標識ＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤリガンドタンパク質の濃度－結合関係の特性評価にＭａｇｎａｂｅａｄ試験を使用し、それによって半最大有効濃度（ＥＣ５０値）の測定による相対的結合親和性を特性評価した。この方法は、ＭＭＰ－２またはＮＲＰ１標的タンパク質上の受容体からのフルオロフォア標識ＣＴＸの結合の置換（阻害）を測定することにより、非標識ＣＴＸＤおよびコンジュゲートＣＴＸ誘導体の相対的親和性を特性評価するためにも有用である。このようにして、種々のＣＴＸ、ｍＣＴＸおよびＣＴＸＤ誘導体の親和性を比較するために、半最大阻害濃度（ＩＣ５０値）を測定した。
【0186】
Ｍａｇｎａｂｅａｄ調製
各反応チューブ中で体積１μＬのビーズ（ビーズ直径１～４ｐｍと特定）をピペッティングし、３回の洗浄を行った。各回の洗浄は、ビーズを２ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ８６６２）に（再）懸濁し、チューブを磁気濃縮器（ＤｙｎａＭａｇ－５；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１２３０３Ｄ）に入れ、１０分後に上清を捨てることを含む。その後、ビーズを１：１００に希釈した試験標的タンパク質に対するウサギ抗体を含む５０μＬのＤＰＢＳ中で、４℃で１時間インキュベートした。使用した抗ＭＭＰ－２抗体はポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：ＰＡＩ－１６６６７）であり、これは長さ６６０アミノ酸のヒトＭＭＰ－２タンパク質（ＮＰ＿００４５２１．１）のアミノ酸位置５０４－５１８の合成配列に対して産生した。ＭＭＰ－２タンパク質は、成熟活性酵素（例えば、ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ ＃Ｅｎｚ－１００またはＳｉｇｍａ ＃ＳＲＰ３１１８）またはプロ酵素（例えば、ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ ＃Ｅｎｚ－７６９またはＳｉｇｍａ ＃ＳＲＰ６２７０）のいずれでもよく、これらは非常に類似したＣＴＸ結合結果を有する。使用した抗ＮＲＰｌ抗体はポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：ＰＡ５－２６０７９）で、９２３アミノ酸長のヒトＮＲＰ１タンパク質（ＮＰ＿００３８６４．５）のアミノ酸位置７２２－７５０の合成配列に対して産生した。抗体によってビーズに固定されたＮＲＰ１タンパク質は、９２３アミノ酸長の配列のうち８４３アミノ酸（２２～８５６）を含む単一のグリコシル化ポリペプチド鎖として組換え産生された（ＰｒｏｓＰｅｃ、カタログ番号：Ｃｙｔ－１０５９）。２回目の抗体コーティング後、ビーズを３回洗浄し、０．１６μＭの濃度で選択した標的タンパク質（例えば、ＭＭＰ－２またはＮＲＰ１）を含む５０μＬのＤＰＢＳ中で、室温で１時間インキュベートした。Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験の場合、非特異的結合を除去するためにブロッキングインキュベーションを行う必要はなかった。
各反応チューブ中で体積１μＬのビーズ（ビーズ直径１～４ｐｍと特定）をピペッティングし、３回の洗浄を行った。各回の洗浄は、ビーズを２ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ８６６２）に（再）懸濁し、チューブを磁気濃縮器（ＤｙｎａＭａｇ－５；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１２３０３Ｄ）に入れ、１０分後に上清を捨てることを含む。その後、ビーズを１：１００に希釈した試験標的タンパク質に対するウサギ抗体を含む５０μＬのＤＰＢＳ中で、４℃で１時間インキュベートした。使用した抗ＭＭＰ－２抗体はポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：ＰＡＩ－１６６６７）であり、これは長さ６６０アミノ酸のヒトＭＭＰ－２タンパク質（ＮＰ＿００４５２１．１）のアミノ酸位置５０４－５１８の合成配列に対して産生した。ＭＭＰ－２タンパク質は、成熟活性酵素（例えば、ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ ＃Ｅｎｚ－１００またはＳｉｇｍａ ＃ＳＲＰ３１１８）またはプロ酵素（例えば、ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ ＃Ｅｎｚ－７６９またはＳｉｇｍａ ＃ＳＲＰ６２７０）のいずれでもよく、これらは非常に類似したＣＴＸ結合結果を有する。使用した抗ＮＲＰｌ抗体はポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：ＰＡ５－２６０７９）で、９２３アミノ酸長のヒトＮＲＰ１タンパク質（ＮＰ＿００３８６４．５）のアミノ酸位置７２２－７５０の合成配列に対して産生した。抗体によってビーズに固定されたＮＲＰ１タンパク質は、９２３アミノ酸長の配列のうち８４３アミノ酸（２２～８５６）を含む単一のグリコシル化ポリペプチド鎖として組換え産生された（ＰｒｏｓＰｅｃ、カタログ番号：Ｃｙｔ－１０５９）。２回目の抗体コーティング後、ビーズを３回洗浄し、０．１６μＭの濃度で選択した標的タンパク質（例えば、ＭＭＰ－２またはＮＲＰ１）を含む５０μＬのＤＰＢＳ中で、室温で１時間インキュベートした。Ｍａｇｎａｂｅａｄ試験の場合、非特異的結合を除去するためにブロッキングインキュベーションを行う必要はなかった。
【0187】
試験物質の暴露
フルオロフォア標識試験物質（例えば、ＣＴＸ－Ｃｙ５、もしくはＣＴＸＤ－Ｃｙ５、またはＣＴＸ－Ａ４８８）の試験では、標的タンパク質でコーティングしたビーズを、標識試験物質を特定濃度で含む試験溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。試験溶液は、例えば、１０～１４％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水に１００μＭの試験物質を溶解したストック溶液をＤＰＢＳで希釈することによって調製した。試験溶液と共にインキュベートした後、ビーズを３回洗浄し、２ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
フルオロフォア標識試験物質（例えば、ＣＴＸ－Ｃｙ５、もしくはＣＴＸＤ－Ｃｙ５、またはＣＴＸ－Ａ４８８）の試験では、標的タンパク質でコーティングしたビーズを、標識試験物質を特定濃度で含む試験溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。試験溶液は、例えば、１０～１４％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水に１００μＭの試験物質を溶解したストック溶液をＤＰＢＳで希釈することによって調製した。試験溶液と共にインキュベートした後、ビーズを３回洗浄し、２ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
【0188】
非標識試験物質を試験する場合、標的タンパク質でコーティングしたビーズを、ＤＰＢＳに溶解した特定濃度の非標識試験物質を含む５０μＬの試験溶液に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。次に、２μＭの標識ＣＴＸ（ＣＴＸ－Ｃｙ５またはＣＴＸ－Ａ４８８）と特定濃度の非標識試験物質を含む５０μＬのＤＰＢＳ溶液を添加し、１μＭの標識ＣＴＸ（置換指示リガンド）と特定濃度の非標識試験物質（置換リガンド）中でビーズをインキュベートした。ビーズを室温でさらに１時間インキュベートした後、３回洗浄し、２ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー測定の準備とした。
【0189】
フローサイトメトリーによるビーズ結合蛍光強度の測定
フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）を用い、励起に６３５ｎｍ赤色レーザー、およびＣｙ５標識リガンド結合の蛍光強度測定にＲ１チャンネル、または励起に４８８ｎｍ青色レーザー、およびＡ４８８標識リガンド結合の蛍光強度測定にＢｌチャンネルを用い、パルスエリアモードでフローサイトメトリー解析を行った。吸引容積は１サンプルあたり２００μＬで、穏やかに混合するように設定し、１サンプルあたり１００００イベントを収集した。流速は遅く設定され、最大イベント数は毎秒５００であった。この包括的楕円ゲートは、主要ビーズ集団の周辺で適用され、これは、陰性対照ビーズで得られた前方散乱対側方散乱のドットプロットに基づいて設定され、ダブレットおよびマルチプレットに関連するイベントが解析から除外されるようにした。ゲーティングは、同じ種類のビーズを用いた全ての実験を通して一定に保った。
フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）を用い、励起に６３５ｎｍ赤色レーザー、およびＣｙ５標識リガンド結合の蛍光強度測定にＲ１チャンネル、または励起に４８８ｎｍ青色レーザー、およびＡ４８８標識リガンド結合の蛍光強度測定にＢｌチャンネルを用い、パルスエリアモードでフローサイトメトリー解析を行った。吸引容積は１サンプルあたり２００μＬで、穏やかに混合するように設定し、１サンプルあたり１００００イベントを収集した。流速は遅く設定され、最大イベント数は毎秒５００であった。この包括的楕円ゲートは、主要ビーズ集団の周辺で適用され、これは、陰性対照ビーズで得られた前方散乱対側方散乱のドットプロットに基づいて設定され、ダブレットおよびマルチプレットに関連するイベントが解析から除外されるようにした。ゲーティングは、同じ種類のビーズを用いた全ての実験を通して一定に保った。
【0190】
標識リガンドの結合の定量的特性評価には、ゲートイベントのＭＦＩを用いた。結果はデルタＲＦＩ（ＲＦＩマイナス１）値で表した。標識試験物質の相対的親和性は、デルタＲＦＩ値を対数濃度に対してプロットし、シグモイド曲線フィッティング（ボルツマン関数）により半最大有効濃度（ＥＣ５０）を決定することにより評価した。
【0191】
置換試験では、結果を標識リガンド結合の阻害パーセント（置換％）に変換し、対数濃度に対する置換％をプロットし、シグモイド曲線フィッティングにより半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することにより、非標識試験物質の相対的親和性を評価した。
【実施例7】
【0192】
ファージ提示リガンドペプチド結合測定用ファージの調製
ファージ提示試験溶液は、慣用的なファージ提示プロトコルにしたがって調製した［例えば、Ｔｏｎｉｋｉａｎ ２００７］。発現ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをリン酸化およびアニーリングし、ｐＡＳ６２ファージミドベクター［米国特許第８７１６４３７号広報、３２段、第４８～４９列］にベクター／インサート比１：３でライゲーションした。インサートを含むファージミドは、Ｐ３コートタンパク質に融合したリンカーペプチド配列（ＧＳＡＳＳＡ）でＣ末端を拡張した提示タンパク質をコードしていた。エレクトロコンピテント細菌細胞（大腸菌ＳＳ３２０）をライゲーション産物で形質転換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むライソジェニーブロス寒天培地（ＬＢ／Ａｍｐ）プレートにストリークし、３７℃で１６時間インキュベートした。この条件下では、ファージミド保有細胞のみが生存し、コロニーを形成する。数個のクローンの塩基配列を決定し、標的配列を確認した単一コロニーを３ｍＬの２ＹＴ／Ａｍｐブロスに接種し、３７℃で培養が中対数期に達するまでインキュベートした。培養物にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ファージ／細胞比１０：１）を感染させ、３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬの培養物を２００ｍＬの２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎブロスに移し、一晩インキュベートした。一晩の細胞培養物（２００ｍＬ）を、４００ｍＬ遠沈管で８０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離してペレット化した。上清を４０ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２００ｇ／Ｌ ＰＥＧ－８０００、１４６．１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）を含む新しい４００ｍＬ遠心チューブに移した後、十分に混合した後、室温で２０分間インキュベートした。沈殿したファージを１８０００×ｇ、１５分間、室温で遠心分離してペレット化した。上清を捨てた後、ペレットを接線方向に向けて１０００ｒｐｍで１分間再度遠心分離し、残留流体を回収および除去した。ファージを４ｍＬのファージ再懸濁緩衝液（ＴＢＴ）に可溶化し、１８０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離して不溶物質を全て除去した。上清を４本の１．５ｍＬ遠心チューブ（４×１ｍＬ）に移し、２００－２００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌで再度沈殿させ、さらに５分間インキュベートした後、１２０００×ｇで再度遠心分離した。ペレットを少ない体積（１５０～３００μＬ）のファージ再懸濁緩衝液に再懸濁し、合わせて単一のファージ溶液にした。ファージ溶液の粒子濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ Ｃ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分光光度計を用いて、０．５～１０の吸光度範囲における吸光度（ＯＤ２６８）とファージ力価の直線関係に基づいて分光光度法で決定した。ファージ粒子濃度は式：（ＯＤ２６８－ＯＤ３２０）×５×ｌ０１２粒子／ｍＬにしたがって評価し［Ｔｏｎｉｋｉａｎ ２００７］；ＴＢＴで希釈することによって標的濃度に設定した。
ファージ提示試験溶液は、慣用的なファージ提示プロトコルにしたがって調製した［例えば、Ｔｏｎｉｋｉａｎ ２００７］。発現ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをリン酸化およびアニーリングし、ｐＡＳ６２ファージミドベクター［米国特許第８７１６４３７号広報、３２段、第４８～４９列］にベクター／インサート比１：３でライゲーションした。インサートを含むファージミドは、Ｐ３コートタンパク質に融合したリンカーペプチド配列（ＧＳＡＳＳＡ）でＣ末端を拡張した提示タンパク質をコードしていた。エレクトロコンピテント細菌細胞（大腸菌ＳＳ３２０）をライゲーション産物で形質転換した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むライソジェニーブロス寒天培地（ＬＢ／Ａｍｐ）プレートにストリークし、３７℃で１６時間インキュベートした。この条件下では、ファージミド保有細胞のみが生存し、コロニーを形成する。数個のクローンの塩基配列を決定し、標的配列を確認した単一コロニーを３ｍＬの２ＹＴ／Ａｍｐブロスに接種し、３７℃で培養が中対数期に達するまでインキュベートした。培養物にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ファージ／細胞比１０：１）を感染させ、３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬの培養物を２００ｍＬの２ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎブロスに移し、一晩インキュベートした。一晩の細胞培養物（２００ｍＬ）を、４００ｍＬ遠沈管で８０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離してペレット化した。上清を４０ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２００ｇ／Ｌ ＰＥＧ－８０００、１４６．１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）を含む新しい４００ｍＬ遠心チューブに移した後、十分に混合した後、室温で２０分間インキュベートした。沈殿したファージを１８０００×ｇ、１５分間、室温で遠心分離してペレット化した。上清を捨てた後、ペレットを接線方向に向けて１０００ｒｐｍで１分間再度遠心分離し、残留流体を回収および除去した。ファージを４ｍＬのファージ再懸濁緩衝液（ＴＢＴ）に可溶化し、１８０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離して不溶物質を全て除去した。上清を４本の１．５ｍＬ遠心チューブ（４×１ｍＬ）に移し、２００－２００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌで再度沈殿させ、さらに５分間インキュベートした後、１２０００×ｇで再度遠心分離した。ペレットを少ない体積（１５０～３００μＬ）のファージ再懸濁緩衝液に再懸濁し、合わせて単一のファージ溶液にした。ファージ溶液の粒子濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ Ｃ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分光光度計を用いて、０．５～１０の吸光度範囲における吸光度（ＯＤ２６８）とファージ力価の直線関係に基づいて分光光度法で決定した。ファージ粒子濃度は式：（ＯＤ２６８－ＯＤ３２０）×５×ｌ０１２粒子／ｍＬにしたがって評価し［Ｔｏｎｉｋｉａｎ ２００７］；ＴＢＴで希釈することによって標的濃度に設定した。
【実施例8】
【0193】
フローサイトメトリーによるフルオロフォア標識試験物質の細胞染色強度の解析
細胞は、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質抗真菌溶液（Ａｂ／Ａｍ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ５９５５）を添加した推奨培地中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。使用した細胞（括弧内は入手源＃カタログ番号および培養培地）は以下の通りである：Ｕ２５１ ＭＧヒト神経膠芽腫（Ｓｉｇｍａ ＃０９０６３００１、ＲＰＭＩ－１６４０）、Ｕ８７ ＭＧヒト神経膠芽腫（Ｓｉｇｍａ ＃８９０８１４０２、ＤＭＥＭ高グルコース）、ＰＡＮＣ－１ヒト膵臓癌（Ｓｉｇｍａ ＃８７０９２８０２、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ）、Ａ３７５ヒト黒色腫（Ｓｉｇｍａ ＃８８１１３００５、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ＳＫ－Ｂｒ－３ヒト乳癌（ＡｄｄｅｘＢｉｏ ＃Ｃ０００６００７、ＤＭＥＭ低グルコース）、ＴＥ－６７１ヒト横紋筋肉腫（Ｓｉｇｍａ ＃８５１１１５０２、ＤＭＥＭ高グルコース）、ＨＤＦａヒト皮膚線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ ＃１０６－０５Ａ、他の添加物を含まない線維芽細胞増殖培地）、ＨＵＶＥＣヒト内皮細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｃ００３５Ｃ、Ｌａｒｇｅ Ｖｅｓｓｅｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみを添加したＭｅｄｉｕｍ ２００）、新生児ラット星状細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ｎ７７４５１００、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、１５％ＦＢＳを添加）。
細胞は、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質抗真菌溶液（Ａｂ／Ａｍ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ５９５５）を添加した推奨培地中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。使用した細胞（括弧内は入手源＃カタログ番号および培養培地）は以下の通りである：Ｕ２５１ ＭＧヒト神経膠芽腫（Ｓｉｇｍａ ＃０９０６３００１、ＲＰＭＩ－１６４０）、Ｕ８７ ＭＧヒト神経膠芽腫（Ｓｉｇｍａ ＃８９０８１４０２、ＤＭＥＭ高グルコース）、ＰＡＮＣ－１ヒト膵臓癌（Ｓｉｇｍａ ＃８７０９２８０２、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ）、Ａ３７５ヒト黒色腫（Ｓｉｇｍａ ＃８８１１３００５、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ＳＫ－Ｂｒ－３ヒト乳癌（ＡｄｄｅｘＢｉｏ ＃Ｃ０００６００７、ＤＭＥＭ低グルコース）、ＴＥ－６７１ヒト横紋筋肉腫（Ｓｉｇｍａ ＃８５１１１５０２、ＤＭＥＭ高グルコース）、ＨＤＦａヒト皮膚線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ ＃１０６－０５Ａ、他の添加物を含まない線維芽細胞増殖培地）、ＨＵＶＥＣヒト内皮細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｃ００３５Ｃ、Ｌａｒｇｅ Ｖｅｓｓｅｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみを添加したＭｅｄｉｕｍ ２００）、新生児ラット星状細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃Ｎ７７４５１００、ＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、１５％ＦＢＳを添加）。
【0194】
培養液を除去した後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞解離酵素液を５～１０分間作用させて細胞を剥離し、ＦＢＳ添加培養液で酵素を失活させた。細胞を遠心分離で３回洗浄し、上清を捨ててＤＰＢＳに再懸濁した。３回目の洗浄後、懸濁液の細胞密度をＣｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０μＬのサンプルから決定し、０．４％ Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅによる対比染色によって生存率９５％超の基準を満たすかどうかも評価した。細胞密度は、ＤＰＢＳで希釈することによって、１ｍＬ当たり１００万～１５０万個に設定した。細胞懸濁液を１００μＬサンプルとして５ｍＬフローサイトメトリーチューブに分注し、標識試験物質（例えば、１００μＭのストック溶液を必要に応じて希釈したもの）または同等のビヒクル（例えば１０％ＤＭＳＯ溶液）を体積１～３μＬで添加した。次いで試験チューブは、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、試験チューブをチルラックに置き、２．５μＭのＰｏ－Ｐｒｏ－１を各チューブに添加して、４℃で１５分間インキュベートし、非生存細胞を染色した。その後、細胞を３回洗浄し、冷ＤＰＢＳ（２ｍＬ／チューブ）に再懸濁し、できるだけ早く、通常は１時間以内に行うフローサイトメトリー試験までチルラックに保管した。
【0195】
フローサイトメトリー解析は、フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）を用い、励起用６３５ｎｍ赤色レーザー、およびＣｙ５標識リガンド取込みの蛍光強度測定用のＲ１チャンネル、ならびに励起用４０５ｎｍ紫色レーザー、およびＰｏ－Ｐｒｏ－１蛍光検出用Ｖ１チャンネルを用いて行った。両チャンネルのイベントはパルスエリアモードで記録された。吸引容積はサンプルあたり２００μＬで、穏やかに混合するように設定し、サンプルあたり１００００イベントを収集した。流速は遅く設定され、最大イベント数は毎秒５００であった。
【0196】
各セットの実験を解析するために、まず、非染色対照細胞で得られた線形モードのＦＳＣ対ＳＳＣ散布図にゲートを定義し、細胞株に典型的なサイズおよび粒状性を有する単一細胞のみを解析に含めた。高いＰｏ－Ｐｒｏ－１シグナル強度を示す非生存細胞も解析から除外した。設定したゲート設定は、同じ種類の細胞を用いた全ての実験を通して一定に保たれた。染色強度の定量的な特性評価には、ゲーティングされたイベントの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を用いた。結果は、ＭＦＩまたは相対蛍光強度（ＲＦＩ）で表され、後者は同時に処理した未染色ビヒクル対照サンプルのＭＦＩに対するサンプルのＭＦＩの比として定義される。細胞への取込みの評価には、デルタＭＦＩ値またはデルタＲＦＩ値を用い、これは同時に処理した未染色の対照サンプルの値に対する増加（差）を意味する。ほとんどの実験は二つ組形式で行った。
【実施例9】
【0197】
試験物質の細胞分裂阻害効力の測定
細胞を単層で増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で７５～９０％コンフルエントレベルになるまで培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで剥離した後、細胞を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１０％ ＦＢＳ添加細胞培養液１００μＬ中１，５００個／ウェルで播種した。約２４時間のインキュベート期間後、各ウェルの培地全量を９０μｌの新しい培地に交換し、そこに試験物質含有培地３０μＬを添加し、３．１６ｎＭ～３．１６μＭの様々な試験物質濃度を３．１６倍ごとに得た。次いで、細胞をさらに７２時間インキュベートした。試験物質処理後の細胞の生存率は、製造者の指示にしたがって行った、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）生存率アッセイを用いて決定した。簡潔に言うと、ＣＣＫ－８溶液を１０％培養体積になるように細胞に添加した。細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートし、プレートリーダーを用いて４６０ｎｍの吸光度からホルマザン色素産生を測定した。実験は全て、６回の測定を並行して行った。
細胞を単層で増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で７５～９０％コンフルエントレベルになるまで培養した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで剥離した後、細胞を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１０％ ＦＢＳ添加細胞培養液１００μＬ中１，５００個／ウェルで播種した。約２４時間のインキュベート期間後、各ウェルの培地全量を９０μｌの新しい培地に交換し、そこに試験物質含有培地３０μＬを添加し、３．１６ｎＭ～３．１６μＭの様々な試験物質濃度を３．１６倍ごとに得た。次いで、細胞をさらに７２時間インキュベートした。試験物質処理後の細胞の生存率は、製造者の指示にしたがって行った、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）生存率アッセイを用いて決定した。簡潔に言うと、ＣＣＫ－８溶液を１０％培養体積になるように細胞に添加した。細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートし、プレートリーダーを用いて４６０ｎｍの吸光度からホルマザン色素産生を測定した。実験は全て、６回の測定を並行して行った。
【0198】
各処理について、ビヒクル対照群も同じプレートで同時に行った。各処理についての結果は、対応するビヒクル群に対する％として計算し、ボルツマン関数にしたがってシグモイド曲線フィッティングした対数スケールで、濃度に対してプロットした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、変曲点、すなわちビヒクル対照と最大阻害の中間点で決定した。最小有効濃度は、２０％超の統計的に有意な阻害をもたらす最低の試験濃度と定義した。ビヒクル対照からの統計的に有意な差は、一元配置分散分析に続く、ダネット検定を用いて検定した。
【実施例10】
【0199】
ＣＴＸ－ＣＡＲ／ＣＴＸＤ－ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
形質導入ベクターの構築
本発明者らは、以下のタンパク質ドメイン配列をコードするｃＤＮＡを含むＣＴＸＤ８－ＣＡＲおよびＣＴＸ－ＣＡＲ遺伝子カセットを設計した：ＩｇＧ重鎖シグナルペプチド（ＧＭＣＳＦＲａ）、ＣＴＸＤ８、またはＣＴＸ、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ２８細胞内共刺激エンドドメインを有するヒトＣＤ２８の膜貫通領域（ＣＤ２８膜貫通型およびＣＤ２８細胞質型）、（Ｇｌｙ）３リンカー、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質領域、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドおよび切断型ＣＤ１９。設計されたＣＴＸＤ８－ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列は、図１１に示され、これは、配列番号４４に記載されている。図１１は、アミノ酸配列の上記エレメントを描いており、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ２８細胞質、ＣＤ３ゼータ、および切断型ＣＤ１９には下線が引かれている。機能しない切断型ＣＤ１９は、形質導入効率を検出することを可能にするように付加した。このカセットはｐＵＣ５７クローニングベクターに挿入されて得た後、切り出し、改変ｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターにライゲーションした。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲまたはＣＴＸ－ＣＡＲをコードするレトロウイルス粒子は、ｊｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－ＣＡＲをコードする改変ＭＳＧＶレトロウイルスベクター、ＭｏＭＬＶ ｇａｇ－ｐｏｌの配列を含むＰｅｇ－Ｐａｍ－ｅプラスミド、およびＲＤ１１４の配列を含むｐＭａｘ．ＲＤ１１４プラスミドでＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることにより作製した。ウイルス上清はトランスフェクション後７２時間で回収し、同日中にＴ細胞形質導入に使用するか、または使用するまで－８０℃で急速凍結および保存した。
形質導入ベクターの構築
本発明者らは、以下のタンパク質ドメイン配列をコードするｃＤＮＡを含むＣＴＸＤ８－ＣＡＲおよびＣＴＸ－ＣＡＲ遺伝子カセットを設計した：ＩｇＧ重鎖シグナルペプチド（ＧＭＣＳＦＲａ）、ＣＴＸＤ８、またはＣＴＸ、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ２８細胞内共刺激エンドドメインを有するヒトＣＤ２８の膜貫通領域（ＣＤ２８膜貫通型およびＣＤ２８細胞質型）、（Ｇｌｙ）３リンカー、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質領域、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドおよび切断型ＣＤ１９。設計されたＣＴＸＤ８－ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列は、図１１に示され、これは、配列番号４４に記載されている。図１１は、アミノ酸配列の上記エレメントを描いており、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、ＣＤ８アルファヒンジ、ＣＤ２８細胞質、ＣＤ３ゼータ、および切断型ＣＤ１９には下線が引かれている。機能しない切断型ＣＤ１９は、形質導入効率を検出することを可能にするように付加した。このカセットはｐＵＣ５７クローニングベクターに挿入されて得た後、切り出し、改変ｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターにライゲーションした。ＣＴＸＤ８－ＣＡＲまたはＣＴＸ－ＣＡＲをコードするレトロウイルス粒子は、ｊｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－ＣＡＲをコードする改変ＭＳＧＶレトロウイルスベクター、ＭｏＭＬＶ ｇａｇ－ｐｏｌの配列を含むＰｅｇ－Ｐａｍ－ｅプラスミド、およびＲＤ１１４の配列を含むｐＭａｘ．ＲＤ１１４プラスミドでＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることにより作製した。ウイルス上清はトランスフェクション後７２時間で回収し、同日中にＴ細胞形質導入に使用するか、または使用するまで－８０℃で急速凍結および保存した。
【0200】
Ｔリンパ球の増殖および形質導入
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いた密度勾配分離により、健常ドナーから単離した。その後、細胞を１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｅ（クローン：ＯＫＴ３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）および抗ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を事前コーティングした２４ウェルの非組織培養処理プレートに播種した。初期刺激用の培養培地は、１０％ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加したＲＰＭＩ １６４０であった。２４時間後、ヒトインターロイキン－７（ＩＬ－７；１０ｎｇ／ｍＬ）およびヒトインターロイキン－１５（ＩＬ－１５；５ｎｇ／ｍＬ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を培養物に添加した。翌日、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下、２０μｇ／ｍＬ ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）コーティングプレート上で細胞をレトロウイルス粒子で形質導入した。４８時間のインキュベート後、細胞をさらなる実験に使用した。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いた密度勾配分離により、健常ドナーから単離した。その後、細胞を１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｅ（クローン：ＯＫＴ３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）および抗ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を事前コーティングした２４ウェルの非組織培養処理プレートに播種した。初期刺激用の培養培地は、１０％ウシ胎児血清および２ｍｍｏｌ／Ｌ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加したＲＰＭＩ １６４０であった。２４時間後、ヒトインターロイキン－７（ＩＬ－７；１０ｎｇ／ｍＬ）およびヒトインターロイキン－１５（ＩＬ－１５；５ｎｇ／ｍＬ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を培養物に添加した。翌日、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下、２０μｇ／ｍＬ ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）コーティングプレート上で細胞をレトロウイルス粒子で形質導入した。４８時間のインキュベート後、細胞をさらなる実験に使用した。
【0201】
形質導入効率の評価
レトロウイルスの形質導入効率は、アロフィコシアニンコンジュゲート抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて、切断型ＣＤ１９分子をフローサイトメトリーで検出することにより決定した。Ｔ細胞の純度は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲート抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）染色により決定した。フローサイトメトリー解析に用いた全ての抗体は、１０μｇ／ｍＬの最終濃度で氷上１０分間アプライした。解析は、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターおよびＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、１サンプルあたり少なくとも１０，０００細胞について行った。
レトロウイルスの形質導入効率は、アロフィコシアニンコンジュゲート抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて、切断型ＣＤ１９分子をフローサイトメトリーで検出することにより決定した。Ｔ細胞の純度は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲート抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）染色により決定した。フローサイトメトリー解析に用いた全ての抗体は、１０μｇ／ｍＬの最終濃度で氷上１０分間アプライした。解析は、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターおよびＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、１サンプルあたり少なくとも１０，０００細胞について行った。
【実施例11】
【0202】
ＣＴＸ－ＣＡＲ／ＣＴＸＤ－ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性の検討
ＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌由来細胞株（ＭＤＡ ＨＥＲ２）は、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入）をヒトＨＥＲ２遺伝子コード化レンチウイルス粒子で形質導入後、単一細胞クローニングにより作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ陰性対照細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。ホタルルシフェラーゼ発現ＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞株およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ｅＧＦＰ．ｆｆＬｕｃをコードするレトロウイルスでＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞株およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を形質導入し、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）とホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）の融合遺伝子を発現させた後、単一細胞クローニングによって作製した。
ＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌由来細胞株（ＭＤＡ ＨＥＲ２）は、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入）をヒトＨＥＲ２遺伝子コード化レンチウイルス粒子で形質導入後、単一細胞クローニングにより作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ陰性対照細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。ホタルルシフェラーゼ発現ＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞株およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、ｅＧＦＰ．ｆｆＬｕｃをコードするレトロウイルスでＭＤＡ－ＨＥＲ２細胞株およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を形質導入し、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）とホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）の融合遺伝子を発現させた後、単一細胞クローニングによって作製した。
【0203】
標的に対するＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性は、ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイによって決定した。ｅＧＦＰ／ｆｆＬｕｃを発現するＭＤＡ－ＨＥＲ２およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェル平底プレートに１０５細胞／ウェルの密度で２つ組で播種した。４時間後、様々な量のＣＴＸＤ８－およびＣＴＸ－由来のＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍細胞に添加し、広範囲のエフェクター対標的細胞比における細胞傷害性を評価した。未改変エフェクター細胞（ＮＴ）を含むウェルを、未処理対照の参照とした。２４時間後、培地およびＴ細胞を除去し、残った腫瘍細胞をルシフェラーゼ活性により定量化した。ルシフェラーゼアッセイキットは、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）にしたがって使用し、検出はＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴルミノメーター（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＥ、ＵＳＡ）で行った。
【0204】
参考文献
特許文献
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国際公開第ＷＯ２０１１０９４６７１号広報（ＴＨＥ ＵＡＢ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ）２０１１年８月４日
国際公開第ＷＯ２０１１１４２８５８号広報（ＦＲＥＤ ＨＵＴＣＨＩＮＳＯＮ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＥＲ） ２０１１年１１月１７日
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国際公開第ＷＯ２０１７０６６４８１号広報（ＣＩＴＹ ＯＦ ＨＯＰＥ） ２０１７年４月２０日
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非特許文献
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特許文献
米国特許公開第２０１００２１５５７５号広報（ＴＲＡＮＳＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＮＣ） ２０１０年８月２６日
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項1】
一般的な配列のアミノ酸配列Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含む、クロロトキシン誘導体であって、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターが、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され；（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターが、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され；
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターが、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターが、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示し；
配列番号１の野生型クロロトキシンより少なくとも１．６２倍高い相対的ヒトＭＭＰ－２ 結合性を有するクロロトキシン誘導体。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0023】
上記の観点から、本発明は、一般的な配列
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして、
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示し；
配列番号１の野生型クロロトキシンより少なくとも１．６２倍高い相対的ヒトＭＭＰ－２ 結合性を有するクロロトキシン誘導体に関する。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
のアミノ酸配列を含むクロロトキシン誘導体に関し、
ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして、
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示し；
配列番号１の野生型クロロトキシンより少なくとも１．６２倍高い相対的ヒトＭＭＰ－２ 結合性を有するクロロトキシン誘導体に関する。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0053】
本発明のクロロトキシン誘導体は、以下の一般的なアミノ酸配列：
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含み、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示し；
配列番号１の野生型クロロトキシンより少なくとも１．６２倍高い相対的ヒトＭＭＰ－２ 結合性を有する。
Ｘ０Ｘ１ＣＭＰＣＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＤＨＸＳ４ＸＳ５ＡＲＲＣＸ２Ｘ３ＣＣＧＧＹＧＸ４ＣＦＧＹＱＣＬＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８
（配列番号４３）
を含み、ここで、
（ｉ）Ｎ末端Ｘ０Ｘ１クラスターは、ＡＭ、０Ｍ、または００からなる群から選択され、（ｉｉ）溶解性ＸＳ１ＸＳ２ＸＳ３ＸＳ４ＸＳ５クラスターは、ＦＴＴＱＴ、ＦＴＴＥＳ、ＳＳＳＱＴ、ＳＳＳＥＳ、ＦＳＳＱＴ、ＦＳＳＥＳ、またはＦＳＳＱＳからなる群から選択され、
（ｉｉｉ）内部Ｘ２Ｘ３Ｘ４クラスターは、ＤＫＲ、ＲＤＫ、ＫＤＲ、ＩＫＹ、ＨＫＷ、ＤＲＫ、ＬＫＱ、ＫＫＫからなる群から選択され；そして
（ｉｖ）Ｃ末端Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８クラスターは、Ｎ０００、Ｒ０００、ＮＲ００、ＮＲＧ０、ＮＲＧＹ、ＮＲＲＲ、またはＲＲＲＲからなる群から選択され；
ここで、０はアミノ酸が存在しない位置を示し；
配列番号１の野生型クロロトキシンより少なくとも１．６２倍高い相対的ヒトＭＭＰ－２ 結合性を有する。
【国際調査報告】