特表 2024-502591 眼表面疾患の治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-22

(54)【発明の名称】眼表面疾患の治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240115BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240115BHJP

   A61P 27/04 20060101ALI20240115BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240115BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240115BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240115BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P27/02

A61P27/04

A61P31/00

A61K48/00

A61K31/7105

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023540883

(86)(22)【出願日】2021-08-09

(85)【翻訳文提出日】2023-08-31

(86)【国際出願番号】 CN2021111575

(87)【国際公開番号】W WO2022148016

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】63/134,599

(32)【優先日】2021-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523251862

【氏名又は名称】ドリームホーク ヴィジョン バイオテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ジュオ，スー－ハン

(72)【発明者】

【氏名】リャン，チャン－リン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084AA17

4C084MA58

4C084NA14

4C084ZA33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA58

4C086NA14

4C086ZA33

(57)【要約】

本発明は、ドライアイ疾患、化学又は物理的損傷、感染、神経感覚異常及び不特定の病因等の眼疾患又は眼損傷による被験者の眼表面損傷を治療する方法を提供し、前記被験者に治療有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ－３２８拮抗薬を含む医薬組成物を投与するステップを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

眼疾患又は眼損傷による被験者の眼表面損傷を治療する医薬を製造するための医薬組成物の用途であって、前記医薬組成物は治療有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ－３２８拮抗薬を含む
前記用途。

【請求項2】

前記眼疾患又は眼損傷はドライアイ疾患、化学又は物理的損傷、感染、神経感覚異常及び不特定の病因のうちのいずれかである
請求項１に記載の用途。

【請求項3】

前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３２８拮抗薬は、ｍｉＲ－３２８又はその前駆体の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドである
請求項１に記載の用途。

【請求項4】

該抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチド配列は配列番号３からなる
請求項２に記載の用途。

【請求項5】

該抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの濃度は１～５００μＭ又は１０～１６０μＭである
請求項２に記載の用途。

【請求項6】

眼表面損傷はドライアイ疾患により引き起こされる
請求項１に記載の用途。

【請求項7】

眼表面損傷は神経栄養性角膜炎によって引き起こされる
請求項１に記載の用途。

【請求項8】

眼表面損傷は物理的損傷による角膜擦過傷である
請求項１に記載の用途。

【請求項9】

眼表面損傷は化学的損傷により引き起こされる
請求項１に記載の用途。

【請求項10】

眼表面損傷はマイボーム腺機能不全により引き起こされる
請求項１に記載の用途。

【請求項11】

該医薬組成物は眼に局所的に投与される
請求項１に記載の用途。

【請求項12】

該医薬組成物は点眼薬の形態で投与される
請求項１に記載の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ドライアイ疾患、化学又は物理的損傷、感染、神経感覚異常及び不特定の病因等の眼疾患又は眼損傷による被験者の眼表面損傷を治療する方法に関し、被験者にｍｉＲＮＡ－３２８拮抗薬を投与するステップを含む。

【背景技術】

【0002】

眼の表面は角膜と結膜からなり、眼表面の損傷は、痛み、発赤、視力低下を引き起こし、最終的に永久的な角膜又は結膜損傷を来すことがある。

【0003】

多くの眼疾患又は眼損傷は眼表面損傷を引き起こし得る。最も一般的な眼表面疾患であるドライアイ疾患は、涙及び眼表面等の複数の要因による疾患であり、不快感、視覚障害及び涙膜不安定の症状を引き起こす。

【0004】

涙膜及び眼表面協会（ＴＦＯＳ）により結成された世界ドライアイワークショップ（ＤＥＷＳ）は、「ＴＦＯＳ ＤＥＷＳ ＩＩ定義と分類」（Ｏｃｕｌ Ｓｕｒｆ． ２０１７ Ｊｕｌ； １５（３）： ２７６－２８３）を報告し、本発明で言及したドライアイ疾患の定義を提供していた。汚染物質、紫外線（ＵＶ）放射及びオゾンへの曝露を含む環境要因、及び緑内障治療用の点眼薬等、防腐剤含有の点眼薬の長期間使用も、ドライアイ疾患に関与する場合が多い。これらの要因により、酸化ストレス及び眼表面炎症が増加し、さらにドライアイ疾患の進行が引き起こされる。

【0005】

最近、マイボーム腺機能不全はドライアイ疾患のもう１つの主要な危険要因と認められた。ドライアイ疾患の典型的な症状は、乾燥、灼熱感及び砂のような眼刺激であり、日が経つにつれて悪化する。通常、両眼とも影響を受ける。ドライアイがしばらく続くと、眼表面の微小な擦過傷、角膜びらん及び点状角膜症が起こる。病勢が末期に進むと、上皮は病理学的変化、即ち扁平上皮化生及び杯細胞の減少が発生する。

【0006】

眼に対するアルカリ損傷と酸損傷を含む化学的損傷は、眼表面に広範囲の損傷をもたらす。このような損傷は、角膜の修復が不完全な場合に、永久的な視力障害を引き起こす可能性がある。異物、外傷から金属片に至るまでの範囲の物理的損傷は、眼表面に様々な程度の損傷をもたらす可能性がある。眼感染は角膜びらんを引き起こし得る。角膜上皮が再成長しない場合、角膜びらんが角膜潰瘍に発展する可能性がある。角膜潰瘍を治療しないと、重度の視力喪失が発生する。

【0007】

神経障害性角膜症（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｋｅｒａｔｏｐａｔｈｙ：ＮＫと略称）とも呼ばれる神経栄養性角膜炎は、角膜神経支配が損なわれるため角膜知覚が低下又は消失することを特徴とするものである。角膜の感覚が失われると、上皮性角膜症、上皮欠損、間質性潰瘍、最終的に角膜穿孔を引き起こす可能性がある。これは希少疾患であり、推定有病率が５／１０，０００人未満である。

【0008】

ＮＫの病因は、ヘルペス角膜炎（帯状疱疹及び単純疱疹）、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＢＡＣと略称）を含有する局所薬の長期間使用、化学及び物理的火傷、コンタクトレンズの乱用、レーザー角膜切削形成術（ｌａｓｅｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓ：ＬＡＳＩＫと略称）等の角膜手術等を含むが、それらに限定されない。ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）は、ＮＫ患者を効果的に治療できると証明されている。組換えヒト神経成長因子（ｒｈＮＧＦ）含有のＣｅｎｅｇｅｒｍｉｎ（Ｏｘｅｒｖａｔｅ^TM）は、２０１８年８月２２日に米国で神経栄養性角膜炎の治療用に承認された初めてのＮＫ局所薬である。

【0009】

杯細胞は結膜上皮に制限されている。杯細胞の主な機能は、ムチンを生成及び分泌して、眼の表面に水分を与えて潤滑にすることである。ムチンは高度にグリコシル化された糖タンパク質である。ムチンは、膜貫通型ムチンと分泌型ムチンの２つの異なるタイプに分類される。ＭＵＣ５ＡＣは最も研究されているムチンの１つであり、結膜に見られる大きなゲルを形成する時に分泌されるムチンである。ドライアイ疾患の患者において、結膜内の杯細胞の数の減少が実証されている。また、コンタクトレンズの使用により、杯細胞の密度が変化する。

【0010】

マイクロリボ核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡと略称）は、長さが約２１～２３ヌクレオチドの非コード一本鎖ＲＮＡ分子である。動物体内で、成熟したｍｉＲＮＡは、１種又は複数種のメッセージリボ核酸（ｍｅｓｓａｇｅ ＲＮＡ：ｍＲＮＡと略称）の３’末端の非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲと略称）に相補的なものである。ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとのアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）により、タンパク質翻訳及び／又はｍＲＮＡ切断が阻害される。ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３２８（ｍｉＲ－３２８）は近視の危険要因であること（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ５３：２７３２－２７３９， ２０１２）、及び抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドが近視の治療に用いられること（Ｊｕｏ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ１０１７９９１３Ｂ２， ２０１９）が以前に報告されている。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、ドライアイ疾患、化学又は物理的損傷、感染、神経感覚異常及び不特定の病因等の眼疾患又は眼損傷による被験者の眼表面損傷を治療する方法に関し、被験者に治療有効量のｍｉＲＮＡ－３２８拮抗薬を含む医薬組成物を投与するステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ウサギ角膜細胞株ＳＩＲＣにおいて、ｍｉＲ－３２８発現レベルが、異なる濃度のＢＡＣ処理で用量依存的に増加することを示す。平均値±ＳＥＭのデータは３つの独立した実験からのものである。

【図2】ＢＡＣに１０分間曝露した後、ウサギ角膜細胞株ＳＩＲＣにおいて抗ｍｉＲ－３２８がＮＧＦを用量依存的に増加させることを示す。平均値±ＳＥＭのデータは３つの独立した実験からのものである。

【図3】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は抗ｍｉＲ－３２８で治療された後のウサギ角膜蛍光染色の代表図を示す。本研究ではＰＢＳを陰性対照として用いる。０日目から２１日目までＢＡＣによってドライアイ疾患を誘発した。８日目から２１日目までＰＢＳ（上パネル）又は抗ｍｉＲ－３２８（下パネル）点眼薬による治療を開始した。緑色の蛍光は、ドライアイ疾患による角膜損傷を示す角膜染色である。２１日目に、抗ｍｉＲ－３２８で治療されたウサギには角膜染色がなかったが、ＰＢＳ群には依然として角膜染色が存在していた。

【図4】ウサギ角膜切片のＨ＆Ｅ染色の代表図を示す。ドライアイ疾患ウサギはＰＢＳ又は抗ｍｉＲ－３２８で治療し、正常なウサギは点眼薬で治療しなかった。（Ａ）は、正常群、ＰＢＳ群及び抗ｍｉＲ－３２８群における角膜の代表的なＨ＆Ｅ染色である。ＰＢＳで治療された眼の角膜上皮はより薄く、破壊度がより高かったが、抗ｍｉＲ－３２８で治療された眼の上皮層はより厚く、より無傷であった。正常な眼と、ＰＢＳで治療された眼と、抗ｍｉＲ－３２８で治療された眼とは、間質に統計的有意差がなかった。スケールバー＝５０μｍである。（Ｂ）は３つの群間での上皮及び間質厚さの差を示す散布図である。

【図5】ＴＵＮＥＬアッセイによって検出されたウサギ角膜細胞アポトーシスの代表図を示す。ドライアイ疾患ウサギはＰＢＳ又は抗ｍｉＲ－３２８で治療し、正常なウサギは点眼薬で治療しなかった。（Ａ）はＴＵＮＥＬアッセイでの茶色のアポトーシス細胞である。抗ｍｉＲ－３２８で治療された眼はＰＢＳで治療された眼に比べ、角膜上皮及び間質層のアポトーシス細胞が少なかったが、正常な眼はアポトーシス細胞が殆どなかった。スケールバー＝１００μｍである。（Ｂ）は３つの群間でのアポトーシス細胞の差を示す散布図である。

【図6】ウサギのマイボーム腺の開口部の代表図を示す。ＰＢＳで治療されたウサギの眼には、マイボーム腺の開口部における過角化（矢印）が示されたが、抗ｍｉＲ－３２８で治療されたウサギの眼には示されなかった。スケールバー＝１００μｍである。

【図7】ドライアイ疾患マウスに対する抗ｍｉＲ－３２８の用量依存的効果の代表図を示す。ＢＡＣでマウスの眼にドライアイ疾患を誘発すると同時に、抗ｍｉＲ－３２８で１日２回（１０分間隔）、１４日間治療した。１４日目に代表的な写真を撮影した。そのデータによると、１６０μＭの用量で治療効果が最良である。

【図8】抗ｍｉＲ－３２８がマウスの眼の角膜剥離を修復することを示す。アルジャーブラシ（Ａｌｇｅｒｂｒｕｓｈ）によって両眼に角膜擦過傷を与えた。その後、左眼をＰＢＳで処理し、右眼を抗ｍｉＲ－３２８（１６０μＭ）で処理した。角膜隔離の同日から、１日２回点眼薬を点眼した。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、干眼疾患、化学又は物理的損傷、感染、神経感覚異常及び不特定の病因等の眼疾患又は眼損傷による被験者の眼表面損傷を治療する方法に関し、前記被験者に治療有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ－２３８拮抗薬を含む医薬組成物を投与するステップを含む。

【0014】

本明細書で使用される用語「被験者」とは、動物、特に哺乳動物を指す。好ましい実施例において、用語「被験者」は、一般に人間を指し、且つ特定の１人又は数人に限定されない。

【0015】

用語「治療的に有効な（治療有効）」は、疾患重症度の低下という目標を達成するとともに、代替療法に通常伴う副作用等の有害な副作用を回避するように、各薬剤の用量を限定することを意図する。

【0016】

本発明の一態様において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される塩、担体、佐剤又は賦形剤をさらに含む。

【0017】

本発明の別の態様において、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３２８拮抗薬は、ｍｉＲ－３２８又はその前駆体に相補的なヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドである。

【0018】

１つの実施例において、成熟ヒトｍｉＲ－３２８（ｍａｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ｍｉＲ－３２８）の配列（配列番号１、ＣＵＧＧＣＣＣＵＣＵＧＣＣＣＵＣＣＧＵ）に基づいてアンチセンスｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチド（長さ１５～２２ヌクレオチド）を設計する。長さ１５～２２ヌクレオチドの抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチド配列を表１に示す。本発明で言及した抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドは、先行特許ＵＳ１０１７９９１３Ｂ２に開示されており、該特許の全ての内容は参照によって本発明の明細書に組み込まれる。

【0019】

【表1】

【0020】

１つの実施例において、抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの長さは１５～２２ヌクレオチドの範囲である。別の実施例において、抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの長さは１６又は１７ヌクレオチドである。好ましい実施例において、抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドは配列番号３又は配列番号４からなる。より好ましい実施例において、抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドは配列番号３からなる。

【0021】

本発明は、ｍｉＲＮＡ－３２８アンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。その眼疾患を治療するための形態は、局所用溶液又は軟膏である。１つの実施例において、前記医薬組成物は眼に局所的に投与される。別の実施例において、該医薬組成物は点眼薬の形態で投与される。

【0022】

実施例
以下の実施例は非限定的なものであり、単に本発明の各態様及び特徴を代表するものに過ぎない。

【0023】

実施例１ インビトロでの抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの研究
ウサギ角膜（ＳＩＲＣ）細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンで補足したＤＭＥＭの培地で、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養した。細胞を塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＢＡＣと略称）に１０分間曝露させ、その後、元の培地を新鮮な培地に交換した。ｍｉＲ－３２８レベルを測定するために、細胞をさらに２４時間インキュベートしてから、ＲＮＡ抽出用に収集した。ＮＧＦのパフォーマンスを測定するために、細胞を、ＢＡＣに１０分間曝露させた後、抗ｍｉＲ－３２８で１２時間処理した。

【0024】

実施例２ 抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドでドライアイ疾患を治療する効果を評価するためのマウスモデルでのインビボ研究

【0025】

ドライアイ疾患マウスモデル
塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）は一般的に使用される点眼薬防腐剤である。しかし、ＢＡＣは眼に対して、結膜の炎症及び線維化、涙膜の不安定性、角膜の細胞毒性及び前房の炎症を含む毒性作用がある。高濃度のＢＡＣは、その毒性作用により、動物モデルにおいてドライアイ疾患を誘発するために広く使用されている。

【0026】

まず、Ｃ５７ＢＬ６マウスを抗ｍｉＲ－３２８群とＰＢＳ生理食塩水群にランダムに分けた。なお、ＰＢＳは抗ｍｉＲ－３２８点眼薬を製造するための溶媒である。ドライアイ疾患を誘発するために、Ｃ５７ＢＬ６マウスの両眼に濃度０．２％のＢＡＣを１日５μＬ、７日間点眼した。８日目に、各眼への１日５μＬのＰＢＳ生理食塩水又は抗ｍｉＲ－３２８（１０μＭ）点眼薬の２週間投与を開始し、この２週間の間に依然として両眼へのＢＡＣ点眼を持続していた。

【0027】

この２週間の治療順序は、まず眼にＰＢＳ又は抗ｍｉＲ－３２８を点眼し、次に約１０分間後にＢＡＣを点眼する。この戦略は、患者が抗ドライアイ治療を受ける際にドライアイの原因を排除できないことをシミュレートするものである。

【0028】

結果の評価
２週間のＰＢＳ／抗ｍｉＲ－３２８治療の終了時に抗ｍｉＲ－３２８の治療効果を評価した。臨床観察を毎日行い、蛍光染色を毎週行った。角膜蛍光染色について、１％フルオレセインナトリウムの液滴をフルオレセイン紙ストリップ（Ｍａｄｈｕ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｐｖｔ． Ｌｔｄ．， Ｏｋｈｌａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｒｅａ， Ｉｎｄｉａ）上で調製し、その後、５μＬの溶液を結膜嚢内に滴下した。コバルトブルーフィルを有するスリットランプＳＬ－１５（Ｋｏｗａ社、東京、日本）下で眼を検査し、等級付けした。

【0029】

ＦＤＡによって承認されたドライアイ疾患治療薬Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔの第３相臨床試験からの角膜蛍光染色の等級付け基準に基づき、以下のように少し変更した。角膜の表面を９つの領域に等分する。各領域を０～４のスコア範囲（最高３６スコア）内に０．５ポイント増分で等級付けし、スコアが低いほど、状況が良好である。スコアについて、「０」は染色無しであり、「１」は少数又は稀な点状病変であり、「２」は離散的で計数可能な病変であり、「３」は多すぎて数え切れない病変であり、「４」は融合病変である。

【0030】

２群の動物が７日目に同程度の角膜染色スコアを有する場合、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定を行って治療効果を評価し、そうでない場合、対応ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を行って治療効果を評価した。

【0031】

結果
本回の実験に計１９匹の雄マウスを使用した。そのうち、９匹のマウスをプラセボ群に振り分け、１０匹のマウスを抗ｍｉＲＮＡ－３２８群に振り分けた。そのため、該結果は、プラセボで治療された１８つの眼及び抗ｍｉＲ－３２８で治療された２０つの眼に基づくものである。

【0032】

ＰＢＳ群と抗ｍｉＲ－３２８群の両方ともドライアイ疾患マウスの角膜蛍光染色を著しく改善したが、抗ｍｉＲ－３２８の治療はより良好な結果を達成したように見られる（表２）。７日目及び２１日目の改良染色スコアについて、ＰＢＳ群は３１．１５及び１７．９４であり（ｐ＝０．０００３、対応ｔ検定、表２）、抗ｍｉＲＮＡ－３２８群は３１．７０及び８．２である（ｐ＝１．６７ ｘ １０^－９、対応ｔ検定、表２）。抗ｍｉＲ－３２８投与がＰＢＳ投与より治療効果が高い（Ｐ＝０．００５）ことが実証される。

【0033】

【表2】

【0034】

実施例３ ＢＡＣ誘発ドライアイ疾患に対する抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの治療効果を評価するためのウサギモデルでのインビボ研究

【0035】

ドライアイ疾患ウサギモデル

【0036】

材料と方法
研究において、眼が着色したレッキスウサギ（Ｒｅｘ ｒａｂｂｉｔ）を使用し、ＢＡＣによってドライアイ疾患を誘発する前に、ウサギをＰＢＳ治療群又は抗ｍｉＲ－３２８治療群にランダムに振り分けた。２０μＬの濃度０．１５％のＢＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を１日２回（９：００と１７：００）、１週間点眼することでドライアイ疾患を誘発した。８日目に、ウサギのＰＢＳ又は抗ｍｉＲ－３２８治療を開始し、１日２回、２週間治療したが、この２週間にＢＡＣを依然として１日２回点眼した。この２週間の治療順序は、まず眼にＰＢＳ又は抗ｍｉＲ－３２８を点眼し、次に１０分間隔でＢＡＣを点眼した。

【0037】

結果の評価
上述したように、２週間にわたった抗ｍｉＲ－３２８／ＰＢＳ治療後、その治療効果を評価した。また、「眼合計スコア」と呼ばれる第２の等級付けを使用してウサギの眼に対する治療効果を評価した。

【0038】

「眼合計スコア」は角膜及びコンタクトレンズ研究ユニット（ＣＣＬＲＵ）の等級付けスケール及び公表されたガイドラインから変更したものであり（Ｔａｋａｍｕｒａ Ｅ．ら、日本のアレルギー性結膜疾患ガイドライン２０１７． Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｉｎｔ． ２０１７； ６６：２２０－２２９、及びＳｕ Ｇ．， Ｗｅｉ Ｚ．， Ｗａｎｇ Ｌ．，ら、ウサギ実験的細菌性角膜炎に対するトルイジンブルー媒介光力学療法の評価． Ｔｒａｎｓｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０２０； ９：１３を参照）、且つスケールは輪部充血、眼球結膜充血、瞼板結膜充血及び角膜炎という４つのドメインに基づくものであり、上位３つのドメインは４つの重症度レベル（０～３）があり、角膜炎は５つの重症度レベル（０～４）がある。ウサギの眼を、角膜及びマイボーム腺を含む組織学検査にも用いた。

【0039】

組織学的分析
２１日目に、ウサギを人道的に安楽死させ、その後、右眼球を摘出しダビッドソン固定液（Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ ｆｉｘａｔｉｖｅ）（３７％ホルマリン２０ｍｌ、氷酢酸１００ｍｌ、９５％アルコール３５０ｍｌ及び水５３０ｍｌ）に浸漬した。組織を４８時間固定し、続いて水道水で洗浄し１０％中性溶液緩衝液ホルマリンに移して保存し、その後、トリミング及び処理を行った。

【0040】

また、眼付属器を除去した後、直ちに１０％緩衝ホルムアルデヒド溶液で２４時間固定した。続いて、収集されたサンプル（角膜、結膜及びマイボーム腺）をエタノールの勾配シリーズで脱水し、パラフィンに包埋した。ミクロトーム切片作成後、包埋された組織ブロックをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して組織学検査を行った。自動デジタルスライドスキャナ（Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ｍｉｎｉ ＩＩ，３ｄｈｉｔｅｃｈ Ｌｔｄ．， Ｂｕｄａｐｅｓｔ， Ｈｕｎｇｅｒ）下で全ての標本の組織学的画像を観察し、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．３ｄｈｉｓｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｓｅｖｉｅｗｅｒ）を使用して可視化及び測定した。

【0041】

角膜上皮及び間質中の細胞アポトーシスを評価するためにＴＵＮＥＬアッセイを実行した。製造業者の説明（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）に従って、原位置細胞死検出キットＰＯＤ（番号１１６８４ ８１７９１０）を使用してＴＵＮＥＬアッセイを実行した。４０倍の顕微鏡視野下で、ランダムに選択された３つの視野でアポトーシス細胞を計数した。

【0042】

上眼瞼におけるマイボーム腺開口部の過角化を評価した。１２００μｍの組織学スライド上で各開口部の過角化による閉塞のパーセンテージを計算した。１枚のスライド内の全ての開口部閉塞の平均値は、この特定の眼に対する治療効果を示す。

【0043】

結膜印象細胞診
０、７、１４及び２１日目に結膜印象細胞診の標本を採取し、０．５％アルカイン（Ａｌｃａｉｎｅ）を点眼し、眼内の過剰な液体を拭き取った後、直径５．５ｍｍの半円形ニトロセルロース濾紙（Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ Ｋａｉｓｈａ， Ｌｔｄ．， 日本）を上眼球結膜上に配置した。濾紙を軽い圧力でその位置に１分間保持してから、眼から剥がし、直ちに１０％中性緩衝液ホルマリンで固定した。次いで、製造業者の説明（ＰＡＳ－２－ＩＦＵ， ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｏｇａｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従ってＰＡＳキットで紙を染色した。ＰＡＳ試薬を使用して組織を染色し、４００倍拡大の顕微鏡下で杯細胞の数を計測した。染色後に杯細胞の密度を定量した。

【0044】

実施例４ 物理的損傷による角膜擦過傷及び抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドを使用した治療効果の評価

【0045】

角膜擦過傷マウスモデル

【0046】

材料と方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをまず麻酔下に置き、角膜への物理的損傷時に後続の不快感をさらに軽減するために両眼にアルカインを点眼した。角膜擦過傷を付けるために、清潔にした眼用アルジャーブラシ（Ａｌｇｅｒｂｒｕｓｈ）を使用する。指で瞼を別々に持ち、毎回片眼ずつ開く。次いで、Ａｌｇｅｒｂｒｕｓｈを角膜に強固に接触させ、眼表面上で前後左右にＡｌｇｅｒｂｒｕｓｈを動かして角膜擦過傷を誘発する。手術後に角膜蛍光染色を実施し、その後、角膜蛍光染色を毎日実施した。左眼をＰＢＳで治療し、右眼を抗ｍｉＲ－３２８で治療し、１日２回（午前９時と午後５時）とした。

【0047】

上記角膜上の蛍光染色の大きさを結果として評価する。

【0048】

結果

【0049】

ｍｉＲ－３２８に対するＢＡＣの影響
異なる濃度のＢＡＣでウサギ角膜細胞株（ＳＩＲＣ）を処理した。ｍｉＲ－３２８発現量は用量依存的に増加した（図１）。平均値±ＳＥＭのデータは３つの独立した実験からのものである。ＢＡＣに曝露したＳＩＲＣに対する抗ｍｉＲ－３２８の治療は、ＮＧＦ発現の増加を引き起こした（図２）。

【0050】

角膜染色
計４０個の眼をＰＢＳで治療し、４２個の眼を抗ｍｉＲ－３２８で治療した。抗ｍｉＲ－３２８はウサギ眼の角膜染色を減少させる治療効果を示した（図３）。２週間の治療後に、抗ｍｉＲ－３２８点眼薬は改良染色スコアを著しく低下させたが（ｐ＝０．０３８、対応ｔ検定、表３）、ＰＢＳは角膜染色に影響を与えなかった（ｐ＝０．６９９、対応ｔ検定、表３）。

【0051】

眼合計スコアでデータを分析すると、類似の結果が観察された。該スコアの平均値はＰＢＳ群において著しく悪化したが（ｐ＝７．４ｘ１０^－８、対応ｔ検定、表３）、抗ｍｉＲ－３２８群は改善が僅かであった（ｐ＝０．０５３、対応ｔ検定、表３）。

【0052】

【表3】

【0053】

角膜の厚さ
抗ｍｉＲ－３２８又はＰＢＳ点眼薬で治療されたドライアイ疾患ウサギは、角膜上皮の平均厚さに顕著な差があり（３６．４±１．２μｍ ｖｓ ２５．６±１．７μｍ、ｐ＝９．４ｘ１０^－５）、正常なウサギの角膜上皮の平均厚さは４５．４±１．２μｍである（図４）。ＰＢＳ治療及び抗ｍｉＲ－３２８治療による眼の間の間質厚さの差は統計的に有意ではない（ｐ＝０．３４）（５７８．８±２５．０μｍ ｖｓ ５３９．５±３１．８μｍ、図４）。

【0054】

正常なウサギ眼の間質厚さは５２１．２±２０．４μｍである。ＴＵＮＥＬアッセイでは、角膜上皮（５３±３個の細胞対３９±３個の細胞、Ｐ＝０．００２）及び間質（８４±７個の細胞対６５±５個の細胞、Ｐ＝０．０２９）において、ＰＢＳ群のアポトーシス細胞が抗ｍｉＲ－３２８群より多いことが示された（図５）。

【0055】

マイボーム腺組織学
組織学によると、抗ｍｉＲ－３２８群はＰＢＳ群に比べて、差が０．０５という有意なレベルに達していないが、より低い平均閉塞パーセンテージを有する（５６．４％±７．５９％ ｖｓ ７８．５％±８．１７％、ｐ＝０．０５９）（図６）。

【0056】

結膜杯細胞
抗ｍｉＲ－３２８群の結膜杯細胞の密度はＰＢＳ群より有意に高い（２６ ｖｓ １９細胞／ｍｍ^２、ｐ＝０．００５）。この発見は、ドライアイ疾患における杯細胞の密度が低いという以前の報告と一致する。

【0057】

用量依存的効果
ドライアイ疾患に対する最大の治療効果を達成する用量を見つけるために、本発明では、ドライアイ疾患を有するマウスにおいて、１０、３０、６０、９０、１２０及び１６０μＭの抗ｍｉＲ－３２８用量を試験した。データによると、角膜染色の減少は用量依存性を有し、用量１６０μＭの抗ｍｉＲ－３２８の点眼薬で治療された眼は、１４日目に蛍光染色は殆ど（図７）なかった。したがって、１６０μＭの抗ｍｉＲ－３２８はマウスのドライアイ疾患を治療する最適用量である可能性がある。

【0058】

ＢＡＣによってマウスの眼にドライアイ疾患を誘発するとともに、抗ｍｉＲ－３２８で１日２回（１０分間隔）、１４日間治療し、１４日目に写真を撮り、データによると、１６０μＭの用量では治療効果が最良であり、よって、１６０μＭの抗ｍｉＲ－３２８はマウスのドライアイ疾患を治療する最適用量である可能性がある。

【0059】

物理的損傷による角膜擦過傷及び抗ｍｉＲ－３２８オリゴヌクレオチドの効果評価
角膜修復に対する抗ｍｉＲ－３２８の影響を実証するために、マウスの角膜にＡｌｇｅｒｂｒｕｓｈによって損傷を与えた。角膜剥離後、角膜染色によると、０日目には角膜全体でフルオレセインが観察され、これは角膜が完全に剥離されたことを示す（図８）。しかし、３日目に、抗ｍｉＲ－３２８で治療された眼はＰＢＳで治療された眼に比べて、より速く、より良好な回復を示す（図８）。

【0060】

本発明及びその製造と使用の方法とプロセスは、当業者であれば誰でも本発明の内容を作成及び使用できるように、完全、明確、簡潔且つ正確な用語で説明した。以上は本発明の好ましい実施例であり、出願の保護範囲から逸脱するこなく、本発明の範囲の解釈及びその修正が可能であることを理解すべきである。発明と見なされる主題を特に指摘し、明確に保護を請求するために、以下の特許請求の範囲によって本明細書を締めくくる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【国際調査報告】