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特表2024-502639病原性標的のためのループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-22
(54)【発明の名称】病原性標的のためのループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240115BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240115BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240115BHJP
C12N 15/33 20060101ALN20240115BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6851 Z
C12M1/00 A
C12N15/33
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542512
(86)(22)【出願日】2022-01-15
(85)【翻訳文提出日】2023-07-12
(86)【国際出願番号】 US2022012635
(87)【国際公開番号】W WO2022155546
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】63/138,312
(32)【優先日】2021-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598063203
【氏名又は名称】パーデュー・リサーチ・ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520435267
【氏名又は名称】レイセオン ビービーエヌ テクノロジーズ コープ
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＹＴＨＥＯＮ ＢＢＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰ．
【住所又は居所原語表記】１０ Ｍｏｕｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３８ ＵＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】セヴィル，ジョーダン
(72)【発明者】
【氏名】マックチェスニー，ダービー
(72)【発明者】
【氏名】デヴィッドソン，ジョシア
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ジアンシャン
(72)【発明者】
【氏名】マルサムス，ムラリ カンナン
(72)【発明者】
【氏名】デクストル，アンドレ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルマ，モヒット
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA03
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS26
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物、方法、及びシステムに関する。組成物は、１つ又は複数の標的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び再可溶化剤を含むことができる。組成物は、固相媒体を変色させることができる非ｐＨ感受性薬剤を実質的に含まないものであり得る。本方法は、固相媒体のアセンブリを提供すること、固相媒体上に生体試料を堆積すること、及びＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱すること、を含むことができる。システムは、組成物及び組成物がその上に堆積される固相媒体を含むことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物であって、１つ又は複数の標的プライマー；
ＤＮＡポリメラーゼ；及び
再可溶化剤、を含み、
前記固相媒体を変色させることができる非ｐＨ感受性薬剤を実質的に含まない、前記組成物。
【請求項2】
抗酸化剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
揮発性剤を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
吸湿剤を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記吸湿剤が、２５℃で約４０％～約９０％の相対湿度（ＲＨ）の場合に、約１０重量％を超える量を吸収する、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記吸湿剤には、グリセロール、エタノール、メタノール、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、及びそれらの組み合わせが含まれる、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記再可溶化剤が界面活性剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記再可溶化剤が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリソルベート２０、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記標的プライマーが、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含む病原体を標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記病原体がウイルス病原体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記ウイルス病原体が、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ウイルス病原体が、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
非変色添加剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
前記非変色添加剤が、糖、緩衝液、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
指示薬をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法であって、固相媒体と請求項１に記載の組成物のアセンブリを提供すること；
前記固相媒体上に生体試料を堆積すること；及び
ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度まで前記アセンブリを加熱すること、を含む、前記方法。
【請求項18】
前記生体試料が、唾液、粘液、血液、尿、糞便、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記生体試料が唾液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
ウイルス病原体を検出することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記ＬＡＭＰ分析が逆転写酵素ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
請求項１に記載の組成物；及び前記組成物がその上に堆積される固相媒体、
を含む、ＬＡＭＰ分析を実行するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年１月１５日出願の米国仮特許出願第６３／１３８，３１２号の利益を主張し、この仮特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月１５日出願の米国仮特許出願第６３／１３８，３１２号の利益を主張し、この仮特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、種々の分析目的でヌクレオチドの増幅が可能になる分子生物学技術である。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、標的ヌクレオチドの増幅をモニタリングできるＰＣＲを応用したものである。診断用ｑＰＣＲは、感染症、がん、遺伝子異常を示すヌクレオチドの検出に適用されている。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）は、標的ＲＮＡヌクレオチドの検出が可能になるｑＰＣＲを応用したものである。この能力により、ＲＴ－ＰＣＲはウイルス病原体の検出に好適である。しかし、ＲＴ－ＰＣＲでは、特定のポイントオブケア環境では利用できない場合がある大型の機器を使用する。さらに、ＲＴ－ＰＣＲでは、訓練を受けた人員が起用され、大がかりな試料調製が使用され、実行と結果の取得に時間がかかる。
【0003】
対照的に、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）は、標的ヌクレオチドの診断的同定に対するより単純なアプローチである。特に、ＬＡＭＰは、特定のヌクレオチド配列を増幅する一工程での核酸増幅法である。等温加熱プロセスの使用に加えて、ＬＡＭＰでは、ＰＣＲで使用されるより複雑な蛍光指示薬ではなく、色の変化などの単純な視覚的出力試験指示薬を使用することができる。逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）は、ＲＮＡから標的ヌクレオチドを同定するためにＲＴ－ＰＣＲと同様に使用することができ、ウイルス病原体の存在または不存在を識別する診断能力に使用することができる。ＬＡＭＰはより単純であるため、より少ない機器及び試料調製により実行することができ、そのため、診療所、緊急治療室、さらにはモバイルベースなどのポイントオブケア環境での使用が容易になる。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、ＬＡＭＰ分析を使用して標的ヌクレオチドを検出する際に使用するための技術（例えば、組成物、方法、システム、及びアセンブリ）に関する。いくつかの態様では、標的ヌクレオチドは、目的の病原体に存在することが知られている場合がある。病原体がウイルスである場合、ＬＡＭＰ分析はＲＴ－ＬＡＭＰ分析であってもよい。
【0005】
いくつかの開示実施形態では、病原体標的のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）検出用の唾液試料を調製する方法を提供する。一態様では、そのような方法は、試験対象から一定量の唾液を提供することと、病原体標的の検出が可能になるのに十分な濃度を維持しながら、唾液の緩衝能を低下させる程度まで唾液を水で希釈することとを含むことができる。
【0006】
一態様では、本方法は、元の粘度と比較して唾液の粘度を低下させることを含むことができる。別の態様では、粘度は、希釈、濾過、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数によって低下させることができる。別の態様では、濾過を使用して粘度を低下させることができる。さらなる態様では、１０ミクロンのフィルタを使用して粘度を低下させることができる。さらに別の態様では、粘度は、元の粘度と比較して流動性が増加して固相媒体を通る程度まで低下させることができる。さらに別の態様では、粘度は、約１．０センチポアズ（ｃＰ）～約５０ｃＰの範囲まで低下させることができる。
【0007】
一態様では、このような方法は、唾液試料のｐＨが試験試料の標的範囲に調整される程度まで唾液試料を濾過することを含むことができる。別の態様では、試験試料の標的範囲は約７．２～約８．６であり得る。別の態様では、水は６．０を超えるｐＨを有する場合があり、汚染物質を実質的に含まない場合がある。さらに別の態様では、唾液試料は唾液と水から本質的に構成され得る。なおさらなる態様では、唾液はスポンジベースの採取を使用して採取することができる。
【0008】
一態様では、唾液は、唾液対水の比が約１：１～約１：２０になるまで水で希釈することができる。別の態様では、唾液は、試料の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．２未満となる程度まで水で希釈することができる。さらなる態様では、唾液は約５０μｌ～約１００μｌの体積を有する。さらに別の態様では、唾液試料は、約１００μｌ～約１ｍｌの範囲の体積を有する。
【0009】
追加の態様では、病原体標的は、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含み得る。一態様では、病原体標的はウイルス標的であり得る。別の態様では、ウイルス標的は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。さらに別の態様では、ウイルス標的は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり得る。
【0010】
いくつかの態様では、ＬＡＭＰ検出は、逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）検出を含み得る。
【0011】
他の開示実施形態では、ＬＡＭＰ分析のための試験試料組成物が開示されており、これは、ＬＡＭＰ分析を介して病原体標的を検出するのに十分な量の試験対照の唾液を、唾液の緩衝能を低下させる量の水と組み合わせて含むことができる。
【0012】
一態様では、組成物は約１．０ｃＰ～約５０ｃＰの粘度を有することができる。別の態様では、組成物は約７．２～約８．６のｐＨを有することができる。別の態様では、組成物は、唾液対水の比が約１：１～約１：２０であり得る。さらに別の態様では、組成物は、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．２未満であり得る。別の態様では、水は６．０を超えるｐＨを有する場合があり、汚染物質を実質的に含まない場合がある。一態様では、組成物は唾液と水から本質的に構成され得る。別の態様では、唾液は約５０μｌ～約１００μｌの範囲の体積を有し得る。さらに別の態様では、唾液試料は、約１００μｌ～約１ｍｌの体積を有し得る。
【0013】
一態様では、病原体標的は、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含み得る。別の態様では、病原体標的はウイルス標的であり得る。別の態様では、ウイルス標的は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。さらに別の態様では、ウイルス標的は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る。さらに別の態様では、組成物の緩衝能は５ｍＭ未満であり得る。
【0014】
さらに他の開示実施形態では、固相媒体上のＬＡＭＰ分析用の組成物は、１つ又は複数の標的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び再可溶化剤を含むことができる。いくつかの態様では、このような組成物は、固相媒体を変色させることができる非ｐＨ感受性薬剤を実質的に含まないものであり得る。一態様では、組成物は、抗酸化剤を含むことができる。別の態様では、組成物は揮発性剤を実質的に含まないものであり得る。さらに別の態様では、組成物は吸湿剤を実質的に含まないものであり得る。他の一態様では、組成物は逆転写酵素をさらに含むことができる。
【0015】
一態様では、吸湿剤は、２５℃で相対湿度（ＲＨ）が約４０％～約９０％の間の場合、約１０重量％を超える量を吸収することができる。別の態様では、吸湿剤には、グリセロール、エタノール、メタノール、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸カルシウム、及びそれらの組み合わせを含めることができる。
【0016】
別の態様では、再可溶化剤は界面活性剤であり得る。別の態様では、再可溶化剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリソルベート２０、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【0017】
一態様では、標的プライマーは、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含み得る病原体を標的とすることができる。一態様では、病原体はウイルス病原体であり得る。別の態様では、ウイルス病原体は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。別の態様では、ウイルス病原体は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る。
【0018】
一態様では、組成物は、非変色添加剤をさらに含むことができる。非変色添加剤は、糖、緩衝液、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。別の態様では、組成物は指示薬をさらに含むことができる。
【0019】
他の開示の実施形態では、固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法は、本明細書に記載の固相媒体と組成物のアセンブリを提供すること、固相媒体上に生体試料を堆積すること、及びＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱すること、を含むことができる。一態様では、生体試料は、唾液、粘液、血液、尿、糞便、汗、呼気凝縮液、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数であり得る。別の態様では、生体試料は唾液である。一態様では、ＬＡＭＰ分析は、逆転写酵素ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）であり得る。別の態様では、この方法は、ウイルス病原体を検出することをさらに含むことができる。
【0020】
他の開示実施形態では、ＬＡＭＰ分析を実行するためのシステムは、本明細書に記載の組成物と、その組成物が堆積される固相媒体とを備えることができる。
【0021】
なおさらなる開示実施形態では、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物では、ｐＨ感受性色素を含み得るｐＨ依存性出力シグナル及び複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬を利用することができる。一態様では、ＬＡＭＰ分析はＲＴ－ＬＡＭＰであり得る。
【0022】
一態様では、ｐＨ感受性色素は、フェノールレッド、フェノールフタレイン、アゾリトミン、ブロモチモールブルー、ナフトールフタレイン、クレゾールレッド、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つであり得る。別の態様では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、揮発性試薬、ｐＨ干渉試薬、マグネシウム干渉試薬、またはそれらの組み合わせを実質的に含まないものであり得る。
【0023】
一態様では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、マグネシウム、硫酸アンモニウム、及び炭酸アンモニウムを実質的に含まないものであり得る。一態様では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、標的プライマー、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【0024】
別の態様では、組成物は抗酸化剤を含むことができる。別の態様では、組成物は、キャリアＲＮＡ、キャリアＤＮＡ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、塩酸グアニジン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。一態様では、組成物は固相媒体をさらに含むことができる。
【0025】
一態様では、組成物は、糖、緩衝液、遮断剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる非変色添加剤を含むことができる。一態様では、糖は、トレハロース、グルコース、スクロース、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。別の態様では、遮断剤は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【0026】
他の開示実施形態では、ｐＨ依存性出力シグナルを用いてＬＡＭＰ分析を実行する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の固相媒体と組成物のアセンブリを提供すること、固相媒体上に生体試料を堆積すること、及びＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱すること、を含むことができる。一態様では、ＬＡＭＰ分析はＲＴ－ＬＡＭＰであり得る。一態様では、生体試料は、唾液、粘液、血液、尿、糞便、汗、呼気凝縮液、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数であり得る。一態様では、生体試料は唾液であり得る。別の態様では、この方法は、ウイルス病原体を検出することをさらに含むことができる。
【0027】
さらなる開示実施形態では、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における出力シグナルの精度を最大化する方法は、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を最小限に抑える試薬混合物を提供することと、ＬＡＭＰ反応を実行することとを含むことができる。一態様では、この方法は、非ＬＡＭＰ反応からのプロトンの生成を制御することを含むことができる。別の態様では、この方法は、非ＬＡＭＰ反応による酸化を制御することを含むことができる。
【0028】
他の開示実施形態では、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における出力シグナルの精度を最大化する方法は、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を実質的に除去することを含むことができる。
【0029】
他の開示実施形態では、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における検出限界（ＬＯＤ）を最大化する方法は、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を実質的に除去することを含むことができる。
【0030】
本開示の特質及び利点は、本開示の特質を例として一緒に示す添付図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。添付図面は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】例示的な実施形態に従って、病原体標的のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）検出のために唾液試料を調製する方法を示す。
【図2】例示的な実施形態に従って、ＬＡＭＰ分析の方法を示す。
【図3】例示的な実施形態に従って、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における出力シグナルの精度を最大化する方法を示す。
【図4】例示的な実施形態に従って、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）を唾液試料中で得ることができることを示す。
【図5A】例示的な実施形態に従う、スポンジベースの採取デバイスを示す。
【図5B】例示的な実施形態に従う流涎（ｐａｓｓｉｖｅ ｄｒｏｏｌ）採取デバイスを示す。
【図6A】例示的な実施形態に従う、種々の濃度の試料及び種々の採取デバイスの検出限界を示す。
【図6B】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対する種々の濃度のテンプレートに対するＲＮａｓｅ阻害剤の効果を示す。
【図6C】例示的な実施形態に従う、比色ＬｏＤに対する唾液処理技術の効果を示す。
【図6D】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対するキャリアＤＮＡ濃度の影響を示す。
【図6E】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対するグアニジンＨＣｌの影響を示す。
【図6F】例示的な実施形態に従う、エンドポイントＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対するＵＤＧの効果を示す。
【図6G】例示的な実施形態に従う、比色応答に対する唾液処理の効果を示す。
【図7】例示的な実施形態に従う、凍結唾液試料の安定性を示すチャートである。
【図8】例示的な実施形態に従う、未処理唾液の検出限界を示す。
【図9】例示的な実施形態に従う、ウシ鼻腔スワブにおける検出限界を示す。
【図10】例示的な実施形態に従う、紙上の検出限界を示す。
【図11】例示的な実施形態に従う、フェノールレッドの比色遷移を示す。
【図12】例示的な実施形態に従う、紙ベースのアッセイに使用される緩衝液を示す。
【図13A】例示的な実施形態に従う、紙ＬＡＭＰ検証を示す。
【図13B】例示的な実施形態に従う、紙ＬＡＭＰ検証を示す。
【図14A】例示的な実施形態に従う、０分の時点での紙上の低テンプレート濃度ＬＡＭＰを示す。
【図14B】例示的な実施形態に従う、６０分の時点での紙上の低テンプレート濃度ＬＡＭＰを示す。
【図15】例示的な実施形態に従う、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む未処理の唾液全体を示す。
【図16】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色及び蛍光応答の比較を示す。
【図17A】例示的な実施形態に従う、ＬＡＭＰ比色指示薬としてのカルマガイトの使用を示す。
【図17B】例示的な実施形態に従う、ＬＡＭＰ指示薬としてのＥＢＴの使用を示す。
【図17C】例示的な実施形態に従う、比色レポーターとしてＥＢＴを使用するクロマトグラフィー用紙上のＬＡＭＰを示す。
【図17D】例示的な実施形態に従う、指示薬としてＥＢＴを使用する、種々の紙上のＬＡＭＰの比色応答を示す。
【図17E】例示的な実施形態に従う、比色指示薬としてＥＢＴを使用するｂｉｏｄｙｎｅ Ａ両性紙上のＬＡＭＰ検出を示す。
【図17F】例示的な実施形態に従う、ＬＡＭＰ比色応答に対するクリスタルバイオレット濃度の影響を示す。
【図17G】例示的な実施形態に従う、紙上の種々の濃度のクリスタルバイオレットを使用する比色ＬＡＭＰを示す。
【図17H】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ用の比色レポーターとしてのｐＨ指示薬を示す。
【図17I】例示的な実施形態に従う、ＬＡＭＰ反応の比色応答に対するクレゾールレッド濃度の影響を示す。
【図17J】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の比色応答に対する種々のｐＨ指示薬の濃度の影響を示す。
【図17K】例示的な実施形態に従う、ｐＨ指示薬を使用したＲＴ－ＬＡＭＰ生成物のゲル電気泳動スキャンを示す。
【図17L】例示的な実施形態に従う、フェノールレッドを使用したＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対する初期ｐＨの影響を示す。
【図18】例示的な実施形態に従う、乾燥プロセスの色の安定性を示す。
【図19A】例示的な実施形態に従う、乾燥後の紙の初期色に対する単一反応物の除去の効果を示す。
【図19B】例示的な実施形態に従う、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対するトレハロース及びＴｗｅｅｎ２０の効果を示す。
【0032】
ここで、例示的な実施形態を参照し、本明細書では、これを説明するために特定の言語を使用する。それでもなお、本技術の範囲がそれによって限定されないことを意図していることが理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明の実施形態を説明する前に、本開示は、本明細書に開示される特定の構造、プロセスステップ、または材料に限定されず、関連技術の当業者によって認識されるであろうその等価物にまで拡張されることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、具体的な例または実施形態を説明する目的でのみ使用されており、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。異なる図面における同じ参照番号は同じ構成要素を表す。フローチャート及びプロセスで提供される番号は、ステップ及び操作を示すことを明確にするために提供されており、必ずしも特定の順序（ｏｒｄｅｒ）または順番（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示すものではない。
【0034】
さらに、記載された特質、構造、または特徴は、１つ又は複数の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。以下の説明では、本発明の種々の実施形態の完全な理解を提供するために、組成物、剤形、治療法等の例などの多くの具体的な詳細が提供される。しかし、当業者であれば、そのような詳細な実施形態は、本明細書で明示される全体的な発明概念を限定するものではなく、単にその代表的なものであることを認識するであろう。
【0035】
定義
本明細書で使用される場合、文脈上別段の明確な指示がない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「賦形剤」への言及には、１つ又は複数のそのような賦形剤への言及が含まれ、「担体」への言及には、１つ又は複数のそのような担体への言及が含まれる。
本明細書で使用される場合、文脈上別段の明確な指示がない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「賦形剤」への言及には、１つ又は複数のそのような賦形剤への言及が含まれ、「担体」への言及には、１つ又は複数のそのような担体への言及が含まれる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「配合物」及び「組成物」という用語は交換可能に使用され、２つ以上の化合物、元素、または分子の混合物を指す。いくつかの態様では、「配合物」及び「組成物」という用語は、１つ又は複数の活性剤と担体または他の賦形剤との混合物を指すために使用することができる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「可溶性」という用語は、所定の溶媒に溶解する能力に関する物質または薬剤の尺度または特徴である。組成物の特定の成分における物質または薬剤の溶解度は、約２５℃または約３７℃などの特定の温度で溶解して目に見えて透明な溶液を形成する物質または薬剤の量を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、「親油性」という用語は、水に溶けにくい化合物を指す。逆に、「親水性」という用語は、水に可溶性である化合物を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「対象」とは動物を指す。一態様では、動物は哺乳動物であってもよい。別の態様では、哺乳動物はヒトであってもよい。
【0040】
本明細書で使用される場合、「非液体」は、本明細書に開示される組成物の状態を指すために使用される場合、半固体または固体としての組成物の物理的状態を指す。
【0041】
本明細書で使用される場合、「固体」及び「半固体」とは、標準温度及び圧力で自重を支え、自由に流動しない適切な粘度または構造を有する組成物の物理的状態を指す。半固体の材料は、圧力を加えると容器の形状に適合する場合がある。
【0042】
本明細書で使用される場合、「固相媒体」、「固相ベース」、「固相基材」、「固相試験基材」、「固相検査基材」などは、非液体媒体、デバイス、システム、または環境を指す。いくつかの態様では、非液体媒体は、液体を実質的に含まなくても、または液体を完全に含まなくてもよい。一例では、非液体媒体は、多孔質材料もしくは多孔質表面を有する材料を含むか、または多孔質材料もしくは多孔質表面を有する材料であり得る。別の例では、非液体媒体は、繊維状材料もしくは繊維状表面を有する材料を含むか、または繊維状材料もしくは繊維状表面を有する材料であり得る。さらに別の例では、非液体媒体は紙であってもよい。
【0043】
本明細書で使用される場合、「非変色添加剤」は、その上またはその中で起こっているＬＡＭＰ反応からのヌクレオチド増幅以外の理由による、固相媒体の色の元の色または開始色から異なる色への色の変化を最小限に抑えるまたは防止する添加剤を指す。例えば、一実施形態では、そのような色の変化は、非変色添加剤が存在しない場合に起こる色の変化と比較して、最小限に抑えられるか、または低減し得る。
【0044】
本明細書で使用される場合、「非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色」とは、ＬＡＭＰ反応からのヌクレオチド増幅の結果ではない、固相媒体のあらゆる変色（例えば、元の色から別の色への色の変化）を指す。いくつかの例では、非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色は、揮発性剤、マグネシウム干渉剤、酸化剤、ＬＡＭＰ反応による増幅以外の原因から生じるｐＨ変化、乾燥、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数に起因する固相媒体の変色を指し得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「揮発性剤」とは、高い蒸気圧または低い沸点を有する組成物を含む剤を指す。一例では、アンモニアは揮発して硫酸を残し得るため、硫酸アンモニウムは揮発性剤となり得る。一例では、組成物、構成成分、または元素は、組成物が約３０℃を超える温度において気相で存在する場合、高い蒸気圧を有し得る。一例では、組成物が約８０℃未満の温度において気相で存在する場合、組成物は低い沸点を有し得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ干渉試薬」は、ＬＡＭＰ反応からの増幅以外の理由で、反応、系、または環境のｐＨに影響を与える得る試薬である。一例では、アンモニウムイオンは硫酸アンモニウムから揮発し得、硫酸イオンは反応して硫酸を形成し、ＬＡＭＰ反応による増幅がない場合に反応のｐＨに影響を与え得る。
【0047】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、などを意味することができ、一般に非限定用語であると解釈される。「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語は限定用語であり、そのような用語に関連して具体的に列挙されている成分、構造、ステップなど、ならびに米国特許法に従うもののみを含む。「から本質的になること（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、米国特許法によってそれらに一般に与えられる意味を有する。特に、そのような用語は、関連して使用される項目（複数可）の基本的かつ新規な特徴または機能に実質的に影響を及ぼさない追加の項目、材料、成分、ステップ、または構成要素を含めることが可能であることを除き、一般に限定用語である。例えば、組成物中に存在するが組成物の性質や特徴に影響を及ぼさない微量元素は、「から本質的になること」という語法の下で存在する場合、たとえそのような専門用語に従う項目のリストに明示的に記載されていなくても許容されるであろう。本明細書において「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの非限定用語を使用する場合、「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語法ならびに「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語法にも、あたかも明示的に記載されているかのように直接的支持が与えられるべきであり、その逆も同様であることが理解される。
【0048】
明細書及び特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」、「第４」などの用語は、類似する構成要素間を区別するために使用され、必ずしも特定の連続的または時系列的な順序を説明するために使用されるわけではない。このように使用される用語はいずれも、本明細書に記載される実施形態が、例えば、本明細書に図示または別様に記載されたもの以外の順番で動作できるように、適切な状況下では交換可能であることを理解されたい。同様に、方法が一連のステップを含むものとして本明細書に記載されている場合、本明細書に提示されているステップの順序は、必ずしもそのようなステップが実行される唯一の順序であるわけではなく、記載されたステップのうちのある特定のものが省略される場合がある、及び／または本明細書に記載されていないある特定の他のステップが方法に追加される場合がある。
【0049】
本明細書で使用される場合、「増加した」、「減少した」、「より良好な」、「悪化した」、「より高い」、「より低い」、「強化された」、「最大化された」、「最小化された」などの比較用語は、周囲または隣接する領域にある、同様に位置している、単一のデバイスもしくは組成物内または複数の相当するデバイスもしくは組成物内にある、群またはクラス内にある、複数の群またはクラス内にある、他のデバイス、成分、組成物、または活動とは測定可能な程度に異なる、または既知の従来技術と比較して測定可能な程度に異なる、デバイス、成分、組成物、または活動の特性を指す。
【0050】
本明細書で使用される「結合した（ｃｏｕｐｌｅｄ）」という用語は、化学的、機械的、電気的または非電気的な様式で直接的または間接的に接続していると定義される。本明細書で互いに「隣接している」と記載されている物体は、その語句が使用される文脈に応じて、互いに物理的に接触している、互いに極めて近接している、または互いに同じ一般的領域もしくは範囲に存在することがある。本明細書において「一実施形態では」または「一態様では」という語句が出現する場合、必ずしもすべてが同じ実施形態または態様を指すわけではない。
【0051】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、動作、特徴、特性、状態、構造、項目、または結果の完全もしくほぼ完全な範囲または程度を指す。例えば、「実質的に」封入されている物体は、その物体が完全に封入されているか、ほぼ完全に封入されているかのいずれかであることを意味する。絶対的な完全性からの逸脱の正確な許容可能な程度は、場合によっては特定の状況に依存することがある。しかし、一般的に言えば、完全に近づくと、あたかも絶対的かつ総体的な完全が得られるかのように、同じ全体的な結果が得られるようになる。「実質的に」の使用は、動作、特徴、特性、状態、構造、項目、または結果が完全にもしくはほぼ完全に欠如していることを指す否定的な意味合いで使用される場合にも等しく適用可能である。例えば、粒子を「実質的に含まない」組成物は、粒子が完全に欠如しているか、またはその効果は粒子が完全に欠如しているのと同じである程度にほぼ完全に粒子が欠如しているかのいずれかであろう。言い換えれば、ある成分または要素を「実質的に含まない」組成物であっても、その測定可能な効果がない限り、実際にはそのような項目をなおも含有している場合がある。
【0052】
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、所定の値が端点の「わずかに上」または「わずかに下」であり得ることを規定することにより、数値範囲の端点に柔軟性を与えるために使用される。特に明記しない限り、特定の数または数値範囲に従って「約」という用語を使用することは、「約」という用語を伴わないそのような数値用語または数値範囲を支持するものであると理解されるべきである。例えば、便宜性及び簡潔性のために、「約５０オングストローム～約８０オングストローム」という数値範囲は、「５０オングストローム～８０オングストローム」の範囲を支持するものであるとも理解されるべきである。さらに、本明細書では、実際の数値は、それに伴って「約」という用語が使用される場合でも、支持されることを理解されたい。例えば、「約」３０という記述は、３０をわずかに上回る値と少し下回る値を支持するだけでなく、３０という実際の数値も支持すると解釈されるべきである。
【0053】
本明細書で使用される場合、複数の項目、構造要素、構成要素、及び／または材料は、便宜上、共通のリストで提示してもよい。しかし、これらのリストは、リストの各メンバーが別々かつ固有のメンバーとして個別に識別されるかのように解釈されるべきである。したがって、そのようなリストのいかなる個々のメンバーも、反対の表示がなければ、共通の群内での提示のみに基づいて、同じリストのいかなる他のメンバーとも事実上同等であると解釈されるべきではない。
【0054】
濃度、量、レベル及び他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現または提示することができる。そのような範囲の形式は、単に便宜性及び簡潔性のために使用され、したがって、範囲の制限として明示的に列挙された数値を含むだけなく、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または部分範囲または小数単位も、あたかも各数値及び部分範囲が明示的に列挙されているかのように、含むことが柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。実例として、「約１～約５」という数値範囲は、明示的に列挙された約１～約５の値だけでなく、示された範囲内の個々の値及び部分範囲も含むものと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、２、３、及び４などの個々の値、ならびに１～３、２～４、及び３～５等などの部分範囲、ならびに１、２、３、４、及び５が個別に含まれる。最小値または最大値として１つの数値のみを記載する範囲にも、これと同じ原理が当てはまる。さらに、そのような解釈は、記載されている範囲の広さまたは特徴に関係なく適用されるべきである。
【0055】
本明細書全体を通じて「一例（ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ）」への言及は、その例に関連して説明される特定の特質、構造、または特徴が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて種々の箇所で出現する「一例では」という語句は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではない。
【0056】
実施形態
病原体（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））の多くの分子試験は、実験室に限定される可能性があり、したがって、結果が得られるまでに大幅な遅延時間（＞２４時間）があり、ポイントオブケア環境での採用が妨げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のポイントオブケア試験の開発は何度か試みられているが、いくつかの限界が残っている：ｉ）スケーラビリティ（検査の需要は週に数百万のオーダーであるが、その規模で新しい試験を作成するのは困難である）、ｉｉ）試料処理（唾液を使用する場合、多くの試験では依然として抽出操作が使用される）、及びｉｉｉ）可読性（分子試験では多くの場合蛍光が使用されるため、結果を報告するために蛍光リーダーが使用される）。
病原体（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））の多くの分子試験は、実験室に限定される可能性があり、したがって、結果が得られるまでに大幅な遅延時間（＞２４時間）があり、ポイントオブケア環境での採用が妨げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のポイントオブケア試験の開発は何度か試みられているが、いくつかの限界が残っている：ｉ）スケーラビリティ（検査の需要は週に数百万のオーダーであるが、その規模で新しい試験を作成するのは困難である）、ｉｉ）試料処理（唾液を使用する場合、多くの試験では依然として抽出操作が使用される）、及びｉｉｉ）可読性（分子試験では多くの場合蛍光が使用されるため、結果を報告するために蛍光リーダーが使用される）。
【0057】
現在の検査方法は、試料として希釈唾液（例えば、水中５％体積／体積）を使用して６０分以内に病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の存在下での色の変化を報告する、紙ベースのデバイス及び逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を使用するポイントオブケア試験を使用することによって克服することができる。ＲＴ－ＬＡＭＰは、特に感染の急性期中に適切な診断性能を備えた一定温度で実行される核酸増幅技術である。ＲＴ－ＬＡＭＰは、一定温度で実行することができるため、高価な熱サイクル機器を使用しない。さらに、ＬＡＭＰ生成物用の既存の比色レポーターでは、蛍光リーダーを使用しない。したがって、この試験はポイントオブケア環境での使用に好適であり、迅速な開発及びスケールアップに適しているため、公衆衛生上の緊急事態での使用に適している。
【0058】
ＲＴ－ＬＡＭＰは、種々の病原体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）を検出するためのマイクロ流体紙ベース分析デバイス（μＰＡＤ）に実装することができ、携帯型電子デバイスを使用して画像分析を実行して陽性応答と陰性応答を区別することができる。一例では、紙上での高コントラストＲＴ－ＬＡＭＰ反答により、肉眼で見える色の変化が得られる。さらに、ワックス印刷－印刷領域と試薬の分配の正確な位置合わせが可能－を使用する代わりに、試料間のクロストークを防ぐためにポリスチレンスペーサーを使用することができる。ポリスチレンスペーサーは、製造をスケールアップするためのロールツーロール製造に適している。
【0059】
核酸ベースのＣＯＶＩＤ－１９診断方法は、前処理を使用して結果を提供する。本明細書に開示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の紙上比色検出は、最小限の前処理で実行することができる。このデバイスは、事前増幅なしで紙上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することができる感度及び特異度を有することができる。溶液中で実行される他のアッセイは、紙ベースのアッセイほど製造中に拡張可能ではない場合がある。さらに、本明細書に開示されるアッセイでは数秒で完了することができる希釈操作を使用するが、他のアッセイではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためにプロテアーゼによる処理、熱不活化、及び／またはＲＮＡ抽出などの種々の操作を使用する（操作は少なくとも１０分間で完了し、追加の機器を使用する）。
【0060】
ＬＡＭＰ分析用の試料採取及び特性
唾液には、ＬＡＭＰ反応との関係において困難を引き起こす可能性がある種々の物理的、化学的、及び抗菌的特性がある。例えば、ある物理的特性では、唾液は、有機酸を歯垢から希釈して除去することがあり、これはＬＡＭＰ反応を妨げる可能性がある。化学的特性の一部－ｐＨの変化を最小限に抑える電解質及び緩衝分子－も、ＬＡＭＰ反応を妨げる可能性がある。唾液中の抗菌剤、例えばムチン、アミラーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ酵素にも課題がある。例えば、ペルオキシダーゼ酵素は細菌細胞内でフリーラジカル化合物を形成し、細菌細胞にアポトーシス様の死を引き起こす可能性がある。しかし、このような反応は不安定な酸化還元環境を提供し、ＬＡＭＰ反応を複雑にする可能性もある。
唾液には、ＬＡＭＰ反応との関係において困難を引き起こす可能性がある種々の物理的、化学的、及び抗菌的特性がある。例えば、ある物理的特性では、唾液は、有機酸を歯垢から希釈して除去することがあり、これはＬＡＭＰ反応を妨げる可能性がある。化学的特性の一部－ｐＨの変化を最小限に抑える電解質及び緩衝分子－も、ＬＡＭＰ反応を妨げる可能性がある。唾液中の抗菌剤、例えばムチン、アミラーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ酵素にも課題がある。例えば、ペルオキシダーゼ酵素は細菌細胞内でフリーラジカル化合物を形成し、細菌細胞にアポトーシス様の死を引き起こす可能性がある。しかし、このような反応は不安定な酸化還元環境を提供し、ＬＡＭＰ反応を複雑にする可能性もある。
【0061】
上述の背景を念頭に置いて、図１のフローチャートに示すように、病原体標的のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）検出のために唾液試料を調製する方法１００が提供される。光学的に検出されたｐＨベースの色の変化など、試験結果を示すために選択された最終シグナル出力に応じて、試料中の唾液によって試料全体のｐＨが中性から大きく偏らないようにすることが望ましい場合がある。試料中の唾液の緩衝能または影響をチェックするかまたは別様に制限するために、さまざまな技術及びプロセスを実装することができる。過剰な量の緩衝能は、ｐＨベースの色の変化を検出するために使用されるｐＨの変動を妨げる可能性がある。
【0062】
唾液の緩衝能を低下させる１つの方法として、希釈を挙げることができる。一実施形態では、このような方法は、ブロック１１０に示すように、試験対象から一定量の唾液を提供することと、ブロック１２０に示すように、病原体標的の検出が可能になるのに十分な濃度を維持しながら、唾液の緩衝能を低下させる程度まで唾液を水で希釈することとを含むことができる。
【0063】
唾液中に存在するタンパク質は、別の課題を提示する。例えば、過度に粘性のある試料を固体ベースまたは固相媒体で試験するのは困難になる可能性がある。固体ベースの媒体の流速が遅いと、反応時間が長くなり、広がりの均一性が低下し、結果のばらつきが増大し、結果の無効性が増大する可能性がある。例えば、粘性のある形態の唾液が固体ベースの媒体全体に均一に広がらない場合、色ベースの表示が読み取りにくい場合がある。均一な広がりが低下すると、結果の読み取りに不確実性が加わり、結果のばらつきが増大する可能性がある。技術者によって結果の解釈が異なる場合がある。場合によっては、色の変化が曖昧であったり、変化がなかったりするため、結果を読み取ることが実行不可能になる場合がある。したがって、唾液の粘度を制御することで、発生し得る種々の複雑な問題を防ぐことができる。
【0064】
したがって、別の実施形態では、本方法は、元の粘度と比較して唾液の粘度を低下させることをさらに含むことができる。一態様では、唾液は、希釈、濾過など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数によって減少させることができる。一態様では、希釈を用いて唾液の粘度を低下させる場合、唾液は、唾液対水の比が約１：１から約１：２０になるまで水で希釈することができる。別の態様では、唾液の粘度を水で希釈して、唾液対水の比を約１：１、１：２、１：４、１：８、１：１０、１：１２、１：１４、１：１６、１：１８、または１：２０にすることができる。一態様では、唾液は、試料の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が約０．２未満となる程度まで水で希釈することができる。一態様では、唾液は、約５０μｌ～約１００μｌの範囲の体積を有し得る。別の態様では、唾液試料は、約１００μｌ～約１ｍｌの範囲の体積を有し得る。
【0065】
場合によっては、唾液試料を希釈することにより、唾液の緩衝能及び粘度から生じる作用の影響を低減することができる。唾液の粘度の影響を低減する別の方法には、濾過が含まれる。別の態様では、約２ミクロン～５０ミクロンの間の定格を有するフィルタを使用して粘度を低下させることができる。一例では、フィルタ定格は、２ミクロン、５ミクロン、８ミクロン、１０ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、２５ミクロン、４０ミクロン、または５０ミクロンのうちの１つ又は複数であり得る。一態様では、フィルタ定格は、フィルタが特定の粒径の少なくとも約９８．７％を除去することができる絶対ミクロン定格とすることができる。希釈だけでなく唾液を濾過すると、ＬＡＭＰ反応を妨げる場合がある唾液タンパク質（例えば、ムチン、アミラーゼ、リゾチーム、及びペルオキシダーゼ酵素）も除去することができる。
【0066】
希釈、濾過、またはその両方を組み合わせることにより、粘度を特定の範囲内に収まるように制御することができる。さらに別の態様では、粘度は、元の粘度と比較して流動性が増加して固相媒体を通る程度まで低下させることができる。一例では、唾液の粘度は、希釈または濾過前に約１センチポアズ（ｃＰ）～約１００ｃＰの範囲を有し得る。一例では、唾液の粘度は、希釈または濾過後に約１．０ｃＰ～約５０ｃＰの範囲まで低下させることができる。別の例では、唾液の粘度は、希釈または濾過後に約１．０ｃＰ～約１０ｃＰの範囲まで低下させることができる。
【0067】
唾液を濾過することによって、ｐＨ範囲を所望のレベルに調整することもできる。例えば、一部のｐＨ指示薬は、特定のｐＨ範囲（例えば、７．２～約８．６）内で色の変化を表示する場合がある。したがって、使用するｐＨ指示薬のタイプに応じて、唾液を試験試料の標的範囲に濾過することができる。しかし、試験試料の標的範囲を生理学的条件内に維持すると、ＬＡＭＰ反応結果の均一性を向上させることができる。一態様では、唾液は、唾液試料のｐＨを試験試料の標的範囲に調整する程度まで濾過することができる。一例では、試験試料の標的範囲は、約７．２～約８．６の間のｐＨ範囲を含むことができる。別の例では、試験試料の標的範囲は、約７．６～約８．２の間のｐＨ範囲を含むことができる。
【0068】
試験試料の標的範囲を所望のレベルに調整する場合、ＬＡＭＰ反応におけるｐＨ変化（または他の比色指標）を検出するには十分ではないことがある。別の例では、組成物の緩衝能が水で希釈する前の緩衝能と比較して低下する程度まで唾液を水で希釈して、ｐＨ指標を検出可能にすることができる。一例では、緩衝能は、酸または塩基が加えられたときのｐＨの変化に抵抗する溶液（例えば、唾液、水、または水で希釈された唾液）の能力として定義することができる。一例では、緩衝能は、ｐＨを１単位変化させるために溶液１リットルに加えられる強酸または強塩基の量、すなわちグラム当量として定義することができる。一態様では、水で希釈する前の唾液の緩衝能は、０．０３ｍｇ／ｍｌ～約０．３０ｍｇ／ｍｌの間であり得、水で希釈した後の唾液希釈水の緩衝能は、約０．００３ｍｇ／ｍｌ～約０．０３ｍｇ／ｍｌの間であり得る。別の例では、唾液希釈水の緩衝能は、約５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、または１ｍＭ未満であり得る。
【0069】
試料を希釈するために使用される水には、ＬＡＭＰ反応に干渉する可能性のあるいかなる汚染物質または特性も含まれない必要がある。例えば、ｐＨがあまりに酸性であると、ｐＨベースの指標変化が妨げられる場合、ＬＡＭＰ反応が検出されなくなる可能性がある。一態様では、唾液は水で希釈することができ、この水は約６．０を超えるｐＨを有することができる。別の態様では、水は約８．０未満のｐＨを有することができる。一例では、水は、ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅなどの汚染物質を実質的に含まない分子グレードの水であり得る。ＲＮａｓｅは検出対象の唾液中のＲＮＡを分解し、ＤＮａｓｅはＬＡＭＰ反応中に形成されたＤＮＡを分解する。別の例では、唾液試料は唾液と水から本質的に構成され得る。
【0070】
望ましくない唾液タンパク質の存在を最小限に抑えることは、特定の唾液採取方法を使用して達成することができる。一態様では、唾液は、スポンジベースの採取方法または流涎採取方法のうちの１つ又は複数を使用して採取することができる。スポンジベースの採取方法を使用して唾液を採取すると、ムチン及び高分子量タンパク質はスポンジに吸収されないため、唾液から本質的に濾過されるという利点が得られる場合があり、これにより、固体ベースの媒体上で使用すると、唾液の粘度が低下し、唾液の迅速性、均一性、及び信頼性が向上する可能性がある。流涎法を使用して唾液を採取する場合、濾過されていない唾液は粘度が高くなることがあるため、吸収が低下し、固体ベースの媒体上に分布する可能性がある。結果として、いくつかの実施形態では、流涎を介して唾液を採取する場合、ムチン及び他の細片を除去するためにその後濾過して、その粘度を低下させることができる。
【0071】
選択された病原体標的は、唾液から検出することができる。一態様では、病原体標的は、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、原生動物病原体など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数であり得る。唾液中の病原体標的は、病原体標的からの核酸が、細胞壁、細胞膜、タンパク質膜などから放出され得る場合に検出することができる。
【0072】
より具体的には、一態様では、病原体標的はウイルス標的であり得る。いくつかの態様では、ウイルス標的は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、インフルエンザなど、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0073】
ウイルス標的は、多くの異なるウイルス種から選択することができる。一例では、ウイルス標的は、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ＭＥＲＳコロナウイルス、ヒトレスピロウイルス１、ヒトルブラウイルス２、ヒトレスピロウイルス３、ヒトルブラウイルス４、ヒトエンテロウイルス、ヒト呼吸器ウイルス、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、ライノウイルスＣ、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0074】
ウイルス標的はまた、インフルエンザの形態であってもよい。一態様では、インフルエンザは、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、またはインフルエンザＤのいずれかであり得る。一態様では、ウイルス標的は、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅ目から選択されるウイルスであり得る。一態様では、ウイルス標的は、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅ目のアルファ属、ベータ属、ガンマ属、またはデルタ属から選択することができる。
【0075】
検出することができるウイルスには種々のファミリーが存在する。一態様では、ウイルス標的は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、などを含む科、及びそれらの組み合わせの群から選択されるＤＮＡウイルスであり得る。別の態様では、ウイルス標的は、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅなどを含む科、及びそれらの組み合わせの群から選択されるＲＮＡウイルスであり得る。別の態様では、ウイルス標的は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅなど含む科、及びそれらの組み合わせの群から選択される逆転写ウイルスであり得る。
【0076】
より一般的には、ウイルス標的は、ボルチモア分類によって分類されるウイルスであり得る。一態様では、ウイルス標的は、ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ジカ、Ｃ型肝炎）であり得る。一態様では、ウイルス標的は、ＤＮＡウイルス（例えば、エプスタイン・バー、天然痘）であり得る。一態様では、ウイルス標的は、ポジティブセンスＲＮＡウイルス（例えば、Ａ型肝炎、風疹）であり得る。一態様では、ウイルス標的は、ネガティブセンスＲＮＡウイルス（例えば、エボラ出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎）であり得る。別の態様では、ウイルス標的は、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、水痘、ヘルペス）、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、ロタウイルス）、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス（例えば、レトロウイルス）、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルス（例えば、Ｂ型肝炎）であり得る。
【0077】
ウイルス標的に加えて、別の態様では、病原体標的は細菌性標的であり得る。いくつかの例では、細菌性標的は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｙｅｒｓｉｎｉａなどを含む属、及びそれらの組み合わせから選択することができる。別の例では、細菌性標的は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｔ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓなどを含む種、及びそれらの組み合わせから選択することができる。別の態様では、病原体標的は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓを含む種、及びそれらの組み合わせから選択することができる。
【0078】
病原体標的には、種々のタイプの真菌も含めることができる。一態様では、病原体標的は真菌性標的であり得る。いくつかの例では、真菌性標的は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓなどを含む属、及びそれらの組み合わせから選択することができる。別の態様では、病原体標的は原生生物標的であり得る。いくつかの例では、原生生物標的は、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓなどを含む属、及びそれらの組み合わせから選択することができる。
【0079】
唾液中の病原体標的がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡは逆転写させることができる。したがって、別の態様では、ＬＡＭＰ検出は、逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）であり得る。この例では、逆転写酵素を使用して標的ＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる。ｃＤＮＡは検出可能な量まで増幅することができる。病原体標的をＤＮＡから直接検出できる場合、ＬＡＭＰを使用して、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写することなく、ＤＮＡを検出可能な量まで増幅することができる。
【0080】
別の態様では、検出される特定の標的ヌクレオチド配列は、ヒトバイオマーカーに対応する標的ヌクレオチドであり得る。疾患のヒトバイオマーカーに対応する標的ヌクレオチドを有するあらゆる疾患を検出することができる。乳がん、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、胃腸がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、多くのタイプの癌腫、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、リンパ腫、白血病、黒色腫、前立腺がん、甲状腺がん、胃がんなど、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む、種々のタイプの疾患を検出することができる。例えば、種々のタイプの疾患のバイオマーカーは、アルファフェトプロテイン、ＣＡ１５－３及びＣＡ２７－２９、ＣＡ１９－９、ＣＩ－１２５、カルシトニン、カルレチニン、癌胎児性抗原、ＣＤ３４、ＣＤ９９ＭＩＣ２、ＣＤ１１７、クロモグラニン、染色体３、７、１７、及び９ｐ２１、サイトケラチン、セスミン（ｃｅｓｍｉｎ）、上皮膜抗原、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１ＦＬ１、グリア線維性酸性タンパク質、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質（ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｈＰＧ８０、ＨＭＢ－４５、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、免疫グロブリン、インヒビン、ケラチン、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ－１、ＭｙｏＤ１、筋肉特異的アクチン、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ、胎盤性アルカリホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＰＴＰＲＣ、Ｓ１００タンパク質、平滑筋作用、シナプトフィジン、チミジンキナーゼ、サイログロブリン、甲状腺転写因子－１、腫瘍Ｍ２－ＰＫ、ビメンチンなど、またはそれらの組み合わせ、の１つ又は複数に対応する標的ヌクレオチドを検出することによって検出することができる。
【0081】
別の実施形態では、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の試験試料組成物は、唾液の緩衝能を低下させる量の水と組み合わせて、ＬＡＭＰ分析を介して病原体標的を検出するのに十分な量の試験対象の唾液を含むことができる。一態様では、組成物の粘度は約１．０ｃＰ～約５０ｃＰであり得る。別の態様では、組成物のｐＨは約７．２～約８．６であり得る。これらのそれぞれの範囲内の粘度及びｐＨを選択すると、ｐＨの変化が促進され、したがってｐＨベースの指示薬に起因する色の変化が促進される。
【0082】
唾液を水で希釈して、粘度及びｐＨを上に列挙した範囲内に収めることができる。一態様では、唾液を、約１：１～約１：２０の唾液対水の比で水と混合させることができる。別の態様では、唾液対水の比は、約１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：１２、１：１４、１：１６、１：１８、または１：２０であり得る。別の態様では、唾液は、試料の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．２未満となる程度までの量の水と組み合わせることができる。
【0083】
唾液の量が検出可能な量のウイルスを含有することを保証するために、採取された唾液の量は閾値量よりも多くてもよい。一態様では、唾液は、約５０μｌ～約１００μｌの範囲の体積を有し得る。別の態様では、唾液試料は、約１００μｌ～約１ｍｌの範囲の体積を有し得る。
【0084】
唾液はまた、ＬＡＭＰ反応を促進することができる種々の化学的特性（例えば、ｐＨ及び緩衝能）を有し得る。一態様では、水は約６．０を超えるｐＨを有する場合があり、ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅなどの汚染物質を実質的に含まない場合がある。別の態様では、水は約８．０未満のｐＨを有する場合があり、汚染物質を実質的に含まない場合がある。別の態様では、組成物は唾液と水から本質的に構成され得る。一態様では、組成物の緩衝能は、約０．００３ｍｇ／ｍｌ～約０．０３ｍｇ／ｍｌの間であり得る。別の例では、組成物の緩衝能は、約５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、または１ｍＭ未満であり得る。
【0085】
前述したように、病原体標的は、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含み得る。病原体標的はウイルス標的であり得る。ウイルスのボルチモア分類に基づいて、別の態様では、ウイルス標的は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。別の態様では、ウイルス標的は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る。
【0086】
試薬組成物
検査媒体、読み出しタイプ、及び設計されたシステムの全体的な環境に応じて、さまざまな試薬をＬＡＭＰ分析で使用することができる。さらに、プライマー及び酵素などの反応成分は、検出すべき特定の標的ヌクレオチド配列、同定すべき生物などを考慮して選択することができる。さらに、液体環境、無水環境、筐体、基材等の試験環境の特性、ならびに安定な状態での保存などの他のニーズもＬＡＭＰ分析の基礎となる反応に関与する特定の試薬を選択する際の考慮に入れることができる。
検査媒体、読み出しタイプ、及び設計されたシステムの全体的な環境に応じて、さまざまな試薬をＬＡＭＰ分析で使用することができる。さらに、プライマー及び酵素などの反応成分は、検出すべき特定の標的ヌクレオチド配列、同定すべき生物などを考慮して選択することができる。さらに、液体環境、無水環境、筐体、基材等の試験環境の特性、ならびに安定な状態での保存などの他のニーズもＬＡＭＰ分析の基礎となる反応に関与する特定の試薬を選択する際の考慮に入れることができる。
【0087】
一実施形態では、固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物は、１つ又は複数の標的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び再可溶化剤を含むことができる。一態様では、組成物は、固相媒体を変色させることができる非ｐＨ感受性薬剤を実質的に含まないものであり得る。
【0088】
固相媒体上でＬＡＭＰ分析を行う場合、液相媒体におけるＬＡＭＰ分析と比較して、試薬の濃度を増加させることができる。一態様では、固相媒体上で使用される場合のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、液体媒体で使用される場合のＤＮＡポリメラーゼの濃度の少なくとも２倍であり得る。別の態様では、固相媒体上で使用される場合のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、液体媒体で使用される場合のＤＮＡポリメラーゼの濃度の少なくとも３倍であり得る。一例では、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約３００Ｕ／ｍＬ～約１０００Ｕ／ｍＬであり得る。別の例では、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約６００Ｕ／ｍＬ～約１０００Ｕ／ｍＬであり得る。更に別の例では、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約６２０Ｕ／ｍ～約６８０Ｕ／ｍＬであり得る。
【0089】
ＬＡＭＰ分析が逆転写酵素ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を伴う場合、組成物は逆転写酵素をさらに含むことができる。逆転写酵素は、ＲＮＡベースのウイルスの検出に役立ち得る。一態様では、固相媒体上で使用される場合の逆転写酵素の濃度は、液体媒体で使用される場合の逆転写酵素の濃度の少なくとも２倍であり得る。別の態様では、逆転写酵素の濃度は、液体媒体で使用される場合の逆転写酵素の濃度の少なくとも３倍であり得る。一例では、逆転写酵素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２００Ｕ／ｍＬ～約６００Ｕ／ｍＬであり得る。別の例では、逆転写酵素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２５０Ｕ／ｍＬ～約５００Ｕ／ｍＬであり得る。さらに別の例では、逆転写酵素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２９０Ｕ／ｍＬ～約３１０Ｕ／ｍＬであり得る。
【0090】
標的プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素に加えて、組成物は再可溶化剤を含むことができる。再可溶化剤は、唾液試料が固体ベースの媒体上に堆積するときに、固体ベースの媒体上でのＬＡＭＰ試薬の再水和に役立つ場合がある。一態様では、再可溶化剤は界面活性剤であり得る。例えば、再可溶化剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリソルベート２０など、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ＢＳＡ及びカゼインは、乾燥試薬を再水和するときに、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びその他の関連酵素の再可溶化を促進する。ポリソルベート２０は、乾燥試薬の再可溶化にも役立つ界面活性剤である。一例では、再可溶化剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０５重量％～約５重量％であり得る。別の例では、再可溶化剤の濃度は約０．５重量％～約３重量％であり得る。さらに別の例では、再可溶化剤の濃度は約０．５重量％～約１．５重量％であり得る。
【0091】
組成物は、反応を加速する薬剤、感度を高める薬剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。一例では、反応を加速し、感度を高めるためにＢＳＡを含めることができる。しかし、ＢＳＡを含めるとｐＨ変動が誘導され、結果の読みやすさが損なわれる可能性がある。したがって、いくつかの例では、再可溶化剤には、カゼイン、ポリソルベート２０など、またはそれらの組み合わせを含めることができる。
【0092】
揮発性剤は、ＬＡＭＰ反応に干渉する可能性がある。例えば、揮発性化合物が複数のイオンにイオン化する場合があり、それらイオンのうちの１つが低沸点を有する場合がある。低沸点のイオンが蒸発すると、残ったイオンがさらに反応する可能性がある。さらなる反応のいくつかには、酸化還元反応、酸塩基反応、またはｐＨベースのシグナルの解釈に影響を与える可能性のあるその他の反応が含まれる場合がある。一態様では、組成物は揮発性剤を実質的に含まないものであり得る。一例では、揮発性剤を除去すると、揮発性剤が含まれる場合の色のコントラスト及び反応時間と比較して、固体ベースの媒体の色のコントラストが増加し、反応時間を短縮することができる。一態様では、組成物は、１．０重量％、０．５重量％、０．１重量％、または０．０１重量％のうちの１つ又は複数の量未満の揮発性剤を含有することができる。
【0093】
揮発性剤は、固体ベースの媒体中で不安定性を引き起こす可能性がある。いくつかの例では、硫酸アンモニウムなどの揮発性化合物を含むＬＡＭＰ反応では、アンモニウムイオンが硫酸アンモニウムを部分的にアンモニウムに変換し、それが揮発して硫酸イオンが残る場合に、固体ベースの媒体が不安定になることがある。硫酸イオンは硫酸となり、ｐＨを低下させ、ｐＨベースの指示薬の読み取りに影響を与える場合がある（例えば、ＬＡＭＰ反応が発生していない場合でも、フェノールレッド指示薬が赤から黄色に変化する）。硫酸アンモニウムをベタインに置き換えると、非ＬＡＭＰ反応による変色を防ぎ、保存中の変色を防ぐことで固体ベースの媒体を安定化させることができる。
【0094】
したがって、組成物中の揮発性剤の存在を減少させることにより、ＬＡＭＰ反応及びｐＨベースの指示薬によるその読み取り値への干渉の程度を低下させることができる。一態様では、ＬＡＭＰ組成物は、不揮発性剤、例として中性電荷の低分子量の第四級アンモニウム、中性電荷の低分子量のアミド化合物など、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一例では、不揮発性剤としては、Ｎ－ホルミル尿素、尿素、Ｌ－アスパラギン、トリメチルグリシン（ベタイン）、３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－（１－ピリジニオ）－１－プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ－２０１）、Ｎ－メチル尿素、アセトアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミド、ピラセタム、１，３－ジメチル尿素、１，１－ジメチル尿素、グリコールアミド、２－クロロアセトアミド、スクシンイミド、２－イミダゾリドン、塩化コリン、塩化アセチルコリン、塩化ベタネコール、Ｌ－カルニチン分子内塩、Ｏ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩、４－（シクロヘキシルアミノ）－１－ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート（ＮＤＳＢ－１９５）、３－（１－メチルピペリジニウム）－１－プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ－２２１）、３－（ベンジルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ－２５６）、及びジメチル－２－ヒドロキシエチルアンモニウム－１－プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ－２１１）など、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない
【0095】
一例では、中性電荷の低分子量の第四級アンモニウム、または中性電荷の低分子量のアミド化合物を含む不揮発性剤の濃度は、固相媒体で使用する場合、約１ｍＭ～約２００ｍＭであり得る。別の例では、不揮発性剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。さらに別の例では、不揮発性剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１５ｍＭ～約２５ｍＭであり得る。
【0096】
揮発性剤に加えて、吸湿剤もＬＡＭＰ反応に干渉する可能性がある。吸湿剤は過剰な量の水を保持し、乾燥を遅らせるかまたは防止することで固体ベースの媒体中の試薬を不安定にする可能性がある。一態様では、組成物は吸湿剤を実質的に含まないものであり得る。いくつかの例では、グリセロールなどの吸湿剤を含むＬＡＭＰ反応は、吸湿剤が水を引き付ける可能性があるため、固体ベースの媒体中での試薬の不安定性に寄与する可能性がある。一例では、吸湿剤は、２５℃で約４０％～約９０％の相対湿度（ＲＨ）の場合に、約１０重量％を超える量を吸収することができる。一例では、吸湿剤としては、グリセロール、エタノール、メタノール、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸カルシウムなど、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つ又は複数を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様では、組成物は、１．０重量％、０．５重量％、０．１重量％、または０．０１重量％のうちの１つ又は複数の量未満の吸湿剤を含有することができる。
【0097】
以前のＬＡＭＰ反応物のキャリーオーバー汚染、プライマー二量体化、非特異的増幅、またはそれらの組み合わせを防止するために、いくつかの追加の薬剤を含めることができる。キャリーオーバー汚染は、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、またはそれらの組み合わせをＬＡＭＰ反応物に含めることによって防止することができる。これらの薬剤は、ウラシルを含有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒することができる。
【0098】
フェノールレッドなどの抗酸化作用を有する一部のｐＨベースの指示薬は、抗酸化活性の程度が低い他のｐＨベースの指示薬と比較して、コントラスト及び均一性が向上し得ることが発見されている。一態様では、組成物は、抗酸化剤をさらに含むことができる。一例では、抗酸化剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．１ｍＭ～約１ｍＭであり得る。別の例では、抗酸化剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．８ｍＭであり得る。さらに別の例では、抗酸化剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．３ｍＭであり得る。抗酸化剤は、酸化還元反応を防止することにより、固体ベースの媒体上の試薬を安定化させることができる。
【0099】
Ｎ－アセチルシステイン、ヒドロキシチロソール（ＨＸＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、マンガン、ヨウ化物、メラトニン、α－カロテン、アスタキサンチン、β－カロテン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、リコピン、ゼアキサンチン、アピゲニン、ルテオリン、タンゲレチン、イソラムネチン、ケンフェロール、ミリセチン、プロアントシアニジン、ケルセチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ナリンゲニン、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、テアフラビン、テアルビギン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、レスベラトロール、プテロスチルベン、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペチュニジン、チコリ酸、クロロゲン酸、桂皮酸、エラグ酸、エラジタンニン、没食子酸、ガロタンニン、ロスマリン酸、サリチル酸、クルクミン、フラボノリグナン、キサントン、オイゲノール、カプサイシン、ビリルビン、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、Ｒ－アルファ－リポ酸など、またはそれらの組み合わせ、を含むがこれらに限定されない種々の抗酸化剤を使用することができる。
【0100】
これまでｐＨベースの指示薬について考察してきたが、他の指示薬も使用することができる。一態様では、組成物は指示薬をさらに含むことができる。一例では、指示薬は、固体ベースの媒体とともに使用される場合、フェノールレッドなどのｐＨベースの指示薬であり得る。フェノールレッドには、他の一部の色素にはない抗酸化特性がある。フェノールレッド分子は共役結合系であり、抗酸化特性にも寄与している可能性がある。一例では、指示薬の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．１ｍＭ～約１ｍＭであり得る。別の例では、指示薬の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．８ｍＭであり得る。さらに別の例では、指示薬の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．３ｍＭであり得る。
【0101】
他のいくつかの指示薬も、適切な比色シグナルを提供することができる。別の例では、指示薬は、（ｉ）マグネシウム比色指示薬、（ｉｉ）ｐＨ比色指示薬、または（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカレート比色指示薬のうちの１つ又は複数であり得る。指示薬がマグネシウム比色指示薬である場合、マグネシウムを約０．０１ｍＭ～約２ｍＭの範囲内に維持するために、マグネシウムの濃度を監視するべきである。また、ＤＮＡポリメラーゼに対する干渉を防ぐために、マグネシウムの濃度を監視するべきである。ＤＮＡポリメラーゼの補因子であるマグネシウムは、マグネシウム濃度が標的範囲外である場合、ＤＮＡポリメラーゼに干渉する可能性がある。
【0102】
ＬＡＭＰ反応では、種々のタイプの標的プライマーを使用することもできる。一部の標的プライマーには、ゲノム内の６つまたは８つの領域をそれぞれ標的にすることができる約４つまたは６つのプライマーを含めることができる。一態様では、標的プライマーの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０５μＭ～約５μＭの濃度を有し得る。別の例では、標的プライマーの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．１μＭ～約３μＭであり得る。さらに別の例では、標的プライマーの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２μＭ～約１．６μＭであり得る。
【0103】
標的プライマーは、種々の病原体のゲノムを標的とするように選択することができる。一態様では、標的プライマーは、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含み得る病原体を標的とすることができる。別の態様では、病原体標的はウイルス標的であり得る。別の態様では、ウイルス標的は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。別の態様では、ウイルス標的は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る。要するに、標的プライマーは、ほぼあらゆる病原体標的、特に、本明細書に開示されるような標的病原体を標的とすることができる。
【0104】
固体ベースの媒体が過剰量の揮発性剤、酸化剤、ｐＨ干渉剤、マグネシウム干渉剤など、またはそれらの組み合わせを含む場合、固体ベースの媒体の色は、ＬＡＭＰ反応による増幅が存在しない場合に影響を受けることがある。この問題に対処するために、別の態様では、組成物は非変色添加剤を含むことができる。一態様では、非変色添加剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１ｍＭ～約１Ｍであり得る。別の例では、非変色添加剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０ｍＭ～約５００ｍＭであり得る。さらに別の例では、非変色添加剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２００ｍＭ～約４００ｍＭであり得る。
【0105】
ＬＡＭＰ反応による増幅がない場合に固体ベースの媒体の色を保存し、ＬＡＭＰ反応による増幅が発生した場合にコントラストを潜在的に高めることができる種々の非変色添加剤が存在する。一例では、非変色添加剤は、糖、緩衝液など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。
【0106】
一例では、糖などの非変色添加剤は、固体ベースの媒体を安定化し、長期保存条件下での変色を防止することができる。例えば、トレハロースは、凍結乾燥条件下または周囲温度で乾燥させた場合に酵素の安定性を維持することができる。一態様では、糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストランなど、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。一態様では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１ｍＭ～約１Ｍであり得る。別の例では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０ｍＭ～約５００ｍＭであり得る。さらに別の例では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２００ｍＭ～約４００ｍＭであり得る。
【0107】
ＬＡＭＰ反応はまた、他の試薬を含むこともできる。一態様では、組成物は、酵素、核酸、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。一例では、酵素はＲＮａｓｅ阻害剤またはＤＮａｓｅ阻害剤であり得る。ＲＮａｓｅ阻害剤を含めると、ＲＮＡ標的の分解を遅らせることができ、検出限界を高めることができる。ＤＮａｓｅ阻害剤を含めると、ＤＮＡ標的の分解を遅らせることができ、検出限界を高めることもできる。一態様では、組成物はキャリアＤＮＡまたはキャリアＲＮＡを含むことができる。キャリアＤＮＡまたはキャリアＲＮＡは、それぞれＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの活性を隔離するデコイ基質を提供することができる。別の例では、選択された量の塩酸グアニジンが、ＲＮＡ分子の変性及び露出を刺激し、これによりＬＡＭＰ反応をさらに安定化させることができる。
【0108】
一態様では、固相媒体上で使用される場合、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ阻害剤の濃度は、唾液試料１ｍＬあたり約０．０１μＬ～唾液試料１ｍＬあたり約５μＬであり得る。別の例では、固相媒体上で使用される場合、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ阻害剤の濃度は、唾液試料１ｍＬあたり約０．１μＬ～唾液試料１ｍＬあたり約１μＬであり得る。さらに別の例では、固相媒体上で使用される場合、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ阻害剤の濃度は、唾液試料１ｍＬあたり約０．５μＬ～唾液試料１ｍＬあたり約１．５μＬであり得る。
【0109】
一態様では、キャリアＲＮＡまたはキャリアＤＮＡの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１ｎｇ／μＬ～約１０ｎｇ／μＬであり得る。別の例では、キャリアＲＮＡまたはキャリアＤＮＡの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．１ｎｇ／μＬ～約１ｎｇ／μＬであり得る。さらに別の例では、キャリアＲＮＡまたはキャリアＤＮＡの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｎｇ／μＬ～約０．４ｎｇ／μＬであり得る。
【0110】
上記に加えて、本明細書に記載のＬＡＭＰ反応を実行するのに好適な組成物において、複数の他の薬剤または成分を使用することができる。例えば、別の態様では、組成物は、等張化剤、ｐＨ調整剤、保存剤、水など、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。さらに、これらの成分／薬剤は、具体的に所望の特性の範囲を組成物に提供するために使用することができる。一態様では、組成物の張性は、約２５０～約３５０ミリオスモル／リットル（ｍＯｓｍ／Ｌ）であり得る。別の態様では、組成物の張性は、約２７０～約３３０ｍＯｓｍ／Ｌであり得る。等張化剤は、組成物中に種々の量で存在することができる。一態様では、等張化剤は、組成物中で約０．１重量％、約０．５重量％、または約１重量％～約２重量％、約５重量％、または約１０重量％の濃度を有し得る。
【0111】
組成物はｐＨ干渉試薬を実質的に含まない必要があるが、ＬＡＭＰ反応の前に組成物の初期ｐＨを選択するためにｐＨ調整剤を使用することができる。さらに、ＬＡＭＰ反応の結果を解釈する際に、ｐＨ調整剤の影響を補償することができる場合には、ｐＨ調整剤も使用することができる。ｐＨ調整剤の非限定的な例としては、多数の酸、塩基、及びそれらの組み合わせ、例として、塩酸、リン酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどを挙げることができる。ｐＨ調整剤は、組成物に適切なｐＨを提供するために使用することができる。一態様では、ｐＨは約５．５～約８．５であり得る。一態様では、ｐＨは約５．８～約７．８であり得る。別の態様では、ｐＨは約６．５～約７．８であり得る。さらに他の例では、ｐＨは約７．０～約７．６であり得る。ｐＨ調整剤は、組成物中に種々の量で存在することができる。一態様では、ｐＨ調整剤は、組成物中で約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、または約０．５重量％～約１重量％、約２重量％、約５重量％、または約１０重量％の濃度を有し得る。
【0112】
組成物の貯蔵寿命は、防腐剤を使用することによって延長することができる。防腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、セトリモニウム、過ホウ酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその種々の塩形態、クロロブタノールなどを挙げることができる。防腐剤は、組成物中に種々の量で存在することができる。一態様では、防腐剤は、組成物中で約０．００１重量％、約０．００５重量％、約０．０１重量％、または約０．０５重量％～約０．１重量％、約０．２５重量％、約０．５重量％、または約１重量％の濃度を有し得る。
【0113】
別の実施形態では、図２に示すように、固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法２００は、ブロック２１０に示すように、固相媒体と、本明細書に列挙される成分または組成物のいずれかなど、固相媒体と組み合わせた反応組成物とのアセンブリを提供することを含むことができる。一態様では、本方法は、ブロック２２０に示すように、固相媒体上に生体試料を堆積させることを含むことができる。別の態様では、本方法は、ブロック２３０に示すように、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱することを含むことができる。
【0114】
一態様では、生体試料は、唾液、粘液、血液、尿、糞便、汗、呼気凝縮液など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数であり得る。別の態様では、生体試料は唾液であり得る。一態様では、本方法は、ウイルス病原体を検出することを含むことができる。一態様では、ウイルス病原体は、本明細書に開示されるような病原体であり得る。別の態様では、ＬＡＭＰ分析は、逆転写酵素ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）であり得る。
【0115】
別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約５０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約６０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約６０℃～約６５℃の温度範囲であり得る。等温温度は、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはそれらの組み合わせの活性のうちの１つ又は複数に基づいて選択することができる。
【0116】
別の例では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な温度は、約６０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の例では、等温温度は、摂氏５度未満の差がある範囲内の温度であり得る。
【0117】
別の実施形態では、ＬＡＭＰ分析を実行するためのシステムは、本開示に記載されるような構成を備えることができる。別の態様では、システムは、その上に組成物が堆積される固相媒体を含むことができる。
【0118】
ｐＨ感受性シグナル出力の最大化
ＬＡＭＰ反応を実行する場合、反応の結果を読み取るために種々の指示薬を使用することができる。３つのタイプの比色指示薬には、マグネシウム比色指示薬、ｐＨ比色指示薬、及びＤＮＡインターカレート比色指示薬が含まれる。マグネシウムは、ＤＮＡポリメラーゼの補因子となる場合があり、その濃度を厳密に制御する必要があるため、マグネシウムベースの指示薬をＬＡＭＰ反応との関連で使用する場合、種々の制限に直面することがある。ＤＮＡインターカレート指示薬も、関与する変数の数により制限に直面することがある。３つの指示薬はすべてＬＡＭＰ反応において使用することができるが、ｐＨベースの指示薬は影響を受ける変数が少ない場合がある。
ＬＡＭＰ反応を実行する場合、反応の結果を読み取るために種々の指示薬を使用することができる。３つのタイプの比色指示薬には、マグネシウム比色指示薬、ｐＨ比色指示薬、及びＤＮＡインターカレート比色指示薬が含まれる。マグネシウムは、ＤＮＡポリメラーゼの補因子となる場合があり、その濃度を厳密に制御する必要があるため、マグネシウムベースの指示薬をＬＡＭＰ反応との関連で使用する場合、種々の制限に直面することがある。ＤＮＡインターカレート指示薬も、関与する変数の数により制限に直面することがある。３つの指示薬はすべてＬＡＭＰ反応において使用することができるが、ｐＨベースの指示薬は影響を受ける変数が少ない場合がある。
【0119】
一実施形態では、ｐＨ依存性出力シグナルを利用するループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物は、ｐＨ感受性色素及び複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬を含むことができる。一態様では、ＬＡＭＰ分析は、逆転写ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）であり得る。
【0120】
ｐＨ感受性色素の選択は、ｐＨに相関する比色範囲、色の変化の間のコントラストの程度、色の変化に対するｐＨレベル、色の変化の均一性、及び色の変化の再現性、などの種々の要因に依存し得る。例えば、フェノールレッドは、ｐＨ約６．８～約７．４の間の比色範囲を有し得る。ｐＨ約６．８未満では、フェノールレッドは黄色に変化し、ｐＨ約７．４を超えると、フェノールレッドは赤色に変化し得る。黄色と赤色との間の違いの程度は簡単に読み取ることができ、生理学的条件を模倣したｐＨレベルでｐＨ変化が発生し得る。
【0121】
一態様では、ｐＨ感受性色素は、一貫した対照的な色の変化を達成するために、ｐＨ６．５付近で色変化を示すｐＨ指示薬であり得る（例えば、フェノールレッド）。一態様では、ｐＨ感受性色素は、フェノールレッド、リトマス、ブロモチモールブルー、ニトラジンイエロー、クレゾールレッド、クルクミン、ブリリアントイエロー、ｍ－クレゾールパープル、α－ナフトールフタレイン、フェノールフタレイン、ニュートラルレッド、酸性フクシン、アゾリトミンなど、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様では、ｐＨ感受性色素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．１ｍＭ～約１ｍＭであり得る。別の例では、ｐＨ感受性色素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．８ｍＭであり得る。さらに別の例では、ｐＨ感受性色素の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．２ｍＭ～約０．３ｍＭであり得る。
【0122】
ｐＨ感受性シグナル出力を最大化するために、ＬＡＭＰ反応では、ＬＡＭＰ反応に干渉する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼに干渉する）ことによって、またはＬＡＭＰ反応からのシグナル（例えば、ｐＨシグナル）に干渉することによって、シグナルに不確実性を生じさせる試薬を実質的に含まない必要がある。一態様では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、標的プライマー、またはそれらの組み合わせを含むことができる。別の態様では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、揮発性試薬、ｐＨ干渉試薬、マグネシウム干渉試薬、またはそれらの組み合わせを実質的に含まないものであり得る。
【0123】
一例では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、マグネシウム、硫酸アンモニウム、または炭酸アンモニウムを実質的に含まないものであり得る。ＤＮＡポリメラーゼの補因子としてのマグネシウムは、ＬＡＭＰ反応が設計どおりに進行できることを確認するために厳密に監視するべきである。硫酸アンモニウムはアンモニウムイオンにイオン化され、これにより硫酸イオンが残ることがあり、これは反応して硫酸を形成することがある。炭酸アンモニウムもアンモニウムイオンにイオン化され、これにより炭酸イオンが残ることがあり、これは反応して炭酸を形成することがある。したがって、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、これらの物質を実質的に含まない必要がある。
【0124】
揮発性剤は、反応して、ＬＡＭＰ反応からのｐＨ依存性シグナルに干渉することがある酸または塩基を形成する可能性のある組成物を残す可能性があるため、揮発性剤は最小限に抑えられるべきである。一例では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬には、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなど、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない揮発性試薬を実質的に含まないものであり得る。一態様では、組成物は、１．０重量％、０．５重量％、０．１重量％、または０．０１重量％のうちの１つ又は複数の量未満の揮発性試薬を含有することができる。
【0125】
さらに、任意のｐＨ干渉試薬は、それらのｐＨ干渉試薬が補償されない場合、ｐＨ依存性シグナル出力に干渉する可能性がある。一例では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬には、限定されないが、多数の酸、塩基、及びそれらの組み合わせを含むｐＨ干渉試薬を実質的に含まないものであり得る。一態様では、組成物は、１．０重量％、０．５重量％、０．１重量％、または０．０１重量％のうちの１つ又は複数の量未満のｐＨ干渉試薬を含有することができる。
【0126】
ｐＨが監視されている場合でも、ＬＡＭＰ反応が干渉されると、ｐＨ依存性シグナル出力が悪影響を受ける可能性がある。例えば、マグネシウムは、ＤＮＡポリメラーゼの補因子として、濃度が選択された範囲外にある場合、ＬＡＭＰ反応による増幅に干渉する可能性がある。一例では、複数の非干渉ＬＡＭＰ試薬は、マグネシウム干渉剤を実質的に含まないものであり得る。マグネシウム干渉剤としては、Ｍｇ２＋、Ｍｇ１＋、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マグネシウム七水和物など、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないマグネシウム含有剤が挙げられる。一態様では、組成物は、１．０重量％、０．５重量％、０．１重量％、または０．０１重量％のうちの１つ又は複数の量未満のマグネシウムを含有することができる。別の例では、マグネシウム干渉剤には、マグネシウムに干渉するキレート剤を含めることができる。
【0127】
ｐＨが監視されており、ＬＡＭＰ反応が適切に機能している場合でも、固相媒体の変色は、長期保存などの他の要因によって生じる可能性がある。一態様では、組成物は、非変色添加剤を含むことができる。一例では、非変色添加剤は、糖、緩衝液、遮断剤など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。一例では、糖は固体ベースの媒体を安定化し、長期保存条件下での変色を防ぐことができる。一態様では、糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストランなど、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。
【0128】
一態様では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１ｍＭ～約１Ｍであり得る。別の例では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０ｍＭ～約５００ｍＭであり得る。さらに別の例では、糖の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２００ｍＭ～約４００ｍＭであり得る。
【0129】
緩衝液は、唾液試料からばらつきを除去することによって、ＬＡＭＰ反応の安定化を促進することができる。一例では、緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコＰＢＳ、アルセバー液、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、水、緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）、例としてハンクスＢＳＳ、アールＢＳＳ、グレイ（Ｇｒｅｙ’ｓ）ＢＳＳ、パック（Ｐｕｃｋ’ｓ）ＢＳＳ、シム（Ｓｉｍｍ’ｓ）ＢＳＳ、タイロードＢＳＳ、ＢＳＳプラス、乳酸リンゲル液、生理食塩水（すなわち、０．９％生理食塩水）、１／２生理食塩水など、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つ又は複数を含めることができる。一態様では、緩衝液の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０μＭ～約２０ｍＭであり得る。別の例では、緩衝液の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１００μＭ～約１０ｍＭであり得る。さらに別の例では、緩衝液の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１００μＭ～約５００μＭであり得る。
【0130】
遮断剤によって、ＲＮａｓｅベースの分解、ＤＮａｓｅベースの分解、または他の酵素分解の量を減少させることができる。一例では、遮断剤には、ウシ血清アルブミン、カゼイン、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含めることができる。一態様では、遮断剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１重量％～約５重量％であり得る。別の例では、遮断剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０１重量％～約１重量％であり得る。さらに別の例では、遮断剤の濃度は、固相媒体上で使用される場合、約０．０２重量％～約０．０６重量％であり得る。
【0131】
抗酸化剤は、酸化反応に関連する変数を排除することによって、固相媒体上のｐＨ依存性シグナルの均一性及びコントラストを高めることができる。一例では、組成物は、本明細書に開示される抗酸化剤をさらに含むことができる。
【0132】
別の例では、組成物は固相媒体をさらに含むことができる。固相媒体としては、ガラス繊維、ナイロン、セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリエステル、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。
【0133】
ある特定の添加剤は、ＬＡＭＰ反応の安定性及び均一性を高めることができる。一態様では、組成物は、本明細書に開示される酵素、核酸、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含むことができる。一例では、酵素はＲＮａｓｅ阻害剤またはＤＮａｓｅ阻害剤であり得る。別の態様では、組成物はキャリアＤＮＡまたはキャリアＲＮＡを含むことができる。キャリアＤＮＡまたはキャリアＲＮＡは、それぞれＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの活性を隔離するデコイ基質を提供することができる。
【0134】
別の例では、選択された量の塩酸グアニジンが、ＲＮＡ分子の変性及び露出を刺激することができる。一態様では、塩酸グアニジンの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１ｍＭ～約２００ｍＭであり得る。別の例では、塩酸グアニジンの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約１０ｍＭ～約１００ｍＭであり得る。別の例では、塩酸グアニジンの濃度は、固相媒体上で使用される場合、約２０ｍＭ～約６０ｍＭであり得る。
【0135】
ｐＨ依存性出力シグナルの最大化は、本明細書に開示される他の実施形態と併せて使用することもできる。一実施形態では、ｐＨ依存性出力シグナルを用いてＬＡＭＰ分析を実行する方法は、本明細書に記載の固相媒体と組成物のアセンブリを提供することを含むことができる。本方法は、生体試料を固相媒体上に堆積させることをさらに含むことができる。本方法は、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱することをさらに含むことができる。
【0136】
本明細書に開示されるように、一態様では、生体試料は、唾液、粘液、血液、尿、糞便、汗、呼気凝縮液など、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数であり得る。別の実施形態では、生体試料は唾液であり得る。一態様では、本方法は、ウイルス病原体を検出することを含むことができる。一態様では、ウイルス病原体は、本明細書に別途開示される病原体であり得る。
【0137】
一例では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な温度は、約６０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の例では、等温温度は、摂氏５度未満の差がある範囲内の温度であり得る。
【0138】
別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約５０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約６０℃～約７０℃の温度範囲であり得る。別の態様では、ＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度は、約６０℃～約６５℃の温度範囲であり得る。等温温度は、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはそれらの組み合わせの活性のうちの１つ又は複数に基づいて選択することができる。
【0139】
別の実施形態では、図３に示すように、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における出力シグナルの精度を最大化する方法３００は、ブロック３１０におけるように、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を最小限に抑える試薬混合物を提供することを含むことができる。この方法は、ブロック３２０に示すように、ＬＡＭＰ反応を実行することをさらに含むことができる。一態様では、この方法は、非ＬＡＭＰ反応によるプロトンの生成を制御することを含むことができる。別の態様では、この方法は、非ＬＡＭＰ反応による酸化を制御することを含むことができる。
【0140】
別の実施形態では、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における出力シグナルの精度を最大化する方法は、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を実質的に除去することを含むことができる。
【0141】
別の実施形態では、ｐＨ依存性ＬＡＭＰ分析における検出レベル（ＬＯＤ）を最大化する方法は、シグナル出力媒体から非ＬＡＭＰ反応によって生じる変色を実質的に除去することを含むことができる。一態様では、唾液を水で５～１０％に希釈することによって、検出限界に影響を与えることなく、色のコントラストを高め、試料のばらつきを軽減することができる。別の例では、本明細書に別途開示されるフィルタで唾液を濾過することによって、検出限界に影響を与えることなく、色のコントラストを高め、試料のばらつきを軽減することができる。
【実施例】
【0142】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態のより明確な理解を促進するために提供されるものであり、決してそれを限定することを意味するものではない。
【0143】
希釈唾液試料中のウイルス標的用の紙ＬＡＭＰ分析
実施例１－ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有蒸留水
ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有蒸留水を０．１μｍの膜で濾過することによって調製し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性について試験する。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性は、現在の米国薬局方（ＵＳＰ）の注射用水（ＷＦＩ）に関するモノグラフ試験基準に従って試験する。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、またはプロテアーゼ活性がないことが確認されると、水は汚染物質非含有であると見なされ、唾液試料の調製に使用される。
実施例１－ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有蒸留水
ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有蒸留水を０．１μｍの膜で濾過することによって調製し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性について試験する。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性は、現在の米国薬局方（ＵＳＰ）の注射用水（ＷＦＩ）に関するモノグラフ試験基準に従って試験する。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、またはプロテアーゼ活性がないことが確認されると、水は汚染物質非含有であると見なされ、唾液試料の調製に使用される。
【0144】
実施例２－唾液中での増幅
図４に示すように、唾液試料からのヌクレオチド増幅を確認するための陽性対照として、唾液中のＲＮａｓｅＰを標的とするように核酸配列プライマーを設計した。図４Ａは、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０５ゲノム換算量／反応をスパイクした１８％唾液中のＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７を標的とするプライマーセットの蛍光定量ＲＴ－ｑＬＡＭＰの結果を示す。図４Ｂは、０．２ｎｇの合成ＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７ ＲＮＡを含む水中のＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７を標的とするプライマーセットについての蛍光定量ＲＴ－ｑＬＡＭＰの結果を示す。
図４に示すように、唾液試料からのヌクレオチド増幅を確認するための陽性対照として、唾液中のＲＮａｓｅＰを標的とするように核酸配列プライマーを設計した。図４Ａは、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０５ゲノム換算量／反応をスパイクした１８％唾液中のＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７を標的とするプライマーセットの蛍光定量ＲＴ－ｑＬＡＭＰの結果を示す。図４Ｂは、０．２ｎｇの合成ＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７ ＲＮＡを含む水中のＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７を標的とするプライマーセットについての蛍光定量ＲＴ－ｑＬＡＭＰの結果を示す。
【0145】
図４Ａに示すように、反応ごとに熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０５ゲノム換算量をスパイクした１８％の唾液を分析した。左の図では、ＲＮａｓｅＰのｐ２０サブユニットをコードするＰＯＰ７遺伝子のｍＲＮＡ配列を使用してＲＮａｓｅＰを標的とするように設計されたプライマー（ＲＮａｓｅＰ．Ｉ）が、低レベルのＲＮａｓｅＰを適切に検出しなかったため、増幅は発生しなかった。中央の図では、プライマー（ＲＮａｓｅＰ．ＩＩ）が、テンプレートなしの対照を増幅することなく、ＲＮａｓｅＰのレベルを検出できたため、黒色の線と重なることなく青色の線で示されるように増幅が発生した。右の図では、プライマー（ＲＮａｓｅＰ．ＩＩＩ）が二量体化したため、黒色の線と青色の線の両方で増幅が発生した（例えば、テンプレートなしの対照の黒い線で増幅が示された）。
【0146】
図４Ｂに示すように、０．２ｎｇの合成ＲＮａｓｅＰ ＰＯＰ７ ＲＮＡを含む水を分析した。左の図では、プライマー（ＲＮａｓｅＰ．Ｉ）が二量体化したため、青色の線及び黒色の線で増幅が発生した（例えば、テンプレートなしの対照を増幅させた）。中央の図では、プライマー（ＲＮａｓｅＰ．ＩＩ）が、テンプレートなしの対照を増幅することなく、ＲＮａｓｅＰのレベルを検出できたため、黒色の線と重なることなく青色の線で示されるように増幅が発生した。右の図では、プライマー（ＲＮａｓｅＰ．ＩＩＩ）が、テンプレートなしの対照を増幅することなくＲＮａｓｅ Ｐを増幅したため、青色の線では増幅が発生したが、黒色の線では増幅が発生しなかった。
【0147】
実施例３－唾液採取デバイス
唾液採取デバイスのタイプにより、ＬＡＭＰ反応における唾液試料を容易に得ることができる。場合によっては、操作担当者は、飛沫を介して拡散する可能性のある病原体（例えば、エアロゾルウイルス）から保護するために保護具を使用することがある。したがって、操作担当者は、エアロゾルウイルスとの偶発的な接触から保護するために個人用保護具を装着することができる。特定の唾液採取デバイスは、医療専門家の指導の下、対象が自己管理することができる。唾液採取デバイスは、有効性が証明されており、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、スポンジベースの採取と流涎採取の２つのカテゴリーに分類することができる。
唾液採取デバイスのタイプにより、ＬＡＭＰ反応における唾液試料を容易に得ることができる。場合によっては、操作担当者は、飛沫を介して拡散する可能性のある病原体（例えば、エアロゾルウイルス）から保護するために保護具を使用することがある。したがって、操作担当者は、エアロゾルウイルスとの偶発的な接触から保護するために個人用保護具を装着することができる。特定の唾液採取デバイスは、医療専門家の指導の下、対象が自己管理することができる。唾液採取デバイスは、有効性が証明されており、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、スポンジベースの採取と流涎採取の２つのカテゴリーに分類することができる。
【0148】
スポンジ採取デバイス５００ａは、唾液を吸収するためにスポンジ様の採取パッド５０４を使用し、十分な量が採取されたことを示す試料量適正インジケータ５１２を含む。飽和したら、スポンジを圧縮チューブ５０６に挿入し、フィルタに対して圧縮し、唾液を濾して採取チューブに入れる。この濾過操作を行う理由は、唾液からムチン及び高分子量タンパク質を濾し取り、標本の粘度を大幅に低下させるためである。その結果、固相媒体は、より迅速、均一、かつ信頼性の高い方法で唾液を取り込み、分散することができる。スポンジ採取デバイス５００ａはまた、圧縮チューブ５０６上に圧縮チューブとのシールを形成する圧縮シール５０８；圧縮チューブ５０６を圧縮するためのハンドル５１０；及び十分な唾液が採取されたことを識別するための試料量適正インジケータ５１２、を備えることもできる。
【0149】
流涎デバイス５００ｂは、試料の吸収及び分散を遅くする粘度を有する、未濾過の唾液を提供することができる。流涎デバイス５００ｂは、唾液を採取するための採取漏斗５２２；十分な唾液が採取されたことを示すインジケータライン５２８；唾液を採取するための採取チューブ５２４；チューブキャップ５２６；体積インジケータ５３０；及びチューブキャップ収納部５３２、を含むことができる。
【0150】
どちらのタイプの採取デバイスでも、操作担当者に対する曝露の残余リスクは最小限に抑えられる。スポンジベースのデバイスでは、特にユーザーが圧縮プロセスを不意に行う場合、圧縮操作中にエアロゾルが放出されるという仮説上のリスクがある。曝露のリスクを制御するために、医療操作担当者がこの操作を実行してもよい。採取デバイスは、エアロゾルの逆流を防ぐために圧縮シールを備えていてもよい。流涎採取では、デバイスの外側が浮遊した唾液で汚染される若干のリスクがあり、適切に取り扱わないと操作担当者に二次汚染を引き起こす可能性がある。どちらの場合も、患者が唾液試料を自己採取することで曝露リスクが軽減される。
【0151】
３つの市販の唾液採取デバイスを選択して、唾液中のＲＴ－ＬＡＭＰ反応に対するそれらの効果を評価した。３つのデバイスは、ＳｔａｔＳｕｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の「Ｓａｌｉｖａ Ｓａｍｐｌｅｒ（商標）」、Ｏａｓｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の「Ｐｕｒｅ・ＳＡＬ（商標）」、及び同じくＯａｓｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の「Ｓｕｐｅｒ・ＳＡＬ（商標）」である。ＳｔａｔＳｕｒｅ Ｓａｌｉｖａ Ｓａｍｐｌｅｒ（商標）では、患者から唾液を採取するために使用される緩衝液（例えば、Ｂｕｆｆｅｒ ２０００）を含有するチューブを提供する。Ｓｕｐｅｒ・ＳＡＬは、円筒形の吸収パッド及び採取チューブを使用して、固形汚染物質及び粘液性物質を除去することで唾液の採取を標準化する。Ｐｕｒｅ・ＳＡＬは同様の機構で動作するが、汚染物質を除去するために採取チューブに追加のフィルタが含まれている。
【0152】
唾液ｐＨを、処理済み唾液試料から測定して、その後の比色分析及び蛍光ＲＴ－ＬＡＭＰ ＬＯＤアッセイを、処理済み唾液試料を使用して実行した。このデータを、図６Ａに示す。このデータは、さまざまな唾液採取デバイス（Ｐｕｒｅ－Ｓａｌ、Ｓｕｐｅｒ－Ｓａｌ、Ｓｔａｔ－ｓｕｒｅ）を使用して処理された唾液中のＬｏＤを示している。マスターミックスを０．６マイクロリットルのＨＣｌで処理した。Ｐｕｒｅ・ＳＡＬ（商標）及びＳｕｐｅｒ・ＳＡＬ唾液採取デバイスは、より広範囲の濃度（熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の反応あたり１～１０，０００ゲノム換算量）に対するより広範囲の比色応答を示す。
【0153】
実施例４－唾液採取プロセス
対象が自己検査を行う場合、対象は医療専門家の指導の下、添加物を含有せず、したがって対象が採取に使用しても安全な専用の採取容器に唾液標本を採取する。採取される唾液の量はおよそ１００μＬである。例えば、スポンジサンプラーを対象の口に挿入し、スポンジサンプラーのインジケータの色が変わるまで唾液を採取する。次に、スポンジサンプラーを採取チューブに挿入する。次に、スポンジを圧縮して、唾液（およそ１００μＬ）を、唾液を希釈するための量の水を含有する採取チューブに絞り出す。唾液を、唾液対水の比が約１：１～約１：２０になるまで水で希釈する。唾液を、採取チューブから試験場所に移す。
対象が自己検査を行う場合、対象は医療専門家の指導の下、添加物を含有せず、したがって対象が採取に使用しても安全な専用の採取容器に唾液標本を採取する。採取される唾液の量はおよそ１００μＬである。例えば、スポンジサンプラーを対象の口に挿入し、スポンジサンプラーのインジケータの色が変わるまで唾液を採取する。次に、スポンジサンプラーを採取チューブに挿入する。次に、スポンジを圧縮して、唾液（およそ１００μＬ）を、唾液を希釈するための量の水を含有する採取チューブに絞り出す。唾液を、唾液対水の比が約１：１～約１：２０になるまで水で希釈する。唾液を、採取チューブから試験場所に移す。
【0154】
実施例５－唾液に対するＲＮａｓｅ阻害剤の効果
ＲＮａｓｅ阻害剤を未処理の唾液に、唾液１ｍＬ当たり１μＬの濃度で加え、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応に対するＲＮａｓｅ阻害剤の添加の効果を判定した。
ＲＮａｓｅ阻害剤を未処理の唾液に、唾液１ｍＬ当たり１μＬの濃度で加え、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応に対するＲＮａｓｅ阻害剤の添加の効果を判定した。
【0155】
新たに採取した唾液（５％）に対するＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）（ＡＭ７００６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））の効果を試験して、ポイントオブケアＲＴ－ＬＡＭＰ反応の単一操作プロセスとしての適合性を判定した。１×ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）は、１ｍｌの唾液を使用して２５×ストックから希釈された。処理済み唾液をマトリックスとして使用し、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、１０００コピー～６２．５コピー／反応の濃度範囲で、４０ｍＭ塩酸グアニジン及び０．３ｎｇ／μｌのキャリアＤＮＡとともにｐＨ７．６のＷａｒｍｓｔａｒｔ（商標）比色マスターミックスにスパイクした。ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）処理済みＲＴ－ＬＡＭＰを６５℃でインキュベートして、反応を開始させた。これらの条件下での未処理唾液を、対照として、ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）を使用せずに試験した。
【0156】
５μＬの熱不活化ウイルスを５％処理済み唾液（すなわち、最終反応濃度）で希釈し、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応に加えて、最終反応体積２５μＬの示された濃度を提供した。陰性反応の場合、希釈した熱不活化ウイルスの代わりに５μＬの処理済み唾液（最終反応濃度５％）を加えて、同じ反応体積２５μＬを提供した。加熱は、インキュベータ内で６５℃にて６０分間行った。比色スキャンは、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前後にフラットベッドスキャナーを使用して取得した。１２５０μＬのＮＥＢ比色マスターミックスに、０．５μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ、３．５μＬのｄＵＴＰ ２５×を補充した。ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡＳｅｃｕｒｅ（商標））を全唾液で希釈して１×濃度にし、その後、唾液を５％に希釈して反応物に加えた。
【0157】
図６Ｂに示すように、ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（商標）は、反応物のＬｏＤの有意な増加を示さなかった。すなわち、ＲＮａｓｅ阻害剤の添加によって、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の測定パラメータ（例えば、反応速度、偽陽性率、または検出限界）は、顕著に増加しなかった。
【0158】
実施例６－凍結唾液試料
場合によっては、物流、輸送の必要性等の理由から、唾液試料を分析前に一定期間凍結することが望ましい場合がある。そのような状況は、本明細書に記載のＬＡＭＰ分析を実行する際に特別な注意を払う価値があり得る。図７に示されるように、凍結唾液試料のｐＨは、唾液試料が解凍されて検査されるまでの－２０℃での日数に応じて変化し得る。一例では、ドナー１からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．２１から、採取／凍結と検査の間の６日後のｐＨ７．４６まで変化した。別の例では、ドナー２からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．００から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ６．９８まで変化した。一例では、ドナー３からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．１８から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．１８まで変化した。一例では、ドナー４からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．３５から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．４７まで変化した。一例では、ドナー１からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．２２から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．２４まで変化した。
場合によっては、物流、輸送の必要性等の理由から、唾液試料を分析前に一定期間凍結することが望ましい場合がある。そのような状況は、本明細書に記載のＬＡＭＰ分析を実行する際に特別な注意を払う価値があり得る。図７に示されるように、凍結唾液試料のｐＨは、唾液試料が解凍されて検査されるまでの－２０℃での日数に応じて変化し得る。一例では、ドナー１からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．２１から、採取／凍結と検査の間の６日後のｐＨ７．４６まで変化した。別の例では、ドナー２からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．００から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ６．９８まで変化した。一例では、ドナー３からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．１８から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．１８まで変化した。一例では、ドナー４からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．３５から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．４７まで変化した。一例では、ドナー１からの唾液試料のｐＨは、採取と試験の間の日数が無い場合のｐＨ７．２２から、採取／凍結と試験の間の６日後のｐＨ７．２４まで変化した。
【0159】
実施例７－未処理唾液における検出限界
図８は、未処理唾液の検出限界を示す。未処理唾液を流涎法を使用して採取し、１：３の比で水で希釈して、２５％の唾液及び７５％の水を得た。対照として、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を段階希釈して２５％の唾液にスパイクした。５μＬの２５％唾液を２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に加え、唾液の最終濃度を５％とした。６５℃で１時間インキュベートした後、色が変化した。ｙ軸のコピー数は、希釈しない場合の１００％唾液の元の濃度のコピー数を表す。プライマーの検出限界（ＬＯＤ）は、２５μＬの体積中２５０コピー／反応であり、これは約２００，０００コピー／唾液１ｍＬに相当する。
図８は、未処理唾液の検出限界を示す。未処理唾液を流涎法を使用して採取し、１：３の比で水で希釈して、２５％の唾液及び７５％の水を得た。対照として、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を段階希釈して２５％の唾液にスパイクした。５μＬの２５％唾液を２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰ試薬に加え、唾液の最終濃度を５％とした。６５℃で１時間インキュベートした後、色が変化した。ｙ軸のコピー数は、希釈しない場合の１００％唾液の元の濃度のコピー数を表す。プライマーの検出限界（ＬＯＤ）は、２５μＬの体積中２５０コピー／反応であり、これは約２００，０００コピー／唾液１ｍＬに相当する。
【0160】
したがって、ヌクレアーゼ非含有水で唾液を２５％に希釈し、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応への添加時に唾液の最終濃度５％までさらに希釈すると、６０分以内に結果が得られることが判明した。希釈により、唾液の緩衝能が低下し、阻害成分の濃度が低下し、その両方によって比色報告が遅延することになる。希釈は、唾液の阻害成分を不活化するための、プロテアーゼ、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）１００による前処理、またはＲＮＡ抽出操作など、さまざまな研究で見出される他の前処理操作と比較して、エンドユーザーにとってそれほど複雑ではない。
【0161】
Ｐｕｒｅ・ＳＡＬ（商標）を使用して処理された５％唾液中の比色アッセイのＬｏＤは、１０００コピー／反応（反応体積２５μＬ）であり、これは、８００コピー／希釈を考慮した後の患者唾液１μＬに相当する（図６Ｃ）。
【0162】
図６Ｃに示すように、異なる唾液採取デバイス（Ｐｕｒｅ・ＳＡＬ（商標）、Ｓｕｐｅｒ－Ｓａｌ（商標）、Ｓｔａｔ－ｓｕｒｅ（商標））により、ＬｏＤが変化する可能性がある。すべての処理技術について、水で５％に希釈した唾液を試験した。プライマーセットｏｒｆｌａｂ．２を使用した。５％処理済み唾液（最終反応濃度）で希釈した５μＬの熱不活化ウイルスをＲＴ－ＬＡＭＰ反応に加えて、示された濃度及び最終反応体積２５μＬを得た。陰性反応の場合、希釈した熱不活化ウイルスの代わりに５μＬの処理済み唾液（最終反応濃度５％）を加えて、同じ反応体積２５μＬを提供した。加熱は、インキュベータ内で６５℃にて６０分間行った。比色スキャンは、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前後にフラットベッドスキャナーを使用して取得した。反応物は、１２．５μＬのＮＥＢ ２×比色マスターミックス、２．５μＬのプライマーミックス、５μＬの水、及び５μＬの試料から構成されていた。
【0163】
このＬｏＤは、ＲＴ－ＰＣＲアッセイまたはＲＮＡ抽出を利用する他のアッセイ（１コピー／反応程度）よりも数桁高い。しかし、これらの他のアッセイでは、報告されているＬｏＤを達成するために前処理プロトコル及び／またはＲＮＡ抽出操作を伴っていた。
【0164】
このＬｏＤを高めるために、本発明者らは、ＲＮａｓｅ阻害剤、グアニジンＨＣｌ、及びキャリアＤＮＡの使用を調査した。ＲＮａｓｅ阻害剤の添加により、５％唾液中のＬｏＤが低下した（図６Ｂ）が、これは、唾液中のＲＴ－ＬＡＭＰアッセイでＲＮａｓｅ阻害剤を利用することによりＬｏＤを増加させたという文献報告と矛盾する；この不一致は、使用したＲＮａｓｅ阻害剤のタイプに起因する可能性がある。グアニジンＨＣｌ及びキャリアＤＮＡは両方ともＬｏＤを増加させ（図６Ｄ及び図６Ｅ）、これらを比色溶液反応用のＲＴ－ＬＡＭＰ反応配合物に加えた。紙上で乾燥させる場合、色が変化するため、これらの成分は含まれていなかった。
【0165】
図６Ｄに示すように、５％処理済み唾液（最終反応濃度）で希釈した５μＬの熱不活化ウイルスをＲＴ－ＬＡＭＰ反応に加えて、示された濃度及び最終反応体積２５μＬを得た。陰性反応の場合、希釈した熱不活化ウイルスの代わりに５μＬの処理済み唾液（最終反応濃度５％）を加えて、同じ反応体積２５μＬを得た。プライマーセットｏｒｆｌａｂ．２を使用した。加熱は、インキュベータ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｉｓｏｔｅｍｐ（商標））内で６５℃にて６０分間行った。比色スキャンは、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前後にフラットベッドスキャナーを使用して取得した。１２５０μＬのＮＥＢ比色マスターミックスに、０．５μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ、３．５μＬのｄＵＴＰ、及びキャリアＤＮＡを補充して、示されている最終反応濃度を得た。
【0166】
図６Ｅに示すように、５％処理済み唾液（最終反応濃度）で希釈した５μＬの熱不活化ウイルスをＲＴ－ＬＡＭＰ反応に加えて、示された濃度及び最終反応体積２５μＬを得た。陰性反応の場合、希釈した熱不活化ウイルスの代わりに５μＬの処理済み唾液（最終反応濃度５％）を加えて、同じ反応体積２５μＬを得た。プライマーセットｏｒｆｌａｂ．２を使用した。加熱は、インキュベータ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｉｓｏｔｅｍｐ（商標））内で６５℃にて６０分間行った。比色スキャンは、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前後にフラットベッドスキャナーを使用して取得した。１２５０μＬのＮＥＢ比色マスターミックスに、０．５μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ、３．５μＬのｄＵＴＰ、及びグアニジンＨＣｌ（４０ｍＭ）を補充した。
【0167】
最後に、キャリーオーバー汚染を低減するために、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）（図６Ｆ）を含めた。図６Ｆに、ＵＤＧ及びｄＵＴＰを加えた場合と加えない場合の、サーモミキサー及びインキュベータ上での２５ｕＬの反応について、６５℃で６０分間インキュベートした後の比色スキャンを示す。プライマーセットはｏｒｆｌａｂ．ＩＩを使用した。テンプレートは、示された濃度の熱不活化ウイルスであった。ＵＤＧとの反応については、１２５０μＬのＮＥＢ ２×比色マスターミックスに０．５μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ、３．５μＬのｄＵＴＰを加えた。他のすべての反応では、ＮＥＢ ２×比色マスターミックスを使用した。
【0168】
グアニジンＨＣｌ、キャリアＤＮＡ、及びＵＤＧを含む場合、溶液中の５％処理済み唾液におけるＲＴ－ＬＡＭＰ比色アッセイのＬｏＤは、２５０コピー／反応に増加した（図６Ｇ）。図６Ｇでは、Ｐｕｒｅ・ＳＡＬ（商標）で処理された唾液及び未処理の唾液を使用した、ＲＴ－ＬＡＭＰ比色ＬｏＤを示す。プレートを、６５℃に設定したインキュベータ内で６０分間加熱した。使用したプライマーセットはｏｒｆｌａｂ．ＩＩであり、テンプレートは指定濃度の熱不活化ウイルス（陽性反応）またはヌクレアーゼ非含有水（陰性反応）であった。加熱は、インキュベータ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｉｓｏｔｅｍｐ（商標））内で６５℃にて６０分間行った。比色スキャンは、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の前後にフラットベッドスキャナーを使用して取得した。１２５０μＬのＮＥＢ比色マスターミックスに、０．５μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ、３．５μＬのｄＵＴＰ、キャリアＤＮＡ（０．３ｎｇ／μＬ）、及びグアニジンＨＣｌ（４０ｍＭ）を補充した。
【0169】
実施例８－動物の鼻腔スワブにおける検出限界
図９は、約１ｍＬの水に再懸濁したウシ鼻腔スワブにおける検出限界を示す。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、再懸濁したバックグラウンド粘液及びマイクロバイオームとともに水にスパイクして、唾液を使用した前の例と同じコピー／反応を得た。５μＬの試料を２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰに加えた。６５℃で約１時間インキュベートした後、色が変化した。プライマーについてのＬＯＤは、２５μＬの体積中約２５０コピー／反応であり、これは約５，０００コピー／鼻腔スワブ再懸濁液１ｍＬに相当する。
図９は、約１ｍＬの水に再懸濁したウシ鼻腔スワブにおける検出限界を示す。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、再懸濁したバックグラウンド粘液及びマイクロバイオームとともに水にスパイクして、唾液を使用した前の例と同じコピー／反応を得た。５μＬの試料を２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰに加えた。６５℃で約１時間インキュベートした後、色が変化した。プライマーについてのＬＯＤは、２５μＬの体積中約２５０コピー／反応であり、これは約５，０００コピー／鼻腔スワブ再懸濁液１ｍＬに相当する。
【0170】
実施例９－紙上の検出限界
図１０は、紙上の検出限界を示す。２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰ試薬をグレード１のクロマトグラフィー用紙に加えた。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、ウイルスを段階希釈して１００％プール唾液にスパイクした。１５μＬの約１００％唾液を各紙片に加えた。６５℃で９０分間インキュベートした後、色が変化した。プライマーのＬＯＤは、１５μＬの体積中約３，０００コピー／反応であり、これは約２０，０００コピー／唾液１ｍＬに相当する。
図１０は、紙上の検出限界を示す。２０μＬのＲＴ－ＬＡＭＰ試薬をグレード１のクロマトグラフィー用紙に加えた。熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、ウイルスを段階希釈して１００％プール唾液にスパイクした。１５μＬの約１００％唾液を各紙片に加えた。６５℃で９０分間インキュベートした後、色が変化した。プライマーのＬＯＤは、１５μＬの体積中約３，０００コピー／反応であり、これは約２０，０００コピー／唾液１ｍＬに相当する。
【0171】
紙上でのＬＡＭＰ分析を容易にする試薬組成物
実施例１０－試料試薬
一例では、試薬は表Ａ１に示すように含まれていた。別の例では、試薬は表Ａ２に示すように含まれていた。
実施例１０－試料試薬
一例では、試薬は表Ａ１に示すように含まれていた。別の例では、試薬は表Ａ２に示すように含まれていた。
【表1】
【表2】
【0172】
実施例１１－緩衝液の選択及び濃縮
唾液のｐＨは試料ごとに異なる可能性があるため、紙ベースのデバイスでは緩衝液を使用して、一貫した開始ｐＨを維持した。フェノールレッドの場合、図１１に示すように、比色遷移を促進するにはｐＨ７．６が好適な開始点であった。開始時のｐＨ７．６は、増幅が起こったときに色の変化が可能になる緩衝範囲の限界に近かったため、約８のｐＫａを有するいくつかの緩衝液をスクリーニングした。図１２に示すように、紙ベースのアッセイには１０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ緩衝液を使用した。
唾液のｐＨは試料ごとに異なる可能性があるため、紙ベースのデバイスでは緩衝液を使用して、一貫した開始ｐＨを維持した。フェノールレッドの場合、図１１に示すように、比色遷移を促進するにはｐＨ７．６が好適な開始点であった。開始時のｐＨ７．６は、増幅が起こったときに色の変化が可能になる緩衝範囲の限界に近かったため、約８のｐＫａを有するいくつかの緩衝液をスクリーニングした。図１２に示すように、紙ベースのアッセイには１０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ緩衝液を使用した。
【0173】
実施例１２－反応速度に対するプライマーの影響
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の速度を高めるために、ＲＴ－ＬＡＭＰ蛍光反応混合物に複数のプライマーセットを含めることを調査した。調査は、蛍光指示薬としてＮＥＢ ＬＡＭＰ蛍光色素を使用して水中で行った。複数のプライマーセットを含めても、反応速度が大幅に向上するようには見えなかった。むしろ、反応は主に、単独で使用した場合に最も速い反応時間を有するプライマーセットの速度で進行した。
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の速度を高めるために、ＲＴ－ＬＡＭＰ蛍光反応混合物に複数のプライマーセットを含めることを調査した。調査は、蛍光指示薬としてＮＥＢ ＬＡＭＰ蛍光色素を使用して水中で行った。複数のプライマーセットを含めても、反応速度が大幅に向上するようには見えなかった。むしろ、反応は主に、単独で使用した場合に最も速い反応時間を有するプライマーセットの速度で進行した。
【0174】
実施例１３－試料ＬＡＭＰプロトコル、試薬、検証、及びトラブルシューティング
試料Ｌａｍｐプロトコル１３－Ａ：
プライマーミックス
１．冷凍庫から６つの希釈プライマーすべてを入手する；２．チューブ内で８０μｌのＦＩＰ、８０μｌのＢＩＰ、２０μｌのＦＢ、２０μｌのＬＢ、１０μｌのＦ３及び１０μｌのＢ３を混合する；３．十分なＰＣＲグレードの水を５００μｌになるまで加える。
試料Ｌａｍｐプロトコル１３－Ａ：
プライマーミックス
１．冷凍庫から６つの希釈プライマーすべてを入手する；２．チューブ内で８０μｌのＦＩＰ、８０μｌのＢＩＰ、２０μｌのＦＢ、２０μｌのＬＢ、１０μｌのＦ３及び１０μｌのＢ３を混合する；３．十分なＰＣＲグレードの水を５００μｌになるまで加える。
【0175】
ＬＡＭＰ
１．ＮＥＢ Ｂｓｔ ２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔキット及びプライマーミックスを入手する；２．試薬を解凍している間、ＤＮＡｗａｙをスプレーして少なくとも５分後、キムワイプで表面を拭く；３．必要なすべてのＰＣＲチューブに、使用するＤＮＡ試料及びプライマーをラベル付けする。ＤＮＡが加えられていない陰性対照を必ず追加する；４．反応ごとにＰＣＲグレードの水（または色素）５μｌ、ＮＥＢ Ｂｓｔ ２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔキット１２．５μｌ、及びプライマーミックス２．５μｌを加える。マスターミックスは、実行する反応の数に応じて作成することができる；５．ＥＢＴ色素５μｌを加える場合、最終濃度が３００μＭになるように、１５００μＭの濃度にする必要がある；６．ＤＮＡを含まない反応には、さらに５μｌのＰＣＲグレードの水を加え、ゲルに充填する必要があるまで再度開けない；７．準備ができたら、ＰＣＲチューブを事前にパススルーチャンバー内に残しておいたＰＣＲトレイに置き、ＢＲＫ２０３７に移す；８．ＢＲＫ２０３７に入ったら、－２０°Ｃの冷凍庫から試料ＤＮＡを入手する；９．ＤＮＡｗａｙスプレーを手にスプレーし、ＤＮＡ試料チューブもスプレーで覆うように周りを手でこする；１０．必要に応じて５μｌのＤＮＡ試料を加え、チューブを閉じる。決して２本のＤＮＡチューブを同時に開けたり、ＤＮＡを加えた直後にＰＣＲチューブを閉じたりしないこと；１１．試料を、６５℃で１時間、８０℃で５分間に設定したサーモサイクラーに置く（この操作後、試料を－２０℃で一晩保持してもよい）。
１．ＮＥＢ Ｂｓｔ ２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔキット及びプライマーミックスを入手する；２．試薬を解凍している間、ＤＮＡｗａｙをスプレーして少なくとも５分後、キムワイプで表面を拭く；３．必要なすべてのＰＣＲチューブに、使用するＤＮＡ試料及びプライマーをラベル付けする。ＤＮＡが加えられていない陰性対照を必ず追加する；４．反応ごとにＰＣＲグレードの水（または色素）５μｌ、ＮＥＢ Ｂｓｔ ２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔキット１２．５μｌ、及びプライマーミックス２．５μｌを加える。マスターミックスは、実行する反応の数に応じて作成することができる；５．ＥＢＴ色素５μｌを加える場合、最終濃度が３００μＭになるように、１５００μＭの濃度にする必要がある；６．ＤＮＡを含まない反応には、さらに５μｌのＰＣＲグレードの水を加え、ゲルに充填する必要があるまで再度開けない；７．準備ができたら、ＰＣＲチューブを事前にパススルーチャンバー内に残しておいたＰＣＲトレイに置き、ＢＲＫ２０３７に移す；８．ＢＲＫ２０３７に入ったら、－２０°Ｃの冷凍庫から試料ＤＮＡを入手する；９．ＤＮＡｗａｙスプレーを手にスプレーし、ＤＮＡ試料チューブもスプレーで覆うように周りを手でこする；１０．必要に応じて５μｌのＤＮＡ試料を加え、チューブを閉じる。決して２本のＤＮＡチューブを同時に開けたり、ＤＮＡを加えた直後にＰＣＲチューブを閉じたりしないこと；１１．試料を、６５℃で１時間、８０℃で５分間に設定したサーモサイクラーに置く（この操作後、試料を－２０℃で一晩保持してもよい）。
【0176】
試料試薬濃度１３－Ｂ：
比色ＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックスは：ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰを１．４ｍＭ）、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（０．３２Ｕ／μＬ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴｘ逆転写酵素（０．３Ｕ／μＬ）、フェノールレッド（０．２５ｍＭ）、ｄＵＴＰ（０．１４ｍＭ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ（０．０００４Ｕ／μＬ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１％体積／体積）、ベタイン（２０ｍＭ）、ＢＳＡ（５００μｇ／ｍＬ）、及びトレハロース（１０％重量／体積）、であり得る。
比色ＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックスは：ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、ｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰを１．４ｍＭ）、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（０．３２Ｕ／μＬ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴｘ逆転写酵素（０．３Ｕ／μＬ）、フェノールレッド（０．２５ｍＭ）、ｄＵＴＰ（０．１４ｍＭ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ（０．０００４Ｕ／μＬ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１％体積／体積）、ベタイン（２０ｍＭ）、ＢＳＡ（５００μｇ／ｍＬ）、及びトレハロース（１０％重量／体積）、であり得る。
【0177】
これらの成分を、紙ＬＡＭＰアッセイについて、それぞれ０．２５×の液体濃度から５×以上まで滴定した。濃度は、ＬＡＭＰ反応の速度、６０分の反応時間における陽性と陰性の間のＬＡＭＰ結果のコントラスト、及び非特異的増幅の量の減少によって決定した。
【0178】
タンパク質安定化添加剤の濃度を決定するために、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物を、５％の増分で０％から１５％重量／体積まで滴定し、凍結乾燥ＢＳＡを、０．２ｍｇ／ｍＬの増分で０から１．２５ｍｇ／ｍＬまで滴定した。トレハロース及びＢＳＡの濃度は、それぞれ１０％重量／体積及び０．６２６ｍｇ／ｍＬであった。
【0179】
試料Ｌａｍｐプロトコル１３－Ｃ：
試薬
試薬は、実施例１０の表Ａ－２に示されている。
試薬
試薬は、実施例１０の表Ａ－２に示されている。
【0180】
機器
ピンセット、０．５～１０μＬピペット、２～２０μＬピペット、２０～２００μＬピペット、１００～１０００μＬピペット、Ａｈｌｓｔｒｏｍ－Ｍｕｎｋｓｊｏ Ｇｒａｄｅ ２２２、ｐＨプローブ、６５℃に達し得る熱源（例えば、インキュベータ、水浴）、ＰＣＲフード。
ピンセット、０．５～１０μＬピペット、２～２０μＬピペット、２０～２００μＬピペット、１００～１０００μＬピペット、Ａｈｌｓｔｒｏｍ－Ｍｕｎｋｓｊｏ Ｇｒａｄｅ ２２２、ｐＨプローブ、６５℃に達し得る熱源（例えば、インキュベータ、水浴）、ＰＣＲフード。
【0181】
消毒：
ピペット及びすべての作業台（ＰＣＲフード）表面に、ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹをスプレーする。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹを塗布した後はよく拭き取ること。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹが残っていると反応を妨げる可能性がある。二次汚染を防ぐため、紙ベースのデバイスの製造及び試料の充填には、別々の部屋を使用する。クロマトグラフィー用紙を５ｍｍｘ６ｍｍにプレカットする。
ピペット及びすべての作業台（ＰＣＲフード）表面に、ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹをスプレーする。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹを塗布した後はよく拭き取ること。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹが残っていると反応を妨げる可能性がある。二次汚染を防ぐため、紙ベースのデバイスの製造及び試料の充填には、別々の部屋を使用する。クロマトグラフィー用紙を５ｍｍｘ６ｍｍにプレカットする。
【0182】
ＬＡＭＰの調製：
１．ＰＣＲフード内で、表１３Ｂ－１に示すように２×ＬＡＭＰミックスを調製する。２．ｐＨを１Ｍ ＫＯＨ（約１～２μＬ）で約７．５～８．０（赤色であるがピンク色ではない）に調整する。正確である必要はない。ｐＨ調整後、２×ＬＡＭＰミックスは、－２０℃で保存することができる。
１．ＰＣＲフード内で、表１３Ｂ－１に示すように２×ＬＡＭＰミックスを調製する。２．ｐＨを１Ｍ ＫＯＨ（約１～２μＬ）で約７．５～８．０（赤色であるがピンク色ではない）に調整する。正確である必要はない。ｐＨ調整後、２×ＬＡＭＰミックスは、－２０℃で保存することができる。
【表3】
【0183】
３．表１３Ｂ－２に従ってマスターミックスを調製する。
【表4】
【0184】
４．ｐＨを０．１Ｍ ＫＯＨで８．０に調整する。マイクロｐＨ電極を使用する。５．よく混合する。ＰＣＲフード内の清潔な面に紙パッドを置く。プレカットしたグレード２２２紙パッドに完全ミックス３０μＬを加える。６．ＰＣＲフードの下で室温にて６０分間乾燥させる。７．乾燥させた後、紙パッドを清潔な遠心分離チューブまたは清潔な再密封可能なプラスチックバッグに収集する。
【0185】
試料充填
１．ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹを作業台にスプレーし、ワイパーできれいに拭く。２．テンプレート（ＤＮＡ、ＲＮＡ、熱不活化ウイルス）を冷凍庫から取り出す。３．清潔な表面に反応パッドを配置する。新しい透明フィルム上にパッドを置き、使用後はそれを廃棄することができる。４．まず陰性対照パッドを準備する。２５μＬの非テンプレート溶媒（水、唾液）でパッドを再構成する。再構成プロセスは穏やかに行うべきであり、パッドから試薬を洗い流すのを避ける。５．ピンセットを使用して、陰性対照パッドを清潔な容器（例えば、１インチ×１インチの再密封可能なプラスチックバッグ、遠心分離チューブ）内に置く。６．テンプレートを溶媒で所望の濃度に希釈する。７．さらなる反応パッドを配置し、２５μＬの希釈テンプレートでパッドを再構成する。８．ピンセットを使用して、陽性パッドを清潔な容器（例えば、１インチ×１インチの再密封可能なプラスチックバッグ、遠心分離チューブ）内に置く。９．作業スペースを清掃し、イメージング及びインキュベーションのためにパッドを持ち込む。
１．ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹを作業台にスプレーし、ワイパーできれいに拭く。２．テンプレート（ＤＮＡ、ＲＮＡ、熱不活化ウイルス）を冷凍庫から取り出す。３．清潔な表面に反応パッドを配置する。新しい透明フィルム上にパッドを置き、使用後はそれを廃棄することができる。４．まず陰性対照パッドを準備する。２５μＬの非テンプレート溶媒（水、唾液）でパッドを再構成する。再構成プロセスは穏やかに行うべきであり、パッドから試薬を洗い流すのを避ける。５．ピンセットを使用して、陰性対照パッドを清潔な容器（例えば、１インチ×１インチの再密封可能なプラスチックバッグ、遠心分離チューブ）内に置く。６．テンプレートを溶媒で所望の濃度に希釈する。７．さらなる反応パッドを配置し、２５μＬの希釈テンプレートでパッドを再構成する。８．ピンセットを使用して、陽性パッドを清潔な容器（例えば、１インチ×１インチの再密封可能なプラスチックバッグ、遠心分離チューブ）内に置く。９．作業スペースを清掃し、イメージング及びインキュベーションのためにパッドを持ち込む。
【0186】
イメージング及びインキュベーション：
注：複数のイメージング方法（例えば、微速度撮影ビデオ、スキャニング）及び熱源（例えば、インキュベータ、水浴）が存在する。本プロトコルでは、卓上スキャナー及び微生物インキュベータを使用することができる。１．スキャナーの上部にパッドを配置する。反応前（０分）にパッドをスキャンする。２．インキュベータを６５℃に予熱する。３．パッドをインキュベータ内に置く。パッドを分離する。加熱の均一性は結果の一貫性に影響を与える可能性がある。４．パッドを取り出し、異なる時点（通常は３０分ごと）でスキャンを繰り返す。５．最終スキャンの後、反応パッドをバイオハザード廃棄物容器内に廃棄する。
注：複数のイメージング方法（例えば、微速度撮影ビデオ、スキャニング）及び熱源（例えば、インキュベータ、水浴）が存在する。本プロトコルでは、卓上スキャナー及び微生物インキュベータを使用することができる。１．スキャナーの上部にパッドを配置する。反応前（０分）にパッドをスキャンする。２．インキュベータを６５℃に予熱する。３．パッドをインキュベータ内に置く。パッドを分離する。加熱の均一性は結果の一貫性に影響を与える可能性がある。４．パッドを取り出し、異なる時点（通常は３０分ごと）でスキャンを繰り返す。５．最終スキャンの後、反応パッドをバイオハザード廃棄物容器内に廃棄する。
【0187】
検証：
ＬＡＭＰ増幅の発生を確認するために、各反応パッドを清潔な１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。１００μＬの緩衝液ＥＢを、各チューブに加えた。核酸を溶出するために、反応パッドを緩衝液ＥＢに一晩浸漬した。溶出液を用いてゲル電気泳動（２％アガロースゲル）を実行し、ＬＡＭＰ増幅の発生を確認した。ラダー様パターン（典型的なＬＡＭＰ生成物パターン）が各陽性パッドレーンに示されたが、各陰性レーンには明らかなバンドはなかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
ＬＡＭＰ増幅の発生を確認するために、各反応パッドを清潔な１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。１００μＬの緩衝液ＥＢを、各チューブに加えた。核酸を溶出するために、反応パッドを緩衝液ＥＢに一晩浸漬した。溶出液を用いてゲル電気泳動（２％アガロースゲル）を実行し、ＬＡＭＰ増幅の発生を確認した。ラダー様パターン（典型的なＬＡＭＰ生成物パターン）が各陽性パッドレーンに示されたが、各陰性レーンには明らかなバンドはなかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【0188】
図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、紙ＬＡＭＰ検証を実行した。図１３Ａに示すように、２つの条件（反応混合物中にＢＳＡを含む場合と含まない場合）で紙上のＬＡＭＰを実行した。図１３Ｂに示すように、関連ゲル電気泳動（２％アガロース）を実行した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするｏｒｆ７ａｂ．１プライマーセットを使用した。陰性反応パッドを、２５μＬのヌクレアーゼ非含有水で再構成した。陽性反応パッドを、４００コピー／μＬの熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス２５μＬで再構成した。加熱は、６５℃に設定したインキュベータ内で実行し、フラットベッドスキャナーでスキャンした。
【0189】
ＢＳＡは、ＬＡＭＰ混合物中で使用することができる試薬である。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、ＢＳＡを加えると、反応を加速させ、感度を向上することができる。これらの反応では、紙上の低テンプレート濃度ＬＡＭＰを、２つの条件（反応混合物にＢＳＡを含む場合と含まない場合）に従って実行した。図１４Ａは、０分の時点を示す。図Ｂは６０分の時点を示す。この実験では、ｏｒｆ７ａｂ．１プライマーを使用した。陰性反応パッドを、２５μＬのヌクレアーゼ非含有水で再構成した。陽性反応パッドを、それぞれ８コピー／μＬ及び１６コピー／μＬの熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス２５μＬで再構成した（最終濃度は２００コピー／反応及び４００コピー／反応）。
【0190】
しかし、ＢＳＡは、デバイスにｐＨの変動をもたらす可能性もある。図１３Ａ及び図１４Ｂは、インキュベーション（６０分）後、ＢＳＡを含有する陰性紙パッドが黄色がかった端部を有することを示す。溶出後、溶出液をゲル電気泳動で泳動させた後、図１３Ｂに示すように、ゲル上にＤＮＡ生成物は見えず、端部の黄色がオフターゲット増幅または汚染によって生じたものではないことを示している。ＢＳＡが不均質に分布している場合、熱を加えると端部が黄色になることがある。
【0191】
トラブルシューティング：
紙パッド上の異常なピンク色：ＬＡＭＰ紙パッドを準備するプロセス中に、周囲の色とは異なる異常なピンク色の斑点が存在する可能性があり、これはパッドに直接スプレーされた及び／またはピンセットを介して移されたかのいずれかの残留ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹよって引き起こされた可能性がある。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹは、加えられたＲＮＡ／ＤＮＡテンプレートを分解することがある。このことが発生した場合は、すべての機器及び表面を完全に乾燥させ、新しい５×６ｍｍの紙パッドを切り取り、「ＬＡＭＰ調製」セクションを操作５から再開する。
紙パッド上の異常なピンク色：ＬＡＭＰ紙パッドを準備するプロセス中に、周囲の色とは異なる異常なピンク色の斑点が存在する可能性があり、これはパッドに直接スプレーされた及び／またはピンセットを介して移されたかのいずれかの残留ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹよって引き起こされた可能性がある。ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹは、加えられたＲＮＡ／ＤＮＡテンプレートを分解することがある。このことが発生した場合は、すべての機器及び表面を完全に乾燥させ、新しい５×６ｍｍの紙パッドを切り取り、「ＬＡＭＰ調製」セクションを操作５から再開する。
【0192】
パッド再構成後の試薬のオーバーフロー：試料充填操作中、パッドは、再構成のためにそれに加えられた全試料量を吸収できない可能性がある。テンプレートの濃度は、オーバーフローしたパッドによって正確に表されない可能性がある。パッドの乾燥が不十分な場合、オーバーフローが発生する可能性がある。このような場合は、１）長時間乾燥させる、２）加熱乾燥（３７℃の清潔な微生物インキュベータに置く；Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ポリメラーゼの活性化を防ぐため、温度を４５℃より高く設定しないこと）か、または対流乾燥（乾燥中の空気流を高めるために小型ファンを使用する）などの改善された乾燥方法を使用する、または３）再構成量を２０μＬに減少させる。
【0193】
陰性対照が色の変化を示す：イメージング及びインキュベーション操作中に、陰性パッドは試料含有パッドと同時にまたはその直後に変化する可能性がある。これは、プライマーの二量体化／非特異的増幅、または以前のＬＡＭＰ反応物のキャリーオーバー汚染物質のいずれかによって引き起こされる可能性がある。解決するには、紙上で使用する前に、液体ベースのＬＡＭＰでプライマーを検証する。キャリーオーバー汚染を制御するには、１）すべてのＬＡＭＰ反応物にｄＵＴＰ及びＵＤＧを導入する、２）ＬＡＭＰ混合物の調製及び試料添加用に別個の作業台を維持する、３）試薬ストックを分取し、汚染が発生した疑いがある場合は新しいアリコートを使用する。反応物を過剰インキュベートすると、非特異的増幅が誘発される可能性がある。インキュベーション時間は７５分を超えないようにすること。
【0194】
試料のｐＨ及び緩衝能は比色読み取りに影響を与える：フェノールレッドはｐＨ指示薬であるため、試料のｐＨ及びその緩衝能はアッセイに重大な影響を与える可能性がある。本明細書で提示する試薬組成物は、唾液濃度５～１０％体積／体積（水で希釈）で作用することが確認されている。５％唾液が選択されたのは、その濃度で応答時間が速く、一貫した結果が得られるためである。ヒトの唾液には、重炭酸塩、リン酸塩、及びタンパク質などの高度な緩衝系があり、これは、唾液濃度が高い場合のｐＨ変化（及びしたがって色の変化）を防ぐ。水に再懸濁した鼻腔スワブを用いた紙ＬＡＭＰデバイスを試験したが、試料マトリックスによる阻害は示されなかった。比色読み取りは、緩衝塩溶液（輸送媒体など）によって妨げられることもある。
【0195】
実施例１４－不活化ウイルスを含む未処理唾液の紙上の検出限界。
図１５に示すように、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む全未処理唾液から、唾液１μＬ当たり約２０コピーの検出限界が検証された。２０コピー／μＬ（１×ＬｏＤ－１０試料）、４０コピー／μＬ（２×ＬｏＤ－１０試料）、１００コピー／μＬ（２試料）、１０００コピー／μＬ（２試料）、１０，０００コピー／μＬ（２試料）、１００，０００コピー／μＬ（２試料）、１，０００，０００コピー／μＬ（２試料）などの種々の試料濃度を作成し、陰性試料として、プール唾液のアリコート（３０アリコート）を使用した。結果は、画像処理を使用して確認した。
図１５に示すように、熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む全未処理唾液から、唾液１μＬ当たり約２０コピーの検出限界が検証された。２０コピー／μＬ（１×ＬｏＤ－１０試料）、４０コピー／μＬ（２×ＬｏＤ－１０試料）、１００コピー／μＬ（２試料）、１０００コピー／μＬ（２試料）、１０，０００コピー／μＬ（２試料）、１００，０００コピー／μＬ（２試料）、１，０００，０００コピー／μＬ（２試料）などの種々の試料濃度を作成し、陰性試料として、プール唾液のアリコート（３０アリコート）を使用した。結果は、画像処理を使用して確認した。
【0196】
ＰＨ感受性シグナル出力を最大化する試薬組成物
実施例１５－試料ＬＡＭＰ色素
実施例１５－試料ＬＡＭＰ色素
【表5】
【0197】
実施例１６－
蛍光レポーターでは、特殊な機器を使用せずに読み取るために追加の紫外（ＵＶ）光源が使用されるであろう。しかし、指示薬としてフェノールレッドを使用する比色アッセイではＵＶ光を使用しないため、肉眼で判断することができる。ＤＮＡの重合によりプロトンが生成され、フェノールレッドはｐＨに応答する。希釈唾液（最終濃度５％）を使用して、唾液の緩衝能を克服してｐＨの変化を測定した。唾液を最終濃度５％に希釈すると、干渉物質（例えば、ＲＮａｓｅ）の濃度も低下した。
蛍光レポーターでは、特殊な機器を使用せずに読み取るために追加の紫外（ＵＶ）光源が使用されるであろう。しかし、指示薬としてフェノールレッドを使用する比色アッセイではＵＶ光を使用しないため、肉眼で判断することができる。ＤＮＡの重合によりプロトンが生成され、フェノールレッドはｐＨに応答する。希釈唾液（最終濃度５％）を使用して、唾液の緩衝能を克服してｐＨの変化を測定した。唾液を最終濃度５％に希釈すると、干渉物質（例えば、ＲＮａｓｅ）の濃度も低下した。
【0198】
キャリアＤＮＡ及び塩酸グアニジンを組み込むとまた、ＬｏＤが強化され、水中及び唾液中で同等の比色反応が得られた。キャリアＤＮＡがＬＡＭＰ結果を高める機構は不明であった。この機構は、ＮＥＢ １ｋｂ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ－Ｎ３２３２Ｌ）を使用して調査した。異なる濃度のキャリアＤＮＡ（０．３ｎｇ／μｌ及び０．７５ｎｇ／μｌ）を使用して、ＬｏＤに対する効果を研究した。塩化グアニジン（４０ｍＭ）も使用した。完全マスターミックスのｐＨは７．６に維持され、キャリアＤＮＡを伴わない場合でも同じ条件を試験した。ｐＨ６．５の未処理唾液（５％）を使用して、１０００コピー～６２．５コピー／反応の濃度範囲で熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、塩化グアニジンとともにキャリアＤＮＡの効果を試験した（図６Ｄ）。
【0199】
塩酸グアニジンは、ＬＡＭＰの感度を増加させることが報告された。本発明者らのプライマーセットを使用した場合の性能は、ｐＨ７．６のＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（商標）比色マスターミックスに４０ｍＭの塩酸グアニジンを加えて試験した。ｐＨ６．５のプール唾液（５％）を使用して、１０００コピー～６２．５コピー／反応の濃度範囲の熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、塩化グアニジンの効果を試験した。この同じ組成物を、対照として塩化グアニジンを加えずに試験した。塩化グアニジンは複製の感度を増加させ、複製全体にわたって一貫した増幅を有していた（図６Ｅ）。
【0200】
フェノールレッドと蛍光色素は、ＬＡＭＰベースの核酸増幅を報告する機構が異なるため、経時的なシグナル測定におけるこれらの差異を調査した。反応物は、Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（商標）比色ＬＡＭＰ ２×マスターミックスとＬＡＭＰ蛍光色素の組み合わせを含むＦｒａｍｅＳｔａｒ ９６ウェルのスカート付き光学ボトムプレート上で調製し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｓで密封し、インキュベーションならびに吸光度及び蛍光強度の測定のためにＣｌａｒｉｏｓｔａｒ（商標）Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ）に入れた。経時的な色の変化は、Ａ４３２ｎｍ／Ａ５６０ｎｍの比として表した。吸光度値は、Ａ４３２ｎｍ及びＡ５６０ｎｍをＡ６２０ｎｍで減算することによってベースライン補正を行った。
【0201】
図１６に基づくと、反応における色の変化は、蛍光の変化と比較して遅れて発生した。比色分析及び蛍光分析データは、ＢＭＧ ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓプレートリーダーで収集した。反応ベースミックスは、ＮＥＢ ２ｘ比色ＬＡＭＰマスターミックス、２．５μＬのプライマーミックス、及び５μＬの１：１００希釈のＮＥＢ ＬＡＭＰ蛍光色素（ＮＥＢ Ｂ１７００Ａ）で構成されていた。プレートリーダーのチャンバー温度は、プレートを挿入する前に６５℃に平衡化させた。水で希釈した熱不活化ウイルス５μＬを、反応ベースミックスに加えて、示されている最終反応濃度を得た（陽性反応）。ＮＴＣ反応の場合、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を、反応ベースミックスに加えた。この変化の違いは、ｐＨベースのレポーターは蛍光レポーターよりもＬＡＭＰベースのＤＮＡ増幅に対する応答が遅いことを示唆している。
【0202】
実施例１７－
紙は、数百万のデバイスまでスケールアップできるが、ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬を紙上に置くと、たとえ増幅が発生していなくても、陰性対照を使用した場合でも紙の色が変化した。この色の変化の可能性の１つは、熱によって引き起こされるセルロースの酸化と、ＲＴ－ＬＡＭＰ混合物中に存在する硫酸アンモニウムの酸化性である。この色の変化のもう１つの可能性は、ＲＴ－ＬＡＭＰ混合物からのアンモニアの脱気による試薬の酸性化である。硫酸アンモニウムを除去すると、陰性対照の色が維持された。抗酸化剤として作用するフェノールレッドの濃度を増加させた場合でも、図１１に示すように陰性対照の色が維持された。
紙は、数百万のデバイスまでスケールアップできるが、ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬を紙上に置くと、たとえ増幅が発生していなくても、陰性対照を使用した場合でも紙の色が変化した。この色の変化の可能性の１つは、熱によって引き起こされるセルロースの酸化と、ＲＴ－ＬＡＭＰ混合物中に存在する硫酸アンモニウムの酸化性である。この色の変化のもう１つの可能性は、ＲＴ－ＬＡＭＰ混合物からのアンモニアの脱気による試薬の酸性化である。硫酸アンモニウムを除去すると、陰性対照の色が維持された。抗酸化剤として作用するフェノールレッドの濃度を増加させた場合でも、図１１に示すように陰性対照の色が維持された。
【0203】
実施例１８－比色色素のスクリーニング
３つのクラスの比色指示薬：（ｉ）マグネシウム比色指示薬、（ｉｉ）ｐＨ比色指示薬、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカレート比色指示薬を、紙ベースのアッセイについて評価した。
３つのクラスの比色指示薬：（ｉ）マグネシウム比色指示薬、（ｉｉ）ｐＨ比色指示薬、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡインターカレート比色指示薬を、紙ベースのアッセイについて評価した。
【0204】
マグネシウム指示薬については、カルマガイト（ＣＡＳ＃３１４７－１４－６）、キシリジル（Ｘｙｌｉｄｌｙ）ブル－Ｉ（ＣＡＳ＃１４９３６－９７－１）、クロロホスホナゾＩＩＩ（ＣＡＳ＃１９１４－９９－４）、ｏ－クレゾールフタレインコンプレクソン（ＣＡＳ＃２４１１－８９－４）、Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）Ｂｌａｃｋ Ｔ（ＥＢＴ、ＣＡＳ＃１７８７－６１－７）、及びヒドロキシナフトールブルー（ＨＮＢ、ＣＡＳ＃６３４５１－３５－４）をスクリーニングした。
【0205】
ｐＨ指示薬については、ブロモチモールブルー（ＣＡＳ＃７６－５９－５）、酸性フクシン（ＣＡＳ＃３２４４－８８－０）、ニトラジンイエロー（ＣＡＳ＃５４２３－０７－４）、クレゾールレッド（ＣＡＳ＃１７３３－２－６）、クレゾールレッドナトリウム塩（ＣＡＳ＃６２６２５－２９－０）、クルクミン（ＣＡＳ＃４５８－３７－７）、フェノールレッド（ＣＡＳ＃１４３－７４－８）、フェノールレッドナトリウム塩（ＣＡＳ＃３４４８７－６１－１）、ブリリアントイエロー（ＣＡＳ＃３０５１－１１－４）、ｏ－クレゾールフタレイン（ＣＡＳ＃５９６－２７－０）、ｍ－クレゾールパープル（ＣＡＳ＃２３０３－０１－７）、ｍ－クレゾールパープルナトリウム塩（ＣＡＳ＃６２６２５－３１－４）、α－ナフトールフタレイン（ＣＡＳ＃５９６－０１－０）、及びニュートラルレッド（ＣＡＳ＃５５３－２４－２）をスクリーニングした。
【0206】
ＤＮＡインターカレート色素については、クリスタルバイオレット（ＣＡＳ＃５４８－６２－９）をスクリーニングした。
【0207】
多くのマグネシウム指示薬は、紙上で一貫した色の変化を生じなかった。金属イオン指示薬（カルマガイト及びＥＢＴ）は、溶液中のマグネシウム（ＩＩ）イオンと相互作用し、その濃度は、ポリメラーゼ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの形成によりＲＴ－ＬＡＭＰ実験全体を通じ低下した。
【0208】
図１７Ａは、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したＬＡＭＰ反応全体にわたる、様々な濃度でのカルマガイトの比色応答を示す。ＬＡＭＰ検出は、カルマガイト（マグネシウム指示薬）の濃度を増加させて実行した。Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉゲノムＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨＳ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬであった。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及び示される最終濃度を得るように水で調製したカルマガイト５μＬを使用して、調整した。
【0209】
試験された濃度では、ＬＡＭＰ反応中に視覚的な変化は検出されなかった。ＥＢＴは、ＬＡＭＰ反応の０分～６０分の間の時点で、紫色から暗青色への検出可能な色の変化を示した；しかし、色の変化は明確ではないため、臨床現場での解釈に支障をきたす可能性がある。
【0210】
図１７Ｂに示すように、Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ（商標）Ｂｌａｃｋ Ｔ（マグネシウム指示薬）の濃度を増加させてＬＡＭＰ検出を実行した。Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨＳ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬである。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及び示される最終濃度を得るように水で調製したＥＢＴ ５μＬを使用して、調製した。
【0211】
さらに、ＥＢＴを使用して紙上でＬＡＭＰを使用しても、検出可能な色の変化は生じなかった。図１７Ｃに示すように、ＰＣＲチューブ内のクロマトグラフィー用紙上で、Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ（商標）Ｂｌａｃｋ Ｔの濃度を増加させてＬＡＭＰ検出を実行した。Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉゲノムＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬであった。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及びヌクレアーゼ非含有水で調製したＥＢＴ（３００μＭ）５μＬを使用して調製した。ＥＢＴ反応の場合、反応はヌクレアーゼ非含有水中で調製した２５μＬのＥＢＴ（３００μＭ）から構成されていた。
【0212】
いくつかの異なるタイプの紙をスクリーニングし、ゲル電気泳動によってＰＥＳ及びポリスルホンＢＴＳ ０．８で増幅が発生していることを確認することによって、どの紙上でも比色変化を検出することができなかった（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）。
【0213】
図１７Ｄに示すように、複数の紙上でＬＡＭＰ検出を実行した：クロマトグラフィーグレード１、アニオン交換ナイロン、カチオン交換ナイロン、ポリエーテルスルホン膜、非対称サブミクロンポリスルホン（ＢＴＳ ０．８）、非対称サブミクロンポリスルホン（ＢＴＳ １００）及びヒドロキシル化ナイロン１．２。ｂ）６０分時点でのパネルａの紙のエンドポイントスキャン、及びｃ）６０分時点での抽出されたＬＡＭＰ生成物のゲル電気泳動（２％アガロース）スキャン。Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ（ＨＳ）ゲノムＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬである。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及びヌクレアーゼ非含有水で調製したＥＢＴ（３００μＭ）５μＬを使用して調製した。紙（示されているとおり）を、２５μＬの反応物を含有するＰＣＲチューブに入れ、反応の過程で紙によって吸い上げた。６０分後、紙を取り出してスキャンした。３０を使用してゲルを抽出した。
【0214】
図１７Ｅに示すように、結果は、ａ）ＰＣＲチューブ、ｂ）６０分の時点で紙から抽出したＤＮＡのゲル電気泳動（２％アガロース）、及びｃ）６０分の時点での紙のスキャンについて、経時的に得た。Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ（ＨＳ）ゲノムＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬである。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及びヌクレアーゼ非含有水で調製したＥＢＴ（３００μＭ）５μＬを使用して調製した。Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ両性紙を、２５μＬの反応物を含有するＰＣＲチューブに入れ、反応の過程で紙によって吸い上げた。６０分後、紙を取り出してスキャンした。
【0215】
さらに、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応用の溶液中でクリスタルバイオレット指示薬を安定化することは困難であった。クリスタルバイオレットの不安定な誘導体であるロイコクリスタルバイオレット（ＬＣＶ）の場合、溶液中で無色の安定性を維持するために過剰な亜硫酸ナトリウムを使用した。水に可溶化するために、ＬＣＶでは亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）及びベータ－シクロデキストリン（ＢＣＤ）を使用した。ｄｓＤＮＡに結合させると、ＬＣＶはクリスタルバイオレット（例えば、溶液中の紫色）に戻った。その結果、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応全体を通じて、増幅の結果としてより多くのｄｓＤＮＡが生成されるため、溶液の色が無色から紫色に変化すると予想された。しかし、さまざまな濃度のＣＶでＬＡＭＰ反応を実行すると、陽性反応と陰性反応の両方で色の変化が発生した。
【0216】
図１７Ｆに示すように、ＬＡＭＰ検出を、溶液中のインターカレーション色素である、クリスタルバイオレットを用いて実行し、ｂ）関連する６０分の時点での生成物のゲル電気泳動（２％アガロース）のスキャンを行った。Ｈ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬであった。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及び示される最終濃度を得るようにヌクレアーゼ非含有水で調製したクリスタルバイオレット５μＬを使用して、調製した。紙を、２５μＬの反応物を含有するＰＣＲチューブに入れ、反応の過程で紙によって吸い上げた。６０分後、紙を取り出してスキャンした。亜硫酸ナトリウム及びシクロデキストリンを使用して、クリスタルバイオレットを可溶化した。
【0217】
増幅が、陽性反応では発生しているが陰性反応では発生していないことを確認するために、ＲＴ－ＬＡＭＰ溶液を２％アガロースゲル中で実行したところ、試験したすべてのＣＶ濃度で陽性反応が増幅を示し、一方、陰性反応は、試験したどのＣＶ濃度でも増幅を示さなかったことが示された。したがって、陰性反応における色の変化は、ＬＣＶからＣＶへの分解によって引き起こされたものであり、増幅したＤＮＡの結合が原因ではなかった。
【0218】
異なる濃度のＣＶ、ＳＳ、及びＢＣＤで紙上のＣＶについてさらに試験すると、陰性反応と陽性反応との間の区別がつかない結果が得られた。図１７Ｇに示すように、紙上でインターカレート色素であるクリスタルバイオレット（ＣＶ）を用いたＬＡＭＰ検出のためにエンドポイント比色スキャンを実行した。亜硫酸ナトリウム（ＳＳ）及びベータ－シクロデキストリン（ＢＣＤ）を使用してＣＶを可溶化した。紙は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（商標）２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及び示される最終濃度でヌクレアーゼ非含有水で調製したＣＶ ５μＬを充填した。
【0219】
最後に、約７．０の色遷移ｐＨで約２ｐＨ単位の範囲を包含するいくつかの比色ｐＨ指示薬を、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の予想されるｐＨ範囲の変化及び遷移点に一致するかどうか試験した。これらの範囲は、本発明者らのＬＡＭＰ比色マスターミックスの初期開始ｐＨに基づいて、また唾液の緩衝能を克服するために選択された。この選択プロセスの１つの例外は酸性フクシンであり、これはｐＨ３．０の範囲を包含し、色遷移ｐＨ５．０を有する。図１７Ｈ～図１７Ｋは、選択されたｐＨ指示薬の様々な濃度を、６０分の時点でのＬＡＭＰ反応の関連するゲル電気泳動の結果とともに示す。
【0220】
図１７Ｈに示すように、溶液中のクレゾールレッドナトリウム塩、ニュートラルレッド、フェノールレッドナトリウム塩、ｍ－クレゾールパープル、及びｍ－クレゾールパープルナトリウム塩（ｐＨ指示薬）の濃度を増加させてＲＴ－ＬＡＭＰ検出を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子を標的とするＮ．１０プライマーセットを使用した。陽性反応には、５μＬのインビトロ転写されたＮ遺伝子ＲＮＡを、０．２ｎｇ／μＬの濃度でスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬであった。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（商標）２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及びヌクレアーゼ非含有水中で指定濃度の示されたｐＨ指示薬５μＬを使用して調製した。反応はインキュベータ内で実行し、フラットベッドスキャナーを使用して２０分ごとにスキャンした。
【0221】
図１７Ｉに示すように、クレゾールレッド（ｐＨ指示薬）の濃度を増加させてＬＡＭＰ検出を実行した。Ｈ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡを標的とするｌｏｌＢ．３プライマーセットを使用した。陽性反応には、０．２ｎｇ／μＬの濃度で５μＬのＨ．ｓｏｍｎｉ ｇＤＮＡをスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。総反応体積は２５μＬである。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（商標）２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、示されている最終反応濃度となるクレゾールレッド５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬを使用して調製した。
【0222】
図１７Ｊに示すように、溶液中のクレゾールレッド、ナトリウム塩、ｍ－クレゾールパープル、ブロモチモールブルー及び酸性フクシンの濃度を増加させてＲＴ－ＬＡＭＰ検出を実行し、ｂ）関連する６０分の時点での生成物のゲル電気泳動（２％アガロース）のスキャンを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子を標的とするＮ．１０プライマーセットを使用した。陽性反応には、５μＬのインビトロ転写されたＮ遺伝子ＲＮＡを、０．２ｎｇ／μＬの濃度でスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。反応物は、ＮＥＢ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ２×マスターミックス１２．５μＬ、プライマーミックス２．５μＬ、及び上記のテンプレート（陽性反応）または水（陰性）のいずれか５μＬ、及び示される最終反応濃度を得る示されたｐＨ指示薬５μＬを使用して、調製した。加熱は、６５℃に設定したインキュベータ内で実行し、２０分ごとにフラットベッドスキャナーでスキャンした。
【0223】
図１７Ｋに示すように、ＲＴ－ＬＡＭＰ生成物のエンドポイントゲル電気泳動スキャン（６０分）を、２％アガロースゲルで実行した。
【0224】
示されるように、陽性反応と陰性反応の間で明確な比色応答を生じた１つのｐＨ指示薬は、クレゾールレッドであった。さらに、フェノールレッド（ＮＥＢの比色ＲＴ－ＬＡＭＰキットで使用されるｐＨ指示薬）も、示された初期ｐＨ値を提供するために溶液にＨＣｌとＫＯＨを添加した結果生じる初期ｐＨ値の変化に関して評価した。
【0225】
図１７Ｌに示すように、溶液中でのｐＨ８．１、８．５、及び８．８のフェノールレッド（ｐＨ指示薬）を用いたＲＴ－ＬＡＭＰ検出を実行した。ＨＣｌとＫＯＨを使用して調整を行った後、テンプレートＲＮＡを加えた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子を標的とするＮ．１０プライマーセットを使用した。陽性反応には、５μＬのインビトロ転写されたＮ遺伝子ＲＮＡを、０．２ｎｇ／μＬの濃度でスパイクした。陰性反応には、５μＬのヌクレアーゼ非含有水を使用した。反応物は、２０μＬのマスターミックスと上記のテンプレート（陽性）またはヌクレアーゼを含まない水（陰性）５μＬから構成されていた。（ＮＨ４）２ＳＯ４（２０ｍＭ）、ＫＣｌ（１００ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１６ｍＭ）、ｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰを２８ｍＭ）、ｔｗｅｅｎ２０（０．２％体積／体積）を使用して１０ｍＬのマスターミックスを作製した。したがって、フェノールレッドは、クレゾールレッドと比較して、陽性反応と陰性反応の間のコントラストがより高いレベルになった。
【0226】
その結果、ｐＨ６．５付近で色の変化を伴うｐＨ指示薬は、最も一貫性があり、最もコントラストの強い色の変化を示した（例えば、フェノールレッド）。
【0227】
実施例１９－紙に対する開始ｐＨの影響
本発明者らのプロセスに乾燥を組み込んだ場合の色の安定性を評価するために、ＬＡＭＰマスターミックスのｐＨを８．０、８．５に調整するか、または未調整のまま（例えば、７．６）にし、また再水和に使用される水もしくは合成ＲＮＡ（Ｎ遺伝子、０．２ｎｇ／μＬ）も、８．０、８．５に調整するか、または未調整のまま（例えば、５．５）にした。
本発明者らのプロセスに乾燥を組み込んだ場合の色の安定性を評価するために、ＬＡＭＰマスターミックスのｐＨを８．０、８．５に調整するか、または未調整のまま（例えば、７．６）にし、また再水和に使用される水もしくは合成ＲＮＡ（Ｎ遺伝子、０．２ｎｇ／μＬ）も、８．０、８．５に調整するか、または未調整のまま（例えば、５．５）にした。
【0228】
図１８に示すように、ｐＨ７．６は、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応混合物の未調整のｐＨである。湿設定は、２０μＬのＬＡＭＰ反応マスターミックスを加えた直後に、５μＬの合成ＲＮＡ（Ｎ遺伝子、０．２ｎｇ／μＬ、「＋」）または水（「－」）が加えられたことを示す。乾燥設定は、２０μＬのＬＡＭＰマスターミックスを適用した後、紙ストリップを室温で３０分間自然乾燥させ、その後２５μＬの合成ＲＮＡ（「＋」）または水（「－」）で再水和したことを示す。
【0229】
ｐＨを８．０に調整すると、陰性対照においてより良好な色安定性が得られたが、ｐＨ８．５は高すぎて、標準及び乾燥設定では１２０分間のインキュベーション後に色の変化が識別可能にならなかった。ｐＨを未調整のままにすると、対照を充填した場合でも色が変化した。
【0230】
実施例２０－ＲＴ－ＬＡＭＰ比色応答に対するトレハロース及びＴｗｅｅｎ２０の効果
図１９Ｂは、所与の濃度のトレハロースまたはＴｗｅｅｎ２０を含めた比色ＲＴ－ＬＡＭＰ結果を示す。ｏｒｆｌａｂ．ＩＩプライマーセットを使用した。ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、等モルｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰを１．４ｍＭ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＢＳＴ ２．０（０．３２Ｕ／μＬ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＲＴｘ（０．３Ｕ／μＬ）、フェノールレッド（０．２５ｍＭ）、ｄＵＴＰ（０．１４ｍＭ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ＵＤＧ（０．０００４Ｕ／μＬ）、Ｔｗｅｅｎ２０（指示されている場合、１％体積／体積）、ベタイン（２０ｍＭ）、ＢＳＡ（４０ｍｇ／ｍＬ）、トレハロース（指示されている場合、１０％重量／体積）の基本配合を含むＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックス２０μＬを、グレード１クロマトグラフィー用紙（５ｍｍ×２０ｍｍ）に加え、ＰＣＲ調製フード内で６０分間乾燥させた。２５％処理済み唾液（陽性反応）またはヌクレアーゼ非含有水（陰性反応）中の反応当たり最終濃度１×１０５コピーの熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２５μＬを、乾燥反応パッドに加えた。パッドを６５℃に設定したインキュベータ内で６０分間加熱し、フラットベッドスキャナーを使用してスキャンした。
図１９Ｂは、所与の濃度のトレハロースまたはＴｗｅｅｎ２０を含めた比色ＲＴ－ＬＡＭＰ結果を示す。ｏｒｆｌａｂ．ＩＩプライマーセットを使用した。ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（８ｍＭ）、等モルｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰを１．４ｍＭ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＢＳＴ ２．０（０．３２Ｕ／μＬ）、ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＲＴｘ（０．３Ｕ／μＬ）、フェノールレッド（０．２５ｍＭ）、ｄＵＴＰ（０．１４ｍＭ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ＵＤＧ（０．０００４Ｕ／μＬ）、Ｔｗｅｅｎ２０（指示されている場合、１％体積／体積）、ベタイン（２０ｍＭ）、ＢＳＡ（４０ｍｇ／ｍＬ）、トレハロース（指示されている場合、１０％重量／体積）の基本配合を含むＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックス２０μＬを、グレード１クロマトグラフィー用紙（５ｍｍ×２０ｍｍ）に加え、ＰＣＲ調製フード内で６０分間乾燥させた。２５％処理済み唾液（陽性反応）またはヌクレアーゼ非含有水（陰性反応）中の反応当たり最終濃度１×１０５コピーの熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ２５μＬを、乾燥反応パッドに加えた。パッドを６５℃に設定したインキュベータ内で６０分間加熱し、フラットベッドスキャナーを使用してスキャンした。
【0231】
硫酸アンモニウムを含めると、テンプレートが存在しない場合、ＲＴ－ＬＡＭＰ試薬の乾燥時に赤色から黄色への変化が生じた。この色の変化は、フェノールレッド濃度を増加させ、硫酸アンモニウムをベタインで置き換えることによって防止された（図１９Ａ）。さらに、トレハロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加により、反応速度が増加し、ＬｏＤが増加した（図１９Ｂ）。
【0232】
例示的実施形態
【0233】
一例では、１つ又は複数の標的プライマー；ＤＮＡポリメラーゼ；及び再可溶化剤を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物であって；固相媒体を変色させることができる非ｐＨ感受性薬剤を実質的に含まない、組成物が提供される。
【0234】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の一例では、組成物は、抗酸化剤をさらに含むことができる。
【0235】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、組成物は揮発性剤を実質的に含まないものであり得る。
【0236】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、組成物は吸湿剤を実質的に含まないものであり得る。
【0237】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、吸湿剤は、２５℃で約４０％～約９０％の相対湿度（ＲＨ）の場合に、約１０重量％を超える量を吸収することができる。
【0238】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、吸湿剤としては、グリセロール、エタノール、メタノール、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸カルシウム、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【0239】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、再可溶化剤は界面活性剤であり得る。
【0240】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、再可溶化剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリソルベート２０、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【0241】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、標的プライマーは、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体、または原生動物病原体を含む病原体を標的とすることができる。
【0242】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、病原体はウイルス病原体であり得る。
【0243】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、ウイルス病原体は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス、またはｄｓ－ＤＮＡ－ＲＴウイルスを含むことができる。
【0244】
別の態様では、ウイルス病原体は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る。
【0245】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、組成物は逆転写酵素をさらに含むことができる。
【0246】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、組成物は非変色添加剤をさらに含むことができる。
【0247】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、非変色添加剤は、糖、緩衝液、またはそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む。
【0248】
固相媒体上のループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）分析用の組成物の別の例では、組成物は指示薬をさらに含むことができる。
【0249】
一例では、固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法であって、本明細書に記載の固相媒体と組成物のアセンブリを提供すること、固相媒体上に生体試料を堆積すること、及びＬＡＭＰ反応を促進するのに十分な等温温度までアセンブリを加熱すること、を含む、方法が提供される。
【0250】
固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法の一例では、生体試料は、唾液、粘液、血液、尿、糞便、汗、呼気凝縮液、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数である。
【0251】
固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法の別の例では、生体試料は唾液であり得る。
【0252】
固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法の別の例では、本方法は、ウイルス病原体を検出することをさらに含むことができる。
【0253】
固相媒体上のＬＡＭＰ分析のための方法の別の例では、ＬＡＭＰ分析は、逆転写酵素ＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）であり得る。
【0254】
一例では、本明細書に記載の組成物；及び組成物がその上に堆積される固相媒体を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、ＬＡＭＰ分析を実行するためのシステムが提供される。
【0255】
上記の方法は、本発明のいくつかの実施形態の単なる例示であることを理解されたい。当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの修正及び代替構成を考案することができ、添付の特許請求の範囲は、そのような修正及び構成を網羅するものとする。したがって、本発明を、現在本発明の最も実際的で好ましい実施形態であると考えられるものに関連して具体的かつ詳細に上で説明してきたが、本明細書に記載されている原則及び概念から逸脱することなく、変形を含み、作成することができることは当業者には明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【図17G】
【図17H】
【図17I】
【図17J】
【図17K】
【図17L】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【国際調査報告】