特表 2024-502643 初代消化管間質腫瘍細胞の培養培地、培養方法、及びそれらの利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-22

(54)【発明の名称】初代消化管間質腫瘍細胞の培養培地、培養方法、及びそれらの利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/09 20100101AFI20240115BHJP

   C12Q 1/18 20060101ALI20240115BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240115BHJP

【ＦＩ】

C12N5/09

C12Q1/18

C12N5/077

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023542538

(86)(22)【出願日】2021-01-22

(85)【翻訳文提出日】2023-09-11

(86)【国際出願番号】 CN2021073246

(87)【国際公開番号】W WO2022151520

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】202110041939.2

(32)【優先日】2021-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522178669

【氏名又は名称】合肥中科普瑞昇生物医▲薬▼科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110003845

【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ 青松

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ ▲飛▼▲揚▼

(72)【発明者】

【氏名】李 ▲暁▼雨

(72)【発明者】

【氏名】梅 ▲滬▼生

(72)【発明者】

【氏名】王 文超

(72)【発明者】

【氏名】任 涛

(72)【発明者】

【氏名】王 黎

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA06

4B063QQ02

4B065AA93X

4B065BB01

4B065BB32

4B065BB34

4B065BC01

4B065BC41

4B065BD39

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、初代消化管間質腫瘍細胞を培養する細胞培養培地であって、ガストリン、Ｎ２、インスリン、受容体チロシンキナーゼリガンド、及びＲｏｃｋキナーゼ阻害剤を含む、細胞培養培地を提供する。本発明は更に、上記細胞培養培地を使用することによって消化管間質腫瘍細胞を培養する方法、及び上記方法を使用することによって得られる増殖された細胞集団の効力評価又はスクリーニングにおける利用を提供する。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

初代消化管間質腫瘍細胞を培養する細胞培養培地であって、ガストリン、Ｎ２、インスリン、受容体チロシンキナーゼリガンド、血小板由来成長因子ＡＡ、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子、及び、Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤を含むことを特徴とする、細胞培養培地。

【請求項2】

ガストリンの含有量は、０．３ｎＭ～１０ｎＭ、好ましくは０．３ｎＭ～３ｎＭであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項3】

前記Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ファスジル、及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項4】

Ｎ２の前記細胞培養培地中での体積濃度は、１：２５～１：２００、好ましくは１：５０～１：１００の範囲であり、
インスリンの含有量は、２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌであり、
それぞれの血小板由来成長因子ＡＡ、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子の含有量は、５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、
前記Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤の含有量は、２μＭ～５０μＭ、好ましくは５μＭ～１０μＭであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項5】

前記細胞培養培地は、血清を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項6】

初代消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法であって、以下の工程：
（１）請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養培地を調製する工程と、
（２）培養容器をコラーゲンでコーティングする工程と、
（３）前記コーティングされた培養容器において初代消化管間質腫瘍細胞を接種し、前記細胞培養培地を使用することによって０．１％～２５％の酸素濃度下で前記細胞を培養する工程と、
を含むことを特徴とする、培養方法。

【請求項7】

前記コラーゲンは、ラット尾Ｉ型コラーゲンであり、
前記コラーゲンを、超純水で１：５～１：１００の希釈率、好ましくは１：１０～１：５０の希釈率にて希釈し、
コーティング方法は、前記希釈されたコラーゲンを前記培養容器へと加えて、前記容器の底部を完全に覆い、３０分間以上放置することを含むことを特徴とする、請求項６に記載の培養方法。

【請求項8】

工程（３）において、前記培養を０．１％～４％の酸素濃度下で行うことを特徴とする、請求項６に記載の培養方法。

【請求項9】

消化管間質腫瘍薬の効力を評価する方法又は消化管間質腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）請求項６～８のいずれか一項に記載の培養方法を使用することによって消化管間質腫瘍細胞を培養する工程と、
（２）試験される薬物を必要とされる濃度勾配で準備する工程と、
（３）工程（２）で準備された様々な濃度の前記薬物を、工程（１）で培養された前記消化管間質腫瘍細胞へと加える工程と、
（４）細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学の技術分野、特に、消化管間質腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は増殖させる培養培地及び培養方法、並びに培養された細胞の薬物の効力評価及びスクリーニングにおける方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は、消化管の間葉系組織を起源とする腫瘍の一種であり、消化管間葉系腫瘍の大部分を占め、主に胃（５０％～７０％）に発生する。従来の放射線療法に対するその不感受性のため、外科的切除はＧＩＳＴを治療するのに有効な方法である。しかしながら、腫瘍の進行、転移、又は術後再発により手術の機会を逃した患者の場合に、ＧＩＳＴの生存期間中央値はわずか６ヶ月～１８ヶ月であり、５年生存率は１０％未満である。過去１０年間にわたり、ＧＩＳＴの臨床診断及び治療における分子生物学技術の広範な適用、特にイマチニブに代表される分子標的薬の出現及び普及により、ＧＩＳＴ患者の予後は大幅に改善された。現在、進行性ＧＩＳＴの治療及びＧＩＳＴの術後補助療法におけるイマチニブの顕著な治癒効果は広く認識されているが、同時に研究者らによってイマチニブの一次薬物耐性及び二次薬物耐性への懸念も高まっている。研究によると、患者の４０％～５０％がイマチニブ治療を受けた後２年以内に薬物耐性を発生し、イマチニブ耐性を有する患者は第２選択治療薬としてスニチニブを投与しても、わずか６．８ヶ月の無増悪生存期間延長の中央値しか有さず、一方、その患者は第３選択治療薬としてレゴラフェニブを投与しても、わずか４．８ヶ月の無増悪生存期間延長の中央値しか有さなかった。したがって、臨床診療における消化管間質腫瘍の病因に関する更なる研究を実施し、消化管間質腫瘍を治療する新薬を開発することが急務である。

【0003】

しかしながら、現在、消化管間質腫瘍に適した研究モデルが不足している。これは主に、消化管間質腫瘍と他の一般的な腫瘍との間の違いによるものである。肺癌及び乳癌等の一般的な腫瘍は上皮起源である。現在、上皮由来の腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する方法は比較的急速に開発されているが、非上皮組織由来の腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する方法は殆ど報告されていない（非特許文献１）。さらに、消化管間質腫瘍細胞系統の樹立されたモデルの数も非常に限られており、国際的な商業的細胞企業からほんの一握りの消化管間質腫瘍細胞系統しか市販されておらず、これが消化管間質腫瘍の基礎研究及び新薬開発に多くの支障をきたしている。

【0004】

消化管間質腫瘍を患う患者からの新鮮な腫瘍試料を使用して初代消化管間質腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物を開発する技術は、消化管間質腫瘍にとっての研究モデルを開発する優れた手段である。しかしながら、現在、患者由来の初代消化管間質腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するのに有効な方法は認められていない。報告された方法の殆どでは、血清が培養培地に添加されており（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、一般に、培養の低い成功率及び線維芽細胞等の非消化管間質腫瘍細胞からの干渉という問題を抱えている。

【0005】

したがって、消化管間質腫瘍の分野における基礎研究及び新薬開発の要求を満たすために、患者由来の初代消化管間質腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するのに有効な方法を開発することが急務である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Xu et al., Journal of Hematology & Oncology, 11: 116, 2018

【非特許文献2】Liu et al., Am J Pathol, 183(6): 1862-1870, 2013

【非特許文献3】Liu et al., Ther Adv Med Oncol, 11: 1-15, 2019

【非特許文献4】Fukuda, Oncology Reports, 30: 71-78, 2013

【非特許文献5】Zhu et al., Journal of Central South University, 35(11): 1138-1144, 2010

【発明の概要】

【0007】

本発明は、初代消化管間質腫瘍細胞を培養する細胞培養培地、及びこの培地を使用して初代消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法を提供することを目的としている。本発明の細胞培養培地及び培養方法は、高い成功率、簡便な操作、及び線維芽細胞等の非消化管間質腫瘍細胞からの干渉がないという目標を達成することができる。本発明の細胞培養培地及び培養方法を適用して初代消化管間質腫瘍細胞モデルを構築すると、消化管間質腫瘍患者自身の生物学的特徴を有する消化管間質腫瘍細胞を得ることができ、これを薬物の効力評価又はスクリーニングに使用することができる。

【0008】

本発明の一態様は、初代消化管間質腫瘍細胞を培養する細胞培養培地であって、ガストリン、Ｎ２、インスリン、受容体チロシンキナーゼリガンド、及びＲｏｃｋキナーゼ阻害剤を含む、細胞培養培地を提供することである。ガストリンの含有量は、好ましくは０．３ｎＭ～１０ｎＭ、より好ましくは０．３ｎＭ～３ｎＭ、更に好ましくは０．３ｎＭ～１ｎＭである。

【0009】

Ｎ２の細胞培養培地中での体積濃度は１：２５～１：２００の範囲であり、好ましくは、Ｎ２の体積濃度は１：５０～１：１００の範囲である。

【0010】

インスリンの含有量は２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌである。例えば、市販のインスリン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma製）を培養培地に１：５００～１：５０００の希釈率、好ましくは１：１０００～１：２０００の希釈率で加え、代替的には、市販のインスリン含有培養添加剤であるインスリン－トランスフェリン－セレン－エタノールアミン（１ｍｇ／ｍＬのインスリン含有、Gibco製）を培養培地に１：５０～１：５００の希釈率、好ましくは１：１００～１：２００の希釈率で加える。

【0011】

受容体チロシンキナーゼリガンドは、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子ＣＣ、幹細胞因子、インスリン成長因子１、塩基性線維芽細胞成長因子、及び線維芽細胞成長因子１０からなる群から選択される少なくとも１つであり、受容体チロシンキナーゼリガンドは、好ましくは、血小板由来成長因子ＡＡ、幹細胞因子、及び塩基性線維芽細胞成長因子からなる群から選択される１つ以上である。１つ以上の受容体チロシンキナーゼリガンドが含まれる場合に、それぞれの受容体チロシンキナーゼリガンドの含有量は５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。

【0012】

Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ファスジル、及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つである。好ましいＲｏｃｋ阻害剤はＹ２７６３２である。Ｒｏｃｋ阻害剤の含有量は２μＭ～５０μＭ、好ましくは５μＭ～１０μＭである。

【0013】

また、本発明の細胞培養培地は、報告されている初代消化管間質腫瘍細胞用培養培地に必要な血清成分を含まず（非特許文献４、Liu et al., Nat Protoc. 2017, 12(2): 439-451）、それにより線維芽細胞の過剰増殖からの干渉が回避される。

【0014】

本発明の第２の態様は、初代消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法であって、以下の工程：
（１）本発明の細胞培養培地を調製する工程と、
（２）培養容器をコラーゲンでコーティングする工程と、
（３）コーティングされた培養容器において初代消化管間質腫瘍細胞を接種し、本発明の細胞培地を使用することによって細胞を０．１％～２５％の酸素濃度下で培養し、初代消化管間質腫瘍細胞が培養容器の底面積の約８０％～９０％を占める細胞密度まで成長したら細胞を消化して継代培養する工程と、
を含む、培養方法を提供することである。

【0015】

ここで、培養方法において使用されるコラーゲンはラット尾Ｉ型コラーゲンであり、例えば、市販のコラーゲンＩ（Corning製）を使用することができる。より詳細には、コラーゲンを超純水で１：５～１：１００の希釈率、好ましくは１：１０～１：５０の希釈率にて希釈する。

【0016】

コーティング方法は、希釈されたコラーゲンを培養容器へと加えて、その容器の底部を完全に覆い、３０分間以上放置することを含む。

【0017】

初代消化管間質腫瘍細胞は、患者由来の消化管間質腫瘍組織に由来し得る。

【0018】

例えば、上述の組織試料の収集を、患者からの外科的切除又は生検後３０分以内に行う。より詳細には、滅菌環境において、非壊死部位からの組織試料を０．５ｃｍ^３以上の体積で切り取った後に、予冷した１０ｍＬ～５０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に入れ、これを蓋付きのプラスチック製の滅菌遠心分離管内に収容し、氷上で研究室に輸送する。ここで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、５０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）のペニシリン及び５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）のストレプトマイシンを含有する（以下、「輸送液」と呼ぶ）。

【0019】

バイオセーフティキャビネット内で、組織試料を細胞培養皿に移した後に、これを輸送液ですすぎ、組織試料の表面上の血球を洗い流し、組織試料の表面上の皮膚及び筋膜等の不要な組織を取り除く。

【0020】

すすいだ組織試料を別の新しい培養皿に移し、５ｍＬ～２５ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して組織試料を直径１ｍｍ^３未満の組織片に分ける。

【0021】

組織試料片を遠心分離管に移し、これを卓上遠心分離機において１０００ｒｐｍ以上で３分間～１０分間遠心分離し、上清を遠心分離管からピペットで慎重に除去した後に、得られたものをコラゲナーゼＩＩ（０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、例えば１ｍｇ／ｍＬ）及びコラゲナーゼＩＶ（０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、例えば１ｍｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬ～２５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して再懸濁し、３７℃の一定温度のシェーカーにおいて少なくとも３０分間振盪消化を行い（消化時間は試料サイズに依存する；試料が１ｇより大きければ、消化時間を１．５時間～２時間に増やす）、次に、これを卓上遠心分離機において３００ｇ／分以上で３分間～１０分間遠心分離し、上清を廃棄した後に、消化された組織細胞を、例えば１０％ウシ胎児血清を含む５ｍＬ～２５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で再懸濁した後に、破砕して、例えば１００μｍの目開きのセルシーブ（cell sieve）で篩別し、篩別された細胞懸濁液を遠心分離管に収集し、細胞を血球計算盤で計数する。

【0022】

次いで、細胞懸濁液を遠心分離機において３００ｇ／分以上で３分間～１０分間遠心分離し、上清を廃棄した後に、得られたものを本発明の細胞培養培地中に再懸濁し、次いで、コーティングされた培養容器において１×１０^３個の細胞／ｍＬ～１×１０^５個の細胞／ｍＬの密度で接種して培養する。

【0023】

上記培養方法においては、初代消化管間質腫瘍細胞を培養する工程において、０．１％～４％の酸素濃度下で培養することが好ましい。

【0024】

本発明の第３の態様は、消化管間質腫瘍薬の効力を評価する方法又は消化管間質腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、本発明の培養培地及び培養方法を使用して消化管間質腫瘍細胞の増殖した細胞子孫を取得することと、これを薬物の効力評価及びスクリーニングのための方法及び使用、特に、抗腫瘍薬のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力評価及びスクリーニングのための方法及び使用において適用することとを含む、方法を提供する。

【0025】

好ましくは、消化管間質腫瘍薬の効力を評価する方法又は消化管間質腫瘍薬をスクリーニングする方法は、以下の工程：
（１）初代消化管間質腫瘍細胞を取得し、これを本発明の培養培地及び培養方法を使用することによって培養して消化管間質腫瘍細胞を得る工程と、
（２）試験される薬物を必要とされる濃度勾配で準備する工程と、
（３）工程（２）で準備された様々な濃度の薬物を、工程（１）で培養された消化管間質腫瘍細胞へと加える工程と、
（４）細胞生存率を検出する工程と、
を含む。

【0026】

本発明の有益な効果としては、以下が挙げられる。
（１）本発明の培養培地及び培養方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された消化管間質腫瘍細胞は、細胞の由来患者の病理学的表現型及び不均一性を維持することができ、再生医療の分野において適用することができる。
（２）培養された消化管間質腫瘍細胞は線維芽細胞等の細胞により干渉されず、純化された消化管間質腫瘍細胞及びその子孫を得ることができる。
（３）培養培地の組成は血清等の不確実な成分を含まないため、様々なバッチからの血清の質及び量によって影響されない。
（４）本技術は、高い均一性を有する消化管間質腫瘍細胞を提供することができ、これは、管理可能な費用を有し、新しい候補化合物のハイスループットスクリーニング及び患者についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイスループット薬物感受性機能的試験を含む薬効評価及びスクリーニング並びに毒性試験の分野に適している。

【0027】

本実施の形態の細胞培養培地を使用して、ヒト若しくは他の哺乳動物に由来する消化管間質腫瘍細胞、又はこれらの細胞の少なくともいずれかを含む組織を培養して、消化管間質腫瘍細胞の増殖した対応する子孫を得ることができる。

【0028】

また、本実施の形態の培養方法により得られた細胞を、再生医療、毒性試験、消化管間質腫瘍細胞に関する基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、薬物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの代謝安定性及び代謝スペクトルの決定、並びに消化管間質腫瘍を標的とする新薬の開発等に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１Ａおよび図１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代消化管間質腫瘍細胞の増殖に対する培養培地中の様々な濃度のガストリンＩ及びＮ２の効果を示すグラフである。

【図2】図２Ａ～図２Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代消化管間質腫瘍細胞の増殖に対する培養培地中の様々な濃度の様々な受容体チロシンキナーゼリガンドの効果を示すグラフである。

【図3】図３Ａ～図３Ｆは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代消化管間質腫瘍細胞の増殖に対する培養培地中の様々な因子の組合せの効果を示すグラフである。

【図4】図４は、本発明の消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法を使用して、それぞれ臨床的な消化管間質腫瘍患者の３つの組織試料から分離された初代消化管間質腫瘍細胞を１４日間培養することによって得られた初代消化管間質腫瘍細胞の倒立位相差顕微鏡下での写真（１００倍の倍率）を示す図である。

【図5】図５は臨床的な消化管間質腫瘍患者の同じ組織試料から分離された初代消化管間質腫瘍細胞を培養することによって得られ、その培養をそれぞれコラーゲンＩでコーティングされた様式及び非コーティング様式で、本発明の消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法及び初代消化管間質腫瘍細胞の培養について報告された２つの培養方法を使用して８日間並行して行った消化管間質腫瘍細胞の倒立位相差顕微鏡下での写真（１００倍の倍率）を示す図である。

【図6】図６Ａは、消化管間質腫瘍の臨床的な組織試料から分離された初代消化管間質腫瘍細胞を培養することによって得られ、その培養をそれぞれ本発明の消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法及び消化管間質腫瘍細胞の培養について報告された２つの培養方法を使用して１４日間並行して行った消化管間質腫瘍細胞に対して実施された消化管間質腫瘍細胞及び線維芽細胞の特異的バイオマーカーの免疫蛍光染色の結果（１００倍の顕微鏡下）を示す図である。ここで、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をポジティブコントロールとして使用した。図６Ｂは、上述の３つの異なる培養方法から得られた細胞を染色した後の、ＣＫＩＴ陽性の標識細胞及びＣＫＩＴ陰性の標識細胞の数の統計分析の結果を示す図である。

【図7】図７は、本発明の消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法を使用して、消化管間質腫瘍の臨床的な組織試料から分離された初代消化管間質腫瘍細胞を３０日間連続培養することによって得られた細胞成長曲線を示す図である。

【図8】図８は、消化管間質腫瘍の３つの外科的切除試料と、対応する試料に由来する初代消化管間質腫瘍細胞を本発明の消化管間質腫瘍細胞を培養する培養方法を使用して培養することによって得られた消化管間質腫瘍細胞との間の遺伝子突然変異一致性分析の結果を示す図である。

【図9】図９Ａおよび図９Ｂは、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を使用して培養された消化管間質腫瘍細胞に対する様々な標的薬の用量－応答曲線を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0030】

［実施例１］
ヒト初代消化管間質腫瘍細胞の分離及び消化管間質腫瘍細胞用の培養培地の最適化
（１）ヒト初代消化管間質腫瘍細胞の分離
試料の輸送及び洗浄用に、市販のペニシリン－ストレプトマイシン二重抗体溶液（Corning Inc.製、１００００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Corning製）に２％の体積比で加え、これを以下で「輸送液」と呼ぶ。

【0031】

インフォームドコンセントを受けた消化管間質腫瘍を患う４名の患者から外科的に取り除かれた癌組織試料から、消化管間質腫瘍の組織試料、すなわちＧＩＳＴ－１、ＧＩＳＴ－２、ＧＩＳＴ－３、及びＧＩＳＴ－４を取得した。試料のうちの１つ（ＧＩＳＴ－１）を以下に例示する。上述の組織試料を患者からの外科的切除後３０分以内に収集した。より詳細には、滅菌環境において、非壊死領域からの組織試料を０．５ｃｍ^３以上の体積で採取し、予冷した輸送液中に入れた後に、これを氷上で研究室に輸送した。

【0032】

バイオセーフティキャビネット内で、組織試料（ＧＩＳＴ－１）を１００ｍｍの細胞培養皿に移し、輸送液ですすいだ。組織試料の表面上の血球を洗い流し、組織試料の表面上の皮膚及び筋膜等の不所望な組織を除去した。

【0033】

すすいだ組織試料を別の新しい１００ｍｍの培養皿に移し、そこに１０ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して組織試料を直径１ｍｍ^３未満の組織片に分けた。

【0034】

組織試料片を５０ｍＬの遠心分離管に移し、卓上遠心分離機を使用して１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を遠心分離管からピペットで慎重に取り除いた後に、得られたものをコラゲナーゼＩＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Sigma製）及びコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍＬ）（Sigma製）を含む１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、これを３７℃の一定温度を有するシェーカー上に置き、３０分間～９０分間振盪消化し、次いで、卓上遠心分離機において３５０ｇ／分で５分間遠心分離し、上清を廃棄した後に、消化された組織細胞を１０％のウシ胎児血清（Gibco製）を含む１０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、次いで、得られたものを粉砕し、１００μｍの目開きのセルシーブで篩別し、篩別した細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心分離管において収集し、細胞を血球計算盤で計数した。

【0035】

次いで、細胞懸濁液を遠心分離機において３５０ｇ／分で５分間遠心分離し、上清を廃棄した後に、得られたものを初代消化管間質腫瘍細胞用の以下に記載される培養培地中に再懸濁した。

【0036】

他の３つの消化管間質腫瘍組織試料を上記と同じ方法を使用して分離した。

【0037】

（２）細胞培養プレートのコーティング
ラット尾Ｉ型コラーゲン（Corning Inc.製のＩ型コラーゲン）を超純水で１：５０の比率にて希釈して、コラーゲン希釈液を調製した。コラーゲン希釈液を２４ウェルの培養プレートへと１ウェル当たり５００μｌで加え、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。３７℃のインキュベーター内で１時間放置した後に、コラーゲン希釈液を除去して、コラーゲンでコーティングされた培養プレートを得た。

【0038】

（３）初代消化管間質腫瘍細胞用の培養培地に加えられた因子のスクリーニング
最初に、基本培地を調製した。市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Thermo Fisher SCIENTIFIC製）を１：１００の希釈率で加え、インスリン含有培養添加剤のインスリン－トランスフェリン－セレン－エタノールアミン（ＩＴＳ－Ｘ、Gibco製）を１：１００の希釈率で加え、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤のＹ２７６３２（Sigma製）を１０μＭの最終濃度で加え、市販のＰｒｉｍｏｃｉｎ溶液（InvivoGen製）（５０ｍｇ／ｍｌの濃度の市販品）を１：５００の希釈率で加えて、基本培地を得た。

【0039】

次に、基本培地に様々な種類の添加剤（表１）を加えて、様々な成分を含む消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を調製した。様々な成分を含む培養培地を、培地配合物につき３つのウェルで、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。本実施例のセクション（１）においてＧＩＳＴ組織から分離したＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－１）を、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルの培養プレートにおいて１ウェル当たり３×１０^４個の細胞密度で接種し、様々な培地配合物下で３７℃にて５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。培地は培養開始後３日ごとに交換した。１４日間の培養後に、細胞計数を行った。実験コントロールとして、表１に示される追加の因子を一切含まない基本培地を使用した。

【0040】

他の３つの消化管間質腫瘍組織試料から分離された腫瘍細胞も上記と同様に培養し、計数した。

【0041】

統計結果を表１に示す。

【0042】

【表1】

【0043】

ここで、「＋」は、基本培地と比較して、添加剤（複数の場合もある）が加えられた培地が、少なくとも３例において消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞の増殖を促進する効果を有することを示し、ここで、「＋」の数は促進効果の程度を示す。「－」は、添加剤（複数の場合もある）が加えられた培地が、少なくとも２例において消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞の増殖を阻害する効果を有することを示す。「○」は、少なくとも３例において、添加剤（複数の場合もある）が加えられた培地が消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞の増殖に対して有意な効果を有しないことを示す。これらの結果により、Ｎ２、血小板由来成長因子ＡＡ～血小板由来成長因子ＣＣ、幹細胞因子、インスリン成長因子１、塩基性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子１０、及びガストリンが、少なくとも３例において消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞の増殖を促進することができ、中でも、Ｎ２、血小板由来成長因子ＡＡ、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子、及びガストリンがより強力な効果を有することが明らかになった。

【0044】

（４）初代消化管間質腫瘍細胞用の培養培地に加えられた因子の濃度の最適化
基本培地にガストリンＩ（Anaspec製）を加えて、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭの最終濃度でガストリンＩを含む消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を調製し、これらを、各濃度で３つのウェルにて、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。本実施例のセクション（１）において消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞（ＧＩＳＴ－１）を、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルの培養プレートにおいて１ウェル当たり３×１０^４個の細胞密度で接種し、様々な濃度のガストリンＩを含む培地配合物下で３７℃にて５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。培地は培養開始後に３日ごとに交換した。１４日間の培養後に、細胞計数を行った。０ｎＭのガストリンＩ濃度を有する基本培地を実験コントロールとして使用した。結果を図１Ａに示す。

【0045】

Ｎ２添加剤（Thermo Fisher製）を基本培地へと１：２００、１：１００、１：５０の希釈率で加えて、様々な濃度のＮ２を有する消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を調製した。様々な培地配合物を、各濃度で３つのウェルにて、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。初代細胞の培養及び計数を上記と同様に行った。０のＮ２濃度を有する基本培地を実験コントロールとして使用した。結果を図１Ｂに示す。

【0046】

次いで、１：１００希釈されたＮ２及び１ｎＭのガストリンを基本培地へと加えて、基本培地２を調製した。基本培地２において、幹細胞因子（ＳＣＦ、R&D製）を加えて、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有するＳＣＦを含有する消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を調製した。様々な濃度のＳＣＦを含有する培養培地を、各濃度で３つのウェルにて、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。本実施例のセクション（１）において消化管間質腫瘍組織から分離された初代消化管間質腫瘍細胞（ＧＩＳＴ－１）を、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルの培養プレートにおいて１ウェル当たり４×１０^４個の細胞密度で接種し、様々な濃度のＳＣＦを含む培地配合物下で３７℃にて５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。様々な培地配合物を用いて培養された初代ＧＩＳＴ細胞に対して、３日目、７日目、及び１２日目に細胞計数を行った。結果を図２Ａに示す。

【0047】

同様に、様々な濃度の血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦＡＡ、R&D製）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、R&D製）を含む消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を、基本培地２を使用して、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で調製した。初代細胞の培養及び計数を上記と同様に行った。結果を図２Ｂ及び図２Ｃに示す。

【0048】

これらの結果により、様々な濃度の受容体チロシンキナーゼリガンドのＳＣＦ、ｂＦＧＦ、及びＰＤＧＦＡＡを基本培地２に加えると、初代ＧＩＳＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に対して時間依存的かつ用量依存的な増殖効果を有することが明らかになった。

【0049】

（５）初代消化管間質腫瘍細胞用の培養培地に加えられた様々な濃度での各因子の増殖効果に関する研究
以下の６つの異なる培地配合物を更に調製した：
１．基本培地（以下、ＢＭと呼ぶ）：実施例１のセクション（３）で調製された基本培地、
２．配合物２：１：１００希釈されたＮ２、１ｎＭのガストリン、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ、及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがそれぞれ加えられた基本培地、
３．配合物３：１：１００希釈されたＮ２、１ｎＭのガストリン、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ、及び５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦがそれぞれ加えられた基本培地、
４．配合物４：１：１００希釈されたＮ２、１ｎＭのガストリン、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがそれぞれ加えられた基本培地、
５．配合物５：１：１００希釈されたＮ２、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがそれぞれ加えられた基本培地、
６．配合物６：１ｎＭのガストリン、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがそれぞれ加えられた基本培地、
７．完全培地（以下、ＣＭと呼ぶ）：１：１００希釈されたＮ２、１ｎＭのガストリン、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがそれぞれ加えられた基本培地。

【0050】

最初に、初代ＧＩＳＴ細胞に対する基本培地及び完全培地のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖効果を比較した。基本培地及び完全培地を、各群２つのウェルで、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。

【0051】

実施例１のセクション（１）の方法に従って、消化管間質腫瘍組織から分離したＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）を、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルの培養プレートにおいて１ウェル当たり４×１０^４個の細胞の細胞密度で接種し、２つの異なる培地配合物を用いて３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。培養の１０日目に、異なる培地配合物下でのＧＩＳＴ細胞に対して細胞計数を行った。基本培地を使用して培養されたＧＩＳＴ細胞の数が１００％であった。結果を図３Ａに示す。これらの結果により、完全培地を使用すると、基本培地を使用した場合と比較して、わずか１０日間で細胞数がおよそ７０％増加することが明らかになった。

【0052】

次に、配合物２に基づいて、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを加えて、様々な濃度のＳＣＦの増殖促進効果を研究した。様々な濃度のＳＣＦを含む配合物２の培地を、各濃度で２連のウェルにて、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルのプレートに１ウェル当たり５００μｌの容量で加えた。本実施例のセクション（１）と同じ方法に従って、ＧＩＳＴ－２を、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルの培養プレートにおいて１ウェル当たり４×１０^４個の細胞の細胞密度で接種し、様々な濃度のＳＣＦを含む配合物を用いて３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。１０日目まで培養した後に、様々な培地配合物下での消化管間質腫瘍細胞を計数した。配合物２の培地を使用して培養された消化管間質腫瘍細胞の数が１００％であった。結果を図３Ｂに示す。

【0053】

これらの結果により、配合物２の培地を使用した場合と比較して、ＳＣＦを加えると細胞増殖が効果的に促進されることが明らかになり、ここで、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ濃度では、細胞数は、１０日間の培養後に、配合物２の培地を使用した場合と比較して約２５％増加することができた。

【0054】

同様に、上記の配合物２と同じ工程に従って、配合物３に基づいて、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを加えて、様々な濃度のｂＦＧＦの増殖促進効果を研究した。結果を図３Ｃに示す。これらの結果により、配合物３の培地を使用した場合と比較して、ｂＦＧＦを加えると細胞増殖が効果的に促進されることが明らかになり、ここで、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ濃度では、細胞数は、１０日間の培養後に、配合物３の培地を使用した場合と比較して約１７％増加することができた。

【0055】

同様に、上記の配合物２と同じ工程に従って、配合物４に基づいて、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡを加えて、様々な濃度のＰＤＧＦＡＡの増殖促進効果を研究した。結果を図３Ｄに示す。これらの結果により、配合物４の培地を使用した場合と比較して、ＰＤＧＦＡＡを加えると細胞増殖が効果的に促進されることが明らかになり、ここで、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ濃度では、細胞数は、１０日間の培養後に、配合物４の培地を使用した場合と比較して約１３％増加することができた。

【0056】

同様に、上記の配合物２と同じ工程に従って、配合物５に基づいて、それぞれ０．３ｎＭ、１ｎＭ、及び３ｎＭのガストリンＩを加えて、様々な濃度のガストリンＩの増殖促進効果を研究した。結果を図３Ｅに示す。これらの結果により、配合物５の培地を使用した場合と比較して、ガストリンＩを加えると細胞増殖が効果的に促進され得ることが明らかになり、ここで、１ｎＭのガストリンＩの濃度では、細胞数は、１０日間の培養後に、配合物５の培地を使用した場合と比較して約８％増加することができた。

【0057】

同様に、上記の配合物２と同じ工程に従って、配合物６に基づいて、それぞれ１：２００、１：１００、及び１：５０で希釈されたＮ２を加えて、様々な濃度のＮ２の増殖促進効果を研究した。結果を図３Ｆに示す。これらの結果により、配合物６の培地を使用した場合と比較して、Ｎ２を加えると細胞増殖が効果的に促進されることが明らかになり、ここで、１：１００の希釈率でＮ２を加えると、細胞数は、１０日間の培養後に、配合物６の培地を使用した場合と比較して約８％増加することができた。

【0058】

［実施例２］
ヒト初代ＧＩＳＴ細胞の培養及び既存の培養方法との比較
（１）ヒト消化管間質腫瘍組織由来の初代ＧＩＳＴ細胞の培養
実施例１のセクション（１）と同じ方法を使用して、初代ＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－１、ＧＩＳＴ－２、ＧＩＳＴ－３）を、消化管間質腫瘍を患う３名の患者の癌組織からそれぞれ分離した。次に、分離したＧＩＳＴ細胞を、血球計算盤を使用して計数した後に、コラーゲンＩ（Corning製）でコーティングされた１２ウェルのプレートにおいて１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の細胞密度で接種した。ここで、コーティング方法は以下の通りである：コラーゲンＩを超純水で１：５０の比率にて希釈することによって、コラーゲンＩをコラーゲン希釈液へと調製し、１２ウェルの培養プレートへと１ウェル当たり１ｍｌのコラーゲン希釈液を加えて、プレートのウェルの底部を完全に覆い、３７℃のインキュベーター内で１時間放置した後に、コラーゲン希釈液を除去して、コラーゲンでコーティングされた培養プレートを得た。

【0059】

実施例１のセクション（５）に従って調製された完全培地（ＣＭ）を１２ウェルのプレートへと１ウェル当たり２ｍＬで加え、３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度において培養した。培地は培養開始後に３日ごとに交換した。

【0060】

図４は、１４日目まで培養した細胞の１００倍の位相差顕微鏡下での写真である。

【0061】

（２）初代消化管間質腫瘍細胞用の既存の培養培地の調製
コントロールとして、細胞のコンディショナルリプログラミング技術用の培養培地（以下、「Ｆ培地」とも呼ぶ）を調製した。調製手順は（非特許文献２）が参照され、培地配合物を表２に示す。

【0062】

【表2】

【0063】

別のコントロールとして、文献において報告されている初代消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を調製した。調製及び培養の具体的な工程については、非特許文献４を参照のこと。培養培地の配合は以下の通りであった：２０％の仔ウシ血清をＲＰＭＩ １６４０（Corning製）に加え、続いて市販のペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Corning製）を１％の体積比で加え、最後にＳＣＦを１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。以下、「既知の配合物１」と呼ぶ。

【0064】

（３）消化管間質腫瘍細胞用の様々な培養技術の比較
本発明の培養培地及び培養方法並びに既存の２つの培養培地及び培養方法の培養効果を調べるために、実施例１のセクション（１）と同じ方法を使用して、消化管間質腫瘍を患う患者の癌組織から初代ＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）を分離し、ＧＩＳＴ－２を、以下の３つの培養条件を並行して使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。

【0065】

Ａ．本発明の技術：初代ＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）を、コラーゲンＩ（Corning製）のコーティングを有する又は有しない１２ウェルのプレートにおいて、それぞれ１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の接種密度で接種し、実施例１のセクション（５）で調製された１ウェル当たり２ｍＬの完全培地ＣＭを用いて３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度下においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。

【0066】

Ｂ．細胞のコンディショナルリプログラミング技術：初代ＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）を、コラーゲンＩ（Corning製）のコーティングを有する又は有しない１２ウェルのプレートにおいて、それぞれ１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の接種密度で接種し、１ウェル当たり２ｍＬのＦ培地を用いて３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２％の酸素濃度下においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。

【0067】

Ｃ．別の報告された技術：初代ＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）を、コラーゲンＩ（Corning製）のコーティングを有する又は有しない１２ウェルのプレートにおいて、それぞれ１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の接種密度で接種し、１ウェル当たり２ｍＬの「既知の配合物１」を用いて３７℃で５％のＣＯ_２濃度及び２０％の酸素濃度下においてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。

【0068】

図５は、様々な培養条件下で８日目まで培養したＧＩＳＴ－２細胞の１００倍の位相差顕微鏡下で撮影された細胞写真である。

【0069】

図５によれば、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地及び培養方法を使用することによって、消化管間質腫瘍組織由来の初代ＧＩＳＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に培養することができることが分かる。さらに、本発明のＧＩＳＴ培養培地を使用する場合に、コラーゲンＩでコーティングされた培養プレートは、コラーゲンＩでコーティングされていない培養プレートよりも良好な増殖効率を生じ得る。

【0070】

また、図５に示されるように、本発明の培養培地及び培養方法と比較して、既知の配合物１を用いて培養されたＧＩＳＴ細胞はより少なく、細胞断片がより多く、コラーゲンＩのコーティングを有しない場合の培養効果は、コーティング処理を施した場合よりも乏しい。Ｆ培地を用いて培養されたＧＩＳＴ細胞も本発明の培養方法を使用して培養されたＧＩＳＴ細胞よりも少なく、顕微鏡下では太い形状を有し、輪郭が不明瞭な線維芽細胞を多数認めることができることから、培養された細胞は大きな割合の線維芽細胞を含むことが示され、コラーゲンＩによるコーティング処理の有無にかかわらず、Ｆ培地の培養効果に明らかな違いはない。

【0071】

［実施例３］
消化管間質腫瘍細胞用の免疫マーカーの特定
（１）実施例１のセクション（５）における完全培地ＣＭ、実施例２のセクション（２）における消化管間質腫瘍細胞用の培養培地のＦ培地及び既知の配合物１を使用した。
（２）消化管間質腫瘍を患う患者の臨床的な外科的切除試料から、大豆粒ほどのサイズの癌組織を採取した。実施例１のセクション（１）と同じ方法を使用して、初代消化管間質腫瘍細胞（ＧＩＳＴ－１）を分離し、実施例２のセクション（３）における培養方法Ａ、培養方法Ｂ、及び培養方法Ｃをそれぞれ使用して初代消化管間質腫瘍細胞（ＧＩＳＴ－１）を培養した。
（３）免疫蛍光を使用して、ヒト消化管間質腫瘍細胞上の重要な癌関連バイオマーカーの発現を検出した。

【0072】

本実験において使用される一次抗体はＣＫＩＴ（ＣＤ１１７）（Cell Signaling Technology製）及びα－ＳＭＡ（Cell Signaling Technology製）であった。二次抗体の抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート）（Cell Signaling Technology製）をＣＫＩＴ（ＣＤ１１７）の標的化に使用し、二次抗体の抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４コンジュゲート）（Cell Signaling Technology製）をα－ＳＭＡの標的化に使用した。ここで、ＣＫＩＴは消化管間質腫瘍についての重要なバイオマーカーであり、線維芽細胞はＣＫＩＴタンパク質を発現しない。臨床診療においては、ＣＫＩＴは一般に消化管間質腫瘍の鑑別診断に使用される。α－ＳＭＡは線維芽細胞についての重要なバイオマーカーとして認識されている。

【0073】

詳細には、ＧＩＳＴ細胞が培養プレートの底面積の約８０％を占めたら、当初の１２ウェルのプレートの培地上清を廃棄し、１ｍＬの０．０５％のトリプシン（Thermo Fisher製）を加えて細胞を消化し、３７℃で１５分間インキュベートした後に、消化された細胞を１０％（体積／体積）の仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、次いで遠心分離管中に収集し、３００ｇ／分で５分間遠心分離した。遠心分離後の各群の細胞沈殿物を、それぞれ本発明の完全培地ＣＭ、Ｆ培地、及び既知の配合物１を使用して再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞懸濁液中の細胞を計数した。コラーゲンＩでコーティングされたカバーガラス上に、カバーガラス当たり４×１０^４個の細胞の密度で細胞を接種し、コーティング方法は実施例１のセクション（２）と同じであり、各群の細胞を、それぞれ本発明の完全培地ＣＭ、Ｆ培地、及び既知の配合物１を使用して培養して、カバーガラス上で細胞を成長させた。

【0074】

１４日間培養した後に、細胞をＰＢＳバッファーで２回すすぎ、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで１％のＢＳＡ（Shanghai Sangon Biotech製）及び１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）とともに室温で１時間インキュベートした。細胞をＴＢＳＴバッファーで３回、各回につき３分間すすいだ。ＴＢＳＴバッファーを除去した後に、５０μＬの一次抗体の希釈液（１：２０００倍希釈されたＣＫＩＴ抗体）をスライド上に滴下し、得られたものを４℃で１２時間～１６時間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回、各回につき３分間すすぎ、二次抗体の抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４コンジュゲート）（８μｇ／ｍｌ）をスライド上に滴下し、得られたものを室温で６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回、各回につき３分間すすいだ。次に、二次抗体の抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４コンジュゲート）（８μｇ／ｍｌ）をスライド上に滴下し、得られたものを室温で６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回、各回につき３分間すすいだ。１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ色素（Sigma製）を使用して、細胞を１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回すすいだ。カバーガラスを１滴の封入剤（Thermo Fisher Scientific製）で封入した後に、得られたものを１００倍の蛍光顕微鏡下で写真撮影した。

【0075】

また、ポジティブコントロールとして、承認された消化管間質腫瘍細胞系統ＧＩＳＴ－Ｔ１（ATCCから購入）を使用した。初代細胞を１３日目まで培養したら、８×１０^４個のＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をカバーガラス上に置き、細胞をカバーガラス上で２４時間成長させた。これらの細胞を、様々な方法により培養された上述のＧＩＳＴ－１と同様にして免疫蛍光染色に供し、写真撮影した。

【0076】

結果を図６Ａに示す。

【0077】

図６Ａによれば、消化管間質腫瘍細胞系統ＧＩＳＴ－Ｔ１は、ＧＩＳＴ細胞に特異的なバイオマーカーであるＣＫＩＴタンパク質を高度に発現するが、α－ＳＭＡタンパク質を発現せず、本発明の培養培地及び培養方法を用いて培養された細胞も、ＧＩＳＴ細胞に特異的なバイオマーカーであるＣＫＩＴタンパク質を高度に発現し、α－ＳＭＡタンパク質を発現しない。一方で、同じ試料に由来し、Ｆ培地又は既知の配合物１を用いて培養された初代ＧＩＳＴ細胞は、ＣＫＩＴタンパク質を殆ど発現せず、その大部分は線維芽細胞に特異的なバイオマーカーであるα－ＳＭＡタンパク質のみを発現し、これらの細胞はシート状かつ筋肉繊維状の形態であったことから、これらの２つの培養技術はＧＩＳＴ細胞を効率的に培養することができず、培養された細胞の大部分が線維芽細胞であり、これは本発明の培養培地の培養効果を実現することができないことを示している。

【0078】

図６Ｂは、上述の３つの異なる培養方法によって得られた細胞を染色した後の、ＣＫＩＴ陽性の標識細胞及びＣＫＩＴ陰性の標識細胞を顕微鏡下で計数することによるデータ分析結果を示す。この結果は、顕微鏡写真の観察下での３つの無作為な視野の計数統計である。

【0079】

図６Ａ及び図６Ｂから、報告された２つの培養技術と比較して、本発明の技術は、患者由来の初代ＧＩＳＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的な増殖を実現し、培養された細胞は線維芽細胞の干渉によって影響されないことを確認することができる。

【0080】

［実施例４］
初代ＧＩＳＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの連続培養
実施例２のセクション（１）と同じ方法に従って、実施例１のセクション（５）における完全培地ＣＭを使用してＧＩＳＴ－３細胞を連続培養した。

【0081】

本発明の条件下で培養された細胞については、培養培地を３日ごとに交換した。

【0082】

ＧＩＳＴ細胞が培養プレートにおける底面積の約８０％を覆うまで成長したら、当初の１２ウェルのプレート中の培地上清を廃棄した。１ｍＬの０．０５％トリプシン（Thermo Fisher：２５３０００６２）を加えて細胞を消化し、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。細胞が完全に消化された後に、消化された細胞を１０％（体積／体積）の仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、次いで遠心分離管中に収集し、３５０ｇ／分で５分間遠心分離した。遠心分離後の細胞沈殿物を、完全培地ＣＭを使用して再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞懸濁液中の細胞を計数した。コラーゲンＩでコーティングされた別の１２ウェルの培養プレートへと１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の細胞密度で細胞を接種して、更に培養した。

【0083】

継代培養された細胞の成長が再び培養プレートにおける底面積の約８０％に達したら、培養された細胞を上述の操作方法に従って再度消化し、収集し、そして計数した。再び１ウェル当たり５×１０^４個の細胞の密度で細胞を接種して、更に培養した。

【0084】

以下は、様々な培養条件下での初代消化管間質腫瘍細胞上皮細胞の細胞集団の倍加数を計算する式である：
細胞集団の倍加数＝［ｌｏｇ（Ｎ／Ｘ_０）］／ｌｏｇ２
（式中、Ｎは継代する細胞数であり、Ｘ_０は最初の接種時の細胞数である）（Greenwood et al., Environ Mol Mutagen 2004, 43(1): 36-44を参照）。

【0085】

図７は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアによって描画された本発明の培養条件下での１例の消化管間質腫瘍細胞の成長曲線であり、これは横軸として培養日数を取り、縦軸として細胞集団の倍加数を取っている。図７から、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地によって培養されたＧＩＳＴ細胞が、少なくとも３０日間連続的に増殖し得ることを確認することができる。また、既存のＦ培地及び既知の配合物１を使用して初代ＧＩＳＴ細胞を培養した場合に、実施例３の結果によれば、純化されたＧＩＳＴ細胞を培養することができず、培養された細胞は多数の線維芽細胞によって干渉された。したがって、初代ＧＩＳＴ細胞に対する既存のＦ培地及び既知の配合物１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの持続的な増殖効果を調査することができない。

【0086】

［実施例５］
初代ＧＩＳＴ細胞の遺伝子突然変異一致性の分析
実施例２のセクション（１）と同じ方法に従って、初代ＧＩＳＴ細胞、ＧＩＳＴ－１、ＧＩＳＴ－２、及びＧＩＳＴ－３を、それぞれ実施例１のセクション（５）における完全培地ＣＭを使用して培養した。

【0087】

培養２０日目に、消化管間質腫瘍細胞を収集し、細胞のゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（DNeasy blood & tissue kit）（QIAGEN製）を使用して抽出した。また、細胞の起源に対応する患者の消化管間質腫瘍組織を収集し、細胞のゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（QIAGEN）を使用して抽出した。細胞を提供した患者から２ｍＬの末梢血を収集し、ＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（QIAGEN）を使用してバックグラウンドコントロールとして血中ゲノムＤＮＡを抽出した。

【0088】

引き続き、細胞及び組織試料のゲノムＤＮＡに対して全エクソームシーケンシングを行い（詳細な手順については、Hans Clevers et al., Cell, 11; 172(1-2): 373-386, 2018を参照）、シーケンシング結果を、ＭｕＳｉＣソフトウェアを使用して腫瘍の高頻度突然変異について分析した。ＭｕＳｉＣは、対応する患者の末梢血における遺伝子突然変異をバックグラウンドとして解釈して、遺伝子上の各突然変異型について統計的検定を行い、バックグラウンドよりも有意に高い突然変異率を有する遺伝子を検出した。分析結果は、https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlで入手可能なソフトウェアを使用して生成された。分析結果を図８に示す。

【0089】

図８における腫瘍の高頻度突然変異の分析結果は、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を使用して培養されたＧＩＳＴ細胞と、消化管間質腫瘍の元の組織との間の高頻度突然変異遺伝子が基本的に一致することを示している。すなわち、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を使用して培養されたＧＩＳＴ細胞は、患者の癌組織の当初の遺伝子突然変異特徴を維持することができる。

【0090】

［実施例６］
ＧＩＳＴ細胞の薬物感受性試験
消化管間質腫瘍を患う患者からの外科的切除試料を例に取ると、患者由来の消化管間質腫瘍組織試料から培養されたＧＩＳＴ細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験し得ることが実証される。

【0091】

１．初代ＧＩＳＴ細胞の播種：実施例２のセクション（１）に記載される方法によって実施例１のセクション（５）における完全培地ＣＭを使用することによって培養されたＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－１及びＧＩＳＴ－２）を、３８４ウェルのプレートへと１ウェル当たり３０００個～５０００個の細胞の密度で接種し、細胞を一晩付着させた。

【0092】

２．薬物勾配実験：
（１）薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した：１０μＬの試験される薬物ストック溶液（薬物ストック溶液の濃度は、人体における薬物の最大血中濃度Ｃｍａｘの２倍に基づいて決定された）をそれぞれ取り、２０μＬのＤＭＳＯを含む０．５ｍＬのＥＰチューブに加え、上記のＥＰチューブからの１０μＬの溶液を、２０μＬのＤＭＳＯを入れた２つ目の０．５ｍＬのＥＰチューブへとピペットで移した。つまり、薬物を１：３の比率で希釈した。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる６個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を３８４ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のＤＭＳＯを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。本実施例において、試験される薬物は、消化管間質腫瘍の治療剤として臨床的に承認されたイマチニブ（MCE製）、スニチニブ（MCE製）、レゴラフェニブ（MCE製）であった。

【0093】

（２）高スループット自動ワークステーション（Perkin Elmerから購入）を使用して、３８４ウェルの薬物貯蔵プレートにおける様々な濃度の薬物及び溶剤コントロールを、消化管間質腫瘍細胞が播種された３８４ウェルの細胞培養プレートに加えた。薬物群及び溶剤コントロール群を、それぞれ３つの反復実験ウェルで配置した。各ウェルに加えた薬物の容量は１００ｎＬであった。

【0094】

（３）細胞生存率の試験：投与７２時間後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイキット（Promega製）を使用して、薬物投与後に培養細胞の化学発光値を検出した。化学発光値の大きさは、細胞生存率及び細胞生存率に対する薬物の効果を反映している。調製されたＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出液を各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーを使用して、混合後に化学発光値を検出した。

【0095】

Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを使用してグラフを作成し、半阻害濃度ＩＣ_５０を計算した。

【0096】

（４）薬物感受性試験の結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。

【0097】

図９Ａ及び図９Ｂはそれぞれ、２名の異なるＧＩＳＴ患者の外科的切除癌組織試料から培養されたＧＩＳＴ細胞の、３つの標的薬のイマチニブ、スニチニブ、レゴラフェニブに対する薬物感受性を示している。これらの結果は、同じ患者からの細胞が異なる薬物に対して異なる感受性を有し、異なる患者からの細胞も同じ薬物に対して異なる感受性を有することを示している。

【0098】

詳細には、ＣＫＩＴ野生型ＧＩＳＴ患者に由来するＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－１）は、ＣＫＩＴ突然変異ＧＩＳＴ患者を標的化する標的薬のイマチニブに対してより低い感受性を有し、８．４２μＭの半阻害濃度を有するが、多重標的阻害剤のスニチニブに対する感受性は比較的高く、２．６５μＭの半阻害濃度を有していた。ＣＫＩＴ突然変異を有するＧＩＳＴ患者に由来するＧＩＳＴ細胞（ＧＩＳＴ－２）の試験結果により、標的薬のイマチニブに対する感受性が良好であり、２．５９μＭの半阻害濃度を有し、レゴラフェニブに対する感受性がより良好であり、０．６３μＭの半阻害濃度を有することが明らかになった。

【0099】

本実施例の結果によれば、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地を使用して培養されたＧＩＳＴ細胞の標的薬に対する感受性試験の結果が患者の臨床病理学的タイピングと一致することを確認することができる。したがって、本発明の消化管間質腫瘍細胞用の培養培地は、ＧＩＳＴ患者の臨床的薬効の予測における使用可能性を有する。

【0100】

本発明を一般的な説明及び特定の実施形態により上記で詳細に記載してきたが、本発明に基づいて、幾つかの変更又は改善を行うことができ、これらは当業者には明らかである。したがって、本発明の趣旨から逸脱せずに行われたこれらの変更又は改善は、本発明の保護範囲内にあるべきである。

【産業上の利用可能性】

【0101】

本発明は、初代ＧＩＳＴ細胞を培養する細胞培養培地、及びこの培養培地を使用して初代ＧＩＳＴ細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の細胞培養培地及び培養方法を使用して、高い成功率、簡便な操作で、線維芽細胞等の非ＧＩＳＴ細胞の干渉を受けずにＧＩＳＴ細胞を培養することができ、これらを使用して初代ＧＩＳＴ細胞モデルを構築し、ＧＩＳＴ患者自身の生物学的特徴を有するＧＩＳＴ細胞を得ることができるため、薬物の薬効評価又はスクリーニングにおいて使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】