特表 2024-502783 コロナウイルスワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-23

(54)【発明の名称】コロナウイルスワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20240116BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240116BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240116BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240116BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240116BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

A61P31/14 ZNA

A61P37/04

A61K39/215

A61K39/39

A61K9/12

A61K9/08

A61K39/395 S

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/165

C12N15/13

C12N15/50

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539020

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2023-08-22

(86)【国際出願番号】 AU2021051553

(87)【国際公開番号】W WO2022133547

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】2020904820

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2021903911

(32)【優先日】2021-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504348389

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティー オブ メルボルン

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＥＬＢＯＵＲＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ゴドフリー デール イアン

(72)【発明者】

【氏名】ジャクソン デイビッド チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ジェラルディン ニコラス アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】デリヤニス ジョージア

(72)【発明者】

【氏名】パーセル ダミアン フランシス ジョン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA24

4C076AA25

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB25

4C076BB27

4C076CC35

4C076EE59

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA71

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4C085EE01

4C085FF01

4C085FF11

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、キメラタンパク質及び融合タンパク質及びそれらの組成物、並びにコロナウイルス感染症、又はコロナウイルス感染症に関連する呼吸器疾患又は病状の予防及び／又は治療における、このようなタンパク質及び組成物の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質及びアジュバントを含んでなる組成物であって、
前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、抗体のＦｃ領域に連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなり、又は
前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、Ｆｃ受容体結合ドメインを含んでなるポリペプチドに連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなる、組成物。

【請求項2】

前記受容体結合ドメインが、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、又は表３で定義される任意のその他の株由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記受容体結合ドメインが、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記受容体結合ドメインが、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項5】

前記受容体結合ドメインが、Ｎ３３４～Ｐ５２７（全長スパイクタンパク質に基づく番号付け）由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記受容体結合ドメインが、Ｎ３３４～Ｐ５２７（全長スパイクタンパク質に基づく番号付け）由来のアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の前記受容体結合ドメインが、配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列、又は配列番号１５又は２８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記アミノ酸配列が、図６又は７、又は表３に示される変異の１つ又は複数を含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の前記受容体結合ドメインが、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）、好ましくは０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物であって、前記アミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）が、Ｎ末端及び／又はＣ末端に配置される、組成物。

【請求項10】

前記抗体のＦｃ領域がＩｇＧのＦｃ領域である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＩｇＧがヒトである、請求項１０又は１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記キメラタンパク質又は融合タンパク質のＦｃ領域が、２つの重鎖断片、より好ましくは前記重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

抗体のＦｃ領域が、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１６又は１８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

抗体のＦｃ領域が、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）、好ましくは０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、配列番号２、３、５、６、２２又は２３に記載されるいずれか１つの配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記アジュバントが、ＴＬＲ２－作動薬、より好ましくはＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓなどの分子を含有するＰａｍ－２－Ｃｙｓ、又はＮＫＴ細胞の刺激因子、より好ましくはα－ガラクトシルセラミド（本明細書では「α－ＧａｌＣｅｒ」とも称される）、α－グルコシルセラミド、β－マンノシルセラミド、及びそれらの類似体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記アジュバントが、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ、ＭＡＬＰ－２、リポテイコ酸、ＯｓｐＡ、Ｐｏｒｉｎ、ＬｃｒＶ、リポマンナン、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、及びザイモサンからなる群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記アジュバントが、ポリ－Ｉ：Ｃ、ＣｐＧ、ポリ－ＩＣＬＣ、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、Ｂ（Ｃ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ １３１２、モンタニドＩＳＡ ２０６、モンタニドＩＳＡ Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様の粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ－３－Ｃｙｓ、及びＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロンからなる群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記アジュバントが、代謝可能な油及び乳化剤を含んでなる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記油及び乳化剤が、実質的に全ての油滴が直径１ミクロン未満である水中油型エマルションの形態で存在する、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記油がスクアレンである、請求項２０又は２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記アジュバントが、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート及びソルビタントリオレアートをさらに含んでなる、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記アジュバントが、４．３％スクアレン、０．５％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、０．５％ソルビタントリオレアートを含んでなる、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記組成物が、例えば、上気道及び／又は下気道などの気道への投与のために製剤化又は適合される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

前記組成物が、吸入又は鼻腔内投与のために製剤化又は適合される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

前記組成物が、スプレー、ミスト、又は煙霧剤として製剤化される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

前記組成物が、点鼻スプレー又は点鼻薬として製剤化される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記組成物が、皮下、筋肉内、又は本明細書に記載の任意のその他の経路を介した投与のために製剤化又は適合される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

コロナウイルスに対する対象における免疫応答を誘導するための方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルスに対する対象における免疫応答を誘導するステップを含んでなる、方法。

【請求項31】

コロナウイルスによる感染症に関連する症状の重症度を軽減又は最小化するための方法であって、それを必要とする個体に、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物を投与することによって、コロナウイルスの感染に関連する症状の重症度を軽減又は最小化するステップを含んでなる、方法。

【請求項32】

前記症状が、発熱、空咳、倦怠感、疼き及び痛み、咽喉痛、下痢、結膜炎、頭痛、味覚又は嗅覚の喪失、皮膚の発疹、又は手足の指の変色、呼吸窮迫又は息切れ、胸痛み又は圧迫感、及び発話又は運動の喪失からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

それを必要とする対象における、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）コロナウイルス感染症を治療及び／又は防止する方法であって、治療有効量の請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することによって、前記対象における（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）コロナウイルス感染症を治療及び／又は予防するステップを含んでなる、方法。

【請求項34】

コロナウイルス感染のリスクがある対象を同定するステップをさらに含んでなる、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

それを必要とする対象における、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）コロナウイルス感染症を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における、請求項１～２９のいずれか一項に記載の本発明の組成物の使用。

【請求項36】

個体の肺におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物を前記個体に投与することによって、前記個体の前記肺におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減するステップを含んでなる、方法。

【請求項37】

前記組成物が気道に投与される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記気道が上気道である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記組成物が、鼻及び鼻道、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分の領域のいずれか１つ又は複数に投与される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記コロナウイルス感染症が、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス属（Ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、又はデルタコロナウイルス属（Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）のいずれかに由来するコロナウイルスによる感染である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、方法又は使用。

【請求項41】

前記コロナウイルスが、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）亜群クラスター１ａ及び１ｂの１つ、又はベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）亜群クラスター２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄの１つに由来する、請求項４０に記載の組成物、方法又は使用。

【請求項42】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３又はＨＫＵ１である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物、方法又は使用。

【請求項43】

前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の組成物、方法又は使用。

【請求項44】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物を非ヒト動物に投与することによって、前記動物においてコロナウイルスに向けられた抗体を生成させるステップを含んでなる、コロナウイルスに向けられた抗体を取得する方法。

【請求項45】

コロナウイルスに向けられた抗体を含んでなる抗体製剤であって、前記抗体製剤が請求項４４に記載の方法によって得られる、抗体製剤。

【請求項46】

請求項１～２９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコード化する、核酸分子。

【請求項47】

配列番号１、４、２９、３０、３１又は３２に対応するヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４６に記載の核酸。

【請求項48】

請求項４６又は４７に記載の核酸を含んでなる、発現コンストラクト。

【請求項49】

請求項４６又は４７に記載の核酸、又は請求項４８に記載の発現コンストラクトを含んでなる、細胞。

【請求項50】

コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質及びアジュバントであって、
前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、抗体のＦｃ領域に連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなり、又は
前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、Ｆｃ受容体結合ドメインを含んでなるポリペプチドに連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなる、キメラタンパク質又は融合タンパク質及びアジュバント。

【請求項51】

前記受容体結合ドメインが、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又は変異株、又は表３に定義される任意のその他の株又は変異株に由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項52】

前記受容体結合ドメインが、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５０又は５１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項53】

前記受容体結合ドメインが、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５０又は５１に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項54】

前記受容体結合ドメインが、Ｎ３３４～Ｐ５２７（全長スパイクタンパク質に基づく番号付け）由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５０～５３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項55】

前記受容体結合ドメインが、Ｎ３３４～Ｐ５２７（全長スパイクタンパク質に基づく番号付け）由来のアミノ酸配列からなる、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項56】

コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の前記受容体結合ドメインが、配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列、又は配列番号１５又は２８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０～５５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項57】

前記アミノ酸配列が、図６又は７又は表３に示される変異の１つ又は複数を含む、請求項５６に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項58】

コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の前記受容体結合ドメインが、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）、好ましくは０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０～５７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質であって、前記アミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）が、Ｎ末端及び／又はＣ末端に配置される、キメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項59】

前記抗体のＦｃ領域がＩｇＧのＦｃ領域である、請求項５０～５８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項60】

前記ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項５９に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項61】

前記ＩｇＧがヒトである、請求項５９又は６０に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項62】

前記キメラタンパク質又は融合タンパク質のＦｃ領域が、２つの重鎖断片、より好ましくは前記重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる、請求項５０～６１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項63】

抗体のＦｃ領域が、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１６又は１８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０～６２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項64】

抗体のＦｃ領域が、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）、好ましくは０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０～６３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【請求項65】

前記キメラタンパク質又は融合タンパク質が、配列番号２、３、５、６、２２又は２３に記載されるいずれか１つの配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０～６４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、どちらもその全内容が参照により本明細書に援用される、２０２０年１２月２３日に出願されたオーストラリア仮出願第２０２０９０４８２０号、及び２０２１年１２月２日に出願されたオーストラリア仮出願第２０２１９０３９１１号の優先権の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、キメラタンパク質及び融合タンパク質及びそれらの組成物、並びにコロナウイルス感染症、又はコロナウイルス感染症に関連する呼吸器疾患又は病状の予防及び／又は治療における、このようなタンパク質及び組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

新興の呼吸器コロナウイルスは、世界の人々の健康と経済に大きな脅威を与えている。コロナウイルス（ＣｏＶ）は、大きなプラス鎖ＲＮＡゲノムをコード化して大多数の哺乳類で効率的に自己複製する、系統発生学的に多様なエンベロープウイルスのグループを構成する。ヒトＣｏＶ（ＨＣｏＶｓ－２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、及びＨＫＵ１）感染症は、典型的には、軽度から重度の上気道及び下気道疾患を引き起こす。

【0004】

コロナウイルスは、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）のコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、サイズが微小（直径８０～２００ｎｍ）であり、長さが２６～３２ｋｂの一本鎖ＲＮＡを核物質として含有する。コロナウイルス科の亜群は、アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、及びデルタ（δ）コロナウイルスである。ベータコロナウイルスは、ヒトに関して臨床的に最も重要である。これらとしては、系統ＡのベータコロナウイルスであるＯＣ４３及びＨＫＵ１（感冒を引き起こし得る）が挙げられる。系統Ｂのベータコロナウイルスとしては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（疾患ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす）が挙げられる。中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）は、系統Ｃ由来のベータコロナウイルスである。これらのウイルスは、急性肺損傷（ＡＬＩ）及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を引き起こし、肺不全及び死をもたらし得る。

【0005】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は２００２年から２００３年に出現し、全体の死亡率が１０％、高齢者の死亡率が最大５０％のＡＲＤＳを引き起こした。

【0006】

中東呼吸器症候群－コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）は、２０１２年の４月に中東で出現し、重度の肺炎、ＡＲＤＳ、及び急性腎不全として顕在化した。

【0007】

２０２０年には、高感染性コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に免疫学的にナイーブな世界中の人々が遭遇し、世界は「ＣＯＶＩＤ－１９」と称される疾患として顕在化した極端な状況に直面している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、２００以上の国、領域、又は地域で、これまでに世界中で確認症例数が５，０００万を超え、１００万人以上が死亡している。ＣＯＶＩＤ－１９の症状発現は、軽度から生命を脅かす重症の範囲にわたり、死亡率もかなり高い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

コロナウイルス感染症及び／又はコロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患に対する新しい治療法又は改善された治療法が必要とされている。

【0009】

本明細書における先行技術への言及は、この先行技術がいかなる法域においても一般常識の一部を形成すること、又はこの先行技術が当業者によって理解され、関連性があると見なされ、及び／又は先行技術のその他の部分と組み合わせられることが合理的に期待され得ることを承認又は示唆するものではない。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様では、本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質を提供し、このタンパク質は、抗体のＦｃ領域に連結された、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる、２つ以上のポリペプチドを含んでなる。

【0011】

別の態様では、本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質を提供し、このタンパク質は、それぞれが、Ｆｃ受容体結合ドメインを含んでなるポリペプチドに連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる、２つ以上のポリペプチドを含んでなる。

【0012】

一態様では、本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質を提供し、このタンパク質は、抗体のＦｃ領域に連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなる。

【0013】

別の態様では、本発明は、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質提供をし、このタンパク質は、Ｆｃ受容体結合ドメインを含んでなるポリペプチドに連結されたコロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのダイマーを含んでなる。一実施形態では、キメラタンパク質又は融合タンパク質は、連続ポリペプチド鎖が共有結合した２つのＲＢＤ鎖配列を含んでなる、一本鎖ダイマーである。

【0014】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列、又は配列番号１５又は２８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなり、一実施形態では、アミノ酸配列は、図６又は７に示されるような変異の１つ又は複数を含んでもよい

【0015】

任意の態様において、受容体結合ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に由来してもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、ウイルスの元の（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）祖先型又は（「武漢」）株（ゲノム参照配列：ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２）から進化しており、本明細書では野生型（ＷＴ）株と称される。本明細書に記載されるように、受容体結合ドメインは、ＷＴ（「武漢」）、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタ株、又は表３をはじめとする本明細書で定義される任意のその他の株に由来してもよい。任意の実施形態において、受容体結合ドメインは、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタ株のＮ３３４～Ｐ５２７であってもよい。アルファ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに１つの変異、Ｎ５０１Ｙを保有する。ベータ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに３つの変異、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、及びＫ４１７Ｎを保有する。ガンマ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに３つの変異、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを保有する。カッパ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｌ４５２Ｒ及びＥ４８４Ｑを保有する。デルタ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋを保有する。

【0016】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、関連するアミノ酸配列は、０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有してもよく、ここでアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。

【0017】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１５又は２８のどちらかの１つ又は複数のアミノ酸配列と、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる抗体のＦｃ領域とを含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、関連するアミノ酸配列は、０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有してもよく、ここでアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。

【0018】

任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２、３、５、６、２２又は２３のいずれか１つに記載される配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。さらに、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、特にＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタ株のスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインのＮ３３４－Ｐ５２７を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなり、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと直接的又は間接的に連結され、好ましくはリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなり、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃは、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる。

【0019】

任意の態様において、キメラタンパク質又は融合タンパク質の抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧのＦｃ領域はマウスＩｇＧ１である。

【0020】

任意の態様において、２つ以上のポリペプチドの１つ又は複数、又はキメラタンパク質又は融合タンパク質のダイマー中の受容体結合ドメインの片方又は双方は、Ｃ末端でＦｃ領域と融合していてもよい。代案としては、２つ以上のポリペプチドの１つ又は複数、又はキメラタンパク質又は融合タンパク質のダイマー中の受容体結合ドメインの片方又は双方は、Ｃ末端のリンカーを介してＦｃ領域と融合していてもよい。

【0021】

好ましくは、キメラタンパク質又は融合タンパク質のＦｃ領域は、２つの重鎖断片を含んでなり、より好ましくは、前記重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる。一実施形態では、重鎖断片は、ジスルフィド結合を介して連結される。

【0022】

任意の態様において、抗体のＦｃ領域は、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１６又は１８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。

【0023】

任意の態様において、抗体のＦｃ領域は、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、関連するアミノ酸配列は、０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有してもよい。

【0024】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列、又は配列番号１５又は２８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなり、抗体のＦｃ領域は、配列番号１６又は１８のどちらか１つのアミノ酸配列、又は配列番号１６又は１８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。一実施形態では、受容体結合ドメインのアミノ酸配列は、図６に示されるような、又はアルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、デルタ、デルタプラス、タムダ、ミュー、イオタ又はオミクロン株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に関連して本明細書に記載されるような変異の１つ又は複数を含んでもよい。

【0025】

本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、単離、精製、実質的精製、濃縮、合成、組み換えであってもよい。一実施形態では、精製は、キメラタンパク質又は融合タンパク質に結合したポリ－Ｈｉｓタグの使用によって媒介される。

【0026】

本発明の別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質と、アジュバントとを含んでなる組成物を提供する。好ましくは、組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含んでなる。

【0027】

任意の実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載されるいずれか、好ましくはＴＬＲ２－作動薬、より好ましくはＰＥＧ－４アルギニン（Ｒ４）－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ）などの分子を含有するＰａｍ－２－Ｃｙｓ、又は好ましくはＮＫＴ細胞の刺激因子、より好ましくは、アシル及びスフィンゴシン鎖長、飽和度の多様性と、極性頭部基組成の多様性とを含んでなる、α－ガラクトシルセラミド（本明細書で「α－ＧａｌＣｅｒ」とも称される）、α－グルコシルセラミド、α－グルコシルジアシルグリセロール、α－ガラクトシルジアシルグリセロール、β－マンノシルセラミド、及びそれらの類似体などのＮＫＴ細胞を刺激する能力を有する任意の糖脂質である。

【0028】

いくつかの実施形態では、ＴＬＲ２－作動薬は、Ｐａｍ－３－ＣＳＫ４、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ、ＭＡＬＰ－２、リポテイコ酸、ＯｓｐＡ、Ｐｏｒｉｎ、ＬｃｒＶ、リポマンナン、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、及びザイモサンからなる群から選択され得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリ－Ｉ：Ｃ、ＣｐＧ、ポリ－ＩＣＬＣ、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、マトリックスＭ、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様の粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ－３－Ｃｙｓ、及びＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロンからなる群から選択され得る。

【0030】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、代謝可能な油及び乳化剤（洗剤又は界面活性剤など）を含んでなる。好ましくは、油及び乳化剤は、実質的にその全てが直径１ミクロン未満である油滴を有する水中油型エマルションの形態で存在する。例示的な代謝可能な油及び乳化剤は、米国特許第６，２９９，８８４号明細書及び米国特許第６，０８６，９０１号明細書に記載されている。一実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルションを含んでなる。好ましくは、油はスクアレンである。好ましくは、水相はクエン酸緩衝液（例えば１０ｍＭ、ｐＨ６．５）である。

【0031】

一実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルション中のスクアレンを含んでなる。好ましくは、アジュバントは、ツイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）及びＳｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレアート）をさらに含んでなる。アジュバントは、４．３％スクアレン、０．５％ツイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．５％Ｓｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレアート）を含んでなってもよく、任意選択的に４００ｐｇ／ｍｌのＭＴＰ－ＰＥ（Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－［１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－３（ヒドロキシホスホリル－オキシ）］エチルアミド）を含む。

【0032】

一実施形態では、組成物は５０％ｖｏｌ／ｖｏｌのアジュバントを含んでなり、好ましくはアジュバントはＭＦ５９である。

【0033】

一実施形態では、組成物は凍結乾燥されている。

【0034】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質と、アジュバントとを含んでなる、凍結乾燥組成物を提供する。好ましくはアジュバントは、ＴＬＲ２－作動薬、より好ましくはＰＥＧ－４アルギニン（Ｒ４）－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ）などの分子を含有するＰａｍ－２－Ｃｙｓである。

【0035】

凍結乾燥組成物は、－２０℃～４０℃の温度範囲で少なくとも１ヶ月間安定であってもよい。好ましくは、凍結乾燥形態で－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存した後の再構成組成物の免疫原性及び防御効率は、－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存されていない再構成組成物の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。好ましくは、凍結乾燥形態で－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存した後の再構成組成物によって誘導される抗体力価、好ましくは中和抗体力価は、－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存されていない再構成組成物の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。好ましくは、凍結乾燥形態で－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存した後の再構成組成物の、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の元の（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）祖先型又は（「武漢」）株及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のベータ変異株などの複数のコロナウイルス変異株に対する中和活性は、－２０℃～４０℃の温度範囲で１ヶ月間保存されていない再構成組成物の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である。

【0036】

任意の態様において、本発明のキメラ又は融合物、又は本発明の組成物は、抗体を誘導することによってコロナウイルスに対する免疫応答を誘導し、好ましくは抗体はコロナウイルス粒子又はビリオンを中和する。より好ましくは、本発明のキメラ又は融合体、又は本発明の組成物は、コロナウイルスのＲＢＤに特異的に結合し、ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を阻害する免疫グロブリンを誘導する。

【0037】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は組成物は、Ｂ細胞による抗体の産生を促進するＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導することによって、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導する。

【0038】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は本発明の組成物は、コロナウイルス感染細胞に対する細胞傷害性を媒介するＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することによって、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導する。

【0039】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、ＮＫＴ細胞応答を誘導することによって、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導する。

【0040】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、単回用量として投与される。

【0041】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、プライムブースト体制として投与される。ブーストは、１回目のブースト（すなわち、２回目の用量）又は２回目のブースト（すなわち、３回目の用量）、又はさらには３回目以降のブーストであってもよい。レジメンは、実施例を含めて本明細書に記載されるように、例えば、２回用量レジメン又は３回用量レジメン、或いは４回、５回、及びそれを超えるブーストレジメンであってもよい。好ましくは、プライム用量とブースト用量は異なる時点で投与される。いくつかの実施形態では、プライムとブーストの間の時間間隔は、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、又は１年である。

【0042】

本発明の任意の態様において本発明のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は本発明の組成物は、２回以上の用量として投与される。一実施形態では、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、３回の別々の用量として投与される。

【0043】

予防又は予防療法が意図され又は要求される本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、ウイルス感染、好ましくはコロナウイルス感染の臨床的又は生化学的に検出可能な症状の前に対象に投与される。対象は、コロナウイルス感染のリスクがあるとして同定されてもよい。

【0044】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、気道に投与される。典型的には、本発明のキメラ又は融合体、又は本発明の組成物は、上気道及び／又は下気道に投与される。例えば、本発明のキメラ又は融合体、又は本発明の組成物は、吸入又は鼻腔内を介して対象に投与されてもよい。

【0045】

本発明の任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物の対象への投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。好ましくは、ウイルス負荷は、例えば、上気道及び／又は下気道などの気道において低減される。より好ましくは、ウイルス負荷は、上気道及び下気道において低減される。好ましくは、ウイルス負荷は、肺において低減される。

【0046】

任意の態様において、本発明の組成物は、例えば、上気道及び／又は下気道などの気道への投与のために製剤化又は適合されてもよい。好ましくは、組成物は、吸入又は鼻腔内投与のために製剤化又は適合される。一実施形態では、組成物は、スプレー、ミスト、又は煙霧剤として製剤化される。

【0047】

好ましい実施形態では、組成物は、点鼻スプレーとして又は点鼻薬として製剤化される。

【0048】

任意の態様において、組成物は、皮下、筋肉内、又は本明細書に記載の任意のその他の経路を介した投与のために製剤化又は適合されてもよい。

【0049】

したがって、別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチン又は免疫刺激組成物をさらに提供し、組成物は以下を含んでなる：
－本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質の形態の免疫原、及び
－対象における免疫原に対する免疫応答を増強するためのアジュバント。

【0050】

好ましくは、本発明の組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物中に提供される唯一の免疫原は、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質である。

【0051】

別の態様では、本発明は、活性成分として本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体とを含んでなる、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）コロナウイルス感染症を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物中に存在する唯一の活性成分は、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質である。

【0052】

別の態様では、本発明は、主要成分として本発明のポリペプチド又は融合タンパク質と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体とを含んでなる、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）コロナウイルス感染症を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物中に存在する唯一の活性成分は、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質である。

【0053】

別の態様では、本発明はまた、治療有効量の本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の医薬組成物を対象に投与することによって、対象における免疫応答を惹起することを含んでなる、それを必要とする対象における免疫応答を惹起する方法もまた提供する。

【0054】

本発明はまた、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法も提供する。

【0055】

本発明はまた、本明細書で定義されるキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を対象に投与することを含んでなる、対象におけるコロナウイルスに対する体液性免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましくは、誘導される免疫応答は、「バランスの取れた」Ｔｈ１－Ｔｈ２応答を含んでなる。

【0056】

本発明はまた、本明細書で定義されるキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を対象に投与することを含んでなる、コロナウイルス感染に対して対象を免疫化する方法もまた提供する。

【0057】

本発明は、本明細書で定義されるキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする個体に投与することを含んでなる、コロナウイルスによる感染症に伴う症状の重症度を軽減又は最小化するための方法を提供し、ここで症状は、発熱、空咳、倦怠感、疼き及び痛み、咽喉痛、下痢、悪心と嘔吐、結膜炎、頭痛、味覚又は嗅覚の喪失、皮膚の発疹、又は手足の指の変色、呼吸窮迫又は息切れ、胸痛み又は圧迫感、及び発話又は運動の喪失からなる群から選択される。

【0058】

別の態様では、本発明はまた、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染症を治療及び／又は防止する方法も提供し、方法は、治療有効量の本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質又は本発明の組成物を対象に投与することによって、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）対象におけるコロナウイルス感染症を治療及び／又は防止することを含んでなる。

【0059】

任意の態様において、本発明の方法は、コロナウイルス感染のリスクがある対象を同定することをさらに含んでなる。

【0060】

別の態様では、本発明は、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染症を治療及び／又は予防する薬剤の調製における、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物の使用を提供する。好ましくは、薬剤は上気道への投与のために適合される。

【0061】

任意の実施形態において、本発明はまた、個体の上気道又はその領域、又は下気道又はその領域におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減するための、キメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物の使用も提供する。上気道の領域又は下気道の領域は、本明細書に記載の領域であってもよい（例えば、肺は下気道の領域である）。好ましくは、本発明はまた、コロナウイルスが検出される任意の組織又は器官におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減するための、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は組成物の使用も提供する。好ましくは、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、上気道での使用のために適合される。

【0062】

任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、上気道のみに投与される。換言すれば、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、下気道に投与されず、又は上気道と下気道の双方には投与（すなわち、全気道への投与）されない。

【0063】

さらなる態様では、本発明は、キメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物を個体の上気道に投与することによって、個体の肺におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減することを含んでなる、個体の肺におけるコロナウイルス粒子の量を抑制又は低減する方法を提供する。

【0064】

別の態様では、本発明は、発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物を個体の上気道に投与することによって、個体の上気道から肺へのコロナウイルス粒子の進行を抑制、遅延又は低減することを含んでなる、個体の上気道から肺へのコロナウイルス粒子の進行を抑制、遅延又は低減するための方法を提供する。

【0065】

本発明はさらに、個体の上気道から肺へのコロナウイルス粒子の進行を抑制、遅延、又は軽減するための薬剤の調製における、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用を提供する。好ましくは、薬剤は上気道への投与のために適合される。

【0066】

任意の実施形態において、本発明は、個体の上気道から肺へのコロナウイルス粒子の進行を抑制、遅延又は低減するための、本発明のキメラタンパク質若しくは融合タンパク質、又は本発明の組成物の使用を提供する。好ましくは、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は組成物は、上気道での使用のために適合される。

【0067】

本発明の任意の方法又は使用において、組成物は凍結乾燥組成物であり、方法又は使用は、凍結乾燥組成物を再構成するステップ、及び好ましくはその再構成組成物を個体に投与するステップをさらに含んでなる。

【0068】

好ましくは、いずれの方法も、上気道から肺へのコロナウイルスの蔓延を軽減又は防止する。好ましくは、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は組成物は、上気道に保持される。換言すれば、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質又は組成物の上気道への投与は、肺へのウイルスの蔓延を防止又は低減する。

【0069】

本明細書の用法では、上気道には、鼻及び鼻道、鼻甲介、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分の領域のいずれか１つ又は複数が含まれてもよい。

【0070】

典型的には、下気道には、声帯皺襞下部の喉頭の部分、気管、気管支、及び細気管支のいずれか１つ又は複数の領域が含まれる。肺は下気道に含まれ得て、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、及び肺胞が含まれる。

【0071】

本発明の任意の態様において、上気道への投与は、鼻及び鼻道、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分のいずれか１つ又は複数への投与であってもよい。したがって、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質又は組成物は、（ａ）鼻及び鼻道に投与され、（ｂ）鼻、鼻道、及び副鼻腔に投与され、（ｃ）鼻、鼻道、副鼻腔、及び咽頭に投与され、又は（ｄ）鼻、鼻道、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分に投与されてもよい。

【0072】

任意の態様において、コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患は呼吸器疾患である。

【0073】

一態様では、本発明は、対象における免疫応答を惹起する際に使用するための、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物を提供する。

【0074】

一態様では、本発明は、（ａ）コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患、又は（ｂ）それを必要とする対象におけるコロナウイルス感染症の治療及び／又は予防に使用するための、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物を提供する。

【0075】

本発明の任意の態様において、コロナウイルス感染症は、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス属（Ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）又はデルタコロナウイルス属（Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）のいずれかに由来するコロナウイルスによる感染であってもよい。好ましくは、コロナウイルスは、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）亜群クラスター１ａ及び１ｂの１つ、又はベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）亜群クラスター２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄの１つに由来する。コロナウイルスは、ヒトに感染するあらゆるコロナウイルスであってもよい。例示的なコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３及びＨＫＵ１であるが、コロナウイルスは本明細書に記載のいずれであってもよい。最も好ましくは、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症である。

【0076】

別の態様では、本発明はまた、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を非ヒト動物に投与することによって、動物においてコロナウイルスに向けられた抗体を生成させることを含んでなるコロナウイルスに向けられた抗体を取得するための方法も提供する。好ましくは、方法は、動物から抗体を単離することをさらに含んでなる。

【0077】

別の態様では、本発明はまた、コロナウイルスに向けられた抗体を含んでなる抗体製剤も提供し、ここで、抗体製剤は、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を非ヒト動物に投与することによって動物においてコロナウイルスに向けられた抗体を生成させ、動物から抗体を単離することによって得られる。

【0078】

別の態様では、本発明はまた、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質をコード化する核酸分子も提供する。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。

【0079】

好ましくは、核酸は、配列番号２、５、８、１２、１５、２２又は２３に対応するアミノ酸配列のいずれか１つ又は複数をコード化するヌクレオチド配列を有する。

【0080】

任意の実施形態において、キメラタンパク質又は融合タンパク質をコード化する核酸分子は、配列番号１、４、２９、３０、３１又は３２に対応するヌクレオチド配列を含んでなる。

【0081】

任意の実施形態において、このような核酸は、核酸がプロモーターと作動可能に連結された発現コンストラクトに含まれる。このような発現コンストラクトは、例えばプラスミなどのベクターであり得る。

【0082】

別の態様では、本発明はまた、本発明の核酸分子を含んでなるベクターも提供する。

【0083】

別の態様では、本発明はまた、本発明のベクター又は核酸を含んでなる細胞も提供する。本発明の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞が挙げられる。好ましくは、細胞は単離、実質的精製、又は組換えである。

【0084】

別の態様では、本発明はまた、本発明の細胞を含んでなる、動物又はそれに由来する組織も提供する。

【0085】

本明細書の用法では、文脈が他を必要とする場合を除き、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、及び「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形は、さらなる添加剤、構成要素、整数又はステップを排除することを意図するものではない。

【0086】

本発明のさらなる態様、及び先行する段落で説明された態様のさらなる実施形態は、添付図面を参照して、例示のために与えられた以下の説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0087】

【図1】変異株ＲＢＤタンパク質の生成である。（Ａ）表面がスパイクタンパク質で覆われ、ＡＣＥ２に結合してウイルスの侵入を惹起する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を強調した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのカーツーン図である。（Ｂ）様々なＲＢＤタンパク質のカーツーン図である。（Ｃ－Ｆ）ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーからのＦＰＬＣ溶出プロファイルである。収集された画分が示されている。ＲＢＤモノマーがＳｕｐｅｒｄｅｘ－７５カラムから溶出されたのに対し、ＲＢＤダイマー及びＲＢＤ－Ｆｃタンパク質はＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００カラムから溶出された。（Ｇ）ゲル濾過後の４つのＲＢＤ変異株のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。（Ｈ）ヒトＡＣＥ２を、又は陰性対照としてのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように一過性に形質移入された、ＲＢＤ－Ｆｃ（マウスＩｇＧ１）又は抗ＴＣＲ抗体で染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す、フローサイトメトリー等高線プロットである。

【図2】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）をワクチン接種されたマウスからの一次血清及び二次血清中のＲＢＤ特異的抗体応答である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群ｎ＝５）は、アジュバントなし（ＲＢＤ）で投与される、又は０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）又は０．２μｇのα－ＧＣ（ＲＢＤ ａ－ＧＣ）の存在下で投与される、０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを尾の付け根の皮下経路又はＵＲＴへの鼻腔内経路のどちらかを介してワクチン接種された。マウスは０日目にプライミングされ、２８日目にブーストされた。１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採取された血清は、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図3】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）をワクチン接種されたマウスからの一次血清及び二次血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体力価である。図２に示すＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体について評価された。２回目の注射の直前（１°）及び２回目の注射の２週間後（２°）に採取された血清は、微量中和アッセイを用いて中和抗体について検査された。個々の血清サンプルの連続希釈液は、１００ ＴＣＩＤ_５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢指標株ＶＩＣ０１と共に１時間インキュベートされ、９６ウェルプレートにセットアップしたベロ細胞単層を使用して、残留ウイルス感染力が評価された。ウイルス細胞変性効果は、５日目に測定された。中和抗体力価は、Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．（１９３８）Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｆｉｆｔｙ Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ，２７，４９３－４９７）を用いて計算された。個々の動物からの中和抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図4】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）をワクチン接種されたマウスからの血清の中和活性を評価する、サロゲートウイルス中和試験である。図２に示すＢＡＬＢ／ｃマウスからの二次血清もまた、サロゲートウイルス中和試験を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体について評価された。固定ＡＣＥ２受容体でコーティングされたウェルへの、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質（ＨＲＰ－ＲＢＤ）の結合を阻害する血清抗体の能力が、１：１０の血清希釈でＥＬＩＳＡ形式で検査された。光学濃度の読み取りによって対照血清と比較して、血清がＨＲＰ－ＲＢＤのＡＣＥ２受容体への結合を阻害する程度が判定され、２０％以上の阻害が陽性結果と見なされた。個々の動物のＡＣＥ－２に対するＲＢＤの結合阻害パーセントが示され、各群の平均値は横線で示される。

【図5】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）をワクチン接種されたマウスからの血清サンプルと比較した、ヒト回復期患者サンプル（ｈＣｏｖ）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する血清学的応答である。ＲＢＤ特異的抗体応答、及び微量中和アッセイ及びサロゲートウイルス中和試験によって評価された中和抗体応答が、ＲＢＤワクチン接種されたマウスからの血清と、ｈＣｏｖ患者からの血漿サンプルとの間で比較された。マウス血清サンプルとｈＣｏｖ血漿サンプルは、別々の実験で検査された。

【図6】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質における変異、及びヒト回復期血漿サンプル（ｈＣｏｖ）による、及びＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）をワクチン接種されたマウスからの血清による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の中和である。（Ａ）スパイクコード変異と（頻度）１０を超える局所事例、ＲＢＤ領域の変異が赤で示される。（Ｂ）３つの回復期患者血漿サンプル（ＤＤ２、ＤＤ３、及びＤＤ４）が、５０１Ｙ及び４７７Ｎ変異体を中和できないか、又は中和能力が低下していることを示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイである。（Ｃ）ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーワクチンで免疫化されたマウスからの血清が、Ｐ２Ｃ又はａ－ＧＣアジュバントの存在下で、５０１Ｙ及び４７７Ｎ変異体（ＶＩＣ２０８９及びＶＩＣ４８８１）及び元のＶＩＣ０１株を中和することを示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイである。

【図7】アジュバントあり又はなしでＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されたマウスの血清中の抗体のＲＢＤ変異株に対する結合の幅である。ＲＢＤマルチプレックスビーズアレイアッセイを用いて、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）又はα－ＧＣ（ＲＢＤ ａ－ＧＣ）アジュバントの存在下で投与される、又はアジュバントなし（ＲＢＤ）で投与される、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーワクチンの２回目の皮下投与の４週間後にマウスから採取された血清中の抗体が、１８種類のＲＢＤ変異株に対する結合について検査された。結合は、各変異株に対する各血清サンプルの最大半量有効濃度（ＥＣ_５０）として示される。

【図8】ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）を使用して確立された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マウスチャレンジモデルである。ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、指標ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＶＩＣ０１又はＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）変異株のどちらかで、煙霧剤チャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０；５０％組織培養感染用量）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図9】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されたマウスからの血清による、指標ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＶＩＣ０１（ＷＴ）及びＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株の中和の比較である。アジュバントなし（ＲＢＤ）で投与される、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）又はα－ＧＣ（ＲＢＤ ａ－ＧＣ）の存在化で投与される、ＲＢＤダイマーの２回目の注射に続いて４週間後に採取された血清は、ＶＩＣ０１（ＷＴ）及びＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株に対する中和抗体について、微量中和アッセイを用いて試験された。ウイルスＣＰＥは、５日目に測定された。中和抗体力価は、Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて計算された。個々の動物からの中和抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図10】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されて、ＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされたマウスの肺のウイルス力価である。ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃワクチン単独（ＲＢＤ）で、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）又はα－ＧＣ（ＲＢＤ ａ－ＧＣ）アジュバントありで免疫化されたマウスは、２回目のワクチン投与から１０３日後にＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされた。年齢をマッチさせたワクチン未接種の対照マウスも、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。肺における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図11】ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されて、ＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされたマウスの上気道防御の尺度としての、鼻甲介のウイルス力価である。ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃワクチン単独（ＲＢＤ）で、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）又はα－ＧＣ（ＲＢＤ ａ－ＧＣ）アジュバントありで免疫化され、ＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされたマウスの肺のウイルス力価の評価に加え、上気道防御の尺度として、同じマウスの鼻甲介のウイルス力価もまた評価された。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。鼻甲介における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図12】ウイルスチャレンジによる、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃ（ＲＢＤ）ダイマーワクチンの筋肉内投与の防御効率の評価である。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群は、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）と共に投与される０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを筋肉内ワクチン接種された。マウスは０日目にプライミングされ、２８日目にブーストされて、４週間後にＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされた。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照ＢＡＬＢ／ｃマウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉と鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。組織における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図13】ウイルスチャレンジによる、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃ（ＲＢＤ）ダイマーワクチンの筋肉内投与の防御効率の評価である。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群は、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（ＲＢＤ Ｐ２Ｃ）と共に投与される０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを筋肉内ワクチン接種された。マウスは０日目にプライミングされ、１４日目にブーストされて、３ヶ月後にＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされた。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉と鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。組織における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図14】ＲＢＤマウスＦｃダイマー、ＲＢＤヒトＦｃダイマー、又はＲＢＤタンデムダイマーをワクチン接種されたマウスの一次血清及び二次血清中のＲＢＤ特異的抗体応答の比較である。（Ａ）ワクチン接種に使用される３つのＲＢＤダイマー抗原の概略図である。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群５匹）は、全て０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される、０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマー、ＲＢＤヒトＦｃダイマー、又は一本鎖ダイマーのいずれかを筋肉内ワクチン接種された。マウスは０日目にプライミングされ、２８日目にブーストされた。１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採取された血清は、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図15】アジュバントとしてのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される各ＲＢＤ抗原によって惹起される、ＲＢＤ特異的抗体応答の持続性である。図１４に示すＣ５７ＢＬ／６マウスの血清中のＲＢＤ特異的抗体応答は、４２日目、６３日目、及び８４日目に測定され、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ）と共に投与される３つの異なるＲＢＤ抗原によって誘導された抗体応答の持続性が評価された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図16】ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかを配合した、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されたマウスの血清中のＲＢＤ特異的抗体応答の比較である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーと０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓで、又は０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーとＭＦ５９（登録商標）（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）で、筋肉内免疫化された。マウスは１回目の免疫化の前（事前採血）、及び１４日目（１°）に採血され、１４日目又は２８日目のどちらかでブーストされ、どちらの場合も２回目の免疫化（２°）の２週間後に再採血された。総ＲＢＤ特異的抗体力価は、ＥＬＩＳＡによって判定された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図17】ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかを配合した、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー又はＲＢＤ一本鎖ダイマーをワクチン接種されたマウスの血清中のＲＢＤ特異的抗体応答の比較である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、どちらも０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ）又はＭＦ５９（登録商標）（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のどちらかを配合した、１０μｇのＲＢＤマウスＦｃダイマーで、又は１０μｇのＲＢＤ一本鎖ダイマーで、筋肉内免疫化された。マウスは０日目にプライミングされ、１４日目にブーストされた。１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の４週間後（２°）に採取された血清は、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図18】ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合した、ＲＢＤモノマー又はＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されたマウスの血清中のＲＢＤ特異的抗体応答の比較である。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群は、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ）を配合した０．２ナノモルのＲＢＤモノマー、又は０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ）を配合した０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーのどちらかで、筋肉内免疫化された。マウスは０日目にプライミングされ、２８日目にブーストされた。１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採取された血清は、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査された。抗体力価は、ＯＤが０．３となる血清の最高希釈率（ｌｏｇ_１０）の逆数として計算された。個々の動物からの抗体力価は、横線で示される各グループの平均値で表される。

【図19】ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合したＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーによって誘導される防御効率と、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合したＲＢＤモノマーによって誘導される防御効率との比較である。図１８に示す１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群は、２８日目のブーストから４週間後にＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジされた。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照ＢＡＬＢ／ｃマウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉と鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。組織における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定された。

【図20】ＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃと、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又はＭＦ５９（登録商標）のどちらかとを筋肉内ワクチン接種されたマウスにおける、総応答及びｎＡｂ応答である。（Ａ～Ｄ）ＷＴ ＲＢＤモノマーに反応する総マウスＩｇである。（Ａ及びＢ）０日目及び１１２日目に２用量体制で接種されたマウスの一次（８、１５、２２、４１、６２、及び９０日）及び二次（１２８日）血清における、総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価である。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。（Ｃ及びＤ）０日目２２日目及び１１２日目に２用量体制で接種されたマウスの一次（８、１５、及び２２日）、二次（４１、６２、９０、及び１１１日）及び三次（１３２日）血清中の総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価である。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。（Ｅ）ＷＴ指標株（ＶＩＣ０１）を使用した微量中和アッセイによる中和能力である。ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスからの、二次（６２日目及び１１１日目）及び三次（１３２日目）血清の中和力価。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。ＬＯＤ：検出限界

【図21】ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃ、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｎＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスにおける、総応答及びｎＡｂ応答である。（Ａ～Ｂ）ＷＴ ＲＢＤモノマーに反応する総マウスＩｇである。ＷＴ ＲＢＤマウスＦｃ、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと組み合わせたＷＴ ＲＢＤヒトＦｃを筋肉内ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ）からの、一次血清（２７日目）及び二次血清（４１、５５、７６、及び１１５日目）における総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。（Ｃ）ＷＴ指標株（ＶＩＣ０１）を使用した微量中和アッセイによる中和能力である。ＷＴ ＲＢＤマウスＦｃ、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと組み合わせたＷＴ ＲＢＤヒトＦｃを筋肉内ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスからの二次（４１日）血清の中和力価である。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。

【図22】ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）でチャレンジされたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺における、ウイルス力価である。０日目及び２８日目に、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共にＷＴ ＲＢＤマウスＦｃ、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共にＷＴ ＲＢＤヒトＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスは、１３９日目（２回目の免疫から１１１日後）にＶＩＣ２０８９で煙霧剤チャレンジされた。年齢と性別をマッチさせたワクチン未接種の対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスは殺処分され、ベロ細胞単層上の肺上清が滴定され、５日後にウイルスＣＰＥを測定することによって、個々のマウスの肺における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ５０）が判定された。

【図23】ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスにおける、総応答及びｎＡｂ応答である。（Ａ）ＭＦ５９（登録商標）を配合した１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスからの、一次血清（１°、２０日目）及び二次血清（２°、３３日目）における、総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価である。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。（Ｂ）微量中和アッセイによるＷＴ指標株ＶＩＣ０１又はベータ変異株Ｂ．１．３５１の中和である。ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスからの二次血清（４５日目）の中和力価。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。

【図24】ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）でチャレンジされたマウスの肺及び鼻甲介における、ウイルス力価である。０日目及び２１日目に、ＭＦ５９（登録商標）を配合した１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスは、２回目の免疫化から６０日目にＶＩＣ２０８９で煙霧剤チャレンジされた。年齢と性別をマッチさせたワクチン未接種の対照マウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスは殺処分され、ベロ細胞単層上の肺上清が滴定され、５日後にウイルスＣＰＥを測定することによって、個々のマウスの肺における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ５０）が判定された。

【図25】ＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｍＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスにおける、総応答及びｎＡｂ応答である。（Ａ）１０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ、又はＭＦ５９（登録商標）を配合した３μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスからの一次血清（１°、２０日目）及び二次血清（２°、３３日目）中の総ＷＴ抗体力価である。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。（Ｂ）微量中和アッセイによるＷＴ指標株ＶＩＣ０１又はベータ変異株Ｂ．１．３５１の中和である。１０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ、又はＭＦ５９（登録商標）を配合した３μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスからの二次血清（３３日目）の中和力価。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。

【図26】ＭＦ５９（登録商標）又はベータＲＢＤ－ｈＦｃと合わせたＷＴ－ＲＢＤ－ｈＦＣで免疫化されたマウスにおける、総Ａｂ応答である。０日目及び２１日目にＭＦ５９（登録商標）存在下で、（１０、３、１又は０．３μｇ）のＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ（Ａ及びＢ）、又はベータＲＢＤ－ｈＦｃ（Ｃ及びＤ）を筋肉内ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスからの一次血清（１°、２０日目；Ａ及びＣ）及び二次血清（２°、３７日目；Ｂ及びＤ）中の総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。

【図27】ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ－ＲＢＤ－ｈＦＣで、又はＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されたマウスにおける、ＷＴ ＲＢＤモノマー及びベータＲＢＤモノマーに対するＡｂ応答である。０日目及び２１日目にＭＦ５９（登録商標）存在下で、（１０、３、１又は０．３μｇの）ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又はベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスの二次血清（５６日目）中のＷＴ ＲＢＤ特異的抗体力価（Ａ）、及びベータＲＢＤ特異的抗体力価（Ｂ）。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈率の逆数（ｌｏｇ１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。

【図28】ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ－ＲＢＤ－ｈＦＣで、又はＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されて、ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）又はベータ変異株Ｂ．１．３５１でチャレンジされた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺におけるウイルス力価である。０日目及び２１日目にＭＦ５９（登録商標））の存在下で、１０、３、１又は０．３ｍｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又はベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種されたマウスは、２回目の免疫化の５５日後又は６２日後に、それぞれＶＩＣ２０８９（Ａ）、又はベータ変異株Ｂ．１．３５１（Ｂ）で煙霧剤チャレンジされた。年齢と性別マッチさせたワクチン未接種の対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスもまた、対応する日にそれぞれチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスは殺処分され、ベロ細胞単層上の肺及び鼻の上清が滴定され、５日後にウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定することによって、個々のマウスの肺における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ５０；５０％組織培養感染用量）が判定された。ＬＯＤ：検出限界

【図29】ハムスターにおける抗ＲＢＤ抗体力価である。ＯＤ値０．３を与える血清の最高希釈の逆数として計算された、ハムスターにおける抗ＲＢＤ抗体力価である。１４日目のＰＢＳ対照データは、試験に含めなかった。

【図30】ＣＳＵハムスター研究：ＷＴ株に対する３回目の投与から１４日後に採取された７８日目の血清を試験する、プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）である。

【図31】ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又はＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されて、ＷＴ（ＷＡ－０１／ＵＳＡ）又はベータ変異株（Ｂ．１．３５１）ウイルスでチャレンジされた、ハムスターの中咽頭拭き取り検体及び肺におけるウイルス力価である。ハムスターは、０、２１、及び６４日目に、３０又は１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又はＭＦ５９（登録商標）を配合した３０、１０又は３μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種され、８５日目に、ケタミン－キシラジン麻酔下で、１００μｌの容量で１×１０^４ｐｆｕのウイルスを鼻腔内滴下注入することによってチャレンジされた。使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ株はＷＡ－０１／ＵＳＡ（ＷＴ）及びベータ変異株（Ｂ．１．３５１）であり、ハムスターはチャレンジから３日後に殺処分された。ウイルス負荷は、（Ａ）チャレンジの３日後、動物を安楽死させる直前に採取された中咽頭拭き取り検体、及び（Ｂ）チャレンジの３日後に調製された頭蓋肺ホモジネート中で測定された。ウイルス力価は、ベロ細胞のコンフルエントな単層上で、連続１０倍希釈を行い、翌日プラークを計数することによって判定された。力価は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）として表される。ＬｏＤ：検出限界

【図32】ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原に特異的なラット抗体力価である。０、２２、及び４３日目に、生理食塩水、又は５０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ、又はＭＦ５９（登録商標）アジュバントと合わせた５０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種された３０匹のラット群からの血清中のＷＴスパイクに対するＩｇＧ抗体力価が、各列の下に示される。４４～４５日目又は５６日目の毒性の終了時に、各ラットから終末血液サンプルを採取し、血清に処理して、ＥＬＩＳＡによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧ抗体応答が評価された。

【図33】ＷＴ ＲＢＤモノマーに反応する総マウスＩｇである。ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤ－ｈＦｃの新鮮に調製した製剤、又は異なる温度で保存したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤ－ｈＦｃ凍結乾燥製剤を鼻腔内ワクチン接種されたマウスからの、（Ａ）一次血清（２１日目）及び（Ｂ）二次血清（４３日目）中の総ＷＴ ＲＢＤ抗体力価。ＥＬＩＳＡ力価は、吸光度０．３を与える抗体希釈度の逆数（ｌｏｇ_１０）として表される。これは、結合のバックグラウンドレベルの少なくとも５倍に相当する。

【図34】中和能力である。（Ａ）微量中和アッセイによるＷＴ指標株ＶＩＣ０１の中和である。ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた新鮮に調製したＲＢＤ－ｈＦｃ製剤、又は異なる温度で保存したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤ－ｈＦｃ凍結乾燥製剤を鼻腔内ワクチン接種されたマウスからの、二次血清（７０日目）の中和力価。半数阻害希釈率（ＩＤ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。（Ｂ）ＧｅｎＳｃｒｉｐｔサロゲートウイルス中和試験（ｓＶＮＴ）を使用して評価された、ＡＣＥ２に対するＲＢＤの結合阻害パーセントである。新鮮に調製したＲＢＤ－ｈＦｃ／ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ製剤、又は異なる温度で保存した凍結乾燥ＲＢＤ－ｈＦｃ／ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ製剤を鼻腔内ワクチン接種されたマウスからの、二次血清（４３日目）のｓＶＮＴ力価である。

【図35】ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）でチャレンジされたマウスの肺及び鼻甲介における、ウイルス力価である。０日目及び３０日目に、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又は４０℃で１か月間保存されたＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた凍結乾燥ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを鼻腔内ワクチン接種されたマウスは、２回目の免疫化の８２日後にＶＩＣ２０８９で煙霧剤チャレンジされた。年齢と性別をマッチさせたワクチン未接種の対照マウスもまた、同時にチャレンジされた。チャレンジから３日後にマウスは殺処分され、ベロ細胞単層上の肺（Ａ）及び鼻甲介（Ｂ）の上清が滴定され、５日後にウイルスＣＰＥを測定することによって、個々のマウスの肺及び鼻甲介における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ５０）が判定された。

【図36】中和能力である。微量中和アッセイによるＷＴ指標株ＶＩＣ０１及びベータ変異株Ｂ１．３５１の中和。新鮮に調製したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又は４０℃で１か月間保存したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた凍結乾燥ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを鼻腔内ワクチン接種されたマウスからの二次血清（７０日目）の中和力価。半数阻害希釈率（ＩＤ５０）は、ウェルの５０％でＣＰＥを完全に防止する血清の逆希釈に基づいて計算され、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式によって計算された。

【発明を実施するための形態】

【0088】

配列の説明

【0089】

【0090】

【0091】

【0092】

【0093】

【0094】

【0095】

【0096】

【0097】

【0098】

【0099】

【0100】

【0101】

【0102】

【0103】

【0104】

【0105】

【0106】

本明細書で開示され定義される本発明は、本文又は図面で言及される又はそれから明らかな２つ以上の個々の特性の全ての代替の組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。これらの全ての異なる組み合わせは、発明の様々な代替態様を構成する。

【0107】

次に、本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態と併せて説明するが、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はないことが理解されるであろう。逆に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる全ての代替物、修正物、及び等価物を網羅することを意図している。

【0108】

当業者であれば、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載のものと類似した又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載された方法及び材料に、どのようにも制限されない。本明細書で開示され定義される本発明は、本文又は図面で言及される又はそれから明らかな２つ以上の個々の特性の全ての代替の組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。これらの全ての異なる組み合わせは、発明の様々な代替態様を構成する。

【0109】

本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により援用される。

【0110】

本明細書を解釈する目的では、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆もまた同様である。

【0111】

本明細書の式で使用される一般化学用語は、それらの通常の意味を有する。

【0112】

本発明者らは、アジュバント（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ）と組み合わされると、一連のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して幅広く防御する強力な中和抗体応答を惹起する、新規の組換えＲＢＤキメラタンパク質又は融合タンパク質ワクチンを開発した。注目すべきことに、本発明者らは、アジュバント（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ）を含むワクチン組成物の、鼻腔内投与による上気道をはじめとする様々な経路を介したワクチン接種が、上気道（鼻腔）及び下気道の双方におけるウイルス複製から防御する強力な中和抗体応答を惹起することを示した。広範な防御は、潜在的に致命的な合併症をもたらし得る播種性肺感染に対する防御を提供する。さらに、本発明者らは、ワクチン接種によって誘導される免疫が少なくとも３ヶ月持続し、広範な防御が維持されて変異株が回避されることを見出した。

【0113】

コロナウイルス
「コロナウイルス」又は「ＣｏＶ」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ；並びにＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＫＵ１などの風土病コロナウイルスをはじめとするが、これらに限定されるものではない、コロナウイルスファミリーの任意のウイルスを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、中国の武漢で始まった深刻な大流行の原因として特定され、世界の他の地域に急速に蔓延した、新たに出現したコロナウイルスを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９－ｎＣｏＶ及び武漢コロナウイルスとしても知られている。これは、ウイルススパイクタンパク質を介して、ヒト宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する。スパイクタンパク質はまたＴＭＰＲＳＳ２に結合して切断され、ウイルスの膜融合のためにスパイクタンパク質を活性化する。

【0114】

コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）のコロナウイルス亜科及びニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）（国際ウイルス分類委員会）。この亜科は、それらの系統関係とゲノム構造に基づいて、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス属（Ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、及びデルタコロナウイルス属（Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）の４つの属からなる。亜科クラスターは、アルファコロナウイルス属（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）の１ａ及び１ｂ、及びベータコロナウイルス属（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）の２ａ、２ｂ、２ｃ、及び２ｄと標識される。アルファコロナウイルスとベータコロナウイルスは、哺乳類にのみ感染する。ガンマコロナウイルスとデルタコロナウイルスは鳥に感染するが、それらのいくつかは哺乳類にも感染し得る。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスは通常、ヒトでは呼吸器疾患を引き起こし、動物では胃腸炎を引き起こす。３つの高病原性ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトでは重度の呼吸器症候群を引き起こし、その他の４つのヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＫＵ１）は、免疫正常な宿主に軽度の上気道疾患のみを引き起こすが、それらのいくつかは、乳児、幼児、及び高齢者に重度の感染症を引き起こし得る。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスは、家畜に大きな疾病負担をもたらし得るが；これらのウイルスとしては、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ腸内下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、及び最近出現したブタ急性下痢症候群コロナウイルス（ＳＡＤＳ－ＣｏＶ）が挙げられる。現在の配列データベースに基づいて、全てのヒトコロナウイルスは動物起源であり：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、及びＨＣｏＶ－２２９Ｅは、コウモリ起源であると考えられており、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３及びＨＫＵ１は、齧歯類起源であると考えられている。

【0115】

コロナウイルスには、抗原グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩがある。コロナウイルスの非限定的例としては、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ヒト呼吸器コロナウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネコ腸内コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ウサギコロナウイルス、マウス肝炎ウイルス、ラット唾液腺涙腺炎ウイルス、ブタ血液凝集性脳脊髄炎ウイルス、牛コロナウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、及び七面鳥コロナウイルス、並びに本明細書に記載される任意のその他のもの、及びＣｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １７，ｐａｇｅｓ１８１－１９２（２０１９）；及びＳｈｅｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｊｕｌｙ ２０２０（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １６ Ｍａｒｃｈ ２０２０），Ｐａｇｅｓ ９１－９８で言及されるものが挙げられる。

【0116】

亜群１ａコロナウイルスの非限定的例としては、ＦＣｏｖ．ＦＩＰＶ．７９．１１４６．ＶＲ．２２０２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＶ＿００７０２５）、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２３０６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ８１１７８９．２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１１７８６．２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１１７８８．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１１７８５．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５２１５７．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ０１１４８２．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ９６２４３３．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ２７１９６５．２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０６０．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ６０９３７１．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０６０．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５９．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５８．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５７．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５２．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５１．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＱ６９３０５０．１）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１９６１．１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１１７８７）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）、又は後日同定される、任意のその他の亜群１ａコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0117】

亜群１ｂコロナウイルスの非限定的例としては、ＢｔＣｏＶ．１Ａ．ＡＦＣＤ６２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０１０４３７）、ＢｔＣｏＶ．１Ｂ．ＡＦＣＤ３０７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０１０４３６）、ＢｔＣｏｖ．ＨＫＵ８．ＡＦＣＤ７７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０１０４３８）、ＢｔＣｏＶ．５１２．２００５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ６４８８５８）、ブタ流行性下痢ウイルスＰＥＤＶ．ＣＶ７７７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３４３６、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ３５５２２４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ３５５２２３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ３５５２２１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０６２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｎ６０１０６１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０６０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６０１０５２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ４００９０２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ５４７３９５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４７３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４７２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４７１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４７０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４６０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５３ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４５０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ６８７４４９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５００２１５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０６１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０６０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０５０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０４９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４７６０４８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１７７２５８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１７７２５７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１７７２５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１７７２５５．１）、ＨＣｏＶ．２２９Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２６４５）、ＨＣｏＶ．ＮＬ６３．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００５８３１）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ２．ＨＫ．２９８．２００６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ２０３０６６）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ２．ＨＫ．３３．２００６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ２０３０６７）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ２．ＨＫ．４６．２００６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ２０３０６５）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ２．ＧＤ．４３０．２００６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ２０３０６４）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他の亜群１ｂコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0118】

亜群２ａコロナウイルスの非限定的例としては、ＨＣｏＶ．ＨＫＵ１．Ｃ．Ｎ５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ３３９１０１）、ＭＨＶ．Ａ５９（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００１８４６）、ＰＨＥＶ．ＶＷ５７２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００７７３２）、ＨＣｏＶ．ＯＣ４３．ＡＴＣＣ．ＶＲ．７５９（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００５１４７）、牛腸内コロナウイルス（ＢＣｏＶ．ＥＮＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３０４５）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他の亜群２ａコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0119】

亜群２ｂコロナウイルスの非限定的例としては、コウモリＳＡＲＳＣｏＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ２１１８５９）、ＳＡＲＳＣｏＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ２１１８６０）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０４５５１２．２）、ＢｔＳＡＲＳ．ＨＫＵ３．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０２２３０５）、ＢｔＳＡＲＳ．ＨＫＵ３．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０８４１９９）、ＢｔＳＡＲＳ．ＨＫＵ３．３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０８４２００）、ＢｔＳＡＲＳ．Ｒｍ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ４１２０４３）、ＢｔＣｏＶ．２７９．２００５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ６４８８５７）、ＢｔＳＡＲＳ．Ｒｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ４１２０４２）、ＢｔＣｏＶ．２７３．２００５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ６４８８５６）、ＢｔＳＡＲＳ．Ｒｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ０７１６１５）、ＳＡＲＳＣｏＶ．Ａ０２２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６８６８６３）、ＳＡＲＳＣｏＶ．ＣＵＨＫ－Ｗ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２７８５５４）、ＳＡＲＳＣｏＶ．ＧＤＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２７８４８９）、ＳＡＲＳＣｏＶ．ＨＣ．ＳＺ．６１．０３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５１５５１２）、ＳＡＲＳＣｏＶ．ＳＺ１６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ３０４４８８）、ＳＡＲＳＣｏＶ．Ｕｒｂａｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２７８７４１）、ＳＡＲＳＣｏＶ．ｃｉｖｅｔ０１０（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５７２０３５）、及びＳＡＲＳＣｏＶ．ＭＡ．１５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ４９７００８）、ＲｓＳＨＣ０１４（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＫＣ８８１００５）、Ｒｓ３３６７（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＫＣ８８１００６）、ＷｉＶ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＫＣ８８１００７）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他の亜群２ｂコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0120】

亜群２ｃコロナウイルスの非限定的例としては、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｒｉｙａｄｈ＿２＿２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６５２．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１８＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６５１．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１７＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４７．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１５＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４５．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１６＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４４．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿２１＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３４）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１９＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３２）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｂｕｒａｉｄａｈ＿１＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３０．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｈａｆｒ－Ａｌ－Ｂａｔｉｎ＿１＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２８．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１２＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２７．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｂｉｓｈａ＿１＿２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２０．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｒｉｙａｄｈ＿３＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１３．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ｒｉｙａｄｈ＿１＿２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１２．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿３＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１８６５６５．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿１＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１８６５６７．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿２＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１８６５６６．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス単離株Ａｌ－Ｈａｓａ＿４＿２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１８６５６４．１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ１９２５０７．１）、ベータコロナウイルス・イングランド（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｎｇｌａｎｄ）１－Ｎ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０１９８４３）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ＿ＳＡ－Ｎ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ６６７０７４）、中東呼吸器症候群コロナウイルスの以下の単離株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６５５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６５４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６４１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６３３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６２９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ６００６１７．１）、コロナウイルス・ネオロミシア（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｎｅｏｒｏｍｉｃｉａ）／ＰＭＬ－ＰＨＥ１／ＲＳＡ／２０１１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ８６９６７８．２、コウモリコロナウイルスＴａｐｅｒ／ＣＩＩ＿ＫＳＡ＿２８７／Ｂｉｓｈａ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４９３８８５．１、コウモリコロナウイルスＲｈｈａｒ／ＣＩＩ＿ＫＳＡ＿００３／Ｂｉｓｈａ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／２０１３ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４９３８８８．１、コウモリコロナウイルスＰｉｋｕｈ／ＣＩＩ＿ＫＳＡ＿００１／Ｒｉｙａｄｈ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／２０１３ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４９３８８７．１、コウモリコロナウイルスＲｈｈａｒ／ＣＩＩ＿ＫＳＡ＿００２／Ｂｉｓｈａ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／２０１３ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４９３８８６．１、コウモリコロナウイルスＲｈｈａｒ／ＣＩＩ＿ＫＳＡ＿００４／Ｂｉｓｈａ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／２０１３ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ４９３８８４．１、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ４．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５０６）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ４．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００９０１９）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ４．３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５０７）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ４．４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５０８）、ＢｔＣｏＶ １３３．２００５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００８３１５）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ５．５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１２）；ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ５．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００９０２０）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ５．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１０）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ５．３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１１）、ヒトベータコロナウイルス２ｃ Ｊｏｒｄａｎ－Ｎ３／２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ７７６１７４．１；ヒトベータコロナウイルス２ｃ ＥＭＣ／２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ８６９０５９．２）、アブラコウモリコロナウイルスＨＫＵ５単離株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０８０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１００．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０９０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１８．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１７．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１６．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１５．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１４．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１３．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１２．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１１．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１１０．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２１０５．１）、アブラコウモリコロナウイルスＨＫＵ４単離株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４３．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４１．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４０．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３８．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４８．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４７．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４６．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４５．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４４．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４３．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４２．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４１．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４０．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３８．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３７．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０３６．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６１．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６０．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５８．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５７．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５６．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５５．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５４．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５３．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５２．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５１．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０５０．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０４９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７３．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７２．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７１．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０７０．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６９．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６８．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６７．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６６．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６５．１ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６４．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６３．１、又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＣ５２２０６２．１、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他の亜群２ｂコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0121】

亜群２ｄコロナウイルスの非限定的例としては、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ９．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１４）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ９．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００９０２１）、ＢｔＣｏＶ．ＨｋＵ９．３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１５）、ＢｔＣｏＶ．ＨＫＵ９．４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ０６５５１６）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他亜群２ｄコロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0122】

亜群３コロナウイルスの非限定的例としては、ＩＢＶ．Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ．ＩＢＶ．ｐ６５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ００１３３９）、並びに現在知られている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースに見いだされ得る）又は後日同定される、任意のその他亜群３コロナウイルス、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0123】

コロナウイルスは、図６に示されるような変異の１つ又は複数を含むスパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含んでなる任意のウイルスであってもよい。

【0124】

本発明の任意の態様による治療を必要とする、又は本明細書に記載の任意の組成物の投与を必要とする、対象又は個体は、コロナウイルス感染症の症状を示している個体、又はコロナウイルス感染症と診断された個体であってもよい。さらに、対象又は個体は、コロナウイルスに感染していると臨床的又は生化学的に判定されていてもよい。

【0125】

対象は、末期臓器不全を発症する前に、コロナウイルス感染症の段階にあってもよい。それを必要とする対象は、終末臓器不全を発症する前に、臨床進行の開始時からコロナウイルス感染症を有しているものであれば誰でもよい。一実施形態では、対象は、コロナウイルス感染症状を有している期間が１２日以内であり、生命を脅かす臓器の機能不全又は臓器不全を有していない。好ましくは対象は、例えば、症状発現から１４日目以前、又はウイルス血症及び血清陰性段階など、疾患の経過の初期にある。

【0126】

「対象」又は「個体」は、コロナウイルスによる感染に罹り易い、及び／又はコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患若しくは障害に罹り易い、任意の動物であってもよい。本発明の対象は哺乳類であり得て、特定の実施形態ではヒトであり、それは乳児、子供、成人又は高齢者であり得る。「コロナウイルスによる感染のリスクがある対象」又は「コロナウイルス感染のリスクがある対象」は、コロナウイルスに曝露する可能性がある、又は曝露した可能性があるあらゆる対象である。「対象」又は「個体」には、あらゆるヒト又は非ヒト動物が含まれる。したがって、本発明の化合物は、ヒトの治療に有用であることに加えて、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びブタ、又はコロナウイルスに感染する可能性のあるあらゆる動物などであるが、これらに限定されるものではない、コンパニオンアニマル及び家畜をはじめとする、哺乳類の獣医学的治療に有用であってもよい。

【0127】

リスクのある対象としては、免疫不全の人、高齢者（６５歳以上）、２歳未満の子供、医療従事者、コロナウイルス感染が確定され又は疑われる人と濃厚接触する成人又は子供、及び肺感染症、心臓病又は糖尿病、一次性又は二次性免疫不全症などの基礎疾患を有する人々が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0128】

タンパク質及びポリペプチド
「単離された」は、本明細書で開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、その自然環境の構成要素から同定され、分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。自然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドの診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれてもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製されるか、又は（２）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を使用する非還元条件下又は還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、均一になるまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離されたタンパク質には、組換え細胞内の原位置ポリペプチドも含まれる。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0129】

「断片」は、ポリペプチドと実質的に同様の機能活性、又は実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持する、本発明のポリペプチドの一部であり、これは本明細書に記載のアッセイを用いて判定され得る。

【0130】

ポリペプチド配列、すなわち、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに関する、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」又は「同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せず、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後に、本発明の特定のポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。

【0131】

当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズム（以下に記載される非限定的例）をはじめとする、アライメントを測定するための適切なパラメータを判定し得る。アミノ酸配列が整列される場合、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに関する、又はそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（これは、代案としては所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに関する、又はそれに対して、特定のアミノ酸配列同一性パーセントを有するか又はそれを含んでなる、所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、次のように計算され得る：アミノ酸配列同一性パーセント＝Ｘ／Ｙ１００（式中、Ｘは配列アライメントプログラム又はアルゴリズムによるＡとＢのアライメントによって完全一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性パーセントと等しくならない。

【0132】

同一性パーセントの計算では、典型的に、正確な一致が数えられる。２つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７に従って修正）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ギャップありアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０）が利用され得る。代案としては、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復サーチが実施され得る。前出のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用され得る。アライメントはまた、検査によって手動で実行されてもよい。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較してアミノ酸又はＤＮＡ配列全体を整列させ、したがってアミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供し得る。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡＬＩＧＮＸモジュールなど、いくつかの市販ＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージで使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷでアミノ酸配列を位置合わせした後、アミノ酸同一性配列が評価され得る。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）又はＪａｌＶｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｌｖｉｅｗ．ｏｒｇ／）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）を使用すると、複数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性と同一性を評価できるようになる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ １２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ、ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２、及びｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝４を使用し得る。

【0133】

ポリペプチドは、望ましくはアミノ末端及びカルボキシル末端を含んでなる。ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸又はＤ－及びＬ－アミノ酸の混合物を含んでなり得る。しかしながら、Ｄ－アミノ酸で構成されるポリペプチドは、生体内での生物学的活性のより高い保持を有することが期待されるので、アミノ酸のＤ型が特に好ましい。

【0134】

ポリペプチドは、多くの従来技術のいずれかによって調製され得る。ポリペプチドは、天然に存在する供給源から、又は組換え供給源から単離又は精製され得る。組換え生産が好ましい。例えば、組換えポリペプチドの場合、周知の分子遺伝学的技術を用いて、所望のペプチドをコード化するＤＮＡ断片が、適切なベクターにサブクローニングされ得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９を参照されたい）。断片は転写され、引き続いてポリペプチドが生体外で翻訳され得る。市販のキットもまた採用され得る（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．によって製造されるものなど）。核酸の操作には、ポリメラーゼ連鎖反応が任意選択的に採用され得る。

【0135】

「保存的置換」という用語は、本明細書の用法では、ペプチドの天然配列に存在するアミノ酸を、天然又は非天然アミノ酸、又は同様の立体特性を有するペプチド模倣体で置換することを指す。置換される天然アミノ酸の側鎖が極性又は疎水性のどちらかである場合、保存的置換は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸、又は同じく極性又は疎水性である（置換されるアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）ペプチド模倣部分によるものでなければならない。

【0136】

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者には良く知られている。次の６つのグループは、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0137】

天然に存在するアミノ酸は典型的には、それらの特性に従ってグループ化されているので、立体的に類似した非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換は保存的置換と見なされという事実を念頭に置いて、天然に存在するアミノ酸による保存的置換が判定され得る。非天然アミノ酸による保存的置換を生成するために、当該技術分野で周知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することもまた可能である。天然アミノ酸のペプチド模倣体は、当業者に知られている文献で十分に立証されており、非天然（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ）又は非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸については下でさらに詳しく説明される。保存的置換に影響を与える場合、置換するアミノ酸は元のアミノ酸と同じ又は類似の官能基を側鎖に有する必要がある。

【0138】

「非保存的置換」又は「非保存的残基」という語句は、本明細書の用法では、親配列に存在するアミノ酸を、異なる電気化学特性及び／又は立体特性を有する別の天然又は非天然アミノ酸で置換することを指す。したがって、置換アミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（又は小さく）あり得て、及び／又は置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子特性を有する官能基を有し得る。このタイプの非保存的置換の例としては、フェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンによるアラニンの置換、グリシンによるイソロイシンの置換、又は－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ２）５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－によるアスパラギン酸の置換が挙げられる。非保存的置換には、保存的と見なされないあらゆる変異が含まれる。

【0139】

非保存的アミノ酸置換は、以下における変化によって生じ得る：（ａ）置換領域におけるアミノ酸骨格の構造；（ｂ）アミノ酸の電荷又は疎水性；又は（ｃ）アミノ酸側鎖の嵩高さ。一般に、タンパク質の特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、次のような置換である：（ａ）親水性残基が疎水性残基に（又はそれによって）置換される；（ｂ）プロリンがその他の残基に（又はそれによって）置換される；（ｃ）例えば、フェニルアラニンなどの嵩高い側鎖を有する残基が、例えば、グリシンなどの嵩高い側鎖のない残基に（又はそれによって）置換される；（ｄ）例えば、リシル基、アルギニル基又はヒスチジル基などの電気陽性側鎖を有する残基が、例えば、グルタミル基又はアスパルチル基などの電気陰性残基に（又はそれによって）置換される。

【0140】

例えば、挿入、欠失及び／又は置換によって変異ポリペプチドを生成するための天然アミノ酸配列の改変は、当業者に知られている様々な手段によって実行され得る。例えば、部位特異的変異は、修飾部位を含んでなる合成オリゴヌクレオチドを発現ベクターにライゲートすることによって導入され得る。交互に、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４２：１３３（１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３７：７３（１９８５）；Ｃｒａｉｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２－１９（Ｊａｎｕａｒｙ １９９５）；及び米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び米国特許第４，７３７，４６２号明細書で開示されるようなオリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発手順が使用され得る。変異を導入するための好ましい手段は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）である。

【0141】

任意の適切な発現ベクター（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ：１９８５）に記載されるような）と対応する適切な宿主が、組換えポリペプチドの産生のために採用され得る。発現宿主としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）内の細菌種；バキュロウイルスシステム（例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって記載されるような）を含む哺乳類又は昆虫宿主細胞システム；及びＣＯＳ－７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＢＨＫ細胞株などの確立された細胞株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、発現宿主の選択が、生成されるポリペプチドの種類に影響を与えることを認識している。例えば、酵母細胞又は哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞）中で産生されるポリペプチドのグリコシル化は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞中で産生されるポリペプチドのグリコシル化とは異なるであろう。

【0142】

交互に、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の標準的なペプチド合成技術を使用して合成され得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：１９８４）で概説されるように）。特に、ポリペプチドは固相合成の手順を使用して合成され得る（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４（１９６３）；Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：７０５－７３９（１９８７）；及び米国特許第５，４２４，３９８号明細書を参照されたい）。所望ならば、これは自動ペプチド合成装置を使用して実行され得る。ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔ－ＢＯＣ）又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸ブロック基の除去、及び樹脂からのポリペプチドの分離は、例えば、低温での酸処理によって達成され得る。次に、例えばジメチルエーテルで抽出して非ペプチド有機化合物を除去し、合成されたポリペプチドが樹脂粉末から抽出され得る（例えば、約２５％ｗ／ｖ酢酸で）。ポリペプチドの合成に続いて、不完全なポリペプチド又は遊離アミノ酸を除去するために、任意選択的にさらなる精製（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して）が実行され得る。合成ポリペプチドに対してアミノ酸分析及び／又はＨＰＬＣ分析が実施され、その同一性が検証され得る。本発明による他の適用については、当業者に公知であり本明細書に記載されるように、本明細書に記載の方法又はその他の遺伝的手段などによって、より大きな融合タンパク質の一部として、又は物理的又は化学的コンジュゲーションなどを介して、より大きな複合物の一部として、ポリペプチドを生成することが好ましくあってもよい。

【0143】

本発明のポリペプチドはまた、別の部分によって修飾、結合又は融合されて、精製を促進し、又はポリペプチドの生体内半減期を延長し、又は当該技術分野で既知の方法を使用するイムノアッセイで使用されてもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンド又はその他のタンパク質への結合などによって修飾されてもよい。

【0144】

「ペプチド模倣体」は、本発明のポリペプチドと実質的に同じ構造的及び／又は機能的特徴を有する合成化合物であり、後者については本明細書でさらに詳しく説明する。典型的には、ペプチド模倣体は、本発明のポリペプチドと同一又は類似の構造、例えば、ダイマーを形成する能力が低下した配列番号６又は２３の同一又は類似の配列、又はその断片を有する。ペプチド模倣体は、一般に、天然には合成されない少なくとも１つの残基を含む。ペプチド模倣化合物の非天然成分は、以下の１つ又は複数に従ってもよい：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）連鎖以外の残基結合基；ｂ）天然アミノ酸残基に代わる非天然残基；又はｃ）二次構造模倣を誘導する残基、すなわち、例えば、βターン、γターン、βシート、αらせんコンフォメーションなどの二次構造を誘導し又は安定化させる残基。

【0145】

ペプチド模倣体は、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ａｌ－Ｏｂｅｉｄｉ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５－２２３；Ｈｒｕｂｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１１４－１１９；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：１７－２７；Ｏｓｔｒｅｓｈ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｔ．２６７：２２０－２３４などの科学文献及び特許文献に記載されている様々な手順及び方法論を用いて合成され得る。

【0146】

本明細書で想定される修飾としては、側鎖への修飾、ポリペプチド合成中における非天然アミノ酸及び／又はその誘導体の組み込み、及び本発明のポリペプチドに立体構造的制約を課す架橋剤及びその他の方法の使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。分子がダイマーを形成する能力を低下させる翻訳後修飾をはじめとする、任意の修飾が本明細書で想定される。例としては、当該技術分野で知られているようなクリックケミストリーによって組み込まれる修飾が挙げられる。例示的な修飾としては、ペグ化及びグリコシル化が挙げられる。

【0147】

本発明によって想定される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化と、それに続くＮａＢＨ４による還元などによるアミノ基の修飾；メチルアセトイミド酸によるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；及びピリドキサール－５－リン酸によるリジンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＨ４による還元が挙げられる。

【0148】

アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサール、及びグリオキサールなどの試薬による複素環縮合生成物の形成によって修飾されてもよい。

【0149】

カルボキシル基は、Ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、それに続く、例えば対応するアミドへの誘導体化によって修飾されてもよい。

【0150】

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸によるシステイン酸への酸化；その他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸又はその他の置換マレイミドとの反応；４－クロロ水銀安息香酸、４－クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀塩化物、２－クロロ水銀－４－ニトロフェノール、及び他の水銀を使用した水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化などの方法によって修飾されてもよい。

【0151】

トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化、又は２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルブロミド又はスルフェニルハロゲン化物によるインドール環のアルキル化によって、修飾されてもよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって変性され、３－ニトロチロシン誘導体が形成されてもよい。

【0152】

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、又はジエチルピロ炭酸によるＮ－カルボエトキシル化によって達成されてもよい。

【0153】

タンパク質合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を組み込む例としては、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ－異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で想定される非天然アミノ酸の一覧を表２に示す。

【0154】

【0155】

【0156】

【0157】

【0158】

架橋剤は、例えば、ｎ＝１～ｎ＝６の（ＣＨ２）ｎスペーサー基を有する二官能性イミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分及び別の基特異的反応性部分を通常含むヘテロ二官能性試薬などのホモ二官能性架橋剤を使用して、３Ｄ立体構造を安定化するために使用され得る。

【0159】

「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体をはじめとするが、これらに限定されるものではない、様々な抗体構造を指す。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と同義的に使用されてもよい。

【0160】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリー又はその他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト源由来抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特に除外する。特に、「組換えヒト抗体」という用語には、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子組換えである動物（例えば、マウス）から単離された抗体；宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；及びヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、その他のあらゆる手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された全てのヒト配列抗体が含まれる。したがって、このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する。しかしながら、このような抗体は、生体外変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列遺伝子の組換え動物が使用される場合には、生体内体細胞変異誘発）に供され得て、したがって組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連する配列である一方で、生体内においてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい。

【0161】

スパイクタンパク質及びＲＢＤ
コロナウイルスのビリオンは、直径約８０～２００ｎｍの球形である。コロナウイルスの最も顕著な特徴は、ビリオンの表面から突き出たクラブ状の突起である。これらのスパイクはビリオンの特徴であり、それらに太陽コロナのような外観を与え、コロナウイルスという名前の由来となっている。ビリオンのエンベロープ内には、ヌクレオカプシドがありる。コロナウイルスはらせん対称のヌクレオカプシドを有しており、これはプラス鎖ＲＮＡウイルスでは稀であるが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスでは遥かに一般的である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶは、コロナウイルス科に属する。

【0162】

「ＣｏＶ－Ｓ」という用語は、コロナウイルスの「Ｓ」又は「Ｓタンパク質」又は「スパイクタンパク質」とも称され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶＳ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶＳなどの特定のＳタンパク質、又はコロナウイルス科のその他のメンバーを指し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、１２７３アミノ酸のＩ型膜糖タンパク質で、それはエンベロープに包まれたコロナウイルス粒子の表面でスパイク又はペプロマーを構成する三量体に集合する。このタンパク質には、（１）宿主受容体結合と（２）膜融合という２つの重要な機能があり、これらはＳタンパク質のＮ末端（Ｓ１）半分とＣ末端（Ｓ２）半分に帰せられる。ＣｏＶ－Ｓは、Ｓ１サブユニットに存在する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介してその同族受容体に結合する。全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列によって例示される。「ＣｏＶ－Ｓ」という用語には、異なるＣｏＶスパイクタンパク質又はその断片から単離された、ＣｏＶスパイクタンパク質のタンパク質変異型が含まれる。この用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウス又はヒトＦｃ、又はＲＯＲ１などのシグナル配列に、結合したＣｏＶスパイクタンパク質又はその断片も包含する。

【0163】

任意の実施形態において、スパイクタンパク質は、以下の表３をはじめとする本明細書に記載の変異株又は株に由来してもよい。

【0164】

任意の態様において、受容体結合ドメインは、以下の表３に記載されるものなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に由来してもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、ウイルスの元のＷＴ株から進化している（ゲノム参照配列：ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２）。本明細書に記載されるように、受容体結合ドメインは、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、デルタ、ラムダ、イオタ、ミュー又はオミクロン株（表３）、及びＲＢＤにおける変異を伴って出現すると予想されるその他の株に由来してもよい。任意の実施形態において、受容体結合ドメインは、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、デルタ、ラムダ、イオタ、ミュー、又はオミクロン株のＮ３３４－Ｐ５２７、及び例えば、Ｙ．１、ＡＹ．２、ＡＹ．３、及びＡＹ．４．２などのデルタプラスのような出現してもよいその他の株であってもよい。アルファ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに１つの変異、Ｎ５０１Ｙを保有する。ベータ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに３つの変異、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、及びＫ４１７Ｎを保有する。ガンマ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに３つの変異、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを保有する。カッパ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｌ４５２Ｒ及びＥ４８４Ｑを保有する。デルタ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｌ４５２Ｒ及びＴ４７８Ｋを保有する。ラムダ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｌ４５２Ｑ及びＦ４９０Ｓを保有する。イオタ変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに１つの変異、Ｅ４８４Ｋを保有する。ミュー変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに２つの変異、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙを保有する。オミクロン変異株は、元のＷＴ株と比較して、ＲＢＤに１５の変異、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、及びＹ５０５Ｈを保有する。

【0165】

ベータＲＢＤは、ひいてはベータＲＢＤ（例えば配列番号２２）（変異（Ｎ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、及びＥ４８４Ｋ）を有する）を含んでなる本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、ＲＢＤ変異Ｎ５０１Ｙ及びＫ４１７Ｎ（ＡＣＥ２への結合（Ｎ５０１Ｙ）及び免疫回避（Ｋ４１７Ｎ）に影響を及ぼすことが知られている２つの重要な変異）をオミクロンと共有するので、野生型ＲＢＤよりもオミクロンにより近い。同様の理由で、ベータＲＢＤは、ひいてはベータＲＢＤを含んでなる本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、ガンマ（Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ（免疫回避）、及びＫ４１７Ｔ）、ミュー（Ｎ５０１Ｙ及びＥ４８４Ｋ）、及びイオタ（Ｅ４８４Ｋ）により近い。本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又はベータＲＢＤ（例えば配列番号２）を含んでなる本発明の組成物は、ガンマ、ミュー、イオタ、及びオミクロンに対して優れた応答を駆動するはずである。

【0166】

【0167】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列、又は配列番号１５又は２８のどちらか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。一実施形態では、アミノ酸配列は、図６又は７に示される変異、又はアルファ、ベータ、ガンマ、カッパ、又はデルタ株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に関連して本明細書に記載される変異の１つ又は複数を含んでもよい。

【0168】

任意の態様において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメインは、０～８個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有する配列番号１５又は２８のどちらか１つ又は複数のアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、関連するアミノ酸配列は、０～７個、好ましくは０～６個、好ましくは０～５個、好ましくは０～４個、好ましくは０～３個、好ましくは０～２個、好ましくは０～１個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）を有してもよく、ここでアミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加（又はそれらの組み合わせ）は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。

【0169】

抗体のＦｃ領域及びＦｃ受容体結合ドメイン
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。換言すれば、Ｆｃ領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる、２つの重鎖フラグメントを含有する。本発明の文脈において、Ｆｃ領域は、２つの重鎖断片、好ましくは前記重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでなる。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合されている。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定数ドメインは、α、δ、ε、γ、μと称される。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＲＢＤ－Ｆｃダイマーは、いかなるエフェクター機能も、又はいかなる検出可能なエフェクター機能も示さない。「エフェクター機能」又は「エフェクター活性」は、抗体のＦｃ領域に帰せられる生物学的活性を指し、抗体イソタイプによって変動する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体など）の下方制御；及びＢ細胞活性化が挙げられる。生体外及び／又は生体内細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇が確認され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがってＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）ことが確実にされ得る。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）のページ４６４の表３で要約される。関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するための生体外アッセイの非限定的例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）；及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代案としては、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。このようなアッセイで有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代案としては、又はそれに加えて、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）で開示されているような、動物モデルにおいて生体内で評価されてもよい。抗体がＣ１ｑに結合できず、それ故ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実行されてもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレット及び国際公開第２００５／１００４０２号パンフレットにおける、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施されてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及び生体内クリアランス／半減期の判定はまた、当該技術分野で既知の方法を使用して実行され得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９Ａ１号パンフレットを参照されたい）。

【0171】

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ又は複数が置換された抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。このようなＦｃ変異体としては、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体をはじめとする、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。例えば、抗体変異型は、例えば、Ｆｃ領域の２３４位及び２３５位における置換（残基のＥＵ番号付け）など、ＦｃγＲ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含んでなってもよい。例えば、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である（例えば、国際公開第号パンフレット２０１２／１３０８３１を参照されたい）。さらに、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるような、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性の変化（すなわち減少）をもたらす変化が、Ｆｃ領域に加えられてもよい。

【0172】

いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、補体（Ｃ１ｑ）及び／又はＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合部位に対する変異を含む。いくつかの態様では、このような変異は、融合タンパク質を抗体指向性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体指向性細胞傷害性（ＣＤＣ）不能にすることができる。

【0173】

「Ｆｃ領域」という用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域もまた含まれる。Ｆｃ領域には、重鎖のカルボキシル末端が含まれていてもよい。宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコード化する特定の核酸分子の発現によって宿主細胞で産生される抗体は、全長重鎖を含んでもよいか、又はそれは全長重鎖の切断変異型を含んでもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるようなＥＵ指針とも称されるＥＵ番号付けシステムに従う。抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列変異型が想定されてもよい。抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列変異型は、抗体をコード化するヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。このような修飾としては、例えば、抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれらへの挿入、及び／又はそれらの置換が挙げられる。最終コンストラクトが、例えば、抗炎症応答の誘導又は支持などの所望の特性を有しているという条件で、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせによって最終コンストラクトが得られ得る。

【0174】

抗体のＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの抗体のクラスのいずれかのＦｃ領域であってもよい。抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２のサブクラス（イソタイプ）にさらに分類されてもよい。したがって、本発明の文脈で使用される場合、抗体はＩｇＧのＦｃ領域であってもよい。例えば、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ａｎＩｇＧ２、ａｎＩｇＧ２ｂ、ａｎＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。いくつかの態様では、本発明の融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域のＩｇＧを含んでなる。本発明の文脈において、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１のＦｃ領域である。

【0175】

Ｆｃ領域は、抗体のクラスに応じて２つ又は３つの定常ドメインに寄与する２つの重鎖で構成されている。Ｆｃ領域は、特定のタンパク質と結合することによって、各抗体が所与の抗原に対して適切な免疫応答を生じることを確実にする。

【0176】

Ｆｃ受容体結合ドメインは、細胞表面上のＦｃ受容体に結合する任意のタンパク質又はポリペプチドである。Ｆｃ受容体結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメインであってもよい。Ｆｃ受容体結合ドメインはまた、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、及び補体タンパク質などのその他の免疫分子にも結合する。

【0177】

リンカー
さらに、本明細書で提供される融合タンパク質は、リンカー（又は「スペーサー」）を含んでなってもよい。本発明の文脈において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン、又は受容体結合ドメインのダイマーのアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる、２つ以上のポリペプチドは、Ｃ末端でリンカーを介してＦｃ領域又はＦｃ受容体結合ドメインに融合される。

【0178】

リンカーは通常、最大２０アミノ酸の長さを有するペプチドである。「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」、又は「融合された（ｆｕｓｅｄ ｔｏ）」という用語は、例えばペプチド結合など、２つの部分の間に形成される共有結合を指す。したがって、本発明の文脈において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のアミノ酸の長さを有してもよい。例えば、本明細書で提供される融合タンパク質は、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン、又は受容体結合ドメインのダイマーのアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる、２つ以上のポリペプチドと、抗体のＦｃ領域との間のリンカー、例えば、Ｆｃ領域／ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端と受容体結合ドメインポリペプチドのＣ末端との間のリンカーを含んでなってもよい。このようなリンカーには、融合タンパク質の異なるポリペプチドが独立して折り畳まれ、期待されるような挙動を示す可能性を高めることができるという利点がある。

【0179】

したがって、本発明の文脈において、コロナウイルスのスパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン、又は受容体結合ドメインのダイマーのアミノ酸配列を含んでなるか又はそれからなる、２つ以上のポリペプチドと、抗体のＦｃ領域又はＦｃ受容体結合ドメインとが、単一の共有結合した多機能ポリペプチドに含まれてもよい。

【0180】

いくつかの態様では、本発明の融合タンパク質はペプチドリンカーを含む。いくつかの態様では、ペプチドリンカーには、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＳ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）又はＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）が含まれ得る。いくつかの態様では、ペプチドリンカーには、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（長さ６アミノ酸のリンカー）又はさらに長いアミノ酸配列が含まれ得る。リンカーは、異なる長さの一連の反復グリシン残基及びセリン残基（ＧＳ）、すなわち（ＧＳ）ｎであってもよく、ｎは１～１５以上の任意の数である。例えば、リンカーは、（ＧＳ）３（すなわち、ＧＳＧＳＧＳ）以上であってもよく、又は（ＧＳ）１１以上であってもよい。ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又はそれ以上をはじめとする、任意の数であり得ることが理解されるであろう。このような長さのリンカーを有する融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、リンカーを有していない融合タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。

【0181】

核酸
本発明のポリペプチドのいずれかをコード化する核酸分子もまた、本発明の範囲内である。核酸は、例えば、本発明のポリペプチドの製造において、及び治療薬として有用である。それらは、培養中又は生体内で細胞に投与されてもよく、細胞からの本発明のポリペプチドの分泌を誘導又は促進する分泌シグナルを含んでもよい。また、本発明の核酸を含有するか又は含む発現ベクター及び宿主細胞も、本発明の範囲内である（下でさらに詳しく説明される）。本発明の核酸は、定義上「単離された」と称されてもよい一方で、本発明のポリペプチドは野生型ポリペプチドではなく、したがって天然に存在する核酸によってコード化されないであろう。したがって、本発明のポリペプチド及び核酸は、「精製」、「実質的精製」、「単離」、「組換え」又は「合成」であってもよいが、天然に存在する物質と区別されるためにそうである必要はない。

【0182】

「単離された」核酸分子は、典型的にはスパイクタンパク質であるポリペプチドをコード化する核酸の天然供給源中で、それが通常結合している少なくとも１つの汚染核酸分子から、同定され分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然界で見られる形態又は設定とは異なる。したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、通常、スパイクタンパク質を発現する感染細胞に含有される核酸分子も含まれ、その場合、例えば、核酸分子は、天然の細胞とは異なる染色体上の位置にある。

【0183】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離又は精製された形態で提供されてもよい。選択されたポリペプチドを「コード化する」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に置かれると、生体内でポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列には、ウイルス、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡからのゲノム配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置してもよい。

【0184】

本発明のポリヌクレオチドは、例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているように、当該技術分野で周知の方法に従って合成され得る。

【0185】

本発明のポリヌクレオチド分子は、挿入配列と作動可能に連結された制御配列を含む発現カセットの形態で提供されてもよく、したがって標的対象における生体内での本発明のポリペプチドの発現を可能にする。これらの発現カセットは、次に、典型的には、核酸免疫化のための試薬としての使用に適したベクター（例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットは、宿主対象に直接投与されてもよい。代案としては、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターが、宿主対象に投与されてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製及び／又は投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有でき、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターであってもよい。

【0186】

したがって、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを含む。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列、及び任意選択的に、本明細書で定義される異なるポリペプチドをコード化する１つ又は複数のさらなるポリヌクレオチド配列を含んでなる、炎症性疾患又は病状の予防又は治療に使用するためのベクターを提供する。

【0187】

さらに、本発明の組成物及び生成物は、ポリペプチドとポリヌクレオチドの混合物を含んでなってもよいことが理解されるであろう。したがって、本発明は、いずれか１つのポリペプチドの代わりに、前記ポリペプチドを発現できるポリヌクレオチドがある、本明細書で定義される組成物又は製品を提供する。

【0188】

発現ベクターは、分子生物学の技術分野において日常的に構築され、例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために、プラスミドＤＮＡ及び適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、及び例えば必要であり、且つ正しい方向に配置されているポリアデニル化シグナルなどのその他の要素の使用を伴ってもよい。その他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。この点に関するさらなる例として、本発明者らはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）を参照する。

【0189】

したがって、本発明のポリペプチドは、このようなベクターを細胞に送達し、ベクターからの転写を生じさせることによって提供されてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド、又はベクターにおける本発明での使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる制御配列と作動可能に連結され、すなわちベクターは発現ベクターである。

【0190】

「動作可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が通常の機能を果たすように構成された、要素の配置を指す。したがって、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターなどの所与の調節配列は、適切な酵素が存在する場合、その配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を誘導する機能がある限り、配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列がプロモーター配列と核酸配列の間に存在しても、プロモーター配列は依然としてコード配列と「作動可能に連結された」と見なされ得る。

【0191】

いくつかの発現系が当該技術分野で記載されており、そのそれぞれは、典型的には、発現制御配列と作動可能に連結された、関心のある遺伝子又はヌクレオチド配列を含有するベクターからなる。これらの制御配列には、転写プロモーター配列、転写開始配列、及び転写終了配列が含まれる。本発明のベクターは、例えば、複製起点、任意選択的に前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択的にプロモーターの調節因子を備えた、プラスミド、ウイルス又はファージベクターであってもよい。「プラスミド」は、染色体外遺伝要素の形態のベクターである。例えば、細菌プラスミドの場合は、ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子などの１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよく、又は真菌ベクターの場合は、耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターは、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの生成のために生体外で使用されてもよく、又は例えば、哺乳類宿主細胞などの宿主細胞を形質移入又は形質転換するために使用されてもよい。ベクターはまた、例えば、ポリペプチドの生体内発現を可能にするために、生体内で使用されるように適合されてもよい。

【0192】

「プロモーター」は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの転写を開始し制御するヌクレオチド配列である。プロモーターには、誘導性プロモーター（プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される場合）、抑制性プロモーター（プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される場合）、及び構成的プロモーターが含まれ得る。「プロモーター」又は「制御要素」という用語は、全長プロモーター領域及びこれらの領域の機能的（例えば、転写又は翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。

【0193】

本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、シグナルペプチド配列をさらに含んでなってもよい。シグナルペプチド配列は、シグナルペプチドが発現されて、これもまたプロモーターと作動可能に連結したコード配列によってコード化されるポリペプチドの分泌を促進するように、一般にプロモーターと作動可能に連結して挿入される。

【0194】

典型的には、シグナルペプチド配列は、１０～３０個のアミノ酸、例えば１５～２０個のアミノ酸のペプチドをコード化する。多くの場合、アミノ酸は主に疎水性である。典型的な状況では、シグナルペプチドは、シグナルペプチドを保有する成長中のポリペプチド鎖を発現細胞の小胞体に標的化する。シグナルペプチドは小胞体中で切断され、ゴルジ装置を介してポリペプチドが分泌されるようになる。したがって、本発明のペプチドは、個体内の細胞からの発現及びそれらの細胞からの分泌によって、個体に提供されてもよい。

【0195】

免疫原性及びワクチン組成物
本発明は、本明細書で定義されるキメラタンパク質又は融合タンパク質を含んでなる組成物、及びコロナウイルス感染症の治療又は予防における免疫原性組成物又はワクチン組成物におけるこのようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の使用をさらに提供する。

【0196】

本明細書で使用される「ワクチン組成物」という用語は、疾患に対して生物を防御又は治療するために、組成物内の抗原（免疫原）に対する免疫応答を惹起するために使用される組成物として定義される。

【0197】

本明細書の用法では、「免疫刺激組成物」、「ワクチン組成物」、及び「免疫原性組成物」という用語は、一般に同義的に使用されてもよい。

【0198】

本発明の免疫刺激組成物又はワクチンは、治療的又は予防的活性成分としての本発明の１つ又は複数のペプチドに加えて、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、ビヒクル、緩衝剤又は安定化剤を適切に含んでもよい。このような担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0199】

免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、例えば、非経口（皮下、筋肉内、静脈内又は皮内をはじめとする、又は脳脊髄液への注射による）、経口（バッカル又は舌下をはじめとする）、経鼻、局所（バッカル、舌下又は経皮をはじめとする）、膣又は直腸経路などの任意の適切な経路による投与のために適合され得る。このような組成物は、例えば、無菌条件下でペプチドを担体又は賦形剤と混合することによって、薬学分野で公知の任意の方法によって調製され得る。典型的には、ワクチン組成物は、皮下、筋肉内、静脈内又は皮内経路による、典型的には、注射による投与のために適合される。代案としては、ワクチン組成物は、経口又は経鼻投与のために適合されてもよい。

【0200】

非経口投与のために適合された免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、意図された受容者の血液と製剤が実質的に等張になるようにする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び溶質を含有し得る、水性及び非水性の滅菌注射溶液；及び懸濁剤と増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液であってもよい。注射液のために使用され得る賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が挙げられる。組成物は、例えば密封アンプル及びバイアルなどの単位用量又は多回用量容器内で提示され得て、例えば、使用直前における注射用水などの滅菌液体携行（ｃａｒｒｉｅｄ）の添加のみを要する、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存され得る。即席注射液及び懸濁液は、無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。

【0201】

経口投与のために適合された免疫刺激又はワクチン組成物は、カプセル又は錠剤などの個別のユニットとして；散剤又は顆粒剤として；溶液、シロップ又は懸濁液（水性又は非水性液体；又は食用の泡又はホイップ；又はエマルション）として提示され得る。

【0202】

錠剤又は硬質ゼラチンカプセルのための適切な賦形剤としては、乳糖、トウモロコシデンプン又はそれらの誘導体、ステアリン酸又はそれらの塩が挙げられる。軟質ゼラチンカプセルと共に使用される適切な賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、又は液体ポリオールなどが挙げられる。

【0203】

溶液及びシロップの調製では、使用され得る賦形剤としては、例えば、水、ポリオール、及び糖が挙げられる。懸濁液の調製では、油（例えば植物油）を使用して、水中油又は油中水懸濁液が提供され得る。

【0204】

担体が固体である経鼻投与のために適合された免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、例えば２０～５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗粉末を含み、それは、嗅剤が鼻吸入される、すなわち鼻近くに保持される粉末容器からの鼻腔を介する迅速な吸入の様式で投与される。担体が液体である点鼻スプレー又は点鼻薬として投与するための適切な組成物は、活性成分の水溶液又は油溶液を含んでなってもよい。

【0205】

吸入による投与に適応された組成物としては、様々なタイプの定量投与加圧煙霧剤、ネブライザー又は注入器の手段によって生成され得る、微粒子ダスト又はミストが挙げられる。

【0206】

経皮投与のために適合された免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、受容者の表皮と長期間緊密に接触したままにすることを目的とした、個別のパッチとして提示されてもよい。例えば、活性成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３（６）：３１８（１９８６）に一般に記載されているように、イオン導入によってパッチから送達され得る。

【0207】

局所投与のために適合された組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、煙霧剤又は油として製剤化されてもよい。眼又はその他の外部組織、例えば、口及び皮膚の感染症の場合、組成物は局所軟膏又はクリームとして適用されてもよい。軟膏に製剤化する場合、有効成分はパラフィン系軟膏基剤又は水混和性軟膏基剤のどちらかと一緒に使用され得る。代案としては、活性成分は、水中油型クリーム基剤又は油中水型クリーム基剤を用いてクリームに配合され得る。眼への局所投与のために適合された医薬組成物は、有効成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁された点眼薬を構成してもよい。口内への局所投与のために適合された医薬組成物は、ロゼンジ剤、トローチ剤又はマウスウォッシュを構成してもよい。

【0208】

免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、保存料、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、芳香剤、塩（本発明の物質自体が薬学的に許容可能な塩の形態で提供され得る）、緩衝剤、コーティング剤又は抗酸化剤を含有してもよい。

【0209】

本発明のワクチン組成物はまた、本明細書で定義されるキメラタンパク質又は融合タンパク質に加えて、１つ又は複数のその他の予防的又は治療的に活性な薬剤を含有してもよい。

【0210】

本発明のワクチン組成物で使用するためのキメラタンパク質又は融合タンパク質は、凍結乾燥されていてもいなくてもよい。

【0211】

アジュバント
本発明のワクチン組成物はまた、本明細書で定義されるペプチドに加えて、薬学的に許容可能なアジュバントを含んでもよい。アジュバントは、ワクチン組成物の免疫原性を高めるために添加される。

【0212】

適切なアジュバントは当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される任意のもの、好ましくはＴＬＲ２作動薬、より好ましくはＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－ＣｙｓなどのＰａｍ－２－Ｃｙｓ含有分子、又は好ましくはＮＫＴ細胞の刺激因子、より好ましくはα－ガラクトシルセラミド（本明細書で「α－ＧａｌＣｅｒ」とも称される）、α－グルコシルセラミド、α－グルコシルジアシルグリセロール、α－ガラクトシルジアシルグリセロール、β－マンノシルセラミド、及びアシル鎖とスフィンゴシン鎖の長さ、飽和度、及び極性頭部基組成の多様性を含んでなる、それらの類似体が挙げられる。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＴＬＲ２－作動薬は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ、ＭＡＬＰ－２、リポテイコ酸、ＯｓｐＡ、Ｐｏｒｉｎ、ＬｃｒＶ、リポマンナン、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、及びザイモサンからなる群から選択され得る。

【0214】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリ－Ｉ：Ｃ、ＣｐＧ、ポリ－ＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、Ｂ（Ｃ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡＶ、モンタニドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、及びＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロンからなる群から選択され得るからなる群から選択される（ｃａｎ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）。

【0215】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、代謝可能な油及び乳化剤（洗剤又は界面活性剤など）を含んでなる。好ましくは、油及び乳化剤は、実質的にその全てが直径１ミクロン未満である油滴を有する水中油型エマルションの形態で存在する。例示的な代謝可能な油及び乳化剤は、６，２９９，８８４及び６，０８６，９０１に記載されている。一実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルションを含んでなる。好ましくは、油はスクアレンである。好ましくは、水相はクエン酸緩衝液（例えば１０ｍＭ、ｐＨ６．５）である。

【0216】

一実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルション中のスクアレンを含んでなる。好ましくは、アジュバントは、ツイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）及びＳｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレアート）をさらに含んでなる。アジュバントは、４．３％スクアレン、０．５％ツイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．５％Ｓｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレアート）を含んでなってもよく、任意選択的に４００ｐｉｇ／ｍｌのＭＴＰ－ＰＥ（Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－［１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－３（ヒドロキシホスホリル－オキシ）］エチルアミド）を含む。

【0217】

一実施形態では、組成物は５０％ｖｏｌ／ｖｏｌのアジュバントを含んでなり、好ましくはアジュバントはＭＦ５９（登録商標）である。ＭＦ５９（登録商標）は、スクアレン油の水中油型エマルションである。スクアレンは、ヒト、動植物に見られる天然に存在する物質であり、ワクチン製造工程のために高度に精製される。ＭＦ５９（登録商標）アジュバント（ＭＦ５９Ｃ．１）は、スクアレン内部油相とクエン酸緩衝液外部水相を備えた水中油型エマルションである。例えば、米国特許第６，２９９，８８４号明細書及び米国特許第６，０８６，９０１号明細書；Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．“ＭＦ５９－Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７７－２９６（１９９５）を参照されたい。２つの非イオン性界面活性剤、トリオレイン酸ソルビタン及びポリソルベート８０は、エマルションを安定化するのに役立つ。ＭＦ５９（登録商標）アジュバントの安全性は、動物及びヒトにおいていくつかの抗原と組み合わせて実証されている。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“ＭＦ５９ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｂｏｔｈ Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｏｌｄ Ｍｉｃｅ，”Ｖａｃｃｉｎｅ １４（６）：４７８－４８４（１９９６）を参照されたい。ＭＦ５９（登録商標）は、４．３％スクアレン、０．５％ツイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．５％Ｓｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレアート）であり、任意選択的に４００ｐｇ／ｍｌのＭＴＰ－ＰＥ（Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－［１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－３（ヒドロキシホスホリル－オキシ）］エチルアミド）を含む。ＭＦ５９の例示的な組成は、クエン酸緩衝液ｐＨ６．５（１０ｍＭのクエン酸、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）及び３９ｍｇ／ｍｌのスクアレン、４．７ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、４．７ｍｇ／ｍｌのソルビタントリオレアート、２．６５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、０．１７ｍｇ／ｍｌのクエン酸一水和物を含んでなる。

【0218】

任意の実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載されるいずれか１つであり、好ましくは、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ、α－ガラクトシルセラミド（本明細書で「α－ＧａｌＣｅｒ」とも称される）又はＭＦ５９（登録商標）である。

【0219】

投与量及び投与経路
本明細書の用法では、上気道（ＵＲＴ）には、鼻及び鼻道、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分の領域が含まれてもよい。

【0220】

典型的には、下気道（ＬＲＴ）には、声帯皺襞下部の喉頭の部分、気管、気管支、及び細気管支の領域が含まれる。肺は下気道に含まれ得て、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、及び肺胞が含まれる。本発明の任意の態様において、ＵＲＴへの投与は、鼻及び鼻道、副鼻腔、咽頭、及び声帯皺襞（声帯）上部の喉頭の部分への投与であってもよい。化合物がＵＲＴ内に保持されるか、又はＬＲＴの領域と接触しないという条件で、ＵＲＴの任意の１つ又は複数の領域への投与も想定される。

【0221】

「治療有効量」という語句は、一般に、（ｉ）特定の疾患、病状、又は障害を治療する、（ｉｉ）特定の疾患、病状、障害の１つ又は複数の症状を軽減、改善、又は除去する、又は（ｉｉｉ）本明細書に記載される特定の疾患、病状、又は障害の１つ又は複数の症状の発症を遅らせる、本発明の１つ又は複数のポリペプチド又はポリヌクレオチドの量を指す。望ましくない効果、例えば副作用が、望ましい治療的効果と共に現れることがある；したがって、実務家は、適切な「有効量」を決定する際に、潜在的なリスクと潜在的な利益のバランスを取る。

【0222】

いくつかの実施形態では、ヒト対象に対する本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の有効量は、約０．２５ナノモル／ｋｇ体重／用量～０．０００１ナノモル／ｋｇ体重／用量の範囲にある。好ましくは、範囲は、約０．２５ナノモル／ｋｇ体重／用量～０．０００１ナノモル／ｋｇ体重／用量である。より好ましくは、範囲は、約０．００２ナノモル／ｋｇ体重／用量～０．００１ナノモル／ｋｇ体重／用量である。いくつかの実施形態では、体重／用量範囲は、約０．２５ナノモル／ｋｇ～０．００１ナノモル／ｋｇ、約０．１ナノモル／ｋｇ～０．００１ナノモル／ｋｇ、約０．０２５ナノモル／ｋｇ～０．００１ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．０１ナノモル／ｋｇ～０．００１ナノモル／ｋｇ、又は約０．００５ナノモル／ｋｇ～０．００１ナノモル／ｋｇ体重／用量である。いくつかの実施形態では、量は、０．２５ナノモル、０．１ナノモル、０．０５ナノモル、０．０１ナノモル、０．００５ナノモル、０．００２ナノモル、又は０．００１ナノモル／ｋｇ体重／用量程度の本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質である。投薬体制は状況の緊急性に応じて調整され、最適な治療用量が得られるように調整される。

【0223】

いくつかの実施形態では、ヒト対象に対する本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質の有効量は、１用量当たり約１μｇ～１００μｇの範囲である。好ましくは、範囲は、１用量当たり約１μｇ～５０μｇである。より好ましくは、範囲は、１用量当たり約１μｇ～２０μｇである。いくつかの実施形態では、用量は、１用量当たり約５μｇ～１００μｇ、約５μｇ～５０μｇ、約１０μｇ～４５μｇ、約１０μｇ～２５μｇ、又は約１０μｇ～２０μｇである。いくつかの実施形態では、用量は、約、０．１μｇ、０．２μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ程度である。好ましくは、用量は１５μｇである。

【0224】

必要とされる正確な量は、対象の生物種、年齢及び全身状態、投与様式などに応じて、対象毎に異なるであろう。したがって、正確な「有効量」が特定できない可能性もある。しかしながら、個々の場合における適切な「有効量」は、当業者であれば日常的な実験のみを使用して決定できる。一態様では、対象に投与される用量は、ウイルス量を減少させる任意の用量である。

【0225】

キメラタンパク質又は融合タンパク質又はそのワクチン組成物は、防御免疫応答を誘導するために、当業者に公知の免疫化スキームを用いて投与され得る。これらとしては、単回免疫化、又はプライムブーストストラテジーにおける複数回の免疫化が挙げられる。ブースト免疫化は、初回免疫化（プライム免疫化）の数日後、数週間後、数ヵ月後、或いは数年後にさえ行われ得る。特定の実施形態では、初回プライム免疫化の２週間後、１ヵ月後、２ヵ月後、３ヵ月後、４ヵ月後、５ヵ月後、又は６ヵ月以上後にブースト免疫化が行われる。さらに、毎週、隔週、毎月、隔月、３ヵ月毎、又はそれ以上、複数回のブースト免疫化を行われ得る。その他の実施形態では、ブースト免疫化は、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、又は１２週間毎に行われる。特定の実施形態では、ブースト免疫化は、対象の血清中に防御的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体力価が認められるまで継続され得る。特定の実施形態では、防御的抗体力価を得るために、必要に応じて、対象は、１回のブースト免疫化、２回のブースト免疫化、３回のブースト免疫化、又は４回以上のブースト免疫化を受ける。さらなる実施形態では、初回プライム免疫化におけるアジュバントと、ブースト免疫化におけるアジュバントは異なる。代案としては、プライム免疫化におけるアジュバントと、ブースト免疫化におけるアジュバントは同じである。

【0226】

この投与は、必要な頻度で繰り返され得る。例えば、ワクチンの初回用量が投与され、後日ブースターが投与されてもよい。

【0227】

本発明の組成物は、筋肉内、鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内又は経口経路など、本明細書に記載の任意の好都合な経路によって投与され得る。

【0228】

本発明の組成物は、筋肉内、鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内又は経口経路など、本明細書に記載の任意の好都合な経路による投与のために製剤化又は適合される。

【0229】

本発明の組成物は、ＵＲＴのみに投与するために製剤化されてもよい。ＵＲＴへの限定は、量によって、特に形態、すなわち、乾燥粉末又は溶液液滴を問わず、さもなければＬＲＴ又はＴＲＴに投与されるであろう組成物の粒度、物理的形態の体積と組成によって、達成されてもよい。代案としては、本発明のワクチン組成物は、ＵＲＴ内のみでの保持を確実にする装置を介して投与されてもよい。

【0230】

本明細書に記載の組成物は、乾燥粉末、スプレー、ミスト、又は煙霧剤をはじめとする、鼻腔内投与のために製剤化されてもよい。これは、コロナウイルス感染症の治療にとって特に好ましくあってもよい。

【0231】

鼻腔内送達を使用して、送達をＵＲＴに限定するために採用され得るいくつかの選択肢がある：（１）液滴／粒度が、ＬＲＴへのアクセスを防ぐのに十分な大きさ（＞１０μｍ）であること確実にする；（２）液体の場合は、流出／排液を最小限に抑える投与量の制限；（３）同様に、流出／排出を最小限に抑える、頭部を逆転させた状態での投与；（４）鼻腔内での保持を促進して流出／排液を防ぐ、粘度増強剤／粘膜付着剤の組み入れ；（５）ＬＲＴ曝露の可能性を完全に排除する経鼻装置（Ｏｐｔｉｎｏｓｅ双方向性送達装置など）の使用。これらの方法の１つ又は組み合わせが適用され得る。

【0232】

適切な担体の選択は、想定される投与の特定の種類に依存する。例えば、鼻粘膜表面などの上気道を介した投与では、化合物は溶液、例えば、水又は等張生理食塩水（緩衝化又は非緩衝化）、又は懸濁液に製剤化されて、滴剤又はスプレーとして鼻腔内投与され得る。好ましくは、このような溶液又は懸濁液は、鼻分泌物に対して等張であり、例えば、約ｐＨ４．０～約ｐＨ７．４、又はｐＨ６．０～ｐＨ７．０の範囲などのほぼ同じｐＨである。緩衝液は生理学的に適合する必要があり、単なる例としてリン酸緩衝液が挙げられる。例えば、代表的な鼻充血除去剤は、約６．２のｐＨに緩衝化されていると記載されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、同上、１４４５ページ）。もちろん、通常の当業者であれば、鼻及び／又は上気道投与のための無害な水性担体に適した生理食塩水の含有量及びｐＨを容易に決定し得る。

【0233】

例えば、技術的に知られている、保存料、着色料、潤滑油又は粘稠な鉱油又は植物油、香料、芳香油のような天然又は合成の植物抽出物、及び例えばグリセロールのような保湿剤及び粘度増強剤もなどのその他の成分もまた含めて、製剤にさらなる粘度、保湿性、及び心地よい質感、及び匂いを提供し得る。本発明による溶液又は懸濁液の経鼻投与では、液滴、小滴、及びスプレーを生成するための様々な装置が当該技術分野で利用可能である。例えば、本明細書に記載のワクチン組成物は、ガラス、プラスチック、又は金属製の分注管を含む、単純なスポイト（又はピペット）の手段によって、鼻腔内に投与され得て、このスポイトから、一端に取り付けられた手動式ポンプ、例えば柔軟なゴム球によって供給される空気圧によって、内容物が一滴ずつ排出される。

【0234】

目の涙液分泌物は、眼窩から鼻道に排出されるので、所望であれば、本明細書に記載のワクチン組成物を送達するための担体として、適切な薬学的に許容可能な点眼液が当業者によって容易に提供され得て、点眼薬の形態で眼窩に投与されて、眼内投与と鼻腔内投与の双方が提供され得る。

【0235】

一実施形態では、滴剤又はスプレーとして送達するための溶液又は懸濁液を含有するスポイト又はスプレー装置を含む、予め測定された単位用量ディスペンサーが、投与される薬物の１回又は複数回の用量を含有して調製される。本発明はまた、ワクチン組成物の１回又は複数回の脱水単位用量を、任意の必要な塩及び／又は緩衝剤、保存料、着色剤などと共に含有するキットも含み、これは適量の水を添加することによって溶液又は懸濁液をすぐに調製できる。水は滅菌でも非滅菌でもよいが、一般的には滅菌水が好ましい。

【0236】

本発明の組成物は単位用量剤形で提供され得て、一般に密封容器内に提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットには、通常、（必ずしも必須ではないが）使用説明書が含まれる。それは、複数の前記単位用量剤形を含み得る。

【0237】

予防及び治療の方法
任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、本明細書に記載されるコロナウイルス株、特に表３のもののいずれか１つ又は複数に対する抗体、好ましくは中和抗体を生成する。任意の態様において、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物は、本明細書に記載のコロナウイルス株、特に表３に記載のコロナウイルス株のいずれか又は複数に対して、治療的又は予防的処置を提供する。以下に定義される態様及び実施形態において、「コロナウイルス」への言及には、表３に記載されるものをはじめとするが、これらに限定されるものではない、本明細書に記載のコロナウイルスの１つ又は複数の株、例えば、ＷＴ、アルファ及びベータ株；ＷＴ、アルファ、ベータ、及びＶＩＣ２０８９株；ＷＴ、アルファ、ベータ、デルタ株；ＷＴ、アルファ、ベータ、デルタ、デルタプラス、ガンマ、ラムダ、ミュー、イオタ、カッパ、及びミクロン株への言及も含まれる。本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質質、又は本発明の組成物は、キメラタンパク質又は融合タンパク質中のＲＢＤアミノ酸配列が由来するものとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して、治療的又は予防的利益を提供してもよい。

【0238】

本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、又は本発明の組成物が、それに対して治療的又は予防的利益をもたらす、例示的な株を実施例に示す。

【0239】

一態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルスに関連する疾患を治療及び／又は予防することを含んでなる、コロナウイルスに関連する疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。

【0240】

一態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患を治療及び／又は予防することを含んでなる、コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。

【0241】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルス感染に関連する呼吸器疾患又は病状を治療及び／又は予防することを含んでなる、コロナウイルス感染に関連する呼吸器疾患又は病状を治療及び／又は予防する方法を提供する。

【0242】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる気道炎症を軽減することを含んでなる、コロナウイルスに関連するか、又はそれによって引き起こされる気道炎症を軽減する方法を提供する。

【0243】

別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激剤を、それを必要とする対象に投与することによって、コロナウイルス感染中の呼吸器疾患又は病状を制御する対象の能力を改善することを含んでなる、コロナウイルス感染中の呼吸器疾患又は病状を制御する対象の能力を改善する方法も提供する。

【0244】

別の態様では、本発明は、コロナウイルス感染症と診断された、又はその疑いのある対象における自然免疫応答を惹起するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用を提供する。

【0245】

別の態様では、本発明は、コロナウイルスによって引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用を提供する。

【0246】

別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染に関連する呼吸器疾患又は病状を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用をさらに提供する。

【0247】

別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用をさらに提供する。

【0248】

別の態様では、本発明は、コロナウイルス感染症と診断された、又はその疑いのある対象における気道炎症を軽減するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用を提供する。

【0249】

別の態様では、本発明は、コロナウイルス感染中の呼吸器疾患又は病状を制御する対象の能力を改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の使用をさらに提供する。

【0250】

一態様では、本発明は、コロナウイルス感染症と診断された、又はその疑いのある対象における自然免疫応答を惹起するのに使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

【0251】

別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び／又は予防に使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

【0252】

別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染に関連する呼吸器疾患又は病状の治療及び／又は予防に使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

【0253】

別の態様では、本発明は、コロナウイルス感染症と診断された、又はその疑いのある対象における気道炎症の軽減に使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

【0254】

別の態様では、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染中の呼吸器疾患又は病状の制御に使用するための、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

【0255】

予防又は予防療法が意図され又は必要とされる本発明の任意の態様において、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物は、ウイルス感染症の臨床的又は生化学的に検出可能な症状の前に対象に投与される。

【0256】

本発明の任意の態様において、本明細書に記載のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の対象への投与は、対象におけるウイルス負荷を低減する。好ましくは、ウイルス負荷は、例えば、上気道及び／又は下気道などの気道において低減される。好ましくは、ウイルス負荷は、鼻腔及び咽頭（すなわち喉）において低減される。代案の実施形態では、ウイルス負荷は、胃腸管、末梢循環、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、又はコロナウイルスによる感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症に罹り易いことが知られているその他の器官に存在してもよい。

【0257】

「コロナウイルス感染症」又は「ＣｏＶ感染症」という用語は、本明細書の用法では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルスによる感染症を指す。この用語には、多くは下気道で発症するコロナウイルスによる気道感染症が含まれる。症状には、高熱、空咳、息切れ、肺炎、下痢などの消化器症状、臓器不全（腎不全及び腎機能不全）、敗血症ショックなどが含まれ得て、重症の場合は死亡する。

【0258】

コロナウイルス感染の減少は、治療後の対象からのサンプル中のウイルス負荷を測定し、それを治療前の同じ対象からのサンプル中のウイルス負荷と比較することを含む、当該技術分野で公知の、又は本明細書に記載の任意の方法を使用して判定されてもよい。サンプルは、対象から得られる任意の生物学的サンプルであってよく、血液、唾液、尿、糞便、鼻洗浄液、痰、及び粘液分泌物を含んでもよい。サンプルは気道、好ましくは例えば、鼻又は咽頭（すなわち喉）などの上気道から採取されてもよい。「呼吸器疾患」又は「呼吸器病状」という用語は、炎症を伴い、上気道（鼻腔、咽頭、喉頭を含む）及び下気道（気管、気管支、肺を含む）を含む呼吸器系の構成要素に影響を及ぼす、いくつかの病気のいずれか１つを指す。上気道及び下気道の炎症は、ウイルス感染に関連しているか、又はそれによって引き起こされてもよい。

【0259】

呼吸器疾患の症状には、咳、過剰な痰の分泌、息切れ感、又は聞こえる喘鳴を伴う胸部絞扼感などが含まれてもよい。

【0260】

呼吸器疾患の存在、改善、治療又は予防は、対象の臨床的又は生化学的に関連する方法、又はそれからの生検によって判定されてもよい。例えば、測定されるパラメータは、肺機能の存在及び程度、閉塞の徴候及び症状；運動耐性；夜間覚醒；学校や職場に通えなかった日数；気管支拡張剤の使用；吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）の用量；経口糖質コルチコイド（ＧＣ）使用；その他の薬剤の必要性；医学的処置の必要性；入院であってもよい。

【0261】

本明細書の用法では、呼吸器感染症という用語は、気道の任意の箇所の感染症を意味する。呼吸器感染症の例としては、風邪、副鼻腔炎、喉の感染症、扁桃炎、喉頭炎、気管支炎、肺炎、又は細気管支炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の任意の実施形態において、呼吸器感染症は風邪である。個人はウイルス検査によって気道感染症を有すると同定されてもよく、かゆみのある涙目、鼻汁、鼻閉、くしゃみ、咽喉痛、咳、頭痛、発熱、倦怠感、悪心、嘔吐、倦怠感、脱力感などの系（ｓｙｓｔｅｍｓ）を示してもよい。一態様では、呼吸器感染症を有する対象は、その他の呼吸器疾患を有していなくてもよい。ウイルス、好ましくはコロナウイルスの存在又は量の検出は、臨床サンプル（鼻洗浄液、喀痰、ＢＡＬ）又は血清学から単離された、ＲＮＡのＰＣＲ／配列決定によって行われてもよい。

【0262】

本明細書の用法では、呼吸器感染症という用語は、気道の任意の箇所のコロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症を意味する。

【0263】

個人はウイルス検査によって気道感染症を有すると同定されてもよく、かゆみのある涙目、鼻汁、鼻閉、くしゃみ、咽喉痛、咳、頭痛、発熱、倦怠感、悪心、嘔吐、倦怠感、脱力感などの症状を示してもよい。一態様では、呼吸器感染症を有する対象は、その他の呼吸器疾患を有していなくてもよい。ウイルスの存在又は量の検出は、臨床サンプル（鼻洗浄液、喀痰、ＢＡＬ）又は血清学から単離された、ＲＮＡのＰＣＲ／配列決定によって行われてもよい。対象の「治療」又は「治療する」という用語には、疾患又は病状、疾患の症状又は病状、又は疾患又は病状のリスク（又は易罹患性）を遅延させる、減速する、安定させる、治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、是正する、悪化を軽減する、回復させる、改善する、又は影響を与える目的での、本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の対象への適用又は投与（又は、本明細書に記載の本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物の、対象由来の細胞又は組織への適用又は投与）が含まれる。「治療する」とは、傷害、病態、又は病状の治療又は改善における任意の成功の指標を指し、これは、緩和；寛解；悪化の速度の減少；疾患の重症度の軽減；症状の安定化、軽減、又は傷害、病態又は病状を対象にとってより耐え易くする；変性又は衰退の速度を減速する；変性の最終点の衰弱を軽減する；又は対象の身体的又は精神的健康を改善するなどの任意の客観的又は主観的なパラメータを含む。

【0264】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をはじめとするコロナウイルスによって引き起こされる症状の広範さを考慮すると、本明細書に記載の方法によるワクチン接種に対する陽性応答には、対象が経験するあらゆる症状の回復又は改善が含まれてもよいことが理解されるであろう。

【0265】

例えば、ワクチン接種に対する陽性応答は、対象における倦怠感、筋肉痛、頭痛、及び／又は無気力状態の全体的なレベルの低下であってもよい。陽性応答にはまた、対象の発熱の低下及び無熱状態への復帰も含まれてもよい。

【0266】

ワクチン接種に対する陽性応答は、呼吸器ウイルス感染に続く呼吸器症状の悪化を予防又は減弱してもよい。これは、例えば質問票に基づいて、ベースラインから試験期間終了までの疾患スコアの平均変化の比較によって評価され得て、また、感染／風邪症状発症に続いて、下気道症状スコア（ＬＲＳＳ－胸部絞扼感、喘鳴、息切れ（ｓｈｏｒｔｎｅｓｓ ｏｒ ｂｒｅａｔｈ）、及び咳の症状）が毎日評価され得る。ベースラインの肺機能（最大呼気流量ＰＥＦ）からの変化もまた評価され得て、治療に対する陽性応答は、ＰＥＦの減少が有意に減衰することである。例えば、プラセボ治療群は増悪のピーク時に朝のＰＥＦの１５％の有意な低下を示す一方、治療群はベースラインからのＰＥＦの変化が１５％未満で有意でない低下を示す。

【0267】

ワクチン接種に対する陽性応答はまた、肺周辺又は胸膜の付近のすりガラス状の不透明度の存在の減少（例えば、胸部ＣＴ画像技術を使用して判定される）であってもよい。

【0268】

ワクチン接種に対する陽性応答にはまた、血中酸素レベルの上昇又は正常レベルへの復帰も含まれてもよい。

【0269】

ワクチン接種に対する陽性応答にはまた、血圧の変化及び凝固因子の存在の増加などの心血管障害の改善も含まれてもよい。

【0270】

防御免疫応答には、体液性免疫応答と細胞性免疫応答が含まれ得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御は、スパイクタンパク質に向けられた血清中和抗体（液性免疫応答）によって与えられると考えられており、粘膜ＩｇＡ抗体及び細胞媒介免疫応答もまた役割を果たしている。細胞性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する防御に有用であり、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答とメモリーＢ細胞応答が特に重要である。ＣＤ８＋免疫は、ウイルス感染細胞を死滅させるのに特に重要である。ナチュラルキラー細胞及びＮＫＴ細胞もまた、ウイルス感染細胞の殺滅及び／又は排除に重要であってもよい。

【0271】

キット
別の実施形態では、本発明の１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチド及び／又は上記の免疫原性組成物を含む、キット又は製造品が提供される。

【0272】

なおも別の態様では、本発明は、対象への別々の、後続の、又は同時の投与のための、本発明のワクチン組成物と、１つ又は複数のアジュバントとを含んでなる、部品のキットを提供する。

【0273】

その他の実施形態では、上記の治療又は予防用途で使用するためのキットが提供され、キットには以下が含まれる：
－本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は免疫原性組成物を保持する容器；
－使用説明書が記載されたラベル又は添付文書。

【0274】

任意の実施形態において、キットは、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を惹起するための１つ又は複数のさらなる有効成分又は活性成分を含有してもよい。

【0275】

キット又は「製造品」は、容器と、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含んでなってもよい。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。容器は、病状の治療に有効な治療用組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する、静脈注射用溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。ラベル又は添付文書は、治療用組成物が選択された病状を治療するために使用されることを示す。一実施形態では、ラベル又は添付文書は使用説明書を含み、治療用又は予防用組成物を使用して、本明細書に記載の炎症性疾患又は病状が治療され得ることを示す。

【0276】

キットは、（ａ）治療用又は予防用組成物；及び（ｂ）第２の有効成分又は活性成分が入った第２の容器を含んでなってもよい。本発明のこの実施形態におけるキットは、組成物及び他の活性成分を使用して、本明細書に記載される炎症性疾患又は病状に起因する障害が治療され得るか、又はそれに端を発する合併症が予防され得ることを示す添付文書をさらに含んでなってもよい。代案としては、又はそれに加えて、キットは、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬理的に許容可能な緩衝液を含んでなる、第２の（又は第３の）容器をさらに含んでなってもよい。それは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジをはじめとする、商業的及び使用者観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。

【0277】

任意の実施形態において、治療用組成物は、治療用、予防用、又は免疫原性の組成物を保持するための入れ物を含む、使い捨ての又は再利用可能な装置の形態で提供されてもよい。一実施形態では、装置は注射器である。装置は、１～２ｍＬの治療用又は免疫原性の組成物を保持してもよい。治療用又は予防用組成物は、すぐに使用できる状態で、又はさらなる構成成分の混合又は添加が必要な状態で、装置内に提供され得る。

【0278】

本明細書で開示され定義される本発明は、本文又は図面で言及される又はそれから明らかな２つ以上の個々の特性の全ての代替の組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。これらの全ての異なる組み合わせは、発明の様々な代替態様を構成する。

【0279】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それらは本発明の広い範囲を限定するものとしてどのようにも解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書で開示される原理の多くの変形及び修正を容易に考案し得る。

【実施例】

【0280】

実施例１－ＲＢＤ－ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質の生成
材料及び方法
ＲＢＤマウスＩｇＧ１ Ｆｃ融合体：
組換えＲＢＤマウスＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（配列番号３）を生成するために、祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｎ３３４－Ｐ５２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２；配列番号１５）の短縮型受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコード化する組換えＤＮＡ断片を、５’ＡｇｅＩと３’ＢａｍＨＩクローニング部位の間で合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。次にこれらを、コアヒンジ領域からＣ末端リジンに至るマウスＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号１６）を含有してＮ末端ＧＳＧＳＧリンカー（配列番号１７）を含む哺乳類発現ベクターｐＨＬＳｅｃにクローニングし、それによってＲＢＤをｍＩｇＧ１－Ｆｃに融合させた。

【0281】

ＲＢＤヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体：
組換えＲＢＤヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２５）を生成するために、ＧＳＧＳＧリンカー（配列番号１７）を介して、コアヒンジ領域からＣ末端リジンに至るヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（配列番号１８）に融合された祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｎ３３４－Ｐ５２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２；配列番号１５）をコード化する組換えＤＮＡ断片と、それに続く停止コドンを哺乳類発現のためにコドン最適化し（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５’ＮｈｅＩと３’ＸｈｏＩクローニング部位（ＩＤＴ）の間で合成した。次にこれを哺乳類発現ベクターｐＨＬＳｅｃ（配列番号４）にクローニングした。

【0282】

ＲＢＤモノマー：
組換えＲＢＤモノマーを生成するために、祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の短縮型受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｎ３３４－Ｐ５２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２；配列番号１５）をコード化する組換えＤＮＡ断片を哺乳類発現のためにコドン最適化し（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５’ＮｈｅＩと３’ＸｈｏＩクローニング部位（ＩＤＴ）の間で合成した。次に、これを哺乳動物発現ベクターｐＨＬＳｅｃにクローニングし、６－ＨＩＳタグとそれに続くＣ末端の終止コドン（配列番号８）を組み込んだ。ＲＢＤタンデムダイマーは、本明細書では一本鎖ＲＢＤダイマーとも称される。

【0283】

ＲＢＤタンデムダイマー：
組換えＲＢＤタンデムダイマーを生成するために、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｅｌｌ，２０２０）に基づき、タンデムに繰り返される祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｒ３１９－Ｋ５３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２．２、配列番号１９及び２０）の２つの短縮形受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコード化する組換えＤＮＡ断片を哺乳類発現のためにコドン最適化し（ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５’ＮｈｅＩと３’ＢａｍＨＩクローニング部位（ＩＤＴ）の間で合成した。次に、これを哺乳動物発現ベクターｐＨＬＳｅｃにクローニングし、６－ＨＩＳタグとそれに続くＣ末端の終止コドン（配列番号１１）を組み込んだ。

【0284】

ＲＢＤベータヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体
ＧＳＧＳＧリンカー（配列番号１７）を介して、コア－ヒンジ領域からＣ末端リジンに至るヒトＩｇＧ１（配列番号１８）のＦｃドメインに融合された祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｎ３３４－Ｐ５２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ＿０４５５１２；配列番号１５）の短縮型ＲＢＤをコード化する組換えＤＮＡ断片と、それに続く哺乳類発現ベクターｐＨＬＳｅｃからの停止コドンを哺乳類発現ベクターｐＸＣ－１７．４にクローニングできるように、ＰＣＲプライマーを設計した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを使用して哺乳類発現ベクターｐＸＣ－１７．４にクローニングし、配列番号２９に記載のポリヌクレオチドを生成した。変異Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙを導入するために、ＰＣＲ変異誘発を使用した。これは、ＤｏＣｏ－Ｐｒｏ－ＲＢＤ－１ ＡＤＰの生成のために使用されたコンストラクトであった。

【0285】

タンパク質発現：
ＲＢＤ－βヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質を除く全てのＲＢＤタンパク質は、製造業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３形質移入キットを使用したＥｘｐｉ２９３Ｓ細胞の一過性形質移入によって発現させた。タンパク質を６日目に採取した。ＲＢＤ－Ｆｃタンパク質をプロテインＡセファロース（ＣＬ－４Ｂ、Ｃｙｔｉｖａ）によって上清から精製し、ＲＢＤモノマー及びＲＢＤタンデムダイマーをＮｉ－ＮＴＡ樹脂（ＨｉｓＰｕｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって精製した。全てのタンパク質はゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーを使用してさらに精製し、ＲＢＤ－Ｆｃ及びＲＢＤタンデムダイマーはＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ＲＢＤモノマーはＳｕｐｅｒｄｅｘＳ７５カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、さらに精製した。全てのタンパク質は滅菌濾過し、使用前に－８０℃で保存した。

【0286】

ベータＲＢＤ－ｈＦｃタンパク質を発現する安定したプールのための研究細胞バンク（ＲＣＢ）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＱＬＤノード）で開発された。Ｌｏｎｚａ ＧＳｖ９（商標）の推奨に従って、単一バイアルからの細胞を振盪フラスコ内で復活及び増殖させ、１２日間にわたる流加振盪フラスコ生産でタンパク質を生産した。馴化培地は、深層濾過と０．２μｍ濾過によって採取した。抗原はプロテインＡ樹脂、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ）上で捕捉し、ｐＨ４．０で溶出した。抗原は、ｐＨ３．５まで酸性化して６０分を超えて保持し、次にｐＨ５．５まで中和して、低ｐＨウイルス不活化に供した。抗原をｐＨ６．５のクエン酸緩衝液で緩衝液交換し、ＰＳ８０を０．０２％で配合して、１．０６ｍｇ／ｍＬに希釈した後、無菌的にバイアルに充填した。

【0287】

タンパク質のＡＦ６４７－コンジュゲーション：
次に、精製したＲＢＤ－ｍＦｃ及びマウスＩｇＧ１イソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ－２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、製造業者の指示に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。

【0288】

結果及び考察
ＲＢＤモノマー、ＲＢＤタンデムダイマー、及びＲＢＤ－ＩｇＧ１ Ｆｃダイマーの３つの異なる形態（図１Ｂ）での発現のために、単離形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（図１Ａ）をコード化するＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＨＬＳｅｃにクローニングした。マウス及びヒトの双方のＲＢＤ－ＩｇＧ１ Ｆｃダイマーを生成した。これらのタンパク質は、哺乳類Ｅｘｐｉ－２９３Ｓ細胞を一過性に形質移入することによって発現させ、６日後、ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィー（図１Ｃ～Ｇ）によってタンパク質を単離精製した後、滅菌濾過して－８０℃で保存した。

【0289】

精製されたＲＢＤ－Ｆｃダイマータンパク質の活性は、ＲＢＤの天然受容体であるヒトＡＣＥ２を発現するように形質移入された２９３Ｔ細胞を染色することによって、検証した（図１Ｈ）。無関係のタンパク質（Ｔ細胞受容体）を形質移入された対照細胞株は、ＲＢＤ－Ｆｃダイマーでは染色されなかったが、抗ＴＣＲ抗体では予想通り染色された。

【0290】

実施例２－アジュバントあり又はなしでのＲＢＤ－Ｆｃダイマーの皮下及び鼻腔内接種経路の比較
材料及び方法
ワクチン接種及び採血体制
ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群ｎ＝５）に、アジュバントなしで投与される、又は０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又は０．２μｇのα－ＧＣのアジュバントの存在下で投与される、０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを尾の付け根の皮下経路（１００μｌ）又はＵＲＴへの経鼻経路（１５μｌ）のどちらかを介してワクチン接種した。マウスを０日目にプライミングし、２８日目にブーストした。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採血した。

【0291】

ＲＢＤ特異的抗体応答を測定するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＲＢＤ特異的抗体力価は、ＥＬＩＳＡによって判定した。平底９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の２μｇ／ｍｌ濃度のＲＢＤモノマーで、５０μｌ／ウェルでコーティングした。プレートは加湿雰囲気下、４℃で一晩インキュベートした。未結合抗体を除去し、ウェルをＰＢＳ中の１００μｌ／ウェルの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ画分Ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｉｂｃｏ）で１～２時間ブロックした後、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。マウス血清の連続希釈液をウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ウサギ抗マウスＩｇ Ａｂ（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、結合したＡｂを検出した。検出抗体を加湿雰囲気下、室温で１時間インキュベートし、次にプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、１００μｌのテトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５２１４）を各ウェルに加え、５～７分後に１Ｍオルトリン酸（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の１００μｌ／ウェルの添加によって反応を停止させた。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍの波長で各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を測定した。Ａｂの力価は、０．３のＯＤを達成するのに必要な、血清の最高希釈率の逆数として表される。

【0292】

微量中和アッセイ
微量中和アッセイで使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株は、ベロ細胞培養物中で増殖させ－８０℃で保存した。アッセイの前日に、ベロ細胞を平底９６ウェルプレートに、２×１０^４細胞／ウェルで播種した。熱不活化血清の連続２倍希釈液を、１００ ＴＣＩＤ_５０（５０％組織培養感染用量）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共に１時間インキュベートし、残留ウイルス感染力をベロ細胞の４つのウェルで評価した。プレートを３７℃でインキュベートし、５日目にウイルス細胞変性効果を測定した。中和抗体力価は、Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて計算した。

【0293】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サロゲートウイルス中和試験
ＡＣＥ２受容体タンパク質とＲＢＤとの間の相互作用の抗体媒介遮断に基づく、スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に向けられた循環抗体の検出は、製造業者の指示に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サロゲートウイルス中和試験（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）を使用してマウス血清中で測定した。手短に述べると、１０μｌのマウス血清を９０μｌのサンプル希釈緩衝液で希釈し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質（ＨＲＰ－ＲＢＤ）と共にインキュベートした；試験溶液を、固定されたＡＣＥ２受容体でコーティングされたウェルに添加した。光学濃度の読み取りによって対照血清と比較して、血清がＨＲＰ－ＲＢＤのＡＣＥ２受容体への結合を阻害する程度を判定し、２０％以上の阻害が陽性結果と見なされた。

【0294】

結果及び考察
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群を、アジュバントなしで、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ）アジュバント又はα－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）アジュバントと混合して、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー（ＲＢＤ）で免疫化した。皮下及び鼻腔内（上気道、ＵＲＴ）の２つの免疫化経路を試験した。

【0295】

１回目の注射（０日目）の４週間後に、同一のブースト注射が続いた。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採血した。各群の各マウスについて、ＲＢＤ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、総抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体力価を判定した（図２）。

【0296】

これらの結果は、アジュバントを含まないＲＢＤが、事前採血サンプルによって判定されるバックグラウンドを超える応答をほとんど誘導しないことを示した。しかしながら、どちらのアジュバント（Ｐ２Ｃとα－ＧＣ）も一次注射後に非常に強い抗体力価（１０^３～１０^４）を誘導し、二次注射後には１０^５以上の抗体力価を誘導した。

【0297】

これらの血清サンプルはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを使用した微量中和アッセイでも検査され、中和力価は、ベロ細胞の感染を阻害するために必要な力価によって判定された。このアッセイは、一次免疫化後の高い抗体力価にもかかわらず、抗体がほとんど又は全く誘導されないことを実証した。しかし、二次免疫化後、アジュバントと合わせたＲＢＤが投与された全ての群で、抗体力価２００～２０００の範囲の非常に強力な中和抗体応答が検出された（図３）。

【0298】

これらの血清サンプルの中和能の独立した検証として、サロゲートウイルス中和試験（ｓＶＮＴ）として知られる別個のアッセイ（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）もまた採用された。この検査では、抗体を含有するサンプルが、ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を妨げる能力を測定する。実施し得る検査数が限られているので、二次血清サンプルのみを検査したところ、このアッセイにおいてアジュバント添加ＲＢＤワクチンは、ＲＢＤ－ＡＣＥ－２結合を９５％を超えて阻害することが明らかになった。非アジュバント添加ＲＢＤワクチンで免疫化されたマウスからの血清は、このアッセイでは中和抗体応答を記録できなかった（図４）。

【0299】

これらのデータは、同じ実験ではないが、同じ期間枠で採取されアッセイされた、ヒト回復期患者サンプル（ｈＣｏｖ）から得られた同様のデータとも関連付けて提示されている（図５）。これらのデータは、比較としてのみ提供されている。

【0300】

実施例３－スパイクタンパク質変異型の試験
ヒト回復期血漿サンプル（ｈＣｏｖ）
ヒト回復期血漿サンプル（ｈＣｏｖ）ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、及びＤＤ４は、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａ教授（Ｐｅｔｅｒ Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、微生物学及び免疫学部）から供給された。これらの患者は、２０２０年４月にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢指標株ＶＩＣ０１に感染した。微量中和アッセイを用いて、５０１Ｙ及び４７７Ｎ変異体（ＶＩＣ２０８９及びＶＩＣ４８８１）、及び元のＶＩＣ０１株に対する中和活性について血清を試験した。

【0301】

マウス血清サンプル
ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群ｎ＝５）に、アジュバントなしで投与される、又は０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又は０．２μｇα－ＧＣアジュバントの存在下で投与される、０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを尾の付け根の皮下経路を介してワクチン接種した。マウスを０日目にプライミングし、２８日目にブーストした。２回目の用量から４週間後に採取した血清を、微量中和アッセイを用いて、５０１Ｙ及び４７７Ｎ変異体（ＶＩＣ２０８９及びＶＩＣ４８８１）、及び元のＶＩＣ０１株に対する中和活性について試験した。これらの血清はまた、マルチプレックスビーズアレイを使用して、１８個のＲＢＤ変異タンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）への結合についても試験した。

【0302】

結果及び考察
オーストラリアで２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）及び（Ｄ６１４Ｇ／Ｓ４７７Ｎ）が出現したことから、本発明者らは、これらのウイルスの単離株（ＶＩＣ２０８９及びＶＩＣ４８８１）について、３つの異なる回復期患者血漿サンプル（ＤＤ２、ＤＤ３、及びＤＤ４）によって中和される能力を元のＶＩＣ０１株と比較して試験した（図６Ｂ）。ＤＤ１は、測定可能な中和抗体力価を含有しない患者サンプルとして含めた。サンプルＤＤ２、ＤＤ３、及びＤＤ４は、変異株（ＶＩＣ２０８９及びＶＩＣ４８８１）を中和する能力が損なわれていた。これにより、元のＶＩＣ０１株に感染した患者は、これらの新しい変異株に対して限定的な免疫を有していてもよく、さらに、ワクチンに使用されるＳタンパク質が武漢指標（ＶＩＣ０１）株に基づいていることから、これらの変異株の出現が、ワクチン誘導免疫の有効性と寿命を限定してもよいことが示唆される。

【0303】

次に、本発明者らは、Ｐ２Ｃ又はα－ＧＣアジュバントの存在下で、ＲＢＤ－Ｆｃダイマーワクチンで免疫化されたマウスからの血清について、これら２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和する能力が損なわれているかどうかを試験した（図６Ｃ）。結果は、これらの免疫化マウス血清サンプルが、α－ＧＣをアジュバントとして使用した場合、元のＶＩＣ０１株と少なくとも同等か又はそれ以上にこれらの変異ウイルス株を中和できることを明らかに示す。より広範囲のＲＢＤ変異株を調べるために、本発明者らは、世界的流行中にこれまでに検出された１８の異なるＲＢＤ変異株への結合を比較できる、ＲＢＤマルチプレックスアッセイを用いた（図７）。Ｐ２Ｃ又はα－ＧＣアジュバントのどちらかと組み合わせたＲＢＤワクチンで免疫化されたマウス由来の血清サンプルの結合能力（最大半量有効濃度（ＥＣ_５０）として示される）には、ほとんど差がないことが判明した。結合が最も弱い（ＥＣ_５０が最も低い）変異株はＴ４７８Ｉであったが、これでも３００を超える高いＥＣ_５０読み取りを示した。

【0304】

総合すると、アジュバントと合わせたＲＢＤ－Ｆｃダイマーによるワクチン接種は、異なるウイルス株に対する微量中和アッセイにおいて同等レベルの中和を達成する（図５）。これは、ワクチンが全ての免疫応答をＲＢＤエピトープに集中させ、この標的の包括的カバーを提供するので、個々のアミノ酸残基の変異がワクチン誘導免疫から逃れられにくくなるためであると考えられる。ワクチンがスパイク全体又はウイルス全体に基づく場合は、免疫系がカバーするエピトープがより多く存在するので、このようなことが起こる可能性がより低くなってもよい。

【0305】

実施例４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マウスチャレンジモデルにおけるワクチンの試験
材料及び方法
ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マウスチャレンジモデルの確立
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス群を、指標ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＶＩＣ０１又はＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）変異株のどちらかで、煙霧剤チャレンジした。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０；５０％組織培養感染用量）は、前日に２×１０^４細胞／ウェルの濃度で平底９６ウェルプレートに播種したベロ細胞単層上で、上清を滴定して判定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０倍連続希釈液をベロ細胞の４つのウェルで評価し；ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）を５日後に測定した。

【0306】

ワクチン接種マウスの上気道及び肺における防御効果の評価
ワクチン接種後の指定された時間に、煙霧剤によってマウスをＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）変異体でチャレンジした。チャレンジの３日後にマウスを殺処分し、心臓穿刺によって血液を採取した。左肺を採取し、組織学のために４％パラホルムアルデヒド中で固定した。チャレンジされたマウスの肺及び鼻甲介におけるウイルス力価を判定するために、右肺葉及び鼻甲介を採取し、５００μｌの培地中でビーズビートによって均質化し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。次に、上清を収集し、試験するまで－８０℃で保存した。感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０；５０％組織培養感染用量）は、前日に２×１０^４細胞／ウェルの濃度で平底９６ウェルプレートに播種したベロ細胞単層上で、上清を滴定して判定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０倍連続希釈液をベロ細胞の４つのウェルで評価し；ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）を５日後に測定した。

【0307】

結果及び考察
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶＩＣ２０８９株は、元のＶＩＣ０１株と比較して２つの重要な変異、Ｄ６１４Ｇ及びＮ５０１Ｙを保有する。後者の変異は、このアミノ酸置換が、以前にマウスに適応したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスで観察されていることから、特に重要である。これは、５０１Ｎ残基を有する元の祖先型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスとは対照的に、Ｎ５０１Ｙ変異ＲＢＤがマウスＡＣＥ２に結合できるためである。したがって、本発明者らは、天然に存在する変異株の単離株を、２つの一般的に使用されるマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃ）において試験した（図８）。その結果、Ｎ５０１Ｙ変異株はこれらのマウスに感染し、３日前後をピークに高いウイルス力価を示したのに対し、元の野生株（Ｎ５０１）はこれらのマウスに感染できなかったことが示された。そこで本発明者らは、免疫化されたマウスをウイルスでチャレンジするための小動物モデルを開発した。

【0308】

免疫化されたマウスからの血清サンプルがＶＩＣ２０８９株を中和できることを確認するために、図９にＷＴとＶＩＣ２０８９株を並べて比較した中和力価を示すが、有意差は観察されなかった。

【0309】

本発明者らは、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃワクチン単独で、又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又はα－ＧａｌＣｅｒアジュバントと共に、予め（およそ１００日前に）免疫化されたマウスを試験した。２回目の免疫化とウイルスチャレンジの間に長い期間があったにもかかわらず、どちらかのアジュバントと合わせたＲＢＤで免疫化されたマウスは、肺感染から完全に防御され、肺サンプル中に検出可能なウイルスはなかった。これは、ワクチンが皮下投与されたか鼻腔内投与されたかに関係なく見られた。アジュバント無添加のＲＢＤワクチンでは、防御は得られなかった（図１０）。本発明者らはまた、上気道防御の尺度としてマウスの鼻甲介からのサンプルも試験した。これらの免疫化されたマウスの一部では、依然として低レベルのウイルスが検出可能であった一方で、ウイルス力価は少なくとも９９％減少し、α－ＧａｌＣｅｒと合わせたＲＢＤで皮下経路を介して免疫化されたマウスの４／５匹では、検出可能なウイルスはなかった（図１１）。

【0310】

実施例５－ＲＢＤワクチンの筋肉内投与の有効性評価
材料及び方法
ワクチン接種及びチャレンジ体制
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを５０μｌで筋肉内接種した。マウスを０日目にプライミングし、２８日目にブーストした。４週間後、マウスをＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株で煙霧剤チャレンジした。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照ＢＡＬＢ／ｃマウスもまた、同時にチャレンジした。

【0311】

５匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群は、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される０．１ナノモルのＲＢＤダイマーを筋肉内ワクチン接種した。マウスを０日目にプライミングし、１４日目にブーストして、３ヶ月後にＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジした。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスもまた、同時にチャレンジした。

【0312】

ワクチン接種マウスの上気道及び肺における防御効果の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスの双方をチャレンジしてから３日後に、動物を殺処分し、右肺葉と鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。組織における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定した。

【0313】

結果及び考察
臨床現場における注射経路は通常、筋肉内であるので、本発明者らはまた、マウスウイルスチャレンジエッセイ（ｅｓｓａｙ）において、筋肉内経路（四頭筋（ｑｕａｄｒａｃｅｐｔ））を介して免疫化されたマウスも試験した。これらのデータは、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤワクチンで免疫化された１０／１０匹のマウスの肺及び鼻甲介の双方で、ウイルスが検出できないことを印象的に示した（図１３）。同様の結果はＣ５７ＢＬ／６マウスの５／５でも観察され、ワクチンが２つの異なる実験用マウス系統にわたって完全に防御的であることが示唆された。

【0314】

実施例６－ＲＢＤマウスＦｃダイマー、ＲＢＤヒトＦｃダイマー、及び一本鎖ＲＢＤダイマーの比較
材料及び方法
ワクチン接種及び採血体制
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群５匹）に、全て０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される、０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマー、ＲＢＤヒトＦｃダイマー、又は一本鎖ダイマーのいずれかを５０μｌで筋肉内ワクチン接種した。マウスを０日目にプライミングし、２８日目にブーストした。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（４２°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採血した。ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与される３つの異なるＲＢＤ抗原によって誘導された抗体応答の持続性を評価するために、マウスは６３日目と８２日目にも採血した。全ての血清サンプルは、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査した。

【0315】

結果及び考察
次に、本発明者らは、ダイマーを生成するためにマウスのＦｃ領域とヒトのＦｃ領域のどちらを使用するかによってＲＢＤワクチンの効力に違いがあるかどうか、また単純な一本鎖ダイマーでも同様に機能するかどうかを試験した。本発明者らは、それぞれアジュバントとしてＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを使用して、マウスＩｇＧ１ Ｆｃ領域と、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と、又は一本鎖ＲＢＤダイマーと融合したＲＢＤを比較した（図１４ａ）。マウスＦｃダイマーは、一次免疫化及び二次免疫化後にヒトＦｃダイマーよりわずかに強い応答を示した一方で、ＲＢＤ一本鎖ダイマーは一次免疫化後に非常に弱い応答を誘導したが、これはブースト後にＦｃダイマーと同様のレベルまで上昇した（図１４ｂ）。マウスＦｃダイマーは、マウスＦｃ受容体に対するマウスＦｃの適合性がより高いので、マウスにおいてほぼ確実にヒトＦｃダイマーよりも良好に機能した。しかしながら、最終的にはヒトもワクチンで免疫化されるので、ヒトＦｃダイマーがマウスでもほぼ同様に機能したことは有望であり、これはヒトではより良く機能すると考えられる。

【0316】

本発明者らは、各ＲＢＤ製剤（アジュバントとしてＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを使用）に対する応答の持続性を測定した（図１５）。マウスダイマーとヒトダイマーはどちらも、１回目の注射から最長８４日間、安定したレベルのＲＢＤ特異的抗体力価を示した。対照的に、ＲＢＤ一本鎖ダイマーで免疫化されたマウスの抗体レベルは、８４日の時間枠で漸進的低下を示し、このダイマーによる応答の持続性が低いことが示唆された。これは、ヒトを免疫化する場合、ＲＢＤヒトＩｇＧ１ Ｆｃダイマーが、強力で持続的な応答を提供する最適な製剤であることを示唆する。

【0317】

実施例７－ＭＦ５９（登録商標）アジュバントと合わせたＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーの試験
材料及び方法
ワクチン接種及び採血体制
ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかを配合した、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマーをワクチン接種されたマウスにおけるＲＢＤ特異的抗体応答を評価するために、１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーと０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓで、又は０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーとＭＦ５９（登録商標）（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）で、５０μｌで筋肉内免疫化した。マウスは１回目の免疫化の前（事前採血）、及び１４日目（１°）に採血され、１４日目又は２８日目のどちらかでブーストし、どちらの場合も２回目の免疫化（２°）の２週間後に再採血した。

【0318】

ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかを配合した、ＲＢＤマウスＩｇＧ１－Ｆｃダイマー又はＲＢＤ一本鎖ダイマーをワクチン接種されたマウスにおけるＲＢＤ特異的抗体応答を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、どちらも０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又はＭＦ５９（登録商標）（５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を配合した、１０μｇのＲＢＤマウスＦｃダイマーで、又は１０μｇのＲＢＤ一本鎖ダイマーで、筋肉内免疫化した。マウスを０日目にプライミングし、１４日目にブーストした。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の４週間後（２°）に採血した。全ての血清サンプルは、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査した。

【0319】

結果及び考察
ＭＦ５９（登録商標）は比較的良く確立されたアジュバントであるので、本発明者らは、次にこれをＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントと比較した（図１６）。マウスは、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ又はＭＦ５９（登録商標）アジュバントのどちらかと共に、ＲＢＤマウスＦｃダイマーで免疫化した。マウスは１回目の免疫化の前に採血し（事前採血）、２週間又は４週間後のどちらかでブーストし、それぞれの場合において二次免疫化の２週間後に再採血して、総抗ＲＢＤ特異的ＩｇＧ力価を判定した。この実験により、ＭＦ５９（登録商標）アジュバントが、ＲＢＤ特異的抗体を高力価で誘導するのに、同等に良好かそれ以上であることが明らかになった。

【0320】

本発明者らはまた、ＭＦ５９アジュバント（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントの存在下で、ＲＢＤマウスＦｃダイマーをＲＢＤ一本鎖ダイマーと比較した（図１７）。一次免疫化と二次免疫化の双方の後、どのアジュバントを使用したかに関係なく、ＲＢＤ Ｆｃダイマーをワクチンとして使用した場合の抗体力価は、ＲＢＤ一本鎖ダイマーを使用した場合と比較してより高かった。

【0321】

実施例８－ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与されるＲＢＤモノマーと対比した、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと共に投与されるＲＢＤ ｍ－Ｆｃダイマーに対する応答の包括的解析
材料及び方法
ワクチン接種及び採血体制
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群を、０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合した０．２ナノモルのＲＢＤモノマーで、又は０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合した０．１ナノモルのＲＢＤマウスＦｃダイマーで、５０μｌで筋肉内免疫化した。マウスを０日目にプライミングし、２８日目にブーストした。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、２回目の注射の直前（１°）、及び２回目の注射の２週間後（２°）に採血した。血清は、ＥＬＩＳＡによってＲＢＤ特異的抗体について検査した。

【0322】

ワクチン接種マウスの上気道及び肺における防御効果の評価
２８日目のブーストから４週間後に、マウスをＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）変異株でチャレンジした。年齢をマッチさせた５匹のワクチン未接種の対照ＢＡＬＢ／ｃマウスもまた、同時にチャレンジした。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、右肺葉と鼻甲介を採取して均質化し、上清を収集して－８０℃で保存した。組織における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ_５０）は、ベロ細胞単層上の上清を滴定し、５日後にＣＰＥを評価することによって判定した。

【0323】

結果及び考察
次の実験は、アジュバント存在下で、ＲＢＤモノマーがＲＢＤＦｃダイマーと同様の応答を誘導できるかどうかを調べるために設計された（図１８）。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群は、事前採血を行った後、ＲＢＤモノマーとＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのワクチン製剤、又はＲＢＤ ｍ－ＦｃダイマーとＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのワクチン製剤のどちらかで、筋肉内免疫化した。一次免疫化の４週間後にマウスを採血し、二次免疫化の２週間後にブーストして採血した。血清サンプルを総抗ＲＢＤ抗体力価について試験したところ、ＲＢＤ Ｆｃダイマーが一次免疫化後にＲＢＤモノマーよりもはるかに強い応答をもたらしたことが明らかになった。血清中の抗ＲＢＤ抗体の力価はブースト後に顕著に増加したが、それでもＲＢＤ Ｆｃダイマーワクチンと同じレベルには達しなかった。

【0324】

ブーストの４週間後、これらのマウスをＮ５０１Ｙマウスチャレンジモデルで試験した（図１９）。以前と同様、ＲＢＤダイマーで免疫化されたマウスは完全に防御され、肺又は鼻甲介からウイルスは検出されなかった。対照的に、ＲＢＤモノマーで免疫化された８／１０匹のマウスでは、肺に検出可能なウイルスは示されなかったが、全てのマウスの鼻甲介には中程度から高いウイルス力価が残っていた。

【0325】

実施例９－ＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃ抗原製剤とＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントとの免疫原性の比較、及び用量レジメンと回数の影響
材料及び方法
臨床的に承認されているスクアレン水中油型アジュバントＭＦ５９（登録商標）（Ｓｅｑｉｒｕｓ，Ｈｏｌｌｙ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＵＳＡ）が、Ｆｌｕａｄ（登録商標）Ｑｕａｄワクチンにおける長年にわたる良好な安全性記録により、ＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃ抗原を用いた試験のために選択された。

【0326】

０．３ナノモルのＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントと共にＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーワクチン（１０μｇ）で、５０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＭＦ５９（登録商標）アジュバントと共にＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーワクチン（１０μｇ）で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内投与して比較した。マウスは、０日目と１１２日目の２回用量レジメン、又は０日目、２２日目、及び１１２日目の３回用量レジメンのどちらかに従って接種した。血清を接種前及び接種後に採取した。

【0327】

結果及び考察
ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかと共にＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーを筋肉内投与すると、同等の総ＲＢＤ特異的抗体応答が得られた。どちらの群においても、２回用量スケジュール（図２０Ａ～Ｂ）及び３回用量スケジュール（図２０Ｃ～Ｄ）による一次及び二次免疫化の双方に続いて、総ＲＢＤ特異的Ａｂ応答の増強が観察された。

【0328】

２回用量レジメン又は３回用量レジメンのどちらかにおける、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーによる一次免疫化と二次免疫化の間の延長された期間は、観察された同様の力価によるブースター免疫化に続く総ＲＢＤ抗体応答に影響を与えるようには見えず、２回用量レジメン（図２０Ａ）及び３回用量レジメン（図２０Ｃ）のそれぞれにおいて、二次免疫化の１６日後及び１２日後同様の力価が観察された。２回用量体制の２回用量間の１１２日間で、総抗体レベルは平坦域に達したようであった（図２０Ａ）。３回用量レジメンの総抗体応答では、総ＲＢＤ特異的Ａｂ応答が、二次免疫化（２２日目）から９０日目まで増加し、１１１日目（二次免疫化から８９日目）にわずかに減少する傾向があった。１１１日目に投与された３回目の用量は減少傾向を逆転させ、総ＲＢＤ特異的Ａｂ応答は、１３２日目までに再び増加した（図２０Ｃ）。

【0329】

ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーを３回用量体制で接種されたマウスからのウイルス中和力価の結果は、二次免疫化の４０日後（６２日目）からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｎＡｂのレベルが増加し、三次免疫化の２１日後（１３２日目）にさらに増加したことを実証した（図２０Ｅ）。

【0330】

これらの結果は、臨床的に承認されているＭＦ５９（登録商標）アジュバントと共に使用した場合、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントと比較して、ＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーの免疫原性が維持されることを示す。さらに、プライミング免疫化の２２日後又は１１２日後にブースターが投与された場合でも、抗体レベルは同様なようである。３回目のブースター免疫化は、総抗体レベルの低下を逆転させ、ｎＡｂレベルをさらに高めることができるようである。これは、ＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーが、総レベルとｎＡｂレベルを２回目の注射後よりも高く上昇させるブーストを提供する能力を反映している。

【0331】

実験１０－１回用量後におけるＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃの増加する用量の免疫原性と防御効率の評価
材料及び方法
ＭＦ５９（登録商標）アジュバントの有無にかかわらず、１０μｇを超えるＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃが１回のワクチン接種後に防御免疫の向上を提供するかどうかを判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＦ５９（登録商標）の存在下又は非存在下（５０％ｖ／ｖ）で、１０、３０又は５０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃをプライムのみのレジメンを用いて、筋肉内経路を介して免疫化した。

【0332】

結果及び考察
結果は、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇ又は３０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃの単回投与は、どちらも防御免疫を提供するには十分ではなく、チャレンジされた全ての動物の肺でウイルス力価が検出されたことを示した。さらに、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇ用量のＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃとの比較で、より高い３０μｇ用量では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジに対する優れた防御免疫が得られず、ウイルス力価はより高く、ワクチン未接種の対照で観察されたものと同等であった。

【0333】

これらの結果はＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃのプライミングワクチンの用量を増やしても、未感作マウスにおける防御免疫応答の誘導のための２回目のワクチン接種の必要性を克服できないことを示す。

【0334】

実験１１－ＲＢＤヒトＩｇＧ１ ＦｃダイマーとＲＢＤマウスＩｇＧ１ Ｆｃダイマーの免疫原性及び防御効率の比較
材料及び方法
ＷＴ ＲＢＤ－Ｆｃワクチン候補をヒト臨床試験にさらに進めるために、ＷＴ ＲＢＤヒトＦｃダイマータンパク質（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を使用）を生成した。ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６の双方のマウス系統で、プライムブースト体制を用いて、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマーの筋肉内投与と、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｍＦｃダイマーの筋肉内投与とを比較した。

【0335】

結果及び考察
ＲＢＤ特異的抗体解析は、ＲＢＤ－ＦｃワクチンのヒトＦｃ形態は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではわずかにより低いものの、マウスＦｃ形態と同様の総抗ＲＢＤ抗体のレベル及びパターンを誘導することを実証した。どちらのマウス系統でも、マウス及びヒトのＦｃ形態のＲＢＤワクチンは、一般に１１５日目（ブースト後８７日）まで一定レベルで維持される、持続性の抗体応答を誘導した（図２１Ａ～Ｂ）。

【0336】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、２回目の免疫から１３日後に採取された中和抗体（ｎＡｂ）力価を評価したところ、全ての動物でｎＡｂの上昇が実証され、総ＲＢＤ特異的抗体で観察されたように、ＲＢＤワクチンのヒトＦｃ形態は、ワクチンのマウスＦｃ形態と同様の、又はわずかにより低いレベルのｎＡｂを誘導した（図２１Ｃ）。

【0337】

マウスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルが、１３９日目（ブースター免疫の１１日後）に適用され、結果は、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントの存在下では、ＲＢＤ－Ｆｃワクチンのマウス型とヒト型はどちらも、ＲＢＤヒトＦｃで免疫化された５／５匹のマウス及びＲＢＤマウスＦｃで免疫化された３／５匹のマウスにおいて、下気道感染に対する完全な防御が可能であったことを実証した（図２２）。

【0338】

これらの結果は、ＷＴ ＲＢＤヒトＦｃダイマータンパク質が、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓアジュバントの存在下で、ＷＴ ＲＢＤマウスＦｃダイマーと同様の免疫原性と防御効率を提供することを実証する。

【0339】

実験１２－ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃの免疫原性と防御効率
次に、プライムブーストレジメンを使用して、ＭＦ５９（登録商標）アジュバントと合わせたＷＴ ＲＢＤヒトＦＣの免疫原性と防御効率を、筋肉内経路を介してＣ５７ＢＬ／６マウスで評価した。

【0340】

ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃワクチン候補は、一次免疫化の２０日後（２０日目）に高レベルのＲＢＤ特異的総Ａｂを提供し、それはブースト免疫の１２日後（３３日目）にはさらに上昇した（図２３Ａ）。ＷＴウイルスとベータ変異型ウイルスの双方を中和できる、高いｎＡｂレベルもまた観察された（図２３Ｂ）。予想通り、ＷＴウイルスに対するより高いｎＡｂが、ベータウイルスと比較して観察された。

【0341】

マウスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルを８１日目（二次免疫化の６０日後）に適用したところ、上気道感染と下気道感染の双方に対する完全な防御が示された（図２４）。

【0342】

これらの結果は、ＭＦ５９（登録商標）アジュバントと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマーが、プライム／ブーストレジメンで筋肉内投与された場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫をマウスに提供し得ることを示す。

【0343】

実験１３－ＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチン候補の免疫原性
材料及び方法
世界的流行の発生以来、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株がウイルスの元のＷＴ株に取って代わった。ベータ株及びデルタ株をはじめとするこれらの変異株のいくつかは、ＷＴベースのワクチンによって媒介されるワクチン誘導免疫に対して、部分的に耐性があるようである。ベータ変異株は、これまでに報告されている変異株の中で最も回避性が高く、ＲＢＤに３つの変異（Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、及びＫ４１７Ｎ）を保有する。

【0344】

ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＲＢＤ－ｈＦｃワクチンの適応性を実証するために、ワクチンのベータＲＢＤバージョンを生成した（ベータＲＢＤ－ｈＦｃ）。引き続くＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチンの２つの用量（１０μｇ及び３μｇ）を、プライムブーストレジメンで筋肉内経路を介してマウスで調べた。

【0345】

結果及び考察
１０μｇ又は３μｇのどちらかの用量のＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されたマウスでは、プライムブーストレジメンに続いて、ＷＴ ＲＢＤモノマーに対する強固な抗体応答が観察された（図２５Ａ）。

【0346】

３μｇ又は１０μｇのどちらかのＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化された１９／２０匹のマウスでは、ベータ変異株に特異的な中和抗体力価が観察された（図２５Ｂ）。興味深いことに、３μｇの用量でプライムブーストを受けたマウスは、１０μｇの用量でプライムブーストを受けたマウスと比較して、ベータ変異株に対するより高いｎＡｂを有するようであった。さらに、有効力価がより低いにもかかわらず、ＷＴ変異株を中和できるｎＡｂが１６／２０匹のマウスで観察された（図２５Ｂ）。

【0347】

これらの結果は、プライムブーストレジメンを用いた、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃダイマーのマウスへの筋肉内投与が、強固なＷＴ－ＲＢＤ特異的抗体応答と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＷＴ及びベータ変異株の双方を中和できるｎＡｂとを生じることを示唆する。

【0348】

実験１４－ＭＦ５９（登録商標）と共に投与される、異なる用量のＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ抗原及びベータ変異株ＲＢＤ－ｈＦｃ抗原の免疫原性と防御効率の評価
材料及び方法
ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマー及びベータＲＢＤ－ｈＦｃダイマーの最小有効用量を判定するために、プライムブーストレジメンを用いて、ＭＦ５９（登録商標）の存在下で、一連の用量（１０、３、１及び０．３μｇ）のどちらかのダイマーで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを筋肉内免疫化した。

【0349】

結果及び考察
免疫原性
ＭＦ５９（登録商標）の存在下で、１０、３、１、又は０．３μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ又はベータＲＢＤ－ｈＦｃのどちらかを筋肉内ワクチン接種された、マウスの一次及び二次血清中の総抗ＷＴ ＲＢＤ抗体力価を、ＲＢＤ特異的ＥＬＩＳＡを使用して測定した（図１４）。一次ＲＢＤ抗体応答は、評価されたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ）（図２６）及びベータＲＢＤ－ｈＦｃ（図２６）の全ての用量で、比較的一貫していたが、ベータＲＢＤ－ｈＦｃ製剤で免疫化されたマウスでは、全体的な力価がわずかにより低くなっていた。二次ＲＢＤ抗体力価は全ての群にわたってブーストされ、抗原の用量が減少するにつれてブーストレベルが低下する傾向がわずかにあった（図２６Ｃ、Ｄ）。同様に、ブースト後、ベータＲＢＤ－ｈＦｃ製剤で免疫化されたマウスでは、全体的なＲＢＤ抗体力価がわずかにより低く、各ベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチン接種群内でより大きなばらつきも観察された。同様の結果は、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ又は ＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃをワクチン接種されたマウスからの二次血清（５６日目）を、ＷＴ ＲＢＤモノマーとベータＲＢＤモノマーの双方に対するＡｂ応答について分析した場合にも、観察された（図２７））。

【0350】

防御効率
下気道感染に対する防御効率は、チャレンジ株としてＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）及びベータ変異株Ｂ．１．３５１を使用した、マウスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルで評価した。研究の７６日目（ブーストの５５日後）に、各ワクチン接種群の１０匹のマウスのうち５匹を、ＭＦ５９（登録商標）の存在下で１０、３、１又は０．３μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ又はベータＲＢＤ－ｈＦｃのいずれかで免疫化し、ＶＩＣ２０８９で煙霧剤チャレンジした（図２８Ａ）。研究の８３日目（ブーストの６２日後）に、各群の残りの５匹のマウスを、Ｂ．１．３５１で煙霧剤チャレンジした（図２８Ｂ）。

【0351】

実験１５－ハムスターモデルにおけるＲＢＤ－ｈＦｃダイマーワクチンの免疫原性と防御効率の評価
材料及び方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したハムスターは、ヒトの上気道及び下気道感染の症状に酷似している。ハムスターはまた、体重が減少し、無気力になり、毛並みが乱れ、猫背になり、呼吸が速くなる。ハムスターの肺と腸では高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が確認されており、これらの組織にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに結合できるＡＣＥ２が点在する。この理由から、ハムスターは開発中のＣＯＶＩＤワクチンを評価するモデルとして使用されてきた。

【0352】

ハムスターに、０日目と２１日目に、ＭＦ５９（登録商標）又はＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓのどちらかを配合したＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマーを３０μｇ又は１０μｇ投与した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジは、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０２１，２９：５５１－５６３の“Ｓｙｒｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ”の方法に従って実施した。

【0353】

結果及び考察
総ＲＢＤ特異的抗体応答
全てのハムスターは２回目の注射後に血清転換したが、数匹のハムスターの応答は以前のマウス研究で観察されたものよりも低く、ばらつきが大きかった。そのため、４９日目に、ハムスターに、対応するワクチンの３回目の用量を投与した。これにより、図２９に提示される全てのハムスターで、はるかにより高い抗体産生がもたらされた。興味深いことに、２回目のワクチン用量後、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマー群は、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマー群よりも低い抗体力価を示した。逆応答は、マウスの研究でも観察された。

【0354】

実験１６－ハムスターモデルにおけるベータ変異株に対するＲＢＤワクチンの免疫原性と防御効率の評価
材料及び方法
ハムスターに、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０、１０又は３μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマー、又はＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃをワクチン接種し、０日目及び２１日目に２回筋肉内投与した。３回目の用量を６３日目に投与し、各ハムスターの肺及び鼻甲介におけるウイルス負荷を測定するために、８５日目にチャレンジを実行し、８８日目に組織を採取した。中和抗体（ｎＡｂ）力価は、本明細書の他の箇所に記載されているように評価した。

【0355】

結果及び考察
図３０は、各群のハムスターの個々のｎＡｂ力価を示す。この時点で、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマーで免疫化された１０匹のハムスターのうち７匹が検出可能なｎＡｂ応答を示し、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃダイマーで免疫化された３０匹のマウスのうち１５匹が検出可能なｎＡｂ応答を示した。これらのｎＡｂ応答は、ＷＴウイルスに対して測定した。

【0356】

次に、８５日目にこれらのハムスターをＷＴ（ＷＡ－０１／ＵＳＡ）又はベータ変異株（Ｂ．１．３５１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのどちらかでチャレンジし、チャレンジ後３日間にわたり毎日、中咽頭拭き取り検体を採取した。ハムスターは、肺のウイルス力価評価のために８８日目に殺処分した。データは、３日目の拭き取り検体データ、及び実験終了時の肺組織１ｍｇあたりのウイルス負荷を提示している。観察された中程度で非常に多様なｎＡｂ応答（図３０）と一致して、免疫化されたハムスターは、ウイルスチャレンジに対して中程度で多様な程度の耐性を示した（図３１）。ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジでは、３日目の拭き取り検体中でＰＢＳ（プラセボ）を投与されたハムスターのウイルス負荷は低く（平均約８０ＰＦＵ）、１匹の対照ハムスターでは５ＰＦＵの検出限界を下回っており、ワクチンを接種されたハムスターでは明らかな減少を示す余地はほとんどなかった。それにもかかわらず、３日目の拭き取り検体中の平均ウイルス負荷は、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０μｇＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されたハムスターにおいてより低く（１３ＰＦＵ）、３匹のハムスターのＰＦＵは検出限界（５ＰＦＵ）を下回り、２匹のハムスターは少量ではあるが検出可能なウイルスを有した。ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃで処置されたハムスターは全て検出可能なウイルスを有し、３日目の拭き取り検体中の平均ウイルス負荷（４２ＰＦＵ）は、ＰＢＳで処置されたハムスターより中程度にのみ低かった。ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０、１０、及び３μｇのベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化されたハムスターは、平均ＰＦＵ（２９、１８、６１ＰＦＵ）の中程度の減少しか示さなかった（図３１Ａ）。

【0357】

ベータ（Ｂ．１．３５１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスでチャレンジされたハムスターは、ＰＢＳ処置群でウイルス負荷量がより高く（平均１２００ＰＦＵ）、３日目の拭き取り検体でワクチン誘導防御のより良い証拠を示した。最低の３μｇ用量を投与された１匹を除いて、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化された全てのハムスターは、より低いウイルス負荷を有し、ＰＢＳ群と重複はなかった（３０、１０、及び３μｇ処置群の平均ＰＦＵはそれぞれ１１０、３２、及び２５０）（図３１Ａ）。

【0358】

頭蓋肺組織のサンプルから得られた結果は同様であったが、３日目の拭き取り検体とはいくつかの顕著な違いがあった（図３１Ｂ）。このように、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇのＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ群は、ＷＴ（ＷＡ－０１／ＵＳＡ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して最良の防御を示し（９．１×１０＾４対９．２×１０＾６ＰＦＵ／１００ｍｇ組織、ＰＢＳ処理群）、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇ及び３μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ群は、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０μｇのベータＲＢＤ群（１×１０＾７ＰＦＵ／１００ｍｇ組織）よりも低い平均力価（２．７×１０＾５及び１．１×１０＾６）を示した。ベータウイルスチャレンジ群では、ＰＢＳ処置群が平均１．７×１０＾７ＰＦＵ／１００ｍｇ組織）であったのに対し、ＭＦ５９（登録商標）と合わせた１０μｇベータＲＢＤ－ｈＦｃ免疫化群は平均ＰＦＵが最も低かった（９．４×１０＾５）。ＭＦ５９（登録商標）と合わせた３０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃで免疫化された群は、より大きな広がりを示し、３匹のハムスターはＰＢＳ群よりもはるかに低かった（１００倍以上）のに対し、２匹はＰＢＳ群と同様で、平均ＰＦＵ値は２．３×１０^６であった。最も低いＭＦ５９（登録商標）と合わせた３μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ免疫群（７．９×１０^６ＰＦＵ）のハムスターでは、防御の形跡はほとんど見られなかった。

【0359】

総合すると、ＭＦ５９（登録商標）と合わせたＲＢＤ－ｈＦｃワクチンは、ハムスター研究において免疫原性であることが示された（図２９～３０）。

【0360】

実験１７－ラットモデルにおけるベータＲＢＤワクチンの免疫原性
材料及び方法
毒性学試験の一環として、ラットモデルにおいてＭＦ５９（登録商標）アジュバントを含む又は含まない、ベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチンの免疫原性を評価した（図３２）。３０匹のスプラーグドーリー系ラットの３群に、０日目、２２日目、４３日目に、生理食塩水、５０μｇのベータＲＢＤ－ｈＦｃ、又は５０μｇのＭＦ５９（登録商標）アジュバントと合わせたベータＲＢＤ－ｈＦｃを筋肉内ワクチン接種した。４４～４５日目又は５６日目の毒性の終了時に、各ラットから終末血液サンプルを採取し、血清に処理して、ＥＬＩＳＡによってＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧ抗体応答が評価された。

【0361】

結果及び考察
図３２に示すように、ＭＦ５９（登録商標）と共に投与されるベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチンは高度に免疫原性であり、ＭＦ５９（登録商標）と共にベータＲＢＤ－ｈＦｃワクチンで免疫化された３０匹のラットのうち、１匹を除く全てが、１０^４以上のスパイク反応性ＩｇＧ抗体の力価を示した。１匹のラットはより低い抗体力価を生じたが、これは依然として、生理食塩水を注射した対照動物のバックグラウンドレベル（力価１００）を明らかに超えていた。対照的に、ＭＦ５９（登録商標）アジュバントなしでベータＲＢＤ ｈＦｃで免疫化されたラットでは、３０匹中３匹だけが検出可能なＩｇＧ抗スパイク抗体を産生した。

【0362】

実験１８－凍結乾燥ＲＢＤヒトＦｃ／ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓワクチン製剤の安定性の評価
方法及び材料
本発明者らは、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合した凍結乾燥したＲＢＤヒトＦｃダイマーの安定性を評価した。これらの製剤は、再構成してＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内ワクチン接種に使用する前に、４０℃、室温（ＲＴ）、４℃又は－２０℃で１ヶ月間保存した。保存された凍結乾燥製剤に対する応答は、新鮮に調製したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを配合したＲＢＤヒトＦｃダイマーによって、及び凍結乾燥の２４時間後に再構成した凍結乾燥製剤によって惹起された応答と比較した。

【0363】

５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、新鮮に調製したワクチン、凍結乾燥から２４時間後に再構成したワクチン、又は４０℃、ＲＴ、４℃、又は－２０℃で４週間保存してから再構成した凍結乾燥ワクチンのいずれかを、鼻腔内に２回ワクチン接種した。ワクチンは、０日目及び３０日目に投与した。１回目の用量の投与ための凍結乾燥保存ワクチンは実験の３２日前に調製し、２回目の用量の投与のための凍結乾燥保存ワクチンは実験の０日目に調製した。これにより、１回目と２回目の用量の双方のワクチンを、特定の条件で１か月間保存することが可能になった。マウスは、１回目の注射の直前（事前採血）、１回目の免疫から２１日後（１°採血）、２回目の免疫後の様々な時点（２°採血）で採血した。

【0364】

体液性応答を１回目と２回目の免疫後に評価し、これにはＥＬＩＳＡによる抗ＲＢＤ抗体応答、並びに生体外微量中和アッセイとサロゲートウイルス中和試験（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の評価が含まれた。

【0365】

試験の１１２日目（２回目の用量の８２日後）に、新鮮に調製したＲＢＤ－ｈＦｃ／ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ製剤を接種されたマウス、及び４０℃で１ヶ月間保存した凍結乾燥ＲＢＤ－ｈＦｃ／ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ製剤をワクチン接種されたマウスをＶＩＣ２０８９（Ｄ６１４Ｇ／Ｎ５０１Ｙ）でチャレンジした。

【0366】

結果及び考察
ＷＴ ＲＢＤモノマーに反応する総免疫グロブリン（Ｉｇ）、及び中和Ａｂ応答
新鮮に調製したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ／ＲＢＤ－ｈＦｃ製剤又は凍結乾燥ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ／ＲＢＤ－ｈＦｃ製剤のどちらかをワクチン接種されたマウスの血清における、一次及び二次ＷＴ ＲＢＤ特異的抗体応答を評価した。異なる条件下で保存された凍結乾燥製剤を投与された全てのマウスは、新鮮に調製された製剤をワクチン接種されたマウスで生成された力価に匹敵する、強力な抗体力価を示した（図３３）。

【0367】

同様に、微量中和アッセイ（図３４Ａ）及びサロゲートウイルス中和試験（図３４Ｂ）の双方を使用して、新鮮に調製したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤ－ｈＦｃを投与されたマウスの血清中の中和抗体応答と、凍結乾燥ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＲＢＤ－ｈＦｃ製剤をワクチン接種された動物の中和応答とを比較すると、全てのマウスの間で同等の中和応答が観察された。

【0368】

防御効率
上気道及び下気道感染に対する防御効率は、ＶＩＣ２０８９（Ｎ５０１Ｙ／Ｄ６１４Ｇ）を使用して、マウスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルで評価した。０日目及び３０日目に、ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ＋ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ、又は４０℃で１か月間保存した凍結乾燥ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ＋ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓを鼻腔内ワクチン接種されたマウスを、２回目の免疫化の８２日後にＶＩＣ２０８９で煙霧剤チャレンジした。年齢と性別をマッチさせたワクチン未接種の対照マウスもまた、同時にチャレンジした。チャレンジから３日後にマウスを殺処分し、ベロ細胞単層上の肺及び鼻甲介の上清を滴定し、５日後にウイルスＣＰＥを測定することによって、個々のマウスの肺及び鼻甲介における感染性ウイルスの力価（ＴＣＩＤ５０）を判定した。

【0369】

新鮮に調製したワクチン、又は４０℃で保存した、凍結乾燥ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ／ＲＢＤ－ｍＦｃワクチンを接種された全てのＢＡＬＢ／ｃマウスで、肺感染に対する完全な防御が観察された（図３５Ａ）。さらに、新鮮に調製したワクチンを投与された４／５匹のマウス、及び凍結乾燥ワクチンで免疫化された５／５匹のマウスの鼻甲介では、ウイルスは検出されなかった（図３５Ｂ）。

【0370】

これらの結果から、本発明者らは、ＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓ＋ＲＢＤ－ｍＦｃ製剤を凍結乾燥し、－２０℃～４０℃の範囲の温度で最長１ヶ月保存した場合、免疫原性と防御効率が維持されると結論付けた。

【0371】

武漢指標株ＶＩＣ０１及びベータ変異株Ｂ１．３５１に対する中和活性
新鮮に調製したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせたＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃ、又は４０℃で保存したＰＥＧ－Ｒ４－Ｐａｍ－２－Ｃｙｓと合わせた凍結乾燥ＷＴ ＲＢＤ－ｈＦｃを鼻腔内ワクチン接種されたマウスからの二次血清（７０日目）を、マイクロ中和アッセイにより武漢指標株ＶＩＣ０１とベータ変異株Ｂ．１．３５１の双方を中和する能力について評価した。図３６に示すように、どちらの製剤も、武漢指標株ＲＢＤ抗原を含有するにもかかわらず、相同な武漢指標株ＶＩＣ０１及びベータ変異株Ｂ．１．３５１の双方に対して強力な中和活性を惹起した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31-1】

【図31-2】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

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【国際調査報告】