特表 2024-502939 組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-24

(54)【発明の名称】組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240117BHJP

   A61K 35/742 20150101ALI20240117BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/002 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 9/52 20060101ALI20240117BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240117BHJP

   C07K 4/12 20060101ALN20240117BHJP

   C07K 4/06 20060101ALN20240117BHJP

   C07K 14/025 20060101ALN20240117BHJP

   C07K 14/28 20060101ALN20240117BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

A61K35/742

A61K39/12

A61K39/00 H

A61K39/002

A61K39/02

A61P37/04

A61K9/52

C07K19/00 ZNA

C07K4/12

C07K4/06

C07K14/025

C07K14/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023536479

(86)(22)【出願日】2021-12-13

(85)【翻訳文提出日】2023-07-31

(86)【国際出願番号】 GB2021053264

(87)【国際公開番号】W WO2022129881

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】2019767.9

(32)【優先日】2020-12-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518314040

【氏名又は名称】チェイン バイオテクノロジー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】グリーン， エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドリー， ベンジャミン マイケル

(72)【発明者】

【氏名】チャン， シソン

(72)【発明者】

【氏名】エドワーズ， リチャード マーク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA23X

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA24

4B065CA45

4C076AA60

4C076AA94

4C076BB01

4C076CC06

4C085AA03

4C085BA02

4C085BA07

4C085BA09

4C085BA51

4C085EE01

4C085GG08

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC68

4C087BC69

4C087MA37

4C087MA52

4C087NA14

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA10

4H045CA11

4H045CA20

4H045CA40

4H045CA41

4H045DA50

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

少なくとも１つの抗原をコードする異種核酸分子を含むクロストリジウム綱の細菌であって、嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において抗原を発現することができ、少なくとも１つの抗原は感染病原体抗原または腫瘍抗原である、細菌。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの抗原をコードする異種核酸分子を備えるクロストリジウム綱の細菌であって、前記細菌は嫌気性細胞増殖中に前記細菌の細胞内区画において前記抗原を発現することができ、前記少なくとも１つの抗原が感染病原体抗原または腫瘍抗原である、細菌。

【請求項2】

前記少なくとも１つの抗原が、１個以上のＴ細胞抗原セグメントおよび／または１個以上のＢ細胞抗原セグメントを備える、請求項１に記載の細菌。

【請求項3】

前記１つ以上のＴ細胞抗原セグメントが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原セグメントおよび／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントである、請求項２に記載の細菌。

【請求項4】

前記少なくとも１つの抗原が、２個以上の抗原セグメント、例えば３個以上、５個以上、または１０個以上の抗原セグメントを備える多抗原融合ポリペプチドであり；任意選択で、前記多抗原融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原セグメントおよび少なくとも１つのＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントを備える、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項5】

適宜、前記抗原セグメントが部分的に重複しており、前記抗原セグメントが由来する抗原のアミノ酸配列を組み合わせて≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、より好ましくは１００％包含する、請求項４に記載の細菌。

【請求項6】

嫌気性細胞増殖中のクロストリジウムの細胞の細胞重量あたり発現される抗原の量が、１０ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇまたは４０ｎｇ／ｍｇより重く、最大５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍｇ、１μｇ／ｍｇ、１．５、２．０、２．５、５．０、１０または２０μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量、例えば１０～４００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；２０～２００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；４０～１００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；１００ｎｇ～５μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；２００ｎｇ～２．５μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；４００～１５００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；または約８００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量である、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項7】

前記異種核酸分子が、単一コピーとしてゲノムに組み込まれているか、あるいは低コピープラスミドまたは高コピープラスミドに組み込まれている、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項8】

前記細菌が前記抗原と共発現可能な免疫賦活剤またはアジュバントをコードするさらなる異種核酸分子を備える；および／または前記細菌が酪酸などの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができる、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項9】

前記感染病原体抗原が、ウイルス抗原、クラミジア抗原もしくはマイコプラズマ抗原などの細菌抗原、寄生虫抗原、プリオン抗原、蠕虫抗原、線虫抗原、原虫抗原、真菌抗原、またはそれらの任意の組み合わせである、先行する請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項10】

前記感染病原体抗原が、
ａ．ＨＰＶ抗原であって、任意選択で、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸１～１４０を備え、例えば、前記ＨＰＶ抗原は、配列番号３の核酸配列のヌクレオチド１９～４７７によってコードされる、ＨＰＶ抗原であるか；あるいは、
ｂ．コレラ菌抗原であって、任意選択で、ＣｔｘＢであり、任意選択で、前記コレラ菌抗原は、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくは配列番号２１のアミノ酸１～１０４を備え、または配列番号２０のヌクレオチド２７０～５８１によってコードされる、コレラ菌抗原である、
前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項11】

前記細菌がクロストリジウムのクラスターＩ、ＩＶおよび／またはＸＩＶａに由来する、例えば前記細菌がクロストリジウム属に由来する、例えば前記細菌がクロストリジウム・ブチリカムである、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項12】

前記細菌が、前記細菌の細胞質において可溶性ポリペプチドまたは封入体として前記抗原を発現することができる、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項13】

胞子または栄養細胞の形態である、前記請求項のいずれかに記載の細菌。

【請求項14】

前記請求項のいずれかに記載の細菌を備える医薬組成物であって、前記医薬組成物は、任意選択で、食品に添加される、医薬組成物。

【請求項15】

前記細菌の胞子または栄養細胞を備えるカプセルを備え、前記カプセルは、経口投与後に下部消化管の嫌気性部分において前記胞子または栄養細胞の放出を可能にする遅延放出層またはコーティングを備える、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

医薬に使用するための、請求項１～請求項１３のいずれかに記載の細菌、または請求項１４もしくは請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

対象における抗原特異的免疫応答の生成における使用のためのクロストリジウム綱の細菌であって、前記細菌は抗原をコードする異種核酸分子を備え、前記細菌は嫌気性細胞増殖中に前記細菌の細胞内区画において前記抗原を発現することができる、使用のための細菌。

【請求項18】

前記抗原特異的免疫応答が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答などの細胞性免疫応答である；ならびに／あるいは、Ｂ細胞応答である、請求項１７に記載の使用のための細菌。

【請求項19】

対象における疾患の治療的処置または予防的処置における使用のためのクロストリジウム綱の細菌であって、前記細菌は抗原をコードする異種核酸分子を備え、前記細菌は嫌気性細胞増殖中に前記細菌の細胞内区画において前記抗原を発現することができ、前記抗原は感染病原体抗原であって前記疾患は感染性疾患であるか、または前記抗原は腫瘍抗原であって前記疾患はがんである、使用のための細菌。

【請求項20】

前記細菌が請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の細菌である、請求項１７～請求項１９のいずれか一項に記載の使用のための細菌。

【請求項21】

前記細菌が経口投与用である、請求項１７～請求項２０のいずれか一項に記載の使用のための細菌。

【請求項22】

前記細菌が、胞子の形態であるかまたは請求項１５に記載の医薬組成物の形態である、請求項２１に記載の使用のための細菌。

【請求項23】

前記対象がヒトである、請求項１７～請求項２２のいずれか一項に記載の使用のための細菌。

【請求項24】

前記異種核酸分子を前記細菌に導入するステップを備える、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の細菌を調製する方法。

【請求項25】

１つ以上の薬学的に許容される希釈剤または賦形剤とともに前記細菌を製剤化するステップを備える、請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物を調製する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細菌ワクチン、特には経口投与および細胞性免疫の刺激に適した生細菌ワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

ワクチンは、疾病予防、特に感染性疾患の予防において主導的役割を果たすとともに、既存の感染症や慢性疾患の治療にも期待されている。経口ワクチンは、従来の注射ベースの製剤の欠点の一部に対処し、安全性および服薬遵守を向上させ、投与を容易にする。経口ワクチンは、全身および粘膜部位の両方で液性応答および細胞性応答を刺激し得るが、Ｖｅｌａ Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．（２０１７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｏｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ，１１４，１１６－１３１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１７．０４．００８で概説されているように、その開発には胃腸（ＧＩ）管によってもたらされる大きな課題がある。例えば、脆弱な抗原がタンパク質分解酵素や胃の酸性環境によって分解されないようにする戦略が必要である。経口ワクチンが腸に到達すると、粘液層の存在、胃腸液の組成、および上皮バリアの作用により、リンパ系への分子の透過性が制限される。抗原は、小腸の腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）のパイエル板にある特殊な上皮細胞「Ｍ細胞」によって取り込まれ、経細胞輸送されて樹状細胞（ＤＣ）に送達され、そこで処理されてその表面に抗原断片が提示されることによってナイーブＴ細胞が活性化されると考えられている。

【0003】

開発中の経口ワクチンの典型的な戦略は、免疫応答を引き起こすために高用量の抗原と強力なアジュバントに依存してきた（Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ、上記参照）。一部の戦略では、アジュバント効果を誘発し得るグラム陰性菌のリポ多糖、サルモネラ菌リピドＡ誘導体、またはコレラ毒素を利用しているが、毒性の点においてトレードオフがある。

【0004】

細菌ワクチンが有望であり、コレラ菌または腸チフス菌の弱毒生ワクチンが認可されている。ラクトコッカスなどのグラム陽性菌は、ＬＰＳを回避し、より耐性がある可能性があり、ワクチンプラットフォームとしての可能性が示唆されている（Ｂａｈｅｙ－Ｅｌ－Ｄｉｎ，Ｍ ａｎｄ Ｇａｈａｎ，ＣＧＭ（２０１０）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ：‘Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ’，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，７：１，１０６－１０９，ＤＯＩ：１０．４１６１／ｈｖ．７．１．１３６３１）。経口組換え乳酸桿菌ワクチンが、ＷＯ２００１／０２１２００Ａ１に開示されている。細菌ワクチンはこれまで、粘膜免疫系が十分に研究されている小腸を標的とするために使用されてきた。胞子形成中に封入体において高レベルの抗原を発現するように遺伝子改変された弱毒化ウェルシュ菌が、Ｃｈｅｎ Ｙ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＳＩＶ ｐ２７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌ ＳＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２９：２２６－２３３，ＩＳＳＮ ００４２－６８２２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００４．０８．０１８において提案されている。そのメカニズムは、胞子形成後の母細胞の溶解によって、小腸の回腸終末部にあるパイエル板へ直接高濃度の抗原を送り込むことにあると思われる。

【0005】

現在までに認可されている経口ワクチンは、通常、治療用ワクチンとしてではなく、感染予防を目的としている。現在のワクチンではＢ細胞によって産生される抗体が防御と主に相関しているが、細胞内感染に対する防御においては細胞性免疫機能が重要であり、ほとんど全ての疾患において、ＣＤ４^＋細胞はＢ細胞の分化成熟を助けるのに必要である（Ｓｔａｎｌｅｙ Ａ．Ｐｌｏｔｋｉｎ（２００８）Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐａｇｅｓ ４７：４０１－４０９，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８６／５８９８６２）。確立された感染症および腫瘍免疫の制御には、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む細胞性免疫がより重要であると一般に認識されている。

【0006】

多くのタンパク質ベースのワクチンでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってタンパク質が貪食またはエンドサイトーシスされてエンドソームおよびリソソームに取り込まれることで、リソソームがタンパク質をより小さなペプチドに分解し、その一部（ＣＤ４エピトープ）がリソソーム膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合でき、細胞表面に提示されることにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞はその後のＢ細胞による抗体の産生に必要となる（Ｔ細胞が助ける）。それ故に、身体を刺激して抗体を産生させるためにタンパク質抗原が主に使用されてきた。

【0007】

ＭＨＣクラスＩ分子上の抗原ペプチドの提示（ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の刺激に必要）の主な経路は、ウイルス感染後などにＡＰＣ内で発現される抗原に依存する。しかし、研究によると、ＡＰＣは、抗原のクロスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスによって、抗原を内在化し、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することもできるが、これは一般的に非効率的なプロセスであることが分かっている。外来性のペプチドまたはタンパク質のＭＨＣクラスＩ経路への送達は、フロイントアジュバントなどの化学アジュバント、およびスクアレンと界面活性剤との混合物の使用によって部分的に成功している（Ｈｉｌｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＶＡＣＣＩＮＥ １７：２１９－２２８）。ＥＰ３２３５８３１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｖａｃｍｅｄｉｘ ＵＫ Ｌｔｄ）は、組換えオーバーラップペプチド（ＲＯＰ）として知られる人工のマルチエピトープ融合タンパク質がＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を同時に刺激できることを示している。ＲＯＰは、カテプシン切断部位の標的配列によって結合されたオーバーラップペプチドで構成されており、ペプチドの由来となるタンパク質全体よりも防御免疫のプライミングにおいて効率的である。ＲＯＰによる皮下免疫は、ウイルスモデルおよび腫瘍モデルにおいて防御効果を有することが示されている（Ｚｈａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：９１８４－９１９１；およびＣａｉ Ｌ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：７６５１６－７６５２４）。

【0008】

経口投与および細胞性免疫の刺激に適した、効果的な細菌ワクチンが依然として必要とされている。

【0009】

ＷＯ２０１８／０５５３８８（ＣＨＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、例えば模擬結腸環境において、抗炎症因子としての（Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ＨＢ）を発現するように遺伝子改変されたクロストリジウムを開示している。ＷＯ２０１９／１８０４４１（ＣＨＡＩＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、Ｒ－３－ＨＢ遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムのインビボおよび薬物動態プロファイリングを開示している。遺伝子改変株は、細菌胞子を経口投与されたマウスの結腸サンプルから単離できた。

【0010】

本発明者らは、プラットフォームワクチン技術を開発するために、大腸などの胃腸管の下部嫌気性領域を標的とする嫌気性条件下で増殖するクロストリジウムの能力を利用しようと試みた。Ｒ－３－ＨＢ遺伝子改変クロストリジウムの抗炎症効果とは対照的に、本発明は、嫌気性細胞増殖中に抗原を細胞内で発現するように遺伝子改変されたクロストリジウムが、抗原特異的免疫応答を刺激し得るという驚くべき発見に基づいている。

【0011】

本明細書における以前に公開された文書のリストまたは議論は、その文書が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であるという認識として解釈されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の第１の態様は、少なくとも１つの抗原をコードする異種核酸分子を含むクロストリジウム綱の細菌であって、その細菌は嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において少なくとも１つの抗原を発現することができ、ここで、少なくとも１つの抗原は、感染病原体抗原または腫瘍抗原である。

【0013】

感染病原体抗原または腫瘍抗原は細菌に対して異種である。抗原を「発現することができる」とは、異種核酸分子が細菌内で転写され、さらに典型的には翻訳されて抗原の発現をもたらすことを意味する。

【0014】

細菌による抗原の発現は、嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画で起こる。クロストリジウム綱の細菌は偏性嫌気性菌であり、その大部分は胞子を形成する能力を有する（すなわち、胞子形成細菌である）。そのような細菌は胞子の形態または栄養型の形態であってよく；後者の形態では、細菌は代謝的に活性であり、典型的には増殖している。代謝的に活性な形態のクロストリジウムに抗原の発現を標的化することにより、腸の嫌気性部分に抗原を標的化する媒体としてクロストリジウムを使用することができる。細菌を胞子として経口投与することで、細菌は胃腸管を通過する間、休眠状態で生存し、嫌気性部分に到達すると発芽して増殖する。

抗原

【0015】

「抗原」とは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する分子を意味する。抗体に結合する抗原はＢ細胞抗原と呼ばれる。適切な分子の種類としては、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、ガングリオシド、脂質、リン脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの断片、それらの一部、およびそれらの組み合わせが挙げられる。糖タンパク質を含む、ペプチドおよびポリペプチド抗原が好ましい。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子と複合体を形成したペプチド断片にのみ結合する。認識される抗原の部位は「エピトープ」と呼ばれる。Ｂ細胞エピトープがペプチドまたはポリペプチドである場合、それは典型的には３個以上のアミノ酸、一般的には少なくとも５個、より一般的には少なくとも８～１０個のアミノ酸を含有する。アミノ酸は、ポリペプチドの一次構造において隣接するアミノ酸残基であってもよいし、あるいは折りたたまれたタンパク質において空間的に並置されていてもよい。Ｔ細胞エピトープは通常、抗原に由来する短い一次配列である。それらは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る。典型的には、ＭＨＣクラスＩ結合Ｔ細胞エピトープは８～１１のアミノ酸長である。クラスＩＩ分子は、１０～３０残基以上の長さでありうるペプチドと結合してよく、ここで、ペプチドの最適な長さは１２～１６残基である。特定の対立遺伝子型のＭＨＣ分子に結合するペプチドは、ペプチドと対立遺伝子型ＭＨＣ分子との間の相補的な相互作用を可能にするアミノ酸残基を含む。推定Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ分子に結合する能力は、実験的に予測および確認することができる（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３８：１２３－１４５）。

【0016】

第一の態様によると、クロストリジウム綱の細菌によって発現される抗原は、感染病原体抗原または腫瘍抗原である。「感染病原体抗原」とは、その抗原が、ヒトなどの感受性宿主に感染することができ、典型的には症状を引き起こすことができる感染性病原体に由来する抗原を意味する。「に由来する」とは、感染性病原体抗原が感染病原体のゲノムにコードされているか、またはそのようなコードされた抗原の変異体であることを含む。「腫瘍抗原」とは、その抗原が、主に、例えば腫瘍細胞によって、ほぼ排他的または排他的に発現される抗原に由来するか、あるいは腫瘍細胞を正常細胞と区別するために当技術分野で使用されるマーカーとして機能する抗原に由来することを意味する。「に由来する」とは、腫瘍抗原ががん細胞のゲノムにコードされているか、またはそのようなコードされた抗原の変異体であることを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、がんのリスクに関連する感染病原体抗原であってよい。抗原は、完全なタンパク質の断片または一部であってよく、その断片はエピトープを含む。「抗原セグメント」は抗原の一部であり、その抗原はエピトープを含む。

【0017】

「変異体」とは、１つ以上の位置に保存的または非保存的アミノ酸の挿入、欠失、または置換が存在するタンパク質またはペプチドを指す。「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組み合わせを意味する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。抗原またはその一部の典型的な変異体は、対応するネイティブ抗原またはその一部と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を有するであろう。

【0018】

２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータープログラム、例えば、ウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、パーセント同一性は、配列が最適に整列されているポリペプチドに関連して計算されることが理解されるであろう。

【0019】

あるいは、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実行され得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２），４６７３－８０）。使用されるパラメータは、次のとおりであってもよい。
・高速ペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ－ｔｕｐｌｅ（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、上の対角線の数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
・マルチプルアラインメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップエクステンションペナルティ；０．０５。
・スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

【0020】

「変異体」はまた、変異抗原をコードする核酸分子を指してもよい。

【0021】

適切な感染病原体抗原としては、ウイルス抗原、細菌抗原（クラミジア抗原またはマイコプラズマ抗原を含む）、寄生虫抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、線虫抗原、真菌抗原、プリオン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられうる。感染病原体抗原と腫瘍抗原との組み合わせも用いられうる。場合によっては、選択された抗原は交差免疫（交差防御とも呼ばれる）を提供し、これにより、単一の抗原または組み合わせた複数の抗原は、関連する感染病原体に対する免疫または防御を与えうる。交差免疫は、抗原が感染病原体の複数の株や種に保存されている（すなわち、共通または相同である）場合に起こりうる。したがって、このような交差免疫をもたらす抗原（単一の抗原または複数の組み合わせた抗原のいずれか）を使用することが望ましい場合がある。

【0022】

ウイルス抗原の例として、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原；例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス抗原、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質などのコロナウイルス抗原（例えば、コロナウイルス抗原は、それぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に関連する、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、およびＨＫＵ１コロナウイルス株に交差免疫を与える１つの抗原または複数の組み合わせた抗原であってよい）；ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、ならびにその他のＨＩＶ成分などの、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；肝炎、例えば、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎、肝炎のＳ、Ｍ、およびＬタンパク質などの肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ－Ｓ抗原；インフルエンザウイルス抗原であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ、ならびにその他のインフルエンザウイルス抗原；ＳＡＧ－１またはｐ３０などの麻疹ウイルス抗原；Ｅ１およびＥ２タンパク質ならびに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ成分および他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原（例えば、腸管内のプロテアーゼによってＶＰ８およびＶＰ５に開裂される、ウイルスの表面カプシドに見られるＶＰ４）；エンベロープ糖タンパク質Ｂおよび他のサイトメガロウイルスタンパク質などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などのＲＳウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐＩＩおよびテロメラーゼなどの水痘・帯状疱疹ウイルス抗原；黄熱病に関連するフラビウイルスの抗原；西ナイルウイルス抗原；デングウイルス抗原；ジカウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；アフリカ豚コレラウイルス抗原；ブタ生殖呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原；および、口蹄疫ウイルス（例えば、コクサッキーウイルスＡ１６）抗原が挙げられる。慢性持続感染を引き起こすウイルスの抗原が好ましい場合もある。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）；Ｃ型肝炎；Ｂ型肝炎；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヘルペスウイルスには、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、および水痘・帯状疱疹ウイルスが含まれる。

【0023】

いくつかの実施形態では、ウイルス抗原はＨＰＶ抗原である。持続的なＨＰＶ感染は、疣贅または前がん病変の発生を引き起こす可能性があり、後者では、感染部位に応じて、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、口、または喉のがんのリスクが高まる。ＨＰＶ遺伝子型１６、１８、３１、５２、５３、および５８は高リスクＨＰＶ遺伝子型であり、がんのリスクに関連する株であることを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は、高リスク遺伝子型に由来するＨＰＶ抗原、例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質、好ましくは、１つ以上の高リスクＨＰＶ遺伝子型にわたって保存されているＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に対応する少なくとも１つの抗原である。適切な抗原がＷＯ２０１９／０３４８８７に記載されており、１つ以上のＨＰＶ遺伝子型（すなわち、株）にわたって保存されている複数のペプチド配列から構成されるポリペプチドをコードする核酸が記載されている。他の適切な抗原としては、Ｆｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｌ１ ａｎｄ Ｌ２ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４８１８～４８２６ページに記載のように、Ｌ１および／またはＬ２カプシドタンパク質由来の抗原が挙げられる。一実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸１～１４０を含み、例えば、ここで、ＨＰＶ抗原は、配列番号３の核酸配列のヌクレオチド１９～４７７によってコードされる。

【0024】

いくつかの実施形態では、ウイルス抗原はコロナウイルス抗原である。コロナウイルス感染は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）およびコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）などの症状の出現を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、エピトープの選択は、ＭＨＣ対立遺伝子にわたる可能性の高い提示に基づいて、相同ＳＡＲＳタンパク質と、Ｆａｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ２０１９－ｎＣｏＶ，ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ，ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．１９．９５５４８４によって特定された上位に予測されるＢおよびＴ細胞エピトープとの比較に基づいている。さらなる適切なエピトープが、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｅｐｉｔｏｐｅ－ｂａｓｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０２０．１９８０８２に記載されている。

【0025】

細菌抗原の例には、クロストリジウム属細菌抗原、例えば、クロストリジウム・ディフィシル（クロストリディオイデス・デフィシルに改名）トキシンＡおよびＢ；百日咳菌抗原、例えば百日咳毒素；ジフテリア菌抗原、例えばジフテリア毒素もしくはジフテリアトキソイドエリテマトーシス（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、および他のジフテリア菌抗原成分；破傷風菌抗原、例えば破傷風毒素もしくは破傷風トキソイドおよび他の細菌抗原成分；連鎖球菌抗原、例えばＭタンパク質および他の連鎖球菌抗原成分；グラム陰性桿菌抗原、結核菌抗原、例えば、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａおよび他のマイコバクテリア抗原成分；コレラ菌抗原、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｔｘＢ）；ヘリコバクター・ピロリ菌抗原成分；肺炎球菌抗原、例えば、ニューモリシン、肺炎球菌抗原成分；インフルエンザ菌抗原、例えばインフルエンザ菌抗原成分；炭疽菌抗原、例えば、炭疽菌防御抗原および他の炭疽菌抗原成分；リケッチア属細菌抗原、例えば、ｒｏｍｐＡおよび他のリケッチア属細菌抗原成分；またはウシ型結核菌抗原；またはブルセラ菌抗原が含まれる。また、本明細書に記載の細菌抗原には、いずれの他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リッケチア、またはクラミジア抗原も含まれる。慢性持続感染症を引き起こす細菌の抗原、例えば、結核菌、ボレリア・ブルグドルフェリなどのボレリア種、コリネバクテリウム・ジフテリエ、クラミジア、コレラ菌、チフス菌；マイコプラズマの抗原が好ましい場合がある。

【0026】

いくつかの実施形態では、細菌抗原はコレラ菌抗原である。コレラ菌は下痢原性腸内病原菌であり、コレラの病原体である。適切なコレラ菌抗原には、コレラ菌に付随するかまたはコレラ菌によって分泌される、ペプチドまたはタンパク質が含まれる。コレラ菌の感染中、この細菌はコレラ毒素、すなわち、Ａサブユニット（ＣｔｘＡ）の１つのコピーとＢサブユニット（ＣｔｘＢ）の５つのコピーからなるヘテロポリマーのホロ毒素を分泌する。ＣｔｘＡサブユニットは、ＧＴＰ結合調節タンパク質であるＧｓαのＡＤＰリボシル化を触媒し、アデニル酸シクラーゼを活性化する。これはｃＡＭＰの過剰産生を引き起こし、最終的には塩化物および炭酸水素塩、続いて水の過剰分泌を引き起こし、特徴的なコレラ便を引き起こす。ＣｔｘＢサブユニットは五量体環を形成しており、Ｂサブユニットの五量体環は、腸上皮細胞の表面に存在するＧＭ１ガングリオシドに結合することによって、Ａサブユニットをその標的に導く。それにより、５つのＧＭ１ガングリオシドを結合できる。それ自体には有毒な活性はない。したがって、一実施形態では、コレラ菌抗原はＣｔｘＢである。いくつかの実施形態では、コレラ菌抗原は、配列番号２１または配列番号２１のアミノ酸１～１０４に、配列番号２４、および／または配列番号２５よってコードされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；または、配列番号２０のヌクレオチド２７０～５８１によってコードされるアミノ酸配列を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、感染性病原体は粘膜部位を介して宿主に感染する（すなわち、粘膜感染性病原体である）。粘膜感染症には下記の病原体が関与し得る：コレラ菌、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、ネズミチフス菌、アデノウイルス、ＲＳウイルス、肺炎球菌、結核菌、ヘリコバクター・ピロリ、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、赤痢菌、クロストリジウム（ディフィシル／パーフリンジェンス）、梅毒、狂犬病ウイルス、カンピロバクター・ジェジュニ、淋病、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ／Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス、ウシＲＳウイルス、気管支敗血症菌、イヌパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルス。感染病原体に関連する感染性疾患は、部位に基づいて分類されうる。例えば、感染性病原体は、気道に関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、季節性インフルエンザ、ＲＳＶ－ＡＬＲＩ、肺炎球菌、結核菌；胃腸管に関連するロタウイルス、ヘリコバクター・ピロリ、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ菌、赤癬菌、またはクロストリジウム（ディフィシルまたはパーフリンジェンス）；または、尿生殖路に関連する梅毒、淋病、単純ヘルペスウイルス２型、ＨＰＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＨＩＶでありうる。

【0028】

用いることができる真菌抗原としては、限定はされないが、カンジダ真菌抗原成分；ヒストプラズマ真菌抗原、球状体抗原（ｓｐｈｅｒｕｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ）などのコクシジオイデス真菌抗原および他のコクシジオデス抗原；クリプトコッカス真菌抗原、および他の真菌抗原が挙げられる。

【0029】

原虫抗原および他の寄生虫抗原の例としては、熱帯熱マラリア原虫などのマラリアを引き起こすマラリア原虫種由来の抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；森林熱帯型リーシュマニアおよび他のリーシュマニア抗原；およびトリパノソーマ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

がん抗原または腫瘍抗原を用いてもよく、これらは、腫瘍関連抗原（例えば、過剰発現タンパク質、分化抗原またはがん／精巣抗原）として、または腫瘍特異的抗原（例えば、オンコウイルス抗原、共通ネオアンチゲンまたはプライベートネオアンチゲン）として分類されうる。例えば、がん／精巣抗原（がん／生殖系列抗原とも呼ばれる）は、通常、免疫特権を持つ生殖系列細胞（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびＮＹ－ＥＳＯ－１）でのみ発現し；分化抗原とは、成人組織では通常発現されない細胞系列分化抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ））を指し；ならびに過剰発現抗原とは、単に、健常なレベルまたは正常なレベルを超えてがん細胞で発現される抗原を指す（例えば、ｈＴＥＲＴ，ＨＥＲ２、メソテリン、およびＭＵＣ－１）（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ Ｊａｎｓｅｎ（２０１９），ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４（７））。

【0031】

したがって、がん抗原または腫瘍抗原として、限定はされないが、Ｋ－Ｒａｓ、サバイビン、ジストログリカン、ＫＳ［１／４］凡がん抗原（ｐａｎ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）、卵巣がん抗原（ＣＡ１２５）、前立腺性酸性フォスファターゼ、ＰＳＡ、メラノーマ関連抗原ｐ９７、メラノーマ抗原ｇｐ７５、高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、多形上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原（ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば：ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＯ１７－１Ａ；ＧＩＣＡ１９－９、ＣＴＡ－１およびＬＥＡ、バーキットリンパ腫抗原－３８．１３、ＣＤ１９、ヒトＢ細胞リンパ腫抗原－ＣＤ２０、ＣＤ３３、メラノーマ特異的抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、およびガングリオシドＧＭ３、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＴＳＴＡ）、例えばＤＮＡ型腫瘍ウイルスのＴ抗原（Ｔ－ａｎｔｉｇｅｎ ＤＮＡ ｔｕｍｏｕｒ ｖｉｒｕｓｅｓ）およびＲＮＡ型腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導腫瘍抗原、がん胎児性抗原－αフェトプロテイン、例えば結腸のＣＥＡ、膀胱腫瘍がん胎児性抗原、分化抗原、例えば、ヒト肺がん抗原Ｌ６、Ｌ２０、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原－Ｇｐ３７、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、ＥＧＦＲなどの乳がん抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＡＢＰ７、ダブルコルチン、ブレビカン、ＨＥＲ２抗原、多形上皮ムチン（ＰＥＭ）、悪性ヒトリンパ球抗原－ＡＰＯ－１、胎児赤血球中に認められるＩ抗原などの分化抗原、初期内胚葉、成人赤血球中に認められるＩ抗原、着床前胚、胃線がんに認められるＩ（Ｍａ）、Ｍ１８、乳房上皮に認められるＭ３９、骨髄系細胞に認められるＳＳＥＡ－１、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ－Ｄ５、結腸直腸がんに認められるＤ１５６－２２、ＴＲＡ－１－８５（血液型Ｈ）、結腸線がんに認められるＣ１４、肺線がんに認められるＦ３、胃がんに認められるＡＨ６、Ｙハプテン、胚性癌腫細胞に認められるＬｅｙ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１細胞に認められるＥＧＦ受容体、膵がんに認められるＥ１シリーズ（血液型Ｂ）、胚性癌腫細胞に認められるＦＣ１０．２、胃線がん抗原、線がんに認められるＣＯ－５１４、線がんに認められるＮＳ－１０、ＣＯ－４３、Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体に認められるＧ４９、結腸線がんに認められるＭＨ２、結腸がんに認められる１９．９、胃がんムチン、骨髄系細胞に認められるＴ５Ａ７、メラノーマに認められるＲ２４、胚性癌腫細胞に認められる４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ－１、ＧＭ２、ＯＦＡ－２、ＧＤ２、およびＭ１：２２：２５：８、４～８細胞段階の胚に認められるＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４、皮膚Ｔ細胞リンパ腫由来のＴ細胞受容体由来ペプチド、癌に認められる線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）、ならびにそれらの変異体が挙げられうる。

【0032】

いくつかの実施形態では、がん抗原または腫瘍抗原は、Ｋ－Ｒａｓ、ＰＳＡまたはサバイビンの、多抗原融合ポリペプチドまたは組換えオーバーラップペプチド（ＲＯＰ）である。

【0033】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原は１つ以上のＴ細胞抗原セグメントおよび／または１つ以上のＢ細胞抗原セグメントを含む。抗原セグメントは抗原の一部であり、抗原はエピトープを含む。典型的には、抗原セグメントはエピトープを含む。Ｔ細胞抗原セグメントは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原セグメントまたはＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントであってよい。ＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原セグメントは、ＭＨＣＩＩに関連してＣＤ４^＋Ｔ細胞に提示され得るエピトープを含む抗原またはその一部である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントは、ＭＨＣＩに関連してＣＤ８^＋Ｔ細胞に提示され得るエピトープを含む抗原またはその一部である。異なる抗原セグメントは、異なる抗原または同じ抗原に提供され得る。複数の抗原またはその一部／断片を使用してもよい。適切には、抗原セグメントは、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む、またはそれらから構成される断片などの抗原の断片の形態である。これは、天然抗原が特に大きい場合に都合が良い。ポリペプチドエピトープは、より大きな分子に関連して提供される場合、抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるより大きな分子からのエピトープの切断を促進するために、切断部位に隣接して提供されてよい。これは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープとの関連において、ＡＰＣのエンドリソソーム区画からのエピトープの退出と、ＭＨＣＩへのロードのためのサイトゾルへの侵入を促進するために特に有用である。あるいは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープは、約７０未満のアミノ酸、例えば６０未満、５０未満、４０未満のアミノ酸の抗原断片として提供されてもよい。

【0034】

適切には、抗原は、２個以上の抗原セグメント、例えば、３個以上、５個以上、または１０個以上の抗原セグメントを含む多抗原融合ポリペプチドであり、任意に、≦２００個、好ましくは≦１００個、より好ましくは≦５０個の抗原セグメントを上限とする。「多抗原融合ポリペプチド」とは、エピトープなどの抗原セグメントを含むポリペプチドであって、抗原セグメントが直接連結されて人工ポリペプチドを形成するか、または適切な連結配列によって分離されて連結されて人工ポリペプチドを形成する、ポリペプチドを意味し；これは、ポリエピトープ、人工ポリエピトープ、またはモザイクポリエピトープと呼ばれる場合がある。これにより、抗原内の抗原セグメント間に生じる介在配列は、多抗原融合ポリペプチドにおいて回避されうる。各抗原セグメントは、同一または異なる抗原からのものであってよい。ＥＰ３２３５８３１に記載のとおり、抗原セグメントまたはエピトープ、とりわけ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントまたはエピトープの、多抗原融合ポリペプチドからの切断を促進するために、適切な連結配列を含んでよい。多抗原融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＣＤ４^＋Ｔ細胞抗原セグメントおよび少なくとも１つのＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原セグメントを含む。

【0035】

多抗原融合ポリペプチド中の抗原セグメントは、それらが由来する抗原において部分的に重複するポリペプチド配列に適切に由来し得る。２個の抗原セグメントが部分的に重複する場合、第一の抗原セグメントは第二の抗原セグメントと共有されないＮ末端配列を有し、第二の抗原セグメントは第一の抗原セグメントと共有されないＣ末端配列を有し、２つの抗原セグメントは共通の配列を共有するであろう。例えば、１個の抗原は、当該抗原の全配列を完全に含むオーバーラップペプチドに分割されうる。複数の抗原が存在する場合、それぞれがオーバーラップペプチドとして存在してもよい。

【0036】

用語「オーバーラップペプチド」は、ＥＰ３２３５８３１に記載されているような組換えオーバーラップペプチド（ＲＯＰ）を包含する。「オーバーラップペプチド」および「ＲＯＰ」とは、抗原が、部分的に重複する２個以上の抗原セグメント配列、すなわちペプチド配列を含む、上記で定義される多抗原融合ポリペプチド（本明細書では多抗原融合タンパク質とも称する）であることを意味する。適切には、多抗原融合タンパク質中の抗原セグメントは、部分的に重複しており、組み合わせにより、それらが由来する抗原のアミノ酸配列の≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、より好ましくは１００％を包含している。すなわち、第一のポリペプチドは第二のポリペプチドと部分的に重なり、第二のポリペプチドは第三のポリペプチドと部分的に重なるなどであってもよい。

【0037】

いくつかの実施形態では、オーバーラップペプチドを含む多抗原融合タンパク質は、≧３個、好ましくは≧５個、より好ましくは≧１０個の抗原セグメントを含んでいてもよく；任意で、≦２００個、好ましくは≦１００個、より好ましくは≦５０個の抗原セグメントを上限とする。例えば、ＲＯＰは１０個の抗原セグメントを含んでいてもよく、全てのセグメントを合わせると、抗原全体のアミノ酸配列の１００％を構成する。多抗原融合タンパク質中の全ての抗原セグメントは、必ずエピトープを含むことが理解されるであろう。

【0038】

いくつかの実施形態では、各抗原セグメントは、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）のＣＤ８^＋エピトープ；少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）のＣＤ４^＋エピトープ；および／または少なくとも１つ（少なくとも２つなど）のＢ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、各抗原セグメントは、ＣＤ８^＋エピトープおよびＣＤ４^＋エピトープとして同時に機能する少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）のアミノ酸配列を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、各抗原セグメントは、８～５０アミノ酸長、好ましくは１０～４０アミノ酸長、より好ましくは１５～３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、各抗原セグメントは、抗原セグメント間に位置する切断部位の配列を含んでもよい。例えば、切断部位の配列は、カテプシンの切断部位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、切断部位は、カテプシンＳの切断部位（ＬｕｅｔｚｎｅｒおよびＫａｌｂａｃｈｅｒ，２００８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３（５２）：３６１８５－３６１９４でさらに説明されている）（例えば、Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ｌｙｓ（配列番号２６）または同様の切断部位）、カテプシンＢの切断部位（例えば、Ｍｅｔ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ（配列番号２７）または同様の切断部位）、カテプシンＫの切断部位（例えば、Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２８）または同様の制限部位）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カテプシンＳの切断部位は、Ｘ－Ｖａｌ／Ｍｅｔ－Ｘ↓Ｖａｌ／Ｌｅｕ－Ｘ－疎水性アミノ酸、Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ↓、－Ｌｅｕ、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ↓、－Ｌｅｕ、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ↓、－Ｌｅｕ、Ｘ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ↓（配列番号２９）、Ｘ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ↓（配列番号３０）、Ｘ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ↓（配列番号３１）およびＸ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ｌｙｓ↓（配列番号３２）からなる群から選択され；ここで、各Ｘは独立して、任意の天然アミノ酸であり、↓は切断位置を意味する。いくつかの実施形態では、各抗原セグメントは、上記の切断部位の配列を介して人工多抗原融合タンパク質中で直接接続される。いくつかの実施形態では、各抗原セグメントを接続するために使用される切断部位の配列は、同一であるかまたは異なっている。いくつかの実施形態では、切断部位の配列は各抗原セグメントに含まれないか；あるいは、切断部位の配列は抗原セグメントに含まれているが、抗原セグメントが消化された後に形成される少なくとも１つの切断生成物（または切断生成物の一部または全部）は、依然としてＣＤ８^＋エピトープまたはＣＤ４^＋エピトープである。

【0040】

いくつかの実施形態では、多抗原融合タンパク質（適宜、オーバーラップペプチドを含む）は、さらに：
（ａ）標識配列（例えば、検出のためのＦＬＡＧ）；
（ｂ）膜透過性配列（例えば、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ））
（ｃ）カテプシン切断部位（例えば、ＬＲＭＫ（配列番号３３））；および／または
（ｄ）細胞壊死誘導因子配列
からなる群から選択される１つ以上の任意の要素の配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、人工多抗原融合タンパク質は、１００～２０００アミノ酸長、好ましくは１５０～１５００アミノ酸長、より好ましくは２００～１０００アミノ酸長または３００～８００アミノ酸長である。

【0042】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、式Ｉ：
Ｙ－（Ａ－Ｃ）ｎ－Ｚ （Ｉ）
の構造で示される。
式中、
Ａは抗原セグメントであり；
Ｃはカテプシンの切断部位の配列であり；
ｎは≧３の正の整数であり；
Ｙは存在しないか、あるいは、“Ｙ０－Ｂ”（ここで、Ｙ０はアジュバント要素配列、細胞壊死誘導要素配列、またはそれらの組み合わせであり、Ｂは存在しないか、または切断部位の配列である）で示される配列であり；
Ｚは存在しないか、あるいはアジュバント要素配列、細胞壊死誘導要素配列、またはそれらの組み合わせであり；
ただし、Ｚが存在しない場合、最後の“Ａ－Ｃ”中のＣは存在しない可能性がある。

【0043】

いくつかの実施形態では、切断部位配列は、Ｃと異なる（すなわち、Ｂ≠Ｃ）。いくつかの実施形態では、切断部位配列は、Ｃと同一である（すなわち、Ｂ＝Ｃ）。いくつかの実施形態では、ｎは、５～１００の任意の整数であり、好ましくは６～５０、より好ましくは７～３０である。

細菌とその調製方法

【0044】

本発明の第１の態様の細菌はクロストリジウム綱の細菌である。クロストリジウムには、クロストリジウム目、ハラナエロビウム目（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ）、およびサーモアナエロバクター目（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）が含まれる。クロストリジウム目には、クロストリジウム属を含むクロストリジウム科が含まれる。クロストリジウム属は、細菌の属の中で最大のものの１つである。この属は、偏性嫌気性菌であり、胞子を生成することができる、桿状のグラム陽性菌により定義される。

【0045】

好ましくはクロストリジウム目またはクロストリジウム属の種は、胞子を形成することができる。

【0046】

ある特定のクロストリジウム属の種は、毒素を産生するのでヒト疾患の原因となることが知られている（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５３３／９７８１８４５６９６３３７．２．８２０）。これらには、クロストリディオイデス・デフィシル、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ノービイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンスが含まれる。

【0047】

好ましくは、種は、病原性のクロストリジウム属の種ではない。それは、そのような病原性の種からの弱毒株であっても、そうでなくてもよい。

【0048】

いくつかのクロストリジウム属の種はヒト下部消化管に存在する。下部消化管で検出される主なクロストリジウムには、クロストリジウムのクラスターＸＩＶａ（クロストリジウム・コッコイデス群としても知られる）およびクロストリジウムのクラスターＩＶ（クロストリジウム・レプタム群としても知られる）が含まれる（Ｌｏｐｅｔｕｓｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２０１３，５：２３）。クロストリジウムのクラスターＸＩＶａには、クロストリジウム、ユーバクテリウム、ルミノコッカス、コプロコッカス、ドレア（Ｄｏｒｅａ）、ラクノスピラ、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）およびブチリビブリオ属に属する種が含まれる。クロストリジウムのクラスターＩＶは、クロストリジウム、ユーバクテリウム、ルミノコッカス、およびアナエロフィルム（Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ）属で構成される。

【0049】

クロストリジウムのクラスターＩには腸内微生物叢（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｍｎｉ．２０１７．１１．００３）に存在する種が含まれる一方で、他の種は主に土壌および他のそのような環境的ニッチにおいて認められ、溶媒および酸の生産に有用な産業的シャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）の典型である（ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０１６．０５．０１１）。クラスターＩには：クロストリジウム・アセチカム（Ｃ．ａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アエロトレランス、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・バラチ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・カダベリス（Ｃ．ｃａｄａｖｅｒｉｓ）、クロストリジウム・セルロリティカム、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・シャボイ（Ｃ．ｃｈａｕｖｏｅｉ）、クロストリジウム・クロストリジオフォルメ（Ｃ．ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・コリカニス（Ｃ．ｃｏｌｉｃａｎｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（現在はクロストリディオイデス・デフィシルに改名）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃ．ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・エステルセティカム（Ｃ．ｅｓｔｅｒｔｈｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ファラックス（Ｃ．ｆａｌｌａｘ）、クロストリジウム・フェセリ（Ｃ．ｆｅｓｅｒｉ）、クロストリジウム・フォルミカセチカム（Ｃ．ｆｏｒｍｉｃａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・グリコリカム（Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ヒストリチクム、クロストリジウム・イノキューム（Ｃ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウム・リュングダーリー（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃ．ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、クロストリジウム・マヨンベイ（Ｃ．ｍａｙｏｍｂｅｉ）、クロストリジウム・メソオキシベンゾボランス（Ｃ．ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・ノービイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・オエデマチエンス（Ｃ．ｏｅｄｅｍａｔｉｅｎｓ）、クロストリジウム・パラピュトリフィカム（Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ピリフォルメ（Ｃ．ｐｉｌｉｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃ．ｒａｍｏｓｕｍ）、クロストリジウム・ロゼウム（Ｃ．ｒｏｓｅｕｍ）、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・セプティカム、クロストリジウム・ソルデリ、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・スティックランディ、クロストリジウム・テルチウム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・サーモサッカロリティクム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・チロブチリカム、クロストリジウム・パプロソルベンス（Ｃ．ｐａｐｒｏｓｏｌｖｅｎｓ）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・カルボキシドボランス（Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・シンデンス（Ｃ．ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、およびクロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）が含まれる。ヒトの腸内で見られるクロストリジウムのクラスターＩの種のうち、疾患に関連するものは少数だが、一般に大部分は健康と満足のいく生活状態に寄与すると考えられている。好ましくは、クラスターＩから選択される細菌は、健康上の利益に関連する種である。これらの種には、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・シンデンス、およびクロストリジウム・ブチリカムが含まれる。

【0050】

好ましくは、細菌はクロストリジウム属のクラスターＩ、ＩＶおよび／またはＸＩＶａに由来する。

【0051】

好ましくは、細菌は、下部消化管、例えばヒトの下部消化管、で検出可能であるが、下部消化管、例えばヒトの下部消化管、における常在微生物叢の一部を永続的に生着または形成すると考えられていないか、あるいはそのような常在種からの弱毒株である。

【0052】

酪酸産生は、クロストリジウム亜門、および特にクロストリジウムのクラスターＸＩＶａおよびＩＶに属する嫌気性細菌で広く認められる。酪酸産生種は、ヒトの結腸の常在菌であるクロストリジウム属の２つの優勢な科、ルミノコッカス科とラクノスピラ科の中に見出される。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／１４６２－２９２０．１３５８９。ラクノスピラ科には、ユーバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ローズブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ローズブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、ユーバクテリウム・ハリイ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ）、アナエロスティペス・ハドルス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ）、ルミノコッカス・トルキース（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ）、コプロコッカス・オイタクツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ）、ブラウティア・オベウム（Ｂｌａｕｔｉａ ｏｂｅｕｍ）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）が含まれる。ルミノコッカス科には、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、サブドリグラヌルム・バリアビレ（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）、ルミノコッカス・ブローミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒｏｍｉｉ）、ユーバクテリウム・シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ）が含まれる。

【0053】

好ましくは、細菌種は酪酸を産生する。ヒト下部消化管に永続的に生着すると考えられいない酪酸産生種にはクロストリジウム・ブチリカムが含まれる。

【0054】

好ましくは、種は、エレクトロポレーションまたは結合による形質転換などの遺伝子工学技術に適しており、典型的には非病原性株である。既知の形質転換可能な株としては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムおよびクロストリジウム・サッカロリティカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）を含む工業用溶媒株、ならびにクロストリジウム・ディフィシルを含む病原性種が挙げられる。

【0055】

好ましくは、種はクロストリジウム・ブチリカムである。適切な株には、（ＤＳＭ１０７０２／ＡＴＣＣ１９３９８／ＮＣＴＣ７４２３）としても言及される「Ｒｏｗｅｔｔ」株が含まれる。

【0056】

いくつかの実施形態では、クロストリジウム菌は、酪酸などの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができる。ＳＣＦＡには乳酸、酢酸、酪酸が含まれており、Ｔ細胞の応答を強化すると考えられている。酪酸は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激し、そのエフェクター機能を高めることができ（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，８：１４４３０，ａｎｄ Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４８（５）：９９２－１００５）、また、高濃度の糞便中の酪酸は、固形がん腫瘍の患者におけるニボルマブまたはペムブロリズマブによる治療後の無増悪生存期間の延長と関連している（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３（４）：ｅ２０２８９５）。さらに、酪酸は活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の記憶能力を高め、抗原再遭遇時の最適なリコール応答には短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が必要であった（Ｂａｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，２０１９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５１（２）：２８５－２９７）。それ故に、クロストリジウムを含む微生物叢には、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の記憶細胞としての長期生存を促進する役割がある。ＳＣＦＡの産生は、典型的には栄養細胞増殖中の、グルコースなどの炭水化物基質から酪酸などのＳＣＦＡへの代謝によって、すなわち嫌気性代謝によって、決定され得る。

【0057】

第１の態様による細菌は、本明細書に記載のとおり、抗原をコードする異種核酸分子を含む。すなわち、それは遺伝子改変細菌である。「異種核酸分子」とは、核酸分子が抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などの１つ以上の非ネイティブ配列を含むことを意味するが、代わりに、嫌気性細胞増殖中にネイティブ抗原の遺伝子発現レベルの増加を促進するように、非ネイティブ制御配列の制御下でネイティブ抗原コード配列を提供できることも考えられる。異種核酸分子は、遺伝子、すなわち遺伝子の転写を開始させるプロモーターに操作可能に連結されたＯＲＦを含む。当技術分野で公知のように、他の制御配列も存在してよい（Ｍｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａ ｒｏａｄｍａｐ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ａｎａｅｒｏｂｅ，４１：１０４－１１２）。異種核酸分子は、非ネイティブ遺伝子を含みうる。用語「非ネイティブ遺伝子」は、その自然環境にはない遺伝子を指し、微生物のある種からの遺伝子であって、同じ属の別の種に導入された遺伝子を含む。本明細書で用いる場合、用語「カセット」には、本明細書に記載のいずれの異種核酸分子が含まれ、適宜、異種核酸分子は、抗原をコードするＯＲＦ；プロモーターに操作可能に連結されたＯＲＦ；他の制御配列；非ネイティブ遺伝子；またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上の非ネイティブ配列を含む。異種核酸分子は、クロストリジウムに対してコドン最適化されていてもよい。

【0058】

プロモーターは、無酸素条件下での胞子発芽後のような嫌気性細胞増殖中、および／または嫌気性栄養細胞代謝中の、抗原の発現を可能にするように選択される。「嫌気性細胞増殖」とは、クロストリジウム菌が胞子ではなく細胞の形態であり、栄養増殖、すなわち細胞分裂ができることを意味する。クロストリジウム菌は嫌気性条件下でのみ増殖することができる。増殖は、コロニー形成単位の増加によって認識されうる。嫌気性栄養細胞代謝は、利用可能な炭水化物源からの酪酸、酢酸、乳酸、またはそれらの組み合わせなどのＳＣＦＡの産生によって評価することができる。例えば、グルコースのような炭水化物基質などの発酵性基質を細菌に供給することができ、酪酸、酢酸、乳酸、またはそれらの組み合わせなどのＳＣＦＡの産生を測定して代謝を示すことができる。「嫌気性細胞増殖」および「嫌気性栄養細胞代謝」という表現は、互換的に使用されてよい。よって、プロモーターは、代謝的に活性な細胞または増殖中の細胞において活性となるように選択される。

【0059】

適切なプロモーターは細胞増殖中に活性であり、構成的プロモーターであってもよい。一次代謝に必須の遺伝子のプロモーターは、適切な構成的プロモーターでありうる。抗原の発現レベルは、強力なプロモーターなどの選択された強度を有するプロモーターを用いて遺伝子発現を制御することによって最適化され得る。適切には、ネイティブなクロストリジウムのプロモーターが用いられる。適切なプロモーターとしては、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３６：７０－７５）；クロストリジウム・アセトブチリカムのｐｔｂおよびｔｈｌプロモーター（Ｔｕｍｍａｌａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３７９３－３７９９）およびクロストリジウム・パーフリンジェンスのｃｐｅ プロモーター（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， Ｌａｂｂｅ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２： ５５５０－５５５８）およびクロストリジウム・アセトブチリカム由来のチオラーゼプロモーター（Ｗｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：５３１－５４１）が挙げられる。他の適切なプロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのｈｂｄ、ｃｒｔ、ｅｔｆＡ、ｅｔｆＢおよびｂｃｄプロモーター（Ａｌｓａｋｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２００５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７：７１０３－７１１８）、およびｐ０９５７プロモーター；ならびに、ｐＭＴＬ８００００モジュラーシャッフルプラスミド（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８：７９－８５）から得ることができる、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｄｘ プロモーター（ＮＣＩＭＢ１０６９６）であってよい。好ましくは、選択可能なマーカー遺伝子のプロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのｔｈｌ遺伝子のプロモーター、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ遺伝子プロモーター、またはクロストリジウム・スポロゲネスのｆｄｘ遺伝子プロモーターである。

【0060】

異種核酸分子は、当技術分野で公知の方法を使用してクロストリジウムに導入され得る。典型的には、異種核酸分子は単一コピーとしてゲノムに組み込まれるか、低コピーのプラスミド上に存在する。あるいは、異種核酸分子は高コピープラスミド上に存在してよい。高コピープラスミドは、例えば、ＳＹ，Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ＬＤ，Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ ＥＴ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９３ Ａｐｒ １５；１０８（３）：３１９－２３に記載の通り、約８～１４、またはそれ以上のコピー数にて存在し得る。

【0061】

適切なプラスミドとしては、クロストリジウムによって安定に維持されるプラスミドが挙げられる。適切なプラスミドは、クロストリジウム内での複製を可能にするために、適切な複製起点および任意の必要な複製遺伝子を含む。プラスミドの形質転換は典型的には、クロストリジウムにおいて、結合または転換によって行われる。クロストリジウムにおける転換および結合の方法は、Ｄａｖｉｓ，Ｉ，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ，ＮＰ（２００５）“Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ”，Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｄｕｒｒｅ Ｐ，ｅｄ）ｐａｇｅｓ ３７－５２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡに記載されている。

【0062】

異種核酸分子は、ＷＯ ２０１０／０８４３４９およびＭｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ａｎａｅｒｏｂｅ ４１：１０４－１１２に記載されているアレル連結交換（Ａｌｌｅｌｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）（ＡＣＥ）；または、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集（Ａｔｍａｄｊａｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ，ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ Ｎ１－４（ＨＭＴ），ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６６（６））によってなどの遺伝子組み込み技術を用いて、ゲノム、典型的にはクロストリジウムの染色体に組み込まれうる。アレル結合交換はいずれのクロストリジウム種の遺伝子改変に用いることができ、ウラシルに対して栄養要求性であってフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に対して耐性のあるｐｙｒＥ欠失変異体の最初の作製に依ると考えられている。これにより、ＦＯＡの存在下で、カウンター／ネガティブ選択マーカーとして異種ｐｙｒＥ対立遺伝子を用いた対立遺伝子交換によるＤＮＡ断片の挿入が可能となる。挿入部位の変更後、作製した株を、ＡＣＥを用いて迅速にウラシル原栄養性に戻してよく、それにより、ｐｙｒＥ堪能なバックグラウンドで変異体の表現型を特徴づけることができる。重要なことは、ｐｙｒＥ対立遺伝子の補正と同時にＡＣＥを用いて、不活性化された遺伝子の野生型コピーがゲノムに導入されうることである。ｐｙｒＥ欠失の最初の作製は、前述のＭｉｎｔｏｎらに記載されているように特別な形態のＡＣＥによって、またはＷＯ ２００７／１４８０９１に記載されているように可動性グループＩＩイントロンを再標的化する手段によって行われる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集はまた、大きなＤＮＡ断片の組み込みのためにクロストリジウムで広く応用されており、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＣＲＩＳＰＲ‐ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．１１：９６１－７２）、クロストリジウム・ベイジェリンキー（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ａｎｄ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００：１－５）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｐｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．６：２５６６６）、およびクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ Ｎ１－４ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８３：ｅ００２３３－１７）を含む、多くのクロストリジウムの株で適用に成功している。

【0063】

異種核酸分子が、単一コピーとしてゲノムに組み込まれているか、あるいは低コピープラスミドに存在している場合、発現される抗原の量は、異種核酸分子が高コピー数プラスミド上に存在している場合よりも、典型的には少ないであろう。本発明者らは、異種核酸分子が単一コピーとしてゲノムに組み込まれている場合であっても、抗原特異的免疫応答が効果的に刺激され得ることを見出した。嫌気性細胞増殖中のクロストリジウムの細胞の細胞重量当たり発現される抗原の量は、典型的には、最大、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍｇ、１μｇ／ｍｇ、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０または２０μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量までの範囲であってよい（ただし、０ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量を超え、典型的には１０ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇまたは４０ｎｇ／ｍｇを超える）。これらのうちのいずれか２つ値の間の任意の範囲が想定される。例えば、嫌気性細胞増殖中のクロストリジウムの細胞の細胞重量当たり発現される抗原の量は、１０～４００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；２０～２００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；４０～１００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；１００ｎｇ～５μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；２００ｎｇ～２．５μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；４００～１５００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；または約８００ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量であってよいか；あるいは、１～５μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量、２～４μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量、例えば、約３μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量；またはいずれの他の組み合わせであってよい。その量は、クロストリジウムの細胞を培養し、ＦＬＡＧなどの検出タグを典型的に含む抗原を抽出し、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングなどの検出手段で定量することにより、決定され得る。Ｓｉｇｍａから入手可能なＦＬＡＧ－タグ標準物質などのタンパク質標準物質をそのようなアッセイで用いて、検量線を作成してよい。実施例１では、ＦＬＡＧ－ＲＯＰはかろうじて検出可能であった（ＯＤ１．０まで培養した細胞の比体積で＜２５ｎｇに相当する）。ＯＤ１．０の細胞密度を０．３ｇ／Ｌとして、その培養量の菌の乾燥重量を推定すると、＜８０ｎｇ／ｍｇ乾燥細胞重量に相当する。産生される抗原の量は、プロモーターの強度、細胞あたりの異種核酸分子のコピー数などに応じて変化し得る。

【0064】

実施形態のいずれかにおいて、細菌細胞は、抗原と同時発現することができる免疫賦活剤またはアジュバントをコードするさらなる異種核酸分子を含みうる。典型的な免疫賦活剤は、ポリペプチド、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８もしくはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５などのサイトカインであってよい。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７抗原は臨床試験でＩＬ－１２と併用されている（Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｔｒｉａｌ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ ＨＰＶ１６ ａｎｄ ＨＰＶ１８ Ｅ６／Ｅ７ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｈｅｍｏｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．１０７（３）：４８７－４９８）。よって、任意のＨＰＶ抗原と併用するのに適した免疫賦活剤はＩＬ－１２である。

【0065】

本発明の対応する態様は、少なくとも１つの異種核酸分子を細菌に導入することを含む、第１の態様に記載の細菌を調製する方法を提供する。

医薬組成物および調製方法

【0066】

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の細菌を含有する医薬組成物である。

【0067】

本発明の対応する態様は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤または賦形剤とともに細菌を製剤化するステップを含む、第２の態様に記載の医薬組成物を調製する方法を提供する。

【0068】

細菌は単独で投与することも可能であるが、医薬組成物中に存在させることが好ましい。本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または治療および／または予防成分（アジュバントなど）のようなさらなる成分を含有する医薬組成物を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」とは、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に公知の任意の公知の化合物または既知の化合物の組み合わせをいう。担体は１つ以上の賦形剤または希釈剤を含むことができる。

【0069】

クロストリジウムは、細菌の増殖に適した条件下で行われる発酵によって調製することができる。発酵後、細菌は遠心分離を使用して精製され、活性を保持するように調製され得る。組成物中の細菌は、生存可能な有機体として提供される。組成物は細菌胞子および／または栄養細胞を含有することができる。細菌を乾燥させることで、細菌の活動性を保持することができる。適切な乾燥方法には、凍結乾燥、噴霧乾燥、加熱乾燥、およびそれらの組み合わせが含まれる。その後、得られた粉末を、本明細書に記載されているように、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。

【0070】

胞子および／または栄養型の細菌を、本明細書に記載されるように、経口投与用の有用な賦形剤および成分とともに製剤化してよい。特に、医薬品および栄養補助食品業界で慣用されている脂肪成分および／または水性成分、湿潤剤、増粘剤、保存剤、テクスチャー剤、風味増強剤および／またはコーティング剤、酸化防止剤、保存剤、ならびに／あるいは染料。適切な薬学的に許容される担体としては、結晶セルロース、セロビオース、マンニトール、グルコース、スクロース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウムおよびデンプン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。次いで、細菌は、本明細書に記載されるように、適切な経口摂取可能な形態に製剤化され得る。適切な経口摂取可能な形態の生菌は、医薬品業界で周知の方法によって調製され得る。適切な医薬担体、賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０１３に記載されている。

【0071】

本発明の医薬組成物は、単位容量の形態などの剤形に入れることができる。医薬組成物には、経口または直腸内投与に適したものが含まれる。本発明の組成物は、１回投与してもよく、または治療計画の一部として連続的に投与してもよい。好ましくは、投与は、都合のよい投与計画を用いた経口投与である。

【0072】

適切な経口剤形としては、錠剤、カプセル、粉末（例えば、小袋入り粉末）および液体が挙げられる。細菌が経口投与用である場合、それは適切には、胞子の形態で；または遅延放出医薬組成物中の栄養細胞の形態で提供される。

【0073】

本発明の医薬組成物は、坐剤および注腸製剤を含む直腸内投与用に製剤化することもできる。坐剤の場合、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶解され、活性成分が、例えば撹拌することによって均一に分散される。次いで、溶解した均質な混合物を好都合な大きさの型に注ぎ、冷却して固化させる。注腸製剤は、当業者に公知である、ゲルもしくは軟膏を含む半固体、または懸濁液、水溶液もしくは泡を含む液体形態であり得る。

【0074】

本発明の医薬組成物は、有効量の細菌が腸の嫌気性部分に送達されるように投与される。「有効量の細菌」とは、細菌が、抗原に対する適切な免疫応答を誘導するか；または病気を予防、寛解、もしくは治療するのに有効な量の抗原の送達をもたらすという意味を含む。例えば、ＣＴＬ応答が適切である可能性があるウイルス感染の場合、抗原は、その抗原に対するＣＤ８^＋ＣＴＬ応答を誘導するのに有効な量であろう。

【0075】

適切には、細菌は、医薬組成物中において、乾燥組成物の１×１０^５～１×１０^１１コロニー形成単位／ｇ（ＣＦＵ／ｇ）に相当する量で存在することができる。適切には、細菌は、単位剤形あたり１×１０^６～１×１０^１０ＣＦＵ、好ましくは単位剤形あたり約１×１０^７～１×１０^９ＣＦＵ、例えば単位剤形あたり約１×１０^８ＣＦＵの量で存在してもよい。

【0076】

医薬組成物には、アジュバントまたは免疫賦活分子、特に遅延放出用に製剤化された医薬組成物が含まれうる。しかしながら、アジュバントが必要とされない場合があるか、または抗原が従来のポリペプチド抗原ワクチン製剤で提供された場合に必要とされうる量よりも少ない量でのみ必要とされる場合があるか、あるいは、毒性の低いアジュバントのみが必要とされる場合があると想定される。したがって、アジュバントを含まない医薬組成物が、ミョウバンなどのヒトでの使用に適したアジュバントのみを含む医薬組成物と同様に、想定される。

【0077】

アジュバントは、医薬組成物への混合により、抗原に対する免疫応答を増加させるか、さもなければ変更するいずれの物質である。アジュバントとして、ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮａ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ（ＳＯ_４）_４、シリカ、ミョウバン、ＡＩ（ＯＨ）_３、Ｃａ３（ＰＯ_４）_２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＤＭＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル（ｎｏｒｎｕｒａｍｙｌ）－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ｎｏｒ－ＭＤＰとも称される）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’２’－ジパルミトイル－ｓ－ｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥとも称される）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ－８０（Ｒ）エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リポ多糖およびその様々な誘導体（リピドＡを含む）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋ社のアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌由来のｗａｘ Ｄ、コリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌、およびブルセラ属の細菌で見出された物質、リポソームまたは他の脂肪乳剤、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮ（米国特許第５８，７６７および５，５５４，３７２を参照）、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ならびにＱＳ－２１が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0078】

免疫応答を変更または刺激するために用いられうる追加のアジュバントまたは化合物としては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンドが挙げられる。哺乳類において、ＴＬＲはＤＣ上で発現する受容体のファミリーであり、微生物病原体に関連する分子パターンを認識して応答する。いくつかのＴＬＲリガンドがワクチンアジュバントとして集中的に研究されている。細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）はＴＬＲ４リガンドであり、その解毒変異体モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）はヒトでの使用が承認されているアジュバントである。ＴＬＲ５は単球およびＤＣ上で発現され、フラジェリンに応答し、一方でＴＬＲ９はＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡを認識する。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＯＬＧ）は、ＴＬＲ９の強力なリガンドおよびアゴニストであり、そのアジュバント特性について集中的に研究されている。

【0079】

リンパ球制御特性の結果として有用であるサイトカインなど、免疫応答を刺激する他の剤（免疫賦活剤）を挙げることができる。適切なサイトカインとしては、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１８が挙げられうる。

【0080】

本発明の医薬組成物は、栄養細胞または胞子などの生細胞を含有するカプセルとして製剤化することができ、ここで、カプセルは、経口投与後に下部消化管の嫌気性部分において、生細胞、典型的には栄養細胞を放出できるようにする遅延放出層またはコーティングを含む。「遅延放出」とは、細菌の放出が、投与後または服用後に一定期間遅れることを意味する（遅延はラグタイムとしても知られている）。この変更は、特別な製剤設計および／または製造方法によって達成される。その後の放出は、速放性剤形の放出と同様であり得る。

【0081】

遅延放出のための賦形剤および製剤は当技術分野で周知であり、特定の技術が市販されている。

【0082】

経口投与される薬剤の標的を結腸とするための戦略として、ｐＨ感応性ポリマーによるコーティング；時限放出システムの製剤；結腸の細菌によって特異的に分解される担体の利用；生体接着システム；および浸透圧制御ドラッグデリバリーシステムを含む、様々な方法が提案されている。微生物分解性ポリマー、特にアゾ架橋ポリマーが、結腸を標的とした薬剤のコーティングとして使用するために研究されてきた。

【0083】

アミロース、イヌリン、ペクチン、グアーガムなどの特定の植物多糖類は、胃腸管の酵素の存在下で影響を受けないため、結腸を標的としたドラッグデリバリーシステムの製剤化のために、薬剤のコーティングとして研究されている。さらに、植物多糖類と甲殻類抽出物（キトサンまたはその誘導体を含む）の組み合わせは、結腸送達システムの開発において興味深いものであることが証明されている。

【0084】

遅延放出製剤の賦形剤の例としては、水中で急速に膨潤し、その膨潤した構造内に大量の水を保持することができるヒドロゲルが挙げられる。ヒドロゲルの種類によって薬物放出パターンが異なるため、結腸送達を促進するためのヒドロゲルの利用が研究されている。例えば、高粘度のアクリル樹脂ゲルであるＥｕｄｉｓｐｅｒｔ ｈｖを用いてヒドロゲルが調製されており、これは直腸下部での長期間の滞留性に優れている。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマー（エボニックインダストリーズ）は、胃耐性、ｐＨ制御による薬物放出、結腸送達、活性物質の保護、および活性物質からの保護を含む、様々な形態のコーティングを提供する。

【0085】

医薬組成物は、細菌および１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を、当技術分野の技術を使用して遅延放出層またはコーティングでコーティングすることによって調製され得る。例えば、公知のプレスコーター（ｐｒｅｓｓ ｃｏａｔｅｒ）のいずれかを使用して圧縮することによってコーティングを形成してよい。別法として、医薬組成物を、造粒および凝集技術によって調製してよいか、あるいは噴霧乾燥法を使用して構築し、続いて乾燥させてもよい。

【0086】

コーティングの厚さは、前述の技法のいずれかを使用することによって正確に制御できる。当業者は、所望のラグタイム、および／またはラグタイム後に細菌が放出される所望の速度を得るための手段として、コーティング厚さを選択することができる。

【0087】

ｐＨ依存性システムは、ヒト消化管のｐＨが、胃（ｐＨは約１～２であり得、消化中はｐＨ４まで上昇する）から消化部位の小腸（ｐＨは約６～７であり得る）を経て徐々に上昇し、回腸遠位部でさらに上昇するという一般に認められた見解を利用している。錠剤、カプセルまたはペレットをｐＨ感応性ポリマーでコーティングすることにより、遅延放出がもたらされ、胃液から活性薬剤を保護する。

【0088】

本発明の医薬組成物は、第１の態様に記載の細菌を特定のｐＨでＧＩ管に送達するように製剤化され得る。市販の賦形剤としては、胃腸管の特定の部位に細菌を送達するために使用できるＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマーが挙げられる。例えば、十二指腸内のｐＨは約５．５を超える可能性がある。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ １００－５５（粉末）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ ３０ Ｄ－５５（水性分散液）、および／またはＡｃｒｙｌ－ＥＺＥ（登録商標）（Ｐｏｗｄｅｒ）を、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ １００－５５に基づいた使用準備済みの腸溶コーティングとして、用いることができる。空腸内のｐＨは約６～約７である可能性があり、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ １００（粉末）および／またはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ １２，５（有機溶液（Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））を用いることができる。結腸への送達は約７．０を超えるｐＨにて達成され得るので、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ １００（粉末）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ １２，５（有機溶液）、および／またはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ ３０ Ｄ（水性分散液）を用いることができる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ ３０ Ｄ製剤用に特別に設計されたＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標）Ｔ２０ 流動化剤（ｇｌｉｄａｎｔ）と可塑剤のプレミックスを用いることもできる。

【0089】

適切には、本発明の医薬組成物は、第１の態様に記載の細菌を、好ましくは経口投与によって胃腸管に送達するように製剤化される。

【0090】

人間の胃腸管は、食道、胃、腸など、口から肛門まで伸びる消化に関わる構造で構成されている。胃腸管には、肝臓、胆道、膵臓などの副腺器官（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｏｒｇａｎ）は含まれない。腸には小腸と大腸が含まれる。小腸には、十二指腸、空腸、回腸が含まれる。大腸には、盲腸、結腸、直腸、肛門が含まれる。上部消化管には、頬側口腔、咽頭、食道、胃、十二指腸が含まれる。下部消化管には、小腸（十二指腸より下）と大腸が含まれる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、第１の態様に記載の細菌を、胃腸管の内腔または粘膜表面、より好ましくは大腸の内腔または粘膜表面、より好ましくは結腸の内腔または粘膜表面に送達する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、第１の態様に記載の細菌を、下部消化管の嫌気性部分、好ましくは結腸および／または末端小腸（末端回腸、「回腸終末部」とも呼ばれる）に送達する。

【0091】

Ｚｈｅｎｇ，Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｌｇａｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０１５ ３０９：６，Ｃ３５０－Ｃ３６０に概説されているように、ヒトの腸管内には急な酸素勾配が存在する。海抜ゼロでの呼吸可能な空気のＰｏ_２は１４５ｍｍＨｇ付近（２１％Ｏ_２付近）である。健康な肺胞の測定では、Ｐｏ_２は１００～１１０ｍｍＨｇであることが明らかになっている。全く対照的に、健康な結腸の最も内腔側のＰｏ_２は１０ｍｍＨｇ（１．４％Ｏ_２）以下である。このような違いは、酸素源、局所代謝、および血流の解剖学的構形態の組み合わせを反映している。Ｐｏ_２は腸粘膜下層から数兆個の嫌気性微生物が生息する内腔に向かって放射軸に沿って急激に低下する。

【0092】

細菌が胞子として経口的に送達される場合、細菌は胃腸管を通過して嫌気性部分に到達し、そこで発芽して増殖する。下部消化管の嫌気性部分には、回腸終末部および結腸が含まれる。上記のＺｈｅｎｇの見解によれば、結腸は回腸終末部よりもＰｏ_２が低い場合があるため、細菌の増殖は結腸内でより効率的である場合がある。胞子の発芽および嫌気性代謝または増殖を引き起こすのに必要なＰｏ_２は、０～２％の範囲でありうる。

【0093】

ヒト結腸の体積（上行結腸、下行結腸、横行結腸の合計）は約６００ｍｌであり（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２－１４）Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍｏｔｉｌ．２６，１２４－１３０）、一方でマウスの腸全体の体積は約１ｍｌである（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｂａｓｉｔ，Ａ．Ｗ．＆ Ｍｕｒｄａｎ，Ｓ．（２００８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０，６３－７０）。おおよその合計胃腸通過時間は、マウスでは約５～６時間であり（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＥＪＮＭＭＩ Ｒｅｓ．３，６０ ａｎｄ Ｋａｓｈｙａｐ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４４，９６７－９７７）、結腸通過時間はヒトでは２３～４０時間と推定されている（Ｄｅｇｅｎ，Ｌ．Ｐ．＆ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｓ．Ｆ．（１９９６）Ｇｕｔ ３９，２９９－３０５およびＷａｇｅｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．３９，１６６－１６９－１６９）。ヒト腸内の通過時間はマウスよりも５倍長いため、結腸の体積が同じであれば、同じ濃度の抗原を得るために必要な胞子の数は少なくなる（例えば５分の１）。

【0094】

さらに、細菌はマウスの結腸よりも約５倍長くヒトの結腸に存在するため、細胞分裂の時間が長くなり（５倍）、結果として細胞数が増え、抗原の産生量が増加する。菌株ＣＨＮ１の実験室での発酵に基づく倍加時間は、大腸菌と同様であり、大腸菌の腸内倍加時間は約３時間である（Ｍｙｈｒｖｏｌｄ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１００３９）。ＣＨＮ１は腸内を通過する間に細胞が１０回倍加する可能性があり、これは細胞数の３桁の増加に相当する。マウスでは、細胞数の１０倍未満の増加に相当する細胞の約２回の倍加に足る時間しかない。マウスの腸と比較して、ヒトの腸に送達された各胞子からは約１００倍の細胞が増殖する。腸の体積の違い、結腸通過時間、および腸内での細胞分裂を考慮すると、マウスとヒトにほぼ同じ用量が送達された場合、腸内腔内の抗原量はほぼ同じになる。

【0095】

上記では、ヒトの腸とネズミの腸との違いについて詳細に説明しているが、これは、当技術分野で公知のものに基づいて、他の宿主に容易に適応させることができる（例えば、細菌の送達を、意図する宿主、例えば、他の哺乳類または鳥類に適応させることができる）。

【0096】

空腹時に服用した医薬組成物は、服用後約５時間で上行結腸に到達すると考えられるが、実際の到達は胃の排出速度に大きく依存する。結腸内の薬物送達は、この領域を通過する速度に大きく影響される。健康な男性の場合、カプセルは平均して２０～３０時間で結腸を通過する。溶液および粒子は通常、近位結腸内に広範囲に広がり、多くの場合、大腸全体に分散する。

【0097】

本発明の医薬組成物は、胃腸管への時間制御された送達のために、すなわち、第１の態様に記載の細菌を送達することにより、投与後一定時間（ラグタイム）後に抗原をもたらすように、製剤化され得る。

【0098】

時間制御送達用の市販の賦形剤としては、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ ３０ Ｄ（水性分散液）およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ １２，５（有機溶液）が挙げられる。これらの賦形剤は、不溶性、高透過性、ｐＨ非依存性の膨潤賦形剤であり、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳと異なる比率で組み合わせることでカスタマイズされた放出プロファイルを提供できる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳ ３０ Ｄ（水性分散液）およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳ １２，５（有機溶液）は、不溶性、低透過性、ｐＨ依存性の膨潤賦形剤であり、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬと異なる比率で組み合わせることでカスタマイズされた放出プロファイルを提供できる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＮＥ ３０ Ｄ（水性分散液）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＮＥ ４０ Ｄ（水性分散液）、およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＮＭ ３０ Ｄ（水性分散液）は、不溶性、低透過性、ｐＨ依存性の膨潤賦形剤であり、マトリックス形成剤であり得る。

【0099】

好ましくは、医薬組成物は、第１の態様に記載の細菌を、投与後（すなわち、経口投与後）約４時間で胃腸管に送達するように製剤化され得る。好ましくは、医薬組成物は、第１の態様による細菌を、投与後約４～４８時間、好ましくは投与後約５～４０時間、例えば投与後約５、１０、１５、２０または２４時間；好ましくは、投与後約５時間～１０時間、５時間～１５時間、５時間～２０時間、あるいは約１０時間～２４時間、１５時間～２４時間、または２０時間～２４時間後で送達するように製剤化され得る。

【0100】

適切には、医薬組成物は食間または食事と一緒に投与するためのものである。

【0101】

腸の嫌気性部分に到達した際の本発明の第１の態様に記載の細菌の増殖は、便培養などの培養によって確認することができる。実験モデルでは、実験動物から得た胃腸管の一部から、細菌を培養することができる。腸の嫌気性部分に到達した際の本発明の第１の態様に記載の細菌の増殖は、例えば、細菌を認識する抗体を使用するなど、当業者に公知の免疫組織学的アプローチによっても確認することができる。

【0102】

抗原を産生する遺伝子改変嫌気性菌を、食品の一部として、すなわちヨーグルト、牛乳または豆乳の中に、あるいは栄養補助食品として、組み込むこともできる。このような食品および栄養補助食品は、食品および栄養補助食品業界で周知の方法によって調製され得る。

【0103】

組成物を、飼料添加物として動物用飼料製品に組み込むことができる。

【0104】

腸内における遺伝子改変細菌の増殖とコロニー形成の程度は、種と株の選択によって、および／または、細菌が増殖する特定の基質をプレバイオティクスとして、プロバイオティクスを含む同じ用量内もしくは別々に摂取される組成物として提供することによって、制御され得る。

【0105】

したがって、組成物はまた、投与されたプロバイオティクスの増殖を増強するために、プレバイオティクスをさらに含有するか、またはプレバイオティクスとともに投与するためのものであってもよい。プレバイオティクスは、本明細書に記載の細菌と連続的に、同時に、または別々に投与されうる。プレバイオティクスおよび細菌は、同時投与のために同じ組成物に一緒に製剤化され得る。あるいは、細菌およびプレバイオティクスを同時または連続投与用に別々に製剤化することもできる。

【0106】

プレバイオティクスは、腸内でのプロバイオティクスの増殖を促進する物質である。これらは腸内で細菌によって発酵される食品物質である。プレバイオティクスの添加は、腸内のプロバイオティクス株の増殖を促進できる培地を提供する。１つ以上の単糖、オリゴ糖、多糖、または細菌の増殖を促進する他のプレバイオティクスを使用してもよい。

【0107】

好ましくは、プレバイオティクスは、フルクトース、ガラクトース、マンノースを任意で含むオリゴ糖；食物繊維、特に可溶性繊維、大豆繊維；イヌリン；またはそれらの組み合わせからなる群から選択されてよい。好ましいプレバイオティクスは、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆のオリゴ糖、グリコシルスクロース（ＧＳ）、ラクトスクロース（ＬＳ）、ラクツロース（ＬＡ）、パラチノースオリゴ糖（ＰＡＯ）、マルトオリゴ糖、ペクチン、それらの加水分解物、またはそれらの組み合わせである。

医学的用途

【0108】

本発明の第３の態様は、医薬に使用するための第１の態様の細菌または第２の態様の医薬組成物を提供する。

【0109】

本発明の第４の態様は、対象において抗原特異的応答を生じさせるのに使用するためのクロストリジウム綱の細菌を提供し、ここで細菌は、抗原をコードする異種核酸分子を含み、かつ、嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において抗原を発現することができる。

【0110】

対応する態様は、クロストリジウム綱の細菌を投与することを含む、対象において抗原特異的免疫応答を生成する方法を提供し、ここで細菌は、抗原をコードする異種核酸分子を含み、かつ嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において抗原を発現することができる。

【0111】

本発明の第５の態様は、対象における疾患の治療的処置または予防的処置における使用のためのクロストリジウム綱の細菌であって、細菌は抗原をコードする異種核酸分子を含み、細菌は嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において前記抗原を発現することができ、抗原は感染病原体抗原であって疾患は感染病原体によって引き起こされる疾患であるか、または抗原は腫瘍抗原であって疾患はがんである、細菌を提供する。

【0112】

対応する態様は、クロストリジウム綱の細菌を投与するステップを含む、対象において疾患を予防するか、寛解させるか、または治療する方法であって、細菌は抗原をコードする異種核酸分子を含み、細菌は嫌気性細胞増殖中に細菌の細胞内区画において前記抗原を発現することができ、抗原は感染病原体抗原であって疾患は感染病原体によって引き起こされる疾患であるか、または抗原は腫瘍抗原であって疾患はがんである、方法を提供する。

【0113】

典型的には、本発明のこれらの態様のいずれにおいても、対象は哺乳類または鳥類であり、典型的には哺乳類、好ましくはヒトである。動物のワクチン接種に適した哺乳動物としては、ウシ、ヒツジ、もしくはヤギを含む有蹄動物などの農業用動物；またはウマ；またはネコもしくはイヌなどの飼育動物が挙げられる。適切な鳥類には、ニワトリまたは七面鳥が含まれる。典型的には、抗原が感染性病原体抗原である場合、対象は、感染病原体によって引き起こされる疾患に感受性のある種である。典型的には、抗原が腫瘍抗原である場合、対象は、その腫瘍抗原が腫瘍の特徴である種のものである。

【0114】

これらの用途にはワクチン接種が含まれる。ワクチン接種の適切な用量と投与スケジュール（例：初回用量および１回以上の追加接種用量）は、Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｏｍ ｃｏｎｃｅｐｔ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ ａｎｄ ＭｃＩｎｎｅｓ，ｅｄｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。例えば、ワクチン接種は、１回の投与後に有効でありうるか、あるいは約３週間～６か月の間隔で１～３回の接種を行ってもよい。いくつかの実施形態では、本発明のワクチンがプライムワクチンまたはブースターワクチンのいずれかであって、それらの他方が異なるワクチンであるプライムブーストレジメンなど、異なるワクチンによるワクチン接種レジメンにおいて、ワクチン接種が提供されてもよい。２回以上の追加接種でありうる。典型的には、そのようなレジメンは同じ感染病原体または同じがんを対象とするものである。

抗原特異的免疫応答の生成における医学的用途

【0115】

第４の態様において、抗原は、腫瘍抗原または感染病原体抗原に限らず、本明細書で定義されるいずれの抗原であってよい。例えば、抗原は、人工配列（すなわち、自然界には存在しない人工的に設計された配列）を含んでいてもよい。

【0116】

「抗原特異的免疫応答」には、抗原特異的であるいずれの細胞性免疫応答または体液性免疫応答、すなわち、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答、もしくはＢ細胞（抗体）応答などのＴ細胞応答が含まれる。

【0117】

典型的な免疫応答では、抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）に送達され、抗原特異的細胞傷害性ＣＤ８^＋（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＣＤ４^＋Ｔリンパ球を刺激して誘発する。プロフェッショナルＡＰＣとしても知られるＤＣが、微小環境中の抗原を採取し、細胞内で処理する（例えば、抗原が貪食された後）。ＤＣが活性化されると（例えば、炎症シグナルに起因して）、ＤＣはリンパ節に移動し、それによって適応免疫応答を活性化することができる。理論に縛られるわけではないが、クロストリジウム綱の細菌は、ＡＰＣ、特に腸のＤＣ（粘膜ＤＣなど）によって内部移行されうる。例えば、クロストリジウム綱の細菌を内部移行したことによって抗原を取り込んだ（例えば、貪食した）ＤＣが、活性化され、リンパ節に移動し、前記抗原に対する特異性を有するＴ細胞を活性化し、及びその後Ｂ細胞を活性化し得る。ＡＰＣは、クロストリジウム綱の細菌に加えて、アジュバント、リポ多糖（ＬＰＳ）、炎症性サイトカインによってもたらされるような、さらに活性化シグナルにさらされる場合がある。

【0118】

Ｔ細胞は、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を発現する。ヘルパーＣＤ４^＋Ｔ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を効果的に刺激して増幅し、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助ける。ＣＤ４^＋応答は、誘導／活性化されるＣＤ４^＋Ｔ細胞の種類によって分類され得る。例えば、ＣＤ４^＋応答は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１、Ｔｈ２、および／またはＴｈ１７の応答でありうる。Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞は、当業者に公知である、マーカー（例えば、細胞表面マーカー）、サイトカイン分泌および／またはファンクショナルアッセイによって分類され得る。達成されるＣＤ４^＋応答（またはその組み合わせ）のタイプは、使用される抗原および／またはアジュバントもしくは他の免疫調節分子に依存してよく、これらは所望の結果に応じて選択されうる。例えば、蠕虫感染に対する防御には、Ｔｈ２応答の方がＴｈ１応答よりも適している。ＩＦＮ－γ産生に関連することが多いＴｈ１応答は、細胞内の寄生虫に対する防御に対してＴｈ２応答よりも適している。Ｔｈ１細胞はＣＤ８^＋キラーＴ細胞を刺激し、Ｔｈ２細胞はＢ細胞を刺激し；Ｔｈｌ７細胞は炎症を促進する。

【0119】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、標的抗原を含む標的細胞を特異的に認識し、アポトーシスを誘導することができる。特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒトではＨＬＡ－Ｉ抗原）に効率的に提示される抗原に依存する。ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍細胞およびウイルスなどの細胞内感染病原体に感染した細胞を直接認識して破壊できるため、予防および治療用の細胞性免疫ワクチンによって標的とされる主な細胞タイプである。それ故に、腫瘍細胞抗原およびウイルスなどの細胞内感染病原体の抗原を標的とする目的では、これらの細胞は、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子上に提示されるこれらの抗原を直接認識できるので、ウイルスなどの感染因子に対してＣＤ８^＋応答を開始するために有利であり得る。ＣＴＬは抗腫瘍応答にも関連している。

【0120】

ＣＤ４^＋細胞のサブセットが局所微小環境にサイトカインを放出することによってＣＤ８^＋細胞の活性をサポートおよび／または増強する可能性があるため、ＣＤ４^＋応答とＣＤ８^＋応答との組み合わせは有益である可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞応答の組み合わせが抗原によって誘導される。

【0121】

単一ペプチド抗原が免疫応答を刺激する効率は、ＭＨＣ（またはヒトの場合はＨＬＡ）についてのその発現プロファイルに基づいて、対象および集団間で異なる場合がある。ＭＨＣ／ＨＬＡハプロタイプは対象間で異なり、ＭＨＣ／ＨＬＡの各ハプロタイプは結合することができ、それによって特定の種類のペプチド断片を提示する。例えば、同じ抗原について、第１の対象のＭＨＣ／ＨＬＡによって提示されるペプチド断片は、第２の対象のＭＨＣ／ＨＬＡによって提示されるものとは配列が異なる場合がある。これらのＭＨＣ／ＨＬＡサブタイプは、免疫応答を誘導する能力が異なる場合があり、その結果、特定の抗原に対する応答性について集団内で差異が生じる。すべての対象が必要な免疫応答を誘導するためにペプチドを適切に処理して提示できるわけではないため、これは単一ペプチドベースのワクチンの主要な欠点である。単一ペプチドワクチンのこの制限は、本明細書およびＥＰ３２３５８３１Ａ１に記載のＲＯＰを含む、上述のオーバーラップペプチドを含有するポリエピトープおよび／またはポリペプチドなどの多抗原融合タンパク質を使用することによって克服することができる。ＲＯＰは、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を同時に誘導できることが示されており、複数のペプチドセグメントから構成されているため、特定の対象に適するセグメントが存在する可能性が非常に高くなる。これにより、集団のＭＨＣ／ＨＬＡ制限が克服される。

【0122】

Ｂ細胞応答は、特異抗原を標的とする抗体（すなわち、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」）によって特徴付けられる。Ｂ細胞は、ポリペプチドなどの成分を内部移行し、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子と複合体を形成して細胞表面にポリペプチド分子の断片を提示することもできる。Ｂ細胞は、その細胞表面に抗原特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する場合もある。ＭＨＣによって提示される抗原に依存するＴ細胞およびＴＣＲとは異なり、ＢＣＲは、ＭＨＣによって提示されずに抗原エピトープを認識できる（すなわち、ＢＣＲは可溶性抗原を認識することもできる）。抗原は、適切な表面免疫グロブリンを有するＢ細胞を直接活性化してＩｇＭを産生する。場合によっては、Ｂ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩにロードされた抗原を提示することによる活性化をＴ細胞に依存する。処理された抗原に応答したＣＤ４^＋Ｔ細胞には、免疫グロブリンのＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを誘導し得る。しかしながら、一部の抗原は、Ｔ細胞とは独立してＢ細胞を活性化できる。それ故に、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞応答の誘導は、Ｔ細胞応答（ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋）の誘導と連動し得る。

【0123】

適切な抗体応答には、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧアイソタイプなどの様々なアイソタイプが含まれうる。達成される抗体応答のタイプは、使用される抗原および／またはアジュバントもしくは他の免疫調節分子に依存する場合があり、所望の結果に応じて選択されてよい。

【0124】

ＩｇＡは、分泌型ではｓｌｇＡとも呼ばれ、粘膜の免疫機能において重要な役割を果たす抗体である。粘膜に関連して産生されるＩｇＡの量は、他の全ての種類の抗体を合わせた量よりも多い。絶対量では、毎日３～５グラムが腸内腔に分泌される。これは、体全体で産生される総免疫グロブリンの最大１５％に相当する。ＩｇＡには２つのサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）があり、単量体としても二量体としても産生され得る。ＩｇＡの二量体型は最も一般的で、分泌型ＩｇＡ（ｓｌｇＡ）とも呼ばれる。ｓｌｇＡは、涙、唾液、汗、初乳、ならびに尿生殖路、胃腸管、前立腺、および呼吸上皮からの分泌物を含む粘膜分泌物に見られる主要な免疫グロブリンである。血液中でも少量認められる。ｓｌｇＡの分泌成分は、タンパク質分解酵素による分解から免疫グロブリンを保護し；それにより、ｓｌｇＡは過酷な胃腸管環境でも生存でき、身体の分泌物中で増殖する微生物から保護する。ｓｌｇＡは、他の免疫グロブリンの炎症作用を阻害することもできる。ＩｇＡは補体系の活性化に乏しく、オプソニン作用も弱い。

【0125】

ＩｇＧにはいくつかのサブタイプがある。ヒトでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、Ｔヘルパー１型応答、補体結合、高親和性ＦｃＲによる食作用に関連しており、防御免疫を示すが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４応答は効果が低い傾向がある。

【0126】

いくつかの実施形態では、抗原によって誘導される抗原特異的免疫応答は、Ｂ細胞応答である。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答には、抗原特異的抗体の生成が含まれる、すなわち、抗原は、前記抗原に特異的な（すなわち、前記抗原に結合する）抗原特異的抗体の産生を誘導する。いくつかの実施形態では、抗原特異的抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む群か、あるいはそれらからなる群から選択される抗体セロタイプに属する。いくつかの実施形態では、抗原特異的抗体は分泌型抗体、例えば分泌型ＩｇＡ（ｓｌｇＡ）、分泌型ＩｇＭ、または分泌型ＩｇＧである。したがって、いくつかの実施形態では、抗原は、抗原特異的ＩｇＡ、抗原特異的ＩｇＭ、抗原特異的ＩｇＧ、またはそれらの任意の組み合わせの産生を誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコレラ菌抗原は、コレラ菌抗原特異的免疫応答、例えば、コレラ菌抗原特異的Ｂ細胞免疫応答、またはコレラ菌抗原特異的抗体の産生を誘導する。コレラ菌抗原特異的抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧであってよい。いくつかの実施形態では、コレラ菌抗原特異的抗体はＩｇＡ、場合により分泌型ＩｇＡ（ｓｌｇＡ）である。いくつかの実施形態では、コレラ菌抗原はＣｔｘＢである。いくつかの実施形態では、ＣｔｘＢは、ＣｔｘＢ特異的応答、例えば、ＣｔｘＢ特異的Ｂ細胞応答またはＣｔｘＢ特異的抗体の産生を誘導する。ＣｔｘＢ特異的抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＣｔｘＢ特異的抗体はＩｇＡ、場合により分泌型ＩｇＡ（ｓｌｇＡ）である。

【0127】

本明細書に記載の抗原を含有する細菌は、マウスモデルにおける経口免疫後など、抗原特異的免疫応答を誘導する能力について試験され得る。目的の抗原（例えば、ＨＰＶ、ＯＶＡ、またはＣｔｘＢなどのコレラ菌抗原）または抗原に対応するＲＯＰ（例えば、ＲＯＰ－ＨＰＶまたはＲＯＰ－ＯＶＡ）を含有する細菌の胞子（例えば、クロストリジウム・ブチリカム）を、マウスのグループに強制経口投与によって投与することができる。同じ細菌に由来するが、抗原（またはＲＯＰ抗原）を含まない胞子の陰性対照を、別のマウスのグループに投与してもよい。抗原を含む細菌をそのような陰性対照と比較し、差異があれば抗原特異的であると考えられる。この実験に適した陽性対照には、抗原（例えば、ＲＯＰ－ＨＰＶもしくはＲＯＰ－ＯＶＡ、またはＣｔｘＢなどのコレラ菌抗原）（ＤＣによって取り込まれ、前記抗原に対する免疫応答の活性化をもたらす）の皮下注射による非経口投与が含まれる。それ故に、この陽性対照との比較によって、抗原を含有する細菌によって誘導される免疫応答が抗原自体の投与と同等であるかどうかの指標が得られるであろう。

【0128】

したがって、このタイプのシステムは、抗原特異的応答を同定するために使用でき、特定のタイプの抗原に限定されない。実際、陰性対照はそのまま（抗原を含有しない細菌）とし、陽性対照は目的の抗原（例えば、本明細書に記載の感染病原体抗原または腫瘍抗原のいずれか）の皮下注射による非経口投与に変更し、試験条件は、目的の抗原（または前記抗原のＲＯＰ）を含有する細菌を調製することのみを必要とする。

【0129】

さらに、細菌は目的の抗原の送達媒体として作用するため、例示したクロストリジウム・ブチリカムに限定されない。例示されているクロストリジウム・ブチリカムは、抗原が免疫応答を媒介できる胃腸管の嫌気性部分に抗原を送達するように作用する。それ故に、胃腸管の嫌気性部分に到達できることが同様に知られているクロストリジウム綱の他の細菌も、同様に適切な送達媒体である。この場合、陰性対照は目的のクロストリジウム綱の細菌（本明細書に記載のものなど）に変更され、陽性対照は目的の抗原の皮下注射による非経口投与のままであり、試験条件は単に、選択した細菌が目的の抗原を発現するように、クロストリジウム・ブチリカムについて本明細書に記載のものと同様の方法で、遺伝子改変されることを必要とする。

【0130】

抗原を含有する細菌の投与、陰性対照および陽性対照を、免疫レジメンで行ってよい。例えば、マウスは２週間間隔で３回免疫され得る。免疫レジメンの後、例えばレジメンの４２日後にマウスを屠殺する。このレジメンは、抗原を含む遺伝子改変細菌の胞子が免疫応答を誘導する方法で抗原を送達できるかどうかを評価するために実施された。

【0131】

免疫応答は、当業者に公知の多くの方法で検出され得る。例えば、標準的な方法を使用して、均質化された脾臓からの脾細胞および血液サンプルからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、単核細胞単離物を得ることができる。次に、これらの単核細胞単離物は、例えば、磁気関連細胞選別（ＭＡＣＳ）やフィコール・ハイパック勾配（密度）分離を用いて、リンパ球を得るなど、目的の細胞集団を単離するための様々な選別プロトコルで処理され得る。例えば、Ｔ細胞（ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋）は、Ｔ細胞特異的マーカー（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞についてはＣＤ８ａ）に基づいて単核球単離物から濃縮されうる。あるいは、またはさらに、Ｂ細胞などの他の細胞集団を単離してもよい。

【0132】

目的の細胞種の濃縮集団が得られたら、その細胞種を、免疫応答の活性化に関連するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦα）の分泌について、あるいは活性化した細胞表現型を示すマーカー（例えば、細胞表面マーカー及および／または細胞内マーカー）の発現について試験することができる。ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦαなどのサイトカインは、それぞれ抗ＩＦＮ－γ抗体または抗ＴＮＦα抗体の存在下でＴ細胞をプレート内で培養し、野生型抗原タンパク質（例えばＨＰＶタンパク質またはＣｔｘＢなどのコレラ菌抗原）、抗原のＲＯＰ（例えばＲＯＰ－ＨＰＶまたはＲＯＰ－ＯＶＡ）または抗原を含む栄養型の細菌細胞で細胞を再刺激することにより、ＥＬＩＳＰＯＴで試験することができる。目的の抗原に対して特異性を有するＴ細胞（例えばＨＰＶ特異的Ｔ細胞）が存在する場合、次いでその抗原で再刺激すると、Ｔ細胞はＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦαを分泌するように誘導される。抗原を含有しない栄養型の細菌細胞の使用を陰性対照とし、それを試験条件と比較して、ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦαの分泌がどの程度抗原特異的であるかを特定することができる。ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦα標準物質（すなわち、様々な濃度のこれらのサイトカインのアリコート）は、陽性対照として、および用量反応曲線を確立するために使用され得る。ＥＬＩＳＰＯＴについては、スポット形成単位（ＳＰＵ）が評価され得、ここで、対照群の平均よりも少なくとも２標準偏差高い試験条件（例えば、ワクチン接種群）のＳＰＵは、試験条件について陽性結果を示す。

【0133】

あるいは、またはさらに、免疫応答は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されているような細胞内サイトカイン染色によって試験され得る。簡単に述べると、上記の免疫レジメンを受けたマウスから得られた脾細胞は、抗原（例えば、ＲＯＰ抗原）、ならびにＥＬＩＳＰＯＴと同じ陰性対照および陽性対照とともに培養され得る。次いで、細胞を抗体（例えば、フィコエリトリン結合モノクローナルラット抗マウスＣＤ８またはＣＤ４抗体）または免疫グロブリンアイソタイプ対照で標識することができる。次いで、脾細胞を、ｆｉｘ／ｐｅｒｍプロトコル（例えば、ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎによるＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット）を使用して固定および透過処理し、細胞内抗原の検出抗体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート結合抗ＩＦＮ－γ抗体）とともにインキュベートすることができる。次に、サンプルをフローサイトメトリーによって評価することができ、ここで、アイソタイプ対照の蛍光を上回る蛍光によって細胞の抗原特異的活性化が示される。ＣＤ８またはＣＤ４とＩＦＮ－γとの共染色は、ＩＦＮ－γの抗原特異的発現をＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔ細胞のいずれかに帰属させることになる。

【0134】

あるいは、またはさらに、免疫応答は、典型的にはＡＰＣによるＴ細胞の再刺激後に、Ｔ細胞表面受容体または受容体リガンドの発現を検出することによって試験され得る。例えば、細胞表面のＣＤ４０リガンド発現は、Ｈｅｇａｚｙ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５３：１３２０－１３３７に記載されているように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上で評価され得る。定義された抗原刺激後にＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを決定し、実験群と対照群との間でノンパラメトリック解析を実施して、母集団平均の抗原特異的Ｔ細胞パーセンテージの差異を特定できる。試験条件についての陽性結果は、陰性対照群と比較して抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージが高いこと（すなわち、ＣＤ４０Ｌの上方制御）、例えば、少なくとも１％高い、少なくとも２％高い、少なくとも５％高い、および／または最大１０％以上高いことによって示される。

【0135】

ＣＴＬ応答の細胞毒性を、クロム５１（^５１Ｃｒ）リリースアッセイを使用して評価することができる（Ｂ．Ｐａｉｇｅ Ｌａｗｒｅｎｃｅ，２００４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２２（１）：１８．６．１－１８．６．２７を参照）。例えば、ＣＴＬに対する目的の抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍抗原を発現するがん細胞）を、細胞溶解時に標的細胞から放出される^５１Ｃｒで標識してよい。したがって、ワクチン接種された対象（抗原特異的応答を開始することができると予想される）に由来するＣＴＬの細胞毒性を、対照であるナイーブ対象（抗原特異的ＣＴＬを有することが予想されない）に由来するＣＴＬと比較してよい。ワクチン接種群に由来するＣＴＬの^５１Ｃｒ検出の増加は、抗原特異的応答の誘導に関する陽性結果を示す。典型的には、試験群の陽性結果は、試験群の平均値が対照群の平均値より少なくとも２標準偏差以上高い場合に示される。

【0136】

細胞毒性を評価するための別の適切なアッセイは、ＣｙＱＵＡＮＴ ＬＤＨ細胞毒性アッセイである。乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＬＤＨ）は、細胞膜が損傷すると放出される細胞基質酵素である。したがって、^５１Ｃｒリリースアッセイについて記載したものと同じ条件を使用して、ＣＴＬと標的細胞の共培養でＬＤＨレベルを試験し、ワクチン接種群が対照群と比較して細胞毒性の増加を示すより高いＬＤＨを有するかどうかを確認することができる。典型的には、試験群の陽性結果は、試験群の平均値が対照群の平均値より少なくとも２標準偏差以上高い場合に示される。

【0137】

あるいは、またはさらに、^３Ｈチミジンを用いてＴ細胞の増殖を試験できる。^３Ｈは有糸分裂の細胞分裂中に染色体ＤＮＡの新しい鎖に組み込まれるため、細胞分裂に伴って細胞内に蓄積する。ワクチン接種された対象から単離されたＴ細胞（またはＴ細胞のサブセット）は、対照であるナイーブ対象から単離されたＴ細胞（またはＴ細胞のサブセット）と比較されうる。単離されたＴ細胞を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＰＢＭＣまたは抗原をロードされた活性化ＤＣと共培養し、その増殖を経時的に評価できる。ワクチン接種レジメンにより抗原特異的Ｔ細胞が得られる場合、これらは、抗原を発現する抗原提示細胞と共培養すると、より高い速度で増殖するであろう。したがって、より多量の^３Ｈチミジン取り込みに基づくＴ細胞増殖の増加は、ワクチン接種された対象についての肯定的所見を示す。典型的には、試験群の陽性結果は、試験群の平均値が対照群の平均値より少なくとも２標準偏差以上高い場合に示される。

【0138】

細胞増殖を評価するための別の適切なアッセイは、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイである。ＣＦＳＥは、細胞内の遊離アミンと反応して共有結合性色素－タンパク質複合体を生成する、蛍光細胞染色色素である。これにより、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によりＣＦＳＥ蛍光に基づいて検出できる生細胞が得られる。ＣＦＳＥを有する細胞が分裂すると、ＣＦＳＥ蛍光のレベルが細胞間で分裂し、細胞分裂の世代に対応するピークの視覚化が可能になる。したがって、上記の^３Ｈチミジンと同じ条件をＣＦＳＥアッセイで評価することができる。このアッセイでは、Ｔ細胞増殖の増加はフルオレセインの付加発光ピークの検出に基づいており、これはワクチン接種対象についての肯定的所見として細胞分裂を示すこととなる。典型的には、試験群の陽性結果は、試験群の平均値が対照群の平均値より少なくとも２標準偏差以上高い場合に示される。

【0139】

Ｂ細胞応答は、免疫レジメン中または終了後に収集された血清または他の適切なサンプル中の抗体のレベルを定量化することによって評価され得る。抗体価は、生物が特定のエピトープを認識する抗体をどれだけ産生したかの測定値であり、陽性結果が得られる最大希釈（連続希釈における）の逆数として表される。抗体価はＥＬＩＳＡを使用して試験され得る。それ故に、上記の免疫レジメンを受けたマウスから得られた血清を、抗体価について評価し、同じ対照と比較することができる。陰性対照と比較して少なくとも２標準偏差以上高いなど、より高い抗体価は、抗原特異的な様式でＢ細胞が活性化されていることを示すであろう。ＩｇＡ抗体価は粘膜免疫を示しているため、抗原特異的ＩｇＡのレベルを特異的に試験して粘膜免疫の誘導を評価してよい。ＩｇＡの試験に適したサンプルとしては、血清、糞便、結腸もしくは腸の内容物、または回腸壁抽出物が挙げられる。さらに、またはあるいは、全身性免疫および／または抗原特異的ＩｇＭを示す抗原特異的ＩｇＧ力価を試験してもよい。典型的には、血清サンプルが検査されるであろう。

【0140】

抗原特異的ＩｇＡと総ＩｇＡの比を測定し、Ｂ細胞応答を示してよい。例えば、総ＩｇＡ及び抗原特異的ＩｇＡは、ＥＬＩＳＡにより決定してよい。実験群と対照群との間でノンパラメトリック解析を行い、母集団平均の抗原特異的ＩｇＡ／ＩｇＡ比の差を探索してもよい。陽性結果は、実験群と対照群の間の母集団平均の抗原特異的ＩｇＡ／ＩｇＡ比において統計的に有意な差が確認されることである。

【0141】

一般に受け入れられている動物モデル（Ｉｒｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２１：１０１－１０８に記載されるものなど）を、腫瘍またはがん抗原を使用したがんに対する免疫化の試験に使用できる。例えば、がん細胞（ヒトまたはマウス）をマウスに導入して腫瘍を生じさせることができ、本明細書に記載の腫瘍抗原を含有する細菌を、前記抗原に関連する腫瘍を有する対象に送達してもよい。がん細胞は、皮下注射によって導入されて、目的の抗原に関連した異種移植片または同系腫瘍を形成することができる。がん細胞に対する効果（すなわち、キャリパーを用いて測定できる、腫瘍サイズの縮小、または腫瘍進行（すなわち、腫瘍が成長し続ける速度）の減少）を、免疫の有効性の尺度として評価することができる。より複雑なモデルとしては、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルの使用が挙げられ、このモデルでは、前記患者の癌に関連する抗原が、本明細書に記載の免疫レジメンを受けたマウス（例えば、ヒト化マウス）に投与される。あるいは、またはさらに、抗腫瘍ＣＴＬのレベルおよび活性は、例えば、腫瘍生検を採取し、腫瘍微小環境におけるＣＴＬ（腫瘍抗原特異的ＣＴＬを含む）のレベルを試験することにより試験されてよい。抗原特異的ＣＴＬを、ＭＨＣをロードした腫瘍抗原に特異的なＭＨＣ四量体を用いて同定してよく、次に、腫瘍微小環境中のＣＴＬを、例えばフローサイトメトリーによって定量化することができる。生検では、炎症反応およびＴ細胞の活性化に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ）を測定することにより、サイトカインを試験してよい。この試験はヒトでも行うことができ、抗原を持つ細胞に対する循環細胞傷害性Ｔリンパ球のレベルの上昇がみられるか試験すること、抗原に対する循環抗体のレベルについて試験すること、ならびに抗原を発現している細胞が存在するかを試験すること、などがエンドポイントとなる。

【0142】

適切な試験はＣａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載されており、ＲＯＰ－サバイビンまたはＲＯＰ－ＨＰＶ－Ｅ７による免疫化が特異的な細胞性免疫応答を生成し、サバイビンまたはＨＰＶ－Ｅ７タンパク質を発現するメラノーマＢ１６細胞の接種からマウスを保護することを実証した。この実験では、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスをＲＯＰ抗原（ＲＯＰ－ｓｕｒｖｉｖｉｎまたはＲＯＰ－ＨＰＶ－Ｅ７）によって皮下的に抗原刺激し、陽性対照としての野生型抗原と比較した。両条件とも抗原はモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）で乳化されていた。ＭＰＬで乳化した同一ワクチンを、３週間間隔で２回、皮下的にブーストした。最後のブーストから３週間で、マウスにＢ１６－Ｅ７またはＢ１６－サバイビンにチャレンジ感染させ、その後ＥＬＩＳＰＯＴ分析で評価した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、抗ＩＦＮ－γ－ＡｂプレコートプレートでＲＯＰ－ＨＰＶまたはＲＯＰ－サバイビンを用いて再刺激を行い、上述のようにＰＢＭＣおよび脾臓細胞で実施された。

【0143】

Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７中のデータは、ＲＯＰ抗原と野生型抗原を使用してマウスを抗腫瘍免疫応答のために免疫できるマウスシステムを示している。それ故に、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７の免疫戦略は、ＲＯＰ抗原または腫瘍抗原に対応する野生型抗原を用いて、陽性対照として展開できる。次いで、クロストリジウム綱の細菌を遺伝子改変して前記腫瘍抗原を発現させ、並行免疫レジメンにおいて用いることができる。陰性対照は、同じ細菌を用いた免疫であるが、抗原を含まないものである。それ故に、このシステムを、Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載されているように、腫瘍抗原でＰＢＭＣまたは脾細胞を再刺激して、ＩＦＮ－γ分泌を陽性対照および陰性対照と比較することにより、腫瘍特異抗原を含有する細菌が抗腫瘍応答を誘導できるかどうかを判定するために使用できる。試験条件（例えば、ワクチン接種グループ）のＳＦＵ（スポット形成単位）数が対照群の平均より少なくとも２標準偏差高い場合、その試験条件についての陽性結果を示す。

【0144】

したがって、当業者は、感染病原体抗原および／または腫瘍抗原などの抗原を含有するクロストリジウム綱の細菌が前記抗原に対する免疫応答を誘導するかどうかを容易に評価することができる。これらのシステムは、抗原や細菌の種類に限定されない。

対象における感染性疾患もしくは癌の治療的もしくは予防的処置

【0145】

この第５の態様において、抗原は感染病原体抗原であって疾患は感染病原体によって引き起こされる疾患であるか、または抗原は腫瘍抗原であって疾患はがんである。

【0146】

疾患、特にがんを「寛解すること」または「治療すること」とは、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの進行を遅らせる、阻止する、または軽減すること；患者には認識できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和または回復すること；身体的（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理的（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方で疾患を調節すること；あるいは、疾患もしくは障害またはそれらの臨床症状の、発症もしくは発達もしくは進行を予防もしくは遅延させることを意味する。感染性疾患の場合、「寛解すること」または「治療すること」とは、それに応じて解釈されてよく、対象における生存感染病原体の負荷を軽減すること、または、休眠状態の感染病原体が活発に増殖する形態になることの再発を予防または軽減することも含んでよい。「治療的処置」はそれに応じて解釈されるべきである。「予防すること」とは、本明細書に記載の剤が予防的であることを含む。防御的もしくは予防的な使用もしくは処置には、例えばワクチン接種によって、対象が疾患に罹患するリスクを低減または除去する使用または処置が含まれる。「予防的処置」はそれに応じて解釈されるべきである。

【0147】

生物学的、医学的、または生活の質において、そのような処置治療から利益を得られうる場合、被験者は治療を必要としている。処置は、典型的には、医師または獣医師によって実施され、治療上有効な量の細菌または組成物が投与されうる。第１の態様に記載の細菌または第２の態様に記載の組成物の治療上有効な量とは、本明細書に記載の処置、例えば疾患またはその症状を遅らせる、阻止する、軽減する、または予防するために有効であろう量を指す。治療上有効な量は、抗原（例えば、それに対する特定のタイプ又は強さの免疫応答を引きおこす抗原の能力）、クロストリジウム細胞による抗原の産生効率、処置される対象、苦痛の重症度及びタイプ、等に依存し得る。典型的には、治療的処置が必要な対象は、疾患の症状を呈している。あるいは、対象は、疾患にかかりやすいか、または検査では疾患に対して陽性であったが、まだ症状を示していない場合がある。典型的には、予防的処置を必要とする対象は、疾患に罹患していないが、疾患を発症する危険性を有している可能性がある。予防的処置は、特に感染性疾患に適している。

【0148】

処置すべき感染性疾患は、適切には、感染病原体に向けられた抗原特異的な免疫応答に応答し得るものである。感染性疾患、障害または状態は、本明細書に列挙した感染病原体抗原に関連するものから選択され得る。処置すべきがんは、本明細書に列挙された腫瘍抗原などの腫瘍抗原に関連するいずれのがん、特に腫瘍抗原を利用する免疫療法に応答することが示されているがんであり得る。

【0149】

治療的処置は、がんまたは慢性の感染性疾患に関して特に有益である。慢性の感染性疾患には、感染病原体によって数か月または数年にわたって持続するものか、あるいは感染病原体の活発な増殖期および／または症状期、および休止期を示すものが含まれる。慢性持続感染は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）；Ｃ型肝炎；Ｂ型肝炎；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、および水痘帯状疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス；黄熱に関連するフラビウイルス；西ナイルウイルス；デングウイルス；ジカウイルス；日本脳炎ウイルス；アフリカ豚コレラウイルス；豚生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスならびに口蹄疫ウイルス（例えば、コクサッキーウイルスＡ１６）を含むウイルスによって引き起こされうる。慢性持続感染は、結核菌、マイコバクテリウム・ボビス、ブルセラ菌、ボレリア・ブルグドルフェリなどのボレリア種、コリネバクテリウム・ジフテリエ、クラミジア、コレラ菌、チフス菌；マイコプラズマ；カンジダ・アルビカンスを含む真菌；ならびに、蠕虫および原虫を含む様々な寄生虫を含む細菌によっても引き起こされうる。処置すべき適切ながんとしては、免疫原性が最も高い固形腫瘍の２つと考えられていて、ワクチン開発において広範に研究されているメラノーマおよび腎細胞がん、あるいは、結腸、肺、子宮頸部、膵臓、胃、肝臓、腸、膀胱、卵巣、前立腺、骨、脳または頭頸部のがんが挙げられる。

【0150】

予防的処置には、典型的には、免疫記憶の確立が必要であり、免疫記憶の確立により、免疫された対象が、典型的には感染病原体抗原によるその後の攻撃から保護または部分的に保護される。免疫記憶は、適応免疫の重要な結果であり、以前に遭遇した病原体に対してより迅速な免疫応答を開始して、疾患への罹患を防ぐことができる。免疫記憶は治療的処置においても重要である可能性がある。

【0151】

Ｔ細胞の免疫記憶は、特定の抗原に対する記憶Ｔ細胞が存在するかどうかを識別するＭＨＣ四量体を用いて試験され得る。ＭＨＣ四量体は、ＭＨＣをロードした抗原に対して特異性を有するため、目的の抗原に特異的なＭＨＣ四量体を用いることができる（例えば、ＨＰＶ特異的ＭＨＣ四量体）。これらを、対象から単離されたサンプル（例えば、血液サンプルまたは脾細胞）において使用して、抗原特異的Ｔ細胞の頻度を測定することができる。ＭＨＣ四量体はＭＨＣクラスＩおよびＩＩに使用でき、このことはＭＨＣ四量体を用いて、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞の両方を測定することができることを意味する。さらに、ＭＨＣ四量体を他のＴ細胞マーカーの蛍光抗体と併用することで、抗原特異的Ｔ細胞サブセット（例えば、抗原特異的Ｔｈ１、Ｔｈ２および／またはＴｈ１７細胞）の割合を評価することができる。抗原特異的Ｔ細胞の割合は、免疫した対象と免疫していない対象を比較して、フローサイトメトリーにより評価され得る。例えば、本明細書に記載の免疫レジメンを受けたマウスから得られたサンプルには、ＭＨＣ四量体結合について評価された血液サンプルおよび／または脾臓細胞、およびＴ細胞サブセットの蛍光マーカーパネルが含まれうる。非免疫化マウスと比較して、免疫化マウスはＭＨＣ四量体との結合の割合が高いはずであり、これをＴ細胞サブセットによってさらに評価して、誘導されたＴ細胞応答のタイプを特定することができる。ＨＰＶ感染の場合、より高い割合の抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＰＶ抗原を含有するクロストリジウム綱の細菌で免疫することによって防御的Ｔ細胞免疫が確立されたことを示すと考えられる。

【0152】

Ｂ細胞の免疫記憶は、免疫化マウスおよび非免疫化マウス（例えば、記載されている免疫レジメンに従って）からＢ細胞を単離し、同じ抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の存在下でＢ細胞を再刺激することによって、インビトロで試験され得る。免疫化マウスからのＢ細胞は、定量的にも定性的にも良好な応答を示し、前者は、再刺激後のＢ細胞の頻度（すなわち、細胞懸濁液中の細胞数を数える）を比較することによって評価され得る。Ｂ細胞の親和性成熟により、産生されたメモリーＢ細胞抗体はまた、非免疫化マウスのナイーブＢ細胞と比較して高い親和性を有するであろう。このことは、（免疫化マウスおよび非免疫化マウスから）産生された抗体を精製して、抗原（またはそのエピトープ）に対するそれらの親和性を比較することにより試験され得る。免疫化マウスから産生された抗体がより高い親和性を持つ場合、防御免疫を示し得るＢ細胞記憶応答が確立されている。対応するインビボ研究では、そのようなマウスを使用し、抗原が由来する病原体（例えば、抗原がＨＰＶ抗原である場合はＨＰＶによる感染；例えば、Ｌｏｎｇｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８５：１３２５３－１３２５９に記載の通り）でチャレンジ感染させ、その病原体で初めてチャレンジ感染されたマウスと比較して感染負荷を評価する。

【0153】

上記の細胞系を、マウスを抗原に関連する病原体でチャレンジ感染させるインビボマウス系で補完してよい。Ｔ細胞免疫および／またはＢ細胞免疫の存在により、免疫化マウスは、ナイーブマウスと比較して、感染からの部分的または完全な保護率の増加など、感染負担が軽減されるはずである。したがって、適切なインビボ系では、感染負担を評価するために、免疫レジメンの後にチャレンジレジメンを行うことになる。適切な動物モデルは、Ｂａｋａｌｅｔｚ（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：５５２－５６８に記載されている。免疫記憶はまた、本発明の第４の態様に関連して記載されたＣａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７（上記参照）およびＩｒｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９（上記参照）に記載されているような、腫瘍のチャレンジ感染モデルを含むインビボ腫瘍モデルにおいて試験されてもよい。

【0154】

本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含む。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0155】

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、および記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、範囲内に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の特定の除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

【0156】

本発明の所定の態様、特徴またはパラメータに対する選好および選択肢は、文脈が別段の指示をしない限り、本発明の他の全ての態様、特徴およびパラメータに対するあらゆる選好および選択肢と組み合わせて開示されたものとみなされるべきである。

【0157】

本明細書で言及される全ての刊行物は、本願に記載の発明に関連して使用される可能性のある、刊行物に記載されている構成要素を説明かつ開示する目的で、可能な限り最大限の範囲で参照により本明細書に組み込まれる。

【0158】

本発明は、以下の非限定的な実施例および図面においてさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0159】

【図1】図１：ＲＯＰタンパク質の設計および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での切断されたＲＯＰの提示。既知のＴ細胞エピトープは、カテプシンＳの最小切断シグナル（ＬＲＭＫ（配列番号３３））によって一本鎖タンパク質に連結されたオーバーラップペプチド断片に分割される。ＲＯＰはＡＰＣ内のエンドソームで切断され、個々のペプチドエピトープはＭＨＣ分子を介して提示され、Ｔ細胞上の受容体によって認識され得る。

【図2】図２：ＲＯＰタンパク質を細胞内で発現するように遺伝子改変されたクロストリジウム・ブチリカムにおけるＲＯＰ－ＨＰＶおよびＲＯＰ－ＯＶＡに結合したＦＬＡＧタグのウェスタンブロット検出。ＣＨＮ－０野生型を対照として使用した。（Ａ）において、矢印はＣＡＤＤ－ＨＰＶ－ＲＯＰにおけるＲＯＰ－ＨＰＶバンドを示すが、ＣＨＮ－０野生型細胞にはない。（Ａ）画像全体にわたってコントラストを強調－赤色の矢印はＣＡＤＤ－ＨＰＶ－ＲＯＰにおけるＲＯＰ－ＨＰＶバンドを示すが、ＣＨＮ－０野生型にはない。（Ｂ）３５μｌのタンパク質をロードし（約１７５ｍｇ）、５％ミルクでブロッキングし、抗ＦＬＡＧ（Ａ９４６９）をＴＢＳ－Ｔ中に１：５０００希釈で２時間反応させ、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＢＣＩＰ／ＮＢＴを使用して７分間発色させた。

【図3】図３：クロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変用のＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡ１コンストラクト。

【図4】図４：クロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変用のＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶコンストラクト。

【図5】図５：比率１０００：１（ＣＨＮ－０：ＤＣ２．４細胞）でＣＨＮ－０栄養細胞に暴露されたＤＣ２．４細胞培養物内で観察されたｐＨＲｏｄｏ蛍光。スケールバーは５００μｍ。

【図6】図６：ＣＨＮ－０野生型（オレンジ色のバー）の胞子、遺伝子改変ＣＡＤＤ－ＨＰＶ（灰色のバー）の胞子で強制経口投与により免疫したか、あるいはアジュバントとともに精製ＲＯＰ－ＨＰＶタンパク質（黄色のバー）で皮下注射により免疫したマウスの脾臓から単離したＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ評価。陰性対照として、ＰＢＳの経口投与および皮下投与の両方を行った（水色および濃青色のバー）。単離したＴ細胞を２．５×１０^５／ウェルの密度で播種し、精製ＲＯＰ－ＨＰＶまたは野生型ＨＰＶタンパク質（ともに５μｇ／ウェル）またはＣＨＮ－０野生型の栄養細胞（０．５×１０^５／ウェル）で再刺激した。

【図7】図７：ＣＨＮ－０野生型（オレンジ色のバー）の胞子、遺伝子改変ＣＡＤＤ－ＯＶＡ（灰色のバー）の胞子で強制経口投与により免疫したか、あるいはアジュバントとともに精製ＲＯＰ－ＯＶＡタンパク質（黄色のバー）で皮下注射により免疫したマウスの脾臓から単離したＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ評価。陰性対照として、ＰＢＳの経口投与および皮下投与の両方を行った（水色および濃青色のバー）。単離したＴ細胞を２．５×１０^５／ウェルの密度で播種し、精製ＲＯＰ－ＯＶＡ（５μｇ／ウェル）またはＣＨＮ－０野生型の栄養細胞（０．５×１０^５／ウェル）のいずれかで再刺激した。

【図8】図８：実施例３の免疫戦略を表す図。

【図9】図９：（Ａ）コレラ毒素ＣｔｘＢのＦＬＡＧタグ付き抗原の核酸配列および翻訳されたタンパク質配列。核酸配列中の下線を引いた配列は、順に、ＮｏｔＩ部位、ＮｄｅＩ部位、およびＮｈｅＩ部位である。プロモーター領域はＮｏｔＩとＮｄｅＩとの間にあり翻訳されないが、翻訳される抗原領域はＮｄｅＩとＮｈｅＩ部位との間である。（Ｂ）ネイティブのＣｔｘＢタンパク質配列（Ｐ０１５５６）とＣｔｘＢのＦＬＡＧタグ付き抗原配列（ＣＨＡＩＮ＿ＣｔｘＢ）との間の配列アラインメント。

【図10】図１０：ＣｔｘＢを細胞内で発現するようにｐＭＴＬ８２１５１プラスミド（ＣｔｘＢ－ｆｕｌｌ ｐｌａｓｍｉｄ）から遺伝子改変されたクロストリジウム・ブチリカムにおけるＣｔｘＢに結合したＦＬＡＧタグのウェスタンブロット検出。ＣＨＮ－０野生型を対照として使用した。赤色の矢印は、ＣｔｘＢを発現するＣＨＮ－０株では予想されるＭＷ（約１３ｋＤａ）で有意なバンドが見られるが、ＣＨＮ－０野生型では見られないことを示す。（Ｂ）２０μｌのタンパク質をロードし、５％ミルクでブロッキングし、抗ＦＬＡＧ（Ａ９４６９）をＴＢＳ－Ｔ中に１：５０００希釈で２時間反応させ、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＢＣＩＰ／ＮＢＴを使用して＜３分間発色させた。

【0160】

実施例１：遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムの構築および調製
土壌および動物（ヒトを含む）の糞便中に存在し得る胞子形成嫌気性細菌クロストリジウム・ブチリカムのＤＳＭ１０７０２株を、細菌の細胞質で抗原を発現するように遺伝子改変した。選択された抗原を、ＷＯ２００７／１２５３７１Ａ２に記載されているように、組換えオーバーラップペプチド（ＲＯＰ）技術に基づいて遺伝子改変した。

【0161】

ＲＯＰタンパク質配列は、カテプシン切断部位標的配列（ＬＲＭＫ（配列番号３３））によって連結されたオーバーラップペプチドで構成されている（図１参照）。カテプシンは樹状細胞（ＤＣ）のエンドソームに存在し、エンドサイトーシスの後、ＲＯＰタンパク質はその構成ペプチドに切断される。このアプローチにより、広範囲のＴ細胞エピトープの送達が可能になり、様々なＨＬＡ対立遺伝子にわたる細胞性免疫の誘導が促進され、母集団カバー率が最大化される。ナイーブＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞をプライミングするには、ＤＣによる効果的な抗原提示が必要である。ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞内病原体に対する免疫防御および腫瘍サーベイランスに関与している。ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７）は、広範な免疫機能を形成および制御しており、特に適応免疫の制御において重要な役割を担っている。ＲＯＰの使用は、防御的な細胞性免疫の生成において、野生型抗原の使用よりも優れていることが以前に示されている。古典的ＭＨＣクラスＩＩ提示経路を通じてＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激することに加え、ＲＯＰは、外来抗原がＭＨＣクラスＩによってＡＰＣ上に提示されてＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化するプロセスである交差提示を通じて、強固なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を導くことができる（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７，８（４４）ｐｐ７６５１６－７６５２４）。

【0162】

これまでは、ＡＣＥ技術による遺伝子改変に用いるため、ｐｙｒＥ遺伝子が破壊されたクロストリジウム・ブチリカムの株を作製していた。今回、この株の染色体におけるｐｙｒＥ遺伝子座に、構成的プロモーターの制御下でＲＯＰタンパク質コード配列を安定的に組み込むことに成功した。

【0163】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｅ７エンベロープタンパク質とオボアルブミン（ＯＶＡ）に基づいて、２つの異なるＲＯＰタンパク質コード配列を開発した。これらの配列を用いて、必要な酵素切断部位、およびＦＬＡＧタグをＲＯＰタンパク質につなぐＮ末端部位に追加のカテプシン切断シグナルを導入することにより、遺伝子改変用のｐＭＴＬ８００００ベクターシリーズに導入するためのカセットを設計した。遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムのｐｙｒＥ欠損株は、ＨＰＶまたはオボアルブミン由来のＲＯＰを、細胞内で発現する（図２参照）。

【0164】

ＲＯＰタンパク質の発現と産生を確認した後、以前に開発した胞子発酵（ｓｐｏｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）プロトコルを用いて、遺伝子改変株の胞子と栄養細胞ペレットを作製した。その後、これらの材料を、ＤＣにおけるインビトロでのベースライン試験のため、およびマウスにおけるインビボでの免疫実験に使用するために評価した。

材料及び方法
細菌株の培養

【0165】

大腸菌株ＢＬ２１、ＤＨ５αおよびＣＡ４３４を、１５％（ｗ／Ｖ）寒天および／または抗生物質を添加した溶原性ブロス（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ；植物性トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）中で、必要に応じて、プラスミドの増殖に伴う代謝負荷に依存して３０℃または３７℃にて、好気的に増殖させた。液体培養物を、インキュベーション中、２００ｒｐｍで撹拌した。

【0166】

クロストリジウム・ブチリカム株ＤＳＭ１０７０２は、ＤＳＭＺ寄託所（ライプニッツ研究所、ＤＳＭＺ－ドイツ微生物および細胞培養コレクション、ＩｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａＳＳｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に寄託されている。クロストリジウム・ブチリカム株を、嫌気性ワークステーション（Ｄｏｎ Ｗｈｉｔｌｅｙ製、１０％水素、１０％二酸化炭素、８０％窒素、３７℃）において、必要に応じて１０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、２％（ｗ／Ｖ）グルコース、１５％（ｗ／Ｖ）寒天および／または抗生物質を添加した強化クロストリジウム増殖培地（ＲＣＭ；酵母抽出物１３ｇ／Ｌ、植物性ペプトン１０ｇ／Ｌ、可溶性デンプン１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、システイン塩酸塩０．５ｇ／Ｌ）中で、ルーチン的に増殖させた。
遺伝子改変株の維持および選択のため、クロストリジウム・ブチリカムを、嫌気性ワークステーションにおいて、それぞれ必要に応じて１０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、２％（ｗ／Ｖ）グルコース、１５％（ｗ／Ｖ）寒天、ウラシルおよび／または抗生物質を添加したクロストリジウム基本培地（ＣＢＭ、硫酸鉄七水和物１２．５ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン四水和物１２．５ｍｇ／Ｌ、カザミノ酸２ｇ／Ｌ、４－アミノ安息香酸１．２５ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１．２５ｍｇ／Ｌ、ビオチン２．５μｇ／Ｌ）中で増殖させた。マウス糞便におけるコロニー形成単位の検出のため、ホモジナイズした糞便サンプルを、改変したクロストリジウム・ブチリカム基本分離培地（塩化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０２ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物０．０２ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物０．０１ｇ／Ｌ、塩化コバルト六水和物０．００１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム７ｇ／Ｌ、リン酸ニカリウム７ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０１％（ｗ／Ｖ）、ビオチン０．００００５％（ｗ／Ｖ）、システイン塩酸塩０．５ｇ／Ｌ、グルコース２％（ｗ／Ｖ）、寒天１５％（ｗ／Ｖ）、Ｄ－サイクロセリン２５０ｍｇ／Ｌ）に撒いた。

【0167】

クロストリジウム・ブチリカムの胞子を、ＦｅｒＭａｃ ３２０微生物培養バッチ式バイオリアクター（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｔｃｈ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＥｌｅｃｔｒｏＬａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）の２Ｌベッセルで、２％（ｗ／Ｖ）グルコースを添加したＲＣＭ中で調製した。ベッセルを、流量０．２ｖｖｍの窒素ガスでスパージし（ｓｐａｒｇｅ）、ｐＨ６．５、温度３７℃で維持し、１００ｒｐｍで攪拌した。細胞および胞子塊を採取し、氷冷した滅菌水で繰り返し洗浄することによって胞子を細胞物質から分離した。胞子はさらに使用するまで４℃で保管しました。胞子の計数を、胞子ストックの段階希釈物を予め還元したＲＣＭ寒天プレート上に３連でプレーティングすることによって行った。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定する前に、プレートを嫌気性ワークステーションで２４時間インキュベートした。

遺伝子コンストラクトおよびプラスミド

【0168】

オボアルブミンコンストラクトについて、野生型オボアルブミンのアミノ酸（ａａ）配列のａａ２４１～ａａ３４０の範囲（ＳＭＬＶＬＬＰＤＥＶＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶＹＬＰＲＭＫＭＥＥＫＹＮＬＴＳＶＬＭＡＭＧＩＴＤＶＦＳＳＳＡＮＬＳＧＩＳＳＡＥＳＬＫＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ；配列番号５）を４つのオーバーラップ配列に分割し、最小のカテプシン切断部位（ＬＲＭＫ（配列番号３３））によって連結して、ＲＯＰ－ＯＶＡで表される１４２ａａ組換えオーバーラップペプチド（ＳＭＬＶＬＬＰＤＥＶＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＬＲＭＫＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶＹＬＰＲＭＫＭＥＥＫＹＮＬＴＳＶＬＭＡＬＲＭＫＫＹＮＬＴＳＶＬＭＡＭＧＩＴＤＶＦＳＳＳＡＮＬＳＧＩＳＳＡＥＳＬＫＩＳＬＲＭＫＩＳＳＡＥＳＬＫＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ；配列番号６）を作製した。

【0169】

ＲＯＰ－ＯＶＡをクロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変用にさらに改変して、ＲＯＰ－ＯＶＡの２位にあるａａメチオニン（Ｍ、ＡＴＧ）に対するヌクレオチドシグナルを組み込んだＮｄｅＩ切断部位（ＣＡＴＡＴＧ）、Ｎ末端部位のさらなるカテプシン切断部位とそれに続くＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８））に対するシグナル、および停止コドンＴＡＡによってＦＬＡＧ－タグから分離されたＮｈｅＩ切断部位（ＧＣＴＡＧＣ）についてのヌクレオチド配列を含めた（図３）。

【0170】

ヒトパピローマウイルス１６型コンストラクトについて、野生型Ｅ７タンパク質のａａ配列のａａ１～ａａ９８の範囲（ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ；配列番号７）を４つのオーバーラップ配列に分割し、最小のカテプシン切断部位（ＬＲＭＫ（配列番号３３））によって連結し、ＲＯＰ－ＨＰＶで表される１４０ａａ組換えオーバーラップペプチド（ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＬＲＭＫＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＬＲＭＫＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＬＲＭＫＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ；配列番号８）を作成した。

【0171】

ＲＯＰ－ＨＰＶをクロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変用にさらに改変して、ＲＯＰ－ＨＰＶの１位にあるａａメチオニン（Ｍ、ＡＴＧ）に対するヌクレオチドシグナルを組み込んだＮｄｅＩ切断部位（ＣＡＴＡＴＧ）、Ｎ末端部位のさらなるカテプシン切断部位とそれに続くＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８））に対するシグナル、および停止コドンＴＡＡによってＦＬＡＧ－タグから分離されたＮｈｅＩ切断部位（ＧＣＴＡＧＣ）についてのヌクレオチド配列を含めた（図４）。

【0172】

ＲＯＰ－ＯＶＡおよびＲＯＰ－ＨＰＶコンストラクトを、合成遺伝子としてＧｅｎｅＡｒｔ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからｐＭＫベクターで入手した。

【0173】

ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡ１およびＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶコンストラクトを、さらなるコドン使用最適化なしに合成遺伝子としてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄから、プラスミドｐＭＫ－ＲＱで入手した。合成遺伝子コンストラクトを含むｐＭＫ－ＲＱプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＬＢで一晩増殖させ、１５％（Ｖ／Ｖ）グリセロールのストックとして－８０℃で保管した。

大腸菌におけるＲＯＰタンパク質標準物質の発現

【0174】

合成ＲＯＰ－ＯＶＡおよびＲＯＰ－ＨＰＶコンストラクトを保管プラスミドから切り出し、ライゲーション非依存クローニングを用いてＢｓａＩ制限酵素直線化プラスミドｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｏｘｆｏｒｄ）にクローニングした。製造者の指示に従って、ベクターアンプリコンを大腸菌ＢＬ２１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。

【0175】

ＲＯＰ－ＨＰＶ発現のために、ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４－ＲＯＰ－ＨＰＶを有するＢＬ２１を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢブロス中で培養した。０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質の産生を誘導した。遠心分離により細胞ペレットを採取し、溶解バッファー（ＰＢ、０．５％トリトンＸ－１００、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。再懸濁した細胞に６００Ｗで５秒間、７秒間隔で２０サイクルの超音波処理を行った。組換えタンパク質を含む封入体を、２０，０００×ｇで４５分間遠心分離することによって収集した。封入体ペレットを変性緩衝液（８Ｍ尿素）に再懸濁し、激しく振盪しながら２時間インキュベートした。溶液を遠心分離してタンパク質をデブリから分離した。

【0176】

タンパク質画分を含む上清をニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、溶出緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて溶出した。精製タンパク質のリフォールディングは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた漸進的な透析によって達成された。

【0177】

ＲＯＰ－ＯＶＡ発現のために、ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４－ＲＯＰ－ＯＶＡを有するＢＬ２１を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ培養液中で培養した。１８℃にて０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質の産生を誘導した。遠心分離により細胞ペレットを採取し、溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１：３０，０００ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．１％ＤＤＭ、０．１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ８．０）に再懸濁した。再懸濁した細胞に、３５％振幅で５秒間、１５秒間隔で、１０分間超音波処理を行った。組換えタンパク質を含む封入体を、２０，０００×ｇで４５分間遠心分離することによって収集した。封入体ペレットを、６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に可溶化し、氷上で１時間インキュベートした後、０．２μｍフィルターで濾過した。

【0178】

タンパク質画分を含む濾液をＮｉ－ＮＴＡアフィニティカラムにロードし、溶出バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６Ｍ塩酸グアニジン、５００ｍＭイミダゾール）を用いて溶出した。低温希釈緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％サルコシル）で希釈した後、１０ｋＤａの分子量カットオフのビバスピンカラムを用いてタンパク質を濃縮し、脱塩緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）を用いてＰＤ－１０カラムを通して脱塩することにより、塩酸グアニジンを除去した。

【0179】

エンドトキシンを、Ｐｉｅｒｃｅエンドトキシン除去キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造者の指示に従って除去した。サンプルを０．２μＭフィルターで濾過し、さらに使用するまで４℃で保管した。

クロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変

【0180】

クロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変用プラスミドを調製するために、ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡ１およびＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶコンストラクトをまず、大腸菌ＤＨ５αにおいてｐＭＫ－ＲＱで増殖させた。Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して製造者の指示に従ってプラスミドを抽出し、製造者の指示に従ってＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液中で制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ（全て、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）を使用して、プラスミドからコンストラクトを切り出した。単離したカセットを、ｐｙｒＥ修復カセットと構成的プロモーターＰ_ｆｄｘをＭＣＳの前に追加で含むｐＭＴＬ８３１５１（ｐＣＢ１０２グラム陽性（Ｇｒａｍ＋）レプリコン、ｃａｔＰ抗生物質マーカー（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）、ＣｏｌＥ１グラム陰性（Ｇｒａｍ－）レプリコン、ｔｒａＪ接合伝達機能、およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ））に導入した。増殖のためにプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。プラスミドを前述と同様に単離し、カセットが正しく挿入されていることを確認するためにＧｅｎｅＷｉｚシークエンシングサービスを用いて配列決定した。

【0181】

配列が確認されたプラスミドｐＭＴＬ８３１５１＿ｐｙｒＥ修復＿Ｐ_ｆｄｘ＿ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡ１およびｐＭＴＬ８３１５１＿ｐｙｒＥ修復＿Ｐ_ｆｄｘ＿ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶを、大腸菌ＣＡ４３４接合伝達ドナー（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｄｏｎｏｒ）に形質転換した。上記の通り配列を確認した後、大腸菌ＣＡ４３４を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ中で一晩増殖させ、１５％グリセロールストックとして－８０℃で保管した。

【0182】

それぞれのプラスミドを有する復活した大腸菌ＣＡ４３４の新鮮なコロニーを用いて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢブロスに播種した。一晩インキュベートした後、培養物を用いて新鮮な補充培地に１：１０で播種し、ＯＤ_６００が０．５～０．７に達するまでインキュベートした。１ｍＬの体積の培養物を取り出し、５，０００×ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液に再懸濁した。培養物を上記のように遠心分離し、上清を捨てた。

【0183】

復活したクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０．１（野生型ＣＨＮ－０のΔｐｙｒＥ誘導体）の新鮮なコロニーを用いて、段階希釈シリーズを２％グルコースおよび１％ＣａＣＯ_３を添加した新鮮な予め還元したＲＣＭブロスに播種した。嫌気性条件で一晩インキュベートした後、増殖を示す最大希釈培養物を用いて、新鮮な補充培地に１：１０で接種し、ＯＤ_６００が０．５～０．７に達するまでインキュベートした。１ｍＬの体積の培養物を取り出し、５０℃で１０分間熱処理した。

【0184】

そのように処理した大腸菌ＣＡ４３４およびクロストリジウム・ブチリカムの両方を嫌気性ワークステーションに移し、５：１（ＯＤ_６００：ＯＤ_６００）の比率で混合した。接合混合物を予め還元した非選択的ＲＣＭ寒天プレート上にスポットし、直立状態で一晩培養した。インキュベーション後、混合物を５００μＬの新鮮な予め還元したＲＣＭブロス中に採取し、２５０μｇ／ｍＬのＤ－サイクロセリンおよび１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを添加した新鮮な予め還元したＲＣＭ寒天プレートに１００μＬの体積で撒いた。ウラシル原栄養性が回復した変異体を選択するために、チアンフェニコール耐性コロニーをＣＢＭ寒天プレートに繰り返しパッチプレートし（ｐａｔｃｈ ｐｌａｔｅ）、チアンフェニコール含有選択的ＲＣＭ寒天プレートでプラスミド喪失をクロスチェックした。プラスミドを失った原生生物コロニーのゲノムＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）バクテリア用ゲノムＤＮＡキット（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて製造業者の指示に従って単離し、シークエンシングに用いて、統合領域、プロモーター、それぞれのＲＯＰ配列にまたがるプライマーを用いて、クロストリジウム・ブチリカムの染色体におけるＣＡＤＤ－ＲＯＰカセットの存在を確認した（表３）。

表３：ＣＡＤＤ－ＲＯＰカセットの配列確認に用いたプライマー

【0185】

ＲＯＰカセットを染色体に組み込むと、構成的プロモーターの制御下で単一コピーが導入される。これにより細胞内のタンパク質の発現と産生が低下するが、これは、より強力なプロモーターの使用および／または遺伝子の複数コピーの挿入によって調整できる。

クロストリジウム・ブチリカムにおけるＲＯＰの発現の確認

【0186】

復活したクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－２（ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶ）およびＣＨＮ－３（ＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡ１）の新鮮なコロニーを用いて新鮮な予め還元した補充ＲＣＭブロスに段階希釈で播種し、一晩増殖させた。増殖を示す最大希釈培養物を用いて新鮮な予め還元した補充ＲＣＭブロスに、０．０５の開始ＯＤ_６００で播種した。ＯＤ_６００が１、２、および４となるまで増殖したとき、および２４時間インキュベートした後、１／ｍＬのＯＤ_６００と同等量を１３，０００×ｇで２分間遠心分離した。ペレットを４５μＬの５×ＳＤＳローディング色素（２０％（Ｖ／Ｖ）０．５トリス－塩酸塩ｐＨ６．８、２３％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、４０％（Ｖ／Ｖ）の１０％（ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液、１０％（Ｖ／Ｖ）２－メルカプトエタノール、１０ｍＬ ｄＨ_２Ｏ、ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、９８℃で１５分間熱処理した。

【0187】

最大４０μＬ／ウェルの再懸濁ペレットをＮｏｖｅｘ（商標）ＷｅｄｇｅＷｅｌｌ（商標）１２％トリスグリシンミニゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、室温で２００Ｖを用いて１×ＳＤＳ緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）中で泳動した。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）染色済みタンパク質ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をマーカーとして５μＬ／ウェルにてロードし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ａｂ５３９５（ａｂｃａｍ）をＦＬＡＧタグ陽性対照として、１：５希釈で用いた。

【0188】

分離したタンパク質を、Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ブロッティングシステム（ＢｉｏＲａｄ）をＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）パックとともに、製造者の指示に従って使用することにより、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を検出するために、ＰＶＤＦメンブレンをまず、ＴＢＳ－Ｔブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、５％（ｗ／Ｖ）粉乳）中で１時間、室温にて振盪プラットフォーム上でインキュベートした。次いで、ブロッキング緩衝液をＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ ｔａｇ（登録商標）抗体アルカリホスファターゼ複合体（１：５，０００；Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ－Ｔ緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で置き換え、室温で２時間、振盪プラットフォーム上でインキュベートした。メンブレンを、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液中において室温で５分間、２回洗浄し、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中において室温で５分間、１回洗浄した。ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ基質（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従って使用することにより、アルカリホスファターゼの検出を行った。

実施例２：樹状細胞株によるクロストリジウム・ブチリカムの貪食およびサイトカイン応答の誘導

【0189】

マウスＤＣ２．４細胞培養におけるベースライン研究では、これらの細胞が栄養細胞およびクロストリジウム・ブチリカムの胞子を貪食できることが示され、これはこれらの細菌細胞内で発現されるＲＯＰタンパク質の送達を成功させるための必要条件である。

【0190】

ＤＣ２．４細胞の細胞培養物を、野生型株ＣＨＮ－０の栄養細胞および胞子に曝露した。ＣＨＮ－０は、栄養型または胞子型のいずれかで、貪食によってＤＣ２．４細胞に取り込まれた（図５参照）。

【0191】

その後、これらの暴露されたＤＣ２．４細胞培養物のサイトカインプロファイルを、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）マウスサイトカインアレイパネル（表１および２）を用いて評価した。ＣＨＮ－０と培地対照に対する応答には差が認められた。
表１：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）マウスサイトカインパネルにおけるスポット密度

表２：選択したサイトカインおよびそれらの機能

【0192】

これらの予備実験から、培養ＤＣ２．４細胞が栄養細胞または胞子のいずれかに曝露された場合、ＣＨＮ－０野生型株は培養ＤＣ２．４細胞からのサイトカインの放出を引き起こすことができると結論付けられた。これらのサイトカインは、白血球の動員（ＮＫ細胞）、自然免疫および適応免疫の活性化に関連していると考えられる。
材料及び方法
細胞株

【0193】

ＤＣ２．４細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ－１１９０４（商標））を、１０％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎仔血清、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸および１×１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。

貪食アッセイ

【0194】

ＤＣ２．４を、９６ウェル細胞培養プレートに２×１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。ＣＨＮ－０栄養細胞を、製造者の指示に従ってｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、２×１０^７細胞／ウェルの濃度で加えた。ＤＣ２．４細胞をＣＨＮ－０細胞と一緒に３時間インキュベートした後、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて画像化した。

ＤＣ２．４細胞ベースライン研究

【0195】

サイトカインプロファイルは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従い評価した。ＤＣ２．４細胞を、１２ウェル細胞培養プレートに５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。ＤＣ２．４細胞を１×１０^７ＣＨＮ－０細胞／ウェルとともに一晩インキュベートした。細胞培養上清をその後の分析に使用した。細胞を細胞培養プレートから剥離し、遠心分離した。７００μＬの体積の上清を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒキットに付属の検出抗体カクテル（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）とともに、室温で１時間インキュベートした。この混合液を、前処理したメンブレンに加え、振盪プラットフォーム上において４℃で一晩、穏やかに振盪させた。次いで、メンブレンを洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）でリンスした後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）と、Ｃｈｅｍｉ Ｒｅａｇｅｎｔ混合液（Ｃｈｅｍｉ Ｒｅａｇｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）による発色を行った。メンブレンをＸ線フィルムに１０分間露光し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアでスポット強度を定量化した。

実施例３：遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムでのマウスの経口免疫

【0196】

インビボ免疫実験を実施することにより、Ｔ細胞応答の探索に焦点を当て、ＲＯＰタンパク質変異体を発現する遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムの胞子を用いてＲＯＰ抗原を送達し、免疫応答を誘導できるかどうかを評価した。マウスに、２８日間にわたり隔週で、胞子を強制経口投与するか、または精製ＲＯＰタンパク質を皮下注射し、４２日後にマウスを屠殺した。

【0197】

屠殺後に単離した脾細胞を用いたＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、強制経口投与により抗原を発現するクロストリジウム・ブチリカム株で免疫したマウスが抗原特異的Ｔ細胞応答を生成することが実証された。具体的には、ＲＯＰ－ＨＰＶを発現する株で免疫したマウスは、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の両方を生成する（図６参照）が、ＲＯＰ－ＯＶＡを発現する株で免疫したマウスは、それぞれの抗原に特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を生成する（図７参照）。重要なことに、マウスはクロストリジウム・ブチリカム株そのものを標的としたＴ細胞免疫応答を生成しない。

【0198】

野生型および遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムの胞子を用いて免疫したマウス由来の糞便サンプルの社内評価により、最初の免疫イベントの７時間後から糞便中で菌株が検出され得ることが実証された。

材料及び方法
インビボ実験

【0199】

動物を、巣材を備えた個別に換気されたケージに収容した。マウスには餌（ペレットとして提供）および水を自由に摂取させた。全ての手順は、１９８６年制定の動物（科学的処置）法（Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ １９８６）およびオックスフォード大学委員会のガイドラインに従って、内務省ライセンス３０／３１９７に基づくプロトコルに従って行われた。

【0200】

免疫実験のために、６週齢の雌マウスをランダムに５匹ずつのグループに分けた。消化管を通じた免疫化を、１００μＬのＰＢＳ中のＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＨＰＶまたはＣＡＤＤ－ＲＯＰ－ＯＶＡの胞子、すなわち、遺伝子改変ＣＨＮ株（ＣＨＮ－ＲＯＰ－ＨＰＶまたはＣＨＮ－ＲＯＰ－ＯＶＡと称される）の１×１０^８ＣＦＵを強制経口投与することによって実施した。ＣＨＮ－０野生型胞子およびＰＢＳを対照として、同じ条件で与えた。非経口免疫は、１００μＬのフロイントアジュバント（初回（ｐｒｉｍｅ）免疫、０日目）または不完全フロイントアジュバント（追加免疫、１４日目および２８日目）中の１００μｇのＲＯＰ－ＨＰＶまたはＲＯＰ－ＯＶＡタンパク質の皮下注射によって行われた。各グループのマウスを０日目、１４日目、２８日目に３回免疫し、４２日後に屠殺した。各投与イベントの３時間後および７時間後に糞便サンプルを収集した。全血および血清サンプルは、各投与イベントおよび屠殺時に収集された。脾臓を屠殺時に単離した。
表３

単核細胞の単離

【0201】

脾細胞およびＰＢＭＣを、製造者の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ １．０８４密度勾配（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、それぞれ、均質化した脾臓および末梢全血サンプルから単離した。細胞懸濁液または全血をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ培地に重層し、室温にて４００×ｇで２０～３０分間遠心分離した。単核細胞単離物を平衡塩類溶液で洗浄して残留混入物を除去した。

【0202】

Ｔ細胞の精製のため、１つの免疫グループから単離した単核細胞をプールし、ＣＤ８ａ（Ｌｙ－ａ）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示に従って使用して精製した。９０μＬの体積のＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を用いて、１×１０^７細胞を再懸濁し、その後、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを添加し、４℃で１０分間インキュベートした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を保持するために、細胞懸濁液を磁場中でＭＡＣＳ ＬＳカラムにアプライした。フロースルーを２回収集し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞特異的実験に用いた。続いて、磁場を使用せずに緩衝液をアプライすることによってＣＤ８^＋Ｔ細胞を溶出した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は両方とも、ＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用する前にＲＰＭＩ培地に再懸濁した。

ＩＦＮ－γ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ

【0203】

ＩＦＮ－γ遊離の検出のために、マウスＩＦＮ－γ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｕ－ＣｙＴｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造者の指示に従って用いた。１００μＬ ＲＰＭＩ／ウェル中の合計２．５×１０^５個のＴ細胞を、抗ＩＦＮ－γ抗体で予めコーティングしたプレートに添加し、野生型ＨＰＶタンパク質、ＲＯＰ－ＨＰＶタンパク質、ＲＯＰ－ＯＶＡタンパク質（それぞれ５μｇ／ウェル）、または０．５×１０^５ＣＦＵ／ウェルのＣＨＮ－０栄養細胞のいずれかで再刺激した。コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性対照として５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした後、ビオチン化検出抗体を添加し、続いてＧＡＢＡ結合体とインキュベートし、アクチベーターＩ／ＩＩ溶液とインキュベートしてスポットを形成させた。Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用してスポットをスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。

実施例４：クロストリジウム中の細胞内ＣｔｘＢ抗原を用いたマウスの免疫

【0204】

コレラ腸管毒素サブユニットＢ（ＣｔｘＢ）は、コレラ菌のコレラ腸管毒素の五量体環を構成する、１３ｋＤａのサブユニットタンパク質である。コレラ腸管毒素サブユニットＢは、Ａサブユニットと一緒にホロ毒素（コレラゲン）を形成する。ホロ毒素はＢサブユニットの五量体環で構成されており、その中央孔はＡサブユニットによって占められている。Ａサブユニットには、ジスルフィド架橋によって結合された２つの鎖、Ａ１およびＡ２が含まれている。Ｂサブユニットの五量体環は、腸上皮細胞の表面に存在するＧＭ１ガングリオシドに結合することによって、Ａサブユニットをその標的に導く。５つのＧＭ１ガングリオシドに結合できる。それ自体には有毒な活性はない。

遺伝子コンストラクトおよびプラスミド

【0205】

ＣＡＤＤ－ＣｔｘＢ経口ワクチン開発のために、ＣｔｘＢをコードするタンパク質配列（配列番号２４）を、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ提出番号（ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ）Ｐ０１５５６から、シグナル配列（ＭＩＫＬＫＦＧＶＦＦＴＶＬＬＳＳＡＹＡＨＧ（配列番号１９））を除去し、Ｃ－末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８））を加えて、決定した。遺伝子改変用に含まれるさらなる変更として、ａａメチオニン（Ｍ、ＡＴＧ）に対するヌクレオチドシグナルを組み込んだＮｄｅＩ切断部位（ＣＡＴＡＴＧ）および停止コドンＴＡＡによってＦＬＡＧタグから分離されたＮｈｅＩ切断部位のヌクレオチド配列（ＧＣＴＡＧＣ）を含む（図９）。ＣｔｘＢ＿ＦＬＡＧコンストラクトは、ＧｅｎｅＷｉｚによってクロストリジウム・ブチリカムへの遺伝子改変用にコドン最適化されてｐ０９５７プロモーターの後ろに合成され、サブクローニングのためにＧｅｎｅＷｉｚに提出するｐＭＴＬ８３１５１－ｐｙｒＥ修復ベクターにクローニングした。

クロストリジウム・ブチリカムの遺伝子改変

【0206】

ｐＭＴＬ８３１５１－ｐｙｒＥ修復＿ｐ０９５７＿ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ中で一晩増殖させ、１５％（Ｖ／Ｖ）グリセロールストックとして－８０℃で保管した。

【0207】

クロストリジウム・ブチリカムにおけるプラスミドベースの細胞内発現のための正確なプラスミドにクローニングするために、ｐＭＴＬ８３１５１－ｐｙｒＥ修復＿ｐ０９５７＿ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って用いて、ＤＨ５αから抽出し、ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧコンストラクトを、製造者の指示に従って制限酵素ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩをＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（全て、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）中で用いて、プラスミドから切り出した。単離したカセット（ｐ０９５７プロモーターを含む）をｐＭＴＬ８２１５１（ｐＢＰ１グラム陽性レプリコン、ｃａｔＰ抗生物質マーカー、ＣｏｌＥ１グラム陰性レプリコン、ｔｒａＪ接合伝達機能、およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ））に導入した。増殖のためにプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。プラスミドを前述と同様に単離し、カセットが正しく挿入されていることを確認するためにＧｅｎｅＷｉｚシークエンシングサービスを用いて配列決定した。

【0208】

配列が確認されたプラスミドｐＭＴＬ８２１５１＿ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧを、大腸菌ＣＡ４３４接合伝達ドナーに形質転換した。上記の通り配列を確認した後、大腸菌ＣＡ４３４を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ中で一晩増殖させ、１５％グリセロールストックとして－８０℃で保管した。

【0209】

ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドを有する復活した大腸菌ＣＡ４３４の新鮮なコロニーを用いて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢブロスに播種した。一晩インキュベートした後、培養物を用いて新鮮な補充培地に１：１０で播種し、ＯＤ_６００が０．５～０．７に達するまでインキュベートした。１ｍＬの体積の培養物を取り出し、５，０００×ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液に再懸濁した。培養物を上記のように遠心分離し、上清を捨てた。

【0210】

復活したクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０の新鮮なコロニーを用いて、段階希釈シリーズを２％グルコースおよび１％ＣａＣＯ３を添加した新鮮な予め還元したＲＣＭブロスに播種した。嫌気性条件で一晩インキュベートした後、増殖を示す最大希釈培養物を用いて、新鮮な補充培地に１：１０で接種し、ＯＤ_６００が０．５～０．７に達するまでインキュベートした。１ｍＬの体積の培養物を取り出し、５０℃で１０分間熱処理した。

【0211】

そのように処理した大腸菌ＣＡ４３４およびクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０の両方を嫌気性ワークステーションに移し、５：１（ＯＤ_６００：ＯＤ_６００）、通常は１ｍＬの大腸菌に０．２ｍＬのクロストリジウム・ブチリカムの比率で混合した。接合混合物を予め還元した非選択的ＲＣＭ寒天プレート上にスポットし、直立状態で一晩培養した。インキュベーション後、混合物を５００μＬの新鮮な予め還元したＲＣＭブロス中に採取し、２５０μｇ／ｍＬのＤ－サイクロセリンおよび１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを添加した新鮮な予め還元したＲＣＭ寒天プレートに１００μＬの体積で撒いた。プラスミドを有するクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０を選択するために、チアンフェニコール耐性コロニーをＲＣＭ＋１５μｇ／ｍＬチアンフェニコール寒天プレートに繰り返しパッチプレートした。チアンフェニコール耐性コロニーのゲノムＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）バクテリア用ゲノムＤＮＡキット（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて製造者の説明書に従って単離してシークエンシングに用い、ＭＣＳにまたがるプライマーを用いることによってｐＭＴＬ８２１５１＿ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドの存在を確認した（表４）。

表４：ｐＭＴＬ８２１５１＿ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドを含むクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０コロニーの配列確認に用いたプライマー

【0212】

ｐＭＴＬ８２１５１－ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドをクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０に導入すると、クロストリジウム・ブチリカム細胞質内でのマルチコピープラスミドからのＣｔｘＢ完全タンパク質の高発現がもたらされる。

クロストリジウム・ブチリカムにおけるＣｔｘＢの発現の確認

【0213】

復活したクロストリジウム・ブチリカムＣＨＮ－０およびｐＭＴＬ８２１５１－ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧの新鮮なコロニーを用いて、１５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを添加した新鮮な予め還元した補充ＲＣＭブロスに段階希釈で播種し、一晩増殖させた。増殖を示す最大希釈培養物を用いて１５μｇ／ｍＬチアンフェニコールを添加した新鮮な予め還元した補充ＲＣＭブロスに、０．０５の開始ＯＤ_６００で播種した。ＯＤ_６００が１、２、および４となるまで増殖した時に、２／ｍＬのＯＤ_６００と同等量を１３，０００×ｇで２分間遠心分離した。ペレットを４０μＬの５×ＳＤＳローディング色素（２０％（Ｖ／Ｖ）０．５トリス－塩酸塩ｐＨ６．８、２３％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、４０％（Ｖ／Ｖ）の１０％（ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液、１０％（Ｖ／Ｖ）２－メルカプトエタノール、１０ｍＬ ｄＨ_２Ｏ、ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、９８℃で１５分間熱処理した。

【0214】

最大２０μＬ／ウェルの再懸濁ペレットをＮｏｖｅｘ（商標）１６％トリシンミニゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、室温で１４０Ｖを用いて１×Ｎｏｖｅｘ（商標）トリシンＳＤＳ泳動用緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で泳動した。Ｓｐｅｃｔｒａ（商標）マルチカラーローレンジタンパク質ラダー（Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をマーカーとして１０μＬ／ウェルにてロードし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ａｂ５３９５（ａｂｃａｍ）をＦＬＡＧタグ陽性対照として、１：５希釈で用いた。

【0215】

分離したタンパク質を、Ｔｒａｎ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ブロッティングシステム（ＢｉｏＲａｄ）をＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）パックとともに、製造者の指示に従って使用することにより、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を検出するために、ＰＶＤＦメンブレンをまず、ＴＢＳ－Ｔブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、５％（ｗ／Ｖ）粉乳）中で１時間、室温にて振盪プラットフォーム上でインキュベートした。次いで、ブロッキング緩衝液をＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ ｔａｇ（登録商標）抗体アルカリホスファターゼ複合体（１：５，０００；Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ－Ｔ緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で置き換え、室温で２時間、振盪プラットフォーム上でインキュベートした。メンブレンを、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液中において室温で５分間、２回洗浄し、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス－塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中において室温で５分間、１回洗浄した。ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ基質（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造者の指示に従って使用することにより、アルカリホスファターゼの検出を行った。図１０に発現を示す。ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧタンパク質はウェスタンブロットで高レベルに検出され、ＯＤ１．０まで培養した細胞の比体積で９００ｎｇに相当した。よって、ＯＤ１．０の細胞密度を０．３ｇ／Ｌであると仮定すると、タンパク質は３μｇ／ｍｇ乾燥細胞重量であると推定される。

免疫原性試験

【0216】

インビボ免疫実験を実施することにより、細胞性および体液性応答に焦点を当て、ＣｔｘＢ抗原を発現する遺伝子改変クロストリジウム・ブチリカムの胞子が抗原を送達し、免疫応答を誘導できるかどうかを評価した。クロストリジウム・ブチリカム胞子は上記の通り生成される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、野生型ＣＡＤＤ株（陰性対照）またはｐＭＴＬ８２１５１－ｐ０９５７－ＣｔｘＢ－ＦＬＡＧプラスミドからのＣｔｘＢを発現するＣＡＤＤワクチン株を、１×１０^８ＣＦＵ／用量を、１週間間隔で３回、経口投与する。第３のグループには、陽性対照として現在市販されている経口コレラワクチンを投与する。全体を通して臨床的観察を行い、試験品の忍容性（体重の変化、および猫背もしく被毛の立毛などの身体的外観）を判定する。
表５

【0217】

屠殺時に脾臓を採取し、単一細胞懸濁液に処理し、ＣＤ４^＋細胞とＣＤ８^＋細胞を個別に精製して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＩＦＮ－γ遊離を介したＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋特異的Ｔ細胞応答を決定する（上述の材料と方法に記載）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答は、腸特異的組織（小腸および結腸）でも分析され、ここでは、Ｄｉ Ｌｕｃｃｉａ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７：８９９－９０８に記載の通り、組織を抽出し、粘液溶解酵素（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）およびＥＤＴＡで処理し、単一細胞懸濁液に消化する。この懸濁液から単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、市販のＣｔｘＢ抗原に事前に曝露されている）で再刺激され、細胞表面のＣＤ４０リガンド発現の変化が、Ｈｅｇａｚｙ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５３：１３２０－１３３７に記載されているようにフローサイトメトリーによって評価される。

【0218】

終了時に腸内容物を抽出し、抗原特異的体液性応答をＥＬＩＳＡアッセイで評価し、ＣｔｘＢ特異的分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）産生を総ＩｇＡに対する割合として、Ｄｉ Ｌｕｃｃｉａ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７：８９９－９０８に記載されているように決定する。

予期された結果

【0219】

ＣＡＤＤプラットフォームにより発現される細胞内ＲＯＰで示されたように、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、細胞内ＣｔｘＢ抗原を発現するＣＡＤＤ株で免疫したマウスが、ＣＤ４^＋応答がより強調された抗原特異的Ｔ細胞応答を生成すると予想される。重要なことに、ＣＨＮ－０野生型株で免疫したマウスがＴ細胞応答を生成することは期待できない。

【0220】

腸特異的組織評価では、刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞によってＣＤ４０リガンドが急速に上方制御されるため、ＣＤ４０リガンドが使用される。そのため、ＡＰＣを介してＣＤ４^＋細胞を再刺激すると、野生型ＣＡＤＤグループと比較してＣｔｘＢを発現するＣＡＤＤを投与したグループでＣＤ４０リガンドの発現が増加し、ＣｔｘＢ特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が示されると予想される。

【0221】

古典的に、Ｂ細胞の刺激と抗体の産生にはＣＤ４^＋Ｔ細胞の刺激が必要であるため、コレラワクチンにおいて強いＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が防御の良い相関関係として一般的に受け入れられている。ｓＩｇＡ抗体応答はコレラ菌に対する防御免疫において重要であることも知られているため、ＣｔｘＢ特異的分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の産生を評価することによって粘膜免疫の体液性応答を決定することも目指している。ＥＬＩＳＡにより、野生型ＣＡＤＤプラットフォーム単独と比較して、ＣＡＤＤ－ＣｔｘＢ経口ワクチンの投与に応答した抗原特異的なｓＩｇＡの増加が確認できることが予期される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【配列表】

2024502939000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-02-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0059】

適切なプロモーターは細胞増殖中に活性であり、構成的プロモーターであってもよい。一次代謝に必須の遺伝子のプロモーターは、適切な構成的プロモーターでありうる。抗原の発現レベルは、強力なプロモーターなどの選択された強度を有するプロモーターを用いて遺伝子発現を制御することによって最適化され得る。適切には、ネイティブなクロストリジウムのプロモーターが用いられる。適切なプロモーターとしては、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３６：７０－７５）；クロストリジウム・アセトブチリカムのｐｔｂおよびｔｈｌプロモーター（Ｔｕｍｍａｌａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３７９３－３７９９）およびクロストリジウム・アセトブチリカム由来のチオラーゼプロモーター（Ｗｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：５３１－５４１）が挙げられる。他の適切なプロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのｈｂｄ、ｃｒｔ、ｅｔｆＡ、ｅｔｆＢおよびｂｃｄプロモーター（Ａｌｓａｋｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２００５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７：７１０３－７１１８）、およびｐ０９５７プロモーター；ならびに、ｐＭＴＬ８００００モジュラーシャッフルプラスミド（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８：７９－８５）から得ることができる、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｄｘ プロモーター（ＮＣＩＭＢ１０６９６）であってよい。好ましくは、選択可能なマーカー遺伝子のプロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのｔｈｌ遺伝子のプロモーター、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ遺伝子プロモーター、またはクロストリジウム・スポロゲネスのｆｄｘ遺伝子プロモーターである。

【国際調査報告】