特表 2024-502957 抗炎症性マイクロＲＮＡが濃縮された細胞外小胞を産生するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-24

(54)【発明の名称】抗炎症性マイクロＲＮＡが濃縮された細胞外小胞を産生するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240117BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240117BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240117BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240117BHJP

   A61K 35/20 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240117BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240117BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240117BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALI20240117BHJP

   C12N 5/095 20100101ALI20240117BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

A61K35/545

A61K35/28

A61K35/30

A61K35/20

A61P29/00

A61P43/00 105

C12Q1/68 100Z

C12N5/0775

C12N5/0797

C12N5/095

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539873

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-08-23

(86)【国際出願番号】 CN2021142539

(87)【国際公開番号】W WO2022143784

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】202011612853.2

(32)【優先日】2020-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519420355

【氏名又は名称】セルラー バイオメディシン グループ （シャンハイ） リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100203208

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原 洋平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(71)【出願人】

【識別番号】523474494

【氏名又は名称】セルラー バイオファーマ（シャンハイ） リミテッド

(72)【発明者】

【氏名】リー，ピン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ジン

(72)【発明者】

【氏名】シェン，メイピン

(72)【発明者】

【氏名】ダイ，チェンシャン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QQ52

4B063QR48

4B063QR90

4B063QS10

4B063QS40

4B065AA90X

4B065AC14

4B065BA30

4B065BD39

4B065CA23

4B065CA44

4C087AA01

4C087BB39

4C087BB44

4C087BB45

4C087BB63

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB11

4C087ZB21

(57)【要約】

単離された幹細胞を有効量の少なくとも１つの免疫調節因子と共に培養することによってエキソソームを産生する方法が提供される。このようにして産生されたエキソソームは、抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害するｍｉＲＮＡが濃縮されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下のステップを含む、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡが濃縮された細胞外小胞を産生するための方法：
（ａ）前記細胞外小胞の放出を可能にする期間にわたって細胞培養培地中で幹細胞を培養するステップであって、前記培養培地が、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡが濃縮された細胞外小胞の放出を誘導するのに有効な量の少なくとも１つの免疫調節因子を含み、前記細胞外小胞が前記幹細胞から前記細胞培養培地中に放出される、ステップ、および
（ｂ）前記細胞培養培地から前記細胞外小胞を単離するステップ。

【請求項2】

前記少なくとも１つの免疫調節因子がインターフェロンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ａ）の前に、前記幹細胞を約６０％～約９５％の範囲のコンフルエンシーで前培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記インターフェロンがインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記インターフェロンが、前記細胞培養培地中で約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記インターフェロンが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞外小胞がエキソソームを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記細胞外小胞が、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記幹細胞が、間葉系幹細胞、乳腺上皮幹細胞、神経幹細胞またはがん幹細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルが、前記少なくとも１つの免疫調節因子で処理されていない対照幹細胞における前記少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルと比較して、少なくとも２倍増加する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルが約２倍～約５倍増加する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルが約２倍～約８倍増加する、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記幹細胞が約１日～約８日間培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記幹細胞が約２日間培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

請求項１に記載の方法によって調製された細胞外小胞。

【請求項18】

請求項１７に記載の細胞外小胞を含む医薬組成物。

【請求項19】

請求項１７に記載の細胞外小胞を含むキット。

【請求項20】

対象の疾患を治療する方法であって、請求項１８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項21】

前記疾患が炎症性疾患、線維性疾患、またはそれらの組み合わせである、請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された中国特許出願第２０２０１１６１２８５３２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１２月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は１１２９９－００９９４４－ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２ＫＢである。

【0003】

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特異的ｍｉＲＮＡのレベルを増加させるための方法に関する。

【背景技術】

【0004】

細胞外小胞（ＥＶ）は、リン脂質二重層を含有する細胞由来膜構造である。それらのサイズおよび生合成の機構に応じて、それらはエキソソーム、微小胞およびアポトーシス小体として分類され得る。ＥＶはまた、エクトソームとエキソソームの２つのカテゴリーに大別することができる。エキソソームは、細胞によって分泌され、細胞間シグナル伝達において重要な役割を果たす。多胞体（ＭＶＢ）は、エンドソーム内腔に内向きに出芽する管腔内小胞（ＩＬＶ）によって定義されるエンドソームである。ＭＶＢが細胞表面（原形質膜）と融合すると、これらのＩＬＶはエキソソームとして放出される。

【0005】

細胞外小胞の主な特徴には、以下が含まれ得る：１）直径３０～１５０ｎｍのサイズ、２）透過型電子顕微鏡下でカップ形状の小胞構造であることが示されるリン脂質二重層を有すること、ならびに３）ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１などのテトラスパニン、およびＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘなどのマーカーを有すること。エキソソームは、それらを分泌する細胞の構成成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含有する。ＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（長いｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）などの小分子ＲＮＡが含まれる。それらは、細胞の機能および挙動に影響を及ぼし得る遠隔細胞によって取り込まれる。エキソソームを介した細胞間コミュニケーションは、がん、神経変性、および炎症性疾患を含む様々な障害の病因に関与しているようである。Ｋａｌｌｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０，３６７（６４７８）：ｅａａｕ６９７７。

【0006】

炎症は、感染および傷害に対する応答の複雑な生物学的および病態生理学的カスケードであり、炎症機序は多くの疾患に密接に関連している。炎症応答の規模、炎症促進因子および抗炎症因子の複雑なネットワーク、ならびに方向は、様々な障害の発症および進行に影響を及ぼし得る。現在利用可能な治療戦略は、炎症性疾患の原因ではなく症状を標的とすることが多く、しばしば無効であり得る。

【0007】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、増殖およびアポトーシスなどの細胞活性において重要な役割を果たす。それらはまた、炎症を制御するための重要な遺伝子調節因子として浮上している。それらは、適切な消散を可能にし、炎症反応の制御されない進行を防止するために微調整されたシグナル伝達調節因子である。Ｔａｈａｍｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１３７７。研究は、それらが肺炎症の進行に関与し、肺線維症の治療に有用であることを示している。間葉系幹細胞に由来するエキソソームは、マイクロＲＮＡが濃縮されており、炎症経路を調節することによって抗炎症効果を有し得る。ヒト間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞における特定のマイクロＲＮＡのレベルを増加させることは、炎症性疾患および線維性疾患の治療において非常に重要である。しかしながら、細胞外小胞において特定の特異的マイクロＲＮＡを増加させるための特に効率的な方法はない。

【0008】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特異的ｍｉＲＮＡ（例えば、抗炎症性ｍｉＲＮＡ）のレベルを効率的に増加させるための方法を提供する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋａｌｌｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０，３６７（６４７８）：ｅａａｕ６９７７

【非特許文献2】Ｔａｈａｍｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１３７７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特異的ｍｉＲＮＡのレベルを増加させるための方法（インビトロ）を提供する。

【0011】

本開示は、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡが濃縮された細胞外小胞を産生するための方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本方法は、以下のステップを含み得る：（ａ）細胞外小胞の放出を可能にする期間にわたって細胞培養培地中で細胞（例えば、幹細胞）を培養するステップであって、培地が、ある量の少なくとも１つの免疫調節因子を含み、細胞外小胞が細胞（例えば、幹細胞）から細胞培養培地中に放出される、ステップ、および（ｂ）細胞培養培地から細胞外小胞を単離するステップ。

【0013】

特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫調節因子の量は、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡが濃縮された細胞外小胞の放出を誘導するのに有効である。

【0014】

本方法は、ステップ（ａ）の前に、幹細胞を、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約７０％～約９０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約９０％、または約７５％～約８０％の範囲のコンフルエンシーで前培養することをさらに含み得る。

【0015】

少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0016】

細胞外小胞はエキソソームを含み得る。

【0017】

特定の実施形態では、１つ以上の細胞外小胞（例えば、エキソソーム）は、より高いレベルの少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。

【0018】

特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫調節因子は、インターフェロン（例えば、１つ以上のインターフェロン）を含む。

【0019】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、インターフェロンおよび／またはＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。

【0020】

インターフェロンは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）を含み得る。インターフェロンは、１つ以上のインターフェロンを含み得る。

【0021】

インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型インターフェロンであり得る。Ｉ型インターフェロンには、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－ε、インターフェロン－κおよびインターフェロン－ωが含まれる。ＩＩ型インターフェロンには、インターフェロン－γが含まれる。

【0022】

特定の実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0023】

特定の実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ－γであり、α型および／またはβ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β）を含有しない。

【0024】

インターフェロンの量は、約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ～約１２ｎｇ／ｍｌ、約９ｎｇ／ｍｌ～約１１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。

【0025】

インターフェロンの量は、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡが濃縮されたエキソソームの放出を誘導するのに有効であり得る。

【0026】

培養培地は、幹細胞の培養に適している。

【0027】

細胞外小胞（例えば、エキソソーム）は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲の直径を有し得る。

【0028】

幹細胞は、ヒト幹細胞であり得る。幹細胞は、間葉系幹細胞、乳腺上皮幹細胞、神経幹細胞またはがん幹細胞であり得る。

【0029】

特定の実施形態では、少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルは、インターフェロンで処理されていない対照幹細胞における少なくとも１つの抗炎症性ｍｉＲＮＡのレベルと比較して、少なくとももしくは約１倍、少なくとももしくは約２倍、少なくとももしくは約３倍、少なくとももしくは約４倍、少なくとももしくは約５倍、少なくとももしくは約６倍、少なくとももしくは約７倍、少なくとももしくは約８倍、少なくとももしくは約９倍、約２倍～約５倍、約２倍～約７倍、約２倍～約６倍、約２倍～約４倍、約２倍～約３倍、または約２倍～約８倍増加し得る。

【0030】

幹細胞は、約１日～約１０日間、約１日～約８日間、約１日～約６日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間または約８日間の範囲の期間にわたって培養され得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）は、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含有する培養培地を遠心分離、例えば、超遠心分離または順次遠心分離して、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含むペレットを得ることによって、単離することができる。

【0032】

本方法のステップ（ｂ）は、幹細胞から放出された細胞外小胞を含有する培養培地を遠心分離して、細胞外小胞を含むペレットを得ることを含み得る。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において、培養培地は、３００ｇ（任意選択）、２０００ｇ～３０００ｇ（例えば、３０００ｇ）、１０，０００ｇ、および１１０，０００ｇ～１２０，０００ｇ（例えば、１２０，０００ｇ）で遠心分離される（例えば、順次）。

【0033】

特定の実施形態では、細胞培養培地から細胞外小胞を単離するステップ（例えば、ステップ（ｂ））は、細胞培養培地をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合し、一定期間（例えば、一晩）インキュベートすることと、混合物を（例えば、遠心分離によって）分離して、細胞外小胞を含有する沈殿物を得ることとを含む。

【0034】

本開示は、本方法によって調製された細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を提供する。

【0035】

細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含む医薬組成物も本開示に包含される。

【0036】

いくつかの実施形態では、組成物は無細胞である。

【0037】

組成物は、生理学的に許容される賦形剤をさらに含有することができる。

【0038】

組成物は、全身的に、またはそれを必要とする部位に局所的に対象に投与され得る。組成物は、対象または別の対象から得られた幹細胞に由来する、または幹細胞から放出された細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含有し得る。

【0039】

本開示は、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を含むキットを提供する。

【0040】

本開示はまた、対象の疾患を治療する方法を提供する。本方法は、本医薬組成物を対象に投与することを含み得る。

【0041】

疾患は、炎症性疾患、線維性疾患、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0042】

本開示の第１の態様では、以下のステップを含む、細胞外小胞における特異的ｍｉＲＮＡのレベルを増加させるための方法が提供される：
（ａ）幹細胞を提供するステップ、
（ｂ）適切な培養条件下で、幹細胞を前培養して、６０～９５％の範囲のコンフルエンスを有する前培養された幹細胞を得るステップ、
（ｃ）１つ以上の免疫調節因子を含有する培養培地中で、前培養された幹細胞を誘導および培養して、幹細胞から放出された細胞外小胞を含有する培養培地を得るステップであって、１つ以上の免疫調節因子がインターフェロンを含む、ステップ、ならびに
（ｄ）培養培地から細胞外小胞を単離するステップ。

【0043】

特定の実施形態では、細胞外小胞において、以下のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ、またはそれらの組み合わせの１つ以上のレベルが増加する。

【0044】

特定の実施形態では、細胞外小胞は、以下の特徴の１つ以上を有する：
（ｍ１）増加した相対的発現レベルＭ１を有するｍｉＲ－２１（例えば、ｍｉＲ－２１－５ｐ）、ここで、Ｍ１≧３、またはＭ１は３～６の範囲であり、
（ｍ２）増加した相対的発現レベルＭ２を有するｍｉＲ－１４６ａ（例えば、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ）、ここで、Ｍ２≧３、またはＭ２は３～９の範囲であり、および
（ｍ３）増加した相対的発現レベルＭ３を有するｌｅｔ－７ａ（例えば、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ）、ここで、Ｍ３≧３、またはＭ３は３～６の範囲であり、
相対的発現レベルは、同じ条件下で、ただし幹細胞を１つ以上の免疫調節因子で処理せずに調製した細胞外小胞（対照）における対応するｍｉＲＮＡの発現レベルと比較することによって得られる（対照におけるｍｉＲＮＡのレベルを１とする）。

【0045】

特定の実施形態では、単離された細胞外小胞は、以下の特徴の１つ以上を有する：
（ｆ１）増加した相対的発現レベルＥ１を有するＴＧＦβ１、ここで、Ｅ１≧１．５、またはＥ１は１．５もしくは２．０からの範囲であり、および／または
（ｆ２）増加した相対的発現レベルＥ２を有するＨＧＦ、ここで、Ｅ２≧１．５、またはＥ１は１．５もしくは２．０からの範囲であり、
相対的発現レベルは、同じ条件下で、ただし１つ以上の免疫調節因子を含まずに調製した細胞外小胞（対照）におけるＴＧＦβ１またはＨＧＦの発現レベルと比較することによって得られる（対照におけるＴＧＦβ１またはＨＧＦの発現レベルを１とする）。

【0046】

特定の実施形態では、細胞外小胞は、以下を有する：
（ｆ３）低下した相対的発現レベルＥ３を有するＭＭＰ８、ここで、Ｅ３≦０．６、またはＥ３は０．４～０．６の範囲であり、
相対的発現レベルは、同じ条件下で、ただし１つ以上の免疫調節因子を含まずに調製した細胞外小胞（対照）におけるＭＭＰ８の発現レベルと比較することによって得られる（対照におけるＭＭＰ８の発現レベルを１とする）。

【0047】

特定の実施形態では、細胞外小胞は、以下の特徴の１つ以上を有する：
（ｆ４）同様の相対的発現レベルＥ４を有するＩＬ１β、ここで、Ｅ４≦１５、例えば、１～１５もしくは１～１２であり、および／または
（ｆ５）同様の相対的発現レベルＥ５を有するＩＬ６、ここで、Ｅ５≦１０、例えば、１～１０もしくは１～６であり、
相対的発現レベルは、同じ条件下で、ただし１つ以上の免疫調節因子を含まずに調製した細胞外小胞（対照）におけるＩＬ１βまたはＩＬ６の発現レベルと比較することによって得られる（対照におけるＩＬ１βまたはＩＬ６の発現レベルを１とする）。

【0048】

特定の実施形態では、本方法は、細胞外小胞における抗炎症活性を有するｍｉＲＮＡ（または抗炎症性ｍｉＲＮＡ）のレベルを増加させるために使用される。

【0049】

特定の実施形態では、抗炎症性ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0050】

特定の実施形態では、細胞培養培地から細胞外小胞を単離するステップ（例えば、ステップ（ｄ））は、以下を含む：
（ｄ１）培養培地を分離して、細胞外小胞を含有する無細胞上清を得ること、
（ｄ２）ステップ（ｄ１）の上清をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合し、一定期間（例えば、一晩）インキュベートすること、および
（ｄ３）ステップ（ｄ２）で得られた混合物を分離して、細胞外小胞を含有する沈殿物を得ること。

【0051】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、１つ以上のヒト免疫調節因子を含む。

【0052】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、１つ以上の組換え免疫調節因子を含む。

【0053】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、ＩＦＮ－γを含む。

【0054】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、ＩＦＮおよびＴＮＦαを含み、ＴＮＦα対ＩＦＮの質量比は、約０．０１：１～約１：１、または約０．０１：１～約０．２：１である。

【0055】

特定の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞である。

【0056】

特定の実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒトなどの哺乳動物に由来する。

【0057】

特定の実施形態では、幹細胞は、脂肪、骨髄、胎盤、またはそれらの組み合わせなどのヒト組織に由来する。

【0058】

特定の実施形態では、幹細胞は、脂肪組織由来幹細胞である。

【0059】

特定の実施形態では、幹細胞のコンフルエンスは、前培養後に６０～９５％、７０～９０％または７５～８０％である。

【0060】

特定の実施形態では、培養培地は、血小板溶解物またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する。特定の実施形態では、培養培地中の血小板溶解物の濃度は、約２％（ｖ／ｖ）～約１５％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）である。

【0061】

特定の実施形態では、培養培地は、血小板溶解物またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α（ＭＥＭ αまたはαＭＥＭ）である。

【0062】

特定の実施形態では、誘導および培養の期間は、約２４時間～約４８時間（例えば、ステップ（ｃ）において）である。

【0063】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子は、ＩＦＮ－γ（例えば、配列番号１）を含む。

【0064】

特定の実施形態では、培養培地／系におけるＩＦＮ－γの濃度は、約５～４０ｎｇ／ｍｌ、約５～２０ｎｇ／ｍｌまたは約９～１１ｎｇ／ｍｌである（培養培地／系の体積に基づいて計算）。

【0065】

特定の実施形態では、ステップ（ｄ１）において、培養培地を遠心分離して無細胞上清を得る。

【0066】

特定の実施形態では、ステップ（ｄ１）において、遠心分離は、約１０～４０分間の約３，０００～１０，０００ｇの分別遠心分離である。

【0067】

特定の実施形態では、ステップ（ｄ２）において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧ４０００～ＰＥＧ８０００、例えばＰＥＧ６０００から選択される。

【0068】

特定の実施形態では、混合物中のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００）の濃度は、約８％（ｗ／ｖ）～約２０％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）～約１８％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）～約２０％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）～約１６％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）～約１５％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）～約１２％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、約１１％（ｗ／ｖ）、約１２％（ｗ／ｖ）、約１３％（ｗ／ｖ）、約１４％（ｗ／ｖ）、約１５％（ｗ／ｖ）、約１６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、または約１０％（ｗ／ｖ）～約１２％（ｗ／ｖ）である。

【0069】

特定の実施形態では、ステップ（ｄ３）において、培養培地を遠心分離して、細胞外小胞を含有する沈殿物を得る。

【0070】

特定の実施形態では、ステップ（ｄ３）において、遠心分離は、約４０～７０分間の約３，０００～１５，０００ｇの分別遠心分離である。

【0071】

特定の実施形態では、本方法は、ステップ（ｅ）：ステップ（ｄ）で得られた細胞外小胞のｍｉＲＮＡレベル、細胞生存率およびマーカー発現レベルを測定するステップをさらに含む。

【0072】

特定の実施形態では、マーカー発現レベルを測定するステップは、マーカーの遺伝子発現レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）および／またはタンパク質レベルを測定することを含む。

【0073】

特定の実施形態では、マーカーには、成長因子、炎症促進因子、および細胞外小胞特異的マーカーが含まれる。

【0074】

特定の実施形態では、成長因子は、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0075】

特定の実施形態では、炎症促進因子は、インターロイキン１β（ＩＬ１β）、インターロイキン６（ＩＬ６）、メタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0076】

特定の実施形態では、細胞外小胞特異的マーカーは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0077】

特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ、またはそれらの組み合わせを含む。

【0078】

特定の実施形態では、ｍｉＲ－１４６ａは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６ａ－３ｐである。

【0079】

特定の実施形態では、ｍｉＲ－２１は、ｍｉＲ－２１－５ｐおよび／またはｍｉＲ－２１－３ｐである。

【0080】

特定の実施形態では、ｌｅｔ－７ａは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐおよび／またはｌｅｔ－７ａ－３ｐである。

【0081】

本開示の第２の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡ（例えば、抗炎症性ｍｉＲＮＡ）の増加したレベルを有する細胞外小胞であって、本開示の第１の態様に記載の方法によって得られる細胞外小胞が提供される。

【0082】

特定の実施形態では、細胞外小胞は、ヒト細胞に由来する。

【0083】

特定の実施形態では、ヒト細胞は、誘導された幹細胞および／または間葉系幹細胞である。

【0084】

特定の実施形態では、１つ以上の免疫調節因子で処理されていない対照幹細胞から得られた細胞外小胞と比較して、本細胞外小胞は、以下の特徴の１つ以上を有する：
（１）１つ以上の抗炎症性ｍｉＲＮＡの増加したレベル、および／または、上皮間葉転換を阻害する１つ以上のｍｉＲＮＡの増加したレベル、
（２）ＴＧＦβ１、ＨＧＦ、またはそれらの組み合わせから選択される成長因子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の増加したレベル、
（３）メタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）（これは炎症促進性である）のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の低下したレベル、ならびに
（４）細胞外小胞特異的マーカーの同様の、または増加したレベル。

【0085】

特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐおよびｌｅｔ－７ａ－５ｐを含む。

【0086】

特定の実施形態では、成長因子は、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）および／または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む。

【0087】

特定の実施形態では、細胞外小胞において、インターロイキン１β（ＩＬ１β）およびインターロイキン６（ＩＬ６）のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、対照細胞外小胞のレベルと同様である。

【0088】

特定の実施形態では、細胞外小胞特異的マーカーは、ＣＤ９、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１を含む。

【0089】

特定の実施形態では、「陰性対照群」において、幹細胞は、同じ培養条件下で、ただし１つ以上の免疫調節因子を含まずに誘導および培養され、細胞外小胞が単離される。

【0090】

本開示の第３の態様では、以下を含む医薬組成物が提供される：
（Ｚ１）本開示の第２の態様に記載の細胞外小胞、および
（Ｚ２）薬学的に許容される担体。

【0091】

特定の実施形態では、医薬組成物の剤形は、液体剤形または固体剤形（凍結乾燥剤形など）から選択される。

【0092】

特定の実施形態では、医薬組成物は、炎症性疾患および／または線維性疾患を治療するために使用される。

【0093】

特定の実施形態では、線維性疾患は、肺線維症を含む。

【0094】

特定の実施形態では、医薬組成物は、注射剤または霧化吸入製剤であり得る。

【0095】

本開示の第４の態様では、本開示の第３の態様に記載の医薬組成物を含むキットが提供される。

【0096】

特定の実施形態では、キットは、炎症性疾患または線維性疾患を治療するための他の薬物をさらに含む。

【0097】

本開示の第５の態様では、本開示の第２の態様の細胞外小胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患を治療するための方法が提供される。

【0098】

特定の実施形態では、疾患は、炎症性疾患、線維性疾患、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0099】

特定の実施形態では、疾患は、肺線維症、肺炎、気道炎症、ＡＲＤＳまたはＣＯＰＤから選択される。

【0100】

特定の実施形態では、医薬組成物は、ウイルスに関連する、またはウイルスによって引き起こされる疾患を治療するために使用される。

【0101】

特定の実施形態では、ウイルスは、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、およびＭＥＲＳコロナウイルスから選択される。

【0102】

特定の実施形態では、炎症性疾患は、ウイルス感染性炎症、細菌感染性炎症、真菌感染性炎症、自己免疫応答炎症、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0103】

特定の実施形態では、医薬組成物は、傷害を治療するために使用される。

【0104】

傷害は、虚血性傷害、低酸素傷害、化学的傷害、物理的傷害、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0105】

本開示の範囲内で、本開示の上記の技術的特徴および以下に詳細に説明する技術的特徴（実施形態など）を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは詳述しない。

【図面の簡単な説明】

【0106】

【図1】継代４（Ｐ４）の脂肪由来間葉系幹細胞の生存率に対する異なる免疫調節因子の効果を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ８）を使用して、示された因子を含有する溶液Ｂ中で４８時間培養した後の細胞の生存率を測定した。結果は、ＴＮＦα群およびＩＦＮγ群の細胞生存率は陰性対照群の細胞生存率と比較して有意に低下せず、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の細胞生存率は陰性対照群の細胞生存率と比較して低下したことを示す。

【図2A】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞におけるｍＲＮＡレベルでのＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＩＬ６およびＩＬ１βの発現を示す。図２Ａは、ｍＲＮＡレベルでのトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）の発現を示し、図２Ｂは、ｍＲＮＡレベルでの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を示し、図２Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）の発現を示し、図２Ｄは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン６（ＩＬ６）の発現を示し、図２Ｅは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン１β（ＩＬ１β）の発現を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）。

【図2B】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞におけるｍＲＮＡレベルでのＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＩＬ６およびＩＬ１βの発現を示す。図２Ａは、ｍＲＮＡレベルでのトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）の発現を示し、図２Ｂは、ｍＲＮＡレベルでの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を示し、図２Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）の発現を示し、図２Ｄは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン６（ＩＬ６）の発現を示し、図２Ｅは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン１β（ＩＬ１β）の発現を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）。

【図2C】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞におけるｍＲＮＡレベルでのＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＩＬ６およびＩＬ１βの発現を示す。図２Ａは、ｍＲＮＡレベルでのトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）の発現を示し、図２Ｂは、ｍＲＮＡレベルでの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を示し、図２Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）の発現を示し、図２Ｄは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン６（ＩＬ６）の発現を示し、図２Ｅは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン１β（ＩＬ１β）の発現を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）。

【図2D】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞におけるｍＲＮＡレベルでのＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＩＬ６およびＩＬ１βの発現を示す。図２Ａは、ｍＲＮＡレベルでのトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）の発現を示し、図２Ｂは、ｍＲＮＡレベルでの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を示し、図２Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）の発現を示し、図２Ｄは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン６（ＩＬ６）の発現を示し、図２Ｅは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン１β（ＩＬ１β）の発現を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）。

【図2E】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞におけるｍＲＮＡレベルでのＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＩＬ６およびＩＬ１βの発現を示す。図２Ａは、ｍＲＮＡレベルでのトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）の発現を示し、図２Ｂは、ｍＲＮＡレベルでの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を示し、図２Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）の発現を示し、図２Ｄは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン６（ＩＬ６）の発現を示し、図２Ｅは、ｍＲＮＡレベルでのインターロイキン１β（ＩＬ１β）の発現を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ．（標準偏差）。

【図3A】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－２１－５ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１４６ａ－５ｐのレベルを示す。図３Ａは、ｍｉＲ－２１－５ｐレベルを示し、図３Ｂは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐレベルを示し、図３Ｃは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐレベルの比較を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図3B】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－２１－５ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１４６ａ－５ｐのレベルを示す。図３Ａは、ｍｉＲ－２１－５ｐレベルを示し、図３Ｂは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐレベルを示し、図３Ｃは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐレベルの比較を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図3C】異なる免疫調節因子で細胞を処理したか、または処理しなかった場合の、Ｐ４の脂肪由来間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－２１－５ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１４６ａ－５ｐのレベルを示す。図３Ａは、ｍｉＲ－２１－５ｐレベルを示し、図３Ｂは、ｌｅｔ－７ａ－５ｐレベルを示し、図３Ｃは、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐレベルの比較を示す。対照は、陰性対照群である。ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＩＦＮγ：インターフェロンγ。ＴＮＦα＋ＩＦＮγは、２つの因子を組み合わせて使用したことを意味する。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4A】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4B】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4C】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4D】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4E】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図4F】異なる免疫調節因子で処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を示す。図４Ａは、陰性対照群の粒径分布を示し、図４ＢはＴＮＦα群の粒径分布を示し、図４Ｃは、ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｄは、ＴＮＦα＋ＩＦＮγ群の粒径分布を示し、図４Ｅは、細胞外小胞の粒子密度／濃度を示し、図４Ｆは、細胞外小胞の粒径を示す。統計分析をすべての群で行い、陰性対照群と比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。エラーバー、Ｓ．Ｄ。

【図5】異なる免疫調節因子で処理した後のＰ４の脂肪由来間葉系幹細胞由来のエキソソームのマーカーＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の発現を示す（試料は同じ体積を有していた）。Ｃｔｒｌ：陰性対照群；ＴＮＦ１０：ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮ１０：ＩＦＮγ １０ｎｇ／ｍｌ；Ｔ＋Ｉ１０：ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍｌ＋ＩＦＮγ １０ｎｇ／ｍｌ。

【発明を実施するための形態】

【0107】

本開示は、単離された幹細胞を有効量の少なくとも１つの免疫調節因子と共に培養することによってエキソソームを産生する方法を提供する。このようにして産生されたエキソソームは、抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡが濃縮されている。

【0108】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特定のｍｉＲＮＡのレベルを増加させるためのインビトロ方法を提供する。具体的には、幹細胞が、１つ以上の免疫調節因子（例えば、インターフェロンγ）の存在下で培養され、細胞外小胞が、増加したレベルの抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または低下したレベルの炎症促進因子を含有する細胞培養培地から単離される。特定の実施形態では、間葉系幹細胞が本開示の方法によって培養されるとき、細胞外小胞におけるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１およびｌｅｔ－７ａのレベルが有意に増加し、一方、インターロイキン１β（ＩＬ１β）、インターロイキン６（ＩＬ６）、メタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）などの炎症促進因子のレベルは有意に低下する。

【0109】

特定の実施形態では、抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡが濃縮された細胞外小胞の集団が、１つ以上の免疫調節因子で処理されていない幹細胞に由来する細胞外小胞と比較して、少なくとももしくは約０．１％、少なくとももしくは約０．５％、少なくとももしくは約１％、少なくとももしくは約２％、少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約１５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、または少なくとももしくは約９０％の、より高いレベルの１つ以上の抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する１つ以上のｍｉＲＮＡを含む細胞外小胞を含む。

【0110】

細胞外小胞における１つ以上の抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルは、１つ以上の免疫調節因子で処理されていない幹細胞に由来する対照細胞外小胞における１つ以上の抗炎症性ｍｉＲＮＡおよび／または上皮間葉転換を阻害する１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルと比較して、約１％～約１００％、約５％～約９０％、約１０％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約１０％～約５０％、約１５％～約４０％、約５％～約２０％、約１％～約２０％、約１０％～約３０％、少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約１５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、約１０％～約９０％、約１２．５％～約８０％、約２０％～約７０％、約２５％～約６０％、または約２５％～約５０％、少なくとももしくは約１倍、少なくとももしくは約２倍、少なくとももしくは約３倍、少なくとももしくは約４倍、少なくとももしくは約５倍、少なくとももしくは約６倍、少なくとももしくは約７倍、少なくとももしくは約８倍、少なくとももしくは約９倍、少なくとももしくは約１０倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、約２倍～約１００倍、約１．１倍～約１０倍、約１．１倍～約５倍、約１．５倍～約５倍、約２倍～約５倍、約３倍～約４倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約１００倍、約１０倍～約１００倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約１００倍、約２０倍～約５０倍、約３０倍～約１００倍、約５０倍～約１００倍、約７０倍～約１００倍増加し得る。

【0111】

細胞外小胞における１つ以上の成長因子（例えば、ＴＧＦβ１および／またはＨＧＦ）のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルのレベルは、１つ以上の免疫調節因子で処理されていない幹細胞に由来する対照細胞外小胞における１つ以上の成長因子のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルのレベルと比較して、約１％～約１００％、約５％～約９０％、約１０％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約１０％～約５０％、約１５％～約４０％、約５％～約２０％、約１％～約２０％、約１０％～約３０％、約５０％～約１００％、少なくともまたは約５％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約１５％、少なくともまたは約２０％、少なくともまたは約３０％、少なくともまたは約４０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約１００％、約１０％～約９０％、約１２．５％～約８０％、約２０％～約７０％、約２５％～約６０％、または約２５％～約５０％、少なくともまたは約１倍、少なくともまたは約２倍、少なくともまたは約３倍、少なくともまたは約４倍、少なくともまたは約５倍、少なくともまたは約６倍、少なくともまたは約７倍、少なくともまたは約８倍、少なくともまたは約９倍、少なくともまたは約１０倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．５倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、約２倍～約１００倍、約１．１倍～約１０倍、約１．１倍～約５倍、約１．５倍～約５倍、約２倍～約５倍、約３倍～約４倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約１００倍、約１０倍～約１００倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約１００倍、約２０倍～約５０倍、約３０倍～約１００倍、約５０倍～約１００倍、約７０倍～約１００倍増加し得る。

【0112】

細胞外小胞における１つ以上の炎症促進因子（例えば、ＭＭＰ８、ＩＬ１βおよび／またはＩＬ６）のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルのレベルは、１つ以上の免疫調節因子で処理されていない幹細胞に由来する対照細胞外小胞における１つ以上の炎症促進因子のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルのレベルと比較して、約１％～約１００％、約５％～約９０％、約１０％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約１０％～約５０％、約１５％～約４０％、約５％～約２０％、約１％～約２０％、約１０％～約３０％、少なくともまたは約５％、少なくともまたは約１０％、少なくともまたは約１５％、少なくともまたは約２０％、少なくともまたは約３０％、少なくともまたは約４０％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約１００％、約１０％～約９０％、約１２．５％～約８０％、約２０％～約７０％、約２５％～約６０％、約２５％～約５０％、約４０％～約６０％、少なくともまたは約１倍、少なくともまたは約２倍、少なくともまたは約３倍、少なくともまたは約４倍、少なくともまたは約５倍、少なくともまたは約６倍、少なくともまたは約７倍、少なくともまたは約８倍、少なくともまたは約９倍、少なくともまたは約１０倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．５倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、約２倍～約１００倍、約１．１倍～約１０倍、約１．１倍～約５倍、約１．５倍～約５倍、約２倍～約５倍、約３倍～約４倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約１００倍、約１０倍～約１００倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約１００倍、約２０倍～約５０倍、約３０倍～約１００倍、約５０倍～約１００倍、約７０倍～約１００倍低下し得る。

【0113】

一実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、ＭＥＭ α（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）である。

【0114】

別の実施形態では、間葉系幹細胞の細胞培養培地はＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（５００ｍｌの低グルコースＤＭＥＭ、２５ｍｌの小胞枯渇ウシ血清、ＧｌｕｔａＭＡＸ １％）である。

【0115】

一実施形態では、乳腺上皮幹細胞のための細胞培養培地は、Ｍａｍｍａｒｙ Ｅｐｉｔｈｉｅａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（２５０ｍｌのＭＣＤＢ－１７０、２５０ｍｌのＤＭＥＭ－Ｆ１２、１．２ｇの重炭酸ナトリウム、２．５μｇのＥＧＦ、０．２５ｍｇのヒドロコルチゾン、２．５ｍｇのインスリン、３５ｍｇのＢＰＥ）である。

【0116】

本開示は、細胞外小胞を調製する方法を提供する。

【0117】

特定の実施形態では、本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－２１のレベルをインビトロで増加させるための方法を提供する。本方法は、以下のステップを含み得る：
（１）培養培地（例えば、血小板溶解物（溶液Ｂなど）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培養培地）中で、脂肪由来間葉系幹細胞（例えば、Ｐ２～Ｐ４）を、例えば約１０，０００～１５，０００細胞／ｃｍ^２の細胞播種密度で播種し、約７０％～９０％の細胞コンフルエンスに達するように細胞を培養するステップ、
（２）細胞を、１つ以上の免疫調節因子（ヒト組換えインターフェロンγなど）を含有する培養培地（例えば、血小板溶解物（溶液Ｂなど）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培養培地）中で約２４時間～約４８時間培養するステップ、
（３）培養培地を回収し、培養培地の３，０００～１０，０００ｇの分別遠心分離後に上清を得るステップ、および
（４）ステップ（３）で得られた上清を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、溶液Ｃ）と例えば一晩、共インキュベートした後、ヒト細胞由来の細胞外小胞を含有する３，０００～１５，０００ｇの分別遠心分離によって沈殿物を得るステップ。

【0118】

本開示の方法では、細胞外小胞における特定の特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－２１など）のレベルまたは発現を有意に増加させることができ、細胞外小胞の特異的タンパク質の粒径または発現に実質的に影響しない。

【0119】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特定のｍｉＲＮＡのレベルをインビトロで増加させるための方法を提供する。本方法は、以下のステップを含み得る：（１）血小板溶解物を含有する培地中で、Ｐ２～Ｐ４脂肪由来間葉系幹細胞を約１０，０００～１５，０００細胞／ｃｍ^２の細胞播種密度で播種し、細胞を約７０％～９０％のコンフルエンスに培養するステップ、および（２）幹細胞を培養し、細胞外小胞を単離するステップ。

【0120】

特定の実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト組織に由来する間葉系幹細胞である。細胞は、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６から選択され得る。一実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト組織由来の間葉系幹細胞であり、細胞はＰ４から選択される。

【0121】

特定の実施形態では、間葉系幹細胞の播種密度は、前培養または培養について１０，０００～１５，０００細胞／ｃｍ^２または約１０，０００細胞／ｃｍ^２であり得る。

【0122】

特定の実施形態では、血小板溶解物の濃度は、細胞培養培地中で約２％、５％、または１０％であり得る。

【0123】

特定の実施形態では、間葉系幹細胞のコンフルエンスは、７０％～９０％、約８０％または約７０％の範囲であり得る。

【0124】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における特定のｍｉＲＮＡのレベルを増加させるために使用され得る培養培地を含有するキットを提供し、この細胞培養培地は、約１０～４０ｎｇ／ｍｌの濃度で示された免疫調節因子を含有する溶液Ｂを含む。

【0125】

特定の実施形態では、細胞培養培地中の免疫調節因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌである。

【0126】

特定の実施形態では、溶液Ｂは、約５％～約１０％（例えば、１０％、または５％）の血小板溶解物を含有する細胞培養培地である。

【0127】

特定の実施形態では、溶液Ｂは、約１００，０００～１５０，０００ｇで約６時間～約２４時間の超遠心分離後、約５％～約１０％（例えば、１０％、または５％）の血小板溶解物を含有するαＭＥＭ培地の上清を回収することによって得られる。

【0128】

特定の実施形態では、溶液Ｂは、約１２０，０００ｇで約６時間の超遠心分離後、約５％～約１０％（例えば、１０％、または５％）の血小板溶解物を含有するαＭＥＭ培地の上清を回収することによって得られる。

【0129】

特定の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、溶液Ｃ）を、培養培地、または細胞外小胞を含有する上清に、約８％～約２０％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００～８０００）の最終濃度まで添加する。

【0130】

本開示は、ヒト細胞に由来する細胞外小胞を単離するための方法を提供する。

【0131】

ステップ（３）では、ステップ（２）で得られた培養培地の約３，０００～１０，０００ｇの分別遠心分離後に上清を回収し、ステップ（４）では、ステップ（３）で得られた上清を溶液Ｃと一晩共インキュベートし、３，０００～１５，０００ｇの分別遠心分離によって、ヒト細胞由来の細胞外小胞を含有する沈殿物を得る。

【0132】

特定の実施形態では、ステップ（２）で得られた培養培地を約３，０００ｇで約１５分間遠心分離する。

【0133】

特定の実施形態では、ステップ（２）で得られた培養培地を約１０，０００ｇで約３０分間遠心分離する。

【0134】

特定の実施形態では、ステップ（３）で得られた上清をＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ４０００～８０００を含有する溶液Ｃ）と例えば一晩共インキュベートし、このとき、混合物中のＰＥＧの最終濃度は約８％～約２０％である。

【0135】

特定の実施形態では、混合物（ＰＥＧおよび細胞外小胞を含有する）は、約１２％のＰＥＧ６０００を含有する。

【0136】

特定の実施形態では、ステップ（３）で得られた上清を溶液Ｃと一晩共インキュベートし、次いで、分別遠心分離を行う（約３，０００ｇで約１時間、または約１２０，０００ｇで約７０分間）。

【0137】

特定の実施形態では、本方法は、細胞生存率を測定し、少なくとも１つのマーカーの遺伝子発現レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）および／またはタンパク質レベルを測定するステップ（５）をさらに含む。

【0138】

特定の実施形態では、ステップ（５）において、モニタリングすることは、マーカーの遺伝子発現レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）および／またはタンパク質レベルを測定することを含み、マーカーは陽性マーカーおよび／または陰性マーカーであり得る。

【0139】

特定の実施形態では、陽性マーカーは、遺伝子発現レベルが、ヒト細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１およびｌｅｔ－７ａのレベルを増加させる程度と正に相関するマーカーである。陰性マーカーは、遺伝子発現レベルが、ヒト細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１およびｌｅｔ－７ａのレベルを増加させる程度と負に相関するマーカーである。

【0140】

特定の実施形態では、陽性マーカーは、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）から選択される。

【0141】

特定の実施形態では、陰性マーカーは、インターロイキン１β（ＩＬ１β）、インターロイキン６（ＩＬ６）およびメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）から選択される。

【0142】

特定の実施形態では、ステップ（５）において、モニタリングすることは、ヒト細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１およびｌｅｔ－７ａの相対的発現レベルを蛍光定量ＰＣＲによって測定することを含む。

【0143】

特定の実施形態では、ステップ（５）において、モニタリングすることは、ウエスタンブロットによって、ヒト細胞に由来する細胞外小胞に特異的なマーカーＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１のタンパク質レベルを測定することを含む。このマーカーは、細胞外小胞に特異的なタンパク質の発現と正に相関する。

【0144】

特定の実施形態では、ステップ（５）において、モニタリングすることは、ＮＴＡによってヒト細胞由来の細胞外小胞の粒子濃度および粒径を測定することを含む。

【0145】

本開示は、ＩＦＮγが、ヒト細胞に由来する細胞外小胞における抗炎症性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２１－５ｐおよびｍｉＲ１４６ａ－５ｐなど）および／または上皮間葉転換を阻害するｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７ａ－５ｐなど）のレベルをインビトロで効果的に増加させることができることを提供する。炎症促進因子メタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）のレベルは、有意に低減される。したがって、本開示の細胞外小胞は、より良好な抗炎症活性を有する。

【0146】

本方法は、細胞外小胞における成長因子（例えば、ＴＧＦβ１およびＨＧＦ）のレベル（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベル）を増加させ、これは治療効果を改善するのに役立つ。

【0147】

本開示で得られる細胞外小胞に特異的なタンパク質ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の発現レベルがさらに増加され、これは、本開示の細胞外小胞が良質であることを示す。

【0148】

実験結果は、特異的免疫調節因子（例えば、ＩＦＮγ）を含有する培養培地の使用が細胞生存率に影響せず、細胞毒性効果が低いことを示した。

【0149】

細胞外小胞
細胞外小胞は、細胞によって放出される膜に包まれた小胞である。それらの主要構成成分は、脂質、タンパク質および核酸である。それらは、核酸および可溶性タンパク質を含む水性コアをカプセル化する脂質－タンパク質二重層から構成される。細胞外小胞には、限定されないが、それらのサイズ、細胞起源および形成機構に基づいて、エキソソーム、脱落小胞（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅ）、微小胞、小胞、大型小胞、微粒子およびアポトーシス小体が含まれる。エキソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）を形成する後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次いで、多小胞体は細胞の限界膜と融合し、付随してエキソソームを放出する。脱落小胞は、限界細胞膜の外向きの出芽とそれに続く融合によって形成される。細胞がアポトーシスを受けたとき、細胞は崩壊し、アポトーシス小体と呼ばれる異なる膜に包まれた小胞にその細胞内容物を分割する。細胞外小胞の非限定的な例としては、循環細胞外小胞、ベータ細胞細胞外小胞、膵島細胞細胞外小胞、エキソソームおよびアポトーシス小体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

【0150】

３つの主要なタイプの細胞外小胞（ＥＶ）、すなわち、エキソソーム、微小胞およびアポトーシス小体が存在する。ＥＶの３つの主要なタイプのすべては、脂質二重層で区切られており、直径は３０～２，０００ｎｍの範囲である。

【0151】

大きな細胞外小胞は、直径が約５μｍ～約１２μｍの範囲であり得る。アポトーシス小体は、直径が約１μｍ～約５μｍの範囲であり得る。微小胞は、直径が約１００ｎｍ～約１μｍの範囲であり得る。エキソソームは、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、または約５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の直径を有し得る。

【0152】

エキソソームは、細胞微小環境中のほとんどすべてのタイプの細胞によって分泌される小さな膜結合小胞であり、生物流体中に見出される（Ｌｏｔｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ａ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ．Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１４；３：２６９１３）。それらは、異なるＲＮＡ（ｍＲＮＡ、調節性ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、脂質およびタンパク質を含む生体高分子を天然に保有し、それらのカーゴをレシピエント細胞に効率的に送達し、機能を誘発し、細胞コミュニケーションを媒介することができる（Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２（８）：５６９－７９）。

【0153】

エキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む様々な細胞のパラクリン因子の主成分である。ＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣに由来するＥＶの一タイプである。ＭＳＣ由来エキソソームでは、いくつかのｍｉＲＮＡおよびタンパク質が、異なる経路を介して標的細胞の様々な活性を変化させるとして同定されている。ＭＳＣエキソソームは、発症、エピジェネティック調節、免疫調節（ｍｉＲ－１５５およびｍｉＲ－１４６）、腫瘍形成および腫瘍進行（ｍｉＲ－２３ｂ、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－２１４およびｍｉＲ－１２２）などの生理学的および病理学的プロセスに関与する。エキソソソームデータベースであるＥｘｏＣａｒｔａによれば、９００を超えるタイプのタンパク質がＭＳＣエキソソームから収集されている。ＭＳＣエキソソームが、特定のサイトカインおよび成長因子、例えばＴＧＦβ１、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などを含有することが研究により示されており、これらは免疫調節において役立つことが示されている。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）およびＭＭＰ－９もまた、ＭＳＣエキソソームにおいて見出されている。これらのタンパク質は、血管新生を刺激するのに重要な役割を果たし、エキソソームによって促進される組織修復を促し得る。

【0154】

いくつかの実施形態では、エキソソームまたは細胞外小胞は、限定されないが、赤血球、免疫細胞、ヒト単球およびマクロファージ、腫瘍細胞、上皮細胞、線維芽細胞、幹細胞（例えば、初代細胞もしくは自己細胞から）、または骨髄を含む細胞または組織に由来する。細胞外小胞またはエキソソームは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球またはマクロファージから単離され得るか、またはそれらに由来し得る。

【0155】

いくつかの実施形態では、エキソソームまたは細胞外小胞は、培養細胞に由来する。

【0156】

いくつかの実施形態では、エキソソームまたは細胞外小胞は、カーゴまたはペイロードを含むか、または含有する。いくつかの実施形態では、カーゴまたはペイロードは、治療剤である。いくつかの実施形態では、カーゴまたはペイロードは、診断剤である。

【0157】

本エキソソームまたは細胞外小胞のカーゴまたはペイロードには、限定されないが、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび／または小分子が含まれる。

【0158】

本開示はまた、本明細書に記載のエキソソームまたは細胞外小胞を含む医薬組成物を含む組成物を提供する。本開示はまた、疾患の治療に使用するための本明細書に記載のエキソソームまたは細胞外小胞、および本明細書に記載のエキソソームまたは細胞外小胞のいずれかを使用する疾患の治療方法を提供する。

【0159】

細胞外小胞を単離するための方法としては、遠心分離などのサイズ分離方法が挙げられる。一実施形態では、細胞外小胞の様々な成分を単離することは、順次遠心分離を含む単離方法によるものであり得る。本方法は、試料を８００ｇで所望の時間量にわたって遠心分離すること、細胞および細胞残屑を含有するペレットならびに（第１の）上清を回収すること、（第１の）上清を２，０００ｇで所望の時間遠心分離すること、大きな細胞外小胞およびアポトーシス小体を含有するペレットならびに（第２の）上清を回収することを含み得る。順次遠心分離方法は、（第２の）上清を１０，０００ｇで遠心分離し、微小胞を含有するペレットならびに（第３の）上清を回収することをさらに含み得る。順次遠心分離方法は、（第３の）上清を１００，０００ｇで遠心分離し、エキソソーム（直径約３０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲）を含有するペレットならびに（第４の）上清を回収することをさらに含み得る。順次遠心分離方法は、リン酸緩衝生理食塩水などで細胞外小胞（例えば、大きな細胞外小胞およびアポトーシス小体、微小胞ならびにエキソソーム）を含むペレットの各々を洗浄し、続いて適切な重力で遠心分離して細胞外小胞を含有するペレットを回収することをさらに含み得る。各遠心分離ステップ後の細胞外小胞の単離、純度、濃度、サイズ、サイズ分布およびそれらの組み合わせは、ナノ粒子追跡、透過型電子顕微鏡、免疫ブロットおよびそれらの組み合わせなどの方法を使用して確認することができる。濃度およびサイズなどについて細胞外小胞を分析するためのナノ粒子追跡（ＮＴＡ）は、ＺＥＴＡＶＩＥＷ（ＰａｒｔｉｃｌｅＭｅｔｒｉｘ，Ｍｅｅｒｂｕｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販）などの市販の機器を使用して動的光散乱によって行うことができる。単離後、本方法は、細胞外小胞マーカーを検出することをさらに含み得る。

【0160】

細胞外小胞を単離する方法としてはまた、例えばＥＸＯＱＵＩＣＫ ＴＣ試薬（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から市販）などの市販の試薬を使用することが挙げられる。

【0161】

エキソソームは、超遠心分離、精密濾過、サイズ排除クロマトグラフィーなど、またはそれらの組み合わせを含む任意の適切な技術によって単離され得る。エキソソームは、物理的パラメータ（例えば、サイズ、密度）および生化学的パラメータ（例えば、それらの生合成に関与する特定のタンパク質の有無）の両方に基づく技術の組み合わせを使用して単離することができる。特定の実施形態では、エキソソームは、キットを使用して単離される。一実施形態では、エキソソームは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔおよび／またはＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して単離される。

【0162】

単離後、本方法は、細胞外小胞の細胞外小胞マーカーを検出することをさらに含み得る。

【0163】

細胞外小胞マーカーまたはエキソソームマーカーには、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＬＡＰＭ１、ＴＳＧ１０１、およびそれらの組み合わせが含まれる。

【0164】

細胞
細胞は、真核細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞（例えば、非ヒト霊長類細胞）などの哺乳動物細胞であり得る。これらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得することができるいくつかの細胞株が含まれる。特定の実施形態では、細胞を、病原体、例えばウイルス、細菌、マイコバクテリア、真菌、単細胞生物に感染させる。特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。

【0165】

哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト霊長類であり得る。非ヒト霊長類には、限定されないが、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。哺乳動物は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であり得る。

【0166】

特定の実施形態では、細胞は、除去され、一次、二次、不死化またはトランスフォーム状態で組織培養中に維持され得る。特定の実施形態では、細胞は、培養細胞であるか、または供給源（例えば、組織、器官、対象など）から新たに得られた細胞である。哺乳動物細胞は、初代細胞または二次細胞であり得、これは、動物組織から得られた後、比較的短時間培養で維持されていることを意味する。これらには、初代肝細胞、初代筋細胞、初代筋芽細胞などが含まれる。

【0167】

特定の実施形態では、本方法は、幹細胞または前駆細胞を培養する。幹細胞は、自己複製する能力および分化した子孫を生成する能力の両方を有する未分化細胞である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７－２９８を参照）。哺乳動物では、２つの広範なタイプの幹細胞、すなわち、胚性幹細胞および成体幹細胞が存在し、これらは様々な組織に見出される。

【0168】

幹細胞は、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、血液幹細胞または造血幹細胞であり得る。幹細胞はまた、臍帯血に由来し得る。幹細胞は、体細胞核移植または脱分化によって生成され得る。

【0169】

幹細胞には、限定されないが、血液幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞（ＮＳＣ）、皮膚幹細胞、内皮幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、腸管上皮幹細胞または生殖幹細胞が含まれる。特定の実施形態では、間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血および脂肪組織などの中胚葉器官から単離される。

【0170】

特定の実施形態では、幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）である。ＩＰＳＣとは、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、または最終分化細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、ミオサイト、ニューロン、表皮細胞などから人工的に生成された多能性幹細胞の一タイプを指す。

【0171】

特定の実施形態では、本方法は、増殖細胞を培養する。特定の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞（初代Ｔ細胞を含む）を培養する。

【0172】

細胞は、治療されている対象から採取された自己細胞および／または生体適合性の同種もしくは同系の細胞、例えば自己、同種もしくは同系の幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）、前駆細胞（例えば、結合組織前駆細胞または多能性成体前駆細胞）および／またはさらに分化した他の細胞を含み得る。

【0173】

（限定されないが）胚性幹細胞、誘導された高効力幹細胞、がん幹細胞および組織幹細胞を含む、分化能を有する任意の幹細胞が、誘導されたエキソソームを産生するための方法において使用され得る。組織幹細胞には、限定されないが、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜縁幹細胞、毛包幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞および卵巣幹細胞が含まれる。エキソソームを産生するために使用される幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、がん幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、皮膚幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜縁幹細胞、毛包幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、骨髄幹細胞、角膜幹細胞および卵巣幹細胞から選択することができる。

【0174】

本方法の特定の実施形態では、細胞を、約１時間～約３０日間、約３時間～約２０日間、約５時間～約１０日間、約５時間～約５日間、約１０時間～約３日間、約１２時間～約４８時間、約１２時間～約３６時間、約１日～約１０日間、約１日～約８日間、約１日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間、約１日～約３日間、約１日～約２日間、約１２時間、約１日、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間または約４８時間の範囲の期間にわたって、１つ以上の免疫調節因子と接触させる。

【0175】

マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、遺伝子発現を転写後に調節する調節ＲＮＡのクラスである。ｍｉＲＮＡは、進化的に保存された、約１８～２５ヌクレオチドの長さの小さな非コードＲＮＡ分子である。Ｗｅｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．９（６）：８５０－８５９。Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ（２００９）Ｃｅｌｌ １３６（２）：２１５－２３３。各ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに対する部分的に相補的な配列を含む数百の標的ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることができる。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、または翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして作用する。Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．７６８：１４７－１６３。

【0176】

細胞の転写後調節の方法として、ｍｉＲＮＡは、増殖およびアポトーシスなどの細胞活性において重要な役割を果たす。いくつかのｍｉＲＮＡは、重要な負のフィードバックループに影響を及ぼし、一方、他のｍｉＲＮＡは、応答の阻害剤を抑圧することによって免疫系の応答を増幅する働きをする。ｍｉＲＮＡは、先天性免疫応答の開始に関与するシグナル伝達タンパク質を標的とし、様々な異なるｍｉＲＮＡが炎症応答の強度に影響を及ぼす。ｍｉＲＮＡは、炎症を減弱させるプロセスに関連し得る。

【0177】

研究により、ｍｉＲＮＡが肺の炎症の進行に密接に関連していることが示されている。例えば、ＬＰＳ刺激は、ＮＦ－κＢ経路を介して抗炎症効果を有するｍｉＲ－２１のアップレギュレーションを引き起こし得る。ＴＮＦ－α刺激は、ｍｉＲ－１４６のアップレギュレーションを引き起こし得、それにより、その後、ＩＬ－６、ＩＬ－８などの炎症促進因子のレベルをダウンレギュレートし得る。したがって、マイクロＲＮＡは、炎症の進行において重要なフィードバック調節の役割を果たす。インビボおよびインビトロ特発性肺線維症実験では、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を調節するために、ｌｅｔ－７ファミリーのマイクロＲＮＡを、肺胞上皮細胞において高い発現レベルを有するトランスフォーミング成長因子ＴＧＦ－βおよびＨＧＭＡ２によって阻害した。これは、ｌｅｔ－７ファミリーのマイクロＲＮＡが肺線維症の治療に有用であり得ることを示す。間葉系幹細胞に由来するエキソソームは、ｍｉＲ－２１およびｍｉＲ１４６を含むマイクロＲＮＡが濃縮され得、炎症経路を調節することによって抗炎症効果を有し得る。

【0178】

したがって、間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞におけるｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１４６および／またはｌｅｔ－７ａのレベルを増加させることは、炎症性疾患および線維性疾患（例えば、肺線維症）の治療において非常に重要である。

【0179】

本ＥＶは、低毒性の、特定の部位へのｍｉＲＮＡの標的化された効果的な送達を提供し得る。本ＥＶは、ｍｉＲＮＡを循環ヌクレアーゼから保護し、ｍＲＮＡを無傷で標的部位に送達し得る。

【0180】

抗炎症性ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ）、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－１０ａ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１４９、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１８１（ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１８１ｄ）、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１８７およびｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２２３のうちの１つ以上が含まれる。Ｔａｈａｍｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１３７７。

【0181】

ｍｉＲ－１０ａおよびその作用は脊椎動物間で十分に保存されており、炎症の制御における重要な転写後メディエータであることが見出されている（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（２０１２）３９：４５０９－１８）。重要なことに、そのダウンレギュレーションは、炎症性障害、例えば関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、急性膵炎およびアテローム性動脈硬化症において報告されている（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１０ａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ａｔｈｅｒｏ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２０１０）１０７：１３４５０－５；Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－１０ａ，ｗｈｉｃｈ ｔａｒｇｅｔｓ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）１８７：５８７９－８６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ（２０１４）１４：１５９－６６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｍｉＲ－１０ａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈ１／Ｔｈ１７ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ＩＢＤ．Ｇｕｔ（２０１５）６４（１１）：１７５５－６４；Ｍｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ＮＦ－κＢ／ＹＹ１／ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１０ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１６）６：２００５９）。このｍｉＲＮＡは、腸内で主に発現され、前述のように腸の恒常性の維持に寄与する。ｍｉＲ－１０ａは、ＮＦ－κＢシグナル伝達に関与する複数の標的遺伝子を阻害し、炎症性疾患の病因において重要である。

【0182】

最近の研究により、炎症経路の負のフィードバックによる炎症の消散におけるｍｉＲ－２１の本質的な役割が明らかにされている（Ｓｈｅｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ４ ｖｉａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＰＤＣＤ４ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－２１．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）１１：１４１－７；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｍｉＲ－２１ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．（２０１４）１３：２７；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍｉＲ－２１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＴＮＦ－α－ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＤ４０ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＳＩＲＴ１－ＮＦ－κＢ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｎｅｒ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１７）４１：１２４－３６）。

【0183】

ｍｉＲ－１４６ファミリーは、２つの遺伝子、ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－１４６ｂを含み、これらは、炎症促進性刺激に応答して、過剰な炎症を制御するための負のフィードバックとして発現される（Ｋｕｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１４６ａ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１４６ｂ－５ｐ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β，ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．（２０１３）１９：７３７－５０）。それらの異常な発現は、ＲＡ、ループス疾患、乾癬、および変形性関節症などの様々な炎症性障害に関連する（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４６ａ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（２０１２）３５（４）：１５２５－９）。

【0184】

１つ以上のｍｉＲＮＡの測定されたレベルと、基準量または対照試料におけるｍｉＲＮＡの１つ以上のレベルとの比較は、当業者に公知の任意の方法によって行われ得る。例えば、試料中のマイクロＲＮＡの量と標準量とを比較することは、試料中の５Ｓ ｒＲＮＡ（またはスパイクされたオリゴヌクレオチド）とｍｉＲＮＡとの比を、対照試料中の５Ｓ ｒＲＮＡ（またはスパイクされたオリゴヌクレオチド）とｍｉＲＮＡとの公表されたまたは公知の比と比較することを含み得る。

【0185】

ｍｉＲＮＡのレベル、量、存在量または濃度が測定され得る。測定結果は、絶対値であってもよいし、相対的（例えば、基準オリゴヌクレオチドに対して、基準ｍｉＲＮＡに対してなど）であってもよい。

【0186】

試料中のマイクロＲＮＡの量またはレベルを測定または検出することは、当業者に公知の任意の様式で行うことができ、ｍｉＲＮＡのレベルを測定または検出するためのそのような技術は周知であり、容易に使用することができる。ｍｉＲＮＡを検出するための様々な方法が記載されており、それらの方法としては、小分子ＲＮＡシーケンシング（ｓＲＮＡｓｅｑ）、ディープシーケンシング、単一分子直接ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、標的化ＲＴ－ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ｍｉＲＮＡ Ｔａｑｍａｎアレイカード、電気化学的方法（例えば、ｍｉＲＮＡライゲートナノ粒子の酸化）、生物発光法、生物発光タンパク質再組立て、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）ベースの方法、蛍光相関分光法および表面増強ラマン分光法が挙げられ得る（Ｃｉｓｓｅｌｌ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ Ｄｅｏ，Ｓ．Ｋ．（２００９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３９４：１１０９－１１１６）。

【0187】

本発明の方法は、ｍｉＲＮＡのレベルまたは量をアッセイするとき、ＲＮＡを逆転写するステップを含み得る。

【0188】

任意の適切な方法／キットを使用して、単離し、ｍｉＲＮＡのレベルをアッセイすることができる。

【0189】

定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用してマイクロＲＮＡを検出および定量するために使用することができる市販のキット、例えばＡｍｂｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なｑＲＴ－ＰＣＲ ｍｉＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔもある。成熟ｍｉＲＮＡの短い長さを補うために標的特異的なステルンループ（ｓｔｅｒｎ－ｌｏｏｐ）逆転写プライマーを使用するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓも、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）から入手可能である。ＯｒｉＧｅｎｅ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から市販されているｑＳＴＡＲ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを使用することもできる。米国特許公開第２０１４００２４７００号明細書。他の市販のキット、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（シリカベースのＲＮＡ精製技術を使用する）が、１８ヌクレオチド以上のｍｉＲＮＡを単離するために使用され得、Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡから入手可能である。ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍは、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースのリアルタイムＰＣＲを使用してｍｉＲＮＡの検出を可能にする三成分系であり、すべて単一の試料からの成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの定量に使用することができる（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡから同様に入手可能）。ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａは、ｍｉＲＮＡの定量のためにＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎと併せてＲＴ－ＰＣＲを使用することに基づく市販のキットを有する（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡから入手可能なＡｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ（商標）ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手可能なｍｉｒＶＡＮＡは、小分子ＲＮＡを単離するためのガラス繊維フィルタ（ＧＦＦ）ベースの方法を使用する。

【0190】

ｍｉＲＮＡを検出するための方法はまた、複数のマイクロＲＮＡを同時に検出することを可能にするハイブリダイゼーションベースの技術プラットフォームおよび大規模並列次世代小分子ＲＮＡシーケンシングを含み得る。市販のハイブリダイゼーションベースの一技術は、標識分岐ＤＮＡ（Ｐａｎｏｒｎｉｃｓ）によって提供されるシグナル増幅を用いたサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを利用する。別のハイブリダイゼーションベースの技術は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能であり（ｎＣｏｕｎｔｅｒ ｍｉＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、この場合、複数のｍｉＲＮＡ配列が検出され、蛍光標識された配列タグで区別される。次世代シーケンシングの例は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）およびＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨＴ－１２ビーズアレイ）から入手可能である。

【0191】

ｍｉＲＮＡは、小ＲＮＡ分子を単離するための当技術分野で記載されている方法によって単離することができる（米国特許公開第２０１００２９１５８０号明細書、米国特許公開第２０１００２２２５６４号明細書、米国特許公開第２００６００１９２５８号明細書、米国特許公開第２０１１００５４００９号明細書および米国特許公開第２００９００２３１４９号明細書）。

【0192】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、以下のステップを含む方法によって試料から単離され得る：ａ）ｍｉＲＮＡを有する試料を得るステップ、ｂ）試料から全ＲＮＡを単離するステップ、ｃ）適切なサイズのＲＮＡ（例えば、小分子ＲＮＡ）を分離するための、例えばゲル電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による全ＲＮＡのサイズ分画ステップ、ｄ）分離された小分子ＲＮＡの一端または両端にＤＮＡアダプタをライゲートするステップ、ｅ）アダプタライゲートＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写およびＰＣＲ増幅ステップ、ならびに（ｆ）ＤＮＡシーケンシングステップ。ステップ（ａ）～（ｆ）は、上記とは異なる順序で行われてもよい。ステップ（ａ）～（ｆ）のいずれかは、省略されてもよく、または組み合わされてもよい。

【0193】

試料からｍｉＲＮＡを単離するための他の方法としては、以下のステップを含む方法を使用することが挙げられる：ａ）ｍｉＲＮＡを有する試料を得るステップ、ｂ）試料に抽出溶液を添加するステップ、ｃ）抽出された試料にアルコール溶液を添加するステップ、ｄ）試料を鉱物またはポリマー支持体に適用するステップ、ならびにｅ）鉱物支持体またはポリマー支持体から、ｍｉＲＮＡを含有するＲＮＡをイオン性溶液で溶出するステップ。試料からｍｉＲＮＡ分子を単離するための他の手順は、以下を伴うことができる：ａ）アルコール溶液を試料に添加するステップ、ｂ）試料を鉱物またはポリマー固体支持体に適用するステップ、ｃ）イオン溶液で支持体からｍｉＲＮＡ分子を溶出するステップ、およびｄ）ｍｉＲＮＡ分子を使用する、または、特徴づけるステップ（米国特許出願公開第２０１００２２２５６４号明細書）。

【0194】

ｍｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡからのｍｉＲＮＡの分離を伴う方法、例えば米国特許出願公開第２００６００１９２５８号明細書に記載の方法によって単離され得る。これらの方法は、ａ）５’キャップ構造を有するｍＲＮＡおよび５’リン酸を有する小分子ＲＮＡを含む生物学的単離物を提供するステップ、ｂ）単離物を、標識部分を有するリン酸反応性試薬と、標識部分が５’キャップ構造よりも５’リン酸に優先的に付加される条件下で接触させ、それによって、標識小分子ＲＮＡを産生するステップ、ならびにｃ）標識の存在に従ってｍＲＮＡから小分子ＲＮＡを区別するステップを含む。

【0195】

マイクロＲＮＡを単離および／または定量する方法の例としては、限定されないが、マイクロＲＮＡの少なくとも一部を蛍光核酸（蛍光プローブ）とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたマイクロＲＮＡを蛍光試薬と反応させること、この場合、ハイブリダイズしたマイクロＲＮＡが蛍光を放出する、またはマイクロＲＮＡの少なくとも一部を放射性標識相補的核酸にハイブリダイズすることが挙げられる。ｍｉＲＮＡの蛍光標識および検出のための市販の製品が存在する。ＮＣｏｄｅ ｍｉＲＮＡ Ｒａｐｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍおよびＮＣｏｄｅ Ｒａｐｉｄ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３ ｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは両方とも、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から市販されている。さらに、蛍光標識は市販されており、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手可能、Ｃｙ色素（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅｓ）、ＤｙＬｉｇｈｔフルオロフォア（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から入手可能）、およびＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓを含み得る。

【0196】

ロックド核酸プローブも使用することができる。例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＩＳＨ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓは、マイクロＲＮＡの検出を提供する。このキットは、インサイチュハイブリダイゼーションに使用することができ、Ｅｘｉｑｏｎ（ＵＳＡおよびＤｅｎｍａｒｋ）から市販されているｄｏｕｂｌｅ ＤＩＧ＊－ｌａｂｅｌｅｄ ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎを使用する。

【0197】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡを検出するためのプローブは、一本鎖デオキシリボ核酸分子、一本鎖リボ核酸分子、一本鎖ペプチド核酸（ＰＮＡ）または一本鎖ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む一本鎖分子を含み得る。プローブは、プローブがｍｉＲＮＡを検出することができるように、検出されるｍｉＲＮＡの相補体と実質的に相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。いくつかの実施形態では、プローブは、プローブがｍｉＲＮＡの相補体を検出することができるように、ｍｉＲＮＡと実質的に同一、すなわち８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。いくつかの例では、プローブは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドまたは少なくとも４０ヌクレオチドである。いくつかの場合では、プローブは、２５ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下；５０ヌクレオチド以下；７５ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下または１２５ヌクレオチド以下の長さであり得る。いくつかの実施形態では、プローブは、ｍｉＲＮＡの少なくとも５個の連続するヌクレオチド、例えば、少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、２０個、２１個および２２個またはそれ以上の連続するヌクレオチドと実質的に相補的、または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、プローブは、５～２０個、５～２５個、５～５０個、５０～１００個または１００個を超える連続するヌクレオチド長であり得る。

【0198】

免疫調節因子
本明細書で使用される場合、免疫調節因子は、インターフェロン（ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えばＴＮＦα）、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0199】

インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型インターフェロンを包含する。インターフェロンは、ヒトインターフェロンであり得る。

【0200】

Ｉ型インターフェロンには、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－ε、インターフェロン－κおよびインターフェロン－ωが含まれる。ＩＩ型インターフェロンには、インターフェロン－γが含まれる。ＩＩＩ型インターフェロンには、インターフェロン－λが含まれる。

【0201】

本方法および本組成物で使用されるインターフェロンは、野生型インターフェロンの配列の全部または一部と実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の）アミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質であり得る。米国特許出願第２００７０２７４９５０号明細書；第２００４０２４７５６５号明細書および第２００７０２４３１６３号明細書；米国特許第７，２３８，３４４号明細書；第６，９６２，９７８号明細書；第４，５８８，５８５号明細書；第４，９５９，３１４号明細書；第４，７３７，４６２号明細書；第４，４５０，１０３号明細書；第５，７３８，８４５号明細書；ならびに国際公開第０７／０４４，０８３号は、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる。

【0202】

インターフェロンはまた、ＰＥＧ化インターフェロン（ＰＥＧ－ＩＦＮ）など、修飾され得る。本方法において使用され得るインターフェロンにはまた、インターフェロンの変種、例えば、フラグメント、コンセンサスインターフェロン（ＣＩＦＮ）、変性したグリコシル化（非ネイティブグリコシル化またはアグリコシル化）を有するインターフェロン、非天然インターフェロン、組換えインターフェロン、インターフェロン変異体が含まれる。当業者は、市販されており、治療薬として使用されているものを含む様々なインターフェロンを十分に認識している。

【0203】

インターフェロンは、合成、組換えまたは精製され得る。インターフェロンはまた、インターフェロンをコードする核酸配列を含むベクターを使用して発現させることができる。

【0204】

ＩＦＮγは体内の重要な免疫調節因子であり、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原のプロセシングおよび提示を促進することができる。ＩＦＮγは、細胞表面受容体に結合することによって様々な抗ウイルスタンパク質を産生するようにウイルス感染細胞を誘導することができる。

【0205】

特定の実施形態では、ＩＦＮγは、１６．８ｋＤａの分子量を有する。

【0206】

代表的なヒトインターフェロンγアミノ酸配列を配列番号１に示す：
ＭＱＤＰＹＶＫＥＡＥＮＬＫＫＹＦＮＡＧＨＳＤＶＡＤＮＧＴＬＦＬＧＩＬＫＮＷＫＥＥＳＤＲＫＩＭＱＳＱＩＶＳＦＹＦＫＬＦＫＮＦＫＤＤＱＳＩＱＫＳＶＥＴＩＫＥＤＭＮＶＫＦＦＮＳＮＫＫＫＲＤＤＦＥＫＬＴＮＹＳＶＴＤＬＮＶＱＲＫＡＩＨＥＬＩＱＶＭＡＥＬＳＰＡＡＫＴＧＫＲＫＲＳＱＭＬＦＱＧＲＲＡＳＱ（配列番号１）
インターフェロンのＮ末端またはＣ末端に任意選択のタグ配列（容易な精製のための６Ｈｉｓタグなど）が存在し得る。さらに、本開示の免疫調節抑制因子（インターフェロンなど）は、野生型および変異型を含み得、変異型は、野生型の対応する生物学的活性の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を含む。

【0207】

細胞培養培地中の免疫調節因子の濃度は、１つ以上の所望のｍｉＲＮＡのレベルの増加を促進し得、および／または１つ以上の炎症促進因子のレベルを低減し得る。細胞培養培地中の免疫調節因子の濃度は、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。特定の実施形態では、細胞培養培地中の免疫調節因子の濃度は、約１０±５ｎｇ／ｍｌである。

【0208】

細胞培養培地中の免疫調節因子の濃度は、少なくとももしくは約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約３ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約４ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約６ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約７ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約８ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約９ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１１ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１２ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１３ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１４ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１６ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１７ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１８ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約１９ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとももしくは約９５ｎｇ／ｍｌ、または少なくとももしくは約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、または約７５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地中に存在し得る。特定の実施形態では、免疫調節因子は、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地中に存在し得る。

【0209】

特定の実施形態では、細胞培養培地中のＩＦＮ－γの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約９ｎｇ／ｍｌ～約１１ｎｇ／ｍｌ（培養系／培地の体積に基づいて計算）の範囲である。

【0210】

医薬組成物
本開示は、本エキソソームまたは本細胞外小胞を含む医薬組成物を提供する。本開示は、状態または障害の治療に使用するための本エキソソームまたは本細胞外小胞の使用を提供する。

【0211】

いくつかの実施形態では、本エキソソームまたは本細胞外小胞は、薬学的に許容される担体と混合されて、医薬組成物を形成し得る。

【0212】

有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別および体重を含む個々の患者パラメータ、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門的技術内の同様の因子に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患または障害の症状を緩和するか、軽減するか、改善するか、良くするか、低減するか、またはその進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0213】

緩衝液を含む薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；ならびに他の炭水化物；金属錯体；ならびに／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。

【0214】

本エキソソームまたは本細胞外小胞は、細胞をエキソソームまたは細胞外小胞と接触させることによって細胞に送達され得る。

【0215】

本エキソソームまたは本細胞外小胞または本組成物は、限定されないが、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）注射、大槽内注射または注入、経口、経皮、経眼（ｏｃｕｌａｒ）、腹腔内、皮下、インプラント、舌下、皮下、筋肉内、経直腸、経粘膜、経眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下内（ｓｕｂ－ａｒａｃｈｉｎｏｉｄ）、気管支内およびリンパ内投与を含む任意の経路によって対象に送達／投与され得る。本組成物は、非経口的または全身的に投与され得る。本組成物は、局所的に投与され得る。

【0216】

静脈内形態には、限定されないが、ボーラス注射および点滴注射が含まれる。静脈内剤形の例としては、限定されないが、注射用水ＵＳＰ；限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンガー注射液を含む水性ビヒクル；限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む水混和性ビヒクル；ならびに、限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルを含む非水性ビヒクルが挙げられる。

【0217】

本開示は、（ａ）本開示に記載の方法によって調製された細胞外小胞と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0218】

本開示の細胞外小胞は、増加したレベルの特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２１およびｌｅｔ－７ａなど）を有するので、および、インターロイキン１β（ＩＬ１β）、インターロイキン６（ＩＬ６）およびメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）などの炎症促進因子のレベルが低減されるので、本開示は、炎症、線維症、感染性疾患などの様々な疾患の治療に適している。

【0219】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」の成分は、過剰な副作用（毒性、刺激およびアレルギー反応など）がなく、ヒトおよび／または哺乳動物に適している。「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与に使用される様々な賦形剤および希釈剤を含む担体を指す。

【0220】

本開示の医薬組成物は、安全かつ有効な量の本開示の活性成分および薬学的に許容される担体を含む。そのような担体には、（限定されないが）生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。一般に、医薬製剤は投与様式に適合すべきである。本開示の医薬組成物の剤形は、注射剤、凍結乾燥製剤、幹細胞製剤または霧化吸入製剤であり得る。例えば、通常の生理食塩水、またはグルコースおよび他のアジュバントを含有する水溶液を用いて従来の方法によって調製することができる。無菌条件下で医薬組成物を調製することが望ましい。

【0221】

本開示の活性成分の有効量は、投与様式、治療される疾患の重症度などによって変動し得る。好ましい有効量は、様々な因子に基づいて（例えば、臨床試験を通じて）当業者によって決定され得る。因子には、限定されないが、活性成分の薬物動態パラメータ、例えばバイオアベイラビリティ、代謝、半減期など；治療される患者の疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状態、投与経路などが含まれる。

【0222】

本開示の薬学的に許容される担体には、（限定されないが）水、生理食塩水、リポソーム、脂質、タンパク質、タンパク質－抗体コンジュゲート、ペプチド、セルロース、ナノゲル、またはそれらの組み合わせが含まれる。担体の選択は、当業者に周知の投与様式と一致すべきである。

【0223】

治療される状態
本開示は、対象における障害を治療するための方法であって、本組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本エキソソームまたは本細胞外小胞は、治療有効量で投与され得る。本エキソソームまたは本細胞外小胞は、状態、障害または疾患を治療するために対象に送達／投与され得る。

【0224】

本組成物は、炎症性疾患および／または線維性障害を治療するために使用され得る。本組成物は、ウイルス感染または細菌感染を治療するために使用され得る。

【0225】

本組成物は、炎症性疾患などの疾患、または自己免疫障害などの免疫障害を治療する方法に使用され得る。

【0226】

炎症性障害は、急性炎症性障害または慢性炎症性障害であり得る。

【0227】

炎症性疾患、障害または状態の例としては、限定されないが、皮膚炎、慢性湿疹、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠動脈症候群、虚血性再灌流、クローン病、炎症性腸疾患、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、アレルギー反応、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）もしくは他の急性白血球媒介肺傷害、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎が挙げられる。

【0228】

炎症性疾患には、アトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患、慢性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性呼吸器疾患、および潰瘍性大腸炎、クローン病などの炎症性腸疾患などが含まれる。

【0229】

本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」という用語は、哺乳動物の身体内の炎症反応によって引き起こされる疾患を指し、その代表的な例としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患、鼻炎などの呼吸器炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、乾癬、座瘡、接触皮膚炎などの皮膚炎症性疾患；胃炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患などの消化器炎症性疾患；および上記の疾患の合併症が挙げられる。さらに、炎症性疾患には、肺がん、胃がん、結腸直腸がんなどの炎症反応関連がんも含まれる。

【0230】

さらに、本明細書に記載の組成物は、炎症の迅速な消散から利益を得る状態を治療するのに有用である。したがって、本明細書に記載の組成物は、熱創傷および糖尿病性創傷の治癒を含む創傷治癒の促進に有用である。本明細書に記載の方法に従って治療され得る他の症状としては、慢性膵炎、皮膚炎、腹膜炎、ドライアイ、細菌感染、脂肪組織炎症、限局性侵襲性歯周炎、顎関節症、関節炎、術後疼痛、術後認知低下、内毒素ショック、ＨＳＶ－角膜炎、同種移植片拒絶および心虚血が挙げられる。

【0231】

特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、喘息、虚血再灌流傷害、ライム関節炎、歯周炎、腹膜炎、乾癬、関節リウマチ、強皮症および全身性炎症反応症候群からなる群から選択される。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、口腔粘膜炎、口内炎、口唇炎、舌炎およびシェーグレン症候群からなる群から選択される。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、変形性関節症または関節リウマチである。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、脂肪組織炎症である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、血管炎症である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、心虚血である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、子宮内膜症である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、口腔粘膜炎である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、眼系の疾患または障害である。特定の実施形態では、眼系の疾患または障害は、眼の炎症性疾患、ドライアイ症候群、黄斑浮腫および網膜症からなる群から選択される。特定の実施形態では、本方法は、角膜創傷治癒を促進するための方法である。

【0232】

特定の実施形態では、本方法は、本組成物を抗炎症剤と共に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、化合物および抗炎症剤は、同じ剤形または別々の剤形に含有される。

【0233】

特定の実施形態では、疾患または障害は、喘息、虚血再灌流傷害、ライム関節炎、歯周炎、腹膜炎、乾癬、関節リウマチ、強皮症、口腔粘膜炎、口内炎、口唇炎、舌炎、シェーグレン症候群および全身性炎症反応症候群から選択される炎症性疾患または炎症性障害である。特定の実施形態では、炎症性疾患または炎症性障害は、喘息、乾癬、強皮症および口腔粘膜炎から選択される。

【0234】

特定の実施形態では、本開示は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、直腸炎、嚢炎、嚢のクローン病、好酸球性大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、空置性大腸炎、化学的大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、偽膜性大腸炎および不定性大腸炎からなる群から選択される消化器疾患または消化器障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、疾患または障害は、潰瘍性大腸炎、クローン病、直腸炎、嚢炎、嚢のクローン病、好酸球性大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、空置性大腸炎、化学的大腸炎および虚血性大腸炎から選択されるＩＢＤ関連疾患またはＩＢＤ関連障害である。実施形態では、ＩＢＤ関連疾患またはＩＢＤ関連障害は、潰瘍性大腸炎またはクローン病である。実施形態では、ＩＢＤ関連疾患またはＩＢＤ関連障害は、嚢炎である。特定の実施形態では、本開示は、腸閉塞、慢性膵炎、大腸炎、結腸がん、先天性消化器異常、腹壁破裂、高排出瘻孔、非経口栄養関連肝疾患、術後イレウス（ＰＯＩ）、術後腸炎症、短腸症候群および散発性ポリポーシスからなる群から選択される消化器疾患または消化器障害を治療する方法を提供する。

【0235】

治療される状態または疾患としては、炎症性または自己免疫障害、状態および疾患、例えば炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多関節性関節炎、多発性硬化症、アレルギー性疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎および喘息、ならびに上記の病態が挙げられる。

【0236】

本組成物は、線維性障害を治療するために使用され得る。

【0237】

線維性障害には、限定されないが、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆道、軟組織（例えば、縦隔または後腹膜）、骨髄、関節、眼および胃の線維症が含まれ得る。さらなる特定の実施形態では、線維性障害には、肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆道、軟組織（例えば、縦隔または後腹膜）、骨髄、関節および胃の線維症が含まれ得る。さらなる特定の実施形態では、線維性障害には、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟組織、骨髄、腸、および関節の線維症が含まれ得る。さらに別の実施形態では、線維性障害には、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肺線維症、特発性肺線維症、皮膚線維症、眼線維症（莢膜線維症など）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（石炭労働者の塵肺症の合併症）、増殖性線維症、新生物性線維症、慢性炎症性気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息、気腫、喫煙者の肺、結核）に続く肺線維症、アルコールまたは薬物誘導性肝線維症、肝硬変、感染誘導性肝線維症、放射線または化学療法誘導性線維症、腎性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性強皮症、関節線維症、いくつかの形態の癒着性関節包炎、慢性線維化胆管症、例えば原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、胆道閉鎖、家族性肝内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、インプラント周囲線維症および石綿肺が含まれ得る。

【0238】

「線維症」、「線維性疾患」、「線維性障害」という用語およびそれらの語形変化は、器官または組織における線維性結合組織の過剰な沈着の病理学的状態を示し得る。より具体的には、線維症は、組織損傷に対する応答として、持続的な線維性瘢痕形成および結合組織による細胞外マトリックスの過剰産生を含む病理学的プロセスである。生理学的には、結合組織の沈着物は、下にある器官または組織の構造および機能を消滅させる可能性がある。

【0239】

線維症または線維性障害は、任意の器官または組織の線維症に関連し得る。特定の器官線維症の例示的な非限定的な例としては、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば小腸）、胆道、軟組織（例えば、縦隔または後腹膜）、骨髄、関節または胃の線維症、特に肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば小腸）、胆道、軟組織（例えば、縦隔または後腹膜）、骨髄、関節または胃の線維症が挙げられる。

【0240】

特定の実施形態では、線維性障害は、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟組織（例えば、縦隔または後腹膜）、骨髄、腸、および関節（例えば、膝、肩または他の関節）の線維症からなる群から選択される。

【0241】

一実施形態では、線維性障害は、肝臓、肺、皮膚、腎臓または腸の線維症であり得る。

【0242】

特定の実施形態では、線維性障害には、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肺線維症、特発性肺線維症、皮膚線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（石炭労働者の塵肺症の合併症）、増殖性線維症、新生物性線維症、慢性炎症性気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息、気腫、喫煙者の肺、結核）に続く肺線維症、アルコールまたは薬物誘導性肝線維症、肝硬変、感染誘導性肝線維症、放射線または化学療法誘導性線維症、腎性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性強皮症、関節線維症、いくつかの形態の癒着性関節包炎、慢性線維化胆管症、例えば原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）および原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、胆道閉鎖、家族性肝内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、インプラント周囲線維症ならびに石綿肺が含まれる。

【0243】

本組成物は、抗炎症剤または鎮痛剤、例えばオピエートアゴニスト、リポキシゲナーゼ阻害剤、例えば５－リポキシゲナーゼの阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えばシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、インターロイキン阻害剤、例えばインターロイキン－１阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、一酸化窒素の阻害剤もしくは一酸化窒素の合成の阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、またはサイトカイン抑制抗炎症剤と併せて、例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、コデイン、フェンタニル、イブプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド性鎮痛剤、スフェンタニル、スリンダク、テニダップなどの化合物と共に、使用され得る。同様に、本組成物は、上記の鎮痛剤；増強剤、例えばカフェイン、Ｈ２アンタゴニスト（例えば、ラニチジン）、シメチコン、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム；充血緩和剤、例えばフェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、レボ－デゾキシエフェドリン；鎮咳剤、例えばコデイン、ヒドロコドン、カラミフェン、カルベタペンタン、デキストロメトルファン；利尿剤；および、鎮静性または非鎮静性抗ヒスタミン剤と共に投与され得る。

【0244】

抗炎症剤には、限定されないが、プロスタサイクリン、ドーパミン、ガンシクロビル、レボフロキサシン、シメチジン、ヘパリン、アンチトロンビン、エリスロポエチンおよびアスピリンが含まれる。

【0245】

別々に、または同じ医薬組成物中のいずれかで投与される、本組成物と組み合わせられ得る他の治療剤の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：（ａ）ＶＬＡ－４アンタゴニスト、（ｂ）コルチコステロイド、例えばベクロメタゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、フルチカゾン、ヒドロコルチゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、サルメテロール、サルメテロール、サルブタモール、ホルモテロール、（ｃ）免疫抑制剤、例えばシクロスポリン（シクロスポリンＡ、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標））、タクロリルヌス（ｔａｃｒｏｌｉｒｎｕｓ）（ＦＫ－５０６、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））、ラパマイシン（シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））および他のＦＫ－５０６型免疫抑制剤、ならびにミコフェノレート、例えばミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））、（ｄ）抗ヒスタミン剤（Ｈ１－ヒスタミンアンタゴニスト）、例えばブロモフェニラミン、クロルフェニラミン、デキスクロイフェニラミン、トリプロリジン、クレマスチン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、トリペレナミン、ヒドロキシジン、メトジラジン、プロメタジン、トリメプラジン、アザタジン、シプロヘプタジン、アンタゾリン、フェニラミンピリルアミン、アスタミゾール、テルフェナジン、ロラタジン、セチリジン、フェキソフェナジン、デスカルボエトキシロラタジン、（ｅ）非ステロイド性抗喘息剤（例えば、テルブタリン、メタプロテレノール、フェノテロール、イソエタリン、アルブテロール、ビトルテロールおよびピルブテロール）、テオフィリン、クロモリンナトリウム、アトロピン、イプラトロピウムブロミド、ロイコトリエンアンタゴニスト（例えば、ザフムルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、イラルカスト、ポビルカストおよびＳＫＢ－１０６、２０３）、ロイコトリエン生合成阻害剤（ジロートン、ＢＡＹ－１００５）、（ｆ）非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、例えばプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン）、酢酸誘導体（例えば、インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、イブフェナク、イソキセパック、オキスピナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシンおよびゾメピラク）、フェナム酸誘導体（例えば、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸およびトルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸誘導体（例えば、ジフルニサルおよびフルフェニサル）、オキシカム（例えば、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカムおよびテノキシカン）、サリチレート（例えば、アセチルサリチル酸およびスルファサラジン）ならびにピラゾロン（例えば、アパゾン、ベズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）、（ｇ）シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤、例えばセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））、（ｈ）ホスホジエステラーゼＩＶ型（ＰＤＥ ＩＶ）の阻害剤、（ｉ）金化合物、例えばオーラノフィンおよびオーロチオグルコース、（ｊ）エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、（ｋ）抗体療法、例えばオルソクローン（ＯＫＴ３）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））およびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、（ｌ）ケモカイン受容体の他のアンタゴニスト、特にＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ６、（ｍ）潤滑剤または皮膚軟化剤、例えば鉱油およびラノリン、（ｎ）角質溶解剤（例えば、タザロテン）、（ｏ）ビタミンＤ３誘導体、例えばカルシポトリエンまたはカルシポトリオール（Ｄｏｖｏｎｅｘ（登録商標））、（ｐ）ＰＵＶＡ、（ｑ）アントラリン（Ｄｒｉｔｈｒｏｃｒｅｍｅ（登録商標））、（ｒ）エトレチネート（Ｔｅｇｉｓｏｎ（登録商標））およびイソトレチノイン、ならびに（ｓ）多発性硬化症治療剤、例えばインターフェロン－ベータ－１ベータ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、インターフェロン（ベータ－１アルファ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒｅｋ（登録商標）、Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、酢酸グラチラマー（Ｃａｐｏｘｏｎｅ（登録商標））、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾロン）およびシクロホスファミド、（ｔ）ＤＭＡＲＤＳ、例えばメトトレキサート、（ｕ）他の化合物、例えば５－アミノサリチル酸およびそのプロドラッグ；ヒドロキシクロロキン；Ｄ－ペニシラミン；代謝拮抗剤、例えばアザチオプリン、６－メルカプトプリンおよびメトトレキサート；ＤＮＡ合成阻害剤、例えばヒドロキシ尿素および微小管破壊剤、例えばコルヒチン。

【0246】

本組成物および本方法は、肝線維症、肺の炎症状態、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、気管支炎および敗血症などのウイルスによって引き起こされるものなどを治療するために使用され得る。

【0247】

キット
本開示はまた、本エキソソームもしくは本細胞外小胞、または本組成物を含有するキットを包含する。

【0248】

いくつかの実施形態では、キットは、本エキソソームもしくは本細胞外小胞、または本組成物、およびキットを使用するための説明書を含む。要素は、個別に、または組み合わせて提供され得る。

【0249】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の要素の１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器で提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態で（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態で）提供され得る。

【0250】

本開示は、いくつかの実施形態を参照してさらに説明される。実施形態は、本開示を例示するためにのみ使用され、本開示の範囲を限定するためには使用されないことを理解されたい。実験方法について条件が指定されていない以下の実施形態では、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件、または製造業者の推奨事項が一般に使用される。特に明記しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。

【0251】

常に明示的に述べられているわけではないが、すべての数値指定の前に「約」という用語があってもよいことを理解されたい。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に述べられていない限り、「約」という用語は、特定の値に対して許容可能な誤差範囲内を意味すると仮定されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値±１０％を指す。

【0252】

実験方法
（１）ヒト間葉系幹細胞の培養
Ｐ４のヒト脂肪由来間葉系幹細胞を１×１０^４細胞／ｃｍ^２で播種し、８０％まで増殖したら元の培地を捨てた。溶液Ｂ（陰性対照群）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを含有する溶液Ｂ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含有する溶液Ｂ、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを含有する溶液Ｂをそれぞれ細胞に添加し、３７℃で、５％のＣＯ_２と共に約４８時間培養した。

【0253】

（２）ヒト間葉系幹細胞由来の細胞外小胞の単離
細胞培養物上清を回収し、３０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を次のステップに使用し、沈殿物を除去した。上清を１０，０００ｇで０．５時間遠心分離した。次いで、上清を使用し、細胞残屑を除去した。ＰＥＧ濃度が１２％となるように、２４％のＰＥＧ６０００を含有する溶液（例えば、溶液Ｃ）を培養培地（遠心分離後の上清）に添加し、４℃で一晩保持した。これを３，２００ｇで４℃で１時間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物をＰＢＳに再懸濁した。これを１２０，０００ｇで７０分間遠心分離した。上清を捨て、遠心管の底部の沈殿物をＰＢＳに再懸濁した。

【0254】

（３）細胞生存率の測定
ＣＣＫ８キットを使用して、（示された因子を含むか、または含まない）異なる溶液Ｂ中で４８時間培養した後の細胞の代謝値を測定した。

【0255】

（４）定量的蛍光ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による遺伝子の発現レベルの測定
ＲＮＡ抽出キットを用いて細胞のＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標）Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して１μｇのＲＮＡを逆転写した。実験要件に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイのプローブをプライマーとして使用して、定量的蛍光ＰＣＲによって関連タンパク質のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。ＧＡＰＤＨを内部対照として実験を３回繰り返した。ＰＣＲ後、Ｃｔ値を測定した。２^{－△△ＣＴ}法を実験におけるデータ分析に使用した。

【表1】

（５）定量的蛍光ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるｍｉＲＮＡレベルの測定
ＲＮＡ抽出キットを使用して、細胞外小胞からｍｉＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐを定量化のために使用した。１０ｎｇをその後の逆転写に使用した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ＡｓｓａｙｓをｃＤＮＡへの逆転写に使用した。ｍｉＲ－１９１－５ｐを内部対照として実験を３回繰り返した。ＰＣＲ後、Ｃｔ値を測定した。２^{－△△ＣＴ}法を実験におけるデータ分析に使用した。

【表2】

（６）ウエスタンブロットによる細胞外小胞マーカーの発現の測定
プロテアーゼ阻害剤を含むＮＰ－４０溶解緩衝液を使用して、エキソソームを溶解した。ＢＣＡキットを使用して、エキソソソームタンパク質濃度を測定した。４×ローディング緩衝液を試料の一部に添加し、９５℃で５分間煮沸した。同じ体積の試料を電気泳動ゲルにロードし、８０Ｖで０．５時間および１２０Ｖで１時間泳動した。ゲル電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に２５０ｍＡの定電流で１．５時間転移させた。転移後、試料を０．５時間ブロックした。一次抗体（抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３および抗ＣＤ８１）（１：１，０００）をブロッキング緩衝液に添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴを使用して、膜を１０分間３回すすいだ。一次抗体種に特異的な二次抗体（１：３，０００）を添加し、試料を室温で３時間インキュベートした。ＴＢＳＴを使用して膜を１０分間３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用してウエスタンブロットでタンパク質を検出した。

【0256】

（７）ＮＴＡによる細胞外小胞の粒子濃度および粒径の測定
脱イオン水を使用して、ナノ粒子追跡分析器ＺｅｔａＶｉｅｗの試料細胞を洗浄した。機器をポリスチレンミクロスフェアによって較正した。ＰＢＳを使用して試料細胞を洗浄した。試料をＰＢＳを使用して希釈し、分析を行った。

【0257】

［実施例１］
脂肪由来間葉系幹細胞の活性に対する異なる免疫調節因子の効果
上記のように１０ｎｇ／ｍｌの因子で細胞を処理した後、ＣＣＫ８を使用して細胞生存率を測定した。

【0258】

図１に示すように、ＴＮＦαまたはＩＦＮγで処理した細胞の生存率は、陰性対照群の生存率と比較して有意に変化しなかった。ＴＮＦαおよびＩＦＮγで処理した細胞の生存率は、陰性対照群の生存率と比較してわずかに低下した。

【0259】

［実施例２］
異なる免疫調節因子で処理した細胞におけるｍＲＮＡ発現レベル
上記のように１０ｎｇ／ｍｌの因子で細胞を処理した後、蛍光定量ＰＣＲを使用して、細胞における異なるｍＲＮＡの発現を測定した。

【0260】

結果を図２Ａ～図２Ｅに示す。

【0261】

（ａ）ＩＦＮγで処理した細胞では、陰性対照群のｍＲＮＡ発現レベルと比較して、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のｍＲＮＡ発現レベルが有意に増加した。炎症促進性ＭＭＰ８のｍＲＮＡ発現レベルは、陰性対照群のｍＲＮＡ発現レベルと比較して有意に低下した。ＩＬ１βおよびＩＬ６のｍＲＮＡ発現レベルは、陰性対照群のｍＲＮＡ発現レベルと比較して約数倍増加した（例えば、ＩＬ１βは約１３倍増加し、ＩＬ６は約６倍増加した）が、その増加はＴＮＦαを添加したときの増加よりもはるかに（数十～数百倍）小さかった。

【0262】

（ｂ）ＴＮＦαまたはＴＮＦα＋ＩＦＮγで処理した細胞では、ＴＧＦβ１およびＨＧＦのｍＲＮＡ発現レベルは、陰性対照群のｍＲＮＡ発現レベルと比較して有意に増加しなかった。炎症促進性ＩＬ１β、ＩＬ６およびＭＭＰ８のｍＲＮＡ発現レベルは、陰性対照群のｍＲＮＡ発現レベルと比較して、数十倍または数百倍も有意に増加した（例えば、ＩＬ１βは２００倍を超えて増加し、ＩＬ６は３０倍を超えて増加した）。

【0263】

上記の結果は、特異的免疫調節因子（例えば、ＩＦＮγ）による処理後、細胞におけるＴＧＦβ１およびＨＧＦのｍＲＮＡレベルが増加し、ＴＧＦβ１およびＨＧＦのレベルの増加をもたらしたことを示唆している。これにより、細胞外小胞における対応するタンパク質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの増加がもたらされた。

【0264】

特異的免疫調節因子（例えば、ＩＦＮγ）による処理後、炎症促進性ＭＭＰ８のｍＲＮＡレベルが低下し、これにより、細胞におけるＭＭＰ８の合成の低下がもたらされた。これにより、細胞外小胞における因子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下がもたらされた。

【0265】

特異的免疫調節因子（例えば、ＩＦＮγ）による処理後、細胞における炎症促進性ＩＬ１βおよびＩＬ６のｍＲＮＡレベルはあまり変化せず、これにより、細胞外小胞におけるＩＬ１βおよびＩＬ６のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の同様のレベル（またはレベルのわずかな増加）がもたらされた。

【0266】

［実施例３］
異なる免疫調節因子で処理した細胞外小胞におけるｍｉＲＮＡレベル
上記のように１０ｎｇ／ｍｌの因子で細胞を処理した後、ＲＮＡ抽出キットを使用して、細胞から産生された細胞外小胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１４６ａ－５ｐの発現をｑＰＣＲによって測定した。

【0267】

図３Ａ～図３Ｃに示すように、ＩＦＮγで処理した細胞では、抗炎症性ｍｉＲ－２１－５ｐおよびｍｉＲ－１４６ａ－５ｐの発現レベルは、陰性対照群の発現レベルと比較して有意に増加した。上皮間葉転換（ＥＭＴ）の調節に関連するｌｅｔ－７ａ－５ｐの発現レベルも、陰性対照群の発現レベルと比較して有意に増加した。

【0268】

［実施例４］
ＮＴＡによって測定した、異なる免疫調節因子で細胞を処理した後の細胞外小胞の粒子濃度および粒径
ＺｅｔａＶｉｅｗを使用して、異なる免疫調節因子で細胞を処理したときの細胞外小胞の粒子濃度および粒径を測定した。

【0269】

図４Ａ～図４Ｆに示すように、因子で処理した細胞からのすべての細胞外小胞の粒子濃度は、陰性対照群の粒子濃度よりも有意に低かった。ＴＮＦαまたはＩＦＮγで処理した細胞からの細胞外小胞の粒径は、陰性対照群の粒径と有意に異ならなかった。ＴＮＦα＋ＩＦＮγで処理した細胞からの細胞外小胞の粒径は、陰性対照群の粒径よりも有意に大きかった。

【0270】

［実施例５］
異なる炎症促進因子で細胞を処理した後の細胞外小胞特異的マーカーの発現
ウエスタンブロットを使用して、異なる因子で処理した細胞から産生された細胞外小胞に特異的なマーカーの発現を測定した。

【0271】

図５に示すように、ＩＦＮγ群の細胞外小胞のＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の発現レベルが最も高かった。

【0272】

考察
異なる培養条件および誘導条件は、ＥＶの産生に対して異なる効果を有した。

【0273】

この研究は、特異的免疫調節因子（ＩＦＮγなど）の存在下で培養した細胞からの細胞外小胞のｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐおよびｌｅｔ－７ａ－５ｐのレベルが、陰性対照群のレベルと比較して予想外に有意に増加したことを示す。

【0274】

ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１－５ｐは抗炎症活性を有し、ｌｅｔ－７ａ－５ｐは上皮間葉転換を阻害する活性を有するので、本方法を使用して生成されたＥＶはより良好な抗炎症活性および／または上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する能力を有し、これは炎症性疾患または線維性疾患などの疾患の治療に有益である。

【0275】

さらに、脂肪由来間葉系幹細胞をＩＦＮγで処理した後、細胞内のＴＧＦβ１およびＨＧＦのｍＲＮＡレベルが有意に増加し、これにより、細胞外小胞におけるＴＧＦβ１およびＨＧＦのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの増加がもたらされた。

【0276】

さらに、炎症促進因子ＭＭＰ８のｍＲＮＡ発現は有意に減少したが、ＩＬ１βおよびＩＬ６のｍＲＮＡレベルは有意に増加せず、これはまた、炎症性疾患または線維性疾患などの疾患を治療するために使用される本開示のＥＶにとって役立つ。

【0277】

さらに、ＩＦＮγ処理細胞の分泌エキソソームによって産生される細胞外小胞特異的マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１のレベルが最も高く、本開示のＥＶが優れた品質を有することを示唆している。

【0278】

ＩＦＮγによる処理は、他の処理条件（例えば、ＴＮＦαおよびＴＮＦα＋ＩＦＮγ）と比較して、細胞外小胞における抗炎症性ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１－５ｐ）のレベルおよび上皮間葉転換を阻害するｌｅｔ－７ａ－５ｐのレベルをより効果的に増加させることができ、好ましいサイトカイン発現プロファイルを得ることができ、それによって本開示のＥＶにおける複数の因子（ＴＧＦβ１およびＨＧＦなど）および複数の活性分子（ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質）の組み合わせ効果および相乗効果に寄与する。

【0279】

本発明の範囲は、上記で具体的に示され説明されたものによって限定されない。当業者は、材料、構成、構造および寸法の図示された例に対する適切な代替物があることを認識するであろう。特許および様々な刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の説明において引用され、議論される。そのような参考文献の引用および議論は、単に本発明の説明を明確にするために提供されており、任意の参考文献が本明細書に記載の本発明の先行技術であることを認めるものではない。本明細書で引用および議論されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているものの変形、修正、および他の実施は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本発明の特定の実施形態を示し説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。前述の説明に記載された事項は、例示のみを目的として提供され、限定として提供されるものではない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【国際調査報告】