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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-24
(54)【発明の名称】早期口腔扁平上皮癌の評価方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6837 20180101AFI20240117BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240117BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6837 Z
G01N33/53 M
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542944
(86)(22)【出願日】2022-01-14
(85)【翻訳文提出日】2023-09-12
(86)【国際出願番号】 US2022070208
(87)【国際公開番号】W WO2022155679
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】63/199,655
(32)【優先日】2021-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519222933
【氏名又は名称】ロマ リンダ ユニヴァーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ヴィエット チー ティー
(72)【発明者】
【氏名】アウィゼラット ブラッドリー イー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR56
4B063QS32
4B063QS40
4B063QX02
(57)【要約】
ここに提供されるのは、個人における口腔扁平上皮癌の予後の方法、適切な治療計画の決定の支援を提供する方法、及び治療に対する反応性を監視する方法である。これらの方法は、個人からのサンプルから口腔癌に対する高リスクエピジェネティック及び臨床病理学的スコアを決定するステップを含む。前記サンプルは、ブラシ生検サンプルであり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＯＳＣＣを有する個人からの生物学的サンプルから口腔癌の高リスクエピジェネティック及び臨床病理学的（ＲＥＡＳＯＮ）スコアを決定するステップ、並びにＲＥＡＳＯＮスコアに応じた治療計画を選択するステップ、ここで前記治療計画は、選択的頸部郭清術、放射線療法、免疫療法、又は化学療法のうちの１つ以上である、
を含む、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）を有する個人の予後に基づく治療計画の決定の支援を提供する、方法。
【請求項2】
前記個人が、早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＥＡＳＯＮスコアを、複数の非分子の変数及び複数の遺伝子の複数のメチル化パターンに基づいて決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記複数の非分子の変数が、個人の年齢、個人の性別、個人の人種、個人の喫煙、個人の飲酒、ＯＳＣＣの組織悪性度、ＯＳＣＣの段階、神経周囲浸潤、リンパ管湿潤、及びＯＳＣＣのマージン状態のうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
メチル化パターンがＲＥＡＳＯＮスコアを決定するような複数の遺伝子が、ＡＢＣＡ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー２）、ＣＡＣＮＡ１Ｈ（電位依存性カルシウムチャネルα１Ｈ）、ＣＣＮＪＬ（サイクリン-Ｊ-Ｌｉｋｅ）、ＧＰＲ１３３（接着型Ｇタンパク質共役型受容体１３３）、ＨＧＦＡＣ（肝細胞増殖因子アクチベーター）、ＨＯＲＭＡＤ２（ＨＯＲＭＡドメイン含有タンパク質２）、ＭＣＰＨ１（マイクロセファリン１）、ＭＹＬＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ）、ＲＮＦ２１６（リングフィンガータンパク質２１６）、ＳＯＸ８（ＳＲＹ-ｂｏｘ転写因子８）、ＴＲＰＡ１（一過性受容体電位型カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１）、及びＷＤＲ８６（ＷＤリピートドメイン８６）のうちの２つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
生物学的サンプルを、ブラシスワブを用いて取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ＯＳＣＣを有する個人のＲＥＡＳＯＮスコアが、正常者の基準ＲＥＡＳＯＮスコアを上回る場合、ＯＳＣＣを有する個人が、予後不良を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＥＡＳＯＮスコアが、０～３５の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアが、１７である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＯＳＣＣを有する個人からの生物学的サンプルから口腔癌の高リスクエピジェネティック及び臨床病理学的（ＲＥＡＳＯＮ）スコアを決定するステップ、並びに正常者の基準ＲＥＡＳＯＮスコアを上回っている、ＯＳＣＣを有する個人のＲＥＡＳＯＮスコアに応じて、個人をＯＳＣＣ関連死亡の高リスクを有すると分類するステップ、
を含む、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）を有する個人のリスク層別化をする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９９，６５５号の利益及び優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９９，６５５号の利益及び優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）の評価、診断、予後、及び治療支援のためのシステム並びに方法に関する。
【背景技術】
【0003】
毎年３０，０００人の患者が、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）と診断され、及び残念ながら、その発生率は、増えつつある。これらの早期患者でさえ、５年生存率は６０％である。低い生存率は、一つにはリスク予測の不正確さが原因である。早期ＯＳＣＣは、高リスクの特徴を持つ患者に対して、選択的リンパ節切除、放射線治療、又は化学放射線療法などのアジュバント治療の有無に関わらず、主に癌の外科的切除によって治療される。現在、アジュバント治療を割り当てるためのリスク予測は、すべて臨床病理学的情報に基づいている。複数のレトロスペクティブ研究及びプロスペクティブ研究は、これらの標準的な病床理学的因子は、０．７のｃ統計量（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）（ｃ-ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）である中程度の精度を持つことが示されている。これまでのゲノムワイド関連解析は、実行可能なバイオマーカーを生み出していない。これらの研究の欠点は、臨床的に変換可能な（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）アレイプラットフォーム（ａｒｒａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）を使用できなかったこと、及び癌治療が行われているリアルタイムでメチル化を定量できなかったことを含む。臨床治療を適切に調整するため、より正確なリスクアセスメント方法を開発することが急務である。
【発明の概要】
【0004】
ここで提供されるのは、ＯＳＣＣの診断及び治療方法である。例えば、ＯＳＣＣの予後の方法及び適切な治療計画の決定方法、並びに治療への反応性を監視する方法が提供される。一実施態様において、ＯＳＣＣを有する個人の予後の方法は、個人からの生物学的サンプルから口腔癌の高リスクエピジェネティック及び臨床病理学的スコア（ＲＥＡＳＯＮ）スコアを決定するステップを含む。方法は、被験者におけるＯＳＣＣの評価のために被験者から生物学的サンプルを採取するための非侵襲的手法も含む。一実施態様は、病気の評価及び患者の予後の決定をするために患者からサンプルを採取する方法も含む。一実施態様において、前記生物学的サンプルは、がんと疑われる組織からの細胞の収集物、又は個人からの唾液、血液若しくは他の体液からの細胞の収集物であり得る。一実施態様において、前記生物学的サンプルを、ブラシ生検によって得る。一実施態様において、前記サンプルは、ブラシスワブサンプルである。一実施態様において、前記被験者は、前記生物学的サンプルのメチロームの評価に基づいて、早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣを有することを診断される。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、複数の非分子の変数（ｎｏｎ-ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）と複数の遺伝子の複数のメチル化パターンとの組み合わせである。前記複数の非分子の変数は、年齢、性別、人種、喫煙、飲酒、組織学的悪性度、段階、神経周囲浸潤（ＰＮＩ）、リンパ管浸潤（ＬＶＩ）、及びマージン状態が含まれる。メチル化パターンが前記ＲＥＡＳＯＮスコアを決定する前記複数の遺伝子は、ＡＢＣＡ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー２（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂ－ｆａｍｉｌｙ Ａ ｍｅｍｂｅｒ ２））、ＣＡＣＮＡ１Ｈ（電位依存性カルシウムチャネルα１Ｈ(Ｃａｌｃｉｕｍ Ｖｏｌｔａｇｅ-Ｇａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｌｐｈａ１ Ｈ)）、ＣＣＮＪＬ（サイクリン-Ｊ-ｌｉｋｅ（Ｃｙｃｌｉｎ-Ｊ-Ｌｉｋｅ））、ＧＰＲ１３３（接着型Ｇタンパク質共役型受容体１３３（Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ-Ｐｒｏｔｅｉｎ-Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １３３））、ＨＧＦＡＣ（肝細胞増殖因子アクチベーター（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ））、ＨＯＲＭＡＤ２（ＨＯＲＭＡドメイン含有タンパク質２（ＨＯＲＭＡ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２））、ＭＣＰＨ１（マイクロセファリン１（Ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｉｎ １））、ＭＹＬＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍｙｏｓｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｋｉｎａｓｅ））、ＲＮＦ２１６（リングフィンガータンパク質２１６（Ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２１６））、ＳＯＸ８（ＳＲＹ-ｂｏｘ転写因子８（ＳＲＹ－ｂｏｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ８））、ＴＲＰＡ１（一過性受容体電位型カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃａｔｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ Ｍｅｍｂｅｒ １））、及びＷＤＲ８６（ＷＤリピートドメイン８６（ＷＤ Ｒｅｐｅａｔ Ｄｏｍａｉｎ ８６））の２つ以上を含む。
【0005】
実施態様は、ＯＳＣＣの予後に基づいて治療計画の推奨を提供する方法を含む。前記方法は、個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定するステップを含み、基準ＲＥＡＳＯＮスコア以上である前記サンプルからのＲＥＡＳＯＮスコアは、予後不良を示す。臨床病理学的構成要素の前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、０から９の範囲（９つの二分化された危険因子-人種、性別、７つの危険因子[ＰＮＩ、腫瘍悪性度、マージン状態、ＬＶＩ、段階、現在の喫煙、アルコール使用歴]）、及び１３個のＣｐＧエピジェネティック部位（三部位数（ｔｅｒｔｉｌｅｓ）として分類される）については０から２６の範囲である。前記総ＲＥＡＳＯＮスコアは、臨床病理学的スコアとエピジェネティックスコアとを組み合わせることにより、０から３５の範囲となる。一実施態様において、前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される前記総ＲＥＡＳＯＮスコアのカットオフ範囲の中央値である。一実施態様において、１７の前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される。
【0006】
実施態様は、個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定することにより、外科的治療から恩恵を受け得る早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣを有する個人を同定する方法を含む。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、医療専門家及び患者が、選択的頸部郭清術、放射線治療法、又は化学療法の１つ以上などの治療計画を評価及び選択するための決定のサポートツールを提供する。実施態様は、ＯＳＣＣを有する個人の治療法を選択する方法を含む。一実施態様において、前記方法は、個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定することを含む。基準ＲＥＡＳＯＮスコア以上であるサンプルからの前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、頸部郭清術、放射線療法、又は化学療法の１つ以上などの１つ以上の治療選択肢から恩恵を受け得る個人を示す。一実施態様において、前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される総ＲＥＡＳＯＮスコアのカットオフ範囲の中央値である。一実施態様において、前記１７の基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される。
【0007】
実施態様は、前記ＲＥＡＳＯＮスコアを用いる口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）を有する個人のリスク層別化の方法を含む。そのような方法の１つは、個人からの生物学的サンプルから口腔癌の高リスクエピジェネティック及び臨床病理学的スコア（ＲＥＡＳＯＮ）スコアを決定するステップ、及び健康な個人の基準ＲＥＡＳＯＮスコア以上であるＯＳＣＣを有する個人のＲＥＡＳＯＮスコアに応答して、ＯＳＣＣ関連死亡の高いリスクを有するような個人を分類するステップを含む。
【0008】
本特許又は本出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本特許又は本特許出願公開公報の写しは、請求及び必要な手数料の支払いにより、特許庁から提供される。
実施態様は、添付図面と併せて以下の詳細な説明により容易に理解される。実施態様は、例として図示されており、及び添付図面の限定をする目的ではない。
実施態様は、添付図面と併せて以下の詳細な説明により容易に理解される。実施態様は、例として図示されており、及び添付図面の限定をする目的ではない。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図2】図２は、ヒートマップであり、及び異なるメチル化遺伝子の階層クラスタリングは、高リスク対低リスクのＯＳＣＣ患者における明確なメチル化シグネチャーを示す。それは、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）コホートにおいて、５年まで生存した患者と死亡した患者との間で、上位１２個のメチル化の異なる遺伝子のヒートマップである。
【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、機能的なネットワーク解析マッピングからの表示である。機能的なエンリッチメント解析は、３つのパスウェイ上の異なるメチル化をされた遺伝子の凝集体を同定する。図３Ａは、最も差次的に摂動されたメチル化経路（Ｐadjusted＜０．０５）の上位１０位にマッピングする、差次的に濃縮された遺伝子のドットプロットである。図３Ｂは、統計的に最も差次的にメチル化された経路の上位３つの表示を灰色の円で示したもので、及び構成要素遺伝子の異なるメチル化における倍率変化を、各遺伝子の負（緑）から正（赤）の倍率変化で表現する。各円のサイズは、遺伝子数に基づいている。
【図4】図４Ａは、１０倍のカバレッジで変曲点を示す全ＣＰＧにおける、カバレッジのグラフ表示である。図４Ｂは、がん被験者及び正常被験者のスワブサンプル及び組織サンプルの両方において定量されたＣＰＧの数のグラフ表示である。カットオフ値として１０倍の読み取り深度を使用し、定量化されたＣｐＧサイトの数を、各サンプルにおいて決定する。図４Ｃは、ブラシスワブ及び組織の平均マッピング効率のグラフ表示である。前記平均マッピング効率は、ブラシスワブでは８９．４５％、組織では９０％であり、２つのサンプリング方法に著しい差はなかった。図４Ｄは、ＭＣ-ＳｅｑによってプロファイルされたＣＰＧの相対的な遺伝子位置（左）及び、プロファイルされたＥＰＩＣアレイによってカバーされたＣＰＧの相対的な遺伝子位置（右）の円グラフ表示のセットである。ＭＣ-Ｓｅｑは、ＥＰＩＣアレイよりも機能的遺伝子領域をより確実にカバーする。
【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、３人の患者のそれぞれのがん部位及び正常部位の組織検体及びブラシスワブ検体の間の相関を示す散布図である。相関値を記載する。図５Ｃは、箱ひげ図（中央値、四部位数、最大値及び最小値）を用いて可視化した、ＭＣ-Ｓｅｑで定量した癌サンプル及び正常サンプル間のメチル化差のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
詳細な説明
口腔及び中咽頭における癌のほとんどは、口や喉の内側を形成する扁平上皮細胞において発生する扁平上皮細胞扁平上皮細胞癌（ＯＳＣＣ）である。口腔癌は、増加傾向にあり、過去２０年で３分の２に増加している。毎年３０，０００人のアメリカ人が、口腔扁平上皮細胞癌と診断され、及び新たに診断された症例の８０％は、領域リンパ節移転又は遠隔転移のない早期Ｉ／ＩＩである。たとえ早期口腔癌患者でも、５年間の生存率は６０％と低い。ＯＳＣＣ患者は、がん及び頸部リンパ節の外科的切除を処置され、その後、リスク層別化に基づく化学療法及び免疫療法を併用又は併用せずにアジュバント放射線治療を処置される。しかしながら、臨床病理学的情報のみに依存する現在の臨床治療では、リスク予測及び生存率は、依然として低い。ＯＳＣＣ患者の最大４０％は、早期癌を呈する患者であっても、５年以内に死亡する。この低い生存率は、他の癌、又は口腔咽頭のＳＣＣなどの他の頭部癌及び頸部癌のサブタイプとは対照的である。臨床病理学的データと分子シグネチャーとの両方を組み合わせ、ＯＳＣＣ患者を高リスク及び低リスクカテゴリーに層別化し、かつ、アジュバント化学療法及び放射線療法に関する臨床決定サポートを提供し、並びに最終的に生存率を改善する、強固な予後方法を開発する必要がある。
口腔及び中咽頭における癌のほとんどは、口や喉の内側を形成する扁平上皮細胞において発生する扁平上皮細胞扁平上皮細胞癌（ＯＳＣＣ）である。口腔癌は、増加傾向にあり、過去２０年で３分の２に増加している。毎年３０，０００人のアメリカ人が、口腔扁平上皮細胞癌と診断され、及び新たに診断された症例の８０％は、領域リンパ節移転又は遠隔転移のない早期Ｉ／ＩＩである。たとえ早期口腔癌患者でも、５年間の生存率は６０％と低い。ＯＳＣＣ患者は、がん及び頸部リンパ節の外科的切除を処置され、その後、リスク層別化に基づく化学療法及び免疫療法を併用又は併用せずにアジュバント放射線治療を処置される。しかしながら、臨床病理学的情報のみに依存する現在の臨床治療では、リスク予測及び生存率は、依然として低い。ＯＳＣＣ患者の最大４０％は、早期癌を呈する患者であっても、５年以内に死亡する。この低い生存率は、他の癌、又は口腔咽頭のＳＣＣなどの他の頭部癌及び頸部癌のサブタイプとは対照的である。臨床病理学的データと分子シグネチャーとの両方を組み合わせ、ＯＳＣＣ患者を高リスク及び低リスクカテゴリーに層別化し、かつ、アジュバント化学療法及び放射線療法に関する臨床決定サポートを提供し、並びに最終的に生存率を改善する、強固な予後方法を開発する必要がある。
【0011】
実施態様は、ＯＳＣＣ特有のメチル化特徴を定量化するためのサンプル収集の方法を含む。そのような方法の１つは、癌の特有のメチル化特徴を定量化するための強固な非侵襲的方法として機能するブラシスワブ生検を含む。特定の実施態様において、前記方法は、メチル化シグネチャーを確立するために、メチルキャプチャーシーケンシング（ＭＣ Ｓｅｑ）プロセスを通じて、ブラシスワブ生検からのサンプルのその後の処理を含む。このシグネチャーを、臨床病床理学的因子と組み合わせて評価し、死亡のリスクを決定し、及び適切な治療計画の決定のサポートを提供するために使用される、ＲＥＡＳＯＮスコアを得る。
【0012】
ここで開示されるのは、遺伝子メチル化シグネチャーを、臨床病理学的因子と組み合わせて、早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣ患者における５年死亡率のリスクを決定する際に高い予後性能を有する複合分子及び非複合分子シグネチャーを形成する方法である。臨床病理学的データを、ＯＳＣＣ患者５１５人の内部のレトロスペクティブコホート、及びＴＣＧＡの患者５８人のコホートから解析した。これら２つのコホートにおける５年死亡率を高く予測する臨床病理学的因子の上位を、決定した。ＴＣＧＡコホートで利用可能なメチル化アレイデータを解析し、及び５年後までに死亡したＯＳＣＣ患者と生存したＯＳＣＣ患者との間で異なるメチル化がされている１２個の遺伝子を同定した。１２個の遺伝子のメチル化シグネチャーと関連する臨床病理学的因子を、リスクスコア-ＲＥＡＳＯＮスコアと組み合わせる。その予測性能を、診断から５年以内に死亡した早期ＯＳＣＣ患者を特定することで評価した。
【0013】
実施態様は、ＯＳＣＣの予後に基づく治療計画の推奨を提供する方法を含む。前記方法は、個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定するステップを含み、基準ＲＥＡＳＯＮスコア以上である前記サンプルからのＲＥＡＳＯＮスコアは、予後不良を示す。臨床病理学的構成要素の前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、０～９（９つの二分化された危険因子-人種、性別、７つの危険因子[ＰＮＩ、腫瘍悪性度、マージン状態、ＬＶＩ、段階、現在の喫煙、アルコール使用歴]）及び１３のＣｐＧエピジェネティック部位については、０～２６（三分位数として分類）の範囲である。前記総ＲＥＡＳＯＮスコアは、臨床病理学的スコアとエピジェネティックスコアとを組み合わせることにより、０～３５となる。一実施態様において、基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される総ＲＥＡＳＯＮスコアのカットオフ範囲の中央値である。一実施態様において、１７の前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される。前記方法は、前記ＲＥＡＳＯＮスコアに基づいて被験者に治療を提案するステップをさらに含み、前記治療は、少なくとも頸部部分切除（ｐａｒｔｉａｌ ｎｅｃｋ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）、放射線治療、化学療法、免疫療法、及びそれらの組み合わせから選択される積極的治療、並びにアクティブサーベイランスのうちの１つ以上である。特定の実施態様において、前記ＲＥＡＳＯＮスコアを、選択された治療計画に対する患者の反応性を監視するために使用し得る。
【0014】
実施態様は、早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣを有する個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定することにより、外科治療から恩恵を受け得る早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣを有する前記個人を特定する方法を含む。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、医療専門家及び患者が、選択的頸部郭清術、放射線治療法、免疫療法、又は化学療法などの治療計画を評価及び選択するための決定のサポートツールを提供する。実施態様は、ＯＳＣＣを有する個人の治療法を選択する方法を含む。一実施態様において、前記方法は、個人からのサンプルからＲＥＡＳＯＮスコアを決定することを含む。前記サンプルからのＲＥＡＳＯＮスコアが基準ＲＥＡＳＯＮスコア以上であることは、頸部郭清術、放射線治療法、免疫療法、又は化学療法などの１つ以上の治療選択肢から恩恵を受け得る個人であることを示す。特定の実施態様において、前記スコアは、生存状態に基づいて経験的に決定される。一実施態様において、前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される総ＲＥＡＳＯＮスコアのカットオフ範囲の中央値である。一実施態様において、１７の前記基準ＲＥＡＳＯＮスコアは、参加者を低リスクサブグループ及び高リスクサブグループに分類するために使用される。
【0015】
実施態様は、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＮＪＬ、ＧＰＲ１３３、ＨＧＦＡＣ、ＨＯＲＭＡＤ２、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１、及びＷＤＲ８６の２つ以上のメチル化パターンを決定するための少なくとも２つ以上のプライマー及び／又はプローブを含む評価キットも含む。この評価キットは、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＮＪＬ、ＧＰＲ１３３、ＨＧＦＡＣ、ＨＯＲＭＡＤ２、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１、及びＷＤＲ８６のうちの２つ以上メチル化パターンを決定するための命令も含み得る。この評価キットは、ＣｐＧエピジェネティックスコアを決定するための命令も含み得る。この評価キットは、ＣｐＧエピジェネティックスコア、並びに個人の年齢、個人の性別、個人の人種、個人の喫煙、個人の飲酒、ＯＳＣＣの組織学的悪性度、ＯＳＣＣの段階、神経周囲浸潤（ＰＮＩ）、リンパ管浸潤（ＬＶＩ）、及びＯＳＣＣのマージン状態の１つ以上を含む複数の非分子の変数に基づいてＲＥＡＳＯＮスコアを決定するための命令も含み得る。実施態様は、ＯＳＣＣ患者のリスク層別化のためのこれらの評価キットの使用方法も含む。
【0016】
本明細書で使用される場合、“治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”若しくは“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”は、完治若しくは不全治癒を意味し、又は基礎疾患若しくは関連する状態の症状は、少なくとも影響を受け、予防され、軽減され、除去され及び／又は遅延され、及び／又は症状を引き起こす基礎となる細胞的、生理学的、若しくは生化学的原因若しくは機構の１つ以上が影響を受け、予防され、軽減され、遅延され及び／又は除去されることを意味する。この文脈で使用される場合、減少された（ｒｅｄｕｃｅｄ）又は遅延された（ｄｅｌａｙｅｄ）は、未治療の病気の生理学的な状態だけでなく、未治療の病気の分子状態を含む、未治療の病気の状態との相対的な関係を意味することが理解される。特定の実施態様において、前記ＲＥＳＯＮスコアの決定は、被験者を治療するための包括的なリスク層別化戦略の一部である。
【0017】
実施態様は、診断時にＯＳＣＣ患者のメチル化シグネチャーを非侵襲的に決定するために、ブラシスワブサンプル及びＭＣ-Ｓｅｑを使用するＯＳＣＣ被験者のリスク層別化のための方法を含む。前記方法は、ブラシスワブを使用する生体サンプルを採取するステップ、複数の非分子の変数及び複数の遺伝子の複数のメチル化パターンの組み合わせである、ＲＥＡＳＯＮスコアを前記生体サンプルから決定するステップ、及び前記ＲＥＳＯＮスコアに応じてリスク層別化を提供するステップを含む。前記複数の非分子の変数は、年齢、性別、人種、喫煙、飲酒、組織学的悪性度、段階、神経周囲浸潤（ＰＮＩ）、リンパ管浸潤（ＬＶＩ）、及びマージン状態を含む。メチル化パターンがＲＥＡＳＯＮスコアを決定する前記複数の遺伝子は、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＮＪＬ、ＧＰＲ１３３、ＨＧＦＡＣ、ＨＯＲＭＡＤ２、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１、及びＷＤＲ８６のうち２つ以上を含む。このように被験者の層別化が改善されることで、一次治療の決定がより適切にサポートされる結果になる。
【0018】
本明細書に、ＲＥＳＯＮスコアの開発を支援する患者の選択及びデータ収集過程について記載する。前記患者を、彼らが治療を受けた施設で集計された既存のＯＳＣＣデータベースから選択した。このデータベースのための臨床データの収集は、ロマリンダ大学（ＬＬＵ）、コロンビア大学Ｉｒｖｉｎｇメディカルセンター（ＣＵＩＭＣ）、ポートランドプロビデンスメディカルセンター（ＰＰＭＣ）、イリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）、及びアラバマ大学バーミンガム校（ＵＡＢ）を含む、各施設の治験審査委員会により承認された。前記調査は、口腔舌、上顎及び下顎歯肉、硬口蓋、口腔底部、頬粘膜、並びに唇粘膜を含む口腔サブサイトのみに限定した。臨床病期及び病理学的病期を、対がん米国合同委員会第８版ステージングマニュアル（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ （ＡＪＣＣ） Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ）に基づいて記録した。全患者は、生検確認されたＯＳＣＣのＩ期又はＩＩ期（すなわち、Ｔ１Ｎ０Ｍ０又はＴ２Ｎ０Ｍ０）であった。匿名化された患者の臨床病理学的特徴を、データ解釈に使用した。以下の情報：年齢、性別、人種、喫煙、飲酒、ＴＮＭ分類、腫瘍位置、病理学的特徴[すなわち、神経周囲浸潤（ＰＮＩ）、リンパ管浸潤（ＬＶＩ）、マージン状態、組織学的悪性度]、及び腫瘍切除に加えて受けた治療法（すなわち、頸部リンパ節切除、化学療法を併用又は併用せずに放射線治療）は、カルテレビューから取集された。５１５人の患者の内部コホート及び５８人の患者のＴＣＧＡコホートは、病理学的ＴＮＭ分類に基づく早期（Ｉ又はＩＩ）ＯＳＣＣ患者からなった。表１は、彼らの人口統計学的及び臨床病理学的特徴を詳述する。統計的検定及びｐ値を示す。略語：ＡＪＣＣ＝対がん米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）；ＮＯＳ＝特定不能（ｎｏｔ ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）；ＳＤ＝標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、ＴＣＧＡ＝がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）。
【0019】
【表1-1】
【表1-2】
【0020】
ＴＣＧＡコホートは、６０％が男性であり、９３％が白人であり、及び平均年齢は６４歳であった。患者の大部分（６８％）は、現在又は過去に喫煙者であり、及び患者の６１％はアルコールを使用していた。腫瘍サブサイトは、口腔舌、歯茎、頬粘膜、口腔底部を含み、ＴＣＧＡコホートの５７％は、口腔舌ＳＣＣからなり、残りは他のサブサイトに分布していた。病理学的病期分類に関しては、３１％がＩ期であり、及び６９％はＩＩ期であった。腫瘍の悪性度に関しては、１９％が高分化型の腫瘍であり、残りの８１％は中分化型又は低分化型の腫瘍であった。ＰＮＩは、３５％存在し、ＬＶＩは６．９％存在し、及び断端陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｒａｇｉｎ）又は断端近接（ｃｌｏｓｅ ｍａｒａｇｉｎ）は、２１％のケースで存在した。５年生存率は、８６％であった。ＴＣＧＡコホート及び内部コホートの間の顕著な差を、表１に示す。性別、年齢、自己申告された人種、及び喫煙は、２つのコホート間で差はなかった。前記内部コホートは、ヒスパニック系を自己申告した患者の割合がより高かった（２２％対３．６％、ｐ＝０．００１）。前記内部コホートは、アルコールを摂取した患者が顕著に少なかった（４０％対６１％、ｐ＝０．００２）。腫瘍部位に顕著な違いがあった。舌ＳＣＣ患者の割合は、両コホートで同様であったが（５７％）、前記内部コホートは、前記ＴＣＧＡコホートよりも歯槽（歯肉）ＳＣＣの割合が高かった（１７％対５％、ｐ＜０．００１）。腫瘍悪性度にも差があり、高分化型腫瘍を有する内部コホートが高かった（４０％対１９％、ｐ＝０．００１）。ＴＣＧＡコホートと比較して、内部コホートではＰＮＩを有する割合は低かった（１１％対３５％、ｐ＜０．００１）。同様に、内部コホートでは、病理学的病期が低い患者が顕著に多かった（６４％対３１％、ｐ＜０．００１）。しかしながら、早期で高分化型腫瘍でＰＮＩが低いにも関わらず、死亡のリスクは、内部コホートよりも顕著に高かった（３７％対１４％、Ｐ＝０．００１）。
【0021】
前記ｃ-ｉｎｄｅｘを、様々な臨床病理学的因子を用いて算出した。２つのコホートの間で最も高い予測能力を示した前記臨床病理学的特徴は、年齢、人種、性別、喫煙、飲酒、組織学的悪性度、段階、ＰＮＩ、ＬＶＩ、及びマージン状態であった。１０個の非分子の特徴のこのパネルは、ＴＣＧＡコホートではｃ-ｉｎｄｅｘ＝０．７２、内部コホートではｃ-ｉｎｄｅｘ＝０．６６の５年死亡リスクを予測した。二つの群間で臨床病理学的特徴の違いが報告されているにも関わらず、予後予測能に顕著な差はなかった。前記２つの群の複合は、５年死亡リスクにおいてｃ-ｉｎｄｅｘ＝０．６７を有した。前記低いｃ-ｉｎｄｅｘは、臨床病理学的因子だけでは、０．８以上のｃ-ｉｎｄｅｘで定義されるような疾患リスクを十分に評価できないことを示した過去の臨床研究及びバイオマーカー研究と一致する。現在の臨床治療は、リスク評価及び治療決定のためのこれらの臨床病理学的因子のみに頼っている。
【0022】
ＴＧＣＡデータベースにおける早期ＯＳＣＣ患者からのメチル化データの解析を、実施した。ＤＮＡメチル化データの前処理、品質管理フィルタリング、及び正常化（一括修正（ｂａｔｃｈ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）及び代理変数解析（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む）を、Ｒバイオコンダクターパッケージのｍｉｎｆｉパッケージを用いて実施した。前記ｍｉｎｆｉパッケージは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＤＮＡメチル化マイクロアレイの解析のための柔軟な及び包括的なバイオコンダクターパッケージである。メチル化差解析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、Ｒパッケージのｌｉｍｍａパッケージを用いて実施した。前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０Ｋ Ａｒｒａｙデータ解析を図１に記載する。図１は、実施態様による、ＴＣＧＡコホートからのメチル化アレイデータの解析方法のフローチャートである。
【0023】
方法１００において、４５０Ｋアレイ１０２及び表現型データ１０４の２つのデータセットを、前記ｍｉｎｆｉパッケージのＲＧチャネルセット１０６にロードした。これらは、２色のマイクロアレイ、具体的にはイルミナのメチル化アレイからの生（未処理）データである。次に、前記ＲＧセットデータを、イルミナのメチル化マイクロアレイのために層別化されたクオンタイル正規化前処理（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を実行するｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓＱｕａｎｔｉｌｅ関数を用いて正規化する１０８。その後、前記データを、メチル化マイクロアレイをゲノムの位置にマッピングするゲノム比率セット関数（ｇｅｎｏｍｉｃ ｒａｔｉｏ ｓｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で処理する１１０。次のステップ１１２において、前記サンプルの性別を予測し、及び次いで前記サンプルの表現型と照合する。ステップ１１２は、自己申告と生物学的性別との間に不一致であるサンプルを特定することにより、前記サンプルと出力とが一致していることを判断するための品質管理のステップである。その後、前記データは、プローブフィルターステップ１１４を受けた。簡単に言えば、総計４８５，５１２のプローブの中で、Ｘ又はＹ染色体にハイブリダイズするプローブを除去し１１６、４７３，８６４のプローブが残った。その上、一塩基多形（ＳＮＰｓ）に関連する１７，３５１のプローブを除去し１１８、及び遺伝子領域をマッピングしていない１１１，９７７のプローブを除去した１２０。前記ｐ値を、前記プローブフィルタープロセスの次のステップ１２２の一部として、残っているプローブについて計算した。少なくとも５０％のサンプルにおける０．０１未満の検出ｐ値を、ステップ１２４で決定すると、少なくとも５０％のサンプルで０．０１よりも大きい検出ｐ値であったそれらのプローブを、ステップ１２６において除去した。残りの３４４，５３６のプローブから、少なくとも５０％のサンプルで０．０１未満の検出ｐ値であったそれらのプローブを、ステップ１２８で保持した。その後、交差反応性又は複数のゲノム位置にマッピングされた前記プローブを、ステップ１３０でフィルターし、３２４，４６５のプローブが残った。
【0024】
次いで、フィルターしたプローブの前記ベータ値及びＭ値を、ステップ１３２で計算した。ベータ値は、各ＣｐＧサイトにおけるメチル化の生の推定値である（範囲０～１）。Ｍ値は、同じメチル化状態の異なる推定値であり、解析のためのより良い統計的特性を有する。全サンプル中で０．１未満のベータ値、又は全サンプル中で０．９を超えるベータ値を有する前記プローブを、ステップ１３４で除外し、３１７，０１６のプローブが残った。結果変数として患者の生存状態を用い、代理変数解析を用いた一括修正を、実施した。サンプル中のベータ値のばらつきを、ステップ１３６で解析した。生存状態との相関が０．２より高い代理変数を、除外した（１４個の代理変数のうち３個が特定された）。代理変数解析を、使用し、関心のある結果（例えば、バッチ効果）とは関係ないが、分析に影響を与え得る不要なばらつきを引き起こすデータにおけるパターンを識別する。代理変数を、高次元データから推測し、及びこれらの不要なばらつきの原因を調整するために共変量として使用される。次に、上位３０％の変動するメチル化プローブを、ステップ１３８で選択し、４，５４４の遺伝子に及ぶ９５，１０４のプローブの総数が、メチル化差解析のために保持される。前記同じプローブは、ステップ１４０でＭ値を保持した。ベータ値を、使用し、ＣｐＧサイトのメチル化状態を説明したが、Ｍ値を、同じ部位の統計解析に用いる。Ｍ値におけるｌｉｍｍａ機能を使用するメチル化差解析を、Ｒバイオコンダクターパッケージを使用して解析し、前記ｌｉｍｍａ機能を、マイクロアレイ解析からから生じた遺伝子発現データの解析のために使用する。
【0025】
解析に利用可能なサンプルサイズを考慮し（ｎ＝５８）、０．１未満の調整されたｐ値を示す生存状態について、異なるメチル化をされたＣｐＧを、予後パネルの分子構成要素に含めることを検討した。ヒートマップは、クラスタリング変数として生存状態を用いる、Ｒにおけるヒートマップパッケージｖ１．０．１２を使用する、階層的クラスタリング解析を使用して構築された。パスウェイ（ｐａｔｈｗａｙｓ）の中でメチル化が異なる遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）の濃縮を評価するために、パスウェイ解析を、遺伝子オントロジー（ＧＯ）及び京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）という、２つの相補的及び重複するアノテーションを用いて行った。パスウェイ解析、特に過剰発現解析を、ＫＥＧＧを用いて実行した。並びに、ＧＯアノテーションは、ＲのｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ ｖ３．１６．１を使用して実施され、重要でない発現変動遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ）を“バックグラウンドユニバース（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓｅ）”として特定し、及びボンフェローニ補正を用いる多重検定を考慮した。ＧＯアノテーションを用いる過剰発現解析では、パスウェイを、生物学的プロセス、分子機能、及び細胞内コンパートメントにさらに分類した。Ｒのｅｎｒｉｃｈｐｌｏｔパッケージｖ１．８．１を用いる機能的濃縮の２つの可視化（すなわち、ドットプロット及び遺伝子概念ネットワーク）によって、異なるメチル化をされたパスウェイを、相互に関連すること、及び異なるメチル化をされた部位に寄与していることを評価した。
【0026】
生存状態と関連する、異なるメチル化部位を持つ遺伝子の発現の相関を、開発した。ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）により収集された遺伝子発現の解析を、前記ＴＣＧＡデータベースにおける早期ＯＳＣＣ患者から実施した。生の遺伝子数を、ＴＣＧＡから得た。少なくとも９０％のサンプルで少なくとも１０カウントの遺伝子のみを、解析のために保持した。前記遺伝子数のＥｎｓｅｍｂｌ識別子（ＩＤ）を、ＲのＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＢｒｏｗｓｅｒ ｖ２．１８．２パッケージを用いてＥｎｔｒｅｚ ＩＤｓにアノテーションした。遺伝子のアノテーションは、Ｈｏｍｏ．ｓａｐｉｅｎｓ ｖ．１．３．１パッケージを使用して付与された。ＲＮＡｓｅｑ遺伝子数とＣｐＧサイトメチル化との相関を、ＳＴＡＴＡ／ＳＥ １４．２（ＳｔａｔａＣｏｒｐ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ）を使用して実施した。
【0027】
統計解析を、ＳＴＡＴＡ／ＳＥ １４．２で実施した。各コホートについて、単変量解析を実施し、分布特性を決定し、及び欠陥データのランダム性を評価した（最終的な予後パネルリスクファクタースコアに含まれる変数は、欠測値が５％未満であったため、インピュテーションを実施しなかった）。主要転機（５年追跡時の生存状態[生存対死亡]）との二変量解析は、結果変数との候補変数（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）（関連する臨床的及び人口統計学的リスク因子の詳細なスクリーニングからの研究者の選択に基づく）について実施した。連続変数について、カットオフは、カットオフが臨床的に意味を成すことを確認するために、マニュアル調整によって検出されたカイ２乗相互作用を用いて導き出された。スコアの単純性を最大化しながら、再帰分割を使用し、最終的な非分子スコアリングシステムを導き出し、最終セルにおいて誤分類された値の数を最小化することを目的に５年追跡時の生存状態を予測した。各決定ノードにおけるオッズ比率を、最も近い整数に丸めて、スコアを作成した。導き出されたリスクスコアの動作特性を、発見コホート（内部コホート、ｎ＝５１５）及び検証コホート（ＴＣＧＡ、ｎ＝５８）の両方で計算した。受信者動作曲線下の面積（ＡＵＲＯＣ）に相当する、前記コンコーダンス統計量（ｃ-統計量）を、使用し、早期死亡及び罹患のリスクにおいてＯＳＣＣ患者を予後するために導入されたリスク因子スコアを用いたモデルの識別及び適合を評価した。ｃ-統計量の範囲は、０．５（ランダムコンコーダンス）～１（完全コンコーダンス）である。
【0028】
ＤＮＡメチル化に基づく、前記ＲＥＳＯＮスコアの分子構成要素を、メチル化状態遷移マトリックスに従って開発した。各ＣｐＧサイトについて、β値が０．３未満は非メチル化状態、０．３３～０．７５はヘミメチル化状態、及び＞０．７５は完全メチル化状態を示した。メチル化レベルが、メチル化されていない状態からよりメチル化されている状態へと移動した場合、遺伝子は、高メチル化されたとみなされた。逆に、メチル化レベルがより低い状態に変化した場合、遺伝子は低メチル化されたとみなされた。状態変化のないメチル化の変化は、重要とはみなされなかった。前記ＲＥＳＯＮスコアを、それぞれの非分子的危険因子及び分子的危険因子の有無を組み合わせることにより、定められた。前記ｃ-統計量を、前記個人のＲＥＳＯＮスコアを用いて、５年後に観察された生存状態と５年後に予後された生存状態とを比較することにより、上記のように導き出した。
【0029】
サンプル採取方法を、ＯＳＣＣの非侵襲的で強固な評価方法を実施するために開発した。相関を、臨床バイオマーカー研究においてブラシスワブを用いたＤＮＡメチル化マークのロバスト性を決定するために各患者の癌及び正常の組織並びにブラシスワブサンプル間で計算した。
【0030】
３人のＯＳＣＣ患者が、癌及び対側の正常の組織及びブラシスワブ生検の採取を受け、各患者について合計４サンプルを採取した。エピゲノムワイドＤＮＡメチル化定量化を、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔXT Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑプラットフォームを用いて実施した。ＤＮＡの質及びメチル化部位の分解能を、ブラシスワブ及び組織サンプル間で比較した。前記患者を、生物学的サンプル及び臨床病理学的情報が収集される多施設プロスペクティブ臨床研究に登録した。臨床データ及びサンプルの収集は、ロマリンダ大学（ＬＬＵ）、イリノイ大学シカゴ校（ＵＩＣ）、及びアラバマ大学バーミンガム校（ＵＡＢ）を含む各施設の治験審査委員会により承認を得た。患者は、１８歳以上であり、口腔舌、上顎及び下顎歯肉、硬口蓋、口腔底部、頬粘膜、並びに唇粘膜を含む、口腔サブサイトの生検診断での扁平上皮癌を持ち、かつ、ＯＳＣＣの治療歴がない場合に、患者は適格とされた。臨床病期及び病理学的病理を、対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）第８版ステージングマニュアルに基づき記録した。以下の情報：年齢、性別、人種、喫煙及び飲酒、段階、腫瘍部位、病理学的特徴、並びに腫瘍除去以外に受けた治療法を、カルテレビューから収集した。手術時に採取された生物学的サンプルは、瞬間冷凍した癌及び対側の正常の組織、並びに癌部位及び対側の正常部位のブラシスワブ生検を含む。Ｉｓｏｈｅｌｉｘブラシスワブ（Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、癌部位又は対側の正常部位で、スワブの各表面に１０回ずつ、合計２０回ブラッシングした。前記ブラシスワブを、５００μｌＢｕｃｃａｌＦｉｘTM安定化溶液（Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して保存した。サンプルは、-８０℃で保存した。
【0031】
合計３人の患者を、今回の研究については進行中のプロスペクティブ臨床研究から無作為に選んだ。ＤＮＡを、３人の患者の癌側及び対側の正常側の瞬間冷凍された組織及びブラシスワブから抽出し、合計１２サンプル（患者１人につき４サンプル）であった。ゲノムＤＮＡの質を、分光光度法で決定し、及び濃度を、蛍光光度法で決定した。ＤＮＡの完全性及び断片サイズを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で動くマイクロ流体チップを用いて決定した。
【0032】
インデックス付きペアエンド全ゲノムシーケシングライブラリーを、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ Ｍｅｔｈｙｌ-Ｓｅｑ ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて調製した。ゲノムＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｅ２２０システムを用いて１５０～２００ｂｐの断片長にせん断した。せん断化したサンプルのサイズ分布を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｓｙｓｔｅｍ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて決定した。断片化したＤＮＡ末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリマー及びポリヌクレオチドキナーゼで修復し、並びに“Ａ”塩基を、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いて付加した後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビードベースの精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）をした。前記メチル化されたアダプターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰでビーズ精製された。アダプターライゲーションされたＤＮＡの質及び量を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸシステムで評価した。サンプルを、カスタムＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｍｅｔｈｙｌ-Ｓｅｑ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｂｒａｒｙを使用することにより標的メチル化部位を濃縮した。ハイブリダイゼーションを、サーマルサイクラーを使用し、６５℃で１６時間実施した。濃縮が完了したら、前記サンプルを、ストレプトアビジンコートビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、及び一連のバッファーで洗浄し、非特異的ＤＮＡフラグメントを除去した。ＤＮＡフラグメントを、０．１Ｍ ＮａＯＨでビーズから抽出した。濃縮されたＤＮＡの非メチル化Ｃ残基は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ-Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、バイサルファイト変換を行った。前記ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮ライブラリー及びバイサルファイト変換ライブライリーは、カスタムメイドプライマー（ＩＤＴ）を用いてＰＣＲ増幅を行った。デュアルインデックライブラリーを、Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量化し、及び挿入物のサイズ分布を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸシステムを用いて評価した。サンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ＮｏｖａＳｅｑの１００ｂｐペアエンドシーケンシングを用いて、イルミナプロトコルに従って配列決定した。ポジティブコントロール（調製したバクテリオファージＰｈｉ Ｘライブラリー）を、各レーンに０．３％の濃度で添加し、リアルタイムでシーケンスクオリティを評価した。
【0033】
シグナル強度を、システムのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、各実行中に個々のベースコールに変換した。サンプルデマルチプレキシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’Ｓ ＣＡＳＡＶＡ１．８．２ソフトウェア一式を用いて実行した。前記サンプルのエラーレートは、１％未満及びレーン内のサンプル当たりリード分布が、妥当な許容誤差以内であることを要求された。シーケンスデータの質を、ＦａｓｔＱＣ（ｖｅｒ．０．１１．８）を用いて調査した。品質の悪いアダプターシーケンス及びフラグメントを、Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ（ｖｅｒ．０．６．３＿ｄｅｖ）により除去した。Ｂｉｓｍａｒｋ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ（ｖｅｒ．ｖ０．２２．１＿ｄｅｖ）を使用し、デフォルトのパラメータでバイサルファイトヒトゲノム（ｈｇ１９）にリードをアラインした。ヒトゲノムへのサンプルアラインメントを、ｂｏｗｔｉｅ ２（ｖｅｒ．２．３．５．１）を使用して実行した。クオリティトリミングされたペアエンドリードを、バイサルファイト順鎖（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｔｒａｎｄ）リード（Ｃ-＞Ｔ変換）又は逆鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ）リード（Ｇ-＞Ａ変換）に変換した。複製されたリードを、Ｂｉｓｍａｒｋマッピング出力から除去し、及びＣｐＧを抽出した。全てのＣｐＧサイトを、シーケンスカバレッジ（すなわち、リード深度）によりグループ化し；カバレッジ≧１０ｘ深度のＣｐＧサイトは、高いＭＣ-Ｓｅｑデータ品質を保証するために、解析に保持された。遺伝子を、Ｈｏｍｅｒ ａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ．ｐｌを用いてアノテーションした。このソフトウェアで、前記プロモーター領域を、転写開始部位（ＴＳＳ）から１キロ塩基と定義する。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲプロセスを、適用し、ＣｐＧサイトごとのｐ値を調整した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関を、解剖学的部位を一致させた組織サンプル及びブラシスワブサンプル間、並びに同一患者の癌サンプル及び正常サンプル間で計算した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関及び絶対差を、前記サンプル間の共通のＣｐＧサイトの間で計算した。ＭＣ-Ｓｅｑで測定された全てのＣｐＧサイトからβ値の相関を示す散布図を、表示した。癌部位及び正常部位について、組織とブラシスワブとの間のこれらのＣｐＧサイトの一致を示す別の散布図を、示す。スチューデントｔ検定を実施し、癌グループ及び正常グループ、又は組織グループ及びブラシスワブグループの間のβ値を比較した。癌グループ対正常グループにおける最も顕著な１，０００個のＣｐＧの特徴を選択した。これらの結果に基づき、-ｌｏｇ１０（ｔ検定 ｐ値）を、１，０００個のＣｐＧサイトごとに計算し、（１）癌対正常、及び（２）組織対ブラシスワブの間で、これら１，０００個のＣｐＧについて検定統計量の有意性の相違の程度を比較した。統計解析を、Ｒ環境（ｖ．４．１．０）で実施した。
【0034】
５年生存しなかった早期ＯＳＣＣ患者におけるメチル化が異なる遺伝子を明らかにしたメチル化アレイ解析
解析の基準を満たすＣｐＧサイトを持つ４，５４４遺伝子のうち、１２個の遺伝子が、０．１未満の調整されたｐ値を示した（表２）。遺伝子の位置及びメチル化の倍率変化の値を、示す。ここで低い生存率の予測である各遺伝子の前記メチル化傾向を、過去の研究で低い生存率の予測である遺伝子発現傾向と比較して示す。参照した研究のＰＭＩＤを含む。それらは、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＮＪＬ、ＧＰＲ１３３、ＨＧＦＡＣ、ＨＯＲＭＡＤ２、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１、及びＷＤＲ８６を含む。
解析の基準を満たすＣｐＧサイトを持つ４，５４４遺伝子のうち、１２個の遺伝子が、０．１未満の調整されたｐ値を示した（表２）。遺伝子の位置及びメチル化の倍率変化の値を、示す。ここで低い生存率の予測である各遺伝子の前記メチル化傾向を、過去の研究で低い生存率の予測である遺伝子発現傾向と比較して示す。参照した研究のＰＭＩＤを含む。それらは、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＣＣＮＪＬ、ＧＰＲ１３３、ＨＧＦＡＣ、ＨＯＲＭＡＤ２、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１、及びＷＤＲ８６を含む。
【0035】
【表2】
【0036】
図２は、ヒートマップであり、及び異なるメチル化遺伝子の階層的クラスタリングは、高リスク対低リスクのＯＳＣＣ患者における明確なメチル化シグネチャーを示す。図２は、ヒートマップを用いて、上位１２個の異なるメチル化遺伝子の５８個のＴＣＧＡの患者のサンプルのそれぞれのメチル化状態を示している。癌が原因で５年後までに死亡した患者を、ヒートマップの左側にグループ分けし、５年後まで生存した患者と比較してメチル化シグネチャーに顕著な差がある。
【0037】
１２個の遺伝子のそれぞれの文献探索は、ＳＯＸ８を除いて、いずれの遺伝子も、ヒト又は前臨床研究のいずれにおいてもＯＳＣＣと過去に関連付けられていないことが明らかにした。表２において、各遺伝子を、癌の生存率の低さを示す参照された臨床研究と関連付ける。ＳＮＰｓ又は過剰メチル化のどちらかを介するＨＯＲＭＡＤ２の異常調節は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び甲状腺癌における低い生存率の原因とみなされる。ＭＹＬＫ過剰発現は、膀胱癌、結腸直腸癌、及び肝細胞癌における生存率の低さと関連している。ＧＰＲ１３３発現は、多形膠芽腫を持つ患者の生存率と逆相関している。ＳＯＸ８の役割は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及びｉｎ ｖｉｖｏモデル、並びにＯＳＣＣの臨床サンプルを用いて既に調査されている。臨床研究において、ＳＯＸ８は、舌ＳＣＣを持つ化学療法抵抗性の患者で過剰発現しており、並びにリンパ節移転の高度化、進行した腫瘍の病期、及び全生存期間の短縮と関連している。同様に、ＳＯＸ８の高発現は、子宮内膜癌を持つ患者における高腫瘍組織悪性度、リンパ節移転、及び全生存期間の短縮と関連している。癌におけるＴＲＰＡ１発現は、議論の的になっており、遺伝子の過剰発現は上咽頭癌における低い生存率と関連し、及び遺伝子の過小発現は腎明細胞癌における低い生存率と関連している。しかしながら、国際癌ゲノムコンソーシアムのデータを使用する研究は、遺伝子のＴＲＰファミリーは、異なる癌の種類によって異なる発現をし、及びいくつかのＴＲＰ遺伝子は、他の遺伝子よりも強い予後予測能を持っていることを示す。ＡＴＰ結合カセットトランスポーターのスーパーファミリーの膜結合タンパク質をコードするＡＢＣＡ２は、低い生存率を有する卵巣上皮癌及び急性リンパ症白血病の患者で過剰発現している。ＨＧＦＡＣの発現は、乳管癌及び卵巣癌における生存率と直接相関している。ＷＤＲ８６の発現は、結腸直腸癌及び乳癌における低い生存率に関連する。胃癌、肺癌及び卵巣癌を含む固形腫瘍の臨床研究では、ＣＡＣＮＡ１Ｈを含むＴ型カルシウムチャネル遺伝子の発現は、生存率についての予後のシグネチャーとして使用される。ＲＮＦ２１６の発現は、結腸直腸癌及び卵巣癌における低い生存率と関連しているが、過剰発現又は過小発現が生存率を低下させるのかは、不明である。ＣＣＮＪＬの発現は、肝細胞癌における生存率と逆相関する。
【0038】
注目すべきは、１２個の遺伝子のメチル化の差は、いずれのタイプの癌においても低い生存率と以前に関連していなかったことである。ＨＯＲＭＡＤ２及びＨＧＦＡＣを除いて、これらの候補遺伝子について公表された研究は、メチル化よりもむしろ差次的遺伝子発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に焦点を当てている。
【0039】
ＲＥＡＳＯＮスコアの予後予測能
前記ＲＥＡＳＯＮスコアを、１０個の因子の非分子のパネルと１３個のＣｐＧを含む１２個の遺伝子のメチル化パネルとを組み合わせることにより計算し、各遺伝子のメチル化状態を、メチル化状態遷移マトリックスを用いて決定した。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、５年の疾患特異的死亡率をｃ-ｉｎｄｅｘ＝０．９１５と予測した。
前記ＲＥＡＳＯＮスコアを、１０個の因子の非分子のパネルと１３個のＣｐＧを含む１２個の遺伝子のメチル化パネルとを組み合わせることにより計算し、各遺伝子のメチル化状態を、メチル化状態遷移マトリックスを用いて決定した。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、５年の疾患特異的死亡率をｃ-ｉｎｄｅｘ＝０．９１５と予測した。
【0040】
異なるメチル化遺伝子の機能的解析
遺伝子発現データは、５８人のＴＣＧＡ ＯＳＣＣ患者のＤＮＡメチル化データのうち５５人について利用可能であった。ますます理解されつつあるように、遺伝子の過剰メチル化は、遺伝子発現の減少又は増加をもたらすことができ、これはＴＣＧＡサンプルで観察された。各遺伝子における遺伝子発現及びＤＮＡメチル化の間に顕著な相関を、１２個の遺伝子のうち６遺伝子（ＡＢＣＡ２[ｒ＝０．４６、ｐ＝０．０００５]、ＧＰＲ１３３[ｒ＝０．４２、ｐ＝０．００１５]、ＭＣＰＨ１[ｒ＝０．３１、ｐ＝０．０２４]、ＲＮＦ２１６[ｒ＝－０．３８、ｐ＝０．００４５]、ＴＲＰＡ１[ｒ＝－０．６０、ｐ＜０．０００１]、ＷＤＲ８６[ｒ＝０．３６、ｐ＝０．００７２]）で観察した。さらに、遺伝子ネットワーク解析を、公表されているデータベースを用いて実施し、前記１２個の候補遺伝子が、確立されたシグナル伝達ネットワークに直接関連しているかどうかを決定した。表３は、候補遺伝子に関連する前記ＫＥＧＧパスウェイを詳述する。
遺伝子発現データは、５８人のＴＣＧＡ ＯＳＣＣ患者のＤＮＡメチル化データのうち５５人について利用可能であった。ますます理解されつつあるように、遺伝子の過剰メチル化は、遺伝子発現の減少又は増加をもたらすことができ、これはＴＣＧＡサンプルで観察された。各遺伝子における遺伝子発現及びＤＮＡメチル化の間に顕著な相関を、１２個の遺伝子のうち６遺伝子（ＡＢＣＡ２[ｒ＝０．４６、ｐ＝０．０００５]、ＧＰＲ１３３[ｒ＝０．４２、ｐ＝０．００１５]、ＭＣＰＨ１[ｒ＝０．３１、ｐ＝０．０２４]、ＲＮＦ２１６[ｒ＝－０．３８、ｐ＝０．００４５]、ＴＲＰＡ１[ｒ＝－０．６０、ｐ＜０．０００１]、ＷＤＲ８６[ｒ＝０．３６、ｐ＝０．００７２]）で観察した。さらに、遺伝子ネットワーク解析を、公表されているデータベースを用いて実施し、前記１２個の候補遺伝子が、確立されたシグナル伝達ネットワークに直接関連しているかどうかを決定した。表３は、候補遺伝子に関連する前記ＫＥＧＧパスウェイを詳述する。
【0041】
【表3】
【0042】
表４は、遺伝子オントロジーカテゴリー（すなわち、生物学的サンプル、細胞内コンパートメント、分子機能）によって集約される候補遺伝子に関連するＧＯパスウェイを詳述する。ＧＯアノテーションに基づく、差次的にメチル化されたパスウェイ（ｐ値＜０．０５に調整された）を示す。差次的にメチル化されたパスウェイを、生物学的プロセス（ＢＰ）、分子機能（ＭＦ）、及び細胞内コンパートメント（ＣＣ）のオントロジーに基づいて評価した。予後パネルに含まれる１２個の異なるメチル化遺伝子のいずれかを含むパスウェイを、同定する。
【0043】
【表4-1】
【表4-2】
【0044】
１２個の異なるメチル化遺伝子のうちの７個（すなわち、ＡＢＣＡ２、ＣＡＣＮＡ１Ｈ、ＭＣＰＨ１、ＭＹＬＫ、ＲＮＦ２１６、ＳＯＸ８、ＴＲＰＡ１）は、統計的に重要な差次的メチル化パスウェイにマップした。複数の関連する差次的メチル化パスウェイにマップされた異なるメチル化遺伝子間の複雑な関連性を、遺伝子セットの濃縮ドットプロット及び遺伝子コンセプトネットワークプロットを用いて可視化した（図３Ａ及び図３Ｂ）。図３Ａ及び３Ｂは、機能的ネットワーク解析マッピングによる表現である。機能的濃縮解析は、３つの概念に集約されるパスウェイ上の異なるメチル化遺伝子の集合体を同定する。図３Ａは、最も差次的にメチル化されたパスウェイの上位１０位に位置する異なる濃縮された遺伝子のドットプロットである（ｐadjusted＜０．０５）。図３Ｂは、灰色の円で識別される統計的に最も差次的にメチル化されたパスウェイの上位３つ、及び構成遺伝子の異なるメチル化における倍率変化を、各遺伝子についてネガティブ（緑）からポジティブ（赤）までの倍率変化で色分けした図である。各円のサイズは、遺伝子数に基づく。
【0045】
ＣＡＣＮＡ１Ｈ及びＭＹＬＫは、１９の統計的に差次的にメチル化されたパスウェイのうち５つに位置付けた（ｐadjusted＜０．０５、表３）。ＲＥＡＳＯＮ分類に含まれる１２個の異なるメチル化遺伝子のうち、これら２つ（ＣＡＣＮＡ１Ｈ及びＭＹＬＫ）は、差次的メチル化経路の上位３つ：向神経活性リガンド受容体相互作用、モルヒネ依存、及びカルシウムシグナル伝達経路に位置付ける。
【0046】
早期ＯＳＣＣの低い生存率の予測に高い精度を示すＲＥＡＳＯＮスコア
前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、１２個の遺伝子のメチル化シグネチャーと同様に、非分子の臨床病理学的因子に依存する。ＯＳＣＣにおけるこれまでのメチル化研究では、ＯＳＣＣの予後を示すとしてこれらの１２個の遺伝子のいずれも同定されていない。ＳＯＸ８を除いて、パネル内の前記遺伝子は、これまでＯＳＣＣと関連していなかった。しかしながら、これらの遺伝子のいくつかは、発癌において重大な役割を果たすとしてしっかりと確証されていないが、全１２個の遺伝子は、患者組織の遺伝子関連研究において、他の癌の生存と関連している。しかし、発現のプロファイルは、ＯＳＣＣについて予測するメチル化プロファイルと一致していない。
前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、１２個の遺伝子のメチル化シグネチャーと同様に、非分子の臨床病理学的因子に依存する。ＯＳＣＣにおけるこれまでのメチル化研究では、ＯＳＣＣの予後を示すとしてこれらの１２個の遺伝子のいずれも同定されていない。ＳＯＸ８を除いて、パネル内の前記遺伝子は、これまでＯＳＣＣと関連していなかった。しかしながら、これらの遺伝子のいくつかは、発癌において重大な役割を果たすとしてしっかりと確証されていないが、全１２個の遺伝子は、患者組織の遺伝子関連研究において、他の癌の生存と関連している。しかし、発現のプロファイルは、ＯＳＣＣについて予測するメチル化プロファイルと一致していない。
【0047】
登録した３人の患者の臨床病理学的情報を、表４ａ及び４ｂに詳述する。前記３人の患者は、早期及び後期ＯＳＣＣ（Ｉ期及びＩＶ期）の両方を含み、並びにタバコ及びアルコールの摂取習慣は様々であった。患者の年齢は、４９歳及び６８歳であった。２人の患者は男性であり、及び１人は女性であった。全ての患者は、白人で、非ヒスパニック系であった。
【0048】
【表5】
【表6】
【0049】
表４ａ及び４ｂは、３人の患者の人口統計学的及び臨床病理学的情報を示している。略語：Ｆ＝女性、Ｍ＝男性、ＴＮＭ＝腫瘍、リンパ節、転移の分類。
【0050】
手術時に採取した癌及び対側の正常の組織及びブラシスワブ生検は、ＤＮＡ抽出を行い、その収量及び質を表５に示した。各サンプルの総投入量は３０μＬで、組織のＤＮＡの総投入量は、１８７ｎｇ～６６０ｎｇの範囲であり、及び平均は３９０ｎｇであった。スワブのＤＮＡ総投入量は、５１ｎｇ～１９９８ｎｇの範囲であり、平均は５３２ｎｇであった。投入範囲は、この範囲でＭＣ-Ｓｅｑを用いたＣｐＧサイトの定量が再現可能であることを示した結果と一致した。ここに示すように、１５０～３００ｎｇという少ないＤＮＡの量及び表５の所見と匹敵するＤＮＡの質が、本明細書に記載の方法を用いることでうまく増幅した。表５は、組織生検及びブラシスワブ生検の配列決定の入力として使用されるゲノムＤＮＡの特性を示す。
【0051】
【表7】
【0052】
分光光度法及び蛍光光度法で評価した前記ＤＮＡ濃度及び質、並びに各サンプルの総ＤＮＡ投入量を、表５に示す。Ｃ＝癌、Ｎ＝正常である。
【0053】
ＭＣ-Ｓｅｑマッピングの効率評価
表６は、各生物学的サンプルのマッピング効率を詳述する。ＭＣ-Ｓｅｑ配列を使用すると、全サンプルにわたって９０％の平均マッピング効率で参照ゲノムにマッピングした。各サンプルのＭＣ-Ｓｅｑ結果を、表６に示す。前記最後の２行は、全てのスワブのサンプル及び全ての組織のサンプルについての平均値を示す。Ｃ＝癌、Ｎ＝正常である。
表６は、各生物学的サンプルのマッピング効率を詳述する。ＭＣ-Ｓｅｑ配列を使用すると、全サンプルにわたって９０％の平均マッピング効率で参照ゲノムにマッピングした。各サンプルのＭＣ-Ｓｅｑ結果を、表６に示す。前記最後の２行は、全てのスワブのサンプル及び全ての組織のサンプルについての平均値を示す。Ｃ＝癌、Ｎ＝正常である。
【0054】
図４Ａは、１０倍のカバレッジで変曲点を示す全てのＣｐＧにおける、カバレッジのグラフ表示である。組織サンプルとブラシスワブサンプルとの間のマッピング効率に著しい差はなかった（図４Ａ）。図４Ｂは、癌被験者及び正常者のスワブサンプル及び組織サンプルの両方で定量されたＣｐＧの数のグラフ表示である。カットオフとして１０倍の読み取り深度を用い、定量されたＣｐＧサイトの数を、各サンプルにおいて決定した。ペアになったブラシスワブ及び組織の間のマッピング効率における平均差は、最小は-０．５６７％で、組織サンプルに有利で、範囲は-１．９～１．７％であった。メチル化されたＣの大部分は、ＣｐＧコンテキストに出現した。各ＣＰＧの読み取りの深度を、全てのクエリされたＣＰＧにわたってグラフ化し、及び１０倍のカバレッジでの変曲点を示した（図４Ｂ）。これらの結果は、以前の提示された結果と同様であり、ＣｐＧサイトの大部分は、少なくとも１０倍のカバレッジを示した。このカットオフを適応し、少なくとも１０倍のカバレッジを持つＣｐＧサイトに解析を集中させた。少なくとも１０倍のカバレッジを持つＣｐＧの平均数は、スワブサンプルについて２，７１６，６７４個、及び組織サンプルについて２，９０４，２６１個であり、２つのサンプルタイプ間に著しい差はなく、ＤＮＡメチロームを測定するために最も一般的に使用されるツールであるＩｌｌｕｍｉｎａ ＥＰＩＣアレイよりも３倍多いＣｐＧが調査された。図４Ｃは、ブラシスワブ及び組織の平均マッピング効率のグラフ表示である。図４Ｃは、１２個の個人のサンプルのそれぞれについて、少なくとも１０倍のカバレッジを有するＣｐＧの数を示す。前記平均マッピング効率は、ブラシスワブで８９．４５％であり、及び組織で９０％であり、２つのサンプリング方法の間で著しい差はなかった。
【0055】
メチローム領域の分布
ＭＣ-ＳｅｑでプロファイルされたＣｐＧサイトの分布を、全１２個のサンプル（３，５６６，８４３ＣｐＧ）にわたって重複する１０倍の読みの深度以上でうまく測定されたＣｐＧサイトの中で決定した。
ＭＣ-ＳｅｑでプロファイルされたＣｐＧサイトの分布を、全１２個のサンプル（３，５６６，８４３ＣｐＧ）にわたって重複する１０倍の読みの深度以上でうまく測定されたＣｐＧサイトの中で決定した。
【0056】
図４Ｄは、ＭＣ-ＳｅｑによってプロファイルされたＣｐＧの相対的な遺伝子位置（左）及びプロファイルされたＥＰＩＣアレイによってカバーされたＣｐＧの相対的な遺伝子位置（右）のセットの円グラフ表示である。ＭＣ-Ｓｅｑは、ＥＰＩＣアレイよりも機能的遺伝子領域をより確実にカバーした。図４Ｄは、３６％がイントロン、２６％がプロモーター、１９％がエクソン、１９％が遺伝子間領域であったことを示している。全体として、ＭＣ-Ｓｅｑは、ＥＰＩＣアレイによって一般的に提供されるよりもメチロームにおける機能的遺伝子領域のより強固なカバレッジを提供し、ＥＰＩＣアレイよりもプロモーター領域及びエクソンにおいて１０倍より多くのＣｐＧサイトを検出した。ＥＰＩＣアレイからの４８４，６９７個のＣｐＧのうち、４５０Ｋにおいても発見された大部分を、ＭＣ-Ｓｅｑにより少なくとも１０倍のカバレッジでプロファイルした。これらＣｐＧの内訳は、３３％のイントロン、３３％のプロモーター、１５％のエクソン、及び１９％の遺伝子間領域であったが、機能的遺伝子領域におけるＣｐＧの総数は、カバレッジがより限られているため、比例して少なかった（図４Ｄ）。
【0057】
一致した解剖学的部位からのブラシスワブ及び組織生検の相関性
全体として、全サンプルにわたるＣｐＧサイトメチル化間の相関は高く、全て９０％を上回っていた。全サンプル（癌＋対照）（ｓ＝３，５６６，８４３）で共有された全てのＣｐＧサイト中の組織及びブラシスワブ（ｎ＝１２）間の相関の平均は、９３．２％（９５％信頼区間：９３．２３％、９３．２５％）であった。癌サンプル中で共有される全てのＣｐＧサイトにおける組織及びブラシスワブ（ｎ＝６）間の平均相関は、９１．３％（９５％信頼区間：９１．３２％、９１．３５％）であった。正常サンプル中で共有される全てのＣｐＧサイトにおける組織及びブラシスワブ（ｎ＝６）間の平均相関は、９５．１％（９５％信頼区間：９５．１３％、９５．１４％）であった。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ３人の患者の癌部位及び正常部位についての組織及びブラシスワブ生検の相関を示す散布図である。相関値を記載している。１０倍カバレッジのＣｐＧのこの散布図は、組織及びブラシスワブ間で高い一致を示していた（図５Ａ及び図５Ｂ）。
全体として、全サンプルにわたるＣｐＧサイトメチル化間の相関は高く、全て９０％を上回っていた。全サンプル（癌＋対照）（ｓ＝３，５６６，８４３）で共有された全てのＣｐＧサイト中の組織及びブラシスワブ（ｎ＝１２）間の相関の平均は、９３．２％（９５％信頼区間：９３．２３％、９３．２５％）であった。癌サンプル中で共有される全てのＣｐＧサイトにおける組織及びブラシスワブ（ｎ＝６）間の平均相関は、９１．３％（９５％信頼区間：９１．３２％、９１．３５％）であった。正常サンプル中で共有される全てのＣｐＧサイトにおける組織及びブラシスワブ（ｎ＝６）間の平均相関は、９５．１％（９５％信頼区間：９５．１３％、９５．１４％）であった。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ３人の患者の癌部位及び正常部位についての組織及びブラシスワブ生検の相関を示す散布図である。相関値を記載している。１０倍カバレッジのＣｐＧのこの散布図は、組織及びブラシスワブ間で高い一致を示していた（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【0058】
癌サンプル及び正常サンプルの間では差はあるが、組織及びブラシスワブの間では差がない、上位のメチル化特徴
癌サンプル及び正常サンプルの間で最も変わりやすい上位１，０００のメチル化特徴が、解析の焦点であり、組織及びブラシスワブのサンプリング方法間で差がかなり少ないと予想される。図５Ｃは、ＭＣ-Ｓｅｑで定量化した癌サンプル及び正常サンプル間のメチル化の差のグラフ表示であり、箱ひげ図（中央値、四分位数、最大値及び最小値）を用いて可視化した。ｔ検定によるＣｐＧメチル化の差の各検定のｐ値を、-ｌｏｇ10（ｐ値）で表し、及び癌対正常の平均は、３．６７（すなわち、ｐ＝０．０００２１）であった。同じＣｐＧサイトは、メチル化に差はなく、組織対ブラシスワブの間で平均-ｌｏｇ10（ｐ値）＝０．９６（すなわち、ｐ＝０．１１）であった。前記結果は、ブラシスワブが、組織生検の臨床的に実行可能な代替となることを示唆している。
癌サンプル及び正常サンプルの間で最も変わりやすい上位１，０００のメチル化特徴が、解析の焦点であり、組織及びブラシスワブのサンプリング方法間で差がかなり少ないと予想される。図５Ｃは、ＭＣ-Ｓｅｑで定量化した癌サンプル及び正常サンプル間のメチル化の差のグラフ表示であり、箱ひげ図（中央値、四分位数、最大値及び最小値）を用いて可視化した。ｔ検定によるＣｐＧメチル化の差の各検定のｐ値を、-ｌｏｇ10（ｐ値）で表し、及び癌対正常の平均は、３．６７（すなわち、ｐ＝０．０００２１）であった。同じＣｐＧサイトは、メチル化に差はなく、組織対ブラシスワブの間で平均-ｌｏｇ10（ｐ値）＝０．９６（すなわち、ｐ＝０．１１）であった。前記結果は、ブラシスワブが、組織生検の臨床的に実行可能な代替となることを示唆している。
【0059】
Ｍ値の偏りは、ＤＮＡメチル化を測定するために採用される方法の標準的な定性的な診断である。Ｍ値の偏りを、配列決定されたＤＮＡ鎖の関数として調査した（Ｒ１は“順”鎖、及びＲ２は同配列であるが“逆”鎖からのものである）。Ｍ値の偏りは、特徴的なプロファイルを持ち、前記Ｒ１鎖は、鎖の大部分で高いシーケンスカバレッジを示す一方で、逆鎖からのカバレッジは低く及び減衰が早い。図６Ａ～６Ｌは、特徴的なＭ値のバイアスが、正常サンプルと比較した癌サンプル、並びに組織生検と比較したブラシスワブ生検において一貫していることを示す、代表的なＭ-バイアスのカバレッジプロットである。各サンプル（サンプル１、サンプル２、及びサンプル３）に対する４つのパネル（図６Ａ～６Ｄ、図６Ｅ～６Ｈ、及び図６Ｉ～６Ｌ）のセットは、本質的に同一である。これらのデータは、ＤＮＡの供給源及びサンプルの病理学的状態が、Ｍ値の偏り、及び推定により収集されたＤＮＡメチル化データの質に影響しないことを証明する。
【0060】
癌患者におけるＥＷＡＳ研究は、エピゲノムにおける個人間の変動性を同定しており、及び手頃な価格のＥＷＡＳテクノロジーの最近の利用の可能度は、臨床転帰の予測をし得る異なるメチル化特徴を同定することを目的としたエピジェネティックバイオマーカー研究の急速な増加につながっている。最も一般的に使用されているプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ４５０Ｋ及びＩｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣアレイのようなアレイベースであり、エピゲノム中のＣｐＧサイトの限定的なカバレッジを与える。全ゲノムバイサルファイトシーケンス（ＷＧＢＳ）は、エピゲノムプロファイリングのための最も包括的な方法であり、２８００万のＣｐＧを捕捉する。しかしながら、前記コスト、集中的なワークフロー、並びに高品質及び大量のＤＮＡインプットの必要性は、特に癌治療における、その臨床的なトランスレータビリティ（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）を著しく制限する。ＭＣ-Ｓｅｑは、アレイ及びＷＧＢＳの間の有望な手段として浮上しており、ＮＧＳを使用して、アレイベースのプラットフォームよりも著しく多くのＣｐＧを捕捉する一方、ＷＧＢＳよりもハイスループット及び手頃な価格であるという利点を有する。本明細書で示すように、ＭＣ-Ｓｅｑは、ＥＰＩＣアレイのようなアレイベースのプラットフォームよりも信頼性が高く、及び効率的なエピゲノムプロファイリングのためのプラットフォームである。前記ＥＰＩＣアレイ及びＭＣ-Ｓｅｑを、末梢血単核細胞サンプルで比較したところ、ＭＣ-Ｓｅｑは、ＥＰＩＣアレイよりもコーディング領域及びＣｐＧアイランドにおいて著しく多くのＣｐＧを捕捉した。前記ＥＰＩＣアレイは、サンプルにつき８４６，４６４個のＣｐＧサイトを捕捉したのに対して、ＭＣ-Ｓｅｑは、サンプルにつき３，７０８，５５０個のＣｐＧサイトを捕捉した。両方のプラットフォームに捕捉された４７２，５４０個のＣｐＧサイトのうち、メチル化状態に高い相関性（ｒ＝０．９８－０．９９）があった。さらに、前記ＥＰＩＣアレイは、発癌における既知の役割を持つ遺伝子に富んでいるが、ＭＣ-Ｓｅｑは、より不可知論的な方法（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｎｎｅｒ）でメチル化を定量し、及び前記ＥＰＩＣアレイよりも３～４倍多くのＣｐＧをプロファイルし、癌における新規エピジェネティック修飾を発見できる可能性がより高くなる。さらに、各遺伝子内の前記カバレッジ領域は、前記ＥＰＩＣアレイ、及びＰＣＲ又はパイロシークエンジングのような他の一般的に使用されるメチル化解析技術よりも包括的であった。本明細書で開示されるのは、ＭＣ-Ｓｅｑに関する方法であり、この技術の全体的なプロファイリング能力がより高いため、機能的な遺伝子領域内のより著しく多いＣｐＧサイトを捕捉した。ハイスループット能力及びカバレッジの深さは、ＭＣ-Ｓｅｑを臨床環境で使用されるＣＬＩＡ承認見込み（臨床検査室改善修正法）プラットフォームを充当するようにする。
【0061】
これらのメチル化バイオマーカー研究の臨床解釈は、以下の理由：１）ＯＳＣＣを他の頭頸部癌のサブサイト（すなわち、中咽頭、下咽頭、喉頭）と組み合わせ、ＯＳＣＣを明確な臨床疾患として認識できない不均一な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）コホートを作り出すこと、並びに２）限られたＣｐＧの数にクエリする、アレイベースのプラットフォームにだけ依存することにより、制限されている。結果として、これらの研究のいずれからも、高い予後予測能を有するメチル化バイオマーカーを生み出していない。臨床病理学的データと組み合わせたメチル化シグネチャーを、使用し、早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣの５年以内の死亡率を予測するためのリスクスコアを開発し、前記リスクスコアは、Ｃ統計量＝０．９１５である死亡率を正確に予測した。前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、診断後に５年間生存した早期ＯＳＣＣ患者対死亡した早期ＯＳＣＣ患者の間で上位１２個の異なるメチル化遺伝子を利用した。これらの特定の遺伝子のメチル化の差は、ＯＳＣＣの転帰と相関していた。
【0062】
他の頭頸部からの明確な臨床的サブサイトであることに加えて、口腔は、非侵襲的な生検技術が容易に利用できる解剖学的部位である。バイオマーカーの臨床解釈は、治療中に測定できることを必要とする。ホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織を腫瘍除去後まで待つことは、必要な治療が遅れる可能性がある。唾液及びブラシスワブの両方を使用し、診断時にＯＳＣＣ細胞を非侵襲的にサンプリングする。唾液を、生物学的サンプルとして使用し、ＯＳＣＣのメチル化バイオマーカーを同定した。しかしながら、唾液及び癌組織の間のメチル化の一致は、非常に変化しやすい。
【0063】
本明細書に開示される実施態様は、ブラシスワブ及びＭＣ-Ｓｅｑを使用するＯＳＣＣの評価方法を含み、診断時のメチル化シグネチャーを決定する。一致した部位からのブラシスワブ生検及び組織生検は、高度に相関したメチル化シグネチャーを有していた。ブラシスワブサンプルの前記ＤＮＡの質及び量は、ＭＣ-Ｓｅｑを実施するのに十分であった。マッピング効率は、組織及びブラシスワブの間で同等であった。ペアになった組織及びブラシスワブの間に高い相関があり、及び十分なＤＮＡを得られたことを考慮すると、ブラシスワブは、組織生検の臨床的に強固な代替となる。ＭＣ-Ｓｅｑは、ＣｐＧサイトのより広いカバレッジを提供し、及びサンプルベースの相関が、２つのプラットフォーム間で高かった（ｒ＝０．９８）。従って、ブラシスワブの採取は、リスク層別化のためのメチル化シグネチャーを決定するための非侵襲的な方法である。
【0064】
口腔癌の生存率は、過去４０年間改善されていない。実際、世界的にＯＳＣＣの発生率は、増加傾向にある。世界中の２２の癌登録の疫学研究では、舌癌の発生率は、喫煙又は飲酒の従来の危険因子を持たない４５歳未満の若い女性で急増している。ＯＳＣＣは、ヒトパピロマーウイルス（ＨＰＶ）によるものではなく、新たに診断された症例の大部分が、ＨＰＶ陽性と関連している中咽頭ＳＣＣとは異なる。ＨＰＶ陽性の中咽頭ＳＣＣは、ＨＰＶ陰性の疾患よりも生存率が顕著に良好であり、放射線癌療法グループ（ＲＴＯＧ）０１２９試験のレトロスペクティブ解析では、３年の全生存率が８２．４％であったのに対し、ＨＰＶ陰性群では５７．１％に過ぎなかった。ＨＰＶ陽性の中咽頭ＳＣＣの全生存率は、この特定の疾患のサブセットを対象とした臨床試験で９０％まで上昇した。同様に、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ-１）阻害薬であるニボルマブ、及びプログラム細胞死（ＰＤ-Ｌ１）阻害薬であるペムブロリズマブのＦＤＡ承認の後、頭頸部ＳＣＣにおける第４の治療法としての免疫療法の導入は、特にＨＰＶ陽性の中咽頭ＳＣＣにおいて、標準的な化学療法及び放射線療法からの治療を“徐々に緩和する（ｄｅ-ｅｓｃａｌａｔｅ）”ための第１の手段として免疫療法を使用する多数の臨床試験を明らかにした。不運にも、免疫療法は、腫瘍微小環境に免疫細胞が豊富に存在し、免疫原性の高い頭頸部癌の１２～２０％にしか効果がないが、ＯＳＣＣは、免疫原性が低く、及びその結果、治療が困難である。これらの理由のため、ＯＳＣＣ患者は、頭頸部癌の治療における最近の進歩にも関わらず、低い生存率が続いている。特定の実施態様において、前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、患者に対する適切な治療を決定する際に、現在の臨床ガイドラインの補助的な尺度として使用される。前記ＲＥＡＳＯＮスコアのカットオフは、生存曲線に基づいて決定される。
【0065】
乳癌におけるバイオマーカー研究を反映して、頭頸部癌の研究者は、ＯＳＣＣ患者に対して治療をより適切に調整するための多重遺伝子リスクスコアを開発しよう試みている。これまでの研究は、異なる遺伝子発現、遺伝子の増幅及び欠損、メチル化、並びにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を潜在的なバイオマーカーとして用いてきた。本明細書における実施態様とは対照的に、治療の段階的な拡大から恩恵を受ける高リスク患者を同定し、研究の大部分は、頸部転移のリスクを予測するバイオマーカー開発することにより過剰治療を防ぐことに主として焦点を合わしている。現在、早期ＯＳＣＣ患者の大部分（最大８０％）は、頸部転移をしていない。しかしながら、これらの患者の２０％以上は、潜在的な（すなわち、臨床検査及び臨床画像で検出できない）頸部転移がある。計算論的モデル研究、レトロスペクティブ研究、及び予防的頸部リンパ節切除を受けた早期ＯＳＣＣ患者と経過観察で管理された患者とを比較した１つの大規模なプロスペクティブ臨床試験を含む、幾多の刊行物はすべて、不顕性転移の２０％以上のリスクは、予防的頸部リンパ節切除がない場合の低い生存率の前兆となることを示している。結果として、たとえ予防的頸部リンパ節切除が、肩機能障害、神経損傷及びリンパ浮腫を含む合併症（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を伴う患者の最大８０％に対して過剰治療を伴うとしても、早期ＯＳＣＣ患者にとって予防的頸部リンパ節切除を受けることが現在の治療の標準となっている。この臨床実践は、患者をリスク層別化する、より微妙なアプローチを開発する必要がある。しかしながら、現在まで、臨床で使用できるほど高い精度で頸部転移のリスクを予測する分子シグネチャーは存在しない。早期ＯＳＣＣの低い生存率を予測するバイオマーカーが必要である。
【0066】
頸部郭清術を徐々に緩和するためのバイオマーカーに焦点を当てるのではなく、本明細書に開示された方法は、早期ＯＳＣＣ患者における低い生存率のバイオマーカーを開発することに向けられており、治療の段階的な拡大から恩恵を受け得る高リスク患者を同定することを意図している。本研究で開発された前記ＲＥＡＳＯＮスコアは、早期ＯＳＣＣ患者の５年後までの死亡リスクを０．９１５のｃ-ｉｎｄｅｘで予測する。前記リスクスコアは、非常に変わりやすい疾患において意味のあるバイオマーカーを発見する可能性を最大化するために、特に口腔のサブサイトに焦点を当て、大規模な内部コホートと一般に公開されているＴＣＧＡデータの両方を活用して開発された。内部コホート及び一般に公開されているコホートを利用して、１２個の遺伝子のメチル化シグネチャーを持つ顕著な臨床病理学的因子を導き出し、５年以内に死亡するリスクの高い早期（Ｉ／ＩＩ）ＯＳＣＣ患者の特定において高い予後予測能を有する複合分子／非分子のＲＥＡＳＯＮスコアを作成する。
【0067】
技術革新の特定の実施態様が、半明細書に開示され、及び説明されてきたが、そのような実施態様が例示としてのみ提供されることは、当業者にとって明らかだろう。前述の実施態様は、例示的な実施例である。多数の変形、変更、及び代替が生じ、並びに本技術革新の要旨及び範囲から外れることなく、当業者に利用可能であろう。本明細書に記載された実施態様に対する様々な代替が、本技術革新の１つ以上の態様を実施する際に採用され得ることを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3A-B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A-D】
【図6E-H】
【図6I-L】
【図7】
【国際調査報告】