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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-24
(54)【発明の名称】Ｔ細胞を標的とするＡＡＶベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240117BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240117BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20240117BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240117BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240117BHJP
C07K 14/015 20060101ALN20240117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/35
C12N5/10
A61K35/76
C07K14/015
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542960
(86)(22)【出願日】2022-01-14
(85)【翻訳文提出日】2023-08-04
(86)【国際出願番号】 US2022012542
(87)【国際公開番号】W WO2022155482
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】63/137,497
(32)【優先日】2021-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】322005747
【氏名又は名称】ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ジェームズ ケノン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA10
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB21
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA20
(57)【要約】
本開示は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質、及びＡＡＶカプシド、及びそれを含むウイルスベクターを提供する。本明細書に記載のウイルスベクターは、天然のＡＡＶカプシド配列と比較して、目的の標的細胞、例えばＴ細胞における形質導入を増加させ得る。本開示はまた、本開示のウイルスベクター及びウイルスカプシドを細胞またはそれを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１７～２３のいずれか１つの配列を有する形質導入関連ペプチドを含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項2】
前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項3】
前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０に対応するアミノ酸を置換する、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項4】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項5】
カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１の配列を含み、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０が配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）を含む形質導入関連ペプチドによって置換されている、前記組換えＡＡＶベクター。
【請求項6】
Ｘ１がＧではなく、Ｘ２がＳではなく、Ｘ３がＡではなく、Ｘ４がＱではなく、Ｘ５がＮではなく、Ｘ６がＫではなく、及び／またはＸ７がＤではない、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項7】
Ｘ１がＨ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｖ、またはＳである、請求項５～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項8】
Ｘ２がＡまたはＴである、請求項５～７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項9】
Ｘ３がＰまたはＴである、請求項５～８のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項10】
Ｘ４がＲまたはＤである、請求項５～９のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項11】
Ｘ５がＶ、Ｑ、Ｃ、ＳまたはＤである、請求項５～１０のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項12】
Ｘ６がＥ、ＡまたはＰである、請求項５～１１のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項13】
Ｘ７がＥ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである、請求項５～１２のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項14】
Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＶであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＥである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項15】
Ｘ１がＭであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項16】
Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＣであり、Ｘ６がＡであり、Ｘ７がＮである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項17】
Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＴである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項18】
Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項19】
Ｘ１がＶであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＰであり、Ｘ７がＡである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項20】
Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ４６がＥであり、Ｘ７がＮである、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項21】
前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項22】
前記カプシドタンパク質が配列番号１に対して約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項23】
前記カプシドタンパク質が配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項24】
カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１６のアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含み、前記形質導入関連ペプチドが配列番号１に対してアミノ酸４５４～４６０を置換する、前記組換えＡＡＶベクター。
【請求項25】
前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項26】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれか１つの配列を有する組換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、核酸。
【請求項27】
前記核酸が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群から選択される配列を含む、請求項２６に記載の核酸。
【請求項28】
前記核酸がＤＮＡ配列である、請求項２６または２７に記載の核酸。
【請求項29】
前記核酸がＲＮＡ配列である、請求項２６または２７に記載の核酸。
【請求項30】
請求項２６～２９のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項31】
請求項２６～２９のいずれか１項に記載の核酸、または請求項３０に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項32】
前記カプシドタンパク質によってカプシド封入されたカーゴ核酸をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項33】
前記カーゴ核酸が治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする、請求項３２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項34】
前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞への形質導入の増加を示す、請求項３２～３３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項35】
前記細胞がＴ細胞である、請求項３４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項36】
前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す、請求項３５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項37】
前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す、請求項３５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項38】
請求項１～２５もしくは３２～３７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の核酸、請求項３０に記載の発現ベクター、または請求項３１に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項39】
請求項３１に記載の細胞または請求項１～２５もしくは３２～３７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項40】
ＡＡＶベクターを細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項１～２５または３２～３７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターと接触させることを含む、前記方法。
【請求項41】
前記細胞の接触がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記細胞がＴ細胞である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項43】
請求項１～２５または３２～３７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターの有効量を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
【請求項44】
請求項１～２５または３２～３７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターとｅｘ ｖｉｖｏで接触させた細胞を対象に投与することを含む、治療を必要とする前記対象を治療する方法。
【請求項45】
前記対象が哺乳動物である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項46】
前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
医薬品として使用するための、請求項１～２５または３２～３７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項48】
治療を必要とする対象を治療する方法における使用のための、請求項１～２５または３２～３７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１３７，４９７号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１３７，４９７号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のバリアントカプシドタンパク質、ならびにそれを含むウイルスカプシド及びウイルスベクターに関する。特に、本開示は、ウイルスベクターに組み込まれ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／またはｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞の増強された細胞形質導入の表現型を付与することができるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質及びそれを含むＡＡＶカプシドに関する。
【0003】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＳＴＲＤ＿０２２＿０１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、記録日：２０２２年１月１３日、ファイルサイズ約１６３．４キロバイト）。
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＳＴＲＤ＿０２２＿０１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、記録日：２０２２年１月１３日、ファイルサイズ約１６３．４キロバイト）。
【背景技術】
【0004】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のディペンドウイルス属に属する小型の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、多くの細胞及び組織タイプに感染する能力、病原性の欠如、免疫原性の低さ、及び非分裂細胞を効果的に形質導入する能力により、遺伝子治療のための有望なウイルスベクターである。既知のＡＡＶ血清型はそれぞれ、特定の細胞タイプに感染する能力に差がある。
【0005】
Ｔ細胞を標的とするＡＡＶの使用に関心が集まっている。例えば、Ｔ細胞を標的とするＡＡＶは、Ｔ細胞疲弊を予防、制限、及び／または逆転させるための遺伝子治療法に使用することができる。Ｔ細胞疲弊は、多くの慢性感染症及びがんにおいて生じるＴ細胞機能不全の状態であり、ＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を低減することも示されている。しかしながら、ＡＡＶは典型的には、Ｔ細胞を高レベルで形質導入しない。
【0006】
したがって、当該技術分野においては、Ｔ細胞を標的とし、形質導入効率を増強させることができる改善されたＡＡＶベクターが必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、１つ以上の形質導入関連ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、ならびにそれを含むＡＡＶカプシド及びウイルスベクターに関する。開示された形質導入関連ペプチドは、Ｔ細胞などの所望の細胞タイプへのＡＡＶベクターの細胞形質導入を増強することができる。
【0008】
本開示は、カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、該カプシドタンパク質が配列番号１７～２３のいずれか１つの配列を有する形質導入関連ペプチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０に対応するアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含む。
【0009】
本開示は、カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、該カプシドタンパク質が配列番号１の配列を含み、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０が配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）を含む形質導入関連ペプチドによって置換されている、組換えＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＧではなく、Ｘ２はＳではなく、Ｘ３はＡではなく、Ｘ４はＱではなく、Ｘ５はＮではなく、Ｘ６はＫではなく、及び／またはＸ７はＤではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨ、Ｍ、Ａ、Ｑ、ＶまたはＳである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＡまたはＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ３はＰまたはＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ４はＲまたはＤである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＶ、Ｑ、Ｃ、Ｓ、またはＤである。いくつかの実施形態では、Ｘ６はＥ、Ａ、またはＰである。いくつかの実施形態では、Ｘ７はＥ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＥである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＭであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＣであり、Ｘ６はＡであり、Ｘ７はＮである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＳであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＰであり、Ｘ７はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＳであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＳであり、Ｘ４６はＥであり、Ｘ７はＮである。
【0010】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号１に対して約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0011】
本開示は、カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、該カプシドタンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含み、該形質導入関連ペプチドが、配列番号１に対してアミノ酸４５４～４６０を置換する、組換えＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【0012】
本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれか１つの配列を有する組換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡ配列である。本開示は、本明細書に開示される核酸のいずれか１つを含む発現ベクターを提供する。本開示はさらに、本明細書に開示される核酸のいずれか１つ、または本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つを含む細胞を提供する。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターのいずれか１つは、カプシドタンパク質によってカプシド封入されたカーゴ核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、該カーゴ核酸は、治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターは、形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターは、形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターは、形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す。
【0014】
本開示は、本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターのいずれか１つ、本明細書に開示される核酸のいずれか１つ、本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つ、または本明細書に開示される細胞のいずれか１つ、を含む組成物を提供する。本開示はさらに、本明細書に開示される細胞のいずれか１つ、または本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターのいずれか１つ、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0015】
本開示は、ＡＡＶベクターを細胞に送達する方法であって、該細胞を本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つと接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞の接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。本開示は、有効量の本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つを対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つとｅｘ ｖｉｖｏで接触させた細胞を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。本開示は、医薬品として使用するための、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つを提供する。本開示はまた、治療を必要とする対象の治療方法における使用のための、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つを提供する。
【0016】
これらの実施形態及び他の実施形態については、以下の発明を実施するための形態でさらに詳しく述べる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】野生型ＡＡＶ６と比較した、バリアントカプシドを含む様々なＡＡＶベクターについて、実施例２に記載の製造プロセスを用いて得られた合計ベクターゲノム（ｖｇ）の体積収量を示す。
【図2】野生型ＡＡＶ６または示されたＡＡＶ６カプシドバリアントを含むＡＡＶベクターのいずれかを形質導入されたＴ細胞の顕微鏡分析からの画像を示す。各ＡＡＶベクターはＧＦＰ導入遺伝子をパッケージングした。画像は、示されている異なる感染多重度（ＭＯＩ）を用いてＡＡＶベクターを細胞に形質導入した後に得た。
【図3】ＧＦＰ導入遺伝子をパッケージングした野生型ＡＡＶ６またはＧＦＰ導入遺伝子をパッケージングしたバリアントカプシドを含む示されたＡＡＶのいずれかを形質導入したＴ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。Ａは、試験した細胞試料のサイズ及び粒度（すなわち、前方散乱と側方散乱）を示し、そこから目的の細胞集団（図上の丸で囲まれた部分）を特定した。Ｂは、分析のために選択された細胞集団のみのサイズ及び粒度を示す。Ｃは、目的の細胞集団について測定された蛍光（ＦＩＴＣ）シグナルを示す。野生型ＡＡＶ６を形質導入した細胞と比較して、ＳＴＲＤ－２０７カプシドを含むＡＡＶベクターを形質導入した細胞では蛍光の増加があった。
【図4】野生型ＡＡＶ６または示されているカプシドバリアントを含むＡＡＶのそれぞれを用いて実施したフローサイトメトリー実験から得られたＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合（％）のプロットを示す。Ｔ細胞は２人の異なるヒトドナー（ドナー１１及びドナー１２）由来であった。異なるＭＯＩを、示されているように使用した（ドナー１２のＴ細胞では１０，０００、５，０００、及び２，５００、ドナー１１のＴ細胞では１５，０００、７，５００、及び３，７５０）。
【図5】実施例１に記載されているＴ細胞の形質導入のための３回の進化及び選択後に、活性化Ｔ細胞の核画分（Ａ）及び細胞質画分（Ｂ）から得られたバリアントカプシドを含む個々のＡＡＶの単離株を表すバブルプロットである。各バブルは別個のカプシドタンパク質のアミノ酸配列を表し、バブルの半径は各ライブラリーにおけるそのバリアントのリード数に比例する。Ｙ軸はリードの絶対数を表す。データは、視覚化しやすいようにｘ軸に沿って広がっている。優勢な単離株をシークエンシング解析のために選択した。
【発明を実施するための形態】
【0018】
特に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の発明を実施するための形態で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限するように意図するものではない。
【0019】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、論文、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の受託番号、及び他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
【0020】
本開示及び添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドタンパク質中のすべてのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１カプシドサブユニットのナンバリングに関するものである。当業者であれば、本明細書に記載される修飾は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に挿入された場合、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３カプシドサブユニットにおける修飾をもたらし得ることを理解するであろう。あるいは、カプシドサブユニットを独立して発現させて、カプシドサブユニットのうちの１つまたは２つのみ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３、またはＶＰ２＋ＶＰ３）において修飾を行うことができる。
【0021】
定義
以下の用語が、本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
以下の用語が、本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
【0022】
単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明確に示さない限り、複数形も含むことが意図されている。
【0023】
さらに、「約」という用語は、本明細書で使用する場合、測定可能な値、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の量または長さ、用量、時間、温度などに言及する場合に、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0024】
また、本明細書で使用する場合、「及び／または」とは、関連する列挙事項のうちの１つ以上を考え得る形で組み合わせたもののすべてと、択一形式（「または」）で解釈したときには、組み合わせたものが含まれないことを指すとともに、これらを包含する。
【0025】
文脈上、別段に示されていない限り、本明細書に記載されている様々な特徴は、任意の組み合わせで用いることができることが明確に意図されている。
【0026】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に示されている任意の特徴または特徴を組み合わせたものを除外または省略できることも本開示は想定している。さらに例示すると、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及び／またはＶから選択され得ることを本明細書が示している場合、この文言はまた、これらのアミノ酸（複数可）の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、Ｉ、またはＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ、またはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから、そのような各々の副次的組み合わせが本明細書に明示的に記載されているかのように、アミノ酸が選択され得ることも示す。さらに、そのような文言はまた、指定されたアミノ酸のうちの１つ以上が除外され得ることも示す。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ａ、Ｇ、またはＩではない；Ａではない；ＧまたはＶではないなど、そのような考えられ得る各除外項目が本明細書に明示的に記載されているかのようになる。
【0027】
本明細書で使用する場合、「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減」という用語及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％以上の減少を意味する。
【0028】
本明細書で使用する場合、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強」という用語及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％以上の増加を示す。
【0029】
「パルボウイルス」という用語は、本明細書で使用する場合、自律的に複製するパルボウイルス及びディペンドウイルスを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科を包含する。自律性パルボウイルスには、Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｂｏｃａｐａｒｖｉｒｕｓ属、及びＤｅｎｓｏｖｉｒｕｓ亜科のメンバーが含まれる。例示的な自律性パルボウイルスには、限定されないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、及び現在知られているか、または後に発見される任意の他の自律性パルボウイルスが含まれる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００７０５－０１３－１９１４－Ｉ）を参照のこと。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、脊椎動物、例えば哺乳動物を指すために互換的に使用される。哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジー）、またはヒトであり得る。ｉｎ ｖｉｖｏで得られた、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された対象の組織、細胞、またはそれらの誘導体も包含される。ヒト対象は、成人、ティーンエイジャー、小児（２歳～１４歳）、乳児（１ヶ月～２４ヶ月）、または新生児（１ヶ月まで）であり得る。いくつかの実施形態では、成人は、約６５歳以上、または約６０歳以上の高齢者である。いくつかの実施形態では、対象は、妊婦または妊娠を計画している女性である。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の方法を「必要としている」。
【0030】
本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ３２．３３型、ＡＡＶｒｈ８型、ＡＡＶｒｈ１０型、ＡＡＶｒｈ７４型、ＡＡＶｈｕ．６８型、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及び現在知られているか、または後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。多くのＡＡＶ血清型及びクレードが特定されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３－：３７５－３８３；及び表２を参照のこと）。
【0031】
本明細書で使用する場合、「キメラＡＡＶ」という用語は、２つ以上の異なる血清型のＡＡＶ由来の領域、ドメイン、及び／または個々のアミノ酸を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶを指す。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶ血清型に由来する第１の領域、及び第２のＡＡＶ血清型に由来する第２の領域から構成されるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶ血清型に由来する第１の領域、第２のＡＡＶ血清型に由来する第２の領域、及び第３のＡＡＶ血清型に由来する第３の領域から構成されるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／またはＡＡＶ１２のうちの２つ以上に由来する領域、ドメイン、個々のアミノ酸を含み得る。例えば、キメラＡＡＶは、以下（表１）に示される第１及び第２のＡＡＶ血清型からの領域、ドメイン及び／または個々のアミノ酸を含み得、表中、ＡＡＶＸ＋Ｙは、ＡＡＶＸ及びＡＡＶＹに由来する配列を含むキメラＡＡＶを示す。
【表1】
【0032】
複数のＡＡＶ血清型からの個々のアミノ酸または領域を１つのカプシドタンパク質に含めることによって、複数のＡＡＶ血清型に別々に由来する複数の所望の特性を有するカプシドタンパク質を得ることができる。
【0033】
様々な血清型のＡＡＶ及び自律性パルボウイルスのゲノム配列、ならびに天然の末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。このような配列は、文献、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１ ８６２、ＡＡＢ９５４５０．１、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照のこと（これらの開示は、参照により、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸配列及びアミノ酸配列を教示する目的で、本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５－３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；及び米国特許第６，１５６，３０３号も参照のこと（これらの開示は、参照により、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸配列及びアミノ酸配列を教示する目的で、本明細書に組み込まれる）。表２も参照のこと。自律性パルボウイルス及びＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）にさらに詳細に説明されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ９（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６９４７－６９５８）、ＡＡＶ８（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０－１２２７１）、ＡＡＶ６（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９４５－１２９５７）、ＡＡＶ５（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１１１８７－１１１９９）、ＡＡＶ４（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６－１１５７０）、ＡＡＶ３Ｂ（Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０３：２６－３６）、ＢＰＶ（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６０３－２６１４）、及びＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０及びＴｓａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照のこと。
【表2-1】
【表2-2】
【0034】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ウイルス産生細胞株を使用して培養で産生することができる。「ウイルス産生細胞（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）」、「ウイルス産生細胞株」、または「ウイルス産生細胞（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）」という用語は、ウイルスベクターを産生するのに使用される細胞を指す。ＨＥＫ２９３細胞及び２３９Ｔ細胞は、一般的なウイルス産生細胞株である。以下の表８は、様々なウイルスベクターのための例示的なウイルス産生細胞株を列挙する。ｒＡＡＶの産生は、典型的には細胞において３つのエレメント：１）ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する導入遺伝子、２）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、ならびに３）ヘルパーウイルスタンパク質配列、の存在を必要とする。これらの３つのエレメントは、１つ以上のプラスミド上で提供され、細胞にトランスフェクションされるか、または形質導入され得る。
【表3】
【0035】
本明細書で使用する場合、「感染多重度」または「ＭＯＩ」という用語は、細胞と接触するビリオンの数を指す。例えば、培養細胞は、１細胞当たり約１×１０２～約１×１０５個のビリオンの範囲のＭＯＩでＡＡＶと接触することができる。
【0036】
「形質導入」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸（例えば、導入遺伝子）がウイルスベクターによって細胞に導入されるプロセスを指す。本明細書では、ウイルスベクターに組み込まれ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増強された細胞形質導入の表現型を付与することができる修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、バリアントカプシドタンパク質）及びそれを含むカプシドについて記載する。本明細書で使用する場合、「増強された形質導入」、「増強された細胞形質導入」、及び類似の用語は、約１．５倍～約１００倍、またはそれ以上の形質導入の増加を指し得る。例えば、形質導入は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、またはそれ以上増加し得る。修飾されたＡＡＶ（例えば、カプシドバリアントを含むＡＡＶ）の形質導入は、野生型ＡＡＶベクターまたは天然ＡＡＶベクターと比較して増強され得る。いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドを含むＡＡＶベクターの形質導入は、形質導入関連ペプチドを欠く以外は同一であるＡＡＶベクターと比較して増強され得る。
【0037】
「導入遺伝子」という用語は、細胞の形質導入に使用される任意の核酸配列を指し、ｅｘ ｖｉｖｏで維持される細胞であっても、生物内の細胞であってもよい。導入遺伝子は、コード配列、非コード配列、ｃＤＮＡ、遺伝子またはその断片もしくは一部、ゲノム配列、調節エレメントなどであり得る。「トランスジェニック」生物、例えば、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物は、導入遺伝子が送達または導入された生物であり、該導入遺伝子は、トランスジェニック生物内で発現して産物を産生することができ、その存在により、生物において効果（例えば、治療効果または有益な効果）及び／または表現型（例えば、所望の表現型または改変された表現型）が付与され得る。
【0038】
「トロピズム」という用語は、本明細書で使用する場合、ウイルスが特定の細胞または組織に優先的に侵入し、任意選択で、その後、ウイルスゲノムに担持される配列（複数可）の発現（例えば、転写及び任意選択で翻訳）をその細胞内で行うこと、例えば、組換えウイルスでは、目的の異種核酸（複数可）の発現を行うことを指す。
【0039】
ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは別段に調節される核酸配列では、トランス作用因子の非存在下では開始しない場合があることは当業者には明らかであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合、そのウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定に組み込まれたプロウイルス、組み込まれないエピソーム、及びそのウイルスが細胞内で取り得る任意の他の形態から行うことができる。
【0040】
本明細書で使用する場合、「全身性トロピズム」及び「全身性形質導入」（ならびに同等の用語）とは、それぞれ、本開示のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、全身の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓及び／または膵臓）に対してトロピズムを示すか、または形質導入することを示す。いくつかの実施形態では、筋肉組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋及び心筋）の全身性形質導入が観察される。いくつかの実施形態では、骨格筋組織の全身性形質導入が行われる。例えば、いくつかの実施形態では、全身の本質的にすべての骨格筋が形質導入される（ただし、形質導入の効率は、筋肉の種類によって変動し得る）。いくつかの実施形態では、四肢筋、心筋及び横隔膜筋の全身性形質導入が行われる。任意選択で、ウイルスカプシドまたはウイルスベクターは、全身経路（例えば、静脈内、関節内またはリンパ内などの全身経路）を介して投与される。
【0041】
あるいは、いくつかの実施形態では、カプシドまたはウイルスベクターは、局部（例えば、足蹠部に、筋肉内に、皮内に、皮下に、局所的に）送達される。
【0042】
別段に示されていない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的なトロピズム」、または類似の用語は、好適な対照を参照することによって判断することができる（例えば、対照の形質導入またはトロピズムの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｔ細胞、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（膵島β細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮及び／または平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞及び／または腎臓に対して、効率的な形質導入を行うか、または効率的なトロピズムを有する。好適な対照は、所望のトロピズムプロファイルを含む様々な要因によって決定されることになる。いくつかの実施形態では、好適な対照は野生型または天然ウイルスである。
【0043】
同様に、ウイルスが、標的組織に対して「効率的な形質導入を行わない」か、もしくは「効率的なトロピズムを有さない」か、または類似の用語については、好適な対照を参照することによって判断することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、性腺及び／または生殖細胞に対して効率的な形質導入を行わない（すなわち、効率的なトロピズムを有さない）。いくつかの実施形態では、組織（複数可）（例えば肝臓）への望ましくない形質導入は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋及び／または中枢神経系の細胞）の形質導入のレベルの２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
【0044】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、別段に示されていない限り、ペプチド及びタンパク質の両方を包含する。
【0045】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドの配列であり得る（天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）が、代表的な実施形態では、一本鎖ＤＮＡ配列または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
【0046】
本明細書で使用する場合、「単離」ポリヌクレオチド（例えば、「単離ＤＮＡ」または「単離ＲＮＡ」）とは、天然に存在する生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の構成要素、例えば、細胞もしくはウイルスの構造的な構成要素、または一般的にそのポリヌクレオチドと関連して見られる他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離」ヌクレオチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
【0047】
同様に、「単離」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の構成要素、例えば、細胞もしくはウイルスの構造的な構成要素、または一般的にそのポリペプチドと関連して見られる他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、「単離」ポリペプチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
【0048】
本明細書で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法的に同等な語）とは、ウイルスベクターを、出発物質中の少なくともいくつかの他の構成要素から、少なくとも部分的に分離することを意味する。いくつかの実施形態では、「単離」ウイルスベクターまたは「精製」ウイルスベクターは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
【0049】
本明細書で使用する場合、「形質導入関連ペプチド」という用語は、ＡＡＶベクターに組み込まれ、任意の細胞へのＡＡＶベクターの形質導入を改変させ得る短いアミノ酸配列を指す。形質導入関連ペプチドは、ＡＡＶベクターの形質導入に何らかの影響を与え得る。例えば、いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、目的の標的細胞へのＡＡＶベクターの形質導入を増加させる。いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、標的とされていない細胞へのＡＡＶベクターの形質導入を減少させる。形質導入関連ペプチドは、既存のＡＡＶカプシド配列に挿入されてもよく（すなわち、配列中のアミノ酸の正味の数の増加を生じさせる）、またはＡＡＶカプシド配列の既存の部分を置換してもよい（すなわち、配列内のアミノ酸の数の正味の変化を生じさせない、または低減する）。
【0050】
「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」とは、細胞もしくは対象におけるタンパク質の不在または欠損に起因する症状を緩和し、低減し、予防し、遅延し及び／または安定させることができるポリペプチドであり、及び／または別段の形で対象に利益、例えば抗がん作用、もしくは移植生存性の向上をもたらすポリペプチドである。
【0051】
「治療する」、「治療すること」、または「～の治療」という用語（及びその文法的変形表現）とは、対象の状態の重症度を低減し、少なくとも部分的に改善し、もしくは安定させること、及び／または少なくとも１つの臨床症状をいくらか緩和、軽減、減少もしくは安定化させること、及び／または疾患もしくは障害の進行の遅延が存在することを意味する。「対象」という用語は、「患者」という用語と交換可能に用いられる。
【0052】
「予防する」、「予防すること」及び「予防」（ならびにその文法的変形表現）とは、対象における疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生を予防及び／または遅延すること、及び／または疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生の重症度を、本開示の方法を行わない状態で見られる重症度よりも低減することを指す。予防は、完全なもの、例えば、疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）が完全に存在しないことであり得る。予防は、部分的であってもよく、対象における疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生、及び／または発生の重症度が、本開示を行わない状態で生じ得るものよりも低くなるような予防であり得る。
【0053】
「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、疾患または疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを治療するために対象に投与したときに、疾患またはその症状のそのような治療に影響を及ぼすのに十分な量を指す。「治療有効量」は、例えば、疾患及び／またはその疾患の症状、疾患及び／または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療される患者の年齢、体重及び／または健康状態、ならびに処方医の判断に応じて変動し得る。任意の所定の場合における適切な量は、当業者が確認し得るか、または常法的な実験によって決定することができる。
【0054】
本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えばウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、いくつかの文脈では、「ベクター」という用語は、そのベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指すために用いられる場合もある。
【0055】
「アデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」は、典型的には、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシドによってカプシド封入された核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含む。「ＡＡＶカプシド」は、約６０個の「ＡＡＶカプシドタンパク質」（本明細書では互換的に「ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット」または「カプシドタンパク質」と称される）を含むほぼ球形のタンパク質シェルであり、会合してＴ＝１の正二十面対構造をとる。本明細書に記載されるＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドは、複数のＡＡＶカプシドタンパク質を含む。ＡＡＶベクターがＡＡＶカプシドタンパク質を含むと記載される場合、該ＡＡＶベクターがＡＡＶカプシドを含み、該ＡＡＶカプシドが１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質を含むことが理解されるであろう。「ウイルス様粒子（ｖｉｒａｌ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」または「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」という用語は、移入カセットまたは導入遺伝子を含む任意のベクターゲノムまたは核酸を含まないタンパク質カプシドを指す。「ＡＡＶベクター」、「ＡＡＶカプシド」、及び「ＡＡＶカプシドタンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用される場合がある。文脈に基づいて、当業者であれば、使用される特定の用語の意味を容易に推測できるであろう。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、「移入カセット」を含む核酸、すなわち、ＡＡＶベクターによって細胞に送達され得る１つ以上の配列を含む核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は自己相補的である（すなわち、二本鎖である）。いくつかの実施形態では、核酸は自己相補的ではない（すなわち、一本鎖である）。
【0057】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、１つ以上の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターでは概して、ウイルスの生成には、シスの末端反復（複数可）（ＴＲ（複数可））のみが必要となる。他のすべてのウイルス配列は、必須ではなく、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングできる導入遺伝子のサイズを最大化するために、１つ以上のＴＲ配列のみを保持することになる。構造タンパク質及び非構造タンパク質のコード配列は、トランスで供給され得る（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはその配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことによって）。実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択で２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、その２つのＴＲは典型的には、ベクターゲノムの５’末端及び３’末端に位置して、異種核酸を挟むが、その異種核酸に連続する必要はない。ＴＲは、同じであっても、互いに異なっていてもよい。
【0058】
「末端反復」または「ＴＲ」という用語には、ヘアピン構造を形成して、逆位末端反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み及び／またはプロウイルスレスキューなどのような所望の機能を媒介する）任意のウイルス末端反復または合成配列が含まれる。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲであることも、非ＡＡＶ ＴＲであることもできる。例えば、非ＡＡＶ ＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの、または任意の他の好適なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）をＴＲとして使用することができ、該配列は切断、置換、欠失、挿入及び／または付加によってさらに修飾され得る。さらに、ＴＲは、部分的または完全に合成されたもの、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている「二重Ｄ配列」であり得る。
【0059】
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３を含むがこれらに限定されない任意のＡＡＶ、または現在知られているか、もしくは後に発見される任意の他のＡＡＶからであり得る（例えば、表２を参照のこと）。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、及び／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然のＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、切断、及び／またはミスセンス変異によって改変され得る）。
【0060】
本開示のウイルスベクターはさらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されるように、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向型トロピズムを有する）及び／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲ及びウイルスカプシドが異なるパルボウイルスからのものである）であり得る。
【0061】
本開示のウイルスベクターはさらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１（その開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、二本鎖パルボウイルス粒子であることができる。したがって、いくつかの実施形態では、二本鎖（デュプレックス）ゲノムを本開示のウイルスカプシドにパッケージングすることができる。
【0062】
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失及び／または置換を含む他の修飾を含むことができる。
【0063】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾形態、及び合成アミノ酸を包含する。
【0064】
天然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表３に示す。
【表4】
【0065】
あるいは、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基（非限定的な例を表４に示す）であることができ、及び／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化もしくは硫酸化）によって修飾されているアミノ酸であることができる。
【表5-1】
【表5-2】
【0066】
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、「非天然」アミノ酸であり得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９（２００６）に記載される）。有益なことに、これらの非天然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結させるのに使用することができる。
【0067】
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織及び細胞の関与」を特徴とする。これは、リンパ細網組織における免疫能のある細胞の分化及び増殖を伴い、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発達、またはその両方につながる。Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １ １７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。換言すると、感染またはワクチン接種によって免疫原に曝露された後、宿主によって能動免疫応答が開始される。能動免疫は、受動免疫と対比することができ、受動免疫は、能動免疫化宿主から非免疫宿主への予め形成された物質（抗体、移入因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移入によって獲得される。
【0068】
「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書で使用する場合、その免疫応答によって、疾患の発症を予防または低減するという点で、対象にある程度の利点をもたらすことを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療及び／または予防において有用であり得る（例えば、がんまたは腫瘍形成を予防することにより、がんまたは腫瘍を退縮させることにより、及び／または転移を予防することにより、及び／または転移性結節の成長を予防することにより）。治療の利点が任意のその欠点を上回る限り、防御効果は完全であっても部分的であってもよい。
【0069】
本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、「がん組織」という用語は、腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
【0070】
「がん」という用語は、当該技術分野において理解されている意味を有し、例えば、身体の離れた部位に拡散する（すなわち、転移する）可能性のある組織の無制御な増殖である。例示的ながんには、限定されないが、黒色腫、腺癌、胸腺癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、及び現在知られているか、または後に特定される任意の他のがんもしくは悪性状態が含まれる。代表的な実施形態では、本開示は、腫瘍形成がんの治療及び／または予防方法を提供する。
【0071】
「腫瘍」という用語はまた、当該技術分野において、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として理解されている。腫瘍は、悪性または良性であり得る。代表的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、悪性腫瘍を予防及び治療するために使用される。
【0072】
「がんを治療すること」、「がんの治療」という用語、及び同等の用語は、がんの重症度を低減するかもしくは少なくとも部分的に解消させること、及び／または疾患の進行を遅延させる及び／または制御すること、及び／または疾患を安定化させることが意図される。いくつかの実施形態では、これらの用語は、がんの転移を予防するか、低減するかもしくは少なくとも部分的に解消すること、及び／または転移性結節の成長を予防するか、低減するかもしくは少なくとも部分的に解消することを示す。
【0073】
「がんの予防」または「がんを予防すること」、及び同等の用語は、その方法が、がんの発症率及び／または重症度を少なくとも部分的に解消するもしくは低減する及び／または遅延させることが意図される。換言すれば、対象におけるがんの発症の可能性もしくは確率が低減される、及び／または発症が遅延され得る。
【0074】
修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質及びそれを含むカプシド
本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３）バリアント、ならびにそれを含むウイルスカプシド及びウイルスベクターを提供する。各カプシドバリアントは、１つ以上の形質導入関連ペプチドを含む。形質導入関連ペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質には存在せず、いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、目的の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）への形質導入の増強をもたらし得る。本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、現在知られているか、または後に発見される任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に対するバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質のバリアントである。
本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３）バリアント、ならびにそれを含むウイルスカプシド及びウイルスベクターを提供する。各カプシドバリアントは、１つ以上の形質導入関連ペプチドを含む。形質導入関連ペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質には存在せず、いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、目的の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）への形質導入の増強をもたらし得る。本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、現在知られているか、または後に発見される任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に対するバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質のバリアントである。
【0075】
ａ．ＡＡＶカプシドタンパク質の修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の形質導入関連ペプチドは、修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの様々な細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞）における細胞形質導入の増強を含むがこれらに限定されない１つ以上の望ましい特性を付与することができる。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子もしくはＡＡＶウイルスベクターと比較して、増強された細胞形質導入（例えば、増強されたＴ細胞の形質導入）を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶウイルス粒子またはベクターは、中和抗体を回避することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の形質導入関連ペプチドは、修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの様々な細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞）における細胞形質導入の増強を含むがこれらに限定されない１つ以上の望ましい特性を付与することができる。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子もしくはＡＡＶウイルスベクターと比較して、増強された細胞形質導入（例えば、増強されたＴ細胞の形質導入）を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶウイルス粒子またはベクターは、中和抗体を回避することもできる。
【0076】
本開示の形質導入関連ペプチドは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列を置換することができ、その結果、ＡＡＶカプシドタンパク質配列中のアミノ酸の数の正味の増減は生じない。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列を本開示の形質導入関連ペプチドで置換すると、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較してアミノ酸の正味の損失（例えば欠失）が生じ得る。例えば、形質導入関連ペプチドは、以下の血清型のいずれか１つ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶからのＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸を置換することができる。いくつかの実施形態では、本開示の形質導入関連ペプチドは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列に挿入され得、その結果、ＡＡＶカプシドタンパク質配列中のアミノ酸の数が増加する。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の修飾は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の、天然カプシド配列には存在しないアミノ酸による置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の修飾は、天然のカプシドタンパク質配列には存在しないアミノ酸による、以下のアミノ酸残基：４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、及び４６０の１つ以上の置換をもたらし、該アミノ酸ナンバリングは、野生型ＡＡＶ６カプシドタンパク質のＶＰ１配列、または任意の他のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応する残基に対するものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の修飾は、以下のアミノ酸残基：４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、及び４６０の１つ以上の欠失をもたらし、該アミノ酸ナンバリングは、野生型ＡＡＶ６カプシドタンパク質のＶＰ１配列、または任意の他のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応する残基に対するものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の修飾は、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸配列に対する、アミノ酸４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、及び／または４６０の１つ以上の置換をもたらす。
【0078】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）の形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）の形質導入関連ペプチドを含み、該カプシドタンパク質は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶ、のいずれか１つのものである。いくつかの実施形態では、配列番号１または２５～３４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）の形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質配列（例えば、配列番号１）の配列を含み、さらに、配列番号２４の形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質配列、例えば配列番号１、または２５～３４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の同一性、例えば少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１に対して約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0079】
配列番号２４の形質導入関連ペプチドを使用して、開示されたＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列の任意の場所にある１つ以上のアミノ酸残基を置換することができる。いくつかの実施形態では、配列番号２４の形質導入関連ペプチドを使用して、カプシドタンパク質の配列を置換することができ、該カプシドタンパク質は、配列番号１及び２５～３４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４の形質導入関連ペプチドは、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列に挿入され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質の天然配列を配列番号２４の形質導入関連ペプチドで置換すると、ＡＡＶカプシドタンパク質の配列から１つ以上のアミノ酸が欠失される場合がある。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０が配列番号２４を含む形質導入関連ペプチドにより置換されていることを除いて、配列番号１の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号２４は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質の配列を置換するために使用され、その結果得られる配列は、野生型配列には存在しない少なくとも１つ、２つ、３つなどの個々のアミノ酸を含むようになる。
【0080】
いくつかの実施形態では、配列番号２４は、Ｘ１がＧではなく、Ｘ２がＳではなく、Ｘ３がＡではなく、Ｘ４がＱではなく、Ｘ５がＮではなく、Ｘ６がＫではなく、及び／またはＸ７がＤではない配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｈ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｖ、またはＳである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＡまたはＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ３はＰまたはＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ４はＲまたはＤである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＶ、Ｑ、Ｃ、Ｓ、またはＤである。いくつかの実施形態では、Ｘ６はＥ、Ａ、またはＰである。いくつかの実施形態では、Ｘ７は、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＥである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＭであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＤであり、Ｘ５はＣであり、Ｘ６はＡであり、Ｘ７はＮである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＳであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＴである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＰであり、Ｘ７はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＳであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＳであり、Ｘ４６はＥであり、Ｘ７はＮである。
【0081】
いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７のアミノ酸配列を有し、Ｘ１＝Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、またはＳ；Ｘ２＝ＡまたはＴ；Ｘ３＝ＰまたはＴ；Ｘ４＝ＲまたはＤ；Ｘ５＝Ｖ、Ｑ、Ｃ、Ｓ、またはＤ；Ｘ６＝Ｅ、Ａ、またはＰ；及びＸ７＝Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである（配列番号１６）。いくつかの実施形態では、形質導入関連ペプチドは、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【0082】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドは、ＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸を置換する。本開示は、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質のバリアントであって、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含むアミノ酸配列を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質のバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１及び２５～３４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むが、１つ以上のアミノ酸は配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドで置換される。
【0083】
いくつかの実施形態では、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドは、配列番号１及び２５～３４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸を置換する。
【0084】
いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号１７～２３のいずれか１つの配列を含む形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号１７の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号１８の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号１９の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号２０の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号２１の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号２２の形質導入関連ペプチドによって置換される。いくつかの実施形態では、天然のＡＡＶ６カプシドタンパク質（例えば配列番号１）のアミノ酸４５４～４６０は、配列番号２３の形質導入関連ペプチドによって置換される。
【0085】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも約８０％同一な配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0086】
ｂ．ＡＡＶカプシドタンパク質の他の修飾
本開示は、修飾されるＡＡＶカプシドタンパク質が天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質または表２に示されるＡＡＶのいずれか）であり得ることが企図されるが、それらに限らない。当業者であれば、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する様々な操作が当該技術分野で既知であり、本開示は天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の修飾に限定されないことを理解するであろう。例えば、修飾されるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶと比較して既に改変されていてもよい（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または現在知られているか、もしくは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来する）。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、操作されたＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂであってもよい。このようなＡＡＶカプシドタンパク質もまた、本開示の範囲内である。
本開示は、修飾されるＡＡＶカプシドタンパク質が天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質または表２に示されるＡＡＶのいずれか）であり得ることが企図されるが、それらに限らない。当業者であれば、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する様々な操作が当該技術分野で既知であり、本開示は天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の修飾に限定されないことを理解するであろう。例えば、修飾されるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶと比較して既に改変されていてもよい（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または現在知られているか、もしくは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来する）。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、操作されたＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂであってもよい。このようなＡＡＶカプシドタンパク質もまた、本開示の範囲内である。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はキメラである。例えば、キメラＡＡＶカプシドタンパク質は、２つ以上のＡＡＶ血清型、または３つ以上のＡＡＶ血清型に由来する配列を含み得る。キメラＡＡＶカプシドタンパク質は、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、及び鳥類ＡＡＶ、のうちの２つ以上に由来する配列を含み得る。
【0088】
したがって、いくつかの実施形態では、修飾されるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶに由来し得るが、カプシドタンパク質に挿入される、及び／または置換される、及び／または１つ以上のアミノ酸の欠失によって改変されている１つ以上の外来配列（例えば、天然ウイルスに外因性である）をさらに含む。したがって、本明細書で特定のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質、または表２に示されるＡＡＶのいずれかからのカプシドタンパク質など）について言及する場合、天然のカプシドタンパク質、及び本開示の修飾以外の改変を有するカプシドタンパク質を包含することが意図される。このような改変には、置換、挿入、及び／または欠失が含まれる。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、そのタンパク質に挿入されたアミノ酸（本開示のアミノ酸配列置換以外）を、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、または７０個未満含む。実施形態では、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、アミノ酸置換（本開示による形質導入関連ペプチド以外）を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、または７０個未満含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、アミノ酸の欠失（本開示の形質導入関連ペプチド以外）を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、または７０個未満含む。
【0089】
本開示によるＡＡＶカプシドタンパク質に対する修飾は、「選択的」修飾である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型間のサブユニット全体または大きなドメインのスワップを伴う以前の研究とは対照的である（例えば、国際特許公開ＷＯ００／２８００４及びＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、「選択的」修飾は、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３個以下の連続するアミノ酸の挿入及び／または置換及び／または欠失をもたらす。本開示の修飾されたカプシドタンパク質及びカプシドは、現在知られているか、または後に特定される任意の他の修飾をさらに含み得る。アミノ酸残基が、野生型アミノ酸配列または天然のアミノ酸配列に存在するアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基によって置換される本明細書に記載される実施形態では、任意の他のアミノ酸残基は、当該技術分野で既知である任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり得る（例えば、表３及び４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、置換は保存的置換であり得、いくつかの実施形態では、置換は非保存的置換であり得る。
【0090】
本明細書に記載されているように、多数のＡＡＶからのカプシドタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列が当該技術分野で既知である。したがって、天然のＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置に「対応する」アミノ酸は、任意の他のＡＡＶについて容易に決定することができる（例えば、配列アラインメントを使用することにより）。２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は当該技術分野で既知である。配列類似性または同一性は、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局在的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるもの、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７－３９５（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または検査によるものを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知である標準的な技法を使用して決定され得る。
【0091】
別の好適なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）、及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５７８７（１９９３）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０－４８０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、これは任意選択でデフォルト値に設定される。パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成及び目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体により確立されるが、その値は感度を増加させるために調整されてもよい。
【0092】
さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２によって報告されているギャップＢＬＡＳＴである。
【0093】
別段に示されていない限り、同一性パーセントの計算は、ワールドワイドウェブのアドレス：ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、本開示において実施される。
【0094】
ｃ．修飾されたウイルスカプシド
本開示はまた、本明細書に開示されるバリアントカプシドタンパク質の少なくとも１つを含むウイルスカプシドを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスカプシドはパルボウイルスカプシドであり、これはさらに、自律性パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであってもよい。任意選択で、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶカプシド、鳥類ＡＡＶカプシド、または現在知られているか、もしくは後に特定される任意の他のＡＡＶである。ＡＡＶ血清型の非限定的なリストを表２に示す。本開示のＡＡＶカプシドは、表２に列挙されたＡＡＶ血清型のいずれかであり得るか、または１つ以上の挿入、置換、及び／または欠失によって前述のいずれかに由来し得る。修飾されたウイルスカプシドは、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載されている「カプシド担体」として使用することができる。本開示によるウイルスカプシドは、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現によって産生することができる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７－４８８）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載される約６０のバリアントカプシドタンパク質を含む。
本開示はまた、本明細書に開示されるバリアントカプシドタンパク質の少なくとも１つを含むウイルスカプシドを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスカプシドはパルボウイルスカプシドであり、これはさらに、自律性パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであってもよい。任意選択で、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶカプシド、鳥類ＡＡＶカプシド、または現在知られているか、もしくは後に特定される任意の他のＡＡＶである。ＡＡＶ血清型の非限定的なリストを表２に示す。本開示のＡＡＶカプシドは、表２に列挙されたＡＡＶ血清型のいずれかであり得るか、または１つ以上の挿入、置換、及び／または欠失によって前述のいずれかに由来し得る。修飾されたウイルスカプシドは、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載されている「カプシド担体」として使用することができる。本開示によるウイルスカプシドは、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現によって産生することができる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７－４８８）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載される約６０のバリアントカプシドタンパク質を含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、ウイルスカプシドは、所望の標的組織（複数可）上に存在する細胞表面分子と相互作用するようにウイルスカプシドを誘導する標的化配列（例えば、ウイルスカプシドに置換または挿入される）を含む標的化ウイルスカプシドであり得る（例えば、国際特許公開ＷＯ００／２８００４及びＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４）、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３－３６１（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０位及び／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載する］、ならびに米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７位、５３４位、５７３位、及び５８７位に続くＲＧＤモチーフを含有するＰＩペプチドの挿入を記載する］を参照のこと）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４－９７５（２００１）により記載される４４９位及び５８８位）。
【0096】
例えば、本開示のウイルスカプシドは、目的の特定の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞及び／または肺）に対するトロピズムが比較的非効率である場合がある。有益なことに、標的化配列をこれらの低形質導入ベクターに組み込むことによって、そのウイルスカプシドに、所望のトロピズム、及び任意選択で、特定の組織または細胞、例えばＴ細胞に対する選択的トロピズムを付与することができる。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシド、及びベクターは、例えば国際特許公開ＷＯ００／２８００４に記載されている。別の例としては、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数可）に再誘導する手段として、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９（２００６）に記載されている１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を本開示のＡＡＶカプシドサブユニットに直交部位で組み込むことができる。有益なことに、これらの非天然アミノ酸を用いて、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結することができ、その分子としては、限定されないが、グリカン（マンノース－樹状細胞標的化）；特定のがん細胞タイプに標的化送達するためのＲＧＤ、ボンベシン、または神経ペプチド；成長因子受容体、インテグリンなどの特定の細胞表面受容体を標的とするファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドが挙げられる。アミノ酸を化学修飾する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、標的化配列は、特定の細胞タイプ（複数可）への感染を誘導するウイルスカプシド配列（例えば、自律性パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
【0097】
別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメインまたはヘパラン硫酸（ＨＳ）結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）を、典型的にはＨＳ受容体に結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）に挿入または置換して、得られるバリアントにヘパリン及び／またはヘパラン硫酸への結合性を付与し得る。ＨＳ／ヘパリンへの結合は、アルギニン及び／またはリジンに富む「塩基性パッチ」によって媒介されることが当該技術分野で既知である。例示的な実施形態では、モチーフＢＸＸＢ（配列番号１０５）（配列中、「Ｂ」は塩基性残基であり、Ｘは中性及び／または疎水性である）に続く配列を用いることができる。非限定的な例として、ＢＸＸＢは、ＲＧＮＲ（配列番号１０６）であり得る。別の非限定的な例として、ＢＸＸＢは、天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６２位～２６５位を置換する、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応する位置（複数可）で置換される。
【0098】
パルボウイルスＢ１９は、グロボシドをその受容体として用いて、初代赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１４）。Ｂ１９の構造は、８Å分解能で測定されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１０６）。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域は、アミノ酸３９９～４０６の間（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：４１９）、βバレル構造Ｅ及びＦの間のループアウト領域（Ｃｈｉｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７５０２）にマッピングされている。したがって、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインを本開示のＡＡＶカプシドタンパク質に置換して、ウイルスカプシドまたはそれを含むウイルスベクターを赤血球系細胞に標的化することができる。
【0099】
いくつかの実施形態では、外因性標的化配列は、修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを改変するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するものであってもよく、あるいは、完全または部分的に合成されたものであってもよい。例示的な標的化配列としては、細胞表面受容体及び糖タンパク質に結合するリガンド及び他のペプチド、例えばＲＯＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド成長因子（例えば、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、ａ、β、またはγ）、神経ペプチド及びエンドルフィンなど、ならびに細胞をそれらの同族受容体を標的化する能力を保持するそれらの断片が挙げられる。他の例示的なペプチド及びタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト成長因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β－エンドルフィン、Ｌｅｕ－エンケファリン、リモルフィン、アルファ－ネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン及び上記のようなものの断片が挙げられる。またさらなる選択肢として、毒素（例えば、破傷風毒素またはアルファ－ブンガロトキシンなどのヘビ毒素）からの結合ドメインが、標的化配列としてカプシドタンパク質に置換され得る。さらに別の代表的な実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））により記載される「非古典的」輸入／輸出シグナルペプチド（例えば、線維芽細胞成長因子－１及び－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）をそのＡＡＶカプシドタンパク質に置換することによって修飾することができる。また、特定の細胞による取り込みを誘導するペプチドモチーフ、例えば、肝臓細胞による取り込みを引き起こすＦＶＦＬＰ（配列番号１０４）ペプチドモチーフも包含される。
【0100】
ファージディスプレイ技法及び当該技術分野で既知である他の技法を用いて、目的の任意の細胞タイプを認識するペプチドを特定することができる。標的化配列は、受容体（例えば、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位を標的とする任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例には、限定されないが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及び他のグリコサミノグリカン、ムチンに見られるシアル酸部分、糖タンパク質、ならびにガングリオシド、ＭＨＣ１糖タンパク質、膜糖タンパク質に見られる糖鎖構成成分（マンノース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、フコース、ガラクトースなどを含む）が挙げられる。表７は、好適な標的化配列の他の非限定的な例を示す。
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表6-5】
【表6-6】
【表6-7】
【0101】
いくつかの実施形態では、標的化配列は、細胞への侵入を標的とする別の分子に化学的にカップリングするのに用いることができるペプチド（例えば、そのＲ基を介して化学的にカップリングできるアルギニン残基及び／またはリジン残基を含むことができる）であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載されている変異を含むことができる。例えば、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６３位、７０５位、７０８位、及び／または７１６位における選択的アミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質における対応する変更（複数可）を含むことができる。
【0102】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシド、またはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６４位の直後に選択的アミノ酸の挿入を含むか、または他のＡＡＶからのカプシドタンパク質において対応する変更を含む。「アミノ酸Ｘ位の直後」とは、挿入が、指示されたアミノ酸位置のすぐ後に続くことを意図する（例えば、「アミノ酸２６４位の後」は、２６５位での点挿入、またはより広範囲での挿入、例えば、２６５位～２６８位の挿入などを示す）。さらに、いくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシド、またはベクターは、アミノ酸修飾、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０９３７８４号（例えば、２ｉ８）及び／またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１４４２２９号（例えば、二重グリカン）に記載されるものを含み得る。
【0103】
異種分子は、ＡＡＶ感染において天然に見出されないもの、例えば野生型ＡＡＶゲノムによりコードされないものと定義される。さらに、治療上有用な分子は、キメラウイルスカプシドの外側に会合して、該分子を宿主標的細胞内へ移入することができる。このような会合分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、糖鎖、脂質、及び／またはポリペプチドが含まれ得る。本開示の一実施形態では、治療上有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合している（すなわち、コンジュゲートまたは化学的にカップリングしている）。分子を共有結合させる方法は、当業者に既知である。
【0104】
ｄ．修飾されたウイルスベクター
本開示は、本開示のカプシドタンパク質バリアント及びカプシドを含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシド及び／またはベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシド及び／またはベクターゲノムを含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本開示の修飾されたカプシドタンパク質を含む修飾されたＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを含む。
本開示は、本開示のカプシドタンパク質バリアント及びカプシドを含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシド及び／またはベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシド及び／またはベクターゲノムを含む）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本開示の修飾されたカプシドタンパク質を含む修飾されたＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを含む。
【0105】
例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本開示のカプシドタンパク質バリアントを含むウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）と、（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸と、を含み、該末端反復配列を含む核酸は、ウイルスカプシドによってカプシド封入される。核酸は、任意選択で、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み得る。代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。
【0106】
ＡＡＶは典型的には、Ｔ細胞を高レベルで形質導入しない。対照的に、いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターは、野生型ウイルスベクター、またはカプシドタンパク質バリアントを含まないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、１つ以上の細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞）及び／または組織の形質導入の増強を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型または天然のＡＡＶウイルスベクターと比較して細胞形質導入を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型もしくは天然のＡＡＶウイルスベクター、または本明細書に開示されるカプシドタンパク質バリアントのいずれか１つを含まないＡＡＶウイルスベクターと比較して、１つ以上の細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞）において形質導入を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、造血幹細胞への形質導入を増加させ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、単球、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／またはナチュラルキラー細胞において形質導入を増加させ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、衛星細胞、間葉系幹細胞、及び／または基底細胞において形質導入を増加させ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、肺上皮細胞、肝細胞、及び／または骨格筋細胞において形質導入を増加させ得る。
【0107】
ＡＡＶの既知の受容体及び共受容体には、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、インテグリン、Ｏ－結合シアル酸、Ｎ－結合シアル酸、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ）、肝細胞成長因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）、ＣＤ９、ＦＧＦＲ－１、３７／６７ｋＤａラミニン受容体、及び血小板由来成長因子受容体が含まれる。実施形態では、本開示のＡＡＶウイルスベクターは、これらの受容体及び／または共受容体のうちの１つ以上に対して親和性を増加させる。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型または天然のＡＡＶウイルスベクターと比較して、ヘパリン及び／またはヘパラン硫酸結合を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型または天然のＡＡＶウイルスベクターと比較して、シアル酸結合を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型または天然のＡＡＶウイルスベクターと比較して、インテグリン結合を増加させる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、野生型または天然のＡＡＶウイルスベクターと比較して、αサブユニット及びβサブユニットを含むインテグリンへの結合を増加させる。インテグリンは、例えば、α４β７、α４β１、α１β１、α２β１、αＥβ７、αＬβ２、α５β１、α５β６、α５β５、α５β８、α５β８、α３β１、α５β１、α１１β１、α５β３、α１１β３、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８であり得る。
【0108】
本開示はまた、本開示のカプシドタンパク質バリアント（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質バリアント）またはカプシドタンパク質バリアントを含む１つ以上のカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）をコードするヌクレオチド配列、またはそれを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれか１つの配列を有する組換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群から選択される配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。発現ベクターは、限定されないが、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルスなど）、または非ウイルスベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどであり得る。本開示はまた、本開示の１つ以上のヌクレオチド配列または発現ベクターを含む細胞を提供する。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る。
【0109】
ウイルスベクターの産生方法
本開示はさらに、本明細書に開示されるウイルスベクターを産生する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、細胞形質導入を増加させる（例えば、Ｔ細胞への形質導入を増加させる）ＡＡＶベクターの産生方法であって、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上の表面露出残基を特定すること、ｂ）（ａ）で特定した表面露出アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成すること、ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーからのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を産生すること、ｄ）感染及び複製が起こり得る条件下で（ｃ）のＡＡＶ粒子と細胞を接触させること、ｅ）少なくとも１回の感染サイクルを完了して、対照ＡＡＶ粒子と同等以上の力価に複製できるＡＡＶ粒子を選択すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）及び（ｅ）は複数回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。表面露出残基を特定するための方法の非限定的な例には、低温電子顕微鏡法が挙げられる。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ９（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６９４７－６９５８）、ＡＡＶ８（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０－１２２７１）、ＡＡＶ６（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９４５－１２９５７）、ＡＡＶ５（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１１１８７－１１１９９）、ＡＡＶ４（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６－１１５７０）、ＡＡＶ３Ｂ（Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０３：２６－３６）、ＢＰＶ（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６０３－２６１４）、及びＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０及びＴｓａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照のこと。
本開示はさらに、本明細書に開示されるウイルスベクターを産生する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、細胞形質導入を増加させる（例えば、Ｔ細胞への形質導入を増加させる）ＡＡＶベクターの産生方法であって、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上の表面露出残基を特定すること、ｂ）（ａ）で特定した表面露出アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを生成すること、ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーからのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を産生すること、ｄ）感染及び複製が起こり得る条件下で（ｃ）のＡＡＶ粒子と細胞を接触させること、ｅ）少なくとも１回の感染サイクルを完了して、対照ＡＡＶ粒子と同等以上の力価に複製できるＡＡＶ粒子を選択すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）及び（ｅ）は複数回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。表面露出残基を特定するための方法の非限定的な例には、低温電子顕微鏡法が挙げられる。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ９（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６９４７－６９５８）、ＡＡＶ８（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０－１２２７１）、ＡＡＶ６（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９４５－１２９５７）、ＡＡＶ５（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１１１８７－１１１９９）、ＡＡＶ４（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６－１１５７０）、ＡＡＶ３Ｂ（Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０３：２６－３６）、ＢＰＶ（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６０３－２６１４）、及びＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０及びＴｓａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照のこと。
【0110】
表面露出残基の解像及び特定により、ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発によるその後の修飾が可能となり、さらなる選択及び／またはスクリーニングを通じて特定できるＡＡＶカプシドが生成される。したがって、さらなる実施形態では、本開示は、細胞形質導入を増加させる（例えば、Ｔ細胞への形質導入を増加させる）ＡＡＶベクターの産生方法であって、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上の表面露出アミノ酸残基を特定すること、ｂ）ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発によって（ａ）で特定した表面露出アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を生成すること、ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質からのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を産生すること、ｄ）感染及び複製が起こり得る条件下で（ｃ）のＡＡＶ粒子と細胞を接触させること、ならびにｅ）少なくとも１回の感染サイクルを完了して、対照ＡＡＶ粒子と同等以上の力価に複製できるＡＡＶ粒子を選択すること、を含む方法を提供する。
【0111】
ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発によって、表面露出アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を生成する方法は、当該技術分野で既知である。この包括的アプローチは、いずれのＡＡＶカプシドの修飾にも適用できるプラットフォーム技術をもたらす。このプラットフォーム技術の適用により、元のＡＡＶカプシドテンプレートに由来し、形質導入効率が増強されたＡＡＶバリアントが得られる。１つの利点及び利益として、この技術の適用により、ＡＡＶベクターによる遺伝子療法の対象となる患者のコホートが拡大されることとなる。
【0112】
いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルスベクターを産生する方法であって、細胞に、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えばＡＡＶ ＴＲ配列）を含む核酸テンプレートと、（ｂ）その核酸テンプレートの複製及びＡＡＶカプシドへのカプシド封入に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列及び本開示のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶ ｃａｐ配列）と、を提供することを含む、方法を提供する。任意選択で、核酸テンプレートは、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それらのＩＴＲ配列は、異種核酸配列（存在する場合）の５’側及び３’側に位置するが、その異種核酸配列に直接連続している必要はない。
【0113】
核酸テンプレートならびにＡＡＶ ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸テンプレートを含むウイルスベクターが細胞内で産生されるような条件下で提供される。方法は、細胞からウイルスベクターを収集するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地から、及び／または細胞を溶解することによって収集することができる。細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であり得る。当該技術分野で既知である任意の好適な細胞を用いることができる。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能をもたらすトランス相補性パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス相補性細胞であることができる。
【0114】
ＡＡＶの複製配列及びカプシド配列は、当該技術分野で既知である任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルでは典型的には、単一のプラスミド上でＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶの複製配列及びパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、一緒に提供されるのが利便的なことがある。ＡＡＶ ｒｅｐ配列及び／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失のあるアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。ＥＢＶベクターを用いて、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を発現させてもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続した細胞分裂の全体を通じて高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶベースの核エピソーム」として表される染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照のこと）。さらなる選択肢として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞に安定して組み込まれ得る。典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキュー及び／またはパッケージングを防止するために、ＴＲに隣接しない。
【0115】
核酸テンプレートは、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失のあるアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。別の例示として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲに隣接するレポーター遺伝子を担持するバキュロウイルスベクターについて記載している。ＥＢＶベクターを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述されるように、テンプレートを送達してもよい。
【0116】
いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定して組み込まれる。ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当該技術分野で既知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクター、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号及び同第６，０９３，５７０号に記載される効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子のすべてを担持する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供され得る。
【0117】
さらに、ヘルパーウイルス機能は、ヘルパー配列が染色体に埋め込まれたパッケージング細胞によって提供されるか、または安定した染色体外エレメントとして維持され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングすることができず、例えば、ＴＲに隣接していない。当業者であれば、
【0118】
単一のヘルパー構築物上にＡＡＶ複製及びカプシド配列、ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを理解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であり得る。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、核酸テンプレートをさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及び／またはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。ｒＡＡＶテンプレートは、例えば、プラスミドテンプレートとして提供され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞に組み込まれる。あるいは、ｒＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶベースの核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供される。ｒＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶテンプレートは、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルスの複製及びパッケージングに十分なアデノウイルス５’及び３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復及びＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、及び存在する場合、ｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス骨格に埋め込まれ、５’及び３’シス配列に隣接しているため、これらの配列は、アデノウイルスカプシドにパッケージングされ得る。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がＡＡＶビリオンにパッケージングされないように、一般に、ＴＲに隣接していない。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）では、アデノウイルスとＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーについて記載されている。
【0121】
ＡＡＶパッケージング法では、ヘルペスウイルスもヘルパーウイルスとして使用してもよい。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは有益なことに、拡張可能なＡＡＶベクター産生スキームを容易にし得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６及びＷＯ００／１７３７７）。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターを、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５－４３により記載されるように、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において産生し、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶテンプレートを送達することができる。
【0122】
混入ヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該技術分野で既知である任意の方法によって得ることができる。例えば、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別することができる。ＡＡＶは、ヘパラン基質に対する親和性に基づき、ヘルパーウイルスから分離することもできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。欠失のある複製欠損ヘルパーウイルスを用いて、いずれの混入ヘルパーウイルスも、複製能を持たないようにできる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するのに必要なのはアデノウイルス初期遺伝子の発現のみであるため、後期遺伝子の発現を欠くアデノウイルスヘルパーを用いてもよい。後期遺伝子の発現を欠損したアデノウイルス変異体は、当該技術分野で既知である（例えば、アデノウイルス変異体ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９）。
【0123】
組換えウイルスベクター
本開示は、本明細書に開示されるカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質）の少なくとも１つまたはカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）の少なくとも１つを含む組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）を提供し、該カプシドタンパク質は、本明細書に開示される１つ以上の形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞、例えばＴ細胞への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す。
本開示は、本明細書に開示されるカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質）の少なくとも１つまたはカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）の少なくとも１つを含む組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）を提供し、該カプシドタンパク質は、本明細書に開示される１つ以上の形質導入関連ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞、例えばＴ細胞への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクター、または形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す。
【0124】
本開示の組換えウイルスベクターは、核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏで送達するのに有用である。修飾されたウイルスカプシドによりパッケージングして、細胞内へ移入できる分子には、異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機小分子、金属、またはこれらの組み合わせが含まれる。特に、ウイルスベクターは、有益なことに、哺乳動物細胞を含む動物細胞に核酸を送達または移入するのに用いることができる。したがって、いくつかの実施形態では、核酸（「カーゴ核酸」）を本開示のカプシドタンパク質によりカプシド封入され得る。本開示のウイルスベクターで送達されるカーゴ核酸配列は、目的の任意の異種核酸配列（複数可）であり得る。
【0125】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現は、野生型ＡＡＶベクター（ＡＡＶ６ベクターなど）または本明細書に開示される形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現と比較して増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現は、野生型ＡＡＶベクター（ＡＡＶ６ベクターなど）または本明細書に開示される形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現と比較して、少なくとも約１．５倍、例えば約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍（間にあるすべての値及び部分範囲を含む）増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現は、野生型ＡＡＶベクター（ＡＡＶ６ベクターなど）または本明細書に開示される形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターによって送達される異種核酸の発現と比較して、少なくとも約１０％、例えば、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％（間にあるすべての値及び部分範囲を含む）増加する。
【0126】
目的の核酸としては、治療用（例えば、医学的または獣医学的用途）または免疫原性（例えば、ワクチン用）ポリペプチドもしくはＲＮＡを含む、ポリペプチドをコードする核酸が含まれる。いくつかの実施形態では、該カーゴ核酸は、治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする。
【0127】
治療用ポリペプチドには、限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＡＢＣＤ１、βグロビン（ＨＢＢ）、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＦ、嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィン及びマイクロジストロフィンを含む。例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公開第２００３／０１７１３１号；国際公開ＷＯ／２００８／０８８８９５，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１ ３７１４－１３７１９（２０００）；及びＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）を参照のこと）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビン１１型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、ａ－グロビン、スペクトリン、α－１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンパ毒素など）、ペプチド成長因子、神経栄養因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３及び－４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［ＲＡＮＫＬ及びＶＥＧＦを含む］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子－α及び－βなど）、リソソーム酸性α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングを調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１の阻害剤１及びその断片［例えば、ＷＯ２００６／０２９３１９及びＷＯ２００７／１００４６５］）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンに作用する分子、例えば短縮型の構成的活性ｂＡＲＫｃｔ、抗炎症因子、例えばＩＲＡＰ、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なＭａｂはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、神経ペプチド及びその断片（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照のこと）、血管新生阻害剤、例えばバソヒビン及び他のＶＥＧＦ阻害剤（例えば、バソヒビン２［ＷＯ ＪＰ２００６／０７３０５２を参照のこと］）が含まれ得る。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、及び腫瘍壊死因子）、宿主因子の転写を増強または阻害するタンパク質（例えば、転写エンハンサーまたは阻害因子エレメントに連結されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９、転写エンハンサーまたは阻害因子エレメントに連結されたジンクフィンガータンパク質、転写エンハンサーまたは阻害因子エレメントに連結された転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター）、がん療法で使用される薬剤に対する耐性を付与するタンパク質、がん抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、及び治療効果を必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターを用いて、モノクローナル抗体及び抗体断片、例えば、ミオスタチンに対して指向される抗体または抗体断片を送達することもできる（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４－５９０（２００５）を参照のこと）。ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該技術分野で既知であり、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。任意選択で、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、その天然状態で分泌型ポリペプチドであるか、または例えば、当該技術分野で既知である分泌シグナル配列との作動可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。
【0128】
あるいは、本開示のいくつかの実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介／ｒａｍスプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照のこと）、及び他の非翻訳ＲＮＡ、例えば、「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９、Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードしてもよい。例示的な非翻訳ＲＮＡには、複数の薬剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／または予防するため、及び／または化学療法による損傷を防ぐための心臓に投与するためのもの）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため。例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照のこと）、ホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照のこと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかん用）、ならびに病原性生物及びウイルス（例えば、Ｂ型及び／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対して指向されるＲＮＡｉが含まれる。
【0129】
さらに、選択的スプライシングを誘導する核酸配列を送達することができる。例示すると、ジストロフィンエキソン５１の５’及び／または３’スプライス部位と相補的であるアンチセンス配列（または他の阻害配列）を、Ｕ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと共に送達して、このエキソンのスキッピングを誘導することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）の５’側に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列を本開示の修飾されたカプシド内にパッケージングして、送達することができる。
【0130】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集を誘導する核酸配列を送達することができる。例えば、核酸は、遺伝子編集分子、例えばガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼをコードすることができる。いくつかの実施形態では、核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アルゴノートエンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造誘導型エンドヌクレアーゼ）、またはＲＧＮ（ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードし得る。
【0131】
ウイルスベクターはまた、宿主染色体上の遺伝子座と共通の相同性を有し、それと組み換わる異種核酸を含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞における遺伝的欠損を修正するために利用することができる。
【0132】
本開示はまた、例えば、ワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などからの免疫原を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知である任意の目的の免疫原をコードし得る。
【0133】
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｌ ａｌ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７、Ｙｏｕｎｇらの米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらの米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，８６３，５４１号を参照のこと）。抗原は、パルボウイルスカプシドにおいて提示され得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノムに導入した異種核酸から発現され得る。本明細書に記載される及び／または当該技術分野で既知である任意の目的の免疫原は、本開示のウイルスベクターにより提供され得る。
【0134】
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発し、及び／または対象を、微生物、細菌、原虫、寄生虫、真菌、及び／またはウイルス感染及び疾患を含むがこれらに限定されない、感染及び／または疾患から保護するのに好適な任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルトミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）、またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫源、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶエンベロープＧＰ １６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。免疫原性ポリペプチドはまた、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質、及びラッサ熱エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えばワクシニアＬＩ遺伝子産物またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原、例えばＮＰ及びＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、及び／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、または鳥類感染性気管支炎ウイルス免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶの免疫原）、ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリアの免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）の免疫原、及び／または当該技術分野で現在知られているか、もしくは後に免疫原として特定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。
【0135】
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原であり得る。任意選択で、腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面に発現する。
【0136】
例示的ながん及び腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原及び腫瘍抗原には、限定されないが、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＦＲＡＭＥ、ｐ１５、黒色腫腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４．９６８．６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）、ムチン抗原（国際特許公開ＷＯ９０／０５１４２）、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、パピローマウイルス抗原、及び／または黒色腫、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、及び現在知られているか、もしくは後に特定される任意の他のがんもしくは悪性の病態、またはそれらの転移といったがんに関連することが現在知られているか、または後に発見される抗原（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照のこと）が含まれる。
【0137】
当業者であれば、目的の異種核酸（複数可）が適切な制御配列と作動可能に会合し得ることを理解するであろう。例えば、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、及び／またはエンハンサーなどの発現制御エレメントと作動可能に会合し得る。
【0138】
さらに、目的の異種核酸（複数可）の調節された発現は、例えば、特定の部位でのスプライシング活性を選択的に遮断するオリゴヌクレオチド、小分子、及び／または他の化合物の有無によって異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することにより、転写後レベルで達成され得る（例えば、ＷＯ２００６／１１９１３７に記載される）。
【0139】
当業者であれば、所望のレベル及び組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用することができることを理解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、天然または外来であり得、天然または合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が、該転写開始領域が導入される野生型宿主において見られないことを意図する。
【0140】
いくつかの実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象に対して天然であり得る。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に対して天然であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（複数可）において機能するように選択される。さらに、いくつかの実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であり得る。
【0141】
誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列（複数可）の発現にわたって調節を提供することが望ましいそれらの用途において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または優先プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋肉特異的または優先（心筋、骨格筋、及び／または平滑筋特異的または優先を含む）、神経組織特異的または優先（脳特異的または優先を含む）、眼特異的または優先（網膜特異的及び角膜特異的を含む）、肝臓特異的または優先、骨髄特異的または優先、膵臓特異的または優先、脾臓特異的または優先、及び肺特異的または優先プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの誘導性発現制御エレメントは、Ｔ細胞における選択的発現を促進する。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ホルモン誘導性エレメント及び金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが含まれる。
【0142】
異種核酸配列（複数可）が転写され、次いで標的細胞内で翻訳される実施形態では、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、一般に、特定の開始シグナルが含まれる。これらの外因性翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含み得、天然及び合成の両方の様々な起源のものであることができる。
【0143】
医薬組成物及び使用方法
本開示はまた、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシド、ウイルスベクター、核酸、発現ベクター、及び／または細胞のうちの少なくとも１つを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体中に本開示のウイルスベクター及び／またはカプシド及び／またはカプシドタンパク質及び／またはウイルス粒子、ならびに任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含む医薬組成物が提供される。注射用では、担体は、典型的には液体となる。他の投与様式では、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与では、担体は吸入可能なものであり、任意選択で、固体または液体の微粒子形態であることができる。「薬学的に許容される」とは、毒性がないか、または別段の形で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく対象に投与することができる。
本開示はまた、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシド、ウイルスベクター、核酸、発現ベクター、及び／または細胞のうちの少なくとも１つを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体中に本開示のウイルスベクター及び／またはカプシド及び／またはカプシドタンパク質及び／またはウイルス粒子、ならびに任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含む医薬組成物が提供される。注射用では、担体は、典型的には液体となる。他の投与様式では、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与では、担体は吸入可能なものであり、任意選択で、固体または液体の微粒子形態であることができる。「薬学的に許容される」とは、毒性がないか、または別段の形で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく対象に投与することができる。
【0144】
本開示によるウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞を含む広範な細胞内に異種核酸を送達するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。ウイルスベクターを用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチドを産生するために、またはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法を行うために、目的の核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで送達できる。ウイルスベクターは、さらに、核酸の送達が必要な対象に核酸を送達して、例えば、免疫原性ポリペプチド、または治療用ポリペプチド、または機能性ＲＮＡを発現させる方法において有用である。このようにして、該ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを、対象において、ｉｎ ｖｉｖｏで産生させることができる。対象は、該ポリペプチドが欠損しているために、該ポリペプチドを必要とし得る。さらに、該方法は、該ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを対象において産生させることによって、ある程度の有益な作用をもたらし得るという理由で行うことができる。いくつかの実施形態では、該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞内でポリペプチドまたはＲＮＡを発現させること、及び任意選択で、細胞からポリペプチドまたはＲＮＡを単離することを含む。ウイルスベクターを使用して、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを培養細胞または対象において産生させることもできる（例えば、対象をバイオリアクターとして使用して、該ポリペプチドを産生させるか、または例えばスクリーニング法と関連させて該機能性ＲＮＡが対象に及ぼす作用を観察する）。
【0145】
本開示は、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子、及び／または組成物のいずれか１つを対象に投与する方法を提供する。したがって、本開示は、有効量の本明細書に開示されるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のいずれか１つ、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）のいずれか１つ、及び／または組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。したがって、本開示は、本明細書に開示されるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のいずれか１つ、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）のいずれか１つ、及び／または組成物のいずれか１つを、医薬品として使用するため、及び／または治療を必要とする対象の治療方法において使用するために提供する。
【0146】
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達して、治療用ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを送達することが有益である任意の疾患状態を治療及び／または予防するために用いることができる。いくつかの実施形態では、疾患状態は、Ｔ細胞の機能不全または増加に関連するか、相関するか、またはそれによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、疾患状態には、限定されないが、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質）及び肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）、及び他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリリシン）、多発性硬化症（βインターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、及び他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌に対するもの］）、真性糖尿病（インスリン）、筋ジストロフィー、例としてデュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、ａ、β、γ］、筋伸展性ミオスタチンプロペプチドに対するＲＮＡｉ、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照のこと］、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照のこと］、及びミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）及びベッカー型、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（ａ－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［ａ－ガラクトシダーゼ］及びポンペ病［リソソーム酸性α－グルコシダーゼ］）及び他の代謝障害、先天性肺気腫（α－１－アンチトリプシン）、レッシュ－ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ－サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾患（ならびに眼及び網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症に関するＰＤＧＦ及び／またはバソヒビンもしくは他のＶＥＧＦの阻害剤、または網膜障害、例えばＩ型糖尿病におけるものを治療／予防するための他の血管新生阻害剤）、実質臓器の疾患、例えば、脳（例として、パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン及び／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチン及び／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］）、肝臓、腎臓、心臓、例として鬱血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）及びその断片（例えば、ＩｌＣ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、［３２－アドレナリン作動性受容体、２－アドレナリン作動性受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンに作用する分子、例えば短縮型の構成的活性ｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ、ホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅなどの送達による）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１及び／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓの送達による）、心臓移植の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎不全（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ及びＴＮＦａ可溶性受容体）、肝炎（ａ－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、脊髄小脳失調症、例としてＳＣＡ１、ＳＣＡ２、及びＳＣＡ３、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などが含まれる。本開示はさらに、臓器移植後に用いて、移植の成功率を上昇させる、及び／または臓器移植もしくは補助療法の負の副作用を低減することができる（例えば、サイトカインの産生を遮断する免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによって）。別の例として、骨形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬ及び／またはＶＥＧＦを含む）を、例えば、がん患者における骨折または外科的除去の後に、骨同種移植片と共に投与することができる。
【0147】
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターを用いて、肝疾患または肝障害を治療及び／または予防するためのポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達することができる。肝疾患または障害は、例えば、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝疾患、線維症、黄疸、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、バッド－キアリ症候群、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール性線維症、非アルコール性線維症、脂肪肝、ギルバート症候群、胆道閉鎖症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）、フォン・ギールケ病（ＧＳＤ Ｉ）、血友病Ａ、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、ホモシスチン尿症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、チロシン血症１型、アルギナーゼ１欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素１欠損症、シトルリン血症１型、シトリン欠損症、クリグラー・ナジャー症候群１型、シスチン症、ファブリー病、糖原病１ｂ、ＬＰＬ欠損症、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、オルチニントランスロカーゼ欠損症、原発性高シュウ酸尿症１型、またはＡＤＡ ＳＣＩＤであり得る。
【0148】
本明細書に記載のウイルスベクターを使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を作製することもできる。例えば、本開示のウイルスベクターを使用して、非多能性細胞、例えば、成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などに幹細胞関連核酸（複数可）を送達することができる。
【0149】
幹細胞と関連する因子をコードする核酸は、当該技術分野で既知である。幹細胞及び多能性と関連するこのような因子の非限定的な例としては、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及び／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、ＫＨＺ Ｋｌｆ４及び／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ及び／またはＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧ及び／またはＬＩＮ２８が挙げられる。
【0150】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾されたベクターを使用して、本明細書に記載される、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（ａ－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原病（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α－グルコシダーゼ）を治療することができる。いくつかの実施形態では、本開示を実施して、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（アルファ－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原病（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α－グルコシダーゼ）を治療及び／または予防することもできる。
【0151】
遺伝子移入は、疾患状態を理解し、療法を提供するために大いに役立つ。欠陥遺伝子が既知であり、クローニングされている多数の遺伝性疾患が存在する。概して、上記疾患状態は、一般的には劣性様式で遺伝する通常酵素の欠損状態と、調節または構造タンパク質に関与する場合があり、典型的には優性様式で遺伝する不均衡状態との２つに分類される。欠損状態疾患については、遺伝子移入を使用して、正常な遺伝子を患部組織にもたらし置換療法を行うこと、またアンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを作成することができる。不均衡な疾患状態については、遺伝子移入を使用して、モデル系において疾患状態を作成することができ、次いでそれを疾患状態に対抗する試行において使用することができる。したがって、本開示によるウイルスベクターは、遺伝性疾患の治療及び／または予防を可能にする。
【0152】
本開示によるウイルスベクターを用いて、機能性ＲＮＡを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで提供してもよい。機能性ＲＮＡは、例えば、非コードＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、細胞における機能性ＲＮＡの発現は、該細胞による特定の標的タンパク質の発現を減少させることができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現を減少させる必要のある対象において、該タンパク質の発現を減少させることができる。いくつかの実施形態では、細胞における機能性ＲＮＡの発現は、該細胞による特定の標的タンパク質の発現を増加させることができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現を増加させる必要のある対象において、該タンパク質の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、機能性ＲＮＡの発現によって、細胞内の特定の標的ＲＮＡのスプライシングを調節することができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のＲＮＡのスプライシングを調節する必要のある対象において、該ＲＮＡのスプライシングを調節することができる。いくつかの実施形態では、細胞における機能性ＲＮＡの発現は、該細胞による特定の標的タンパク質の機能を調節することができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の機能を調節する必要のある対象において、該タンパク質の機能を調節することができる。機能性ＲＮＡは、例えば、細胞もしくは組織の培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与して遺伝子発現及び／または細胞生理機能を調節することもできる。
【0153】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルスベクターをｅｘ ｖｉｖｏで細胞と接触させてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、例えば活性化Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）は、ヒト患者などの対象から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターと接触した細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【0154】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする異種核酸を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターとＴ細胞との接触により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現され、ＣＡＲ Ｔ細胞が生成される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるウイルスベクターのいずれか１つをｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞と接触させることを含む、ＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法を提供する。本開示はさらに、本明細書に開示される方法のいずれか１つを使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞と、本明細書に開示されるＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含む治療を必要とする対象を治療する方法とを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、同じ対象から得られたＴ細胞（自己Ｔ細胞）を使用して産生されるが、他の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、健康なドナー対象から得られたＴ細胞（同種異系Ｔ細胞）を使用して産生される。ＣＡＲ Ｔ細胞の投与を必要とする対象は、医師または熟練した医療従事者によって特定され得、任意の疾患、例えば、がん、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または多発性骨髄腫を有し得る。
【0155】
Ｔ細胞疲弊は、多くの慢性感染症及びがんにおいて生じるＴ細胞機能不全の状態であり、ＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を低減することも示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えウイルスベクターは、Ｔ細胞疲弊を予防、制限、及び／または逆転させるための遺伝子治療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ治療法）において使用される。したがって、本開示は、本明細書に開示されるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のいずれか１つ、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）のいずれか１つ、及び／または組成物のいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＴ細胞疲弊を緩和、予防、制限、及び／または逆転させる方法を提供する。
【0156】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、免疫原、例えば免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターと細胞との接触は、免疫原の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は対象に投与され得、それにより、対象において免疫原に対する免疫応答が誘導される。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が誘発される。いくつかの実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は対象から取り出されており、ウイルスベクターがその中に導入され、次いで細胞が対象に戻される。Ｅｘ ｖｉｖｏでの操作のために対象から細胞を取り出し、次いで対象に戻す方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。あるいは、組換えウイルスベクターを、ドナー対象からの細胞、培養細胞、または他の任意の好適な供給源からの細胞に導入することができ、該細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
【0157】
いくつかの実施形態では、細胞を、がんを有する対象から取り出し、本開示によるがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触させることができる。次いで、この修飾された細胞を対象に投与することにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで十分な免疫応答を開始できない（すなわち、十分な量の増強した抗体を産生できない）免疫抑制状態にある対象に有利に用いられ得る。あるいは、がん抗原をウイルスカプシドの一部として発現させるか、または他の方法でウイルスカプシドに会合させることもできる（例えば、上述のように）。別の選択肢として、当該技術分野で既知である任意の他の治療用核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して、がんを治療及び／または予防することができる。
【0158】
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、オメガ－インターフェロン、タウ－インターフェロン、インターロイキン－１－α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞成長因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、及びリンホトキシン）により増強され得ることが当該技術分野で既知である。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくはＣＴＬ誘導性サイトカイン）をウイルスベクターと共に対象に投与することができる。サイトカインは、当該技術分野で既知である任意の方法により投与することができる。外因性サイトカインを対象に投与してもよく、あるいは、サイトカインをコードする核酸を、好適なベクターを用いて対象に送達して、該サイトカインをｉｎ ｖｉｖｏで産生させてもよい。
【0159】
さらに、本開示によるウイルスベクターは、診断法及びスクリーニング法において使用され、これにより目的の核酸が細胞培養系あるいはトランスジェニック動物モデルにおいて一過性または安定的に発現される。
【0160】
本開示のウイルスベクターはまた、当業者には明らかなように、遺伝子標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含むが、これらに限定されない様々な非治療的目的でも使用することができる。該ウイルスベクターはまた、安全性（分散、毒性、免疫原性など）を評価する目的でも使用することができる。このようなデータは、例えば、臨床的有効性の評価前に規制当局承認プロセスの一環として、米国食品医薬品局によって検討される。
【0161】
いくつかの実施形態では、本開示の修飾されたウイルスカプシドは、新規なカプシド構造に対する抗体の産生に使用される。いくつかの実施形態では、細胞への抗原提示のために、例えば対象へ投与して外因性アミノ酸配列に対して免疫応答をもたらすために、外因性アミノ酸配列を修飾されたウイルスカプシド中に挿入することができる。
【0162】
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターを投与する前及び／またはその投与と同時に（例えば、それぞれの投与から数分もしくは数時間以内に）ウイルスカプシドを投与して、特定の細胞部位を遮断することができる。例えば、本発明のカプシドは、肝臓細胞上の細胞受容体を遮断するために送達することができ、その後またはそれと同時に送達ベクターを投与でき、それによって、肝臓細胞の形質導入を低減し、他の標的（例えば、骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋）の形質導入を増強し得る。
【0163】
投与量及び投与様式
ウイルスベクターは、特定の標的細胞に好適な標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度において細胞中に導入することができる。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞タイプ及び数ならびに特定のウイルスベクターに応じて変動し得、当業者であれば過度の実験をすることなく決定することができる。代表的な実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択で少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
ウイルスベクターは、特定の標的細胞に好適な標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度において細胞中に導入することができる。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞タイプ及び数ならびに特定のウイルスベクターに応じて変動し得、当業者であれば過度の実験をすることなく決定することができる。代表的な実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択で少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
【0164】
ウイルスベクターが導入される細胞（複数可）は、Ｔ細胞、神経細胞（末梢及び中枢神経系の細胞、特に脳細胞、例えばニューロン及びオリゴデンドロサイトを含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮細胞、及び角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸及び呼吸上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、及び／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などを含むが、これらに限定されない任意のタイプのものであり得る。代表的な実施形態では、細胞は、任意の前駆細胞であることができる。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であることができる。さらに別の選択肢として、細胞は、がん細胞または腫瘍細胞であることができる。さらに、細胞は、上に示したように、任意の起源の種からであり得る。
【0165】
ｅｘ ｖｉｖｏでの核酸送達に好適な細胞は、上記のようなものである。対象に投与する細胞の投与量は、対象の年齢、状態及び種、細胞のタイプ、細胞によって発現させる核酸、投与様式などによって変動する。典型的には、薬学的に許容される担体中で、１用量当たり少なくとも約１０２～約１０８個の細胞または少なくとも約１０３～約１０６個の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを形質導入した細胞は、薬学的担体と組み合わせて治療有効量で対象に投与される。
【0166】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを細胞に導入し、該細胞を対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはカプシドにおいて発現される）に対する免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的に有効な量のポリペプチドを発現する細胞の量が投与される。「免疫原的に有効な量」は、医薬製剤が投与される対象においてポリペプチドに対する能動免疫応答を誘発するのに十分である、発現したポリペプチドの量である。いくつかの実施形態では、投与量は、防御免疫応答をもたらすのに十分である。免疫原性ポリペプチドの投与の利点が任意のその欠点を上回る限り、付与される防御の程度は完全であるか、または永続的である必要はない。したがって、本開示は、細胞に核酸を投与する方法であって、該細胞を本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子、及び／または組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【0167】
対象に投与するウイルスベクター及び／またはカプシドの投与量は、投与様式、治療及び／または予防される疾患または病態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸などに依存し、常法で決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５の形質導入単位、任意選択で約１０８～１０１３の形質導入単位の力価である。いくつかの実施形態では、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回以上の投与）を用いて、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【0168】
本開示によるウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはカプシドの、それを必要とするヒト対象または動物への投与は、当該技術分野で既知である任意の手段によって行うことができる。任意選択で、ウイルスベクター、ウイルス粒子及び／または組成物は、薬学的に許容される担体中に治療有効量で送達される。いくつかの実施形態では、治療有効量のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはカプシドが送達される。
【0169】
例示的な投与様式としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［例として、骨格筋、横隔膜筋及び／または心筋への投与］、皮内、胸腔内、脳内及び関節内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ管内など、ならびに組織または器官への直接的注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳への）が挙げられる。投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節中、またはその付近）に対するものであることもできる。任意の所与の場合における最も好適な経路は、治療及び／または予防される病態の性質及び重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。本開示はまた、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）などの非コードＲＮＡを生成するために実施することもできる。
【0170】
注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体の溶液もしくは懸濁液に好適な固体形態、またはエマルションのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。あるいは、本開示のウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局在様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤において投与してもよい。さらに、ウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着させて送達され得る（例えば、米国特許公開第ＵＳ－２００４－００１３６４５－Ａ１号に記載される）。
【実施例】
【0171】
以下の実施例は、例示目的で本明細書に含まれているに過ぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で使用する場合、ＳＴＲＤ．２０１、ＳＴＲＤ．２０２、ＳＴＲＤ．２０３、ＳＴＲＤ．２０４、ＳＴＲＤ．２０５、ＳＴＲＤ．２０６、及びＳＴＲＤ．２０７という用語は、カプシドタンパク質配列を表すために使用され、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０１、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０２、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０３、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０４、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０５、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０６、及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．２０７という用語は、カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを表すために使用される。ただし、ＳＴＲＤ．２０１、ＳＴＲＤ．２０２、ＳＴＲＤ．２０３、ＳＴＲＤ．２０４、ＳＴＲＤ．２０５、ＳＴＲＤ．２０６、及びＳＴＲＤ．２０７という用語は、当業者には明らかなように、文脈によっては、指定されたカプシドを含むＡＡＶベクターを表すために使用されることがある。
【0172】
実施例１：形質導入関連ペプチドを含むＡＡＶカプシドタンパク質バリアントの進化
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化プロセスを使用して、ＡＡＶベクターに組み込まれるとＴ細胞へのベクターの形質導入が増強されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを調製した。このプロセスの最初のステップには、低温電子顕微鏡を使用したＡＡＶカプシド表面の表面露出領域の特定が含まれた。次いで、ＡＡＶカプシドの表面露出領域内の選択された残基を、各コドンをヌクレオチドＮＮＫによって置換した縮重プライマーを使用した変異誘発に供し、ギブソンアセンブリ及び／またはマルチステップＰＣＲによって遺伝子断片を一緒に組み合わせた。本明細書では、配列番号１のアミノ酸残基４５４～４６０をランダム変異誘発に供し、組換えカプシド遺伝子配列のライブラリーを生成した。この縮重ライブラリーの各遺伝子を野生型ＡＡＶゲノムにクローニングして、元のＣａｐコードＤＮＡ配列と置換し、プラスミドライブラリーを得た。次に、プラスミドライブラリーを、アデノウイルスヘルパープラスミドと共に２９３産生細胞株にトランスフェクトし、ＡＡＶカプシドライブラリーを生成した。ＤＮＡシークエンシングにより、ＡＡＶライブラリーの作製が成功したことを確認した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化プロセスを使用して、ＡＡＶベクターに組み込まれるとＴ細胞へのベクターの形質導入が増強されるＡＡＶカプシドタンパク質バリアントを調製した。このプロセスの最初のステップには、低温電子顕微鏡を使用したＡＡＶカプシド表面の表面露出領域の特定が含まれた。次いで、ＡＡＶカプシドの表面露出領域内の選択された残基を、各コドンをヌクレオチドＮＮＫによって置換した縮重プライマーを使用した変異誘発に供し、ギブソンアセンブリ及び／またはマルチステップＰＣＲによって遺伝子断片を一緒に組み合わせた。本明細書では、配列番号１のアミノ酸残基４５４～４６０をランダム変異誘発に供し、組換えカプシド遺伝子配列のライブラリーを生成した。この縮重ライブラリーの各遺伝子を野生型ＡＡＶゲノムにクローニングして、元のＣａｐコードＤＮＡ配列と置換し、プラスミドライブラリーを得た。次に、プラスミドライブラリーを、アデノウイルスヘルパープラスミドと共に２９３産生細胞株にトランスフェクトし、ＡＡＶカプシドライブラリーを生成した。ＤＮＡシークエンシングにより、ＡＡＶライブラリーの作製が成功したことを確認した。
【0173】
Ｔ細胞を標的とし、効果的に形質導入できるＡＡＶベクターを特定するために、上述のＡＡＶライブラリーを複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択に供した。具体的には、混合細胞集団への最初の形質導入を行い、続いて活性化ドナーＴ細胞への２回の形質導入を行った。各段階でウイルスＤＮＡを精製し、ＰＣＲ増幅してＡＡＶベクターにバッククローニングし、次の回の選択に使用した。コンビナトリアルな操作及びＡＡＶベクターの選択に使用される一般的な方法のさらなる詳細は、ＷＯ２０１９／１９５４４９、ＷＯ２０１９／１９５４２３、及びＷＯ２０１９／１９５４４４に提供されており、それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。３回の感染後、培養Ｔ細胞からＡＡＶ粒子を単離した。具体的には、細胞を溶解し、ウイルスＤＮＡをＴ細胞の核画分及び細胞質画分から精製し、上記のようにＰＣＲ増幅してＡＡＶベクターにバッククローニングした。
【0174】
実施例１に記載された３回の選択及び進化の後、Ｔ細胞の核画分及び細胞質画分において豊富に存在するＡＡＶバリアントをシークエンシングして、単一のＡＡＶ単離株を特定した。図５に示すバブルプロットにおいて、バブルの大きさはリード数に比例する。核画分（ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０３、２０５）、細胞質画分（ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６、２０７）、または核画分及び細胞質画分（ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１、２０２、及び２０４）において最も豊富に存在するＡＡＶバリアントをシークエンシングし、アミノ酸４５４～４６０位に存在するアミノ酸残基を特定した。図６及び表５を参照のこと。これらの結果から、表５の形質導入関連ペプチドを含むバリアントカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンは、Ｔ細胞を効果的に形質導入できることが示された。
【表7】
【0175】
実施例２：形質導入関連ペプチドを含むＡＡＶベクターの製造性
実施例１で特定された様々なＡＡＶベクターが大規模システムで製造可能かどうかを判断するために、標準的な方法に従ってＡＡＶを産生し、収量を野生型ＡＡＶ６ベクターの収量と比較した。
実施例１で特定された様々なＡＡＶベクターが大規模システムで製造可能かどうかを判断するために、標準的な方法に従ってＡＡＶを産生し、収量を野生型ＡＡＶ６ベクターの収量と比較した。
【0176】
標準的なトリプルトランスフェクションプロトコルに従って、ＡＡＶをＨＥＫ２９３細胞で産生した。簡単に述べると、細胞に、（ｉ）野生型ＡＡＶ９カプシド配列、または表５に列挙されたバリアントカプシド配列のいずれかを含むプラスミド、（ｉｉ）５’ＩＴＲ、導入遺伝子、及び３’ＩＴＲ配列を含むプラスミド、ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶ産生に必要なヘルパー遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクトした。ＡＡＶを細胞培養の上清から精製した。続いて、ＰＣＲベースの定量化アプローチを使用して、各ＡＡＶの収量を測定した。
【0177】
図１及び表６に示すように、ＳＴＲＤ－２０１のカプシド配列を含む組換えＡＡＶベクター（本明細書では「ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１」と称される）は、野生型ＡＡＶ６の収量よりも高い収量を示した。さらに、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０４、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０５、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６、及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７の収量は、野生型ＡＡＶ６の収量と同等であった。
【0178】
これらのデータは、カプシドバリアントタンパク質を含むＡＡＶベクターが商業的製造に好適であることを裏付ける。
【表8】
【0179】
実施例３：Ｔ細胞におけるＡＡＶバリアントによるＧＦＰ導入遺伝子の発現の特性決定
ＧＦＰ導入遺伝子配列を保持する、組換えＡＡＶバリアント、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０２、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０４、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０５、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６、及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７、または野生型ＡＡＶ６ベクターを活性化Ｔ細胞に形質導入した。Ｔ細胞は増殖中に凝集するため、イメージング前に細胞をピペットで上下させるか、混合した。ＧＦＰの発現を顕微鏡により観察し、実験からの画像を図２に示す。ＧＦＰ発現が高いほど、Ｔ細胞へのウイルスベクターの形質導入がより効率的であることを示す。図２の画像から分かるように、すべてのＡＡＶバリアントは、野生型ＡＡＶ６ウイルスベクターと比較して、より明るい緑色の蛍光シグナルを示し、したがって、活性化Ｔ細胞におけるＧＦＰのより高い発現を示した。組換えＡＡＶバリアントの中でも、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７は特に増強されたＧＦＰ発現を示し、このことは、Ｔ細胞への形質導入がより増強されていることを示唆する。野生型ＡＡＶ６ウイルスベクターと比較してＡＡＶバリアントからのＧＦＰ発現のレベルをさらに分析するために、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７バリアントのいずれかを形質導入したＴ細胞をフローサイトメトリーに供し、Ｔ細胞のみを陰性対照として使用した。図３Ｃに示すように、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７バリアントを形質導入した増加した割合の細胞は、ＡＡＶ６親ベクターにより形質導入した集団と比較してより高いＧＦＰシグナル（青線を超えるＦＩＴＣシグナルにより示される）を示した。ＡＡＶバリアント（ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０２、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０４、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０５、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７）を形質導入された細胞におけるＧＦＰ発現は、図４においてさらに定量化され、図４では、所与の集団におけるＧＦＰ陽性細胞の割合（％）（棒グラフで示す）及びその集団におけるＧＦＰの平均強度（線グラフで示す）が示される。この結果は、ＧＦＰ陽性細胞数の増加が、野生型ＡＡＶ６と比較して、ＡＡＶバリアントによって形質導入された細胞におけるＧＦＰシグナルの平均強度の増加とよく対応していることを示しており、このことは、ＡＡＶバリアントのＴ細胞への形質導入が増強された結果、Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現が増加したことを示している。
ＧＦＰ導入遺伝子配列を保持する、組換えＡＡＶバリアント、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０２、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０４、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０５、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６、及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７、または野生型ＡＡＶ６ベクターを活性化Ｔ細胞に形質導入した。Ｔ細胞は増殖中に凝集するため、イメージング前に細胞をピペットで上下させるか、混合した。ＧＦＰの発現を顕微鏡により観察し、実験からの画像を図２に示す。ＧＦＰ発現が高いほど、Ｔ細胞へのウイルスベクターの形質導入がより効率的であることを示す。図２の画像から分かるように、すべてのＡＡＶバリアントは、野生型ＡＡＶ６ウイルスベクターと比較して、より明るい緑色の蛍光シグナルを示し、したがって、活性化Ｔ細胞におけるＧＦＰのより高い発現を示した。組換えＡＡＶバリアントの中でも、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７は特に増強されたＧＦＰ発現を示し、このことは、Ｔ細胞への形質導入がより増強されていることを示唆する。野生型ＡＡＶ６ウイルスベクターと比較してＡＡＶバリアントからのＧＦＰ発現のレベルをさらに分析するために、ＡＡＶ６ベクターまたはＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７バリアントのいずれかを形質導入したＴ細胞をフローサイトメトリーに供し、Ｔ細胞のみを陰性対照として使用した。図３Ｃに示すように、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７バリアントを形質導入した増加した割合の細胞は、ＡＡＶ６親ベクターにより形質導入した集団と比較してより高いＧＦＰシグナル（青線を超えるＦＩＴＣシグナルにより示される）を示した。ＡＡＶバリアント（ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０１、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０２、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０４、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０５、ＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０６及びＡＡＶ．ＳＴＲＤ－２０７）を形質導入された細胞におけるＧＦＰ発現は、図４においてさらに定量化され、図４では、所与の集団におけるＧＦＰ陽性細胞の割合（％）（棒グラフで示す）及びその集団におけるＧＦＰの平均強度（線グラフで示す）が示される。この結果は、ＧＦＰ陽性細胞数の増加が、野生型ＡＡＶ６と比較して、ＡＡＶバリアントによって形質導入された細胞におけるＧＦＰシグナルの平均強度の増加とよく対応していることを示しており、このことは、ＡＡＶバリアントのＴ細胞への形質導入が増強された結果、Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現が増加したことを示している。
【0180】
上記は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物も本発明に含まれる。
【0181】
付番された実施形態
以下の実施形態のリストは、例示のみを目的として本明細書に含まれており、包括的または限定的であることを意図するものではない。特許請求される主題は、以下の実施形態に明示的に限定されない。
実施形態１．カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１７～２３のいずれか１つの配列を有する形質導入関連ペプチドを含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
実施形態２．前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３．前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０に対応するアミノ酸を置換する、実施形態１または実施形態２に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態４．前記カプシドタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含む、実施形態１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態５．カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１の配列を含み、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０が配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）を含む形質導入関連ペプチドによって置換されている、前記組換えＡＡＶベクター。
実施形態６．Ｘ１がＧではなく、Ｘ２がＳではなく、Ｘ３がＡではなく、Ｘ４がＱではなく、Ｘ５がＮではなく、Ｘ６がＫではなく、及び／またはＸ７がＤではない、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態７．Ｘ１がＨ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｖ、またはＳである、実施形態５～６のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態８．Ｘ２がＡまたはＴである、実施形態５～７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態９．Ｘ３がＰまたはＴである、実施形態５～８のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１０．Ｘ４がＲまたはＤである、実施形態５～９のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１１．Ｘ５がＶ、Ｑ、Ｃ、ＳまたはＤである、実施形態５～１０のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１２．Ｘ６がＥ、ＡまたはＰである、実施形態５～１１のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１３．Ｘ７がＥ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである、実施形態５～１２のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１４．Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＶであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＥである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１５．Ｘ１がＭであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１６．Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＣであり、Ｘ６がＡであり、Ｘ７がＮである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１７．Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＴである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１８．Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１９．Ｘ１がＶであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＰであり、Ｘ７がＡである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２０．Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ４６がＥであり、Ｘ７がＮである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２１．前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２２．前記カプシドタンパク質が配列番号１に対して約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２３．前記カプシドタンパク質が配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２４．カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１６のアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含み、前記形質導入関連ペプチドが配列番号１に対してアミノ酸４５４～４６０を置換する、前記組換えＡＡＶベクター。
実施形態２５．前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、実施形態２４に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２６．配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれか１つの配列を有する組換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、核酸。
実施形態２７．前記核酸が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群から選択される配列を含む、実施形態２６に記載の核酸。
実施形態２８．前記核酸がＤＮＡ配列である、実施形態２６または実施形態２７に記載の核酸。
実施形態２９．前記核酸がＲＮＡ配列である、実施形態２６または実施形態２７に記載の核酸。
実施形態３０．実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸を含む、発現ベクター。
実施形態３１．実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸、または実施形態３０に記載の発現ベクターを含む、細胞。
実施形態３２．前記カプシドタンパク質によってカプシド封入されたカーゴ核酸をさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３３．前記カーゴ核酸が治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする、実施形態３２に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３４．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞への形質導入の増加を示す、実施形態３２～３３のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３５．前記細胞がＴ細胞である、実施形態３４に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３６．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す、実施形態３５に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３７．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す、実施形態３５に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３８．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸、実施形態３０に記載の発現ベクター、または実施形態３１に記載の細胞を含む、組成物。
実施形態３９．実施形態３１に記載の細胞または実施形態１～２５もしくは３２～３７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
実施形態４０．ＡＡＶベクターを細胞に送達する方法であって、前記細胞を実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターと接触させることを含む、前記方法。
実施形態４１．前記細胞の接触がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．前記細胞がＴ細胞である、実施形態４０または実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターの有効量を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
実施形態４４．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターとｅｘ ｖｉｖｏで接触させた細胞を対象に投与することを含む、治療を必要とする前記対象を治療する方法。
実施形態４５．前記対象が哺乳動物である、実施形態４３または実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．前記対象がヒトである、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．医薬品として使用するための、実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
実施形態４８．治療を必要とする対象を治療する方法における使用のための、実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
以下の実施形態のリストは、例示のみを目的として本明細書に含まれており、包括的または限定的であることを意図するものではない。特許請求される主題は、以下の実施形態に明示的に限定されない。
実施形態１．カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１７～２３のいずれか１つの配列を有する形質導入関連ペプチドを含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
実施形態２．前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３．前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０に対応するアミノ酸を置換する、実施形態１または実施形態２に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態４．前記カプシドタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含む、実施形態１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態５．カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１の配列を含み、配列番号１のアミノ酸４５４～４６０が配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７（配列番号２４）を含む形質導入関連ペプチドによって置換されている、前記組換えＡＡＶベクター。
実施形態６．Ｘ１がＧではなく、Ｘ２がＳではなく、Ｘ３がＡではなく、Ｘ４がＱではなく、Ｘ５がＮではなく、Ｘ６がＫではなく、及び／またはＸ７がＤではない、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態７．Ｘ１がＨ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｖ、またはＳである、実施形態５～６のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態８．Ｘ２がＡまたはＴである、実施形態５～７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態９．Ｘ３がＰまたはＴである、実施形態５～８のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１０．Ｘ４がＲまたはＤである、実施形態５～９のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１１．Ｘ５がＶ、Ｑ、Ｃ、ＳまたはＤである、実施形態５～１０のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１２．Ｘ６がＥ、ＡまたはＰである、実施形態５～１１のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１３．Ｘ７がＥ、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＡである、実施形態５～１２のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１４．Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＶであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＥである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１５．Ｘ１がＭであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１６．Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＤであり、Ｘ５がＣであり、Ｘ６がＡであり、Ｘ７がＮである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１７．Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＴである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１８．Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＱであり、Ｘ６がＥであり、Ｘ７がＧである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態１９．Ｘ１がＶであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＰであり、Ｘ７がＡである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２０．Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＡであり、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＲであり、Ｘ５がＳであり、Ｘ４６がＥであり、Ｘ７がＮである、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２１．前記カプシドタンパク質が、配列番号１に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２２．前記カプシドタンパク質が配列番号１に対して約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２３．前記カプシドタンパク質が配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２４．カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記カプシドタンパク質が配列番号１６のアミノ酸配列を有する形質導入関連ペプチドを含み、前記形質導入関連ペプチドが配列番号１に対してアミノ酸４５４～４６０を置換する、前記組換えＡＡＶベクター。
実施形態２５．前記形質導入関連ペプチドが、配列番号１７～２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、実施形態２４に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態２６．配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれか１つの配列を有する組換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、核酸。
実施形態２７．前記核酸が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、及び１５からなる群から選択される配列を含む、実施形態２６に記載の核酸。
実施形態２８．前記核酸がＤＮＡ配列である、実施形態２６または実施形態２７に記載の核酸。
実施形態２９．前記核酸がＲＮＡ配列である、実施形態２６または実施形態２７に記載の核酸。
実施形態３０．実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸を含む、発現ベクター。
実施形態３１．実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸、または実施形態３０に記載の発現ベクターを含む、細胞。
実施形態３２．前記カプシドタンパク質によってカプシド封入されたカーゴ核酸をさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３３．前記カーゴ核酸が治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする、実施形態３２に記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３４．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、細胞への形質導入の増加を示す、実施形態３２～３３のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター。
実施形態３５．前記細胞がＴ細胞である、実施形態３４に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３６．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の核への形質導入の増加を示す、実施形態３５に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３７．前記ＡＡＶベクターが、前記形質導入関連ペプチドを含まないＡＡＶベクターと比較して、前記Ｔ細胞の細胞質基質への形質導入の増加を示す、実施形態３５に記載のＡＡＶベクター。
実施形態３８．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクター、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の核酸、実施形態３０に記載の発現ベクター、または実施形態３１に記載の細胞を含む、組成物。
実施形態３９．実施形態３１に記載の細胞または実施形態１～２５もしくは３２～３７のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
実施形態４０．ＡＡＶベクターを細胞に送達する方法であって、前記細胞を実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターと接触させることを含む、前記方法。
実施形態４１．前記細胞の接触がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２．前記細胞がＴ細胞である、実施形態４０または実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターの有効量を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
実施形態４４．実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターとｅｘ ｖｉｖｏで接触させた細胞を対象に投与することを含む、治療を必要とする前記対象を治療する方法。
実施形態４５．前記対象が哺乳動物である、実施形態４３または実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．前記対象がヒトである、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．医薬品として使用するための、実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
実施形態４８．治療を必要とする対象を治療する方法における使用のための、実施形態１～２５または３２～３７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】