特表 2024-503108 改良型アルファウイルスベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-24

(54)【発明の名称】改良型アルファウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240117BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240117BHJP

   C12N 15/117 20100101ALI20240117BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/002 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240117BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240117BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240117BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20240117BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20240117BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/113 Z

C12N15/117 Z

C12N7/01

C12N15/86 Z

C12N15/31

C12N15/33

C12N15/53

C12N15/13

C12N15/26

C12N15/24

A61P37/04

A61K48/00

A61K39/00 G

A61K39/02

A61K39/12

A61K39/002

A61K39/00 K

A61K39/39

A61P43/00 121

A61P33/00

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/00

A61P31/10

A61K35/76

A61K9/127

A61K47/18

A61K39/395 N

A61K38/19

A61K38/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023543115

(86)(22)【出願日】2022-01-19

(85)【翻訳文提出日】2023-09-05

(86)【国際出願番号】 US2022013004

(87)【国際公開番号】W WO2022159511

(87)【国際公開日】2022-07-28

(31)【優先権主張番号】63/139,297

(32)【優先日】2021-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518213307

【氏名又は名称】グリットストーン バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ホン スー－ジーン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA44

4B065CA45

4B065CA60

4C076AA19

4C076CC07

4C076CC31

4C076CC32

4C076CC34

4C076CC35

4C076DD49

4C076FF11

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA18

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA14

4C084MA02

4C084MA05

4C084MA24

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB311

4C084ZB312

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZB381

4C084ZB382

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA14

4C085AA38

4C085BA01

4C085BA02

4C085BA07

4C085BA49

4C085BA51

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB44

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE05

4C085EE06

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA09

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA05

4C087MA24

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB31

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZB38

4C087ZC75

(57)【要約】

本明細書は、複数のサブゲノミックプロモーターにより駆動される複数の発現カセットを有するアルファウイルス由来ベクターを含むワクチン組成物を開示する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

自己複製アルファウイルスベースの発現系を含む抗原発現系の送達のための組成物であって、前記自己複製アルファウイルスベースの発現系を含み、
前記自己複製アルファウイルスベースの発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
（ｂ）少なくとも２つのカセットであって、その各々が独立して、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
ａ．エピトープコード核酸配列と、
ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、
ｃ．任意選択で３’リンカー配列と
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列、及び
（ｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記アルファウイルスにとって天然のポリ（Ａ）配列または外因性のポリ（Ａ）配列である、前記第２のポリ（Ａ）配列
を含む、前記カセット
を含み、
ここで、５’側から３’側へ配向した、前記少なくとも２つのカセットのうちの第１のものは、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａを含むコア保存プロモーター配列を含む第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、前記少なくとも２つのカセットのうちの少なくとも第２のものは、前記コア保存プロモーター配列を含む第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、
前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター及び／または前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、アルファウイルスにコードされる前記コア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む、
前記自己複製アルファウイルスベースの発現系を含む抗原発現系の送達のための組成物。

【請求項2】

前記ＳＧＰ１の拡張３’側プロモーター領域が、前記ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域とは異なる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたは前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの両方ではなくいずれかが、アルファウイルスにコードされる前記コア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記拡張３’側プロモーター領域が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記拡張３’側プロモーター領域が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記拡張３’側プロモーター領域が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記拡張３’側プロモーター領域が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

前記拡張３’側プロモーター領域が、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

（ａ）前記サブゲノミックプロモーターの各々が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴを含む拡張３’側プロモーター領域を含み、（ｂ）前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたは前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの両方ではなくその一方のみが、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧをさらに含む拡張３’側プロモーター領域を含み、前記ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが、前記ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴの３’側でコードされる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項10】

前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター、前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーター、またはその両方が、アルファウイルスにコードされる前記コア保存プロモーター配列の５’側に由来する拡張５’側プロモーター領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項11】

前記拡張５’側プロモーター領域が、アルファウイルス非構造タンパク質４（ｎｓｐ４）に由来するポリヌクレオチド配列を含み、前記コア保存プロモーター配列の５’側でコードされる、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされる、請求項１０または１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｃｔｃｔを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項14】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項15】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項16】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項17】

前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなる、請求項１０に記載の組成物。

【請求項18】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなる、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ＲＮＡアルファウイルス骨格の前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項23】

前記拡張３’側プロモーター領域及び／または前記拡張５’側プロモーター領域が、前記コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項24】

前記拡張３’側プロモーター領域及び／または前記拡張５’側プロモーター領域が、前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターと前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの間の組み換えを減少させるかまたは排除することができる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項25】

前記拡張３’側プロモーター領域及び／または前記拡張５’側プロモーター領域が、１つ以上の転写エンハンサーエレメントを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項26】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、カセットの発現を、同じカセットが前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項27】

前記ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域が、カセットの発現を、同じカセットが前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項28】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、対象への投与後に、前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されているカセットによってコードされるエピトープに対して、同じカセットが前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて、より強い免疫応答を刺激することができる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項29】

前記ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域が、対象への投与後に、前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている前記カセットによってコードされるエピトープに対して、同じカセットが前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて、より強い免疫応答を刺激することができる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項30】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、前記第２のカセットの５’側に隣接してコードされ、任意選択で、前記第２のカセットのコザック配列の５’側に隣接してコードされる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項31】

前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたは前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターのいずれかが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項32】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項33】

前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項34】

（ａ）前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたは前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターのいずれかが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含み、かつ
（ｂ）他方のサブゲノミックプロモーターが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含むが、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含まない、
前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項35】

前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターがポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含み、前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターがポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含み、ここで、前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターが、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含まない、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項36】

免疫原性ポリペプチドをコードする前記核酸配列のうちの１つ以上の規則配列が、５’側から３’側へ、以下を含む式で表され：
Ｐ_１－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－Ｐ_２－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇ
式中、Ｐ_１は、前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐ_２は、前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐ_ａについては、追加のカセットについてａ＝０または１であり、
Ｎは前記エピトープコード核酸配列を含み、ｃ＝１であり、
Ｌ５は前記５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、
Ｌ３は前記３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、
Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、
Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃは、対応するエピトープコード核酸配列であり、かつ
Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆは普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、任意選択で、少なくとも１つの前記普遍的配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む、
請求項１～３５のいずれかに記載の組成物。

【請求項37】

各Ｘについて、前記対応するＮ_ｃは、別個のエピトープコード核酸配列である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

各Ｙについて、前記対応するＵ_ｆは、別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、請求項３６または３７に記載の組成物。

【請求項39】

各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、
Ｌ５は、前記エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、前記５’リンカー配列が、少なくとも２アミノ酸長であるペプチドをコードし、
Ｌ３は、前記エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、前記３’リンカー配列が、少なくとも２アミノ酸長であるペプチドをコードする、
請求項３６～３８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項40】

前記エピトープコード核酸配列が、
コードする前記エピトープの配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは別個のものにする、少なくとも１つの変化、
病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び寄生虫由来ペプチドからなる群より選択される感染症生物ペプチドをコードする核酸配列であって、任意選択で、前記エピトープコード核酸配列が、ＭＨＣクラスＩエピトープもしくはＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードする、前記感染症生物ペプチドをコードする核酸配列、または
それらの組み合わせ
を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項41】

ナノ粒子状送達ビヒクルをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項42】

前記ナノ粒子状送達ビヒクルが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項３９に記載の組成物。

【請求項43】

前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項４２に記載の組成物。

【請求項44】

前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート）分子を含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項45】

前記ナノ粒子状送達ビヒクルが前記抗原発現系を内包する、請求項３９～４４のいずれかに記載の組成物。

【請求項46】

前記骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項47】

前記骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項48】

前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項49】

前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項50】

非構造タンパク質媒介性増幅のための配列が、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔ ＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項51】

前記骨格が、構造ビリオンタンパク質であるカプシド、Ｅ２及びＥ１をコードしない、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項52】

前記カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内で構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項53】

ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号３または配列番号５の配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項54】

ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４～１１１７６の欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項55】

前記骨格が、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項56】

前記カセットが、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４～１１１７６の欠失に取って代わるよう７５４４位に挿入されている、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項57】

前記カセットのうちの１つ以上が、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド長である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項58】

前記カセットのうちの１つ以上が、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチド長である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項59】

前記１つ以上のベクターが、少なくとも３５００ヌクレオチド長であるカセットの発現を駆動することができる、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項60】

前記１つ以上のベクターが、少なくとも６０００ヌクレオチド長であるカセットの発現を駆動することができる、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項61】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、ＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項62】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項63】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部分をコードするエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、前記Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部分が、抗体により結合され得ることが予測されるかもしくは既知である、全長タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質サブユニット、または抗原断片を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項64】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、２つ以上の抗原コード核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項65】

各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

各抗原コード核酸配列が、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている、請求項６４または６５に記載の組成物。

【請求項67】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があることが予測または確認された２つ以上の別個のエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項68】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項69】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または最大４００個の核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項70】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示され、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示され、かつ／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができる、ポリペプチド配列もしくはそれらの一部をコードする、エピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項71】

前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示され、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示され、かつ／または（３）Ｂ細胞応答クラスを刺激することができる、ポリペプチド配列もしくはそれらの一部をコードする、エピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項72】

対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つのエピトープコード核酸配列によってコードされるエピトープのうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、細胞表面上の抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答が生じる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項73】

対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列によってコードされる抗原のうちの少なくとも１つが、前記抗原のうちの少なくとも１つを標的とする抗体反応を生じさせる、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項74】

前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答が生じ、任意選択で、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の各々の発現が、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項75】

各ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列が、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項76】

少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項77】

少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在しかつ少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項78】

少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項79】

少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在しかつ少なくとも１つの普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、前記少なくとも１つの普遍的配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つ、及び／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項80】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項81】

前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項82】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格にとって天然のポリ（Ａ）配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項83】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格にとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項84】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項85】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項86】

前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも８０個の連続するＡヌクレオチドである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項87】

前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項88】

前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列もしくはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列、または２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列もしくはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む、請求項８７に記載の組成物。

【請求項89】

前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が、２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列を含み、任意選択で、前記２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列が、２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、２つ以上のＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、またはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列とＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む、請求項８７に記載の組成物。

【請求項90】

前記抗原カセットが、
イントロン配列、外因性イントロン配列、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、Ｆｕｒｉｎ切断部位をコードするヌクレオチド配列、または前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されているｍＲＮＡの核外輸送、安定性、もしくは翻訳効率を増強させることが知られている５’側もしくは３’側の非コード領域内の配列
のうちの少なくとも１つをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項91】

前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープが含まれるがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項92】

前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓ－タグ、またはＶ５タグからなる群より選択される、請求項９１に記載の組成物。

【請求項93】

前記１つ以上のベクターが、少なくとも１つの免疫調節因子をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。

【請求項94】

前記免疫調節因子が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である、請求項９３に記載の組成物。

【請求項95】

前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは共に連結された多重特異性抗体のいずれかとしての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または全長一本鎖抗体（例えば、重鎖と軽鎖が可動性リンカーによって連結されている全長ＩｇＧ）である、請求項９４に記載の組成物。

【請求項96】

前記抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、２Ａ等の自己切断配列もしくはＩＲＥＳのいずれかにより区切られている連続配列であるか、または前記抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、連続グリシン残基等の可動性リンカーによって連結されている、請求項９４または９５に記載の組成物。

【請求項97】

前記免疫調節因子がサイトカインである、請求項９３に記載の組成物。

【請求項98】

前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１またはそれら各々のバリアントのうちの少なくとも１つである、請求項９７に記載の組成物。

【請求項99】

前記組成物のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。

【請求項100】

前記組成物のうちのいずれかのヌクレオチド配列または単離されたヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意選択で、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である、前記細胞。

【請求項101】

前記組成物請求項のいずれかに記載の組成物及び使用説明書を含むキット。

【請求項102】

対象を治療するための方法であって、前記組成物請求項のいずれかに記載の組成物または前記組成物のうちのいずれかの医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項103】

対象での免疫応答を誘導するための方法であって、前記組成物請求項のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項104】

前記対象が、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の前記エピトープコード核酸配列によってコードされるＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されるかもしくは既知である少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、請求項１０２～１０３のいずれかに記載の方法。

【請求項105】

自己複製アルファウイルスベースの発現系を含むペイロードの送達のための組成物であって、前記自己複製アルファウイルスベースの発現系を含み、
前記自己複製アルファウイルスベースの発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが、
（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
（ｂ）少なくとも２つのカセットであって、その各々が独立して、
（ｉ）少なくとも１つのペイロードコード核酸配列、及び
（ｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記アルファウイルスにとって天然のポリ（Ａ）配列または外因性のポリ（Ａ）配列である、前記第２のポリ（Ａ）配列
を含む、前記カセット
を含み、
ここで、５’側から３’側へ配向した、前記少なくとも２つのカセットのうちの第１のものは、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａを含むコア保存プロモーター配列を含む第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、前記少なくとも２つのカセットのうちの少なくとも第２のものは、前記コア保存プロモーター配列を含む第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、
前記ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター及び／または前記ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、アルファウイルスにコードされる前記コア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む、
前記自己複製アルファウイルスベースの発現系を含むペイロードの送達のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１月１９日に出願の米国仮出願第６３／１３９，２９７号の利益を主張するものであり、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本発明に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年５月１９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＧＳＯ＿１０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、サイズが１０，１４２，３３０バイトである。

【背景技術】

【0003】

背景
アルファウイルスは、ヒト及び他の動物における多くの疾患に関与する小さな一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの一群である。例えば、“Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅｐｔ．１９９４，ｐ．４９１－５６２（非特許文献１）、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｉｏｂｏｌ．，２００９，ｖ．４：８３７－８５６（非特許文献２）を参照のこと。アルファウイルスは、それらの複製効率及び特異性が高いことから、哺乳類細胞での異種タンパク質の発現のための自己複製ＲＮＡベクターの操作において有用であることが証明されている。例えば、Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＰＮＡＳ，１９９６，ｖ．９３，ｐｐ．１１３７１－１１３７７（非特許文献３）、Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡｓ”，ＰＮＡＳ，２０１４，ｖ．１１：２９，ｐｐ．１０７０８－１０７１３（非特許文献４）を参照のこと。この分野ではいくらかの前進が見られるものの、標的細胞へのＲＮＡベクターの送達の効率、ＲＮＡベクターからの異種タンパク質の発現の効率、ＲＮＡベクターから発現するタンパク質の「個別化」の容易さ、ある特定の異種タンパク質（例えば、ネオアンチゲン）がＲＮＡベクターから発現した場合の免疫応答の改善、及び／またはそのようなＲＮＡベクターの製造効率の改善等の領域では、改善が必要とされている。

【非特許文献1】“Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅｐｔ．１９９４，ｐ．４９１－５６２

【非特許文献2】Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｉｏｂｏｌ．，２００９，ｖ．４：８３７－８５６

【非特許文献3】Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＰＮＡＳ，１９９６，ｖ．９３，ｐｐ．１１３７１－１１３７７

【非特許文献4】Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡｓ”，ＰＮＡＳ，２０１４，ｖ．１１：２９，ｐｐ．１０７０８－１０７１３

【発明の概要】

【0004】

概要
本明細書では、自己複製アルファウイルスベースの発現系を含む抗原発現系の送達のための組成物を提供し、かかる自己複製アルファウイルスベースの発現系の送達のための組成物が、自己複製アルファウイルスベースの発現系を含み、自己複製アルファウイルスベースの発現系が１つ以上のベクターを含み、１つ以上のベクターが、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに（ｂ）少なくとも２つのカセットであって、その各々が独立して、（ｉ）ａ．エピトープコード核酸配列と、ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、ｃ．任意選択で３’リンカー配列と、を含む、少なくとも１つの抗原コード核酸配列；及び（ｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、アルファウイルスにとって天然ポリ（Ａ）配列または外因性ポリ（Ａ）配列である、第２のポリ（Ａ）配列、を含む、カセット、を含み、ここで、５’側から３’側へ配向した、少なくとも２つのカセットのうちの第１のものは、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａを含むコア保存プロモーター配列を含む第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、少なくとも２つのカセットのうちの少なくとも第２のものは、コア保存プロモーター配列を含む第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター及び／またはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、アルファウイルスにコードされるコア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む。

【0005】

本明細書ではまた、自己複製アルファウイルスベースの発現系を含むペイロードの送達のための組成物も提供し、かかる自己複製アルファウイルスベースの発現系の送達のための前記組成物が、（Ａ）自己複製アルファウイルスベースの発現系を含み、自己複製アルファウイルスベースの発現系が１つ以上のベクターを含み、１つ以上のベクターが、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格；ならびに（ｂ）少なくとも２つのカセットであって、その各々が独立して、（ｉ）少なくとも１つのペイロードコード核酸配列、及び（ｉｉ）任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、アルファウイルスにとって天然ポリ（Ａ）配列または外因性ポリ（Ａ）配列である、第２のポリ（Ａ）配列、を含む、カセット、を含み、ここで、５’側から３’側へ配向した、少なくとも２つのカセットのうちの第１のものは、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａを含むコア保存プロモーター配列を含む第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、少なくとも２つのカセットのうちの少なくとも第２のものは、コア保存プロモーター配列を含む第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター及び／またはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、アルファウイルスにコードされるコア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む。

【0006】

いくつかの態様では、ＳＧＰ１の拡張３’側プロモーター領域は、ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域とは異なる。

【0007】

いくつかの態様では、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの両方ではなくいずれかが、アルファウイルスにコードされるコア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む。

【0008】

いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴを含む。いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む。いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴからなる。いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなる。いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む。

【0009】

いくつかの態様では、（ａ）サブゲノミックプロモーターの各々が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴを含む拡張３’側プロモーター領域を含み、（ｂ）ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの両方ではなくその一方のみが、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧをさらに含む拡張３’側プロモーター領域を含み、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧは、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴの３’側でコードされる。

【0010】

いくつかの態様では、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーター、またはその両方が、アルファウイルスにコードされるコア保存プロモーター配列の５’側に由来する拡張５’側プロモーター領域を含む。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、アルファウイルス非構造タンパク質４（ｎｓｐ４）に由来するポリヌクレオチド配列を含み、コア保存プロモーター配列の５’側でコードされる。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされる。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｃｔｃｔを含む。

【0011】

いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなる。

【0012】

いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなる。

【0013】

いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格の少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターを含む。

【0014】

いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来する。

【0015】

いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域は、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターとＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの間の組み換えを減少させるかまたは排除することができる。いくつかの態様では、拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域は、１つ以上の転写エンハンサーエレメントを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターは、カセットの発現を、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができる。いくつかの態様では、ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域は、カセットの発現を、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができる。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターは、対象への投与後に、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されているカセットによってコードされるエピトープに対して、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて、より強い免疫応答を刺激することができる。いくつかの態様では、ＳＧＰ２の拡張３’側プロモーター領域及び／または拡張５’側プロモーター領域は、対象への投与後に、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されているカセットによってコードされるエピトープに対して、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて、より強い免疫応答を刺激することができる。

【0016】

いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターは、第２のカセットの５’側に隣接してコードされ、任意選択で、第２のカセットのコザック配列の５’側に隣接してコードされる。

【0017】

いくつかの態様では、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターのいずれかが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含む。いくつかの態様では、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含む。

【0018】

いくつかの態様では、（ａ）ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターまたはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターのいずれかが、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含み、（ｂ）他方のサブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含むが、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含まない。いくつかの態様では、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含み、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含み、ここで、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターは、ポリヌクレオチド配列ＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含まない。

【0019】

いくつかの態様では、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列のうちの１つ以上の規則配列は、５’側から３’側へ、以下を含む式で表され：
Ｐ１－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－Ｐ２－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
式中、Ｐ１は、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐ２は、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐａの場合、追加のカセットについてａ＝０または１であり、Ｎはエピトープコード核酸配列を含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮｃは、対応するエピトープコード核酸配列であり、かつ、Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵｆは普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、任意選択で、少なくとも１つの普遍的配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む。

【0020】

いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは別個のエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは別個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、５’リンカー配列が、少なくとも２アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、３’リンカー配列が、少なくとも２アミノ酸長であるペプチドをコードする。

【0021】

いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、コードするエピトープの配列を、野生型核酸配列によりコードされる対応するペプチド配列とは別個のものにする少なくとも１つの変化；病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び寄生虫由来ペプチドからなる群より選択される感染症生物ペプチドをコードする核酸配列であって、任意選択で、エピトープコード核酸配列が、ＭＨＣクラスＩエピトープもしくはＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードする、感染症生物ペプチドをコードする核酸配列、またはそれらの組み合わせ、を含む。

【0022】

いくつかの態様では、組成物はさらに、ナノ粒子状送達ビヒクルを含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは、抗原発現系を内包する。

【0023】

いくつかの態様では、骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされる、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介性増幅のための配列は、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔ ＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、骨格は、構造ビリオンタンパク質であるカプシド、Ｅ２及びＥ１をコードしない。いくつかの態様では、カセットは、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内で構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４～１１１７６の欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４～１１１７６の欠失に取って代わるよう７５４４位に挿入される。

【0024】

いくつかの態様では、カセットのうちの１つ以上は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、カセットのうちの１つ以上は、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも３５００ヌクレオチド長であるカセットの発現を駆動することができる。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも６０００ヌクレオチド長であるカセットの発現を駆動することができる。

【0025】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩによって提示されるエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部分をコードするエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、Ｂ細胞応答を刺激することができるポリペプチド配列またはその一部分は、抗体により結合され得ることが予測されるかもしくは既知である、全長タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質サブユニット、または抗原断片を含む。

【0026】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、２つ以上の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は互いに直接連結されている。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列は、リンカーをコードする核酸配列により別個の抗原コード核酸配列に連結されている。

【0027】

いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによる提示能があることが予測または確認されている２つ以上の別個のエピトープをコードするエピトープコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～１０、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも１１～２０、１５～２０、１１～１００、１１～２００、１１～３００、１１～４００、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または最大４００個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、少なくとも２～４００個の核酸配列を含み、抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つは、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示され、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示され、かつ／または（３）Ｂ細胞応答を刺激することができる、ポリペプチド配列もしくはそれらの一部をコードする、エピトープコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つは、（１）ＭＨＣクラスＩによって提示され、（２）ＭＨＣクラスＩＩによって提示され、かつ／または（３）Ｂ細胞応答クラスを刺激することができる、ポリペプチド配列もしくはそれらの一部をコードする、エピトープコード核酸配列を含む。

【0028】

いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、少なくとも１つのエピトープコード核酸配列によってコードされたエピトープのうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、細胞表面上の抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答が生じる。いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、少なくとも１つの抗原コード核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つは、抗原のうちの少なくとも１つを標的とする抗体反応を生じさせる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列が対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、細胞表面上の抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答が生じ、任意選択で、少なくとも１つの抗原コード核酸配列の各々の発現が、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される。

【0029】

いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列は、８～３５アミノ酸長、任意選択で、９～１７、９～２５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸長のポリペプチド配列をコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は、１２～２０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０～４０アミノ酸長である。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つの普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意選択で、少なくとも１つの普遍的配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つ、及び／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含む。

【0030】

いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、骨格にとって天然のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、骨格にとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０個の連続するＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも８０個の連続するＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在する。いくつかの態様では、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列もしくはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列、または２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列もしくはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列は、２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列を含み、任意選択で、２つ以上の第２のポリ（Ａ）配列は、２つ以上のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、２つ以上のＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、またはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列とＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列の組み合わせを含む。

【0031】

いくつかの態様では、抗原カセットはさらに、イントロン配列、外因性イントロン配列、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、Ｆｕｒｉｎ切断部位をコードするヌクレオチド配列、または少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されているｍＲＮＡの核外輸送、安定性、もしくは翻訳効率を増強させることが知られている５’側もしくは３’側の非コード領域内の配列、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗原カセットはさらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープが含まれるがこれらに限定されないレポーター遺伝子を含む。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓ－タグ、またはＶ５タグからなる群より選択される。

【0032】

いくつかの態様では、１つ以上のベクターはさらに、少なくとも１つの免疫調節因子をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの態様では、免疫調節因子は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは共に連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または全長一本鎖抗体（例えば、重鎖と軽鎖が可動性リンカーによって連結されている全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の重鎖配列及び軽鎖配列は、２Ａ等の自己切断配列もしくはＩＲＥＳのいずれかにより区切られている連続配列であるか、または抗体の重鎖配列及び軽鎖配列が、連続グリシン残基等の可動性リンカーによって連結されている。いくつかの態様では、免疫調節因子はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１またはそれら各々のバリアントのうちの少なくとも１つである。

【0033】

本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含むベクターまたはベクターのセットも提供する。

【0034】

本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかのヌクレオチド配列または単離されたヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞も提供し、任意選択で、細胞は、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である。

【0035】

本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの組成物及び使用説明書を含むキットも提供する。

【0036】

本明細書ではまた、対象を治療するための方法も提供し、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかまたは本明細書に記載される医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。

【0037】

本明細書ではまた、対象での免疫応答を誘導するための方法も提供し、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかまたは本明細書に記載される医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。

【0038】

いくつかの態様では、対象は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のエピトープコード核酸配列によってコードされるＭＨＣクラスＩエピトープもしくはＭＨＣクラスＩＩエピトープを提示することが予測されるかまたは既知である少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。

【0039】

いくつかの態様では、上記組成物のうちのいずれかはさらに、ナノ粒子状送達ビヒクルを含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってよい。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは、抗原発現系を内包する。

【0040】

いくつかの態様では、上記組成物のうちのいずれかはさらに複数のＬＮＰを含み、ＬＮＰは、抗原発現系、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質を含み、ここで、複数のＬＮＰ中の少なくとも約９５％のＬＮＰは、非層状形態を有する、または高電子密度であるかのいずれかである。

【0041】

いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質と、（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物である。

【0042】

いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びそれらの混合物からなる群より選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ_１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ_１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ_１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ_１６）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）複合体、及びそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである。

【0043】

いくつかの態様では、抗原発現系は、ＬＮＰ中に完全に封入されている。

【0044】

いくつかの態様では、ＬＮＰの非層状形態は、逆ヘキサゴナル相（Ｈ_ＩＩ）またはキュービック相の構造を含む。

【0045】

いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。

【0046】

いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。

【0047】

いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％を構成する。

【0048】

いくつかの態様では、ＬＮＰのうち９５％超は、非層状形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰのうち９５％超は、高電子密度である。

【0049】

いくつかの態様では、上記組成物のうちのいずれかはさらに複数のＬＮＰを含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する総脂質の５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質；ＬＮＰ中に存在する総脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質；及び非カチオン性脂質であって、以下のいずれか、すなわち、リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物であって、リン脂質が、ＬＮＰ中に存在する総脂質の４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％を構成し、コレステロールもしくはその誘導体が、ＬＮＰ中に存在する総脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成するもの；リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物であって、リン脂質が、ＬＮＰ中に存在する総脂質の３ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％を構成し、コレステロールもしくはその誘導体が、ＬＮＰ中に存在する総脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成するもの、を含むか、またはＬＮＰ中に存在する総脂質の最大４９．５ｍｏｌ％を構成して、リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物に含まれ、コレステロールもしくはその誘導体が、ＬＮＰ中に存在する総脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、非カチオン性脂質、を含む。

【0050】

いくつかの態様では、上記組成物のうちのいずれかはさらに複数のＬＮＰを含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する総脂質の５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質；ＬＮＰ中に存在する総脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質；及びＬＮＰ中に存在する総脂質の１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質を含む。

【0051】

いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの混合物を含む。

【0052】

いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはそれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはそれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、平均分子量が約２，０００ダルトンである。

【0053】

いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する。

【0054】

いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉ：

の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含み、式中、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｒ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ａ－、－Ｒ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ａ－、－Ｒ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－もしくは直接結合であり；Ｇ^１は、Ｃ_１－Ｃ_２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｒ^ａＣ（＝Ｏ）－または直接結合であり：－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ａ－もしくは直接結合であり；Ｇは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキレンであり；Ｒ^ａは、ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^１ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり；Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^２ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり；Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^３ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり；Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^４ａがＨもしくはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ^４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり；Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり；Ｒ^７はＣ４－Ｃ２０アルキルであり；Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ^８とＲ^９は、それらが結合している窒素原子と共に、５員、６員もしくは７員の複素環を形成し；ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して１～２４の整数であり；ｘは、０、１または２である。

【0055】

いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩ：

の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含み、式中、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－もしくは炭素－炭素二重結合であり、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^１ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^１ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^１ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、Ｒ^２ａ及びＲ^２ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^２ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^２ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^２ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^３ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^３ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^３ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、それぞれの出現において、独立して、（ａ）ＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ^４ａがＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^４ｂは、それが結合している炭素原子と共に、隣接するＲ^４ｂ及びそれが結合している炭素原子と一緒になって炭素－炭素二重結合を形成するかのいずれかであり、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、Ｒ^７は、それぞれの出現において、独立してＨもしくはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり、Ｒ^８及びＲ^９は、それぞれ独立して、非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ^８とＲ^９は、それらが結合している窒素原子と共に、１個の窒素原子を含む５員、６員もしくは７員の複素環を形成し、ａ及びｄは、それぞれ独立して０～２４の整数であり、ｂ及びｃは、それぞれ独立して１～２４の整数であり、ｅは、１もしくは２であるが、ただし、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａもしくはＲ^４ａのうち少なくとも１つがＣ１－Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ^１もしくはＬ^２のうち少なくとも一方が－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－もしくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、ａが６の場合はイソプロピルではない、またはａが８の場合はｎ－ブチルではないことを条件とする。

【0056】

いくつかの態様では、上記組成物のうちのいずれかはさらに、中性脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質を含む１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0057】

いくつかの態様では、化合物と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。

【0058】

いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールのモル比は、約２：１～１：１の範囲である。

【0059】

いくつかの態様では、ポリマー結合脂質はペグ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とペグ化脂質のモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ペグ化脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒまたはＰＥＧジアルキオキシプロピルカルバマート（ｄｉａｌｋｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ）である。いくつかの態様では、ペグ化脂質は、以下の構造ＩＩＩ：

を有する、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、Ｒ^１０及びＲ^１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖は任意選択で、１つ以上のエステル結合により中断され、ｚは、平均値が３０～６０の範囲である。いくつかの態様では、Ｒ^１０及びＲ^１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、ｚの平均は約４５である。ここから開始

【0060】

いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性核酸と混合すると自己組織化して非二重層構造になる。いくつかの態様では、非二重層構造は、直径が６０ｎｍ～１２０ｎｍである。いくつかの態様では、非二重層構造は、直径が約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍである。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは、直径が約１００ｎｍである。

【0061】

本明細書ではまた、本明細書に記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれかを含むベクターまたはベクターのセットも提供する。本明細書ではまた、本明細書に開示される単離されたヌクレオチド配列を含むベクターも開示する。

【0062】

本明細書ではまた、本明細書に記載されるヌクレオチド配列または単離されたヌクレオチド配列のセットのうちいずれかを含む単離細胞も提供し、任意選択で、細胞は、ＢＨＫ－２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａ細胞である。

【0063】

本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか及び使用説明書を含むキットも提供する。本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターまたは組成物及び使用説明書を含むキットも開示する。

【0064】

本明細書ではまた、Ｃｏｖｉｄ－１９を患う対象を治療するための方法も提供し、かかる方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかまたは医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。

【0065】

本明細書ではまた、対象を治療するための方法も提供し、かかる方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかまたは医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。

【0066】

本明細書ではまた、対象での免疫応答を刺激するための方法も提供し、かかる方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかまたは医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。

【0067】

本明細書ではまた、対象を治療するための方法も開示し、かかる方法は、本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0068】

本明細書ではまた、上記組成物のうちのいずれかの１つ以上のベクターを製造する方法も開示する。

【0069】

本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかを製造する方法も開示する。

【図面の簡単な説明】

【0070】

本発明のこれら及び他の、特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面の参照によりさらに良く理解される。

【0071】

【図1】単一アルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ）を特徴とする自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）系を示す。

【0072】

【図2】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセットを特徴とするＳＡＭ系を示す。

【0073】

【図3】別々のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ）により駆動される複数の発現カセットを特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。免疫２週間後のＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔの結果が示されている。スパイク、ヌクレオカプシド、またはＯｒｆ３ａに広がる重複ペプチドプールに対するＴ細胞応答が示されている。

【0074】

【図4】別々のＣＭＶプロモーターにより駆動される複数の発現カセットを特徴とするＣｈＡｄＶ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。免疫２週間後のＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔの結果が示されている。スパイク、ヌクレオカプシド、またはＯｒｆ３ａに広がる重複ペプチドプールに対するＴ細胞応答が示されている。

【0075】

【図5】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット５「ＴＣＥ５」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。左パネルは、スパイク抗原に広がる８つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。右パネルは、ＮＣａｐ、膜、及びＯｒｆ３ａに広がる３つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。データは、１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫したＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）で、免疫後２週間目に脾細胞の単離を行った場合である。

【0076】

【図6】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット５「ＴＣＥ５」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスのスパイク特異的ＩｇＧ反応を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫した（ｎ＝４／群）。免疫後４週間目に血清を採取して分析した。Ｓ１ ＩｇＧ結合をＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより測定。エンドポイント力価を内挿。幾何平均、幾何学的ＳＤ。

【0077】

【図7】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット６または７「ＴＣＥ６／７」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。上のパネルは、スパイク抗原に広がる８つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。下パネルは、ＮＣａｐ、膜、及びＯｒｆ３ａに広がる３つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。データは、１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫したＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）で、免疫後２週間目に脾細胞の単離を行った場合である。

【0078】

【図8】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット６または７「ＴＣＥ６／７」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスのスパイク特異的ＩｇＧ反応を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫した（ｎ＝４／群）。免疫後４週間目に血清を採取して分析した。Ｓ１ ＩｇＧ結合をＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより測定。エンドポイント力価を内挿。幾何平均、幾何学的ＳＤ。

【0079】

【図9】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット５または８「ＴＣＥ５／８」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。上のパネルは、スパイク抗原に広がる８つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。下パネルは、ＮＣａｐ、膜、及びＯｒｆ３ａに広がる３つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。データは、１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫したＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）で、免疫後２週間目に脾細胞の単離を行った場合である。

【0080】

【図10】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＩＤＴ－スパイク」及びＴ細胞エピトープカセット５または８「ＴＣＥ５／８」）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスのスパイク特異的ＩｇＧ反応を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫した（ｎ＝４／群）。免疫後４週間目に血清を採取して分析した。Ｓ１ ＩｇＧ結合をＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより測定。エンドポイント力価を内挿。幾何平均、幾何学的ＳＤ。

【0081】

【図11】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＳＡ－スパイク」、及びＴ細胞エピトープカセット９「ＴＣＥ９」またはヌクレオカプシドとＴＣＥ１１の組み合わせ「Ｎｕｃ－ＴＣＥ１１）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスの、ＥＬＩＳｐｏｔを使用して測定された抗原特異的細胞性免疫応答を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。左パネルは、スパイク抗原に広がる８つの重複ペプチドプールに対する反応の総和を示す。中央パネルは、ＴＣＥ（Ｏｒｆ３ａ、膜ならびにＮＳＰ３、４、６及び１２の遺伝子）のためのタンパク質特異的ペプチドプールを用いたＥＬＩＳｐｏｔにより検出されたＴ細胞応答の和を示す。右パネルは、は、ヌクレオカプシドに広がるペプチドプールに対する反応の総和を示す。データは、１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫したＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）で、免疫後２週間目に脾細胞の単離を行った場合である。１４日目、Ｔ細胞分析のために各群で６匹のマウスから脾臓を採取した。残りのマウス（ｎ＝６）からの血清を、抗ＩｇＧ ＭＳＤ ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ応答について０週目、４週目、８週目及び１２週目に分析した。４週間のＩｇＧデータが示されている。

【0082】

【図12】別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセット（スパイク「ＳＡ－スパイク」、及びＴ細胞エピトープカセット９「ＴＣＥ９」またはヌクレオカプシドとＴＣＥ１１の組み合わせ「Ｎｕｃ－ＴＣＥ１１）を特徴とするＳＡＭ系ワクチン接種を受けたマウスのスパイク特異的ＩｇＧ反応を示す。様々なカセット編成の概略が上部に示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０ｕｇの各ＳＡＭワクチンで免疫した（ｎ＝６／群）。免疫後０週目、４週目、８週目及び１２週目に血清を採取して分析した。免疫４週間後が示されている。Ｓ１ ＩｇＧ結合をＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより測定。エンドポイント力価を内挿。幾何平均、幾何学的ＳＤ。

【発明を実施するための形態】

【0083】

詳細な説明
本明細書では、多シストロン性アルファウイルス由来自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクター及び本明細書に記載されるペイロード／抗原発現系の送達のための組成物について記載する。多シストロン性ＳＡＭコンストラクトには、（Ａ）自己複製アルファウイルスベースの発現系が含まれ、かかる自己複製アルファウイルスベースの発現系には１つ以上のベクターが含まれ、かかる１つ以上のベクターには、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格であって、（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と、が含まれる、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに（ｂ）ペイロード配列を発現する少なくとも２つのカセットであって、５’側から３’側へ配向した、少なくとも２つのカセットのうちの第１のものは、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａを含むコア保存プロモーター配列を含む第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、少なくとも２つのカセットのうちの少なくとも第２のものは、コア保存プロモーター配列を含む第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）を含むプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーター及び／またはＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターが、アルファウイルスにコードされるコア保存プロモーター配列の３’側に由来する拡張３’側プロモーター領域を含む、少なくとも２つのカセット、が含まれる。

【0084】

理論に拘束されることは望まないが、一般に、本明細書での多シストロン性ＳＡＭベクターは、当該分野に存在する潜在的な技術的制約に対処し、これには、（１）大型カセット（例えば、天然アルファウイルスサブゲノミックプロモーターから発現する天然カセットのサイズより大きい、例えば、長さが約４ｋｂ以上のカセット）が含まれている複数のペイロードの発現を改善すること、（２）複数のペイロードの発現の制御改善、例えば、異なるペイロードの相対発現を制御すること、及び（３）ベクター組み換え事象（例えば、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター間でのベクター内部プロモーターの組み換え）の減少等によるベクター安定性の改善、が含まれるがこれらに限定されない。

【0085】

例示的ワクチンの状況では、カセットの各々は、独立して、（ｉ）ａ．エピトープコード核酸配列と、ｂ．任意選択で５’リンカー配列と、ｃ．任意選択で３’リンカー配列と、を含む、少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むことができる。

【0086】

カセットには、任意選択で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列を含めることができ、ここで、第２のポリ（Ａ）配列は、アルファウイルス骨格にとって天然ポリ（Ａ）配列であるかまたは外因性ポリ（Ａ）配列である。

【0087】

本明細書での多シストロン性ＳＡＭベクターには、コア保存プロモーター配列が含まれる複数のサブゲノミックプロモーターが含まれる。一般に、最小「保存」プロモーター配列には、ポリヌクレオチド配列ｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａが含まれ、ここで、「＋１」は、サブゲノミックプロモーターの推定転写開始部位を示す。アルファウイルスサブゲノミックプロモーターの追加のフランキング配列は、プロモーター活性に影響を与えることができ、コアプロモーターの一部と見なされ得る。例えば、追加のフランキング配列は、検出可能なインビトロでの発現及び／または検出可能なインビボでの有効性（例えば、免疫応答の刺激における有効性）を生み出すために必要となる場合がある。

【0088】

サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１、ＳＧＰ２、または両方）には、拡張３’側プロモーター領域が含まれ得る。拡張３’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来し得る。拡張３’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来し得る。拡張３’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれ得る。拡張３’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴと、アルファウイルス、例えば、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来する、追加の拡張３’側プロモーター領域のポリヌクレオチドと、が含まれ得る。拡張３’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれ得る。拡張３’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれ得る。拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴを含むことができ、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされて（すなわち、コア保存プロモーターと拡張３’側プロモーター領域との間に散在ヌクレオチドが１つも含まれない）、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれるサブゲノミックプロモーターをもたらし得る。拡張３’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含むことができ、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされて、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるサブゲノミックプロモーターをもたらし得る。

【0089】

サブゲノミックプロモーターのうちの一方（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）には、拡張３’側プロモーター領域が含まれ得る。サブゲノミックプロモーターのうちの一方には、他方の拡張３’側プロモーター領域とは異なる拡張３’側プロモーター領域が含まれ得る（例えば、ＳＧＰ１及びＳＧＰ２は、異なる拡張３’側プロモーター領域を有する）。理論に拘束されることは望まないが、例えば、拡張３’側プロモーター領域は、ベクターの安定性を、例えば、拡張３’側プロモーター領域をサブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（ＳＧＰ１またはＳＧＰ２であって、両方ではない）に含めることでベクター組み換え事象（例えば、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター間でのベクター内部プロモーターの組み換え）を減少させることにより改善することができる。

【0090】

理論に拘束されることは望まないが、別の例では、拡張３’側プロモーター領域は、発現の制御、例えば、様々なサブゲノミックプロモーターからのカセットの発現の相対強度を制御することを、拡張３’側プロモーター領域をサブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（ＳＧＰ１またはＳＧＰ２であって、両方ではない）に含めることで改善することができる。

【0091】

サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができる。サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴと、アルファウイルス、例えば、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来する追加のポリヌクレオチドと、が含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができる。サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域配列を含むことができる。

【0092】

サブゲノミックプロモーターのうちの１つまたは全部が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができるが、サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、アルファウイルス、例えば、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来する、追加の拡張３’側プロモーター領域のポリヌクレオチドを含むことができる。サブゲノミックプロモーターのうちの１つまたは全部が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができるが、サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域配列を含むことができる。

【0093】

サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができる。サブゲノミックプロモーターのうちの１つまたは全部が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができるが、サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができる。

【0094】

サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができ、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされて、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれるサブゲノミックプロモーターをもたらし得る。

【0095】

サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができ、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされて、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるサブゲノミックプロモーターをもたらし得る。

【0096】

サブゲノミックプロモーターのうちの１つまたは全部が、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができるが、サブゲノミックプロモーターのうちの一方のみ（すなわち、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかであって、両方ではない）が、ポリヌクレオチド配列ＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる拡張３’側プロモーター領域を含むことができ、コア保存プロモーター配列の３’側に隣接してコードされ得る。

【0097】

場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣまたは追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣのいずれかと対になった、ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧのいずれかが含まれる。場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡまたは追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡのいずれかと対になった、ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧまたはＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧのいずれかが含まれる。

【0098】

場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、いずれも追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣと対になったＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣと対になったＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。

【0099】

場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、いずれも追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴと対になったＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡと対になったＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。

【0100】

場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣと対になったＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣと対になったＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。

【0101】

場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡと対になったＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。場合によっては、対サブゲノミックプロモーター配列（すなわち、ＳＧＰ１とＳＧＰ２）には、追加の拡張３’側プロモーター領域を含まないＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡと対になったＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれる。

【0102】

サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ１、ＳＧＰ２、または両方）には、拡張５’側プロモーター領域が含まれ得る。理論に拘束されることは望まないが、拡張５’側プロモーター領域は、発現の制御、例えば、様々なサブゲノミックプロモーターからのカセットの発現の相対強度を制御することを、拡張５’側プロモーター領域を含めることで改善することができる。拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来し得る。拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来し得る。拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｃｔｃｔが含まれる（すなわち、コア保存プロモーターと拡張５’側プロモーター領域との間に散在ヌクレオチドが１つも含まれない）。一実施形態では、サブゲノミックプロモーターのうちの１つ以上の各々には、最小配列ｃｔｃｔｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａが含まれる。

【0103】

拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔに由来するポリヌクレオチド配列が含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。

【0104】

拡張５’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。拡張５’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。

【0105】

ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔに由来するポリヌクレオチド配列が含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｔｔｃｃａｔｃａｔａｇｔｔａｔｇｇｃｃａｔｇａｃｔａｃｔｃｔａｇｃｔａｇｃａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｃａｇｃｔａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ａｃｃｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域には、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔが含まれ得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、ポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターの拡張５’側プロモーター領域は、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされるポリヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｃｃｃｔａｔａａｃｔｃｔからなり得る。

【0106】

拡張プロモーター領域には、１つ以上の転写エンハンサーエレメントが含まれ得る。エンハンサーエレメントは、コアプロモーター配列（複数可）の３’側でも５’側でもコードされ得る。ＳＧＰ１、ＳＧＰ２のいずれか、または両方が、エンハンサーエレメントを含むことができる。エンハンサーエレメントは、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスと同じアルファウイルスに由来し得る。エンハンサーエレメントは、コア保存プロモーター配列の由来として用いられたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来し得る。特に、天然アルファウイルスのｎｓｐ４遺伝子のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドは、天然の２６Ｓサブゲミック転写プロモーターとの関連においてアルファウイルスサブゲノミックプロモーターのコア保存プロモーター配列と重複する。したがって、ＳＧＰ１、ＳＧＰ２のいずれか、または両方が、アルファウイルス非構造タンパク質４（ｎｓｐ４）に由来するポリヌクレオチド配列が含まれるエンハンサーエレメントを含むことができ、これは一般に、コア保存プロモーター配列の５’側でコードされ、例えば、コア保存プロモーター配列の５’側に隣接してコードされる。ｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドには、配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれ得るサブゲノミックプロモーターをもたらす追加の配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡが含まれ得る。ＳＧＰ１、ＳＧＰ２のいずれか、または両方が、配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含むことができる。コア保存プロモーター配列の５’側にｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを、及びコア保存プロモーター配列の３’側に拡張３’側プロモーター領域のＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含めることにより、配列ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるサブゲノミックプロモーター（これは一般に、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかに限られ、両方ではない）をもたらすことができる。ｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドには、配列ＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれ得るサブゲノミックプロモーターをもたらす追加の配列ＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡが含まれ得る。ＳＧＰ１、ＳＧＰ２のいずれか、または両方が、配列ＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣを含むことができる。コア保存プロモーター配列の５’側にｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを、及びコア保存プロモーター配列の３’側に拡張プロモーター領域のＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含めることにより、配列ＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるサブゲノミックプロモーター（これは一般に、ＳＧＰ１またはＳＧＰ２のいずれかに限られ、両方ではない）をもたらすことができる。

【0107】

コア保存プロモーター配列の５’側にｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを、及びコア保存プロモーター配列の３’側に拡張プロモーター領域のＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧを含めることにより、以下の配列対が含まれるサブゲノミックプロモーターをもたらすことができる：
（１）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ１及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ２、
（２）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ２及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ１、
（３）ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ１及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ２、
（４）ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ２及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ１、
（５）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ１及びＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ２、
（６）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣが含まれるＳＧＰ２及びＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧが含まれるＳＧＰ１。

【0108】

コア保存プロモーター配列の５’側にｎｓｐ４のＣ末端部分をコードするポリヌクレオチドを、及びコア保存プロモーター配列の３’側に拡張プロモーター領域のａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇを含めることにより、以下の配列対からなるサブゲノミックプロモーターをもたらすことができる、
（１）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ１及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ２、
（２）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ２及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ１、
（３）ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ１及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ２、
（４）ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ２及びＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ１、
（５）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ１及びＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ２、
（６）ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣからなるＳＧＰ２及びＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧからなるＳＧＰ１。

【0109】

ＲＮＡアルファウイルス骨格の少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列には、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターが含まれ得る。例えば、ＳＧＰ１とは、アルファウイルス骨格によってもたらされる「天然」サブゲノミックプロモーターを指し得る。

【0110】

カセットを、発現レベルの制御が提供されるよう並べることができる。例えば、理論に拘束されることは望まないが、図２で示すように、別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセットを特徴とするＳＡＭ系は、ＳＧＰ１とＳＧＰ２の両方が第２の遺伝子をコードする転写産物を産生することを考えると、第２のＳＧＰ（ＳＧＰ２）の制御下にある遺伝子を高発現させることができる。したがって、多シストロン性ＳＡＭベクターは、カセットの発現を、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができるＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターを有し得る。いくつかの実施形態では、拡張プロモーター領域（例えば、５’ｎｓｐ４ポリヌクレオチド及び／または上記のａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇ）は、カセットの発現を、同じカセットがＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターに機能的に連結されている場合と比べて少なくとも２倍促進することができるＳＧＰ２に含められる。

【0111】

カセットは、そのカセットからのペイロードの発現を駆動することができるサブゲノミックプロモーターにカセットが機能的に連結されるよう構成することができる。例えば、サブゲノミックプロモーターは、カセットのコザック配列５’側に隣接することを含め、カセットの５’側に隣接させることができる。

【0112】

Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、当業者により理解される平易な意味を有するものと解釈されることが意図される。さらに明確にするために、以下に特定の用語を定義する。平易な意味と記載の定義の間に矛盾がある場合は、記載の定義が使用される。

【0113】

本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を刺激する物質である。抗原は、ネオアンチゲンであり得る。抗原は、特定の集団、例えば、がん患者の特定の集団の間で見られる抗原である「共通抗原」であり得る。

【0114】

本明細書で使用される場合、用語「ネオアンチゲン」は、例えば、腫瘍細胞での変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する野生型抗原とは異なるものにする、少なくとも１つの変化を有する抗原である。ネオアンチゲンには、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列が含まれ得る。変異には、フレームシフトもしくは非フレームシフトのインデル、ミスセンスもしくはナンセンスの置換、スプライス部位の変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、またはネオＯＲＦを生じさせる任意のゲノム変化もしくは発現変化が含まれ得る。変異にはまた、スプライスバリアントも含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾にはまた、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原も含まれ得る。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照のこと。対象は、様々な診断方法、例えば、以下に詳述される患者選択方法の使用を介して投与のために特定され得る。

【0115】

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原」は、対象の腫瘍細胞もしくは組織中に存在するが、対象の対応する正常な細胞もしくは組織には存在しない抗原であるか、または正常な細胞もしくは組織と比較して、腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかもしくはそのことが見出されたポリペプチドに由来する抗原である。

【0116】

本明細書で使用される場合、用語「抗原ベースのワクチン」は、１つ以上の抗原、例えば、複数の抗原に基づいたワクチン組成物である。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0117】

本明細書で使用される場合、用語「候補抗原」は、抗原を表し得る配列を生じさせる変異または他の異常である。

【0118】

本明細書で使用される場合、用語「コード領域」は、タンパク質をコードする遺伝子の部分（複数可）である。

【0119】

本明細書で使用される場合、用語「コード変異」は、コード領域で生じる変異である。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「ＯＲＦ」とは、オープンリーディングフレームを意味する。

【0121】

本明細書で使用される場合、用語「ＮＥＯ－ＯＲＦ」は、変異またはスプライシング等の他の異常から生じる腫瘍特異的ＯＲＦである。

【0122】

本明細書で使用される場合、用語「ミスセンス変異」は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。

【0123】

本明細書で使用される場合、用語「ナンセンス変異」は、あるアミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または標準開始コドンの除去を引き起こす変異である。

【0124】

本明細書で使用される場合、用語「フレームシフト変異」は、タンパク質のフレームに変化を引き起こす変異である。

【0125】

本明細書で使用される場合、用語「インデル」は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。

【0126】

本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一性」パーセントという用語は、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用するかまたは目視検査によって測定される、最大一致度について比較及びアラインメントを行った場合に、明示されたパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することもあれば、別の場合には、比較される２配列の全長にわたって存在することもある。

【0127】

配列比較では典型的には、１つの配列が参照配列の役目を果たし、これに対して被験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する被験配列（複数可）の配列同一性パーセントを算出する。別法として、配列の類似性または非類似性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における、特定のヌクレオチドの、または翻訳された配列の場合はアミノ酸の、有無の組み合わせによって確立することができる。

【0128】

比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．内にあるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、または目視検査（概要は、下記Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）によって行うことができる。

【0129】

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に入手可能である。

【0130】

本明細書で使用される場合、用語「ノンストップまたはリードスルー」は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異である。

【0131】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞受容体が典型的に結合する、抗原の特定部分である。

【0132】

本明細書で使用される場合、用語「免疫原性」は、免疫応答を、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または両方を介して刺激する能力である。

【0133】

本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」とは、特定の抗原と特定のＭＨＣアレルの間での結合の親和性を意味する。

【0134】

本明細書で使用される場合、用語「ベイト」は、試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列を濃縮するために使用される核酸プローブである。

【0135】

本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの間の差である。

【0136】

本明細書で使用される場合、用語「バリアントコール」は、典型的にはシークエンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。

【0137】

本明細書で使用される場合、用語「多型」は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体の、ＤＮＡを持つ細胞すべてに見出されるバリアントである。

【0138】

本明細書で使用される場合、用語「体細胞バリアント」は、個体の非生殖系細胞に生じるバリアントである。

【0139】

本明細書で使用される場合、用語「アレル」は、遺伝子のバージョンまたは遺伝子配列のバージョンまたはタンパク質のバージョンである。

【0140】

本明細書で使用される場合、用語「ＨＬＡ型」は、ＨＬＡ遺伝子アレルを補足するものである。

【0141】

本明細書で使用される場合、用語「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」は、未成熟終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解である。

【0142】

本明細書で使用される場合、用語「幹変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、腫瘍発生の初期に生じる、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。

【0143】

本明細書で使用される場合、用語「サブクローナル変異（ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、腫瘍発生の後期に生じる、腫瘍細胞のサブセットにのみ存在する変異である。

【0144】

本明細書で使用される場合、用語「エクソーム」は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムのうちのエクソン集であり得る。

【0145】

本明細書で使用される場合、用語「ロジスティック回帰」は、従属変数が１に等しい確率のロジットを従属変数の線形関数としてモデル化する、統計からの２値のデータに関する回帰モデルである。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「ニューラルネットワーク」は、多層の線形変換、それに続く、典型的には確率的勾配降下法及び誤差逆伝播法により訓練される要素ごとの非線形変換を行うことからなる、分類または回帰のための機械学習モデルである。

【0147】

本明細書で使用される場合、用語「プロテオーム」は、細胞、細胞群、または個体によって発現及び／または翻訳される全タンパク質のセットである。

【0148】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチドーム」は、細胞表面上のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示される全ペプチドのセットである。ペプチドームは、細胞または細胞集の特性を指す場合がある（例えば、腫瘍を構成する細胞すべてのペプチドームの結合体を意味する腫瘍ペプチドーム、または感染症により感染している細胞すべてのペプチドームの結合体を意味する感染症ペプチドーム）。

【0149】

本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＰＯＴ」とは、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味し、これは、ヒト及び動物での免疫応答をモニタリングするための一般的な方法である。

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「デキストラマー」は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣ多量体である。

【0151】

本明細書で使用される場合、用語「寛容または免疫寛容」は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答性の状態である。

【0152】

本明細書で使用される場合、用語「中枢性寛容」は、自己反応性Ｔ細胞クローンを除去すること、または自己反応性Ｔ細胞クローンを促進して免疫抑制性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に分化させることのいずれかによって、胸腺において影響を受ける寛容である。

【0153】

本明細書で使用される場合、用語「末梢性寛容」は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞を促進してＴｒｅｇに分化させることによって、末梢において影響を受ける寛容である。

【0154】

用語「試料」には、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当該技術分野で公知の他の手段が含まれる手段によって対象から採取された、単一細胞もしくは複数の細胞または細胞の断片あるいは体液のアリコートが含まれ得る。

【0155】

用語「対象」は、細胞、組織、または生物、ヒトもしくは非ヒトを包含し、雌雄、インビボ、エキソビボ、またはインビトロを問わない。対象という用語は、ヒト等の哺乳類を含む。

【0156】

用語「哺乳類」は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、これには、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタが含まれるが、これらに限定されない。

【0157】

用語「臨床因子」とは、対象の状態、例えば、疾患の活動性または重症度の尺度を指す。「臨床因子」は、非試料マーカーを含む対象の健康状態のすべてのマーカー、及び／または対象の他の特徴、例えば、限定することなく、年齢及び性を包含する。臨床因子は、対象からの試料（または試料の集団）または決定されている条件下の対象の評価から取得され得るスコア、値、または値のセットであり得る。臨床因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物等の他のパラメータによって予測することもできる。臨床因子には、腫瘍の種類、腫瘍サブタイプ、感染症の種類、感染症サブタイプ、及び喫煙歴が含まれ得る。

【0158】

用語「腫瘍に由来する抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲを介して、腫瘍から取得される核酸配列；または腫瘍をシークエンシングし、次いで、シークエンシングデータを使用して、例えば、当該技術分野で公知の様々な合成法もしくはＰＣＲベースの方法を介して核酸配列を合成することにより取得される配列データを指す。派生配列には、配列が最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または発現のための他の最適化）等の、核酸配列バリアントが含まれ得、それらは、腫瘍から取得される対応する天然核酸配列がコードするポリペプチド配列と同じポリペプチド配列をコードする。

【0159】

用語「感染症に由来する抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲを介して、感染細胞もしくは感染症生物から取得される核酸配列、または感染細胞もしくは感染症生物をシークエンシングし、次いで、シークエンシングデータを使用して、例えば、当該技術分野で公知の様々な合成法もしくはＰＣＲベースの方法を介して核酸配列を合成することにより取得される配列データを指す。派生配列には、配列が最適化された核酸配列バリアント（例えば、コドン最適化及び／または発現のための他の最適化）等の、核酸配列バリアントが含まれ得、それらは、対応する天然感染症生物核酸配列がコードするポリペプチド配列と同じポリペプチド配列をコードする。派生配列には、天然感染症生物ポリペプチド配列に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）の変異を有する改変感染症生物ポリペプチド配列をコードする核酸配列バリアントが含まれ得る。例えば、改変ポリペプチド配列は、感染症生物タンパク質の天然ポリペプチド配列に対して１つ以上のミスセンス変異を有し得る。

【0160】

用語「アルファウイルス」とは、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは典型的には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、チクングニアウイルス、及びセムリキ森林ウイルス等の旧世界、または東部ウマ脳炎、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその派生株ＴＣ－８３等の新世界に分類される。アルファウイルスは典型的には、自己複製ＲＮＡウイルスである。

【0161】

用語「アルファウイルス骨格」とは、ウイルスゲノムの自己複製を可能にするアルファウイルスの最小配列（複数可）を指す。最小配列には、非構造タンパク質媒介性増幅のための保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびにサブゲノミック（例えば、２６Ｓ）プロモーターエレメント等のサブゲノミックウイルスＲＮＡの発現のための配列が含まれ得る。

【0162】

用語「非構造タンパク質媒介性増幅のための配列」には、当業者に周知のアルファウイルス保存配列エレメント（ＣＳＥ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれる。ＣＳＥとしては、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、２４ｎｔ ＣＳＥ、サブゲノミックプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列）、１９ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。

【0163】

用語「ＲＮＡポリメラーゼ」には、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６等のバクテリオファージ由来のポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0164】

用語「脂質」には、疎水性及び／または両親媒性の分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であり得る。脂質は、合成でも天然由来でもあり得、場合によっては生物分解性であり得る。脂質には、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）等のこれに限定されない脂質複合体、ワックス、油、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンが含まれ得る。脂質にはまた、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれ得る。

【0165】

用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」には、水性内部を囲む脂質含有膜を使用して形成される小胞様構造が含まれ、リポソームとも呼ばれる。脂質ナノ粒子には、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベース組成物が含まれる。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であり得る。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸塩（タウロコール酸ナトリウム）、及びステロール（コレステロール）等の生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性、アニオン性、または中性の脂質の定義された比を含め、これに限定されない、異なる脂質分子について定義された比を使用して形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を内包することができ、その後、標的細胞と接触させて内包された分子を宿主細胞サイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面も含めて、非脂質分子を用いて修飾または機能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ））または多層（多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ））であり得る。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体を形成することができる。単層脂質ナノ粒子は核酸と複合体を形成することができ、ここで、核酸は水性内部にある。多重層脂質ナノ粒子は核酸と複合体を形成することができ、ここで、核酸は水性内部にあるか、または形成するかもしくは間に挟まれる。

【0166】

略語：ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（主要組織適合遺伝子複合体）；ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ヒト白血球抗原）、またはｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ（ヒトＭＨＣ遺伝子座）；ＮＧＳ：ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（次世代シークエンシング）；ＰＰＶ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ（陽性適中率）；ＴＳＮＡ：ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ（腫瘍特異的ネオアンチゲン）；ＦＦＰＥ：ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ（ホルマリン固定パラフィン包埋）；ＮＭＤ：ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ（ナンセンス変異依存分解機構）；ＮＳＣＬＣ：ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（非小細胞肺癌）；ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ（樹状細胞）。

【0167】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈で特に明示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。

【0168】

具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、用語「約」は、本明細書で使用される場合、当該技術分野における通常の許容公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内であると理解される。「約」は、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解され得る。文脈から別様に明確でない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。

【0169】

本明細書で直接定義されていないいかなる用語も、本発明の技術分野内で理解されるような、それらの用語に共通して関連付けられる意味を有すると理解されるべきである。本明細書では、本発明の態様の組成物、デバイス、方法等、及びそれらをどのように作製または使用するかを説明するうえで、実践者に追加のガイダンスを提供するために特定の用語が論じられる。同じものについて複数の言い方で言われる場合があることを認識されよう。したがって、本明細書で論じられる用語のうちの任意の１つ以上について代替言語及び同義語が使用される場合がある。ある用語が本明細書で詳述されるかもしくは論じられているか否かは重要ではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料等が提供される。明示的に記述されていない限り、１つまたは少数の同義語または同等物の記述は、他の同義語または同等物の使用を排除するものではない。用語の例を含め、例の使用は、例示のみを目的としており、本明細書での本発明の態様の範囲及び意味を限定するものではない。

【0170】

本明細書の本文中で引用されているすべての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0171】

ＩＩ．抗原の同定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ分析のための研究方法が報告されており、抗原同定領域に適用されている^{６，１４、１５}。臨床現場での抗原同定のための感度及び特異性の増大のための特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、２つの領域、すなわち、実験室プロセスに関連するものと、ＮＧＳデータ分析に関連するものとに分類することができる。記載の研究方法はまた、他の状況での抗原の同定、例えば、感染症生物、対象での感染、または対象の感染細胞から抗原を同定する同定に適用することができる。最適化の例は当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、米国出願公開第１６／６０６，５７７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０２０１８１２４０Ａ１号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に方法が詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0172】

抗原（例えば、腫瘍または感染症生物に由来する抗原）を同定するための方法には、細胞表面に提示される（例えば、樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞を含め、腫瘍細胞、感染細胞、または免疫細胞にＭＨＣによって提示される）可能性の高い抗原、及び／または免疫原性である可能性の高い抗原を同定することが含まれる。一例として、そのような方法の１つは、腫瘍、感染細胞、もしくは感染症生物から、エクソーム、トランスクリプトームもしくは全ゲノムのヌクレオチド配列決定及び／または発現のデータのうちの少なくとも１つを取得するステップであって、ヌクレオチド配列決定データ及び／または発現データが、抗原（例えば、腫瘍または感染症生物に由来する抗原）のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、取得するステップ；抗原の各々が１つ以上のＭＨＣアレルによって細胞表面、例えば、対象の腫瘍細胞または感染細胞の表面に提示される数的可能性のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力するステップであって、数的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、入力するステップ；ならびに選択抗原のセットを生成するために、数的可能性のセットに基づいて抗原のセットのサブセットを選択するステップ、を含み得る。

【0173】

ＩＩ．Ｂ．ネオアンチゲンにおける腫瘍特異的変異の同定
本明細書ではまた、ある特定の変異（例えば、がん細胞に存在するバリアントまたはアレル）の同定のための方法も開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソームには存在するが、対象の正常組織には存在しない可能性がある。共通ネオアンチゲンを含め、腫瘍に特異的なネオアンチゲンを同定するための特定の方法が当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に方法が詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。腫瘍に特異的な共通ネオアンチゲンの例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９２２６９４１Ａ１号に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。共通ネオアンチゲンには、ＫＲＡＳ関連変異（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、及び／またはＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ変異）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＫＲＡＳ関連ＭＨＣクラスＩネオエピトープには、野生型（ＷＴ）ヒトＫＲＡＳに関する変異、例えば、以下の例示的アミノ酸配列に関する変異が含まれ得る：
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ。

【0174】

腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍においてのみタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす場合には、腫瘍の免疫学的標的化に有用であると見なすことができる。有用な変異には、（１）タンパク質に異なるアミノ酸をもたらす非同義変異、（２）終止コドンが修飾または欠失されて、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を持つより長いタンパク質の翻訳をもたらすリードスルー変異、（３）成熟ｍＲＮＡにイントロンが包含されてしまい、そのため固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらすスプライス部位変異、（４）２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を持つキメラタンパク質を生じさせる染色体再構成（すなわち、遺伝子融合）、（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を持つ新たなオープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異または欠失、が挙げられる。変異にはまた、非フレームシフトインデル、ミスセンス置換もしくはナンセンス置換、スプライス部位の変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、またはネオＯＲＦを生じさせる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含まれ得る。

【0175】

例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、もしくは遺伝子融合の変異から生じる、変異を有するペプチドまたは変異ポリペプチドは、腫瘍と正常細胞を対比させたＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質のシークエンシングを行うことによって同定することができる。

【0176】

また、変異には、以前に同定されている腫瘍特異的変異も含まれ得る。既知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースに見出すことができる。

【0177】

個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおける特定の変異またはアレルの存在を検出するために様々な方法が利用可能である。この分野での進歩により、正確、容易、かつ安価な大規模ＳＮＰジェノタイピングが提供された。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンス法、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップ等の各種ＤＮＡ「チップ」技術を含め、いくつかの技術が報告されている。これらの方法では、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵入切断、それに続く質量分析法、または固定化南京錠型プローブ（ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）及びローリングサークル増幅による、小シグナル分子の生成に基づく。特異的変異を検出するための当該技術分野で公知の方法のいくつかを以下にまとめる。

【0178】

ＰＣＲベースの検出手段では、複数のマーカーのマルチプレックス増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズが重複しない、同時に分析可能なＰＣＲ産物が生成されるようＰＣＲプライマーを選択することは当該技術分野において周知である。別法として、差別的に標識され、そのため各々が差別的に検出可能なプライマーを用いて、異なるマーカーを増幅させることが可能である。当然のことながら、ハイブリダイゼーションに基づく検出手段により、試料中の複数のＰＣＲ産物の差別的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の技術が当該技術分野で公知である。

【0179】

ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける一塩基多型の分析を容易にするために、いくつかの方法が開発されている。例えば、一塩基多型は、例えばＭｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）に開示されているような、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することによって検出することができる。その方法によれば、多型性部位に対して３’側に隣接するアレル配列に相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから取得された標的分子にハイブリダイズ可能にされている。標的分子上の多型性部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含有している場合は、その誘導体が、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みは、プライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それによりその検出を可能にする。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が分かっているため、そのプライマーがエキソヌクレアーゼに対して耐性になったという所見から、標的分子の多型性部位に存在するヌクレオチド（複数可）が、反応に使用されるヌクレオチド誘導体のヌクレオチドに相補的であることが明らかになる。この方法には、大量の外来性配列データの決定を必要としないという利点がある。

【0180】

多型性部位のヌクレオチドの同一性を決定するために溶液を用いる方法を使用することができる。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（仏国特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法でのように、多型性部位に対して３’側に隣接するアレル配列に相補的なプライマーが用いられる。この方法では、多型性部位のヌクレオチドに相補的である場合にプライマーの末端に組み込まれる標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。

【0181】

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして知られる代替的方法がＧｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．によって報告されている（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法では、標識されたターミネーターと、多型性部位に対して３’側にある配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する。したがって、組み込まれている標識されたターミネーターは、評価される標的分子の多型性部位に存在するヌクレオチドによって決定され、かつ、それに相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス特許第２，６５０，８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化されている不均一相アッセイであり得る。

【0182】

ＤＮＡの多型性部位を評価するためのプライマー誘導型ヌクレオチド組み込み手順がいくつか報告されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９－７７８４（１９８９）、Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）、Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４－６９２（１９９０）、Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３－１１４７（１９９１）、Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９－１６４（１９９２）、Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７－１１２（１９９２）、Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１－１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型性部位における塩基同士を識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのようなフォーマットでは、シグナルが、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランで生じる多型は、ランの長さに比例するシグナルを生じさせ得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６－５９（１９９３））。

【0183】

多数のイニシアチブが、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。合成時リアルタイム１分子シークエンシング技術は、蛍光ヌクレオチドの検出に依存しており、配列決定されるテンプレートに相補的なＤＮＡの新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれる。一方法では、３０～５０塩基長のオリゴヌクレオチドが、カバーガラスに５’末端で共有結合により係留されている。これらの係留鎖は２つの機能を果たす。第１に、テンプレートが、表面に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な捕捉尾部を伴って構成されている場合に、それらの係留鎖は標的テンプレート鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成するテンプレート指向性のプライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの、合成、検出、及び色素を除去するための色素－リンカーの化学的切断を使用する配列決定のための定位置部位として機能する。各サイクルには、ポリメラーゼ／標識ヌクレオチドの混合物の添加、すすぎ、イメージング及び色素の切断が含まれる。代替的方法では、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、各ヌクレオチドは、ガンマ－リン酸に結合しているアクセプター蛍光部分で色分けされる。システムは、蛍光修飾したヌクレオチドが新たな鎖に組み込まれる際の、蛍光タグ付きポリメラーゼと蛍光修飾したヌクレオチドとの相互作用を検出する。他の合成時解読技術もまた存在する。

【0184】

変異を同定するために、任意の好適な合成時解読プラットフォームを使用することができる。上記のように、現在４つの主要な合成時解読プラットフォームが利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａの１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成時解読プラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても報告されている。いくつかの実施形態では、配列決定される複数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位をテンプレートの３’及び／または５’末端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合で結合している相補配列に捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重の役目を果たし得る支持体に結合している配列に相補的な核酸配列である。

【0185】

捕捉配列の代替として、ある結合対（例えば、米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されるような、例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、またはアビジン－ビオチンの対等）のメンバーを各断片に連結させて、その結合対それぞれの第２のメンバーでコートされた表面に捕捉させることができる。

【0186】

捕捉の後、例えば、テンプレート依存性合成時解読を含め、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載のような、一分子検出／シークエンシングによって配列を分析することができる。合成時解読では、表面に結合した分子が、ポリメラーゼ存在下で複数の標識ヌクレオチド三リン酸に曝露される。テンプレートの配列は、成長鎖の３’末端に組み込まれる標識ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで実施することも、ステップアンドリピート方式で実施することもできる。リアルタイム分析の場合、各ヌクレオチドに異なる光学標識を組み込むことができ、組み込まれたヌクレオチドの刺激に複数のレーザーを利用することができる。

【0187】

シークエンシングにはまた、他の超並列シークエンシングまたは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の技術及びプラットフォームも含まれ得る。超並列シークエンシング技術及びプラットフォームのさらなる例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加で同様の現在の超並列シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を使用することができる。

【0188】

本明細書に記載される方法に使用するための核酸試料を取得するために、任意の細胞種または組織を用いることができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料は、腫瘍もしくは既知の技術（例えば、静脈穿刺）により得られる体液、例えば、血液、または唾液から得ることができる。別法として、乾燥試料（例えば、毛髪または皮膚）に核酸試験を実施することができる。さらに、ある試料をシークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織型のものである場合の正常組織からシークエンシングのために取得することができる。ある試料をシークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と比べて異なる組織型のものである場合の正常組織からシークエンシングのために取得することができる。

【0189】

腫瘍には、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、脳腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、及びＴ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上が含まれ得る。

【0190】

別法として、タンパク質質量分析法を使用して、腫瘍細胞上でＭＨＣタンパク質に結合している変異ペプチドの存在を同定または検証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から、酸溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。

【0191】

ＩＩＩ．免疫調節因子
本明細書に記載されるＣｈＡｄＶベクターまたは本明細書に記載されるアルファウイルスベクター等の本明細書に記載されるベクターは、少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むことができ、同じかまたは別個のベクターが、少なくとも１つの免疫調節因子コードする核酸を含むことができる。免疫調節因子には、免疫チェックポイント分子に結合して、その活性を遮断する結合分子（例えば、ｓｃＦｖ等の抗体）が含まれ得る。免疫調節因子には、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（ＩＬ－１２のｐ３５、ｐ４０、ｐ７０、及び／またはｐ７０融合コンストラクトを含む）、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１等のサイトカインが含まれ得る。免疫調節因子には、修飾サイトカイン（例えば、ｐｅｇＩＬ－２）が含まれ得る。ベクターは、抗原カセット、及び免疫調節因子をコードする１つ以上の核酸分子を含むことができる。

【0192】

遮断または阻害の標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子には、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ、γδ、及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞に発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ－１５０４９のうちの１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する、抗体、もしくはその抗原結合断片、または他の結合タンパク質が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１遮断薬）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤）が含まれる。抗体をコードする配列は、当該技術分野の通常の技能を使用してＣ６８等のベクター内に操作が可能である。例示的な方法は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるＦａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４－９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７に記載されている。

【0193】

ＩＶ．ペイロード及び抗原
ペイロード核酸配列は、目的細胞に送達されることが所望される、任意の核酸配列であり得る。一般に、ペイロードは、核酸配列の発現を駆動するようプロモーターに連結される核酸配列である。ペイロード核酸配列は、ポリペプチド（すなわち、転写されて、タンパク質に翻訳されることのできる核酸配列）をコードすることができる。一般に、ペプチドをコードするペイロード核酸配列は、細胞で発現されることが所望される任意のタンパク質をコードすることができる。タンパク質の例としては、抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、またはＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ）、抗体、サイトカイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、またはゲノム編集システム成分（例えば、ゲノム編集システムで使されるヌクレアーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集システムとしては、ＣＲＩＳＰＲシステム、ジンクフィンガーシステム、メガヌクレアーゼシステム、またはＴＡＬＥＮシステムが挙げられるが、これらに限定されない。ペイロード核酸配列は、非コード配列であり得る（すなわち、転写されることはできるが、タンパク質に翻訳されない核酸配列）。一般に、非コードペイロード核酸配列は、細胞で発現されることが所望される任意の非コードポリヌクレオチドであり得る。非コードポリヌクレオチドの例としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）またはゲノム編集システムポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ［ｇＲＮＡ］、シングルガイドＲＮＡ［ｓｇＲＮＡ］、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］、及び／またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］）が挙げられるが、これらに限定されない。ペイロード核酸配列は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上）の別個のポリペプチド（例えば、一緒に連結されている２つ以上の別個のエピトープ配列）をコードするか、または２つ以上の別個の非コード核酸配列（例えば、２つ以上の別個のＲＮＡｉポリヌクレオチド）を含有することができる。ペイロード核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列と非コード核酸配列の組み合わせを有することができる。

【0194】

ベクターは、１～３０のペイロードコード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、もしくはそれ以上の異なるペイロードコード核酸配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４の異なるペイロードコード核酸配列、または１２、１３もしくは１４の異なるペイロードコード核酸配列を含有することができる。ペイロードコード核酸配列とは、「カセット」の、ペイロードをコードする部分を指し得る。カセットの特徴については本明細書で詳述されている。カセットは、カセット内で一緒に連結されている２つ以上のペイロードコード核酸配列を含有することができる（例えば、例示的な非限定的例として、連結されたＴ細胞エピトープをコードする連結された抗原コード核酸配列）。

【0195】

ベクターは、１～３０の別個のペイロードコード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、もしくはそれ以上の別個のペイロードコード核酸配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４の別個のペイロードコード核酸配列、または１２、１３もしくは１４の別個のペイロードコード核酸配列を含有することができる。ペイロードコード核酸配列とは、個々のペイロード配列のための配列、例えば、例示的な非限定的例として、カセット内で一緒に連結されている２つ以上のペイロードコード核酸配列の、連結されたＴ細胞エピトープの各々を指し得る。

【0196】

抗原には、ヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれ得る。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であり得る。したがって、ワクチンに有用な抗原には、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が含まれ得る。がんワクチンに使用することができる抗原は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ／２０１９／２２６９４１号に記載されている。

【0197】

本明細書では、本明細書に開示の方法によって同定される腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、既知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び本明細書に開示の方法によって同定される変異ポリペプチドまたはそれらの断片を開示する。ネオアンチゲンペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、ネオアンチゲンには、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0198】

本明細書ではまた、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチド、例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織で異常に発現されることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドも開示する。抗原ペプチドが由来し得る好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報を管理している。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。腫瘍抗原（例えば、共通腫瘍抗原及び腫瘍ネオ抗原）には、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１７／０５８，１２８号に記載のものが含まれ得るが、これに限定されない。抗原ペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、抗原には、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0199】

抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下の、ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満であるＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドの場合は、８～１５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のアミノ酸長、プロテアソームによる切断を促進するペプチドの内部または近傍での配列モチーフの存在、及びＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、のうちの少なくとも１つを含むことができる。ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合は、６～３０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０のアミノ酸長、細胞外もしくはリソソームでのプロテアーゼ（例えば、カテプシン）による切断またはＨＬＡ－ＤＭに触媒されるＨＬＡ結合を促進するペプチドの内部もしくは近傍での配列モチーフの存在。

【0200】

１つ以上の抗原が腫瘍の表面に提示され得る。

【0201】

１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。

【0202】

対象での自己免疫応答を誘導する１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン作製との関連では、考慮から除外することができる。

【0203】

少なくとも１つの抗原ペプチド分子のサイズは、限定するわけではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０またはそれ以上のアミノ分子残基、及びそこから導き出せる任意の範囲を含むことができる。具体的な実施形態では、抗原ペプチド分子は５０アミノ酸以下である。

【0204】

抗原ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩの場合は、１５残基長以下であり得、通常は約８～約１１残基、特に９または１０残基からなり、ＭＨＣクラスＩＩの場合は、６以上３０以下の残基であり得る。

【0205】

抗原ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示され得る。いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様では、抗原ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満またはそれより低いＩＣ５０を有し得る。

【0206】

いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に自己免疫応答を誘導しない、及び／または免疫寛容を引き起こさない。

【0207】

また、少なくとも２つ以上の抗原ペプチドを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの別個のペプチドを含有する。少なくとも２つの別個のペプチドは、同じポリペプチドに由来し得る。別個のポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方で異なっていることを意味する。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するか、あるいは正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチド、例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織で異常に発現されることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチドである。抗原ペプチドが由来し得る好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ）データベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報を管理している。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、臨床グレードのがんゲノムデータを集約し、それらを何万ものがん患者からの臨床転帰と関連付けている。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様では、腫瘍特異的変異は、特定のがん種のドライバー変異である。

【0208】

本明細書ではまた、感染症生物、対象における感染、または対象の感染細胞と関連する任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原は、感染症生物のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に由来し得る。感染症生物のポリペプチド配列には、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。感染症生物には、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、デング熱ウイルス、オルチミクソウイルス科（ｏｒｔｈｙｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）ウイルス、及び結核が含まれるが、これらに限定されない。

【0209】

本明細書では、本明細書に開示の方法によって同定される感染症生物特異的な抗原またはエピトープを含む単離されたペプチド、既知の感染症生物特異的な抗原またはエピトープを含むペプチド、及び本明細書に開示の方法によって同定される変異ポリペプチドまたはそれらの断片を開示する。抗原ペプチドは、それらのコード配列との関連において説明することができ、その場合、抗原には、関連ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

【0210】

本明細書に記載されるベクター及び関連組成物を使用して、任意の生物からの抗原、例えば、それらの毒素もしくは他の副生成物を、送達し、かかる生物もしくはその副生成物と関連する感染症もしくは他の有害反応を予防及び／または治療することができる。

【0211】

ワクチンに組み込むことができる（例えば、カセットにしてコードされる）抗原には、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する病原性ウイルス等のウイルスに対してヒトまたは非ヒト動物を免疫するのに有用な免疫原が含まれる。抗原は、様々なウイルス科から選択され得る。対抗する免疫応答が望まれる望ましいウイルス科の例には、ピコルナウイルス科が含まれ、これには、感冒の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びＡ型肝炎ウイルス等のヒトエンテロウイルスが含まれるエンテロウイルス属、ならびに主に非ヒト動物での、口蹄疫の原因であるアプトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）属が含まれる。ウイルスのうちピコルナウイルス科の中では、標的抗原には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧが含まれる。別のウイルス科には、カルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科が含まれ、これにはノーウォーク群のウイルスが包含され、これらは流行性胃腸炎の重要な病原体である。ヒト及び非ヒト動物での免疫応答を刺激するための標的抗原に使用するために望ましいさらに別のウイルス科はトガウイルス科であり、これにはアルファウイルス属が含まれ、これには、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎及び西部ウマ脳炎、ならびに風疹ウイルス等のルビウイルスが含まれる。Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科には、デングウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎またはコロナウイルス科から生成される場合があり、これには、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）等の多数の非ヒトウイルス、及びヒト呼吸器コロナウイルスが含まれ、これらは、感冒及び／または非Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎を引き起こす場合がある。コロナウイルス科の中では、標的抗原には、Ｅ１（Ｍタンパク質またはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓタンパク質またはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチンーエルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ－ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）の糖タンパク質（コロナウイルスすべてに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオカプシド）が含まれる。さらに他の抗原は、ラブドウイルス科に対して指向され得、これには、ベシクロウイルス属（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、及びリッサウイルス全般（例えば狂犬病）が含まれる。ラブドウイルス科の中では、好適な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来し得る。マールブルグウイルス及びエボラウイルス等の出血熱ウイルスが含まれるｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科は、好適な抗原源であり得る。パラミクソウイルス科には、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス（麻疹及びイヌジステンパーを含む）、ならびに呼吸器多核体ウイルスが含まれるニューモウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから配列が入手可能な糖（Ｇ）タンパク質及び融合（Ｆ）タンパク質）が含まれる。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科の中に分類され、好適な抗原源であり得る（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン熱（ｈｅｍａｈａｇｉｎ ｆｅｖｅｒ）ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビ羊病）及び様々な未分類のブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）が含まれる。アレナウイルス科では、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原源が得られる。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（小児に急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属、及びカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）属（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。レトロウイルス科にはオンコリビリナル（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科が含まれ、これには、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチビリナル（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（これには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、及びスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）が含まれる）のようなヒト及び動物の疾患が包含される。レンチウイルスの中から、多くの好適な抗原が報告されており、容易に選択することができる。好適なＨＩＶ抗原及びＳＩＶ抗原の例には、非限定的に、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、及びＲｅｖといったタンパク質、ならびにそれらの様々な断片が含まれる。例えば、Ｅｎｖタンパク質の好適な断片には、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１等のそのサブユニット、またはより小さなそれらの断片、例えば、少なくとも約８アミノ酸長のもの、のうちのいずれかが含まれ得る。同様に、ｔａｔタンパク質の断片が選択され得る。［米国特許第５，８９１，９９４号及び米国特許第６，１９３，９８１号を参照のこと。］また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）、及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒ．２００１）に記載のＨＩＶタンパク質及びＳＩＶタンパク質も参照のこと。別の例では、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶの免疫原性タンパク質もしくはペプチドを使用して、融合タンパク質または他の免疫原性分子が形成され得る。例えば、２００１年８月２日に公開されたＷＯ０１／５４７１９、及び、１９９９年４月８日に公開されたＷＯ９９／１６８８４に記載のＨＩＶ－１ Ｔａｔ及び／またはＮｅｆ融合タンパク質及び免疫化レジメンを参照のこと。本発明は、本明細書に記載されるＨＩＶ及び／またはＳＩＶの免疫原性タンパク質もしくはペプチドに限定されない。さらに、これらのタンパク質に対する様々な改変が報告されており、そうでなければ当業者が容易に行うことができる。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載されている改変ｇａｇタンパク質を参照のこと。さらに、任意の所望のＨＩＶ免疫原及び／またはＳＩＶ免疫原が、単独または組み合わせで送達され得る。そのような組み合わせには、単一ベクターからかまたは複数のベクターからの発現が含まれ得る。パポーバウイルス科には、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵウイルス及びＪＣＵウイルス）及びパピローマウイルス亜科（がんまたは乳頭腫の悪性進行と関連する）が含まれる。アデノウイルス科には、呼吸器疾患及び／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルス科ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、単純ウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を包含するａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科、ならびにサイトメガロウイルス属（ヒトＣＭＶ）、ムロメガロウイルス属）が含まれるｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科、ならびにリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、及びラジノウイルス属が含まれるｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科が含まれる。ポックスウイルス科には、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア属（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、ブタポックスウイルス属を包含するｃｈｏｒｄｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ亜科、ならびにｅｎｔｏｍｏｐｏｘｙｉｒｉｎａｅ亜科が含まれる。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。好適な抗原源であり得る分類対象外ウイルスの１つは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらに他のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスが含まれ得る。アルファウイルス科には、ウマ動脈炎ウイルス及び様々な脳炎ウイルスが含まれる。

【0212】

ワクチンに組み込むことができる（例えば、カセット内でコードされる）抗原には、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する、細菌、真菌、寄生性微生物もしくは多細胞寄生虫が含まれる病原体に対して、ヒトまたは非ヒト動物を免疫化するのに有用な免疫原も含まれる。細菌性病原体の例には、病原性グラム陽性球菌が含まれ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、及びｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが含まれる。病原性グラム陰性球菌には、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓが含まれる。病原性腸内グラム陰性桿菌には、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ及びｅｉｋｅｎｅｌｌａ；類鼻疽；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）；ｍｏｒａｘｅｌｌａ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）；ｂｒｕｃｅｌｌａ；Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）；ｙｅｒｓｉｎｉａ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）；ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓならびにｓｐｉｒｉｌｌｕｍが含まれる。グラム陽性桿菌には、ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）；ｃｈｏｌｅｒａ；Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；及びバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性菌によって引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス症；他のクロストリジウム；結核；ハンセン病；及び他のマイコバクテリアが含まれる。特定の細菌種の例は、限定することなく、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ複合体、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍである。病原性スピロヘータによる疾患には、梅毒；トレポネーマ症：イチゴ腫、ピンタ及び風土病梅毒；及びレプトスピラ症が含まれる。高病原体細菌及び病原性真菌によって引き起こされる他の感染症には、アクチノミセス症／放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、醸母菌症（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、ヒストプラスマ症（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）及びコクチジオイデス真菌症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）；カンジダ症（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、及びムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及びクロモミコーシス；及び皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染症には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘症が含まれる。マイコプラズマ感染症及びクラミジア感染症の例には、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；性病性リンパ肉芽腫、オウム病、及び周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性真核生物は、病原性の原生動物及び蠕虫を包含し、それらにより引き起こされる感染症には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒによって引き起こされる）；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症（例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉによって引き起こされる）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ感染症、トリカン（Ｔｒｉｃｈａｎ）感染症、トキソプラズマ感染症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、バベシア症；ジアルジア症（例えば、Ｇｉａｒｄｉａによって引き起こされる）、施毛虫症（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓによって引き起こされる）、フィラリア症、住血吸虫症（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａによって引き起こされる）、線虫感染症、吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）または吸虫（ｆｌｕｋｅ）感染症、及び条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。他の寄生虫感染症は、特にＡｓｃａｒｉｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、及びＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉによって引き起こされ得る。

【0213】

本明細書ではまた、感染症生物、対象における感染、または対象の感染細胞と関連する任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原は、感染症生物の核酸配列またはポリペプチド配列に由来し得る。感染症生物のポリペプチド配列には、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。感染症生物には、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、デング熱ウイルス、オルチミクソウイルス科（ｏｒｔｈｙｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）ウイルス、及び結核が含まれるが、これらに限定されない。

【0214】

抗原は、腫瘍細胞、感染細胞、または樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞等の細胞の細胞表面に提示されることが予測されるものを選択することができる。抗原は、免疫原性であることが予測されるものを選択することができる。

【0215】

抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下の、ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満であるＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドの場合は、８～１５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のアミノ酸長、プロテアソームによる切断を促進するペプチドの内部または近傍での配列モチーフの存在、及びＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、のうちの少なくとも１つを含むことができる。ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合は、６～３０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０のアミノ酸長、細胞外もしくはリソソームでのプロテアーゼ（例えば、カテプシン）による切断またはＨＬＡ－ＤＭに触媒されるＨＬＡ結合を促進するペプチドの内部もしくは近傍での配列モチーフの存在。

【0216】

１つ以上の抗原が腫瘍の表面に提示され得る。１つ以上の抗原が感染細胞の表面に提示され得る。

【0217】

１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であり得、例えば、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力がある。１つ以上の抗原は、感染症を有するかまたは有すると疑われる対象において免疫原性であり得、例えば、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力がある。１つ以上の抗原は、感染症のリスクのある対象において免疫原性であり得、例えば、その感染症に対する免疫学的防御（すなわち、免疫）を提供する、対象でのＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を刺激する能力、例えば、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、またはその感染症に特異的な抗体の産生を刺激する等の能力がある。

【0218】

１つ以上の抗原は、１つ以上の抗原を認識する抗体（例えば、腫瘍または感染症抗原を認識する抗体）の産生等のＢ細胞応答を刺激する能力があり得る。抗体は、直鎖ポリペプチド配列を認識することができるか、または二次及び三次構造を認識することができる。したがって、Ｂ細胞抗原には、直鎖ポリペプチド配列または二次構造及び三次構造を有するポリペプチドが含まれ得、それらとしては、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、または二次構造及び三次構造を有することが既知であるかもしくは予測される任意のポリペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍または感染症抗原に対するＢ細胞応答を刺激する能力がある抗原はそれぞれ、腫瘍細胞または感染症生物の表面に見られる抗原であり得る。腫瘍または感染症抗原に対するＢ細胞応答を誘発する能力がある抗原はそれぞれ、腫瘍または感染症生物で発現される細胞内ネオアンチゲンであり得る。

【0219】

１つ以上の抗原には、Ｔ細胞応答を刺激する能力がある抗原（例えば、予測されるＴ細胞エピトープ配列等のペプチド）と、Ｂ細胞応答を刺激する能力がある別個の抗原（例えば、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン）の組み合わせが含まれ得る。

【0220】

対象での自己免疫応答を刺激する１つ以上の抗原は、対象のためのワクチン作製との関連では、考慮から除外することができる。

【0221】

少なくとも１つの抗原ペプチド分子（例えば、エピトープ配列）のサイズは、限定するわけではないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０またはそれ以上のアミノ分子残基、及びそこから導き出せる任意の範囲を含むことができる。具体的な実施形態では、抗原ペプチド分子は５０アミノ酸以下である。

【0222】

抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩの場合は１５残基長以下であり得、通常約８～約１１残基、特に９または１０残基が含まれ、ＭＨＣクラスＩＩの場合は、６～３０残基であり得る。

【0223】

必要に応じて、より長いペプチドをいくつかの方法で設計することができる。ある場合では、ＨＬＡアレルでのペプチドの提示可能性が予測されるかまたは既知である場合、より長いペプチドには、（１）個々の提示されるペプチドが、各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端へ向かって２～５アミノ酸の伸長を有する、（２）提示されたペプチドの一部または全部と、各々について伸長された配列との連結、のいずれかが含まれ得る。別の場合では、シークエンシングにより腫瘍内に存在する長い（１０残基超）ネオエピトープ配列が明らかになる場合（例えば、新規ペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルーまたはイントロン包含による）、より長いペプチドには、（３）新規の腫瘍特異的または感染症特異的なアミノ酸の領域全体が含まれ、したがって、計算によるかまたはインビトロ試験に基づいた、最も強力なＨＬＡ提示の短いペプチドの選択の必要性が省かれる。いずれの場合も、より長いペプチドの使用により、患者細胞による内因性プロセシングが可能になり、より効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の刺激がもたらされ得る。より長いペプチドにはまた、腫瘍または感染症生物でそれぞれ発現されるもの等の、ペプチドの全長タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質ドメイン、及びそれらの組み合わせも含まれ得る。Ｂ細胞応答を刺激するために、より長いペプチド（例えば、全長タンパク質、タンパク質サブユニット、またはタンパク質ドメイン）及びそれらの組み合わせを含めることができる。

【0224】

抗原ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示され得る。いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様では、抗原ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満またはそれより低いＩＣ５０を有し得る。

【0225】

いくつかの態様では、抗原ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に自己免疫応答を誘導しない、及び／または免疫寛容を引き起こさない。

【0226】

また、少なくとも２つ以上の抗原ペプチドを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの別個のペプチドを含有する。少なくとも２つの別個のペプチドは、同じポリペプチドに由来し得る。別個のポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方で異なっていることを意味する。ペプチドには、腫瘍特異的変異が含まれ得る。腫瘍特異的ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来し得るか、あるいは正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチド、例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織で異常に発現されることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチドであり得る。ペプチドは、感染症生物と関連することが既知であるかまたはそのように疑われている任意のポリペプチドに由来し得るか、あるいは正常な細胞もしくは組織と比較して感染細胞において発現が変化していることが既知であるかまたはそのことが見出された任意のポリペプチドに由来するペプチドであり得る（例えば、発現が宿主細胞に限定されている感染症のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれる、感染症のポリヌクレオチドまたはポリペプチド）。抗原ペプチドが由来し得る好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ）データベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報を管理している。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、臨床グレードのがんゲノムデータを集約し、それらを何万ものがん患者からの臨床転帰と関連付けている。いくつかの態様では、腫瘍特異的変異は、特定のがん種のドライバー変異である。

【0227】

所望の活性または特性を有する抗原ペプチド及びポリペプチドを修飾して、ある特定の所望の属性、例えば薬理学的特性の改善を提供し、一方で、未修飾ペプチドが所望のＭＨＣ分子と結合して適切なＴ細胞を活性化させるという生物学的活性を増大させるかまたはその実質的にすべてを少なくとも保持するようにすることができる。例えば、抗原ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的な置換等の様々な変更に供することができ、その場合、そのような変更により、それらの使用における特定の利点、例えば、ＭＨＣの結合、安定性または提示の改善が提供され得る。保存的置換とは、あるアミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似する別のアミノ酸残基に置き換えること、例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、もしくはある極性残基を別の極性残基に置き換えることを意味する。置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせが含まれる。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を使用してプローブしてもよい。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）、及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されている、周知のペプチド合成手順を使用して行うことができる。

【0228】

様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの修飾は、ペプチド及びポリペプチドの安定性をインビボで増大させる際に特に有用であり得る。安定性は多くの方法でアッセイ可能である。例えば、ペプチダーゼ及び様々な生物学的媒体、例えば、ヒトの血漿及び血清が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照のこと。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して好都合に決定され得る。プロトコルは一般に以下のとおりである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、非熱非働化）を、使用前に遠心分離により脱脂する。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。所定の時間間隔で少量の反応溶液を取り出し、６％トリクロロ酢酸またはエタノールの水溶液に加える。混濁反応試料を１５分間冷却（４℃）し、その後、沈殿した血清タンパク質を遠心にかけてペレットにする。その後、ペプチドの存在を、安定性特異的なクロマトグラフィー条件を使用した逆相ＨＰＬＣによって決定する。

【0229】

ペプチド及びポリペプチドは、血清中半減期改善以外の所望の属性が得られるよう、修飾可能である。例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を刺激する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を刺激する能力がある少なくとも１つのエピトープを含有する配列への結合によって増強され得る。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー複合体は、スペーサー分子によって連結可能である。スペーサーは典型的には、生理学的条件下で実質的に非荷電である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物等の比較的小さい中性分子で構成される。スペーサーは典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意選択で存在するスペーサーは同じ残基で構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーでもホモオリゴマーでもあり得ることが理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは一般には少なくとも１または２残基、より一般には３～６残基である。別法として、ペプチドは、スペーサーを用いずにＴヘルパーペプチドに連結可能である。

【0230】

抗原ペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結することができ、またペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにおいてもスペーサーを介して連結することもできる。抗原ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれのアミノ末端も、アシル化が可能である。例示的Ｔヘルパーペプチドには、破傷風トキソイド８３０～８４３、インフルエンザ３０７～３１９、マラリアスポロゾイト周囲３８２～３９８及び３７８～３８９が含まれる。

【0231】

タンパク質またはペプチドは、標準的分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然物からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成等の、当業者に公知の任意の技術によって作製可能である。様々な遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースに見出すことができる。そのようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈウェブサイトに設けられたＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術または当業者に公知であろう技術を使用して、増幅及び／または発現が可能である。別法として、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な市販の調製物が当業者に公知である。

【0232】

さらなる態様では、抗原には、抗原ペプチドまたはその部分をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、一本鎖及び／または二本鎖、あるいは天然または安定化形態のポリヌクレオチド、例えば、チオリン酸骨格を有するポリヌクレオチド等、あるいはそれらの組み合わせのいずれかであり得、イントロンを含有する場合もあれば、含有しない場合もある。抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、発現が改善するよう、例えば、転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性を改善すること等により、配列最適化が可能である。例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、コドンが最適化されたものであり得る。本明細書で「コドン最適化」とは、所与の生物のコドンバイアスに関して使用頻度の低いコドンを、使用頻度の高い同義コドンに置き換えることを指す。ポリヌクレオチド配列を、転写後プロセシングが改善するよう最適化することができ、例えば、意図しないスプライシングが減少するよう、スプライシングモチーフ（例えば、標準及び／または潜在的／非標準のスプライスドナー配列、分岐配列、及び／またはアクセプター配列）の除去、及び／または好ましいスプライシング現象にバイアスをかけるための外因性スプライシングモチーフ（例えば、スプライスドナー配列、分岐配列、及び／またはアクセプター配列）の導入等を介して最適化することができる。外因性イントロン配列には、ＳＶ４０に由来するもの（例えば、ＳＶ４０ミニイントロン）及び免疫グロブリンに由来するもの（例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子）が含まれるが、これらに限定されない。外因性イントロン配列は、プロモーター／エンハンサー配列と抗原（複数可）配列の間に組み込まれ得る。発現ベクターに使用するための外因性イントロン配列は、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）：２８８－３０２）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド配列を、転写安定性が改善するよう、例えば、ＲＮＡ不安定性モチーフ（例えば、ＡＵリッチエレメント及び３’ＵＴＲモチーフ）及び／または反復ヌクレオチド配列の除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、正確な転写が改善するよう、例えば、潜在的転写イニシエーター及び／またはターミネーターの除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、翻訳及び翻訳精度が改善するよう、例えば、潜在的ＡＵＧ開始コドン、早期ポリＡ配列、及び／または二次構造モチーフの除去を介して最適化することができる。ポリヌクレオチド配列を、転写産物の核外輸送が改善するよう、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の付加等を介して最適化することができる。発現ベクターに使用するための核外輸送シグナルは、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｌ ５；３６３（２）：２８８－３０２）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド配列を、ＧＣ含量に関して、例えば、所与の生物の平均ＧＣ含量が反映されるよう最適化することができる。配列最適化により、転写、翻訳、転写後プロセシング、及び／またはＲＮＡ安定性等の１つ以上の配列特性のバランスを取ることができる。配列最適化により、転写、翻訳、転写後プロセシング、及びＲＮＡ安定性のそれぞれのバランスの取れた最適配列を生成することができる。ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ＩＤＴ）、Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、ＳＧＩ－ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）等の配列最適化アルゴリズムが当業者に公知である。抗原をコードするタンパク質の１つ以上の領域を別々に配列最適化することができる。

【0233】

さらに別の態様では、ポリペプチドまたはその部分を発現する能力がある発現ベクターを提供する。様々な細胞型の発現ベクターが当該技術分野において周知であり、過度の実験を伴うことなく選択することができる。一般に、ＤＮＡは、プラスミド等の発現ベクター内に、発現のための適切な配向及び正しいリーディングフレームで挿入される。必要に応じて、所望の宿主により認識される、適切な転写調節性及び翻訳調節性の制御ヌクレオチド配列にＤＮＡを連結させることができるが、そのような制御は一般に発現ベクター内で利用可能である。その後、ベクターが標準的技術により宿主に導入される。ガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに見出すことができる。

【0234】

ＩＶ．Ａ．カセット
１つ以上のペイロードの選択、「カセット」のクローニング及び構築ならびにウイルスベクターへのその挿入に用いられる方法は、本明細書で提供される教示を考慮すれば、当業者の技量の範囲内である。「ペイロードカセット」または「カセット」または「抗原カセット」とは、選択されたペイロードまたは複数のペイロード（例えば、抗原コード核酸配列等のペイロードコード核酸配列）と、ペイロード（複数可）を転写し、転写された産物を発現するために必要な他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。選択されたペイロードまたは複数のペイロードとは、別個のペイロード配列を指し得、例えば、カセット内のペイロードコード核酸配列は、ペイロードが転写され、発現されるよう、ペイロードコード核酸配列（または複数のペイロードコード核酸配列）をコードすることができる。ペイロードまたは複数のペイロードは、転写が可能な方法で調節性成分に機能的に連結され得る。そのような成分には、ウイルスベクターをトランスフェクトされた細胞においてペイロード（複数可）の発現を駆動することができる従来の調節エレメントが含まれる。したがって、ペイロードカセットは、選択されたプロモーターを含有することもでき、これは、ペイロード（複数可）に連結され、組換えベクターの選択ウイルス配列内に他の任意選択の調節エレメントと共に配される。Ａカセットには、１つ以上のペイロード、例えば、本明細書に記載されるペイロードのうちのいずれかをコードする１つ以上の配列が含まれ得る。カセットは、１つ以上のペイロードコード核酸配列を有することができ、例えば、複数のペイロードコード核酸配列を含有するカセットは、それぞれ独立して別々のプロモーターに機能的に連結されている、及び／または他のマルチシストン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｏｎｉｃ）の系、例えば、２Ａリボソームスキッピング配列要素（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列要素等を使用して一緒に連結されている。リンカーはまた、ＴＥＶまたはフーリンの切断部位等の切断部位を有することができる。切断部位を有するリンカーを、他の要素、例えば、多シストロン性の系にあるものと組み合わせて使用することができる。非限定的な例を用いて説明すると、フーリンプロテアーゼ切断部位が翻訳後の２Ａ配列の除去を促進するよう構成されるように、フーリンプロテアーゼ切断部位を２Ａリボソームスキッピング配列要素と組み合わせて使用することができる。

【0235】

複数のペイロードコード核酸配列を含有するカセットでは、各ペイロードコード核酸配列を連結させることができる（例えば、例示的な非限定的例では、連結されたＴ細胞エピトープをコードする連結されたペイロードコード核酸配列）。多シストロン性フォーマットの例を用いて説明すると、ペイロードをコードするカセットは、以下のように構成される：（１）内因性２６Ｓプロモーター－ペイロード１－Ｔ２Ａ－ペイロード２タンパク質、または（２）内因性２６Ｓプロモーター－ペイロード１－２６Ｓプロモーター－ペイロード２。多シストロン性フォーマットの例を用いてさらに説明すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペイロードをコードするカセットは、以下のように構成される：（１）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－Ｔ２Ａ－膜タンパク質、または（２）内因性２６Ｓプロモーター－スパイクタンパク質－２６Ｓプロモーター－連結されたＴ細胞エピトープ。

【0236】

本明細書に記載されるアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーターに加え、追加のプロモーターまたはプロモーターエレメントを用いることができる。有用なプロモーターは、構成的プロモーターまたは調節（誘導性）プロモーターであり得、発現されるペイロード（複数可）の量の制御を可能にする。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのプロモーターである［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照のこと］。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列はニワトリ細胞質ベータアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。他の好適または望ましいプロモーターも、当業者により選択され得る。

【0237】

カセットにはまた、ウイルスベクター配列にとって異種の核酸配列も含まれ得、これには、転写物（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）の効率的なポリアデニル化のためのシグナルをもたらす配列、ならびに機能的なスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位を有するイントロンが含まれる。本発明の例示的ベクターで用いられる一般的なポリＡ配列は、パポーバウイルスＳＶ－４０に由来するものである。ポリ－Ａ配列（例えば、非天然ポリＡ）は一般に、ペイロードに基づく配列の後、ウイルスベクター配列の前のカセット内に挿入され得る。一般的なイントロン配列はまたＳＶ－４０に由来し得、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と呼ばれる。カセットはまた、プロモーター／エンハンサー配列とペイロード（複数可）の間に位置するようなイントロンを含有することもできる。これら及び他の一般的ベクター要素の選択は、従来通りであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及びそこに引用されている参考文献を参照のこと］、そのような配列の多くが商業的及び産業的供給源ならびにＧｅｎｂａｎｋから利用可能である。

【0238】

カセットは、１つ以上のペイロード（例えば、１つ以上のペイロードコード核酸配列）を有することができる。例えば、所与のカセットには、１～１０、１～２０、１～３０、１０～２０、１５～２５、１５～２０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のペイロードが含まれ得る。ペイロードは、互いに直接連結され得る。ペイロードはまた、リンカーを用いて互いに連結され得る。ペイロードは、ＮからＣへ、またはＣからＮへ等の、互いに対して任意の配向が可能である。

【0239】

本明細書の他の箇所に記載があるように、カセットは、選択され得る部位の中でも特に、ＶＥＥ骨格の欠失させた構造タンパク質等のウイルスベクター内の任意の選択欠失の部位か、またはＣｈＡｄに基づくベクターのＥ１遺伝子領域欠失もしくはＥ３遺伝子領域欠失の部位に位置させることができる。

【0240】

多シストロン性ＳＡＭベクターは、各要素の規則配列を５’側から３’側へ表すための以下の式を用いて表すことができ、
Ｐ１－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－Ｐ２－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
式中、Ｐ１は、ＳＧＰ１サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐ２は、ＳＧＰ２サブゲノミックプロモーターを含み、Ｐａの場合、追加のカセットについてａ＝０または１であり、Ｎは、ペイロードコード核酸配列を含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮｃは、対応するペイロードコード核酸配列であり、かつ、Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵｆは普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であり、任意選択で、少なくとも１つの普遍的配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む。

【0241】

ペイロードをコードする配列（例えば、カセット、またはカセット内のペイロードをコードする核酸配列のうちの１つ以上）は、各要素の規則配列を５’側から３’側へ表すための以下の式を用いて表すことができ、
Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ－Ｇ３_ｇ
式中、Ｐは、第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ａ＝０または１であり、ｃ＝１であり、Ｎは、本明細書に記載されるペイロード由来核酸配列のうちの１つ（例えば、本明細書に記載される抗原コード核酸配列のうちのいずれか）を含み、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、各Ｘについて、対応するＮ_ｃは、ペイロードコード核酸配列であり、かつ、Ｙ＝０、１、または２であり、各Ｙについて、対応するＵ_ｆは、（１）普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であって、任意選択で、かかる少なくとも１つの普遍的配列が破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む、普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列であるか、または（２）ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮ_ｃは、別個のペイロードコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵ_ｆは、別個の普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列または別個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である。上記のペイロードコード配列式は、場合によっては、連結されたＴ細胞エピトープ等の連結されたペイロード配列をコードするカセットの部分を表すだけである。例えば、例示的な非限定的例として、連結されたＴ細胞エピトープ及び１つ以上の全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードするカセットでは、上記のペイロードコード配列式は連結されたＴ細胞エピトープを表し、これとは別に、カセットは、２Ａリボソームスキッピング配列要素（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）及び／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列要素等のマルチシストン性の系を使用して任意選択で連結されている、１つ以上の全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質をコードする。

【0242】

一例では、存在する要素には、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であり、ベクター骨格がＣｈＡｄＶ６８ベクターを含む場合、ａ＝１であり、ＰはＣＭＶプロモーターであり、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列が存在し、ここで、第２のポリ（Ａ）配列は、ベクター骨格にとって外因性ポリ（Ａ）配列であり、ここで、任意選択で、外因性ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列もしくはＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列を含み、かつ、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、５’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、３’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であることが含まれる。上記のペイロードコード配列式は、場合によっては、連結されたＴ細胞エピトープ等の連結されたエピトープ配列をコードするペイロードカセットの部分を表すだけである。

【0243】

一例では、存在する要素には、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝１８、Ｙ＝２であり、ベクター骨格がベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターを含む場合、ａ＝０であり、ペイロードカセットが、内因性２６Ｓプロモーターに機能的に連結されており、少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、骨格により提供される少なくとも８０個の連続するＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ、またはそれらの組み合わせをコードし、Ｌ５は、エピトープの天然Ｎ末端アミノ酸配列をコードする天然５’リンカー配列であり、ここで、５’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｌ３は、エピトープの天然Ｃ末端アミノ酸配列をコードする天然３’リンカー配列であり、ここで、３’リンカー配列が、少なくとも３アミノ酸長であるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列の各々であることが含まれる。

【0244】

ペイロードカセットは、各要素の規則配列を５’側から３’側へ表すための以下の式を用いて表すことができ、
（Ｐ_ａ－（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）_Ｘ）_Ｚ－（Ｐ２_ｈ－（Ｇ５_ｅ－Ｕ_ｆ）_Ｙ）_Ｗ－Ｇ３_ｇ
式中、Ｐ及びＰ２はプロモーターヌクレオチド配列を含み、ＮはＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープをコードする核酸配列であり、各Ｙについて、対応するＵｆは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列（例えば、普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列）である。普遍的配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含むことができる。普遍的配列は、破傷風トキソイドペプチドを含むことができる。普遍的配列は、ＰＡＤＲＥペプチドを含むことができる。普遍的配列は、破傷風トキソイドペプチド及びＰＡＤＲＥペプチドを含むことができる。存在する要素の数を選択することにより、組成物及び規則配列をさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１、ｂ＝０または１、ｃ＝１、ｄ＝０または１、ｅ＝０または１、ｆ＝１、ｇ＝０または１、ｈ＝０または１、Ｘ＝１～４００、Ｙ＝０、１、２、３、４または５、Ｚ＝１～４００、及びＷ＝０、１、２、３、４または５である。

【0245】

一例では、存在する要素には、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、及びＷ＝１である場合、追加のプロモーターは存在せず（例えば、ＲＮＡアルファウイルスまたはＣｈＡｄＶの骨格等のベクター骨格で提供されるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、１０のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、５’リンカーが各Ｎに存在し、３’リンカーが各Ｎに存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最終ＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、かつ、２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）に連結するリンカーが存在することを表していることが含まれる。

【0246】

カセットの３’末端をベクター骨格（例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格）に連結することの例には、３’の１９ｎｔ ＣＳＥ等のベクター骨格によって提供される３’ＵＴＲ要素に直接連結することが含まれる。カセットの５’末端をベクター骨格（例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格）に連結することの例には、サブゲノミックプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列）、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔ ＣＳＥ、もしくは２４ｎｔ ＣＳＥ等の、ベクター骨格のプロモーターまたは５’ＵＴＲ要素に直接連結することが含まれる。

【0247】

他の例には、以下が含まれる：ａ＝１の場合、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在することを表し；ａ＝１、かつ、Ｚが１より大きい場合、ベクター骨格によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在し、各々が、核酸配列をコードする１つ以上の別個のＭＨＣクラスＩエピトープの発現を駆動し；ｈ＝１の場合、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列の発現を駆動するための別個のプロモーターが存在することを表し；かつ、ｇ＝０の場合、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列は、存在する場合に、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）に直接連結されていることを表す。例えば、ＣｈＡｄＶベクター骨格は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下に置かれた抗原カセットを有することができる。

【0248】

他の例には、存在している各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有し得る場合、３’リンカーを有し得る場合、どちらも有し得ない場合、または両方を有し得る場合が含まれる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカー及び３’リンカーの両方を有し得るが、他のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーを有するか、３’リンカーを有するか、またはどちらも有し得ない。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他のＭＨＣクラスＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0249】

複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーと３’リンカーの両方を有し得るが、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0250】

他の例には、存在している各ペイロードが、５’リンカーを有し得る場合、３’リンカーを有し得る場合、どちらも有し得ない場合、または両方を有し得る場合が含まれる。複数の各ペイロードが同じ各ペイロードカセット内に存在する例では、一部の各ペイロードは５’リンカーと３’リンカーの両方を有し得るが、他の各ペイロードは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。複数の各ペイロードが同じ各ペイロードカセット内に存在する他の例では、一部の各ペイロードは５’リンカーまたは３’リンカーのいずれかを有し得るが、他の各ペイロードは５’リンカーを有し得るか、３’リンカーを有し得るか、またはどちらも有し得ない。

【0251】

プロモーターヌクレオチド配列であるＰ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格等のベクター骨格によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列と同じであり得る。例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって提供されるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２は、各々がサブゲノミックプロモーター配列（例えば、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列）またはＣＭＶプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列であるＰ及び／またはＰ２は、ベクター骨格（例えば、ＣｈＡｄＶまたはＲＮＡアルファウイルスの骨格）によって提供されるプロモーターヌクレオチド配列とは異なっていてよく、また互いに異なっていてもよい。

【0252】

５’リンカーであるＬ５は、天然配列でも非天然配列でもあり得る。非天然配列には、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが含まれるが、これらに限定されない。３’リンカーであるＬ３もまた、天然配列でも非天然配列でもあり得る。さらに、Ｌ５及びＬ３は、両方が天然配列であること、両方が非天然配列であること、または一方が天然であり、他方が非天然であることが可能である。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸長であり得る。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、２～３０、２～４０、２～５０、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、３～４０、３～５０、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、４～４０、４～５０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～４０、５～５０、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、６～４０、６～５０、７～１０、７～１５、７～２０、７～２５、７～３０、７～４０、７～５０、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、８～４０、または８～５０のアミノ酸長であり得る。

【0253】

アミノ酸リンカーＧ５は各Ｙについて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸長であり得る。Ｇ５はまた、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、２～３０、２～４０、２～５０、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、３～４０、３～５０、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、４～４０、４～５０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～４０、５～５０、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、６～４０、６～５０、７～１０、７～１５、７～２０、７～２５、７～３０、７～４０、７～５０、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、８～４０、または８～５０のアミノ酸長でもあり得る。

【0254】

アミノ酸リンカーＧ３は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。Ｇ３はまた、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸長でもあり得る。Ｇ３は、２～１０、２～１５、２～２０、２～２５、２～３０、２～４０、２～５０、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、３～４０、３～５０、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、４～４０、４～５０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～４０、５～５０、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、６～４０、６～５０、７～１０、７～１５、７～２０、７～２５、７～３０、７～４０、７～５０、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、８～４０、または８～５０のアミノ酸長でもあり得る。

【0255】

各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープの組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープ及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ及びＢ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原の組み合わせをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープ／抗原をコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、７～１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎはまた、ＭＨＣクラスＩエピトープの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長をコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎはまた、ＭＨＣクラスＩエピトープの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０アミノ酸長をコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、Ｂ細胞応答を刺激する能力があるエピトープをコードすることができる。

【0256】

多シストロン性の系内の各カセットそれぞれを含め、カセットは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも１０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも２０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも３０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも４０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも５０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも６０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも７０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも８０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、少なくとも９０００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、１００～１０００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、１００～９０００、または１００～１００００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、５００～１０００、５００～２０００、５００～３０００、５００～４０００、５００～５０００、５００～６０００、５００～７０００、５００～８０００、５００～９０００、または５００～１００００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、１０００～２０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、または１０００～１００００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、ほぼアルファウイルスから欠失させた長さ（例えば、ＶＥＥ骨格において欠失させた構造タンパク質の長さ）であり得る。カセットは、アルファウイルスから欠失させた長さより短い長さであり得る。カセットは、アルファウイルスから欠失させた長さを超える長さであり得る。

【0257】

複数のカセットが含まれるベクターの場合、全カセットを合わせた合計の長さは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド長であり得る。複数のカセットが含まれるベクターの場合、全カセットを合わせた合計の長さは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチド長であり得る。複数のカセットが含まれるベクターの場合、全カセットを合わせた合計の長さは、１００～１０００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、１００～９０００、または１００～１００００ヌクレオチド長であり得る。複数のカセットが含まれるベクターの場合、全カセットを合わせた合計の長さは、５００～１０００、５００～２０００、５００～３０００、５００～４０００、５００～５０００、５００～６０００、５００～７０００、５００～８０００、５００～９０００、または５００～１００００ヌクレオチド長であり得る。複数のカセットが含まれるベクターの場合、全カセットを合わせた合計の長さは、１０００～２０００、１０００～３０００、１０００～４０００、１０００～５０００、１０００～６０００、１０００～７０００、１０００～８０００、１０００～９０００、または１０００～１００００ヌクレオチド長であり得る。

【0258】

カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得る。カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる（例えば、免疫原性ポリペプチドコードする、感染症または腫瘍に由来する２つの別個の核酸配列をコードすることができる）。カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、７００ヌクレオチド以下であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のペイロードが含まれ得る。

【0259】

カセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる（例えば、免疫原性ポリペプチドコードする、感染症または腫瘍に由来する２つの別個の核酸配列をコードすることができる）。カセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは３７５～７００ヌクレオチド長であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列コードすることができる。カセットは、３７５～７００ヌクレオチド長であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のペイロードが含まれ得る。

【0260】

カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得る。カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、６００、５００、４００、３００、２００、もしくは１００ヌクレオチド長またはそれ以下であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のペイロードが含まれ得る。

【0261】

カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得る。カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、少なくとも３つの別個のエピトープコード核酸配列をコードすることができる。カセットは、３７５～６００、３７５～５００、または３７５～４００ヌクレオチド長であり得、１～１０、１～５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のペイロードが含まれ得る。

【0262】

Ｖ．ワクチン組成物
本明細書ではまた、特異的免疫応答、例えば、腫瘍特異的免疫応答または感染症生物特異的免疫応答を生じさせる能力がある免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も開示する。ワクチン組成物は典型的には、例えば、本明細書に記載の方法を使用して選択されるか、あるいは病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び／または寄生虫由来ペプチドから選択される、１つまたは複数の抗原を含む。ワクチン組成物はワクチンとも呼ばれ得る。

【0263】

ワクチンは、１～３０のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０の異なるペプチド、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４の異なるペプチド、または１２、１３もしくは１４の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドには、翻訳後修飾が含まれ得る。ワクチンは、１～１００もしくはそれ以上のヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはそれ以上の異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３もしくは１４の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１～３０の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはそれ以上の異なる抗原配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４の異なる抗原配列、または１２、１３もしくは１４の異なる抗原配列を含有することができる。

【0264】

ワクチンは、１～３０の抗原コード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはそれ以上の異なる抗原コード核酸配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４の異なる抗原コード核酸配列、または１２、１３もしくは１４の異なる抗原コード核酸配列を含有することができる。抗原コード核酸配列とは、「抗原カセット」の部分をコードする抗原を指し得る。抗原カセットの特徴については本明細書で詳述されている。カセットは、カセット内で一緒に連結されている２つ以上の抗原コード核酸配列（例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする連結された抗原コード核酸配列）を含有することができる。

【0265】

ワクチンは、１～３０の別個のエピトープコード核酸配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４，９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはそれ以上の別個のエピトープコード核酸配列、６、７、８、９、１０ １１、１２、１３、もしくは１４の別個のエピトープコード核酸配列、または１２、１３もしくは１４の別個のエピトープコード核酸配列を含有することができる。エピトープコード核酸配列とは、カセット内で一緒に連結されている２つ以上の抗原コード核酸配列の、連結されたＴ細胞エピトープの各々のような、個々のエピトープ配列のための配列を指し得る。

【0266】

ワクチンは、エピトープコード核酸配列の少なくとも２つのリピートを含有することができる。本明細書で使用される、「反復」（または互換的に「リピート」）とは、抗原コード核酸配列内での同一の核酸エピトープコード核酸配列（本明細書に記載される任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）の２回以上の反復を指す。一例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は、エピトープコード核酸配列の少なくとも２回の反復をコードする。さらなる非限定的な例では、カセットの抗原コード核酸配列部分は、複数の別個のエピトープをコードし、別個のエピトープのうちの少なくとも１つは、別個のエピトープをコードする核酸配列の少なくとも２回の反復によってコードされる（すなわち、少なくとも２つの別個のエピトープコード核酸配列）。例示的な非限定的例では、抗原コード核酸配列は、エピトープコード核酸配列によってコードされるエピトープＡ、Ｂ、及びＣをコードし、エピトープコード配列Ａ（Ｅ_Ａ）、エピトープコード配列Ｂ（Ｅ_Ｂ）、及びエピトープコード配列Ｃ（Ｅ_Ｃ）、ならびに別個のエピトープのうちの少なくとも１つの反復を有する例示的な抗原コード核酸配列は、以下の式によって例示されるが、これらに限定されない：
－１つの別個のエピトープの反復（エピトープＡの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ
－複数の別個のエピトープの反復（エピトープＡ、Ｂ、及びＣの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ
－複数の別個のエピトープの多回反復（エピトープＡ，Ｂ，及びＣの反復）：
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ、または
Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ。

【0267】

上記の例は限定的なものではなく、別個のエピトープのうちの少なくとも１つの反復を有する抗原コード核酸配列は、別個のエピトープの各々を任意の順序または頻度でコードすることができる。例えば、順序及び頻度は、別個のエピトープのランダムな配置、例えば、エピトープＡ、Ｂ、及びＣを用いる例では式Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ｂ。が可能である。

【0268】

本明細書ではまた、抗原コードカセットも提供され、この抗原コードカセットは、５’側から３’側へ、下式で表される少なくとも１つの抗原コード核酸配列を有し、
（Ｅ_ｘ－（Ｅ^Ｎ _ｎ）_ｙ）_ｚ
式中、Ｅは、別個のエピトープコード核酸配列等のヌクレオチド配列を表し、
ｎは、別々の別個のエピトープコード核酸配列の数を表し、かつ、０を含めた任意の整数であり、
Ｅ^Ｎは、それぞれの対応するｎの、別々の別個のエピトープコード核酸配列を構成するヌクレオチド配列を表し、
ｚ回の反復ごとに、ｘ＝０または１、各ｎについてｙ＝０または１、及びｘまたはｙの少なくとも一方＝１、かつ
ｚ＝２以上であり、ここで、抗原コード核酸配列は、Ｅ、所与のＥ^Ｎ、またはそれらの組み合わせの少なくとも２回の反復を含む。

【0269】

各ＥまたはＥ^Ｎは、独立して、本明細書に記載の任意のエピトープコード核酸配列（例えば、感染症Ｔ細胞エピトープ及び／またはネオアンチゲンエピトープをコードするペプチド）を含むことができる。例えば、各ＥまたはＥ^Ｎは、独立して、５’側から３’側へ、式（Ｌ５_ｂ－Ｎ_ｃ－Ｌ３_ｄ）で表されるヌクレオチド配列を含むことができ、その場合、Ｎは、各ＥまたはＥ^Ｎと関連する別個のエピトープコード核酸配列を含み、ｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ｄ＝０または１である。使用可能なエピトープ及びリンカーは本明細書に詳述されており、例えば、Ｖ．Ａ．抗原カセットを参照されたい。

【0270】

エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）の反復は、配列同士を直鎖状に直接連結され得る（例えば、上記例示のようにＥ_Ａ－Ｅ_Ａ－．．．）。エピトープコード核酸配列の反復は、１つ以上の追加のヌクレオチド配列によって区切られ得る。一般に、エピトープコード核酸配列の反復は、本明細書に記載の組成物に適用可能な任意のサイズのヌクレオチド配列によって区切られ得る。一例では、エピトープコード核酸配列の反復は、別々の別個のエピトープコード核酸配列（例えば、上記例示のように、Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ｃ－Ｅ_Ａ．．．））によって区切られ得る。反復が、単一の別々の別個のエピトープコード核酸配列によって区切られており、各エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）が２５アミノ酸長のペプチドをコードする例では、反復は７５ヌクレオチドによって区切られ得、例えば、Ｅ_Ａ－Ｅ_Ｂ－Ｅ_Ａ・・・で表される抗原コード核酸の場合、Ｅ_Ａは７５ヌクレオチドによって区切られている。例を用いて説明すると、２５マーの抗原であるＴｒｐ１（ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱ）及びＴｒｐ２（ＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴ）の反復をコードする配列ＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴＶＴＮＴＥＭＦＶＴＡＰＤＮＬＧＹＭＹＥＶＱＷＰＧＱＴＱＰＱＩＡＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹＳＶＲＤＴを有する抗原コード核酸では、Ｔｒｐ１の反復は２５マーのＴｒｐ２によって区切られており、したがって、Ｔｒｐ１エピトープコード核酸配列の反復は、７５ヌクレオチドのＴｒｐ２エピトープコード核酸配列で区切られている。反復が、２、３、４、５、６、７、８、または９の別々の別個のエピトープコード核酸配列によって区切られており、各エピトープコード核酸配列（任意選択の５’リンカー配列及び／または任意選択の３’リンカー配列を包含）が２５アミノ酸長のペプチドをコードする例では、反復はそれぞれ、１５０、２２５、３００、３７５、４５０、５２５、６００、または６７５のヌクレオチドによって区切られ得る。

【0271】

一実施形態では、異なるペプチド及び／またはポリペプチド、あるいはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子等の異なるＭＨＣ分子と会合する能力を持つよう選択される。いくつかの態様では、１つのワクチン組成物は、出現頻度が最も高いＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する能力があるペプチド及び／またはポリペプチドのためのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２つの好ましい、少なくとも３つの好ましい、もしくは少なくとも４つの好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する能力がある異なる断片を含むことができる。

【0272】

ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び／または特異的ヘルパーＴ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的ヘルパーＴ細胞応答を刺激する能力があり得る。

【0273】

ワクチン組成物は、特異的Ｂ細胞応答（例えば、抗体反応）を刺激する能力があり得る。

【0274】

ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び／または特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的ヘルパーＴ細胞応答及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。ワクチン組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、及び特異的Ｂ細胞応答を刺激する能力があり得る。

【0275】

ワクチン組成物はさらに、アジュバント及び／または担体を含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例は、本明細書で以下に記載される。組成物は、担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞等、例えば、Ｔ細胞にペプチドを提示する能力がある樹状細胞（ＤＣ）等と会合することができる。

【0276】

アジュバントは、ワクチン組成物内に混合することにより抗原に対する免疫応答を増大させるか、そうでなければ修正する、任意の物質である。担体は、足場構造、例えば、抗原を会合させることができるポリペプチドまたは多糖であり得る。任意選択で、アジュバントは、共有結合または非共有結合により結合される。

【0277】

アジュバントが抗原に対する免疫応答を増大させる能力は、典型的には、免疫介在性反応の大幅もしくは実質的な増大、または疾患症状の軽減により示される。例えば、液性免疫の増大は典型的には、抗原に対して産生された抗体の力価の大幅な増大によって示され、またＴ細胞活性の増大は、典型的には、細胞の増殖、または細胞傷害性、またはサイトカイン分泌の増大に示される。アジュバントはまた、免疫応答を、例えば、主に液性またはＴｈによる応答を主に細胞性またはＴｈによる応答に変えることによって変化させ得る。

【0278】

好適なアジュバントには、１０１８ ＩＳＳ、ミョウバン、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクター系、ＰＬＧ微粒子、レジキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニン由来のＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ等の所有権のある他のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。不完全フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦ等のアジュバントが有用である。樹状細胞に対して特異的ないくつかの免疫アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に報告されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７、Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。サイトカインも使用され得る。いくつかのサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織への遊走に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－アルファ）、Ｔリンパ球に対する効率的抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を促進すること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１及びＩＬ－４）（参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）に直接関連している。

【0279】

ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドもまた、ワクチンという状況ではアジュバントの効果を増強させることが報告されている。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９と結合するＲＮＡ等の他のＴＬＲ結合分子も使用され得る。

【0280】

有用なアジュバントの他の例には、化学修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非－ＣｐＧ細菌ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに治療薬及び／またはアジュバントとして作用し得るシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５等の免疫活性小分子及び抗体が含まれるが、これらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、過度の実験を伴うことなく当業者により容易に決定され得る。追加のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）等のコロニー刺激因子が含まれる。

【0281】

ワクチン組成物は、２種以上の異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記のものまたはそれらの組み合わせのいずれかを含め、任意のアジュバント物質を含むことができる。また、ワクチン及びアジュバントを一緒に、または任意の適切な順序で別々に投与可能であることも企図される。

【0282】

担体（または賦形剤）は、アジュバントとは独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるために特に変異体の分子量を増加させること、安定性を付与すること、生物学的活性を増大させること、または血清中半減期を延長することであり得る。さらに、担体は、ペプチドをＴ細胞に提示するのを助けることができる。担体は、当業者に既知の任意の好適な担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン等、免疫グロブリン、またはホルモン、例えば、インスリンもしくはパルミチン酸等であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫化の場合、担体は一般に、ヒトに許容され、かつ安全な、生理学的に許容される担体である。ただし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは好適な担体である。別法として、担体は、デキストラン、例えば、セファロースであり得る。

【0283】

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来性抗原それ自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドという形態にある抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に可能である。これに一致して、ペプチドがＣＴＬの活性化に使用されるだけではなく、さらなるＡＰＣがそれぞれのＭＨＣ分子と共に加えられる場合、免疫応答が増強され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ワクチン組成物はさらに、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。

【0284】

抗原はまた、ウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォーム、例えば、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または第２世代、第３世代もしくは第２／第３世代ハイブリッドのレンチウイルス及び特定の細胞型もしくは受容体を標的にするよう設計された任意の世代の組換えレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されないレンチウイルス等に含めることもできる（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）。上記のウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォームのパッケージング容量に応じて、この手法では、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列に隣接する場合もあれば、リンカーによって区切られている場合も、細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列が先行する場合もある（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照のこと）。宿主への導入時、感染細胞は抗原を発現し、それによりペプチド（複数可）に対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答が刺激される。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫に有用な多種多様な他のワクチンベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター等は本明細書での説明から当業者に明らかであろう。

【0285】

Ｖ．Ａ．ワクチンの設計及び製造に関する追加の考慮事項
Ｖ．Ａ．１．すべての腫瘍サブクローンを対象とするペプチドのセットの決定
すべてまたはほとんどの腫瘍サブクローンによって提示されるペプチドを意味する幹ペプチド（Ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）に、ワクチン内に含めるための優先順位を付けることができる。任意選択で、提示され、かつ高い確率で免疫原性であることが予測される幹ペプチドがない場合、または提示され、かつ高い確率で免疫原性であることが予測される幹ペプチドの数が、追加の非幹ペプチドをワクチンに含めることができるほど十分に少ない場合は、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定し、ワクチンでカバーされる腫瘍サブクローンの数が最大限となるようにペプチドを選択することにより、さらなるペプチドに優先順位を付けることができる。

【0286】

Ｖ．Ａ．２．抗原の優先順位付け
上記の抗原フィルターがすべて適用された後でも、ワクチン技術が支持できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチンに含めるために利用可能な場合がある。さらに、抗原分析の様々な側面が依然として不確かな場合があり、ワクチン抗原候補の異なる特性間でのトレードオフが存在し得る。したがって、選択工程の各ステップにおける所定のフィルターの代わりに、統合的多次元モデル、すなわち、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を配し、統合的手法を使用して選択を最適化するモデルを考慮することができる。
１．自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（典型的には、自己免疫のリスクが低い方が好ましい）
２．シークエンシングアーチファクトの確率（典型的には、アーチファクトの確率の低い方が好ましい）
３．免疫原性の確率（典型的には、免疫原性の確率の高い方が好ましい）
４．提示の確率（典型的には、提示の確率の高い方が好ましい）
５．遺伝子発現（典型的には、発現の高い方が好ましい）
６．ＨＬＡ遺伝子の対象範囲（抗原のセットの提示に関与するＨＬＡ分子の数が大きいほど、腫瘍、感染症、及び／または感染細胞がＨＬＡ分子の下方制御もしくは変異を介して免疫攻撃から逃避する確率が低くなり得る）
７．ＨＬＡクラスの対象範囲（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方を対象とすることにより、治療効果の確率が上がり、腫瘍または感染症による回避の確率が下がり得る）

【0287】

さらに、任意選択で、抗原が、患者の腫瘍もしくは感染細胞の全部もしくは一部において、喪失または不活性化しているＨＬＡアレルにより提示されることが予測される場合、それらの抗原をワクチン接種の優先順位から外す（例えば、除外する）ことができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の消失、または遺伝子座のホモ接合性の欠失のいずれかによって起こる。ＨＬＡアレル体細胞変異の検出のための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）及びホモ接合性の欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出のための方法も同様に十分に報告されている。（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原はまた、質量分析データから、予測抗原が予測ＨＬＡアレルにより提示されないことが示される場合にも優先順位から外され得る。

【0288】

Ｖ．Ｃ．自己増幅ＲＮＡベクター
一般に、すべての自己増幅ＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターは、自己複製ウイルスに由来する自己増幅骨格を含有する。用語「自己増幅骨格」とは、ウイルスゲノムの自己複製を可能にする、自己複製ウイルスの最小配列（複数可）を指す。例えば、アルファウイルスの自己複製を可能にする最小配列には、非構造タンパク質媒介性増幅のための保存された配列（例えば、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及び／またはポリＡ配列）が含まれ得る。自己増幅骨格にはまた、ウイルスのサブゲノムＲＮＡの発現のための配列（例えば、アルファウイルスでは２６Ｓプロモーターエレメント）も含まれ得る。ＳＡＭベクターは、プラス鎖ＲＮＡポリヌクレオチドまたはマイナス鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、プラス鎖またはマイナス鎖自己複製ウイルスに由来する骨格を持つベクターであり得る。自己複製ウイルスには、アルファウイルス、フラビウイルス（例えば、クンジンウイルス）、麻疹ウイルス、及びラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。自己複製ウイルスに由来するＳＡＭベクター系の例は、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １３；２３（１２）．ｐｉｉ：Ｅ３３１０．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２３１２３３１０）に詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0289】

Ｖ．Ｃ．１．アルファウイルス生物学
アルファウイルスはトガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。それらのメンバーは典型的には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、チクングニアウイルス、及びセムリキ森林ウイルス等の旧世界、または東部ウマ脳炎、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその派生株ＴＣ－８３等の新世界に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然アルファウイルスゲノムは典型的には、長さが約１２ｋｂであり、その最初の３分の２には、ウイルスゲノムの自己複製のためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子が含有され、最後の３分の１には、ビリオン産生のための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットが含有される（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。

【0290】

アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞へのウイルスの付着に続き、ビリオンが細胞内コンパートメント内の膜と融合し、最終的にサイトゾル内へのゲノムＲＮＡの放出をもたらす。このゲノムＲＮＡは、プラス鎖方向にあり、かつ５’のメチルグアニル酸キャップ及び３’のポリＡ尾部を含み、翻訳されて、複製複合体を形成する非構造タンパク質ｎｓＰ１～４を生成する。感染初期にはその後、プラス鎖は複合体によりマイナス鎖のテンプレートに複製される。現在のモデルでは、複製複合体は、感染の進行につれてさらなるプロセシングを受け、そこから生じるプロセシングされた複合体が、マイナス鎖から、全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ、及び構造遺伝子を含有する２６Ｓサブゲノミックプラス鎖ＲＮＡの両方への転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）は、様々なＲＮＡ複製ステップにおいて役割を果たすことが確認されており、それらには、マイナス鎖テンプレートからのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補鎖、ゲノムテンプレートからのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔ ＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡの間の接合部領域での２４ｎｔ ＣＳＥ、及びプラス鎖テンプレートからのマイナス鎖合成における３’ １９ｎｔ ＣＳＥが含まれる。

【0291】

ウイルスの自然の生活環では、様々なＲＮＡ種の複製に続き、ウイルス粒子が典型的には構築される。２６Ｓ ＲＮＡが翻訳され、そこから生じたタンパク質がさらなるプロセシングを受けて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２つの小ポリペプチドＥ３及び６Ｋ等の構造タンパク質が生成される（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルスＲＮＡのカプシド形成が起こり、通常はパッケージされるゲノムＲＮＡにのみ特異的なカプシドタンパク質を持ち、その後、ビリオンが組み立てられ、膜表面に出芽する。

【0292】

Ｖ．Ｃ．２．送達ベクターとしてアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルスの配列、特徴、及び他の要素を含む）を使用して、アルファウイルス系送達ベクター（アルファウイルスベクター（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）、アルファウイルスウイルスベクター（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ベクターとも呼ばれる）を生成することができる。アルファウイルスは、以前から発現ベクター系として使用するために操作されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、特に、異種抗原発現が所望され得るワクチンという状況において、いくつかの利点を提供する。アルファウイルスベクターは一般に、宿主サイトゾルで自己複製するその能力のため、細胞内に多くのコピー数の発現カセットを生成することができ、高レベルの異種抗原生成をもたらす。さらに、ベクターは一般に一過性であるため、バイオセーフティの改善、ならびにベクターに対する免疫寛容の誘導の減少をもたらす。一般に、公衆は、ヒトアデノウイルス等の他の標準的ウイルスベクターと比較して、アルファウイルスベクターに対する既存の免疫も欠いている。また、アルファウイルスに基づくベクターは一般に、感染細胞に対する細胞傷害性応答ももたらす。細胞傷害性は、発現された異種抗原に対する免疫応答を適切に刺激するために、ワクチンという状況ではある程度重要であり得る。ただし、所望の細胞傷害性の程度は綱渡り的であり得るため、ＶＥＥのＴＣ－８３株を含め、いくつかの弱毒化アルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例は、高レベルの抗原発現を可能にし、抗原に対する強い免疫応答を刺激し、ベクター自体に対する免疫応答を刺激せず、かつ安全な方法で使用可能である、アルファウイルス骨格を利用することができる。さらに、抗原発現カセットは、ＶＥＥまたはその弱毒化派生株ＴＣ－８３に由来する配列が含まれるがこれらに限定されない、ベクターが使用するアルファウイルス配列の最適化を介して、異なるレベルの免疫応答を刺激するよう設計可能である。

【0293】

アルファウイルス配列を使用して、いくつかの発現ベクター設計戦略が設計されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。一戦略では、アルファウイルスベクター設計には、２６Ｓプロモーター配列エレメントの第２のコピーを構造タンパク質遺伝子の下流に挿入し、それに続けて異種遺伝子を挿入することが含まれる（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。したがって、天然の非構造タンパク質及び構造タンパク質に加え、異種タンパク質を発現する追加のサブゲノムＲＮＡが生成される。この系では、感染性ビリオンの生成のための全エレメントが存在するため、非感染細胞における発現ベクターの感染の繰り返しが発生し得る。

【0294】

別の発現ベクター設計では、ヘルパーウイルス系を利用している（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質が異種遺伝子に置き換えられる。したがって、まだ無傷の非構造遺伝子に媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製に続いて、２６ＳサブゲノムＲＮＡにより、異種タンパク質の発現がもたらされる。従来、構造タンパク質を発現する追加のベクターはその後、細胞株のコトランスフェクション等によりトランスで供給され、感染性ウイルスが生成される。系は、ＵＳＰＮ８，０９３，０２１に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヘルパーベクター系は、感染性粒子が形成される可能性を制限するという利益を提供し、したがって、バイオセーフティが改善する。さらに、ヘルパーベクター系はベクター全長を短縮し、複製及び発現の効率が改善する。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、アルファウイルス骨格を利用することができ、ここで、構造タンパク質は抗原カセットに置き換えられ、得られたベクターは、バイオセーフティの問題を減らすと同時に、発現ベクター全体のサイズの縮小による効率的な発現を促進する。

【0295】

Ｖ．Ｃ．３．インビトロでの自己増幅ウイルスの生成
ＲＮＡ生成のための当該技術分野で周知の好都合な技術は、インビトロ転写（ＩＶＴ）である。この技術では、まず所望のベクターのＤＮＡテンプレートが、当業者に周知の技術、例えば、クローニング、制限酵素消化、ライゲーション、遺伝子合成（例えば、化学合成及び／または酵素による合成）、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の標準的な分子生物学技術によって生成される。

【0296】

ＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡへの転写が所望される配列（例えば、ＳＡＭ）の５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する。プロモーターには、Ｔ３、Ｔ７、Ｋ１１、またはＳＰ６等のバクテリオファージポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。選択される特定のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に応じて、所望の配列に加え、追加の５’ヌクレオチドを転写させることができる。例えば、標準Ｔ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧにより参照され得、ここで、所望の配列Ｎの生成のためにＤＮＡテンプレートＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＮを使用するＩＶＴ反応により、ｍＲＮＡ配列ＧＧ－Ｎがもたらされる。理論に拘束されることは望まないが、一般に、Ｔ７ポリメラーゼは、グアノシンで始まるＲＮＡ転写産物をより効率的に転写する。追加の５’ヌクレオチドが所望されない場合（例えば、追加のＧＧがない場合）、ＤＮＡテンプレートに含有されているＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、所望の配列（例えば、ＳＡＭベクターが由来する自己複製ウイルスの天然５’配列を有するＳＡＭ）の５’ヌクレオチドのみを含有する転写産物をもたらす配列であり得る。例えば、最小Ｔ７プロモーターは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡにより参照され得、ここで、所望の配列Ｎの生成のためにＤＮＡテンプレートＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＮを使用するＩＶＴ反応により、ｍＲＮＡ配列Ｎがもたらされる。同様に、配列ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡにより参照される最小ＳＰ６プロモーターを、追加の５’ヌクレオチドを含まない転写産物を生成するために使用することができる。典型的ＩＶＴ反応では、ＤＮＡテンプレートは、適切なＲＮＡポリメラーゼ酵素、緩衝剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）と共にインキュベートされる。

【0297】

得られたＲＮＡポリヌクレオチドを任意選択でさらに修飾することができ、これには、７－メチルグアノシンまたは関連構造等の５’キャップ構造の付加、及び任意選択で、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部が含まれるよう３’末端を修飾することが含まれるが、これに限定されない。修飾ＩＶＴ反応では、ＲＮＡは、ＩＶＴ中のキャップ類似体付加を介して共転写により５’キャップ構造でキャップ化される。キャップ類似体には、ジヌクレオチド（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）キャップ類似体またはトリヌクレオチド（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）キャップ類似体が含まれ得、ここで、Ｎは、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを表す（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジン等の、これらに限定されないリボヌクレオシド）。例示的キャップ類似体及びＩＶＴ反応におけるそれらの使用は米国特許第１０，５１９，１８９号にも詳述されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。考察されているように、Ｔ７ポリメラーゼは、グアノシンで始まるＲＮＡ転写産物をより効率的に転写する。グアノシンで始まっていないテンプレートでの転写効率を改善するために、トリヌクレオチドキャップ類似体（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ－Ｎ）を使用することができる。トリヌクレオチドキャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップ類似体（ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｎ）を使用するＩＶＴ反応と比べて転写効率を、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれ以上高めることができる。

【0298】

５’キャップ構造はまた、ｍＲＮＡ ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びＳ－アデノシルメチオニンを含有するワクシニアキャッピング系（例えば、ＮＥＢカタログ番号Ｍ２０８０）等を使用して、転写後に付加することが可能である。

【0299】

得られたＲＮＡポリヌクレオチドを、任意選択で、記載されているキャッピング技術とは別に、またはそれに加えてさらに修飾することができ、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部が含まれるよう３’末端を修飾することが含まれるが、これに限定されない。

【0300】

その後、ＲＮＡは、当該技術分野で周知の技術、例えば、フェノール－クロロホルム抽出またはカラム精製（例えば、クロマトグラフィーを用いる精製）を使用して精製可能である。

【0301】

Ｖ．Ｃ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面は、ベクターそれ自体に対する免疫である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、ある特定のヒトアデノウイルス系の場合のように、ベクターそれ自体に対する免疫をすでに有している形の場合もあれば、ワクチン投与の後でベクターに対する免疫が発生している形の場合もある。後者は、プライミング用量とブースト用量が分かれている場合のように、同じワクチンの複数投与が実施される場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクター系が使用される場合に、重要な考慮事項である。

【0302】

アルファウイルスベクターの場合、標準的送達方法は、カプシドタンパク質、Ｅ１タンパク質、及びＥ２タンパク質をトランスで提供して感染性ウイルス粒子を生成する、すでに考察されているヘルパーウイルス系である。ただし、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質は多くの場合、中和抗体の主な標的であることに留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、感染性粒子が中和抗体により標的とされる場合には、標的細胞に目的抗原を送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性が低減され得る。

【0303】

ウイルス粒子媒介性の遺伝子送達の代替は、発現ベクターを送達するためのナノ材料の使用である（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。ナノ材料ビヒクルは重要なことには、非免疫原性物質で作製可能であり、一般に、送達ベクターそれ自体に対する免疫が刺激されることを回避できる。これらの材料には、脂質、無機ナノ材料、及び他の高分子材料が含まれ得るが、これらに限定されない。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であり得る。材料は、合成でも天然由来でもあり得、場合によっては生物分解性であり得る。脂質には、脂肪、コレステロール、リン脂質、脂質複合体が含まれ得、それらとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）、ワックス、油、グリセリド、及び脂溶性ビタミンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0304】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、両親媒性という脂質の性質が膜及び小胞様構造の形成を可能にするため、魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般に、これらの小胞は、標的細胞の膜内への吸収及びサイトゾル内への核酸の放出により発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは、特定の細胞型の標的化が促進されるよう、さらに修飾または機能化され得る。ＬＮＰ設計での別の考慮事項は、標的化効率と細胞毒性の間のバランスである。脂質組成物には一般に、カチオン、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の定義された混合物が含まれる。場合によっては、ＬＮＰの凝集を防ぐため、脂質の酸化を防ぐため、または追加の部分の結合を促進する官能性化学基を提供するために、特定の脂質を含める。脂質の組成は、ＬＮＰ全体のサイズ及び安定性に影響を与え得る。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質組成物は、ＰＥＧもしくはＰＥＧ結合脂質、ステロール、または中性脂質等の１つ以上の他の脂質が含まれるよう製剤化可能である。

【0305】

血清に直接曝露される発現ベクター等の核酸ベクターでは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解または遊離核酸によるオフターゲットの免疫系刺激を含め、いくつかの望ましくない結果が生じる可能性がある。したがって、分解を回避すると同時に、潜在的オフターゲット作用も回避するために、アルファウイルスベクターの封入を使用することができる。ある特定の例では、アルファウイルスベクターは、送達ビヒクル内、例えば、ＬＮＰの水性内部内に、完全に封入されている。アルファウイルスベクターのＬＮＰ内封入は、マイクロ流体混合及びマイクロ流体液滴生成デバイスでの液滴生成等の当業者に周知の技術によって実施可能である。そのようなデバイスには、標準的Ｔ字型デバイスまたはフローフォーカス型デバイスが含まれるが、これらに限定されない。一例では、ＭＣ３またはＭＣ３様を含有する組成物等の所望の脂質製剤が、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成デバイスに提供され、送達ベクター及び所望の物質が、ＭＣ３またはＭＣ３様を用いるＬＮＰの内部内に完全に封入される。一例では、液滴生成デバイスは、生産されるＬＮＰのサイズ範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径が１～１０００ナノメートル、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ナノメートルの範囲のサイズを有し得る。液滴生成後、発現ベクターを内包する送達ビヒクルをさらに処理または修飾して、それらを投与用に調製することができる。

【0306】

Ｖ．Ｄ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｄ．１．チンパンジーアデノウイルスでのウイルス送達
１つ以上の抗原の（例えば、抗原カセットを介した）送達のためのワクチン組成物は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、様々な新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を提供することにより作製が可能である。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号１を参照のこと）を、抗原送達のためのワクチン組成物に使用することができる。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターは、ＵＳＰＮ６，０８３，７１６に詳述されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣｈＡｄＶ６８を用いるベクター及び送達システムは、米国出願公開第ＵＳ２０２００１９７５００Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０２０２４３７１９Ａ１号に詳述されており、その各々は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0307】

さらなる態様では、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む組換えアデノウイルス、及びその発現を導く制御配列に機能的に連結されている抗原カセットが本明細書で提供される。組換えウイルスは、哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞に感染する能力があり、細胞で抗原カセット産物を発現させる能力がある。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。これらの遺伝子欠失部位のいずれにも抗原カセットを挿入することができる。抗原カセットには、抗原刺激された免疫応答が所望される対象となる抗原が含まれ得る。

【0308】

別の態様では、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスに感染した哺乳類細胞が本明細書で提供される。

【0309】

さらに別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｃ６８由来）またはその機能的断片を発現する新規哺乳類細胞株が提供される。

【0310】

さらに別の態様では、哺乳類細胞に抗原カセットを送達するための方法が本明細書で提供され、細胞に、抗原カセットを発現するよう操作されているＣ６８等のチンパンジーアデノウイルスを有効量にて導入するステップを含む。

【0311】

さらに別の態様では、がんを治療するために、哺乳類宿主での免疫応答を刺激するための方法が提供される。この方法は、免疫応答が標的とする対象である腫瘍からの１つ以上の抗原をコードする抗原カセットを含むＣ６８等の組換えチンパンジーアデノウイルスを、有効量にて宿主に投与するステップを含むことができる。

【0312】

さらに別の態様では、感染症等の対象での疾患を治療または予防するために、哺乳類宿主での免疫応答を刺激するための方法が提供される。この方法は、免疫応答が標的とする対象である感染症等からの１つ以上の抗原をコードする抗原カセットを含むＣ６８等の組換えチンパンジーアデノウイルスを、有効量にて宿主に投与するステップを含むことができる。

【0313】

また、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳類細胞も開示する。遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群より選択され得る。

【0314】

また、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示する。遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群より選択され得る。いくつかの態様では、核酸分子は配列番号１を含む。いくつかの態様では、核酸分子は配列番号１の配列を含み、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている。

【0315】

また、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列を含むベクター、及び抗原カセットであって、異種宿主細胞でのかかるカセットの発現を導く１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、抗原カセット、も開示し、任意選択で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なシスエレメントを少なくとも含み、シスエレメントは、抗原カセット及び制御配列に隣接している。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列からなる群より選択される遺伝子を含む。いくつかの態様では、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠くことができる。

【0316】

本明細書ではまた、部分的に欠失したＥ４遺伝子を含むアデノウイルスベクターであって、欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ２領域、及び欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ３領域、ならびに任意選択で、欠失または部分的欠失Ｅ４ｏｒｆ４領域、を含むアデノウイルスベクターも開示する。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２の少なくとも部分欠失、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５の少なくとも部分欠失、及び配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２の少なくとも部分欠失、のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２のＥ４欠失を含むことができ、ここで、ベクターは、配列番号１に記載の配列の少なくともヌクレオチド２～３６，５１８を含む。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ３、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失、Ｅ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失、及びＥ４Ｏｒｆ４の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の少なくとも部分欠失、完全欠失Ｅ４Ｏｒｆ２、及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の少なくとも部分欠失及びＥ４Ｏｒｆ３の少なくとも部分欠失である、Ｅ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位からＥ４Ｏｒｆ５の開始部位までのＥ４欠失を含むことができる。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ１の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ２の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ３の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。部分的に欠失したＥ４は、Ｅ４Ｏｒｆ４の開始部位に隣接するＥ４欠失であり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１１００ヌクレオチド、少なくとも１２００ヌクレオチド、少なくとも１３００ヌクレオチド、少なくとも１４００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１６００ヌクレオチド、少なくとも１７００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも１９００ヌクレオチド、または少なくとも２０００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも７００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも１５００ヌクレオチドであり得る。Ｅ４欠失は、５０ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、９００ヌクレオチド以下、１０００ヌクレオチド以下、１１００ヌクレオチド以下、１２００ヌクレオチド以下、１３００ヌクレオチド以下、１４００ヌクレオチド以下、１５００ヌクレオチド以下、１６００ヌクレオチド以下、１７００ヌクレオチド以下、１８００ヌクレオチド以下、１９００ヌクレオチド以下、または２０００ヌクレオチド以下であり得る。Ｅ４欠失は、７５０ヌクレオチド以下であり得る。Ｅ４欠失は、少なくとも１５５０ヌクレオチド以下であり得る。

【0317】

部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠く、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３４，９４２、ヌクレオチド３４，９５２～３５，３０５、及び配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，３０２～３５，６４２を欠くＥ４遺伝子配列を欠く、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９８０～３６，５１６を欠く、Ｅ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示され、かつ配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９７９～３５，６４２を欠く、Ｅ４遺伝子配列であり得る。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、カセットを有することができ、ここで、カセットは、少なくとも１つのペイロード核酸配列を含み、かつ、カセットは、少なくとも１つのペイロード核酸配列に機能的に連結されている少なくとも１つのプロモーター配列を含む。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示されるＣｈＡｄＶ６８配列の１つ以上の遺伝子または制御配列を有することができ、任意選択で、１つ以上の遺伝子または制御配列は、配列番号１に示される配列のチンパンジーアデノウイルス末端逆位反復（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、任意選択で、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、及び／またはＥ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有することができ、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠く。部分的に欠失したＥ４遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６を有することができ、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠き、また配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有し、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。

【0318】

部分的に欠失したＥ４遺伝子は、配列番号１に示される配列の少なくともヌクレオチド３４，９１６～３５，６４２を欠き、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２～３４，９１６である、配列番号１に示されるＥ４遺伝子配列であり得、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド２～３４，９１６の３’であり、ヌクレオチド２～３４，９１６はさらに、Ｅ１欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド５７７～３４０３を欠き、かつ、Ｅ３欠失に対応する、配列番号１に示される配列のヌクレオチド２７，１２５～３１，８２５を欠き、また配列番号１に示される配列のヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８を有し、ここで、部分的に欠失したＥ４遺伝子は、ヌクレオチド３５，６４３～３６，５１８の５’である。

【0319】

本明細書ではまた、抗原カセットを発現するよう操作されたＣ６８ベクター等の本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトされた宿主細胞も開示する。本明細書ではまた、ヒト細胞への本明細書に開示されるベクターの導入を介して導入された選択遺伝子を発現するヒト細胞も開示する。

【0320】

本明細書ではまた、抗原カセットを哺乳類細胞に送達するための方法も開示し、抗原カセットを発現するよう操作されたＣ６８ベクター等の本明細書に開示されるベクターを有効量にて前記細胞に導入することを含む。

【0321】

本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターを哺乳類細胞内に導入すること、細胞を好適な条件下で培養すること、及び抗原を生成することを含む、抗原を生成するための方法も開示する。

【0322】

Ｖ．Ｄ．２．Ｅ１発現補完細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかが欠失した組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するために、欠失遺伝子領域の機能は、ウイルスの複製及び感染性に必須であれば、ヘルパーウイルスまたは細胞株によって、すなわち、補完細胞株またはパッケージング細胞株によって組換えウイルスに供給が可能である。例えば、複製欠損型チンパンジーアデノウイルスベクターを作製ために、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株には、ＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれ得る。チンパンジーＥ１遺伝子産物を発現する細胞株の作製のためのプロトコル（ＵＳＰＮ６，０８３，７１６の実施例３及び４）に従って、任意の選択チンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。

【0323】

チンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定するには、ＡＡＶ増強アッセイを使用することができる。このアッセイは、特徴付けられていない他の（例えば、他の種からの）アデノウイルスのＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株でのＥ１機能を確認するために有用である。そのアッセイは、ＵＳＰＮ６，０８３，７１６の実施例４Ｂに記載されている。

【0324】

選択チンパンジーアデノウイルス遺伝子、例えば、Ｅ１は、選択された親細胞株での発現のためのプロモーターの転写調節下にあり得る。この目的のために、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターの中には、亜鉛による誘導性のヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、またはグルココルチコイド、特に、デキサメタゾンによる誘導性のマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されているプロモーター等の他の誘導性プロモーターも、パッケージング細胞株の生産に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現制御に構成的プロモーターを用いることもできる。

【0325】

親細胞は、任意の所望Ｃ６８遺伝子を発現する新規細胞株の作製のために選択され得る。制限することなく、そのような親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］及びＷＩ－３８［ＣＣＬ７５］細胞であり得る。他の好適な親細胞株は、他の供給源から入手可能である。親細胞株には、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａが含まれ得る。

【0326】

Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製に有用であり得る。本質的に同じ手順を使用して構築される、１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルスの遺伝子産物を発現する細胞株は、それらの産物をコードする遺伝子が欠失した組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄ Ｅ１遺伝子産物を発現する細胞株もまた、チンパンジー組換えＡｄの作製に有用である。

【0327】

Ｖ．Ｄ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、細胞に少なくとも１つの抗原を送達するウイルスベクターを含むことができる。そのようなベクターは、Ｃ６８等のチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列、及び抗原カセットであって、そのカセットの発現を導く制御配列に機能的に連結されている抗原カセット、を含む。Ｃ６８ベクターは、感染哺乳類細胞でカセットを発現させる能力がある。Ｃ６８ベクターは、１つ以上のウイルス遺伝子が機能的に欠失していてよい。抗原カセットは、プロモーター等の１つ以上の制御配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択のヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株は、欠失したアデノウイルス遺伝子の任意の必要産物をチンパンジーウイルスベクターに供給することができる。

【0328】

「機能的に欠失した」という用語は、十分な量の遺伝子領域が除去されるか、そうでなければ、例えば、変異または修飾によって改変されており、その遺伝子領域がもはや遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を生成できなくなっていることを意味する。機能欠失をもたらし得る変異または修飾には、未成熟終止コドンの導入ならびに標準及び非標準の開始コドンの除去等のナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングもしくは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。所望される場合、遺伝子領域全体を除去することができる。

【0329】

本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の修飾、例えば、配列の欠失、挿入、及び他の変異は、標準的分子生物学的技術を使用して生成され得、それらは本発明の範囲内である。

【0330】

Ｖ．Ｄ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明に有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子が機能的に欠失しており、任意選択で、他の変異、例えば、温度感受性変異または他の遺伝子の欠失を持つチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列はまた、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成する上でも有用であることが予測される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている（例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照のこと）。

【0331】

ヒト（または他の哺乳類の）細胞への抗原カセットの送達に有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築では、一連のアデノウイルス核酸配列をベクターで用いることができる。最小チンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスと併用して感染性組換えウイルス粒子を生成することができる。ヘルパーウイルスは、ウイルスの感染性及び最小チンパンジーアデノウイルスベクターの増殖に必要とされる必須遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択欠失のみが、他の点では機能的なウイルスベクターで行われる場合、欠失させた遺伝子産物は、欠失した遺伝子機能をトランスで提供する選択パッケージング細胞株でウイルスを増殖させることにより、ウイルスベクター生成工程において供給可能である。

【0332】

Ｖ．Ｄ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスは、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスシスエレメントのみを含有するウイルス粒子である。すなわち、ベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列（複製起点として機能）ならびに天然５’パッケージング／エンハンサードメイン（線状Ａｄゲノムのパッケージング及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントに必要な配列を含有）を含有する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ９６／１３５９７号中の「最小」ヒトＡｄベクターの調製について記載されている技術を参照のこと。

【0333】

Ｖ．Ｄ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製欠損アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列よりも多く含有することもできる。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の様々な部分の欠失、ならびにヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の任意選択の使用により形成される感染性ウイルス粒子を特徴とし得る。

【0334】

一例として、好適なベクターは、Ｃ６８アデノウイルス最初期遺伝子Ｅ１ａ及び遅初期（ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ）遺伝子Ｅ１ｂの全部または十分な部分を、それらの正常な生物学的機能が排除されるよう、欠失させることによって形成され得る。複製欠損型Ｅ１欠失ウイルスは、機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含有する、対応遺伝子産物をトランスで提供する、チンパンジーアデノウイルスに形質転換された補完細胞株で増殖させた場合、感染性ウイルスを複製及び生成する能力がある。既知のアデノウイルス配列との相同性に基づき、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスについても言えるように、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは多くの細胞型に感染する能力があり、抗原（複数可）を発現することはできるが、細胞が非常に高い感染多重度で感染しない限り、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを持たない大半の細胞においては複製することはできないことが予測される。

【0335】

別の例として、Ｃ６８アデノウイルス遅初期遺伝子Ｅ３の全部または一部は、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から排除され得る。

【0336】

チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターはまた、Ｅ４遺伝子の欠失を有して構築可能である。さらに別のベクターは、遅初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を含有することができる。

【0337】

欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１～Ｌ５のいずれかにおいても行うことができる。同様に、中期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２での欠失も一部の目的に有用であり得る。他の欠失は、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子で行われ得る。

【0338】

上記で考察した欠失は個々に使用することができる、すなわち、アデノウイルス配列は、Ｅ１欠失のみを含有することができる。別法として、生物学的活性の破壊または低下に有効な遺伝子全体またはそれらの部分の欠失を任意の組み合わせで使用することができる。例えば、１つの例示的ベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ３欠失の有無を問わず、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子の欠失、またはＥ１、Ｅ２ａ及びＥ３遺伝子の欠失、またはＥ１及びＥ３遺伝子の欠失、またはＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４遺伝子の欠失等を有することができる。上述のように、そのような欠失を温度感受性変異等の他の変異と組み合わせて使用して、所望の結果を達成することができる。

【0339】

抗原（複数可）を含むカセットは、任意選択で、チンパンジーＣ６８ Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入され得る。別法として、所望される場合、既存の遺伝子領域にカセットを挿入して、その領域の機能を破壊することができる。

【0340】

Ｖ．Ｄ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを運ぶために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルス断片を使用して、カセットを含有する感染性組換えウイルス粒子を生成するのに十分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を提供することができる。

【0341】

有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株によって発現されない、選択アデノウイルス遺伝子配列、を含有する。ヘルパーウイルスは、複製欠損であり得、上記配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含有し得る。ヘルパーウイルスを、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて使用することができる。

【0342】

Ｃ６８の場合、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端とＳｓｐＩをクリッピングすることにより形成される断片であり得、この場合、ウイルスの左端から約１３００ｂｐが除去される。次いで、このクリッピングされたウイルスは、プラスミドＤＮＡと共にＥ１発現細胞株にコトランスフェクトされ、それにより、プラスミドでのＣ６８配列との相同組換えによって組換えウイルスが形成される。

【0343】

ヘルパーウイルスはまた、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５－１６９８７（１９８９）、Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されているようにポリカチオン複合体に形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意選択で、レポーター遺伝子を含有することができる。多数のそのようなレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なる、ヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在により、Ａｄベクターとヘルパーウイルスの両方を独立してモニターすることが可能になる。この第２のレポーターは、得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を精製時に可能にするために使用される。

【0344】

Ｖ．Ｄ．８．ウイルス粒子のアセンブリ及び細胞株の感染
アデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列、抗原カセット、及び他のベクター要素の、様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、及び組換えウイルス粒子を生成するためのプラスミド及びベクターの使用はいずれも、従来技術を使用して達成することができる。そのような技術には、従来のｃＤＮＡクローニング技術、インビトロ組換え技術（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列をもたらす任意の好適な方法が含まれる。標準的トランスフェクション及びコトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミン等のリポソーム媒介性トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来方法には、ウイルスゲノムの相同組換え、寒天重層でのウイルスプラーク形成、シグナル発生を測定する方法等が含まれる。

【0345】

例えば、所望抗原カセットを含有するウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ヘルパーウイルス存在下、インビトロでベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列の間で相同組換えが起こり、これにより、ベクター中のアデノウイルス抗原の配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされることができ、組換えウイルスベクター粒子がもたらされる。

【0346】

得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、選択された細胞への抗原カセットの導入に有用である。パッケージング細胞株で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ試験では、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスは、非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞にカセットを導入する際の有用性を示している。

【0347】

Ｖ．Ｄ．９．組換えウイルスベクターの使用
このように、抗原カセットを含有する、得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記のようにアデノウイルスベクターとヘルパーウイルスまたはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株の協働により生成）により、対象にインビボまたはエキソビボで抗原（複数可）を送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルが提供される。

【0348】

上記の組換えベクターは、公開されている遺伝子治療法に従ってヒトに投与される。抗原カセットを担持するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは、生物学的に適合する溶液または薬学的に許容される送達ビヒクルに懸濁させて、患者に投与され得る。好適なビヒクルには、滅菌生理食塩水が含まれる。薬学的に許容される担体であることが既知であり、かつ当業者に周知の他の水性及び非水性の等張無菌注射液ならびに水性及び非水性の無菌懸濁液は、この目的のために用いられ得る。

【0349】

チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞に形質導入するのに十分な量であり、かつ、過度の有害作用を伴わないか、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療上の利益を提供するのに十分なレベルの抗原導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与され、これは、医療分野の当業者により決定され得る。従来の薬学的に許容される投与経路には、肝臓への直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口及び他の非経口による投与経路が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わせてよい。

【0350】

ウイルスベクターの投与量は、主に、治療される病態、患者の年齢、体重及び健康等の要因に応じて異なるため、患者によって異なり得る。投与量は、任意の副作用に対する治療上の利益のバランスが取れるよう調整され、そのような投与量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なり得る。抗原（複数可）の発現レベルをモニターして、投与量の投与頻度を決定することができる。

【0351】

組換え複製欠損アデノウイルスは、「薬学的に有効な量」、すなわち、所望の細胞にトランスフェクトするため、及びワクチン効果、すなわち、ある程度の測定可能なレベルの防御免疫を得るのに十分なレベルの選択遺伝子の発現を提供するための投与経路において有効な組換えアデノウイルスの量にて投与され得る。抗原カセットを含むＣ６８ベクターは、アジュバントと共に同時投与され得る。アジュバントは、特に、アジュバントがタンパク質である場合、ベクターとは別個（例えば、ミョウバン）であってもベクター内でコードされてもよい。アジュバントは、当該技術分野において周知である。

【0352】

従来の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口及び他の非経口による投与経路が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わされる場合もあれば、免疫原または疾患に応じて調整される場合もある。例えば、狂犬病予防では、皮下、気管内及び鼻腔内の経路が好ましい。投与経路は主に、治療される疾患の性質に応じて異なる。

【0353】

抗原（複数可）に対する免疫レベルをモニターして、ブースターがある場合はその必要性を決定することができる。例えば、血清中の抗体価の評価の後、任意選択のブースター免疫が望ましい場合がある。

【0354】

ＶＩ．治療方法及び製造方法
対象での腫瘍特異的な免疫応答を刺激すること、腫瘍に対するワクチン接種をすること、対象でのがんの症状を、１つ以上の抗原、例えば、本明細書に開示される方法を使用して同定される複数の抗原を対象に投与することによって治療及び／または軽減すること、を行う方法もまた提供される。

【0355】

対象での感染症生物特異的な免疫応答を刺激すること、感染症生物に対するワクチン接種をすること、対象での感染症生物と関連する感染症の症状を、１つ以上の抗原、例えば、本明細書に開示される方法を使用して同定される複数の抗原を対象に投与することによって治療及び／または軽減すること、を行う方法もまた提供される。

【0356】

いくつかの態様では、対象は、がんと診断されているかまたはがんを発症するリスクがある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマまたは腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であり得る。腫瘍は、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び組織器官の他の腫瘍等の任意の固形腫瘍、ならびにリンパ腫及び白血病等の血液腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、及びＢ細胞リンパ腫であり得る。

【0357】

いくつかの態様では、対象は、感染症と診断されているかまたは感染症のリスクがある（例えば、年齢、地理／旅行により、及び／または仕事上、感染症のリスクが高いかもしくはその素因がある、あるいは季節性及び／または新規疾患による感染症のリスクがある）。

【0358】

抗原は、ＣＴＬ応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｔ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｂ細胞応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。抗原は、Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答の両方を刺激するのに十分な量で投与され得る。

【0359】

抗原は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。治療剤には、抗ウイルス剤または抗生物質等の感染症生物を標的とするものが含まれ得る。

【0360】

さらに、チェックポイント阻害剤等の抗免疫抑制剤／免疫刺激剤を対象にさらに投与することができる。例えば、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１を対象にさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者でのがん性細胞に対する免疫応答を増強させることができる。特に、ＣＴＬＡ－４の遮断は、ワクチン接種プロトコルに従った場合、有効であることが示されている。

【0361】

ワクチン組成物中に含められる各抗原の最適量、及び最適投与レジメンを決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に調製可能である。注射の方法には、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．が含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法には、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．が含まれる。ワクチン組成物の他の投与方法は当業者に公知である。

【0362】

ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数及び／または量が、組織、がん、感染症、及び／または患者に特異的であるよう編集可能である。例えば、ペプチドの正確な選択は、所与の組織における親タンパク質の発現パターンによって導くことができ、また患者の変異または疾患の状態によっても導くことができる。選択は、特定の種類のがん、特定の感染症（例えば、対象が感染しているかまたはそれによる感染リスクがある特定の感染症の分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）／株（ｓｔｒａｉｎ））、疾患の状態、ワクチン接種の目的（例えば、予防的か、または進行中の疾患の標的化）、先行治療レジメン、患者の免疫状態、及び当然のことながら患者のＨＬＡハプロタイプ、に応じて異なり得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人のニーズに従って、個別化された成分を含有することができる。例としては、特定の患者での抗原の発現に従った抗原選択の変更、または一次治療もしくは治療スキームに続く二次治療の調整が含まれる。

【0363】

患者は、様々な診断方法、例えば、以下に詳述される患者選択方法の使用を介して抗原ワクチンの投与のために特定され得る。患者選択には、１つ以上の遺伝子における変異、または、１つ以上の遺伝子の発現パターンを特定することを伴い得る。患者選択には、進行中の感染の感染症を特定することを伴い得る。患者選択には、感染症による感染のリスクを特定することを伴い得る。場合によっては、患者選択には、患者のハプロタイプを特定することを伴う。様々な患者選択方法を並行して実施することができ、例えば、シークエンシング診断では、患者の変異及びハプロタイプの両方を特定することができる。様々な患者選択方法を順次に実施することができ、例えば、１つの診断検査で変異を特定し、別の診断検査で患者のハプロタイプを特定し、その場合、各検査は、同じ診断法（例えば、両方ともハイスループットシークエンシング）でも、異なる診断法（例えば、一方がハイスループットシークエンシング、他方がサンガー法による配列決定）でも可能である。

【0364】

がんまたは感染症のためのワクチンとして使用される組成物の場合、正常組織で高量発現される自己ペプチドと同様の正常な自己ペプチドを持つ抗原は、本明細書に記載される組成物では回避され得るかまたは低量で存在し得る。一方、患者の腫瘍または感染細胞が高量の特定の抗原を発現することが知られている場合、このがんまたは感染症を治療するための医薬組成物はそれぞれ、高量で存在することができ、及び／またはこの特定の抗原またはこの抗原の経路に特異的な複数の抗原が含まれ得る。

【0365】

抗原を含む組成物は、すでにがんまたは感染症を患っている個体に投与され得る。治療用途では、組成物は、腫瘍抗原または感染症生物抗原に対する有効なＣＴＬ応答を刺激し、症状及び／または合併症を治癒もしくは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で対象に投与される。これを達成するために適した量は、「治療的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、及び処方医師の判断に応じて異なる。組成物は一般に、重篤な病状、すなわち、生命を脅かすかもしくは生命を脅かす可能性のある状況、特に、がんが転移している、または感染症生物により臓器障害及び／または他の免疫病理が誘導されている場合に用いられ得ることに留意すべきである。そのような場合、外来性物質の最小化及び抗原の相対的無毒性を考慮し、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能であり、また担当医はそのことが望ましいと感じ得る。

【0366】

治療的使用の場合、投与は、腫瘍の検出時もしくは外科的除去時に開始するか、または検出時もしくは感染症治療時に開始することができる。これに続き、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、及びその後の期間、または免疫が提供されている（例えば、メモリーＢ細胞もしくはメモリーＴ細胞集団、または抗原特異的Ｂ細胞もしくは抗体が産生される）と見なされるまで用量をブーストすることができる。

【0367】

治療的処置のための医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経鼻、経口または局所（ｌｏｃａｌ）の投与について意図される。医薬組成物は、非経口で、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与され得る。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を刺激するために外科的切除部位に投与され得る。組成物は、対象の特定の感染した組織及び／または細胞を標的とするために投与され得る。本明細書では、非経口投与用の組成物を開示し、これは、抗原の溶液を含み、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができ、また濾過滅菌することもできる。得られた水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされるか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等のような、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有し得る。

【0368】

抗原はまた、それらをリンパ組織等の特定の細胞組織に指向させるリポソームにより投与され得る。リポソームもまた、半減期延長に有用である。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。これらの調製物では、送達される抗原は、単独で、あるいはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体等の、例えば、リンパ系細胞の間で高頻度に見られる受容体に結合する分子と組み合わせて、または他の治療用もしくは免疫原性の組成物と組み合わせて、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の抗原が充填されたリポソームをリンパ系細胞の部位へと方向付けることができ、そこで、リポソームが、選択された治療用／免疫原性の組成物を送達する。リポソームは、標準的小胞形成脂質から形成することができ、これには一般に、中性及び負の電荷を帯びたリン脂質及びコレステロール等のステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性及び血流中でのリポソーム安定性を考慮することによって導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを調製するために様々な方法が利用可能である。

【0369】

免疫細胞に指向させる場合、リポソーム内に組み込まれるリガンドには、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片が含まれ得る。リポソーム懸濁液は、特に、投与様式、送達されるペプチド、及び治療される疾患病期によって異なる用量で、静脈内、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）等に投与され得る。

【0370】

治療または免疫を目的とする場合、ペプチドをコードし、任意選択で本明細書に記載されるペプチドのうちの１つ以上をコードする核酸もまた患者に投与され得る。患者に核酸を送達するために多数の方法が好都合に使用される。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。この手法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載のような弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。ＤＮＡのみで構成されている粒子が投与され得る。別法として、ＤＮＡを金粒子等の粒子に付着させることができる。核酸配列を送達するための手法には、電気穿孔を用いるかまたは用いない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターが含まれ得る。

【0371】

核酸はまた、カチオン性脂質等のカチオン性化合物と複合体にして送達され得る。脂質媒介性遺伝子送達方法は、例えば、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ９６／１８３７２、９３２４６４０ＷＯＡＷＯ９３／２４６４０、Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、米国特許第５，２７９，８３３号（Ｒｏｓｅ）、米国特許第５，２７９，８３３号、９１０６３０９ＷＯＡＷＯ９１／０６３０９、及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されている。

【0372】

抗原はまた、ウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォーム、例えば、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、または第２世代、第３世代もしくは第２／第３世代ハイブリッドのレンチウイルス及び特定の細胞型もしくは受容体を標的にするよう設計された任意の世代の組換えレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されないレンチウイルス等に含めることもできる（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）。上記のウイルスベクターに基づくワクチンプラットフォームのパッケージング容量に応じて、この手法では、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列に隣接する場合もあれば、リンカーによって区切られている場合も、細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列が先行する場合もある（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照のこと）。宿主への導入時、感染細胞は抗原を発現し、それによりペプチド（複数可）に対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答が刺激される。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫に有用な多種多様な他のワクチンベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター等は本明細書での説明から当業者に明らかであろう。

【0373】

核酸を投与する手段は、１つまたは複数のエピトープをコードするミニ遺伝子コンストラクトを使用する。ヒト細胞での発現のための選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使用表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導き出す。これらのエピトープコードＤＮＡ配列に直接隣接する、連続ポリペプチド配列を作成する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子設計に組み込むことができる。逆翻訳され、ミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保留シグナルが挙げられる。さらに、合成（例えば、ポリアラニン）または天然に存在するフランキング配列をＣＴＬエピトープに隣接して含めるこれにより、ＭＨＣのＣＴＬエピトープ提示を改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによりＤＮＡに変換される。重複オリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）は、周知の技術を使用して適切な条件下で合成、リン酸化、精製及びアニールされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結される。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子はその後、所望の発現ベクターにクローニング可能である。

【0374】

精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を使用して注射用に調製され得る。これらのうち最も簡便なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が報告されており、また新たな技術が利用可能になり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂質を用いて好都合に製剤化される。さらに、保護的相互作用性非凝縮性（ＰＩＮＣ）と総称される糖脂質、膜融合性リポソーム、ペプチド及び化合物はまた、安定性、筋肉内分散、または特定の器官もしくは細胞型への輸送等の可変要素に影響を与えるために、精製プラスミドＤＮＡと複合体を形成させることが可能である。

【0375】

また、本明細書に開示される方法のステップを実施すること、及び複数の抗原または複数の抗原のサブセットを含むワクチンを生成すること、を含むワクチンを製造する方法も開示する。

【0376】

本明細書に開示される抗原は、当該技術分野で公知の方法を使用して製造され得る。例えば、本明細書に開示される抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生成する方法には、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、かかる抗原またはベクターの発現に好適な条件下で培養すること、及び抗原またはベクター精製することが含まれ得る。標準的精製方法には、クロマトグラフィー法、電気泳動法、免疫学的技術、沈殿、透析、濾過、濃縮、及びクロマトフォーカシング技術が含まれる。

【0377】

宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞が含まれ得る。宿主細胞は、本明細書に開示される抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換が可能であり、ここで、任意選択で、単離されたポリヌクレオチドはさらに、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡであり得る。

【0378】

ＶＩＩ．抗原の使用及び投与
他に使用可能な、ワクチン接種の方法、プロトコル、及びスケジュールには、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０２１０９２０９５号に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。

【0379】

プライム／ブースト戦略における各ベクターには、典型的には、抗原が含まれるカセットが含まれる。カセットには、約１～５０の抗原が含まれ得、通常は各抗原を囲む天然配列等のリンカー、またはＡＡＹ等の他の非天然リンカー配列によって区切られている。カセットにはまた、ユニバーサルなクラスＩＩ抗原と見なすことができる破傷風トキソイド抗原及びＰＡＤＲＥ抗原のようなＭＨＣＩＩ抗原も含まれ得る。カセットにはまた、ユビキチン指向配列等の標的指向配列も含まれ得る。さらに、各ワクチン用量は、免疫調節因子と併せて（例えば、同時、前、または後）対象に投与され得る。各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）と併せて（例えば、同時、前、または後）対象に投与され得る。ＣＰＩには、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するもの、例えば、抗体またはそれらの抗原結合部分が含まれ得る。そのような抗体には、トレメリムマブまたはデュルバルマブが含まれ得る。各ワクチン用量は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（ＩＬ－１２のｐ３５、ｐ４０、ｐ７０、及び／またはｐ７０融合コンストラクトを含む）、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１等のサイトカインと併せて（例えば、同時、前、または後）対象に投与され得る。各ワクチン用量は、修飾サイトカイン（例えば、ｐｅｇＩＬ－２）と併せて（例えば、同時、前、または後）対象に投与され得る。

【0380】

対象に１つ以上の抗原を投与するには、ワクチン接種プロトコルを使用することができる。対象への投与にはプライミングワクチン及びブースティングワクチンを使用することができる。プライミングワクチンには、本明細書に記載される抗原コードベクター、例えば、ＣｈＡｄＶ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）に基づくベクターのいずれかが用いられ得る。ブースト用量には、本明細書に記載される抗原コードベクター、例えば、ＣｈＡｄＶ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはＳＡＭ系ベクター（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づくベクターのいずれかが用いられ得る。１つ以上のブースト用量を投与することができ、同じブースティングワクチンの連続投与（例えば、同じＣｈＡｄＶ６８系ベクターの連続投与もしくは同じＳＡＭ系ベクターの連続投与）、または異なるブースティングワクチンの連続投与（例えば、ＳＡＭ系ベクターの投与、それに続くＣｈＡｄＶ６８系ベクターの投与）が可能である。異なるワクチンの連続投与には、異なるワクチンの任意の組み合わせが含まれ得る。例えば、ワクチン戦略では、ＣｈＡｄＶ６８系のプライム、それに続く１回以上のＳＡＭ系ブースト、及びＳＡＭ系ブーストに続くＣｈＡｄＶ６８系ブーストを使用することができる。例示的な非限定的なワクチン戦略には、ＣｈＡｄＶプライム－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＣｈＡｄＶブースト、またはＣｈＡｄＶプライム－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＳＡＭブースト－ＣｈＡｄＶブーストが含まれるが、これらに限定されない。

【0381】

ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１ｘ１０^１１ウイルス粒子～１ｘ１０^１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１ｘ１０^１１ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、５ｘ１０^１１ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、１ｘ１０^１２ウイルス粒子の用量で投与され得る。ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンについて選択された投与量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、ならびに処方医師の判断に応じて異なる。

【0382】

ＳＡＭベースのワクチンは、１０～３００μｇのＲＮＡの範囲の用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、１００～３００μｇのＲＮＡの範囲の用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、１００μｇのＲＮＡの用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンは、３００μｇのＲＮＡの用量で投与され得る。ＳＡＭベースのワクチンについて選択された投与量は、例えば、組成物、投与様式、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、ならびに処方医師の判断に応じて異なる。

【0383】

プライミングワクチンは、対象に（例えば、筋肉内に）注射され得る。用量ごとの両側注射を使用することができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）１回以上の注射を使用することができる（例えば、総投与量が１ｘ１０^１２ウイルス粒子）；０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、特に０．１ｕｇもしくは１ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる；または１～１００ｕｇＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、特に１０、１００、もしくは３００ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる。

【0384】

ワクチンブースト（ブースティングワクチン）は、プライムワクチン接種後に（例えば、筋肉内に）注射され得る。用量ごとの両側注射を使用することができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）１回以上の注射を使用することができる（例えば、総投与量が１ｘ１０^１２ウイルス粒子）；０．００１～１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、特に０．１ｕｇもしくは１ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる、または１～１００ｕｇＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、特に１０、１００もしくは３００ｕｇでのＳＡＭベクターの１回以上の注射を使用することができる。

【0385】

ブースティングワクチンは、プライムの後、約１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと及び／または８週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、４週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、６週間ごとに投与され得る。ブースティングワクチンは、プライムの後、１２週間ごとに投与され得る。ブースト用量は、ワクチン接種プロトコルの期間中、異なる間隔で投与され得る。例えば、例示的な非限定的例には、プライム－４ｗ－ブースト－１２ｗ－ブースト－１２ｗ－ブースト、またはプライム－４ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブースト－６ｗ－ブーストが含まれる（「ｗ」は週を表す）。

【0386】

ワクチン投与のうちの１回以上には、１つ以上のチェックポイント阻害剤の同時投与が含まれ得る。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１遮断薬）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。例示的な非限定的例では、ニボルマブ、ヤーボイ／イピリムマブ、またはそれらの組み合わせ。

【0387】

抗ＣＴＬＡ－４（例えば、トレメリムマブ）もまた、対象に投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ４は、同じリンパ節への流入が確実に行われるよう、筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはＳＡＭ低用量）部位の近くに皮下投与され得る。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ－４の選択的ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂ阻害剤である。抗ＣＴＬＡ－４（トレメリムマブ）目的皮下用量は、典型的には、７０～７５ｍｇ（特に７５ｍｇ）であり、用量範囲は、例えば、１～１００ｍｇまたは５～４２０ｍｇである。

【0388】

ある特定の場合には、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ－１及びＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断する選択的高親和性ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般に、４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与される。

【0389】

ワクチンの投与前、投与中、及び／または投与後に免疫モニタリングが実施され得る。そのようなモニタリングから、パラメータの中でも特に安全性及び有効性の情報を得ることができる。

【0390】

免疫モニタリングの実施には、ＰＢＭＣが一般に使用される。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種前、及びプライムワクチン接種後（例えば、４週間及び８週間後）に分離され得る。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前及び各ブーストワクチン接種後（例えば、４週間及び８週間後）に採取され得る。

【0391】

Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答等の免疫応答は、免疫モニタリングプロトコルの一部として評価され得る。例えば、本明細書に記載されるワクチン組成物が免疫応答を刺激する能力を、モニター及び／または評価することができる。本明細書で使用される場合、「免疫応答を刺激する」とは、免疫応答の任意の増大、例えば、免疫応答の開始（例えば、プライミングワクチンが、無感作の対象での免疫応答の開始を刺激すること）、または免疫応答の任意の増強作用（例えば、ブースティングワクチンが、プライミングワクチンにより開始された既存の免疫応答等の、抗原に対する既存の免疫応答を有する対象での免疫応答の増強作用を刺激すること）を指す。Ｔ細胞応答は、当該技術分野で公知の１つ以上の方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイにより測定され得る。ワクチンでコードされるエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ＩＦＮ－ガンマ等のサイトカインの誘導を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを使用して、細胞内または細胞外で捕捉されるＩＦＮ－ガンマ等のサイトカインの誘導を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を使用して、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に特異的なＴ細胞受容体を発現しているＴ細胞集団を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに対する特定のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞応答は、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン及びカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）取り込み後のＴ細胞集団のエキソビボ増殖を測定することによってＰＢＭＣからモニターされ得る。ワクチンでコードされるエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム遊離アッセイまたは代替的比色細胞毒性アッセイによって機能的に評価され得る。

【0392】

Ｂ細胞応答は、当該技術分野で公知の１つ以上の方法、例えば、Ｂ細胞分化（例えば、形質細胞への分化）、Ｂ細胞もしくは血漿細胞の増殖、Ｂ細胞もしくは形質細胞の活性化（例えば、ＣＤ８０もしくはＣＤ８６等の共刺激マーカーの上方制御）、抗体クラススイッチ、及び／または抗体産生（例えば、ＥＬＩＳＡ）を決定するために使用されるアッセイを使用して測定され得る。

【0393】

対象の疾患の状態は、本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれかの投与後にモニター可能である。例えば、疾患の状態は、対象からの単離されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用してモニターされ得る。さらに、ワクチン療法の有効性は、対象からの単離されたｃｆＤＮＡを使用してモニターされ得る。ｃｆＤＮＡのモニタリングには、ａ．対象からｃｆＤＮＡを単離するか、または単離しておくステップ、ｂ．単離されたｃｆＤＮＡをシークエンシングするか、またはシークエンシングしておくステップ、ｃ．対象の野生型生殖細胞系列核酸配列と比べて、ｃｆＤＮＡでの１つ以上の変異の頻度を決定するか、または決定しておくステップ、及びｄ．対象の疾患の状態を、ステップ（ｃ）から評価するか、または、評価しておくステップ、が含まれ得る。方法にはまた、上記ステップ（ｃ）に続いて、ｄ．所与の対象についてステップ（ａ）～（ｃ）の反復を複数回実施し、複数回の反復で決定された１つ以上の変異の頻度を比較すること、及びｆ．対象の疾患の状態をステップ（ｄ）から評価すること、または評価しておくこと、も含めることができる。複数回の反復は、異なる時点で実施され得、例えば、ステップ（ａ）～（ｃ）の第１の反復をワクチン組成物の投与の前に実施し、ステップ（ａ）～（ｃ）の第２の反復をワクチン組成物の投与の後で実施することができる。ステップ（ｃ）には、複数回の反復で決定された１つ以上の変異の頻度、または第１の反復で決定された１つ以上の変異の頻度と、第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度と、を比較することが含まれ得る。後続の反復または第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度の増加は、疾患の進行として評価され得る。後続の反復または第２の反復で決定された１つ以上の変異の頻度の減少は、応答として評価され得る。いくつかの態様では、応答は、完全奏功（ＣＲ）または部分奏効◇（ＰＲ）である。評価ステップに続いて、例えば、ｃｆＤＮＡにおける１つ以上の変異の頻度の評価により対象が疾患を有することが示される場合は、療法が対象に実施され得る。ｃｆＤＮＡ単離ステップでは、細胞または細胞片からｃｆＤＮＡを分離するために遠心分離を使用することができる。ｃｆＤＮＡは、血漿層、バフィーコート、及び赤血球を分離する等により全血から単離され得る。ｃｆＤＮＡシークエンシングでは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、サンガー法による配列決定、デュプレックスシークエンシング、全エクソームシークエンシング、全ゲノムシークエンシング、ｄｅ ｎｏｖｏシークエンシング、段階的シークエンシング、ターゲットアンプリコンシークエンシング、ショットガンシークエンシング、またはそれらの組み合わせを使用することができ、また、シークエンシングの前に１つ以上の目的ポリヌクレオチド領域についてｃｆＤＮＡを濃縮させることが含まれ得る（例えば、１つ以上の変異をコードすることが既知である、もしくはその疑いのあるポリヌクレオチド、コード領域、及び／または腫瘍エクソームポリヌクレオチド）。ｃｆＤＮＡを濃縮させることには、修飾（例えば、ビオチン化）され得る１つ以上のポリヌクレオチドプローブを、１つ以上の目的ポリヌクレオチド領域にハイブリダイズさせることが含まれ得る。一般に、任意の数の変異が同時または並行してモニターされ得る。

【0394】

同種ワクチン接種レジメンには、２回目の用量の有効性を改善するため、同種の用量間の間隔が含まれ得る。例えば、ＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンは、初回用量として投与が可能であり、有効性改善のため、例えば、ＣｈＡｄＶ特異的中和抗体価がブースト用量の有効性に与える影響を軽減するために、ブースト用量としてのＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンの再投与の前に間隔を含めることが可能である。例えば、初回用量では、中和抗体の産生が誘導され得、これは、その後、経時的に減少する。本明細書に記載されるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチンの例示的な非限定的例では、間隔は、少なくとも２７週間である。間隔は、２７週間であり得る。間隔は、２８週間であり得る。間隔は、２９週間であり得る。間隔は、３０週間であり得る。間隔は、３１週間であり得る。間隔は、３２週間であり得る。間隔は、３３週間であり得る。間隔は、少なくとも２７週間であり得る。間隔は、少なくとも２８週間であり得る。間隔は、少なくとも２９週間であり得る。間隔は、少なくとも３０週間であり得る。間隔は、少なくとも３１週間であり得る。間隔は、少なくとも３２週間であり得る。間隔は、少なくとも３３週間であり得る。

【0395】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、わずか８週間であり得る。間隔は、８週間であり得る。間隔は、９週間であり得る。間隔は、１０週間であり得る。間隔は、１１週間であり得る。間隔は、１２週間であり得る。間隔は、１３週間であり得る。間隔は、１４週間であり得る。間隔は、１５週間であり得る。間隔は、１６週間であり得る。間隔は、１７週間であり得る。間隔は、１８週間であり得る。間隔は、１９週間であり得る。間隔は、２０週間であり得る。間隔は、２１週間であり得る。間隔は、２３週間であり得る。間隔は、２４週間であり得る。間隔は、２５週間であり得る。間隔は、２６週間であり得る。

【0396】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、少なくとも８週間であり得る。間隔は、少なくとも９週間であり得る。間隔は、少なくとも１０週間であり得る。間隔は、少なくとも１１週間であり得る。間隔は、少なくとも１２週間であり得る。間隔は、少なくとも１３週間であり得る。間隔は、少なくとも１４週間であり得る。間隔は、少なくとも１５週間であり得る。間隔は、少なくとも１６週間であり得る。間隔は、少なくとも１７週間であり得る。間隔は、少なくとも１８週間であり得る。間隔は、少なくとも１９週間であり得る。間隔は、少なくとも２０週間であり得る。間隔は、少なくとも２１週間であり得る。間隔は、少なくとも２３週間であり得る。間隔は、少なくとも２４週間であり得る。間隔は、少なくとも２５週間であり得る。間隔は、少なくとも２６週間であり得る。

【0397】

同種プライム－ブースト戦略におけるＣｈＡｄＶ６８に基づくワクチン投与の間隔は、２か月であり得る。間隔は、２．５か月であり得る。間隔は、３か月であり得る。間隔は、３．５か月であり得る。間隔は、４か月であり得る。間隔は、４．５か月であり得る。間隔は、５か月であり得る。間隔は、５．５か月であり得る。間隔は、６か月であり得る。間隔は、６．５か月であり得る。間隔は、７か月であり得る。間隔は、７．５か月であり得る。間隔は、８か月であり得る。間隔は、８．５か月であり得る。間隔は、少なくとも２か月であり得る。間隔は、少なくとも２．５か月であり得る。間隔は、少なくとも３か月であり得る。間隔は、少なくとも３．５か月であり得る。間隔は、少なくとも４か月であり得る。間隔は、少なくとも４．５か月であり得る。間隔は、少なくとも５か月であり得る。間隔は、少なくとも５．５か月であり得る。間隔は、少なくとも６か月であり得る。間隔は、少なくとも６．５か月であり得る。間隔は、少なくとも７か月であり得る。間隔は、少なくとも７．５か月であり得る。間隔は、少なくとも８か月であり得る。間隔は、少なくとも８．５か月であり得る。

【0398】

ＶＩＩＩ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
組織試料の溶解及び可溶化後、古典的免疫沈降（ＩＰ）法を使用してＨＬＡペプチド分子の単離を実施した（５５～５８）。ＨＬＡ特異的ＩＰには清澄化したライセートを使用した。例及び方法は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳述されている。

【0399】

ＩＸ．提示モデル
患者におけるペプチド提示の可能性を特定するために、提示モデルを使用することができる。様々な提示モデルが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号及び同第ＵＳ２０１１０２９３６３７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号に提示モデルが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0400】

Ｘ．トレーニングモジュール
ペプチド配列が、そのペプチド配列と関連するＭＨＣアレルによって提示されるかどうかの可能性を生成するトレーニングデータセットに基づいて、１つ以上の提示モデルを構築するために、トレーニングモジュールを使用することができる。様々なトレーニングモジュールが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に提示モデルが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。トレーニングモジュールでは、アレルごとにペプチドの提示可能性を予測するための提示モデルを構築することができる。トレーニングモジュールではまた、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル設定でのペプチドの提示可能性を予測するための提示モデルを構築することができる。

【0401】

ＸＩ．予測モジュール
配列データを受け取り、提示モデルを使用する配列データにおいて候補抗原を選択するために、予測モジュールを使用することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞、患者の感染細胞、もしくは感染症生物自体から抽出された、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であり得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較し、１つ以上の変異を含有する部分を特定することによって、変異ペプチド配列である候補ネオアンチゲンを特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の感染細胞から抽出された配列データと比較し、感染症生物と関連する１つ以上の抗原を含有する部分を特定すること等によって、病原体由来ペプチド、ウイルス由来ペプチド、細菌由来ペプチド、真菌由来ペプチド、及び寄生虫由来ペプチドである候補抗原を特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較し、不適切に発現された候補抗原を特定することによって、正常な細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織において発現が変化している候補抗原を特定し得る。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の感染組織細胞から抽出された配列データと比較し、発現された候補抗原を特定する（例えば、発現されたポリヌクレオチド及び／または感染症に特異的なポリペプチドを特定する）ことによって、正常な細胞または組織と比較して感染細胞または感染組織で発現している候補抗原を特定し得る。

【0402】

提示モジュールでは、処理されたペプチド配列に１つ以上の提示モデルを適用して、ペプチド配列の提示可能性を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、候補抗原に提示モデルを適用することによって、ＨＬＡ分子または感染細胞ＨＬＡ分子に提示される可能性の高い腫瘍１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択し得る。一実施態様では、提示モジュールは、推定提示可能性が所定の閾値を上回る候補抗原配列を選択する。別の実施態様では、提示モデルは、推定提示可能性が最も高いＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは一般に、ワクチンで送達可能な最大エピトープ数である）。所与の患者について選択された候補抗原が含まれるワクチンを対象に注射して免疫応答を刺激することができる。

【0403】

ＸＩ．Ｂ．カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１概要
患者への注射用に選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成するために、カセット設計モジュールを使用することができる。例えば、カセット設計モジュールを使用して、連結されたＴ細胞エピトープ等の連結されたエピトープ配列をコードする配列を生成することができる。様々なカセット設計モジュールが当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号にカセット設計モジュールが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0404】

治療用エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示可能性と関連している予測モジュールによって決定された選択ペプチドに基づいて生成され得、ここで、提示可能性は提示モデルにより決定される。ただし、他の実施形態では、治療用エピトープのセットは、多数の方法（単独または組み合わせ）のうちのいずれか１つ以上に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩアレルまたはＨＬＡクラスＩＩアレルへの結合親和性もしくは予測結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩアレルまたはＨＬＡクラスＩＩアレルへの結合安定性もしくは予測結合安定性、ランダムサンプリング等に基づいて生成され得ることが理解される。

【0405】

治療用エピトープは、選択されたペプチド自体に対応し得る。治療用エピトープには、選択されたペプチドに加え、Ｃ末端及び／またはＮ末端のフランキング配列も含まれ得る。Ｎ末端及びＣ末端のフランキング配列は、その供給源であるタンパク質との関連における治療用ワクチンエピトープの天然のＮ末端及びＣ末端のフランキング配列であり得る。治療用エピトープは、長さが固定されたエピトープを表し得る。治療用エピトープは、長さが可変のエピトープを表し得、ここで、エピトープの長さは、例えば、Ｃ－フランキング配列またはＮ－フランキング配列の長さに応じて変動し得る。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、各々が２～５残基の異なる長さを有することができ、エピトープに１６の可能な選択肢をもたらす。

【0406】

カセット設計モジュールはまた、カセット内の１対の治療用エピトープ間の接合部にまたがる接合部エピトープの提示を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。接合部エピトープは、カセット内で治療用エピトープとリンカー配列を連結させる過程が原因でカセットに生じる、非自己であるが無関係な新規エピトープ配列である。接合部エピトープの新規配列は、カセット自体の治療用エピトープとは異なる。

【0407】

カセット設計モジュールは、接合部エピトープが患者において提示される可能性を低下させるカセット配列を生成することができる。具体的には、カセットが患者に注射される場合、接合部エピトープには、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩのアレルによって提示され、それぞれ、ＣＤ８またはＣＤ４のＴ細胞応答を刺激する可能性がある。そのような反応は、その接合部エピトープに反応性のＴ細胞には、治療上の利益がなく、カセット内の選択された治療用エピトープに対する免疫応答を抗原競合により減弱させる可能性があるため、望ましくない場合が多い^７６。

【0408】

カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットを反復処理することができ、カセット配列が、そのカセット配列と関連する接合部エピトープの提示スコアが数的閾値を下回るものを決定することができる。接合部エピトープ提示スコアは、カセット内の接合部エピトープの提示可能性と関連する量であり、接合部エピトープ提示スコアが高値であるほど、カセットの接合部エピトープがＨＬＡクラスＩもしくはＨＬＡクラスＩＩまたは両方によって提示される可能性が高いことを示す。

【0409】

一実施形態では、カセット設計モジュールは、候補カセット配列のうち接合部エピトープ提示スコアが最も低いものと関連するカセット配列を決定し得る。

【0410】

カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列を反復処理し、候補カセットの接合部エピトープ提示スコアを決定して、閾値を下回る接合部エピトープ提示スコアと関連する最適カセット配列を特定し得る。

【0411】

カセット設計モジュールはさらに１つ以上の候補カセット配列をチェックして、候補カセット配列内の接合部エピトープのいずれかが、ワクチンを設計する対象である所与の患者の自己エピトープであるかどうかを特定し得る。これを達成するために、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴ等の既知のデータベースに対して接合部エピトープをチェックする。一実施形態では、カセット設計モジュールは、接合部自己エピトープを回避するカセットを設計ように構成される。

【0412】

カセット設計モジュールは、力任せ（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）法を実施して、可能性のある全部またはほとんどの候補カセット配列を反復処理し、接合部エピトープ提示スコアが最も小さい配列を選択することができる。ただし、そのような候補カセットの数は、ワクチン容量が増大するにつれて、とてつもなく大きくなり得る。例えば、ワクチン容量が２０エピトープの場合、カセット設計モジュールは、接合部エピトープ提示スコアが最低のカセットを決定するために、約１０^１８の可能な候補カセットを反復処理しなければならない。こうした決定は、カセット設計モジュールが、患者のためのワクチン生成を妥当な時間内に完了させるには、計算的に負担となり（計算処理資源が必要という点で）、ときに解決困難な場合がある。さらに、可能な接合部エピトープを候補カセットごとに考慮することは、さらに大きな負担となり得る。したがって、カセット設計モジュールは、力任せ法の場合の候補カセット配列数よりは大幅に少数の、多数の候補カセット配列を反復処理する方法に基づいてカセット配列を選択し得る。

【0413】

カセット設計モジュールは、ランダムまたは少なくとも準ランダムに生成された候補カセットのサブセットを生成することができ、カセット配列として所定の閾値を下回る接合部エピトープ提示スコアと関連する候補カセットを選択する。さらに、カセット設計モジュールは、カセット配列として接合部エピトープ提示スコアが最も低いサブセットからの候補カセットを選択し得る。例えば、カセット設計モジュールは、２０選択エピトープのセットに対して約１００万候補カセットのサブセットを生成、接合部エピトープ提示スコアが最も小さい候補カセットを選択し得る。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、そのサブセットから接合部エピトープ提示スコアが低いカセット配列を選択することは、力任せ法と比べて最適以下であり得るが、計算資源が大幅に少なくて済むため、その実装が技術的に実現可能となる。さらに、より効率的なこの手法とは対照的に力任せ法を実施しても、接合部エピトープ提示スコアにはわずかな、さらには無視できるほどの改善しかもたらされない場合があるため、資源配分の観点からは価値がない。カセット設計モジュールは、非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）としてカセットのエピトープ配列を定式化することにより、改善されたカセット構成を決定することができる。ノードのリストと各ノードペア間の距離が与えられている場合、ＴＳＰは、各ノードを１回だけ訪問し、元のノードへ戻るための総距離が最小となるものと関連するノードの配列を決定する。例えば、互いの距離が既知の都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられている場合、ＴＳＰの解法は、各都市を１回だけ訪問するために巡回した総距離が可能経路のうちで最小である閉の都市配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンでは、ノードペア間の距離が非対称である場合の最適ノード配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢまで巡回するための「距離」は、ノードＢからノードＡまで巡回するための「距離」とは異なる場合がある。非対称ＴＳＰを使用して改善された最適カセットについて解くことによって、カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ間の接合部を横断して、提示スコア減少をもたらすカセット配列を見出すことができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの接合部全体の接合部エピトープ提示スコアを最小限に抑えるために、エピトープがカセット内で連結されるべき順序に対応する治療用エピトープの配列を示す。この手法で決定されたカセット配列は、接合部エピトープの提示が大幅に少ない配列となる可能性があり、一方で、生成される候補カセット配列数が大きい場合は特に、ランダムサンプリング法よりも計算資源が大幅に少なくて済む可能性が高い。様々な計算手法及びカセット設計最適化のための比較の例示的な例は、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0414】

共通抗原ワクチンに含めるための共通（ネオ）抗原配列及びそのようなワクチンによる治療に適切な患者は、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１７／０５８，１２８号に記載のように、当業者により選択され得る。共通（ネオ）抗原候補の質量分析（ＭＳ）による確認は、選択工程の一部として実施可能である。

【0415】

カセット設計モジュールはまた、ワクチンでコードされる追加のタンパク質配列を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。例えば、連結されたＴ細胞エピトープをコードする配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、ワクチン中に存在する追加のタンパク質配列（例えば、全長タンパク質配列）によってすでにコードされているＴ細胞エピトープを考慮に入れることができ、例えば、追加のタンパク質配列によってすでにコードされているＴ細胞エピトープを候補配列の一覧から除去すること等により行う。

【0416】

カセット設計モジュールはまた、配列のサイズを考慮に入れてカセット配列を生成することができる。理論に拘束されることは望まないが、一般に、カセットサイズの増大は、ワクチン生成及び／またはワクチン有効性等のワクチンの態様にマイナスの影響を与え得る。一例では、カセット設計モジュールは、重複Ｔ細胞エピトープ配列等の重複配列を考慮に入れることができる。一般に、重複Ｔ細胞エピトープ配列を含有する単一配列（「フレーム」とも呼ばれる）は、複数のペプチドをコードするために必要な配列サイズが縮小されることから、個々のＴ細胞エピトープ配列を別々に連結している配列よりも効率的である。したがって、例示的な例では、連結されたＴ細胞エピトープをコードする配列を生成するために使用されるカセット設計モジュールは、１つ以上の追加のＴ細胞エピトープをコードするようＴ細胞エピトープ候補を拡張することのコスト／利益を考慮に入れることができ、例えば、追加のＴ細胞エピトープを提示するＭＨＣにさらなる集団を対象とさせることで得られる利益を、配列サイズ増大のコストと対比させて決定することができる。

【0417】

カセット設計モジュールはまた、確認されたエピトープにより引き起こされる免疫応答の刺激の程度を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。

【0418】

カセット設計モジュールはまた、例えば、集団のある割合で、例えば、集団の少なくとも８５％、９０％、または９５％で、少なくとも１つの免疫原性エピトープが少なくとも１つのＨＬＡにより提示される（例えば、４つの主要な民族集団、すなわちヨーロッパ人（ＥＵＲ）、アフリカ系米国人（ＡＦＡ）、アジア人・太平洋諸島住民（ＡＰＡ）及びヒスパニック（ＨＩＳ）にわたる、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子）、ある集団全体でコードされたエピトープの提示を考慮に入れてカセット配列を生成することができる。例示的な非限定的例として、カセット設計モジュールはまた、少なくとも１つの確認されたエピトープを提示するか、または少なくとも４つ、５つ、６つ、もしくは７つの予測エピトープを提示する、少なくとも１つのＨＬＡが少なくとも集団の８５％、９０％、または９５％にわたって存在するよう、カセット配列を生成することができる。

【0419】

カセット設計モジュールはまた、潜在的安全性を改善する他の態様を考慮に入れてカセット配列を生成することができ、例えば、安全性リスクを示す可能性のある機能性タンパク質、機能性タンパク質ドメイン、機能性タンパク質サブユニット、または機能性タンパク質断片を、コードすること、もしくはコードする可能性を制限する。場合によっては、カセット設計モジュールは、コードされるペプチドの配列サイズが、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満であるよう制限することができる。場合によっては、カセット設計モジュールは、単一連続配列が、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満であるよう、コードされるペプチドの配列サイズを制限することができるが、複数の配列が、同じ翻訳された対応する全長タンパク質に由来し得、合わせて５０％超をコードし得る。例を用いて説明すると、重複Ｔ細胞エピトープ配列を含有する単一配列（「フレーム」）が、翻訳された対応する全長タンパク質の５０％よりも大きい場合、フレームを複数のフレームに分割して（例えば、ｆ１、ｆ２等）、各フレームが翻訳された対応する全長タンパク質の５０％未満となるようにすることができる。カセット設計モジュールはまた、コードされるペプチドの配列サイズを、単一連続配列が、翻訳された対応する全長タンパク質の４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４５％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、または３３％未満となるよう制限することができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、複数のフレームは、互いに重複する配列を有することができ、言い換えれば、それぞれが別々に同じ配列をコードすることができる。同じ遺伝子からの複数のフレームがコードされる場合、同じ遺伝子に由来する２つ以上の核酸配列を、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の直前またはそれに連結されることのないよう並べることができるが、これは、対応する遺伝子において第１の核酸配列に第２の核酸配列が続く場合であり、それが直後であるか否かは問わない。例えば、同じ遺伝子内に３つのフレームがある場合（アミノ酸位置が増加する順にｆ１、ｆ２、ｆ３）：
－以下のカセット順序は許容されない：
○ ｆ１の直後にｆ２
○ ｆ２の直後にｆ３
○ ｆ１の直後にｆ３
－以下のカセット順序は許容される：
○ ｆ３の直後にｆ２
○ ｆ２の直後にｆ１

【0420】

ＸＩＩＩ．コンピュータの例
本明細書に記載される計算方法のいずれかではコンピュータを使用することができる。当業者は、コンピュータが、異なるアーキテクチャを有し得ることを認識するであろう。コンピュータの例は当業者に公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号、米国出願公開第ＵＳ２０２０００１０８４９Ａ１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号にコンピュータが詳述されており、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0421】

ＸＩＶ．実施例
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、あくまで事例を提供するにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差は当然のことながら許容されるべきである。

【0422】

本発明の実施には、特に明記しない限り、当技術分野の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来方法が使用される。そのような技術は文献に十分な説明がある。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

【0423】

ＸＩＶ．Ａ．スパイクタンパク質配列の最適化
スパイクタンパク質をコードする、配列が最適化された様々なヌクレオチド配列をＣｈＡｄＶ６８ワクチンベクターで評価した。

【0424】

スパイク配列の配列最適化
Ｗｕｈａｎ Ｈｕ／１からのスパイクヌクレオチド配列（配列番号７８）を、アミノ酸配列が影響を受けないように、同義コドンを置換することにより配列最適化を行った。ヒトでの発現増強のため、及び合成を助けるよう複雑さの軽減のため、ＩＤＴアルゴリズムを使用した（例えば、配列番号６６～７４を参照のこと）。スパイク配列に、２つの追加のアルゴリズムを使用してさらなる配列最適化を行い、（１）ＳＧＩ ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して生成された単一配列（配列番号８７）、（２）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＳｉｎｇａｐｏｒｅによるＣＯＯＬを使用して生成されたＣＴ１、ＣＴ２０、ＣＴ５６、ＣＴ８３、ＣＴ１３１、及びＣＴ１９９で表される６つの配列（配列番号７９～８４）（ＣＯＯＬアルゴリズムは複数の配列を生成し、６つが選択された）を得た。それぞれの配列を表１に示す。

【0425】

ＣｈＡｄＶ６８ウイルスを感染させるかまたはＣｈＡｄＶ６８ゲノムＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ａ細胞からのｃＤＮＡにおいてスプライシング現象を特定した。具体的には、１０ｅ５～１０ｅ６細胞からのトータルＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙカラムを使用して精製した。残留ＤＮＡをＤＮＡｓｅ処理により除去し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してｃＤＮＡを作製した。その後、Ｇｒｉｔｓｔｏｎｅ ＣｈＡｄＶ６８カセットの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに対して特異的なプライマーを使用してＰＣＲ産物を生成させ、アガロースゲル電気泳動、ゲル精製、及びサンガー法による配列決定により分析して、スプライシングにより欠失した領域を特定した。

【0426】

スプライスドナー部位を、ヌクレオチド配列モチーフを破壊するがアミノ酸配列を乱さない部位特異的変異誘発によって除去した。変異誘発は、上記変異をＰＣＲプライマーに組み込み、いくつかの断片を並行して増幅させ、断片にＧｉｂｓｏｎアセンブリを実行することによって達成された（３０～６０ｎｔが重複）。最適化されたクローンＣＴ１－２Ｃ（配列番号８５）は、ＮＴ３８５及びＮＴ５３９における、サンガー法による配列決定で同定されたスプライスドナーモチーフが変異しており、クローンＩＤＴ－４Ｃ（配列番号８６）では、ＮＴ３８５、ＮＴ５３９における、サンガー法による配列決定で同定されたスプライスドナーモチーフ、ならびにＮＴ２００３及びＮＴ２４７３における予測ドナーモチーフが変異していた。さらに、ＩＤＴ－４Ｃクローンでは、ｎｔ４４５における可能なポリアデニル化部位ＡＡＴＡＡＡがＡＡｃＡＡＡに変異していた。

【0427】

記載の配列を表１に示す。

【0428】

配列最適化済みスパイク配列のクローニング
配列が最適化されたスパイク配列はそれぞれ、３つのｇＢｌｏｃｋを１セットとしてＩＤＴから注文したものであり、各ｇｂｌｏｃｋが１３００～１５００ｂｐであり、互いに約１００ヌクレオチド重複するものであった。スパイク配列の５’末端及び３’末端を含むｇＢｌｏｃｋは、プラスミド骨格と１００ヌクレオチド重複した。ｇｂｌｏｃｋを、ＰＣＲとＧｉｂｓｏｎアセンブリの組み合わせにより線状ｐＡ６８－Ｅ４ｄ ＡｓｉｓＩ／ＰｍｅＩ骨格に構築して、ｐＡ６８－Ｅ４配列で最適化されたスパイクのクローンを生成した。ＰＣＲによりクローンのスクリーニングを行い、次いで、適切なサイズのクローンをプラスミド作製のために成長させ、ＮＧＳまたはサンガー法による配列決定のいずれかでシークエンシングした。適切なクローンの配列が確認された時点で、トランスフェクション用に大規模なプラスミドの作製及び精製を実施した。

【0429】

ベクターの作製
ｐＡ６８－Ｅ４－スパイクプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化し、ＴｒａｎｓＩｔ Ｌｅｎｔｉトランスフェクション試薬を使用して２ｕｇのＤＮＡを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション５日後、細胞及び培地を採取し、－８０℃及び３７℃での凍結－解凍によりライセートを生成した。ライセートの一部を使用して、３０ｍＬの２９３Ｆ細胞を再感染させ、４８～７２時間インキュベートしてから採取した。ライセートを、－８０℃及び３７℃での凍結－解凍により生成し、ライセートの一部を使用して４００ｍＬの２９３Ｆ細胞を感染させ、１ｅ６細胞／ｍＬで播種した。次いで、４８～７２時間の後、細胞を採取し、１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に溶解し、３７℃及び－８０℃での凍結・解凍を１回行った。その後、ライセートを４３００×ｇで１０分間遠心分離にかけて清澄化してから、１．２／１．４のＣｓＣｌのグラジエントに負荷した。グラジエントを最低２時間実行してからバンドを採取し、Ｔｒｉｓで２～４倍に希釈した後、１．３５のＣｓＣｌグラジエントで少なくとも２時間、再実行した。ウイルスバンドを採取し、次いで、１×ＡＲＭ緩衝液で３回透析した。ウイルス感染価を免疫染色力価アッセイにより決定し、ウイルス粒子を、Ａ２６０ｎｍの吸光度で測定した。

【0430】

ウェスタン分析
スパイク発現分析用の試料を、トランスフェクション後の指定された時間に採取するか、または精製したウイルスの場合、既知のウイルスＭＯＩを用いた制御された感染実験を設定することにより、感染後の特定の時間、典型的には２４～４８時間目に採取した。１ｅ６細胞を、典型的には、１０％ベータ－メルカプトエタノールを添加した０．５ｍＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液に採取した。試料を沸させ、変性及び還元条件下、４～２０％ポリアクリルアミドゲルで実行した。その後、ＢｉｏＲａｄ Ｒａｐｉｄ転写装置を使用して、ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットした。膜を、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ中で室温にて２時間ブロッキングした。その後、膜を、抗スパイクＳ１ ポリクローナル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）または抗スパイクモノクローナル抗体１Ａ９（ＧｅｎｅＴｅｘ；カタログ番号ＧＴＸ６３２６０４）でプローブし、２時間インキュベートした。その後、膜を、ＰＢＳＴ中で洗浄し（５回）、ＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｓ）で１時間プローブした。膜を上記のように洗浄し、その後、化学発光基質ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートした。その後、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（ＢｉｏＲａｄ装置）を使用して画像を取得した。

【0431】

結果
スパイクＳ２タンパク質の発現を、スパイクをコードする様々なベクターを用いた２９３Ｆ細胞でのウイルス生成時に評価した。ＩＤＴ配列最適化スパイクカセットをコードするベクターを使用して、ＳＡＭベクターで発現させた場合には、抗スパイクＳ２抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用したウエスタンブロットによってスパイクＳ２タンパク質が検出されたが、ＣｈＡｄＶ６８ベクター（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）」；配列番号６９）で発現させた場合には、２つの異なるＭＯＩ及び時点において検出されなかった（データ図示せず）。スパイクバリアントＤ６１４Ｇ（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ」、配列番号７０）を発現するよう操作された２つのクローンもまた、Ｓ２抗体を使用したウェスタンにより検出可能なレベルのスパイクタンパク質を発現しなかった（データ図示せず）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質をスパイク（「ＣＭＶ－スパイク（ＩＤＴ）－Ｄ６１４Ｇ－Ｍｅｍ」、配列番号６６）と共に共発現するよう操作されたクローン、またはＦｕｒｉｎ切断部位を破壊するようＲ６８２Ｖ変異が含まれているクローンでは、発現表現型はレスキューされなかった（データ図示せず）。対照的に、スパイクＳ１ タンパク質が検出されなかったＦｕｒｉｎ Ｒ６８２Ｖ変異を除いては、すべてのＩＤＴコンストラクトで、低レベルではあるが、スパイクＳ１ タンパク質が検出された。

【0432】

ＩＤＴ配列最適化クローンに関する発現の問題が、Ｓ１ドメインまたはＳ２ドメインに特異的なものであったのかどうかを解き明かすため、Ｓ１ドメインまたはＳ２ドメインのみを発現するベクターも評価した。ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ１タンパク質のみをコードするＣｈＡｄＶ６８ベクターは、全長スパイクベクターで観察された、より低い発現とは対照的に、タンパク質強発現を示した（データ図示せず）。予想どおり、Ｓ２ドメインのみをコードするベクターを用いたＳ１では、シグナルは観察されなかった。対照的に、ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ２タンパク質のみをコードするＣｈＡｄＶ６８ベクターは、観察できるほどのタンパク質発現を示さず、全長スパイクベクターでは観察されたシグナルは存在しないに等しかった（データ図示せず）。したがって、データは、ＩＤＴ配列最適化スパイクＳ２が、全長スパイク配列の発現に影響を与えることも含め、不十分な発現を示すことを示す。

【0433】

タンパク質発現に対処するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードするヌクレオチド配列に、追加の配列最適化アルゴリズムを使用して配列最適化を行い、（１）ＳＧＩ ＤＮＡ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して生成された単一配列（配列番号８７）、（２）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＳｉｎｇａｐｏｒｅによるＣＯＯＬを使用して生成されたＣＴ１、ＣＴ２０、ＣＴ５６、ＣＴ８３、ＣＴ１３１、及びＣＴ１９９で表される６つの配列（配列番号７９～８４）（ＣＯＯＬアルゴリズムは複数の配列を生成し、６つが選択された）を得た。ＣＯＯＬアルゴリズムでの配列最適化では、配列ＣＴ１（配列番号７９）が生成され、これは、抗Ｓ２抗体及び抗Ｓ１抗体の両方を使用したウェスタンにより評価した場合、ＣｈＡｄＶ６８ベクターを使用して検出可能な発現が示された（データ図示せず）。ＣＯＯＬアルゴリズム及びＳＧＩアルゴリズムを使用して生成された追加の配列もまたウェスタンにより評価した。ＳＧＩクローン及びＣＯＯＬ配列ＣＴ１３１もまた、抗Ｓ２抗体を使用したウェスタンにより検出可能なレベルのスパイクタンパク質を示したが、ＣＯＯＬで生成された他の配列では、対照のＣＴ１由来配列（レーン２）以外の検出可能なシグナルは生成されなかった。したがって、データは、特定の配列最適化がＣｈＡｄＶ６８ベクターにおける全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の発現を改善したことを示している。

【0434】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、それ自身の複製機構をコードする、細胞質で複製するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡは、スプライシング及び核外輸送機構による自然のプロセシングを受けない。ＣｈＡｄＶ６８ベクターから発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクコードｍＲＮＡにおけるスプライシングの役割を評価するため、スパイクコード領域を増幅させるためのプライマーを設計した。ｍＲＮＡスプライシングの存在下では、アンプリコンのサイズは、予測される全長コード領域よりも小さいと思われる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクカセットをコードするプラスミドのＰＣＲでは予測したアンプリコンサイズが示されたが（「スパイクプラスミド」左パネル、右カラム）、感染２９３細胞からのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅では２つの小さいアンプリコンが示され、これはｍＲＮＡ転写産物のスプライシングを示す（「ＣｈＡｄ－スパイク（ＩＤＴ）ｃＤＮＡ」左パネル、左カラム）。さらに、スパイクコード配列を、Ｓ１コード配列とＳ２コード配列とに分割した。感染２９３細胞からのＳ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅では予測したアンプリコンサイズが示され（「スパイクＳ１」右パネル、左カラム）、Ｓ１は望ましくないスプライシングを受けない可能性が高いが、Ｓ２領域内の配列はスプライシングに影響し得ることを示している。

【0435】

より小さいアンプリコン配列を分析し、サンガー法による配列決定により２つのスプライスドナー部位を同定した。さらなるシークエンス解析により、さらなる３つの潜在的ドナー部位を予測した。スプライスモチーフ配列の位置及び同一性を以下に示す（ｎｔトリプレットはコドンに対応し、番号付けはスパイクＡＴＧを基準に開始する）：
ＮＴ３８５－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧＴ－＞ＡＡａ ＧＴｃ ＴＧｃ（シークエンシングにより同定）
ＮＴ５３９－：ＡＡ ＧＧＴ ＡＡＧ Ｃ－＞Ａｇ ＧＧｃ ＡＡａ Ｃ（シークエンシングにより同定）
ＮＴ２００３－：ＣＡ ＧＧＴ ＡＴＣ Ｔ－＞Ｃｔ ＧＧａ ＡＴＣ Ｔ（予測）
ＮＴ２４７３－：ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＣＣ－＞ＡＡａ ＧＴｃ ＡＣＣ（予測）
ＮＴ３４１７－：Ｃ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＣＣ－＞Ｔ ＣＣａ ＣＴｇ ＣＡａ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ａｇｔ

【0436】

選択されたスプライスドナー部位を、ヌクレオチド配列モチーフを破壊するがアミノ酸配列を乱さない部位特異的変異誘発によって除去した。ＣＯＯＬで配列最適化されたクローンＣＴ１を、ＮＴ３８５及びＮＴ５３９にて変異している、配列が同定されたスプライスドナーモチーフを有するクローンＣＴ１－２Ｃ（配列番号８５）のための参照配列として使用した。ＩＤＴ配列最適化クローンを、クローンＩＤＴ－４Ｃ（配列番号８６）のための参照配列として使用し、ＮＴ３８５、ＮＴ５３９、ＮＴ２００３、及びＮＴ２４７３にて変異している、配列が同定されたスプライスドナーモチーフ及び予測スプライスドナーモチーフの両方、ならびにＮＴ４４５にてＡＡｃＡＡＡに変異している、可能なポリアデニル化部位ＡＡＴＡＡＡを有した。クローンでは、配列が同定されたスプライスドナーモチーフを含め、スパイクタンパク質発現がウェスタンによって検出された。スプライシングをさらにコンストラクトでＰＣＲ分析により評価した。スプライスドナーモチーフ及び／または潜在的ポリＡ部位単独を変異させることでスプライシングが妨げられることはなかったことから、スプライシングが、サブドミナントなスプライス部位から生じた可能性があることを示している。

【0437】

ＣｈＡｄＶ６８ベクターから発現する全長スパイクｍＲＮＡでのスプライシング現象の特定を考慮して、追加のコンストラクトが生成され、タンパク質発現改善について評価される。追加の最適化には、外因性核外輸送シグナル（例えば、恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、もしくはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））を特徴とするコンストラクト、またはスプライシングにバイアスをかけるための、外因性スプライスのドナー／分岐／アクセプターのモチーフ配列の導入、例えば、ＳＶ４０ミニイントロン（配列番号８８）をスパイク遺伝子のすぐ上流でＣＭＶプロモーターとコザック配列との間に導入すること、による人工イントロンの追加を特徴とするコンストラクトが含まれる。同定及び予測されたスプライスドナーモチーフもまた、追加の配列最適化と組み合わせてさらに評価される。

【0438】

ＸＩＶ．Ｂ．多シストロン性自己増幅ｍＲＮＡベクターの評価
別々のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーターにより駆動される複数の発現カセットを特徴とする自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン設計について、評価結果を記載する。図１は、単一アルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ）を特徴とする自己増幅ｍＲＮＡ（ＳＡＭ）系を示す。そのような系では、単一ＳＧＰは、２Ａリボソームスキッピング配列要素（例えば、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａ配列）または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列要素を使用して複数のタンパク質を発現する多シストロン性転写産物を含め、ペイロードカセットの転写にのみ関与する。図２は、別々のＳＧＰにより駆動される複数の発現カセットを特徴とするＳＡＭ系を示す。理論に拘束されることは望まないが、複数のＳＧＰは、ＳＧＰ１とＳＧＰ２の両方が第２の遺伝子をコードする転写産物を産生することを考えると、第２のＳＧＰ（ＳＧＰ２）の制御下にある遺伝子の高発現を駆動することができる。

【0439】

様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの設計、コンストラクト、及び投与レジメンを評価した。ワクチンは、スパイクタンパク質の様々な最適化型、選択された予測Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）、またはスパイクとＴＣＥカセットの組み合わせをコードした。

【0440】

具体的には、２６Ｓ転写産物の転写のためのプロモーターとして機能する２４ｎｔのコア保存プロモーター配列ｃｔｃｔｃｔａｃｇｇｃＴＡＡｃｃｔｇａａ（＋１）ｔｇｇａが含まれる、様々なアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ）を評価した。

【0441】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド（下表２の様々なスパイクバリアント配列）または様々な連結されたＴ細胞エピトープカセット（代表的「ＴＣＥ５」を参照のこと）をコードする２つのカセットを有するベクターでは、第１のカセットは、第１のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーターＳＧＰ１（ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣ）により駆動され、第２のカセットは、第２のアルファウイルス由来サブゲノミックプロモーターＳＧＰ２（ＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧ）により駆動された。ＳＧＰ２には、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）のＣ末端の８アミノ酸をコードするヌクレオチドを５’領域で隣接させ、３’では、ＶＥＥＶアルファウイルスからの１８ｎｔの非翻訳領域（例えば、ａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇ）をコードするヌクレオチドを隣接させた（あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるＡｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，５９（６），１９９８，ｐｐ．９５２－９６４を参照のこと）。フランキング配列は、ＳＧＰ１との組み換え予防及び任意の潜在的な追加の転写エンハンサーエレメントの組み込みを含め、様々な目的のためにＳＧＰ２に含めた。さらに、ＳＧＰ２は、第２のカセットのためのコザック配列の５’側に隣接してコードされる。ＳＧＰ１及びＳＧＰ２の両方が含まれる代表的配列を配列番号９３に示す。

【0442】

具体的な方法を以下に詳述する。

【0443】

マウスの免疫化
マウスの試験はすべて、ＩＡＣＵＣで承認されたプロトコルを基にＭｕｒｉｇｅｎｉｃｓにて行われた。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を全試験で使用した。ワクチンを－８０℃で保存し、免疫当日に室温で解凍し、その後、ＰＢＳで０．１μｇ／ｍＬに希釈して、０．２ミクロンのフィルターで濾過した。濾過した製剤を４℃で保存し、調製の４時間以内に注射した。すべての免疫を、前脛骨筋への両側筋肉内に５０μＬずつ２回、計１００μＬを注射して行った。

【0444】

脾細胞の単離
Ｔ細胞応答の評価では、免疫後の様々な時点でマウスの脾臓を抽出した。いくつかの試験では、脾臓の採取を同時に行い、比較が可能になるよう、免疫をずらして行われたことに留意されたい。脾臓を採取し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳにより分析した。脾臓を完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に懸濁させ、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して解離させた。解離した細胞を４０μｍストレーナーを使用して濾過し、赤血球ＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解した。溶解後、細胞を３０μｍストレーナーで濾過し、完全ＲＭＰＩに再懸濁させた。

【0445】

血清採取
免疫後の様々な時点において２００μＬの血液を採取した。血液を１０００ｇにて室温で１０分間、遠心分離にかけた。血清を採取し、－８０℃で凍結した。

【0446】

Ｓ１ ＩｇＧ ＭＳＤ／ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＱｕｉｃｋＰｌｅｘプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）で希釈した５０μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１（１μｇ／ｍＬ）（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、２５０μＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を使用して撹拌しながら３回洗浄し、オービタルシェーカーでプレートを１５０μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で室温にて１時間ブロッキングした。被験血清を、１０％同一種血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）で適切な系列にて希釈し、各プレートの単一ウェルで試験した。希釈度１：１００で開始して３倍希釈し、試料あたり１１の希釈である。ウェルを洗浄し、５０ｕＬの希釈試料をウェルに加え、オービタルシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。ウェルを洗浄して、ＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で希釈した２５μＬのＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識抗マウス抗体（１μｇ／ｍＬ）（ＭＳＤ）と共にオービタルシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、１５０μＬのトリプロピルアミン含有読み取り用緩衝液（ＭＳＤ）を加えた。ＱＰｌｅｘ ＳＱ １２０（ＭＳＤ）ＥＣＬマイクロプレートリーダーを使用してプレートに直ちに実行した。エンドポイント力価は、シグナルがバックグラウンド値の２倍となる各試料の相互希釈と定義され、バックグラウンド値の２倍を超える最終２値の間にラインを適合させて内層される。バックグラウンド値は、１０％同一種血清のみを含有する対照ウェルの平均値（プレートごとに計算）である。

【0447】

ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析
プレコートした９６ウェルプレート（ＭＡｂｔｅｃｈ，Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ，ＡＬＰ）を製造者の操作手順に従って使用し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。試料を、様々な重複ペプチドプール（１５アミノ酸長、１１のアミノ酸重複）で、ペプチドあたり１μｇ／ｍＬの最終濃度にて一晩刺激した。スパイクの場合－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原に広がる８つの異なる重複ペプチドプール（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、プールあたり３６～４０ペプチド）。脾細胞を、各スパイクプールにつき１×１０^５細胞／ウェルにて２連で播種し、スパイクプールの２、４、及び７の場合は２．５×１０^４細胞／ウェル（７．５×１０^４ナイーブ細胞と混合）にて２連で播種した。ＴＣＥカセットに対する応答の測定－ヌクレオカプシドタンパク質（ＪＰＴ、ＮＣａｐ－１、１０２ペプチド）に広がる１プール、膜タンパク質（ＪＰＴ、ＶＭＥ－１、５３ペプチド）に広がる１プール、及びカセットでコードされるＯｒｆ３ａ領域に広がる１プール（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、３８ペプチド）。ＴＣＥペプチドプールの場合、脾細胞を、各プールにつき２ｘ１０^５細胞／ウェルにて２連で播種した。ＤＭＳＯのみの対照を、それぞれの試料及び細胞数ごとに播種した。３７℃で一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで洗浄し、抗サルＩＦＮγ ｍＡｂビオチン（ＭＡｂｔｅｃｈ）と共に２時間インキュベートし、次いで、追加洗浄、及びストレプトアビジン－ＡＬＰ（ＭＡｂｔｅｃｈ）との１時間のインキュベーションを行った。最終洗浄後、プレートをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＭＡｂｔｅｃｈ）と共に１０分間インキュベートし、免疫スポットを発生させた。スポットを画像化し、ＡＩＤリーダー（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を使用して計数した。データの処理及び分析では、複製ウェル変動性（変動性＝分散／（中央値＋１））が１０より大きく、中央値が１０より大きい試料を除外した。スポット値を、下式に従ったウェル飽和に基づいて補正した。

補正スポット＝生スポット＋２^＊（生スポット^＊飽和／（１００－飽和）

各試料を、陰性対照ペプチドウェルの平均値を減算してバックグラウンドを補正した。データは、１×１０^６脾細胞あたりのスポット形成コロニー（ＳＦＣ）として表される。ウェル飽和値が３５％超のウェルを「過多のため計数不能」（ＴＮＴＣ）と分類し、除外した。ＴＮＴＣであった試料及びペプチドの場合、２．５×１０^４細胞／ウェルで測定した値を用いた。

【0448】

評価された様々な配列は以下のとおりである：
－「ＩＤＴスパイク_ｇ」：ＩＤＴ最適化配列によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であり（配列番号６９を参照のこと）、配列番号５９に関してＤ６１４Ｇ変異が含まれ（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照のこと）、「スパイクＶ１」とも呼ばれる
－「ＣＴスパイク_ｇ」：Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号７９）であり、配列番号５９に関してＤ６１４Ｇ変異が含まれ（配列番号７０の対応するヌクレオチド変異を参照のこと）、「スパイクＶ２」とも呼ばれる。「ＣＴスパイク_Ｄ」と呼ばれるバージョンでは、Ｄ６１４は未変化である。
－「ＣＴスパイクＦ２Ｐ_ｇ」：Ｃｏｏｌ Ｔｏｏｌ最適化配列バージョン１によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であり（配列番号７９）、Ｆｕｒｉｎ切断部位を破壊（６８２～６８５のＲＲＡＲをＧＳＡＳに）するためのＲ６８２Ｖ、ならびに参照スパイクタンパク質（配列番号５９）に関してスパイクの２次構造を妨げるためのＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐが含まれる。
ヌクレオチド配列は配列番号８９に示され、タンパク質配列は配列番号９０に示される
－「ＴＣＥ５」：スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープ。
ヌクレオチド配列は配列番号９１に示され、タンパク質配列は配列番号９２に示される
－「ＴＣＥ６」：スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープ。
－「ＴＣＥ７」：スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープ。
－「ＴＣＥ７」：スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープ。
－「ＴＣＥ９」：スパイク以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープであり、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ－２間で保存されている確認されたエピトープ（例えば、汎コロナウイルスワクチンとして）が含まれており、ある特定のフレームが、アレルのための追加の予測エピトープ（すなわち、未確認エピトープ）を含めるために拡張されており（全フレームを通して２１の追加のアミノ酸）、合計サイズが５５６アミノ酸である
－「ＴＣＥ１１」：スパイク及びヌクレオカプシド以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する、ＭＨＣ分子上に提示されることがＥＤＧＥプラットフォームで予測された、選択されたＣＤ８＋エピトープ；スパイクに加え、合計サイズが６１６アミノ酸である確認されたエピトープ（１９７ａａ＋全長Ｎ）
－代表的ＳＡＭベクターであるＳＡＭ－ＳＧＰ１－ＴＣＥ５－ＳＧＰ２－ＣＴスパイク_ＧＦ２Ｐは配列番号９３に示される

【0449】

ＴＣＥ５アミノ酸配列（配列番号９２）：
ＭＡＧＥＡＰＦＬＹＬＹＡＬＶＹＦＬＱＳＩＮＦＶＲＩＩＭＲＬＷＬＣＷＫＣＲＳＫＮＰＬＬＹＤＡＮＹＦＬＣＷＨＴＮＬＡＶＦＱＳＡＳＫＩＩＴＬＫＫＲＷＱＬＡＬＳＫＧＶＨＦＶＣＮＬＬＬＶＴＬＫＱＧＥＩＫＤＡＴＰＳＤＦＶＲＡＴＡＴＩＰＩＱＡＳＬＰＦＧＷＬＩＶＧＶＡＬＬＡＶＲＲＰＱＧＬＰＮＮＴＡＳＷＦＴＡＬＴＱＨＧＫＥＤＬＫＦＰＲＧＱＧＶＰＩＮＴＮＳＳＰＤＤＱＩＧＹＹＲＲＡＴＲＲＩＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＩＴＳＧＤＧＴＴＳＰＩＳＥＨＤＹＱＩＧＧＹＴＥＫＷＥＳＧＶＫＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＫＭＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＤＣＶＶＬＨＳＹＦＴＳＤＹＹＱＬＹＳＴＱＬＳＴＤＴＧＶＥＨＶＴＦＦＩＹＮＫＩＶＤＥＰＥＥＨＶＱＩＨＴＩＤＧＳＳＧＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩＧＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＰＧＰＧＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＧＰＧＰＧＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＰＧＰＧ－

【0450】

ＴＣＥ１１アミノ酸配列：Ｎ末端のリーダー（太字）と、Ｃ末端のＧＰＧＰＧリンカー（配列番号５６）を持つ普遍的ＭＨＣクラスＩＩ（太字斜体）とを有する、連結された、ＥＤＧＥ予測によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭＨＣクラスＩエピトープカセット「ＴＣＥ１１」：

【0451】

ＳＡＭ－ＳＧＰ１－ＴＣＥ５－ＳＧＰ２－ＣＴスパイク_ＧＦ２Ｐヌクレオチド配列（配列番号９３）：（ＮＴ１～１７：Ｔ７プロモーター；ＮＴ６２～７５４３：ＶＥＥＶ非構造タンパク質コード領域；ＮＴ７５１８～７５６０：ＳＧＰ１；ＮＴ７５８２～７５８７及び９５４１～９５４６：コザック配列；ＮＴ７５８８～９４７４：ＴＣＥ５カセット；ＮＴ９４８０～９５４０：ＳＧＰ２；ＮＴ９５４７～１３３６８：ＣＴスパイクＦｕｒｉｎ－２Ｐ）

【0452】

ＣＭＶ－ＣＴスパイクＧＦ２Ｐ－ＣＭＶ－ＴＣＥ５カセットのヌクレオチド配列（配列番号１１４）

【0453】

結果
いずれもＳＧＰ１及びＳＧＰ２により発現される二重カセットを特徴とする様々なＳＡＭベクター編成を評価した。

【0454】

検討したのは、当該分野に存在する潜在的な技術的制約に対処する多シストロン性ＳＡＭベクターであったが、これには、（１）大型カセット（例えば、天然アルファウイルスサブゲノミックプロモーターから発現する天然カセットのサイズより大きい、例えば、長さが約４ｋｂ以上のカセット）が含まれている複数のペイロードの発現を改善すること、（２）複数のペイロードの発現の制御改善、例えば、異なるペイロードの相対発現を制御すること、及び（３）ベクター組み換え事象（例えば、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター間でのベクター内部プロモーターの組み換え）の低減等によるベクター安定性の改善、が含まれるが、これらに限定されない。

【0455】

コードされたエピトープに対するＴ細胞応答をモニタリングすることにより評価されるように、カセットの発現は、両プロモーターにより効果的に駆動された。注目すべきことに、ＳＧＰ２プロモーターの制御下にある第２のカセットは、Ｔ細胞応答をモニタリングすることにより評価されるように、ワクチンという状況ではより良い発現をもたらし、概ね２倍超である。

【0456】

様々な順序の、修飾ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と、ＥＤＧＥ予測によるエピトープ（ＥＰＥ）をコードするＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）カセットと、をコードするＳＡＭワクチンプラットフォームを評価した。

【0457】

様々なコンストラクトでワクチン接種した場合、スパイクに対するＴ細胞応答（上パネル）、コードされたＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答（中央パネル）、及びスパイク特異的ＩｇＧ抗体（下パネル）が産生された。図５及び図６（及び表４Ａ～表４Ｃで定量化）では、ＳＡＭコンストラクトには、「ＩＤＴスパイク_ｇ」（配列番号６９）単独（左列）、ＩＤＴスパイク_ｇが第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＴＣＥ５が第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（中央列）、またはＴＣＥ５が第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＩＤＴスパイク_ｇが第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（右列）が含まれ、評価した免疫応答は上記のとおりであった。図７及び図８（及び表５Ａ～表５Ｃで定量化）では、ＳＡＭコンストラクトには、「ＩＤＴスパイク_ｇ」（配列番号６９）単独（１列目）、ＩＤＴスパイク_ｇが第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＴＣＥ６もしくはＴＣＥ７が第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（それぞれ列２及び列４）、またはＴＣＥ６もしくはＴＣＥ７が第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＩＤＴスパイク_ｇが第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（それぞれ列３及び列５）が含まれ、評価した免疫応答は上記のとおりであった。図９及び図１０（及び表６Ａ～表６Ｃで定量化）では、ＳＡＭコンストラクトには、「ＣＴスパイク_ｇ」（配列番号７９）単独（１列目）、ＣＴスパイク_ｇが第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＴＣＥ５もしくはＴＣＥ８が第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（それぞれ列２及び列４）、またはＴＣＥ５もしくはＴＣＥ８が第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＣＴスパイク_ｇが第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（それぞれ列３及び列５）が含まれ、評価した免疫応答は上記のとおりであった。図１１及び図１２（及び表７Ａ～表７Ｄで定量化）では、ＳＡＭコンストラクトには、Ｂ．１．３５１（「南アフリカ」ベータ－系列）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（配列番号１１２；「ＳＡスパイク」）からのスパイクタンパク質（５０１Ｙ．Ｖ２）単独（１列目）、ＴＣＥ９（表８を参照のこと）が第１のサブゲノミックプロモーターから発現し、その後、ＳＡ－スパイクが第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（列２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（配列番号６２；「Ｎｕｃ」；Ｗｕｈａｎ原株分離株）とＴＣＥ１１（表９を参照のこと）の両方をコードするカセットが、第１のサブゲノミックプロモーター（ヌクレオカプシド－Ｔ２Ａリンカー－ＴＣＥ１１であり、かつ、ＧＰＧＰＧリンカー及びＰＡＤＲＥと破傷風トキソイドの両方の普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む）から発現し、その後、ＳＡ－スパイクが第２のサブゲノミックプロモーターから発現するもの（列３）、または無感作マウス（列４）が含まれ、評価した免疫応答は上記のとおりであった。

【0458】

一般に、特にスパイクタンパク質では、それぞれのエピトープが第２のサブゲノミックプロモーター（ＳＧＰ２）から発現した場合にＴ細胞応答が増大し、これには、スパイク単独と比べて、スパイクを標的とするＴ細胞応答の増大も含まれた。同様の傾向は、スパイク抗原が第２のサブゲノミックプロモーターから発現した場合のスパイク特異的ＩｇＧ力価でも全般的に観察されたが、ただし、ＣＴスパイク_ｇコンストラクトの可能性が高い。

【0459】

したがって、結果は、複数の別個のＳＧＰプロモーターの使用により、特に、ワクチンという状況で、アルファウイルス由来ＳＡＭベクター内の複数のカセットの効果的な発現が生じることを実証している。さらに、データは、ＳＡＭワクチンプラットフォームにおける抗原カセットの配列順序が免疫応答に影響を与えたことを実証している。

【0460】

本明細書で言及されるベクター、カセット、及び抗体のための特定の追加配列が以下に記載され、配列番号により言及されている。

【0461】

表Ａ
配列表、配列番号１３０～８１９５を指す。ＥＤＧＥスコアが０．００１超の、所与のＨＬＡアレルと関連することが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされる各候補ＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。各エントリーには、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１超の候補エピトープ配列及び同族ＨＬＡアレルが含まれ、それぞれの同族ペア形成がＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥスコアが０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）にランク付けされている。例えば、候補エピトープＭＥＳＬＶＰＧＦ（配列番号１２７）は、ＨＬＡ－Ｂ^＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ^＊３７：０１、及びＨＬＡ－Ｂ^＊０７：０５とペアを形成して、ＥＤＧＥスコアがそれぞれ．０１９、．０３２、及び．００８であることが予測される。したがって、配列番号１３０のエントリーは、「ＭＥＳＬＶＰＧＦ：Ｂ１８：０１Ｍ；Ｂ３７：０１Ｍ；Ｂ０７：０５Ｌ」となる。

【0462】

表Ｂ
配列表、配列番号８１９６～２６７４０を指す。ＥＤＧＥスコアが０．００１超の、所与のＨＬＡアレルと関連することが予測されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされる各候補ＭＨＣクラスＩＩエピトープが示されている。各エントリーには、予測されたＥＤＧＥスコアが０．００１超の候補エピトープ配列及び同族ＨＬＡアレルが含まれ、それぞれの同族ペア形成がＨ（ＥＤＧＥスコア＞０．１）、Ｍ（ＥＤＧＥスコアが０．０１～０．１）、及びＬ（ＥＤＧＥスコア＜０．０１）にランク付けされている。例えば、候補エピトープＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ（配列番号１２８）は、ＨＬＡ－ＤＱＡ１^＊０３：０２－Ｂ１^＊０３：０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１１：０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１^＊０５：０５－Ｂ１^＊０３：１９、及びＨＬＡ－ＤＰＡ１^＊０１：０３－Ｂ１^＊１０４：０１とペアを形成して、ＥＤＧＥスコアがそれぞれ０．００３１４５、０．００３２８、０．０４１０９７、及び０．０１１６１３であることが予測される。したがって、配列番号８２１９のエントリーは、「ＶＥＬＶＡＥＬＥＧＩ：ＤＱＡ１^＊０３：０２－Ｂ１^＊０３：０３Ｌ；ＤＲＢ１^＊１１：０２Ｌ；ＤＱＡ１^＊０５：０５－Ｂ１^＊０３：１９Ｍ；ＤＰＡ１^＊０１：０３－Ｂ１^＊１０４：０１Ｍ」となる。ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰだけは、それらのアルファ鎖及びベータ鎖で言及されている。ＨＬＡ－ＤＲは、アルファ鎖がヒト集団では一般にインバリアントであり、ＨＬＡ－ＤＲペプチドの接触領域は特にインバリアントであるため、そのベータ鎖でのみ言及される。

【0463】

表Ｃ
配列表、配列番号２６７４１～２７１７９を指す。ＥＤＧＥスコアが０．００１超の、所与のＨＬＡアレルと関連することが予測された、最適化カセット内でコードされる、スパイクタンパク質からのＭＨＣクラスＩエピトープ以外の追加のＭＨＣクラスＩエピトープが示されている。追加のエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号５９）により得られたすべての初期エピトープをＳ１とＳ２に分割して、対象とする集団の基準Ｐを計算し、本明細書に記載される最適化アルゴリズムを適用することによって決定された。

【0464】

表Ｄ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク重複ペプチドプールについての配列表、配列番号２７１８０～２７４９５を指す。各エントリーには、刺激性ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質源、ペプチドサブプール情報、及び表が含まれる。例えば、刺激性ペプチドＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ（配列番号２７１８０）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｗｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇバリアント）に由来し、サブプールＳ＿Ｗｕ＿１＿２に含められ、表Ｄに見出される。したがって、配列番号２７１８０のエントリーは、「ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣ：スパイクＷｕｈａｎ Ｄ６１４Ｇ；Ｓ＿Ｗｕ＿１＿２；表Ｄ」となる。

【0465】

表Ｅ
ＴＣＥ５でコードされる重複ペプチドプールについての配列表、配列番号２７４９６～２７６０３を指す。各エントリーには、刺激性ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質源、ペプチドサブプール情報、及び表が含まれる。例えば、刺激性ペプチドＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ（配列番号２７４９６）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質に由来し、サブプールＯＬＰ＿Ｍｅｍに含められ、表Ｅに見出される。したがって、配列番号２７４９６のエントリーは、「ＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶ：膜；ＯＬＰ＿Ｍｅｍ；表Ｅ」となる。

【0466】

表Ｆ
ＴＣＥ５でコードされる最小エピトープペプチドプールについての配列表、配列番号２７６０４～２７９３９を指す。各エントリーには、刺激性ペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質源、ペプチドサブプール情報、及び表が含まれる。例えば、刺激性ペプチドＡＬＳＫＧＶＨＦＶ（配列番号２７６０４）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ３ａタンパク質（フレーム５２～８５）に由来し、サブプールＭｉｎ＿確認済に含められ、表Ｆに見出される。したがって、配列番号２７６０４のエントリーは、「ＡＬＳＫＧＶＨＦＶ：ＯＲＦ３ａ ５２～８５；Ｍｉｎ＿確認済；表Ｆ」となる。

参考文献
１．Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ． ＆ Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｏｆｆ．Ｊ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１４－３１７５
２．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ． ＆ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，６９－７４（２０１５）．
３．Ｇｕｂｉｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａｒｔｙｏｍｏｖ，Ｍ．Ｎ．，Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ． ＆ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｔｕｍｏｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，３４１３－３４２１（２０１５）．
４．Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１２４－１２８（２０１５）．
５．Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１，２１８９－２１９９（２０１４）．
６．Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｂｒｅａｄｔｈ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，８０３－８０８（２０１５）．
７．Ｔｒａｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４，６４１－６４５（２０１４）．
８．Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｎ． ＆ Ｗｕ，Ｃ．Ｊ．－Ｙ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：２０１１０２９３６３７ － ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ ＴＵＭＯＲ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＮＥＯＡＮＴＩＧＥＮＳ．（Ａ１）．ａｔ ＜ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｆｔ１．ｕｓｐｔｏ．ｇｏｖ／ｎｅｔａｃｇｉ／ｎｐｈ－Ｐａｒｓｅｒ？Ｓｅｃｔ１＝ＰＴＯ１＆Ｓｅｃｔ２＝ＨＩＴＯＦＦ＆ｄ＝ＰＧ０１＆ｐ＝１＆ｕ＝／ｎｅｔａｈｔｍｌ／ＰＴＯ／ｓｒｃｈｎｕｍ．ｈｔｍｌ＆ｒ＝１＆ｆ＝Ｇ＆ｌ＝５０＆ｓ１＝２０１１０２９３６３７．ＰＧＮＲ．＞
９．Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｈｏｏｆ，Ｉ．，Ｌｕｎｄ，Ｏ． ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６ Ｓｕｐｐｌ ２，Ｓ３（２０１０）．
１０．Ｙａｄａｖ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｕｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ５１５，５７２－５７６（２０１４）．
１１．Ｂａｓｓａｎｉ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｐｌｅｔｓｃｈｅｒ－Ｆｒａｎｋｉｌｄ，Ｓ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｊ． ＆ Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔｒｏｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＭＣＰ １４，６５８－６７３（２０１５）．
１２．Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０，２０７－２１１（２０１５）．
１３．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ． ＆ Ｏｇａｗａ，Ｓ．Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ ５，４４５－４５９（２０１４）．
１４．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５１１，５４３－５５０（２０１４）．
１５．Ｒａｊａｓａｇｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ １２４，４５３－４６２（２０１４）．
１６．Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：０１２０２０８７０６ － ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＧＥＮＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＳＡＭＰＬＥＳ．（Ａ１）．ａｔ ＜ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｆｔ１．ｕｓｐｔｏ．ｇｏｖ／ｎｅｔａｃｇｉ／ｎｐｈ－Ｐａｒｓｅｒ？Ｓｅｃｔ１＝ＰＴＯ１＆Ｓｅｃｔ２＝ＨＩＴＯＦＦ＆ｄ＝ＰＧ０１＆ｐ＝１＆ｕ＝／ｎｅｔａｈｔｍｌ／ＰＴＯ／ｓｒｃｈｎｕｍ．ｈｔｍｌ＆ｒ＝１＆ｆ＝Ｇ＆ｌ＝５０＆ｓ１＝２０１２０２０８７０６．ＰＧＮＲ．＞
１７．Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ ｆｏｒ ＮｅｘｔＧｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ － ＩＤＴ．ａｔ ＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎｅｘｔｇｅｎ／ｔａｒｇｅｔ－ｃａｐｔｕｒｅ＞
１８．Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１１５２－１１５８（２０１５）．
１９．Ｃｉｅｓｌｉｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｅｘｏｍｅ ｃａｐｔｕｒｅ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｄｅｇｒａｄｅｄ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２５，１３７２－１３８１（２０１５）．
２０．Ｂｏｄｉｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｉｄｄｅｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｕｎｄｅｔｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ １２５，６００－６０５（２０１５）．
２１．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｅｌｋａ：ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｓｍａｌｌ－ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒ－ｎｏｒｍａｌ ｓａｍｐｌｅ ｐａｉｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．２８，１８１１－１８１７（２０１２）．
２２．Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍｐｕｒｅ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｎｃｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，２１３－２１９（２０１３）．
２３．Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｗ ｐｕｒｉｔｙ ｔｕｍｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２，ｅ１０７（２０１４）．
２４．Ｍｏｓｅ，Ｌ．Ｅ．，Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｈａｙｅｓ，Ｄ．Ｎ．，Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ． ＆ Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｓ．ＡＢＲＡ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｄｉｎｇ ｉｎｄｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ａｓｓｅｍｂｌｙ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．３０，２８１３－２８１５（２０１４）．
２５．Ｙｅ，Ｋ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｍ．Ｈ．，Ｌｏｎｇ，Ｑ．，Ａｐｗｅｉｌｅｒ，Ｒ． ＆ Ｎｉｎｇ，Ｚ．Ｐｉｎｄｅｌ：ａ ｐａｔｔｅｒｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｓｉｚｅｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．２５，２８６５－２８７１（２００９）．
２６．Ｌａｍ，Ｈ．Ｙ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ＢｒｅａｋＳｅｑ ａｎｄ ａ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，４７－５５（２０１０）．
２７．Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｅｓｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，１０２３－１０３１（２０１３）．
２８．Ｂｏｅｇｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．４，１０２（２０１２）．
２９．Ｌｉｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＡＴＨＬＡＴＥＳ：ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１，ｅ１４２（２０１３）．
３０．Ｍａｙｏｒ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ Ｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１２７１５３（２０１５）．
３１．Ｒｏｙ，Ｃ．Ｋ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．，Ｇｒａｖｅｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．，Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ． ＆ Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｊ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ＲＮＡ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ＤＮＡ－ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ．ｅＬｉｆｅ ４，（２０１５）．
３２．Ｓｏｎｇ，Ｌ． ＆ Ｆｌｏｒｅａ，Ｌ．ＣＬＡＳＳ：ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅａｄｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４ Ｓｕｐｐｌ ５，Ｓ１４（２０１３）．
３３．Ｍａｒｅｔｔｙ，Ｌ．，Ｓｉｂｂｅｓｅｎ，Ｊ．Ａ． ＆ Ｋｒｏｇｈ，Ａ．Ｂａｙｅｓｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５０１（２０１４）．
３４．Ｐｅｒｔｅａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ ｅｎａｂｌｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅａｄｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，２９０－２９５（２０１５）．
３５．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｈ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ． ＆ Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ－Ｓｅｑ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ３５５
３６．Ｖｉｔｔｉｎｇ－Ｓｅｅｒｕｐ，Ｋ．，Ｐｏｒｓｅ，Ｂ．Ｔ．，Ｓａｎｄｅｌｉｎ，Ａ． ＆ Ｗａａｇｅ，Ｊ．ｓｐｌｉｃｅＲ：ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５，８１（２０１４）．
３７．Ｒｉｖａｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，６６６－６６９（２０１５）．
３８．Ｓｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ａ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｍａｄｅｏｙ，Ｊ．，Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｊ． ＆ Ａｋｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２１，１７２８－１７３７（２０１１）．
３９．Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．，Ｐｙｌ，Ｐ．Ｔ． ＆ Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．ＨＴＳｅｑ－－ａ Ｐｙｔｈｏｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｏ ｗｏｒｋ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．３１，１６６－１６９（２０１５）．
４０．Ｆｕｒｎｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＳＦ３Ｂ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｕｖｅａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１３－０３３０
４１．Ｚｈｏｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１４－２９３０
４２．Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＳＦ３Ｂ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２３５，５７１－５８０（２０１５）．
４３．Ｃａｒｉｔｈｅｒｓ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ：Ｔｈｅ ＧＴＥｘ Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ １３，３１１－３１９（２０１５）．
４４．Ｘｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ＣｏＭＰＡＳＳ：ａ ｄｕａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａｓｅｔｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ８９４４５（２０１４）．
４５．Ａｎｄｒｅａｔｔａ，Ｍ． ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｇａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｖ６３９
４６．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｂｕｕｓ，Ｓ． ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂ － ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ－Ｉ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ；ｉｍｐａｃｔｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１，１８－２６（２０１４）．
４７．Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ，ＴＡＰ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，２２９５－２３０３（２００５）．
４８．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｌｕｎｄ，Ｏ． ＆ Ｋｅｓｍｉｒ，Ｃ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５７，３３－４１（２００５）．
４９．Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｆ．－Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１，Ｍ１１１．０１１４２９－Ｍ１１１．０１１４２９（２０１２）．
５０．Ｄｕａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｒｕｌｅｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１１，２２３１－２２４８（２０１４）．
５１．Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：９７８０８１５３４５３１２：Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ ＠ Ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍ．ａｔ ＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍ／Ｊａｎｅｗａｙｓ－Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ－Ｋｅｎｎｅｔｈ－Ｍｕｒｐｈｙ／ｄｐ／０８１５３４５３１３＞
５２．Ｃａｌｉｓ，Ｊ．Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９，ｅ１００３２６６（２０１３）．
５３．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，２５６－２５９（２０１４）
５４．Ｗａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６，１０９０－１０９８（２０１２）．
５５．Ｈｕｎｔ ＤＦ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＲＡ，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ Ｊ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｍｉｃｈｅｌ Ｈ，Ｓｅｖｉｌｉｒ Ｎ，Ｃｏｘ ＡＬ，Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＶＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＨＬＡ－Ａ２．１ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２．２５５：１２６１－１２６３．
５６．Ｚａｒｌｉｎｇ ＡＬ，Ｐｏｌｅｆｒｏｎｅ ＪＭ，Ｅｖａｎｓ ＡＭ，Ｍｉｋｅｓｈ ＬＭ，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ Ｊ，Ｌｅｗｉｓ ＳＴ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＶＨ，Ｈｕｎｔ ＤＦ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｏｃｔ ３；１０３（４０）：１４８８９－９４．
５７．Ｂａｓｓａｎｉ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｐｌｅｔｓｃｈｅｒ－Ｆｒａｎｋｉｌｄ Ｓ，Ｊｅｎｓｅｎ ＬＪ，Ｍａｎｎ Ｍ．Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔｒｏｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１５ Ｍａｒ；１４（３）：６５８－７３．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１４．０４２８１２．
５８．Ａｂｅｌｉｎ ＪＧ，Ｔｒａｎｔｈａｍ ＰＤ，Ｐｅｎｎｙ ＳＡ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＡＭ，Ｗａｒｄ ＳＴ，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ ＷＨ，Ｃｏｂｂｏｌｄ Ｍ，Ｂａｉ ＤＬ，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ Ｊ，Ｈｕｎｔ ＤＦ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＩＭＡＣ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＨＬＡ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５ Ｓｅｐ；１０（９）：１３０８－１８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０８６．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｕｇ ６
５９．Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ ＣＪ，Ｂｏｄｍｅｒ ＷＦ，Ｂｒｏｗｎ Ｇ，Ｇａｌｆｒｅ Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＦ，Ｚｉｅｇｌｅｒ Ａ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，ＨＬＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ－ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ．１９７８ Ｍａｙ；１４（１）：９－２０．
６０．Ｇｏｌｄｍａｎ ＪＭ，Ｈｉｂｂｉｎ Ｊ，Ｋｅａｒｎｅｙ Ｌ，Ｏｒｃｈａｒｄ Ｋ，Ｔｈ’ｎｇ ＫＨ．ＨＬＡ－ＤＲ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８２ Ｎｏｖ；５２（３）：４１１－２０．
６１．Ｅｎｇ ＪＫ，Ｊａｈａｎ ＴＡ，Ｈｏｏｐｍａｎｎ ＭＲ．Ｃｏｍｅｔ：ａｎ ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ ＭＳ／ＭＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１３ Ｊａｎ；１３（１）：２２－４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｍｉｃ．２０１２００４３９．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｄｅｃ ４．
６２．Ｅｎｇ ＪＫ，Ｈｏｏｐｍａｎｎ ＭＲ，Ｊａｈａｎ ＴＡ，Ｅｇｅｒｔｓｏｎ ＪＤ，Ｎｏｂｌｅ ＷＳ，ＭａｃＣｏｓｓ ＭＪ．Ａ ｄｅｅｐｅｒ ｌｏｏｋ ｉｎｔｏ Ｃｏｍｅｔ－－ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１５ Ｎｏｖ；２６（１１）：１８６５－７４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３３６１－０１５－１１７９－ｘ．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｎ ２７．
６３．Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ，Ｊｅｓｓｅ Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ，Ｊａｓｏｎ Ｗｅｓｔｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｔａｆｆｏｒｄ Ｎｏｂｌｅ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．ＭａｃＣｏｓｓ．Ｓｅｍｉ－ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｄａｔａｓｅｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：９２３ － ９２５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００７
６４．Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ，Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｓｔｏｒｅｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．ＭａｃＣｏｓｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｔａｆｆｏｒｄ Ｎｏｂｌｅ．Ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７（１）：２９－３４，Ｊａｎｕａｒｙ ２００８
６５．Ｌｕｋａｓ Ｋａｌｌ，Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｓｔｏｒｅｙ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｔａｆｆｏｒｄ Ｎｏｂｌｅ．Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２４（１６）：ｉ４２－ｉ４８，Ａｕｇｕｓｔ ２００８
６６．Ｋｉｎｎｅｙ ＲＭ，ＢＪ Ｊｏｈｎｓｏｎ ，ＶＬ Ｂｒｏｗｎ ，ＤＷ Ｔｒｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ２６ Ｓ ｍＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｔｒｉｎｉｄａｄ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｄｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２（２），４００－４１３．１９８６ Ｊｕｌ ３０．
６７．Ｊｉｌｌ Ｅ Ｓｌａｎｓｋｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｑｕｅ Ｍ Ｒａｔｔｉｓ，Ｌｉｓａ Ｆ Ｂｏｙｄ，Ｔａｒｅｋ Ｆａｈｍｙ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｍ Ｊａｆｆｅｅ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐ Ｓｃｈｎｅｃｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄｒｅｗ Ｍ Ｐａｒｄｏｌｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ ｔｈａｔ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｔｈｅ ＭＨＣ－Ｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＣＲ Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｉｓｓｕｅ ４，１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００，Ｐａｇｅｓ ５２９－５３８．
６８．Ａ Ｙ Ｈｕａｎｇ，Ｐ Ｈ Ｇｕｌｄｅｎ，Ａ Ｓ Ｗｏｏｄｓ，Ｍ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ Ｄ Ｔｏｎｇ，Ｗ Ｗａｎｇ，Ｖ Ｈ Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｇ Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ，Ｒ Ｃｏｔｔｅｒ，Ｄ Ｈｕｎｔ，Ｄ Ｍ Ｐａｒｄｏｌｌ，ａｎｄ Ｅ Ｍ Ｊａｆｆｅｅ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｄｅｒｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；９３（１８）：９７３０－９７３５，１９９６ Ｓｅｐ ３．
６９．ＪＯＨＮＳＯＮ，ＢＡＲＢＡＲＡ Ｊ．Ｂ．，ＲＩＣＨＡＲＤ Ｍ．ＫＩＮＮＥＹ，ＣＲＹＳＴＬＥ Ｌ．ＫＯＳＴ ＡＮＤ ＤＥＮＮＩＳ Ｗ．ＴＲＥＮＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｄｅｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６７：１９５１－１９６０，１９８６．
７０．Ａａｒｎｏｕｄｓｅ，Ｃ．Ａ．，Ｋｒｕｓｅ，Ｍ．，Ｋｏｎｏｐｉｔｚｋｙ，Ｒ．，Ｂｒｏｕｗｅｎｓｔｉｊｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｉｅｒ，Ｐ．Ｉ．（２００２）．ＴＣＲ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｊｕｒｋａｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９，７－１３．
７１．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．，Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｓ．，Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，Ｏｓｅｒｏｆｆ，Ｃ．，Ｍａｅｗａｌ，Ａ．，Ｓｎｏｋｅ，Ｋ．，Ｓｅｒｒａ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｕｂｏ，Ｒ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｅｔｔｅ，Ａ．（１９９４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｏｔｅｎｃｙ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＲ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｈｅｌｐｅｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＤＲ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １，７５１－７６１．
７２．Ｂａｎｕ，Ｎ．，Ｃｈｉａ，Ａ．，Ｈｏ，Ｚ．Ｚ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．Ｔ．，Ｐａｒａｖａｓｉｖａｍ，Ｋ．，Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ，Ｇ．Ｍ．，Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．（２０１４）．Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４，４１６６．
７３．Ｃｏｒｎｅｔ，Ｓ．，Ｍｉｃｏｎｎｅｔ，Ｉ．，Ｍｅｎｅｚ，Ｊ．，Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｋｏｓｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｋ．（２００６）．Ｏｐｔｉｍａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４，２１０２－２１０９．
７４．Ｄｅｐｌａ，Ｅ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ａａ，Ａ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｒｉｍｉ，Ｃ．，Ａｌｌｏｓｅｒｙ，Ｋ．，ｄｅ Ｂｒａｂａｎｄｅｒｅ，Ｖ．，Ｋｒａｋｏｖｅｒ，Ｊ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．，Ｐｏｗｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２，４３５－４５０．
７５．Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｇ．Ｙ．，Ｆｉｋｅｓ，Ｊ．，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｂ．，Ｃｒｉｍｉ，Ｃ．，Ｑｉｎ，Ｍ．，ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ，Ｍ．Ｆ．，Ｏｓｅｒｏｆｆ，Ｃ．，Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｃ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｎｉｇｅｎｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＬＡ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２，３９１５－３９２５．
７６．Ｊａｎｅｔｚｋｉ，Ｓ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｌ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．，Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｅｌｔｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ Ｈｏｏｓ，Ａ．（２０１５）．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｉｓｐｏｔ ａｓｓａｙｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １０，１０９８－１１１５．
７７．Ｌｙｏｎｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．，Ｂｒａｓｉｃ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｉ．（２００６）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６，１１４５５－１１４６１．
７８．Ｎａｇａｉ，Ｋ．，Ｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．，Ａｎ，Ｊ．，Ｓｈｉｒａｋａｔａ，Ｔ．，Ｍｉｎｅｎｏ，Ｊ．，Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｓｈｉｋｕ，Ｈ．，Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｏｓｔｉｃｋ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ Ａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｄｉｓｐｌａｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ １１９，３６８－３７６．
７９．Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｔａｎ，Ａ．，Ｔｅｒｍｉｊｔｅｌｅｎ，Ａ．，Ｄｅｍｏｔｚ，Ｓ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．（１９８９）．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９，２２３７－２２４２．
８０．Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．，Ｍａｒｃｈｅｓｉｎｉ，Ｄ．，Ｆｕｒｚｅ，Ｊ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈｅｓｎｕｔ，Ｒ．Ｗ．（１９９１）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ－ｍｏｕｓｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３，１００７－１０１５．
８１．Ｙａｃｈｉ，Ｐ．Ｐ．，Ａｍｐｕｄｉａ，Ｊ．，Ｚａｌ，Ｔ．，ａｎｄ Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ，Ｎ．Ｒ．Ｊ．（２００６）．Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎｄｕｃｅ ｄｅｌａｙｅｄ ＣＤ８－Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ－－ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＣＤ８ ｉｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｌｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２５，２０３－２１１．
８２．Ｐｕｓｈｋｏ Ｐ，Ｐａｒｋｅｒ Ｍ，Ｌｕｄｗｉｇ ＧＶ，Ｄａｖｉｓ ＮＬ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＲＥ，Ｓｍｉｔｈ ＪＦ．Ｒｅｐｌｉｃｏｎ－ｈｅｌｐｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９７ Ｄｅｃ ２２；２３９（２）：３８９－４０１．
８３．Ｓｔｒａｕｓｓ，ＪＨ ａｎｄ Ｅ Ｇ Ｓｔｒａｕｓｓ．Ｔｈｅ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ：ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９４ Ｓｅｐ；５８（３）：４９１－５６２．
８４．Ｒｈｅｍｅ Ｃ，Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ ＭＵ，Ｇｒａｎｄｇｉｒａｒｄ Ｄ．Ａｌｐｈａｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５ Ｊａｎ；９０（１）：４５－５２．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｎｏｖ １２．
８５．Ｒｉｌｅｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋ．ＩＩ，ａｎｄ Ｗｉｌｆｒｅｄ Ｖｅｒｍｅｒｒｉｓ．Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１７，７（５），９４．
８６．Ｆｒｏｌｏｖ Ｉ，Ｈａｒｄｙ Ｒ，Ｒｉｃｅ ＣＭ．Ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ５’ ｅｎｄ ｏｆ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍｉｎｕｓ－ ａｎｄ ｐｌｕｓ－ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＲＮＡ．２００１ Ｎｏｖ；７（１１）：１６３８－５１．
８７．Ｊｏｓｅ Ｊ，Ｓｎｙｄｅｒ ＪＥ，Ｋｕｈｎ ＲＪ．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９ Ｓｅｐ；４（７）：８３７－５６．
８８．Ｂｏ Ｌｉ ａｎｄ Ｃ．ｏｌｉｎ Ｎ．Ｄｅｗｅｙ．ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｆｅ ｇｅｎｏｍｅ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１２：３２３，Ａｕｇｕｓｔ ２０１１
８９．Ｈｉｌｌａｒｙ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｔａｒｉｑ Ｄａｏｕｄａ，Ｄｉａｎａ Ｐａｏｌａ Ｇｒａｎａｄｏｓ，Ｃｈａｎｔａｌ Ｄｕｒｅｔｔｅ，Ｅｒｉｃ Ｂｏｎｎｅｉｌ，Ｍａｔｈｉｅｕ Ｃｏｕｒｃｅｌｌｅｓ，Ａｎｊａ Ｒｏｄｅｎｂｒｏｃｋ，Ｊｅａｎ－Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｌａｖｅｒｄｕｒｅ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｃｏｔｅ，Ｓｙｌｖｉｅ Ｍａｄｅｒ，Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｐｉｅｒｒｅ Ｔｈｉｂａｕｌｔ，ａｎｄ Ｃｌａｕｄｅ Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ．ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１６，
９０．Ｊｕｌｉａｎｅ Ｌｉｅｐｅ，Ｆａｂｉｏ Ｍａｒｉｎｏ，Ｊｏｈｎ Ｓｉｄｎｅｙ，Ａｎｉｔａ Ｊｅｋｏ，Ｄａｎｉｅｌ Ｅ．Ｂｕｎｔｉｎｇ，Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｓｅｔｔｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｍ．Ｋｌｏｅｔｚｅｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｐ．Ｈ．Ｓｔｕｍｐｆ，Ａｌｂｅｒｔ Ｊ．Ｒ．Ｈｅｃｋ，Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｍｉｓｈｔｏ．Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６．
９１．Ｍｏｍｍｅｎ ＧＰ．，Ｍａｒｉｎｏ，Ｆ．，Ｍｅｉｒｉｎｇ ＨＤ．，Ｐｏｅｌｅｎ，ＭＣ．，ｖａｎ Ｇａａｎｓ－ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ，ＪＡ．，Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｓ．，Ｈｅｃｋ ＡＪ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｅｌｓ ＣＡ．Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ（ＨＬＡ－ＤＲ） Ｌｉｇａｎｄｏｍｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｓ Ｖｉａ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５（４）：１４１２－１４２３，Ａｐｒｉｌ ２０１６．
９２．Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｍａｔｈｉａｓ Ｖｏｒｍｅｈｒ，Ｎｉｅｌｓ ｖａｎ ｄｅ Ｒｏｅｍｅｒ， Ｍｕｓｔａｆａ Ｄｉｋｅｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌｏｗｅｒ，Ｊａｎ Ｄｉｅｋｍａｎｎ，Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｂｏｅｇｅｌ，Ｂａｒｂａｒａ Ｓｃｈｒｏｒｓ，Ｆｕｌｖｉａ Ｖａｓｃｏｔｔｏ，Ｊｏｈｎ Ｃ．Ｃａｓｔｌｅ，Ａｒｂｅｌ Ｄ．Ｔａｄｍｏｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｈｕｂｅｒ，Ｏｚｌｅｍ Ｔｕｒｅｃｉ，ａｎｄ Ｕｇｕｒ Ｓａｈｉｎ．Ｍｕｔａｎｔ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｄｒｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃａｎｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６，Ａｐｒｉｌ ２０１５．
９３．Ｔｒａｎ Ｅ．，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ Ｓ．，Ｇｒｏｓ Ａ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐ．Ｆ．，Ｌｕ Ｙ．Ｃ．，Ｄｕｄｌｅｙ Ｍ．Ｅ．，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ Ｊ．Ｒ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ Ｒ．Ｐ．，Ｈｏｇａｎ Ｋ．，Ｈｉｎｒｉｃｈｓ Ｃ．Ｓ．，Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ Ｍ．Ｒ．，Ｙａｎｇ Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（６１８４） ６４１－６４５，Ｍａｙ ２０１４．
９４．Ａｎｄｒｅａｔｔａ Ｍ．，Ｋａｒｏｓｉｅｎｅ Ｅ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｍ．，Ｓｔｒｙｈｎ Ａ．，Ｂｕｕｓ Ｓ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｍ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｐａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６７（１１－１２） ６４１－６５０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５．
９５．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｌｕｎｄ，Ｏ．ＮＮ－ａｌｉｇｎ．Ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ－ｂａｓｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０：２９６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００９．
９６．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｌｕｎｄ，Ｏ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ＳＭＭ－ａｌｉｇｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：２３８，Ｊｕｌｙ ２００７．
９７．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ＰＥＡＫＳ ＤＢ：ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１１（４）：１－８．１／２／２０１２．
９８．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋａｍｉｌｌａ Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ，ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｍ．１２８８９．
９９．Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．，Ｈｅｌｍａｎ，Ｅ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．，Ｚａｃｋ，Ｔ．，Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．，Ｏｎｏｆｒｉｏ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｗ．，Ｗｅｉｒ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，４１３－４２１
１００．ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｒ．，Ｈｉｌｅｙ，Ｃ．Ｔ．，Ｒｏｗａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｔ．Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｂｉｒｋｂａｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｖｅｅｒｉａｈ，Ｓ．，Ｖａｎ Ｌｏｏ，Ｐ．，Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＨＬＡ Ｌｏｓｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｓｃａｐｅ ｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １７１，１２５９－１２７１．ｅ１１．
１０１．Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｏｎｅｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｒａｊａｓａｇｉ，Ｍ．，Ｔｉａｏ，Ｇ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｄｅｌｌａｇａｔｔａ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｔｅｅｌｍａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１１５２－１１５８．
１０２．Ｖａｎ Ｌｏｏ，Ｐ．，Ｎｏｒｄｇａｒｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｉｎｇｊａｒｄｅ，Ｏ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｎｅｓ，Ｈ．Ｇ．，Ｒｙｅ，Ｉ．Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｗｅｉｇｍａｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ａ．，Ｎａｕｍｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，１６９１０－１６９１５．
１０３．Ｖａｎ Ｌｏｏ，Ｐ．，Ｎｏｒｄｇａｒｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｉｎｇｊａｒｄｅ，Ｏ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｎｅｓ，Ｈ．Ｇ．，Ｒｙｅ，Ｉ．Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｗｅｉｇｍａｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ａ．，Ｎａｕｍｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，１６９１０－１６９１５．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2024503108000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-10-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2024503108000001.app

【国際調査報告】