特表 2024-503118 安定性および発現が改良されたポリペプチド複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-24

(54)【発明の名称】安定性および発現が改良されたポリペプチド複合体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240117BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240117BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240117BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240117BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240117BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240117BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240117BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240117BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20240117BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K14/725

C07K16/28

C07K16/24

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K39/395 N

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023543138

(86)(22)【出願日】2022-01-18

(85)【翻訳文提出日】2023-09-14

(86)【国際出願番号】 CN2022072592

(87)【国際公開番号】W WO2022156687

(87)【国際公開日】2022-07-28

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/072601

(32)【優先日】2021-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518330176

【氏名又は名称】ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】シュイ チエンチン

(72)【発明者】

【氏名】ワン ショアン

(72)【発明者】

【氏名】クー チーチエ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045BA70

4H045BA71

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、改変されたＴＣＲ定常領域にそれぞれ融合された重鎖および軽鎖の抗体可変領域を含むポリペプチド複合体を提供し、ここで該改変されたＴＣＲ定常領域は、該ポリペプチド複合体が改良された安定性および／または発現レベルを有するように、該ポリペプチド複合体を安定させるための少なくとも一つの変異を含む。また、ポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分および第二の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合ポリペプチド複合体、該ポリペプチド複合体または該二重特異性抗原結合ポリペプチド複合体の製造方法、該ポリペプチド複合体または該二重特異性抗原結合ポリペプチド複合体を使用して疾患または障害を治療する方法、該ポリペプチド複合体および／または該二重特異性抗原結合ポリペプチド複合体をコードするポリペプチド、該ポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞、該ポリペプチド複合体および／または該二重特異性抗原結合性ポリペプチド複合体を含む組成物および医薬組成物も本明細書で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第一の抗原結合部分および第二の抗原結合部分を含むポリペプチド複合体であって、ここで：
該第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで：
Ｃ１は操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＣＢｅｔａまたは操作されたＣＡｌｐｈａを含み、
Ｃ２は操作されたＣＡｌｐｈａまたは操作されたＣＢｅｔａを含み、
Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は該ポリペプチド複合体を安定化することができ、
該操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａは、該操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａのＣ末端領域、または操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａのＣ末端に近接している一つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの変異をさらに含み、ここで該少なくとも一つの変異は、操作されたＣＡｌｐｈａの安定性、操作されたＣＢｅｔａの安定性、および／または操作されたＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａの界面安定性を改善する、および
該第一の抗体は第一の抗原特異性を有する；および
該第二の抗原結合部分は第二の抗原特異性を有する、
ポリペプチド複合体。

【請求項2】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐから選択される少なくとも一つの変異残基を含む、および／または前記操作されたＣＢｅｔａが、Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａから選択される少なくとも一つの変異残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項3】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａが、以下から選択される、一つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成するための一つまたは複数の変異残基を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド複合体： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０Ｃ、およびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【請求項4】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、そのＣ末端に「ＦＦＰＳＰＥＳＳ」（配列番号９）または「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の欠失を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項5】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項6】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項7】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび前記操作されたＣＢｅｔａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異Ｓ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３Ｔ、およびＣＢｅｔａ上の変異Ｅ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄを含む、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド複合体。

【請求項8】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異残基Ｐ８ＣおよびＤ８６Ｃ、ならびにＣＡｌｐｈａのＣ末端の４アミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む、請求項１、３、および４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項9】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび前記操作されたＣＢｅｔａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異残基Ｐ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上の変異残基Ａ１８Ｃ、ならびにＣＡｌｐｈａのＣ末端の４アミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む、請求項１、３、および４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項10】

前記操作されたＣ２が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含み、前記操作されたＣ１が、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項11】

前記操作されたＣ１が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含み、前記操作されたＣ２が、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項12】

前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体： １０／１１、１２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。

【請求項13】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体： １２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。

【請求項14】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号４２および４３の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号４２および４３の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項15】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号５０および５１の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号５０および５１の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項16】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号７９および４３の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号７９および４３の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項17】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号８０および５１の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号８０および５１の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項18】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一つが、外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原、または腫瘍抗原を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項19】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を対象とし、他方が腫瘍関連抗原を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項20】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＰＤ－Ｌ１を対象とし、他方が４－１ＢＢを対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項21】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＨＥＲ２ Ｄ２を対象とし、他方がＨＥＲ２ Ｄ４を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項22】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＩＬ－１７を対象とし、他方がＩＬ－２０を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項23】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＩＬ－４を対象とし、他方がＩＬ－１３を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項24】

部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）に結合された、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む、コンジュゲート。

【請求項25】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項26】

請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。

【請求項27】

請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２６に記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。

【請求項28】

前記ポリペプチド複合体が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を発現する方法であって、該宿主細胞が、前記ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含む、方法。

【請求項29】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を産生する方法であって、以下を含む、方法：
ａ） 宿主細胞に以下を導入する工程：
Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、
ここで：
Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができる、および
前記第一の抗体は第一の抗原特異性を有する、
ｂ） 前記宿主細胞に前記ポリペプチド複合体を発現させる工程。

【請求項30】

以下の工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法：
前記第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する、第二の抗原結合部分をコードする一つまたは複数の追加のポリヌクレオチドを
前記宿主細胞に導入する工程。

【請求項31】

前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項２９～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む組成物。

【請求項33】

請求項１～２３のいずれかに記載のポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項34】

治療を必要とする対象の状態を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を対象に投与することを含む、方法。

【請求項35】

前記第一の抗原および前記第二の抗原が両方とも調節される場合、前記状態を軽減、除去、治療、または予防することができる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む一つまたは複数の容器を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、２０２１年１月１９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７２６０１号の利益を主張する。

【0002】

発明の分野
本開示は、一般に、改変されたＴＣＲ定常領域に融合された抗体可変領域を含むポリペプチド複合体、およびそれを含む多重特異性ポリペプチド複合体、ならびにそれらの調製方法および使用に関する。

【背景技術】

【0003】

二重特異性抗体等の多重特異性抗体は、新規のカテゴリーの治療薬として成長しつつある。２つの異なる標的または２つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体のユニークな能力により、通常の抗体ではアクセスできない多くの新規の作用機序（ＭＯＡ）が可能になった。これらの新規のＭＯＡを臨床開発に適用するために、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に開示されているように、２つの親抗体を所望の価数および機能を備えた二重特異性分子に構築することができる、ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）という二重特異性プラットフォームを開発した。

【0004】

たとえば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に開示されているように、ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）プラットフォームは、抗体ＦａｂのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを置き換えるために特定のＴＣＲ定常領域（ＣＢｅｔａ／ＣＡｌｐｈａ）を採用した。キメラＦａｂは、通常の抗体Ｆａｂの軽鎖および重鎖の界面と直交するユニークな軽鎖および重鎖の界面を有する。キメラＦａｂと通常のＦａｂを異なるフォーマットで構築することにより、異なる構造および価数を有する様々な二重特異性分子を作成することができる。

【0005】

所望の発現レベル、安定性、および／または抗原に対する親和性を有する二重特異性等の多重特異性の分子を設計することが大いに必要とされている。本開示は、たとえば、ＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａのＣ末端領域および／またはＣ末端に近接している残基等の操作を通じて、所望の安定性および／またはタンパク質発現レベルを有する特定の多重特異性、たとえば二重特異性のポリペプチド複合体について記載する。

【発明の概要】

【0006】

一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体を提供し、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は該二量体を安定化することができ、該第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、ここでＣ１は操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＣＢｅｔａを含み、かつＣ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含む、またはＣ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、かつＣ２は操作されたＣＢｅｔａを含む。

【0007】

一態様では、本開示は、第二の抗原結合部分と結合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体を提供し、ここで該第一の抗原結合部分は、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異残基とＣ２に含まれる第二の変異残基との間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができ、ここでＣ１は操作されたＣＢｅｔａを含み、Ｃ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含み；または、Ｃ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、Ｃ２は操作されたＣＢｅｔａを含む、およびここで該第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、該第二の抗原結合部分は該第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する。

【0008】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、ＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端領域、またはＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端に近接している残基に少なくとも一つの変異を含む。一部の実施形態では、上記少なくとも一つの変異は、そのような変異のないＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａと比較して、ＣＡｌｐｈａの安定性、ＣＢｅｔａの安定性、および／もしくはＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａ界面安定性を改善する。一部の実施形態では、少なくとも一つの変異を有する開示されたポリペプチド複合体は、そのような変異のないポリペプチド複合体と比較して、発現レベル、安定性、および／または抗原に対する親和性が改善している。

【0009】

一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の二重特異性断片を提供する。一態様では、本開示は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合した、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、または本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含むコンジュゲートを本明細書に提供する。

【0010】

一態様では、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、または本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体をコードする単離されたポリヌクレオチドを本明細書に提供する。一態様では、本開示は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む単離されたベクターを本明細書で提供する。一態様では、本開示は、本明細書に提供される単離されたポリヌクレオチドまたは本明細書に提供される単離されたベクターを含む宿主細胞を本明細書に提供する。一態様では、本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を発現する方法であって、本明細書で提供される宿主細胞を、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体が発現される条件下で培養することを含む方法を提供する。

【0011】

一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を産生する方法であって、 ａ） 宿主細胞に、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、およびＮ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを導入する工程、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合はＣ１およびＣ２の二量体を安定化することができる、および上記第一の抗体は第一の抗原特異性を有する； ｂ） 上記宿主細胞に前記ポリペプチド複合体を発現させる工程を含む、方法を提供する。

【0012】

一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を産生する方法であって、 ａ） 宿主細胞に、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、第二の抗体のＶＨを含む第三のポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、および第二の抗体のＶＬを含む第四のポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチドを導入する工程、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができる、および上記第一の抗体は第一の抗原特異性を有する、および上記第二の抗体は第二の抗原特異性を有する； ｂ） 上記宿主細胞に二重特異性のポリペプチド複合体を発現させる工程を含む、方法を提供する。

【0013】

一態様では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を産生する方法であって、 ａ） 宿主細胞に、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第二の抗体の第二の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ１）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第二の抗体の第二の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、第一の抗体のＶＬを含む第三のポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、および上記第一の抗体は第一の抗原特異性を有する、および上記第二の抗体は第二の抗原特異性を有する； ｂ） 上記宿主細胞に二重特異性のポリペプチド複合体を発現させる工程を含む、方法を提供する。

【0014】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を産生する方法は、ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む。

【0015】

一態様では、本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体、または本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を含む組成物を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体、または本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を本明細書に提供する。

【0016】

一態様では、本開示は、治療を必要とする対象の状態を治療する方法であって、治療有効量の本明細書で提供されるポリペプチド複合体、または本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。特定の実施形態では、第一の抗原および第二の抗原が両方とも調節される場合、該状態が軽減、除去、治療、または予防され得る。

【0017】

特定の実施形態では、非天然鎖間結合は、Ｃ１に含まれる第一の変異残基とＣ２に含まれる第二の変異残基との間に形成される。特定の実施形態では、第一および第二の変異残基の少なくとも一つはシステイン残基である。特定の実施形態では、非天然鎖間結合はジスルフィド結合である。特定の実施形態では、第一の変異残基はＣ１の接触界面（ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）内に含まれ、および／または第二の変異残基はＣ２の接触界面内に含まれる。特定の実施形態では、少なくとも一つの天然システイン残基がＣ１および／またはＣ２に存在しないか、または存在する。特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａのＣ７４位の天然システイン残基は、存在しないか、または存在する。特定の実施形態では、天然のＣ７４はＣＢｅｔａには存在しない。特定の実施形態では、天然のジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、およびＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）は、存在してもしなくてもよい。

【0018】

特定の実施形態では、少なくとも一つの天然のＮ－グリコシル化部位がＣ１および／またはＣ２に存在しないか、または存在する。特定の実施形態では、天然のＮ－グリコシル化部位はＣ１および／またはＣ２には存在しない。

【0019】

特定の実施形態では、本明細書に開示される二量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の非天然鎖間結合を含む。特定の実施形態では、非天然鎖間結合の少なくとも一つはジスルフィド結合である。 特定の実施形態では、二量体は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上のジスルフィド結合を含む。

【0020】

特定の実施形態では、第一のＶＨは第一の結合ドメインでＣ１に作動可能に連結され、第一のＶＬは第二の連結ドメインでＣ２に作動可能に連結される。特定の実施形態では、第一のＶＨは、コネクタを介して第一の結合ドメインでＣ１に結合し、第一のＶＬは、コネクタを介して第二の結合ドメインでＣ２に結合する。

【0021】

特定の実施形態では、第一および／または第二の連結ドメインは、適切な長さ（たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基）の抗体Ｖ／Ｃ結合のＣ末端断片、および適切な長さ（たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基）のＴＣＲ Ｖ／Ｃ結合のＮ末端断片を含む。

【0022】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、アミノ酸残基９～３５、５２～６６、７１～８６、および１２２～１２７からなる群から選択される接触界面内に変異システイン残基等の変異残基を含む；および／または操作されたＣＡｌｐｈａは、アミノ酸残基６～２９、３７～６７、および８６～９５からなる群から選択される接触界面内に変異システイン残基等の変異残基を含む。

【0023】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、変異残基Ｋ９Ｅを含む。

【0024】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、Ｓ５６Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｅ１４Ｃ、Ｌ６２Ｃ、Ｄ５８Ｃ、Ｓ７６Ｃ、およびＲ７８Ｃから選択される位置でアミノ酸残基を置換する変異システイン残基を含む、および／または操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｔ４９Ｃ、Ｙ１１Ｃ、Ｌ１３Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｖ２３Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｔ４６Ｃ、Ｌ５１Ｃ、およびＳ６２Ｃから選択される位置でアミノ酸残基を置換する変異システイン残基を含む。

【0025】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａおよび操作されたＣＡｌｐｈａは、以下からなる群から選択される一対のアミノ酸残基を置換する一対の変異システイン残基を含み、ここでシステイン残基の対は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる： ＣＢｅｔａにおけるＳ１６ＣおよびＣＡｌｐｈａにおけるＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａにおけるＦ１３ＣおよびＣＡｌｐｈａにおけるＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ１６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａのＶ１２ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａのＥ１４ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａのＦ１３ＣおよびＣＡｌｐｈａのＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａのＬ６２ＣおよびＣＡｌｐｈａのＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａのＤ５８ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ７６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ６２Ｃ、およびＣＢｅｔａのＲ７８ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ６２Ｃ。

【0026】

特定の実施形態では、少なくとも一つの天然グリコシル化部位が、操作されたＣＢｅｔａおよび／または操作されたＣＡｌｐｈａに存在しないか、または存在する。特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａにおける天然グリコシル化部位はＮ６９であり、および／または操作されたＣＡｌｐｈａにおける天然グリコシル化部位は、Ｎ３４、Ｎ６８、Ｎ７９、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0027】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、天然ＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１～１１７を包含するＦＧループおよび／または天然ＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６～７１を包含するＤＥループを欠失しているか、または保持している。

【0028】

特定の実施形態では、第一のポリペプチドは、抗体ＣＨ２ドメインおよび／または抗体ＣＨ３ドメインをさらに含む。

【0029】

特定の実施形態では、第一の抗原特異性および第二の抗原特異性は、２つの異なる抗原を対象とするか、または１つの抗原上の２つの異なるエピトープを対象とする。

【0030】

特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＣＴＬＡ－４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＣＴＬＡ－４に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は４－１ＢＢに結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分は４－１ＢＢに結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第一および第二の抗原結合部分は、ＨＥＲ２の２つの別個のドメインにそれぞれ結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ２に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ４に結合する。 特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ２に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－１７に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－２０に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－２０に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－１７に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－１３に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－１３に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－４に結合する。

【0031】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の結合は、コネクタ、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、もしくは疎水性－親水性相互作用、またはそれらの組み合わせを介する。

【0032】

特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は、第二の抗原特異性を有する第二の抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＦａｂを含む。特定の実施形態では、第一の抗原特異性および第二の抗原特異性は、２つの異なる抗原を対象とするか、または１つの抗原上の２つの異なるエピトープを対象とする。

【0033】

特定の実施形態では、第一および第二の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を対象とし、他方は、腫瘍関連抗原を対象とする。特定の実施形態では、第一および第二の抗原特異性の一方はＣＤ３を対象とし、他方は腫瘍関連抗原を対象とする。特定の実施形態では、第一および第二の抗原特異性の一方はＣＤ３を対象とし、他方はＣＤ１９を対象とする。

【0034】

特定の実施形態では、第一の抗原結合部分は第一の二量体化ドメインをさらに含み、第二の抗原結合部分は第二の二量体化ドメインをさらに含み、ここで第一および第二の二量体化ドメインは結合している。

【0035】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインの結合は、コネクタ、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、もしくは疎水性－親水性相互作用、またはそれらの組み合わせを介する。

【0036】

特定の実施形態では、第一および／または第二の二量体化ドメインは、場合によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来する、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。

【0037】

特定の実施形態では、第一および／または第二の二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域、抗体ＣＨ２ドメイン、および／または抗体ＣＨ３ドメインの少なくとも一部をさらに含む。特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは、第三の結合ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結される。

【0038】

特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、第二の抗原結合部分の重鎖可変ドメインに作動可能に連結される。

【0039】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは異なり、ホモ二量体化を妨げ、および／またはヘテロ二量体化を促進する方法で結合する。

【0040】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、ノブ・イン・トゥ・ホール、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または柔軟性の増加を介して結合してヘテロ二量体を形成することができる。

【0041】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善するために、マウスＴＣＲの安定性に寄与する少なくとも一つの対応するアミノ酸残基で置換された少なくとも一つの残基を含む。

【0042】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃ末端に１つ以上の変異残基、たとえば１、２、３、４、５、または６個の変異残基を含み、ここで変異残基は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列、ヒトカッパ軽鎖Ｃ末端配列、ＰＤＢ－５ＤＫ３（ヒトＩｇＧ４）ＣＨ１領域配列、ヒトラムダ軽鎖Ｃ末端領域配列、ＰＤＢ－１ＩＧＴ（マウスＩｇＧ２ａ）ＣＨ１領域配列、ＰＤＢ－１ＩＧＴ（マウスＩｇＧ２ａ）カッパ軽鎖Ｃ末端領域配列、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域配列（たとえば、ＥＲＫＣＣ－ＥＲＫＳＣ、配列番号３）、ＰＤＢ－５Ｅ８Ｅ（ヒトＩｇＡ）ＣＨ１領域配列、ＰＤＢ－５Ｅ８Ｅ（ヒトＩｇＡ）カッパ軽鎖Ｃ末端領域配列、ＰＤＢ－１ＤＥＥ（ヒトＩｇＭ）ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＥ ＣＨ１領域配列、またはヒトＩｇＤ ＣＨ１領域配列に由来する断片を含む。

【0043】

特定の実施形態では、たとえばそのＣ末端におけるＣＡｌｐｈａの一つまたは複数の改変は、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善し得る。特定の実施形態では、ＣＡｌｐｈａのＣ末端残基（ＣＡｌｐｈａのＣ末端領域の残基、たとえば位置８１～９６、８４～９５、９２～９５、または９２～９６のアミノ酸残基）をヒトＩｇＧ１配列セグメントまたはヒトカッパ軽鎖Ｃ末端セグメントによって置換することにより、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルが改善され得る。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に変異を含み、Ｃ末端は、アミノ酸配列、たとえば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列に由来する「ＥＰＫＳ」（配列番号４）および「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む。別の例として、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＥＰＫＳ」（配列番号４）を有する変異を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に変異を含み、Ｃ末端は、ヒトカッパ軽鎖Ｃ末端残基に由来するアミノ酸配列、たとえば、「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む。

【0044】

特定の実施形態では、ＣＢｅｔａ上の少なくとも一つのアミノ酸残基、たとえば、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に構造的に近いまたは近接している残基の改変も、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善し得る。

【0045】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善するために、マウスＴＣＲ由来の対応する一つまたは複数のアミノ酸残基に変異した一つまたは複数の残基を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、置換Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐから選択される少なくとも一つの変異残基を含み、および／または改変ＣＢｅｔａは、置換Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａから選択される少なくとも一つの変異残基を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、変異残基Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐを含む。特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、変異残基Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａを含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、変異残基Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐを含み、改変ＣＢｅｔａは、変異残基Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａを含む。

【0046】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａは、ＣＡｌｐｈａ上のＳ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３ＴならびにＣＢｅｔａ上のＥ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄから選択される、１、２、３、４、５、６、または７個の変異を含む。

【0047】

特定の実施形態では、少なくとも一つの天然システイン残基は、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａ中に存在しなくても存在していてもよい。特定の実施形態では、天然残基Ａ１２８、Ｄ１２９およびＣ１３０はＣＢｅｔａには存在せず、および／または天然残基Ｃ９６はＣＡｌｐｈａには存在しない。特定の実施形態では、２つのＣｙｓ残基によって形成される元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合が存在するように、天然残基Ａ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０はＣＢｅｔａに存在し、および／または天然残基Ｃ９６はＣＡｌｐｈａに存在する。

【0048】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、以下から選択される、一つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成する一つまたは複数の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０Ｃ、およびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【0049】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、非天然ジスルフィド結合を形成するための、以下から選択される一つまたは複数の変異残基の群を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６ＣおよびＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９ＣおよびＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０ＣおよびＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、Ｄ８６Ｃ、Ｐ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ。

【0050】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６ＣおよびＦ７８Ｃ。

【0051】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＮ８０Ｃ。

【0052】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８ＣおよびＮ８０Ｃ。

【0053】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９ＣおよびＮ８０Ｃ。

【0054】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＳ８１Ｃ。

【0055】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５ＣおよびＳ８１Ｃ。

【0056】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＳ８１Ｃ。

【0057】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＩ８２Ｃ。

【0058】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＰ８４Ｃ。

【0059】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９ＣおよびＰ８４Ｃ。

【0060】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３ＣおよびＰ８４Ｃ。

【0061】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ。

【0062】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＴ８７Ｃ。

【0063】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＡ９ＣおよびＦ８８Ｃ。

【0064】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０ＣおよびＦ８９Ｃ

【0065】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、以下の変異残基を含む： ＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【0066】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【0067】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、Ｄ８６Ｃ、およびＰ９０Ｃ、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【0068】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、以下の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ。

【0069】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、Ｇｌｙアミノ酸残基がヒンジ領域に隣接するか、またはヒンジ領域の一部を形成するように、ＣＢｅｔａのＣ末端にＧｌｙアミノ酸残基を含む。

【0070】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、そのＣ末端にまたはＣ末端周囲に、１～２２個のアミノ酸残基、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個のアミノ酸残基の欠失を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、そのＣ末端にまたはＣ末端周囲に、アミノ酸残基「ＦＦＰＳＰＥＳＳ」（配列番号９）等の８個のアミノ酸残基（たとえば、アミノ酸残基８８～９５）の欠失を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、そのＣ末端にまたはＣ末端周囲に、アミノ酸残基「ＰＥＳＳ」（配列番号６）等の４つのアミノ酸残基（たとえば、アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0071】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、ＣＢｅｔａのＣ末端にアミノ酸残基グリシンを含み、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む。

【0072】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）、ＣＢｅｔａのＣ末端のアミノ酸残基グリシン、およびＣＡｌｐｈａのＣ末端における「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む。

【0073】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）、およびＣＡｌｐｈａのＣ末端のＰ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐ変異、ＣＢｅｔａ上のＥ１７ＫおよびＳ２１Ａ変異を含む。

【0074】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）、ＣＢｅｔａのＣ末端のアミノ酸残基グリシン、およびＣＡｌｐｈａのＣ末端の「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む。

【0075】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）、ＣＢｅｔａのＣ末端のアミノ酸残基グリシン、およびＣＡｌｐｈａのＣ末端の「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む。

【0076】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｆ２６ＣおよびＦ７８Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0077】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｓ３６ＣおよびＮ８０Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0078】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｓ３８ＣおよびＮ８０Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0079】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｋ３９ＣおよびＮ８０Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0080】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｑ３４ＣおよびＳ８１Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0081】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｖ３５ＣおよびＳ８１Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0082】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｓ３６ＣおよびＳ８１Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0083】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｑ３４ＣおよびＩ８２Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0084】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｐ８ＣおよびＰ８４Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0085】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｆ２９ＣおよびＰ８４Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。
９５）の欠失を含む。

【0086】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｔ３３ＣおよびＰ８４Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0087】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｐ８ＣおよびＤ８６Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0088】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｐ８ＣおよびＴ８７Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0089】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ａ９ＣおよびＦ８８Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0090】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｖ１０ＣおよびＦ８９Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0091】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異残基Ｐ９０ＣおよびＣｂｅｔａ上の変異残基Ａ１８Ｃ、およびＣａｌｐｈａのＣ末端の４つのアミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む。

【0092】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異Ｓ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３Ｔ、ならびにＣｂｅｔａ上の変異Ｅ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄを含む。

【0093】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、７つの変異Ｃａｌｐｈａ上のＳ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３Ｔ、ならびにＣｂｅｔａ上のＥ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄ、ならびに元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）を含む。

【0094】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異Ｐ８Ｃ、Ｄ８６Ｃ、およびＰ９０Ｃ、ならびにＣｂｅｔａ上の変異Ａ１８Ｃを含む。

【0095】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異Ｐ８Ｃ、およびＤ８６Ｃをふくみ、かつ元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）を含む。

【0096】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異Ｐ９０ＣおよびＣｂｅｔａ上の変異Ａ１８Ｃを含み、かつ元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）を含む。

【0097】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび操作されたＣＢｅｔａは、Ｃａｌｐｈａ上の変異Ｐ８Ｃ、Ｄ８６Ｃ、およびＰ９０Ｃ、ならびにＣｂｅｔａ上の変異Ａ１８Ｃを含み、かつ元のＴＣＲ天然ジスルフィド結合（ＣＡｌｐｈａ上のＣ９６、ならびにＣＢｅｔａ上のＡ１２８、Ｄ１２９、およびＣ１３０）を含む。

【0098】

特定の実施形態では、操作されたＣ２は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含む、および／または操作されたＣ１は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１は、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含む、および／または操作されたＣ２は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１および操作されたＣ２がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む： １０／１１、１２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。特定の実施形態では、操作されたＣ２および操作されたＣ１がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む： １２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。

【0099】

特定の実施形態では、操作されたＣ２および操作されたＣ１はそれぞれ、配列番号４２および４３の一対の配列を含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１および操作されたＣ２はそれぞれ、配列番号４２および４３の一対の配列を含む。

【0100】

特定の実施形態では、操作されたＣ２および操作されたＣ１はそれぞれ、配列番号５０および５１の一対の配列を含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１および操作されたＣ２はそれぞれ、配列番号５０および５１の一対の配列を含む。

【0101】

特定の実施形態では、操作されたＣ２および操作されたＣ１はそれぞれ、配列番号７９および４３の一対の配列を含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１および操作されたＣ２はそれぞれ、配列番号７９および４３の一対の配列を含む。

【0102】

特定の実施形態では、操作されたＣ２および操作されたＣ１はそれぞれ、配列番号８０および５１の一対の配列を含む。特定の実施形態では、操作されたＣ１および操作されたＣ２はそれぞれ、配列番号８０および５１の一対の配列を含む。

【0103】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２、ビボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、ｔｒｉＦａｂ、タンデム連結されたＦａｂ、Ｆａｂ－Ｆｖ、タンデム連結されたＶドメイン、タンデム連結されたｓｃＦｖｓ、および他のフォーマットへと作製することができる。

【0104】

別の態様では、本開示は、疾患または状態の検出、診断、予後診断、または治療のための、本明細書で提供されるポリペプチド複合体を含むキットを提供する。

【0105】

本開示の前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して開始するいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0106】

【図1】図１Ａは、非還元条件または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図１Ｂは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図1-2】図１Ａは、非還元条件または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図１Ｂは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図1-3】図１Ａは、非還元条件または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図１Ｂは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図2】図２Ａおよび２Ｃは、非還元または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図2-2】図２Ａおよび２Ｃは、非還元または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図2-3】図２Ａおよび２Ｃは、非還元または還元条件下での、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、精製後のＴ８３１１タンパク質の第二のバッチのＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価を示す。

【図3】図３は、温度上昇時のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＤＳＦプロファイルを示す。

【図3-2】図３は、温度上昇時のＴ８３１１タンパク質の第一のバッチのＤＳＦプロファイルを示す。

【図4】図４は、Ｔ８３１１タンパク質のＤＳＣ曲線を示し、Ｔ８３１１－５７およびＴ８３１１－６１のＤＳＣ曲線は右にシフトしており、これはＴ８３１１－１と比較して温度上昇に対する耐性が比較的強いことを示している。

【図5】Ｔ８３１１タンパク質のＤＬＳ曲線を示す。

【図6】Ｔ８３１１－１、Ｔ８３１１－５７、およびＴ８３１１－６１の質量スペクトルを示す。

【図7】標的発現細胞に対するＴ８３１１タンパク質の結合曲線を示す。

【図8】Ｔ８３１１タンパク質の機能をチェックするためのレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。Ｔ８３１１－５７およびＴ８３１１－６１は、ＰＤ－Ｌ１発現細胞による４－１ＢＢ媒介ＮＦ－ＫＢ経路の活性化において良好なアゴニスト効果を示した。Ｇ３４（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ３４－１．ｕＩｇＧ１）は、ＰＤ－Ｌ１発現細胞を用いたＲＧＡテストで弱いアゴニスト効果を示した。

【図9】Ｔ８３１１タンパク質のＰＫ分析結果を示す。Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、他の抗体と比較して、より長いｔ_１／２を示し、より大きなＡＵＣおよびより小さなクリアランスを示した。

【図10】精製後のＷ３６１８タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）およびＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ｂ）の特性評価を示す。

【図11】温度上昇時のＷ３６１８タンパク質のＤＳＦプロファイルを示す。

【図12】ＴＲＡＣ＿Ｈｕｍａｎ ＣＡｌｐｈａ（配列番号１）および本明細書に開示される操作されたＣＡｌｐｈａ、ＴＲＡＣ＿ＷｕＸｉＢｏｄｙ １．０（配列番号１０）の配列および番号付けを示す。

【図13】ＴＲＢＣ２＿Ｈｕｍａｎ ＣＢｅｔａ（配列番号２）および本明細書に開示される操作されたＣＢｅｔａ、ＴＲＢＣ＿ＷｕＸｉＢｏｄｙ １．０（配列番号８）の配列および番号付けを示す。

【図14】２つのＷｕＸｉＢｏｄｙフォーマットＥ１７ＲおよびＧ２５Ｒ、ならびに対照フォーマットＧ３４を示す。

【図15】Ｗ３６１８タンパク質のＰＫ分析結果を示す。Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と比較して、より長いｔ_１／２を示し、より大きなＡＵＣおよびより小さなクリアランスを示した。

【図16】非還元条件または還元条件下での、精製後のＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価（上のパネル）、および精製後のＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３タンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価（下のパネル）を示す。

【図17】温度上昇時のＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３タンパク質のＤＳＦプロファイルを示す。

【図18】Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３タンパク質のＰＫ分析結果を示す。Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と比較して、より長いｔ_１／２を示し、より大きなＡＵＣおよびより小さなクリアランスを示した。

【図19】非還元条件下または還元条件下での、精製後のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価（上のパネル）、および精製後のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４タンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価（真ん中のパネルおよび下のパネル）を示す。

【図19-2】非還元条件下または還元条件下での、精製後のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ特性評価（上のパネル）、および精製後のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４タンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性評価（真ん中のパネルおよび下のパネル）を示す。

【図20】温度上昇時のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４タンパク質のＤＳＦプロファイルを示す。

【図21】Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１タンパク質およびＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１タンパク質のＰＫ分析結果を示す。Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と比較して、より長いｔ_１／２を示し、より大きなＡＵＣおよびより小さなクリアランスを示した。

【図22】Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１タンパク質とＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７８．ｕＩｇＧ１タンパク質のＰＫ分析結果の比較を示す。

【図23】Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１タンパク質とＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７９．ｕＩｇＧ１タンパク質のＰＫ分析結果の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0107】

詳細な説明
本開示の以下の記載は、単に本開示の様々な実施形態を説明することを目的としている。したがって、論じた特定の改変は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく様々な等価物、変更、および改変を行うことができることが明らかであり、そのような等価性の実施形態も本明細書に含まれることが理解される。刊行物、特許および特許出願を含む、本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される参考文献の特定の内容が本開示と矛盾するまたは一貫性がない場合、本開示が優先する。

【0108】

本明細書で使用される特定の用語は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）で定義および／または説明されている。これらの定義および／または説明は本明細書に組み込まれ、別段の記載がない限り、本開示に適用される。

【0109】

Ａ．ペプチド複合体
一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は該二量体を安定化することができ、該第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、ここでＣ１は操作されたＣＢｅｔａを含み、Ｃ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含む、またはＣ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、Ｃ２は操作されたＣＢｅｔａを含む。

【0110】

一態様では、本開示は、第二の抗原結合部分と結合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体を提供し、ここで該第一の抗原結合部分は、Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、ここでＣ１およびＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異残基とＣ２に含まれる第二の変異残基との間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができ、ここでＣ１は操作されたＣＢｅｔａを含み、Ｃ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含み；または、Ｃ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、Ｃ２は操作されたＣＢｅｔａを含む、およびここで該第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、該第二の抗原結合部分は該第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する。

【0111】

多重特異性フォーマットおよび／または番号付けの都合に応じて、本明細書に開示されるような、第一、第二、および第三等の番号付け配列は異なっていてもよい。たとえば、第一のＶＨに第二のＶＨとして番号付けしてもよく、第一のＶＬに第二のＶＬとして番号付けしてもよい。別の例として、第二の抗原結合部分は第一の抗原結合部分として番号付けしてもよく、第一の抗原結合部分は第二の抗原結合部分として番号付けしてもよい。図１４に示すように、好みおよび／または利便性に応じて、ＶＨ１にはＶＨ２として番号付けすることができ、ＶＬ１にはＶＬ２等として番号付けすることができる。

【0112】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、ＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端領域、またはＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端に近接している残基に少なくとも一つの変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも一つの変異は、そのような変異のないＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａと比較して、ＣＡｌｐｈａの安定性、ＣＢｅｔａの安定性、および／またはＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａ界面安定性を改善する。一部の実施形態では、少なくとも一つの変異を有する開示されたポリペプチド複合体は、そのような変異のないポリペプチド複合体と比較して、発現レベル、安定性、および／または抗原に対する親和性が改善している。

【0113】

ｉ． ＴＣＲ定常領域
本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、ＴＣＲに由来する定常領域を含む。天然ＴＣＲは２本のポリペプチド鎖から構成されており、一般に２つのタイプがある： 一つはアルファ鎖およびベータ鎖から構成され（すなわち、アルファ／ベータＴＣＲ）、もう一つはガンマ鎖およびデルタ鎖から構成されている（すなわち、ガンマ／デルタＴＣＲ）。これら２つのタイプは構造的に似ているが、位置および機能が異なる。約９５％のヒトＴ細胞はアルファ／ベータＴＣＲを有し、残りの５％はガンマ／デルタＴＣＲを有する。アルファ鎖の前駆体も見出され、プレアルファ鎖と命名される。２つのＴＣＲポリペプチド鎖のそれぞれは、免疫グロブリンドメインおよび膜近傍領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。免疫グロブリン領域は可変領域および定常領域からなり、免疫グロブリン型のフォールドが存在することが特徴である。各ＴＣＲポリペプチド鎖はシステイン残基（たとえば定常ドメインのＣ末端または膜近傍領域のＮ末端）を有しており、これらが一緒になって２つのＴＣＲ鎖をつなぐジスルフィド結合を形成することができる。

【0114】

ヒトＴＣＲα鎖定常領域（ＣＡｌｐｈａまたはＣａｌｐｈａと呼ばれる）は、図１２に示すように、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０１８４８、または配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＲＡＣとして知られている。

【0115】

ヒトＴＣＲβ鎖定常領域（ＣＢｅｔａまたはＣｂｅｔａと呼ばれる）は、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２（ＩＭＧＴ命名法）として知られる２つの異なるバリアントを有する（Ｔｏｙｏｎａｇａ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡｓ， Ｖｏｌ． ８２， ｐｐ．８６２４－８６２８， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８５）を参照）。ＴＲＢＣ２＿Ｈｕｍａｎ（ＣＢｅｔａ）のアミノ酸配列を図１３に配列番号２として示す。

【0116】

具体的には、天然ＴＣＲβ鎖は、７４位に天然システイン残基を含み、これは対になっていないため、天然アルファ／ベータＴＣＲにおいてジスルフィド結合を形成しない。特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体において、この天然のシステイン残基は存在しないか、または別の残基に変異している。これは、間違った鎖内または鎖間のペアリングを回避するのに役立ち得る。特定の実施形態では、天然のシステイン残基は、別の残基、たとえばセリンまたはアラニン（たとえば、Ｃ７４Ａ）に置換される。特定の実施形態では、置換により、インビトロでのＴＣＲリフォールディング効率を改善することができる。

【0117】

本開示において、本明細書で提供されるポリペプチド複合体の第一および第二のＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲ定常領域の間に、ＴＣＲ定常領域を安定化することができる少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、ＣＡｌｐｈａの安定性、ＣＢｅｔａの安定性、および／またはＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａ界面安定性を改善するために、ＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端領域、またはＣＡｌｐｈａおよび／もしくはＣＢｅｔａのＣ末端に近接している残基に少なくとも一つの変異を含む。

【0118】

鎖間結合は、一方のＴＣＲ定常領域上の一つのアミノ酸残基と、他方のＴＣＲ定常領域上の別のアミノ酸残基との間に形成される。特定の実施形態では、非天然鎖間結合は、２つのＴＣＲ定常領域を結合させて二量体にすることができる任意の結合または相互作用であってもよい。適切な非天然鎖間結合の例は、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、または疎水性－親水性相互作用、ノブ・イン・トゥ・ホール、またはそれらの組み合わせを含む。非天然鎖間結合の例は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0119】

特定の実施形態では、ＴＣＲ定常領域二量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の非天然鎖間結合を含む。場合により、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の非天然鎖間結合のうちの少なくとも一つは、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、もしくは疎水性－親水性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0120】

変異残基を含むＴＣＲ定常領域は、本明細書では「操作された」ＴＣＲ定常領域、たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａまたは操作されたＣＢｅｔａとも呼ばれる。特定の実施形態では、ポリペプチド複合体の第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）は、操作されたＴＣＲα鎖（ＣＡｌｐｈａ）を含み、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）は、操作されたＴＣＲβ鎖（ＣＢｅｔａ）を含む。特定の実施形態では、Ｃ１は操作されたＣＢｅｔａを含み、Ｃ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含む。

【0121】

特定の実施形態では、操作されたＴＣＲ定常領域は、一つまたは複数の変異システイン残基を含む。特定の実施形態では、一つまたは複数の変異残基は、第一および／または第二の操作されたＴＣＲ定常領域の接触界面内に含まれる。

【0122】

本明細書で使用される「接触界面」という用語は、ポリペプチドが互いに相互作用／結合するポリペプチド上の特定の領域を指す。接触界面は、相互作用が生じるときに接触または結合する、対応するアミノ酸残基と相互作用することができる一つまたは複数のアミノ酸残基を含む。接触界面中のアミノ酸残基は、連続した配列であってもなくてもよい。たとえば、界面が三次元である場合、界面内のアミノ酸残基は、直線配列上の異なる位置で分離されていてもよい。

【0123】

特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、アミノ酸残基９～３５、５２～６６、７１～８６、および１２２～１２７からなる群から選択される接触界面内に変異システイン残基等の変異残基を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、アミノ酸残基６～２９、３７～６７、および８６～９５からなる群から選択される接触界面内に変異システイン残基等の変異残基を含む。特に指定しない限り、本開示におけるＴＣＲ定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、図１２および１３に示す通りである。

【0124】

特定の実施形態では、一つまたは複数のジスルフィド結合が、操作されたＣＡｌｐｈａと操作されたＣＢｅｔａとの間に形成され得る。ＣＢｅｔａ中の変異したシステイン残基は、以下からなる群から選択される置換であってもよい： Ｓ５６Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｅ１４Ｃ、Ｆ１３Ｃ、Ｌ６２Ｃ、Ｄ５８Ｃ、Ｓ７６Ｃ、およびＲ７８Ｃ。および／またはＣＡｌｐｈａ中の変異したシステイン残基は、以下からなる群から選択される置換であってもよい： Ｔ４９Ｃ、Ｙ１１Ｃ、Ｌ１３Ｃ、Ｓ１６Ｃ、Ｖ２３Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｔ４６Ｃ、Ｌ５１Ｃ、およびＳ６２Ｃ。特定の実施形態では、変異したシステイン残基の対は、以下からなる群から選択される置換の対であってもよく、ここで一対のシステイン残基は、非天然の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる： ＣＢｅｔａにおけるＳ１６ＣおよびＣＡｌｐｈａにおけるＹ１１Ｃ、ＣＢｅｔａにおけるＦ１３ＣおよびＣＡｌｐｈａにおけるＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ１６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＬ１３Ｃ、ＣＢｅｔａのＶ１２ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａのＥ１４ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ１６Ｃ、ＣＢｅｔａのＦ１３ＣおよびＣＡｌｐｈａのＶ２３Ｃ、ＣＢｅｔａのＬ６２ＣおよびＣＡｌｐｈａのＹ４４Ｃ、ＣＢｅｔａのＤ５８ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ７６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４６Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＴ４９Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＬ５１Ｃ、ＣＢｅｔａのＳ５６ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ６２Ｃ、およびＣＢｅｔａのＲ７８ＣおよびＣＡｌｐｈａのＳ６２Ｃ。

【0125】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、一つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成するための、以下から選択される一つまたは複数の変異残基を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０Ｃ、およびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【0126】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、非天然ジスルフィド結合を形成するための、以下から選択される一つまたは複数の変異残基の群を含む： ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６ＣおよびＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９ＣおよびＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６ＣおよびＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４ＣおよびＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３ＣおよびＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９ＣおよびＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０ＣおよびＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、Ｄ８６Ｃ、Ｐ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８ＣおよびＤ８６Ｃ。

【0127】

本出願全体を通じて本明細書で使用される場合、ＴＣＲ定常領域に関して「ＸｎＹ」は、ＴＣＲ定常領域上のｎ番目のアミノ酸残基Ｘ（本明細書で提供される図１２～１３の番号付けに基づく）はアミノ酸残基Ｙで置換されていることを意味することを意図する。ここで、ＸおよびＹはそれぞれ特定のアミノ酸残基の一文字の略語である。番号ｎは図１２～１３に示されている番号付けにのみ基づいており、実際の位置とは異なる場合があることに留意されたい。

【0128】

非天然アミノ酸残基に加えて、特定の実施形態における操作されたＴＣＲ定常領域は、野生型ＴＣＲ定常領域配列中の一つまたは複数の天然残基に対する追加の改変をさらに含んでもよい。このような追加の改変の例は、天然のシステイン残基に対する改変、天然のグリコシル化部位に対する改変、および／または天然のループに対する改変を含む。

【0129】

特定の実施形態では、少なくとも一つの天然システイン残基が、操作されたＣＢｅｔａ中に存在しないか、存在する。たとえば、ＣＢｅｔａのＣ７４位の天然システイン残基は、操作されたＣＢｅｔａに存在してもしなくてもよい。

【0130】

いかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、ＣＢｅｔａ上の天然システイン残基の存在および非存在の両方を許容するという点で有利であると考えられる。可溶性ＴＣＲヘテロ二量体上の天然システイン残基の存在がＴＣＲのリガンド結合能力に有害であることが示唆されているが（たとえば、米国特許第７，６６６，６０４号を参照）、本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、抗原結合活性に悪影響を与えることなくこの天然システインの存在を許容する。さらに、ＴＣＲヘテロ二量体における天然のジスルフィド結合はＴＣＲヘテロ二量体の安定化に良いというＷｕ ｅｔ ａｌ． ｍＡｂｓ， ７（２）， ｐｐ．３６４-３７６ （２００５）による反対の教示にもかかわらず、本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、高レベルで発現される天然のシステイン残基の非存在下で存在する。

【0131】

特定の実施形態では、天然のＴＣＲ定常領域に存在する一つまたは複数の天然のグリコシル化部位は、本開示で提供されるポリペプチド複合体中に改変（たとえば、除去）されてもよく、または維持されてもよい。ポリペプチド配列に関して本明細書で使用される「グリコシル化部位」という用語は、炭水化物部分（たとえば、オリゴ糖構造）が結合できる側鎖を有するアミノ酸残基を指す。抗体のようなポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖、たとえばアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニン等のトリペプチド配列におけるアスパラギン残基（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）への炭水化物部分の結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのいずれか一つの糖がヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することを指す。天然グリコシル化部位の除去は、上記のトリペプチド配列の一つまたは複数（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）または一つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）が置換されるようにアミノ酸配列を改変することによって利便性よく達成することができる。

【0132】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体において、少なくとも一つの天然グリコシル化部位は、操作されたＴＣＲ定常領域、たとえば、第一および／または第二のＴＣＲ定常領域に存在しないか、または存在する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、ＣＡｌｐｈａ（すなわちＮ３４、Ｎ６８、およびＮ７９）およびＣＢｅｔａ（すなわちＮ６９）などはタンパク質の発現と安定性に必要である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｂｓ， ７：２， ３６４－３７６， ２０１５を参照）等、Ｎ結合型グリコシル化部位が存在するという既存の教示とは対照的に、タンパク質の発現および安定性に影響を与えることなくグリコシル化部位の全部または一部の除去を許容すると考えられる。

【0133】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体において、操作されたＣＡｌｐｈａのＮ－グリコシル化部位の少なくとも一つ、たとえばＮ３４、Ｎ６８、およびＮ７９が、存在しないか、または存在する。特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａにおけるＮ－グリコシル化部位の少なくとも一つ、たとえば、Ｎ６９は存在しないか、または存在する。

【0134】

特定の実施形態では、天然ＴＣＲ定常領域に存在する一つまたは複数の天然二次構造は、本開示で提供されるポリペプチド複合体中に改変（たとえば、除去）または保持されてもよい。特定の実施形態では、天然ループ（天然ＣＢｅｔａのＦＧループおよび／またはＤＥループ等）は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体中で改変される（たとえば、除去される）か、保持される。「ＦＧループ」および「ＤＥループ」という用語は、主にＴＣＲβ鎖定常ドメインに見られる構造である。ＦＧループは天然のＣＢｅｔａのアミノ酸残基１０１～１１７を包含しており、ＣＤ３に対するα／βＴＣＲキャビティの一つの構成要素を形成する、異常に細長く、溶媒に曝露されている構造要素である。ＤＥループは、天然のＣＢｅｔａのアミノ酸残基６６～７１を含む。特定の実施形態では、ＦＧループの配列は存在しない、および／またはＹＰＳＮ（配列番号８１）で置換されている。
特定の実施形態では、天然ＤＥループの配列は存在しない、および／またはＱＳＧＲ（配列番号８２）で置換されている。

【0135】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善するために、マウスＴＣＲの安定性に寄与する少なくとも一つの対応するアミノ酸残基で置換された少なくとも一つの残基を含む。

【0136】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、Ｃ末端に一つまたは複数の変異残基、たとえば１、２、３、４、５、または６個の変異残基を含み、ここで変異残基は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列、ヒトカッパ軽鎖Ｃ末端配列、ＰＤＢ－５ＤＫ３（ヒトＩｇＧ４）ＣＨ１領域配列、ヒトラムダ軽鎖Ｃ末端領域配列、ＰＤＢ－１ＩＧＴ（マウスＩｇＧ２ａ）ＣＨ１領域配列、ＰＤＢ－１ＩＧＴ（マウスＩｇＧ２ａ）カッパ軽鎖Ｃ末端領域配列、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域配列（たとえば、ＥＲＫＣＣ－ＥＲＫＳＣ、配列番号３）、ＰＤＢ－５Ｅ８Ｅ（ヒトＩｇＡ）ＣＨ１領域配列、ＰＤＢ－５Ｅ８Ｅ（ヒトＩｇＡ）カッパ軽鎖Ｃ末端領域配列、ＰＤＢ－１ＤＥＥ（ヒトＩｇＭ）ＣＨ１領域配列、ヒトＩｇＥ ＣＨ１領域配列、またはヒトＩｇＤ ＣＨ１領域配列に由来する断片を含む。

【0137】

特定の実施形態では、たとえばそのＣ末端におけるＣＡｌｐｈａの一つまたは複数の改変は、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善し得る。特定の実施形態では、ＣＡｌｐｈａのＣ末端残基（ＣＡｌｐｈａのＣ末端領域の残基、たとえば位置８１～９６、８４～９５、９２～９５、または９２～９６のアミノ酸残基）をヒトＩｇＧ１配列セグメントまたはヒトカッパ軽鎖Ｃ末端セグメントによって置換することにより、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルが改善され得る。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に変異を含み、Ｃ末端は、アミノ酸配列、たとえば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列に由来する「ＥＰＫＳ」（配列番号４）および「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む。別の例として、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＥＰＫＳ」（配列番号４）を有する変異を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に変異を含み、Ｃ末端は、ヒトカッパ軽鎖Ｃ末端残基に由来するアミノ酸配列、たとえば、「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む。

【0138】

特定の実施形態では、ＣＢｅｔａ上の少なくとも一つのアミノ酸残基、たとえば、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に構造的に近いまたは近接している残基の改変も、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善し得る。

【0139】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、本明細書に開示されるポリペプチド複合体の安定性および／または発現レベルを改善するために、マウスＴＣＲ由来の対応する一つまたは複数のアミノ酸残基に変異した一つまたは複数の残基を含む。たとえば、操作されたＣＡｌｐｈａは、置換Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐから選択される少なくとも一つの変異残基を含み、および／または改変ＣＢｅｔａは、置換Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａから選択される少なくとも一つの変異残基を含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、変異残基Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐを含む。特定の実施形態では、操作されたＣＢｅｔａは、変異残基Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａを含む。特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａは、変異残基Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐを含み、改変ＣＢｅｔａは、変異残基Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａを含む。

【0140】

特定の実施形態では、操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａは、ＣＡｌｐｈａ上のＳ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３ＴならびにＣＢｅｔａ上のＥ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄから選択される、１、２、３、４、５、６、または７個の変異を含む。

【0141】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体において、ＴＣＲ由来の定常領域は、抗体由来の可変領域に作動可能に連結されている。抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域は、スペーサーの有無にかかわらず、ＴＣＲ定常領域に作動可能に連結することができる。

【0142】

特定の実施形態では、第一の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は第一の結合ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に融合されており、第一の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は第二の結合ドメインで第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に融合されている。

【0143】

特定の実施形態では、第一の結合ドメインは、抗体 Ｖ／Ｃ結合のＣ末端断片の少なくとも一部、およびＴＣＲ Ｖ／Ｃ結合のＮ末端断片の少なくとも一部を含む。

【0144】

本明細書で使用される用語「抗体 Ｖ／Ｃ結合」は、抗体可変ドメインと定常ドメインとの境界、たとえば、重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとの間の境界、または軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとの間の境界を指す。同様に、用語「ＴＣＲ Ｖ／Ｃ結合」は、ＴＣＲ可変ドメインと定常ドメインとの境界、たとえば、ＴＣＲα可変ドメインと定常ドメインとの間の境界、またはＴＣＲβ可変ドメインと定常ドメインとの間の境界を指す。第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインなどの結合ドメインは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

特定の実施形態では、第一のポリペプチドは、式（Ｉ）：ＶＨ－ＨＣＪ－Ｃ１のように作動可能に連結されたドメインを含む配列を含み、第二のポリペプチドは、式（ＩＩ）：ＶＬ－ＬＣＪ－Ｃ２のように作動可能に連結されたドメインを含む配列を含む。ここで：
ＶＨは抗体の重鎖可変ドメインである；
ＨＣＪは、上記で定義した第一の結合ドメインである；
Ｃ１は、上記で定義した第一のＴＣＲ定常ドメインである；
ＶＬは抗体の軽鎖可変ドメインである；
ＬＣＪは、上記で定義した第二の結合ドメインである；
Ｃ２は、上記で定義した第二のＴＣＲ定常ドメインである。

【0146】

ＨＣＪおよびＬＣＪの様々な配列が、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されている。

【0147】

米国特許第９，６８３，０５２号は、ＴＣＲ定常領域間の接触界面内の特定の残基をＦｃ領域内に操作して（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ）、２つの重鎖のヘテロ二量体対合を促進することができることを開示している。本明細書に開示されるＴＣＲ定常領域間の接触界面内のそのような残基および／または対応する残基は、軽鎖と重鎖との間の対形成を促進するために、Ｆａｂ領域、たとえば、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン内に操作することもできる。

【0148】

ｉｉ． 抗体可変領域
本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。従来のネイティブ抗体では、可変領域は、たとえば、Ｎ末端からＣ末端まで、次の式に示されるように、隣接するフレームワーク（ＦＲ）領域によって挟まれた３つのＣＤＲ領域を含む： ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。本明細書で提供されるポリペプチド複合体は、そのような従来の抗体可変領域を含むことができるが、これに限定されない。たとえば、可変ドメインは、可変ドメインが抗原に特異的に結合できる限り、抗体重鎖または軽鎖のＣＤＲの３つすべてまたは３つ未満と、ＦＲの４つすべてまたは４つ未満を含んでもよい。

【0149】

第一の抗体は、第一の抗原特異性を有する。換言すれば、ＶＨおよびＶＬは、抗原またはエピトープに特異的に結合することができる抗原結合部位を形成する。抗原特異性は、任意の適切な抗原またはエピトープ、たとえば、外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原、または腫瘍抗原を対象とすることができる。外来性抗原は、吸入、摂取、または注射によって体内に入り、エンドサイトーシスまたは食作用によって抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示され、ＭＨＣ ＩＩ複合体を形成することができる。内在性抗原は、細胞代謝、細胞内ウイルスまたは細菌感染の結果として正常細胞内で生成され、ＭＨＣ Ｉ複合体を形成することができる。自己抗原（ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）は、自己免疫疾患に罹患している患者の免疫系によって認識されるが、正常な状態では、この抗原は免疫系の標的となるべきではない。ネオ抗原は正常な身体にはまったく存在せず、腫瘍やがん等の特定の病気が原因で生成される。特定の実施形態では、抗原は、特定の疾患（たとえば、腫瘍またはがん、自己免疫疾患、感染症および寄生虫症、心血管疾患、神経障害、神経精神状態（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、傷害、炎症、凝固障害）に関連している。特定の実施形態では、抗原は免疫系（たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等の免疫細胞）に関連する。

【0150】

特定の実施形態では、第一の抗原特異性は、免疫関連抗原またはそのエピトープを対象とする。免疫関連抗原の例は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を含む。

【0151】

Ｔ細胞特異的受容体分子は、Ｔ細胞が、抗原提示細胞またはＡＰＣと呼ばれる別の細胞によって提示されるエピトープ／抗原に結合し、追加のシグナルが存在する場合には、それによって活性化されて応答することを可能にする。Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０とも呼ばれる）、４－１ ＢＢ、ＣＤ５、およびＣＤ９５（Ｆａｓ受容体としても知られる）であってもよい。

【0152】

ＮＫ細胞特異的受容体分子の例は、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体およびＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ２を含む。

【0153】

特定の実施形態では、第一の抗原特異性は、腫瘍関連抗原またはそのエピトープを対象とする。「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍細胞表面上に存在するか、または腫瘍細胞表面上に提示され得、腫瘍細胞上または腫瘍細胞内に位置する抗原を指す。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞によってのみ提示され得、正常な細胞、すなわち、非腫瘍細胞によっては提示され得ない。一部の他の実施形態では、腫瘍関連抗原は腫瘍細胞上で独占的に発現され得るか、または非腫瘍細胞と比較して腫瘍特異的変異を表し得る。一部の他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞および非腫瘍細胞の両方で見出すことができるが、非腫瘍細胞と比較した場合に腫瘍細胞で過剰発現されるか、または腫瘍組織は非腫瘍組織に比べて構造がコンパクトではないため、腫瘍細胞内での抗体結合に利用可能である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は腫瘍の脈管構造上に位置する。腫瘍関連表面抗原の具体例は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0154】

特定の実施形態では、第一の抗原特異性は、ＣＤ３、４．１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｃｄＨ３、ＥｐＣＡＭ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲの変異型）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｄＬＬ３、ＢＣＭＡ、シアリル－Ｌｅａ、５Ｔ４、ＲＯＲ１、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、メソテリン、葉酸受容体１、ＶＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、プロテオグリカン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦＲ、αＶβ３－インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ｃ－ｅｒｂ－２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ｐ９７、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ、ＧＴ３、ＧＱ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＦＸ２、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４ Ｔｒｐ２、ｇｐ１００、チロシナーゼ、Ｍｕｃ－１、テロメラーゼ、サバイビン、Ｇ２５０、ｐ５３、ＣＡ１２５ ＭＵＣ、Ｗｕｅ抗原、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＨＳＰ－２７、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－７２、ＨＳＰ－９０、Ｐｇｐ、ＭＣＳＰ、ＥｐＨＡ２、細胞表面標的ＧＣ１８２、ＧＴ４６８またはＧＴ５１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２０、ＩＬ－１３、ＩＬ－４からなる群から選択される抗原またはそのエピトープを対象とする。

【0155】

抗体可変ドメインは、親抗体に由来することができる。親抗体は、たとえば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、または動物抗体（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ等）を含む任意のタイプの抗体であり得る。親抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。

【0156】

特定の実施形態では、親抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当技術分野で知られている様々な方法、たとえば、ハイブリドーマ技術、組換え法、ファージディスプレイ、またはそれらの任意の組み合わせによって産生することができる。抗体を産生する例示的な方法は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0157】

本明細書に記載される親抗体は、たとえば、ＣＤＲ配列を異なるフレームワークまたはスキャフォールドに移植するため、一つまたは複数のフレームワーク領域の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換するため、親和性成熟のために一つまたは複数のＣＤＲ領域内の一つまたは複数の残基を置換するため、等のためにさらに改変することができる。これらは、当業者であれば従来の技術を使用して達成することができる。

【0158】

親抗体は、当技術分野で公知の治療用抗体、たとえば、治療用または診断用としてＦＤＡによって承認されている抗体、または状態を治療するための臨床試験中の抗体、または研究開発中の抗体であってもよい。既知の抗体の可変領域のポリヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、たとえば、www.ncbi.nlm nih gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.htmlのような公共データベースから得ることができる。治療用抗体の例とは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる治療用抗体を含むが、これらに限定されない。

【0159】

特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＣＴＬＡ－４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＣＴＬＡ－４に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は４－１ＢＢに結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分は４－１ＢＢに結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、第一および第二の抗原結合部分は、ＨＥＲ２の２つの別個のドメインに結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ２に結合する。 特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ４に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ２に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－１７に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－２０に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－２０に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－１７に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－４に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－１３に結合する。特定の実施形態では、第一の抗原結合部分はＩＬ－１３に結合する。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分はＩＬ－４に結合する。

【0160】

ＣＤＲは抗原結合に関与することが知られているが、６つのＣＤＲのすべてが必須または変更不可であるわけではないことが判明している。換言すれば、抗原に対する特異的結合親和性を実質的に保持しながら、一つまたは複数のＣＤＲを置換または変更または改変することが可能である。

【0161】

二重特異性ポリペプチド複合体
一態様では、本開示は、本明細書において二重特異性ポリペプチド複合体を提供する。本明細書で使用する「二重特異性」という用語は、それぞれが異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる２つの抗原結合部分が存在することを意味する。本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の重鎖可変ドメイン、および第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の軽鎖可変ドメインを含む第一の抗原結合部分を含み、ここで、Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然の安定化鎖間結合を含む二量体を形成することができる。本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、第二の抗原結合部位を含むがＴＣＲ定常領域に由来する配列を含まない、第二の抗原結合部分をさらに含む。

【0162】

特定の実施形態では、本開示は、第二の抗原結合部分と結合した第一の抗原結合部分を含む二重特異性ポリペプチド複合体を提供し、ここで：
第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで：
Ｃ１は操作されたＣＢｅｔａを含む、およびＣ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含む；またはＣ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含む、およびＣ２は操作されたＣＢｅｔａを含み、
Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異残基とＣ２に含まれる第二の変異残基との間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができ、
ＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａは、二量体をさらに安定化させるために、該ＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａのＣ末端領域、またはＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａのＣ末端に近接しているアミノ酸位置に少なくとも一つの変異を含む、および
第一の抗体は第一の抗原特異性を有する；および
第二の抗原結合部分は、第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する。

【0163】

本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、重鎖および軽鎖可変ドメインの誤対合を有する傾向が著しく低く、安定性および／または発現レベルが増加している。

【0164】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第二の抗原結合部分は、第二の抗体の第二の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）および第二の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む。特定の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２の少なくとも一方が抗体定常領域に作動可能に連結されるか、またはＶＨ２およびＶＬ２の両方がそれぞれ抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域に作動可能に連結される。特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は、ＶＨ２に作動可能に連結された抗体定常ＣＨ１ドメイン、およびＶＬ２に作動可能に連結された抗体軽鎖定常ドメインをさらに含む。たとえば、第二の抗原結合部分はＦａｂを含む。

【0165】

第一、第二、第三、および第四の可変ドメイン（たとえば、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１、およびＶＬ２）が一つの細胞内で発現される場合、ＶＨ１がＶＬ１と特異的に対合し、ＶＨ２がＶＬ２と特異的に対合し、結果として生じる二重特異性タンパク質産物は正しい抗原結合特異性を有することになることが望ましい。しかし、ハイブリッドハイブリドーマ（またはクアドローマ）等の既存の技術では、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＬ１、およびＶＬ２のランダムな対合が発生し、その結果、最大１０種類の異なる二重特異性抗原結合分子が生成され、そのうち機能的な二重特異性抗原結合分子は一つだけである。これにより、生産収率が低下するだけでなく、目的生成物の精製も複雑になる。

【0166】

例示的な例では、第一の抗原結合ドメインは、ＶＬ１－Ｃ２と対合したＶＨ１－Ｃ１を含み、第二の抗原結合ドメインは、ＶＬ２－ＣＬと対になったＶＨ２－ＣＨ１を含む。驚くべきことに、Ｃ１とＣ２は優先的に互いに結合し、ＣＬまたはＣＨ１とは結合する傾向が低く、その結果、Ｃ１－ＣＨ、Ｃ１－ＣＬ、Ｃ２－ＣＨ、およびＣ２－ＣＬ等の望ましくない対合の形成が防止され、大幅に減少した。Ｃ１－Ｃ２の特異的結合の結果、ＶＨ１はＶＬ１と特異的に対合して、それにより第一の抗原結合部位を提供し、ＣＨ１はＣＬと特異的に対合して、それにより第二の抗原結合部位を提供するＶＨ２－ＶＬ２の特異的対合を可能にする。したがって、第一の抗原結合部分と第二の抗原結合部分はミスマッチになりにくく、たとえばＶＨ１－ＶＬ２、ＶＨ２－ＶＬ１、ＶＨ１－ＶＨ２、ＶＬ１－ＶＬ２の間の誤対合は、第一および第二の抗原結合部分の両方がたとえばＶＨ１－ＣＨ１、ＶＬ１－ＣＬ、ＶＨ２－ＣＨ１、およびＶＬ２－ＣＬの形態の天然Ｆａｂの対応物である場合に比べて大幅に減少するであろう。

【0167】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞から発現される場合、同等の条件下で発現される参照分子（参照分子は、Ｃ１の代わりに天然のＣＨ１を有し、Ｃ２の代わりに天然のＣＬを有することを除いて、二重特異性ポリペプチド複合体と同一である）よりも、誤対合生成物が有意に少ない（たとえば、誤対合生成物が少なくとも１、２、３、４、５個またはそれ以上少ない）、および／または生産収率が著しく高いであろう（たとえば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上高い収率）。

【0168】

特定の実施形態では、第一および／または第二の抗原結合部分は、二価、三価、四価等の多価である。本明細書で使用される「価」という用語は、所定の分子内に特定の数の抗原結合部位が存在することを指す。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、抗原結合分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位が存在することを示す。２つの結合部位が両方とも同じ抗原または同じエピトープに特異的に結合する場合、二価分子は単一特異的となり得る。同様に、たとえば、２つの結合部位が第一の抗原（またはエピトープ）に対して単一特異性であり、第三の結合部位が第二の抗原（またはエピトープ）に対して特異的である場合、三価分子は二重特異性となり得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体中の第一および／または第二の抗原結合部分は、同じ抗原またはエピトープに特異的な少なくとも２つの結合部位を有する、二価、三価、または四価であり得る。これは、特定の実施形態において、一価の対応物よりも抗原またはエピトープへのより強い結合を提供する。特定の実施形態では、二価の抗原結合部分において、第一価の結合部位と第二価の結合部位は構造的に同一である（すなわち、同じ配列を有する）か、または構造的に異なる（すなわち、同じ特異性を有するにもかかわらず異なる配列を有する）。

【0169】

特定の実施形態では、第一および／または第二の抗原結合部分は多価であり、スペーサーの有無にかかわらず、作動可能に互いに連結された２つ以上の抗原結合部位を含む。

【0170】

特定の実施形態では、第一および／または第二の抗原結合部分は、重鎖および/または軽鎖においてスペーサーの有無にかかわらず連結され、少なくとも一つの抗原結合部分を形成する、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５（上記）およびＢｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７（上記）に記載されているＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに他の断片のうちの一つまたは複数、またはそれらの組み合わせを含む。

【0171】

特定の実施形態では、第二の抗原結合部分は、第二の抗体の２つ以上のＦａｂを含む。２つのＦａｂは、相互に作動可能に連結することができ、たとえば、第一のＦａｂは、間にスペーサーの有無にかかわらず、重鎖を介して第二のＦａｂに共有結合することができる。

【0172】

特定の実施形態では、第一の抗原結合部分は第一の二量体化ドメインをさらに含み、第二の抗原結合部分は第二の二量体化ドメインをさらに含む。本明細書で使用される「二量体化ドメイン」という用語は、互いに結合して二量体を形成することができる、またはいくつかの例では、２つのペプチドの自発的二量体化を可能にするペプチドドメインを指す。

【0173】

特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは第二の二量体化ドメインと結合することができる。この結合は、任意の適切な相互作用または連結または結合、たとえば、コネクタ、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、もしくは疎水性－親水性相互作用、またはそれらの組み合わせを介するものであってもよい。例示的な二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域、抗体ＣＨ２ドメイン、抗体ＣＨ３ドメイン、および二量体化して相互に結合することができる他の適切なタンパク質単量体を含むが、これらに限定されない。ヒンジ領域、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４等の任意の抗体アイソタイプに由来していてもよい。

【0174】

特定の実施形態では、第一および／または第二の二量体化ドメインは、抗体ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。特定の実施形態では、第一および／または第二の二量体化ドメインは、抗体ＣＨ２ドメインおよび／または抗体ＣＨ３ドメインをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、第一および／または第二の二量体化ドメインは、ヒンジ－Ｆｃ領域、すなわちヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは、第一のＴＣＲ定常領域のＣ末端に作動可能に連結されていてもよい。特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、第二の抗原結合部分の抗体ＣＨ１定常領域のＣ末端に作動可能に連結されていてもよい。

【0175】

特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは、第三の結合ドメインで第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に（間にスペーサーの有無にかかわらず）作動可能に連結される。第三の結合ドメインの様々な設計および配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0176】

特定の実施形態では、第一の二量体化ドメインは、操作されたＴＣＲ定常領域のＣ末端に作動可能に連結され、一緒になってキメラ定常領域を形成する。換言すれば、キメラ定常領域は、操作されたＴＣＲ定常領域と作動可能に連結された、第一の二量体化ドメインを含む。

【0177】

特定の実施形態では、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来する第一のヒンジＦｃ領域に結合された操作されたＣＢｅｔａを含む。このようなキメラ定常領域の例示的な配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0178】

特定の実施形態では、キメラ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来する第一のヒンジに結合された操作されたＣＡｌｐｈａを含む。のようなキメラ定常領域の例示的な配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0179】

特定の実施形態では、キメラ定常領域は、第一の抗体のＣＨ２ドメインおよび／または第一の抗体のＣＨ３ドメインをさらに含む。たとえば、キメラ定常領域は、第三の結合ドメインのＣ末端に結合された第一の抗体のＣＨ２－ＣＨ３ドメインをさらに含む。このようなキメラ定常領域の例示的な配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0180】

これらのキメラ定常領域および第二のＴＣＲ定常ドメインの対合は、本明細書に開示されるポリペプチド複合体を提供するために、それらを操作して所望の抗体可変領域に融合させることができるという点で有用である。たとえば、抗体重鎖可変領域をキメラ定常領域（Ｃ１を含む）に融合させることにより、本明細書に提供されるポリペプチド複合体の第一のポリペプチド鎖を与えることができる；同様に、抗体軽鎖可変領域を第二のＴＣＲ定常ドメイン（Ｃ２を含む）に融合させることにより、本明細書で提供されるポリペプチド複合体の第二のポリペプチド鎖を与えることができる。

【0181】

これらのキメラ定常領域および第二のＴＣＲ定常ドメインの対合は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の第一の抗原結合部分を生成するためのプラットフォームとして使用することができる。たとえば、第一の抗体の可変領域をプラットフォーム配列のＮ末端に融合させることができる（たとえば、ＶＨをキメラ定常ドメインに、ＶＬをＴＣＲ定常ドメインにそれぞれ融合させる）。二重特異性ポリペプチド複合体を生成するために、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体に結合するように、第二の抗原結合部分を設計および生成することができる。

【0182】

特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインはヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４等の抗体に由来していてもよい。特定の実施形態では、第二の二量体化ドメインは、必要に応じて、例えばヒンジＦｃ領域等の、抗体のＣＨ２ドメインおよび／または抗体のＣＨ３ドメインをさらに含んでもよい。ヒンジ領域は、第二の抗原結合部位（たとえば、Ｆａｂ）の抗体重鎖に結合していてもよい。

【0183】

二重特異性ポリペプチド複合体では、第一および第二の二量体化ドメインは結合して二量体を形成することができる。特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは異なり、ホモ二量体化を妨げ、および／またはヘテロ二量体化を促進する方法で結合する。たとえば、第一および第二の二量体化ドメインは、それらが同一ではなく、それら自体内でホモ二量体を形成するよりもむしろ相互にヘテロ二量体を優先的に形成するように選択することができる。特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、ノブ・イン・トゥ・ホールの形成、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または柔軟性の増加を介して結合してヘテロ二量体を形成することができる。

【0184】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、ノブ・イン・トゥ・ホールを形成できるようにそれぞれ変異したＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む。ノブは、第一のＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドにおける小さなアミノ酸残基をより大きなアミノ酸残基に置換することによって得ることができ、ホールは、大きな残基をより小さな残基に置換することによって得ることができる。ノブ・イン・トゥ・ホールの変異部位の詳細については、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６（上記）、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５（上記）、およびＢｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７（上記）を参照されたい。

【0185】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、Ｓ１３９ＣおよびＴ１５１Ｗ置換（ノブ）を含むＩｇＧ１アイソタイプの第一のＣＨ３ドメインと、Ｙ１３４Ｃ、Ｔ１５１Ｓ、Ｌ１５３Ａ、およびＹ１９２Ｖ置換（ホール）を含むＩｇＧ１アイソタイプの第２のＣＨ３ドメインとを含む。別の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、Ｓ１３６ＣおよびＴ１４８Ｗ置換（ノブ）を含むＩｇＧ４アイソタイプの第一のＣＨ３ドメインと、Ｙ１３１Ｃ、Ｔ１４８Ｓ、Ｌ１５０Ａ、およびＹ１８９Ｖ置換（ホール）を含むＩｇＧ４アイソタイプの第二のＣＨ３ドメインとを含む。第一および第二の二量体化ドメインのさらなる例示的な例は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0186】

特定の実施形態では、第一および第二の二量体化ドメインは、第一のヒンジ領域および第二のヒンジ領域をさらに含む。たとえば、置換の電荷対をＩｇＧ１およびＩｇＧ２のヒンジ領域に導入して、ヘテロ二量体化を促進することができる。詳細については、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７（上記）を参照されたい。

【0187】

二重特異性フォーマット
本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、当技術分野で知られている任意の適切な二重特異性フォーマットであってもよい。特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、参照二重特異性抗体フォーマットに基づく。二重特異性フォーマットに関して本明細書で使用される「に基づく」とは、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、抗原結合部分の一つがＣ１に作動可能に連結されたＶＨおよびＣ２に作動可能に連結されたＶＬ（Ｃ１およびＣ２は本明細書に開示されている通り、結合している）を含むように改変されていることを除いて、参照二重特異性抗体と同じ二重特異性フォーマットをとる。当技術分野で公知の参照二重特異性抗体フォーマットの例は、 （ｉ）対称Ｆｃを有する二重特異性抗体、（ｉｉ）非対称Ｆｃを有する二重特異性抗体、（ｉｉｉ）追加の抗原結合部分が付加された通常の抗体、（ｉｖ）二重特異性抗体断片、（ｖ）追加の抗原結合部分が付加された通常の抗体断片、（ｖｉ）ヒトアルブミンまたはヒトアルブミン結合ペプチドが付加された二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0188】

ＢｓＩｇＧは各抗原に対して一価であり、単一の宿主細胞内で２つの軽鎖と２つの重鎖を共発現させることによって産生することができる。追加のＩｇＧは、軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に追加の抗原結合ユニットを付加することによって二重特異性ＩｇＧを形成するように操作される。追加の抗原結合ユニットは、ＤＶＤ－Ｉｇ等の単一ドメイン抗体（不対合ＶＬまたはＶＨ）、対抗体可変ドメイン（ＦｖまたはｓｃＦｖ等）、または操作されたタンパク質スキャフォールドであってもよい。ＢｓＩｇＧにおける抗原結合ユニットのいずれか、特にＶＨ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬの対は、本明細書に開示されるようにＣＨ１をＣ１に、およびＣＬをＣ２に置換するように改変して、本明細書に提供される二重特異性ポリペプチド複合体を与えることができる。

【0189】

二重特異性抗体断片は、抗体に由来するが、抗体定常ドメインの一部またはすべてを欠く抗原結合断片である。このような二重特異性抗体断片の例は、例えば、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびダイアボディ等を含む。本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を提供するために、二重特異性抗体断片中の抗原結合部位（たとえば、特に対合したＶＨ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬ）を、本明細書で開示されるポリペプチド複合体（たとえば、ＶＨ－Ｃ１／ＣＬ－Ｃ２）を含むように改変することができる。

【0190】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、全ＩｇＧ分子または全ＩｇＧ様分子等の「全」抗体のフォーマット、およびタンデム単鎖可変断片分子（ｔａＦｖｓ）等の小さな組み換えフォーマット、ダイアボディ（Ｄｂｓ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂｓ）、およびこれらの様々な他の誘導体（Ｂｙｒｎｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３１（１１）：６２１－６３２に記載の二重特異性抗体フォーマットを参照。）に基づいている。二重特異性抗体の例は、クアドローマ、化学的に結合したＦａｂ（断片抗原結合）、およびＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）を含むがこれらに限定されないフォーマットに基づいている。

【0191】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）；ハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）；多特異性アンチカリン（登録商標）プラットフォーム（Ｐｉｅｒｉｓ）；ダイアボディ；単鎖ダイアボディ；タンデム単鎖Ｆｖ断片；ＴａｎｄＡｂｓ；三重特異性Ａｂｓ（Ａｆｆｉｍｅｄ）；Ｄａｒｔｓ（デュアルアフィニティリターゲティング、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）；二重特異性Ｘｍａｂ（Ｘｅｎｃｏｒ）；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉｔｅｓ； Ａｍｇｅｎ； ５５ ｋＤａ）；トリプルボディ（Ｔｒｉｐｌｅｂｏｄｙ）；トリボディ（Ｔｒｉｂｏｄｙ）（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）融合タンパク質（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ）多機能組換え抗体誘導；Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）プラットフォーム（Ｇｅｎｍａｂ）；ドック・ロック（Ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ）プラットフォーム；ノブ・イン・トゥ・ホール（ＫＩＨ）プラットフォーム；ヒト化二重特異性ＩｇＧ抗体（ＲＥＧＮ１９７９）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；Ｍａｂ_２二重特異性抗体（Ｆ－Ｓｔａｒ）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン免疫グロブリン）（Ａｂｂｖｉｅ）；カッパ－ラムダボディ（ｋａｐｐａ－ｌａｍｂｄａ ｂｏｄｙ）；ＴＢＴＩ（四価二重特異性タンデムＩｇ）；およびＣｒｏｓｓＭａｂから選択される二重特異性フォーマットに基づく。

【0192】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ；ＤＡＦ（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）；ＤＡ（ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ）；ＤｕｔａＭａｂ；ＤＴ－ＩｇＧ；ノブ・イン・トゥ・ホール共通ＬＣ；ノブ・イン・トゥ・ホールアセンブリ；電荷対（Ｃｈａｒｇｅ ｐａｉｒ）；ＳＥＥＤボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）；Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）；ＬＵＺ－Ｙ；Ｆｃａｂ；カッパ－ラムダボディ；および直交Ｆａｂ（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ）を含む二重特異性ＩｇＧ様抗体（ＢｓＩｇＧ）から選択される二重特異性フォーマットに基づく。二重特異性抗体フォーマットの詳細な説明については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ．， Ｚｈａｉ Ｑ． ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ Ｐ． Ｊ． （２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７： ９５－１０６を参照されたい。

【0193】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＤＶＤ－ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ；ｓｃＦＶ－（Ｌ）ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ；ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ；Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ；ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ；Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ；ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ；２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ；ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ４－Ｉｇ； ｓｃＦｖ４－Ｉｇ； Ｚｙｂｏｄｙ（商標）；およびＤＶＩ－ＩｇＧ（ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ）（同上を参照）を含む追加の抗原結合部分を有するＩｇＧ付加抗体から選択される二重特異性フォーマットに基づく。

【0194】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ナノボディ；ナノボディ－ＨＡＳ；ＢｉＴＥ；ダイアボディ；ＤＡＲＴ；ＴａｎｄＡｂ（登録商標）；ｓｃダイアボディ；ｓｃ－ダイアボディ－ＣＨ３；ダイアボディ－ＣＨ３；トリプルボディ（Ｔｒｉｐｌｅ Ｂｏｄｙ）；ミニ抗体（Ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）；Ｍｉｎｉｂｏｄｙ；ＴｒｉＢｉ ｍｉｎｉｂｏｄｙ；ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ；Ｆａｂ－ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ；Ｆ（ａｂ’）２； Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２；ｓｃＦｖ－ＫＩＨ；Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ；四価ＨＣＡｂ；ｓｃダイアボディ－Ｆｃ；ダイアボディ－Ｆｃ；タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ；およびイントラボディ（同上を参照）を含む二重特異性抗体断片から選択されるフォーマットに基づく。

【0195】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ドック・ロック（Ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ）；ＩｍｍＴＡＣ；ＨＳＡｂｏｄｙ；ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ；およびタンデムｓｃＦｖ－毒素（Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ－Ｔｏｘｉｎ）（同上を参照）等の二重特異性フォーマットに基づく。

【0196】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、ＩｇＧ－ＩｇＧ；Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ；およびｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２（同上を参照）を含む二重特異性抗体コンジュゲートから選択されるフォーマットに基づく。

【0197】

特定の実施形態では、第一の抗原結合部分および第二の結合部分は、会合してＩｇ様構造を形成することができる。Ｉｇ様構造は、抗原結合のための２つのアームと会合および安定化のための１つのステムを備えたＹ字型構造を有する天然抗体に似ている。天然抗体との類似点は、良好なインビボ薬物動態、所望の免疫学的応答および安定性等の様々な利点を提供することができる。本明細書に提供される第二の抗原結合部分と結合した本明細書に提供される第一の抗原結合部分を含むＩｇ様構造は、Ｉｇ（たとえば、ＩｇＧ）の熱安定性に匹敵する熱安定性を有することが見出されている。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＩｇ様構造は、天然ＩｇＧのそれ（ｔｈａｔ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ＩｇＧ）の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％である。

【0198】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は４つのポリペプチド鎖： ｉ）ＶＨ１－Ｃ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３； ｉｉ） ＶＬ１－Ｃ２； ｉｉｉ） ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、および ｉｖ） ＶＬ２－ＣＬを含み、ここでＣ１およびＣ２は、少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域および／または２つのＣＨ３ドメインは、二量体化を促進することができる一つまたは複数の鎖間結合を形成することができる。たとえば、図１４（Ｅ１７Ｒ）を参照されたい。特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、３つのポリペプチド鎖の対：ｉ）ＶＨ１－ＣＨ１－ＶＨ２－Ｃ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３； ｉｉ）ＶＬ２－Ｃ２；および ｉｉｉ）ＶＬ１－ＣＬを含み、ここでＣ１およびＣ２は、少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域および／または２つのＣＨ３ドメインは、二量体化を促進することができる一つまたは複数の鎖間結合を形成することができる。たとえば、図１４（Ｇ２５Ｒ）を参照されたい。

【0199】

ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６（ＷＯ２０１９／０５７１２２、たとえばその中の図１および２２）は、多くの二重特異性抗体フォーマットを示しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される操作されたＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６号（ＷＯ２０１９／０５７１２２号）に記載されている二重特異性抗体フォーマットのいずれにも適用することができる。

【0200】

二重特異性複合体の抗原特異性
本明細書で提供される二重特異性複合体は、２つの抗原特異性を有する。第一および第二の抗原結合部分は、それぞれ第一および第二の抗原特異性を対象とする。

【0201】

第一および第二の抗原特異性は同一であってもよく、換言すれば、第一および第二の抗原結合部分は同じ抗原分子、または同じ抗原分子の同じエピトープに結合する。

【0202】

あるいは、第一および第二の抗原特異性は異なっていてもよい。たとえば、第一および第二の抗原結合部分は、異なる抗原に結合することができる。このような二重特異性ポリペプチド複合体は、たとえば、２つの異なる抗原を近接させ、それによってそれらの相互作用を促進する（たとえば、免疫細胞を腫瘍抗原または病原体抗原に近接させ、したがって免疫系によるそのような抗原の認識または除去を促進する）のに有用であり得る。別の例として、第一および第二の抗原結合部分は、一つの抗原の異なる（および場合により重複しない）エピトープに結合することができる。これは、標的抗原、特に変異を受けやすい抗原（たとえば、ウイルス抗原）の認識または結合を強化するのに役立ち得る。

【0203】

一部の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性複合体の抗原特異性の一つは、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を対象とする。一部の実施形態では、第一および第二の抗原結合部分の一方は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ９５に特異的に結合することができ、他方は腫瘍関連抗原に対して特異的に結合することができる。

【0204】

一部の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性複合体の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を対象とし、他方の抗原特異性は、腫瘍関連表面抗原を対象とする。特定の実施形態では、二重特異性複合体の第一の抗原結合部分は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子（ＣＤ３等）に特異的に結合することができ、および第二の抗原結合部分は、腫瘍関連抗原（ＣＤ１９等）に特異的に結合することができ、あるいはその逆も可能である。

【0205】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、以下を含む４つのポリペプチド鎖を含む： ｉ）第一のキメラ定常領域に作動可能に連結されたＶＨ１； ｉｉ）第二のキメラ定常領域に作動可能に連結されたＶＬ１； ｉｉｉ）従来の抗体重鎖定常領域に作動可能に連結されたＶＨ２、および ｉｖ）従来の抗体軽鎖定常領域に作動可能に連結されたＶＬ２。特定の実施形態では、第一のキメラ定常領域は、それぞれ上記で定義されたＣ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むことができる。特定の実施形態では、第二のキメラ定常領域は、上で定義したように、Ｃ２を含むことができる。特定の実施形態では、従来の抗体重鎖定常領域は、それぞれ上記で定義したように、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むことができる。特定の実施形態では、従来の抗体軽鎖定常領域は、上記で定義したように、ＣＬを含むことができる。

【0206】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号６６、６７、および６８（表２２）からなる群から選択される３つの配列の組み合わせを含み、ここで第一の抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に結合し、第二の抗原結合部分は４－１ＢＢに結合する。

【0207】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号６９、７０、７１、および７２（表２３）からなる群から選択される４つの配列の組み合わせを含み、ここで第一の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ２に結合し、第二の抗原結合部分はＨＥＲ２ Ｄ４に結合する。

【0208】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号７３、７４、および７５（表２４）からなる群から選択される３つの配列の組み合わせを含み、ここで第一の抗原結合部分はＩＬ－１７に結合し、第二の抗原結合部分はＩＬ－２０に結合する。

【0209】

特定の実施形態では、二重特異性ポリペプチド複合体は、配列番号７６、７７、および７８（表２５）からなる群から選択される３つの配列の組み合わせを含み、ここで第一の抗原結合部分はＩＬ－４に結合し、第二の抗原結合部分はＩＬ－１３に結合する。

【0210】

調製方法
本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体をコードする単離された核酸またはポリヌクレオチドを提供する。

【0211】

本明細書で使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含むポリヌクレオチドを包含する。他に示さない限り、特定のポリヌクレオチド配列は、明示的に示された配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（たとえば、縮重コドン置換）、アリル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８ （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８ （１９９４）を参照）。

【0212】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、組換え技術を使用して構築することができる。この目的のために、親抗体の抗原結合部分（ＣＤＲまたは可変領域等）をコードするＤＮＡを単離し、従来の手順を使用して（たとえば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。同様に、ＴＣＲ定常領域をコードするＤＮＡも取得することができる。一例として、可変ドメイン（ＶＨ）をコードするポリヌクレオチド配列および第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）をコードするポリヌクレオチド配列が得られ、作動可能に連結されて、宿主細胞内での転写および発現が可能となり、第一のポリペプチドが生成される。同様に、ＶＬをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞内での第二のポリペプチドの発現を可能にするために、Ｃ１をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。必要に応じて、一つまたは複数のスペーサーをコードするポリヌクレオチド配列も、他のコード配列に作動可能に連結されて、所望の産物の発現を可能にする。

【0213】

コードするポリヌクレオチド配列（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、第一および第二のポリペプチドの発現または産生が実現可能であり、適切な制御下にあるように、場合により発現ベクターにおいて一つまたは複数の制御配列にさらに作動可能に連結することができる。

【0214】

コードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の組換え技術を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためにベクターに挿入することができる。別の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体は、当技術分野で知られている相同組換えによって生成され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は一般に、シグナル配列、複製起点、一つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（たとえば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および転写終結配列のうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない。

【0215】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に挿入され、そのタンパク質の発現をもたらすことができるビヒクルを指す。通常、構築物は適切な調節配列も含む。たとえば、ポリヌクレオチド分子は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および／または部位特異的改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’隣接領域に位置し、ポリヌクレオチド分子は、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列および部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'隣接領域に位置し、宿主細胞内で所望の転写物／遺伝子を発現することができる様式でコード配列に作動可能に連結された調節配列を含むことができる。ベクターを使用して宿主細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトし、それが宿主細胞内で保有する遺伝因子の発現をもたらすことができる。ベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスを含む。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス等）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（ＳＶ４０等）を含む。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々なエレメントを含んでもよい。さらに、ベクターは複製起点を含んでもよい。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングを含むがこれらに限定されない、細胞への侵入を補助する物質も含んでいてもよい。

【0216】

一部の実施形態では、ベクター系は、哺乳動物系、細菌系、酵母系等を含み、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ，ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２等、および他の研究室ベクター（ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌ ｖｅｃｔｏｒ）および市販のベクターのようなプラスミドを含むが、これらに限定されない。適切なベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含んでもよい。

【0217】

本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。本明細書で使用される「宿主細胞」という語句は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入された細胞を指す。

【0218】

本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等の真正細菌、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のエシェリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）等のセラチア属、シゲラ属、ならびに枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属、およびストレプトマイセス属等の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む。

【0219】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌等の真核微生物も、ポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体をコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核生物の宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、クルイベロミセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、クルイベロミセス・ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クルイベロミセス・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびクルイベロミセス・マルシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクルイベロミセス属の宿主；ヤロウィア属（ＥＰ ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワンニオミセス属；ならびにニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌等の他の多くの属、種、および株も一般に入手可能であり、本明細書において有用である。

【0220】

グリコシル化ポリペプチド複合体、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、およびヨトウガ［スポドプテラ・フンギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒａｇｉｐｅｒｄａ）］（毛虫）、ネッタイシマカ［アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）］（蚊）、ヒトスジシマカ［アエデス・アルボピクツス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）］（蚊）、キイロショウジョウバエ［ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）］（ショウジョウバエ）、カイコ［ボンビス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）］等の宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞（pｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｓｅｃｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、たとえば、オートグラファ・カリフォルニアＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ）のＬ－１バリアントおよびカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶ）のＢｍ－５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本開示による本明細書におけるウイルスとして使用することができ、特に、ヨトウガ［スポドプテラ・フンギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒａｇｉｐｅｒｄａ）］細胞のトランスフェクション用に使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。

【0221】

しかし、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖はルーチン的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；Ｅｘｐｉ２９３等のヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３－２５１ （１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８ （１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0222】

宿主細胞は、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、またはクローニングベクターの増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養することができる。

【0223】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体の産生のために、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を様々な培地で培養することができる。ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ；ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培ｔｉ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）， Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５ （１９８０）， 米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；または米国特許登録番号第３０，９８５号（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｒｅ． ３０，９８５）で記載されている培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用することもできる。これらの培地には、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）等の薬物）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。他の必要なサプリメントも、当業者に知られている適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

【0224】

一態様では、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体を発現する方法を提供し、この方法は、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体が発現される条件下で、本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む。

【0225】

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体を産生する方法であって、以下を含む、方法を提供する： ａ） 宿主細胞に以下を導入する工程： Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、 ここで： Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合はＣ１とＣ２との二量体を安定化することができる、および第一の抗体は第一の抗原特異性を有する； ｂ） 宿主細胞にポリペプチド複合体を発現させる工程。

【0226】

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体を産生する方法であって、以下を含む、方法を提供する： ａ） 宿主細胞に以下を導入する工程： Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、および第二の抗原結合部分をコードする一つまたは複数（たとえば、１つまたは２つ）の追加のポリヌクレオチド、ここで： Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１に含まれる第一の変異残基とＣ２に含まれる第二の変異残基との間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、非天然鎖間結合はＣ１とＣ２との二量体を安定化することができ、第一の抗原結合部分および第二の抗原結合部分は、第一の抗原結合部分が天然のＦａｂ対応物である場合に比べてミスペアリングを減少させる、および第一の抗体は第一の抗原特異性を有し、第二の抗体は第二の抗原特異性を有する、 ｂ） 宿主細胞が二重特異性ポリペプチド複合体を発現できるようにする工程。

【0227】

特定の実施形態では、この方法は、ポリペプチド複合体を単離する工程をさらに含む。

【0228】

組換え技術を使用する場合、本明細書で提供されるポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体は、細胞内で、細胞膜周辺腔で産生することができ、または培地に直接分泌することができる。生成物が細胞内で生成される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解断片のいずれかの微粒子破片が、たとえば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡単に説明すると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞破片は遠心分離によって除去することができる。生成物が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、通常、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述の工程のいずれかに含めることができ、外来性汚染物質の増殖を防ぐために抗生物質を含めることができる。

【0229】

細胞から調製される、本明細書に提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、好ましい精製技術はアフィニティークロマトグラフィーである。

【0230】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体が免疫グロブリンＦｃドメインを含む場合、ポリペプチド複合体中に存在するＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて、プロテインＡを親和性リガンドとして使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくポリペプチド複合体の精製に使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１－１３ （１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：１５６７ １５７５ （１９８６））。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも使用することができる。制御多孔質ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定したマトリックスを使用すると、アガロースで達成できる流量および処理時間よりも速い流量およびより短い処理時間が可能になる。

【0231】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）でのセファロース（商標）クロマトグラフィー［ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｈｅｐａｒｉｎ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標） ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ａｎ ａｎｉｏｎ ｏｒ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ （ｓｕｃｈ ａｓ ａ ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｌｕｍｎ）］、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収する抗体に応じて使用することができる。

【0232】

任意の予備精製工程に続いて、目的のポリペプチド複合体および夾雑物を含む混合物を、約２．５～４．５のｐＨで溶出緩衝液を使用する、好ましくは低塩濃度（たとえば、約０～０．２５Ｍの塩）で行う、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。

【0233】

特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、従来の方法を使用して高収率で容易に精製することができる。二重特異性ポリペプチド複合体の利点の一つは、重鎖可変ドメイン配列と軽鎖可変ドメイン配列との間のミスペアリングが大幅に減少することである。これにより、不要な副生成物の生成が減少し、比較的単純な精製プロセスを使用して高純度の生成物を高収率で得ることが可能になる。

【0234】

誘導体
特定の実施形態では、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、所望のコンジュゲートとの結合のベースとして使用することができる。

【0235】

様々なコンジュゲートが、本明細書に提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に結合され得ることが企図される（たとえば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｍ． Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ． Ｅ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊｒ． （ｅｄｓ．）， Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８９）を参照）。これらのコンジュゲートは、他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、混合、または付加によって、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に結合され得る。

【0236】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、一つまたは複数の複合体への結合に利用することができる、エピトープ結合部分の外側に特定の部位を含むように操作してもよい。たとえば、そのような部位は、コンジュゲートへの共有結合を促進するために、たとえばシステインまたはヒスチジン残基等の一つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含んでいてもよい。

【0237】

特定の実施形態では、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、直接的に、またはたとえば別のコンジュゲートまたはリンカーを通じて間接的にコンジュゲートに結合されていてもよい。

【0238】

たとえば、システイン等の反応性残基を有するポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、反応性基がたとえばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、または他のチオール反応性結合パートナー（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ）であるチオール反応性薬剤に結合されていてもよい（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ． ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０－５５，６４３－６７１）。

【0239】

別の例として、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体をビオチンに結合させ、次にアビジンに結合した第二のコンジュゲートに間接的に結合させることができる。さらに別の例として、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、結コンジュゲートにさらに結合するリンカーに結合することができる。リンカーの例は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジポイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネート等）、およびヒスチジン活性フッ素化合物［ｈｉｓ－ａｃｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｉｎｅ］（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）を含む。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供する、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １７３：７２３－７３７ （１９７８））およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。

【0240】

コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態修飾部分（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、精製部分、または細胞傷害性部分であってもよい。検出可能な標識の例は、蛍光標識（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、またはテキサスレッド）、酵素基質標識（たとえば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（たとえば、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１４Ｃ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^２１１Ａｔ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、および^３２Ｐ、他のランタニド）、発光ラベル、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、検出用のＤＮＡ分子または金を含んでもよい。特定の実施形態では、コンジュゲートは、抗体の半減期を延長するのに役立つＰＥＧ等の薬物動態修飾部分であってもよい。他の適切なポリマーは、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー等を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートは、磁気ビーズ等の精製部分であってもよい。「細胞傷害性部分」は、細胞に有害な物質、または細胞に損傷を与えるか細胞を殺す可能性のある任意の物質であってもよい。細胞傷害性部分の例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびそのアナログ、代謝拮抗剤（たとえば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル（ｔｈｉｏｅｐａ ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン （ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン系（たとえば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分阻害薬（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。

【0241】

抗体、免疫グロブリンまたはその断片等のタンパク質へのコンジュゲートの結合のための方法は、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第６，４４１，１６３号；ＷＯ２００５０３７９９２号；ＷＯ２００５０８１７１１号; およびＷＯ２００６／０３４４８８号に見出され、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0242】

医薬組成物
本開示は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供する。

【0243】

「薬学的に許容される」という用語は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、一般に、製剤を構成する他の成分と化学的および／または物理的に適合し、そのレシピエントと生理学的に適合することを示す。

【0244】

「薬学的に許容される担体」とは、生物活性が許容され、対象にとって非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。本明細書に開示される医薬組成物で使用するための薬学的に許容される担体は、たとえば、薬学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁剤／分散剤、封鎖剤またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助物質、当該技術分野で知られている他の成分、またはそれらの様々な組み合わせを含む。

【0245】

適切な成分は、たとえば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖およびシクロデキストリン等の安定化剤を含んでもよい。適切な抗酸化剤は、たとえば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチルヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘａｎｉｓｏｌ）、ブチルヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルを含んでもよい。本明細書に開示されるように、本明細書に提供される医薬組成物中にメチオニン等の一つまたは複数の抗酸化剤を含めると、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体の酸化が減少する。この酸化の減少により、結合親和性の損失が防止または軽減され、それによってタンパク質の安定性が向上し、保存期間が最大化される。したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体およびメチオニン等の一つまたは複数の抗酸化剤を含む組成物が提供される。

【0246】

さらに説明すると、薬学的に許容される担体は、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、またはブドウ糖加乳酸リンゲル注射液等の水性ビヒクル、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、または落花生油等の非水性ビヒクル、静菌濃度または静真菌濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の等張剤、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液等の緩衝液、重硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、塩酸プロカイン等の局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等の懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）等の乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）等の封鎖剤またはキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸を含んでもよい。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀剤（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ）、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む複数回用量の容器内の医薬組成物に添加することができる。適切な賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、またはエタノールを含む。適切な非毒性補助物質は、たとえば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、またはシクロデキストリンを含む。

【0247】

医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、徐放性製剤、または散剤であってもよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含んでもよい。

【0248】

特定の実施形態では、医薬組成物は注射可能な組成物に製剤化される。注射可能な医薬組成物は、たとえば溶液、懸濁剤、乳剤、または液剤、または懸濁剤、乳剤、もしくは液剤を生成するのに適した固体形態等の任意の従来の形態で調製することができる。注射用製剤は、すぐに注射することができる滅菌および／または非発熱性の液剤、使用直前に溶媒と混合することができる凍結乾燥粉末等の滅菌乾燥可溶性製品（皮下注射錠剤（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ ｔａｂｌｅｔ）を含む）、すぐに注射することができる滅菌懸濁剤、使用直前にビヒクルとすぐに混合できる滅菌乾燥不溶性製品、滅菌および／または非発熱性乳剤を含んでもよい。溶液は水性であっても非水性であってもよい。

【0249】

特定の実施形態では、単位用量の非経口製剤は、アンプル、バイアル、または針付きの注射器に包装される。当技術分野で知られ実施されているように、非経口投与のためのすべての製剤は無菌であるべきであり、発熱性ではないべきである。

【0250】

特定の実施形態では、滅菌凍結乾燥粉末は、本明細書に開示されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を適切な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、粉末または粉末から調製される再構成溶液の安定性を改善する賦形剤または他の薬理学的成分を含んでもよい。使用できる賦形剤は、水、ブドウ糖、ソルビタール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の適切な薬剤を含むが、これらに限定されない。溶媒は、一実施形態では、ほぼ中性のｐＨで、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム、または当業者に公知の他のそのような緩衝液等の緩衝液を含有してもよい。続いて溶液を滅菌濾過し、続いて当業者に公知の標準条件下で凍結乾燥することにより、望ましい製剤が得られる。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアルに分配される。各バイアルは、本明細書で提供されるポリペプチド複合体、二重特異性ポリペプチド複合体、またはそれらの組成物の単回投与量または複数回投与量を含むことができる。正確な試料の採取および正確な投与を容易にするために、１回の用量または一連の用量に必要な量より少量（たとえば、約１０％）を超える量をバイアルに過剰充填することは許容される。凍結乾燥粉末は、約４℃から室温等の適切な条件下で保存することができる。

【0251】

凍結乾燥粉末を注射用水で再構成すると、非経口投与に使用するための製剤が提供される。一実施形態では、再構成のために、滅菌および／または非発熱性の水、または他の液体の適切な担体が凍結乾燥粉末に添加される。正確な量は、選択された治療法によって異なり、経験的に決定することができる。

【0252】

治療方法
治療有効量の本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与し、それによって状態または障害を治療または予防することを含む、治療方法も提供される。特定の実施形態では、対象は、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている。

【0253】

本明細書で使用される状態の「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、状態を予防または緩和すること、状態の発症または発症速度を遅らせること、状態を発症するリスクを低減すること、状態に関連する症状の発現を予防または遅延すること、状態に関連する症状の軽減または終了、状態の完全または部分的な後退の生成、状態の治癒、またはそれらの組み合わせを含む。

【0254】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体の治療有効量は、たとえば、対象の体重、年齢、過去の病歴、現在の投薬、健康状態、交差反応の可能性、アレルギー、過敏症、および有害な副作用、ならびに投与経路および疾患の進行の程度等の当技術分野で知られている様々な要因に依存するであろう。用量は、これらおよび他の状況または要件によって示されるように、当業者（たとえば、医師または獣医師）によって比例的に減少または増加することができる。

【0255】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効量で投与することができる（たとえば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ）。これらの実施形態の特定のものでは、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、これらの実施形態の特定のものでは、用量は１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投与量は治療の過程で変化し得る。たとえば、特定の実施形態では、初回投与量はその後の投与量よりも高くてもよい。特定の実施形態では、投与量は、対象の応答に応じて治療期間にわたって変化し得る。

【0256】

投与計画は、最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供するように調整することができる。たとえば、単回用量を投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよい。

【0257】

本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、たとえば、非経口（たとえば、皮下、腹腔内、静脈内注入、筋肉内または皮内注射を含む静脈内注射）または非非経口［ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ］（たとえば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸、または局所）経路等の当技術分野で知られている任意の経路によって投与することができる。

【0258】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体によって治療される状態または障害は、がんまたはがん性状態、自己免疫疾患、感染症および寄生虫性疾患、心血管疾患、神経障害、精神神経状態（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、傷害、炎症、または凝固障害である。

【0259】

がんに関して、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、新生物または悪性細胞の成長、増殖、または転移を予防または遅らせること、新生物または悪性細胞の成長、増殖、または転移の発生を予防または遅らせること、またはそれらの一部の組み合わせを指し得る。腫瘍に関して、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、腫瘍の全部または一部を根絶すること、腫瘍の増殖（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ）および転移を予防または遅らせること、腫瘍の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ）を予防または遅らせること、またはそれらの一部の組み合わせを含む。

【0260】

たとえば、がんを治療するための本明細書に開示されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体の使用に関して、治療有効量は、腫瘍の全部または一部を根絶することができる、腫瘍を予防または遅らせることができる、がん性状態を媒介する細胞の成長または増殖を予防することができる、腫瘍細胞の転移を予防することができる、腫瘍またはがん性状態に関連する症状またはマーカーを改善することができる、腫瘍またはがん性状態の発症を予防または遅らせることができる、またはそれらの一部の組み合わせを可能にする、ポリペプチド複合体の用量または濃度である。

【0261】

特定の実施形態では、状態および障害は、腫瘍およびがん、たとえば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、グリア芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫（ｍｙｃｏｓｅｓ ｆｕｎｇｏｉｄｓ）、メルケル細胞がん、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ－ｒｉｃｈ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、およびＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫等のその他の血液悪性腫瘍、上咽頭がん、およびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫等の中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物を含む。

【0262】

特定の実施形態では、状態および障害は、Ｂ細胞リンパ腫、場合によりホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫等のＣＤ１９関連疾患または状態を含み、ここで非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺＬ）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ性白血病、ＣＬＬ）、またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、またはワルデンストロムマクログロブリン血症（ＷＭ）を含む。

【0263】

特定の実施形態では、状態および障害は、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１による免疫応答の制御を介して治療することができる過剰増殖状態または感染症を含む。過剰増殖状態の例は、固形腫瘍、血液がん、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。

【0264】

ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、単独で投与してもよいし、一つまたは複数の追加の治療手段または薬剤と組み合わせて投与してもよい。

【0265】

特定の実施形態では、がん、腫瘍、または増殖性疾患の治療に使用される場合、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、がんの治療のための化学療法、放射線療法、手術（たとえば、腫瘍切除術）、一つまたは複数の制吐薬、または化学療法から生じる合併症の他の治療法、またはがんまたは関連する何らかの医学的障害の治療に使用するための他の治療薬と組み合わせて投与することができる。本明細書で使用される「組み合わせて投与される」は、同じ医薬組成物の一部として同時に、別個の組成物として同時に、または別個の組成物として異なるタイミングで投与することを含む。別の薬剤の前または後に投与される組成物は、組成物と第二の薬剤が異なる経路を介して投与される場合でも、本明細書で使用される表現のように、その薬剤と「組み合わせて」投与されるとみなされる。可能な場合、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体と組み合わせて投与される追加の治療薬は、追加の治療薬の製品情報シートに記載されているスケジュールに従って、または米医薬品便覧［Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ‘ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ］（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ７０ｔｈ Ｅｄ （２０１６））または当技術分野において公知のプロトコルに従って投与される。

【0266】

特定の実施形態では、治療薬は、がんに対する免疫応答を誘導または増強することができる。たとえば、腫瘍ワクチンは、特定の腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導するために使用することができる。サイトカイン療法は、免疫系への腫瘍抗原の提示を強化するために使用することもできる。サイトカイン療法の例は、インターフェロン－α、－β、－γなどのインターフェロン、マクロファージ－ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、および顆粒球－ＣＳＦ等のコロニー刺激因子、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、およびＩＬ－１２等のインターロイキン、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－β等の腫瘍壊死因子を含むが、これらに限定されない。免疫抑制標的を不活性化する薬剤、たとえば、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、およびＦａｓリガンド阻害剤も使用することができる。別の薬剤グループは、腫瘍またはがん細胞に対する免疫応答を活性化する薬剤、たとえば、Ｔ細胞活性化を増強する薬剤（たとえば、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、およびＯＸ－４０等のＴ細胞共刺激分子のアゴニスト）、および樹状細胞機能および抗原提示を増強する薬剤を含む。

【0267】

キット
本開示はさらに、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、生体試料中の一つまたは複数の対象標的の存在もしくはレベルを検出するか、またはそれを捕捉もしくは濃縮するのに有用である。生体試料、は細胞または組織を含んでもよい。

【0268】

一部の実施形態では、キットは、検出可能な標識と結合した、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を含む。特定の他の実施形態では、キットは、本明細書で提供される非標識ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体を含み、本明細書で提供される非標識ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体に結合することができる二次標識抗体をさらに含む。キットはさらに、使用説明書、およびキット内の各構成要素を分離するパッケージを含んでもよい。

【0269】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体は、基板またはデバイスと結合される。有用な基質またはデバイスは、たとえば、磁気ビーズ、マイクロタイタープレート、または試験紙であってもよい。このようなものは、結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ等）、イムノグラフィーアッセイ、生体試料中の標的分子の捕捉または濃縮に役立ち得る。

【0270】

以下の実施例は、本開示をより良く説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下に記載されるすべての特定の組成物、材料、および方法は、全部または一部が、本開示の範囲内に含まれる。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定することを意図したものではなく、単に本発明の範囲内に含まれる特定の実施形態を例示することを目的としている。当業者は、発明能力を発揮することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料、および方法を開発することができる。本開示の範囲内に留まりながら、本明細書に記載の手順において多くの変形を行うことができることが理解されるであろう。このような変形例が本開示の範囲内に含まれることが発明者の意図である。

【実施例1】

【0271】

１． 方法
１．１． 表１および１０に例示される二重特異性抗体の生成
ＶＬ、ＶＨ、Ｃｋ、およびＣＨ１をそれぞれコードするポリヌクレオチドを、既存のインハウスＤＮＡ鋳型からＰＣＲによって増幅した。ＣＡｌｐｈａおよびＣＢｅｔａ領域をコードするポリヌクレオチドは、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃ．によって合成された。抗体のネイティブまたはキメラ軽鎖配列をコードするポリヌクレオチドを、ＣＭＶプロモーターおよびカッパまたはラムダシグナルペプチドを含む線状ベクターに挿入した。

【0272】

抗標的１ ＶＨ－ＣＨ１および抗標的２ ＶＨ－ＣＢｅｔａのＤＮＡ断片を、フォーマット、たとえばＥ１７ＲおよびＧ２５Ｒによる（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを有するヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）定常領域ＣＨ２－ＣＨ３を含む線状化ベクターに挿入した。たとえば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーは、２つの結合部分の間（たとえば、第一の結合部分のＣＨ１と第二の結合部分のＶＨ２との間）、またはＦｃと結合部分との間に位置し得る。特定の実施形態では、Ｅ１７Ｒは（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを有さない。特定の実施形態では、Ｇ２５Ｒは、２つの結合部分の間に（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを有する。

【0273】

ベクターはＣＭＶプロモーターおよびヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む。

【0274】

１．２． 発現および精製
重鎖および軽鎖発現プラスミドを、メーカーの説明に従って、Ｅｘｐｉ２９３発現システムキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ａ１４６３５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、上清を収集し、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７５４３ ８０２）を使用してタンパク質を精製した。抗体濃度はＮａｎｏ Ｄｒｏｐにより測定した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＳＥＣによって評価した。

【0275】

１．３． 示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）
抗体の融解温度（Ｔｍ）は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標） ７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して研究した。１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。プレートを０．９℃／分の速度で２６℃から９５℃まで加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の導関数を計算し、データ収集およびＴｏｎｓｅｔ／Ｔｍ計算を操作ソフトウェａ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．３）によって自動的に実行した。

【0276】

１．４． 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣ分析は、Ｍａｌｖｅｒｎ ＤＳＣシステムによって実施した。分析前に、タンパク質試料をまず配合緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。４００μＬのそれぞれの配合緩衝液を参照として９６ウェルプレートに添加し、４００μＬのタンパク質試料を添加した。試料は、ＤＳＣシステム内で９０℃／時間の加熱速度で １０℃から９５℃まで加熱された。ＤＳＣ結果（ＴｍオンセットおよびＴｍ値）は、ベンダーのソフトウェア（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ ＤＳＣソフトウェア１．３０およびＭａｌｖｅｒｎ）によって分析した。

【0277】

１．５． 動的光散乱（ＤＬＳ）によるタグオンセット測定（Ｔａｇｇ－ｏｎｓｅｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
タグオンセットの測定（Ｔａｇｇ－ｏｎｓｅｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）は、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ Ｄｙｎａｐｒｏ（商標））を使用して研究した。各タンパク質試料について３回の取得が収集され、各取得時間は５秒であった。各ウェルは、１５３６プレート（Ａｕｒｏｒａ マイクロプレート）に７．５μＬの抗体溶液および５μＬのシリコンオイルを含んでいた。プレートを０．１２５℃／分の速度で４０℃から８０℃まで加熱した。各測定について、拡散係数を決定し、温度に対してプロットした。タグオンセット値は、操作ソフトウェア（ＤＹＮＡＭＩＣＳ ７．８．１．３）によって自動的に計算した。

【0278】

１．６． ４０℃加速熱安定性試験
抗体は、エッペンドルフ恒温ミキサーを使用して４０℃でインキュベートし、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００によって２８０ｎｍでタンパク質溶液の吸収値を測定し、外観を記録し、０日後、１日後、３日後、７日後、１４日後、２７日後、および３４日後にＳＥＣ－ＨＰＬＣによって純度を検出した。

【0279】

１．７． Ｏ－グリカンの質量スペクトル
２０μｇのタンパク質試料（タンパク質濃度に基づいて試料量を計算した）を１．５ｍＬチューブに添加した。タンパク質試料は、４μＬ ５×Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、および精製水で２０μＬに調製した。得られたタンパク質試料をよく混合し、７５℃で ５～７分間インキュベートした。次に試料を室温まで冷却し、１μＬ Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを添加し、よく混合し、５０℃で１０～１５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料に３０μＬの精製水を添加してよく混合し、脱グリコシル化試料を得た。次いで、脱グリコシル化された試料を、分析のためにガラスインサートバイアルを備えた ＨＰＬＣバイアルに移した。

【0280】

１．８ 標的発現細胞への結合
ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１（１×１０^５細胞／ウェル）および４－１ＢＢ発現細胞ＷＢＰ３４２－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１を、様々な濃度の試験抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、二次抗体Ｒ－ＰＥヤギ抗ヒト ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ－１０９－１１５－０９８）を添加し、細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳに再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターで測定し、ＦｌｏｗＪｏで解析した。

【0281】

１．９． レポーター遺伝子アッセイ
エフェクター細胞ＷＢＰ３４２－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．ＮＦκＢ．Ｃ１Ｄ８およびＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯＫ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１を回収し、洗浄し、Ｆ－１２Ｋ完全培地に再懸濁した。完全培地中の様々な濃度の試験抗体をＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に添加した。次に、ＲＧＡエフェクター細胞、ＷＢＰ３４２－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．ＮＦκＢ．Ｃ１Ｄ８細胞（安定して組み込まれたＮＦκＢルシフェラーゼ レポーター遺伝子とともに、完全長のヒト４－１ＢＢを安定して発現する）を各ウェルに添加した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２で４～６時間インキュベートした。インキュベーション後、再構成されたＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、ルシフェラーゼ強度をマイクロプレートリーダーで測定した。

【0282】

１．１０． げっ歯類の薬物動態（ＰＫ）
この研究では、一群として５匹の動物を使用した。動物には、１０ｍｇ／ｋｇの抗体を１０分間に１回静脈内注入してそれぞれ投与した。ベースライン試料（投与前）は研究－１日目に収集した。ＰＫサンプルは、ラットへの投与終了後０．５時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、２８８時間、３３６時間、および５０４時間で収集した。

【0283】

抗薬物抗体（ＡＤＡ）試料を、投与前（－１日目）、ならびに投与後の１６８時間および２４０時間で収集した。血清試料中の抗体およびＡＤＡの血清濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。

【0284】

２． 結果
２．１．１． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）の工学設計
この例示的な実施形態では、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－？．ｕＩｇＧ１シリーズと呼ばれる対称２＋２ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＣＡｌｐｈａ領域およびＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａ界面領域を操作した。特定の変異は、ロゼッタ設計を使用して導入した（Ｆｒｏｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ， （２０２０） １１：２３３０， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１６２３１－７．）。Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－？．ｕＩｇＧ１分子のＣＡｌｐｈａ配列（ＴＣＲα配列）およびＣＢｅｔａ配列（ＴＣＲβ配列）を表１に示す。「Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－？．ｕＩｇＧ１」シリーズの分子の名称の長さを短くすることができる。たとえば、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１は、Ｔ８３１１－５７または設計５７と呼ぶことができる。

【0285】

Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１（表１ではＴ８３１１－１と示される）の全長アミノ酸配列を表２２に示す。表１に挙げた他の抗体（たとえば、Ｔ８３１１－８、Ｔ８３１１－２６、Ｔ８３１１－２９等）はそれぞれ、表１に示すＣＡｌｐｈａ配列およびＣＢｅｔａ配列を除き、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と同じアミノ酸配列を含む。たとえば、Ｔ８３１１－１は、ＣＡｌｐｈａ領域に配列番号１０、ＣＢｅｔａ領域およびヒンジ領域に配列番号１１を含む；Ｔ８３１１－８は、ＣＡｌｐｈａ領域に配列番号１２、ＣＢｅｔａ領域およびヒンジ領域に配列番号１３を含む。Ｔ８３１１－１およびＴ８３１１－８は、表１：配列番号１０および１１（Ｔ８３１１－１の場合）対配列番号１２および１３（Ｔ８３１１－８の場合）に示すように、ＣＡｌｐｈａ配列およびＣＢｅｔａ配列を除いて抗体の他の領域に同じ配列を含む。

【0286】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0287】

２．１．２． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）のタンパク質産生
表２は、Ｅｘｐｉ２９３における一過性発現による、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－８．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－２６．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－２９．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－４５．ｕＩｇＧ１からＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１を含むタンパク質の収量および純度の概要を示す。プロテインＡを一工程で精製した後、すべてのｂｓＡｂの純度は＞９０％に達した。表２に示すように、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、発現レベル（たとえば、一段階精製後の収量）をそれぞれ４６～８６％および１２～３９％改善した。図１および図２は、精製後のタンパク質の２つのバッチのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣの特性を示す。これらのｂｓＡｂは、非還元条件下では２５０ｋＤａ、還元条件下では７５ｋＤａ、２５ｋＤａの見かけの分子量で移動し、インタクトで良好に組み立てられた（ｗｅｌｌ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）二重特異性分子を示した。

【0288】

【表2】

【0289】

２．１．３． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）のＤＳＦ特性評価
Ｔ８３１１シリーズの精製タンパク質の熱安定性をＤＳＦによって特性評価し、その結果を表３に列挙した。Ｔ８３１１シリーズのほとんどは、Ｔｍ－ｏｎｓｅｔおよびＴｍ１が程度の差はあるが改善されており、特にＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１。参照ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較して、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１はＴｍ－ｏｎｓｅｔを６～８℃改善し、Ｔｍ１を３℃改善している。図３は、温度上昇時のＴ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子の最初のバッチのＤＳＦプロファイルを示す。

【0290】

【表3】

【0291】

２．１．４． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）のＤＳＣ特性評価
参照Ｔ８３１１ ２＋２分子（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）、ならびに他のＴ８３１１分子の一部を、ＤＳＣを使用してさらに特性評価した。図４は、Ｔ８３１１分子のＤＳＣ曲線が右にシフトしていることを示しており、温度上昇に対する耐性が比較的強いことを示している。表４にＴｍ－ｏｎｓｅｔおよびＴｍ１の値を示す。Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１および Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、最も性能が優れた２つの分子であった。Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１は、Ｔｍ－ｏｎｓｅｔを８．８℃上昇させ、Ｔｍ１を３．６℃改善して、６４．０℃にした。これは、通常のＩｇＧ４抗体のＴｍ１（～６５℃）に近い値である。Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１も、Ｔｍ－ｏｎｓｅｔおよびＴｍ１をそれぞれ５．５℃および２．８℃、大幅に改善した。

【0292】

【表4】

【0293】

２．１．５． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）（２＋２、対称）分子の設計のＤＬＳ特性評価
一部のＴ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子も、図５に示すようにＤＬＳによって特性評価した。得られたタグオンセット（Ｔａｇｇ－ｏｎｓｅｔ）値を表５に列挙する。Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、タグオンセット値の観点で上位２つのバリアントとしてランク付けされた。どちらの設計でも、参照分子（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較してタグオンセットが約３～４℃改善された。

【0294】

【表5】

【0295】

２．１．６． Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）の４０℃加速熱安定性試験
Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１、およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１を熱ストレス条件でさらに検査した。５ｍｇ／ｍｌおよび＞９０％の純度で調製した分子を４０℃で２週間インキュベートした。これらの試料の純度を１日目、３日目、７日目、および１４日目にモニタリングした。表６に２つの抗体の純度の変化を示した。

【0296】

１４日目の参照抗体（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）の純度は９０％未満の値に低下したが、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１（設計－５７のＣＡｌｐｈａ配列およびＣＢｅｔａ配列の設計）およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１（設計－６１）の純度は、９０％以上を維持しており、この２つの設計は、抗体の長期的な熱安定性の向上においても重要な役割を果たしていることを示している。ＣＡｌｐｈａ配列およびＣＢｅｔａ配列の設計（配列）Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１は、設計－５７と呼ばれ、ＣＡｌｐｈａ配列およびＣＢｅｔａ配列の設計（配列）Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、設計－６１と呼ばれる。これらのデータをさらに分析したところ、設計－５７および設計－６１は凝集画分の発達（ｇｒｏｗｔｈ）を低減することによって抗体の長期熱安定性を主に向上させたことが明らかになり、これはＤＬＳの結果とも一致している。

【0297】

【表6】

【0298】

２．１．７． 質量スペクトルによって特性評価されるＯ－グリカン
選択されたＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のグリコシル化状態を質量分析法によって検査した。参照ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子にはＯ－グリコシル化部位があることが知られている。還元質量スペクトルでは、コア－１構造のＯ－グリカン（ＧｌｃＮＡｃ＋Ｈｅｘ＋２＊ＮｅｕＡｃ）の質量が参照分子のＶＬ－ＣＡｌｐｈａ軽鎖上で観察された。しかし、Ｏ－グリカンシグナルは、設計－５７および設計－６１のＶＬ－ＣＡｌｐｈａ鎖では観察されなかった（図６）。

【0299】

２．１．８． 標的発現細胞への結合
ＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａ領域におけるこれらの変異がＴ８３１１ ｂｓＡｂの結合能力に影響を及ぼさないことを確認するために、各標的（抗原）を発現する細胞操作に対するＦＡＣＳ結合を実施した。図７および表７に示すように、参照分子と比較して、Ｔ８３１１バリアントは標的結合能力を非常に良好に維持した。

【0300】

【表7】

【0301】

図７は、２つの標的に対するＴ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標） ｂｓＡｂのＦＡＣＳ結合を示す。太い曲線は各標的に対する陽性対照であった。ＥＣ５０および上位ＭＦＩ値を表７に列挙する。

【0302】

２．１．９． レポーター遺伝子アッセイ
Ｔ８３１１ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標） ｂｓＡｂの機能をレポーター遺伝子アッセイで確認した。標的Ａ発現細胞によって架橋結合すると、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１、およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１は、標的Ｂを介したＮＦ－ＫＢ経路活性化において同等のアゴニスト効果を示した。データを表８および図８に示す。

【0303】

【表8】

【0304】

図８は、Ｔ８３１１ ｂｓＡｂの機能を確認するためのレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。

【0305】

２．１．１０． げっ歯類ＰＫ
設計されたＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＰＫをラットで評価した。ＳＤラットに１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。分子の血漿濃度はＥＬＩＳＡ法により測定した。試料を２１日間収集した。並べて比較するために、ｓｃＦａｂを使用して制御フォーマットＧ３４も構築した。表９Ａに示すように、設計－８、設計－２６、設計－２９、および設計－４５は、参照（Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較して同等の薬物曝露およびＰＫパラメータを示した。Ｇ３４フォーマットを図１４に示す。これはｓｃＦａｂを含むが、ＣａｌｐｈａおよびＣｂｅｔａを含まない。表９Ｂに示すように、設計－５７および設計－６１は薬物曝露を大幅に改善した。参照分子のクリアランス１１．１ｍｌ／日／ｋｇと比較して、Ｔ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＴ８３１１－Ｕ１４Ｔ２．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１のクリアランスは、それぞれ６．６ｍｌ／日／ｋｇおよび６．７ｍｌ／日／ｋｇに減少した（表９Ｂ）。これは４０％の向上であり、通常のモノクローナル抗体に近いレベルを達成した。しかし、制御フォーマットＧ３４は最悪のＰＫ動作を示した。

【0306】

【表9】

【0307】

【表10】

【0308】

２．２．１． Ｗ３６１８分子（１＋１、非対称）のＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）エンジニアリング

【0309】

【表11】

【0310】

２．２．２． Ｗ３６１８ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のタンパク質産生
表１１は、Ｅｘｐｉ２９３における一過性発現によるＷ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１、およびＷ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１の収量および純度の概要を示す。３段階の精製後、すべてのｂｓＡｂの純度は＞９０％に達した。図１０は、精製後のタンパク質の関連するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性を示す。これらのｂｓＡｂは、非還元条件下では１５０ｋＤａ、還元条件下では５０ｋＤａ、２５ｋＤａの見かけの分子量で移動し、インタクトで良好に組み立てられた（ｗｅｌｌ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）二重特異性分子を示した。

【0311】

【表12】

【0312】

２．２．３． Ｗ３６１８ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦ
Ｗ３６１８シリーズの精製タンパク質の熱安定性をＤＳＦによって特性評価し、その結果を表１２に列挙した。参照ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較して、設計－５７（Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１）および設計－６１（Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１）は、Ｔｍ－ｏｎｓｅｔを２～４℃改善し、Ｔｍ１を４℃改善した。

【0313】

【表13】

【0314】

図１１は、温度上昇時のＷ３６１８ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦプロファイルを示す。

【0315】

２．２．４． げっ歯類ＰＫ
図１５に示すように、Ｗ３６１８の設計－５７および設計－６１は、薬物曝露を大幅に改善した。参照分子（Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）のクリアランス９．９４ｍｌ／日／ｋｇと比較して、Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１のクリアランスはそれぞれ６．３５ｍｌ／日／ｋｇおよび５．５４ｍｌ／日／ｋｇに減少した。Ｗ３６１８－Ｕ４Ｔ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ１の半減期も、設計－５７および設計－６１によって、それぞれ１７６時間から２８９時間および３８８時間に大幅に改善された（表１３）。これは４０％以上の改善であり、通常のモノクローナル抗体に近いレベルを達成した。

【0316】

【表14】

【0317】

２．３．１． Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）に関するＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）操作

【0318】

【表15】

【0319】

２．３．２． Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のタンパク質産生
Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子は、ＦＩＴ－Ｉｇ（ＩＬ１７×ＩＬ２０）（ＷＯ２０１７／１３６８２０号、ＦＩＴ－Ｉｇを参照）の公的に入手可能な配列に基づいて生成された（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と命名）。

【0320】

表１５は、Ｅｘｐｉ２９３における一過性発現によるＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１、およびＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１の収量および純度の概要を示す。２段階の精製後、これらすべてのｂｓＡｂの純度は＞９０％に達した。図１６は、精製後のタンパク質の関連するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性を示す。これらのｂｓＡｂは、非還元条件下では２５０ｋＤａ、還元条件下では７５ｋＤａ、２５ｋＤａ、および２５ｋＤａの見かけの分子量で移動し、インタクトで良好に組み立てられた（ｗｅｌｌ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）二重特異性分子を示した。

【0321】

【表16】

【0322】

２．３．３． Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦ
Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３シリーズの精製タンパク質の熱安定性をＤＳＦによって特性評価し、その結果を表１６に列挙した。参照ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較して、設計－５７（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１）および設計－６１（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１）はＴｍ１を１℃改善した。

【0323】

【表17】

【0324】

図１７は、温度上昇時のＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦプロファイルを示す。

【0325】

２．３．４． げっ歯類ＰＫ
図１８に示すように、Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３の設計－５７および設計－６１は、薬物曝露を大幅に改善した。参照分子（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）のクリアランス９．６ｍｌ／日／ｋｇと比較して、Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１のクリアランスはそれぞれ８．６３ｍｌ／日／ｋｇおよび６．０６ｍｌ／日／ｋｇに減少した。半減期も、Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と比較して、設計－５７および設計－６１によって、それぞれ１６７時間から２１３時間および３４１時間に改善された（表１７）。同様の改善は、抗原－Ｆｃ ＥＬＩＳＡ法で検出した場合にも観察された。これは大幅な改善であり、通常のモノクローナル抗体に近いレベルを達成した。

【0326】

【表18】

【0327】

２．４．１． Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（２＋２、対称）に関するＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）操作

【0328】

【表19】

【0329】

２．４．２． Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のタンパク質産生
Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子は、公的に入手可能なＣＯＤＶ－Ｉｇ配列（ＩＬ４×ＩＬ１３）に基づいて生成された（Ａｎｋｅ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．、「ＣＯＤＶ－Ｉｇ、医療用途のための普遍的な二重特異性四価および多機能免疫グロブリンフォーマット」、MＡＢＳ，２０１６，ＶＯＬ．８，ＮＯ．５，８６７－８７８，ＣＯＤＶ－Ｉｇを参照）。

【0330】

表１９は、Ｅｘｐｉ２９３での一過性発現によるＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７８．ｕＩｇＧ１、およびＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７９．ｕＩｇＧ１のタンパク質の収量および純度の概要を示す。一段階の精製後、これらすべてのｂｓＡｂの純度は＞９０％に達した。図１９は、精製後のタンパク質の関連するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ特性を示す。これらのｂｓＡｂは、非還元条件下では２５０ｋＤａ、還元条件下では７５ｋＤａ、２５ｋＤａ、および２５ｋＤａの見かけの分子量で移動し、インタクトで良好に組み立てられた（ｗｅｌｌ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）二重特異性分子を示した。

【0331】

【表20】

【0332】

２．４．３． Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦ
Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４シリーズの精製タンパク質の熱安定性をＤＳＦによって特性評価し、その結果を表２０に列挙する。参照ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子（Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）と比較して、設計－５７（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１）、設計－６１（Ｗ３２９００１－Ｕ３Ｔ３．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１）、設計－７８（Ｗ３２９００１－ Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７８．ｕＩｇＧ１）、および設計－７９（Ｗ３２９００１－ Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－７９．ｕＩｇＧ１）はＴｍ１を６～９℃改善した。

【0333】

【表21】

【0334】

図２０は、温度上昇時のＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４ ＷｕＸｉＢｏｄｙ（商標）分子のＤＳＦプロファイルを示す。

【0335】

２．４．４． げっ歯類ＰＫ
図２１に示すように、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４の設計－５７および設計－６１は、薬物曝露を大幅に改善した。参照分子Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１）のクリアランス５．１６ｍｌ／日／ｋｇと比較して、Ｗ３２９００１－ Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－５７．ｕＩｇＧ１およびＷ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－６１．ｕＩｇＧ１のクリアランスは、それぞれ４．７５ｍｌ／日／ｋｇおよび３．３９ ｍｌ／日／ｋｇに減少した。半減期も、Ｗ３２９００１－Ｕ４Ｔ４．Ｇ２５Ｒ－１．ｕＩｇＧ１と比較して、設計－５７および設計－６１によって、それぞれ２２０時間から２２５時間および３４４時間に改善された（表２１）。同様の改善は、抗原－Ｆｃ ＥＬＩＳＡ法で検出した場合にも観察された。これは大幅な改善であり、通常のモノクローナル抗体に近いレベルを達成した。

【0336】

図２２および図２３では、設計－５７および設計－７８（ＣａｌｐｈａにＣ末端ＰＥＳＳが付加された設計－５７）、ならびに設計－６１および設計－７９（ＣａｌｐｈａにＣ末端ＰＥＳＳが付加された設計－６１）の間のラットＰＫ結果を比較する場合、Ｆｃ－Ｆｃ検出法または抗原－Ｆｃ検出法のいずれによっても有意差は観察されなかった（表２１）。ＤＳＦ （図２０）およびＯ－グリコシル化（データは示さず）による特性評価でも、明らかな違いは示されなかった。

【0337】

【表22】

【0338】

【表23-1】

【表23-2】

【0339】

【表24】

【0340】

【表25】

【0341】

【表26】

【0342】

【表27】

【0343】

本開示は、特定の実施形態を参照して特に図示および記載されてきたが、本明細書に開示されるとおりの本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更を行うことができることが当業者によって理解されるべきである。

【図1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2024503118000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-09-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第一の抗原結合部分および第二の抗原結合部分を含むポリペプチド複合体であって、ここで：
該第一の抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む第一のポリペプチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドを含み、
ここで：
Ｃ１は操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＣＢｅｔａを含み、およびＣ２は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、
またはＣ１は操作されたＣＡｌｐｈａを含み、およびＣ２は操作されたＣＢｅｔａを含み、
Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は該ポリペプチド複合体を安定化することができ、
該操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａは、該操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａのＣ末端領域、または操作されたＣＡｌｐｈａおよび／または操作されたＣＢｅｔａのＣ末端に近接している一つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの変異をさらに含み、ここで該少なくとも一つの変異は、操作されたＣＡｌｐｈａの安定性、操作されたＣＢｅｔａの安定性、および／または操作されたＣＡｌｐｈａ－ＣＢｅｔａの界面安定性を改善する、および
該第一の抗体は第一の抗原特異性を有する；および
該第二の抗原結合部分は第二の抗原特異性を有する、
ポリペプチド複合体。

【請求項2】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、Ｐ９２Ｓ、Ｅ９３Ｄ、Ｓ９４Ｖ、およびＳ９５Ｐから選択される少なくとも一つの変異残基を含む、および／または前記操作されたＣＢｅｔａが、Ｅ１７ＫおよびＳ２１Ａから選択される少なくとも一つの変異残基を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項3】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび／またはＣＢｅｔａが、以下から選択される、一つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成するための一つまたは複数の変異残基を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド複合体： ＣＡｌｐｈａ上のＰ８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＡ９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ１０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ２９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ３３Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＱ３４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＶ３５Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ３８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＫ３９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ７８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＮ８０Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＳ８１Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＩ８２Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ８４Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＤ８６Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＴ８７Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８８Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＦ８９Ｃ、ＣＡｌｐｈａ上のＰ９０Ｃ、およびＣＢｅｔａ上のＡ１８Ｃ。

【請求項4】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、そのＣ末端に「ＦＦＰＳＰＥＳＳ」（配列番号９）または「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の欠失を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項5】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＶＥＰＫＳ」（配列番号５）を有する変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項6】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａのＣ末端に「ＰＥＳＳ」（配列番号６）の代わりに「ＮＲＧＥ」（配列番号７）を有する変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項7】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび前記操作されたＣＢｅｔａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異Ｓ２２Ｆ、Ｔ３３Ｉ、およびＡ７３Ｔ、およびＣＢｅｔａ上の変異Ｅ１７Ｋ、Ｈ２２Ｒ、Ｄ３８Ｐ、およびＳ５３Ｄを含む、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド複合体。

【請求項8】

前記操作されたＣＡｌｐｈａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異残基Ｐ８ＣおよびＤ８６Ｃ、ならびにＣＡｌｐｈａのＣ末端の４アミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む、請求項１、３、および４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項9】

前記操作されたＣＡｌｐｈａおよび前記操作されたＣＢｅｔａが、ＣＡｌｐｈａ上の変異残基Ｐ９０ＣおよびＣＢｅｔａ上の変異残基Ａ１８Ｃ、ならびにＣＡｌｐｈａのＣ末端の４アミノ酸残基（アミノ酸残基９２～９５）の欠失を含む、請求項１、３、および４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項10】

前記操作されたＣ２が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含み、前記操作されたＣ１が、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項11】

前記操作されたＣ１が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、および８０のいずれか一つを含み、前記操作されたＣ２が、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のいずれか一つを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項12】

前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体： １０／１１、１２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。

【請求項13】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ、以下の配列番号からなる群から選択される一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体： １２／１３、１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１、２２／２３、２４／２５、２６／２７、２８／２９、３０／３１、３２／３３、３４／３５、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４２／４３、４４／４５、４６／４７、４８／４９、５０／５１、５２／５３、５４／５５、５６／５７、５８／５９、６０／６１、６２／６３、６４／６５、７９／４３、および８０／５１。

【請求項14】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号４２および４３の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号４２および４３の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項15】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号５０および５１の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号５０および５１の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項16】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号７９および４３の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号７９および４３の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項17】

前記操作されたＣ２および前記操作されたＣ１がそれぞれ配列番号８０および５１の一対の配列を含むか、または前記操作されたＣ１および前記操作されたＣ２がそれぞれ配列番号８０および５１の一対の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項18】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一つが、外来性抗原、内在性抗原、自己抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原、または腫瘍抗原を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項19】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子を対象とし、他方が腫瘍関連抗原を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項20】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＰＤ－Ｌ１を対象とし、他方が４－１ＢＢを対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項21】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＨＥＲ２ Ｄ２を対象とし、他方がＨＥＲ２ Ｄ４を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項22】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＩＬ－１７を対象とし、他方がＩＬ－２０を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項23】

前記第一の抗原特異性および前記第二の抗原特異性のうちの一方が、ＩＬ－４を対象とし、他方がＩＬ－１３を対象とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項24】

部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）に結合された、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む、コンジュゲート。

【請求項25】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項26】

請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。

【請求項27】

請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項２６に記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。

【請求項28】

前記ポリペプチド複合体が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を発現する方法であって、該宿主細胞が、前記ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含む、方法。

【請求項29】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を産生する方法であって、以下を含む、方法：
ａ） 宿主細胞に以下を導入する工程：
Ｎ末端からＣ末端まで、第一のＴＣＲ定常領域（Ｃ１）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および
Ｎ末端からＣ末端まで、第二のＴＣＲ定常領域（Ｃ２）に作動可能に連結された第一の抗体の第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド、
ここで：
Ｃ１およびＣ２は、Ｃ１とＣ２の間に少なくとも一つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、該非天然鎖間結合は二量体を安定化することができる、および
前記第一の抗体は第一の抗原特異性を有する、
ｂ） 前記宿主細胞に前記ポリペプチド複合体を発現させる工程。

【請求項30】

以下の工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法：
前記第一の抗原特異性とは異なる第二の抗原特異性を有する、第二の抗原結合部分をコードする一つまたは複数の追加のポリヌクレオチドを
前記宿主細胞に導入する工程。

【請求項31】

前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項２９～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む組成物。

【請求項33】

請求項１～２３のいずれかに記載のポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む、治療を必要とする対象の状態を治療するための、医薬組成物であって、前記第一の抗原および前記第二の抗原が両方とも調節される場合、該状態を軽減、除去、治療、または予防することができる、医薬組成物。

【請求項34】

請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体を含む一つまたは複数の容器を含むキット。

【国際調査報告】