特表 2024-503234 親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターの精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターの精製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240118BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240118BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z ZNA

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537487

(86)(22)【出願日】2021-12-20

(85)【翻訳文提出日】2023-08-08

(86)【国際出願番号】 IB2021062018

(87)【国際公開番号】W WO2022137076

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,934

(32)【優先日】2020-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/212,457

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム エス． キッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン アール． ライトホルダー

(72)【発明者】

【氏名】マシュー ケー． ローチ

(72)【発明者】

【氏名】タマラ ゼコビック

(57)【要約】

本開示は、親和性クロマトグラフィーによって溶液から組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを精製して、ＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）について濃縮された溶出液を生産するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを精製する方法であって、
親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
１５％～２５％のエタノールおよび緩衝剤を含み、５～６のｐＨを有する溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；
塩、アミノ酸および緩衝剤を含み、２～４のｐＨを有する溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、親和性溶出液を生産すること
を含む方法。

【請求項2】

親和性クロマトグラフィー固定相がカラム中にある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

溶出緩衝液が５ｍＭ～１５０ｍＭの塩を含み、任意選択により、塩が塩化マグネシウムである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

溶出緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭのアミノ酸を含み、任意選択により、アミノ酸がグリシンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

溶出緩衝液が７５ｍＭ～２５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

溶出緩衝液が２．５～３．５のｐＨを有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

溶出緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含み、任意選択により、溶出緩衝液が５ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍまたは２０ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

２カラム体積（ＣＶ）～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出緩衝液が固定相に適用される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

溶出緩衝液が、ｉ）固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる；ｉｉ）固定相から残留不純物を溶出させない；ｉｉｉ）親和性溶出液の沈降をもたらさない；ｉｖ）ｖｇ回収率％を最大化する；ｖ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の固定相へのｒＡＡＶベクターの結合を阻害しない；ｖｉ）三価陰イオンを含有しない；ｖｉｉ）クエン酸イオンを含有しない、またはその組合せである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

０．１ＣＶ～１０ＣＶの親和性溶出液が固定相から収集される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ｒＡＡＶベクターを含む溶液が宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり１ｘ１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）～固定相１ｍＬあたり１．５ｘ１０^１４ｖｇのチャレンジを達成する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶａｖｉａｎ、ＡＡＶｂａｔ、ＡＡＶｂｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｃａｎｉｎｅ、ＡＡＶｅｑｕｉｎｅ、ＡＡＶｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ４、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ５、ＡＡＶｓｎａｋｅ ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

固定相がＡＡＶカプシドに結合する高分子を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

溶出前洗浄溶液が１０ｍＭ～５００ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

溶出前洗浄溶液が１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、５～６のｐＨを有し、任意選択により、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

溶出前洗浄が、ｉ）固定相から結合した不純物を除去する；ｉｉ）ｒＡＡＶ－固定相リガンド結合を維持する；ｉｉｉ）宿主細胞タンパク質などのｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有する、またはその組合せである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

ｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前、ｉｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後、ｉｉｉ）溶出前洗浄の適用前、ｉｖ）溶出前洗浄の適用後、ｖ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前、ｖｉ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させた後、ｖｉｉ)固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させる前、またはその組合せにおいて、固定相の平衡化をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

平衡化が、固定相への緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

緩衝溶液がＴｒｉｓまたは酢酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

緩衝溶液がｐＨ約７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓまたはｐＨ約５．６の約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項23】

親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

第１の再生緩衝液が０．０５Ｎ～１．５Ｎの酸を含み、任意選択により、酸がリン酸である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

第１の再生緩衝液が０．１０Ｎ～０．１５Ｎのリン酸、および１．５～２．５のｐＨを含む、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させる、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が８以上である；
第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が１０以上である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率％が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率％と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのカラム圧力が、０．４ＭＰａ以下である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の純度％が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の純度％と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０と比較して１０％を超えて減少していない、またはその組合せである、
請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が、グアニジンＨＣｌを含む緩衝液と接触させた固定相と比較して増加している、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

固定相と第１の再生緩衝液とを接触させた後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

第２の再生緩衝液が０．１％～５％の界面活性剤を含み、任意選択により、界面活性剤がサルコシルである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

第２の再生緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤がＴｒｉｓである、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

第２の再生緩衝液が０．１％～１．５％のサルコシル、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ、７～８のｐＨを含み、任意選択により、固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第２の再生緩衝液と接触させる、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

ｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、
カラム中の親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および５～６のｐＨを含む溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；ならびに
５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含む溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、ｒＡＡＶベクターを含有する親和性溶出液を生産すること
を含む方法。

【請求項38】

１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

溶出前洗浄が、固定相からのｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有し、溶出前洗浄がｒＡＡＶ－固定相リガンド結合またはその両方を維持し、任意選択により、ｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質が宿主細胞タンパク質である、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

溶出緩衝液が親和性溶出液の沈降をもたらさない、溶出緩衝液が陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）固定相へのｒＡＡＶベクターの結合を阻害しない、またはその両方である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

親和性溶出液中のｖｇ回収率％が、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定した場合、５０％～１００％である；親和性溶出液１ｍＬあたりのｖｇが、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定した場合、約１．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍＬである；親和性溶出液の純度％が、任意選択により、ＳＥＣもしくは非還元的逆相ＨＰＬＣによって測定した場合、総タンパク質のうち、約９５％～約１００％のカプシドタンパク質である、またはその組合せである、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

第１の再生緩衝液の後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

親和性クロマトグラフィー固定相を再生する方法であって、固定相と、酸および１～４のｐＨを含む第１の再生緩衝液とを接触させることを含み、不純物が固定相から除去される、方法。

【請求項45】

第１の再生緩衝液が０．０５Ｎ～１．５Ｎの酸を含み、任意選択により、酸がリン酸または酢酸である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

第１の再生緩衝液が０．１０Ｎ～０．１５Ｎのリン酸、および１．５～２．５のｐＨを含む、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第１の再生緩衝液を固定相に適用し、固定相を、第１の再生緩衝液の体積の約半分と接触させた後、約４５分間保持し、次いで、固定相と、第１の再生緩衝液の体積の第２の半分とを接触させる、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

第１の再生緩衝液の後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

第２の再生緩衝液が界面活性剤および緩衝剤を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

第２の再生緩衝液が０．１％～５％の界面活性剤を含み、任意選択により、界面活性剤がサルコシルである、請求項５０または５１に記載の方法。

【請求項53】

第２の再生緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤がＴｒｉｓである、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

第２の再生緩衝液が０．１％～１．５％のサルコシル、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ、７～８のｐＨを含む、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第２の再生緩衝液が固定相に適用される、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、請求項５０から５６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，４５７号、および２０２０年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，９３４号の優先権を主張し、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。２０２１年１１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＣ０７２５５４Ａ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１，０４８，５７６バイトのサイズである。

【0003】

技術分野
本発明は、ＡＡＶ、特に、親和性クロマトグラフィーによる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの精製に関する。

【背景技術】

【0004】

治療的導入遺伝子を送達するために組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを使用するものを含む遺伝子療法は、治癒がない、また、多くの場合、限られた処置しか存在しない様々な重篤な疾患を処置する能力を有する（Ｗａｎｇら（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：３５８～３７８）。遺伝子療法ベクターの製造は複雑であり、宿主細胞不純物から、および治療的導入遺伝子をコードする完全なベクターゲノムを含有しないウイルスカプシドから治療的ｒＡＡＶベクターを精製するために特殊な方法を必要とする。高純度で良好な安全性および効能プロファイルを有する臨床等級のｒＡＡＶベクター組成物を生産する精製方法の開発に加えて、精製方法を、患者のニーズを満たす高容量のｒＡＡＶ生産レベルに拡大可能にもしなければならない。

【0005】

親和性および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフ法は、完全なｒＡＡＶベクターからの空のウイルスカプシドの分離を含む、臨床等級のｒＡＡＶの大規模生産にとって有用であることがわかっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

最適な純度、効力および一貫性を有する臨床等級のｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ９）の調製のための方法が依然として必要である。これらの方法は、疾患（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ））の処置に関する臨床的ニーズを満たすのに必要な規模で治療的導入遺伝子を有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶの精製を含む。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、限定されるものではないが、宿主細胞タンパク質および宿主核酸からのｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ９ベクター）の精製を含む、ｒＡＡＶベクターの精製の親和性クロマトグラフィー法を提供する。そのような精製されたｒＡＡＶベクターは、ＤＭＤを有する対象などの、ヒト対象への投与のための医薬品の製造および生産にとって好適である。その後のクロマトグラフィーステップ、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によるさらなる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含むクロマトグラフィー溶出液（例えば、親和性クロマトグラフィーに由来する）の調製方法が本明細書で提供される。本開示はまた、有利には、プロセスの完全性を維持しながら（例えば、ｒＡＡＶベクターの精製の成功など）、および製造コストを低減させながら、複数のクロマトグラフィー実行において固定相の使用を可能にする親和性クロマトグラフィー固定相の再生のための方法も提供する。したがって、本明細書に開示される精製方法は、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター組成物を生産する製造方法の重要な態様である。

【0008】

当業者であれば、ルーチン実験を超えない実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特異的実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であろう。そのような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。

【0009】

Ｅ１．ｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、
親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること、および
溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、溶出液を生産すること
を含む方法。

【0010】

Ｅ２．溶出液が親和性溶出液である、Ｅ１に記載の方法。

【0011】

Ｅ３．ローディングが１００ｃｍ／ｈ～５５０ｃｍ／ｈの直線速度で実施される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。

【0012】

Ｅ４．ローディングが約１５０ｃｍ／ｈ～２００ｃｍ／ｈ、約２５０ｃｍ／ｈ～３５０ｃｍ／ｈまたは約４５０ｃｍ／ｈ～５５０ｃｍ／ｈの直線速度で実施される、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。

【0013】

Ｅ５．ローディングが約１７０ｃｍ／ｈ、約３００ｃｍ／ｈ、または約５００ｃｍ／ｈの直線速度で実施される、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。

【0014】

Ｅ６．ローディングが約２ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）～約１０ｍｉｎ／ＣＶ、例えば、約１ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約４ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ～約６ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ～約７ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約８ｍｉｎ／ＣＶ～約９ｍｉｎ／ＣＶまたは約９ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間で実施される、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。

【0015】

Ｅ７．ローディングが約３ｍｉｎ／ＣＶ、約３．５ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４．５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５．５ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ、約６．５ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ、約７．５ｍｉｎ／ＣＶまたは約８ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間で実施される、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。

【0016】

Ｅ８．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が清澄化された溶解物である、Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。

【0017】

Ｅ９．清澄化された溶解物が宿主細胞培養物から調製される、Ｅ８に記載の方法。

【0018】

Ｅ１０．宿主細胞培養物が、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、ＨＴ１０８０、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ、およびＣＨＯ細胞からなる群から選択される宿主細胞を含む、Ｅ９に記載の方法。

【0019】

Ｅ１１．宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である、Ｅ９またはＥ１０に記載の方法。

【0020】

Ｅ１２．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり１ｘ１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）～固定相１ｍＬあたり１．５ｘ１０^１４ｖｇのチャレンジを達成する、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。

【0021】

Ｅ１３．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり２ｘ１０^１３ｖｇ～固定相１ｍＬあたり８ｘ１０^１３ｖｇのチャレンジを達成する、Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。

【0022】

Ｅ１４．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり３ｘ１０^１３ｖｇ～固定相１ｍＬあたり７ｘ１０^１３ｖｇのチャレンジを達成する、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。

【0023】

Ｅ１５．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり約３．８ｘ１０^１３ｖｇ、固定相１ｍＬあたり約２．５ｘ１０^１３ｖｇ、固定相１ｍＬあたり約７．５ｘ１０^１３ｖｇまたは固定相１ｍＬあたり約８ｘ１０^１３ｖｇのチャレンジを達成する、Ｅ１～Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。

【0024】

Ｅ１６．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１Ｌあたり５ｘ１０^１６ｖｇ以下のチャレンジを達成する、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。

【0025】

Ｅ１７．固定相がｒＡＡＶカプシドに結合する、Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載の方法。

【0026】

Ｅ１８．固定相がｒＡＡＶカプシドに結合する親和性クロマトグラフィー固定相であり、溶出液がｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液である、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載の方法。

【0027】

Ｅ１９．固定相がｒＡＡＶカプシドに結合する１つまたは複数の抗原結合性ドメインを含む、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。

【0028】

Ｅ２０．固定相がｒＡＡＶカプシドまたはｒＡＡＶベクターに結合する１つまたは複数の単一ドメイン抗体を含む、Ｅ１～Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法。

【0029】

Ｅ２１．固定相が、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＰ１タンパク質を含むＡＡＶ９カプシドに結合する親和性クロマトグラフィー固定相である、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。

【0030】

Ｅ２２．固定相がラクダ科由来単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ_ＨＨ）を含む、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法。

【0031】

Ｅ２３．固定相が、固定相１ｍＬあたり１．０ｘ１０^１３ｖｇよりも大きい動的結合容量を有する、Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つに記載の方法。

【0032】

Ｅ２４．固定相が、固定相１ｍＬあたり約１．０ｘ１０^１４ｖｇの動的結合容量を有し、任意選択により、結合容量がＩＴＲ ｑＰＣＲによって測定される、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載の方法。

【0033】

Ｅ２５．固定相が、固定相１ｍＬあたり約５．０ｘ１０^１３ｖｇの動的結合容量を有し、任意選択により、結合容量が導入遺伝子 導入遺伝子のｑＰＣＲによって測定される、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。

【0034】

Ｅ２６．固定相が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはその組合せのＡＡＶ血清型のカプシドに結合することができる親和性樹脂である、Ｅ１～Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法。

【0035】

Ｅ２７．固定相が、ＡＡＶ９のＡＡＶ血清型のカプシドに結合することができる親和性樹脂である、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載の方法。

【0036】

Ｅ２８．固定相が、キメラカプシドに結合することができる親和性樹脂である、Ｅ１～Ｅ２７のいずれか１つに記載の方法。

【0037】

Ｅ２９．固定相がポリスチレンジビニルベンゼンビーズを含む樹脂であり、任意選択により、ビーズが５０μｍであり、多孔性である、Ｅ１～Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。

【0038】

Ｅ３０．固定相がＰＯＲＯＳ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ親和性樹脂である、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載の方法。

【0039】

Ｅ３１．固定相がＰＯＲＯＳ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９親和性樹脂である、Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の方法。

【0040】

Ｅ３２．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前の、固定相の使用前洗浄をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。

【0041】

Ｅ３３．使用前洗浄が、固定相への水（例えば、注射用水）の適用および固定相からの水の全部または一部の除去を含む、Ｅ３２に記載の方法。

【0042】

Ｅ３４．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの水が固定相に適用される、Ｅ３３に記載の方法。

【0043】

Ｅ３５．使用前洗浄が固定相の中を上向きに流動する、Ｅ３２～Ｅ３４のいずれか１つに記載の方法。

【0044】

Ｅ３６．使用前洗浄が保存溶液を除去し、任意選択により、保存溶液が１５％～２０％のエタノールを含む溶液である、Ｅ３２～Ｅ３５のいずれか１つに記載の方法。

【0045】

Ｅ３７．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前の、固定相の使用前浄化をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３６のいずれか１つに記載の方法。

【0046】

Ｅ３８．使用前浄化が、固定相へのリン酸（例えば、約０．１Ｎ～約０．２Ｎのリン酸）を含む溶液の適用および固定相からの溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ３７に記載の方法。

【0047】

Ｅ３９．溶液が、約１．５～約２．５（例えば、約１．９）のｐＨの約０．１３２Ｎのリン酸を含む、Ｅ３７またはＥ３８に記載の方法。

【0048】

Ｅ４０．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの溶液が固定相に適用される、Ｅ３８またはＥ３９に記載の方法。

【0049】

Ｅ４１．固定相を約２．５ＣＶの溶液と接触させた後、約４５分間保持し、次いで、固定相と第２の２．５ＣＶの溶液とを接触させる、Ｅ３８～Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法。

【0050】

Ｅ４２．溶液が固定相の中を上向きに流動する、Ｅ３８～Ｅ４１のいずれか１つに記載の方法。

【0051】

Ｅ４３．使用前浄化がバイオバーデンを減少させる、Ｅ３７～Ｅ４２のいずれか１つに記載の方法。

【0052】

Ｅ４４．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前の、固定相の１回目の平衡化をさらに含む、Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載の方法。

【0053】

Ｅ４５．１回目の平衡化が、固定相への緩衝剤（例えば、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ）を含む緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ４４に記載の方法。

【0054】

Ｅ４６．緩衝溶液がｐＨ７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む、Ｅ４５に記載の方法。

【0055】

Ｅ４７．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ４５またはＥ４６に記載の方法。

【0056】

Ｅ４８．固定相の１回目の平衡化が固定相のｐＨを調整する、Ｅ４４～Ｅ４７のいずれか１つに記載の方法。

【0057】

Ｅ４９．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後の、および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前の、および任意選択により、溶出前洗浄の前の、固定相の２回目の平衡化をさらに含む、Ｅ１～Ｅ４８のいずれか１つに記載の方法。

【0058】

Ｅ５０．２回目の平衡化が、固定相への緩衝剤（例えば、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ）を含む緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ４９に記載の方法。

【0059】

Ｅ５１．緩衝溶液がｐＨ７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む、Ｅ５０に記載の方法。

【0060】

Ｅ５２．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ５０またはＥ５１に記載の方法。

【0061】

Ｅ５３．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前の、溶出前洗浄をさらに含む、Ｅ１～Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法。

【0062】

Ｅ５４．溶出前洗浄が、固定相への溶出前洗浄溶液の適用および固定相からの溶出前洗浄溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ５３に記載の方法。

【0063】

Ｅ５５．溶出前洗浄溶液が、ｉ）固定相から結合した不純物を除去する；ｉｉ）ｒＡＡＶ－固定相リガンド結合を維持する；ｉｉｉ）宿主細胞タンパク質などのｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有する、またはその組合せである、Ｅ５３～Ｅ５４のいずれか１つに記載の方法。

【0064】

Ｅ５６．溶出前洗浄溶液が溶媒および緩衝剤を含む、Ｅ５４またはＥ５５に記載の方法。

【0065】

Ｅ５７．溶媒がエタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、およびエチレングリコールからなる群から選択される、Ｅ５６に記載の方法。

【0066】

Ｅ５８．溶媒がエタノールである、Ｅ５６またはＥ５７に記載の方法。

【0067】

Ｅ５９．溶媒の濃度が、約２％～約６０％、例えば、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約２％～約１０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％または約５０％～約６０％である、Ｅ５６～Ｅ５８のいずれか１つに記載の方法。

【0068】

Ｅ６０．溶媒の濃度が約１５％～約２０％（例えば、約１７％、約１７．５％）である、Ｅ５６～Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。

【0069】

Ｅ６１．溶媒がエタノールであり、エタノールの濃度が約１５％～約２０％（例えば、約１７％、約１７．５％）である、Ｅ５６～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。

【0070】

Ｅ６２．溶媒がエタノールであり、エタノールの濃度が約１７％である、Ｅ５６～Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。

【0071】

Ｅ６３．溶媒がエタノールであり、エタノールの濃度が約１７．５％である、Ｅ５６～Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。

【0072】

Ｅ６４．緩衝剤が酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、ビシンおよびその組合せからなる群から選択される、Ｅ５６～Ｅ６３のいずれか１つに記載の方法。

【0073】

Ｅ６５．緩衝剤の濃度が約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～約５００ｍＭである、Ｅ５６～Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。

【0074】

Ｅ６６．緩衝剤の濃度が約５０ｍＭ～約２００ｍＭである、Ｅ５６～Ｅ６５のいずれか１つに記載の方法。

【0075】

Ｅ６７．緩衝剤が酢酸ナトリウムである、Ｅ５６～Ｅ６６のいずれか１つに記載の方法。

【0076】

Ｅ６８．緩衝剤が酢酸ナトリウムであり、溶出前洗浄溶液中の酢酸ナトリウムの濃度が約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）である、Ｅ５６～Ｅ６７のいずれか１つに記載の方法。

【0077】

Ｅ６９．緩衝剤が酢酸ナトリウムであり、溶出前洗浄溶液中の酢酸ナトリウムの濃度が約１５０ｍＭである、Ｅ５６～Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。

【0078】

Ｅ７０．緩衝剤が酢酸ナトリウムであり、溶出前洗浄溶液中の酢酸ナトリウムの濃度が約１５３ｍＭである、Ｅ５６～Ｅ６９のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

Ｅ７１．溶出前洗浄溶液が、約４．５～８．０、例えば、約５．０～約８．０、約５．０～約６．０、約５．０～約５．５、約５．５～約６．０、約６．０～約６．５、約６．５～約７、約７．０～約８．０、約７．５～約８．０のｐＨを有する、Ｅ５４～Ｅ７０のいずれか１つに記載の方法。

【0080】

Ｅ７２．溶出前洗浄溶液が５～６（例えば、約５．６）のｐＨを有する、Ｅ５４～Ｅ７１のいずれか１つに記載の方法。

【0081】

Ｅ７３．溶出前洗浄溶液が、１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および５～６のｐＨを含む、Ｅ５４～Ｅ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0082】

Ｅ７４．溶出前洗浄溶液が、約１５％～２０％のエタノール、約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭの酢酸ナトリウム、および５～６のｐＨを含む、Ｅ５４～Ｅ７３のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

Ｅ７５．溶出前洗浄溶液が、約１７．５％のエタノール、約１５３ｍＭの酢酸ナトリウム、および約５．６のｐＨを含む、Ｅ５４～Ｅ７４のいずれか１つに記載の方法。

【0084】

Ｅ７６．溶出前洗浄溶液が、約１７％のエタノール、約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および約５．６のｐＨを含む、Ｅ５４～Ｅ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0085】

Ｅ７７．２ＣＶ～１０ＣＶ、例えば、１ＣＶ～３ＣＶ、３ＣＶ～５ＣＶ、３ＣＶ～８ＣＶ、４ＣＶ～６ＣＶ、５ＣＶ～８ＣＶ、または８ＣＶ～１０ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、Ｅ５４～Ｅ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0086】

Ｅ７８．４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、Ｅ５４～Ｅ７７のいずれか１つに記載の方法。

【0087】

Ｅ７９．約５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、Ｅ５４～Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。

【0088】

Ｅ８０．溶出前洗浄溶液の流動速度が、約１０ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈ、例えば、約５０ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１０ｃｍ／ｈ～約５０ｃｍ／ｈ、約５０ｃｍ／ｈ～約１００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約２００ｃｍ／ｈ、約２００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約１５０ｃｍ／ｈ～約２５０ｃｍ／ｈ、約３００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約４００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約４５０ｃｍ／ｈ～約５５０ｃｍ／ｈ、または約５００ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈである、Ｅ５４～Ｅ７９のいずれか１つに記載の方法。

【0089】

Ｅ８１．溶出前洗浄溶液の流動速度が、約１５０ｃｍ／ｈ～約２００ｃｍ／ｈ（例えば、約１７０ｃｍ／ｈ）、約１５０ｃｍ／ｈ～約２５０ｃｍ／ｈ（例えば、約２００ｃｍ／ｈ）または約３００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ（例えば、３４５ｃｍ／ｈ）である、Ｅ５４～Ｅ８０のいずれか１つに記載の方法。

【0090】

Ｅ８２．溶出前洗浄の滞留時間が、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶ、例えば、約１ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約３ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ～約６ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ～約７ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約８ｍｉｎ／ＣＶ～約９ｍｉｎ／ＣＶ、または約９ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ５４～Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法。

【0091】

Ｅ８３．溶出前洗浄溶液の滞留時間が、約２ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４．３ｍｉｎ／ＣＶ、約４．３５ｍｉｎ／ＣＶ、約４．５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５．５ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ、または約８ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ５４～Ｅ８２のいずれか１つに記載の方法。

【0092】

Ｅ８４．溶出前洗浄からの溶出液が、少なくとも７５０ｍＡＵ／ｍｍのＡ２８０最大ピーク高さを有する、Ｅ５３～Ｅ８３のいずれか１つに記載の方法。

【0093】

Ｅ８５．溶出前洗浄からの溶出液が、少なくとも７５０ｍＡＵ／ｍｍ～約１２５０ｍＡＵ／ｍｍのＡ２８０最大ピーク高さを有する、Ｅ５３～Ｅ８３のいずれか１つに記載の方法。

【0094】

Ｅ８６．約１５％～約２０％（例えば、約１７．５％）のエタノール、約１５０ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の溶出前洗浄溶液が固定相に適用され、任意選択により、溶出前洗浄溶液の流動速度が約３００～約４００ｃｍ／ｈ（例えば、約３４５ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出前洗浄溶液の滞留時間が約４ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約４．３５ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ５４～Ｅ８５のいずれか１つに記載の方法。

【0095】

Ｅ８７．約１５％～約２０％（例えば、約１７．５％）のエタノール、約１５０ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５．０ＣＶ）の溶出前洗浄溶液が固定相に適用され、任意選択により、溶出前洗浄溶液の流動速度が約１５０～約２５０ｃｍ／ｈ（例えば、約２００ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出前洗浄溶液の滞留時間が約４．５ｍｉｎ／ＣＶ～約５．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約５．０ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ５４～Ｅ８６のいずれか１つに記載の方法。

【0096】

Ｅ８８．約１５％～約２０％（例えば、約１７％）のエタノール、約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む約２．５ＣＶ～約３．５ＣＶ（例えば、約３．０ＣＶ）の溶出前洗浄溶液が固定相に適用され、任意選択により、溶出前洗浄溶液の流動速度が約１５０～約２００ｃｍ／ｈ（例えば、約１７０ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出前洗浄溶液の滞留時間が約２．５ｍｉｎ／ＣＶ～約３．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約３．０ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ５４～Ｅ８７のいずれか１つに記載の方法。

【0097】

Ｅ８９．固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後の、および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前の、および任意選択により、溶出前洗浄の後の、固定相の３回目の平衡化をさらに含む、Ｅ１～Ｅ８８のいずれか１つに記載の方法。

【0098】

Ｅ９０．３回目の平衡化が、固定相への緩衝溶液（例えば、約１５０ｍＭ～約１６０ｍＭの酢酸ナトリウム）の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ８９に記載の方法。

【0099】

Ｅ９１．緩衝溶液が約５．６のｐＨの約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、Ｅ９０に記載の方法。

【0100】

Ｅ９２．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ９０またはＥ９１に記載の方法。

【0101】

Ｅ９３．３回目の平衡化が、５．６のｐＨの約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む約５ＣＶの緩衝溶液の固定相への適用を含む、Ｅ９０～Ｅ９２のいずれか１つに記載の方法。

【0102】

Ｅ９４．固定相からのｒＡＡＶベクターの溶出が、溶出緩衝液の固定相への適用および固定相からの溶出緩衝液の全部または一部の除去を含む、Ｅ１～Ｅ９３のいずれか１つに記載の方法。

【0103】

Ｅ９５．溶出緩衝液が、固定相に由来する残留不純物を優先的に溶出しない、Ｅ９４に記載の方法。

【0104】

Ｅ９６．ｉ）溶出緩衝液が固定相からｒＡＡＶベクターを溶出する；
ｉｉ）溶出緩衝液が親和性溶出液の沈降をもたらさない；
ｉｉｉ）溶出緩衝液がｖｇ回収率（％）を最大化する；
ｉｖ）溶出緩衝液が、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）固定相へのｒＡＡＶベクターの結合を阻害しない；
ｖ）溶出緩衝液が三価陰イオンを含有しない；
ｖｉ）溶出緩衝液がクエン酸イオン、またはその組合せを含有しない、
Ｅ１～Ｅ９５のいずれか１つに記載の方法。

【0105】

Ｅ９７．９０％～１００％のｒＡＡＶベクターがその後の精製ステップにおいてＡＥＸ固定相に結合するように、溶出緩衝液がｒＡＡＶベクターのＡＥＸ固定相への結合を阻害しない、Ｅ１～Ｅ９６のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

Ｅ９８．溶出緩衝液が、塩、アミノ酸、緩衝剤、およびその任意の組合せからなる群から選択される成分を含む、Ｅ１～Ｅ９７のいずれか１つに記載の方法。

【0107】

Ｅ９９．溶出緩衝液の塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ９８に記載の方法。

【0108】

Ｅ１００．溶出緩衝液の塩が塩化マグネシウムである、Ｅ９８またはＥ９９に記載の方法。

【0109】

Ｅ１０１．溶出緩衝液の塩の濃度が、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約５ｍＭ～１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、および約４００ｍＭ～約５００ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１００のいずれかに記載の方法。

【0110】

Ｅ１０２．溶出緩衝液の塩の濃度が約５ｍＭ～約１５０ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１０１のいずれか１つに記載の方法。

【0111】

Ｅ１０３．塩が塩化マグネシウムであり、溶出緩衝液中の塩化マグネシウムの濃度が約１０ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）である、Ｅ９８～Ｅ１０２のいずれか１つに記載の方法。

【0112】

Ｅ１０４．溶出緩衝液のアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、シトルリン、グリシン、およびその任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ９８～Ｅ１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0113】

Ｅ１０５．アミノ酸がグリシンである、Ｅ９８～Ｅ１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0114】

Ｅ１０６．溶出緩衝液のアミノ酸の濃度が、約０ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、および約４００ｍＭ～約５００ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１０５のいずれか１つに記載の方法。

【0115】

Ｅ１０７．溶出緩衝液中のアミノ酸の濃度が約１０ｍＭ～約２００ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１０６のいずれか１つに記載の方法。

【0116】

Ｅ１０８．溶出緩衝液中のアミノ酸の濃度が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１０７のいずれか１つに記載の方法。

【0117】

Ｅ１０９．溶出緩衝液中のアミノ酸の濃度が約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）である、Ｅ９８～Ｅ１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0118】

Ｅ１１０．アミノ酸がグリシンであり、溶出緩衝液中のグリシンの濃度が約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）である、Ｅ９８～Ｅ１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

Ｅ１１１．緩衝剤がクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミンおよび／またはビシンである、Ｅ９８～Ｅ１１０のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

Ｅ１１２．溶出緩衝液の緩衝剤が酢酸ナトリウムである、Ｅ９８～Ｅ１１１に記載の方法。

【0121】

Ｅ１１３．溶出緩衝液中の緩衝剤の濃度が、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭ～４００ｍＭ、約１４５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～約５００ｍＭである、Ｅ９８～Ｅ１１２のいずれか１つに記載の方法。

【0122】

Ｅ１１４．溶出緩衝液中の緩衝剤の濃度が約１４５ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１４８ｍＭ）である、Ｅ９８～Ｅ１１３のいずれか１つに記載の方法。

【0123】

Ｅ１１５．緩衝剤が酢酸ナトリウムであり、溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度が約１４５ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１４８ｍＭ）である、Ｅ９８～Ｅ１１４のいずれか１つに記載の方法。

【0124】

Ｅ１１６．溶出緩衝液が約２～約６、例えば、約２～４、約２．５～約３．５、約２～２．５、約２．５～約３、約３～約３．５、約２．５～約３．５、約３．５～約４、約４～約４．５、約４．５～約５、約５～約５．５または約５．５～約６．０のｐＨを有する、Ｅ１～Ｅ１１５のいずれか１つに記載の方法。

【0125】

Ｅ１１７．溶出緩衝液が約３、約４、または約５のｐＨを有する、Ｅ１～Ｅ１１６のいずれか１つに記載の方法。

【0126】

Ｅ１１８．溶出緩衝液が約２．５～約３．５（例えば、約３．５）のｐＨを有する、Ｅ１～Ｅ１１６のいずれか１つに記載の方法。

【0127】

Ｅ１１９．溶出緩衝液が、約１ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約１ｍＳ／ｃｍ～約２０ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ～約１５ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２０ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ～約２５ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍ、または約３５ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、Ｅ１～Ｅ１１８のいずれか１つに記載の方法。

【0128】

Ｅ１２０．溶出緩衝液が約２０ｍＳ／ｃｍ～約３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、Ｅ１～Ｅ１１９のいずれか１つに記載の方法。

【0129】

Ｅ１２１．溶出緩衝液が、ｉ）２００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．５；ｉｉ）１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｉｉｉ）１００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｉｖ）１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｖ）１００ｍＭのグリシン、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｖｉ）１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１４８ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｖｉｉ）１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０；ｖｉｉｉ）１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０；ｉｘ）１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｗｔ．／ｖ．％のイオジキサノール、ｐＨ３．０；ｘ）１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２５ｗｔ．％プロピレングリコール、ｐＨ３．０、およびｘｉ）５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨからなる群から選択される、Ｅ１～Ｅ１２０のいずれか１つに記載の方法。

【0130】

Ｅ１２２．溶出緩衝液が、約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ_２、約１４０～約１５０ｍＭ（例えば、約１４８ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ約２．５～約３．５（例えば、約３．０）を含む、Ｅ１～Ｅ１２１のいずれか１つに記載の方法。

【0131】

Ｅ１２３．溶出緩衝液が、約１００ｍＭのグリシン、約２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約１４８ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０を含む、Ｅ１～Ｅ１２２のいずれか１つに記載の方法。

【0132】

Ｅ１２４．溶出緩衝液が、ｒＡＡＶのＡＥＸ固定相への結合と競合する陰イオンを含有しない、Ｅ１～Ｅ１２３のいずれか１つに記載の方法。

【0133】

Ｅ１２５．陰イオンが三価陰イオンである、Ｅ１２４に記載の方法。

【0134】

Ｅ１２６．陰イオンがクエン酸塩である、Ｅ１２４またはＥ１２５に記載の方法。

【0135】

Ｅ１２７．２ＣＶ～１０ＣＶ、例えば、１ＣＶ～３ＣＶ、３ＣＶ～５ＣＶ、３ＣＶ～８ＣＶ、４ＣＶ～６ＣＶ、５ＣＶ～８ＣＶ、または８ＣＶ～１０ＣＶの溶出緩衝液が固定相に適用される、Ｅ１～Ｅ１２６のいずれか１つに記載の方法。

【0136】

Ｅ１２８．４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の溶出緩衝液が固定相に適用される、Ｅ１～Ｅ１２７のいずれか１つに記載の方法。

【0137】

Ｅ１２９．溶出緩衝液の流動速度が、約１０ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈ、例えば、約５０ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１０ｃｍ／ｈ～約５０ｃｍ／ｈ、約５０ｃｍ／ｈ～約１００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約２００ｃｍ／ｈ、約２００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約３００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約２５０ｃｍ／ｈ～約３５０ｃｍ／ｈ、約４００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約４５０ｃｍ／ｈ～約５５０ｃｍ／ｈ、または約５００ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈである、Ｅ１～Ｅ１２８のいずれか１つに記載の方法。

【0138】

Ｅ１３０．溶出緩衝液の流動速度が約５０ｃｍ／ｈ～約１００ｃｍ／ｈ（例えば、約６４ｃｍ／ｈ）である、Ｅ１～Ｅ１２９のいずれか１つに記載の方法。

【0139】

Ｅ１３１．溶出緩衝液の流動速度が約２５０ｃｍ／ｈ～約３５０ｃｍ／ｈ（例えば、約３００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ１～Ｅ１３０のいずれか１つに記載の方法。

【0140】

Ｅ１３２．溶出緩衝液の流動速度が約４５０ｃｍ／ｈ～約５５０ｃｍ／ｈ（例えば、約５００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ１～Ｅ１３０のいずれか１つに記載の方法。

【0141】

Ｅ１３３．溶出緩衝液の滞留時間が、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶ、例えば、約１ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約３ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ～約６ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ～約７ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約８ｍｉｎ／ＣＶ～約９ｍｉｎ／ＣＶ、または約９ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ１～Ｅ１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0142】

Ｅ１３４．溶出緩衝液溶液の滞留時間が約３ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５．５ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ、または約８ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ１～Ｅ１３３のいずれか１つに記載の方法。

【0143】

Ｅ１３５．約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ_２、約１４０～約１５０ｍＭ（約１４８ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ約２．５～約３．５（例えば、約３．０）を含む約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の溶出緩衝液が固定相に適用され、任意選択により、溶出緩衝液の流動速度が約４５０～約５５０ｃｍ／ｈ（例えば、約５００ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出緩衝液の滞留時間が約２．５ｍｉｎ／ＣＶ～約３．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約３ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ１～Ｅ１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0144】

Ｅ１３６．約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ２、約１４０～約１５０ｍＭ（約１４８ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ約２．５～約３．５（例えば、約３．０）を含む約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の溶出緩衝液が固定相に適用され、任意選択により、溶出緩衝液の流動速度が約２５０～約３５０ｃｍ／ｈ（例えば、約３００ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出緩衝液の滞留時間が約２．５ｍｉｎ／ＣＶ～約３．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約３ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ１～Ｅ１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0145】

Ｅ１３７．約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ_２、約１４０～約１５０ｍＭ（約１４８ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ約２．５～約３．５（例えば、約３．０）を含む約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の溶出緩衝液が固定相に適用され、任意選択により、溶出緩衝液の流動速度が約５０～約１００ｃｍ／ｈ（例えば、約６４ｃｍ／ｈ）であり、任意選択により、溶出緩衝液の滞留時間が約７．５ｍｉｎ／ＣＶ～約８．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、約７．９７ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ１～Ｅ１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0146】

Ｅ１３８．固定相からの溶出液の収集をさらに含み、溶出液が親和性溶出液である、Ｅ１～Ｅ１３７のいずれか１つに記載の方法。

【0147】

Ｅ１３９．親和性溶出液の収集が、約１ｍＡＵ／ｍｍの経路長のＡ２８０で開始され、約３５ｍＡＵ／ｍｍの経路長で停止される、Ｅ１３８に記載の方法。

【0148】

Ｅ１４０．親和性溶出液の収集が、約２．５ｍＡＵ／ｍｍの経路長のＡ２８０で開始され、約３２．５ｍＡＵ／ｍｍの経路長で停止される、Ｅ１３８に記載の方法。

【0149】

Ｅ１４１．親和性溶出液の収集が、約２．５ｍＡＵ／ｍｍの経路長のＡ２８０で開始され、約２２．５ｍＡＵ／ｍｍの経路長のＡ２８０で停止される、Ｅ１３８に記載の方法。

【0150】

Ｅ１４２．親和性溶出液の収集が、約１０ｍＡＵの経路長のＡ２８０で開始され、約１２０ｍＡＵ（約５ｍｍの経路長）で停止される、Ｅ１３８に記載の方法。

【0151】

Ｅ１４３．親和性溶出液の収集が、約１２．５ｍＡＵのＡ２８０で開始され、約１１２．５ｍＡＵ（約５ｍｍの経路長）で停止される、Ｅ１３８に記載の方法。

【0152】

Ｅ１４４．固定相から収集される親和性溶出液の体積が約１ｍＬ～約３Ｌ、約１０ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約３Ｌ、約２００ｍＬ～約３Ｌ、約５００ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約２Ｌ、または約１００ｍＬ～約１Ｌである、Ｅ１３８～Ｅ１４３のいずれか１つに記載の方法。

【0153】

Ｅ１４５．固定相から収集される親和性溶出液の体積が約０．１ＣＶ～約１０ＣＶである、Ｅ１３８～Ｅ１４４のいずれか１つに記載の方法。

【0154】

Ｅ１４６．固定相から収集される親和性溶出液の体積が約０．１ＣＶ～約８ＣＶ、約０．１ＣＶ～約５ＣＶ、約０．１ＣＶ～約１ＣＶ、約０．１ＣＶ～約０．５ＣＶ、約０．５ＣＶ～約８ＣＶ、約０．５ＣＶ～約５ＣＶ、約０．５ＣＶ～約３ＣＶ、約０．５ＣＶ～約１．５ＣＶ、約０．５ＣＶ～約１．０ＣＶ、約１ＣＶ～約８ＣＶ、約１ＣＶ～約５ＣＶ、または約１ＣＶ～約２ＣＶである、Ｅ１３８～Ｅ１４５のいずれか１つに記載の方法。

【0155】

Ｅ１４７．固定相から収集される親和性溶出液の体積が約０．５ＣＶ～約１．０ＣＶである、Ｅ１３８～Ｅ１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0156】

Ｅ１４８．固定相から収集される親和性溶出液の体積が約１ＣＶ～約２ＣＶ（例えば、約１．１ＣＶ～１．９ＣＶ）である、Ｅ１３８～Ｅ１４７のいずれか１つに記載の方法。

【0157】

Ｅ１４９．親和性溶出液が単一の画分として収集される、Ｅ１３８～Ｅ１４８のいずれか１つに記載の方法。

【0158】

Ｅ１５０．親和性溶出液が１より多い画分として収集される、Ｅ１３８～Ｅ１４９のいずれか１つに記載の方法。

【0159】

Ｅ１５１．１より多い親和性溶出液画分がプールされる、Ｅ１５０に記載の方法。

【0160】

Ｅ１５２．固定相がカラム内にある、Ｅ１～Ｅ１５１に記載の方法。

【0161】

Ｅ１５３．カラムが、約１ｍＬ～約３０Ｌ、約１ｍＬ～約２０Ｌ、約１ｍＬ～約１０Ｌ、約１ｍＬ～約５Ｌ、約１ｍＬ～約１Ｌ、約１ｍＬ～約５００ｍＬ、約１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１ｍＬ～約１００ｍＬ、約１ｍＬ～約５０ｍＬ、約１ｍＬ～約１０ｍＬ、約５００ｍＬ～約１Ｌ、約１Ｌ～約２Ｌ、約１Ｌ～約３Ｌ、約１Ｌ～約４Ｌ、約１Ｌ～約５Ｌ、約１Ｌ～約６Ｌ、約１Ｌ～約７Ｌ、約１Ｌ～約８Ｌ、約１Ｌ～約９Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約１５Ｌ、約１０Ｌ～約２０Ｌ、約１０Ｌ～約２５Ｌ、または約１０Ｌ～約３０Ｌの体積を有する、Ｅ１５２に記載の方法。

【0162】

Ｅ１５４．カラムの体積が約１Ｌ（例えば、約０．９９７Ｌ）であり、約１０ｃｍの内径および約１３ｃｍ（例えば、約１２．７ｃｍ）の床高を有する、Ｅ１５２～Ｅ１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0163】

Ｅ１５５．カラムの体積が約２．６Ｌ（例えば、約２．６７Ｌ）であり、約２０ｃｍの内径および約８．５ｃｍの床高を有する、Ｅ１５２～Ｅ１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0164】

Ｅ１５６．カラムの体積が約１７．０Ｌ（例えば、約１７．６６３Ｌ）であり、約３０ｃｍの内径および約２５ｃｍの床高を有する、Ｅ１５２～Ｅ１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0165】

Ｅ１５７．カラムの体積が約２５Ｌ（例えば、約２５．６１Ｌ）であり、約４５ｃｍの内径および約１５ｃｍの床高を有する、Ｅ１５２～Ｅ１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0166】

Ｅ１５８．親和性溶出液中のｖｇ収率（％）が、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約９８％～約１００％である、Ｅ２～Ｅ１５７のいずれか１つに記載の方法。

【0167】

Ｅ１５９．親和性溶出液のｖｇ収率（％）が、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％である、Ｅ１５８に記載の方法。

【0168】

Ｅ１６０．親和性溶出液１ｍＬあたりのｖｇが、約１．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍＬ、約５．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍＬ、約５．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約７．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍＬ、約１．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ～約８．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、または約１．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ～約５．０ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１５８のいずれか１つに記載の方法。

【0169】

Ｅ１６１．親和性溶出液のｖｇ収率（％）および／または親和性溶出液１ｍＬあたりのｖｇが、ｑＰＣＲによって測定される、Ｅ１５８～Ｅ１６０のいずれか１つに記載の方法。

【0170】

Ｅ１６２．ｑＰＣＲが導入遺伝子配列のコピーを測定する、Ｅ１６１に記載の方法。

【0171】

Ｅ１６３．導入遺伝子配列が、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列、またはその断片を含む、Ｅ１６２に記載の方法。

【0172】

Ｅ１６４．ｑＰＣＲが、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のコピーを測定する、Ｅ１６１に記載の方法。

【0173】

Ｅ１６５．ＩＴＲ配列が、配列番号５～８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列、またはその断片を含む、Ｅ１６４に記載の方法。

【0174】

Ｅ１６６．親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比が０．８より大きい、Ｅ２～Ｅ１６５のいずれか１つに記載の方法。

【0175】

Ｅ１６７．親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比が、約０．８、約０．８１、約０．８２、約０．８３、約０．８４、約０．８５、約０．８６、約０．８７、約０．８８、約０．８９、約０．９、約０．９１、約０．９２、約０．９３、約０．９４、約０．９５、約０．９６、約０．９７、約０．９８、約０．９９、約１．０、約１．１、約１．１１、約１．１２、約１．１３、約１．１４、約１．１５、約１．１６、約１．１７、約１．１８、約１．１９、約１．２０、約１．２１、約１．２２、約１．２３、約１．２４、約１．２５、約１．２６、約１．２７、約１．２８、約１．２９、約１．３０であるか、またはそれより大きい、Ｅ２～Ｅ１６６のいずれか１つに記載の方法。

【0176】

Ｅ１６８．収集される親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と同時に吸光度測定によって測定される、Ｅ２～Ｅ１６７のいずれか１つに記載の方法。

【0177】

Ｅ１６９．親和性溶出液の純度（％）が、溶出液中の総タンパク質の約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％または約９８％～約１００％のカプシドタンパク質である、Ｅ２～Ｅ１６８のいずれか１つに記載の方法。

【0178】

Ｅ１７０．親和性溶出液の純度（％）が、溶出液中の総タンパク質の約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％のカプシドタンパク質である、Ｅ２～Ｅ１６９のいずれか１つに記載の方法。

【0179】

Ｅ１７１．親和性溶出液の総タンパク質のウイルスタンパク質の純度（％）が、非還元的逆相ＨＰＬＣによって測定される、Ｅ１６９またはＥ１７０のいずれか１つに記載の方法。

【0180】

Ｅ１７２．親和性溶出液の総タンパク質のウイルスタンパク質の純度（％）が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される、Ｅ１６９またはＥ１７０のいずれか１つに記載の方法。

【0181】

Ｅ１７３．親和性溶出液の総タンパク質のウイルスタンパク質の純度（％）が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液の総タンパク質のカプシドタンパク質の純度（％）と比較して増加している、Ｅ２～Ｅ１７２のいずれか１つに記載の方法。

【0182】

Ｅ１７４．親和性溶出液のウイルス粒子力価が、約１ｘ１０^１１ｖｐ／ｍＬ～約１ｘ１０^１５ｖｐ／ｍＬ、約１ｘ１０^１２ｖｐ／ｍＬ～約１ｘ１０^１４ｖｐ／ｍＬ、約１ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ～約１ｘ１０^１４ｖｐ／ｍＬ、約１ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ～約９ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬまたは約２ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ～約８ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１７３のいずれか１つに記載の方法。

【0183】

Ｅ１７５．親和性溶出液のウイルス粒子力価が、約１ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約２ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約３ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約４ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約５ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約６ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約７ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約８ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬ、約９ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬまたは約１０ｘ１０^１３ｖｐ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１７４のいずれか１つに記載の方法。

【0184】

Ｅ１７６．親和性溶出液のウイルス粒子力価がサイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるＥ１７４またはＥ１７５に記載の方法。

【0185】

Ｅ１７７．親和性溶出液が約２．５～約４．５、約３～約４、約３．２～約３．６、または約３．４～約３．６のｐＨを有する、Ｅ２～Ｅ１７６のいずれか１つに記載の方法。

【0186】

Ｅ１７８．親和性溶出液中に存在する宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）の量が、約５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約１００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約７５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約５００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約２５０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、または約５０～約１００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１７７のいずれか１つに記載の方法。

【0187】

Ｅ１７９．親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量が、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約２５ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約２０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１５ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、または約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１７８のいずれか１つに記載の方法。

【0188】

Ｅ１８０．親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量が、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、２ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、３ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、４ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、５ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、６ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、７ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、８ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、９ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１５ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇまたは約２０ｐｇ／１ｘ１０９ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１７９のいずれか１つに記載の方法。

【0189】

Ｅ１８１．親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量が、約１ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^６ｐｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬまたは１ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ～約５ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１８０のいずれか１つに記載の方法。

【0190】

Ｅ１８２．親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量が、約５ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ、６ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ、７ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ、８ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ、９ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、２ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、３ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、４ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、５ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、６ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、７ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、８ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、９ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬまたは１０ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１８１のいずれか１つに記載の方法。

【0191】

Ｅ１８３．親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量がｑＰＣＲによって測定される、Ｅ１７８～Ｅ１８２のいずれか１つに記載の方法。

【0192】

Ｅ１８４．親和性溶出液中のＨＣＤＮＡの量が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液中のＨＣＤＮＡの量と比較して減少している、Ｅ２～Ｅ１８３のいずれか１つに記載の方法。

【0193】

Ｅ１８５．減少が、約１～約－１のｒＡＡＶベクターを含む溶液中のＨＣＤＮＡの量と比較した、親和性溶出液中のＨＣＤＮＡの量の対数減少値である、Ｅ１８４に記載の方法。

【0194】

Ｅ１８６．親和性溶出液中に存在する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量が、約１０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約２００００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約１０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約１５０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約１０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約１００００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約１０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約５０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、約１０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約２５００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ、または約５０００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ～約１００００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１８５のいずれか１つに記載の方法。

【0195】

Ｅ１８７．親和性溶出液中に存在するＨＣＰの量が、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約４０００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１０ｐｇｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約３０００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約２０００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１０００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約８００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約６００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約５００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約２５０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、または約５０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約５００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１８６のいずれか１つに記載の方法。

【0196】

Ｅ１８８．親和性溶出液中に存在するＨＣＰの量が、約１０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、２０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、３０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、４０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、５０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、６０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、７０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、８０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、９０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、１００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、２００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、３００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、４００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、５００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、６００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、７００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、８００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、９００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇまたは１０００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１８７のいずれか１つに記載の方法。

【0197】

Ｅ１８９．親和性溶出液中に存在するＨＣＰの量が、約１ｘ１０^２ｎｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^５ｎｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^２ｎｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^４ｎｇ／ｍｇ、１ｘ１０^２ｎｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬまたは約１ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^４ｎｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１８８のいずれか１つに記載の方法。

【0198】

Ｅ１９０．親和性溶出液中に存在するＨＣＰの量が、約１ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、２ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、３ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、４ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、５ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、６ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、７ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、８ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、９ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬ、１０ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬまたは２０ｘ１０^３ｎｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１８９のいずれか１つに記載の方法。

【0199】

Ｅ１９１．親和性溶出液中に存在するＨＣＰの量が、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および銀染色からなる群から選択される方法によって測定される、Ｅ１８６～Ｅ１９０のいずれか１つに記載の方法。

【0200】

Ｅ１９２．親和性溶出液中のＨＣＰの量が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液中のＨＣＰの量と比較して減少している、Ｅ２～Ｅ１９１のいずれか１つに記載の方法。

【0201】

Ｅ１９３．約１～約１０のｒＡＡＶベクターを含む溶液中のＨＣＰの量と比較した、親和性溶出液中のＨＣＰの量の対数減少値が存在する、Ｅ１９２に記載の方法。

【0202】

Ｅ１９４．親和性溶出液中に存在する残留プラスミドＤＮＡの量が、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約９０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約８０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約７０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約６０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約５０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇまたは約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約４０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇである、Ｅ２～Ｅ１９３のいずれか１つに記載の方法。

【0203】

Ｅ１９５．親和性溶出液中に存在する残留プラスミドＤＮＡの量が、約１ｘ１０^４ｐｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^６ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約１ｘ１０^６ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約９ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約８ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約８ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約７ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ、１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約６ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬまたは１ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬ～約５ｘ１０^５ｐｇ／ｍＬである、Ｅ２～Ｅ１９４のいずれか１つに記載の方法。

【0204】

Ｅ１９６．親和性溶出液中の残留プラスミドＤＮＡの量が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液中の残留プラスミドＤＮＡの量と比較して減少している、Ｅ２～Ｅ１９５のいずれか１つに記載の方法。

【0205】

Ｅ１９７．約１～約－１のｒＡＡＶベクターを含む溶液中の残留プラスミドＤＮＡの量と比較した、親和性溶出液中の残留プラスミドＤＮＡの量の対数減少値が存在する、Ｅ１９６に記載の方法。

【0206】

Ｅ１９８．残留プラスミドＤＮＡがｑＰＣＲによって測定される、Ｅ１９４～Ｅ１９７のいずれか１つに記載の方法。

【0207】

Ｅ１９９．親和性溶出液中に存在する残留親和性リガンドの量が、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約１００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約９０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約８０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約７０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約６０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ、約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約５０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇまたは約１ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ～約４０ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇであり、任意選択により、残留親和性リガンドがＥＬＩＳＡによって測定される、Ｅ２～Ｅ１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0208】

Ｅ２００．親和性溶出液中に存在する残留親和性リガンドの量が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬであり、任意選択により、残留親和性リガンドがＥＬＩＳＡによって測定される、Ｅ２～Ｅ１９９のいずれか１つに記載の方法。

【0209】

Ｅ２０１．親和性溶出液中のｒＡＡＶベクターの感染性比が、約５０００ｖｇ／ＩＵ～約５００００ｖｇ／ＩＵ（例えば、約１２９６２、１７５８１、２０３４５ｖｇ／ＩＵ）である、Ｅ２～Ｅ２００のいずれか１つに記載の方法。

【0210】

Ｅ２０２．親和性溶出液中のｒＡＡＶベクターの感染性比が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液中のｒＡＡＶベクターの感染性比と比較して増加している、Ｅ２～Ｅ２０１のいずれか１つに記載の方法。

【0211】

Ｅ２０３．親和性溶出液中のｒＡＡＶベクターの感染性比が、細胞に基づくアッセイによって測定される、Ｅ２０１またはＥ２０２に記載の方法。

【0212】

Ｅ２０４．ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶａｖｉａｎ、ＡＡＶｂａｔ、ＡＡＶｂｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｃａｎｉｎｅ、ＡＡＶｅｑｕｉｎｅ、ＡＡＶｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ４、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ５、ＡＡＶｓｎａｋｅ ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、Ｅ１～Ｅ２０３のいずれか１つに記載の方法。

【0213】

Ｅ２０５．ｒＡＡＶ血清型がＡＡＶ９である、Ｅ１～Ｅ２０４のいずれか１つに記載の方法。

【0214】

Ｅ２０６．ｒＡＡＶベクターが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＰ１タンパク質を含む、Ｅ１～Ｅ２０５のいずれか１つに記載の方法。

【0215】

Ｅ２０７．ｒＡＡＶベクターがミニ－ジストロフィン導入遺伝子を含む、Ｅ１～Ｅ２０６のいずれか１つに記載の方法。

【0216】

Ｅ２０８．ミニ－ジストロフィン導入遺伝子が配列番号１の核酸配列を含むか、またはそれからなる、Ｅ２０７に記載の方法。

【0217】

Ｅ２０９．ミニ－ジストロフィン導入遺伝子が配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるタンパク質をコードする、Ｅ２０７またはＥ２０８のいずれか１つに記載の方法。

【0218】

Ｅ２１０．ｒＡＡＶベクターが配列番号４の核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸を含む、Ｅ１～Ｅ２０９のいずれか１つに記載の方法。

【0219】

Ｅ２１１．固定相を再生することをさらに含む、Ｅ１～Ｅ２１０のいずれか１つに記載の方法。

【0220】

Ｅ２１２．固定相の再生が、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させることを含み、ｒＡＡＶベクタータンパク質、宿主細胞不純物、および／または核酸が、第１の再生緩衝液との接触によって固定相から放出され、任意選択により、方法が、第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ２１１に記載の方法。

【0221】

Ｅ２１３．親和性クロマトグラフィーによってｒＡＡＶベクターの精製のための固定相を再生する方法であって、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させることを含み、ｒＡＡＶベクタータンパク質、宿主細胞不純物および／または核酸が、第１の再生緩衝液との接触によって固定相から放出される、方法。

【0222】

Ｅ２１４．固定相と第１の再生緩衝液とを接触させる前に固定相の４回目の平衡化をさらに含む、Ｅ２１１～Ｅ２１３のいずれか１つに記載の方法。

【0223】

Ｅ２１５．４回目の平衡化が、固定相への緩衝溶液（例えば、約１５０ｍＭ～約１６０ｍＭの酢酸ナトリウム）の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ２１４に記載の方法。

【0224】

Ｅ２１６．緩衝溶液が５．６のｐＨの約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、Ｅ２１５に記載の方法。

【0225】

Ｅ２１７．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ２１５またはＥ２１６に記載の方法。

【0226】

Ｅ２１８．固定相上で実行することができる精製サイクルの数が、第１の再生緩衝液と接触させていない固定相上で実行することができる精製サイクルの数と比較して、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させることによって増加し、
精製サイクルが、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること、および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させることを含み、
溶出液中のｒＡＡＶベクターのｖｇ回収率（％）が５０％またはそれより大きい、
Ｅ２１３～Ｅ２１７のいずれか１つに記載の方法。

【0227】

Ｅ２１９．第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が２より大きい、Ｅ２１８に記載の方法。

【0228】

Ｅ２２０．第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が８以上である；
第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が１０以上である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率（％）が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率（％）と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのカラム圧力が、０．４ＭＰａ以下である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の純度（％）が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の純度（％）と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量と比較して１０％を超えて増加していない；および／または
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０と比較して１０％を超えて減少していない、
Ｅ２１８またはＥ２１９に記載の方法。

【0229】

Ｅ２２１．第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が、グアニジンＨＣｌを含む緩衝液と接触させた固定相と比較して増加している、Ｅ２１８～Ｅ２２０のいずれか１つに記載の方法。

【0230】

Ｅ２２２．第１の再生緩衝液が酸、プロピレングリコール、および／または尿素を含む、Ｅ２１２～Ｅ２２１のいずれか１つに記載の方法。

【0231】

Ｅ２２３．第１の再生緩衝液の酸がリン酸、酢酸、またはアミノ酸である、Ｅ２２２に記載の方法。

【0232】

Ｅ２２４．第１の再生緩衝液中の酸の濃度が、約０．０５Ｎ～約１．５Ｎ、例えば、約０．０５Ｎ～約１Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．７５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．２５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．１５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．０７５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．１Ｎ、約０．１Ｎ～約０．１５Ｎ、約０．０５Ｎ～約０．０６Ｎ、約０．０６Ｎ～約０．０７Ｎ、約０．０７Ｎ～約０．０８Ｎ、約０．０８Ｎ～約０．０９Ｎ、約０．０９Ｎ～約０．１Ｎ、約０．１Ｎ～約０．１１Ｎ、約０．１１Ｎ～約０．１２Ｎ、約０．１２Ｎ～約０．１３Ｎ、約０．１３Ｎ～約０．１４Ｎ、約０．１４Ｎ～約０．１５Ｎ、約０．１５Ｎ～約０．２Ｎ、約０．２Ｎ～約０．３Ｎ、約０．３Ｎ～約０．４Ｎ、約０．４Ｎ～約０．５Ｎ、約０．４５Ｎ～約０．５５Ｎ、約０．５Ｎ～約０．６Ｎ、約０．６Ｎ～約０．７Ｎ、約０．７Ｎ～約０．８Ｎ、約０．８Ｎ～約０．９Ｎ、約０．９Ｎ～約１．０Ｎ、約１．０Ｎ～約１．１Ｎ、約１．１Ｎ～約１．２Ｎ、約１．２Ｎ～約１．３Ｎ、約１．３Ｎ～約１．４Ｎ、約１．４Ｎ～約１．５Ｎである、Ｅ２２２またはＥ２２３に記載の方法。

【0233】

Ｅ２２５．第１の再生緩衝液中の酸の濃度が、約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ、約０．１Ｎ）である、Ｅ２２２～Ｅ２２４のいずれか１つに記載の方法。

【0234】

Ｅ２２６．酸がリン酸である、Ｅ２２２～Ｅ２２５のいずれか１つに記載の方法。

【0235】

Ｅ２２７．酸がリン酸であり、リン酸の濃度が約０．１３Ｎ～約０．１４Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）である、Ｅ２２２～Ｅ２２６のいずれか１つに記載の方法。

【0236】

Ｅ２２８．第１の再生緩衝液が、約１～約４、例えば、約１～約３、約１～約２、約１．５～約２．５、約２～約３、約３～約４、約２～約４のｐＨを有する、Ｅ２１２～Ｅ２２７のいずれか１つに記載の方法。

【0237】

Ｅ２２９．第１の再生緩衝液が約１、約２、約３、約４のｐＨを有する、Ｅ２１２～Ｅ２２８のいずれか１つに記載の方法。

【0238】

Ｅ２３０．第１の再生緩衝液が約２（例えば、約１．９）のｐＨを有する、Ｅ２１２～Ｅ２２９のいずれか１つに記載の方法。

【0239】

Ｅ２３１．酸がリン酸であり、リン酸の濃度が約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）であり、第１の再生緩衝液が約１．５～約２．５（例えば、約１．９）のｐＨを有する、Ｅ２２２～Ｅ２３０のいずれか１つに記載の方法。

【0240】

Ｅ２３２．固定相を、２ＣＶ～１０ＣＶ、例えば、１ＣＶ～３ＣＶ、３ＣＶ～５ＣＶ、３ＣＶ～８ＣＶ、４ＣＶ～６ＣＶ、５ＣＶ～８ＣＶ、または８ＣＶ～１０ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させる、Ｅ２１２～Ｅ２３１のいずれか１つに記載の方法。

【0241】

Ｅ２３３．固定相を、約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第１の再生緩衝液と接触させる、Ｅ２１２～Ｅ２３２のいずれか１つに記載の方法。

【0242】

Ｅ２３４．固定相を約２．５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させた後、約４５分間保持し、次いで、固定相と第２の２．５ＣＶの第１の再生緩衝液とを接触させる、Ｅ２１２～Ｅ２３３のいずれか１つに記載の方法。

【0243】

Ｅ２３５．第１の再生緩衝液が固定相の中を上向きに流動する、Ｅ２１２～Ｅ２３４のいずれか１つに記載の方法。

【0244】

Ｅ２３６．第１の再生緩衝液の流動速度が、約１０ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈ、例えば、約５０ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１０ｃｍ／ｈ～約５０ｃｍ／ｈ、約５０ｃｍ／ｈ～約１００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約２００ｃｍ／ｈ、約２００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約３００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約４００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、または約５００ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈである、Ｅ２１２～Ｅ２３５のいずれか１つに記載の方法。

【0245】

Ｅ２３７．第１の再生緩衝液の流動速度が約４５０ｃｍ／ｈ～約５５０ｃｍ／ｈ（例えば、５００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２３５のいずれか１つに記載の方法。

【0246】

Ｅ２３８．第１の再生緩衝液の流動速度が約２５０ｃｍ／ｈ～約３５０ｃｍ／ｈ（例えば、３００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２３５のいずれか１つに記載の方法。

【0247】

Ｅ２３９．第１の再生緩衝液の流動速度が約１０ｃｍ／ｈ～約２０ｃｍ／ｈ（例えば、１４ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２３５のいずれか１つに記載の方法。

【0248】

Ｅ２４０．第１の再生緩衝液の滞留時間が、約２．５ｍｉｎ／ＣＶ～約３．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、３ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ２１２～Ｅ２３９のいずれか１つに記載の方法。

【0249】

Ｅ２４１．第１の再生緩衝液の滞留時間が、約１１ｍｉｎ／ＣＶ～約１２ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、１１．５ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ２１２～Ｅ２３９のいずれか１つに記載の方法。

【0250】

Ｅ２４２．固定相を、約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）のリン酸を含む、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第１の再生緩衝液と接触させ、第１の再生緩衝液の流動速度が約４５０～約５５０ｃｍ／ｈ（例えば、約５００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２４１のいずれか１つに記載の方法。

【0251】

Ｅ２４３．固定相を、約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）のリン酸を含む、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第１の再生緩衝液と接触させ、第１の再生緩衝液の流動速度が約２５０～約３５０ｃｍ／ｈ（例えば、約３００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２４１のいずれか１つに記載の方法。

【0252】

Ｅ２４４．固定相を、約０．０８Ｎ～約０．１２Ｎ（例えば、約０．１Ｎ）のリン酸を含む、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第１の再生緩衝液と接触させ、第１の再生緩衝液の流動速度が約１０～約２０ｃｍ／ｈ（例えば、約１４ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２１２～Ｅ２４３のいずれか１つに記載の方法。

【0253】

Ｅ２４５．固定相と第１の再生緩衝液とを接触させた後の、固定相の浄化後洗浄をさらに含む、Ｅ２１２～Ｅ２４４のいずれか１つに記載の方法。

【0254】

Ｅ２４６．浄化後洗浄が、固定相への緩衝溶液（例えば、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ）の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ２４５に記載の方法。

【0255】

Ｅ２４７．緩衝溶液がｐＨ７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む、Ｅ２４６に記載の方法。

【0256】

Ｅ２４８．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ２４６またはＥ２４７に記載の方法。

【0257】

Ｅ２４９．緩衝溶液が固定相の中を下向きに流動する、Ｅ２４６～Ｅ２４８のいずれか１つに記載の方法。

【0258】

Ｅ２５０．固定相と第１の再生緩衝液とを接触させた後、および任意選択により、浄化後洗浄の後、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む、Ｅ２１２～Ｅ２４９のいずれか１つに記載の方法。

【0259】

Ｅ２５１．第２の再生緩衝液が界面活性剤および緩衝剤を含む、Ｅ２５０に記載の方法。

【0260】

Ｅ２５２．界面活性剤が、サルコシル、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ２５１に記載の方法。

【0261】

Ｅ２５３．界面活性剤がサルコシルである、Ｅ２５１～Ｅ２５２に記載の方法。

【0262】

Ｅ２５４．第２の再生緩衝液中の界面活性剤のパーセンテージが、約０．１％～約１０％、例えば、約０．１％～約５％、約０．５％～約５％、約０．５％～約２．５％、約０．５％～約１．５％、約０．１％～約０．５％、約０．５％～約１．０％、約１．０％～約５．０％、約５．０％～約１０％である、Ｅ２５１～Ｅ２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0263】

Ｅ２５５．界面活性剤のパーセンテージが約０．５％～約１．５％（例えば、約１．０％）である、Ｅ２５１～Ｅ２５４のいずれか１つに記載の方法。

【0264】

Ｅ２５６．界面活性剤がサルコシルであり、サルコシルの濃度が約０．３％～約１．５％（例えば、約１．０％）である、Ｅ２５１～Ｅ２５５のいずれか１つに記載の方法。

【0265】

Ｅ２５７．第２の再生緩衝液の緩衝剤が、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、およびビシンからなる群から選択される、Ｅ２５１～Ｅ２５６のいずれか１つに記載の方法。

【0266】

Ｅ２５８．第２の再生緩衝液中の緩衝剤がＴｒｉｓである、Ｅ２５１～Ｅ２５７のいずれか１つに記載の方法。

【0267】

Ｅ２５９．第２の再生緩衝液中の緩衝剤の濃度が、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約４００ｍＭ～約５００ｍＭである、Ｅ２５１～Ｅ２５８のいずれか１つに記載の方法。

【0268】

Ｅ２６０．第２の再生緩衝液中の緩衝剤の濃度が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）である、Ｅ２５１～Ｅ２５９のいずれか１つに記載の方法。

【0269】

Ｅ２６１．第２の再生緩衝液中の緩衝剤がＴｒｉｓであり、第２の再生緩衝液中のＴｒｉｓの濃度が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）である、Ｅ２５１～Ｅ２６０のいずれか１つに記載の方法。

【0270】

Ｅ２６２．第２の再生緩衝液が約７～約８、例えば、約７．５のｐＨを有する、Ｅ２５０～Ｅ２６１のいずれか１つに記載の方法。

【0271】

Ｅ２６３．第２の再生緩衝液が、約０．５％～約１．５％（例えば、約１．０％）のサルコシル、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含み、約７～約８（例えば、約７．５）のｐＨを有する、Ｅ２５０～Ｅ２６２のいずれか１つに記載の方法。

【0272】

Ｅ２６４．固定相を、２ＣＶ～１０ＣＶ、例えば、１ＣＶ～３ＣＶ、３ＣＶ～５ＣＶ、３ＣＶ～８ＣＶ、４ＣＶ～６ＣＶ、５ＣＶ～８ＣＶ、または８ＣＶ～１０ＣＶの第２の再生緩衝液と接触させる、Ｅ２５０～Ｅ２６３のいずれか１つに記載の方法。

【0273】

Ｅ２６５．固定相を、約４．５ＣＶ～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第２の再生緩衝液と接触させる、Ｅ２５０～Ｅ２６４のいずれか１つに記載の方法。

【0274】

Ｅ２６６．第２の再生緩衝液が固定相の中を上向きに流動する、Ｅ２５０～Ｅ２６５のいずれか１つに記載の方法。

【0275】

Ｅ２６７．第２の再生緩衝液の流動速度が約４５０ｃｍ／ｈ～約５５０ｃｍ／ｈ（例えば、５００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２６６のいずれか１つに記載の方法。

【0276】

Ｅ２６８．第２の再生緩衝液の流動速度が約２５０ｃｍ／ｈ～約３５０ｃｍ／ｈ（例えば、３００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２６６のいずれか１つに記載の方法。

【0277】

Ｅ２６９．第２の再生緩衝液の流動速度が約１０ｃｍ／ｈ～約２０ｃｍ／ｈ（例えば、１４ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２６６のいずれか１つに記載の方法。

【0278】

Ｅ２７０．第２の再生緩衝液の滞留時間が、約２．５ｍｉｎ／ＣＶ～約３．５ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、３ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ２５０～Ｅ２６９のいずれか１つに記載の方法。

【0279】

Ｅ２７１．再生緩衝液の滞留時間が、約１１ｍｉｎ／ＣＶ～約１２ｍｉｎ／ＣＶ（例えば、１１．５ｍｉｎ／ＣＶ）である、Ｅ２５０～Ｅ２６９のいずれか１つに記載の方法。

【0280】

Ｅ２７２．固定相を、約０．５％～約１．５％（例えば、約１．０％）のサルコシル、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含み、約７～約８（例えば、約７．５）のｐＨを有する、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第２の再生緩衝液と接触させ、第２の再生緩衝液の流動速度が約４５０～約５５０ｃｍ／ｈ（約５００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２７１のいずれか１つに記載の方法。

【0281】

Ｅ２７３．固定相を、約０．５％～約１．５％（例えば、約１．０％）のサルコシル、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含み、約７～約８（例えば、約７．５）のｐＨを有する、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第２の再生緩衝液と接触させ、第２の再生緩衝液の流動速度が約２５０～約３５０ｃｍ／ｈ（約３００ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２７１のいずれか１つに記載の方法。

【0282】

Ｅ２７４．固定相を、約０．５％～約１．５％（例えば、約１．０％）のサルコシル、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含み、約７～約８（例えば、約７．５）のｐＨを有する、約４．５～約５．５ＣＶ（例えば、約５ＣＶ）の第２の再生緩衝液と接触させ、第２の再生緩衝液の流動速度が約１０～約２０ｃｍ／ｈ（約１４ｃｍ／ｈ）である、Ｅ２５０～Ｅ２７１のいずれか１つに記載の方法。

【0283】

Ｅ２７５．固定相と第２の再生緩衝液とを接触させた後の、固定相の再生後洗浄をさらに含む、Ｅ２５０～Ｅ２７４のいずれか１つに記載の方法。

【0284】

Ｅ２７６．再生後洗浄が、固定相への緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ２７５に記載の方法。

【0285】

Ｅ２７７．緩衝溶液が、約７～８（例えば、約７．５）のｐＨの、約１Ｍ～約３Ｍ（例えば、約２Ｍ）のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含む、Ｅ２７６に記載の方法。

【0286】

Ｅ２７８．約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの緩衝溶液が固定相に適用される、Ｅ２７６またはＥ２７７に記載の方法。

【0287】

Ｅ２７９．緩衝溶液が固定相の中を下向きに流動する、Ｅ２７６～Ｅ２７８のいずれか１つに記載の方法。

【0288】

Ｅ２８０．４回目の平衡化緩衝溶液、第１の再生緩衝液、浄化後洗浄緩衝溶液、第２の再生緩衝液および／または再生後洗浄緩衝溶液の滞留時間が、約１ｍｉｎ／ＣＶ～約１５ｍｉｎ／ＣＶ、例えば、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約１２ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶ、約１ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約２ｍｉｎ／ＣＶ～約３ｍｉｎ／ＣＶ、約３ｍｉｎ／ＣＶ～約４ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ～約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ～約６ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ～約７ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ～約８ｍｉｎ／ＣＶ、約８ｍｉｎ／ＣＶ～約９ｍｉｎ／ＣＶ、約９ｍｉｎ／ＣＶ～約１０ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ２１２～Ｅ２７９のいずれか１つに記載の方法。

【0289】

Ｅ２８１．４回目の平衡化緩衝溶液、第１の再生緩衝液、浄化後洗浄緩衝溶液、第２の再生緩衝液および／または再生後洗浄緩衝溶液の滞留時間が、約３ｍｉｎ／ＣＶ、約４ｍｉｎ／ＣＶ、約５ｍｉｎ／ＣＶ、約５．５ｍｉｎ／ＣＶ、約６ｍｉｎ／ＣＶ、約７ｍｉｎ／ＣＶ、約８ｍｉｎ／ＣＶ、約９ｍｉｎ／ＣＶ、約９．５ｍｉｎ／ＣＶ、約１０ｍｉｎ／ＣＶ、約１０．５ｍｉｎ／ＣＶ、約１１ｍｉｎ／ＣＶ、約１１．５ｍｉｎ／ＣＶ、約１２ｍｉｎ／ＣＶ、約１２．５ｍｉｎ／ＣＶ、約１３ｍｉｎ／ＣＶ、約１３．５ｍｉｎ／ＣＶ、約１４ｍｉｎ／ＣＶ、約１４．５ｍｉｎ／ＣＶまたは約１５ｍｉｎ／ＣＶである、Ｅ２１２～Ｅ２８０のいずれか１つに記載の方法。

【0290】

Ｅ２８２．４回目の平衡化緩衝溶液、第１の再生緩衝液、浄化後洗浄緩衝溶液、第２の再生緩衝液および／または再生後洗浄緩衝溶液の流動速度が、約１０ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈ、例えば、約５０ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、約１０ｃｍ／ｈ～約５０ｃｍ／ｈ、約５０ｃｍ／ｈ～約１００ｃｍ／ｈ、約１００ｃｍ／ｈ～約２００ｃｍ／ｈ、約２００ｃｍ／ｈ～約３００ｃｍ／ｈ、約３００ｃｍ／ｈ～約４００ｃｍ／ｈ、約４００ｃｍ／ｈ～約５００ｃｍ／ｈ、または約５００ｃｍ／ｈ～約６００ｃｍ／ｈである、Ｅ２１２～Ｅ２８１のいずれか１つに記載の方法。

【0291】

Ｅ２８３．再生緩衝液のＡ２８０ピーク面積が９００ｍＬ^＊ｍＡＵより大きくなる、および／または再生緩衝液のＡ２６０ピーク面積が５００ｍＬ^＊ｍＡＵより大きくなるように、第１の再生緩衝液、第２の再生緩衝液、またはその両方が、固定相から不純物を除去する、Ｅ２１２～Ｅ２８２のいずれか１つに記載の方法。

【0292】

Ｅ２８４．親和性クロマトグラフィー実行の経過にわたるカラム圧力の最大変化が、移動相の流動を一定に保持した場合に約０．２２２ｍＰａ～約０．７１３ｍＰａである、Ｅ１～Ｅ２８３のいずれか１つに記載の方法。

【0293】

Ｅ２８５．ガードカラム、ガードフィルター、またはガードカラムとガードフィルターとの両方を固定相上にロードする前に、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を濾過することをさらに含む、Ｅ１～Ｅ２８４のいずれか１つに記載の方法。

【0294】

Ｅ２８６．ガードカラムが、第４級アンモニウムもしくはヒドロキシル陰イオンを含む強力な陰イオン交換樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ）、ベンジルウルトラ疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ）、オクチルＨＩＣ樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ）、またはオクチルアミンリガンド樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ ７００）ガードカラムを含む、Ｅ２８５に記載の方法。

【0295】

Ｅ２８７．ガードフィルターが０．２μｍのノミナルフィルターである、Ｅ２８５またはＥ２８６に記載の方法。

【0296】

Ｅ２８８．ガードフィルターが０．２μｍのノミナルＰａｌｌ（商標）ＥＡＶプレカラムフィルターである、Ｅ２８５～Ｅ２８７のいずれか１つに記載の方法。

【0297】

Ｅ２８９．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを精製する方法であって、
親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
１５％～２５％のエタノールおよび緩衝剤を含み、５～６のｐＨを有する溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；
塩、アミノ酸および緩衝剤を含み、２～４のｐＨを有する溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、親和性溶出液を生産すること
を含む方法。

【0298】

Ｅ２９０．ｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、
固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
約１５％～２０％（例えば、約１７％、約１７．５％）のエタノールおよび約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ、約１５３ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；
約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ_２、約１４０～約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（約１４８ｍＭ）、ｐＨ２．５～３．５（例えば、約３．０）を含む溶出緩衝液を用いて、固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させること；
固定相から、精製されたｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を収集すること
を含む方法。

【0299】

Ｅ２９１．ｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、
使用前洗浄が水の固定相への適用を含む、固定相の使用前洗浄；
使用前浄化が約０．１Ｎ～約０．２Ｎのリン酸（例えば、約０．１３２Ｎ）、ｐＨ１．５～２．５（例えば、約１．９）を含む溶液の固定相への適用を含む、固定相の使用前浄化；
１回目の平衡化が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の１回目の平衡化；
固定相上へのｒＡＡＶベクターを含む溶液のローディング；
２回目の平衡化が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の２回目の平衡化；
溶出前洗浄が約１５％～２０％（例えば、約１７％、約１７．５％）のエタノールおよび約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ、約１５３ｍＭ）の酢酸ナトリウム、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む溶出前洗浄溶液の固定相への適用を含む、固定相の溶出前洗浄；
３回目の平衡化が約１５０ｍＭ～約１６０ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）の緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム）、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の３回目の平衡化；
溶出緩衝液が約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のグリシン、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ）のＭｇＣｌ_２、約１４０～約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム（約１４８ｍＭ）、ｐＨ２．５～３．５（例えば、約３．０）を含む、溶出緩衝液を用いた、固定相からのｒＡＡＶベクターの溶出；および／または
固定相からの、精製されたｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液の収集
を含む方法。

【0300】

Ｅ２９２．４回目の平衡化が約１５０ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）の緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム）、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の４回目の平衡化；
固定相と、約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）のリン酸、ｐＨ１．５～２．５（例えば、約１．９）を含む第１の再生緩衝液との接触；
浄化後洗浄が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の浄化後洗浄；
固定相と、約０．５％～約１．５％（例えば、約１％）の界面活性剤（例えば、サルコシル）および約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む第２の再生緩衝液との接触；
再生後洗浄が、約７～８（例えば、約７．５）のｐＨの、約１Ｍ～約３Ｍ（例えば、約２Ｍ）のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含む緩衝溶液の適用を含む、固定相の再生後洗浄；
固定相への注射用水の適用を含む使用後フラッシュ；ならびに／または
固定相と、１７．５％のエタノールを含む溶液との接触
をさらに含む、Ｅ２９１に記載の方法。

【0301】

Ｅ２９３．１７．５％のエタノールを含む溶液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ２９２に記載の方法。

【0302】

Ｅ２９４．固定相を再生する方法であって、
平衡化が約１５０ｍＭ～約１５５ｍＭ（例えば、約１５３ｍＭ）の緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム）、ｐＨ５～６（例えば、約５．６）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の平衡化；
固定相と、約０．１０Ｎ～約０．１５Ｎ（例えば、約０．１３２Ｎ）のリン酸、ｐＨ１．５～２．５（例えば、約１．９）を含む第１の再生緩衝液との接触；
浄化後洗浄が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む緩衝溶液の固定相への適用を含む、固定相の浄化後洗浄；
固定相と、約０．５％～約１．５％（例えば、約１％）の界面活性剤（例えば、サルコシル）および約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）の緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７～８（例えば、約７．５）を含む第２の再生緩衝液との接触；
再生後洗浄が、約７～８（例えば、約７．５）のｐＨの、約１Ｍ～約３Ｍ（例えば、約２Ｍ）のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ）のＴｒｉｓを含む緩衝溶液の適用を含む、固定相の再生後洗浄；
固定相への注射用水の適用を含む使用後フラッシュ；ならびに／または
固定相と、１７．５％のエタノールを含む溶液との接触
を含む方法。

【0303】

Ｅ２９５．ｒＡＡＶベクタータンパク質、カプシドタンパク質、宿主細胞不純物および／または核酸が、第１の再生緩衝液、第２の再生緩衝液またはその両方との接触によって固定相から放出される、Ｅ２９４に記載の方法。

【0304】

Ｅ２９６．１７．５％のエタノールを含む溶液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ２９４またはＥ２９５に記載の方法。

【0305】

Ｅ２９７．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを精製する方法であって、
親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
１５％～２５％のエタノールおよび緩衝剤を含み、５～６のｐＨを有する溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；
塩、アミノ酸および緩衝剤を含み、２～４のｐＨを有する溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、親和性溶出液を生産すること
を含む方法。

【0306】

Ｅ２９８．親和性クロマトグラフィー固定相がカラム中にある、Ｅ２９７に記載の方法。

【0307】

Ｅ２９９．溶出緩衝液が５ｍＭ～１５０ｍＭの塩を含み、任意選択により、塩が塩化マグネシウムである、Ｅ２９７～Ｅ２９８のいずれか１つに記載の方法。

【0308】

Ｅ３００．溶出緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭのアミノ酸を含み、任意選択により、アミノ酸がグリシンである、Ｅ２９８～Ｅ２９９のいずれか１つに記載の方法。

【0309】

Ｅ３０１．溶出緩衝液が７５ｍＭ～２５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤が酢酸ナトリウムである、Ｅ２９７～Ｅ３００のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

Ｅ３０２．溶出緩衝液が２．５～３．５のｐＨを有する、Ｅ２９７～Ｅ３０１のいずれか１つに記載の方法。

【0311】

Ｅ３０３．溶出緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含み、任意選択により、溶出緩衝液が５ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍまたは２０ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、Ｅ２９７～Ｅ３０２のいずれか１つに記載の方法。

【0312】

Ｅ３０４．２カラム体積（ＣＶ）～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出緩衝液が固定相に適用される、Ｅ２９７～Ｅ３０３のいずれか１つに記載の方法。

【0313】

Ｅ３０５．溶出緩衝液が、ｉ）固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる；ｉｉ）固定相から残留不純物を溶出させない；ｉｉｉ）親和性溶出液の沈降をもたらさない；ｉｖ）ｖｇ回収率（％）を最大化する；ｖ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の固定相へのｒＡＡＶベクターの結合を阻害しない；ｖｉ）三価陰イオンを含有しない；ｖｉｉ）クエン酸イオンを含有しない、またはその組合せである、Ｅ２９７～Ｅ３０４のいずれか１つに記載の方法。

【0314】

Ｅ３０６．０．１ＣＶ～１０ＣＶの親和性溶出液が固定相から収集される、Ｅ２９７～Ｅ３０５のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

Ｅ３０７．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを含む、Ｅ２９７～Ｅ３０６のいずれか１つに記載の方法。

【0316】

Ｅ３０８．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードして、固定相１ｍＬあたり１ｘ１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）～固定相１ｍＬあたり１．５ｘ１０^１４ｖｇのチャレンジを達成する、Ｅ２９７～Ｅ３０７のいずれか１つに記載の方法。

【0317】

Ｅ３０９．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、Ｅ２９７～Ｅ３０８のいずれか１つに記載の方法。

【0318】

Ｅ３１０．ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶａｖｉａｎ、ＡＡＶｂａｔ、ＡＡＶｂｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｃａｎｉｎｅ、ＡＡＶｅｑｕｉｎｅ、ＡＡＶｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ４、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ５、ＡＡＶｓｎａｋｅ ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、Ｅ３０９に記載の方法。

【0319】

Ｅ３１１．固定相がＡＡＶカプシドに結合する高分子を含む、Ｅ２９７～Ｅ３１０のいずれか１つに記載の方法。

【0320】

Ｅ３１２．溶出前洗浄溶液が１０ｍＭ～５００ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤が酢酸ナトリウムである、Ｅ２９７～Ｅ３１１のいずれか１つに記載の方法。

【0321】

Ｅ３１３．溶出前洗浄溶液が１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、５～６のｐＨを有し、任意選択により、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、Ｅ２９７～Ｅ３１２のいずれか１つに記載の方法。

【0322】

Ｅ３１４．溶出前洗浄が、ｉ）固定相から結合した不純物を除去する；ｉｉ）ｒＡＡＶ－固定相リガンド結合を維持する；ｉｉｉ）宿主細胞タンパク質などのｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有する、またはその組合せである、Ｅ２９７～Ｅ３１３のいずれか１つに記載の方法。

【0323】

Ｅ３１５．ｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前、ｉｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後、ｉｉｉ）溶出前洗浄の適用前、ｉｖ）溶出前洗浄の適用後、ｖ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前、ｖｉ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させた後、ｖｉｉ)固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させる前、またはその組合せにおいて、固定相の平衡化をさらに含む、Ｅ２９７～Ｅ３１４のいずれか１つに記載の方法。

【0324】

Ｅ３１６．平衡化が、固定相への緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む、Ｅ３１５に記載の方法。

【0325】

Ｅ３１７．緩衝溶液がＴｒｉｓまたは酢酸ナトリウムを含む、Ｅ３１６に記載の方法。

【0326】

Ｅ３１８．緩衝溶液がｐＨ約７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓまたはｐＨ約５．６の約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、Ｅ３１６またはＥ３１７に記載の方法。

【0327】

Ｅ３１９．親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む、Ｅ２９７～Ｅ３１８のいずれか１つに記載の方法。

【0328】

Ｅ３２０．第１の再生緩衝液が０．０５Ｎ～１．５Ｎの酸を含み、任意選択により、酸がリン酸である、Ｅ３１９に記載の方法。

【0329】

Ｅ３２１．第１の再生緩衝液が０．１０Ｎ～０．１５Ｎのリン酸、および１．５～２．５のｐＨを含む、Ｅ３１９またはＥ３２０に記載の方法。

【0330】

Ｅ３２２．固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させる、Ｅ３１９～Ｅ３２１のいずれか１つに記載の方法。

【0331】

Ｅ３２３．第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ３１９～Ｅ３２２のいずれか１つに記載の方法。

【0332】

Ｅ３２４．第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、Ｅ３１９～Ｅ３２３のいずれか１つに記載の方法。

【0333】

Ｅ３２５．第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が８以上である；
第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が１０以上である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率（％）が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率（％）と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのカラム圧力が、０．４ＭＰａ以下である；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の純度（％）が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の純度（％）と比較して１０％を超えて減少していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量と比較して１０％を超えて増加していない；
固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０が、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０と比較して１０％を超えて減少していない、またはその組合せである、
Ｅ３１９～Ｅ３２４のいずれか１つに記載の方法。

【0334】

Ｅ３２６．第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数が、グアニジンＨＣｌを含む緩衝液と接触させた固定相と比較して増加している、Ｅ３１９～Ｅ３２５のいずれか１つに記載の方法。

【0335】

Ｅ３２７．固定相と第１の再生緩衝液とを接触させた後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、Ｅ３１９～Ｅ３２６のいずれか１つに記載の方法。

【0336】

Ｅ３２８．第２の再生緩衝液が０．１％～５％の界面活性剤を含み、任意選択により、界面活性剤がサルコシルである、Ｅ３２７に記載の方法。

【0337】

Ｅ３２９．第２の再生緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤がＴｒｉｓである、Ｅ３２７～Ｅ３２８に記載の方法。

【0338】

Ｅ３３０．第２の再生緩衝液が０．１％～１．５％のサルコシル、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ、７～８のｐＨを含み、任意選択により、固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第２の再生緩衝液と接触させる、Ｅ３２７～Ｅ３２９のいずれか１つに記載の方法。

【0339】

Ｅ３３１．第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ３２７～Ｅ３３０のいずれか１つに記載の方法。

【0340】

Ｅ３３２．第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、Ｅ３２７～Ｅ３３１のいずれか１つに記載の方法。

【0341】

Ｅ３３３．ｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、
カラム中の親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること；
１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および５～６のｐＨを含む溶出前洗浄溶液を固定相に適用すること；ならびに
５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含む溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、ｒＡＡＶベクターを含有する親和性溶出液を生産すること
を含む方法。

【0342】

Ｅ３３４．１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される、Ｅ３３３に記載の方法。

【0343】

Ｅ３３５．溶出前洗浄が、固定相からのｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有し、溶出前洗浄がｒＡＡＶ－固定相リガンド結合またはその両方を維持し、任意選択により、ｒＡＡＶタンパク質以外のタンパク質が宿主細胞タンパク質である、Ｅ３３３またはＥ３３４に記載の方法。

【0344】

Ｅ３３６．溶出緩衝液が親和性溶出液の沈降をもたらさない、溶出緩衝液が陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）固定相へのｒＡＡＶベクターの結合を阻害しない、またはその両方である、Ｅ３３３～Ｅ３３５のいずれか１つに記載の方法。

【0345】

Ｅ３３７．親和性溶出液中のｖｇ回収率（％）が、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定した場合、５０％～１００％である；親和性溶出液１ｍＬあたりのｖｇが、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定した場合、約１．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍＬである；親和性溶出液の純度（％）が、任意選択により、ＳＥＣもしくは非還元的逆相ＨＰＬＣによって測定した場合、総タンパク質のうち、約９５％～約１００％のカプシドタンパク質である、またはその組合せである、Ｅ３３３～Ｅ３３６のいずれか１つに記載の方法。

【0346】

Ｅ３３８．親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む、Ｅ３３３～Ｅ３３７のいずれか１つに記載の方法。

【0347】

Ｅ３３９．第１の再生緩衝液の後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、Ｅ３３３～Ｅ３３８のいずれか１つに記載の方法。

【0348】

Ｅ３４０．親和性クロマトグラフィー固定相を再生する方法であって、固定相と、酸および１～４のｐＨを含む第１の再生緩衝液とを接触させることを含み、不純物が固定相から除去される、方法。

【0349】

Ｅ３４１．第１の再生緩衝液が０．０５Ｎ～１．５Ｎの酸を含み、任意選択により、酸がリン酸または酢酸である、Ｅ３４０に記載の方法。

【0350】

Ｅ３４２．第１の再生緩衝液が０．１０Ｎ～０．１５Ｎのリン酸、および１．５～２．５のｐＨを含む、Ｅ３４０またはＥ３４１に記載の方法。

【0351】

Ｅ３４３．１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第１の再生緩衝液を固定相に適用し、固定相を、第１の再生緩衝液の体積の約半分と接触させた後、約４５分間保持し、次いで、固定相と、第１の再生緩衝液の体積の第２の半分とを接触させる、Ｅ３４０～Ｅ３４２のいずれか１つに記載の方法。

【0352】

Ｅ３４４．第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ３４０～Ｅ３４３のいずれか１つに記載の方法。

【0353】

Ｅ３４５．第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、Ｅ３４０～Ｅ３４４のいずれか１つに記載の方法。

【0354】

Ｅ３４６．第１の再生緩衝液の後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液が第１の再生緩衝液と異なる、Ｅ３４０～Ｅ３４５のいずれか１つに記載の方法。

【0355】

Ｅ３４７．第２の再生緩衝液が界面活性剤および緩衝剤を含む、Ｅ３４６に記載の方法。

【0356】

Ｅ３４８．第２の再生緩衝液が０．１％～５％の界面活性剤を含み、任意選択により、界面活性剤がサルコシルである、Ｅ３４６～Ｅ３４７に記載の方法。

【0357】

Ｅ３４９．第２の再生緩衝液が５０ｍＭ～１５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤がＴｒｉｓである、Ｅ３４６～Ｅ３４８のいずれか１つに記載の方法。

【0358】

Ｅ３５０．第２の再生緩衝液が０．１％～１．５％のサルコシル、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ、７～８のｐＨを含む、Ｅ３４６～Ｅ３４９のいずれか１つに記載の方法。

【0359】

Ｅ３５１．１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第２の再生緩衝液が固定相に適用される、Ｅ３４６～Ｅ３５０のいずれか１つに記載の方法。

【0360】

Ｅ３５２．第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすることをさらに含む、Ｅ３５０～Ｅ３５１のいずれか１つに記載の方法。

【0361】

Ｅ３５３．第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む、Ｅ３５０～Ｅ３５２のいずれか１つに記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0362】

【図1】溶出緩衝液ＡおよびＢに関する例示的な親和性溶出クロマトグラムを描写する。

【図2】ＨＱ－１７およびＨＱ－１８ ＡＥＸ溶出プロファイルの例示的なオーバーレイを描写する。

【図3】ＨＱ－２１およびＨＱ－２２の実行に関する例示的な親和性溶出クロマトグラムを描写する。

【図4】ＨＱ－２１およびＨＱ－２２ ＡＥＸ溶出プロファイルの例示的な対照比較を描写する。

【図5】ＨＱ－２４およびＨＱ－２５ ＡＥＸ溶出プロファイルの例示的な対照比較を描写する。ＨＱ－２４親和性溶出緩衝液は、３０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ３．０であった。ＨＱ－２５親和性溶出緩衝液は、１５０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ３．０であった。

【図6】３ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間で操作された１５ｃｍの床高のＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム上での１２回の精製サイクルにわたる例示的な最大デルタカラム圧力を描写する。

【図7】３ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間で操作された１５ｃｍの床高のＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム上での１２回の精製サイクルにわたる例示的なデルタカラム圧力を描写する。

【図8】直列ＥＡＶガードフィルターを用いて操作されたＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム上での６回の精製サイクルにわたる例示的なカラム圧力を描写する。

【図9】２．７Ｌのカラム上での例示的な親和性溶出クロマトグラムを描写する。

【図10】１７．６Ｌのカラム上での例示的な親和性溶出クロマトグラムを描写する。

【発明を実施するための形態】

【0363】

Ｉ．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけを説明するためのものであり、本発明の限定を意図するものではない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に指摘しない限り、複数形を同様に含むことが意図される。以下の用語は、与えられる意味を有する。

【0364】

本明細書で使用される場合、用語「Ａ２６０／Ａ２８０」または「Ａ２６０／Ａ２８０比」とは、２６０ｎｍで測定された吸光度と、２８０ｎｍで測定された吸光度との比を指す。ｒＡＡＶカプシドを含む溶液のＡ２６０／Ａ２８０比は、溶液中に存在するパッケージングされたＤＮＡを含むカプシド（すなわち、全カプシドおよび中間カプシド）およびパッケージングされたＤＮＡを含まないカプシド（すなわち、空カプシド）の相対量の見積もりを提供する。例えば、その値が高いほど、親和性溶出液などの、溶液中に存在する全カプシドおよび中間カプシドのパーセンテージが大きくなる。溶液間のＡ２６０／Ａ２８０比の比較により、カプシド種の相対的見積もりが可能になり、したがって、より高いＡ２６０／Ａ２８０を有する溶液は、より低いＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶液よりも大きいパーセンテージの全カプシドおよび中間カプシドを有する。本明細書で使用される場合、０．７より大きいＡ２６０／Ａ２８０比を有する親和性溶出液は、医薬品としての使用にとって好適なｒＡＡＶベクター組成物を生産するためのさらなる精製プロセス（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）における使用にとって許容可能であると考えられる。一部の実施形態では、吸光度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム中の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定され、吸光度の測定は、１つまたは複数の波長（例えば、２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍ）であってもよい。

【0365】

本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。一部の実施形態では、用語「約」を、数が測定する時の誤差の標準偏差を有する程度で本明細書に記載される任意の数に付加することができる。

【0366】

本明細書で使用される場合、用語「親和性ｖｇ回収率％」とは、固定相上にロードされたロード溶液（例えば、清澄化された溶解物）中に存在するｖｇの総量のパーセンテージとしての、親和性溶出液中に存在するベクターゲノム（ｖｇ）の量を指す。例えば、親和性ｖｇ回収率％＝（（親和性溶出液中のｖｇの量／ロード溶液中のｖｇの量）^＊１００）。親和性溶出液は、親和性クロマトグラフィー溶出ステップからの全アウトプットを表す、親和性プールと称することができる。ｖｇの量を、限定されるものではないが、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、当業界で公知の任意の方法によって測定することができる。ｖｇ中に存在する任意の核酸配列、例えば、ＩＴＲ配列または導入遺伝子配列を検出および定量することによって、ＱＰＣＲを使用してｖｇを測定することができる。

【0367】

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」とは、線状一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスおよびそのバリアントを指す。この用語は、別途要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、および天然に存在する形態と組換え形態との両方を包含する。

【0368】

カノニカルなＡＡＶ野生型ゲノムは、４６８１塩基を含み（Ｂｅｒｎｓら（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２４３～３０７）、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのためのパッケージングシグナルとしてｃｉｓに機能するそれぞれの末端に末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））を含む。ゲノムは、それぞれ、ＡＡＶ複製（「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」）およびカプシド（「ＡＡＶ ｃａｐ」または「ｃａｐ」）遺伝子として知られる、２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と本明細書で称することもできる。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。

【0369】

野生型ＡＡＶでは、３つのカプシド遺伝子ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が単一のオープンリーディングフレーム内で互いに重複し、選択的スプライシングがＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質の産生をもたらす（Ｇｒｉｅｇｅｒら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３～９９４４）。単一のＰ４０プロモーターは、それぞれ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３について約１：１：１０の比で３つ全てのカプシドタンパク質を発現させ、ＡＡＶカプシドの産生を補完することができる。より具体的には、ＶＰ１は全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３はＮ末端のトランケーションの増加に起因して次第に短縮される。周知の例は、米国特許第７，９０６，１１１合に記載されたＡＡＶ９のカプシドであり、ＶＰ１は配列番号１２３のアミノ酸残基１～７３６を含み、ＶＰ２は配列番号１２３のアミノ酸残基１３８～７３６を含み、ＶＰ３は配列番号１２３のアミノ酸残基２０３～７３６を含む。本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ Ｃａｐ」または「ｃａｐ」とは、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３、ならびにそのバリアントおよびアナログを指す。カプシド遺伝子の第２のオープンリーディングフレームは、カプシドアセンブリープロセスにとって必須である、アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）と呼ばれるアセンブリー因子をコードする（Ｓｏｎｎｔａｇら（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（２３）：１２６８６～１２６９７）。

【0370】

少なくとも４種のウイルスタンパク質が、その見かけの分子量に従って命名される、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子－Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０から合成される。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」は、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０、ならびにそのバリアントおよびアナログを意味する。本明細書で使用される場合、ｒｅｐおよびｃａｐは、野生型と組換え（例えば、改変キメラなど）の両方のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにそれらがコードするポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ｒｅｐをコードする核酸は、１より多いＡＡＶ血清型に由来するヌクレオチドを含むであろう。例えば、ｒｅｐタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶ２血清型に由来するヌクレオチドおよびＡＡＶ３血清型に由来するヌクレオチドを含んでもよい（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１）。

【0371】

本明細書で使用される場合、用語「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」、「ｒＡＡＶ」および／または「ｒＡＡＶベクター」とは、別途具体的に指摘しない限り、ベクターゲノムを含むＡＡＶカプシドを指す。ベクターゲノムは、少なくとも部分的に、天然に存在するＡＡＶに由来しないポリヌクレオチド配列（例えば、野生型ＡＡＶ中に存在しない異種ポリヌクレオチド）を含み、野生型ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子は、ベクターゲノムから除去されている。ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が除去されている（および／またはＡＡＶに由来するＩＴＲが付加されているか、もしくは残っている）場合、ＡＡＶ内の核酸は「ベクターゲノム」と称される。したがって、用語ｒＡＡＶベクターは、カプシドを含むが、完全なＡＡＶゲノムを含まない両方のｒＡＡＶウイルス粒子を包含する；その代わりに、組換えウイルス粒子は、異種の、すなわち、カプシド中に元々存在しない、核酸を含んでもよく、以後、ベクターゲノムと称される。かくして、「ｒＡＡＶベクターゲノム」（または「ベクターゲノム」）とは、ＡＡＶカプシド内に含有されてもよいが、必ずしもそうである必要はない、異種ポリヌクレオチド配列（少なくとも１つのＩＴＲを含む）を指す。ｒＡＡＶベクターゲノムは、二本鎖（ｄｓＡＡＶ）、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）であってもよい。典型的には、ベクターゲノムは、治療的導入遺伝子、遺伝子編集核酸などをコードすることが多い異種（それが誘導される元のＡＡＶに対して）の核酸を含む。

【0372】

本明細書で使用される場合、用語「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」および／または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、別途具体的に指摘しない限り、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（しかし、典型的には、ＡＡＶの全てのカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、またはそのバリアントが存在する）を含み、異種核酸配列を含むベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシドを指す。これらの用語は、カプシドがｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするウイルスゲノムを含有し、ＡＡＶウイルスが、アデノウイルスおよび／もしくは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス、ならびに／またはそれに由来する必要なヘルパー遺伝子も含む細胞中に存在する場合に複製することができる、組換えではない「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルス」とは区別されるべきである。かくして、ｒＡＡＶベクター粒子の産生は、組換えＤＮＡ技術を使用する組換えベクターゲノムの産生を必ず含み、そのため、ベクターゲノムはカプシド内に含有され、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルス粒子、またはｒＡＡＶベクター粒子を形成する。一部の実施形態では、親和性溶出液などの、組成物または溶液中のウイルス粒子を定量し、ウイルス粒子力価（例えば、ｖｐ／ｍＬ）として表すことができる。一部の実施形態では、組成物または溶液のウイルス粒子力価は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。

【0373】

ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、ならびに逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列が当業界で公知である。そのような配列を、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベース中に見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、ＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）、ＡＹ６３１９６５（ＡＡＶ１０）、ＡＹ６３１９６６（ＡＡＶ１１）、およびＤＱ８１３６４７（ＡＡＶ１２）を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３；国際特許出願公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１４／１９４１３２、ＷＯ２０１５／１２１５０１；ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および第７，９０６，１１１号も参照されたい。

【0374】

本明細書で使用される場合、用語「ＡＥＸのｖｇ回収率％」とは、ロード溶液（例えば、親和性溶出液または希釈した親和性溶出液）中に存在するｖｇの総量のパーセンテージとしてのＡＥＸカラムから収集された溶出液中に存在するｖｇの量を指す。例えば、ＡＥＸのｖｇ回収率％＝（（ＡＥＸの溶出液中のｖｇの量／ロード溶液中のｖｇの量）^＊１００）。ＡＥＸの溶出液は、ＡＥＸ溶出ステップからのアウトプットの一部を表す、ＡＥＸプールと称することができる。ｖｇの量を、限定されるものではないが、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、当業界で公知の任意の方法によって測定することができる。ｖｇ中に存在する任意の核酸配列、例えば、ＩＴＲ配列または導入遺伝子配列を検出および定量することによって、ＱＰＣＲを使用してｖｇを測定することができる。

【0375】

本明細書で使用される場合、用語「および／または」とは、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。

【0376】

本明細書で使用される場合、用語「陰イオン交換クロマトグラフィー」または「ＡＥＸ」とは、物質の電荷の差に基づいて物質（例えば、ＡＡＶカプシド、ＤＮＡ、タンパク質、高分子量種、アミノ酸）を分離するために正に荷電した固定相（例えば、樹脂）を用いるクロマトグラフィープロセスを指す。ＡＥＸは、適度に酸性からアルカリ性のｐＨ（例えば、ｐＨ６よりも高い）での電荷の差に基づいて不純物からｒＡＡＶカプシドを分離するのに有用である。ＡＥＸは、空カプシドと全カプシドとの電荷の差に依拠することによって、完全な、または本質的に完全なベクターゲノム（すなわち、全カプシド）を含有するｒＡＡＶベクターから空カプシドを分離することもできる。

【0377】

理論によって束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶカプシドと、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相との間の結合の堅固さは、カプシド内の任意の核酸、溶液のｐＨおよび溶液の導電率からの電荷の寄与を含む、カプシドの負電荷の強度と関連する（Ｑｕ，Ｇ．ら（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０：１８３～１９２）。一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、樹脂（例えば、共有結合により四級化されたポリエチレンイミン、および任意選択により、ＯＨ基で改変されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子（例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂））である。

【0378】

本明細書で使用される場合、用語「と関連する」とは、一方の存在、レベルおよび／または形態が他方のそれと相関する場合、互いに関してを指す。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物、微生物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が、特定の疾患、障害、または状態の発生および／またはそれに対する感受性と相関する場合（例えば、関連集団にわたる）、その疾患、障害、または状態と関連すると考えられる。一部の実施形態では、２つ以上の実体が直接的または間接的に相互作用して、互いに物理的に近くにある、および／または依然として近くにある場合、それらは互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有的に連結されている；一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有的に連結されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびその組合せによって、非共有的に関連している。

【0379】

本明細書で使用される場合、用語「清澄化された溶解物」および「細胞溶解物からの上清」とは、宿主細胞培養物からの宿主細胞の溶解および清澄化後に収集される溶液を指す。限定されるものではないが、沈降化、遠心分離、軟凝集、深層濾過、帯電深層濾過および珪藻土媒体を含有するフィルターを使用する濾過を含む、当業界で公知の任意の方法によって、溶解物を清澄化することができる。

【0380】

本明細書で使用される場合、用語「定置洗浄」または「ＣＩＰ」とは、固定相を溶液と接触させて、ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡおよび他の宿主細胞材料などの不純物を除去するステップ、フェーズまたはプロセスを指す。一部の実施形態では、定置洗浄ステップは、固定相を浄化するのにも役立ち得る。定置洗浄ステップを、クロマトグラフィー実行の経過にわたって２回以上、固定相に対して実施することができる。

【0381】

本明細書で使用される場合、用語「コード配列」または「コードする核酸」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を指し、適切な調節配列の制御下に置いた（それに作動可能に連結された）場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される配列を意味する。コード配列の境界は一般に、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定されるものではないが、原核または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核または真核生物のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびさらに、合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。

【0382】

本明細書で使用される場合、用語「キメラ」とは、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚらの米国特許第６，４９１，９０７号に記載された、異なるパルボウイルス、好ましくは、異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドまたは粒子の配列を含む、ウイルスカプシドまたは粒子を指す。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（９）：４４２１～４４３２も参照されたい。一部の実施形態では、キメラウイルスカプシドは、以下の突然変異：２６３のＱ→Ａ；２６５のＴの挿入；７０５のＮ→Ａ；７０８のＶ→Ａ；および７１６のＴ→Ｎを有するＡＡＶ２カプシドの配列を有するＡＡＶ２．５カプシドである。そのようなカプシドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載された配列番号１５として定義されている。他の好ましいキメラＡＡＶカプシドとしては、限定されるものではないが、ＷＯ２０１０／０９３７８４に記載されたＡＡＶ２ｉ８、ＷＯ２０１４／１４４２２９に記載されたＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ８Ｇ９、ならびにＡＡＶ９．４５（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０～１０７８）、ＷＯ２０１３／０２９０３０に記載されたＡＡＶ－ＮＰ４、ＮＰ２２およびＮＰ６６、ＡＡＶ－ＬＫ０～ＡＡＶ－ＬＫ０１９、ＷＯ２０１５／０１３３１３に記載されたＲＨＭ４－１およびＲＨＭ１５＿１～ＲＨＭ５＿６、ＷＯ２００７／１２０５４２に記載されたＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９が挙げられる。

【0383】

本明細書で使用される場合、用語「クロマトグラフィー固定相」または「固定相」は、ある生成物の別の物質（例えば、不純物）からの分離のために使用することができる任意の物質を指すために使用される。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、樹脂、媒体、膜、膜吸着剤、繊維、またはモノリスである。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、ある特定の条件下でＡＡＶカプシドに結合する媒体である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、親和性クロマトグラフィー樹脂である。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相は、ラクダ科由来単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ_ＨＨ）リガンドで改変された５０μｍの多孔性ポリスチレンジビニルベンゼンビーズを含み、樹脂１ｍＬあたり１．０ｘ１０^１４ｖｇの動的結合容量を有する樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９親和性樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ親和性樹脂）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、イオン交換媒体（例えば、陰イオン交換媒体（ＡＥＸ）、陽イオン交換媒体）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、ＡＥＸクロマトグラフィー樹脂である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱである。一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、共有結合した四級化されたポリエチレンイミン、および任意選択により、ＯＨ基で改変されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂）である。

【0384】

本明細書で使用される場合、用語「溶出液」とは、移動相および固定相を通過した、または固定相から移動した材料を含む、クロマトグラフィー固定相（例えば、モノリス、膜、樹脂、繊維、媒体）から出る（例えば、「固定相から溶出する」）流体を指す。一部の実施形態では、固定相は、例えば、モノリス、膜、樹脂、繊維または媒体を含む。移動相は、カラム上にロードされ、カラムを通って流れた溶液（すなわち、「フロースルー画分」または「未結合画分」と称される）、平衡化溶液（例えば、平衡化緩衝液）、イソクラチック溶出溶液、勾配溶出溶液、固定相の再生のための溶液、固定相の浄化のための溶液、洗浄のための溶液、およびそれらの組合せであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「親和性溶出液」または「親和性プール」とは、親和性クロマトグラフィー固定相および／または親和性クロマトグラフィーカラムからの溶出液を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＡＥＸ溶出液」または「ＡＥＸプール」とは、ＡＥＸ固定相および／またはＡＥＸカラムからの溶出液を指す。

【0385】

本明細書で使用される場合、用語「平衡化」とは、平衡化緩衝液が固定相に適用されるクロマトグラフィープロセスのステップを指す。平衡化緩衝液は、標的分子（例えば、ＡＡＶカプシド）は固定相リガンドと効率的に相互作用し、リガンドによる結合を受けるが、不純物などの他の分子は固定相を通って流れるか、またはその周囲を流れるような、特定の条件（例えば、ｐＨ、導電率）がカラム内に存在することを確保する。フロースルーは、ロードステップの間に、および／またはその後の洗浄ステップの間に起こってもよい。

【0386】

本明細書で使用される場合、用語「挟まれた」とは、他のエレメントによって挟まれた配列を指し、その配列に対して、上流および／または下流の、すなわち、５’および／または３’の１つまたは複数の挟んでいるエレメントの存在を示す。用語「挟まれた」は、配列が必ずしも連続的であることを示すことを意図しない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と、挟んでいるエレメントとの間に介在配列が存在してもよい。２つの他のエレメント（例えば、ＩＴＲ）によって「挟まれた」配列（例えば、導入遺伝子）は、一方のエレメントが配列に対して５’に位置し、他方が配列に対して３’に位置することを示すが、その間に介在配列が存在してもよい。

【0387】

本明細書で使用される場合、用語「軟凝集」とは、微粒子を一緒に凝集させてフロックを形成させるプロセスを指す。微粒子は、タンパク質、核酸、リポタンパク質、宿主細胞の溶解から得られる細胞断片を含んでもよい。一部の実施形態では、液相中で形成するフロックは、液体の頂部に浮く（クリーミング）、液体の底部に沈降する（沈降化）か、または液相から濾過され得る。

【0388】

本明細書で使用される場合、用語「断片」とは、全体の別々の一部分を含むが、全体に見出される１つまたは複数の部分を欠く構造を有する材料または実体を指す。一部の実施形態では、断片は、別々の一部分からなる。一部の実施形態では、断片は、全体に見出される特徴的な構造エレメントまたは部分からなるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、ポリマー断片は、全体ポリマー中に見出される少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個以上の単量体単位（例えば、アミノ酸残基、ヌクレオチド）を含むか、またはそれからなる。

【0389】

ｒＡＡＶベクターは、カプシドが、導入遺伝子を含む完全なベクターゲノムを含有する場合、「全」、「全カプシド」、「全ベクター」、または「完全にパッケージングされたベクター」と称される。宿主細胞によるｒＡＡＶベクターの産生の間に、全カプシドよりも少ない核酸がパッケージングされ、例えば、部分的な、またはトランケートされたベクターゲノムを含有するベクターが産生され得る。これらのベクターは、「中間体」、「中間カプシド」、「部分的」または「部分的にパッケージングされたベクター」と称される。中間カプシドは、分析的超遠心分離によって分析した場合、全カプシドと空カプシドの沈降速度の間の沈降速度である中間の沈降速度を有するカプシドであってもよい。宿主細胞は、いかなる検出可能な核酸材料も含有しないウイルスカプシドを産生することもできる。これらのカプシドは、「空」または「空カプシド」と称される。Ａ２６０／Ａ２８０比を分析的超遠心分離によって分析されたカプシド（すなわち、全、中間および空）に対して予め較正したＳＥＣ－ＨＰＬＣによって決定されたＡ２６０／Ａ２８０比に基づいて、全カプシドを空カプシドと区別することができる。カプシドの特性評価のための当業界で公知の他の方法としては、ＣｒｙｏＴＥＭ、キャピラリー等電点電気泳動および電荷検出質量分析が挙げられる。それぞれ、空および全ＡＡＶ９カプシドに関する約６．２および約５．８の算出された等電点が報告されている（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７．９：４９７４～４９８４）。

【0390】

本明細書で使用される場合、用語「ヌルカプシド」とは、ベクターゲノムを欠くように意図的に生産されたカプシドを指す。そのようなヌルカプシドは、ベクタープラスミドとしても知られる、導入遺伝子カセット配列を含むプラスミドではなく、ｒｅｐ／ｃａｐおよびヘルパープラスミドを用いた宿主細胞のトランスフェクションによって生産することができる。

【0391】

本明細書で使用される場合、用語「機能性」とは、それが特徴付けられる特性および／または活性を示す形態にある生体分子を指す。生体分子は、２つの機能（すなわち、二機能性）または多くの機能（すなわち、多機能性）を有してもよい。

【0392】

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、転写および翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、外来ＤＮＡを宿主細胞中に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。そのような方法は、非組込み型の導入されたＤＮＡの一過的発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、ならびに／または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入された遺伝物質の組込みをもたらすことができる。

【0393】

本明細書で使用される場合、用語「異種」とは、細胞中への核酸のベクター媒介性移入／送達のためのベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）中に挿入された核酸を指す。異種核酸は、典型的には、ベクター（例えば、ＡＡＶ）核酸とは異なる、すなわち、異種核酸は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）核酸に関して非天然である。細胞中に移入または送達されたら、ベクター内に含まれる異種核酸を発現（例えば、適切な場合、転写および翻訳）させることができる。あるいは、ベクター内に含まれる、細胞中の移入または送達された異種核酸は、発現される必要はない。用語「異種」は、核酸を参照して本明細書で常に使用されるものではないが、修飾語句「異種」が存在しない場合であっても、核酸に対する参照は、異種核酸を含むことが意図される。例えば、異種核酸は、ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸、またはその断片、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置における使用のための、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／２２１１４５に記載されたコドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子であろう。

【0394】

さらなる例示的な異種核酸は、以下の遺伝子のうちの１つの野生型コード配列、またはその断片（例えば、トランケートされた、内部欠失）を含み、コドン最適化されていても、されていなくてもよい。

【0395】

【表1】

【0396】

本明細書で使用される場合、用語「相同な」または「相同性」とは、所与の領域または一部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有する２つ以上の参照実体（例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列）を指す。例えば、２つのペプチドにおけるアミノ酸位置が同一のアミノ酸によって占有されている場合、それらのペプチドはその位置で相同である。とりわけ、相同ペプチドは、非改変または参照ペプチドと関連する活性または機能を保持し、改変ペプチドは一般に、非改変配列のアミノ酸配列と「実質的に相同な」アミノ酸配列を有するであろう。ポリペプチド、核酸またはその断片を言う場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、別のポリペプチド、核酸（もしくはその相補鎖）またはその断片と、適切な挿入または欠失と共に最適に整列させた場合、配列の少なくとも約９５％～９９％において配列同一性が存在することを意味する。２つの配列の間の相同性（同一性）の程度を、コンピュータープログラムまたは数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。配列相同性（または同一性）パーセントを算出するそのようなアルゴリズムは一般に、比較領域またはエリアにわたって配列のギャップおよびミスマッチを説明する。例示的なプログラムおよびアルゴリズムは、以下に提供される。

【0397】

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代のトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞、継代の回数に関係なく、それから誘導された子孫を含む、「トランスフェクタント」、「形質転換体」、「形質転換細胞」、および「形質導入細胞」を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターの生産のためのパッケージング細胞である。

【0398】

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞ＤＮＡ」または「ＨＣＤＮＡ」とは、ｒＡＡＶベクターを産生した宿主細胞培養物に由来し、クロマトグラフィー画分（例えば、親和性溶出液、ＡＥＸ溶出液、洗浄）またはクロマトグラフィーロード（例えば、親和性ロード、ＡＥＸロード）中に存在する残留ＤＮＡを指す。宿主細胞ＤＮＡを、宿主細胞にとってユニークな配列を検出するためのｑＰＣＲなどの当業界で公知の方法によって測定することができる。一般的なＤＮＡ濃度を、蛍光色素（例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）もしくはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）、吸光度測定（例えば、２６０ｎｍ、もしくは２５４ｎｍでの）または電気泳動技術（例えば、アガロースゲル電気泳動、もしくはキャピラリー電気泳動）を使用して見積もることができる。溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量を、溶出液中に存在するｖｇの量に対して、例えば、ｎｇ ＨＣＤＮＡ／１ｘ１０^１４ｖｇまたはｐｇ ＨＣＤＮＡ／１ｘ１０^９ｖｇで表すことができる。溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量を、ある体積の溶出液中に存在するｖｇの量に対して、例えば、溶出液１ｍＬあたりのｐｇ ＨＣＤＮＡで表すことができる。

【0399】

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞タンパク質」または「ＨＣＰ」とは、ｒＡＡＶベクターを産生した宿主細胞培養物に由来し、クロマトグラフィー画分（例えば、親和性溶出液、ＡＥＸ溶出液、洗浄）またはクロマトグラフィーロード（例えば、親和性ロード、ＡＥＸロード）中に存在する残留タンパク質を指す。宿主細胞タンパク質を、ＥＬＩＳＡなどの、当業界で公知の方法によって測定することができる。宿主細胞タンパク質を、種々の電気泳動染色法（例えば、銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および／またはウェスタンブロット）によって半定量的に測定することができる。溶出液中に存在するＨＣＰの量を、存在するｖｇの量に対して、例えば、ｎｇ ＨＣＰ／１ｘ１０１４ｖｇまたはｐｇ ＨＣＰ／１ｘ１０^９ｖｇで表すことができる。

【0400】

本明細書で使用される場合、用語「同一性」または「と同一」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的関係性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上同一である場合、互いに「実質的に同一」であると考えられる。

【0401】

２つの核酸またはポリペプチド配列の同一性パーセントの算出を、例えば、最適な比較目的で２つの配列を整列させることによって実施することができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の配列の一方または両方にギャップを導入し、非同一の配列を比較目的で無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占有される場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0402】

同一性パーセント、または相同性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてワールドワイドウェブ上で利用可能な、ＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用して、配列を整列させることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡからの、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて利用可能な、ＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。特に興味深いものは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中のギャップを許容する１つの型のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３～１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０）を参照されたい。

【0403】

また興味深いものは、配列同一性を決定するためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９）の部分相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティは、一般に、１～５、通常は２～４の範囲、一部の実施形態では３であろう。ギャップ伸長ペナルティは、一般に、約０．０１～０．２０の範囲、一部の例では０．１０であろう。プログラムは、比較するために入力される配列によって決定されるデフォルトパラメーターを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメーターを使用して決定される。このプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡからのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。

【0404】

興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７～１４９頁、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。配列同一性パーセントは、以下のパラメーター：ミスマッチペナルティ：１．００；ギャップペナルティ：１．００；ギャップサイズペナルティ：０．３３；および結合ペナルティ：３０．０に基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される。

【0405】

本明細書で使用される場合、用語「不純物」とは、精製されるｒＡＡＶベクターを含む溶液中にも存在する、精製されるｒＡＡＶベクター以外の任意の分子を指す。不純物は、空カプシド、中間カプシド、生体高分子、例えば、ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）、ＲＮＡ、非ＡＡＶタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）、ＡＡＶ凝集体、損傷したＡＡＶカプシド、精製ステップの間／前に試料中に浸出し得るクロマトグラフィーのために使用される吸着剤の一部である分子、内毒素、培地成分を含む、細胞培養物に由来する細胞デブリおよび化学物質、トランスフェクションに由来するプラスミドＤＮＡ、偶発的な因子、細菌およびウイルスを含む。

【0406】

本明細書で使用される場合、用語「感染性比」または「ＩＲ」とは、細胞に感染するのに必要とされるｒＡＡＶベクター粒子の数を指す。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系である。一部の実施形態では、細胞は、ｒＡＡＶベクターを用いた処置を必要とする対象の中の細胞、またはそれから採取された細胞である。感染性比は、細胞に基づくｑＰＣＲアッセイを含む、当業界で公知の任意の方法によって測定することができる。感染性を、体積あたりの感染性単位（ＩＵ）、ＩＵ／ｍＬとして、または存在するｖｇの量に対して、ＩＵ／ｖｇで表すことができる。

【0407】

本明細書で使用される場合、用語「逆方向末端反復」、「ＩＴＲ」、「末端反復」、および「ＴＲ」とは、多くは相補的な、対称的に配置された配列を含む、ＡＡＶウイルスゲノムの末端にあるか、またはその近くにあるパリンドローム末端反復配列を指す。これらのＩＴＲは、折り重なって、ＤＮＡ複製の開始の間のプライマーとして機能するＴ型ヘアピン構造を形成することができる。それらはまた、宿主ゲノム中へのウイルスゲノムの組込み、宿主ゲノムからのレスキュー、および成熟ビリオンへのウイルス核酸の封入にとって必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノムの複製およびウイルス粒子中へのそのパッケージングにとってｃｉｓに必要とされる。「５’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの５’末端および／または組換え導入遺伝子の５’のＩＴＲを指す。「３’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの３’末端および／または組換え導入遺伝子の３’のＩＴＲを指す。野生型ＩＴＲは、約１４５ｂｐの長さである。改変型、または組換えＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の断片または一部分を含んでもよい。当業者であれば、ＤＮＡ複製の連続ラウンドの間に、ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲが３’ＩＴＲになる、およびその逆になるように交換し得ることを理解するであろう。一部の実施形態では、ベクターゲノムをカプシド中にパッケージングして、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター（本明細書では「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」）を産生することができるように、少なくとも１つのＩＴＲが組換えベクターゲノムの５’および／または３’末端に存在する。

【0408】

本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、１）人の手によって設計、生産、調製、および／もしくは製造される、ならびに／または２）最初に生産された時に（自然にあるにしろ、および／または実験設定にあるにしろ）、それが結合していた少なくとも１つの成分から分離される物質または組成物を指す。一般に、単離された組成物は、それらが通常は自然に結合する１つまたは複数の材料、例えば、１つまたは複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物および／または細胞膜を実質的に含まない。用語「単離された」は、人工の組合せ、例えば、組換え核酸、組換えベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）、例えば、ベクターゲノムをパッケージングする、例えば、封入するｒＡＡＶベクター粒子（例えば、限定されるものではないが、ＡＡＶ９カプシドを含むｒＡＡＶベクター粒子など）および医薬製剤を排除しない。用語「単離された」はまた、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）、バリアントもしくは誘導体化形態、または人工である宿主細胞中で発現される形態などの、組成物の代替的な物理的形態を排除しない。

【0409】

単離された物質または組成物を、約１０％、約２０％、約３０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の、または約９９％を超える、それらが最初に結合していた他の成分から分離することができる。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、ある物質が他の成分を実質的に含まない場合、それは「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解できるように、例えば、１つまたは複数の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などのある特定の他の成分と組み合わせた後に、ある物質は「単離された」またはさらには「純粋」であると依然として考えることができる；そのような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントは、そのような担体または賦形剤を含むことなく算出される。

【0410】

本明細書で使用される場合、用語「直線流動速度」または「流動速度」とは、溶液が、体積流量およびカラム半径の関数としてカラム中で固定相を通って流れる速度を指し、式：ｕ＝Ｆ／（π^＊ｒ^２）（式中、ｕ＝直線流量（ｃｍ／ｈ）であり、Ｆ＝体積流量（ｍＬ／ｈ）であり、ｒ＝カラム半径（ｃｍ）である）によって表される。直線流動速度は、時間あたりの距離、例えば、ｃｍ／ｈとして表すことができる。

【0411】

本明細書で使用される場合、用語「ロード」または「ロード溶液」とは、クロマトグラフィー固定相上にロードされる目的の生成物を含有する任意の材料（例えば、溶液）を指す。一部の実施形態では、目的の生成物は、ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、「ロード溶液」がクロマトグラフィー固定相に曝露された場合、ロード溶液の一部の成分は固定相に結合する。一部の実施形態では、ロード溶液がクロマトグラフィー固定相に曝露された場合、ロード溶液の一部の成分はクロマトグラフィー固定相に結合せず、「未結合画分」または「フロースルー」として移動相と共にカラムを通って流れる。一部の実施形態では、ロード溶液は、清澄化された溶解物である。

【0412】

本明細書で使用される場合、用語「ロードチェイス」とは、ロードまたはロード溶液（上で定義された）が適用された後にカラムに適用される溶液を指す。ロードチェイスは、ロードまたはロード溶液の固定相への完全な適用に役立ち、カラムから未結合の材料を除去するのに役立つ。

【0413】

本明細書で使用される場合、用語「モディファイアー」または「移動相モディファイアー」は、クロマトグラフィーを変更するために移動相を改変する移動相の成分である。クロマトグラフィーのそのような変更は、例えば、固定相からの不純物の除去、もしくは洗浄除去、または固定相からの目的の生成物もしくは物質の溶出をもたらす。「モディファイアー」の例としては、塩、緩衝剤、界面活性剤、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、グリシン）、有機溶媒（例えば、エタノール、エチレングリコール）、カオトロピック剤（例えば、尿素）、または置換剤（選択的溶出剤とも称される）が挙げられる。

【0414】

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合によって接続された単量体ヌクレオチドから構成されるか、またはそれを含む任意の分子を互換的に指す。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってもよい。核酸配列は、５’から３’の向きに本明細書で提示される。本開示の核酸配列（すなわち、ポリヌクレオチド）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であってよく、二本鎖分子、一本鎖分子、小または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、小または短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡなどのあらゆる形態の核酸を指す。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子または前記分子のいずれかの断片であってもよい。ヌクレオチドは、一文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）によって本明細書で示される。ヌクレオチド配列は、化学的に改変されているか、または人工であってもよい。ヌクレオチド配列は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。これらの配列はそれぞれ、分子の骨格に対する変化によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドを使用してもよい。他のデオキシヌクレオチドアナログとしては、本開示のヌクレオチド配列において使用することができる、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホラミデート、ならびにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートおよびその２’－Ｏ－アリルアナログならびに２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。

【0415】

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド構築物」とは、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる天然に存在しない核酸分子（例えば、組換え核酸）を指す。核酸構築物は、自然に見出されない様式で組み合わせ、配置される、核酸配列のセグメントを含有するように改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。核酸構築物は、外因的に作出されたＤＮＡを宿主細胞中に送達するように設計された核酸分子である、「ベクター」（例えば、プラスミド、ｒＡＡＶベクターゲノム、発現ベクターなど）であってもよい。

【0416】

本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係での核酸配列（またはポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターまたは他の転写調節配列（例えば、エンハンサー）は、それがコード配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、連結される核酸配列は連続的であることを意味する。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、核酸配列が連続的に連結されていることを意味せず、むしろ、介在配列が、連結されるこれらの核酸配列の間にある。

【0417】

本明細書で使用される場合、用語「純度パーセント」、「純度％」または「カプシド純度％」とは、全カプシド、空カプシドおよび中間カプシドを含む溶液の純度を指す。純度パーセントは、非還元条件の逆相ＨＰＬＣ(ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲ）を含む、当業界で公知の方法によって決定される。溶液中に存在するカプシドに起因し得る、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによって生成されたクロマトグラム吸光度曲線下面積は、吸光度曲線下総面積のパーセンテージとして表される。純度パーセントを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはキャピラリー電気泳動によって測定することもできる。

【0418】

本明細書で使用される場合、用語「ｖｇ収率パーセント」、「ｖｇ収率％」または「ｖｇ回収率％」とは、親和性カラム上にロードされた溶液（例えば、清澄化された溶解物）中に存在するＶＧの量のパーセンテージとしての親和性カラムから収集された溶出液（すなわち、親和性溶出液または親和性プール）中のＶＧの量を指す。例えば、ＶＧ収率％＝（（親和性溶出液中のＶＧの量）／（清澄化された溶解物中のＶＧの量））ｘ１００である。

【0419】

本明細書で使用される場合、用語「ＶＧステップ収率パーセント」または「ＶＧステップ収率％」とは、希釈または濾過の前に親和性プール（本明細書では親和性溶出液とも称される）中に存在するＶＧの量のパーセンテージとしての、ＡＥＸカラムから収集されたプールされた溶出液（すなわち、ＡＥＸプール）中のＶＧの量を指す。例えば、ＶＧステップ収率＝（（ＡＥＸプール中のＶＧの量）／（親和性プール中のＶＧの量））Ｘ１００である。

【0420】

本明細書で使用される場合、用語「溶出前洗浄」とは、ロード溶液が固定相に適用された後に、移動相中に存在する不純物、固定相に非特異的に結合した、および／またはｒＡＡＶカプシドに結合した不純物を除去するのに役立つクロマトグラフィープロセスのステップを指す。固定相に非特異的に結合する不純物は、樹脂材料および／またはリガンドに結合してもよい。例えば、クロマトグラフィープロセスによってｒＡＡＶベクターを精製する場合、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードした後に、溶出前洗浄溶液を固定相に適用して、固定相（例えば、リガンドを介する）とｒＡＡＶベクターとの相互作用を維持しながら、移動相中に存在する不純物（例えば、ＨＣＤＮＡ、ＨＣＰ）ならびに固定相もしくはｒＡＡＶカプシドに非特異的に結合した不純物を除去する。

【0421】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」とは、１つまたは複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達または接触にとって好適である、生物学的に許容される製剤、気体、液体もしくは固体、またはそれらの混合物を指す。

【0422】

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」または「核酸配列によってコードされる」（すなわち、ポリヌクレオチド配列によってコードされる、ヌクレオチド配列によってコードされる）とは、天然に存在するタンパク質と同様、全長天然配列、ならびにサブ配列、改変形態またはバリアントが天然全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、機能性サブ配列、改変形態または配列バリアントを指す。本開示の方法および使用において、核酸配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、必要とされるわけではないが、欠陥がある、またはその発現が不十分である、または遺伝子療法で処置した対象において欠損している内因性タンパク質と同一であってよい。

【0423】

本明細書で使用される場合、用語「組換え」とは、クローニング、制限もしくはライゲーションステップ（例えば、含まれるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに関連する）、および／または天然に見出される生成物とは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組合せの生成物である、ベクター、ポリヌクレオチド（例えば、組換え核酸）、ポリペプチドまたは細胞を指す。組換えウイルスまたはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、組換え核酸（例えば、導入遺伝子および１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸）を含むベクターゲノムを含む。これらの用語はそれぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。

【0424】

本明細書で使用される場合、用語「再生」とは、例えば、不純物の除去またはクロマトグラフィーステップ中に固定相に適用される化学物質の除去によって、固定相と、固定相をその元の状態に戻す溶液とを接触させるステップ、フェーズまたはプロセスを指す。一部の実施形態では、再生のステップは、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードするステップに先行する。一部の実施形態では、再生のステップを、クロマトグラフィー実行の経過にわたって２回以上、固定相に対して実施することができる。

【0425】

本明細書で使用される場合、用語「滞留時間」または「接触時間」とは、カラム内の溶液が固定相と接触する時間を指す。滞留時間は、カラム体積（ＣＶ）あたりの時間、例えば、分／ＣＶとして表すことができる。

【0426】

本明細書で使用される場合、用語「浄化」とは、固定相と、カラム内のバイオバーデンを減少させるのに役立つ溶液と接触させるステップ、フェーズまたはプロセスを指す。浄化ステップを、クロマトグラフィー実行の経過にわたって２回以上、固定相に対して実施することができる。

【0427】

本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、イヌ）を指す。一部の実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態、例えば、本明細書に提供されるように処置することができる疾患、障害または状態に罹患している。一部の実施形態では、対象は、欠損または機能障害ジストロフィンと関連する疾患、障害または状態、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の影響を受けやすい。一部の実施形態では、影響を受けやすい対象は、疾患、障害または状態を生じる素因がある、および／または生じる高いリスク（参照対象もしくは集団において観察される平均リスクと比較して）を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状を呈する。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床兆候）または特徴を呈しない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症状も特徴も呈しない。一部の実施形態では、対象は、ヒト患者である。一部の実施形態では、対象は、診断および／または療法が投与される、および／または投与された個体である（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための遺伝子療法）。一部の実施形態では、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有するヒト患者である。

【0428】

本明細書に記載の方法に従って精製されたｒＡＡＶベクターを使用して処置することができる疾患、障害および状態としては、例えば、代謝疾患もしくは障害（例えば、ファブリ病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症、糖原病）；尿素サイクル疾患もしくは障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）；リソソーム蓄積疾患もしくは障害（例えば、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症）；肝臓疾患もしくは障害（例えば、１～３型進行性家族性肝内胆汁鬱滞症）；血液疾患もしくは障害（Ａ型血友病、Ｂ型血友病、αサラセミア）；がん（例えば、癌腫、肉腫、血液がん）；遺伝子疾患もしくは障害（例えば、嚢胞性線維症）；または感染症（例えば、ＨＩＶ）が挙げられる。

【0429】

本明細書に記載の方法に従って精製されたｒＡＡＶベクターを使用して処置することができる疾患、障害および状態としては、例えば、２１－ヒドロキシラーゼ欠損性先天性副腎過形成症、１Ｂ型軟骨無形成、軟骨形成不全、色覚異常、酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症（ナイマン・ピック病Ａ型またはＢ型）、急性間欠性ポルフィリン症、アデノシンデアミナーゼ２欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（例えば、Ｘ連鎖重症複合免疫不全）、副腎白質ジストロフィー（例えば、Ｘ連鎖）、加齢黄斑変性（例えば、血管新生、ウェット型）、アラジール症候群、アルカプトン尿症、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アルファ－サラセミア、アルポート症候群、アルツハイマー病、アペール症候群、アルギナーゼ欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ１）欠損症（シトルリン血症１型）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、常染色体劣性先天性魚鱗癬、ベッカー型筋ジストロフィー、ベータ－サラセミア、カルバモイルホスファターゼシンテターゼＩ欠損症、セロイドリポフスチン症、シャルコー・マリー・ツースニューロパチー、先天性脈絡膜欠如、慢性肉芽腫症、シトリン欠損症、クリグラー・ナジャー症候群１型および２型、重症下肢虚血、嚢胞性線維症、シスチン症、ダノン病、糖尿病性黄斑網膜症、顕性遺伝性低身長症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ジスフェルリン異常症（例えば、三好型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ）、栄養障害性表皮水疱症、ファブリ病、家族性高コレステロール血症、家族性リポタンパクリパーゼ欠損症、ファンコニ貧血（例えば、ファンコニ貧血Ａ）、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、１Ａ型および１Ｂ型糖原病（フォン・ギールケ病）、ＩＩＩ型糖原病、ＩＶ型糖原病、Ｖ型糖原病、ＶＩ型糖原病、ＸＶ型糖原病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、脳回転状萎縮、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、Ｉ～ＩＩＩ型遺伝性血管性浮腫、ハンチントン病、封入体筋炎、接合部型表皮水疱症、歌舞伎症候群、レーバー先天性黒内障、１型白血球接着不全症、肢帯型筋ジストロフィー、２Ｃ型肢帯型筋ジストロフィー（ガンマ－サルコグリカン異常症）、２Ｄ型肢帯型筋ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、Ｉ型ムコ多糖症、ＩＩ型ムコ多糖症（ハンター症候群）、ＩＩＩＡ型ムコ多糖症、ＩＩＩＢ型ムコ多糖症、ＩＩＩＣ型ムコ多糖症、ＩＩＩＤ型ムコ多糖症、ＩＶＡ型ムコ多糖症（モルキオＡ症候群）、ＩＶＢ型ムコ多糖症（モルキオＢ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖症（マロトー・ラミー型）、Ｉ型筋強直性ジストロフィー、２型筋強直性ジストロフィー、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）欠損症、ネザートン症候群、神経セロイドリポフスチン症、オルニチントランスロカーゼ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポンペ病、１～３型進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、進行性筋原線維性ミオパチー、ピルビン酸キナーゼ欠損症、網膜色素変性、ＲＰＥ６５関連レーバー先天性黒内障、サンドホフ病、鎌状赤血球病、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群２、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、Ｘ連鎖性慢性肉芽腫症、Ｘ連鎖性ミオチュブラーミオパチー、Ｘ連鎖性網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症およびＸ連鎖重症複合免疫不全が挙げられる。

【0430】

本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全体の、または全体に近い程度または度合いの表出の定性的状態を指す。当業者であれば、生物学的および化学的現象が、仮にあるとしても、完了まで行く、および／または完全性まで進行するか、もしくは絶対的な結果を達成することは稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象に内在する完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

【0431】

本明細書で使用される場合、用語「治療的ポリペプチド」は、標的細胞（例えば、単離された細胞）または生物（例えば、対象）中のタンパク質の非存在または欠陥から生じる症状を軽減するか、または低減することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素、構造タンパク質、膜貫通タンパク質、輸送タンパク質）である。導入遺伝子によってコードされる治療的ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、遺伝的欠陥を補正するため、発現または機能と関連する遺伝子の欠損を補正するために、対象に対する利益を付与するものである。同様に、「治療的導入遺伝子」は、治療的ポリペプチドをコードする導入遺伝子である。一部の実施形態では、宿主細胞中で発現される治療的ポリペプチドは、導入遺伝子から発現される酵素（すなわち、宿主細胞中に導入された外因性核酸）である。一部の実施形態では、治療的ポリペプチドは、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞）中に形質導入された治療的導入遺伝子から発現されるジストロフィンタンパク質、またはその断片である。

【0432】

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、投与される量について所望の治療効果をもたらす量を指す。一部の実施形態では、この用語は、治療剤投薬レジメンに従って疾患、障害または状態に罹患している、またはその影響を受けやすい集団に投与した場合に、疾患、障害または状態を処置するのに十分な量を指す。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状の発生および／もしくは重症度を低減する、ならびに／またはその開始を遅延させるものである。当業者であれば、用語「治療有効量」が事実、特定の個体において達成される処置の成功を必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、そのような処置を必要とする患者に投与した場合に、有意な数の対象において特定の望ましい薬理学的応答をもたらすその量であってよい。

【0433】

本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、宿主細胞、標的細胞または生物（例えば、対象）への送達および／またはその中での発現のための任意の異種ポリヌクレオチドを意味するために使用される。そのような「導入遺伝子」を、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を使用して宿主細胞、標的細胞または生物に送達することができる。導入遺伝子を、プロモーターなどの制御配列に作動可能に連結することができる。当業者であれば、発現制御配列を、宿主細胞、標的細胞または生物中での導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択することができることを理解するであろう。一般に、導入遺伝子を、天然で導入遺伝子と結合した内因性プロモーターに作動可能に連結することができるが、より典型的には、導入遺伝子を、導入遺伝子が天然で結合していないプロモーターに作動可能に連結する。導入遺伝子の例は、治療的ポリペプチド、例えば、ジストロフィンポリペプチドまたはその断片をコードする核酸であり、例示的なプロモーターは、天然でジストロフィンをコードするヌクレオチドに作動可能に連結されていないものである。そのような非内因性プロモーターは、当業界で公知の多くの他のもののうち、ＣＢｈプロモーターまたは筋肉特異的プロモーターを含んでもよい。

【0434】

トランスフェクションおよび形質導入を含む、当業界で周知の様々な技術によって、目的の核酸を宿主細胞中に導入することができる。

【0435】

「トランスフェクション」は、ウイルスベクターを使用することなく、外因性核酸を細胞中に導入するための技術として一般に公知である。本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション」とは、ウイルスベクターを使用することなく、組換え核酸（例えば、発現プラスミド）の細胞（例えば、宿主細胞）中への移入を指す。組換え核酸が導入された細胞は、「トランスフェクト細胞」と称される。トランスフェクト細胞は、組換えＡＡＶベクターを生産するための発現プラスミド／ベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｐｒｏ１０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）であってもよい。一部の実施形態では、トランスフェクト細胞（例えば、パッケージング細胞）は、導入遺伝子（例えば、ジストロフィン導入遺伝子）を含むプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミドならびにヘルパー遺伝子を含むプラスミドを含んでもよい。多くのトランスフェクション技術が当業界で公知であり、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、陽イオンまたは陰イオンリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられる。

【0436】

本明細書で使用される場合、用語「形質導入」とは、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）による細胞（例えば、標的細胞、例えば、筋肉細胞）への核酸（例えば、ベクターゲノム）の移入を指す。一部の実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための遺伝子療法は、ジストロフィンをコードする改変された核酸、またはその断片を含むベクターゲノムを、筋肉細胞中に形質導入することを含む。導入遺伝子がウイルスまたはウイルスベクターによって導入された細胞は、「形質導入細胞」と称される。一部の実施形態では、形質導入細胞は、単離された細胞であり、形質導入はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、形質導入細胞は、生物（例えば、対象）内の細胞であり、形質導入はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。形質導入細胞は、生物の標的細胞がポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子、例えば、ジストロフィン、またはその断片をコードする改変された核酸）を発現するような、組換えＡＡＶベクターによって形質導入された生物の標的細胞であってもよい。

【0437】

形質導入することができる細胞は、任意の組織もしくは臓器型、または任意の起源（例えば、中胚葉、外胚葉もしくは内胚葉）の細胞を含む。細胞の非限定例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、膵島ベータ細胞、外分泌細胞）、肺、中枢または末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎、腎臓、眼（例えば、網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓細胞）、筋肉もしくは腰筋、または腸（例えば、内分泌細胞）、脂肪組織（白色、褐色またはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞または造血（例えば、血液もしくはリンパ）細胞が挙げられる。別の例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、膵島ベータ細胞、外分泌細胞）、肺、中枢または末梢神経系、例えば、脳（例えば、神経もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎、腎臓、眼（例えば、網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓細胞）、筋肉もしくは腰筋、または腸（例えば、内分泌細胞）、脂肪組織（白色、褐色またはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞または造血（例えば、血液もしくはリンパ）細胞に発生または分化する万能性または多能性前駆細胞などの、幹細胞が挙げられる。

【0438】

一部の実施形態では、組織または臓器（例えば、筋肉）の特定の領域を、組織または臓器に投与されるｒＡＡＶベクター（例えば、ジストロフィン、またはジストロフィンの一部分の導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクター）によって形質導入することができる。一部の実施形態では、筋肉細胞に、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを形質導入する。一部の実施形態では、骨格筋細胞に、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを形質導入する。一部の実施形態では、心筋細胞に、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを形質導入する。

【0439】

本明細書で使用される場合、用語「２ステップのｖｇ回収率％」とは、親和性クロマトグラフィーおよびＡＥＸクロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターを含む溶液からのｒＡＡＶの精製後のｖｇ回収率を指す。例えば、２ステップのｖｇ回収率を、親和性のｖｇ回収率％にＡＥＸのｖｇ回収率％を乗ずることによって算出することができる。

【0440】

本明細書で使用される場合、用語「上向きに流動する」とは、移動相の流動がカラムの底部からカラムの頂部に向かうような、クロマトグラフィー分離中の移動相の流動の方向を指す。一部の実施形態では、使用前の注射用水（ＷＦＩ）、または再生緩衝液などの移動相は、溶液（例えば、水）がカラムの底部からカラムの頂部に向かって流動するが、クロマトグラフィー分離ステップ（例えば、ローディング、洗浄または溶出）の間に、溶液がカラムの頂部からカラムの底部に向かって流動するように、クロマトグラフィー分離ステップのものと反対の方向に流動する。

【0441】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、核酸（例えば、組換え核酸）の挿入または組込みによって操作することができるプラスミド、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）、コスミド、または他のビヒクルを指す。ベクターを、例えば、核酸を細胞中に導入／移入するため、細胞中の挿入された核酸を転写または翻訳するための、遺伝子操作（例えば、クローニングベクター）を含む、様々な目的で使用することができる。一部の実施形態では、ベクター核酸配列は、細胞中での増殖のための少なくとも複製起点を含有する。一部の実施形態では、ベクター核酸は、異種核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデノシン（ポリＡ）配列および／またはＩＴＲを含む。一部の実施形態では、宿主細胞に送達された場合、核酸配列は増殖される。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達された場合、細胞は異種核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する。一部の実施形態では、宿主細胞に送達された場合、核酸配列、または核酸配列の一部は、カプシド中にパッケージングされる。宿主細胞は、単離された細胞または宿主生物内の細胞であってもよい。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列（例えば、導入遺伝子）に加えて、追加の配列（例えば、調節配列）が同じベクター内に存在し（すなわち、遺伝子に対してｃｉｓに）、遺伝子を挟んでもよい。一部の実施形態では、調節配列は、遺伝子の発現を調節するためにｔｒａｎｓに作用する別々の（例えば、第２の）ベクター上に存在してもよい。プラスミドベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称してもよい。

【0442】

本明細書で使用される場合、用語「ベクターゲノム」とは、ｒＡＡＶベクターを形成するためにＡＡＶカプシド中にパッケージング／封入されていてもよいが、それが必要とされるわけではない核酸を指す。典型的には、ベクターゲノムは、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子、調節エレメントなど）および少なくとも１つのＩＴＲを含む。組換えプラスミドを使用して組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を構築または製造する場合、ベクターゲノムは、プラスミド全体を含むのではなく、むしろ、ウイルスベクターによる送達を意図された配列のみを含む。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、組換えウイルスベクター生産の増殖にとって必要とされるプロセスであるプラスミドのクローニング、選択および増幅にとって重要であるが、それ自体はｒＡＡＶベクター中にパッケージングまたは封入されない。典型的には、カプシド中にパッケージングされる異種配列は、ＩＴＲによって挟まれ、プラスミド骨格から切断された場合、それはカプシド中にパッケージングされる。

【0443】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は一般に、核酸送達ビヒクルとして機能し、ウイルス粒子（すなわち、カプシド）内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、野生型ｒｅｐおよびｃａｐを置き換えた導入遺伝子を含む）を含むウイルス粒子を指し、例えば、ＡＡＶ血清型およびバリアント（例えば、ｒＡＡＶベクター）を含む、レンチウイルスおよびパルボウイルスを含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、組換えウイルスベクターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含むウイルスゲノムを含まない；むしろ、これらの配列は、目的の導入遺伝子を運搬するベクターゲノムの能力を提供するために除去されている。

【0444】

本開示は、宿主細胞回収物からのｒＡＡＶベクター（例えば、全ｒＡＡＶベクター）の精製のための方法を提供する。特に、本開示は、宿主細胞によって産生される他の核酸およびタンパク質（空カプシドを含む）からのｒＡＡＶベクター（例えば、全ｒＡＡＶベクター）の精製のための方法を提供する。さらに、本開示は、全ｒＡＡＶベクター（例えば、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター）からの空カプシドの分離のための方法を提供する。本開示のこれらの態様はそれぞれ、次のセクションでさらに考察される。

【0445】

ＩＩ．ＡＡＶおよびｒＡＡＶベクター
Ａ．ＡＡＶ
上で考察されたように、「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」とは、線状一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスおよびそのバリアントを指す。この用語は、別途要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、および天然に存在する形態と組換え形態との両方を包含する。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、それらは細胞に浸透し、核酸（例えば、導入遺伝子）を核に導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。一部の実施形態では、導入された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）は、形質導入細胞の核においてエピソームとして持続する環状コンカテマーを形成する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム中の特定の部位に、例えば、ヒト第１９染色体上の部位に挿入される。部位特異的組込みは、無作為の組込みとは反対に、予測可能な長期的発現プロファイルをもたらす可能性が高いと考えられる。ヒトゲノム中へのＡＡＶの挿入部位は、ＡＡＶＳ１と称される。細胞中に導入されたら、核酸によってコードされるポリペプチドは、細胞によって発現され得る。ＡＡＶはヒトにおいてはいかなる病原性疾患とも関連しないため、ＡＡＶによって送達される核酸を使用して、ヒト対象における疾患、障害および／または状態の処置のための治療的ポリペプチドを発現させることができる。

【0446】

ＡＡＶの複数の血清型が天然に存在し、今までのところ、少なくとも１５の野生型血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ１５）がヒトから同定されている。１５０を超えるユニークなＡＡＶ血清型が同定されている。天然に存在する血清型とバリアント血清型とは、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるタンパク質カプシドを有することによって区別される。特に、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３Ａ型（ＡＡＶ３Ａ）およびＡＡＶ３Ｂ型（ＡＡＶ３Ｂ）を含むＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅ ２、Ｃｈａｐｔｅｒ ６９（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２；ＷＯ２０１５／１２１５０１；ＷＯ２０１５／０１３３１３を参照されたい、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）。ヒトＣＤ３４＋細胞から単離されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４およびＡＡＶＨＳＣ１５が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（９）：１６２５～１６３４）。ロングリード配列決定によってヒト組織から単離された天然に存在するＡＡＶとしては、ＣＮＳに対する向性を示すＡＡＶｖ６６ならびにＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０が挙げられる（Ｈｓｕら（２０２０）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１１：３２７９）。

【0447】

「霊長類ＡＡＶ」とは、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」とは、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」とは、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶなどを指す。血清型の独自性は、別のＡＡＶと比較したあるＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差は通常、カプシドタンパク質配列および抗原性決定基の差異に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の差異に起因する）。しかしながら、一部の天然に存在するＡＡＶまたは人工のＡＡＶ突然変異体（例えば、組換えＡＡＶ）は、現在公知の血清型のいずれかとの血清学的な差異を示さないことがある。その場合、これらのウイルスは、対応する型のサブグループ、またはより単純には、バリアントＡＡＶであると考えることができる。かくして、本明細書で使用される場合、用語「血清型」とは、血清学的に異なるウイルス、例えば、ＡＡＶ、ならびに血清学的に異ならないが、所与の血清型のサブグループまたはバリアント内にあってもよいウイルス、例えば、ＡＡＶの両方を指す。

【0448】

公知のＡＡＶ血清型のカプシドのアミノ酸配列の包括的な一覧およびアラインメントは、Ｍａｒｓｉｃら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００～１９０９、特に、添付の図１によって提供されている；この刊行物全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0449】

ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、ならびに天然の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列が当業界で公知である。そのような配列を、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベース中に見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、ＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）、ＡＹ６３１９６５（ＡＡＶ１０）、ＡＹ６３１９６６（ＡＡＶ１１）、およびＤＱ８１３６４７（ＡＡＶ１２）を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３；国際特許出願公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１４／１９４１３２、ＷＯ２０１５／１２１５０１；ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および第７，９０６，１１１号も参照されたい。例示目的のみで、野生型ＡＡＶ２は、重複配列を含む３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３；合計６０個のタンパク質がＡＡＶカプシドを構成する）から構成されるＡＡＶの小さい（２０～２５ｎｍ）２０面体ウイルスカプシドを含む。タンパク質ＶＰ１（７３５ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０）、ＶＰ２（５９８ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７８）およびＶＰ３（５３３ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７９）は、カプシド中で約１：１：１０の比で存在する。すなわち、ＡＡＶについて、ＶＰ１は全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３はＶＰ１の次第に短くなるバージョンであり、ＶＰ１と比較してＮ末端のトランケーションが増加している。一実施形態では、本明細書に開示される方法の、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９ ＶＰ１を含む。

【0450】

Ｂ．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
上で考察されたように、「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」は、ウイルスゲノムの全部または一部の、非天然配列による置き換えによって、野生型ＡＡＶと区別される。ウイルス内の非天然配列の組込みは、ウイルスベクターを「組換え」ベクター、したがって、「ｒＡＡＶベクター」と定義する。ｒＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチド（例えば、ジストロフィンポリペプチド、またはその断片、例えば、配列番号２）をコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、ヒトミニ－ジストロフィン、例えば、をコードするヒトコドン最適化された遺伝子、例えば、配列番号１）を含んでもよい。組換えベクター配列をＡＡＶカプシド中に封入またはパッケージングすることができ、それを「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」または単に「ｒＡＡＶ」と称することができる。

【0451】

本開示は、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＶに対して異種であるポリヌクレオチド）を含むｒＡＡＶベクターを精製する方法を提供する。異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、時には２つのＡＡＶ末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））によって挟まれていてもよい。本明細書では「ベクターゲノム」とも称される、ＩＴＲによって挟まれた異種ポリヌクレオチドは、典型的には、目的のポリペプチド、または目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）、例えば、治療的処置のための標的（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための、ジストロフィン、またはその断片をコードする核酸）をコードする。ｒＡＡＶベクターの対象（例えば、患者）への送達または投与は、コードされたタンパク質およびペプチドを対象に提供する。かくして、ｒＡＡＶベクターを使用して、例えば、種々の疾患、障害および状態を処置するために、発現のための異種ポリヌクレオチドを移入／送達することができる。

【0452】

ｒＡＡＶベクターゲノムは一般に、ウイルスｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を置き換える異種核酸配列に対してｃｉｓに１４５塩基のＩＴＲを保持する。そのようなＩＴＲは、組換えＡＡＶベクターを生産するのに必要である；しかしながら、改変されたＡＡＶ ＩＴＲおよび部分的または完全に合成の配列を含む非ＡＡＶ末端反復も、この目的に役立ち得る。ＩＴＲはヘアピン構造を形成し、例えば、感染後に相補的ＤＮＡ鎖の宿主細胞媒介性合成のためのプライマーとして働くように機能する。ＩＴＲはまた、ウイルスのパッケージング、組込みなどにおいても役割を果たす。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製およびｒＡＡＶベクター中へのパッケージングにとってｃｉｓに必要とされる唯一のＡＡＶウイルスエレメントである。ｒＡＡＶベクターゲノムは、一般に、異種配列（例えば、目的の遺伝子をコードする導入遺伝子、または限定されるものではないが、特に、アンチセンス、およびｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子などの目的の核酸配列）を含むベクターゲノムの５’および３’末端にある２つのＩＴＲを含んでもよい。５’および３’ＩＴＲは両方とも、同じ配列を含んでもよいか、またはそれぞれ異なる配列を含んでもよい。ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されるものではないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１を含む任意のＡＡＶまたは他の任意のＡＡＶに由来してもよい。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製およびパッケージングを媒介する配列である。

【0453】

本開示のｒＡＡＶベクターは、カプシドの血清型（例えば、ＡＡＶ９またはその他）とは異なるＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ２、その断片またはバリアント）に由来するＩＴＲを含んでもよい。１つの血清型に由来する少なくとも１つのＩＴＲを含むが、異なる血清型に由来するカプシドを含むそのようなｒＡＡＶベクターを、ハイブリッドウイルスベクターと称することができる（米国特許第７，１７２，８９３号を参照されたい）。ＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列全体を含むか、またはそのバリアント、断片、もしくは改変体であってもよいが、機能を保持するであろう。

【0454】

一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ベクターゲノムの左右の末端（すなわち、それぞれ、５’および３’末端）に位置するＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲであるが、任意の野生型ＡＡＶ血清型、またはそのバリアントに由来するＩＴＲを含んでもよい）を含む。一部の実施形態では、左側（例えば、５’側）のＩＴＲは、配列番号５または配列番号６の核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、左側（例えば、５’側）のＩＴＲは、配列番号５もしくは配列番号６である、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である、またはそれと多くとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、右側（例えば、３’側）のＩＴＲは、配列番号５または配列番号６の核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、右側（例えば、３’側）のＩＴＲは、配列番号５もしくは配列番号６である、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である、またはそれと多くとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列を含む。それぞれのＩＴＲは、ｃｉｓにあるが、互いに、またはジストロフィンをコードする改変された核酸、もしくはその断片と、調節エレメントとを含む組換え核酸などの、可変長の核酸配列によって、ベクターゲノム中の他のエレメントから隔てられていてもよい。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、またはそのバリアントであり、ジストロフィン導入遺伝子を挟む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号５または配列番号６に記載の配列を有するＩＴＲ）によって挟まれたジストロフィン導入遺伝子（例えば、配列番号１の核酸配列を含む）を含む。

【0455】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、線状の、一本鎖であり、ＡＡＶ ＩＴＲによって挟まれている。異種遺伝子の転写および翻訳の前に、およそ４７００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡゲノムを、第２鎖合成を開始するために一方の自己プライミングするＩＴＲの遊離３’－ＯＨを使用してＤＮＡポリメラーゼ（例えば、形質導入細胞内のＤＮＡポリメラーゼ）によって二本鎖形態に変換する必要がある。一部の実施形態では、全長一本鎖ベクターゲノム（すなわち、センスおよびアンチセンス）はアニーリングして、全長二本鎖ベクターゲノムを生成する。これは、反対の極性（すなわち、センスまたはアンチセンス）のゲノムを担持する複数のｒＡＡＶベクターが同じ細胞を同時に形質導入する場合に起こり得る。それらがどのように生産されるかに関係なく、二本鎖ベクターゲノムが形成されたら、細胞は二本鎖ＤＮＡを転写および翻訳し、異種遺伝子を発現することができる。

【0456】

ｒＡＡＶベクターからの導入遺伝子発現の効率は、発現の前に一本鎖ｒＡＡＶゲノム（ｓｓＡＡＶ）を二本鎖ＤＮＡに変換する必要性によって妨げられ得る。このステップは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とすることなく、二本鎖ＤＮＡにフォールディングすることができる逆方向反復ゲノムをパッケージングすることができる自己相補性ＡＡＶゲノム（ｓｃＡＡＶ）を使用することによって回避される（ＭｃＣａｒｔｙ（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８～１６５６；ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８～１２５４；ＭｃＣａｒｔｙら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２～２１１８）。ｓｃＡＡＶベクターの制限は、カプシド中にパッケージングしようとする独自の導入遺伝子、調節エレメントおよびＩＴＲのサイズが、ｓｓＡＡＶベクターゲノム（すなわち、２つのＩＴＲを含む約４，９００ヌクレオチド）の約半分のサイズ（すなわち、約２，５００ヌクレオチドであり、そのうち２，２００ヌクレオチドは導入遺伝子および調節エレメントであり、＋２コピーの約１４５ヌクレオチドのＩＴＲであってよい）であるということである。

【0457】

ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、発現プラスミドの１つのｒＡＡＶ ＩＴＲから末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）を欠失させることによって、その末端からの複製の開始を防止することによって作製される（米国特許第８，７８４，７９９号を参照されたい）。宿主細胞内でのＡＡＶ複製は、ゲノムの野生型ＩＴＲで開始され、末端分離なしに突然変異体ＩＴＲを介して継続し、次いで、ゲノムをわたって戻り、二量体を作出する。二量体は、中央に突然変異体ＩＴＲ、および各末端に野生型ＩＴＲを含む自己相補性ゲノムである。一部の実施形態では、ＴＲＳが欠失した突然変異体ＩＴＲは、ベクターゲノムの５’末端にある。一部の実施形態では、ＴＲＳが欠失した突然変異体ＩＴＲは、ベクターゲノムの３’末端にある。一部の実施形態では、突然変異体ＩＴＲは、配列番号７または配列番号８の核酸配列を含む。

【0458】

理論によって束縛されることを望むものではないが、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分は相補的であるが、多くの塩基がカプシド内殻のアミノ酸残基と接触し、リン酸骨格は、中心に向かうように隔離されているため、カプシド内に実質的な塩基対合が存在する可能性は低い（ＭｃＣａｒｔｙ（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８～１６５６）。脱殻の際に、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分はアニーリングして、一方の末端に共有結合的に閉じたＩＴＲおよび他方の末端に２つの、末端が開いたＩＴＲを有するｄｓＤＮＡヘアピン分子を形成すると考えられる。ＩＴＲは、特に、導入遺伝子、およびそれに対してｃｉｓの調節エレメントをコードする二本鎖領域を挟む。

【0459】

ｒＡＡＶベクターのウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶまたはバリアントＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９－４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ヒツジＡＡＶおよびそのバリアントなどに由来してもよい（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、ｖｏｌｕｍｅ ２、ｃｈａｐｔｅｒ ６９（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい）。カプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２に開示されたいくつかのＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＷＯ２０１５／１２１５０１に開示されたトゥルータイプＡＡＶ（ＡＡＶ－ＴＴ）バリアント、ならびにＷＯ２０１５／０１３３１３に開示されたＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１～ＲＨＭ１５－６、およびそのバリアントが挙げられる（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）。カプシドはまた、ヒトＣＤ３４＋細胞から単離されたＡＡＶバリアントに由来してもよく、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４およびＡＡＶＨＳＣ１５が挙げられる（Ｓｍｉｔｈら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（９）：１６２５～１６３４）。ロングリード配列決定によってヒト組織から単離された天然に存在するＡＡＶとしては、ＣＮＳに対する向性を示すＡＡＶｖ６６ならびにＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０が挙げられる（Ｈｓｕら（２０２０）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１１：３２７９）。当業者であれば、同じか、または類似する機能を果たす、まだ同定されていない他のＡＡＶバリアントが存在する可能性が高いことを知っているであろう。ＡＡＶ ｃａｐタンパク質の完全な補体は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全な補体よりも小さいＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含んでもよいか、またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質の完全な補体を提供することができる。

【0460】

一部の実施形態では、本開示は、治療的ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法における使用のための祖先ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ由来配列をｄｅ ｎｏｖｏで合成し、生物活性について特性評価することができる。ｒＡＡＶベクターへのアセンブリーに加えて、祖先配列の予測および合成を、ＷＯ２０１５／０５４６５３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法を使用して達成することができる。とりわけ、祖先ウイルス配列からアセンブリーされたｒＡＡＶベクターは、現代のウイルスまたはその一部と比較して、ヒト集団において元々存在する免疫に対する感受性の低下を示してもよい。

【0461】

一部の実施形態では、１つより多いＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ血清型、バリアントＡＡＶ血清型）に由来するヌクレオチド配列によってコードされるカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶベクターは、「キメラベクター」または「キメラカプシド」と称される（開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４９１，９０７号を参照されたい）。一部の実施形態では、キメラカプシドタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上のＡＡＶ血清型に由来する核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２ｉ８に由来するカプシド配列、または前記ＡＡＶ血清型のいずれかに由来するアミノ酸の組合せを含むキメラカプシドタンパク質をもたらす、そのバリアントを含む（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１を参照されたい）。あるいは、キメラカプシドは、ある血清型に由来するＶＰ１、異なる血清型に由来するＶＰ２、さらに異なる血清型に由来するＶＰ３、およびその組合せの混合物を含んでもよい。例えば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ ｃａｐタンパク質またはサブユニットおよび少なくとも１つのＡＡＶ２ ｃａｐタンパク質またはサブユニットを含んでもよい。キメラカプシドは、例えば、１つまたは複数のＢ１９ ｃａｐサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含んでもよく、例えば、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質またはサブユニットを、Ｂ１９ ｃａｐタンパク質またはサブユニットによって置き換えることができる。例えば、一実施形態では、ＡＡＶカプシドのＶＰ３サブユニットを、Ｂ１９のＶＰ２サブユニットによって置き換えることができる。

【0462】

一部の実施形態では、キメラベクターは、変更された向性または特定の組織もしくは細胞型に対する向性を示すように遺伝子操作されている。用語「向性」とは、ある特定の細胞もしくは組織型へのウイルスの優先的進入および／またはある特定の細胞もしくは組織型への進入を容易にする細胞表面との優先的相互作用を指す。ＡＡＶの向性は、一般に、異なるウイルスカプシドタンパク質と、その同種細胞受容体との特異的相互作用によって決定される（Ｌｙｋｋｅｎら（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：１６）。好ましくは、ウイルスまたはウイルスベクターが細胞に進入したら、ベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）によって担持される配列（例えば、導入遺伝子などの異種配列）が発現される。

【0463】

「向性プロファイル」とは、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入のパターンを指す。例えば、ＡＡＶカプシドは、例えば、脳細胞の低いものにすぎない形質導入と共に、筋肉細胞の効率的な形質導入を特徴とする向性プロファイルを有してもよい。

【0464】

ＩＩＩ．組換え核酸
本開示の方法は、改変核酸を含む組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターならびに改変核酸を含むプラスミドおよびベクターゲノムの精製を含む。組換え核酸、プラスミドまたはベクターゲノムは、増殖をモジュレートする（例えば、プラスミドの）、および／または改変核酸（例えば、導入遺伝子）の発現を制御するための調節配列を含んでもよい。組換え核酸を、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）の成分として提供することもできる。一般に、ウイルスベクターは、カプシド中にパッケージングされた組換え核酸を含むベクターゲノムを含む。

【0465】

Ａ．改変核酸
改変形態、またはバリアント形態の遺伝子、核酸またはポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）は、参照配列から外れる核酸を指す。参照配列は、天然に存在する、野生型配列（例えば、遺伝子）であってもよく、天然に存在するバリアント（例えば、スプライスバリアント、選択的リーディングフレーム）を含んでもよい。当業者であれば、参照配列をＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）などの公共的に利用可能なデータベース中に見出すことができることを知っているであろう。改変／バリアント核酸は、参照配列と比較して、実質的に同じ、より高いまたはより低い活性、機能または発現を有してもよい。好ましくは、本明細書で互換的に使用される、改変核酸またはバリアント核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされたタンパク質は、その他の点で同一の細胞中で内因性遺伝子（例えば、野生型遺伝子、突然変異体遺伝子）によって提供されるタンパク質の発現のレベルと比較して、細胞中で検出可能により高いレベルで発現される。一部の実施形態では、本明細書で互換的に使用される、改変核酸またはバリアント核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされたタンパク質は、その他の点で同一の細胞中での突然変異を含む内因性遺伝子によって提供されるタンパク質の発現のレベルと比較して、細胞中で検出可能により高いレベルで発現される。

【0466】

核酸に対する改変は、参照配列の１つまたは複数のヌクレオチド置換（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個以上のヌクレオチドの置換）、付加（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個以上のヌクレオチドの挿入）、欠失（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個以上のヌクレオチドの欠失、モチーフ、ドメイン、断片の欠失など）を含む。改変核酸は、参照配列と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であってよい。

【0467】

改変核酸は、参照ポリペプチドに対する約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしてもよい。一部の実施形態では、改変核酸は、参照ポリペプチドに対する１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。

【0468】

一部の実施形態では、改変核酸（例えば、導入遺伝子）は、野生型タンパク質をコードする。そのような改変核酸をコドン最適化することができる。本明細書で互換的に称される「最適化された」または「コドン最適化された」とは、例えば、稀なコドンの使用を最小化すること、ＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させること、クリプティックスプライスドナーまたはアクセプター部位を除去すること、Ｋｏｚａｋ配列を除去すること、リボソーム進入部位を除去することなどによって、ポリペプチドの発現を増加させるために、野生型コード配列または参照配列（例えば、ミニ－ジストロフィンポリペプチドのコード配列、例えば、配列番号２）と比較して最適化されているコード配列を指す。一部の実施形態では、コドン最適化された配列からのタンパク質の発現のレベルは、その他の点では同一の細胞中での野生型遺伝子からのタンパク質の発現のレベルと比較して増加している。一部の実施形態では、コドン最適化された配列からのタンパク質の発現のレベルは、その他の点では同一の細胞中での野生型遺伝子からのタンパク質の発現のレベルと比較して増加していない（例えば、発現が実質的に類似している）。一部の実施形態では、コドン最適化された配列からのタンパク質の発現のレベルは、その他の点では同一の細胞中での突然変異体遺伝子からのタンパク質の発現のレベルと比較して増加している。

【0469】

改変の例としては、１つまたは複数のｃｉｓ作用モチーフの除去および１つまたは複数のＫｏｚａｋ配列の導入が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数のｃｉｓ作用モチーフが除去され、１つまたは複数のＫｏｚａｋ配列が導入される。

【0470】

除去することができるｃｉｓ作用モチーフの例としては、内部ＴＡＴＡボックス；カイ部位；リボソーム進入部位；ＡＲＥ、ＩＮＳ、および／またはＣＲＳ配列エレメント；反復配列および／またはＲＮＡ二次構造；（クリプティック）スプライスドナーおよび／またはアクセプター部位、分岐点；ならびに制限部位が挙げられる。

【0471】

一部の実施形態では、改変核酸は、改変ポリペプチドまたはバリアントポリペプチドをコードする。改変核酸によってコードされる改変ポリペプチド（例えば、コドン最適化されたミニ－ジストロフィン）は、野生型コード配列または参照配列によってコードされるポリペプチドの機能または活性の全部または一部を保持してもよい。一部の実施形態では、改変ポリペプチドは、１つまたは複数の非保存的または保存的アミノ酸変化を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能において限られた役割を果たす、または役割を果たさないことが示されたある特定のドメインは、改変ポリペプチド中に存在しない（例えば、ある特定の結合ドメイン）（例えば、ＷＯ２０１６／０９７２１９）。ｒＡＡＶベクター中に存在する改変核酸は、ｒＡＡＶカプシドのパッケージング容量に起因して、野生型コード配列または参照配列よりも少ないヌクレオチドを含んでもよく（例えば、短縮されたミニジストロフィン導入遺伝子、ＷＯ２００１／８３６９５を参照されたい；Ｂドメインが欠失したヒト第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、ＷＯ２０１７／０７４５２６を参照されたい）、また、トランケート型と、コドン最適化型（例えば、ＷＯ２０１７／２２１１４５に記載されたコドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子）との両方である短縮された導入遺伝子を含んでもよい。一部の実施形態では、改変核酸によってコードされるポリペプチドは、参照配列によってコードされるポリペプチドの機能または活性よりも低い、同じか、または高いが、その少なくとも一部を有する。

【0472】

改変核酸は、参照および／または野生型配列と比較して、改変されたＧＣ含量（例えば、核酸配列中に存在するＧおよびＣヌクレオチドの数）、改変された（例えば、増加もしくは減少した）ＣｐＧジヌクレオチド含量および／または改変された（例えば、増加もしくは減少した）コドン適応指数（ＣＡＩ）を有してもよい。例えば、ＷＯ２０１７／０７７４５１を参照されたい（最適化のために核酸配列を分析するための公共的に利用可能なソフトウェアを含む、目的の核酸配列のコドン最適化のための当業界で周知の様々な配慮を考察している）。本明細書で使用される場合、改変されたとは、特定の値、量または効果の減少または増加を指す。

【0473】

一部の実施形態では、本開示の改変核酸配列のＧＣ含量は、参照および／または野生型遺伝子もしくはコード配列と比較して増加している。改変核酸のＧＣ含量は、野生型コード配列のＧＣ含量よりも、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％高い。一部の実施形態では、ＧＣ含量は、配列中のＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）ヌクレオチドのパーセンテージとして表される。

【0474】

一部の実施形態では、本開示の改変核酸配列のコドン適応指数は、少なくとも０．７４、少なくとも０．７６、少なくとも０．７７、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．８６、少なくとも０．８７、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５または少なくとも０．９８である。

【0475】

一部の実施形態では、本開示の改変核酸配列は、野生型または参照核酸配列と比較して、約１０％、２０％、３０％、５０％以上の減少である、減少したレベルのＣｐＧジヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、改変核酸は、参照配列（例えば、野生型配列）よりも１～５個少ない、５～１０個少ない、１０～１５個少ない、１５～２０個少ない、２０～２５個少ない、２５～３０個少ない、３０～４０個少ない、４０～４５個少ない、もしくは４５～５０個少ない、またはさらに少ないジヌクレオチドを有する。

【0476】

ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、真核生物における遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが知られている。具体的には、真核生物におけるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、本質的には転写機構を阻害することによって遺伝子発現をサイレンシングするのに役立つ。そのため、ＣｐＧモチーフのメチル化によって誘発される遺伝子サイレンシングのため、減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸およびベクターは、高く、より長く続く導入遺伝子発現レベルをもたらすであろう。

【0477】

改変核酸配列は、発現ベクター中へのサブクローニングを容易にするための挟んでいる制限部位を含んでもよい。多くのそのような制限部位が当業界で周知であり、限定されるものではないが、ＡｖａＩ、ＳｗａＩ、ＡｐａＬ１およびＸｍａＩが挙げられる。

【0478】

本開示は、ジストロフィンポリペプチドの機能的に活性な断片をコードする、配列番号１の改変核酸を含む。「機能的に活性」または「機能性ジストロフィンポリペプチド」は、断片が全長ジストロフィンポリペプチドと同じか、または類似する生物学的機能および／または活性を提供することを示す。すなわち、断片は、限定されるものではないが、筋肉線維の筋フィラメントの構造タンパク質と同じ機能を提供する。ジストロフィンの機能的断片の生物活性は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーと関連する神経筋表現型を好転させること、または防止することを包含する。

【0479】

かくして、本発明の一実施形態は、ミニ－ジストロフィンタンパク質をコードする改変核酸であって、配列番号１の核酸配列またはそれと少なくとも約９０％同一である配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる核酸を含むｒＡＡＶベクターを精製する方法に関する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１の核酸配列と少なくとも、または多くても９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。ある特定の実施形態では、核酸は、ウイルスベクター、例えば、パルボウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターの容量の範囲内にある長さを有する。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも、または多くても５０００、４９００、４８００、４７００、４６００、４５００、４４００、４３００、４２００、４１００、または約４０００ヌクレオチド、もしくはそれ以下である。

【0480】

一部の実施形態では、核酸は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも、もしくは多くても９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるミニ－ジストロフィンタンパク質をコードする。

【0481】

一部の実施形態では、核酸（例えば、配列番号１）は、ジストロフィンタンパク質の生産のための組換え核酸の一部である。組換え核酸は、ジストロフィンの発現を増加させるのに有用な調節エレメントをさらに含んでもよい。

【0482】

Ｂ．調節エレメント
本開示の方法は、ポリペプチド（例えばミニ－ジストロフィン）および種々の調節または制御エレメントをコードする改変核酸を含む組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターの精製を含む。典型的には、調節エレメントは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響する核酸配列である。適切な異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳を容易にする意図で、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどを含む、遺伝子発現にとって有用な調節エレメントの正確な性質は、生物間および細胞型間で変化するであろう。調節制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで影響され得る。典型的には、転写をモジュレートする調節制御エレメントは、転写されるポリヌクレオチドの５’末端（すなわち、上流）の近くに並置される。調節制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち、下流）に、または転写物の内部に（例えば、イントロン中に）位置してもよい。調節制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、１～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～５０００、５０００～１０，０００個以上のヌクレオチド）に位置してもよい。しかしながら、ＡＡＶベクターゲノムの長さのため、調節制御エレメントは、典型的には、ポリヌクレオチドから１～１０００ヌクレオチドの範囲内にある。

【0483】

Ｃ．プロモーター
本明細書で使用される場合、「真核プロモーター」などの用語「プロモーター」とは、真核細胞（例えば、筋肉細胞）中での、特定の遺伝子、または１つもしくは複数のコード配列（例えば、ミニ－ジストロフィンコード配列）の転写を開始させるヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、遺伝子またはコード配列の転写のレベルを指令する他の調節エレメントまたは領域と共に動作することができる。これらの調節エレメントとしては、例えば、転写結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびに例えば、アテニュエータ－、エンハンサーおよびサイレンサーなどのプロモーターからの転写の量を調節するように直接的または間接的に作用することが知られる他のヌクレオチド配列が挙げられる。プロモーターは、ほとんどの場合、それが作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の５’側の、同じ鎖上に、および転写開始部位の近くに位置する。プロモーターは、一般に、１００～１０００ヌクレオチド長である。プロモーターは、典型的には、プロモーターの非存在下での同じ遺伝子の発現と比較して遺伝子発現を増加させる。

【0484】

本明細書で使用される場合、「コアプロモーター」または「最小プロモーター」とは、転写を適切に開始させるのに必要とされるプロモーター配列の最小部分を指す。それは以下のいずれかを含んでもよい：転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位および一般的な転写因子結合部位。プロモーターはまた、他の一次調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー、境界エレメント、インスレーター）を含有する近位プロモーター配列（コアプロモーターの５’側）ならびに遠位プロモーター配列（コアプロモーターの３’側）を含んでもよい。

【0485】

好適なプロモーターの例としては、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルスプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；アルブミンプロモーター；マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどの誘導的プロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；α－１－抗トリプシンプロモーター；Ｂ型肝炎表面抗原プロモーター；トランスフェリンプロモーター；アポリポタンパク質Ａ－１プロモーター；ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター；伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーター；ハイブリッド形態のＣＢＡプロモーター（ＣＢｈプロモーター）；ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメントおよびプロモーター、第１エクソン、ならびにニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１イントロンおよびウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら（２００８）ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２）；クレアチンキナーゼプロモーター；およびヒトジストロフィン遺伝子プロモーターが挙げられる。本開示の一部の実施形態では、真核プロモーター配列（例えば、クレアチンキナーゼプロモーター）は、ミニ－ジストロフィンをコードする改変核酸に作動可能に連結される。

【0486】

プロモーターは、構成的、組織特異的または調節的であってもよい。構成的プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子を本質的には常に発現させるものである。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、多くの生理学的および発生条件下で多くの真核組織中で活性である。

【0487】

調節的プロモーターは、活性化または不活性化することができるものである。調節的プロモーターとしては、通常は「オフ」であるが、「オン」に変化するように誘導することができる誘導的プロモーター、および通常は「オン」であるが、「オフ」に変化させることができる「抑制的」プロモーターが挙げられる。温度、ホルモン、サイトカイン、重金属および調節タンパク質を含む、多くの異なる調節因子が公知である。それらの区別は絶対的なものではない；構成的プロモーターは、多くの場合、ある程度まで調節することができる。一部の場合、内因性経路を利用して、例えば、生理学的条件が改善する時に天然で下方調節されるプロモーターを使用して、導入遺伝子発現の調節を提供することができる。

【0488】

組織特異的プロモーターは、特定の型の組織、細胞または臓器においてのみ活性であるプロモーターである。典型的には、組織特異的プロモーターは、特定の組織、細胞および／または臓器に特異的である転写活性化因子エレメントによって認識される。例えば、組織特異的プロモーターは、他の組織よりも、１つまたはいくつかの特定の組織（例えば、２、３または４つ）において活性が高くてもよい。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターによってモジュレートされる遺伝子の発現は、プロモーターが他の組織におけるよりも特異的である組織においてはるかにより高い。一部の実施形態では、プロモーターが特異的である組織以外の任意の組織においてそのプロモーターの活性がわずかであるか、または実質的に活性がなくてもよい。プロモーターは、肝臓細胞中で活性である、マウスアルブミンプロモーター、またはトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）などの組織特異的プロモーターであってもよい。組織特異的プロモーターの他の例としては、骨格筋における発現を誘導する、骨格α－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる（Ｌｉら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４１～２４５）。肝臓特異的発現を、アルブミン遺伝子（Ｍｉｙａｔａｋｅら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４～５１３２）、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２～１００９）およびアルファ－フェトタンパク質（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１５０３～１５１４）に由来するプロモーターを使用して誘導することができる。

【0489】

Ｄ．エンハンサー
別の態様では、治療的ポリペプチドをコードする改変核酸は、治療的ポリペプチドの発現を増加させるためのエンハンサーをさらに含む。典型的には、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントの上流に位置するが、別の配列（例えば、導入遺伝子）の下流または内部に位置してもよい。エンハンサーは、改変核酸の１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチドまたはそれより上流または下流に位置してもよい。エンハンサーは、典型的には、プロモーターエレメントのみによってもたらされる発現の増加を超えて改変核酸（例えば、治療的ポリペプチドをコードする）の発現を増加させる。

【0490】

限定されるものではないが、サイトメガロウイルス主要極初期エンハンサーを含む多くのエンハンサーが当業界で公知である。より具体的には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＭＩＥプロモーターは、３つの領域：モジュレーター、ユニークな領域およびエンハンサーを含む（Ｉｓｏｍｕｒａら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（６）：３６０２～３６１４）。ＣＭＶエンハンサー領域を、別のプロモーター、またはその一部と組み合わせて、ハイブリッドプロモーターを形成させ、それに作動可能に連結された核酸の発現をさらに増加させることができる。例えば、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、またはその一部を、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、またはその一部と組み合わせて、Ｇｒａｙら（２０１１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３～１１５３に記載されたような、ニワトリベータ－アクチンハイブリッドプロモーターを表す、「ＣＢｈ」プロモーターと呼ばれるＣＢＡのバージョンを作製することができる。プロモーターと同様、エンハンサーは構成的、組織特異的または調節的であってもよい。

【0491】

本開示の一部の実施形態では、調節エレメントは、筋肉特異的転写調節エレメント（ｈＣＫ）として働き、ミニ－ジストロフィンをコードする改変核酸に作動可能に連結されたクレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する合成ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターなどの、ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターを含む。

【0492】

Ｅ．フィラー、スペーサーおよびスタッファー
本明細書に開示される場合、ｒＡＡＶベクターにおける使用について意図される組換え核酸は、ｒＡＡＶベクター中へのＡＡＶのパッケージングにとって許容されるウイルスゲノム配列の、近くに、または通常のサイズ（例えば、約４．７～４．９キロベース）に核酸の長さを調整するための追加の核酸エレメントを含んでもよい（Ｇｒｉｅｇｅｒら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３～９９４４）。そのような配列を、フィラー、スペーサーまたはスタッファーと互換的に称することができる。一部の実施形態では、フィラーＤＮＡは、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。一部の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０～９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００以上の長さの配列である。

【0493】

ＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶカプシドへの核酸の最適なパッケージングのための約４ｋｂ～約５．２ｋｂまたは約４．１～４．９ｋｂの範囲のサイズを有するＤＮＡの挿入物を受け入れる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約３．０ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４．０ｋｂ、約４．０ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５．０ｋｂまたは約５．０ｋｂ～約５．２ｋｂの全長を有するベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約４．５ｋｂの全長を有するベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、自己相補性であるベクターゲノムを含む。ｒＡＡＶベクター中の自己相補性（ｓｃ）ベクターゲノムの全長は一本鎖（ｓｓ）ベクターゲノムと同等であるが（すなわち、約４ｋｂ～約５．２ｋｂ）、ｓｃベクターゲノムをコードする核酸配列（すなわち、導入遺伝子、調節エレメントおよびＩＴＲを含む）は、ｓｃベクターをカプシド中にパッケージングするために、ｓｓベクターゲノムをコードする核酸配列のわずか半分ほどの長さでなければならない。

【0494】

Ｆ．イントロンおよびエクソン
一部の実施形態では、組換え核酸は、例えば、イントロン、エクソンおよび／またはその一部を含む。イントロンは、ｒＡＡＶベクター中へのベクターゲノムのパッケージングのための適切な長さを達成するためにフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能してもよい。イントロンおよび／またはエクソン配列はまた、イントロンおよび／またはエクソンエレメントの非存在下での発現と比較して、ポリペプチド（例えば、導入遺伝子）の発現を増強させることもできる（Ｋｕｒａｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５７６～５２８１；ＷＯ２０１７／０７４５２６）。さらに、フィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列（「インスレーター」とも称される）は、当業界で周知であり、限定されるものではないが、ＷＯ２０１４／１４４４８６およびＷＯ２０１７／０７４５２６に記載されたものが挙げられる。

【0495】

イントロンエレメントは、異種ポリヌクレオチドと同じ遺伝子に由来するか、または完全に異なる遺伝子もしくは他のＤＮＡ配列（例えば、ニワトリβ－アクチン遺伝子、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ））に由来してもよい。一部の実施形態では、組換え核酸は、非同種遺伝子（すなわち、改変核酸、例えば、導入遺伝子に由来しない）に由来するイントロンおよびエクソンから選択される少なくとも１つのエレメントを含む。

【0496】

Ｇ．ポリアデニル化シグナル配列（ポリＡ）
さらなる調節エレメントは、停止コドン、終結配列、および限定されるものではないが、ウシ増殖ホルモンポリＡシグナル配列（ＢＨＧポリＡ）などのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含んでもよい。ポリＡシグナル配列は、遺伝子転写の終結を導く真核ｍＲＮＡの３’末端でのポリアデノシン「尾部」の効率的な付加を駆動する（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２３）：１６３３０～１６３３４を参照されたい）。ポリＡシグナルは、新しく形成された前駆体ｍＲＮＡの、その３’末端でのエンドヌクレアーゼ的切断のための、およびアデノシン塩基のみからなるＲＮＡストレッチのこの３’末端への付加のためのシグナルとして作用する。ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および安定性にとって重要である。一部の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅ１ｂポリアデニル化シグナル、増殖ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナルまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたポリアデニル化シグナルである。

【0497】

一部の実施形態では、任意選択により、本明細書に記載の１つまたは複数の他の調節エレメントと共に、組換え核酸のポリＡシグナル配列は、ミニ－ジストロフィンをコードする改変核酸（例えば、配列番号２）の転写の結果得られる前駆体ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断およびポリアデニル化を指令し、行うことができるポリＡシグナルである。

【0498】

一部の実施形態では、筋肉細胞に対する向性を示すｒＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ）およびミニ－ジストロフィンをコードする改変（すなわち、コドン最適化された）核酸を含む組換え核酸および少なくとも１つの以下の調節エレメント：プロモーター（例えば、ヒトＣＫプロモーター）、ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターならびにポリＡ（配列番号４）を含むベクターゲノムを含有する。

【0499】

ＩＶ．ウイルスベクターのアセンブリー
導入遺伝子（例えば、ミニ－ジストロフィンをコードする）を担持するウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、導入遺伝子、好適な調節エレメントおよび細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生にとって必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドからアセンブリーされる。ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、特に、ｒＡＡＶベクター（上掲で考察された）が挙げられる。

【0500】

本開示の方法に従って生産されるｒＡＡＶベクターのベクターゲノム成分は、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、コドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子およびジストロフィン、またはその断片をコードする改変核酸の発現を制御するための関連する発現制御配列を含む。

【0501】

例示的な非限定的実施形態では、ベクターゲノムは、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失した、および／または改変核酸（例えば、導入遺伝子、例えば、コドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子）によって置き換えられたＡＡＶゲノムなどのパルボウイルスゲノムの一部と、その関連する発現制御配列とを含む。ジストロフィン、またはその断片をコードする改変核酸は、典型的には、ウイルスｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸の代わりに、ウイルス複製にとって十分な１つまたは２つのＡＡＶ ＩＴＲまたはＩＴＲエレメント（Ｘｉａｏら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（２）：９４１～９４８）に隣接して挿入される（すなわち、によって挟まれる）。標的細胞（例えば、筋肉細胞）中でのコドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子の組織特異的発現を容易にする際の使用にとって好適な他の調節配列を含有させてもよい。

【0502】

Ａ．パッケージング細胞
当業者であれば、導入遺伝子を含み、ウイルス複製にとって必要とされるウイルスタンパク質（例えば、ｃａｐおよびｒｅｐ）を欠くｒＡＡＶベクターは、そのようなタンパク質がウイルスの複製およびパッケージングにとって必要であるため、複製することができないことを理解するであろう。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を、ベクターゲノムに導入遺伝子を供給するプラスミドとは別であるプラスミドの一部として、細胞（例えば、宿主細胞、例えば、パッケージング細胞）に供給することができる。

【0503】

「パッケージング細胞」または「産生細胞」とは、ベクター、プラスミドまたはＤＮＡ構築物をトランスフェクトすることができる細胞または細胞株を意味し、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングにとって必要とされる全ての欠けている機能をｔｒａｎｓに提供する。ｒＡＡＶベクターのアセンブリーにとって必要な遺伝子は、ベクターゲノム（例えば、コドン最適化されたミニ－ジストロフィン導入遺伝子、調節エレメント、およびＩＴＲ）、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、および例えば、アデノウイルスなどの他のウイルスに由来するある特定のヘルパー遺伝子を含む。当業者であれば、ＡＡＶ生産のための必要な遺伝子を、例えば、１つまたは複数のプラスミドのトランスフェクションを含む様々な方法でパッケージング細胞中に導入することができることを理解するであろう。しかしながら、一部の実施形態では、いくつかの遺伝子（例えば、ｒｅｐ、ｃａｐ、ヘルパー）は、既にパッケージング細胞中に存在するか、ゲノム中に組み込まれているか、またはエピソーム上に担持されていてもよい。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、構成的または誘導的様式で、１つまたは複数の欠けているウイルス機能を発現する。

【0504】

当業界で公知の任意の好適なパッケージング細胞を、パッケージングされたウイルスベクターの生産において用いることができる。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本開示の実施におけるパッケージング細胞の生産にとって有用な細胞の例としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３（構成的プロモーターの制御下で機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０または他の任意のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞株などのヒト細胞株が挙げられる。好適な非ヒト哺乳動物細胞株としては、例えば、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣまたはＣＨＯ細胞が挙げられる。

【0505】

一部の実施形態では、パッケージング細胞は、懸濁培養物中で増殖することができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、無血清培地中で増殖することができる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、無血清培地中の懸濁液中で増殖する。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載されたＨＥＫ２９３細胞であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＰＴＡ１３２７４として寄託されている。限定されるものではないが、ＷＯ２００２／４６３５９に開示されたものを含む、いくつかのｒＡＡＶパッケージング細胞株が当業界で公知である。

【0506】

パッケージング細胞としての使用のための細胞株は、昆虫細胞株を含む。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持することができる任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用することができる。例としては、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株などのツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）細胞株、または蚊細胞株、例えば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株が挙げられる。好ましい細胞株は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞株である。以下の参考文献は、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、そのような細胞に核酸を導入する方法、および培養物中でそのような細胞を維持する方法に関するその教示について本明細書に組み込まれる：「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｉｃｈａｒｄ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２～３８２８；Ｋａｊｉｇａｙａら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６～４６５０；Ｒｕｆｆｉｎｇら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９２２～６９３０；Ｋｉｍｂａｕｅｒら（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２１９：３７～４４；Ｚａｈｏら（２０００）Ｖｉｒｏｌ．２７２：３８２～３９３；および米国特許第６，２０４，０５９号。

【0507】

さらなる代替手段として、本開示のウイルスベクターを、例えば、Ｕｒａｂｅら（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５～１９４３によって記載されたように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためにバキュロウイルスを使用して昆虫細胞中で生産することができる。ＡＡＶのためにバキュロウイルス生産を使用する場合、一部の実施形態では、ベクターゲノムは、自己相補性である。一部の実施形態では、宿主細胞は、任意選択により、バキュロウイルスヘルパー機能をコードする追加の核酸を含み、それによって、ウイルスカプシドの産生を容易にするバキュロウイルス感染細胞（例えば、昆虫細胞）である。

【0508】

パッケージング細胞は一般に、ウイルスベクターの複製およびパッケージングを得るのに十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と共に、１つまたは複数のウイルスベクター機能を含む。これらの様々な機能を、プラスミドまたはアンプリコンなどの遺伝子構築物を使用してパッケージング細胞に一緒に、または別々に供給することができ、それらは細胞株内で染色体外に存在するか、または宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。一部の実施形態では、パッケージング細胞に、少なくともｉ）導入遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、以下の調節エレメント：エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロンおよびポリＡのうちの少なくとも１つをさらに含むベクターゲノムを含むプラスミドならびにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ２ ｒｅｐ）およびｃａｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ９または他のｃａｐ）を含むプラスミドをトランスフェクトする。

【0509】

一部の実施形態では、宿主細胞に、例えば、１つまたは複数のベクター機能が染色体外に含まれた、または細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた宿主細胞株内に含まれる１つまたは複数のパッケージングまたはヘルパー機能を供給する。

【0510】

Ｂ．ヘルパー機能
ＡＡＶは、それがヘルパーウイルスによる細胞の同時感染なしには細胞中で複製することができないディペンドウイルスである。ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始させるのに必要とされる、パッケージング細胞の活動性感染を確立するのに必要とされるヘルパーウイルスエレメントを含む。ヘルパーウイルスとしては、典型的には、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが挙げられる。アデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、アデノウイルス成分であるアデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１ａ）、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを含む。細胞に、種々のヘルパーエレメントをコードする１つまたは複数の核酸をトランスフェクトすることによって、パッケージング細胞にヘルパー機能（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）を提供することができる。あるいは、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞）は、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含んでもよい。例えば、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒト細胞に、アデノウイルス５のＤＮＡを形質転換することによって生成し、ここで、それは限定されるものではないが、Ｅ１およびＥ３を含むいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９～７２）。かくして、これらのヘルパー機能を、例えば、それらをコードするプラスミドによって細胞にそれらを供給する必要なく、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞によって提供することができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞に、少なくともｉ）導入遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、以下の調節エレメント：エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロンおよびポリＡのうちの少なくとも１つをさらに含むベクターゲノムを含むプラスミドならびにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ２ ｒｅｐ）およびｃａｐ遺伝子（例えば、ＡＡＶ９または他のｃａｐ）を含むプラスミドならびにｉｉｉ）ヘルパー機能を含むプラスミドをトランスフェクトする。

【0511】

限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、陽イオン性または陰イオン性リポソーム、担体分子（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームを含む、複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を担持するヌクレオチド配列を細胞宿主中に導入する任意の方法を用いることができる。一部の実施形態では、ヘルパー機能は、ウイルスベクターを使用するトランスフェクション、またはヘルパーウイルスを使用する感染によって提供され、ウイルス感染をもたらすための標準的な方法を使用することができる。

【0512】

ベクターゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物などの任意の好適な組換え核酸であってよく、一本鎖、二本鎖、または二重鎖（すなわち、ＷＯ２００１／９２５５１に記載されたような自己相補性）であってもよい。

【0513】

Ｖ．パッケージングされたウイルスベクターの生産
ウイルスベクターを、当業者には公知のいくつかの方法によって作製することができる（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照されたい）。例示的な非限定的方法は、Ｇｒｉｅｇｅｒら（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７～２９７に記載されており、その内容はあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションを出発点として使用し、適格な臨床マスター細胞バンクからの付着性ＨＥＫ２９３細胞株を使用して、迅速かつ拡大可能なｒＡＡＶ生産を可能にする、振とうフラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター中、動物成分を含まない懸濁条件で増殖させる。トリプルトランスフェクション法（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞株懸濁液は、トランスフェクションの４８時間後に回収した場合、細胞あたり１ｘ１０^５を超えるベクターゲノム含有粒子（ＶＧ）、または細胞培養物１Ｌあたり１ｘ１０^１４を超えるＶＧを生成することができる。より具体的には、トリプルトランスフェクションとは、パッケージング細胞に、３つのプラスミドをトランスフェクトする：１つのプラスミドはＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ（例えば、ＡＡＶ９ ｃａｐ）遺伝子をコードし、別のプラスミドは種々のヘルパー機能（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ）をコードし、別のプラスミドは導入遺伝子（例えば、ジストロフィン、またはその断片）および導入遺伝子の発現を制御するための種々のエレメントをコードする方法を指す。

【0514】

一本鎖ベクターゲノムは、ほぼ等しい割合のプラス鎖またはマイナス鎖としてカプシド中にパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターの一部の実施形態では、ベクターゲノムは、プラス鎖の極性（すなわち、ＤＮＡ鎖のセンスまたはコード配列）である。ｒＡＡＶベクターの一部の実施形態では、ベクターは、マイナス鎖の極性（すなわち、アンチセンスまたは鋳型ＤＮＡ鎖）である。５’から３’の向きにあるプラス鎖のヌクレオチド配列を考慮して、５’から３’の向きにあるマイナス鎖のヌクレオチド配列を、プラス鎖のヌクレオチド配列の逆相補体と決定することができる。

【0515】

望ましい収量を達成するために、増殖およびトランスフェクションの両方を支援する適合性無血清懸濁培地の選択、トランスフェクション試薬、トランスフェクション条件および細胞密度の選択などの、いくつかの変数を最適化する。

【0516】

カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配などの当業界で標準的な方法によって、ｒＡＡＶベクターを精製することができる。ｒＡＡＶベクターを精製するための方法が当業界で公知であり、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）：１０３１～１０３９；Ｓｃｈｅｎｐｐら（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７～４４３；米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ９８／０９６５７に記載された方法が挙げられる。

【0517】

本開示のｒＡＡＶベクターを本明細書に開示された方法に従って生産および精製した後、それらを滴定して（例えば、試料中のｒＡＡＶベクターの量を定量することができる）、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有するヒト対象などの、対象への投与のための組成物を調製することができる。ｒＡＡＶベクターの滴定を、当業界で公知の方法を使用して達成することができる。

【0518】

一部の実施形態では、ベクターゲノムを含有する粒子およびベクターゲノムを含有しない「空」カプシドを含む、ウイルス粒子の数を、電子顕微鏡、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって決定することができる。そのようなＴＥＭに基づく方法は、試料中のベクター粒子（または野生型ＡＡＶの場合、ウイルス粒子）の数を提供することができる。一部の実施形態では、ベクターゲノムを含有する粒子（全カプシド）、およびベクターゲノムを含有しない「空」カプシドの量を、電荷検出質量分析、分析的超遠心分離（ＡＵＣ）、ならびに／またはＡ２６０／Ａ２８０比を決定するための２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定することができる。

【0519】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを、ベクターゲノム中の配列、例えば、ＩＴＲ配列（例えば、配列番号５もしくは配列番号６）、および／または導入遺伝子中の配列（もしくは調節エレメント）に対するプライマーを使用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して滴定することができる。ベクターゲノムの配列を含有するプラスミドなどの、既知の濃度の標準の希釈液に対して同時にｑＰＣＲを実施することにより、マイクロリットルまたはミリリットルなどの単位体積あたりのベクターゲノム（ＶＧ）の数として、ｒＡＡＶベクターの濃度を算出することができる標準曲線を生成することができる。例えば、ＳＥＣまたはＥＬＩＳＡによって測定されたベクター粒子の数と、試料中のベクターゲノムの数とを比較することによって、空カプシドのパーセンテージを見積もることができる。ベクターゲノムは治療的導入遺伝子を含有するため、ベクター試料のｖｇ／ｋｇまたはｖｇ／ｍｌは、一部が空であり、ベクターゲノムを含有しないベクター粒子の数よりも、対象が受けるであろうベクターの治療量を示すことができる。保存溶液中のｒＡＡＶベクターゲノムの濃度が決定されたら、それを、対象（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する対象）への投与のための組成物（例えば、製剤原料）の調製における使用のための好適な緩衝液中で希釈するか、または緩衝剤に対して透析することができる。

【0520】

ＶＩ．親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターの精製
親和性クロマトグラフィー法に基づく新規精製戦略を使用して、高純度ＡＡＶベクター調製物を生成することができる。一部の実施形態では、高純度ｒＡＡＶベクター調製物を生成するための方法が使用される。一部の実施形態では、そのような方法は、ＡＡＶ血清型および／またはカプシドのキメラ現象に関して普遍的である。一部の実施形態では、種々のＡＡＶ血清型の、および／またはキメラカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含むＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに組換え生産されたバリアント（例えば、挿入、欠失および置換などを有するカプシドバリアント）、例えば、ＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５と称するバリアント）に由来する高純度ｒＡＡＶベクター調製物を生成するための方法が使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ９ベクターを精製するための方法を適用することができる。本明細書に記載されるような、拡大可能な製造技術を使用して、疾患（例えば、ＤＭＤ）を処置するための医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）の臨床および商業用ｒＡＡＶベクターを製造することができる。

【0521】

一部の例では、遺伝子療法のための組換えＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の生産には、ベクターを産生した宿主細胞（例えば、限定されるものではないが、宿主細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、膜およびオルガネラを含む宿主細胞デブリ）からのｒＡＡＶベクターの精製、ならびに完全なベクターゲノムを含有しない（例えば、中間および／または空カプシド）、かくして、治療的導入遺伝子を含まないカプシドの除去が必要である。

【0522】

そのような精製方法は一般に、カラム精製、低速遠心分離、超遠心分離、正常流濾過、限外濾過／透析濾過、またはこれらの方法の任意の組合せによる、例えば、宿主細胞の溶解、宿主細胞タンパク質および核酸の沈降、宿主細胞タンパク質および核酸からのＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の分離、ならびに空カプシドからの全ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ９）の分離を含む複数のステップを含む。カラム精製は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン、陽イオン）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィーを含んでもよい。遠心分離法は、例えば、超遠心分離または低速遠心分離（例えば、固体の除去および清澄化のため）を含んでもよい。濾過法は、限定されるものではないが、透析濾過、深層濾過、ノミナル濾過および／または絶対濾過を含んでもよい。

【0523】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを、親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードすること、および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、親和性溶出液を生産することによる、親和性クロマトグラフィーによって、ｒＡＡＶベクターを精製することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶａｖｉａｎ、ＡＡＶｂａｔ、ＡＡＶｂｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｃａｎｉｎｅ、ＡＡＶｅｑｕｉｎｅ、ＡＡＶｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ４、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ５、ＡＡＶｓｎａｋｅ ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９であってもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ミニ－ジストロフィン導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、ミニ－ジストロフィン導入遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ミニ－ジストロフィン導入遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸を含む。

【0524】

Ａ．親和性クロマトグラフィーカラム
一部の例では、本明細書の方法は、ｒＡＡＶベクターを精製するために、またはｒＡＡＶベクターのための精製プロセスにおけるステップとして、親和性クロマトグラフィーを使用する。親和性クロマトグラフィーは、移動相中の標的高分子に対する親和性を示す固定相を使用する。固定相は、固定相マトリックス中で結合した、またはそれに結合した高分子を含有することによって標的高分子に対する親和性を有してもよく、結合した高分子は、標的高分子に対する特異的結合親和性を有する。親和性クロマトグラフィーは、移動相中の物質（例えば、ＡＡＶカプシド、ＤＮＡ、タンパク質、高分子量種、アミノ酸）を分離するために高分子間の特異的な高分子結合親和性を用いる。

【0525】

親和性クロマトグラフィー固定相は、クロマトグラフィーカラム中に存在してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、９９７、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、３００００、４００００、５００００、または６００００ｍＬ（またはそれに由来する任意の範囲）の体積を有してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約２６７０ｍＬの体積を有してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約１７，６６３ｍＬの体積を有してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約２５，６１０ｍＬの体積を有してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約、少なくとも約、または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００ｃｍ（またはそれに由来する任意の範囲）の内径を有してもよい。一部の実施形態では、カラムは、約、少なくとも約、または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００ｃｍ（またはそれに由来する任意の範囲）の床高を有してもよい。

【0526】

Ｂ．固定相
一部の実施形態では、固定相は、ＡＡＶカプシドに結合する親和性クロマトグラフィー固定相である。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相は、カラム中にある。一部の実施形態では、使用される固定相は、ＡＡＶカプシドに結合することができる高分子を含有する。一部の実施形態では、使用される固定相は、ＡＡＶカプシドに結合する１つまたは複数の抗原結合性ドメインを含有する。一部の実施形態では、使用される固定相は、ＡＡＶカプシドに結合することができる１つまたは複数の抗体を含有する。ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶベクターのカプシドであってもよい。ＡＡＶカプシドは、種々のＡＡＶ血清型のものである、および／またはキメラカプシドに由来してもよい（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＨＳＣ１５／１７、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶａｖｉａｎ、ＡＡＶｂａｔ、ＡＡＶｂｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｃａｎｉｎｅ、ＡＡＶｅｑｕｉｎｅ、ＡＡＶｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｎｏｎ－ｐｒｉｍａｔｅ、ＡＡＶｏｖｉｎｅ、ＡＡＶｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ４、ＡＡＶｐｏｒｃｉｎｅ５、ＡＡＶｓｎａｋｅ ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶｖ３３、ＡＡＶｖ３７、ＡＡＶｖ４０、ＡＡＶｖ６７、ＡＡＶｖ７０、ＡＡＶｖ７２、ＡＡＶｖ８４、ＡＡＶｖ８６、ＡＡＶｖ８７およびＡＡＶｖ９０）。一部の実施形態では、固定相は、ｒＡＡＶ９カプシドに結合する親和性クロマトグラフィー固定相である。一部の実施形態では、固定相は、ＡＡＶカプシドに結合する高分子（例えば、抗体）を含む。一部の実施形態では、使用される固定相は、ｒＡＡＶ９カプシドに結合することができる抗体を含有する。

【0527】

一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体など、またはその組合せであってもよい。一部の実施形態では、抗体は、ラクダ科由来単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）であってもよい。

【0528】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相マトリックスは、樹脂である。一部の例では、マトリックスは、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックス、もしくは多孔質ガラス、またはその組合せである。一部の例では、マトリックスは、多孔質ポリスチレンジビニルベンゼンビーズを含む。一部の例では、ポリスチレンジビニルベンゼンビーズは、ラクダ科由来単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ_ＨＨ）リガンドで改変される。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９親和性樹脂である。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ親和性樹脂である。

【0529】

一部の態様では、固定相は、固定相１ｍＬあたり１．０ｘ１０^１３ｖｇを超える動的結合容量を有する。一部の態様では、固定相は、固定相１ｍＬあたり、約、少なくとも約、または多くても約１．０ｘ１０^１３、２．０ｘ１０^１３、３．０ｘ１０^１３、４．０ｘ１０^１３、５．０ｘ１０^１３、６．０ｘ１０^１３、７．０ｘ１０^１３、８．０ｘ１０^１３、９．０ｘ１０^１３、１．０ｘ１０^１４、２．０ｘ１０^１４、３．０ｘ１０^１４、４．０ｘ１０^１４、５．０ｘ１０^１４、６．０ｘ１０^１４、７．０ｘ１０^１４、８．０ｘ１０^１４、９．０ｘ１０^１４、または１．０ｘ１０^１５ｖｇまたはそれ以上（またはそれに由来する任意の範囲）の動的結合容量を有する。

【0530】

Ｃ．親和性クロマトグラフィー固定相のローディング
親和性クロマトグラフィーによってＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）を精製する方法は、ＡＡＶベクターを含む溶液、例えば、精製しようとする物質を、クロマトグラフィーカラム中の親和性クロマトグラフィー固定相上にロードするステップを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを含む溶液は、宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを含む。ロード（例えば、ＡＡＶベクターを含む溶液）をカラム上に重力供給すること、および／またはロードをカラム上にポンプで注入することによって、ローディングのステップを実施することができる。

【0531】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む溶液を、約、少なくとも約、または多くても約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、１７０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０または８００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の直線速度で親和性クロマトグラフィー固定相上にロードすることができる。一部の実施形態では、固定相へのＡＡＶベクターを含む溶液のローディングを、溶液のカラム体積（ＣＶ）あたり、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ（またはそれに由来する任意の範囲）の固定相上での滞留時間で実施することができる。一部の実施形態では、固定相上にロードされるＡＡＶベクターを含む溶液の量は、約、少なくとも約、または多くても約０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）である。

【0532】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む溶液は、本明細書で使用される場合、宿主細胞培養物からの溶解した宿主細胞の沈降化後に収集される溶液を指す、「細胞溶解物に由来する上清」（「清澄化された溶解物」としても知られる）を含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む溶液は、本明細書で使用される場合、宿主細胞の細胞溶解の結果得られる溶液であって、軟凝集、深層濾過、および／またはノミナル濾過を受けた溶液を指す、「回収後溶液」を含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを、少なくとも１つの他の精製または処理ステップ（例えば、細胞溶解、軟凝集、濾過、希釈、ｐＨ調整、クロマトグラフィー）を受けている溶液から精製することができる。一部の実施形態では、清澄化された溶解物は、少なくとも１つの他の精製または処理ステップ（例えば、細胞溶解、軟凝集、濾過、希釈、ｐＨ調整、クロマトグラフィー）を受けている。一部の実施形態では、回収後溶液は、少なくとも１つの他の精製または処理ステップ（例えば、細胞溶解、軟凝集、濾過、希釈、ｐＨ調整、クロマトグラフィー）を受けている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを含む溶液（例えば、親和性クロマトグラフィー固定相にロードされた溶液）は、少なくとも１つの他の精製または処理ステップ（例えば、細胞溶解、軟凝集、濾過、希釈、ｐＨ調整、クロマトグラフィー）から得られる。

【0533】

一部の実施形態では、宿主細胞培養物は、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、ＨＴ１０８０、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ、およびＣＨＯ細胞の群から選択される宿主細胞を含んでもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であってもよい。

【0534】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィー固定相上にロードされるｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ９）を含む溶液を、固定相１ｍＬあたり、約、少なくとも約、または多くても約１ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、１．５ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、２．５ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、３．５ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、４．５ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、５．５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、６．５ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、７．５ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、８．５ｘ１０^１３、９ｘ１０^１３、９．５ｘ１０^１３、１ｘ１０^１４、１．５ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、２．５ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、３．５ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、４．５ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、５．５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、６．５ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、７．５ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、８．５ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、９．５ｘ１０^１４、または１ｘ１０^１５ウイルスゲノム（ｖｇ）（またはそれに由来する任意の範囲）のチャレンジを達成するために固定相上にロードすることができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを含む溶液は、固定相１ｍＬあたり１ｘ１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）から固定相１ｍＬあたり１．５ｘ１０^１４ｖｇのチャレンジを達成するために固定相上にロードされる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む溶液を、固定相１ｍＬあたり５ｘ１０^１３以下のｖｇのチャレンジを達成するために固定相上にロードすることができる。

【0535】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）を精製する方法は、ＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードする前に固定相の使用前洗浄をさらに含む。一部の実施形態では、使用前洗浄は、固定相保存溶液（例えば、エタノール）を除去し、任意選択により、平衡化のための固定相を調製する。一部の実施形態では、使用前洗浄は、固定相への水（例えば、注射用水）の適用および固定相からの水の全部または一部の除去を含む。一部の実施形態では、約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される。一部の実施形態では、使用前洗浄は、カラム中の固定相の中を上向きに流動する。

【0536】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）を精製する方法は、ＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードする前に固定相の使用前浄化をさらに含む。一部の実施形態では、使用前浄化は、固定相へのリン酸（例えば、約０．１Ｎ～約０．２Ｎのリン酸）を含む溶液の適用および固定相からのリン酸を含む溶液の全部または一部の除去を含む。一部の実施形態では、使用前浄化溶液は、１．９のｐＨで約０．１３２Ｎリン酸を含む。一部の実施形態では、約２ＣＶ～約１０ＣＶ、例えば、約２ＣＶ、約３ＣＶ、約４ＣＶ、約５ＣＶ、約６ＣＶ、約７ＣＶ、約８ＣＶ、約９ＣＶまたは約１０ＣＶの溶出前浄化溶液が固定相に適用される。一部の実施形態では、使用前浄化溶液の固定相への適用は、バイオバーデンを減少させる。一部の実施形態では、使用前浄化溶液は、カラム中の固定相の中を上向きに流動する。

【0537】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）を精製する方法は、固定相の平衡化をさらに含む。一部の実施形態では、固定相は、固定相上にロードしようとする溶液、例えば、清澄化された溶解物、および精製しようとする分子、例えば、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ９）と適合する緩衝液の適用によって平衡化される。特に、清澄化された溶解物、およびそれが含有するｒＡＡＶベクターと適合する緩衝液は、適合性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）および／または適合性導電率を有する。

【0538】

親和性クロマトグラフィーによってＡＡＶベクターを精製する場合、１回または複数回、例えば、２、３、４、５、６回以上、固定相の平衡化を実施することができる。一部の実施形態では、平衡化を、ｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前、ｉｉ）固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後、ｉｉｉ）溶出前洗浄の適用前、ｉｖ）溶出前洗浄の適用後、ｖ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前、ｖｉ）溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させた後、および／またはｖｉｉ)固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させる前に実施することができる。一部の実施形態では、平衡化は、固定相への緩衝溶液の適用および固定相からの緩衝溶液の全部または一部の除去を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝溶液は、Ｔｒｉｓまたは酢酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、平衡化のための緩衝溶液は、７～８のｐＨ（例えば、約７．５のｐＨ）の約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、約１００ｍＭ）を含む。一部の実施形態では、緩衝溶液は、５～６のｐＨ（例えば、約５．６のｐＨ）の約１００ｍＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム（例えば、約１５３ｍＭの酢酸ナトリウム）を含む。一部の実施形態では、緩衝溶液は、ｐＨ約７．５の約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む。一部の実施形態では、緩衝溶液は、ｐＨ約５．６の約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。

【0539】

一部の実施形態では、固定相の１回目の平衡化は、任意選択により、固定相および周囲の水性相を、ロード溶液と適合性にするために、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードする前に実施される。

【0540】

一部の実施形態では、固定相の２回目の平衡化は、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前、および任意選択により、溶出前洗浄の前に実施される。「洗浄」と称することができる、そのような２回目の平衡化は、より強力な洗浄または溶出緩衝液の適用前に、固定相から、および固定相の小孔内から、未結合の不純物を除去する。

【0541】

一部の実施形態では、固定相の３回目の平衡化は、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前、および任意選択により、溶出前洗浄の後に実施される。一部の実施形態では、固定相の４回目の平衡化は、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させる前に実施される。

【0542】

一部の実施形態では、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の平衡化緩衝溶液が固定相に適用される。一部の実施形態では、平衡化緩衝溶液は、約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３４５、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００または２０００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の流動速度で固定相に適用される。一部の実施形態では、平衡化緩衝溶液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．１、４．２、４．３、４．３５、４．４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の滞留時間で固定相に適用される。

【0543】

Ｄ．溶出前洗浄
一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーを用いたＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）の精製方法は、溶出前洗浄の使用を含んでもよい。溶出前洗浄は、溶出緩衝液を用いた固定相からのＡＡＶベクターの溶出の前以外に、ＡＡＶベクターをロードした固定相への溶出前洗浄溶液の適用を含んでもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、親和性溶出液を生産するために、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードした後および溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させる前に固定相に適用される。一部の例では、溶出前洗浄は、溶出緩衝液を用いた固定相からのＡＡＶベクターの溶出前に、固定相から少なくとも部分的に、または完全に除去される。有利には、溶出前洗浄は、生成物（例えば、ｒＡＡＶベクター）を溶出させる前に固定相から宿主細胞タンパク質を溶出させることによって、生成物を含む宿主細胞タンパク質の溶出を回避するであろう。

【0544】

一部の実施形態では、溶出前洗浄は、ｉ）固定相から結合した不純物を除去する、もしくは十分に除去する；ｉｉ）固定相に結合したＡＡＶを維持する、もしくは十分に維持する；および／またはｉｉｉ）宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの、ＡＡＶタンパク質以外のタンパク質の除去を改善するために低下したｐＨを有してもよい。

【0545】

一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、溶媒および緩衝剤を含んでもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、溶媒および緩衝剤を含む水性溶液であってもよい。一部の実施形態では、溶媒は、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、溶媒は、エタノールであってもよい。一部の態様では、溶出前洗浄溶液中の、エタノールなどの溶媒の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ｗｔ．％（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出前緩衝液は、溶媒および緩衝剤を含む。一部の実施形態では、溶出前緩衝液は、エタノールである溶媒を含む。一部の実施形態では、溶出前緩衝液は、約１７％または約１７．５％のエタノールを含む。

【0546】

一部の実施形態では、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、ビシン、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液中の、酢酸ナトリウムなどの緩衝剤の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の酢酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、１０ｍＭ～５００ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤は、酢酸ナトリウムである。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約１５０または約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。

【0547】

一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約、少なくとも約、または多くても約３、３．５、４、４．５、５、５．５、５．６、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを有してもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約５～約６のｐＨを含む。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約５．６のｐＨを含む。

【0548】

一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０％（またはそれに由来する任意の範囲）のエタノール；ｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、または３０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の塩化ナトリウム；ｉｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約５、１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）のＴｒｉｓ；およびｉｖ）約、少なくとも約、または多くても約５、５．５、５．６、６、６．５、７、７．５、８、８．５、または９（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを含んでもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０％（またはそれに由来する任意の範囲）のエタノール；ｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、または３０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の塩化ナトリウム；ｉｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の酢酸ナトリウム；およびｉｖ）約、少なくとも約、または多くても約４、４．５、５、５．５、５．６、６、６．５、７、７．５、または８（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを含んでもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０％（またはそれに由来する任意の範囲）のエタノール；ｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の酢酸ナトリウム；およびｉｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約４、４．５、５、５．５、５．６、６、６．５、７、７．５、または８（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを含んでもよい。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、５～６のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約１７．５％のエタノール、約１５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約５．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約１７％のエタノール、約１５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約５．６のｐＨを有する。

【0549】

一部の実施形態では、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の溶出前洗浄溶液が固定相に適用される。一部の実施形態では、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５～５．５ＣＶの溶出前洗浄溶液が、固定相に適用される。一部の実施形態では、約５ＣＶの溶出前洗浄溶液が固定相に適用される。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３４５、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００または２０００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の流動速度で固定相に適用される。一部の実施形態では、溶出前洗浄溶液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．１、４．２、４．３、４．３５、４．４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の滞留時間で固定相に適用される。

【0550】

一部の実施形態では、溶出前洗浄は、固定相からの除去後、２ｍｍの経路長を使用する場合、約、少なくとも約、または多くても約１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｍＡＵのＡ２８０ピーク高さを有する。

【0551】

Ｅ．親和性クロマトグラフィーカラムの溶出
一部の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターを、溶出緩衝液の固定相への適用によって固定相から溶出させることができる。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、固定相から残留不純物を溶出させない、もしくは優先的に溶出させない、および／または親和性溶出液中に比較的少ない沈降物をもたらす、もしくは沈降物をもたらさない。一部の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターは、溶出前洗浄が固定相に適用された後、溶出前洗浄が固定相から少なくとも部分的に除去された後、または固定相を溶出前洗浄と接触させることなく、固定相から溶出される。

【0552】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、以下の特性：ｉ）固定相からｒＡＡＶなどのＡＡＶを溶出させる；ｉｉ）固定相から残留不純物を溶出させない；ｉｉｉ）親和性溶出液の沈降をもたらさない；ｉｖ）親和性ｖｇ回収率％を増加させる、および／または最大化する；ｖ）溶出液中の、ｒＡＡＶ９などのｒＡＡＶベクターの、陰イオン交換（ＡＥＸ）固定相への結合を阻害しない、または十分に阻害しない、のうちのいずれか１つ、その任意の組合せ、または全部を有する。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸イオンなどの三価陰イオンを含有しない。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、その後の精製ステップにおいて、溶出液中のｒＡＡＶ９ベクターなどのｒＡＡＶベクターのＡＥＸ固定相への結合を阻害しない、または十分に阻害せず、溶出液中の、例えば、約、少なくとも約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のｒＡＡＶベクターがＡＥＸ固定相に結合する。

【0553】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、塩、アミノ酸、緩衝剤、またはその任意の組合せを含む。

【0554】

一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウムおよびその組合せであってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩は、塩化マグネシウムであってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩化マグネシウムなどの塩の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩化マグネシウムの濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、５ｍＭ～１５０ｍＭの塩を含み、任意選択により、塩は、塩化マグネシウムである。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭの塩化マグネシウムを含む。

【0555】

一部の実施形態では、溶出緩衝液中のアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、シトルリン、グリシン、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中のアミノ酸は、グリシンであってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中のグリシンなどのアミノ酸の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭのアミノ酸を含み、任意選択により、アミノ酸は、グリシンである。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約１００ｍＭのグリシンを含む。

【0556】

一部の態様では、溶出緩衝液中の緩衝剤は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、ビシン、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムなどの緩衝剤の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、約、少なくとも約、または多くても約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、７５ｍＭ～２５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤は、酢酸ナトリウムである。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約１４８ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。

【0557】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、５．６、６、６．５、７、７．５、または８（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを有してもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、２．５～３．５、例えば、約３．０のｐＨを有する。

【0558】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、ｉ）約、少なくとも約、または多くても約５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）のグリシン；ｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２５０ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）のＭｇＣｌ_２；ｉｉｉ）約、少なくとも約、または多くても約０、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、または３００ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）の酢酸ナトリウム；およびｉｖ）約、少なくとも約、または多くても約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを含んでもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約１００ｍＭのグリシン、約２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約１４８ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約３．０のｐＨを有する。

【0559】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターの、ＡＥＸ固定相への結合と競合する陰イオンを含有しない。一部の態様では、溶出緩衝液は、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターの、ＡＥＸ固定相への結合と競合する三価陰イオンを含有しない。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸陰イオンを含有しない。

【0560】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｍＳ／ｃｍ（またはそれに由来する任意の範囲）の導電率を有してもよい。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、１ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍ、１ｍＳ／ｃｍ～３０ｍＳ／ｃｍまたは２０ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

【0561】

一部の実施形態では、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の溶出緩衝液が固定相に適用される。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００または２０００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の流動速度で固定相に適用される。一部の実施形態では、約２ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの溶出緩衝液が固定相に適用される。一部の実施形態では、約５ＣＶの溶出緩衝液が固定相に適用される。

【0562】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の滞留時間で固定相に適用される。

【0563】

一部の実施形態では、固定相からのＡＡＶベクターの溶出は、固定相にロードされたｒＡＡＶベクターの約、少なくとも約、または多くても約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはそれに由来する任意の範囲）を除去する。

【0564】

一部の例では、溶出液、または溶出液の一部１ｍｌあたりのウイルスゲノム（ｖｇ）の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約１．０ｘ１０^１３、２．０ｘ１０^１３、３．０ｘ１０^１３、４．０ｘ１０^１３、５．０ｘ１０^１３、６．０ｘ１０^１３、７．０ｘ１０^１３、８．０ｘ１０^１３、９．０ｘ１０^１３、１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍｌ（またはそれに由来する任意の範囲）である。

【0565】

一部の例では、標的ＡＡＶベクターに由来するタンパク質である、溶出液、または溶出液の一部における総タンパク質の純度％は、約、少なくとも約、または多くても約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはそれに由来する任意の範囲）である。

【0566】

一部の例では、溶出液、または溶出液の一部における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量は、約、少なくとも約、または多くても約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、もしくは２００００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ（もしくはそれに由来する任意の範囲）または約、少なくとも約、または多くても約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、もしくは５００ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ（もしくはそれに由来する任意の範囲）である。

【0567】

一部の例では、溶出液、または溶出液の一部における宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）の量は、約、少なくとも約、または多くても約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、もしくは５００ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ（もしくはそれに由来する任意の範囲）または約、少なくとも約、または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ｐｇ／１ｘ１０^９ｖｇ（もしくはそれに由来する任意の範囲）である。

【0568】

一部の例は、溶出液、または溶出液の一部のＡ２６０／Ａ２８０比は、約、少なくとも約、または多くても約０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２（またはそれに由来する任意の範囲）である。

【0569】

一部の例では、親和性溶出液の感染性比は、約、少なくとも約、または多くても約８０００、１００００、１１０００、１２０００、１２９６２、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１７５８１、１８０００、１９０００、２００００、２０３４５、２２０００、２５０００、または３００００ｖｇ／ＩＵ（またはそれに由来する任意の範囲）である。

【0570】

Ｆ．親和性溶出液の収集
一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーを用いたｒＡＡＶ９ベクターなどのｒＡＡＶベクターの精製方法は、固定相からの親和性溶出液の収集を含んでもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液を、単一の画分として収集することができる。一部の実施形態では、親和性溶出液を、１つより多い画分として収集することができる。一部の態様では、１つより多い親和性画分の少なくともいくらか、および／または一部をプールすることができる。

【0571】

一部の態様では、親和性溶出液の収集を、２ｍｍの経路長を使用してＡ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｍＡＵ（またはそれに由来する任意の範囲）で開始することができる。一部の態様では、親和性溶出液の収集を、２ｍｍの経路長を使用してＡ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２．５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍＡＵ（またはそれに由来する任意の範囲）で停止することができる。一部の態様では、親和性溶出液の収集を、Ａ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２．５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍＡＵ／５ｍｍ経路長（またはそれに由来する任意の範囲）で開始することができる。一部の態様では、親和性溶出液の収集を、Ａ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍＡＵ／５ｍｍ経路長（またはそれに由来する任意の範囲）で停止することができる。一部の態様では、親和性溶出液の収集を、Ａ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｍＡＵ／ｍｍ（またはそれに由来する任意の範囲）で開始し、親和性溶出液の収集を、Ａ２８０にて約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｍＡＵ／ｍｍ（またはそれに由来する任意の範囲）で停止することができる。一部の例では、収集は、吸光度／時間の勾配に基づいて開始および停止される。一部の例では、開始時間でのｍＡＵ変化／ｍｉｎは、開始時間でのｍＡＵ変化／ｍｉｎ＋１ｓｅｃより小さく、停止時間でのｍＡＵ変化／ｍｉｎは、停止時間でのｍＡＵ変化／ｍｉｎ＋１ｓｅｃより大きく、収集は、開始時間に開始され、収集は停止時間に停止される。一部の例では、収集は、所定の時間または溶出液体積で開始および／または停止される。

【0572】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターを精製する方法は、カラム中の親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードするステップ；１５％～２５％のエタノール、１００ｍＭ～２００ｍＭの酢酸ナトリウム、および５～６のｐＨを含む溶出前洗浄溶液を固定相に適用するステップ；ならびに５０ｍＭ～１５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭ～１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ～２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、および２．５～３．５のｐＨを含む溶出緩衝液を用いて固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させて、ｒＡＡＶベクターを含有する親和性溶出液を生産するステップを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを精製する方法は、親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを精製する方法は、第１の再生緩衝液の後に、固定相と第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含み、第２の再生緩衝液は、第１の再生緩衝液と異なる。

【0573】

一部の実施形態では、固定相から収集される親和性溶出液の体積は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍＬ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、固定相から収集される親和性溶出液の体積は、約、少なくとも約、または多くても約０．０１、０．１、０．５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、０．１ＣＶ～１０ＣＶの親和性溶出液が、固定相から収集される。

【0574】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液のｖｇ回収率％は、約、少なくとも約、または多くても約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％（またはそれに由来する任意の範囲）である。一部の実施形態では、親和性溶出液のｖｇ回収率％を、ｑＰＣＲによって測定することができる。一部の実施形態では、ｑＰＣＲは、導入遺伝子配列のコピーを測定する。一部の実施形態では、導入遺伝子配列は、配列番号１の核酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｑＰＣＲは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のコピーを測定する。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号５～８のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、親和性溶出液のｖｇ回収率％は、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定された場合、５０％～１００％である。

【0575】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液は、約、少なくとも約、または多くても約１．０ｘ１０^１２、５．０ｘ１０^１２、１．０ｘ１０^１３、２．０ｘ１０^１３、３．０ｘ１０^１３、４．０ｘ１０^１３、５．０ｘ１０^１３、６．０ｘ１０^１３、７．０ｘ１０^１３、８．０ｘ１０^１３、９．０ｘ１０^１３、１．０ｘ１０^１４、２．０ｘ１０^１４、３．０ｘ１０^１４、４．０ｘ１０^１４、５．０ｘ１０^１４、６．０ｘ１０^１４、７．０ｘ１０^１４、８．０ｘ１０^１４、９．０ｘ１０^１４、または１．０ｘ１０^１５ｖｇ／ｍL（またはそれに由来する任意の範囲）を含んでもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液のｖｇ／ｍLを、ｑＰＣＲによって測定することができる。一部の実施形態では、ｑＰＣＲは、導入遺伝子配列のコピーを測定する。一部の実施形態では、導入遺伝子配列は、配列番号１の核酸配列を含むか、またはそれからなってもよい。一部の実施形態では、ｑＰＣＲは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のコピーを測定する。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号５～８のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、親和性溶出液のｖｇ／ｍLは、任意選択により、ｑＰＣＲによって測定された場合、約１．０ｘ１０^１２ｖｇ／ｍL～約１．０ｘ１０^１４ｖｇ／ｍLである。

【0576】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーカラムから溶出液を収集するステップは、カラムから収集された溶出液の２６０ｎｍでの吸光度(Ａ２６０）および／または２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）の測定を含んでもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液の吸光度（例えば、Ａ２６０またはＡ２８０での）の測定は、溶出液の流れに従って実施される。一部の実施形態では、収集される親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は、０．８より大きくてもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は、約、少なくとも約、または多くても約０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比を、同時に吸光度を検出しながらサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定することができる。

【0577】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液の純度％は、約、少なくとも約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはそれに由来する任意の範囲）である。一部の実施形態では、親和性溶出液の純度％は、任意選択により、ＳＥＣまたは非還元的逆相ＨＰＬＣによって測定した場合、約９５％～約１００％である。一部の実施形態では、親和性溶出液の純度％を、逆相ＨＰＬＣによって測定することができる。一部の実施形態では、純度％を、ＳＥＣによって測定することができる。一部の実施形態では、親和性溶出液中のＡＡＶカプシドを、非還元形態のＨＰＬＣカラムにロードして、親和性溶出液中での純度％を測定することができる。親和性溶出液中のｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターの純度％は、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターを含む溶液中の、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターの純度％と比較して高くてもよい。

【0578】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液中の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）の量は、親和性溶出液中で、約、多くても約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／１．０ｘ１０^１４ｖｇ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、収集される親和性溶出液中のＨＣＤＮＡの量は、親和性溶出液中で、約、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｐｇ／１．０ｘ１０^９ｖｇ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。親和性溶出液中のＨＣＤＮＡの量を、ｑＰＣＲによって測定することができる。親和性溶出液中のｖｇあたりのＨＣＤＮＡの量は、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターを含む溶液中のｖｇあたりのＨＣＤＮＡの量と比較して少なくてもよい。

【0579】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液中の宿主細胞（ＨＣＰ）の量は、約、多くても約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、または２００００ｎｇ／１．０ｘ１０¹⁴ｖｇ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、収集される親和性溶出液中のＨＣＰの量は、約、多くても約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｐｇ／１．０ｘ１０^９ｖｇ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、親和性溶出液中のＨＣＰの量を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および／または銀染色によって測定することができる。親和性溶出液中のｖｇあたりのＨＣＰの量は、ｒＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターを含む溶液中のｖｇあたりのＨＣＰの量と比較して少なくてもよい。

【0580】

一部の実施形態では、収集される親和性溶出液の感染性比は、約、少なくとも約、または多くても約８０００、１００００、１１０００、１２０００、１２９６２、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１７５８１、１８０００、１９０００、２００００、２０３４５、２２０００、２５０００、または３００００ｖｇ／ＩＵ（またはそれに由来する任意の範囲）である。一部の実施形態では、親和性溶出液の感染性比を、細胞に基づくアッセイによって測定することができる。一部の実施形態では、親和性溶出液の感染性比を、ｒＡＡＶベクターを含む溶液の感染性比と比較して増加させることができる。

【0581】

Ｇ．親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターの精製のために固定相を再生する方法
親和性溶出液の少なくとも１つの画分および／または少なくとも一部の親和性溶出および収集の後、ｒＡＡＶ９親和性精製実行などのさらなるｒＡＡＶベクターのローディングおよび溶出のための親和性クロマトグラフィーカラム媒体を調製するための追加のステップを実施することができる。そのようなステップは、例えば、浄化、平衡化、再生、フラッシュおよび／または保存を含んでもよい。当業者であれば、１つまたは複数のステップを、様々な順序および頻度で実施することができることを理解するであろう。一部の実施形態では、親和性溶出液の少なくとも１つの画分および／または少なくとも一部の親和性溶出および収集の後、親和性クロマトグラフィーカラム中の固定相は、ｒＡＡＶ９親和性精製実行などのさらなるｒＡＡＶのローディングおよび溶出のために再生される。当業者であれば、精製されたｒＡＡＶベクターを含む少なくとも１つの溶出液画分の親和性溶出および収集の後に固定相を再生する方法が、ｒＡＡＶベクタータンパク質を含む不純物を、固定相から除去する方法を含むことも理解するであろう。

【0582】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターの精製のために固定相を再生する方法が記載される。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターの精製のために固定相を再生する方法は、固定相からのｒＡＡＶベクターの溶出および収集の後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることを含む。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターの精製のために固定相を再生する方法は、親和性溶出液の少なくとも一部を取得した後、固定相と第１の再生緩衝液とを接触させることを含む。一部の実施形態では、固定相上で実行することができる精製サイクルの数は、第１の再生緩衝液と接触させていない固定相上で実行することができる精製サイクルの数と比較して増加している。一部の実施形態では、精製サイクルは、固定相上にｒＡＡＶベクターを含む溶液をロードすること、および固定相からｒＡＡＶベクターを溶出させることを含む。

【0583】

一部の実施形態では、第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数は、グアニジンＨＣｌを含む緩衝液と接触させた固定相と比較して増加している。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数は、約、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数は、８以上である。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液と接触させた固定相上で実行することができる精製サイクルの数は、１０以上である。一部の実施形態では、精製サイクルは、固定相上への１回のロードおよび固定相の１回の溶出を含み、ここで、固定相からの親和性溶出液のｖｇ回収率％は、固定相上にロードされた親和性溶出液の９０％以上である。

【0584】

一部の実施形態では、実行することができる精製サイクルは、固定相から溶出液中へのｖｇ回収率％によって決定される。一部の実施形態では、実行することができる精製サイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率％と比較して、減少していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて減少していない現在のサイクルからのｖｇ回収率％を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率％は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のｖｇ回収率％と比較して１０％を超えて減少していない。

【0585】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルのフロースルー中の未結合のＡＡＶベクターの量と比較して増加していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて増加していない現在のサイクルのフロースルー中の未結合のＡＡＶベクターの量を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルのフロースルー中の未結合のｒＡＡＶベクターの量と比較して１０％を超えて増加していない。

【0586】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルのカラム圧力と比較して、増加していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて増加していない現在のサイクルのカラム圧力を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルのカラム圧力は、０．４ＭＰａ以下である。

【0587】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルからの溶出液のカプシド純度％と比較して、減少していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて減少していない現在のサイクルからの溶出液のカプシド純度％を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の純度％は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の純度％と比較して１０％を超えて減少していない。

【0588】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルからの溶出液中のＨＣＰの量と比較して、増加していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて増加していない現在のサイクルからの溶出液中のＨＣＰの量を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＰの量と比較して１０％を超えて増加していない。

【0589】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルからの溶出液中のＨＣＤＮＡの量と比較して、増加していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて増加していない現在のサイクルからの溶出液中のＨＣＤＮＡの量を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液のＨＣＤＮＡの量と比較して１０％を超えて増加していない。

【0590】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、そのカラムを使用する最初の精製サイクルからの溶出液のＡ２６０／Ａ２８０と比較して、減少していない、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％（もしくはそれに由来する任意の範囲）を超えて減少していない現在のサイクルからの溶出液のＡ２６０／Ａ２８０を有する。一部の実施形態では、固定相と、第１の再生緩衝液とを接触させた後の最後の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０は、固定相を第１の再生緩衝液と接触させる前の最初の精製サイクルからの溶出液の平均Ａ２６０／Ａ２８０と比較して１０％を超えて減少していない。

【0591】

一部の実施形態では、実行することができるサイクルは、約、多くても約０．２２２、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、または０．７１３ｍＰａ（またはそれに由来する任意の範囲）である、固定相の親和性溶出の経過にわたって一定の流量を使用するカラム圧力の最大変化を有する。

【0592】

一部の態様では、親和性クロマトグラフィー固定相を再生する方法は、固定相と、１～４のｐＨの酸を含む第１の再生緩衝液とを接触させることを含み、不純物が固定相から除去される。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、酸を含む。一部の態様では、第１の再生緩衝液中の酸の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２Ｎ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液中の酸は、リン酸および／または酢酸であってもよい。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液中の酸は、リン酸である。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液中の酸はリン酸であり、リン酸の濃度は約、少なくとも約、または多くても約０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、または０．１５Ｎ（またはそれに由来する任意の範囲）である。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、０．０５Ｎ～１．５Ｎの酸を含み、任意選択により、酸はリン酸である。一部の例では、第１の再生緩衝液のｐＨは、約、少なくとも約、または多くても約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、０．１０Ｎ～０．１５Ｎのリン酸、および１．５～２．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、ｐＨ約１．９の約０．１３２Ｎのリン酸を含む。

【0593】

一部の実施形態では、固定相を、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）の第１の再生緩衝液と接触させる。一部の実施形態では、固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させる。一部の実施形態では、固定相を、約５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させる。一部の実施形態では、固定相を、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、または１５ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）の第１の再生緩衝液と接触させた後、保持期間の後、固定相と、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、または１５ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）の第１の再生緩衝液とを再度接触させる。一部の実施形態では、保持期間は、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、１５０、３００、４５０、または６００ｍｉｎ（またはそれに由来する任意の範囲）であってもよい。一部の実施形態では、固定相を、約半分の体積の第１の再生緩衝液と接触させた後、約４５分間の保持期間の後、固定相と、第２の半分の体積の第１の再生緩衝液とを接触させる。一部の実施形態では、固定相を、約２．５ＣＶの第１の再生緩衝液と接触させた後、約４５分の保持期間の後、固定相と、約２．５ＣＶの第１の再生緩衝液とを接触させ、任意選択により、第１の再生緩衝液は、ｐＨ約１．９の約０．１３２Ｎのリン酸を含む。

【0594】

一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、固定相の中を上向きに流動する。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、固定相を含有するカラムの中を上向きに流動する。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、緩衝化された溶出液が固定相の中を流動する向きとは反対の向きに固定相の中を流動する。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、緩衝化された溶出液が固定相を含有するカラムの中を流動する向きとは反対の向きに固定相を含有するカラムの中を流動する。

【0595】

一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の流動速度で固定相に適用される。一部の実施形態では、第１の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の滞留時間で固定相に適用される。一部の実施形態では、固定相を再生する方法は、第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む。一部の実施形態では、固定相を再生する方法は、第１の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む。

【0596】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶベクターの精製のために固定相を再生する方法は、第１の再生緩衝液の後、固定相と、第２の再生緩衝液とを接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、第１の再生緩衝液とは異なる。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、界面活性剤および緩衝剤を含んでもよい。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液中の界面活性剤は、サルコシル、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、界面活性剤は、サルコシルであってもよい。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２２、２４、２６、２８、または３０％（またはそれに由来する任意の範囲）の界面活性剤、例えば、サルコシルを含んでもよい。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、０．１％～５％の界面活性剤を含み、任意選択により、界面活性剤は、サルコシルである。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約１％のサルコシルを含む。

【0597】

一部の実施形態では、第２の再生緩衝液中の緩衝剤は、Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ塩基とＴｒｉｓ－ＨＣｌとの混合物）、ＢＩＳ－Ｔｒｉｓプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、ビシン、またはその任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ｍＭの緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓを含んでもよい。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭの緩衝剤を含み、任意選択により、緩衝剤はＴｒｉｓである。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む。

【0598】

一部の実施形態では、第２の再生緩衝液のｐＨは、約、少なくとも約、または多くても約６、６．５、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．５、または９（またはそれに由来する任意の範囲）である。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液のｐＨは、約７～８である。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液のｐＨは、約７．５である。

【0599】

一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０％（またはそれに由来する任意の範囲）のサルコシル、約、少なくとも約、または多くても約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０ｍＭ（またはそれに由来する任意の範囲）のＴｒｉｓを含み、約、少なくとも約、または多くても約６、６．５、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．５、または９（またはそれに由来する任意の範囲）のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、０．１％～１．５％のサルコシル、５０ｍＭ～１５０ｍＭのＴｒｉｓ、７～８のｐＨを含む。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、ｐＨ約７．５の、約１％のサルコシル、約１００ｍＭのＴｒｉｓを含む。

【0600】

一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、固定相の中を上向きに流動する。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、固定相を含有するカラムの中を上向きに流動する。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、緩衝化された溶出液が固定相の中を流動する向きとは反対の向きに固定相の中を流動する。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、緩衝化された溶出液が固定相を含有するカラムの中を流動する向きとは反対の向きに固定相を含有するカラムの中を流動する。

【0601】

一部の実施形態では、固定相を、約、少なくとも約、または多くても約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、または３０ＣＶ（またはそれに由来する任意の範囲）の第２の再生緩衝液と接触させる。一部の実施形態では、固定相を、１ＣＶ～１０ＣＶまたは４．５ＣＶ～５．５ＣＶの第２の再生緩衝液と接触させる。一部の実施形態では、固定相を、約５ＣＶの第２の再生緩衝液と接触させる。

【0602】

一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または２０ｍｉｎ／カラム体積（ＣＶ）（またはそれに由来する任意の範囲）の滞留時間で固定相に適用される。一部の実施形態では、第２の再生緩衝液は、約、少なくとも約、または多くても約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ｃｍ／ｈ（またはそれに由来する任意の範囲）の流動速度で固定相に適用される。

【0603】

一部の実施形態では、第１の再生緩衝液、第２の再生緩衝液、またはその両方は、ｉ）第１の再生緩衝液、第２の再生緩衝液、もしくはその両方に由来する溶出液中のＡ２８０のピーク面積が、約、少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００ｍＬ^＊ｍＡＵ（もしくはそれに由来する任意の範囲）である；および／またはｉｉ）第１の再生緩衝液、第２の再生緩衝液、もしくはその両方に由来する溶出液中のＡ２６０のピーク面積が、約、少なくとも約３００、４００、５００、６００、７００もしくは８００ｍＬ^＊ｍＡＵ（もしくはそれに由来する任意の範囲）であるように、固定相から不純物を除去する。

【0604】

一部の実施形態では、固定相を再生する方法は、第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上にｒＡＡＶベクターを含む別の溶液をロードすることをさらに含む。一部の実施形態では、固定相を再生する方法は、第２の再生緩衝液の少なくとも一部を除去した後に、親和性クロマトグラフィー固定相上に第２の量の溶出前洗浄溶液を適用することをさらに含む。

【0605】

Ｈ．追加のステップ
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の精製方法は、ガードカラム、ガードフィルター、またはガードカラムとガードフィルターとの両方を用いて固定相上にロードする前に、ＡＡＶベクターを含む溶液を濾過することをさらに含む。一部の実施形態では、ガードカラムは、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、またはＣａｐｔｏ ７００ガードカラムである。一部の実施形態では、ガードフィルターは、０．２μｍのノミナルＰａｌｌ（商標）ＥＡＶプレカラムフィルターなどの、０．２μｍのノミナルフィルターである。一部の実施形態では、ガードカラムおよび／またはガードフィルターは使用されない。

【0606】

一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の精製方法は、保存溶液を置換するためのカラム媒体の使用前フラッシング、カラム媒体の使用前浄化、カラム媒体の浄化後洗浄、カラム媒体の平衡化（例えば、使用前の間、使用中における異なる溶液の適用間、および／もしくは使用後）、保存媒体の使用後適用、またはその任意の組合せから選択される追加のステップを含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加のステップを除外することができる。当業者であれば、これらのステップの順序が変化してもよく、ある特定のステップを２回以上実施してもよく、必ずしも順次実施しなくてもよいことも理解するであろう。

【0607】

一部の実施形態では、本明細書に記載の全ての範囲の一部を除外することができる。本明細書に記載される濃度％は、ｗｔ．％および／またはｖｏｌ．％濃度であってもよい。

【0608】

ＶＩＩ．均等物
前記明細書は、当業者が本開示を実施することができるために十分であると考えられる。前記説明および実施例は、本開示のある特定の例示的実施形態を詳述する。しかしながら、どんなに詳細に上記のことが本文中に現れる場合があっても、本開示を多くの方法で実施することができ、本開示が、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。

【0609】

特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用される全ての参考文献、ならびにこれらに引用された参考文献は、これらが既に組み込まれていない程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0610】

ＶＩＩＩ．例示的実施形態
本発明は、以下の実験例を参照して詳細にさらに説明される。これらの実施例は、例示目的でのみ提供され、別途特定しない限り、限定を意図するものではない。かくして、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきでは全くないが、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意かつ全ての変化を包含すると解釈されるべきである。

【実施例】

【0611】

（実施例１）
最適条件のための溶出前洗浄液のスクリーニング
Ａ．溶出前洗浄液スクリーニングのための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、当業界で公知の標準的な方法に従って、ｒＡＡＶ９ベクターを生産するための３プラスミド系をトランスフェクトした（Ｇｒｉｅｇｅｒら（２０１６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７～２９７）。細胞懸濁液を、回収のために５０Ｌの単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）から取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００（オクトキシノール－９としても知られる）で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0612】

Ｂ．親和性クロマトグラフィーによる溶出前洗浄液スクリーニング
表１に記載される、３つの溶出前洗浄液（洗浄液１、洗浄液２、および洗浄液３）を試験して、樹脂リガンドに結合したＡＡＶ９を保持しながら、結合した不純物を除去するための最適条件を決定した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）を、平衡化しようとするＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０に接続し、２Ｌの５０ＳＵＢの清澄化溶解物をロードし、洗浄した。溶出前の５カラム体積（ＣＶ）の洗浄を、表１に示される特定の流動速度および滞留時間で実施した。異なる洗浄緩衝液を用いるそれぞれの方法を、異なる親和性カラム上で実施して、それぞれの条件の反復物を得た。５ｍＬの溶出体積および４０ｍＬの洗浄体積を、それぞれの実行およびそれぞれの条件について収集した。収集された溶出前洗浄液を、２８０ｎｍ（Ａ２８０）での吸光度について評価した。より高いピーク高さは、より高レベルの不純物を示す。親和性溶出液を、表２に示されるように、ウイルスゲノム回収率（ｖｇ回収率％）、純度％、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比についての吸光度測定と同時のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣＡ２６０／２８０）、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去、および感染性比について評価した。

【0613】

【表2】

【0614】

【表3】

【0615】

溶出前洗浄ステップを用いた、および用いない親和性溶出は、ＳＥＣ Ａ２６０／２８０比、ＨＣＤＮＡレベル、および感染性比によって決定した場合、類似する生成物品質を示した。洗浄ステップを用いない、および洗浄液１を用いた親和性溶出は、非還元的逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲ）によって決定した場合、他の試験した条件と比較して有意に低い純度％を示した（洗浄液１についての６７％に対して洗浄液３についての９２％、表２）。表２に示されるように、収集された１７％エタノール、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６の洗浄液（洗浄液３）は、洗浄液なし、または洗浄液１よりも９～１０倍高いＡ２８０ピーク高さを有していたが、これは、より高レベルの不純物がこの溶出前洗浄によって除去されたことを示している。１７％エタノール、１Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６の洗浄液（洗浄液２）は、表２に示されるように、洗浄液なし、または洗浄液１よりもわずか２．５倍高いピーク高さを示すＡ２８０ピークを有していたが、これは、洗浄液３と比較して、洗浄液２中の追加成分である塩化ナトリウムが不純物の除去を妨げていることを示している。したがって、溶出ステップにおける高い生成物回収率を維持しながら、結合した不純物を除去する際のその有効性のため、親和性クロマトグラフィーのための溶出前洗浄として、１７％エタノール、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６の洗浄（洗浄液３）ステップを選択した。

【0616】

Ｃ．まとめ
本実施例は、ミニ－ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶ９ベクターの親和性クロマトグラフィー捕捉ステップのための溶出前洗浄の最適化を記載する。有効な溶出前洗浄は、ｒＡＡＶ９－樹脂リガンド相互作用を維持しながら、結合した不純物を除去した。１７％エタノール、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６の溶出前洗浄は、一貫して高いウイルスゲノム（ｖｇ）回収率％および純度％を維持しながら、不純物を除去したため、それを親和性クロマトグラフィープロセスにおいて使用することができると結論付けられた。

【0617】

（実施例２）
親和性溶出緩衝液に関するＭｇＣｌ２濃度およびｐＨのスクリーニング
Ａ．スクリーニング試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のために２５０ＬのＳＵＢから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0618】

Ｂ．初期溶出緩衝液スクリーニング試験（ＤｏＥ＃１）：ｐＨおよびＭｇＣｌ_２濃度
親和性溶出ステップの最適化は、親和性カラムから最大量のＡＡＶ９を回収するのに重要である。溶出緩衝液成分は、ＡＡＶ９が親和性樹脂から回収されることを確保する際に重要な役割を果たし得る。この第１のスクリーニング試験において、試験した因子は、表３に示されるような親和性溶出緩衝液中のｐＨ（３．０、４．０、および５．０）ならびにＭｇＣｌ_２濃度（０、５０、１００、および２００ｍＭ）であった。これらの実験のための親和性カラム上の平均ロードは、３．８ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬの樹脂であった。２つのＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）を使用して、１２回の実行（それぞれのカラム上で６回の実行）からなる実験試験の設計を行った。

【0619】

【表4】

【0620】

これらの実験のために使用された親和性クロマトグラフィーのプロトコールを、表３に示されたように変化させる溶出緩衝液組成と共に、表４に示す。それぞれの実行について、親和性溶出液を収集し、表３に示される、ｖｇ回収率％（逆方向末端反復のｑＰＣＲ（ＩＴＲ ｑＰＣＲ）によって測定される）、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比、およびＨＣＤＮＡ（ｑＰＣＲによって測定される）を含む分析試験のために提出した。ｖｇ回収率％によって決定された最も高い生成物回収率を示す溶出緩衝液は、１００ｍＭのグリシン、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０（表３中のｑＰＣＲによる６０％～６５％のｖｇ回収率、実行回数５および８）を含有していたが、沈降物が観察された。これらの溶出試料を、分析試験のために採取した上清と共に遠心分離した。ｐＨ３．０の溶出緩衝液について、親和性溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの有意な範囲があり、ＭｇＣｌ_２濃度に依存していた。ＨＣＤＮＡ量は、ｐＨ３．０、２００ｍＭのＭｇＣｌ_２溶出緩衝液についての１７０ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇとｐＨ３．０、０ｍＭのＭｇＣｌ_２溶出緩衝液についての７７３ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇとの間で変化した。かくして、ＭｇＣｌ_２濃度は、親和性溶出液中のＨＣＤＮＡレベルに影響した。低いｐＨの溶出緩衝液中のＭｇＣｌ_２の存在は、沈降を防止した。ｐＨ４．０または５．０の溶出緩衝液は、ＭｇＣｌ_２濃度に関係なく、最も低い生成物回収率をもたらした。ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比は、全ての条件について０．８３～０．８６で変化したが、これは、溶出画分が空カプシドの全カプシドに対する同じ比（約５％～１０％の全カプシド）を含有していたことを示唆する。この初期スクリーニング試験から、より低いｐＨの溶出緩衝液およびＭｇＣｌ_２の存在が、親和性溶出緩衝液にとっての最適条件であることが決定された。この初期スクリーニング試験は、ＭｇＣｌ_２濃度およびｐＨなどの同様のパラメーターを試験する次の実験（ＤｏＥ＃２）の設計に関する情報を提供した。

【0621】

【表5】

【0622】

Ｃ．第２の溶出緩衝液スクリーニング試験（ＤｏＥ＃２）：ｐＨ、ＭｇＣｌ_２濃度、およびグリシン濃度の評価
初期スクリーニング試験（ＤｏＥ＃１）から得られた結果に基づいて、第２のスクリーニング試験（ＤｏＥ＃２）を、ＤｏＥの範囲を限定し、溶出液属性に影響する重要な因子に焦点を当てるために開発した。この二次スクリーニング試験において試験した因子は、表５に示されるように、ｐＨ（３．０、３．５）、ＭｇＣｌ_２濃度（２５、５０、１００、２００ｍＭ）、およびグリシン濃度（０、１００、２００ｍＭ）であった。これらの実験のための親和性カラム上の平均ロードは、２．５ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬの樹脂であった。２つのＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）を、これらの実験のために使用し、それぞれのカラム上で７回実行した。これらの実験のために使用した親和性クロマトグラフィーのプロトコールは、変化させる溶出緩衝液条件と共に、表４に概略されている。それぞれの実行について、親和性溶出液を収集し、ｑＰＣＲによって測定されるｖｇ回収率％およびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を含む様々な分析試験のために提出した。その結果を、表５に示す。全体として、ｖｇ回収率％は、より低い樹脂チャレンジのため、初期スクリーニング試験のものよりもこの二次スクリーニング試験について低かった。樹脂チャレンジ（平均ロード）は、第１（ＤｏＥ＃１）および第２（ＤｏＥ＃２）の試験スクリーニングについて、それぞれ、３．８ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬおよび２．５ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬの樹脂であった。

【0623】

【表6】

【0624】

２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０（表５、実行１３）からなる溶出緩衝液は、最も高いｖｇ回収率％（ｑＰＣＲによる５５％）を有していた。しかしながら、親和性溶出液はいくらかの沈降物を有することが観察されたが、これは、銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によってＡＡＶ９と同時に溶出するさらなる不純物によって引き起こされると決定された（データは示さず）。全ての条件に関するＳＥＣ Ａ２６０／２８０比は一貫していたが、これは、親和性溶出液中の類似する全カプシドの空カプシドに対する比を示唆している。ＤｏＥ＃２データ（表５）とＤｏＥ＃１データ（表３）との比較により、残留不純物の同時溶出を防止する溶出緩衝液の最適な導電率範囲があることが示された。表６に示されるように、２０～３４ｍＳ／ｃｍの導電率範囲は、高い収率でＡＡＶ９ベクターを溶出させ、不純物の溶出を低減させ、沈降を低減させる。逆に、より低い導電率（例えば、４ｍＳ／ｃｍ）を示す溶出は、高い収率をもたらすが、不純物に基づく沈降をももたらす。この傾向は、溶出緩衝液の導電率ならびにイオン強度が不純物の同時溶出を低減させる際に役割を果たすことを示していた。最も好ましい条件は、より低いＭｇＣｌ２濃度、および２０～３４ｍＳ／ｃｍの溶出導電率範囲であった。

【0625】

【表7】

【0626】

Ｄ．まとめ
本実施例では、２つのＤｏＥを実施して、最適な溶出属性を提供する重要な溶出緩衝液成分の範囲を限定した。第１のＤｏＥは、１００ｍＭクエン酸ナトリウム中で、広範囲のｐＨ値（ｐＨ３．０、４．０および５．０）およびＭｇＣｌ_２（０、５０、１００、および２００ｍＭ）濃度を試験した。この第１のＤｏＥから、より低いｐＨの溶出緩衝液ならびにＭｇＣｌ_２の存在が、親和性溶出液のｖｇ回収率％を改善すると結論付けられた。第２のＤｏＥは、１００ｍＭクエン酸ナトリウム中で、より狭い範囲のｐＨ値（ｐＨ３．０および３．５）、ＭｇＣｌ_２濃度（２５、５０、１００、および２００ｍＭ）、およびグリシン濃度（２５、５０、１００、および２００ｍＭ）を試験した。第１のＤｏＥから得られた結果のため、ｐＨ範囲は３．０および３．５であった。第２のＤｏＥから、ｐＨ３．０、より低いＭｇＣｌ_２濃度、および２０～３４ｍＳ／ｃｍの溶出導電率が全て、親和性カラムからの最適なｖｇ回収率％をもたらす条件であると結論付けられた。

【0627】

（実施例３）
親和性溶出緩衝液におけるクエン酸ナトリウムの役割および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）溶出プロファイルに対するその効果
Ａ．溶出緩衝液比較試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のために５０ＬのＳＵＢから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0628】

Ｂ．親和性クロマトグラフィー
試験した親和性溶出緩衝液は、２００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．５（緩衝液Ａ）および１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０（緩衝液Ｂ）であった。両方の溶出緩衝液のための親和性クロマトグラフィー法を、表７に示す。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）を、２回の実行のために使用した。

【0629】

【表8】

【0630】

それぞれ１ｍＬの溶出画分を収集した後、合計５ｍＬのためにプールした。両方の実行について、プールした親和性溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ９．０で中和した。溶出緩衝液Ａについて、中和された親和性溶出液は有意に濁っていたため、溶液を遠心分離した。上清を試験のために提出し、その後の陰イオン交換クロマトグラフィーステップのためのロードとして使用した。緩衝液Ｂについて、プールした親和性溶出液は透明であり、中和後に沈降物は観察されなかった。それぞれの親和性溶出液に関する分析試験の結果を、表８に示す。溶出緩衝液は、類似するｖｇ回収率％および純度％プロファイルを示した。緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの主な差異は、中和時の沈降物の存在であった。緩衝液Ａの溶出プロファイルはより広かったが、これは図１に示されるように残留不純物の同時溶出を示し得る。このより広い溶出プロファイルは、ｒＡＡＶカプシドと共に不純物の溶出をもたらし得た、より段階的なｐＨの低下によって引き起こされた。

【0631】

【表9】

【0632】

Ｃ．緩衝液ＡおよびＢの親和性溶出液を使用する陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
緩衝液ＡおよびＢを用いた親和性実行からの親和性溶出液を、以下に記載される陰イオン交換カラム上でそれぞれさらに処理した。ＡＥＸステップを使用して、空および全ＡＡＶ９カプシドを分離し、ならびに残留宿主細胞不純物を減少させる。親和性溶出緩衝液組成は、ＡＡＶ９が空／全カプシド分離中にＡＥＸカラムにどれぐらいよく結合するかに影響し得る。ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱカラム（ＨＱ）（０．５ｃｍの内径、５ｃｍの床高、および１ｍＬのカラム体積）を、両方の実行のために使用した。両方の実行からの親和性溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ塩基を使用してｐＨ９．０に調整した後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２％のＰＥＧ（８ｋ）、ｐＨ９．０を含む緩衝液中で最初は１０倍に希釈した。溶出液を、導電率が２．０ｍＳ／ｃｍ以下となるまで、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２％のＰＥＧ（８ｋ）、ｐＨ９．０を用いてさらに希釈した。２％のＰＥＧ ８ｋを、共溶媒として希釈緩衝液中に含有させて、ＡＡＶ９のＡＥＸカラムへの結合を促進した。それぞれの実行のために使用したＡＥＸ法を、表９に詳述する。

【0633】

【表10】

【0634】

２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ９．０の緩衝液中の、０～２５０ｍＭのＮａＣｌの直線勾配の５０カラム体積（５０ｍＬ）を使用して、ＡＥＸカラムからＡＡＶ９を溶出させた。フロースルーならびに溶出画分を全て収集し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．６で中和した。１．２以上のＳＥＣ Ａ２６０／２８０比を有する溶出ピーク画分を、表１０および表１１に示されるようにプールした。ＡＥＸ実行（ＨＱ－１８）の緩衝液Ａの親和性溶出液（２００ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．５）については、２つの溶出画分をプールしたが、ＡＥＸ実行（ＨＱ－１７）の緩衝液Ｂの親和性溶出液（１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）については、８つの溶出画分をプールした。

【0635】

【表11】

【0636】

【表12】

【0637】

両方の実行についての溶出プールを、表１２に示されるような、ｖｇ回収率％、純度％、ＨＣＤＮＡ、および分析的超遠心分離（ＡＵＣ）の分析試験のために提出した。

【0638】

【表13】

【0639】

小さいロードの差異が、図２のクロマトグラムオーバーレイに示されるように劇的に異なる結合／溶出プロファイルを有していた。三価陰イオンであるクエン酸塩は、陽イオンＡＥＸ－ＨＱ樹脂への結合についてＡＡＶ９との競合に打ち勝ち、有意に異なる溶出プロファイルおよび特性をもたらすことが決定された。ＡＥＸロード中に８ｍＭのクエン酸塩を含有するＨＱ－１７は、５４％の未結合のＶＧをもたらした。逆に、ＡＥＸロード中にクエン酸塩を含有しないＨＱ－１８は、全てのロードしたＶＧに完全に結合した（フロースルー画分中の０％のＶＧ）。しかしながら、クエン酸塩を含有しない緩衝液Ａ（２００ｍＭグリシン、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．５）の中和後に、沈降物が見られた。これは、凝集（かくして、沈降）を防止するためには、親和性溶出緩衝液中に陰イオンが必要であるが、クエン酸塩のような強力な陰イオンはＡＡＶ９カプシドと比較してＡＥＸ樹脂に優先的に結合するため、陰イオンはクエン酸塩のような強力な陰イオンではあり得ないことを示唆していた。

【0640】

Ｄ．まとめ
本実施例では、２つの親和性溶出緩衝液（緩衝液ＡおよびＢ）を試験して、親和性およびＡＥＸ溶出プロファイルに対するその効果を決定した。緩衝液Ａはクエン酸ナトリウムを含有していなかったが、緩衝液Ｂは１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含有していた。緩衝液ＡおよびＢは、類似するｖｇ回収率％を示す類似する親和性溶出プロファイルを有していた。主な差異は、緩衝液Ａの親和性溶出液（クエン酸ナトリウムを含有しない）の中和時に、沈降物が観察されたことであった。それぞれの緩衝液実行からの親和性溶出液が中和されたら、それらを希釈し、ＡＥＸによって処理した。緩衝液Ａの親和性溶出液（クエン酸ナトリウムを含有しない）を使用したクロマトグラフィー実行からのＡＥＸ溶出液は、緩衝液Ｂの親和性溶出液を使用したクロマトグラフィー実行からのＡＥＸ溶出液よりもはるかに高いｖｇ回収率％を有していた（２７％対７％）。緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの親和性溶出液に関するＡＥＸ溶出プロファイルは、有意に異なるように見えたが、緩衝液ＡのＡＥＸ溶出プロファイルは、より最適な全／空カプシド濃縮を示した。

【0641】

クエン酸ナトリウムはＡＡＶ９－ＡＥＸ樹脂相互作用を阻害し、ＡＥＸ樹脂上へのＡＡＶ９の結合の減少をもたらすと結論付けられた。したがって、親和性溶出緩衝液からクエン酸塩を除去し、代替手段を試験した。

【0642】

（実施例４）
ＡＥＸ ＨＱ実行に対する親和性溶出緩衝液の効果
Ａ．ＡＥＸ実行試験に対する溶出緩衝液のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のためにウェーブバッグから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0643】

Ｂ．親和性クロマトグラフィー－ＡＥＸ連結試験
この連結試験では、様々な溶出緩衝液を用いて親和性クロマトグラフィーを実行した後、希釈し、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂（本明細書ではＨＱと称される）上での陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を使用して空／全カプシドを分離した。上から２つの性能のよい親和性溶出緩衝液を選択したら、大規模試験を行って、類似する結果を確認することができることを確保した。６つの異なる親和性溶出緩衝液を試験して、親和性およびＡＥＸ溶出プロファイルに対するその効果を決定した。これらの異なる溶出緩衝液の組成を、表１３に提供する。

【0644】

【表14】

【0645】

合計２Ｌの清澄化された細胞溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）上にロードした。６つ全ての溶出緩衝液のための親和性クロマトグラフィー法を、表１４に提供する。

【0646】

【表15】

【0647】

１ｍＬの溶出画分を親和性カラムから収集し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分析からのＡ２８０値に基づいてプールした。溶出プール（それぞれの画分について９５０μＬ）を、１ＭのＴｒｉｓ塩基、ｐＨ９．０を使用して中和した。中和後に沈降物が観察された場合、溶出プールを遠心分離し、分析試験のために上清を保持した。親和性溶出プールに関する分析結果を、それぞれの実行について表１５に示す。

【0648】

【表16】

【0649】

次いで、それぞれの親和性クロマトグラフィー実行について得られた親和性溶出液を、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上にロードして、空／全分離を評価した。親和性溶出プールを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２％ ＰＥＧ ８ｋ、ｐＨ９．０中で９～１１倍に希釈した後、ＡＥＸカラム上にロードした。希釈倍数は初期の親和性溶出液体積に依存し、導電率が２．０ｍＳ／ｃｍ以下となるまで溶出液を希釈した。それぞれのロードのｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基の添加によって９．０に調整した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱカラム（０．５ｃｍの内径、５ｃｍの床高、および１ｍＬのカラム体積）を、ＡＥＸによる異なる親和性溶出液の分析のために使用した。

【0650】

陰イオン交換クロマトグラフィー法は、全ての実行にわたって一貫していたが、これを表１６に提供する。

【0651】

【表17】

【0652】

ＡＥＸカラムからの１ｍＬの溶出画分を収集し、ＳＥＣ Ａ２６０／２８０のために提出して、溶出プール化戦略を決定した。ＳＥＣ Ａ２６０／２８０比が１．２以上であった場合、その画分を溶出プールの一部として含有させた。それぞれの実行について、溶出プールを、さらなる分析試験のために提出して、ｖｇ回収率％（導入遺伝子のｑＰＣＲによって測定される）、純度％（ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによって測定される）、ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡ（ｑＰＣＲによって測定される）、および空／中間／全カプシドの％（ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定される）を得た。データは、表１５に示されている。

【0653】

試験した６つの親和性溶出緩衝液のうち、実行ＨＱ－２１（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭグリシン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０）およびＨＱ－２２（１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０）は、最も性能のよい溶出緩衝液であった。希釈時に、両方の親和性溶出緩衝液は、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ樹脂への高いＡＡＶ９結合および高い空／全カプシド分離を可能にした。高い性能を示した重要なパラメーターは、２６～２９％の２ステップのｖｇ回収率％（親和性^＊ＡＥＸ）、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによる９９％の純度％、低いＨＣＤＮＡ含量（６００ｎｇのＨＣＤＮＡ／１ｘ１０１４ｖｇ）、定量限界未満のレベルのＨＣＰ、および分析的超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定した場合の高いパーセントの全カプシド（４１％～５４％）であった。

【0654】

これらの２つの実行に関する親和性およびＡＥＸクロマトグラムを、図３および図４に示す。両方の実行に関する鋭く狭い親和性溶出ピークは、ＡＡＶ９の捕捉および溶出の成功と共に、残留不純物の最小限の同時溶出を示す。両方の実行に関する二峰性のＡＥＸ溶出プロファイルは、空カプシドと全カプシドの鋭い分離を示し、ＡＵＣデータを用いて定量的に確認された。

【0655】

Ｃ．スケールアップ親和性クロマトグラフィー－ＡＥＸクロマトグラフィー連結試験
小規模試験から、２つの異なる親和性溶出緩衝液が、最良の性能を示した（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０（「３０ｍＭクエン酸」（ＨＱ－２１））および１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０（「１５０ｍＭ酢酸」（ＨＱ－２２）））。これらの２つの親和性溶出緩衝液候補を使用して、スケールアップ試験を行って、それらがより大きい規模でも同等の性能を示すことを確保した。合計７Ｌの５０Ｌ ＳＵＢの清澄化された溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（２．６ｃｍの内径、１９ｃｍの床高、および１００ｍＬのカラム体積）上にロードした。このスケールアップ試験のための親和性クロマトグラフィー法は、表１７に概略される。

【0656】

【表18】

【0657】

２５ｍＬの溶出画分を、親和性カラムから収集し、プールした。親和性溶出プールを、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．０で中和した後、分析試験のために提出した。より大きい規模での２つの親和性溶出緩衝液の性能は、表１８に示される収率および純度に関して類似していた。回収されたベクターのＳＥＣ Ａ２６０／２８０比（示さず）は、いずれの親和性溶出緩衝液も、他の緩衝液と比較してｒＡＡＶ９全カプシドの濃縮を増加させないことを示していた。

【0658】

【表19】

【0659】

これらの２つの親和性クロマトグラフィー実行からの親和性溶出プールを、ＡＥＸ実行（ＨＱ－２４およびＨＱ－２５）のための出発材料として使用した。導電率が１．９ｍＳ／ｃｍ以下となるまで、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０中で親和性溶出プール（４８．８ｍＬ）を３０～４０倍に希釈して、ＡＥＸロードを形成させた。必要に応じて、希釈したロードのｐＨを、Ｔｒｉｓ塩基を使用してｐＨ９．０に調整した。希釈したＡＥＸロードを、ＥＫＶフィルターを通して濾過した後、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱカラム（１．２ｃｍの内径、５ｃｍの床高、および５．７ｍＬのカラム体積）上にロードした。それぞれの実行のために使用したＡＥＸ法は、表１６に概略されている。１ｍＬの溶出画分を収集した後、ＳＥＣ Ａ２６０／２８０比に基づいてプールした。実行ＨＱ－２４およびＨＱ－２５に関するＡＥＸプール化戦略を表１９および表２０に示し、ＨＱ－２４（３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む親和性溶出緩衝液を使用）からプールされた１２個の画分およびＨＱ－２５（１５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む溶出緩衝液を使用）からプールされた３個の画分と共に示した。

【0660】

【表20】

【0661】

【表21】

【0662】

ＡＥＸプールを、純度％（ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによって測定される）および全／空カプシド％（ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定される）のために提出した。その結果は表１８で詳述されている。

【0663】

ＨＱ－２４（３０ｍＭクエン酸塩）実行については、ロードされたｖｇの７％がＡＥＸ樹脂から解放されたが、ＨＱ－２５（１５０ｍＭ酢酸塩）実行については、ロードされたｖｇの３％のみがＡＥＸ樹脂から解放された。この結果は、小規模試験（ＨＱ－１７およびＨＱ－１８実行）において観察されたもの、すなわち、三価陰イオンであるクエン酸塩が、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ樹脂へのＡＡＶ９結合を減少させることをさらに裏付ける。ＨＱ－２４（３０ｍＭクエン酸塩）のｖｇステップ収率％は６３％であったが、ＨＱ－２５実行（１５０ｍＭ酢酸塩）からのｖｇステップ収率％は４４％であった。ＨＱ－２４（３０ｍＭクエン酸塩）は、空カプシド％を６分の１に減少させることができたが（７９％から１３％まで）、ＨＱ－２５（１５０ｍＭ酢酸塩）は、空カプシド％を３分の２に減少させることしかできなかった（７９％から５４％まで）。両方の実行は、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによって９９．９％の非常に純粋な生成物プールを生産した。

【0664】

これらの結果から、２つの親和性溶出緩衝液が親和性クロマトグラフィーステップについて同等の性能を示すと決定された。ＡＥＸステップについて、ＨＱ－２４（３０ｍＭクエン酸塩）実行は、図５に示される異なる溶出プロファイルをもたらしたＨＱ－２５（１５０ｍＭ酢酸塩）実行と同じレベルのＡＡＶ９をＡＥＸ樹脂に結合させることができなかった。小規模およびスケールアップ試験は、同様の結果をもたらし、親和性溶出緩衝液中でのクエン酸塩の酢酸塩による置換をもたらした。追加の試験は、ＡＥＸステップ中に全カプシド％の濃縮を改善するために酢酸塩を含有する親和性溶出緩衝液中のＭｇＣｌ_２濃度を最適化した。

【0665】

Ｄ．まとめ
以前の実施例（実施例３）により、１００ｍＭクエン酸ナトリウムはＡＥＸ溶出にとって最適ではないことが示されたので、他の親和性溶出緩衝液成分を試験した。本実施例では、最初に６つの異なる親和性溶出緩衝液（異なる成分を、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０を含む溶液に添加した）を試験して、親和性およびＡＥＸ溶出プロファイルに対するその効果を決定した。

【0666】

この試験から、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０および１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０は、親和性とＡＥＸとの両方の溶出についてｖｇ回収率％ならびにＡＥＸ溶出液中で回収された全カプシド％に関して最良の性能を示した。これに基づいて、スケールアップ親和性クロマトグラフィー－ＡＥＸ連結試験を、１００ｍＬの親和性カラムおよびこれらの上から２つの性能のよい親和性溶出緩衝液を使用して実施した。大規模試験については、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０親和性溶出緩衝液は、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０の親和性溶出緩衝液を含む緩衝液よりも性能が優れていた。１５０ｍＭ酢酸ナトリウムの親和性溶出緩衝液を使用した場合、ＡＥＸステップ中にロードされたｖｇの約３％のみが解放されたが、３０ｍＭクエン酸の親和性溶出緩衝液を使用した場合、ＡＥＸステップ中にロードされたｖｇの約７％が解放された。これは、小規模の親和性－ＡＥＸ連結試験中に観察されたものを裏付け、１５０ｍＭ酢酸ナトリウムの親和性溶出緩衝液をさらなる最適化と共に実現して、ＡＥＸステップ中の全カプシド％濃縮を改善するべきであると結論付けられた。

【0667】

（実施例５）
１５０ｍＭ酢酸ナトリウム親和性溶出緩衝液中の様々なＭｇＣｌ_２濃度

Ａ．親和性クロマトグラフィーステップ：最適ＭｇＣｌ_２濃度試験
親和性溶出緩衝液、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ３．０を、５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２と共に製剤化して、ＭｇＣｌ_２濃度を試験し、最適化した。陰イオン交換クロマトグラフィーステップ中にＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ樹脂上へのＡＡＶ９の結合を阻害するため、クエン酸ナトリウム緩衝液は親和性溶出緩衝液中に含有させなかった。これらの親和性クロマトグラフィー実験の目的は、ベクター回収（ｑＰＣＲアッセイに基づく）を最大化し、親和性溶出後のベクター沈降を防止する親和性クロマトグラフィー溶出緩衝液を同定することであった。

【0668】

合計１Ｌの清澄化された細胞溶解物を、４ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１ｃｍの内径および５ｃｍの床高）上にロードした。これらの実験のために使用された親和性クロマトグラフィー法を、表２１に詳述する。

【0669】

【表22】

【0670】

５ｍＬの溶出画分を親和性カラムから収集し、分析試験のために提出し、重要な結果を表２２に示した。ＩＴＲ ｑＰＣＲ結果に基づいて、溶出緩衝液がより低い濃度のＭｇＣｌ_２を含有していた場合、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液についての６５％のｖｇ回収率および５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液についての５８％のｖｇ回収率などの、ｖｇ回収率％の増加が達成された。しかしながら、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を含有する親和性溶出液中で沈降物が観察された。

【0671】

【表23】

【0672】

Ｂ．最適ＭｇＣｌ_２濃度試験のためのＡＥＸクロマトグラフィーステップ
次に、ＡＥＸ性能、特に、ＡＡＶ９空／全分離に対するＭｇＣｌ_２の効果を決定するために、試験を実施した。以前に記載された親和性クロマトグラフィー実行からの４つの親和性溶出プールを、ＡＥＸクロマトグラフィーステップ（実行２９～３２）のために使用した。これらのＡＥＸ実験の目的は、ＡＥＸ希釈ステップおよび空／全カプシド分離性能に対する、親和性溶出緩衝液中、かくして、親和性溶出液中のＭｇＣｌ_２濃度の効果を評価することであった。ＡＥＸロード中に存在するＭｇＣｌ_２の量は、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ樹脂へのＡＡＶ９の結合に影響し、したがって、空／全カプシド分離に影響し得る。

【0673】

それぞれの親和性溶出プール（５ｍＬ）を、導電率が約１．９ｍＳ／ｃｍに達するまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、２％ＰＥＧ ８ｋで希釈した。必要に応じて、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を使用してｐＨを９．０に調整した。最終的なｐＨ、導電率、および希釈倍数を、それぞれのＡＥＸロードについて記録した。ｐＨは８．９～９．０の範囲であり、導電率は１．９０～１．９８ｍＳ／ｃｍの範囲であり、希釈倍率は１１～１７倍の範囲であった。希釈した試料全体を、ＥＫＶフィルターを通して濾過した後、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱカラム（０．５ｃｍの内径、５ｃｍの床高、および１ｍＬのカラム体積）上にロードした。これらの実験のために使用したＡＥＸ法を、表２３に詳述する。

【0674】

【表24】

【0675】

１ｍＬのＡＥＸ溶出画分を収集し、元の画分の体積の１５％である体積の５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．６の添加によって中和した。溶出画分が中和されたら、それらをＳＥＣ Ａ２６０／２８０分析のために提出して、空／全カプシド比を決定した。これらの溶出画分に関するプール化戦略を、表２４～２７に概略する。１．１５以上のＳＥＣ Ａ２６０／２８０比を示すＡＥＸ溶出画分をプールした。実行２９（１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）および実行３０（１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）について、３つの連続した溶出画分をプールした。実行３１（１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）および実行３２（１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）について、４つの連続した溶出画分をプールした。

【0676】

【表25】

【0677】

【表26】

【0678】

【表27】

【0679】

【表28】

【0680】

それぞれの実行に関するＡＥＸ溶出プールを、ＩＴＲ ｑＰＣＲによって測定されるｖｇ回収率％、ＡＵＣによって測定されるカプシド種％、およびＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲによって測定される純度％を含む分析試験のために提出した。データは、表２２に示されている。

【0681】

４回全てのＡＥＸ実行において、全てのロードしたｖｇが、ＡＥＸカラムに結合した。さらに、純度％（平均純度％＝９８．８±０．３％）および生成物の品質は、非常に類似していた（平均全カプシド％＋平均中間カプシド％＝５８±２％および平均ＳＥＣ Ａ２６０／２８０比＝１．１６±０．０１５）。４回全てのＡＥＸ実行で全カプシドの類似する濃縮が見られたので、ＭｇＣｌ_２濃度はＡＥＸ空／全カプシド分離性能に影響しなかった。しかしながら、親和性溶出緩衝液中のＭｇＣｌ_２の濃度は、親和性とＡＥＸとの両方の実行におけるｖｇ回収率％に影響しなかった。最適な親和性溶出緩衝液は、親和性およびＡＥＸユニット操作について、それぞれ、６５％および５０％のｖｇ回収率％をもたらしたため、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０であることがわかった（表２２）。

【0682】

Ｃ．様々なＭｇＣｌ_２濃度試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のためにバイオリアクターから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0683】

Ｄ．１５０ｍＭ酢酸ナトリウム／２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２親和性溶出緩衝液の拡張性および再現性
上記の結果は小規模親和性クロマトグラフィーカラム（４ｍＬ）上で得られたため、より大きい規模（８ｍＬおよび４０ｍＬのカラム）でさらなる実験を行って、初期の知見を評価し、再現性を試験した。より大きい規模の親和性クロマトグラフィー実行を、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０の親和性溶出緩衝液を使用して完了させ、初期の小規模の結果を確認した。合計５回のスケールアップした親和性実行を、表２８に示されるように、８ｍＬの親和性カラム上での４回の実行および４０ｍＬの親和性カラム上での１回の実行を用いて実施した。

【0684】

【表29】

【0685】

親和性ロードの調製は、本実施例において以前に記載されたものと同じであった。合計１Ｌの清澄化された細胞溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１ｃｍの内径、１０ｃｍの床高、および８ｍＬのカラム体積）上にロードした。直線流動速度が異なることを除いて小規模実行と同様の親和性クロマトグラフィー法を使用した。溶出プールを収集し、ＩＴＲ ｑＰＣＲのために提出して、ｖｇ回収率％を決定した。全部で４回の８ｍＬのカラム体積の親和性クロマトグラフィー実行にわたる平均ｖｇ回収率％は、表２８に示されるように８８％（８３％～９６％の範囲）であった。

【0686】

単一のスケールアップした親和性クロマトグラフィー実行を、４０ｍＬの親和性カラム上で実施した（実行５）。親和性ロードの調製は、本実施例において以前に記載されたものと同じであった。合計４Ｌの清澄化された細胞溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１．６ｃｍの内径、２０ｃｍの床高、および４０ｍＬのカラム体積）上にロードした。直線流動速度が異なることを除いて小規模実行と同様の親和性クロマトグラフィー法を使用した。親和性溶出プールを収集し、ＩＴＲ ｑＰＣＲのために提出して、ｖｇ回収率％を測定し、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＮＲのために提出して、純度％を測定した。ｖｇ回収率％は６９％（表２８）であり、純度％は８６％であった。これらの８回のスケールアップした親和性クロマトグラフィー実行から、小規模での最適な親和性溶出緩衝液が、より大きい規模でも最適な溶出緩衝液であると決定された。ｖｇ回収率％は、様々な規模で全ての実行にわたって同等である。したがって、最適な親和性溶出緩衝液は全ての規模で、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０である。

【0687】

Ｅ．まとめ
本実施例では、ＭｇＣｌ_２濃度を１５０ｍＭ酢酸ナトリウムの親和性溶出緩衝液中で変化させて、ｖｇ回収率％およびＡＥＸステップで精製された全カプシド％をさらに最適化した。４つの異なるＭｇＣｌ_２濃度を試験した。小規模で、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の親和性溶出緩衝液が最良の性能を示し、親和性クロマトグラフィーステップでは６５％のｖｇ回収率およびＡＥＸステップでは５０％のｖｇ回収率を示した。さらに、それは、試験した全ての緩衝液のうち、ＡＥＸステップで最も高い全カプシド％を提供した（３５％の全カプシド）。これらの結果を確認し、再現性を試験するために、８ｍＬおよび４０ｍＬの親和性カラムを用いるより大規模の試験を行った。これらのより大きい規模での親和性クロマトグラフィーステップでのｖｇ回収率％は、小規模のものと同等であったが、これは、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の親和性溶出緩衝液の結果の再現性および拡張性を示している。したがって、選択された親和性溶出緩衝液は、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭグリシン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ３．０を含有する緩衝液であった。

【0688】

（実施例６）
代替的な再生緩衝液に関する定置洗浄（ＣＩＰ）スクリーニング試験
Ａ．ＣＩＰスクリーニング試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のために５０Ｌ ＳＵＢ／ＦＩＮ４３（Ｆｉｎｅｓｓｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）バイオリアクターから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0689】

Ｂ．異なる再生緩衝液の初期スクリーニング
３ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ５．０５を含む再生緩衝液は、樹脂を完全に洗浄せず、親和性クロマトグラフィーカラム樹脂上で実行することができる精製サイクルの数を減少させた。この問題を解決するために、異なる再生緩衝液をスクリーニングして、樹脂の有効な洗浄を提供する最適な再生緩衝液を決定した。

【0690】

合計４Ｌの５０Ｌ ＳＵＢの清澄化された溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１ｃｍの内径、２．２５ｃｍの床高、および１．５７ｍＬのカラム体積）上にロードした。全ての実行について、表２９に詳述される親和性クロマトグラフィー法を使用した。

【0691】

【表30】

【0692】

実行１～７において使用した再生緩衝液ＡおよびＢを、表３０に列挙する。実行７については、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０を、３４ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間で使用した。

【0693】

【表31】

【0694】

親和性クロマトグラフィー法の各ステップからの試料を収集した。再生緩衝液画分を中和した後、ＩＴＲ ｑＰＣＲのために提出して、ｖｇ回収率％を決定した。結果を、表３１に示す。

【0695】

【表32】

【0696】

ＩＴＲ ｑＰＣＲによって測定されたｖｇ回収率％に加えて、各実行についての再生緩衝液のピーク面積を表３２に示されるように決定した。

【0697】

【表33】

【0698】

データは、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０が試験したもののうち最適な再生緩衝液であることを示していた。２番目および３番目に最も高いｖｇ回収率％は、それぞれ、８ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間、０．１Ｎリン酸（１８％ｖｇ）の実行、および３４ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間、０．１Ｎリン酸（１６．８％ｖｇ）の実行から得られた。再生緩衝液のピーク面積比較により、８ｍｉｎ／ＣＶまたは３４ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間を用いる０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０が、より多い量の不純物およびより多い量の残留ｒＡＡＶを除去することによって他の再生緩衝液よりも性能がよいことが示された。３４ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間、０．１Ｎリン酸の再生ピークは、ピーク面積の増大を示したが、それは、親和性クロマトグラフィー法における他のステップと一致している、８ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間からの変化を保証するには十分に有意ではなかった。

【0699】

リガンドアッセイデータは、新しい樹脂の最初の洗浄が、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０を用いた洗浄後の最初の画分中に６７．６５ｎｇのカラムリガンドをもたらすことを示した。これは、最初の０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０が、緩く結合したリガンドを洗浄除去することを示している。これらの結果を確認するために、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０を、様々な親和性ロード材料（例えば、清澄化された溶解物）に対して試験した。

【0700】

Ｃ．代替的な再生緩衝液の第２のスクリーニング
スケールアップされた製造において、親和性樹脂は、再生を３ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ５．０５を用いて実施した場合にわずか２～３サイクルについて使用可能であったが、これは経済的でも効率的でもない。代替的な再生緩衝液のスクリーニングにより、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０が最良の性能を示すことが示された。しかしながら、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０の性能の一貫性を確保するために、様々な親和性ロード材料を使用して結果を確認した。

【0701】

代替的な再生緩衝液の第２のスクリーニングは、異なる再生緩衝液、ならびに０．１Ｎリン酸を試験した。合計２４０ｍＬの５０Ｌ ＳＵＢおよびＦＩＮ４３の清澄化された溶解物を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（１ｃｍの内径、２．８ｃｍの床高、および２．２ｍＬのカラム体積）上にロードした。全ての実行について、表３３に詳述される親和性クロマトグラフィー法を使用した。

【0702】

【表34】

【0703】

以下の緩衝液：１Ｍ酢酸、ｐＨ２．４；０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９；０．５Ｍリン酸、ｐＨ１．２；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の４Ｍ尿素；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の２５％プロピレングリコール；および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の１０ｍＭサルコシルの１つから、再生緩衝液ＡおよびＢを選択した。各実行について試験した特定の代替的な再生緩衝液は、表３０（実行８～１３）に概略されている。親和性クロマトグラフィー法の各ステップからの試料を収集した。再生緩衝液画分を中和した後、ＩＴＲ ｑＰＣＲのために提出して、表３１（実行８～１３）に示されたようにｖｇ回収率％を決定した。ＩＴＲ ｑＰＣＲに加えて、各実行に関する再生緩衝液のピーク面積を、表３２（実行８～１３）に示されたように決定した。データは、いずれの再生緩衝液も、これらの実験において樹脂の有効な洗浄のための陽性対照として使用された１０ｍＭサルコシル洗浄のピークを有意に低減させないことを示唆していた。１０ｍＭサルコシル洗浄は、樹脂からの不純物および残留ｒＡＡＶの除去を示す、一貫した大きいＡ２８０およびＡ２６０ピークを生成し、かくして、サルコシルの使用が実行可能な進むべき道であるかどうかを決定するためのライフサイクル試験によって試験した。

【0704】

Ｄ．まとめ
本実施例では、２つのスクリーニング試験を行って、親和性クロマトグラフィープロセスにおけるＣＩＰステップのための代替的な再生緩衝液を試験した。使用した３ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ５．０５は、樹脂を効率的に洗浄せず、親和性樹脂の限られたライフサイクルをもたらした。初期スクリーニング試験では、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０は、より高いｖｇ回収率％の１つおよびより高い再生ピーク面積を有し、より高いレベルの不純物の除去およびより高いレベルの残留ｒＡＡＶの除去を示したため、最良のＣＩＰ再生緩衝液であった。

【0705】

異なる親和性ロード材料を使用した場合の初期スクリーニング結果との一貫性を示すために、第２のスクリーニング試験を実施した。この第２のスクリーニング試験により、試験した再生緩衝液はいずれも、１０ｍＭサルコシル洗浄のピーク面積を低減させることができないことが示され、これは、樹脂が試験した種々の再生緩衝液によって効率的に洗浄されないことを示していた。さらなる試験を行って、最適なＣＩＰステップを決定した。

【0706】

（実施例７）
３ｍｉｎの滞留時間および１５ｃｍの床高を用いた親和性樹脂のサイクリング試験
Ａ．ライフサイクル試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0707】

Ｂ．ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性樹脂のサイクリング試験
以前のプロセス開発サイクリング試験は、３分～３６分の範囲の滞留時間を用いる親和性クロマトグラフィー法を使用した。製造規模で、親和性クロマトグラフィー操作インターフェース（ＳＫＩＤ）は、これらの滞留時間と関連する流量の範囲を収容することができない。したがって、製造規模のクロマトグラフィーＳＫＩＤを使用することができるように、このサイクリング試験は、全ての親和性ステップにわたって３分間の滞留時間を使用した。

【0708】

１２回の精製サイクルを、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（０．６６ｃｍの内径、１５ｃｍの床高、および５．１ｍＬのカラム体積）に対して実施した。それぞれの実行について、合計２７０ｍＬのＦＩＮ９２の清澄化された溶解物を、７．５ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬの樹脂の樹脂チャレンジで親和性カラム上にロードした。ロードの濁度は、０．２μｍのＰａｌｌ（商標）ＥＡＶフィルターを用いて濾過する前に、約４．７±０．３ＮＴＵであると測定された。濾過された清澄化された溶解物を含有する親和性ロードの袋を、親和性カラムと直列に接続した。実行中に、親和性ロードの袋を、２～８℃に設定した冷蔵庫に入れた。

【0709】

このライフサイクル試験のために使用した親和性クロマトグラフィー法は、表３４に詳述される。

【0710】

【表35】

【0711】

全ての親和性クロマトグラフィーステップは、３分／ＣＶの滞留時間を有していた。親和性溶出のための収集ゲートは、２ｍｍの経路長で２８０ｎｍにて５０ｍＡＵで開始し、４５ｍＡＵで停止すると特定される。この親和性溶出収集基準を用いて、複数の溶出画分を収集し、プールする必要なく、単一の溶出画分を収集することができる。再生ステップ（０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０および１％サルコシル、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）は、製造操作を容易にするために４８分の保持を含んでいた。カラム圧力をモニタリングし、溶出前エタノール洗浄ステップ、サルコシル再生ステップ、およびエタノール保存ステップの間に記録した。それぞれの実行に関する最大デルタカラム圧力を図６に示し、ライフサイクル試験のそれぞれの実行に関するカラム圧力プロファイルを図７に示す。１２回の精製サイクルのそれぞれに由来する親和性溶出を収集し、分析試験のために提出し、その結果を表３５に示す。

【0712】

【表36】

【0713】

デルタカラム圧力は、精製サイクルの間に約０．２ＭＰａから０．７ＭＰａまで増大した。親和性クロマトグラフィー法におけるある特定のステップは、他のものよりも高い圧力を示した。実行１～７の間に、エタノール洗浄ステップが、最も高い圧力を示した。実行８～１０の間に、エタノール保存ステップは、０．２５８ＭＰａ～０．３７５ＭＰａに達する最も高いデルタカラム圧力を有するステップであった。最後に、実行１１および１２の間に、サルコシル洗浄ステップは、それぞれ、０．５１３ＭＰａおよび０．７１３ＭＰａに達する、最も高いデルタカラム圧力を有するステップであった。ライフサイクル試験の間のこれらの有意な圧力増大は、不純物が、再生ステップによってカラムから効率的に除去されず、樹脂上に蓄積していることを示していた。実行中の有意な圧力増大は、親和性樹脂が詰まり始めており、樹脂をさらなる親和性実行のために使用することができないことを示していた。

【0714】

ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９を用いたサイクリングは、１２回の精製サイクルにわたって８３±６％の平均ｖｇ収率％を与えた。実行１～１０の間に定量可能な未結合のｖｇは検出されず、実行１１および１２の間に２％未満の未結合のｖｇが検出されたため、カラムは試験を通して高い結合容量を維持した。これは、ｖｇ収率％および親和性樹脂結合容量が、１２回の連続した精製実行の後でも有意に影響されないことを示していた。

【0715】

１２回の実行の経過にわたって、残留ＨＣＰレベルは２４９５ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ（実行１）から６０１９ｎｇ／１ｘ１０^１４ｖｇ（実行１２）まで増加し、純度パーセントは約４％減少した。まとめて、これらの結果は、親和性カラムが１２回の実行の経過にわたってＡＡＶに結合するその能力を維持するが、カラム樹脂がそれぞれの連続実行と共に不純物で詰まるようになり、カラム圧力および残留ＨＣＰの増大をもたらすことを示していた。

【0716】

全体として、このライフサイクル試験は、カラム圧力および残留ＨＣＰレベルの有意な増大、ならびに純度パーセントの減少を観察する前に、約８～１０回の連続する親和性実行を、単一のＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラムを使用して上手く実施することができることを示した。

【0717】

Ｃ．まとめ
本実施例では、１５ｃｍの床高のカラムを使用する親和性樹脂ライフサイクル試験を、それぞれのステップについて３分間の滞留時間を用いて行った。合計１２回の実行を、同じカラムおよび樹脂に対して実施した。カラム圧力およびｖｇ回収率％を、試験を通して測定した。１２回全ての実行にわたって、ｖｇ回収率％は一定のままであったが、カラム圧力は実行９～１０のあたりで急上昇した。カラム圧力のこの増大は、実行の間に樹脂から効率的に除去されなかった、樹脂上での不純物の蓄積に起因するものであった。純度パーセントの減少も観察された。したがって、親和性樹脂の詰まりが観察される前に、約８～１０回の実行を、単一のカラム上で上手く実施することができた。

【0718】

（実施例８）
不純物の除去のためのガードカラムプレ親和性クロマトグラフィーの使用
Ａ．ガードカラムロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のために５０ＬのＳＵＢバイオリアクターから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0719】

Ｂ．不純物除去プレ親和性カラムに関するガードカラム試験
ガードカラムは、分析カラムの前に配置される保護カラムであり、本試験では、ガードカラムは親和性カラムの前に配置された。次いで、ガードカラムからのフロースルーを、親和性カラム中に供給した。ガードカラムの目的は、同時に、生成物の損失を最小限にしながら、親和性ロードから不純物および沈降物を除去し、それらが親和性カラムに達するのを防止することである。親和性樹脂に結合した不純物／沈降物は、カラム圧力の増大、ならびに樹脂の全体のライフサイクルの減少をもたらし得る。これは、樹脂の無効な使用、およびプロセス費用の増加をもたらす。

【0720】

少ない不純物が親和性カラム上にロードされた；親和性カラムからの再生ピークは減少する可能性が高い。５つの異なるガードカラム（ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、およびＣａｐｔｏ ７００）を、親和性クロマトグラフィー法において試験して、より少ない量の不純物がカラム上にロードされたことを示す、１０ｍＭサルコシル洗浄のピーク面積が減少したかどうかを決定した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱおよびＸＱ樹脂は陰イオン交換樹脂であるが、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、およびＣａｐｔｏ ７００は疎水性相互作用樹脂であり、したがって、これらの２つの樹脂群は、清澄化された溶解物中に存在し得る様々な不純物を標的とする。

【0721】

それぞれのガードカラムは、表３６～３９に示されるような異なるクロマトグラフィー手順を使用した。

【0722】

【表37】

【0723】

【表38】

【0724】

【表39】

【0725】

【表40】

【0726】

合計１Ｌの５０Ｌ ＳＵＢの清澄化された溶解物を、８ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱ、ＨＱ、Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、およびＣａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌガードカラム上にロードしたが、２３０ｍＬの５０Ｌ ＳＵＢの清澄化された溶解物を、４．７ｍＬのＣａｐｔｏ ７００ガードカラム上にロードした。合計６回の実行をこの試験のために実施した：１回の実行はそれぞれのガードカラムを使用し、対照実行はガードカラムを使用しなかった。それぞれのガードカラムからのフロースルー（２４０ｍＬ）を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１ｃｍの内径、２．８ｃｍの床高、および２．２ｍＬのカラム体積）上にロードした。ガードカラムの後、これらの実行のために使用した親和性クロマトグラフィー法を、表４０に詳述する。

【0727】

【表41】

【0728】

親和性クロマトグラフィー法におけるそれぞれの再生ステップに関するピーク面積を、表４１に提供する。試料を、ガードカラムの各ステップおよびＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム手順から取得し、ｑＰＣＲ分析のために提出した。その結果を表４２に示す。ｑＰＣＲの結果に基づくと、ガードカラムを親和性クロマトグラフィー法に含有せた場合、有意な生成物の損失はなかったが、これは、ＡＡＶカプシドが、媒体に結合することなく、試験したガードカラムから流出したことを示している。

【0729】

【表42】

【0730】

【表43】

【0731】

親和性溶出のｖｇ回収率％は、約４０％～９０％の範囲であった。全ての実行について、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９０の再生ステップが、残存する結合したＡＡＶ９を樹脂から除去するのに有効であった。各実行について１％サルコシルステップは、残存するＡＡＶ９がほとんどないか、全くないことを示したが、これは、樹脂からの残留ＡＡＶ９の有効な除去を示している。ガードカラム上で処理された清澄化された溶解物をロードした全ての親和性カラムについて、再生ピーク面積は、対照ピーク面積と類似していたが、これは、ガードカラムが、リン酸および／またはサルコシル洗浄によって少なくとも部分的に後に除去される不純物を効率的に吸着しなかったことを示している。

【0732】

ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９樹脂の洗浄性能の主な指標は、１％サルコシルピークの面積であった。ガードカラムを使用した全ての実行は、対照実行よりも高い１％サルコシルのピーク面積を有していたが、これは、ガードカラムが表４１に示されたように樹脂上への不純物の沈着を防止するのに有効ではなかったことを示している。大きい１％サルコシルのピーク面積をもたらすガードカラムを実装した後であっても、樹脂上に不純物が残存していた。したがって、ＡＡＶ９のための最終的な親和性クロマトグラフィープロセスにおいては、ガードカラムを使用しなかった。

【0733】

Ｃ．まとめ
本実施例では、５つの異なるガードカラムを試験して、それらが親和性カラム上にロードされた不純物のレベルを低下させ、カラム樹脂の寿命を改善するかどうかを決定した。ガードカラムを親和性カラムの前に配置し、ガードカラムのフロースルーを親和性カラム上にロードした。ガードカラムにわたって有意なＡＡＶ９の損失は観察されなかったが、これは、ＡＡＶ９が、結合することなくカラムを通って流れることを示していた。親和性クロマトグラフィープロセスからの再生ピーク面積に基づくと、ピーク面積の有意な減少は観察されなかったが、これは、ガードカラムが親和性ロードからの不純物の除去にとって有効ではなかったことを示している。したがって、ガードカラムは、親和性クロマトグラフィー法の経過にわたって親和性樹脂の詰まりを低減させるのに有効ではない。

【0734】

（実施例９）
親和性樹脂のライフサイクルを改善するためのプレ親和性ガードフィルターの使用
Ａ．ＥＡＶガードフィルターロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のためにＨＣＤ６８および５０ＬのＳＵＢバイオリアクターから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0735】

Ｂ．ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性樹脂と直列のＥＡＶガードフィルターの使用
以前の実行においては、軟凝集の結果生じる、不純物によるＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９樹脂の詰まりが生じた。これは、大規模ＡＡＶ製造プロセスの高価な成分である親和性樹脂のライフサイクルを減少させた。この試験の目的は、０．２μｍのノミナルＰａｌｌ（商標）ＥＡＶプレカラムフィルターの使用が、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性樹脂の現在のライフサイクルを延長することができるかどうかを決定することであった。

【0736】

濾液がカラム上に直接ロードされるように、ＥＡＶフィルターを親和性カラムと直列に配置した。合計３ＬのＨＣＤ６８または５０Ｌ ＳＵＢの清澄化された溶解物を、１１５Ｌ／ｍ２の体積測定ロードで２６０ｃｍ^２のＥＡＶフィルターに通した。次いで、濾液をＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性カラム（１．６ｃｍの内径、１１ｃｍの床高、および２２ｍＬのカラム体積）上にロードした。この実験のために使用した親和性クロマトグラフィー法を、表４３に概略する。

【0737】

【表44】

【0738】

５ｍＬの溶出画分を収集し、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．０を使用して中和した。１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．０の体積は、溶出画分の初期ｐＨに依存した。溶出画分をプールし、表４４に示されるような導入遺伝子のｑＰＣＲおよびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比を含む分析試験のために提出した。

【0739】

【表45】

【0740】

図８に示されるように、カラム圧力をモニタリングし、同じ親和性カラム上で実施された６回の実行にわたって記録した。ｖｇ回収率％およびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比は、６回全ての実行にわたって類似しており、平均回収率は約３８％であった。各実行中にカラムから溶出するＡＡＶ９の量は、ロード体積によって正規化された溶出ピーク面積によって示されるように、一貫していた。

【0741】

これらの結果に基づいて、ＥＡＶガードフィルタープレ親和性カラムは、親和性カラムのライフサイクルを有意に増強しないと決定された。ＥＡＶガードフィルターに関するライフサイクルは、約４～５回の実行であった。５回目の実行は、約０．２ＭＰａのエタノール溶出前洗浄ステップにおける有意な圧力増大を示した。６回目の実行までに、圧力増大はさらにより顕著となったが、これは、不純物が、樹脂上に蓄積しており、かくして、ＥＡＶガードフィルターを用いて効率的に除去されなかったことを示している。したがって、最終的な親和性クロマトグラフィープロセスにおいては、直列ＥＡＶガードフィルターの使用は実行されなかった。

【0742】

Ｃ．まとめ
本実施例では、０．２μｍのＰａｌｌ（商標）ＥＡＶガードフィルターの使用を試験して、それが親和性カラム上にロードされる前に、親和性ロードから残留軟凝集体を除去するかどうかを決定した。残留軟凝集剤は、不純物による親和性樹脂の詰まりをもたらし、そのライフサイクルを減少させた。ガードフィルターが様々なロードについて成功したかどうかを決定するために、様々な供給源材料を試験した。ガードフィルターを用いた親和性樹脂のライフサイクルは約４～５回の実行であり、再生ピーク面積の有意な減少はなかった。したがって、最終的な親和性クロマトグラフィープロセスにおいては、ガードフィルターを使用しなかった。

【0743】

（実施例１０）
親和性クロマトグラフィーのための溶出およびＣＩＰ床高および滞留時間の最適化
Ａ．溶出床高および滞留時間の試験のための親和性ロードの調製
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。細胞懸濁液を、回収のためにＦＩＮ４３バイオリアクターから取得した。細胞回収物を、０．５％のトリトンＸ－１００で処理し、３０分間混合して、細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシド、および空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させ、深層濾過し、クエンチし、０．２μｍで濾過して、清澄化された溶解物を生産し、これを以下に記載されるように親和性クロマトグラフィーカラム上にロードした。

【0744】

Ｂ．溶出およびＣＩＰ床高および滞留時間の試験
この試験の目的は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性クロマトグラフィーの溶出、ＣＩＰ床高および滞留時間が、親和性溶出のｖｇ回収率％、純度％、およびＡ２６０／Ａ２８０比に影響するかどうかを決定することであった。これを試験するために、３つの異なるカラム床高（１０、１５、および２０ｃｍ）および３つの異なる滞留時間（３、５．５、および８分／ＣＶ）を、表４５に概略されるように試験した。

【0745】

【表46】

【0746】

親和性ロードの体積を、８．００ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬの樹脂の樹脂チャレンジを保持し、出発材料の導入遺伝子力価を使用することによって決定した。３つの異なるＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラムを、複数の実行（３．４、５．１、および６．９ｍＬのカラム体積）のために使用した。３分／ＣＶ、５．５分／ＣＶ、および８分／ＣＶの滞留時間に関する一般的な親和性クロマトグラフィー法を、表４６～４８に示す。

【0747】

【表47】

【0748】

【表48】

【0749】

【表49】

【0750】

各実行に関する溶出プールを収集し、表４９に示されるようにｖｇ回収率％、ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡ、純度％、およびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比に関する分析試験のために提出した。

【0751】

【表50】

【0752】

１０回の親和性クロマトグラフィー実行を行って、１０ｃｍ～２０ｃｍの床高、および溶出の滞留時間および３分／ＣＶ～８分／ＣＶのＣＩＰが、ｖｇ回収率％、純度％、不純物レベル（ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡ）、およびＡ２６０／Ａ２８０比に有意に影響するかどうかを決定した。試験した床高および滞留時間のうち、ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡ、純度％、凝集、またはＡ２６０／Ａ２８０比含量における顕著な差異はなかった。ｖｇ回収率％のわずかな差異があったが、これは、溶出およびＣＩＰステップに関して３分／ＣＶおよび５．５分／ＣＶの滞留時間が最適であり得ることを示している。溶出に関する３および５．５ｍｉｎ／ＣＶの滞留時間は、生成物の品質または収率の低下をもたらさなかった。３分／ＣＶおよび５．５分／Ｃｖの滞留時間の実行は、０．１Ｎリン酸、ｐＨ１．９および１％サルコシル、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５のステップを除いて、全てのステップについて５カラム体積を使用した。これらのステップは、６０分の総接触時間を可能にするのに十分な体積を標的とした。全ての滞留時間でのＣＩＰピークは、形状、ピーク面積、および保持体積において一致していた。より低い滞留時間を使用して、プロセス時間を減少させることができた。この試験に基づいて、３分／ＣＶの滞留時間が、１５ｃｍの床高と共に、親和性溶出およびＣＩＰステップにとっての最適な滞留時間であると決定された。

【0753】

Ｃ．まとめ
本実施例では、３つの異なる溶出およびＣＩＰ滞留時間および床高が、親和性溶出液のｖｇ回収率％、純度％、およびＡ２６０／Ａ２８０比にどのように影響するかを決定するために、それらを試験した。ＨＣＰおよびＨＣＤＮＡレベルならびに純度％には有意差はなかった。３分／ＣＶおよび５．５分／ＣＶの滞留時間は、わずかにより高いｖｇ回収率％を有していた。したがって、プロセス時間を減少させるために、溶出およびＣＩＰのために３分の滞留時間を実行した。

【0754】

（実施例１１）
パイロットおよび製造規模の親和性クロマトグラフィープロセス
Ａ．大規模での清澄化された溶解物または親和性ロードの調製
単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で、ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養物中で増殖させ、３プラスミド系をトランスフェクトして、ｒＡＡＶ９ベクターを産生させた。１０％トリトンＸ－１００をＳＵＢに添加して、０．５％の最終濃度を達成し、３０分間撹拌して細胞を溶解し、ｒＡＡＶゲノム、中間カプシドおよび空カプシドを含む全カプシドを含むＡＡＶ９を放出させた。溶解物を軟凝集させた後、濾過して、清澄化された溶解物を生産した。清澄化された溶解物を０．２μｍのプレカラムフィルターの中を通した後、溶解物をＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９親和性樹脂上にロードした。

【0755】

Ｂ．２５０および２０００ＬのＤＭＤ親和性クロマトグラフィー規模への最適化されたスケールアップ
最適化された親和性クロマトグラフィー法を、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢ中で生産されたＡＡＶベクターの下流の処理のために、ｒＡＡＶ９捕捉およびＨＣＰ除去のためにスケールアップした。２５０Ｌ規模では、２．６７ＬのＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラム（２０ｃｍ（直径）ｘ８．５ｃｍ（高さ））に、８ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ樹脂（ＩＴＲ ｑＰＣＲによる）の標的樹脂チャレンジでロードした。２０００Ｌ規模では、１７．６６３Ｌ（３０ｃｍ（ｄ）ｘ２５ｃｍ（ｈ））または２５．６１０Ｌ（４５ｃｍ（ｄ）ｘ１５±１ｃｍ（ｈ））のＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９カラムに、５ｘ１０^１６ｖｇ／Ｌ樹脂以下の標的ローディング容量でロードした。

【0756】

２５０Ｌおよび２０００Ｌ規模のための親和性クロマトグラフィー法を、表５０～表５２に提供する。図９および図１０は、それぞれ、２５０Ｌおよび２０００Ｌ規模で実行した代表的な親和性クロマトグラフィー実行のクロマトグラムを提供する。

【0757】

２５０Ｌ規模については、溶出のＵＶ収集基準は、２５ｍＡＵのＵＶ２８０で開始し、６５ｍＡＵで終了し（２ｍｍの経路長）、合計０．５～１．０ＣＶの溶出を収集した。２０００Ｌ規模については、溶出のＵＶ収集基準は、１２．５ｍＡＵのＵＶ２８０で開始し、１１２．５ｍＡＵで終了し（５ｍｍの経路長）、合計１．１～１．９ＣＶの溶出を収集した。２５０Ｌおよび２０００Ｌ規模に関する分析結果を、表５３～表５５に示す。ミニ－ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターの精製のための親和性クロマトグラフィープロセスを、生成物の品質を維持しながら、２５０Ｌおよび２０００Ｌの規模にスケールアップすることができた。表５６および表５７は、２０００Ｌ規模での、および１７．６６３Ｌまたは２５．６１０Ｌのカラムを使用した、清澄化された溶解物からのＨＣタンパク質の有意な対数減少を示す（３．０～４．４ＬＲＶ）。

【0758】

【表51】

【0759】

【表52】

【0760】

【表53】

【0761】

【表54】

【0762】

【表55】

【0763】

【表56】

【0764】

【表57】

【0765】

【表58】

【0766】

【表59-1】

【0767】

【表59-2】

【0768】

【表59-3】

【0769】

【表59-4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】