特表 2024-503238 ラジカルタンパク質フットプリント法のための光流体アレイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】ラジカルタンパク質フットプリント法のための光流体アレイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240118BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 21/53 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 21/05 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 21/59 20060101ALI20240118BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N35/08 A

G01N37/00 101

G01N33/483 C

G01N21/53 Z

G01N21/05

G01N21/64 F

G01N21/59 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537510

(86)(22)【出願日】2021-11-22

(85)【翻訳文提出日】2023-07-27

(86)【国際出願番号】 US2021060394

(87)【国際公開番号】W WO2022140000

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/128,439

(32)【優先日】2020-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/193,913

(32)【優先日】2021-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/532,806

(32)【優先日】2021-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＷＩＮＤＯＷＳ

２．Ｌｉｎｕｘ

３．ＰＥＮＴＩＵＭ

４．ＡＮＤＲＯＩＤ

５．ＷＩＮＤＯＷＳ ＭＯＢＩＬＥ

６．ｉＯＳ

(71)【出願人】

【識別番号】521296764

【氏名又は名称】ジェネクスト テクノロジーズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＮＥＸＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】スコット ランディー ウェインバーガー

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ウォーレス イーガン

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー ジョナサン パーソフ

(72)【発明者】

【氏名】エミリー エリザベス チー

(72)【発明者】

【氏名】タン フー ブイ

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド アラン ホルマン

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

2G057

2G058

2G059

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043CA04

2G043DA02

2G043DA05

2G043EA01

2G043EA06

2G043HA09

2G043JA03

2G043KA02

2G043KA03

2G043KA09

2G043LA02

2G043MA01

2G043NA01

2G045DA36

2G045FA11

2G045FB07

2G057AA01

2G057AA02

2G057AA04

2G057AB01

2G057AB03

2G057AB04

2G057AB06

2G057AB07

2G057AC01

2G057BA05

2G057BB06

2G058CA01

2G058DA07

2G058GA06

2G059AA01

2G059BB14

2G059CC16

2G059DD12

2G059EE01

2G059EE02

2G059EE06

2G059EE07

2G059FF12

2G059GG01

2G059HH02

2G059JJ03

2G059JJ07

2G059JJ17

2G059KK02

2G059MM01

2G059NN01

(57)【要約】

光流体アレイを使用する生体内および生体外ラジカルタンパク質フットプリント法のシステムおよび方法が提示される。これらの教示は、例えば、三次元タンパク質構造または生体動態を研究するために使用されてもよい。任意の固有標準を含むラジカル線量測定が使用される。内部標準に基づくリアルタイムフィードバックは、異なる実験間の比較可能性を提供し、生体内および生体外分析結果は、実際の生物学的条件を表すデータをもたらす。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラジカルタンパク質フットプリント法のための光流体チップであって、
基板と、
前記基板内にそれぞれ規定された第１ポート、第２ポート、および第３ポートと、
前記基板内に規定され、前記第２および第３ポートの両方と流体連通する第１空洞を含む混合区域と、
前記基板内に規定され、前記混合区域と流体連通する第２空洞を含む光分解区域であって、前記基板に封止され、前記第２空洞の片側を境界付ける第１光学的透明窓をさらに含み、前記第２空洞が蛇行パターンで構成されたチャネルを含み、前記光分解区域が両側で透明である、前記光分解区域と、
前記基板内に規定され、前記光分解区域と流体連通し、前記第１ポートとさらに流体連通する第３空洞を含む線量測定区域であって、前記基板に封止され、前記第３空洞の片側を境界付ける第２光学的透明窓をさらに含む、前記線量測定区域と、
を含む、光流体チップ。

【請求項2】

前記基板は、プラスチックを含む、請求項１に記載の光流体チップ。

【請求項3】

前記基板は、石英を含む、請求項１または２に記載の光流体チップ。

【請求項4】

前記基板は、シリコンの中間層と、石英の上層と、石英の下層と、を含み、前記中間層は、前記上層と前記下層との間に配置されている、請求項３に記載の光流体チップ。

【請求項5】

前記基板は、シリコンの中間層と、溶融シリカの上層と、溶融シリカの下層と、を含み、前記中間層は、前記上層と前記下層との間に配置されている、請求項３に記載の光流体チップ。

【請求項6】

前記基板内に規定され、前記混合区域および前記光分解区域の両方と流体連通する第４空洞を含むシース流発生器をさらに含み、前記シース流発生器は、前記基板内に規定され、前記第４空洞と流体連通する２つのシース流入口ポートを含み、前記シース流入口ポートおよび前記第４空洞は、流体力学的集束を生成するように構成されている、請求項１ないし４または５に記載の光流体チップ。

【請求項7】

前記インラインミキサーは、前記シース流発生器と前記光分解区域との間に流体連通して配置され、前記シース流発生器は、前記インラインミキサーと前記第３ポートとの間に流体連通している、請求項６に記載の光流体チップ。

【請求項8】

前記シース流発生器は、前記光分解区域と前記インラインミキサーとの間に流体連通して配置され、前記インラインミキサーは、前記シース流発生器と前記第２および第３ポートの両方との間に流体連通している、請求項６に記載の光流体チップ。

【請求項9】

ラジカルタンパク質フットプリント法のための光流体システムであって、
基板と、前記基板内にそれぞれ規定された第１ポート、第２ポート、および第３ポートと、を含むチップを含み、前記チップは、さらに、
前記基板内に規定され、前記第２および第３ポートの両方と流体連通する第１空洞を含む混合区域と、
前記基板内に規定され、前記混合区域と流体連通する第２空洞を含む光分解区域であって、前記基板に封止され、前記第２空洞の片側を境界付ける第１光学的透明窓をさらに含み、前記第２空洞が蛇行パターンで構成されたチャネルを含む、前記光分解区域と、
前記基板内に規定され、前記光分解区域と流体連通し、前記第１ポートとさらに流体連
通する第３空洞を含む線量測定区域であって、前記基板に封止され、前記第３空洞の片側を境界付ける第２光学的透明窓をさらに含む、前記線量測定区域と、
前記混合区域の前記第２および第３ポートの両方と流体連通するマイクロ流体システムと、
を含む、光流体システム。

【請求項10】

酸化された生物学的化合物を含む生物学的実体を受容するように構成されたリザーバーをさらに含む、請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

前記線量測定区域に光を供給するように構成された光源をさらに含む、請求項９または１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記線量測定区域内から放射された蛍光を受光するように構成された蛍光光検出器をさらに含む、請求項９、１０、または１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記線量測定区域にコヒーレント光を供給するように構成された光源をさらに含む、請求項９ないし１１または１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記線量測定区域内から散乱された光であって、前記光源からの前記光の方向と直交する方向に散乱された光を受光するように構成された散乱光検出器をさらに含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記線量測定区域内から散乱された光であって、前記光源からの前記光の方向と直交する方向に散乱された光を受光するように構成された屈折率光検出器をさらに含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項16】

前記チップは、前記基板内に規定され、前記混合区域および前記光分解区域の両方と流体連通する第４空洞を含むシース流発生器をさらに含み、前記シース流発生器は、前記基板内に規定され、前記第４空洞と流体連通する２つのシース流入口ポートを含み、前記シース流入口ポートおよび前記第４空洞は、流体力学的集束を生成するように構成されている、請求項９ないし１４または１５に記載のシステム。

【請求項17】

光分解区域、光分解光源、線量測定区域、および線量測定光源を含む光流体アレイと併せて使用するための方法であって、
前記光分解区域に、生物学的実体、化学化合物、および線量計内部標準を含む混合物を導入する工程と、
前記光分解光源から前記光分解区域に光パルスを供給する工程であって、前記光パルスは、一連の周期的光パルスのうちの1つのパルスであり、前記化学化合物からある濃度のラジカルを生成し、前記ラジカルは、前記線量計内部標準と反応するのに有効である、工程と、
前記線量測定光源から前記線量測定区域に光を供給し、前記光分解光源からの前記光が前記光分解区域に供給された後、前記線量測定区域内から受け取られた光の変化を検出し、前記受け取られた光の変化は、前記生物学的実体が前記線量測定区域内にあることを示し、前記線量測定区域内の前記線量計内部標準の測光特性を測定する工程と、
前記測定された測光特性が閾値未満であると判定する工程と、
前記測定された測光特性を前記閾値にするために前記光流体アレイに適用されるべき変化を特定する工程であって、前記変化は、前記光分解光源によって供給される光の量の変化、前記混合物中の前記化合物の濃度の変化、前記光分解区域を通る前記混合物の流速の変化を含む、工程、または前記周期的パルスの位相を調整する工程、
を含む、方法。

【請求項18】

前記光分解光源は、プラズマフラッシュランプ、エキシマレーザー、固体レーザー、またはレーザーダイオードを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記線量測定光源は、可視またはＵＶ光源を含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記化合物は、過酸化水素を含む、請求項１７、１８、または１９に記載の方法。

【請求項21】

前記化合物は、トリフリナートを含む、請求項１７ないし１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記測光特性は、ＵＶ吸光度を含む、請求項１７ないし２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

前記測光特性は、ＵＶまたは可視蛍光を含む、請求項１７ないし２１または２２に記載の方法。

【請求項24】

線量測定区域、線量測定光源、およびシース流発生器を含む光流体アレイにおけるシース流制御のための方法であって、前記方法は、
前記シース流発生器に、複数の細胞、化合物、および線量計内部標準を含む混合物を導入し、さらに前記シース流発生器に緩衝液を導入する工程であって、前記シース流発生器は、流体力学的集束を利用して前記複数の細胞を含む前記混合物をそこから通過させるのに有効であり、前記複数の細胞の前記細胞は、それらの間に均一な間隔を空けて個々に通過させられる、工程と、
前記混合物を前記シース流発生器から前記線量測定区域内に受容し、前記線量測定区域から受光した光を監視しながら、前記線量測定光源から前記線量測定区域に光を供給する工程であって、前記受光した光は、前記細胞が前記線量測定区域を個々に通過する際に周期性を伴って変化する、工程と、
前記周期性を制御するために、前記シース流発生器内への前記混合物の流速または前記緩衝液の流速を調整する工程と、
を含む、方法。

【請求項25】

前記光流体アレイは、前記混合物を前記シース流発生器に送達する第１ポンプと、前記緩衝液を前記シース流発生器に送達する第２ポンプと、をさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記シース流発生器への前記混合物の流速または前記緩衝剤の流速を調整することは、前記第１，第２ポンプの間の差動ポンピング速度を調整することを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第２ポンプのポンピング速度は、前記第１ポンプのポンピング速度の少なくとも１０倍である、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年１２月２１日に出願された米国仮出願第６３／１２８，４３９号の利益を主張し、２０２１年３月５日に出願された米国非仮出願第１７／１９３，９１３号の一部継続でもあり、これは、２０２０年１月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／１２４３０の一部継続であり、２０１９年１０月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／５７０５９の一部継続でもある。ＰＣＴ／ＵＳ２０／１２４３０およびＰＣＴ／ＵＳ１９／５７０５９の両方は、２０１９年１月７日に出願された米国非仮特許出願第１６／３１６，００６号の一部継続であり、現在は、米国特許第１０，８１６，４６８号となっている。米国非仮出願第１６／３１６，００６号は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，２４７号および２０１９年１月４日に出願された第６２／７８８，２１９号の利益を主張する。ＰＣＴ／ＵＳ１９／５７０５９ は、さらに、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，２４７号の利益を直接主張する。ＰＣＴ／ＵＳ２０／１２４３０およびＰＣＴ／ＵＳ１９／５７０５９の両方は、２０１９年１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７８８，２１９号の利益を主張する。上記の特許出願は、全て参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、National Institute of General Medical Sciencesによって授与された助成金Ｒ４３ ＧＭ１３７７２８、Ｒ４３ ＧＭ１２５４２０、およびＲ４４ ＧＭ１２５４２０の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、ラジカルタンパク質フットプリント法のプロセスによる生体分子の高次構造分析のための装置および方法論に関する。本発明のいくつかの実施形態は、バイオ医薬品の三次および四次構造ならびに関連した配座の特定に関し、タンパク質の高次生体分子構造を特定するために、集積光学およびマイクロ流体チップを使用して処理されるタンパク質の閃光光酸化のための改良された装置および方法論を使用する。

【背景技術】

【0004】

本出願と共に提出された任意の文書を含む、この提出物中のいかなる研究、出版物、販売、または活動に関する議論は、そのような研究が先行技術を構成することを認めたものとして解釈されるべきではない。ここでの活動、研究、または出版物に関する議論は、そのような活動、作品、または出版物が特定の管轄区域で存在したこと、または知られていたことを認めるものではない。

【0005】

バイオシミラーは、既存の先発品または参照品に類似するが同一ではない治療薬である。低分子薬の場合とは異なり、バイオシミラーは、オリジナル製品の単なるジェネリック版ではない。従来のジェネリックは、それらの先発品と治療的および分子的に等価であると考えられる。これは、複雑な三次元生体分子であるバイオシミラーの場合には、単純に当てはまらず、その不均一性および生細胞内での生成への依存性は、従来の医薬品と全く異なる。バイオ医薬品の構造と機能活性は、環境に非常に敏感である。治療薬の意図された構造は、タンパク質の濃度、翻訳後修飾の制御、ｐＨおよび製剤中の共溶質、ならびに生産／精製スキームを含む要因の微妙なバランスによって維持される（Gabrielson,J.P.;Weiss IV,W.F.,Technical decision-making with higher order structure data:starting a new dialogue;Journal of Pharmaceutical Sciences,2015）。このように、バイオ医薬品の構造は、慎重に維持されなければならず、されない場合、望ましくない有害な薬理学的結果が生じる可能性がある。

【0006】

バイオ医薬品の副作用（adverse drug reactions：ＡＤＲ）は、典型的には、誇張され
た薬理学および面性反応に起因すると考えられている。患者のＡＤＲの範囲は、症状のある刺激から罹患および死亡にまで及ぶ。一部のＡＤＲの病因は、患者の薬理ゲノム感受性に起因する可能性があるが、多くは治療薬の固有の特性に起因すると考えられており、これが患者に病的かつ致命的な結果をもたらし、バイオ医薬品産業に多大な経済的損失をもたらしている（Giezen,T.J.;Schneider,C.K.,Safety assessment of biosimiles in Europe:a regulatory perspective;J. Generics and Biosimils Initiative Journal;2014）。このように、壊滅的なＡＤＲの発生は、バイオ医薬品の開発および品質管理のための改善された分析の必要性を例証している。

【0007】

ＡＤＲを最小限に抑え、バイオシミラーの開発を促進にするために、FDA、the Center for Drug Evaluation and Research、およびthe Center for Biologics Evaluation and Researchは、タンパク質の高次構造（higher order structure ：ＨＯＳ）を評価するための最先端技術の使用を強調するガイドラインを発行している（Quality considerations
in demonstration bio-similarity of a therapeutic protein product to a reference
product;guidance for industry;U.S.Department of Health and Human Services;J. Food and Drug Administration;Center for Drug Evaluation and Research;Center for Biologics Evaluation and Research Washington,DC;2015）。ＨＯＳ分析は、所与の生体分子の三次および四次構造ならびに関連した配座の特定を含む。このような生体分子には、タンパク質と、生物治療薬とみなされる場合もあれば、そうでない場合もあるタンパク質複合体と、を含む。今日、様々なＨＯＳ分析が存在しているが、生物療法の有効性と安全性を確実に予測するには不十分であることが疑問視されており、新しく改良されたＨＯＳ分析に対する満たされていないニーズが確立されている（Gabrielson,J.P.;Weiss IV,W.F.,Technical decision-making with higher order structure data:starting a new dialogue;Journal of pharmaceutical sciences;2015）。

【0008】

ＨＯＳ分析の満たされていないニーズに対処する技術は、質量分析（mass spectrometry：ＭＳ）と組み合わせた、不可逆的なタンパク質水酸化に依存するラジカルタンパク質フットプリント法である（(Hambly,D.M.;グロス,M.L.,Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale;Journal of the American Society for Mass Spectrometry;2005）。このプロセスは、ヒドロキシル基ラジカルタンパク質フットプリント法（hydroxyl radical protein foot-printing：ＨＲＰＥ）と呼ばれている。ＨＲＰＥを行うには、様々な技術が使用される。おそらく最も広く使用されているアプローチは、単一の高流束量の短パルスのＵＶ光を使用して過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）からヒドロキシル基（ＯＨ）ラジカルを生成する、タンパク質の高速光化学酸化（fast photochemical oxidation of proteins：ＦＰＯＰ）に依存している。ＯＨラジカルと溶媒に曝されたアミノ酸との反応では、典型的には、アミノ酸に正味１個の酸素原子が挿入される。ＯＨラジカルは、寿命が短く、短ＵＶパルスによって生成されると、標識（labeled）タンパク質による立体構造変化が起こる前に、アミノ酸とラジカルとの間の反応が完了する可能性がある（Konermann,L.;Tong,X.;Pan,Y.,Protein structure and dynamics studied by mass spectrometry:H/D exchange,hydroxyl radical labeling,and related approaches;Journal of mass spectrometry;2008）。酵素消化のペプチド生成物の質量スペクトルは、１６Ｄａ、３２Ｄａ、４８Ｄａなどのピークシフトによって特徴付けられるさまざまなレベルの酸化を示す。この情報は、どのペプチドがＨＯＳの外側に位置しているかを推定することに使用されることができ、それゆえ、ＨＯＳのより深い理解につながる。

【0009】

最近、Grossおよび共同研究者は、トリフリン酸ナトリウム水溶液のヒドロキシル基ラジカル攻撃によって形成されるトリフルオロメチル（ＣＦ_３）ラジカルの生成に基づいた別のラジカルタンパク質フットプリント法技術を実証した（Cheng,M.et al.,Laser-Initiated Radical Tirfluoromethylation of Peptides and Proteins:Application to Mass-S
pectrometry-Based Protein Footprinting;Angewandte Chemie International Edition,2017,56(45):p.14007-14010）。タンパク質がＣＦ_３ラジカルを介して標識されると、それらのペプチド生成物の質量スペクトルは、＋６９Ｄａだけシフトする。ＯＨラジカル攻撃と比較した場合、ＣＦ_３ラジカルは、アミノ酸反応速度において非常に相補的であることが示されており、ＯＨラジカルと組み合わせて使用すると、ＯＨラジカルのみ場合と比較して、表面露出アミノ酸の優れた被覆をもたらす。ＨＲＰＦの場合と同様に、ＣＦ_３標識情報は、どのペプチドがタンパク質の外側に位置するかを推定することに使用されることができ、それゆえ、タンパク質ＨＯＳのより深い理解につながる。

【0010】

比較研究に悪影響を与えるＨＲＰＦの技術的制限は、ＯＨラジカルと、緩衝液成分、初期溶質、外来生物物質などの試料中の非分析物成分と、の反応に起因する。バックグラウンド除去比率のばらつきは、試験ごとの非再現性を引き起こし、これは、比較研究を制限してきた（Niu,B.et al.;Dosimetry determines the initial OH radical concentration
in fast photochemical oxidation of proteins(FPOP);Journal of the American Society for Mass Spectrometry;2015）。ＯＨラジカルは、タンパク質トポグラフィーの優れたプローブであるが、分析用調製物に含まれる多くの化合物とも反応する。分析対象タンパク質とバックグラウンド捕捉剤と間には遊離ＯＨラジカルに対する競合が存在するので、再現性のある結果を保証するために、標的タンパク質を酸化するために利用可能なラジカルの有効濃度を測定することが望ましい。同様に、バックグラウンド除去の変動性も、ＣＦ_３ラジカルフットプリント法の再現性に悪影響を及ぼす。光化学では、有効ラジカル濃度は、ラジカル線量計内部標準を使用して測定される。理想的には、線量計（dosimeter）は、有効ラジカル濃度と線量計応答（response）との間の単純な関係、単純で迅速かつ非破壊的な測定手段を有し、ほとんどのタンパク質に対して非反応性である。

【0011】

従来技術では、添加ペプチド内部標準を使用して行われるラジカル線量測定（dosimetry）を教示し（Niu,B.,et al.,Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins(FPOP). J Am Soc Mass Spectrom,2015. 26(5):p.843-6;Niu,B.,et al.,Incorporation of a Reporter Peptide in FPOP Compensates for Adventitious Scavengers and Allows Time-Dependent Measurements. J Am Soc Mass Spectrom,2016.）、または、緩衝液に添加され、標識後の方法で評価されたアデニンなどのＵＶ吸収内部標準を使用して行われるラジカル線量測定を教示している（Xie,B.;Sharp,J.S.,Hydroxyl radical Dosimetry for High Flux Hydroxyl radical Protein Foot-printing Applications using a Simple Optical Detection Method. Analytical chemistry 2015,87(21),10719-23.）。ペプチドラジカル線量測定において、標識ペプチドおよび標的タンパク質は、続いてＬＣ－ＭＳ (選択的にタンパク質分解を伴う) を使用して分析され、酸化標的タンパク質に対する酸化ペプチドの相対比を評価する。所望のペプチド対タンパク質の酸化比が達成されない場合は、有効なＯＨラジカル負荷を増加または減少させる必要性に応じてＨ_２Ｏ_２の濃度を調整しながら実験全体を繰り返す。アデニン線量測定のために、標識プロセスの完了時にアデニンＵＶ吸光度の有効変化が特定され、達成されたアデニンＵＶ吸光度変化と目標アデニＵＶ吸光度変化との比率が特定される。Ｈ_２Ｏ_２濃度は、その後、ＵＶ吸光度の所望の変化に従って変化される。どちらのアプローチも標識が完了した後に行われ、有効なＯＨラジカル負荷をリアルタイムで調整することができず、貴重な試料が消費され、研究者の時間が不必要に無駄になる。

【0012】

米国特許第１０，８１６，４６８号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３４６８２は、生物製剤がＦＰＯＰ ＨＲＰＦプロセス中に標識される際に、リアルタイムでラジカル線量測定を行うシステムおよび方法を教示している。バックグラウンド除去の変動を調整および補償するリアルタイム手段を作成する一方で、ここでのシステムおよび方法では、生物学的混合物に外部内部標準線量計を追加する必要がある。条件によっては、外部内部標準は、生体分子の高次構造に人為的な変化を引き起こす可能性があるため、生物製剤の発
生期の高次構造を特徴付ける簡単な手段を提供するという望ましい目標には適合しない可能性がある。米国特許第１０，８１６，４６８号およびＰＣＴ／ＵＳ１８／３４６８２出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0013】

米国仮出願第６２／７４７，２４７号およびＰＣＴ／ＵＳ１９／５７０５９は、一般に使用される生物緩衝液システムをラジカル線量計の内部標準として使用できる装置および方法論を記載している。一般的に使用される一部の生物学的緩衝液の測光特性（photometric properties）は、ＯＨラジカル攻撃により予測可能な様式で変化する。そのため、これらの緩衝液は、ラジカル線量計の内部標準として使用されることができ、外部試薬を追加する必要性を排除し、また、これらの緩衝液の溶媒和特性は、生体分子の発生期構造を安定化するために十分に確立されているため、生物学的高次構造を変化させない。

【0014】

前述の技術は、生体外（in vitro）でタンパク質または生物医薬品を標識しながらＨＲＰＦラジカル線量測定を行うための装置および方法を記載している。しかしながら、生体外構造実験の結果を真正の生体内（in vivo）挙動に適用する行為は、疑問視されている（Mourao,M.A.;Hakim,J.B.;Schnell,S.,Connecting the dots:the effects of macromolecular crowding on cell physiology. Biophysical Journal 2014,107(12),2761-2766）。生体外ＨＲＰＦの欠点のために、ＨＲＰＦの使用を生体内様式で無傷の全細胞に拡張することに最近の関心および願望がある。例えば、米国特許第１０，８５１，３３５Ｂ２号は、生体内ＨＲＰＦを行うことができる方法および方法論を記載している。簡単に説明すると、複数の溶融シリカ毛細管およびマイクロ流体フィッティングを使用して、緩衝液懸濁細胞とＨ_２Ｏ_２との混合をサポートする。教示されるように、Ｈ_２Ｏ_２は、細胞破壊を引き起こすことなく、アポトーシスを誘導することなく、または細胞死を促進することなく、細胞によって迅速に取り込まれる。しかしながら、教示されたシステムおよび方法は、依然として様々な欠点をもたらす。米国仮特許出願第６２／７８８，２１９号およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１２４３０は、細胞内ラジカル線量測定を行って細胞内細胞質またはオルガネララジカル捕捉を評価および調整する手段を提供することによって、生体内ＦＰＯＰ ＨＲＰＦが改善される装置および方法論を記載している。 さらに、それは、シース流速およびその後の細胞間の間隔を評価し、最終的に制御して、生体内標識プロセス中に浮遊細胞（suspended cells）への効果的な照射を確実にすることができる手段を教示している。

【0015】

前述の技術は、輸送、シース流の確立、化学処理、光ラジカル反応の開始のための手段として溶融シリカ毛細管を使用してタンパク質または生物薬剤を標識するために生体外または生体内ＦＰＯＰ ＨＲＰＦを行い、さらにタンパク質、細胞、化学試薬、および標識生成物の測光特性を精査するための光学領域を提供する装置および方法を記載している。これらの初期段階の実験に有用であるが、溶融シリカ毛細管は、いくつかの望ましくない特徴を有する。１）特に外側保護ポリイミドコーティングが除去される場合、壊れやすく、偶発的に破損しやすい。２）Ｈ_２Ｏ_２からのヒドロキシル基ラジカル形成および適合したＵＶ測光線量測定を可能にするために、紫外線（ultra violet：ＵＶ）不透明ポリイミドコーティングの除去を必要とする。３）光学構成要素への適切な位置合わせを確保にするために、かなりの注意を必要とする。４）例えば生体内ＦＰＯＰを容易にするために必要とされる流体循環路を作製および形成するために、高価で扱いにくいマイクロ流体フィッティングを必要とする。５）交換が面倒である。小さいＩＤ（＜１００ｎｍ）の毛細管が、高流束量の適用時に偶発的に詰まったり破損したりすることは、珍しいことではない。このように、以前に教示されたシステムおよび方法は、様々な欠点をもたらす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明の様々な実施形態は、溶融シリカ毛細管を、標的タンパク質と標識試薬とのオン
ライン混合をサポートする光流体チップ構成要素に置き換える手段を提供することによって、現在の生体外ラジカルタンパク質フットププリント法の上記の欠点に対処するシステムおよび方法を含む。開示されたシステムは、毛細管構成と比較して、光誘起ラジカル化学の間に照射量を実質的に増加させる蛇行光分解セル（serpentine photolysis cell）を含む。様々な実施形態は、生体外ラジカル線量計内部標準の測光特性を使用して、効果的なラジカル生成のリアルタイム測光評価および不要なバックグラウンド除去の調整のためのインライン線量測定セルを含む。

【0017】

本発明の様々な実施形態は、溶融シリカ毛細管を、標的細胞と標識試薬とのオンライン混合をサポートする光流体チップ構成要素に置き換える手段を提供することによって、現在の生体内ラジカルタンパク質フットプリント法の上記の欠点に対処するシステムおよび方法を含む。種々の実施形態は、マイクロ流体シース流の生成をサポートして、細胞間距離の正確な制御を可能にし、毛細管構成と比較したとき、光誘起ラジカル化学の間に照射量を実質的に増加させる蛇行光分解セルなどを用いて、各細胞の外部および細胞内部分の効果的かつ一貫した照射を可能にする。様々な実施形態は、生体内ラジカル線量計内部標準の測光特性を使用して、効果的なラジカル生成のリアルタイム測光評価および不要なバックグラウンド除去の調整のためのインライン線量測定セルを含む。様々な実施形態は、また、細胞の単一化および分割を評価し、再現可能に制御することができる手段、ならびにＨＲＰＦ光分解区域への細胞の到着時間を特定する手段を提供する。

【0018】

本発明の様々な実施形態は、高度なラジカルタンパク質フットプリント法を可能にするタンパク質の生体外または生体内閃光光酸化（flash photo-oxidation）を実行するための改良された実施形態を含む、タンパク質の高次構造を分析するためのオンチップシステムおよび方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、閃光光分解システムと線量計との間に閉ループ制御を確立して、内部標準ラジカル線量計の測光特性における測定された変化に応答して閃光光分解システムの放射照度を制御する、インラインラジカル線量測定システムを提供する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本発明は、自動インラインマイクロ流体混合システムと線量計との間に閉ループ制御を確立して、内部標準ラジカル線量計の測光特性における測定された変化に応答して標識試薬の濃度を制御する、オンチップ、インライン、生体内、または生体外ラジカル線量測定システムを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、本発明は、閃光光分解システムと線量計との間に閉ループ制御を確立して、内部標準ラジカル線量計の測光特性における測定された変化に応答して閃光光分解システムの放射照度を制御する、オンチップ、インライン、生体内、または生体外ラジカル線量測定システムを含み、ラジカルは、標識試薬の光分解によって生成される。

【0021】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計、および他の標識試薬と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）細胞の新生期の測光特性を特定する工程、（４）細胞を、光分解区域において少なくとも１回のＵＶ照射で光照射する工程、（５）光照射後の細胞についての測光特性の変化を特定する工程、および（６）ラジカル線量計測光特性の変化に従って、ＵＶ光源のスペクトル放射照度を調整する工程を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体外インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１
）標的タンパク質（単数または複数）を、生物学的緩衝液、内部標準ラジカル線量計、および他の標識試薬と混合する工程、（２）混合物を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）混合物の発生期の測光特性を特定する工程、（４）混合物を、光学光分解区域において少なくとも１回のＵＶ照射で光照射する工程、（５）光照射後の混合物についての測光特性の変化を特定する工程、および（６）ラジカル線量計測光特性の変化に従って、ＵＶ光源のスペクトル放射照度を調整する工程を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計、および他の標識試薬と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）細胞の新生期の測光特性を特定する工程、（４）細胞を、光分解区域において少なくとも１回のＵＶ照射で光照射する工程、（５）光照射後の細胞についての測光特性の変化を特定する工程、および（６）ラジカル線量計測光特性の変化に従って、インラインマイクロ流体ミキサーを使用して標識試薬の濃度を調整する工程を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体外インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）標的タンパク質（単数または複数）を、生物学的緩衝液、内部標準ラジカル線量計、および他の標識試薬と混合する工程、（２）混合物を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）混合物の発生期の測光特性を特定する工程、（４）混合物を、光分解区域において少なくとも１回のＵＶ照射で光照射する工程、（５）光照射後の混合物についての測光特性の変化を特定する工程、および（６）ラジカル線量計測光特性の変化に従って、インラインマイクロ流体ミキサーを使用して標識試薬の濃度を調整する工程を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、標識試薬、および細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）線量測定区域を出る散乱光の強度を監視することによって、細胞の到着および存在を検出する工程、（４）連続する細胞の到着の間の経過時間を特定する工程、（５）経過時間と正味の緩衝液流速との積当たりの細胞単離量（cell isolation volume）を特定する工程、いおよび（６）所望の細胞単離量を達成するために、シース流および緩衝液流パラメーターを調整する工程を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、標識試薬、および細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）線量測定区域を出る光の位相の変化を監視することによって、細胞の到着および存在を検出する工程、（４）連続する細胞の到着の間の経過時間を特定する工程、（５）経過時間と正味の緩衝液流速との積当たりの細胞単離量を特定する工程、および（６）所望の細胞単離量を達成するために、シース流および緩衝液流パラメーターを調整する工程を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、標識試薬、および細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）線量測定区域を出る散乱光の強度を監視することによって、細胞の到着および存在
を検出する工程、（４）到着する細胞についての正味の流速を特定する工程、（５）光分解区域および線量測定区域から延びる相互接続量（interconnect volume）を特定する工程、（６）細胞が光分解区域から線量測定区域に移動するために必要とされる通過時間を特定する工程、（７）細胞についての光分解区域到着時間を特定する工程、および（８）全てのその後の細胞が光分解区域に到着する時間で光分解システムを動作させる工程と、を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、オンチップ生体内インラインラジカル線量測定システムを使用して、本発明は、分析のための標識生体分子を生成する方法を含み、当該方法は、（１）細胞を、生物学的緩衝液、標識試薬、および細胞によって最終的に取り込まれる内部標準ラジカル線量計と混合する工程、（２）細胞を、光学的線量測定区域に導入する工程、（３）線量測定区域を出る位相を監視することによって、細胞の到着および存在を検出する工程、（４）到着する細胞についての正味の流速を特定する工程、（５）光分解区域および線量測定区域から延びる相互接続量を特定する工程、（６）細胞が光分解区域から線量測定区域に移動するために必要とされる通過時間を特定する工程、（７）細胞についての光分解区域到着時間を特定する工程、および（８）全てのその後の細胞が光分解区域に到着するような時間で光分解システムを動作させる工程と、を含む。

【0029】

標識生体分子の生成に続いて、質量分析または電気泳動などの他の方法を用いて、標識ペプチドを同定し、生体内または生体外での生体分子の高次構造に関する情報を推定してもよい。

【0030】

本発明の様々な実施形態は、オンチップ分析システムを含み、オンチップ分析システムは、発生期の生物学的実体を光分解区域に提供するように構成された試料導入システムであって、生物学的実体は、集束されたシース流中で互いに単離される、試料導入システムと、光を生成して標識試薬の供給源からラジカルを生成するように構成された光分解光源と、シース流および光を受けて、内部標準を標識し、生体内で生物学的実体の生物学的化合物を標識するように構成された光分解区域と、光分解区域から生物学的実体を受容し、散乱光検出器を使用して生物学的実体の存在を検出し、蛍光検出器を使用して内部標準の酸化を検出するように構成された線量測定区域と、生物学的実体の各々についてのラジカルの目標濃度を特定し、ラジカルの目標濃度を満たすために光分解区域の動作を調整するように構成された制御理論回路（control logic）と、標識生物学的化合物を含む生物学的実体を受容するように構成されたリザーバーと、を含む。

【0031】

本発明の様々な実施形態は、発生期の細胞内の生体分子を標識するオンチップ方法を含み、当該方法は、少なくとも１つの細胞を含む試料混合物を、光分解区域に導入し、標識ラジカルの供給源および線量計内部標準を、閃光光分解システムの光分解区域に導入する工程と、標識ラジカルの供給源から標識ラジカルを生成するために、光を供給する工程であって、標識ラジカルは、少なくとも１つの細胞内の生体分子を標識するように構成されている、工程と、線量計内部標準と標識ラジカルとの反応から生じる線量計内部標準の測光特性を検出するように構成されたラジカル線量計の線量測定区域に、少なくとも１つの細胞が到達するまで、必要に応じて予め決定された時間待機する工程であって、ここで、少なくとも１つの細胞は、光散乱によってラジカル線量計の線量測定区域内で検出可能である、工程と、少なくとも１つの細胞が線量測定区域内にある間、ラジカル線量計を使用して線量計内部標準の測光特性を測定する工程と、線量計内部標準の測定された測光特性に基づいて、目標レベルの標識ラジカルが生成されなかったことを決定する工程と、少なくとも１）～４）のうちの１つを調整することによって、光分解区域内の標識ラジカルの濃度を調節する工程と、を含む。１）光分解区域に供給される光の量。２）標識ラジカルの供給の濃度。３）光分解区域内の少なくとも1つの細胞の流速。または、４）光分解区域への光の供給の時間を調整。前述の実施形態では、光分解区域に供給される一連の光パ
ルスは、周期性および位相の両方を有し、周期的パルスの位相を調整することは、周期性を変化させることなくパルスのタイミングを変化させることに留意されたい。

【図面の簡単な説明】

【0032】

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。さらに、本発明の上記の目的および利点は、本発明の特徴を組み込む添付の図面に照らして考慮される場合、例示的な実施形態の以下の説明を読むことから当業者に容易に明らかになるであろう。図面における構成要素は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本開示の原理を明確に示すことに重点が置かれている。

【0033】

本明細書に記載される方法のいずれも、特定の実施形態によれば、以下のいずれか１つ以上をさらに利用することができる。

【0034】

【図1】図１は、閃光光分解システムの実施形態を示す。

【図2】図２は、マイクロ流体システムの実施形態を示す。

【図3】図３は、光流体チップの構成要素の実施形態を詳細に示す。

【図4】図４は、１秒間隔でＵＶ光のパルスを照射されたときのアデニンと過酸化水素との混合物についての線量測定区域測光応答プロットを詳細に示す。

【図5】図５は、マイクロ流体システムの実施形態を示す。

【図6】図６は、生体内光流体チップの好ましい実施形態を示す。

【図7】図７は、いくつかの内部標準ラジカル線量計について、流通細胞、蛍光励起、および発光波長を列挙する表である。

【図8】図８は、本発明の組み合わされた蛍光および光散乱検出器システムの実施形態を示す。

【図9】図９は、本発明の組み合わされた蛍光および光散乱検出器の他の実施形態を示す。

【図10】図１０は、本発明においてＣｅｌｌＲｏｘ（登録商標）ＤｅｅｐＲｅｄおよび過酸化水素を使用して生体内実施形態を照射している間の蛍光ラジカル線量測定応答を示す。

【図11】図１１は、本発明における単離量または細胞間距離を特定および制御するための例示的なプロセスを示す。

【図12】図１２は、光分解光トリガリングの一致した調整を用いた細胞到着特定のための例示的なプロセス１２００を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

有効ラジカル濃度のリアルタイム監視および制御を伴うオンチップ生体内または生体外高速光酸化によって触媒として機能し、溶媒露出分子基の選択的標識によって達成される、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。さらに、標識試薬と、標的タンパク質、細胞、または他の生体内実施形態と、のオンチップインラインマイクロ流体混合によって達成される、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。さらに、生体内での高速光酸化反応をサポートするためのシース流を生成するように機能するオンチップマイクロ流体チャネルによって達成される、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。さらに、一体型蛇行光分解セルを使用してオンチップインライン光化学的誘導反応によって達成される、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。

【0036】

有効ラジカル濃度のリアルタイム監視および制御を伴うオンチップ生体内または生体外高速光酸化によって触媒として機能し、溶媒露出分子基の選択的標識によって達成される
、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。さらに、生体内種単離量のリアルタイム監視および制御を伴うオンチップ生体内高速光酸化、ならびにその後の閃光光分解によって達成される、生体分子高次構造の分析のための装置および方法が提供される。装置および方法は、以下に限定されないが、測光的に半透明または透明である様々な生体内実施形態に適用可能であり、真核細胞、原核細胞、細菌、細胞内ウイルス、ビリオン、ウイルス様粒子、単細胞生物、真核組織、および多細胞生物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、説明のために細胞に言及するが、そのような言及は、限定的なものではなく、そのような言及は、全ての測光的に半透明または透明な生体内生物学的または非生物学的実体に、本質的に適用可能であることが理解される。

【0037】

装置および方法は、一般的なタンパク質生化学、診断研究および開発、感染症研究、生物薬剤研究および開発、抗体研究および開発、バイオシミラー開発、治療抗体研究および開発、小分子薬物研究および開発、ならびに他の治療化合物および材料の開発などの様々な研究分野に適用可能である。さらに、装置および方法は、タンパク質－リガンド相互作用分析、タンパク質－タンパク質相互作用分析、タンパク質－ＤＮＡ相互作用、タンパク質－ＲＮＡ相互作用、タンパク質融合産物分析、タンパク質配座および配座変化分析、細胞－細胞相互作用、ウイルス－細胞相互作用、小薬物分子作用様式分析、生物薬剤作用様式分析、抗体-抗原分析、タンパク質エピトープマッピング、タンパク質パラトープマッピング、ならびに化学反応監視のような種々の研究分析に適用可能である。

【0038】

装置は、標的タンパク質または細胞を、システムの試料導入アセンブリ内に配置された適切なマイクロ遠心分離管またはマイクロプレート内に、手動でピペットを操作することによって、標的タンパク質または細胞の段階的導入を介して、後続の化学標識のために細胞を受容することができる。あるいは、装置は、他の分離および分析器と組み合わせられることができ、標的タンパク質または標的細胞を他の分離および分析器から直接受けることができ、他の分離および分析器としては、選択的タンパク質分離、細胞選別、細胞計数、および組織からの細胞単離を行う機器が挙げられるが、これらに限定されない。

【0039】

本節は、生体内または生体外有効ラジカル濃度を評価し、最終的に制御するために、内部標準線量計の測光特性を使用するオンチップインライン生体内または生体外ラジカル線量計を有する閃光光分解装置の一般的概要を提供する。さらに、本節は、単離量を評価し、緩衝液の流動流内の生体内実施形態の分離を正確に制御するために、生体内実施形態の測光特性を使用する本発明の一般的概要を提供する。各サブアセンブリの詳細な説明は、本明細書の他の箇所で提供される。さらに、これらのサブアセンブリの相互作用を説明する方法が、典型的な器具動作の理解を可能にするために提供される。

【0040】

本発明の様々な実施形態は、図１に示すように、閃光光分解システム１００を含む。 閃光光分解システム１００は、リアルタイムラジカル線量測定のために構成され、いくつかのサブアセンブリを含む。試料導入システム１０１、光分解区域１０２、閃光光分解光源１０３、ラジカル線量計１０４、制御電子機器１０５、機器コントローラー１０６、試料導入システム１０１と光分解区域１０２との間の流体相互接続ライン１０７、光分解セルとラジカル線量計との間の流体相互接続ライン１０８、閃光光分解光源１０３と光分解区域１０２との間の光通信相互接続１０９、ラジカル線量計１０４と制御電子機器１０５との間の電子相互接続１１０、試料導入システム１０１と制御電子機器１０５との間の電子相互接続１１１、制御電子機器１０５と機器コントローラー１０６との間の電子相互接続１１２、および制御電子機器と閃光光分解システムとの間の電子相互接続１１３が示されている。光分解区域１０２、閃光光分解光源１０３、およびラジカル線量計１０４は、一緒になって、「閃光光分解システム」を構成する。

【0041】

光分解区域１０２は、典型的には、光分解セルに含まれる。閃光光分解システム１００
は、生体外試料または生体内試料細胞をリアルタイムで酸化して、ラジカル線量測定を達成するように構成されている。分析対象は、試料導入システム１０１を介して導入される。分析対象は、小容量の微細遠心分離管を使用して、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ハンブルク、ドイツ）から容易に入手可能なマルチウェルマイクロタイタープレート（multi-well microtiter plates）を使用することによって提示され得る。マイクロ流体循環路は、分析対象吸引、標識試薬との混合、生体内処理のためのシース流機器を使用する細胞流体力学的集束、光分解および線量測定区域への輸送、ならびに標識生成物の輸送および沈殿のために構成される。いくつかの実施形態において、試料導入システム１０１は、発生期の生物学的実体を光分解区域（例えば、光分解区域１０２、集束されたシース流中で互いに単離された生物学的実体）に提供するように構成される。シース流は、典型的には、生物学的実体を互いから単離するように構成される。例えば、適切な条件を使用して、生物学的実体は、規則的な間隔によって互いに分離される。

【0042】

光酸化は、光分解区域１０２内で起こる。いくつかの実施形態では、光分解区域は、光流体チップ内に位置する。いくつかの実施形態では、光流体チップは、シリコンまたは石英基板内にマイクロ流体チャネルを作成する、リソグラフィーでサポートされたウェット化学エッチング、ドライ反応性イオンエッチング、およびレーザアブレーション微細構造化等の様々な技術を使用して製造される。いくつかの実施形態では、光流体チップは、プラスチック基板内に流体チャネルをエンボス加工することによって製造され、形成された流体チャネルは、プラスチック基板が除去された領域に光学的に透明な窓を封止することによって作成された光学的に透明なセル内に、試料を輸送する。そのような光学的に透明な窓は、本明細書に開示される光分解および線量測定セルの片側だけに、または両側に配置され得る。例示的なプラスチック基板としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエーテル－エーテル－ケトン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、Ｋａｌｒｅｚ（登録商標）、およびポリクロロトリフルオロエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。流体および光学チャネルの内径は、０．１～５．０ｍｍの範囲であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、流体チャネルおよび光学チャネルは、流体移送、流体混合、流体力学的集束、および光学結合の異なる要件に理想的に対処するために、異なる内径を有することができる。いくつかの実施形態において、光分解区域は、複数の流体経路を向流様式で並置するチャネルの蛇行アレイを含む。

【0043】

光分解区域１０２は、マイクロ流体経路１０７を介して試料導入システム１０１から分析対象を受容する。処理後、光分解区域１０２内の光照射された分析対象は、ラジカル線量計１０４に移送される。光分解区域１０２は、閃光光分解光源１０３と光学的に連通している。閃光光分解光源１０３は、光分解区域１０２内で標識試薬源から標識ラジカルを生成するための光を生成するように構成された光分解光源の一例である。いくつかの実施形態では、光分解区域１０２は、生物学的実体を含むシース流を受容し、閃光光分解光源１０３から光を受けて、線量計内部標準を酸化させ、生体内で生物学的実体の生物学的化合物を酸化させるように構成されている。 例えば、アミノ酸を含むタンパク質およびペプチドは、光分解区域１０２において酸化されてもよい。

【0044】

光分解区域１０２、閃光光分解光源１０３、およびラジカル線量計１０４は、閃光光分解システムを構成する。閃光光分解システムは、プラズマフラッシュランプまたは他の適切な光源（例えば、エキシマレーザー、固体レーザー、またはレーザーダイオード）、および光透過手段の要件を光分解区域に適合させるための関連する光収集／透過光学部品を含む。

【0045】

ラジカル線量計１０４は、光分解区域１０２から標識される分析対象を受容するように構成されるか、または他の実施形態において、ラジカル線量計１０４は、直交光路を使用
することによって光分解区域１０２に組み込まれている。様々な測光検出スキームは、線量計内部標準の関連する測光特性を監視するために、ラジカル線量計によって使用されてもよい。いくつかの実施形態では、線量計内部標準は、生物学的試料中に添加された外部添加剤であり得る。いくつかの実施形態では、生物学的緩衝液システムの固有測光特性は、固有線量計内部標準として機能してもよい。「固有」または「緩衝液に固有」とは、内部標準が緩衝特性を提供する化学種のうちの１つであることを意味する。緩衝液は、必要に応じて、分析対象または細胞を生理学的ｐＨまたはイオン濃度に維持するように構成された生理学的適合性緩衝液である。いくつかの実施形態において、内部標準は、光分解区域１０２において閃光光分解光を受光し、その結果、蛍光性になるように構成される。例えば、線量計内部標準は、様々な実施形態において、水酸化物ラジカルとの反応の際に、少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍の因子によって蛍光を増加してもよい。

【0046】

測光検出スキームとしては、蛍光、測光吸光度、屈折率検出、光散乱検出、および発光が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、測光検出スキームは、紫外線（ＵＶ）蛍光または発光を生成するためにＵＶ光励起源を使用する蛍光検出器を含む。いくつかの実施形態では、蛍光検出器は、可視蛍光または発光を生成するために、ＵＶ励起源を使用する。いくつかの実施形態では、蛍光検出器は、可視蛍光または発光を生成するために、可視励起源を使用する。いくつかの実施形態では、蛍光検出器は、積分光散乱検出器も含む。 いくつかの実施形態では、蛍光検出器は、一体型光屈折率検出器も含む。

【0047】

制御電子機器１０５は、実験室交流（alternating current：ＡＣ）電源から導出された直流（direct current：ＤＣ）駆動電圧を周辺アセンブリに提供し、アナログおよびデジタル制御信号を周辺装置に提供し、アナログまたはデジタル情報を周辺装置から受信し、ＡＤＣおよびデジタルアナログ変換（digital to analog conversion）機能を提供し、データを機器コントローラー１０６に提供し、コマンドを機器コントローラー１０６から受信するように機能する。典型的な実施形態において、制御電子機器アセンブリは、試料導入システム１０１内に配置されたモーターとインターフェースで接続されるモーターコントローラーを含む。さらに、そのような実施形態における制御電子機器アセンブリは、機器コントローラー１０６とのデジタル通信のためのユニバーサルシリアルバス（universal serial bus：ＵＳＢ）ハブを含んでもよい。

【0048】

機器コントローラー１０６は、様々な機器周辺装置のためのプロセス制御を提供する一方で、これらの装置からデジタル形式でステータスおよびデータ情報を受信するように機能する。いくつかの実施形態では、機器コントローラー１０６は、２つの主要モジュール、すなわち、器具構成要素制御のための低レベルマルチスレッドモジュールと、高レベルユーザーインターフェース（user interface：ＵＩ）モジュールと、を有するソフトウェア制御プログラムを実行する。いくつかの実施形態では、制御電子機器１０５は、埋込マイクロプロセッサーを含み、埋込マイクロプロセッサーは、ＵＳＢまたは無線インターフェースを介して機器コントローラー１０６の高レベルＵＩ制御プログラムと通信しながら、低レベル器具構成要素制御を提供する、

【0049】

機器コントローラー１０６、制御電子機器１０５、および様々な相互接続は、共に、閃光光分解システム１００を制御するように構成された制御理論回路を表す。この制御理論回路は、本明細書で開示される方法のいずれかの工程を実行するように構成され得る。例えば、いくつかの実施形態において、制御理論回路は、目標濃度の標識ラジカルが各生物学的実体（entity）について生成されたことを特定するように構成される。この目標濃度は、必要に応じて、タンパク質または細胞構成要素の標識反応が所望の完了レベルに近づくのに十分な標識ラジカル剤を有することを確実にするように選択される。

【0050】

制御理論回路は、さらに、光分解区域１０２における条件を調整して標識ラジカルの目標濃度を満たすことを含むフィードバックループを管理するように構成されてもよい。光分解区域１０２における条件は、例えば、標識ラジカル源の濃度を変化させること、試料導入システム１０１における流速を変化させること、光分解光源１０３から受光する光の量を変化させること、光が光分解光源から受ける時間を変化させること、単離された細胞の分離距離／量を変化させることなどによって調整されてもよい。光分解区域１０２における条件を変化させることによって、制御理論回路は、第１分析対象の分析に基づいて試料導入システム１０１および／または光分解光源１０３にフィードバックを提供して、第２分析対象の分析を改善することができる。

【0051】

いくつかの実施形態では、制御理論回路は、線量測定区域内の内部標準からの蛍光信号に基づいて、細胞からの酸化および／または同定されたペプチドの定量を、正規化するように構成される。これは、閃光光分解システム１００の異なる実例を使用する異なる実験からの結果の比較を可能にする。

【0052】

制御理論回路は、選択的に、さらに、光分解区域１０２内で細胞が光分解光を受光する時間を特定するように、および／または単離された細胞が光分解区域１０２に入る時間間隔を特定するように、構成されている。これらの特定は、線量測定区域内における、蛍光、散乱光、または光の位相変化の検出に基づいてもよく、試料導入システム１０１における流速および／または流量を調整することによって制御されてもよい。

【0053】

制御理論回路は、選択的に、さらに、標識細胞リザーバーおよび分析器への細胞の流れを制御するように構成される。例えば、制御理論回路は、破裂した細胞が標識細胞リザーバーの特定の容器から迂回されるように、または、異なる酸化細胞が時間の関数にわたって異なる区画内に配置されるように、細胞の流れを制御するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、制御理論回路は、分析器からの分析対象信号を使用して、閃光光分解システム１００の任意の態様を制御するように構成される。

【0054】

機器コントローラー１０６および制御電子機器１０５は、選択的に、単一の装置に組み合わせられる。
＜生体外分析対象光化学標識＞

【0055】

図２は、生体外分析対象の処理をサポートするように構成された閃光光分解システム１００のさらなる詳細を、システムのマイクロ流体システム２００の特定の説明とともに示す。 試料／生成物マイクロプレート２０１、試料入口／生成物出口ポート２０２、組み合わされた光分解および線量測定セル２０３、インラインマイクロ流体ミキサー２０４、光流体チップ２０５、緩衝液シリンジポンプ２０６、標識試薬シリンジポンプ２０７、緩衝液リザーバー２０８、廃棄物リザーバー２０９、試料貯蔵ループ２１０、標識試薬リザーバー２１１、試薬移送ライン２１２、緩衝液シリンジポンプ四方弁２１３、インラインミキサーゲート弁２１４、試薬廃棄物ライン２１５、標識試薬シリンジポンプ四方弁２１６、試薬導入ライン２１７、緩衝液導入ライン２１８、緩衝液廃棄物ライン２１９、試料マイクロウェル（microwell）２２０、廃棄物収集マイクロウェル２２１、および生成物収集マイクロウェル２２２が示されている。

【0056】

標識される試料は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ＵＳＡ）から入手可能な９６または３８４ウェルプレート等の試料／生成物マイクロプレート２０１などの貯蔵容器内に貯蔵される。試料は、試料入口／生成物出口ポート２０２を通して吸引によって導入される。吸引された試料は、システムの線量測定および光分解区域２０３を通過し、さらにインラインミキサー２０４を通って引き込まれる。インラインミキサー２０４ならびに光分解および線量測定区域２０３は、両方とも、光流体チップ２０５内に形成される。

【0057】

マイクロ流体システム２００は、２つのシリンジポンプ、緩衝液シリンジポンプ２０６および標識試薬ポンプ２０７を含む。シリンジポンプ２０６は、緩衝液リザーバー２０８、廃棄物リザーバー２０９、および試料貯蔵ループ２１０と連通している。 シリンジポンプ２０７は、試薬移送ライン２１２を介して、廃棄物リザーバー２０９、試薬リザーバー２１１、およびインラインミキサー２０４と連通している。

【0058】

標識プロセスの前に、マイクロ流体循環路は、プライミングされる。シリンジポンプ２０６は、その四方弁２１３を緩衝液リザーバー２０８と連通するように切り替えることによって緩衝液で充填される。そのプランジャーは、シリンジをその容積を完全に充填するために引き抜かれる。シリンジポンプ２０６の容積は、標識される試料の所望の量に応じて、５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１．５ｍＬ、２．０ｍＬ、および２．５ ｍＬの範囲であり得るが、これらに限定されない。次に、シリンジポンプ２０６は、貯蔵ループ２１０と連通するように弁２１３を切り替え、システムを洗い流すのに十分な量をポンピングすることによって、マイクロ流体システムをプライミングする。システム洗い流しの間、緩衝液は、インラインミキサー２０４、光分解および線量測定区域２０３、ポート２０２を通って流れるように方向付けられ、最終的にマイクロプレート２０１の指定された廃棄物ウェル２２１に分注される。このプロセスの間、弁２１４は、インラインミキサー２０４に対して閉じられたままであり、その結果、緩衝液は、チップ２０５を通って方向付けられ、ミキサー２０４を通って出ず、最終的に試薬移送ライン２１２に流入することはない。

【0059】

チップをプライミングした後、試薬送達循環路がプライミングされる。試薬ポンプ２０７は、弁２１６が試薬導入ライン２１７に接続している間に、そのプランジャーを引き戻すことによって試薬リザーバー２１１から引き出された試薬で完全に充填される。試薬ポンプ２０７の容量は、標識される試料の所望の量に依存して、５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１．５ｍＬ、２．０ｍＬ、および２．５ｍＬの範囲であり得るが、これらに限定されない。試薬移送ライン２１２は、シリンジ２０７の内容物を試薬移送ライン２１２に移送するように構成された四方弁２１６を有する試薬ポンプ２０７でポンピングすることによって洗い流され、試薬移送ライン２１２は、プライミング量を、試薬廃棄物ライン２１５を介して廃棄物リザーバー２０９に向けるように構成された弁２１４を有する。弁２１４は、弁２１４からミキサー２０４への相互接続容積が０．２５から１．５μＬの範囲に最小化されるように、インラインミキサー２０４に隣接して配置されている。チップ２０５の流体接続のさらなる詳細は、図３に提供される。

【0060】

以下の工程は、光誘起ラジカル反応を使用して生体外試料を標識するために、マイクロ流体システム２００に関して説明される実施形態によって使用される例示的な動作カスケード反応を概説する。このカスケード反応の変形形態は、当業者には明らかであり、そのような変形形態は、機能的に等価であると解釈され、本明細書で提供される例と発明的に異なるものではない。試料／生成物マイクロプレート２０１は、別個のマイクロウェル２２０が、標識される試料、ならびに空のマイクロウェル２２１および２２２を含むように指定されるように配置され、空のマイクロウェル２２１および２２２は、マイクロ流体システム２００のサブシステムの流体プライミング中に沈殿された標識生成物、廃棄緩衝液、または標識試薬を選択的に収集する。生体外ラジカルタンパク質フットプリント法のために、マイクロウェル２２０は、タンパク質または他のタンパク質性生物学的混合物を含む。プライミング後、緩衝液シリンジポンプ２０６は、試料ループ２１０と連通するように弁２１３を移動させることによって所定量の緩衝液を分注し、その結果として、光流体チップ２０５を通して、入口出口ポート２０２を通して指定された廃棄物マイクロウェル２２１に緩衝液を圧送する。ここで圧送される量は、標識される試料の量よりもわずかに大きい。例えば、１００ｍＬの試料が標識のために目標とされる場合、シリンジポンプ２
０６は、１２０ｍＬの緩衝液を廃棄物マイクロウェル２２１に分注する。他の異なる容積比を使用することができ、上記の例は、例示的なものであり、範囲を限定するものではない。

【0061】

マイクロプレート２０１は、ポート２０２が、標識される試料を含むマイクロウェル２２０に浸漬されるように移動される。緩衝液シリンジポンプ２０６は、そのプランジャーを引き出し、弁２１３、インラインミキサー２０４、光分解線量測定セル２０３、およびポート２０２を介して、流体的に連通することによって、所定の量の試料を吸引する。試料は、光分解線量測定セル２０３およびインラインミキサー２０４を通ってチップ２０５に引き込まれ、最終的に試料貯蔵ループ２１０に引き込まれる。この試料吸引プロセス中、インラインミキサーゲート弁２１４は、標識試薬が循環路に引き込まれないようにミキサーを閉鎖する。

【0062】

試薬リザーバー２１１は、タンパク質標識プロセスに必要とされる標識試薬を含む。ＨＲＰＦの場合、リザーバー２１１は、例えば、典型的には２０ｍＭから１０００ｍＭの範囲の濃度で水性過酸化水素を含む。トリフルオロメチルフットプリント法の場合、試薬リザーバー２１１は、過酸化水素と水性トリフリン酸ナトリウムとの混合物を含む。主にＣＦ_３ラジカル標識が望ましい場合、Ｈ_２Ｏ_２およびトリフリン酸ナトリウムをそれぞれ１：４の濃度比で混合し、典型的には５ｍＭのＨ_２Ｏ_２および２０ｍＭのトリフリン酸ナトリウムを使用する。同時にＨＲＰＦおよびＣＦ_３フットプリント法が所望される場合、Ｈ_２Ｏ_２およびトリフリナートをそれぞれ５：１の比で混合し、典型的には５０ｍＭのＨ_２Ｏ_２および１０ｍＭのトリフリン酸を用いる。上記の混合物は例示的であることを意図しており、範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、他の比が機能的に等価であるように機能してもよく、絶対的条件が実際のタンパク質標識条件に基づいて変化してもよい。

【0063】

標識プロセスを開始するために、ポンプ２０６および２０７は、それらのそれぞれの溶液をマイクロ流体循環路内に分注し始める。ポンプ２０６および２０７の相対的なポンピング速度は、光分解区域に入る標識試薬の所望の最終濃度およびリザーバー２１１内に位置する標識試薬の開始濃度に依存する。一例としてヒドロキシル基ラジカル標識を使用すると、試薬リザーバー２１１は、１０００ｍＭ濃度のＨ_２Ｏ_２を含んでもよく、標識中の所望の最終濃度は、１００ｍＭである。このような条件下では、ポンプ２０７のポンピング速度は、ポンプ２０６のポンピング速度の１０分の１である。正味の流速は、ポンプ２０６および２０７によって確立されるポンピング速度の合計である。

【0064】

図３は、後続の説明を可能にする例示的な光流体アレイ３００のさらなる実施形態を示す。試薬入口ポート３０１、緩衝液入口ポート３０２、ミキサー３０３、光分解セル３０４、線量測定セル３０５、入口出口ポート３０６、および流体チャネル３０８を含む光分解セル３０７の詳細図が示されている。光流体チップ２０５を通る流れを確立した後、光分解光源１０３が動作されて、規則的な閃光間隔で光分解区域３０４を照射する。閃光周波数は、０.２５Ｈｚから５Ｈｚの範囲であってもよいが、これに限定されない。閃光周波数および正味の流速は、試料と標識試薬との混合物が一回の閃光によってのみ照射されること、および照射された混合物の各後続ボーラス（bolus）が所定の単離量によって分割されることを確実にするように確立される。このように、光分解セルの照明された量は、必要な正味の流速および閃光速度を規定する。

【0065】

毛細管式の光誘起ラジカルフットプリント法において、光分解光源は、毛細管内腔内に位置する少量の流体を照射するように集束される。典型的な毛細管内径（internal diameter：ＩＤ）は、５０～２５０μｍの範囲であるが、これに限定されない。さらに、照射領域は、２～８ｍｍの範囲であるが、これに限定されない照射軸方向長さを規定する毛細
管軸に沿って延びる。典型的な用途では、６ｍｍの軸方向距離を有する１００μｍＩＤ毛細管は、４７ｎＬの照明容積を含む。５０μＬの試料が標識のために所望される場合、約１,０６４回の閃光が必要とされ、これは、処理するために多くの分を必要とし、光源の消耗を不必要に加速する。さらに、これらの条件下では、エキシマレーザーおよびプラズマ光源の両方の屈折集束限界が、内腔の内径よりも大きいビーム浪費をもたらすので、光分解光のごく一部のみが毛細管内腔内に集束される。このように、先に教示された毛細管式のアプローチは、様々な欠点をもたらす。

【0066】

光流体チップ２０５は、光分解区域３０７によって詳述されるような蛇行光分解区域３０４を含む。光分解区域３０７内の流体経路は、隣接するフローチャネルが密接に並置された状態で、折り畳まれた様式または曲がりくねった様式で配置され、流れは、向流様式で確立される。蛇行光分解区域は、光分解光をより広い入射領域にわたって分布させることができ、屈折焦点制限を克服するので、光分解光源１０３と試料試薬混合物との間のより良好な光－流体整合を可能にする。標識試薬を効果的に光分解するために入射ＵＶ照射に必要な流束量は、ＵＶ源スペクトル放射照度および標識試薬吸光係数に依存する。Ｈ_２Ｏ_２に基づく標識では、２５０ｎｍ未満のＵＶ波長に対して少なくとも３ｍＪ／ｍｍ^２の流速量が典型的に必要とされる。ＯＨおよびＣＦ_３ラジカル標識の両方について、閃光光分解光源１０３は、１６ｍｍ^２までの照射面積を可能にするのに十分なスペクトル放射照度を有する。このような条件下で、光分解セル３０４内の流体チャネル３０８は、約６．４ｍＬの照射体積を含むように配置され得る。このように、光分解区域３０４の照射体積は、前述の１００ｍｍＩＤ毛細管システムの照射体積よりも１３６倍大きく、したがって、標識は、毛細管式の標識に必要とされる時間のほんの一部で進行し、同時に、光分解システムのひずみを９９％超低減する。

【0067】

試料と標識試薬との混合物は、光分解区域３０４において光分解光源１０３によって照射される。露光後、ラジカルが迅速に形成され、典型的には数マイクロ秒以内に試料を共有結合的に修飾する。標識試料、緩衝液、および修飾試薬は、下流に圧送されて、線量測定区域３０５に入る。線量測定区域３０５の内容物は、限定はしないが、測光吸光度、蛍光、光散乱、屈折率検出、および／または化学発光などの測光手段を使用して精査される。線量測定区域３０５において行われるリアルタイム測定は、フィードバックループを可能にし、このフィードバックループにおいて、光分解条件は、所望の量のラジカル生成が生じ、所望の量の生体外分析対象標識が生じることを確実にするように改変され得る。システムの初期動作中、未照射試料と試薬との混合物を含む線量測定区域の測光特性のベースライン測定が行われる。一旦ベースライン測定がなされると、光分解が進行し、測光特性の変化が特定される。ヒドロキシル基ラジカルタンパク質フットプリント法の場合、ＯＨラジカルは、試料を共有結合的に標識し、典型的に使用されるアデニンなどの内部標準ラジカル線量計を同時に攻撃する。この場合、評価される測光特性は、２６５ｎｍでのＵＶ測光吸光度である。ＯＨラジカル攻撃の際に、アデニンは、有効ＯＨラジカル収率に正比例する様式で、ＵＶ２６５ｎｍ吸光度の減少を示す。微調整プロセス中、有効ＯＨラジカル収率は、線量測定信号における評価された変化と目標変化との間の差に応答して、閃光強度またはＨ_２Ｏ_２濃度のいずれかを変更することによって制御される。

【0068】

内部標準ラジカル線量計の実際の応答が所望のレベル未満である場合、光分解光源１０３の閃光エネルギーは、線量計応答の所望のレベルが達成されるまで増加される。あるいは、試薬ポンプ２０７の相対的なポンピング速度は、緩衝液ポンプ２０６に対して増加され、その後、インラインミキサー２０４内での試料との混合後に、標識試薬の有効濃度を増加させる。内部標準ラジカル線量計の実際の応答が所望のレベルよりも大きい場合、光分解光源１０３の閃光エネルギーは、線量計応答の所望のレベルが達成されるまで減少される。あるいは、試薬ポンプ２０７の相対的なポンピング速度は、緩衝液ポンプ２０６に対して減少され、その後、インラインミキサー２０４内での試料と混合後に、標識試薬の
有効濃度を減少させる。

【0069】

図４は、光分解区域３０４においてヒドロキシル基ラジカルを発生させている間に、線量測定区域３０５で得られたＵＶ吸光度対時間のリアルタイム出力トレース４００を示し、１Ｈｚの閃光速度を使用し、１ｍＭのアデニン水溶液の存在下で１００ｍＭＨ_２Ｏ_２を使用し、これは、マイクロ流体ミキサー３０３において２ｍＭアデニン水溶液と２００ｍＭＨ_２Ｏ_２を１：１（ｖ／ｖ）で混合したものである。非露光ベースライン４０１が示されている。下降肩４０２が示されている。測光応答におけるピークシフト（最小値４０３）、またはこの場合はＵＶ吸光度が示されている。上昇肩４０４が示されている。再確立されたベースライン４０５、時間Ｔ１ ４０６で達成された最小ＵＶ吸光度値が示されている。時間Ｔ２ ４０７で達成された最小ＵＶ吸光度値が示されている。当業者に明らかなように、他のアデニン／Ｈ_２Ｏ_２混合比が、標目濃度を達成するために使用されてもよく、１：１混合比は、例示的であり、範囲を限定するものではないことを意味する。露光されていない前述の混合物についてのベースラインＵＶ測光吸光度測定は、非露光ベースライン４０１によって表される。非露光ベースライン４０１において、ベースラインＵＶ吸光度は、泳動用緩衝液（この場合は水）のバックグラウンドに対して特定されるように、約５５ミリ吸光度単位（milli-absorbance units：ｍＡＵ）であると解釈される。光分解区域３０４内でこの混合物を光照射すると、ＯＨラジカルが形成され、続いてアデニンを酸化する。光照射時間は、特に限定されないが、典型的には１０μ秒である。続いて、ヒドロキシル基ラジカル反応がさらに約１～５μ秒間進行し、その後、反応が自己停止する。照射された混合物が光分解区域３０４から流れ線量測定区域３０５に入ると、測光吸光度信号は、下降肩４０２に示されるように、減少し始める。標識試料のＵＶ吸光度最小値は、最小値４０３で示されるように、約３３ｍＡＵであると解釈される。ここで、混合物の最初に照射されたボーラスについてのアデニンＵＶ吸光度の有効変化は、非露光ベースライン４０１と最小値４０３との間の差（５５ｍＡＵ－３３ｍＡＵ）をとることによって計算され、２２ｍＡＵであると特定される。照射された混合物が線量測定区域３０５から流出するにつれて、測定されたＵＶ吸光度は、上昇肩４０４によって示されるようにそのベースラインに戻り、ベースライン４０５に再び達する。光照射時のＵＶ吸光度の特定された変化は、標識実験のための目標変化と比較される。吸光度変化の有効レベルが所望の目標から逸脱した場合、閃光エネルギーおよび／またはＨ_２Ｏ_２濃度を変更して、前述の制御ループロジックを使用してＯＨラジカル収率を調整する。目標レベルの内部標準線量計測光特性変化が達成されると、所望の量の標識試料が処理され続いて収集されるまで、光照射／線量計応答評価処理が繰り返される。

【0070】

標識プロセス中、線量計応答における有効な変化は、全標識プロセスの再現性および固有の品質を特定するために、各閃光サイクルについて選択的にアクセスされてもよい。これらの条件下で、各閃光サイクルに対する有効線量計応答についての平均、標準偏差、およびパーセント相対標準偏差（relative standard deviation：ＲＳＤ）が取られ、予め確立された品質の測定基準と比較される。典型的なＲＳＤ品質測定基準は、標的タンパク質に対する特定の光化学標識条件によって決定され、５％未満であり得るが、これに限定されない。品質測定基準が達成された場合、標識実験は、許容可能な品質であると決定される。 品質測定基準が達成されない場合、標識実験は、疑わしいものとしてフラグを立てられ、実験者は、適切に警告される。

【0071】

混合物の各露光ボーラスは、所定の単離量に分割され、所定の単離量は、連続閃光間に光分解区域３０４を通って流れる未照射混合物を含む。単離量は、混合物の各ボーラスが１回だけ光照射されることを確実にするために必須であり、これは、照射された試料が光照射される次の試料のボーラスに戻る望ましくない逆行軸方向拡散を軽減するための緩衝区域として効果的に作用すること、および層流軸方向速度差（laminar flow axial velocity differences）を調整することによる。有用な単離量は、標識生成物の望ましくない
希釈を同時に減少させながら、望ましくない二重照射に対して保証する量である。例示的な望ましい単離量目標は、試料を約１０％希釈する量であると解釈される。

【0072】

図４に示される測光応答プロット４００は、アデニンのＯＨラジカル攻撃中に生成される線量計応答最小値の差を特定することによって、有効単離量を計算するために使用され得る。Ｔｒｉｓまたはヒスチジン緩衝液のような他の内部標準ラジカル線量計は、ＯＨラジカル攻撃の際に増加した測光吸光度を示し、この場合、測光応答プロット４００は、極大値を示す。この例示的な考察のために、アデニンを再び内部標準ラジカル線量計として使用する。アデニンについて、混合物の２つの連続的に光照射されたボーラスは、４０６および４０７によって示されるように、２つのそれぞれの有効線量計応答最小値を含む。４０６（Ｔ１）と４０７（Ｔ２）との間の時間差は、計算され得る。例示のために、Ｔ１とＴ２との間の時間差が１．２５秒であると考える。前述の１Ｈｚの閃光速度に対して、閃光間隔は、１．０秒であると特定される。アデニンの例では、単離量は、正味の流速、および閃光間隔と線量計最小間隔との間の差によって特定される。アデニンの例では、正味の流速は、７０μＬ／分または１．１７μＬ／秒であった。したがって、単離量は、１．１７μＬ／秒（１．２５秒）＝０．２９μＬであると特定される。光分解セル３０４の幾何学的特性によって決定される総露光量が３μＬである場合、単離量は、照射量の約１０％であるとみなされ、各ボーラスの１回の閃光露光を確実にするのに十分であると決定される。単離量が所望の目標よりも小さい場合は、所望の単離量を達成するために、正味の流速を比例的に増加させてもよいし、あるいは閃光速度を比例的に減少させてもよい。単離量が所望の目標を超えた場合は、所望の単離量を達成するために、正味の流速を比例的に減少させてもよいし、あるいは閃光速度を比例的に増加させてもよい。 一実施形態では、上述の制御理論ロジックは、機器コントローラー１０６によって自動的に実行される。

【0073】

一旦適切な線量計応答および単離量が達成されると、試料混合物は、確実に標識されることができ、標識された生成物が収集される。標識および生成物収集プロセス中、機器コントローラー１０６は、線量計および単離量目標が達成された時間を記録し、入口出口ポート２０２の出口への適切に標識された生成物の到着時間を特定する。到着時間は、線量測定区域３０５から入口出口ポート２０２までの移送量と正味の流速との商によって特定される。適切に標識された生成物が到着する前に、光流体チップ２０５の出て行く内容物は、ポート２０２を通して指定された廃棄物ウェル２２１に分注される。機器コントローラー１０６の制御下で、適切に標識された生成物が入口出口ポート２０２の出口に到達すると、マイクロプレート２０１は、標識された生成物が生成物収集マイクロウェル２２２内に収集されるように、試料導入システム１０１によって移動される。
＜生体内光化学標識＞

【0074】

先の議論は、生体外試料を標識するための本発明の実施形態の詳細を記載した。 ここで、生体内標識反応をサポートする実施形態についての詳細を記載する。図５は、オンチップ生体内光化学標識のためのマイクロ流体循環路５００および光流体チップ５０１を示す。マイクロプレート２０１、試料入口生成物出口ポート２０２、細胞含有マイクロプレートウェル２２０、廃棄物受容マイクロウェル２２１、生成物収集マイクロウェル２２１、生体内ラジカル標識光流体チップ５０１、シース流発生器５０２、インラインミキサー５０３、光分解区域および線量測定区域アレイ５０４、試料緩衝液マイクロ流体ポンピングシステム５０５、シース緩衝液マイクロ流体ポンピングシステム５０６、試薬マイクロ流体ポンピングシステム５０７、シース流緩衝液シリンジポンプ５０８、四方マイクロ流体弁５０９、シース緩衝液リザーバー５１０、廃棄物リザーバー５１１、シース緩衝液ティー（sheath buffer tee）５１２、試料緩衝液シリンジポンプ５１３、四方マイクロ流体弁５１４、廃棄物リザーバー５１５、緩衝液リザーバー５１６、試料ループ５１７、試薬シリンジポンプ５１８、四方マイクロ流体弁５１９、試薬リザーバー５２０、試薬移送
ライン５２１、シース流入口ポート５２２、およびインラインミキサー試薬導入ポート５２３が示されている。

【0075】

光流体チップ５０１は、３つの異なる機能区域、すなわち、シース流発生器５０２、標識試薬／試料インラインミキサー５０３、ならびに光分解および線量測定セルアレイ５０４を含む。光流体チップ５０１は、３つの異なるマイクロ流体循環路、すなわち、緩衝液および試料流体システム５０５、シース流流体システム５０６、ならびに試薬導入流体システム５０７に接続される。標識を開始する前に、３つの流体システム全てがプライミングされる。システム５０５は、緩衝液シリンジポンプ５１３および弁５１４の作用によってプライミングされる。第１弁５１４は、緩衝液リザーバー５１６とシリンジポンプ５１３との間の流体連通を可能にするように構成される。ポンプ５１３は、緩衝液リザーバー５１６から吸引された泳動用緩衝液で充填される。充填後、弁５１４は、シリンジポンプ５１３と廃棄物リザーバー５１５との間の連通を可能にするように再構成される。シリンジポンプ５１３の内容物は、廃棄物リザーバー５１５に圧送される。このプライミングサイクルは、流体システム５０５内の全ての空気が排出され、以前の緩衝液の残りが洗い流されるまで継続される。典型的な状況下では、サイクルは、３回繰り返されるが、これに限定されない。次に、シリンジポンプ５１３に泳動用緩衝液が再充填され、弁５１４は、試料ループ５１７を介してシリンジポンプ５１３と光流体チップ５０１との間の流体連通を可能にするように構成される。次に、泳動用緩衝液は、シリンジポンプ５１３によって、試料ループ５１７を通して、光流体チップ５０１内に圧送され、緩衝液は、シース流発生器５０２、インラインミキサー５０３、光分解および線量測定区域アレイ５０４を通って流れ、入口出口ポート２０２を介してマイクロプレート２０１内の指定された廃棄物マイクロウェル２２１に流出する。

【0076】

システム５０５をプライミングした後、シース流流体システム５０６がプライミングされる。弁５０９は、シース緩衝液シリンジポンプ５０８とシース緩衝液リザーバー５１０との間の流体連通を可能にするように構成される。生体内光化学標識のために、リザーバー５１０および５１６は、同じ緩衝液を含む。シース流緩衝液は、吸引されて、シース緩衝液シリンジポンプ５０８を満たす。充填後、弁５０９は、シース緩衝液シリンジポンプ５０８と廃棄物リザーバー５１１との間の流体連通を可能にするように再構成される。廃棄物リザーバー５１１は、試薬導入システム５０７と共有されてもよい。さらに、試薬導入システム５０７、マイクロ流体ポンピングシステム５０６、およびシステム５０５は、選択的に、同じ廃棄物緩衝液リザーバーを利用してもよい。シース緩衝液シリンジポンプ５０８は、その内容物を廃棄物リザーバー５１１に排出にする。このプライミングサイクルは、流体システム５０６内の全ての空気が排出され、以前の緩衝液の残りが洗い流されるまで継続される。典型的な状況下では、サイクルは、３回繰り返されるが、これに限定されない。次に、シース緩衝液シリンジポンプ５０８は、シース緩衝液で再充填され、弁５０９は、シース緩衝液シリンジポンプ５０８と光流体チップ５０１との間の流体連通を可能にするように構成される。シース流緩衝液の流れは、結合ティー５１２によって分割され、結合ティー５１２は、シース流発生器５０２のポート５２２を通って光流体チップ５０１に入るシース流緩衝液の２つの流れを確立する。次に、シース流緩衝液は、シース流発生器５０２、インラインミキサー５０３、光分解および線量測定区域アレイ５０４を通って流れ、マイクロプレート２０１内の指定された廃棄物マイクロウェル２２１に入口出口ポート２０２を介して流出する。

【0077】

システム５０５およびマイクロ流体ポンピングシステム５０６をプライミングした後、試薬流体システム５０７がプライミングされる。弁５１９は、試薬リザーバー５２０と試薬シリンジポンプ５１８との間の流体連通を可能にするように構成される。試薬溶液は、吸引されて、試薬シリンジポンプ５１８を満たす。充填後、弁５１９は、試薬シリンジポンプ５１８と廃棄物リザーバー５１１との間の流体連通を可能にするように再構成される
。廃棄物リザーバー５１１は、シース緩衝液流体システム５０６と共有されてもよい。さらに、試薬流体システム５０７、シース緩衝液流体システム５０６、およびシステム５０５は、選択的に、同じ廃棄物緩衝液リザーバーを利用してもよい。試薬シリンジポンプ５１８は、その内容物を廃棄物リザーバー５１１に排出する。このプライミングサイクルは、流体システム５０７内の全ての空気が排出され、以前の試薬溶液の残りが洗い流されるまで継続される。 典型的な状況下では、サイクルは、３回繰り返されるが、これに限定されない。

【0078】

次に、試薬シリンジポンプ５１８は、試薬溶液で再充填され、弁５１９は、試薬シリンジポンプ５１８と光流体チップ５０１との間の流体連通を可能にするように構成される。試薬溶液は、試薬移送ライン５２１を通って圧送され、インラインミキサー５０３の試薬入口ポート５２３を通って光流体チップ５０１に入る。後者と同時に、流体システム５０６および５０５は、前述したように、それらの流体成分を光流体チップ５０１内に圧送する。このようにして、試薬流体システム５０７からのものを含む全ての流体の流れは、チップの下方に向けられ、最終的にポート２０２を出て廃棄物マイクロウェル２２１に向かう。これで、システムは、生体内ラジカルタンパク質フットプリント法の準備が整う。

【0079】

生体内ラジカルタンパク質フットプリント法のために、マイクロウェル２２０は、緩衝液中に懸濁された細胞、組織、または生物を含む。試薬マイクロ流体ポンプシステム５０７およびシース緩衝液シリンジポンプ５０８が静止したままである間、緩衝液シリンジポンプ５１３は、弁５１４を介して試料ループ５１７に接続される。緩衝液シリンジポンプ５１３は、マイクロウェル２２０から細胞を吸引するために使用される。細胞は、ポート２０２まで吸引され、線量測定区域アレイ５０４、インラインミキサー５０３、シース流発生器５０２を通って、最終的に試料ループ５１７に流入する。典型的には、緩衝液中に懸濁された所定量の細胞が吸引され、試料ループ５１７内に貯蔵される。このようにして、細胞は、また、光流体チップ５０１の各区画および内部ポート２０２を通って残る。標識が始まると、流体システム５０７、５０６、および５０５は、同時に流動を開始し、最終的に、試料ループ５１７内に貯蔵された細胞を光流体チップ５０１内に押し込み、そこで、細胞は、標識試薬と混合され、その後、光照射されて、光ラジカル標識プロセスを開始する。

【0080】

細胞が互いに単独で単離され、それらが光照射されたときに一緒に塊にならないまたは凝集しないようにするために、シース流がシース流発生器５０２内に確立され、シース流緩衝液の小分割量によって細胞を分離する。典型的な条件下では、シース緩衝液流速は、緩衝液シリンジ流速の１０倍であるように確立されるが、これに限定されない。後述するように、流体システム５０５および５０６の流速比は、所望の程度の細胞単離を達成するように自動的に調整されてもよい。流体システム５０５および５０６のポンピング活動と同時に、試薬流体システム５０７は、インラインミキサー５０３内で流動細胞と混合するために標識試薬を送達する。生体外標識の場合、シース緩衝液シリンジポンプ５０８およびシステム５０５の正味の流速に対する試薬流体システム５０７の相対流速は、標識試薬の濃度、およびインラインラジカル線量測定システムによって特定されるような有効ラジカル収率の所望のレベルに応じて、自動的に調整され得る。

【0081】

図６は、光流体チップ６０１の好ましい実施形態の詳細図を示す。光流体チップ６０１、緩衝液シリンジポート６０２、試薬入口ポート６０３、試薬ミキサー６０４、シース緩衝液入口ポート６０５、シース流発生器６０６、光分解区域６０７、線量測定区域６０８、および試料入口／生成物出口ポート６０９が示されている。光流体チップ６０１では、試薬ミキサー６０４がシース流発生器６０６の上流に位置する。細胞は、緩衝液シリンジポート６０２を介して光流体チップ６０１に入る。この時点で、それらは単離されず、細胞の密に塊となった集団または他の生体内実施形態として入ってもよい。試薬ミキサー６
０４に入ると、それらは、試薬入口ポート６０３を介して緩衝液シリンジポート６０２に入る標識試薬と混合される。当業者に知られているように、複数の異なる生体内標識試薬が使用されてもよいが、例示的な目的で、生体内ヒドロキシル基ラジカルタンパク質フットプリント法に使用される過酸化水素の使用について説明する。Jonesら（Espino,J.A.;Mali,V.S.;Jones,L.M.,In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical chemistry 2015,87(15),7971-7978.）に記載されているように、過酸化水素は、細胞または他の生体外実体によって迅速かつ容易に取り込まれ、全ての細胞区画に迅速に分注される。後述するように、使用される過酸化水素の最終濃度は、基本的に、線量測定区域６０７で精査される内部標準ラジカル線量計の測光特性の変化によって評価される有効ヒドロキシル基ラジカル収率を特定することによって、閉ループ方式で特定される。

【0082】

マイクロウェル２２０内への沈殿の前に、内部標準ラジカル線量計は、細胞の集団または他の生体内実施形態に添加され、この混合物は、内部標準ラジカル線量計が全ての細胞によって取り込まれ、最終的に細胞間および細胞区画内で均一な分布を達成するように、十分に培養される。次に、細胞を沈降して沈殿物を形成し、上清液を除去する。次に、細胞の沈殿物を緩衝液中に再懸濁し、再度２回目の沈降を行う。このプロセスを、全ての細胞外内部標準ラジカル線量計が除去されるまで繰り返す。細胞外内部標準ラジカル線量計がなくなったら、細胞を緩衝液中に再懸濁し、最終的にウェル２２０に移送する。

【0083】

試薬ミキサー６０４を通過した後、細胞試薬混合物は、シース流発生器６０６に入る。シース流発生器６０６は、シース流緩衝液を受容するための空洞およびシース流緩衝液ポート６０５を含み、発生器６０６のこれらの構成要素は、ともに、流体力学的集束を生成するように成形および配置され、細胞は、シース流緩衝液によって単離される。マイクロ流体システム５０５、５０６、および５０７の相対流速は、所望の細胞間単離量が確立され、同時に標的細胞内ヒドロキシル基ラジカル収率を達成するように調整される。シース流発生器６０６を通過した後、単離された細胞集団は、光分解区域６０７に入り、そこで細胞内光標識ラジカル反応を開始させる光が照射される。光分解区域６０７を通過した後、細胞は、線量測定区域６０８に入り、そこで、有効ラジカル収率、ならびに細胞間距離およびその後の細胞間分割量（partitioning volume）を評価するために光学的に精査される。

【0084】

生体内ラジカルタンパク質フットプリント法の間、細胞内内部標準ラジカル線量計応答は、線量測定区域６０８を通して精査される際に測光的に測定される。典型的な測光測定手段としては、測光吸光度、測光発光、および測光蛍光が挙げられるが、これらに限定されない。単一細胞または他の単一生体内実施形態内で生成される測光信号を検出することが望ましいので、測光蛍光は、そのダイナミックレンジおよび分析感度が典型的に他の前述の方法よりも優れているため、好ましい測定手段であり得る。

【0085】

生体内ラジカルタンパク質フットプリント法のために、蛍光内部標準ラジカル線量計は、ラジカル攻撃および最終的な共有結合修飾の際に、励起および発光特性などの蛍光特性を変化させる。そのような変更は、線量計が所与の励起／発光波長設定について蛍光の増加または減少を行うように、線量計の励起および発光特性を変化させることを含み得る。ラジカル線量計信号検出の感度を最大化することが望ましいので、ラジカル攻撃に起因する取得した蛍光の存在を検出することは、暗または０（dark or zero）バックグラウンドでの小さな信号の検出を可能にするため、このアプローチのための好ましい実施形態である。ラジカル線量計蛍光検出器は、共有結合的に修飾された内部標準線量計についての特定の励起および発光波長を使用して構成される。線量計がその天然状態にある場合、蛍光信号は、検出されない。ラジカル攻撃の際に、線量計の蛍光特性は、選択された励起波長および発光波長に対応するように変化され、検出された蛍光信号強度は、共有結合的に修
飾れた内部標準線量計の濃度に比例し、同様にして、有効ラジカル収率に比例する。

【0086】

図７は、５つの異なる内部標準ラジカル線量計を示し、ヒドロキシル基ラジカル攻撃を使用して酸化された場合に、線量反応様式（dose response manner）で示された励起波長および発光波長の蛍光信号信号を示す。表７００は、線量反応様式でヒドロキシル基ラジカル攻撃に反応する以下の内部標準ラジカル線量計についての細胞分布ならびに蛍光励起および発光波長を列挙する。テレフタル酸、ＣｅｌｌＲｏｘ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ジクロロフルオレセイン、ＣｅｌｌＲｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、およびＣｅｌｌＲｏｘ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ。各線量計が主に分布する細胞内部分もまた示されている。ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）色素は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ＵＳＡ）から市販されている。

【0087】

図８は、本発明の内部標準ラジカル線量計測光検出器８００の実施形態を示す。光源８０１、集束レンズ８０２、励起光８０３、線量測定区域６０８、ダイクロイックミラー８０４、発光光８０５、コリメーター８０６、干渉ノッチフィルター８０７、狭帯域発光光８０８、蛍光／発光光検出器８０９、散乱光８１０、コリメーター８１１、および光散乱検出器８１２が示されている。内部標準ラジカル線量計測光検出器８００は、組み合わされた蛍光および光散乱検出器システムである。当業者には明らかであるように、この組み合わされたシステムは、２つの別個の（蛍光および光散乱）検出器によって置き換えることができ、そのため、本実施形態は、例示的なものであり、範囲を限定するものではない。生体内要素が線量測定区域６０８に入ると、レンズ８０２によって集束され、ダイクロイックミラー８０４によって線量測定区域６０８に向けられた光源８０１からの励起光８０３によって、それらは照射される。光源８０１は、Ｑ－Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から入手可能なＵＶ発光ダイオード（light emitting diode：ＬＥＤ）などの狭帯域幅固体ＵＶ源、またはＴｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）から入手可能な小型固体レーザーであってもよい。あるいは、光源８０１は、Ｑ‐Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から入手可能な可視ＬＥＤなどの固体可視光源、またはＴｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）から入手可能な小型固体可視レーザーであってもよい。典型的な出力パワーは、０.１～１０ｍＷの範囲とすることができるが、これに限定されず、典型的な帯域幅は、１から１５ｎｍの範囲とすることができるが、これに限定されない。光源８０１の波長は、使用される生体内内部標準ラジカル線量計の励起波長に対して適切な選択であるように選択される。集束レンズアセンブリ８０２は、限定されないが、線量測定区域６０８の中心の１～２００μｍ程度の狭いビームに励起光を集束させるために使用され、精査線量測定区域を生成する。ダイクロイックミラー８０４は、励起光を効率的に反射するが、線量測定区域６０８内で照射された共有結合修飾内部標準線量計から生じる発光光８０５を、透過するように選択される。

【0088】

発光光８０５は、最終的にコリメーター８０６によって平行化され、次に、干渉ノッチフィルター８０７を通過して、蛍光発光光検出器８０９に入射する狭帯域発光光８０８を生成する。光検出器８０９は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ（浜松市、日本）から入手可能なＳ１３３６－８ＢＱシリコンフォトダイオードなどのシリコンフォトダイオードを含んでもよい。あるいは、光検出器８０９は、Ｈａｍａｍａｔｓｕから入手可能なＭｉｃｒｏＰＭＴアセンブリＨ１２４００などの小型光電子増倍管（photo-multiplier tube：ＰＭＴ）を含んでもよい。光検出器８０９の出力電流は、電流－電圧（Ｉ－Ｖ）変換器によって処理されて、狭帯域発光光８０８の入射発光光強度に比例する電圧を提供する。光検出器８０９の出力電圧は、制御電子機器１０５に伝送され、アナログデジタル変換器（analog to digital converter：ＡＤＣ）は、最終的に、蛍光計算が行われる機器コントローラー１０６に伝送されるデジタル信号を生成する。

【0089】

細胞または他の生体内実施形態が線量測定区域６０８に入ると、それらは、励起光８０
３を弾性的に散乱させる。入射励起光波長（ｎｍ）と生体内実体サイズ（μｍ）との間のサイズ差により、散乱光８１０は、入射励起光に対して直角な光が優先的に検出される。散乱光８１０は、コリメーター８１１によって平行化され、最終的に散乱光検出器８１２に入射する。所与の励起光強度に対して、散乱光の測定された強度は、量を精査する線量測定区域６１８内に位置する生体内実体のサイズおよび数に比例する。散乱光検出は、入射励起光に対して直交する方向で行われているので、バックグラウンド散乱も測定される。生体内実体が存在しない場合、精査された量の内容物の弾性散乱および非弾性散乱、ならびにラジカル線量計光学表面からの弾性散乱は、非常に低く、そのため、非常に低いバックグラウンド信号を生成する。光散乱信号は、固有の蛍光とは無関係に均一に生成され、そのため、内部標準ラジカル線量計信号なしで細胞または他の生体内実施形態の存在を検出することができる。

【0090】

散乱光検出器８１２は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ（浜松市、日本）から入手可能なＳ１３３６－８ＢＱシリコンフォトダイオードなどのシリコンフォトダイオードを含んでもよい。あるいは、光検出器８１２は、Ｈａｍａｍａｔｓｕから入手可能なＭｉｃｒｏＰＭＴアセンブリＨ１２４００などの小型光電子増倍管（ＰＭＴ）を含んでもよい。散乱光検出器８１２の出力電流は、電流－電圧（Ｉ－Ｖ）変換器によって処理されて、入射散乱光８１０に比例する電圧を提供する。光検出器８１２の出力電圧は、制御電子機器１０５に伝送され、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）は、最終的に、光散乱計算が行われる機器コントローラー１０６に伝送されるデジタル信号を生成する。

【0091】

図９は、本発明の内部標準ラジカル線量計測光検出器９００の別の実施形態を示す。蛍光励起光源９０１、赤色ダイオードレーザー干渉パターン光源９０２、光収集および伝送分岐光ファイバー９０３、ファイバー出力結合光学系９０４、線量測定セル６０８、散乱光列９０５、光学ビームスプリッター９０６、光散乱電荷結合素子カメラ９０７、蛍光列９０８、蛍光収集光学系９０９、蛍光選択干渉フィルター９１０、蛍光検出器８０９、遠視野干渉縞パターン９１１、および抽出空間周波数９１２が示されている。

【0092】

組み合わされた蛍光および光散乱検出器システム９００では、光源は、蛍光内部標準ラジカル線量計要件に合致するように交換されてもよく、光散乱検出は、線量測定セルによって生成される干渉パターンを撮像する二次元電荷結合素子（charged couple device：ＣＣＤ）撮像カメラを使用して達成される。蛍光励起源９０１および赤色ダイオード干渉パターン光源９０２は、光流体チップ６０１から離れて配置され、分岐光ファイバー９０３および必要な光ファイバー結合光学系９０４を使用して線量測定セル６０８に結合される。光源９０１によって生成される波長は、使用された内部標準ラジカル線量計の励起波長要件に合致するように選択される。赤色ダイオード干渉パターン光源９０２は、６５０ｎｍの赤色ダイオードレーザーを使用して、線量測定セル６０８の遠方光学場に生成される光学干渉パターンを生成する。このような構成では、光源９０１および９０２を、機器の外部に取り付けることができ、ラジカル線量測定を行うときに、光源を交換する容易な手段を提供する。

【0093】

光源９０１および９０２からのコヒーレント光は、単一式光ファイバー９０３内で均質化され、線量測定セル６０８に入射するように向けられる。ビームスプリッター９０６は、線量測定セル６０８を出る光を分割して、２つの光学列、すなわち散乱列９０５および蛍光列９０８を生成するために使用される。光散乱列９０５は、線量測定セル６０８の光学遠視野において生成される。赤色ダイオード干渉パターン光源９０２は、コヒーレント光源であるため、そのモダリティー（modality）は、線量測定セル６０８の光学特性と相互作用して、電荷結合素子二次元カメラ９０７によって撮像されるような遠視野干渉縞パターン９１１を生成する。

【0094】

蛍光列９０８は、収集光学系９０９によって収集され平行化され、収集光学系９０９は、干渉フィルター９１０を透過するように光を方向付ける。干渉フィルター９１０の帯域通過特性は、内部標準ラジカル線量計発光スペクトルに合致するように選択される。干渉フィルター９１０の光帯域幅は、１０ｎｍとすることができるが、これに限定されない。干渉フィルター９１０および蛍光励起源９０１は、表７００に列挙されるものなど複数の異なる内部標準ラジカル線量計を収容するために、整合対として交換されるので、干渉フィルター９１０は、ユーザーアクセス可能で除去が簡単な取り付け具に収容される。蛍光発光光は、蛍光検出器８０９によって検出される。

【0095】

細胞が線量測定セル６０８に入ると、それらは、赤色ダイオードレーザー干渉パターン光源９０２の光を弾性的に散乱させ、そのような散乱は、光の平均偏光度を変化させ、同様にして、精査領域を出る光の屈折率および結果として生じる位相（resultant phase）を変化させる。精査領域の屈折率が変化すると、結像された縞９１１は、屈折率の変化に応じて右または左に位置的に変化する。所与の水平またはｘ増分について二次元カメラ９０７の各垂直ピクセルの強度を合計することによって、光学干渉パターン９１２の縞パターンは、空間周波数分布として表される。高速フーリエ変換（fast Fourier transform：ＦＦＴ）を使用して、光学干渉パターン９１２に見られる支配的な空間周波数の位相を、高速時間間隔で計算することができる。細胞が線量測定セル６０８に入ると、付随する光散乱が縞の位置を変化させ、次に位相の変化として表示される。位相変化は、線量測定セル６０８の精査領域内のセルのサイズおよび数に比例する。前述のように、シース流発生器５０２および６０６は、導入された細胞または他の生体内実施形態を単離するように機能してもよく、その結果、それらは、明確に分離され、一緒に凝集されず、ラジカル標識光分解区域内の各実体の効果的かつ一貫した照射を行う。これらの生体内実体の制御された単離は、シース緩衝液シリンジポンプ５０８および緩衝液シリンジポンプ５１３の異なるポンピング速度によって影響される。名目上、シース緩衝液シリンジポンプ５０８のポンピング速度は、例えば、緩衝液シリンジポンプ５１３のポンピング速度の１０倍であるが、これに限定されない。明細書中にさらに記載されるように、各生体内実体の有効な単離は、検出された光散乱信号における時間差を特定することによって評価されてもよく、この時間差は、図４に示される信号プロファイルに同種の様式で、生体内実体が照射される場合に最大になり、この実体が存在しない場合に最小になる。本実施形態では、生体内実体の存在を評価するために、光散乱検出器が用いられる。 他の実施形態では、光散乱検出器は、弾性散乱から生じる検出光の位相の変化を特定する屈折率検出器と置き換えられる。

【0096】

所望の細胞または生体内実体の単離が達成されると、ラジカル標識は、生体外実験について行われたものと非常に類似して進行する。有効ラジカル線量は、生体内実体が光分解区域６０７において照射される際に線量測定区域６０８において測定される蛍光信号の変化を、監視することによって評価される。

【0097】

図１０は、ＣｅｌｌＲｏｘ（登録商標）ＤｅｅｐＲｅｄおよび１００ｍＭ濃度の過酸化水素を用いたラジカル線量測定応答１０００を示す。ベースライン蛍光レベル１００１、線量計蛍光信号の上昇肩１００２、最大線量計蛍光レベル１００３、線量計信号の下降肩１００４、再確立されたベースライン蛍光レベル１００５、時間Ｔ１で生じる最大蛍光レベル１００６、および時間Ｔ２で生じる最大蛍光レベル１００７が示される。図示のように、ベースライン蛍光線量計信号１００１は、上昇肩１００２に急速に移行し、混合物がパルス照射される最中に蛍光レベル１００３で最大になる。酸化されたＣｅｌｌＲｏｘ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄが線量測定区域を出ると、蛍光信号は、下降肩１００４によって示されるように減少し、最終的に、１００５においてその低いバックグラウンド蛍光ベースラインを再確立する。

【0098】

生体外ラジカル標識に類似して、１００６（Ｔ１）および１００７（Ｔ２）によって図示されるように、細胞の２つの連続的に暴露されたボーラスまたは生体内実施形態についての２つの最大蛍光値間の時間差は、単離量、およびシース流発生器６０６によって生成される細胞間分離距離を評価するために使用され得る。生体外系と同様に、全ての最大蛍光信号の再現性を評価して、得られた生体内ラジカル標識の質および再現性を判断してもよい。

【0099】

適切な線量計応答および生体内実体単離量が達成されると、生体内実体を確実に標識することができ、標識された生体内生成物を収集することができる。標識および生成物収集プロセスの間、機器コントローラー１０６は、線量計および単離量目標が達成された時間を記録し、入口出口ポート２０２の出口への適切に標識された生成物の到着時間を特定する。到着時間は、線量測定区域６０８から入口出口ポート２０２までの移送量と、正味の流速と、の商によって特定される。適切に標識された生成物が到着する前に、光流体チップ６０１の流出内容物は、入口出口ポート２０２を通って、指定された廃棄物ウェル２２１内に分注される。機器コントローラー１０６の制御下で、適切に標識された生成物が入口出口ポート２０２の出口に到達すると、マイクロプレート２０１は、標識された生成物が生成物収集マイクロウェル２２２内に収集されるように、試料導入システム１０１によって移動される。
＜標識後分析＞

【0100】

生体内および生体外の両方のラジカルフットプリント法実験について、標識後分析は、典型的には、続いて行われ、収集された試料は、選択的に、分析器を使用して分析される。分析器は、試料の化学分析を行うように構成される。例えば、分析器は、光分解区域において酸化されたタンパク質、ペプチド、炭水化物、金属、核酸、脂質、および／またはアミノ酸を同定するように構成されてもよい。分析器は、例えば、質量分析計、シンチレーター、電気泳動装置、クロマトグラフ、および／または、放射線、質量、電荷、サイズ、もしくは他の特性に基づいて試料成分を分離および／または同定するように構成される任意の他の装置を含んでもよい。いくつかの実施形態では、分析器は、細胞または他の生物学的実体内の同位体または放射性同位体標識を検出し、選択的に、そのような標識を含む構成要素が酸化されたかどうかを判定するように構成される。いくつかの実施形態では、分析器は、特定の成分の標識／非標識濃度の比を測定するように構成される。いくつかの実施形態では、分析器は、ポート２０２と「インライン」であり、そのため、試料を受け取り、リアルタイムで分析するように構成される。例えば、ポート２０２は、試料を質量分析計に直接流入するように構成される、毛細管を含んでもよい。
＜シース流の特定の制御＞

【0101】

本発明の様々な実施形態は、再現可能な生体内ラジカル線量測定を可能にするために、細胞間単離量を特定および制御する方法を含む。生体内ラジカル線量測定が効果的に実施されるためには、生体内実体（単数または複数）が線量測定区域内に存在する場合に内部標準ラジカル線量計の測光測定を実施して、細胞間の細胞内ラジカル線量計応答の差を表す意味のある比較測定を可能にするべきである。

【0102】

図１１は、本明細書に記載の発明を使用して細胞間単離量を特定および制御する例示的な方法１１００を示し、方法１１００は、線量測定区域内の生体内実体の検出をさらに可能にする。細胞導入工程１１０１、第１細胞検出工程１１０２、第２細胞検出工程１１０３、正味の流速特定工程１１０４、細胞単離量特定工程１１０５、良好単離評価工程１１０６、不良単離およびシース流速調整工程１１０７、ならびに反復サイクル１１０８が示されている。

【0103】

細胞導入工程１１０１において、細胞の単一縦列アレイが形成され、線量測定区域６０
８に流入する。第１細胞検出工程１１０２において、散乱光検出器８１２からの信号が監視されて、線量測定区域６０８への第１細胞の到着時間を検出する。細胞または他の生体内生物学的実体が線量測定区域６０８内に到達すると、散乱励起光８１０の強度は、精査領域内の生体内実体のサイズおよび生体内実体の数に従って増加する。第２細胞検出工程１１０３において、上述のプロセスは、線量測定区域６０８への第２細胞の到着時間を検出するために使用される。システムの正味の流速は、シリンジポンプ５０８、シリンジポンプ５１３、およびシリンジポンプ５１８のポンピング速度を合計することによって計算される（１１０４）。流速は、第１細胞と第２細胞との検出の間の時間が、２つの細胞が同時に線量測定区域６０８内にある確率を、低下するのに十分な長さとなる程度まで低下され得る。これは、条件が１度に１つの細胞の照射および酸化を可能にする単一細胞単離を達成する。

【0104】

細胞単離量計算工程１１０５において、細胞間単離量は、第１細胞と第２細胞との間の到着時間差に正味の流速１１０４を掛けることによって特定される。実験的に特定された細胞単離量が、所望の単離量（分離距離および分離時間に直接関連する）から±５％（または他の所定の限界）未満だけ逸脱する場合、次に、システムは、進行工程１００６において、さらなる調整なしに追加の細胞を標識することに進む。選択的に、実験的に特定された細胞単離量が±５％より大きく逸脱する場合、シース流シリンジポンプ５０８のポンピング速度は、シース流速調整工程１１０７において、所望の細胞単離目標量１１０７を達成するように変更され、目標細胞単離量が達成されるまで、特定プロセスが繰り返される（１１０８）。

【0105】

様々な実施形態は、線量測定区域６０８内の生体内実体の存在を検出するためのシステムおよび方法を含む。線量測定区域６０８内の生体内実体の進入および退出の検出された時間は、細胞内線量計内部標準ラジカル応答を測光的に特定するためのデータ取得期間を、特定するために使用されてもよい。線量測定区域６０８に入ると、生体内実体は、散乱光検出器８１２によって検出される散乱光の強度の急速な上昇を引き起こす。調和して、生体内実体が出ると、散乱光検出器８１２によって検出される散乱光の強度は、急激に低下する。散乱光強度の上昇と下降との間の時間差は、生体内実体、例えば細胞の線量測定区域存在期間を表す。存在期間中に、発光光検出器８０９によって検出された光強度値が合計および／または統合されて、対象の生体内実体についての正味の線量測定信号が特定される。このアプローチを使用することによって、測光線量測定は、細胞内および／または細胞外測光信号から生じる信号を検出する一方で、生体内実体を欠く領域についての細胞外液から生じる任意の固有のバックグラウンド信号を拒絶することによって行われてもよい。このようにして、細胞外液に対するバックグラウンド信号は、実験設計によって、細胞内液のバックグラウンド信号よりも実質的に低く、測定は、生体内実体（単数または複数）が存在する場合にのみ行われるので、測定された測光信号の大部分は、細胞内成分から生じるものからなる。
＜生体内実施形態生存率の特定＞

【0106】

いくつかの実施形態は、生体内実体の生存率（viability）を特定するためのシステムおよび方法を含む。所与の生体内実体について、散乱光強度は、測光評価中に線量測定区域６０８内に存在する生体内実体のサイズおよび数に比例する。本明細書に開示される方法論を使用して、線量測定区域６０８内の生体内実体の一定の到達率を効果的に確実にするための手段が説明される。このような状況下では、各データ取得期間の生体内実体の数を一定に制御することができ、測定された散乱光の変動は、生体内実体サイズの変化に大きく依存するようになる。生体内実体サイズの変化は、固有の形態学的変動に起因し得るか、細胞／種の形態における人為的変化を示すことができ、細胞破壊、細胞死、もしくは細胞アポトーシスを示してもよい。生体内培養ＨＲＰＦの固有の目標は、生存条件下で生体分子補体ＨＯＳを評価することであるので、生存できないプロセスおよび／または条件
の存在を検出し、信号を送ることが望ましい。

【0107】

本明細書に記載された本発明の実施形態は、ＨＲＰＦプロトコルから生じてもよい生体内部分への潜在的な害を検出するためのシステムおよび方法を提供し、生存しているが破壊されていない生体内実体について生体内ＨＯＳ分析を行うことができる手段を提供する。例えば、破壊された細胞または線量測定区域６０８内の２つ以上の細胞の存在を、測定された光散乱に基づいて、同時に検出することができる。これらの状況下で検出されたこれらの実体は、これらの条件下で照射されなかった実体から分離され、廃棄されてもよい。
＜閃光光分解光の制御された動作＞

【0108】

本発明の様々な実施形態は、光分解区域１０２への生体内実体の到着と同期して閃光光分解光源１０３を動作するためのシステムおよび方法を含む。生体内ラジカルフットプリント法は、理想的には、再現可能な様式で上記実体（単数または複数）を確実に照射し、再現可能な細胞内ラジカル負荷を光触媒的に引き起こすために、光分解区域内の生体内実体の存在を特定および定量する工程を含む。

【0109】

図１２は、光分解区域６０８への生体内実体の到着を特定する一方で、光分解区域６０８への生体内実体の到着の際に閃光光分解光源１０３が閃光するように正確に動作されるシステムおよび方法を提供する例示的な方法１２００を示す。細胞導入工程１２０１、第１細胞検出工程１２０２、正味の流速の特定１２０３、オンチップ相互接続量の特定１２０４、通過時間の特定１２０５、光分解区域到着時間の特定１２０６、細胞到着時間１２０７での光分解動作の活性化、および適切に標識された細胞１２０８の沈殿を伴うプロセスの継続が示されている。

【0110】

細胞導入工程１２０１において、細胞の単一縦列アレイが本明細書の他の箇所に記載されるように形成され、第１細胞が光分解区域１０２に導入される。検出工程１２０２において、散乱光検出器８１２の出力信号は、線量測定区域６０８への第１細胞の到着時間を検出するために監視される。線量測定区域６０８内に細胞または他の生体内実体が入ると、散乱光の強度は、精査領域内の生体内実体のサイズおよび生体内実体の数に従って増加する。この増加は、散乱光検出器８１２によって検出される。正味の流速特定工程１２０３において、システムの正味の流速は、シリンジポンプ５０８、シリンジポンプ５１３、およびシリンジポンプ５１８のポンピング速度を合計することによって計算される。相互接続量特定工程１２０４において、マイクロ流体システム設計の直接の明示として、光分解区域１０２および線量測定区域６０８から延在する相互接続量が特定され、生体内ラジカルタンパク質フットプリント法の間、一定のままである。通過時間特定工程１２０５において、生体内実体が光分解区域１０２から線量測定区域６０８に移動するために必要とされる通過時間は、相互接続量を正味の流速で割ることによって計算される。光分解区域到着時間特定工程１２０６において、光分解区域到着時間は、線量測定区域到着時間と、光分解区域から線量測定区域への移行時間と、の差を特定することによって計算される。動作工程１２０７において、後続の細胞または生体内実体について、光分解システムは、特定された光分解区域到着時間またはその後の一定の間隔で閃光するように動作される。継続プロセス工程１２０８において、目標数の細胞が処理されるまで、さらなる標識細胞が標識細胞リザーバー２２１内に沈殿される。

【0111】

本明細書の教示は、光散乱光検出器８１２および蛍光／発光光検出器８０９から生じる検出信号の特定の有用性を説明するが、これらの検出器は、複数の説明されていない組み合わせまたは手段によって、線量測定区域６０８への生体内実体の到着を検出する目的のために、または光分解区域１０２への生体内実体の到着を予測する目的のために使用され得ることが、当業者に明らかである。例えば、蛍光／発光光検出器８０９で生成された信
号は、線量測定区域内の生体内実体の存在を検出するための全体的な感度を改善するために、光散乱光検出器８１２からの信号と時間的コヒーレンスにおいて合計され得る。このように、本明細書で説明する方法は、例示的なものであり、範囲を限定するものではないことが意図される。
＜ラジカル線量測定閉ループ制御＞

【0112】

本発明の様々な実施形態は、閉ループ制御ラジカル線量測定システムを較正するシステムおよび方法を含む。これらの実施形態では、閉ループ制御ラジカル線量測定システムは、測定されたラジカル線量計測光蛍光変化に応答して光学的流束量またはラジカル試薬濃度の必要な変化を予測するために使用される較正理論回路を含む。較正関数は、複数の測定を通して経験的に特定され、測定では、サポート緩衝液、生体内実体、およびラジカル線量計の既知の混合物または制御された混合物が、様々な流束量またはラジカル試薬濃度レベルで各別個の制御された一定分量について、単一の閃光で処理される。例示的な実施形態において、低レベル機器制御または高レベルユーザーインターフェースプログラム（例えば、制御電子機器１０５および／または機器コントローラー１０６）のいずれかにおいて実行されるソフトウェアルーティンは、各流束量またはラジカル試薬濃度における線量計測光蛍光の測定された変化を記述するルックアップテーブルまたは曲線適合を生成し、適用された流束量および／またはラジカル試薬濃度と、単一の閃光露光について測定された線量計蛍光変化と、の間の関係を記述する数学的表現または較正関数の生成を可能にする。別の実施形態では、ルックアップテーブルおよび後続の較正関数は、各閃光電圧値および／またはラジカル試薬濃度に対する蛍光変化値を使用して、ユーザーによって手動で生成される。

【0113】

生体内ラジカルタンパク質フットプリント法処理の間、バックグラウンドラジカル除去を線量測定によって評価する。線量計測光蛍光の測定された変化は、ユーザー指定の目標変化と比較される。測定された線量計値が目標値から±１０％以上逸脱する場合、適用された流束量またはラジカル試薬濃度は、測定された線量計吸光度の目標とされた変化を達成するために変更される。上記較正関数は、流束量またはラジカル試薬濃度の必要な変化を予測するために使用される。

【0114】

当業者には、本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に説明したもの以外のさらに多くの変更が可能であることが明らかであろう。したがって、本発明の主題は、開示の趣旨を除いて限定されるべきではない。さらに、本開示を解釈する際に、全ての用語は、文脈と矛盾しない最も広い可能な方法で解釈されるべきである。特に、「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」という用語は、要素、構成要素、または工程を非排他的に参照するものとして解釈されるべきであり、参照された要素、構成要素、または工程が、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、または工程とともに提示または利用され、または組み合わせられてもよいことを示す。

【0115】

本明細書では、本発明の様々な実施形態を説明するために生体細胞が使用されているが、他の実施形態では、「細胞（cells）」は、任意の実施例または請求項において、非生物学的実体、生物学的実体、ウイルス、多細胞生物（例えば、真菌、胞子、極小微生物、カビ、藻類、線虫、アメーバ属、原虫、センモウヒラムシ、酵母）、または非生物学的材料などの他の実体によって置き換えられてもよい。

【0116】

一般的な構造および技法、ならびにより一般的な目標を実行する異なる方法を達成するために使用され得るより具体的な実施形態が、本明細書で説明される。いくつかの実施形態のみが上記で詳細に開示されているが、他の実施形態が可能であり、本明細書内に包含されると見なされる。本明細書は、別の方法で達成されてもよいより一般的な目標を達成するための特定の例を説明する。本開示は、例示的であることが意図され、特許請求の範
囲は、当業者に予測可能であってもよい任意の修正または代替を包含することが意図される。

【0117】

本明細書で論じられる論理回路は、電子回路、ハードウェア、ファームウェア、および／または非一時的コンピューター可読媒体上に記憶されたソフトウェアを含むことができる。

【0118】

「ための手段（means for）」という用語を使用する請求項のみが、３５ ＵＳＣ １１２第６段落に基づいて解釈されることが意図されている。さらに、明細書からの限定は、それらの限定が特許請求の範囲に明示的に含まれない限り、いずれの特許請求の範囲にも読み込まれることを意図していない。本明細書で説明されるコンピューターは、汎用コンピューター、またはワークステーションもしくは実験室もしくは製造機器などの何らかの特定目的コンピューターのいずれかの、任意の種類のコンピューターであってもよい。コンピューターは、Ｗｉｎｄｏｗｓ １０、８、７、またはＬｉｎｕｘを実行するＩｎｔｅｌ（例えば、ＰｅｎｔｉｕｍまたはＣｏｒｅ ２ ｄｕｏ、ｉ３など）またはＡＭＤベースのコンピューターであってもよく、あるいはＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターであってもよい。コンピューターは、また、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｍｏｂｉｌｅ、ｉＯＳ等を含む任意の利用可能なオペレーティングシステムを実行する、ＰＤＡ、携帯電話、タブレット、またはラップトップ等のハンドヘルドコンピューターであってもよい。

【0119】

著作権通知：３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に準拠して、本開示の一部は、著作権保護の対象であり、著作権保護が主張される資料（ソースコードリスト、スクリーンショット、ユーザーインターフェース、またはユーザー命令、または著作権保護が任意の管轄において利用可能である、または利用可能であってもよい、本出願の任意の他の態様等であるが、それらに限定されない）を含む。著作権者は、特許文書または特許開示が特許商標庁の特許ファイルまたは記録に記載されているので、特許文書または特許開示のいずれかによるファクシミリ複製に対して異議を唱えない。他のすべての権利は留保され、他の全ての複製、配布、コンテンツに基づく派生作品の作成、公開表示、およびアプリケーションまたはその任意の部分の公開実行は、適用可能な著作権法によって禁止される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】