特表 2024-503239 細胞培養法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】細胞培養法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20240118BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240118BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240118BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240118BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240118BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20240118BHJP

【ＦＩ】

C12P21/02 C ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/715

A61K38/17

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P37/02

A61K9/08

A61K9/19

A61K47/26

A61K47/02

A61K47/18

A61K39/395 Y

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537516

(86)(22)【出願日】2021-12-21

(85)【翻訳文提出日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 US2021064616

(87)【国際公開番号】W WO2022140389

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】63/129,349

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500203709

【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】クラウス，エリヤフ

(72)【発明者】

【氏名】ナタラジャン，ベンカテシュ

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス，リッツデリーズ・ペレス

(72)【発明者】

【氏名】ニーブス，オマル・クルス

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC01

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA12

4C076AA29

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC09

4C076DD23

4C076DD26

4C076DD51

4C076DD67

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA06

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA53

4C084MA17

4C084MA44

4C084MA66

4C084NA20

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB15

4C085AA33

4C085BB42

4C085CC05

4C085DD61

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA51

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）からエタネルセプトを生産する方法であって、Ｎ生産バイオリアクターを運転する前に、再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）又は交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）細胞保持デバイスを、少なくとも約２０μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で使用して、Ｎ－１バイオリアクターシステムを運転することを含む方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）からエタネルセプトを生産する方法であって、再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）又は交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）細胞保持デバイスを、少なくとも２０μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で使用して、Ｎ－１バイオリアクターシステムを運転することを含む方法。

【請求項2】

２００μｍ以下の細胞凝集体サイズを維持する条件下で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

２０μｍ～１５０μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

２０μｍ～９５μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で実行される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記システムは、以下の式１：

【数1】

［式中、εは［Ｕ^３／Ｌ］（Ｌは前記バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブの長さであり、Ｕは［チューブ内の流量／チューブの断面積］である）であり、νは［細胞培養物粘度／細胞培養物密度］である］
を使用して２０μｍのηを提供するチューブの長さ、チューブの断面積及び流量を利用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ηは、式１を使用して２００μｍ以下である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記流量は、（ｉ）中空糸モジュールでは、約４ｍＬ／分／糸～約１６ｍＬ／分／糸、（ｉｉ）フラットシートフィルタモジュールでは、約３６０Ｌ／ｍ^２／時～約７２０Ｌ／ｍ^２／時、及び（ｉｉｉ）積層プレートモジュールでは、約１Ｌ／ｍ／チャネル～約４Ｌ／ｍ／チャネルから選択され、前記細胞培養物粘度は約１～約６センチポアズから選択され、且つ前記細胞培養物密度は約１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌから選択される、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の方法によって生産されるエタネルセプトを含む製剤。

【請求項9】

前記製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン及び水からなる、請求項８に記載の製剤。

【請求項10】

前記製剤は、凍結乾燥粉末で２５ｍｇのエタネルセプト、４０ｍｇのマンニトール、１０ｍｇのスクロース及び１．２ｍｇのトロメタミンからなる、請求項８に記載の製剤。

【請求項11】

前記製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン及び水からなる、請求項８に記載の製剤。

【請求項12】

１ｍＬの前記製剤が、プレフィルドシリンジ又はＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）自己注射器に入っている、請求項９又は１１に記載の製剤。

【請求項13】

０．５１ｍＬの前記製剤が、プレフィルドシリンジ又はＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）自己注射器に入っている、請求項９又は１１に記載の製剤。

【請求項14】

前記凍結乾燥粉末は、複数回使用バイアルに入っている、請求項１０に記載の製剤。

【請求項15】

治療を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を用いて生産されたエタネルセプトの有効用量を前記患者に投与することを含む、方法。

【請求項16】

前記患者は、関節リウマチ、多関節若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は尋常性乾癬を患っている、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

請求項８～１４のいずれか一項に記載の製剤及び前記製剤の使用説明書を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、治療用タンパク質を生産するための細胞培養法の分野に関する。

【0002】

関連出願の相互参照及び電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６３／１２９，３４９号の優先権の利益を主張する。

【0003】

本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０２１年１２月２１日に作製された４，２５５バイトの「５５４９８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名された、ＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

【背景技術】

【0004】

治療用タンパク質の臨床的製造は、費用のかかる大規模な取り組みである。薬学的治療薬として使用するための組換えポリペプチドの生産は、一般的には、生産用バイオリアクターの接種に十分な細胞塊を生成するように設計された一連のスケールアップ及び拡張フェーズからなる原薬細胞培養プロセスを利用する。細胞培養プロセスは、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）からのバイアルを解凍し、例えば、一連の振盪フラスコ、培養バッグ、及び／又は増殖シードバイオリアクター（例えば、Ｎ－３、Ｎ－２（ここで、数字は、バイオリアクターがＮ、最終、又は生産バイオリアクターから何段階前にあるかを示す）など）を使用することによって培養物を増殖させることによって開始される。種培養バイオリアクターで増殖させた後、培養物はＮ－１バイオリアクター（これは、例えば、潅流バイオリアクターであり得る）に移される。Ｎ－１潅流バイオリアクターにおいて、培養物は、最終培養工程（生産バイオリアクター（Ｎ））での接種に十分な細胞密度を生成するために、新鮮な培地で潅流される。生産バイオリアクターは、組換えポリペプチドの効率的な生産を最大化するように操作される。

【0005】

組換えポリペプチドの生産効率を高めるためのこれまでの努力の多くは、Ｎ生産バイオリアクターのパラメータを操作することを含んでいた。スケールアップ及び拡張フェーズで使用される方法及びシステムは、複雑で、労働集約的であり、扱いにくく、治療用タンパク質生産設備の拡張に多くの課題を提示する。しかし、スケールアップ及び拡張フェーズのための代替的な方法及びシステムは、Ｎ生産ランのための細胞力価及び培養生存率に対する悪影響や、最終治療用タンパク質産物にばらつきがあるために、見出しにくいことがわかっている。より大量の治療用組換えタンパク質に対する要求が高まるにつれ、現在のプロトコルの欠点を最小限に抑える、細胞増殖及び組換えタンパク質生産のための代替の方法及びシステムが必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）からエタネルセプトを生産する方法を提供する。方法は、Ｎ生産バイオリアクターを運転する前に、再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）又は交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）細胞保持デバイスを、少なくとも約２０μｍ（且つ任意選択により約２００μｍ以下、例えば、約２０μｍ～約１５０μｍ又は約２０μｍ～約９５μｍ）の細胞凝集体サイズを維持する条件下で使用して、Ｎ－１バイオリアクターシステムを運転することを含む。様々な態様において、これらの条件は、式１：

【数1】

（式中、εは［Ｕ^３／Ｌ］（ＬはバイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブの長さであり、Ｕは［チューブ内の流量／チューブの断面積］である）であり、νは［細胞培養物粘度／細胞培養物密度］である。任意選択により、条件には、中空糸モジュールでは約４ｍＬ／分／糸～約１６ｍＬ／分／糸、フラットシートフィルタモジュールでは約３６０Ｌ／ｍ^２／時間～約７２０Ｌ／ｍ^２／時間、若しくは積層プレートモジュールでは約１Ｌ／ｍ／チャネル～約４Ｌ／ｍ／チャネルから選択されるチューブ内の流量；約１～約６センチポアズ（例えば、約２～約６センチポアズ）から選択される細胞培養物粘度；及び／又は約１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌから選択される細胞培養物密度が含まれる）を使用して少なくとも約２０μｍ（且つ任意選択により約２００μｍ以下）のηを提供する。

【0007】

本開示はさらに、本明細書に記載の方法を用いて生産されたエタネルセプトを含むエタネルセプトの製剤を提供する。様々な態様において、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン及び水；凍結乾燥粉末で２５ｍｇのエタネルセプト、４０ｍｇのマンニトール、１０ｍｇのスクロース及び１．２ｍｇのトロメタミン；又は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン及び水を含む。本開示はまた、治療を必要とする患者を治療する方法であって、本開示の方法を用いて生産されたエタネルセプトの有効用量を患者に投与することを含む方法を提供する。様々な態様において、患者は、関節リウマチ、多関節若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、又は尋常性乾癬を患っている。治療を必要とする患者を治療するための、本明細書に記載されるように生産されたエタネルセプトの使用、及び治療を必要とする患者を治療する薬剤の調製における、本明細書に記載されるように生産されたエタネルセプトの使用が企図される。本明細書に記載の製剤及びその製剤の使用説明書を含むキットが提供される。

【0008】

本明細書中の様々な実施形態は、様々な状況下で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語を使用して提示される一方、関連する実施形態はまた、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「～から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語を使用して説明され得ると理解されるべきである。本開示は、ある特徴を「含む」と記載された実施形態が、その特徴「からなる」又は「から実質的になる」実施形態を含むことを意図する。「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という用語は、１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）を指し；「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。用語「又は」は、文脈上明確に別段の要求がない限り、代替又は一緒に項目を包含すると理解されるべきである。用語「及び／又は」は、リスト中の各項目（個々に）、リスト中の項目の任意の組み合わせ、及びリスト中の全ての項目を一緒に包含すると理解されるべきである。

【0009】

値の範囲を記載する場合、本開示は、その範囲内に存在する個々の値を意図していると理解されるべきである。例えば、「約２０μｍ～約２００μｍの間の細胞凝集体サイズ」は、以下に限定されないが、４０μｍ、６０μｍ、１００μｍなど、及びそのような値の間の任意の値であり得る。本明細書に記載される範囲のいずれかにおいて、範囲の端点はその範囲に含まれる。しかしながら、この説明はまた、小さい方の端点及び／又は大きい方の端点が除外された同じ範囲も意図する。

【0010】

本発明の追加の特徴及び変形形態は、図面及び詳細な説明を含む本出願の全体から当業者には明らかであろうが、そのような特徴は全て本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載される本発明の特徴を組み換えて追加の実施形態とすることができ、これらもまた、特徴の組み合わせが本発明の態様又は実施形態として具体的に記載されているかどうかにかかわらず、本発明の態様として意図される。本書全体が、統合された開示として関連することが意図されており、たとえ特徴の組み合わせが本書の同じ文、段落、又は節中に共に記載されていなくても、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されていることを理解されたい。また、本発明にとって不可欠なものとして本明細書に記載されている限定のみがそのようなものとしてみなされるべきであり；本明細書に不可欠なものとして記載されていない限定を欠く本発明の変形形態は、本発明の態様として意図される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１はエタネルセプトのアミノ酸配列を示す。しかしながら、この配列に若干の改変及び欠失（１０％まで）を加えることは可能であり、本発明の範囲内で使用できることを理解されるべきである。本開示の方法及び技術は、例えば、その配列、グリコシル化パターン又は他の翻訳後修飾がＥＮＢＲＥＬ（登録商標）とは異なるバイオシミラーエタネルセプトを生産するために使用することができる。

【図2】図２は、実施例に記載したデータを示すグラフである。条件＃１（ＡＭＬ ＳＳＭ ２０１９）、条件＃２（ＡＴＦ Ａ２Ｂ＝０．１２５）、条件＃３（ＡＴＦ Ａ２Ｂ＝０．２５）、及び条件＃４（ＡＴＦ Ａ２Ｂ＝０．３７５）で行ったＮ－１培養物から接種したＮ－０培養物について、エタネルセプトの最終力価（ｍｇ／Ｌ；ｙ軸）を示す。

【図3A】図３Ａ及び３Ｂは、細胞保持デバイスに動作可能に連結されたバイオリアクターを含むバイオリアクターシステムの概略図である。図３Ａの例示的な実施形態における細胞保持デバイスは、少なくとも１つのフィルタモジュール及びポンプを含む交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）システムである。図３Ｂは、少なくとも１つのフィルタモジュール及びポンプを含む再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）システムに動作可能に接続されたバイオリアクターの図である。培地はバイオリアクターに導入され、一方、細胞保持デバイスポンプは、フィルタモジュールを通して細胞培養物を流す。通常、使用済み培地、培養廃棄物、組換えタンパク質などを含む、細胞を含まない回収物を除去する。チューブは培地供給源をバイオリアクターに接続し、バイオリアクターを細胞保持デバイスに接続し、細胞保持デバイスを回収物収集手段（概略的に矢印によって示す）に接続する。図３Ａ及び３Ｂの概略図は、本開示の代表的な態様を示すために提供されているに過ぎず、本開示のシステム及び方法はＮ－１バイオリアクターシステムの構成要素の特定の配置に依存しない。

【図3B】図３Ａ及び３Ｂは、細胞保持デバイスに動作可能に連結されたバイオリアクターを含むバイオリアクターシステムの概略図である。図３Ａの例示的な実施形態における細胞保持デバイスは、少なくとも１つのフィルタモジュール及びポンプを含む交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）システムである。図３Ｂは、少なくとも１つのフィルタモジュール及びポンプを含む再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）システムに動作可能に接続されたバイオリアクターの図である。培地はバイオリアクターに導入され、一方、細胞保持デバイスポンプは、フィルタモジュールを通して細胞培養物を流す。通常、使用済み培地、培養廃棄物、組換えタンパク質などを含む、細胞を含まない回収物を除去する。チューブは培地供給源をバイオリアクターに接続し、バイオリアクターを細胞保持デバイスに接続し、細胞保持デバイスを回収物収集手段（概略的に矢印によって示す）に接続する。図３Ａ及び３Ｂの概略図は、本開示の代表的な態様を示すために提供されているに過ぎず、本開示のシステム及び方法はＮ－１バイオリアクターシステムの構成要素の特定の配置に依存しない。

【発明を実施するための形態】

【0012】

治療用製品に費やされた長年の研究及び開発にもかかわらず、工業的規模での組換えタンパク質の効率的な生産は、依然として課題である。生産性を向上させ、製品の一貫性を向上させ、出発材料のコスト若しくは加工時間を低減させ、又は装置コストを低減させる製造の改善は、実質的な経済的利益を有する。しかしながら、製造プロセスの各段階は患者に送達される最終製品に影響を及ぼす可能性があり、特に工業規模のプロセスにスケールアップする場合、製造方法のパラメータを調整する最終的な効果は予測不可能であり得る。実際、組換えタンパク質を生産するシステム及び方法は、細胞培養によって生産されるタンパク質の量だけでなく、潜在的に予測不可能な方法で、例えば、グリコシル化パターンに関してタンパク質組成自体にも影響を及ぼす。さらに、１つの組換えタンパク質の生産に適した条件が、他の異なる組換えタンパク質の効率的で一貫した製造に必ずしも適しているとは限らない。本開示は、一貫した治療用製品を生産しながら、組換えタンパク質の生産を最大化し、治療用タンパク質の工業規模生産に関連する技術的ハードルを克服する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてエタネルセプトを生産するためのシステム及び方法を提供する。

【0013】

エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合タンパク質である（米国特許第９，５１８，１１１号明細書を参照）。エタネルセプトのＦｃ成分は、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域２（ＣＨ２）ドメイン、重鎖定常領域３（ＣＨ３）ドメイン及びヒンジ領域を含むが、重鎖定常領域１（ＣＨ１）ドメインは含まない。それは９３４のアミノ酸からなり、約１５０キロダルトンの見掛け分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）。エタネルセプトは、この治療薬の活性及び免疫原性に潜在的に影響を及ぼすＮ－及びＯ－結合オリゴ糖の両方を含有する。本開示は、少なくとも部分的には、Ｎ－１生産中のＣＨＯ細胞の凝集レベルを特定レベルに維持することが産生フェーズ中の力価の増加をもたらすという驚くべき発見に基づいている。

【0014】

本開示は、ＣＨＯ細胞からエタネルセプトを生産する方法を対象としている。ＣＨＯ細胞は広く知られており、さらに、例えば、Ｂｒａｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４－２０１２、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２－６３６２、ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１－２３９，及びＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１－３０１６）にも記載されている。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠失変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０）のＤＸＢ１１及びＤＧ－４４は、効率的なＤＨＦＲの選択可能で増幅可能な遺伝子発現系により、これらの細胞での高レベルの組換えタンパク質発現が可能になるため、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０），Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５３７－５６６）。さらに、これらの細胞は、接着又は懸濁培養物として操作しやすく、比較的良好な遺伝的安定性を示す。本開示の好ましい態様では、細胞培養物は懸濁培養物である。

【0015】

本開示の方法は、再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）又は交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）細胞保持デバイスを使用して、少なくとも約２０μｍ、任意選択で約２００μｍ以下の細胞凝集体サイズを維持する条件下で、Ｎ－１バイオリアクターシステムを運転し、その後、Ｎ生産バイオリアクターを運転することを含む。本開示は、少なくとも約２０μｍ（及び、任意選択で約２００μｍ以下）の細胞凝集体サイズが、所望の製品品質特性を維持しながら、Ｎ産生フェーズ中の力価の増大をもたらすＮ－１生産条件を支持することを報告する最初のものである。様々な態様において、細胞凝集サイズは約２０μｍ～約１５０μｍ（例えば、約４０μｍ～約１２５μｍ、約５０μｍ～約１００μｍ、約２０μｍ～約４０μｍ、約２０μｍ～約６０μｍ、約２０μｍ～約７５μｍ、約２０μｍ～約８０μｍ、約２０μｍ～約１２０μｍ、又は約２０μｍ～約１２０μｍ）である。様々な態様において、本方法は、約２０μｍ～約９５μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で実施される。例えば、様々な態様において、本方法は、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約４０μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１２０μｍ、少なくとも約１４０μｍ、少なくとも約１６０μｍ、又は少なくとも約１８０μｍの細胞凝集体サイズを維持する条件下で実施される。或いは又は加えて、本方法は、約２００μｍ以下、約１９０μｍ以下、約１８０μｍ以下、約１７０μｍ以下、約１６０μｍ以下、約１５０μｍ以下、約１４０μｍ以下、約１３０μｍ以下、約１２０μｍ以下、約１１０μｍ以下、約１００μｍ以下、約９０μｍ以下、約８０μｍ以下、約７０μｍ以下、約６０μｍ以下、約５０μｍ以下、約４０μｍ以下、又は約３０μｍ以下の細胞凝集体サイズを維持する条件下で実施される。本開示は、本明細書に記載される端点のいずれかの範囲を明示的に企図する。細胞凝集体のサイズを測定する手段は、当該技術分野において知られている。例えば、自動細胞計数器は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（例えば、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ）、及びＮＯＶＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（例えば、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ＣＤＶ）によって提供され、細胞計数、細胞又は凝集体サイズの決定、及び生存率のモニタリングに使用され得る。

【0016】

「バイオリアクター」という用語は、細胞培養物の増殖に有用な任意の容器を意味する。バイオリアクターは、細胞の培養に有用である限り、任意のサイズであり得、通常は、バイオリアクターは、その内部で増殖させる細胞培養物の体積に適したサイズである。通常、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、２、５、１０、５０、１００、２００、２５０、５００、１，０００、１５００、２０００、２，５００若しくは５，０００リットル又はそれ以上、或いはそれらの間の任意の体積であり得る。バイオリアクターは、８，０００、１０，０００、１２，０００、１８，０００、２５，０００リットル又はそれ以上、或いはそれらの間の任意の体積であり得る。ｐＨ及び温度（これらに限定されない）を含むバイオリアクターの内部条件は、培養期間中に制御することができる。当業者は、本明細書に記載の方法の実施に使用するのに好適なバイオリアクターを知っており、選択することができるであろう。

【0017】

バイオリアクターシステムを「運転する」とは、細胞培養、すなわち、多細胞生物又は組織の外での細胞の成長及び増殖を支持するために、バイオリアクターシステム内の条件を維持することを意味する。哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当該技術分野において知られている。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液中で又は固形の培養基に付着されながら培養され得る。流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクターは、マイクロキャリアの有無にかかわらず、バッチモード、フェドバッチモード、連続モード、半連続モード、又は灌流モードで操作され、哺乳動物細胞培養に利用可能である。哺乳動物細胞のフェドバッチ培養は、培養物が栄養素を含有する濃縮供給培地によって連続的に又は定期的に供給されるものである。例えば、Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２００１），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１８０－８７）を参照されたい。灌流ベースのシステムでは、培地は培養物に連続的に供給され、培養物から連続的に除去される。培地及び細胞培養物の望ましくない生成物が除去されると（例えば、「細胞を含まない回収物」）、細胞は細胞保持デバイス、例えば、交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）及び再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）システムなどのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムによって保持される。ＲＴＦは、再循環手段、最も一般的には蠕動ポンプを使用するもので、細胞培養物を一方向に且つ膜表面に平行に移動させて、バイオリアクター中に細胞を留めながら使用済み培地を除去する。ＡＴＦシステムは、一方向のみに流す代わりに、モジュール（例えば、中空糸フィルタモジュール）内で細胞培養物を前後に移動させるポンプがあることを除いて、ＲＴＦシステムのものと同様である。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書、Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７），６２－６３を参照されたい。ＡＴＦの利点は、交互の流れによって誘発されるフィルタの洗浄効果である。任意選択により、本開示の方法は、ＡＴＦ灌流システムを使用してＮ－１バイオリアクターを運転することを含む。

【0018】

典型的には、中空糸フィルタがＲＴＦ又はＡＴＦシステムにおいて使用される（但し、これは必須ではない）。細胞培養培地、細胞（全細胞及び溶解細胞）、可溶性発現組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質、老廃物などを含む細胞培養物が、孔径又は分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）に応じて、フィルタに導入されると、中空糸材料は、中空糸材料の孔径又は分子量カットオフに基づいて、特定の細胞培養成分（細胞自身に加えて）を内腔側（内側）に保持し、特定の成分をフィルタを通過（透過）させることができる。保持された材料（保持物）は、バイオリアクターに戻される。新鮮な灌流細胞培養培地をバイオリアクターに加え、透過液を所定の間隔で又は連続的にフィルタから抜き出して、所望の又は一定のバイオリアクター体積を維持する。透過物（「細胞を含まない回収物」とも呼ばれる）は、廃棄されるか、保持タンク、保持バッグ若しくは保持トートに保存されるか、又は濾過、凝集、遠心分離及び／若しくは他の下流の精製方法などの別のユニット操作に直接移送され得る。糸は、様々な態様において、約０．５ｍｍ～約１ｍｍの内径を有し、任意の好適な長さ（例えば、約３０ｃｍ～約１１０ｃｍ）であり得る。精密濾過のための中空糸は、一般に、０．１μｍ～１０μｍの範囲の孔径又は５００ｋＤａ以上の分子量カットオフを有し、タンパク質を透過物中に通過させるために使用することができる。限外濾過中空糸は、一般に、０．０１μｍ～０．１μｍの孔径範囲又は３００ｋＤａ以下の分子量カットオフを有し、所望のタンパク質を保持物中に保持し、それをバイオリアクターに戻すために使用することができる。これは、例えば、回収に向けて組換えタンパク質生産物を濃縮するために使用することができる。このようなフィルタとして、例えば、Ｘａｍｐｌｅｒ ＵＦＰ－７５０－Ｅ－４ＭＡ；Ｘａｍｐｌｅｒ ＵＦＰ－３０－Ｅ－４ＭＡ、（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ）；及びＭｉｄｉｋｒｏｓ ＴＣモジュールＴ０２－Ｅ０３０－１０、Ｔ０２－０５０－１０、Ｔ０２－Ｅ７５０－０５、Ｔ０２－Ｍ１０Ｕ－０６（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、Ｃａｌｉｆ．）が市販されている。

【0019】

細胞培養物は、ポンプシステムによってバイオリアクターからフィルタモジュール内に抜き出すことができ、ポンプシステムは細胞培養物をフィルタを通して又はフィルタに沿って（例えば、中空糸の内腔側を通して）通過させる。細胞ポンプシステムの例としては、蠕動ポンプ、二重ダイヤフラムポンプ、低剪断ポンプ（Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ（商標）ポンプ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）、及び交互タンジェンシャルフローシステム（ＡＴＦ（商標）、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）が挙げられる。透過物は、蠕動ポンプの使用によってフィルタから抜き出すことができる。実際、好ましい実施形態では、灌流が交互タンジェンシャルフローシステムの使用によって達成される。

【0020】

本開示の方法は、ＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスを使用して、上記で開示したような細胞凝集体サイズを維持する条件下でＮ－１バイオリアクターシステムを運転することを含む。条件の例としては、バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブの長さ、バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブを通る流量、バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブの断面積、細胞培養物の粘度、及び／又は細胞培養物密度が挙げられる。本開示の様々な態様において、これらの条件は、式１を使用して少なくとも約２０μｍ（且つ任意選択により約２００μｍ以下）のηを提供する：

【数2】

【0021】

式１において、εは［Ｕ^３／Ｌ］である。ＬはバイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦ細胞保持デバイスとを接続するチューブの長さであり、Ｕは［バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦとを接続するチューブ内の流量／バイオリアクターとＲＴＦ又はＡＴＦとを接続するチューブの断面積］である。式１において、νは［細胞培養物粘度／細胞培養物密度］である。いくつかの例では、バイオリアクターと細胞保持デバイスとを接続する単一のチューブがあり、バイオリアクターのポートから細胞保持デバイスのポートまでそのチューブの長さが利用される（例えば、説明のための図３Ａを参照されたい）。他の例では、バイオリアクターと細胞保持デバイスとを接続する複数のチューブが存在し（例えば、説明のための図３Ｂを参照されたい）、これらの配置では式１で利用されるチューブの長さは、バイオリアクター出口ポートで始まり、バイオリアクター入口ポートで終わる、細胞保持デバイスを含まない、回路内のチューブの最も長いセグメントである。単に説明のために、図３Ｂの概略図において、バイオリアクターと細胞保持デバイスへの入口とを接続するチューブを表す太線が、式１において使用される。これらのパラメータの１つ又は複数を調整することが残りのパラメータに影響を及ぼすことは理解されよう。本開示の様々な態様において、チューブを通る流量は、（ｉ）中空糸モジュールでは、約４ｍＬ／分／糸～約１６ｍＬ／分／糸、（ｉｉ）フラットシートフィルタモジュールでは、約３６０Ｌ／ｍ^２／時～約７２０Ｌ／ｍ^２／時、又は（ｉｉｉ）積層プレートモジュール（例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから販売されているＰＲＯＳＴＡＫ（登録商標）モジュール）では、約１Ｌ／ｍ／チャネル～約４Ｌ／ｍ／チャネルから選択され、細胞培養物粘度は約１～約６センチポアズ（例えば、約２～約６センチポアズ）から選択され、且つ／又は細胞培養物密度は約１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌから選択される。

【0022】

細胞培養培地は、インビトロ細胞培養における哺乳動物細胞などの動物細胞の増殖に好適な培地である。細胞培養培地製剤は、当該技術分野においてよく知られている。通常、細胞培養培地は、緩衝液、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン及び微量の必須元素を含有する。細胞培養培地は、血清、ペプトン、及び／又はタンパク質を含んでも含まなくてもよい。無血清の既知組成培養培地を含む様々な組織培養培地が市販されており、例えば、以下の細胞培養培地のいずれか１つ又は組み合わせを使用することができる：ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）などの無血清培地。細胞培養培地には、培養される細胞の要件及び／又は所望の細胞培養パラメータに応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などの追加の又は濃度を高めた成分を補充し得る。

【0023】

細胞培養培地は、無血清、無タンパク質、及び／又は無ペプトン培地であり得る。「無血清」は、ウシ胎児血清などの動物血清を含まない細胞培養培地に適用される。「無タンパク質」は、トランスフェリン、タンパク質成長因子ＩＧＦ－１、又はインスリンなどの外部から添加されるタンパク質を含まない細胞培養培地に適用される。無タンパク質培地は、ペプトンを含有しても含有しなくてもよい。「無ペプトン」は、動物及び／又は植物のタンパク質加水分解物などの外因性タンパク質加水分解物を含まない細胞培養培地に適用される。細胞培養培地から血清及び／又は加水分解物を除去することは、ロット間のばらつきを低減し、濾過などの処理工程を増強するという利点を有する。しかしながら、血清及び／又はペプトンが細胞培養培地から除去された場合、細胞増殖、生存率及び／又はタンパク質発現は、減少するか、又は最適に至らないことがあり得る。したがって、無血清及び／又は無ペプトン細胞培養培地は、アミノ酸、微量元素などの濃度を大きく高めるようにしてもよい。例えば、米国特許第５，１２２，４６９号明細書及び同第５，６３３，１６２号明細書を参照されたい。

【0024】

既知組成細胞培養培地製剤は、アミノ酸、無機塩、炭水化物、脂質、ビタミン、緩衝液及び微量必須元素を含有する複合物である。所望の特性を有する細胞培養物を維持するために必要且つ有益である成分を特定することは、進行中の課題である。特定の宿主細胞の要求を満たすために又は所望の性能パラメータを満たすために補充又は濃縮されている既知組成基礎培地製剤は、既知組成培地を開発するための１つのアプローチである。

【0025】

培地及び細胞自体の成分を含む細胞培養物粘度は、任意選択により、約１～約６センチポアズ（例えば、約２～約６センチポアズ）である。細胞培養物粘度は、「コーンプレート型」粘度計などの任意の好適な粘度計を使用して特徴付けることができる。培地及び細胞自体の成分を含む細胞培養物密度は、任意選択により、約１ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌから選択される。細胞培養物密度は、例えば、トリパンブルー排除法を使用するＲｏｃｈｅ Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓなどの自動細胞計数器を用いることによって特徴付けることができる。

【0026】

本開示の方法は、細胞が２つ以上の異なるフェーズで培養される、大規模生産プロセスの一部として使用され得る。例えば、細胞は、Ｎ－１生産フェーズ前の１つ以上の増殖フェーズで培養され、Ｎ－１生産フェーズで培養され、次いで、タンパク質生産を最大にする条件下で（Ｎ）産生フェーズに移され得る。各フェーズは、それ自体のバイオリアクター容器又は細胞培養に適した他の容器中で行うことができる。２つ以上のフェーズを共通の容器中で行うことができる。１つのそのような例では、増殖フェーズと産生フェーズが同じバイオリアクター容器中で行われる。哺乳動物細胞によるタンパク質の生産のための商業的プロセスでは、一般に、最終産生フェーズに先行する異なる培養容器中で起こる、複数の、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の増殖フェーズが存在する。本開示の方法は、少なくともＮ－１増殖フェーズ中に用いることができるが、先行する増殖フェーズ（例えば、Ｎ－２又はＮ－３）においても用いることができる。

【0027】

ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、例えば、約３０ｍｌの培地を有する１００ｍｌ容器、約８０～約９０ｍｌの培地を有する２５０ｍｌ容器、又は約１５０～約２００ｍｌの培地を有する２５０ｍｌ容器などの小規模培養物中で培養することができる。或いは、培養物、例えば、約３００～約１０００ｍｌの培地を有する１０００ｍｌ容器、約５００ｍｌ～約３０００ｍｌの培地を有する３０００ｍｌ容器、約２０００ｍｌ～約８０００ｍｌの培地を有する８０００ｍｌ容器、及び約４０００ｍｌ～約１５０００ｍｌの培地を有する１５０００ｍｌ容器などの大規模であり得る。タンパク質治療薬の臨床製造用などの大規模細胞培養は、通常、細胞が所望のタンパク質を産生する間、数日間又は数週間維持される。この時間の間、培養物に、細胞培養物の産生フェーズの過程で消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含有する濃縮供給培地が補充され得る。濃縮フィード培地は、ほぼあらゆる細胞培養培地製剤をベースにすることができる。そのような濃縮供給培地は、細胞培養培地の成分の大部分を、例えば、それらの正常量の約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍又は５０倍で含有することができる。濃縮供給培地は、多くの場合、フェドバッチ培養プロセスにおいて使用される。

【0028】

産生フェーズは、大規模に行うことができる。大規模プロセスは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００又は２０，０００リットルの体積で行うことができる。増殖フェーズは、産生フェーズより高温で起こり得る。例えば、増殖フェーズは、約３５℃～約３８℃の第１の温度で起こり得、産生フェーズは、約２９℃～約３７℃、任意選択により、約３０℃～約３６℃又は約３０℃～約３４℃の第２の温度で起こり得る。加えて、例えば、カフェイン、酪酸塩、及びヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学誘導剤を、温度シフトと同時に、温度シフトの前に、及び／又は温度シフトの後に添加し得る。誘導剤が、温度シフトの後に加えられる場合、それらは、温度シフトの１時間～５日後、任意選択により、温度転換の１～２日後に加えられ得る。

【0029】

生産の増殖段階（Ｎ－１段階）の持続時間は、例えば、７～１４日の範囲であり得、産生（Ｎ）バイオリアクターの接種前に指数関数的増殖で細胞を維持するように設計され得る。

【0030】

細胞培養物からの試料は、当該技術分野で知られた分析技術などの任意の分析技術を使用してモニターし、評価することができる。エタネルセプトの品質、培地の品質、及び他の特性を含む様々なパラメータを、培養期間の間、モニターすることができる。試料は、連続モニタリング、リアルタイム又は準リアルタイムを含む、所望の頻度で断続的に採取し、モニターすることができる。試料は、Ｎ－１（又は先行する）フェーズ中、産生（Ｎ）フェーズ中、又は精製プロセス中に採取して、タンパク質生産物及び生産プロセスの特性を定量的及び／又は定性的にモニターすることができる。生産物品質属性の検出は、質量分析、ＵＶ及び／又は質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動などを使用して達成され得る。アミノ酸プロセシング及びグリコシル化などの翻訳後修飾は、例えば、サイズ排除モードで操作され、ＥＳＩ－ＭＳと結合したｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅカラムを使用して特徴付けられ得る（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ，１９：５０２－５０９）。イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液のリアルタイムモニタリングは、レーザー光散乱検出器及びＵＶ吸光度を使用して、各画分について正規化ＬＳ／ＵＶ比をモニタリングすることによって実施することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０３０３７３２号明細書を参照されたい）。

【0031】

本開示の方法、技術、及び組成物は、組換えタンパク質産物を生産するための、特にエタネルセプトを生産するための他の方法、技術、及び組成物と組み合わせて使用することができる。そのような他の方法、技術、及び組成物は、米国特許第７，９１５，２２５号明細書、同第８，１１９，６０５号明細書、同第８，４１０，０６０号明細書、同第８，７２２，６３１号明細書、同第７，６４８，７０２号明細書、同第８，１１９，６０４号明細書、同第８，８２８，９４７号明細書、同第７，２９４，４８１号明細書、同第７，４７６，７２２号明細書、同第７，１２２，６４１号明細書、同第６，８７２，５４９号明細書、同第７，４５２，６９５号明細書、同第７，３００，７７３号明細書、同第８，０６３，１８２号明細書、同第８，１６３，５２２号明細書、同第６，９２４，１２４号明細書、同第７，６４５，６０９号明細書、同第６，８９０，７３６号明細書、同第７，０６７，２７９号明細書、同第７，３８４，７６５号明細書、同第７，８２９，３０９号明細書、同第６，９７４，６８１号明細書、同第６，３０９，８４１号明細書、同第７，８３４，１６２号明細書、同第８，２１７，１５３号明細書、同第８，２７３，７０７号明細書、同第７，７８１，３９５号明細書、同第７，４２７，６５９号明細書、同第７，１５７，５５７号明細書、同第７，５４４，７８４号明細書、同第７，０８３，９４８号明細書、同第７，７２３，４９０号明細書、同第８，０５３，２３６号明細書、同第７，８８８，１０１号明細書、同第８，２４７，２１０号明細書、同第８，４６０，８９６号明細書、同第８，６８０，２４８号明細書、同第６，４１３，７４４号明細書、同第７，０９１，００４号明細書、同第６，８９７，０４０号明細書、同第６，６３２，６３７号明細書、同第７，９５６，１６０号明細書及び同第７，２７６，４７７号明細書中に見出すことができ、これらの各文献は、それが教示し開示する全てについて、参照によりその全体が組み込まれる。

【0032】

本開示はさらに、本明細書に記載の方法を用いて生産されたエタネルセプトを含む製剤を提供する。製剤は、液体製剤又は凍結乾燥製剤であり得る。通常、本製剤のエタネルセプト濃度は、水性製剤（例えば、溶媒として水）中、約４０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬである。より好ましくは、エタネルセプト濃度は、約４０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、より一層好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬ～約７５ｍｇ／ｍＬ、及び任意選択により約５０ｍｇ／ｍＬである。本製剤での使用に好適な賦形剤としては、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース及びグルコースなどの糖／ポリオール；血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡ又は組換えＨＡ）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）などのポリマー；多価アルコール、（例えば、ＰＥＧ、エチレングリコール及びグリセロール）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの非水性溶媒；Ｌ－アルギニン、プロリン、Ｌ－セリン、アラニン、グリシン、塩酸リシン、サルコシン及びガンマ－アミノ酪酸などのアミノ酸；ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０などの界面活性剤、並びに塩化ナトリウム、塩化カリウム及びクエン酸ナトリウムなどの塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0033】

様々な態様において、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン、及び水を含む（又はそれらからなる）。或いは、製剤は、凍結乾燥粉末中に、２５ｍｇのエタネルセプト、４０ｍｇのマンニトール、１０ｍｇのスクロース、及び１．２ｍｇのトロメタミンを含む（又はそれらからなる）。或いは、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、１％のスクロース（ｗ／ｖ）、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＬ－アルギニン、及び水を含む（又はそれらからなる）。

【0034】

任意選択により、製剤は、送達デバイス、又は貯蔵若しくは輸送のための容器中に存在する。例えば、本開示の様々な実施形態において、約１ｍＬ又は約０．５１ｍＬの製剤が、プレフィルドシリンジ又は自己注射器（例えば、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）自己注射器）に入っている。製剤が凍結乾燥粉末である場合、製剤は、任意選択により、複数回使用バイアルに入っている。本開示は、本明細書に記載の製剤を、この製剤の使用説明書と共に含むキットをさらに提供する。キットは、容器、例えば、単回使用容器（すなわち、１用量製剤を保持する容器）を含み得る。単回容器は、容器から規定量の単一用量を確実に患者に投与することができるように、単一用量に加えて十分な余分を含み得るが、容器が第２の用量を投与するために使用できるほどの余分はないことは認識されている。容器（単回使用の容器であるか複数回使用の容器であるかにかかわらず）の例としては、バイアル、シリンジ、及び自動注射器が挙げられる。好適な自己注射器の例としては、米国特許８，１７７，７４９号明細書、同第８，０５２，６４５号明細書及び同第８，９２０，３７４号明細書、並びに国際公開第２０１４／００８９３９３号パンフレット、国際公開第２０１６／０３３４９６号パンフレット及び国際公開第２０１６／０３３５０７号パンフレット（これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出されるものが挙げられる。

【0035】

本明細書に記載のエタネルセプト含有組成物及び製剤、並びに本明細書に記載のシリンジ、自己注射器、キットなどは、治療を必要とする患者、すなわちエタネルセプトによる治療が有効な病態の患者を治療する方法に使用することができる。「治療を必要とする患者」という用語には、既にその障害を有する対象及びその障害を予防しようとする対象を含む。「患者」には、予防的処置又は治療的処置を受けるヒト対象及び他の哺乳動物対象が含まれる。「治療」という用語は、治療的治療と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。「治療」は、疾患の完全な寛解又は根絶である必要はなく、疾患の何らかの改善及び／又は疾患に関連する症状の改善が企図される。エタネルセプトによる治療に応答する病態の例としては、関節リウマチ、多関節若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び乾癬（すなわち、尋常性乾癬）が挙げられる。エタネルセプトによる患者の治療方法は、例えば、米国特許第７，９１５，２２５号明細書、同第８，１１９，６０５号明細書、同第８，４１０，０６０号明細書、同第８，７２２，６３１号明細書、及び同第８，１１９，６０４号明細書（これらの各文献は、その全体が特に、上記の病態及び投与レジメンの説明に関して、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0036】

本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施例は、本発明を説明することのみを目的としており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0037】

ＲＴＦは、組換えタンパク質の生産に有効であるが、労働集約的であり、複雑な装置を必要とし、現在の生産上の課題であり得る。ＣＨＯ細胞においてエタネルセプトを組換え産生するために、Ｎ－１生産フェーズにおいてＡＴＦの使用を試験した。Ｎ－１生産フェーズにおいて，ＲＴＦをＡＴＦに置き換えた初期の試験では、培養物によって最終的に産生されるエタネルセプトの量（Ｎ産生フェーズ後）が減少した。驚くべきことに、Ｎ－１生産フェーズ期におけるＣＨＯ細胞凝集レベルが、Ｎフェーズ産生における産物力価に影響を及ぼすことがわかった。

【0038】

２つのタイプの灌流法、再循環タンジェンシャルフロー濾過（ＲＴＦ）及び交互タンジェンシャルフロー濾過（ＡＴＦ）を用いてＮ－１潅流リアクターを運転した。以下の２つのタイプの細胞保持デバイスを使用した：ＲＴＦ潅流用の孔径０．２μｍのＳａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎスライスカセット、及びＡＴＦ潅流用の孔径０．４５μｍの中空糸膜を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ。Ｎ－１リアクターの作動容積は２Ｌであった。３つの異なるＡＴＦ移送ライン内径を試験した（０．３７５”、０．２５”及び０．１２５”）。システムは、同じ、バイオリアクターと細胞保持デバイスとを接続するチューブ長さ、チューブ内の流量、細胞培養物粘度、及び細胞培養物密度を使用し、条件＃２、＃３、及び＃４の唯一の変数はチューブの断面積（内径）であった。式１をシステムパラメータに適用して、条件＃２及び＃３のηを決定した。条件１及び４は、細胞凝集に影響を及ぼすのに十分な乱流を生じなかった。実験条件を、表１に要約する。

【0039】

【表1】

【0040】

試験した各Ｎ－１条件からの接種源を用いて、１Ｌの作動容積を有するＮ－０リアクターに接種し、標準的な操作パラメータを用いて運転した。この設計により、Ｎ－０リアクター性能及び生産性に対する細胞凝集速度の潜在的影響の評価が可能になった。

【0041】

条件＃１～＃４を用いて運転したＮ－１潅流リアクターは全ての所望の細胞増殖培養性能パラメータを満たし、試験の全過程（５日間）にわたって９５％以上の細胞生存率を支持した。Ｎ－１潅流リアクターから接種されたＮ－０培養物もまた、正常な細胞生存率を示した。しかしながら、驚くべきことに、条件＃２を用いたＮ－１培養物から接種されたＮ－０培養物は、条件＃１、＃３及び＃４を用いて行われたＮ－１培養物から接種された培養物と比較して、力価が非常に低かった。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、η＝１７μｍをもたらす条件＃２の潅流パラメータは、Ｎ－１段階における細胞凝集体の破壊を促進する有害な流体力学的条件と関連していた。Ｎ－１段階における細胞凝集体の破壊は、予想を超えるＮ－０培養性能の低下をもたらした。ηの値を増加させるためにパラメータを調整することにより、Ｎ－１培養物の凝集速度が増加し、驚くべきことに、Ｎ－０培養物における力価が増加した。２０μｍ以上のη値は、一貫した生産物品質属性を維持しながら、より高い力価をもたらす細胞凝集レベルを維持するのに十分な大きさの潅流の流れの渦に相当する。実際、条件＃３及び＃４からのＮ－１培養物について採取されたＮ－０培養物は、培養性能、力価、メインピーク、及び凝集体に関して、ＲＴＦを使用したＮ－１培養物と同等であった。

【0042】

特許、特許出願、文献刊行物などを含む、本明細書に引用されている全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0043】

本発明は好ましい実施形態に重点を置いて記載してきたが、好ましい化合物及び方法の変形が使用され得ること、及び本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施され得ることが意図されていることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲に包含される全ての変更を含む。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【配列表】

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【国際調査報告】