特表 2024-503277 活性化抗原担体の製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】活性化抗原担体の製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240118BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240118BHJP

   C07K 14/025 20060101ALI20240118BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240118BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240118BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 G

A61K39/39

A61P31/20

A61P37/04

A61K39/12

A61K47/20

A61K47/46

C07K14/025 ZNA

C12N1/00 F

C12M1/00 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539809

(86)(22)【出願日】2021-12-28

(85)【翻訳文提出日】2023-08-17

(86)【国際出願番号】 US2021073142

(87)【国際公開番号】W WO2022147442

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/131,457

(32)【優先日】2020-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518071763

【氏名又は名称】スクイーズ バイオテクノロジーズ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バーンスタイン， ハワード

(72)【発明者】

【氏名】ヤラル， デフネ

(72)【発明者】

【氏名】ブラゴヴィッチ， カタリナ

(72)【発明者】

【氏名】ラマクリシュナン， アムリタ

(72)【発明者】

【氏名】ダドガー， マイサム

(72)【発明者】

【氏名】クリア， ルイーズ

(72)【発明者】

【氏名】マリー， ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】アブデルジャワド， タレク

(72)【発明者】

【氏名】ページ， クレア

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB13

4B029GB10

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065BB11

4B065CA44

4B065CA46

4C076BB11

4C076CC06

4C076DD55

4C076EE56

4C076GG41

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA51

4C085CC08

4C085CC32

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF13

4C085FF14

4C085FF21

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）の製剤を提供し、当該製剤は、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣと、凍結保存培地と、を含む。いくつかの態様では、本発明は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）を含む医薬製剤を提供し、製剤は、ａ）ＡＡＣが少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣ、ならびに、ｂ）凍結保存培地を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

活性化抗原担体（ＡＡＣ）を含む医薬製剤であって、前記製剤が、
ａ）ＡＡＣであって、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む、ＡＡＣと、
ｂ）凍結保存培地と、を含む、医薬製剤。

【請求項2】

前記製剤が、約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含む、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

前記製剤が、約７×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項１または２に記載の医薬製剤。

【請求項4】

前記製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項5】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤が、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項6】

前記製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項7】

前記製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項8】

前記製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項9】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤が、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項10】

前記ＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣが、機能的である、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項11】

前記製剤中の前記ＡＡＣが、約７０％以上の機能性を維持する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項12】

前記製剤が、約１×１０^８個／ｍＬの機能的ＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項13】

前記ＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣが、アネキシン染色に対して陽性である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項14】

前記製剤中の前記ＡＡＣが、約７０％以上でアネキシン染色に対して陽性を維持する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項15】

前記アネキシンがアネキシンＶである、請求項１３または１４に記載の医薬製剤。

【請求項16】

前記凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項17】

前記凍結保存培地が、約０．５％～約５％のＤＭＳＯを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項18】

前記凍結保存培地が、約２％のＤＭＳＯを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項19】

前記凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項20】

前記製剤のｐＨが、約６．０～約８．５である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項21】

前記製剤のｐＨが、約７．６である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項22】

ＡＡＣの医薬製剤であって、前記製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である、医薬製剤。

【請求項23】

ＡＡＣの医薬製剤であって、前記製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、医薬製剤。

【請求項24】

前記製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項２２または２３に記載の医薬製剤。

【請求項25】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤が、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項26】

前記製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項27】

前記製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項28】

前記製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項29】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤が、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項30】

ＡＡＣの医薬製剤であって、前記製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、医薬製剤。

【請求項31】

前記凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項32】

前記製剤は、無菌である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項33】

前記製剤は、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項34】

前記製剤は、マイコプラズマを含まない、請求項１～３３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項35】

前記少なくとも一つの抗原が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項36】

前記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、請求項３５に記載の製剤。

【請求項37】

前記抗原が、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＥ７に由来するペプチドを含む、請求項３５または３６に記載の製剤。

【請求項38】

前記抗原が、ＨＰＶ Ｅ６に由来するペプチドおよびＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項39】

前記抗原が、配列番号１～４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項40】

前記抗原が、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項41】

前記ＡＡＣは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗原と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む抗原と、を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項42】

前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項43】

前記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項４２に記載の製剤。

【請求項44】

前記少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む前記ＡＡＣが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記摂動無核細胞を、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントと、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントが前記摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間、インキュベートし、それによって、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントを含む前記ＡＡＣを生成することと、を含む、プロセスにより調製される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項45】

前記狭窄部の前記直径が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記インプット無核細胞が、赤血球である、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

請求項１～４６のいずれか一項に記載の医薬製剤を含む、バイアル。

【請求項48】

医薬製剤を含むバイアルであって、前記医薬製剤は、凍結保存培地中に約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である、バイアル。

【請求項49】

医薬製剤を含むバイアルであって、前記医薬製剤は、凍結保存培地中に約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【請求項50】

前記製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項４８または４９に記載のバイアル。

【請求項51】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項52】

前記製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項53】

前記製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項54】

前記製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項55】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項56】

医薬製剤を含むバイアルであって、前記医薬製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【請求項57】

前記ＡＡＣは、約９．５ｍＬの前記凍結保存培地中に存在する、請求項４８～５６または３９のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項58】

医薬製剤を含むバイアルであって、前記医薬製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【請求項59】

前記製剤は、無菌である、請求項４７～５８のいずれか一項に記載のバイアル。

【請求項60】

ＡＡＣの医薬製剤を作成する方法であって、前記方法は、凍結保存培地を前記ＡＡＣに加えることを含み、前記ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む、方法。

【請求項61】

ＡＡＣの医薬製剤を作成する方法であって、前記ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、前記方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記摂動無核細胞を、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントと、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントが前記摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間インキュベートし、それによって、前記少なくとも一つの抗原および前記アジュバントを含む前記ＡＡＣを生成することと、
ｃ）前記ＡＡＣを洗浄することと、
ｄ）前記ＡＡＣを凍結保存培地中で製剤化することと、を含む、方法。

【請求項62】

前記狭窄部の前記直径が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記ＡＡＣが約６回洗浄される、請求項６１または６２に記載の方法。

【請求項64】

前記ＡＡＣは、遠心分離および再懸濁によって、または遠心分離および濾過によって洗浄される、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記遠心分離が約４０００ｒｐｍである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣが、約９ｍＬ～約１０ｍＬの前記凍結保存培地中で製剤化される、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記医薬製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤が、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、請求項６６または６７に記載の方法。

【請求項69】

前記製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、前記製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

約７×１０^９個のＡＡＣが、約１０ｍＬの前記凍結保存培地中で製剤化される、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記インプット無核細胞が、赤血球である、請求項６１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記方法が、約－１７０℃で前記ＡＡＣの製剤を凍結することをさらに含む、請求項６０～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記ＡＡＣの製剤が、
ａ）前記製剤をチャンバー内に置くことと
ｂ）前記チャンバーの温度を、約－３℃に低下させることと
ｃ）前記チャンバーの温度を、約－２０℃／分の速度で約－１４０℃に低下させることと、
ｄ）前記チャンバーの温度を、約－１．５℃／分の速度で約－１５０℃に低下させることと、
ｅ）前記チャンバーの温度を、約－１．０℃／分の速度で約－１７０℃に低下させることと、
ｆ）前記チャンバーの温度を、約－１７０℃で少なくとも約１０分間保持することと、を含むプロセスにより凍結される、請求項７５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１２月２９日に出願された米国仮出願第６３／１３１，４５７号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容であるコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７５０３２２００３４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１２月２３日、サイズ：１３，０１６バイト）については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、概して、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む活性化抗原担体（ＡＡＣ）の製剤、ならびに凍結保存培地に関する。少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むこうしたＡＡＣを製造する方法、凍結保存可能な製剤を製剤化する方法、およびその製剤を凍結保存する方法も提供される。

【背景技術】

【0004】

パピローマウイルスは、直径約５５ｎｍのビリオンサイズを有する小さな非エンベロープＤＮＡウイルスである。１００を超えるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型が完全に特徴付けられており、さらに多くの数が存在するものと推定されている。ＨＰＶは、子宮頸がん、ならびにいくつかの外陰部がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、肛門がん、および直腸がんの公知の原因である。ほとんどのＨＰＶ感染は無症状であり自然に消失するが、発癌性ＨＰＶ型の一つによる持続性感染は、前がんまたはがんに進行し得る。他のＨＰＶ関連疾患としては、尋常性いぼ、足底いぼ、扁平いぼ、肛門性器いぼ、肛門病変、表皮異形成、局所性上皮肥厚、口腔パピローマ、いぼ状嚢胞、喉頭パピローマ、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および膣上皮内腫瘍（ＶＡＩＮ）が挙げられ得る。

【0005】

公知のＨＰＶ型の多くは、サブセットが発がん性である良性病変を引き起こす。疫学的および系統学的な関係に基づくと、ＨＰＶの型は、十五の「高リスク型」（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および８２）と、三つの「潜在的な高リスク型」（ＨＰＶ２６、５３、および６６）とに分類され、これらはともに、低悪性度および高悪性度の子宮頸部の変化およびがんとして、ならびに他の肛門性器がん、例えば外陰部がん、膣がん、陰茎がん、肛門がんおよび肛門周囲がんなど、ならびに頭頸部がんとして現れることが知られている。最近では、高リスク型のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８と乳がんとの関連も記述された。「低リスク型」に分類される十一種類のＨＰＶ型（ＨＰＶ６、１１、４０、４２、４３、４４、５４、６１、７０、７２、および８１型）が、良性かつ低悪性度の子宮頸部変化、生殖器いぼ、および再発性呼吸器パピローマとして現れることが知られている。皮膚型ＨＰＶの５型、８型、および９２型は、皮膚がんに関連している。いくつかのＨＰＶ関連がんでは、免疫系が低下し、それに応じて抗腫瘍応答が著しく損なわれる。Ｓｕｒｅｓｈ ａｎｄ Ｂｕｒｔｎｅｓｓ Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １３（６）：２０－２７（２０１７）を参照されたい。

【0006】

免疫療法は、概して、受動的介入と能動的介入いずれかの二つの主要なタイプに分けられ得る。受動的プロトコルには、予め活性化および／もしくは操作した細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、疾患特異的な治療用抗体、ならびに／またはサイトカインの投与が含まれる。活性免疫療法戦略は、インビボで免疫系エフェクター機能を刺激することを目的としている。現在のいくつかの活性プロトコルには、疾患関連ペプチド、可溶化物、または同種異系の全細胞によるワクチン接種戦略、腫瘍抗原送達用のビヒクルとしての自己樹状細胞（ＤＣ）の注入、および免疫チェックポイントモジュレータの注入が含まれる。Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，Ｎｉｋｏｓ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４．１４（２０１６）を参照されたい。免疫応答を調節し、抗腫瘍活性を増強し、そしてＨＰＶ関連のがんを治療または予防するという目標を達成するために、養子免疫療法を採用することができる。
疾患関連抗原によって刺激されるＣＤ８^＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４^＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、疾患細胞を標的とし、破壊する潜在性を有するが、内因性Ｔ細胞応答を誘導するための現在の方法は、課題に直面している。本明細書に記載される製剤およびバイアルは、凍結保存培地中のＡＡＣを含み、それを必要とする個体に投与する前に、機能性を損なうことなく製造、保存、輸送することができる。本明細書に記載の方法は、少なくとも一つのＨＰＶ抗原とアジュバントを含む無核細胞または無核細胞由来の実体であり得るＡＡＣを、ハイスループットな方法で効率的に作成するために使用され、ＨＰＶ抗原に対する強固なＴ細胞応答を誘導するために利用することができる。本明細書の開示はまた、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを使用して、ＨＰＶ関連がんを有する個体を治療するための方法、治療、用量およびレジメンも記載する。
特許出願および刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。特許文献である国際公開第２０１３／０５９３４３号、国際公開第２０１５／０２３９８２号、国際公開第２０１６／０７０１３６号、国際公開第２０１７０４１０５０号、国際公開第２０１７００８０６３号、国際公開第２０１７／１９２７８５号、国際公開第２０１７／１９２７８６号、国際公開第２０１９／１７８００５号、国際公開第２０１９／１７８００６号、国際公開第２０２０／０７２８３３号、国際公開第２０２０／１５４６９６号、および国際公開第２０２０／１７６７８９号、米国特許出願公開第２０１８０１４２１９８号および米国特許出願公開第２０１８０２０１８８９号は、参照によりその全体として明示的にここに組み込まれる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１３／０５９３４３号

【特許文献2】国際公開第２０１５／０２３９８２号

【特許文献3】国際公開第２０１６／０７０１３６号

【特許文献4】国際公開第２０１７／０４１０５０号

【特許文献5】国際公開第２０１７／００８０６３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，Ｎｉｋｏｓ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４．１４（２０１６）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

いくつかの態様では、本発明は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）を含む医薬製剤を提供し、製剤は、ａ）ＡＡＣが少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣ、ならびに、ｂ）凍結保存培地を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、フローサイトメトリーによって測定される場合、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、コールターカウンターによって測定される場合、解凍後に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣが機能的である。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、約７０％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^８個／ｍＬ～約１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣがアネキシン染色陽性である。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、約７０％以上のアネキシン染色陽性を維持する。いくつかの実施形態では、アネキシンは、アネキシンＶである。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態では、製剤中の凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約２％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。

【0012】

いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約６．０～約８．５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約７．６である。

【0013】

いくつかの態様では、本発明はＡＡＣの医薬製剤を提供し、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨはｐＨ約６．０～約ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、製剤は、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、マイコプラズマを含まない。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態では、製剤のＡＡＣは、少なくとも一つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ－１６抗原またはＨＰＶ－１８抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＥ７に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＰＶ Ｅ６由来のペプチドと、ＨＰＶ Ｅ７由来のペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１～４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗原と、配列番号２３のアミノ酸配列を含む抗原とを含む。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態では、製剤のＡＡＣはアジュバントを含み、アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。

【0016】

本発明のいくつかの態様では、製剤は、以下を含むプロセスによって調製された少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。いくつかの実施形態では、狭窄部の直径が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。

【0017】

いくつかの態様では、本発明は、医薬製剤を含むバイアルを提供し、当該医薬製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを凍結保存培地中に含有し、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは、約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である。いくつかの態様では、本発明は、医薬製剤を含むバイアルを提供し、当該医薬製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを凍結保存培地中に含有し、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは、約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、フローサイトメトリーによって測定される場合、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、コールターカウンターによって測定される場合、解凍後に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、フローサイトメトリーによって測定される場合、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、コールターカウンターによって測定される場合、解凍後に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬製剤を含むバイアルを提供し、当該医薬製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬの凍結保存培地中に含有し、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは、約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約９．５ｍＬの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。

【0018】

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＣの医薬製剤を作製する方法を提供し、当該方法は、凍結保存培地をＡＡＣに加えることを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む。いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＣの医薬製剤を製造する方法を提供し、当該ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該方法は以下を含む：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させること、およびｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること、ｃ）ＡＡＣを洗浄すること、およびｄ）ＡＡＣを凍結保存培地中で製剤化すること。いくつかの実施形態では、狭窄部の直径が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは約６回洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、遠心分離および再懸濁によって、または遠心分離および濾過によって洗浄される。いくつかの実施形態では、遠心分離は約４０００ｒｐｍである。いくつかの実施形態では、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣは、約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中で製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含有する。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、製剤は、フローサイトメトリーによって測定される場合、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、コールターカウンターによって測定される場合、解凍後に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、約７×１０^９個のＡＡＣは、約１０ｍＬの凍結保存培地中で製剤化される。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球である。

【0019】

いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＣの製剤を約－１７０℃で凍結させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの製剤化は、以下を含むプロセスにより凍結される：ａ）製剤をチャンバー内に置くこと、ｂ）チャンバーの温度を約－３℃に下げること、ｃ）チャンバーの温度を、約－２０℃／分の速度で約－１４０℃に下げること、ｄ）チャンバーの温度を、約１．５℃／分の速度で約－１５０℃に下げること、ｅ）チャンバーの温度を約１．０℃／分の速度で約－１７０℃に下げること、およびｆ）チャンバーの温度を少なくとも約－１７０℃で少なくとも約１０分間保持すること。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、血小板除去の評価を示し、ＲＢＣ回収は、七人の異なる健康なドナーからのＬＯＶＯプロセスにわたって実施された。

【0021】

【図2】図２は、ＬＯＶＯ上の送達媒体による細胞洗浄および再懸濁、ならびに白血球除去フィルタを介した精製を含む、ＲＢＣ精製工程にわたる十一回のランのＲＢＣ、血小板、および白血球の平均全体的回収率を示す。

【0022】

【図3】図３Ａは、６０ｐｓｉおよび７５ｐｓｉの動作圧力で異なるチップ構成を赤血球が通過した後のアネキシンＶ＋集団の増加を示す。図３Ａは、６０ｐｓｉおよび７５ｐｓｉの動作圧力で異なるチップ構成を赤血球が通過した後のＯｖａ６４７の送達を示す。

【0023】

【図4】図４は、異なる細胞濃度のチップを赤血球が通過した後のＯｖａ６４７の送達を示す。

【0024】

【図5】図５は、異なる細胞濃度のチップを赤血球が通過した後のＦＡＭ標識Ｅ６およびＥ７ペプチドの送達を示す。

【0025】

【図6】図６は、異なる圧力のチップを赤血球が通過した後のＦＡＭ標識Ｅ７ペプチドの送達を示す。

【0026】

【図7】図７は、ＡＡＣが３７℃の静置期間中に希釈された、または希釈されていないＡＡＣである場合に、ＩＦＮγレベルによって測定される機能分析を示す。

【0027】

【図8】図８は、二つの異なるプロトコルを使用したＬＯＶＯ処理の平均回収率を示す。

【0028】

【図9】図９は、７×１０^８ＡＡＣ／ｍＬの目標濃度を達成するためのＬＯＶＯ処理を示す。

【0029】

【図10】図１０は、開発されたプロトコルを使用して凍結保存されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの４８バイアルの代表的な負荷を示す。

【0030】

【図11】図１１は、二つのラック構成を使用して凍結保存されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの６４バイアルの代表的な負荷を示す。

【0031】

【図12】図１２は、五つのプロセス開発バッチからの解凍後の数を示す。これら五つのバッチにわたる平均ＡＡＣ数は、１．０３×１０^９ＡＡＣ／ｍＬであった。

【発明を実施するための形態】

【0032】

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＣを含む医薬製剤を提供し、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバント、ならびに凍結保存培地を含む。いくつかの実施形態では、本発明は活性化抗原担体（ＡＡＣ）の医薬製剤を提供し、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結保存培地中に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。

【0033】

いくつかの態様では、本発明は、医薬製剤を含むバイアルを提供し、当該医薬製剤は、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２などであるが、これに限定されない）中に含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは、約ｐＨ７．６である。

【0034】

いくつかの態様では、本発明は、医薬製剤を含むバイアルを提供し、当該医薬製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２などであるが、これに限定されない）中に含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは、約ｐＨ７．６である。

【0035】

少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを含む製剤およびバイアル、ならびに少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣの製剤を調製する方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、以下を含むプロセスによって調製される：ａ）インプット無核細胞の集団を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞の集団を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＰＶ抗原である。また、ＨＰＶ抗原に対する免疫応答の誘導の際に使用するため、またはＨＰＶ関連のがんを治療するための組成物も提供する。また、ＨＰＶ抗原に対する免疫応答を刺激またはＨＰＶ関連のがんを治療する医薬の製造において、有効量のＡＡＣを含む製剤を使用することも提供する。

【0036】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣの医薬製剤を製造する方法が提供され、当該ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該方法は以下を含む：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させること、およびｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること、ｃ）ＡＡＣを洗浄すること、およびｄ）ＡＡＣを凍結保存培地中で製剤化すること。

【0037】

一般的な手法
本明細書で説明または参照される技術および手順は、一般的に十分に理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４^ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，６^ｔｈｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３－８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１１）に記載される広範に利用されている方法論など、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に利用される。

【0038】

定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるが、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合、上記に定める定義が優先するものとする。

【0039】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の参照を含む。

【0040】

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびにその他の類似の形態、およびそれらの文法的等価物は、意味が同等であり、これらの用語のいずれか一つに続く項目または複数の項目が、かかる項目または複数の項目の網羅的なリストであることを意味するものではなく、または列挙された項目または複数の項目のみに限定されることを意味するという点で、オープンエンドであることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ、およびＣを含む物品は、成分Ａ、Ｂ、およびＣから成り得るか（すなわち、それのみを含む）、または成分Ａ、Ｂ、およびＣだけでなく、一つ以上の他の成分も含み得る。そのため、「含む」および同様の形態、ならびにその文法的等価物は、「から本質的に成る」または「から成る」の実施形態の開示を含むことが意図され、理解される。

【0041】

値の範囲が提供される場合、文脈が別段に明確に指示しない限り、下限の単位の十分の一までの各介在する値は、その範囲の上限および下限、ならびにその範囲内の他の記載された値または介在する値の間の値が、記載された範囲内の特定の除外限界に従うことを条件として、本開示内に包含されることが理解される。記載された範囲が制限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲も開示に含まれる。

【0042】

本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野の当業者に容易に認識されるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0043】

本明細書で使用される場合、「無核細胞」は、核を欠く細胞を指す。そのような細胞には、血小板、赤血球および網赤血球などの赤血球（ＲＢＣ）が含まれるが、これらに限定されない。網赤血球は、未成熟（例えば、まだ両凹ではない）の赤血球であり、典型的には人体における赤血球の約１％を構成する。網赤血球も無核である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、無核細胞（例えば、ＲＢＣ、網赤血球、および／または血小板）の濃縮（例えば、全細胞集団のうち、自然界に見られるよりも大きなパーセンテージを含む）、精製、または単離された（例えば、それらの自然環境から、実質的に純粋または均一な形態で）集団の治療および／または処理のために使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、ＲＢＣ（例えば、赤血球または網赤血球）、血小板、および他の血球を含む全血の治療ならびに／または処理に使用される。これらの細胞型の精製または濃縮は、密度勾配システム（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気細胞選別、または赤芽球および赤血球系前駆体のインビトロ分化などの既知の方法を使用して達成される。

【0044】

本明細書で使用される「小胞」という用語は、脂質二重層によって囲まれた液体を含む構造を指す。いくつかの例では、脂質二重層は、天然に存在する脂質組成物に由来する。いくつかの例では、脂質二重層は、細胞膜から供給され得る。いくつかの例では、小胞は、細胞などの様々な種類の実体に由来し得る。こうした例では、小胞は、元の実体からの分子（細胞内タンパク質または膜成分など）を保持することができる。例えば、赤血球に由来する小胞は、赤血球および／または赤血球の膜成分中にあった任意の数の細胞内タンパク質を含み得る。いくつかの例では、小胞は、所望のペイロードに加えて、細胞内に任意の数の分子を含むことができる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ペイロード」は、無核細胞由来小胞（例えば、ＡＡＣ）内に送達される、例えば、装填される、物質を指す。「ペイロード」、「カーゴ」、「送達材料」、および「化合物」は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質、低分子、核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、脂質、炭水化物、巨大分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素およびフルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、ならびにステロイドを指し得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質または低分子薬剤を指し得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、一つ以上の化合物を含み得る。

【0046】

コード配列および制御配列などの核酸配列に関連する場合の「異種」という用語は、通常は一緒に連結されないおよび／または通常は特定の細胞と結合しないものである配列を意味する。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内のまたは別の核酸分子と付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的では異種と考えられるものとなる。対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じさせない。

【0047】

ペプチド配列およびポリペプチド配列などのアミノ酸配列に関連するような「異種」という用語は、通常は一緒に連結されていないおよび／または特定の細胞と通常は関連しない配列を意味する。したがって、ペプチド配列の「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別のアミノ酸分子内にあるかまたは別のアミノ酸分子に付加したアミノ酸のセグメントである。例えば、ペプチド構築物の異種領域は、天然ではペプチドのアミノ酸配列と関連して見出されない配列が隣接するペプチドのアミノ酸配列を含み得る。異種性ペプチド配列の別の例は、ペプチド配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコードされたアミノ酸を有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しないアミノ酸構築物を発現するベクターにより形質転換された細胞は、本発明の目的では異種と考えられるものとなる。対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ペプチドを生じさせない。

【0048】

細胞またはＡＡＣに関連する抗原またはアジュバントなどの剤に関して使用される場合の「外因性」という用語は、細胞の外側の剤または細胞の外側から細胞内に送達される剤を指す。細胞は、既に存在する薬剤を有してもよく、または有しなくてもよく、外因性薬剤が送達された後、薬剤を産生してもよく、または産生しなくてもよい。

【0049】

本明細書で使用される「相同」という用語は、同じ生物に由来する分子を指す。いくつかの例では、用語は、所与の生物内で通常見出されるか、もしくは発現される、核酸またはタンパク質を指す。

【0050】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」は、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益または望ましい臨床結果には、以下の一つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する一つ以上の症状を緩和すること、疾患の程度を軽減すること、疾患を安定させること（例えば、疾患の悪化を予防するもしくは遅延する）、疾患の蔓延（例えば、転移）を予防するもしくは遅延すること、疾患の再発を予防するもしくは遅延すること、疾患の進行を遅延するもしくは遅らせること、疾患の状態を回復すること、疾患を（部分的または完全に）寛解すること、疾患を治療するために必要な一つ以上の他の薬物の用量を低減すること、疾患の進行を遅延すること、生活の質を増加するまたは改善すること、体重増加が増加すること、および／または生存期間が延長すること。また、「治療」には、がんの病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の減少も包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか一つ以上を企図する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「予防的治療」という用語は、個体が、障害を有することまたは障害を有するリスクがあることが知られているかまたは疑われるが、障害の症状を呈していないかまたは最小限の症状を呈している治療を指す。予防的治療を受ける個体は、症状の発症前に治療され得る。いくつかの実施形態では、個体は、前がん病変、特にＨＰＶ感染に関連する前がん病変を有する場合に治療され得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第一の薬剤が別の薬剤と併せて投与されることを意味する。「と併せて」とは、同じ個体への本明細書に記載の免疫コンジュゲートの投与に加えて本明細書に記載の有核細胞の組成物を投与するなど、別の治療モダリティに加えてある一つの治療モダリティを投与することを指す。したがって、「と併せて」とは、この個体へ他の治療モダリティを送達する前、間、または後に、ある一つの治療モダリティを投与することを指す。

【0053】

本明細書で使用される「同時投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法が、約１５分以内、例えば約１０分以内、５分以内、または１分以内のいずれか一つなどの時間間隔で投与されることを意味する。第一の療法および第二の療法が同時に施与される場合、この第一の療法および第二の療法は、同一組成物中に含有されてもよく（例えば、第一の療法および第二の療法の両者を含む組成物）、または別個の組成物に含有されてもよい（例えば、一の組成物中に第一の療法が含まれ、また別の組成物中に第二の療法が含まれる）。

【0054】

本明細書で使用される場合、「連続投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法が、約１５分超、例えば約２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、またはそれ以上のいずれかなどの時間間隔で投与されることを意味する。第一の療法または第二の療法のいずれかが最初に投与され得る。第一および第二の療法は、同じまたは異なるパッケージまたはキットに含まれ得る別々の組成物中に含まれる。

【0055】

本明細書で使用される場合、「同時投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法の投与が互いに重複することを意味する。

【0056】

がんの文脈において、「治療する」という用語は、がん細胞を死滅させること、がん細胞の成長を阻害すること、がん細胞の複製を阻害すること、全体的な腫瘍負荷を軽減すること、および疾患に関連する一つ以上の症状を回復することのいずれかまたは全てを含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、特定の標的の存在または活性を変化させる、改変する、変更する、またはさもなければ修正する作用を指し得る。例えば、免疫応答を調節することは、免疫応答を変える、変化させる、変更する、またはその他改変することをもたらす任意の作用を指し得る。一部の例では、「調節」は、特定の標的の存在または活性を増強することを指す。一部の例では、「調節」は、特定の標的の存在または活性を抑制することを指す。他の例では、核酸の発現を調節することには、核酸の転写の変化、ｍＲＮＡ量の変化（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の対応する変化、ｍＲＮＡ翻訳の変化などを含み得るが、これらに限定されない。

【0058】

本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、特定の標的の存在または活性を遮断、低減、排除、またはさもなければ拮抗する作用を指し得る。阻害は、部分的阻害または完全阻害を指し得る。例えば、免疫応答を阻害することは、免疫応答の遮断、低減、排除、または任意の他の拮抗作用をもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の阻害には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、遺伝子編集などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の阻害は、タンパク質をコードする核酸の転写の減少、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の減少、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の減少などを含み得るが、これらに限定されない。別の実施例では、阻害は、例えば、腫瘍細胞の成長を遅延させるか、もしくは防止するなど、成長を緩徐化させるか、または停止する作用を指し得る。

【0059】

本明細書で使用される場合、「抑制する」という用語は、特定の標的の存在または活性を減少、低減、妨害、制限、軽減、またはその他縮小する作用を指し得る。抑制は、部分的な抑制または完全な抑制を指し得る。例えば、免疫応答を抑制することは、免疫応答を減少、低減、妨害、制限、軽減、またはその他縮小することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の抑制には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の抑制は、タンパク質をコードする核酸の転写の減少、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の減少、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の減少などを含み得るが、これらに限定されない。

【0060】

本明細書で使用される場合、「増強する」という用語は、特定の標的の存在または活性を向上する、ブーストする、高める、またはさもなければ増加する作用を指し得る。例えば、免疫応答を増強することは、免疫応答を向上させる、ブーストする、高める、またはその他増加させることをもたらす任意の作用を指し得る。例示的な一例では、免疫応答を増強することは、抗原および／またはアジュバントを利用して、免疫応答を向上させる、ブーストする、高める、またはその他増加することを指し得る。他の例では、核酸の発現を増強することには、核酸の転写の増加、ｍＲＮＡ量の増加（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の低減、ｍＲＮＡ翻訳の増加などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現を増強することは、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含み得るが、これらに限定されない。

【0061】

本明細書で使用される場合、「誘導する」という用語は、結果を開始する、促進する、刺激する、確立する、またはさもなければ産生する作用を指し得る。例えば、免疫応答を誘導することは、所望の免疫応答を開始、促進、刺激、確立、またはその他産生することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現を誘導することには、核酸の転写の開始、ｍＲＮＡの翻訳の開始などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現を誘導することは、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含み得るが、これらに限定されない。

【0062】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡまたはＤＮＡに見出される）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシンなどの反復単位（すなわち、ペプチド核酸）を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミダートおよびホルホルチオエートなどの合成サブユニットのポリマーを含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダート（Ｐ－ＮＨ_２）またはホスホロチオエート－ホスホロジエステル混合オリゴマーまたはホスホロアミダート－ホスホジエステル混合オリゴマーであり得る。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングするか、または適切なプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成するかのいずれかにより化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から取得することができる。

【0063】

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体を含むがこれらに限定されない。完全長タンパク質およびその断片の両方が定義によって包含される。この用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、所望の活性を維持する限り、天然の配列に対して欠失、付加、および置換などの改変（一般に天然では保存されている）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘導を介してのように意図的であってもよいし、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーを介するなど偶発的であってもよい。

【0064】

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を調節および／または生成する物質を指す。概して、アジュバントは抗原と併せて投与されて、抗原単独と比較して抗原に対する免疫応答の増強をもたらす。様々なアジュバントが本明細書に記載される。

【0065】

本明細書における「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」および「ＣｐＧ ＯＤＮ」という用語は、リン酸によって分離されたシトシンおよびグアニンのジヌクレオチド（本明細書では「ＣｐＧ」ジヌクレオチド、または「ＣｐＧ」とも称される）を含有する、１０～３０ヌクレオチド長のＤＮＡ分子を指す。本開示のＣｐＧ ＯＤＮは、少なくとも一つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されない（すなわち、５－メチルシトシンではない）。ＣｐＧ ＯＤＮは、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有し得る。

【0066】

本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な」または「薬理学的に適合する」とは、生物学的にまたはその他望ましくないものではない物質を意味し、例えば、その物質は、望ましくない重大な生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれを含有する組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。医薬的に許容可能な担体または賦形剤は、毒性および製造試験の必要な基準を満たしており、および／または米国食品医薬品局によって準備された不活性成分ガイドに含まれることが好ましい。

【0067】

本明細書で使用される場合、「マイクロ流体システム」は、少量（例えば、ｍＬ、ｎＬ、ｐＬ、ｆＬ）の流体が処理されて、少量の液体の別個の処理を達成するシステムを指す。本明細書に記載される特定の実施には、多重化、自動化、およびハイスループットスクリーニングが含まれる。流体（例えば、緩衝液、溶液、ペイロード含有溶液、または細胞懸濁液）は、移動、混合、分離、または別の方法で処理することができる。本明細書に記載される特定の実施形態では、マイクロ流体システムを使用して、緩衝液中に懸濁された細胞に機械的狭窄を適用し、細胞内に摂動を誘発し（例えば、穴）、それによってペイロードまたは化合物が細胞のサイトゾルに入ることを可能にする。

【0068】

本明細書で使用される場合、「狭窄部」は、入口部分、中心点、および出口部分によって画定されるマイクロ流体チャネルの一部分を指し得、中心点は、幅、長さ、および深さによって画定される。他の実施例では、狭窄部は、細孔を指してもよく、または細孔の一部分であってもよい。細孔は、ある面（例えば、フィルタおよび／または膜）上に含有され得る。

【0069】

本明細書に記載される構造的および機能的特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は当技術分野で公知である。

【0070】

抗原を含むＡＡＣの製剤化
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを含む医薬製剤が提供され、製剤は、ａ）ＡＡＣであって、少なくとも一つの抗原およびアジュバント含むＡＡＣ、およびｂ）凍結保存培地を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７個のＡＡＣ～約１×１０^１２個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１１個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。フローサイトメトリー法によって測定される解凍後の１．０×１０^９ＡＡＣ／ｍＬの期待濃度は、より低い感度によるコールターベースの計数法の負バイアスに基づいて、コールターベースの細胞計数法によって測定される解凍後の７．０×１０^８ＡＡＣ／ｍＬとほぼ同等である。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７個のＡＡＣ～約１×１０^１２個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１１個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、製剤の量は、約２ｍＬ～約５０ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤の量は、約５ｍＬ～約２０ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤の量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＬまたはそれ以上のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤の量は、約１～約２、約２～約３、約３～約４、約４～約５、約５～約６、約６～約７、約７～約８、約８～約９、または約９～約１０、約１０～約１１、約１１～約１２、約１２～約１３、約１３～約１４、約１４～約１５、約１５～約１６、約１６～約１７、約１７～約１８、約１８～約１９または約１９～約２０ｍＬのいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤の量は、約９．５ｍＬである。

【0073】

いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、製剤は、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍＬのいずれか一つ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、マイコプラズマを含まない。

【0075】

凍結保存培地中のＡＡＣの製剤化
本明細書に記載の方法のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、ＡＡＣの組成物は、薬剤であって、当該薬剤を含まない対応するＡＡＣの組成物と比較して、ＡＡＣの機能を増強する薬剤、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの組成物は、薬剤であって、当該薬剤を含まない対応するＡＡＣの組成物と比較して、凍結－解凍のサイクルにおいてＡＡＣの機能を増強する薬剤、をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、凍結保存剤および／または低温保存剤である。いくつかの実施形態では、凍結保存剤も低温保存剤も、薬剤を含むＡＡＣの組成物中で、あらゆる凍結－解凍サイクルの前のその薬剤を含まないＡＡＣの対応する組成物と比較して、１０％または２０％を超える細胞死を防ぐものではない。いくつかの実施形態では、凍結保存剤および／または低温保存剤を含むＡＡＣ組成物の凍結－解凍サイクルは、凍結－解凍サイクル前の対応するＡＡＣ組成物と比較して、機能の損失が１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下で生じる。いくつかの実施形態では、凍結保存剤および／または低温保存剤を含むＡＡＣ組成物の凍結－解凍サイクルは、凍結保存剤および／または低温保存剤を含まない対応するＡＡＣの組成物の凍結－解凍サイクルと比較して、機能の損失が１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％より少なく生じる。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原を含むＡＡＣ組成物の機能または機能性は、アネキシンＶ染色が陽性であるＡＡＣの割合によって測定される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣ組成物の機能または機能性は、アネキシンＶ染色が陽性であるＡＡＣの割合によって測定される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣ組成物の機能または機能性は、ＣＤ２３５ａ染色が陽性であるＡＡＣの割合によって測定される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣ組成物の機能または機能性は、ＣＤ２３５ａおよびアネキシンＶ染色が陽性である無核細胞由来の小胞の割合によって測定される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの少なくとも約７０％、約８０％、または約９０％は、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクル後に機能的である。いくつかの実施形態では、薬剤は、エンドサイトーシスを増強する化合物、安定化剤、または補因子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシ、またはヒトのアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、マウス、ウシ、またはヒトのアルブミンの一つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミン、またはＥＤＴＡの一つ以上である。いくつかの実施形態では、二価の金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、またはＣａ２＋の一つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＨＥＰＥＳ、グリセリン、グルタチオン、イノシン、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、ナトリウム金属イオン、カリウム金属イオン、マグネシウム金属イオン、塩化物、酢酸塩、グルコン酸塩（ｇｌｕｏｃｏｎａｔｅ）、スクロース、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムの一つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、Ｒｅｊｕｖｅｓｏｌ（登録商標）、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）、ＤＭＳＯ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１５、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）の一つ以上である。

【0076】

本明細書に記載される方法のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、プロセスは、更なるインキュベーション工程なしで調製された対応する無核細胞と比較して、無核細胞の機能を増強する薬剤と無核細胞の組成物をインキュベートする工程を更に含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、製剤は、凍結保存培地を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９～約１×１０^１１個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８個のＡＡＣ、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９個のＡＡＣ、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９．５ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬの凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後の凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターによって測定される約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後の凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む組成物は、約７×１０^９個のＡＡＣを、約９ｍＬ～約１０ｍＬのＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２中に含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む組成物は、約７×１０^９個のＡＡＣを、約９．５ｍＬのＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬのＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２中に含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、－１４０℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下での温度で少なくとも１２か月間保存した後、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下の温度で、少なくとも６、９、１２、１５、１８、２４、３０、または３６か月間保存した後、約７０％以上の機能性を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１００℃、－１１０℃、－１２０℃、－１３０℃、－１４０℃、－１５０℃、－１６０℃、－１７０℃、－１８０℃、－１９０℃、または－２００℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上の機能性を維持する。

【0080】

いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％以上のアネキシン陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上のアネキシン陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、－１４０℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上のアネキシン陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下での温度で少なくとも１２か月間保存した後、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上のアネキシン陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下の温度で、少なくとも６、９、１２、１５、１８、２４、３０、または３６か月間保存した後、約７０％以上のアネキシン陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１００℃、－１１０℃、－１２０℃、－１３０℃、－１４０℃、－１５０℃、－１６０℃、－１７０℃、－１８０℃、－１９０℃、または－２００℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上のアネキシン陽性染色を維持する。

【0081】

いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結－解凍サイクルで、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣは、－１４０℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下での温度で少なくとも１２か月間保存した後、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１４０℃以下の温度で、少なくとも６、９、１２、１５、１８、２４、３０、または３６か月間保存した後、約７０％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、－１００℃、－１１０℃、－１２０℃、－１３０℃、－１４０℃、－１５０℃、－１６０℃、－１７０℃、－１８０℃、－１９０℃、または－２００℃以下の温度で少なくとも１２か月間保存した後、約７０％以上のアネキシンＶおよびＣＤ２３５ａ陽性染色を維持する。

【0082】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個の機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９～約１×１０^１０個の機能的ＡＡＣを含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^８個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^８～約１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、解凍後に約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８個のＡＡＣ、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９個のＡＡＣ、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０個のＡＡＣ、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個の機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^９個の機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９～約１×１０^１０個の機能的ＡＡＣを含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^８個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^８～約１×１０^９個／ｍＬの機能的ＡＡＣを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約２５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、および２５％のＤＭＳＯのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％のＤＭＳＯのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約２％のＤＭＳＯを含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５．０～約９．５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約６．０～約８．５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約７．６である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または１０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５～約６、約６～約７、約７～約８、約８～約９、または約９～約１０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約７～約７．１、約７．１～約７．２、約７．２～約７．３、約７．３～約７．４、約７．４～約７．５、約７．５～約７．６、約７．６～約７．７、約７．７～約７．８、約７．８～約７．９、または約７．９～約８．０のいずれか一つである。

【0088】

いくつかの態様では、ＡＡＣの医薬製剤が提供され、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの医薬製剤が提供され、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のＡＡＣの濃度は、コールターカウンターによって測定される。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、凍結前に約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結前に約６．６５×１０^９個のＡＡＣを含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、および５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約０．５×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、および１．０×１０^１１個のＰＢＭＣ／ｍＬのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、解凍後に約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約６．６５×１０^９個のＡＡＣを含む。

【0095】

本明細書に記載の製剤のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約２ｍＬ～約５０ｍＬの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約５ｍＬ～約２０ｍＬの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＬまたはそれ以上のいずれか一つの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１～約２ｍＬ、約２～約３ｍＬ、約３～約４ｍＬ、約４～約５ｍＬ、約５～約６ｍＬ、約６～約７ｍＬ、約７～約８ｍＬ、約８～約９ｍＬ、または約９～約１０ｍＬ、約１０～約１１ｍＬ、約１１～約１２ｍＬ、約１２～約１３ｍＬ、約１３～約１４ｍＬ、約１４～約１５ｍＬ、約１５～約１６ｍＬ、約１６～約１７ｍＬ、約１７～約１８ｍＬ、約１８～約１９ｍＬまたは約１９～約２０ｍＬのいずれか一つの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約９．５ｍＬの凍結保存培地中にある。

【0096】

いくつかの態様では、ＡＡＣの医薬製剤が提供され、製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。

【0097】

いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、製剤は、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍＬのいずれか一つ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、マイコプラズマを含まない。
医薬製剤を含むバイアル

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤のいずれか一を含むバイアルを提供する。

【0099】

いくつかの態様では、医薬製剤を含むバイアルが提供され、当該医薬製剤はＡＡＣを含み、製剤は約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを凍結保存培地中に含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは、約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣの医薬製剤が提供され、製剤は、凍結保存培地中に約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。

【0100】

本明細書に記載のバイアルのいずれかによるいくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約２ｍＬ～約５０ｍＬの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約５ｍＬ～約２０ｍＬの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＬまたはそれ以上のいずれか一つの凍結保存培地中にある。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１～約２ｍＬ、約２～約３ｍＬ、約３～約４ｍＬ、約４～約５ｍＬ、約５～約６ｍＬ、約６～約７ｍＬ、約７～約８ｍＬ、約８～約９ｍＬ、または約９～約１０ｍＬ、約１０～約１１ｍＬ、約１１～約１２ｍＬ、約１２～約１３ｍＬ、約１３～約１４ｍＬ、約１４～約１５ｍＬ、約１５～約１６ｍＬ、約１６～約１７ｍＬ、約１７～約１８ｍＬ、約１８～約１９ｍＬまたは約１９～約２０ｍＬのいずれか一つの凍結保存培地中にある。

【0101】

いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約２５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、および２５％のＤＭＳＯのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約０．５％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％のＤＭＳＯのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約２％のＤＭＳＯを含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５．０～約９．５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約６．０～約８．５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約７．６である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または１０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約５～約６、約６～約７、約７～約８、約８～約９、または約９～約１０のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨが、約７～約７．１、約７．１～約７．２、約７．２～約７．３、約７．３～約７．４、約７．４～約７．５、約７．５～約７．６、約７．６～約７．７、約７．７～約７．８、約７．８～約７．９、または約７．９～約８．０のいずれか一つである。

【0103】

いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１１個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８個のＡＡＣ、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後の凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターによって測定される約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後の凍結保存培地中に含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．５×１０^６、０．７×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、および１．０×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、および１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約６．６５×１０^８個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^６～約１×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^７～約１×１０^１０個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約０．５×１０^６、１．０×１０^６、０．５×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、および１．０×１０^１１個のＰＢＭＣ／ｍＬのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約０．５×１０^６～約１．０×１０^６、約１．０×１０^６～約０．５×１０^７、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣのいずれか一つを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、フローサイトメトリーにより測定される約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣを含む製剤は、解凍後に約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約７×１０^９個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、解凍後に約６．６５×１０^９個のＡＡＣを含む。

【0107】

いくつかの態様では、活性化ＡＡＣの医薬製剤が提供され、製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。

【0108】

いくつかの実施形態では、製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、製剤は、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍＬのいずれか一つ未満のエンドトキシンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、マイコプラズマを含まない。

【0109】

抗原およびアジュバントを含むＡＡＣの組成物
いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、細胞内に送達された抗原およびアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、細胞内に送達されたＨＰＶ抗原およびアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット赤血球に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット網赤血球に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット赤血球（ＲＢＣ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含む無核細胞由来の小胞である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＲＢＣ由来の小胞である。

【0110】

いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下によって調製される：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。

【0111】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下によって調製される：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）ＨＰＶ抗原およびアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、ＨＰＶ抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１～４および１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１～４および１８～２５のいずれか一つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、無核細胞は、ＲＢＣまたは血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、赤血球または網赤血球である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは無核細胞由来小胞である。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、ＲＢＣ由来小胞または血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、赤血球由来小胞または網赤血球由来小胞である。

【0113】

いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下によって調製される：ａ）インプット赤血球を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット赤血球の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット赤血球の摂動を引き起こして、摂動インプット赤血球を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動インプット赤血球に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット赤血球を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。

【0114】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下によって調製される：ａ）インプット赤血球を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット赤血球の直径の関数であり、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット赤血球の摂動を引き起こして、摂動インプット赤血球を形成する、通過させること、ｂ）ＨＰＶ抗原およびアジュバントが摂動インプット赤血球に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット赤血球を、ＨＰＶ抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１～４および１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１～４および１８～２５のいずれか一つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞（例えば、赤血球）の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１．２μｍ～約３μｍ、約１．４μｍ～約２．６μｍ、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置される。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、同じおよびまたは異なるＨＰＶ抗原に対する応答を惹起する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、一つ以上の抗原性ＨＰＶエピトープと一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、他の抗原またはアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。

【0117】

いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である。

【0118】

抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを含む医薬製剤を生成する方法
いくつかの実施形態では、医薬製剤内に含まれるＡＡＣは、無核細胞由来小胞である。いくつかの実施形態では、抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを含む組成物を生成する方法が提供され、少なくとも一つの抗原およびアジュバントは、ＡＡＣに細胞内送達される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを含む組成物を生成する方法が提供され、ＨＰＶ抗原およびアジュバントは、ＡＡＣに細胞内送達される。

【0119】

本明細書に記載のいずれか一つの製剤によるいくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下を含むプロセスによって調製される：ａ）インプット無核の集団を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞の集団を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。

【0120】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、以下を含むプロセスによって調製される：ａ）インプット無核の集団を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞の集団を、ＨＰＶ抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ６に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ６由来のペプチドと、ＨＰＶ Ｅ７由来のペプチドとを含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球（ＲＢＣ）または血小板である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞が、赤血球または網赤血球である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは無核細胞由来小胞である。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、ＲＢＣ由来小胞または血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、赤血球由来小胞または網赤血球由来小胞である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、組成物を受ける個体に対して自己である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、組成物を受ける個体に対して同種異系である。

【0123】

いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１．２μｍ～約３μｍ、約１．４μｍ～約２．６μｍ、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置される。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、同じおよびまたは異なるＨＰＶ抗原に対する応答を惹起する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、一つ以上の抗原性ＨＰＶエピトープと一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、他の抗原またはアジュバントと共に送達される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、抗原性ＨＰＶエピトープと一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、それ自体と、他の抗原と、またはアジュバントと、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ６抗原またはＨＰＶ Ｅ７抗原である。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＨＰＶ Ｅ７に由来するＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。

【0125】

いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である。

【0126】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣの医薬製剤を製造する方法が提供され、当該ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該方法は以下を含む：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させること、およびｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートすることであって、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成する、インキュベートすること、ｃ）ＡＡＣを洗浄すること、およびｄ）ＡＡＣを凍結保存培地中で製剤化すること。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の回数のいずれか一つで、洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは約６回洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、ＰＢＳ中で洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは培地中で洗浄される。いくつかの実施形態では、培地は、インプット無核細胞用の培地と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、一つ以上の安定化剤を含む培地中で洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、一つ以上の凍結保存剤を含む培地中で洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、遠心分離および再懸濁によって洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、遠心分離および濾過によって洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の工程の遠心分離および再懸濁によって洗浄される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の工程の遠心分離および濾過によって洗浄される。いくつかの実施形態では、一つ以上の遠心分離工程は、約１００ｘｇ、１５０ｘｇ、２００ｘｇ、２５０ｘｇ、３００ｘｇ、３５０ｘｇ、４００ｘｇ、４５０ｘｇ、５００ｘｇ、５５０ｘｇ、６００ｘｇ、６５０ｘｇ、７００ｘｇ、７５０ｘｇ、および８００ｘｇのいずれか一つで実施される。いくつかの実施形態では、一つ以上の遠心分離工程は、約１０００ｒｐｍ、１５００ｒｐｍ、２０００ｒｐｍ、２５００ｒｐｍ、３０００ｒｐｍ、３５００ｒｐｍ、４０００ｒｐｍ、または４５００ｒｐｍのいずれか一つで実施される。

【0127】

本明細書に記載される方法のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^７個のＡＡＣ～約１×１０^１２個のＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１１個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７、０．７×１０^７、１．０×１０^７、０．５×１０^８、０．７×１０^８、１．０×１０^８、０．５×１０^９、０．７×１０^９、１．０×１０^９、０．５×１０^１０、０．７×１０^１０、１．０×１０^１０、０．５×１０^１１、０．７×１０^１１、１．０×１０^１１、０．５×１０^１２、０．７×１０^１２、および１．０×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．５×１０^７～約１．０×１０^７、約１．０×１０^７～約０．５×１０^８個のＡＡＣ、約０．５×１０^８～約１．０×１０^８、約１．０×１０^８～約０．５×１０^９個のＡＡＣ、約０．５×１０^９～約１．０×１０^９、約１．０×１０^９～約０．５×１０^１０、約０．５×１０^１０～約１．０×１０^１０、約１．０×１０^１０～約０．５×１０^１１、約０．５×１０^１１～約１．０×１０^１１個のＡＡＣ、約１．０×１０^１１～約０．５×１０^１２個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、および１×１０^１０個のＡＡＣのいずれか一つを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９ｍＬ～約１０ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．６５×１０^９個のＡＡＣを約９．５ｍＬ中に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、コールターカウンターにより測定される約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを解凍後に含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原とアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である。

【0128】

いくつかの実施形態では、方法は、約－８０℃～約－２５０℃でのＡＡＣの製剤の凍結保存（凍結など）をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、約－１７０℃でのＡＡＣの製剤の凍結保存（凍結など）をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＣの製剤を、－８０℃、－９０℃、－１００℃、－１１０℃、－１２０℃、－１３０℃、－１４０℃、－１５０℃、－１６０℃、－１７０℃、－１８０℃、－１９０℃、－２００℃、－２１０℃、－２２０℃、－２３０℃、－２４０℃、または－２５０℃で冷凍することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＣの製剤を、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃、約－１００℃～約－１１０℃、約－１１０℃～約－１２０℃、約－１２０℃～約－１３０℃、約－１３０℃～約－１４０℃、約－１４０℃～約－１５０℃、約－１５０℃～約－１６０℃、約－１６０℃～約－１７０℃、約－１７０℃～約－１８０℃、約－１８０℃～約－１９０℃、約－１９０℃～約－２００℃、約－２００℃～約－２１０℃、約－２１０℃～約－２２０℃、約－２２０℃～約－２３０℃、約－２３０℃～約－２４０℃、または約－２３０℃～約－２４０℃のいずれか一つで凍結することを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、製剤は、以下を含むプロセスによって凍結保存される：ａ）製剤をチャンバー内に置くこと、ｂ）チャンバーの温度を約０℃～約－２０℃に低下させる第一の工程、ｃ）チャンバーの温度を、約－１０℃／分～約－３０℃／分の速度で約－１３０℃～約－１５０℃に低下させる第二の工程、ｄ）チャンバーの温度を、約－０．５℃／分～約－５℃／分の速度で約－１４０℃～約－１６０℃に低下させる第三の工程、ｅ）チャンバーの温度を、約－０．１℃／分～約－５℃／分の速度で約－１５０℃～約－２００℃に低下させる第四の工程、およびｆ）チャンバーの温度を、約－１５０℃～約－２００℃に少なくとも約５～約３０分間保持すること。いくつかの実施形態では、チャンバーは、限定されるものではないが、例えば、ＭＲ．ＦＲＯＳＴＹ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））などの安定した温度低下速度を促進する凍結保存チャンバーなどの凍結保存チャンバーである。いくつかの実施形態では、異なる凍結保存チャンバーが、上述の工程の一つ以上に使用される。いくつかの実施形態では、製剤はその後、チャンバーから除去され、永久貯蔵物（例えば、液体窒素タンク、および例えば、液体相、液体蒸気転移相または液体窒素の気相などであるがこれらに限定されない）に移動される。

【0130】

いくつかの実施形態では、チャンバーのチャンバーの温度を低下させる第一の工程は、温度を、約０℃、－１℃、－２℃、－３℃、または－４℃、またはそれらの間の任意の温度または範囲のいずれか一つに低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第二の工程は、チャンバーの温度を、約－１３０℃、－１３１℃、－１３２℃、－１３３℃、－１３４℃、－１３５℃、－１３６℃、－１３７℃、－１３８℃、－１３９℃、－１４０℃、－１４１℃、－１４２℃、－１４３℃、－１４４℃、－１４５℃、－１４６℃、－１４７℃、－１４８℃、－１４９℃、－１５０℃、またはそれらの間の任意の温度または範囲のいずれか一つに低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第二の工程は、温度を、約－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２０℃／分、またはそれらの間の任意の速度または範囲のいずれか一つで低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第三の工程は、チャンバーの温度を、約－１４０℃、－１４１℃、－１４２℃、－１４３℃、－１４４℃、－１４５℃、－１４６℃、－１４７℃、－１４８℃、－１４９℃、－１５０℃、－１５１℃、－１５２℃、－１５３℃、－１５４℃、－１５５℃、－１５６℃、－１５７℃、－１５８℃、－１５９℃、－１６０℃、またはそれらの間の任意の温度または範囲のいずれか一つに低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第三の工程は、温度を、約－０．５、－１、－１．５、－２、－２．５、－３、－３．５、－４、－４．５、－５℃／分、またはそれらの間の任意の速度または範囲のいずれか一つで低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第四の工程は、チャンバーの温度を、約－１５０℃、－１５２℃、－１５４℃、－１５６℃、－１５８℃、－１６０℃、－１６２℃、－１６４℃、－１６６℃、－１６８℃、－１７０℃、－１７２℃、－１７４℃、－１７６℃、－１７８℃、－１８０℃、－１８２℃、－１８４℃、－１８６℃、－１８８℃、－１９０℃、またはそれらの間の任意の温度または範囲のいずれか一つに低下させることを含む。いくつかの実施形態では、チャンバーの温度を低下させる第三の工程は、温度を、毎分約－０．１、－０．２、－０．３、－０．４、－０．５、－０．６、－０．７、－０．８、－０．９、－１、－１．１、－１．２、－１．３、－１．４、－１．５、－２、－２．５、－３、－３．５、－４、－４．５、－５℃のいずれか一つの速度で低下させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、チャンバーの温度を、約－１５０℃、－１５２℃、－１５４℃、－１５６℃、－１５８℃、－１６０℃、－１６２℃、－１６４℃、－１６６℃、－１６８℃、－１７０℃、－１７２℃、－１７４℃、－１７６℃、－１７８℃、－１８０℃、－１８２℃、－１８４℃、－１８６℃、－１８８℃、－１９０℃、またはそれらの間の任意の温度または範囲に、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０分またはそれらの間の任意の時間間隔または範囲の間、維持することを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、製剤は、以下を含むプロセスにより凍結保存（例えば、冷凍）される：ａ）製剤をチャンバー内に置くこと、ｂ）チャンバーの温度を約－３℃に低下させること、ｃ）チャンバーの温度を約－２０℃／分の速度で約－１４０℃に低下させること、ｄ）チャンバーの温度を、約－１．５℃／分の速度で約－１５０℃に低下させること、ｅ）チャンバーの温度を、約－１．０℃／分の速度で約－１７０℃に低下させること、およびｆ）チャンバーの温度を－１７０℃に少なくとも約１０分間保持すること。

【0132】

抗原
本明細書に記載の方法、製剤またはバイアルによるいくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、外因性抗原である。本明細書に記載の方法によるいくつかの実施形態では、外因性抗原は、ＨＰＶ抗原である。パピローマウイルスは、直径約５５ｎｍのビリオンサイズを有する小さな非エンベロープＤＮＡウイルスである。１００を超えるＨＰＶ遺伝子型が完全に特徴付けられ、より高い数が存在するものと推定されている。ＨＰＶは、子宮頸がん、ならびにいくつかの外陰部がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、肛門がん、および直腸がんの公知の原因である。ほとんどのＨＰＶ感染は無症状であり自然に消失するが、発癌性ＨＰＶ型の一つによる持続性感染は、前がんまたはがんに進行し得る。他のＨＰＶ関連疾患としては、尋常性いぼ、足底いぼ、扁平いぼ、肛門性器いぼ、肛門病変、表皮異形成、局所性上皮肥厚、口腔パピローマ、いぼ状嚢胞、喉頭パピローマ、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および膣上皮内腫瘍（ＶＡＩＮ）が挙げられ得る。公知のＨＰＶ型の多くは、サブセットが発がん性である良性病変を引き起こす。疫学的および系統学的な関係に基づくと、ＨＰＶの型は、十五の「高リスク型」（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および８２）と、三つの「潜在的な高リスク型」（ＨＰＶ２６、５３、および６６）とに分類され、これらはともに、低悪性度および高悪性度の子宮頸部の変化およびがんとして、ならびに他の肛門性器がん、例えば外陰部がん、膣がん、陰茎がん、肛門がんおよび肛門周囲がんなど、ならびに頭頸部がんとして現れることが知られている。最近では、高リスク型のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８と乳がんとの関連も記述された。「低リスク型」に分類される十一種類のＨＰＶ型（ＨＰＶ６、１１、４０、４２、４３、４４、５４、６１、７０、７２、および８１型）が、良性かつ低悪性度の子宮頸部変化、生殖器いぼ、および再発性呼吸器パピローマとして現れることが知られている。皮膚型ＨＰＶの５型、８型、および９２型は、皮膚がんに関連している。いくつかのＨＰＶ関連がんでは、免疫系が低下し、それに応じて抗腫瘍応答が著しく損なわれる。Ｓｕｒｅｓｈ ａｎｄ Ｂｕｒｔｎｅｓｓ，Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １３（６）：２０－２７（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、外因性抗原は、同じおよびまたは異なる抗原に対する応答を惹起する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、複数の抗原のプール中の抗原は、複数の抗原のプール中の他の抗原に対して向けられる免疫応答を減少させない。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、抗原性ＨＰＶエピトープと一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、それ自体と、他の抗原と、またはアジュバントと、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ６抗原またはＨＰＶ Ｅ７抗原である。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＨＰＶ Ｅ７に由来するＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドは、配列番号１～４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドは、配列番号１８～２５のいずれか一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原が、配列番号１８～２５のいずれか一と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２０のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２２のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２３のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２４のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号２５のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列の少なくとも一つを含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、外因性抗原は、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、または８を含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、外因性抗原は、配列番号１９と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列、および配列番号２３と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、外因性抗原は、配列番号１９のアミノ酸配列、および配列番号２３のアミノ酸配列を含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、複数の抗原は、非共有結合で結合したペプチドのプール内に含まれる。いくつかの実施形態では、複数の抗原は、非共有結合で結合したペプチドのプール内に含まれるものであり、各ペプチドは、一以下の抗原を含む。いくつかの実施形態では、複数の抗原は、非共有結合で結合したペプチドのプール内に含まれるものであり、配列番号１９のアミノ酸配列と配列番号２３のアミノ酸配列とが、別個のペプチド内に含有される。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、同じおよびまたは異なるＨＰＶ抗原に対する応答を惹起する複数のポリペプチドのプール中にある。いくつかの実施形態では、複数の抗原のプール中の抗原は、複数の抗原のプール中の他の抗原に対して向けられる免疫応答を減少させない。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、抗原性ＨＰＶ抗原と一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、それ自体と、他の抗原と、またはアジュバントと、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ１１－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ７－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｃ８－特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、完全長ＨＰＶタンパク質のＮ末端ドメインの一部または全てを含む。

【0134】

本明細書に記載の方法のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、ＡＡＣは、複数の免疫原性エピトープを含む複数のＨＰＶ抗原を含む。さらなる実施形態では、複数の免疫原性エピトープを含む複数の抗原を含むＡＡＣを個体に投与した後、当該複数の免疫原性エピトープのいずれもが、他の免疫原性エピトープのいずれかに対する個体における免疫応答を減少させない。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ポリペプチドであり、また免疫原性エピトープは、免疫原性ペプチドエピトープである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端の隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端の隣接ポリペプチドと縮合する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、免疫原性ペプチドエピトープと一つ以上の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ペプチド配列に隣接する免疫原性ペプチドエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、隣接異種ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。いくつかの実施形態では、隣接異種ペプチド配列は、免疫原性の合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。

【0135】

アジュバント
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を直接的にまたは間接的にのうちのどちらかで調節するおよび／または生じる物質を指すことができる。本発明のいくつかの実施形態では、アジュバントは、ＲＢＣもしくはＲＢＣ由来小胞の集団などの無核細胞または無核由来小胞の集団に細胞内で送達され（すなわち、狭窄処理の前、間、および／または後であるが個体への投与前に、細胞または小胞をアジュバントとインキュベーション）、アジュバントを含むＡＡＣを形成する。いくつかの例では、アジュバントは、ＨＰＶ抗原単独と比較して、ＨＰＶ抗原に対する免疫応答を増強するＨＰＶ抗原と併せて投与される。したがって、アジュバントを使用して、変異型Ｒａｓ抗原に対する免疫細胞応答（例えば、Ｔ細胞応答）の誘発を押し上げることができる。例示的なアジュバントとしては、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）アゴニスト、ならびにＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアジュバントには、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮ、またはクラスＣ ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １０１８、ＣｐＧ ＯＤＮ １５８５、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３３６、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６、ＣＰＧ ＯＤＮ ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００７、ＣｐＧ ＯＤＮ ＢＷ００６、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０１、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３９５、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｍ３６２、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０３の群からの選択を含む。いくつかの実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号３０））、またはＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（ＣｐＧ ７９０９としても知られる）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号３１））オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）を含む。複数のアジュバントを、ＨＰＶ抗原との併用で使用して、免疫応答の惹起を増強することもできる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣは、複数のアジュバントをさらに含む。複数のアジュバントを、ＨＰＶ抗原との併用で使用して、免疫応答の惹起を増強することもできる。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣは、複数のアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣは、アジュバントＣｐＧ ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストの任意の組み合わせをさらに含む。

【0136】

抗原およびアジュバントを含むＡＡＣの組成物の生成に使用される狭窄部
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを含む製剤を提供する。いくつかの実施形態では、無核細胞は、ＲＢＣまたは血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、赤血球または網赤血球である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、ＡＡＣの組成物を受ける個体に対して自己である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、ＡＡＣの組成物を受ける個体に対して自己である。いくつかの実施形態では、少なくとも一つのＨＰＶ抗原は、細胞内で無核細胞に送達される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、細胞内で無核細胞に送達される。ペイロードを無核細胞に導入する方法は、当該技術分野で公知である。

【0137】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、細胞の膜に一過性の細孔が導入され、それによりＨＰＶ抗原が細胞に入ることができるように、細胞を狭窄部に通過させることによって無核細胞に導入される。細胞への化合物の狭窄ベースの送達の例は、国際公開第２０１３／０５９３４３号、国際公開第２０１５／０２３９８２号、国際公開第２０１６／０７０１３６号、国際公開第２０１７０４１０５０号、国際公開第２０１７００８０６３号、国際公開第２０１７／１９２７８５号、国際公開第２０１７／１９２７８６号、国際公開第２０１９／１７８００５号、国際公開第２０１９／１７８００６号、国際公開第２０２０／０７２８３３号、国際公開第２０２０／１５４６９６号，および国際公開第２０２０／１７６７８９号、米国特許出願公開第２０１８０１４２１９８号、および米国特許出願公開第２０１８０２０１８８９号により示されている。

【0138】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原およびアジュバントは、無核細胞（例えば、ＲＢＣ）を含む細胞懸濁液を狭窄部に通過させることによって、無核細胞に送達され、本発明のＡＡＣを生成し、狭窄部は細胞を変形させ、それにより、ＨＰＶ抗原およびアジュバントが細胞に入るように細胞の摂動を引き起こす。いくつかの実施形態では、狭窄部は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。いくつかの実施形態では、複数の狭窄部を、マイクロ流体チャネル内で並列および／または直列に配置することができる。

【0139】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部は、入口部分、中心点、および出口部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部の長さ、深さ、および幅は、変化し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部の幅は、無核細胞の直径の関数である。無核細胞の直径を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ハイコンテントイメージング、細胞カウンター、またはフローサイトメトリーである。

【0140】

ＨＰＶ抗原の無核細胞由来小胞への狭窄に基づく送達のいくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約１０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１μｍ～約４μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１μｍ～約３μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．５μｍ～約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．２μｍ～約２．８μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２μｍ～約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．５μｍ～約２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約３．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．２μｍ～約３．８μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．８μｍ～約４．３μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３μｍである。

【0141】

ＡＡＣへの化合物の送達に影響を与え得るパラメータの例には、これらに限定されないが、狭窄部の寸法、狭窄部の入射角、狭窄部の表面特性（例えば、粗さ、化学修飾、親水性、疎水性など）、動作時の流速（例えば、狭窄部を通過する細胞の通過時間）、細胞濃度、細胞懸濁液中の化合物の濃度、細胞懸濁液中の緩衝液、および狭窄部を通過した後にＡＡＣが回復またはインキュベートする時間の量が含まれ、これらは送達された化合物の無核細胞由来小胞内への通過に影響を与え得る。ＡＡＣへの化合物の送達に影響を与える追加のパラメータとしては、狭窄部内のインプット無核細胞の速度、狭窄部内のせん断速度、細胞懸濁液の粘度、流速に垂直な速度成分、および狭窄部内での時間を挙げることができる。加えて、直列および／または並列のチャネルを含む複数のチップは、無核細胞由来小胞への送達に影響を与え得る。複数のチップを並列にすることは、スループットを増強するために有用であり得る。このようなパラメータは、上記化合物の送達を制御するように設計することができる。いくつかの実施形態では、上記細胞濃度は、約１０～少なくとも約１０^１２細胞個／ｍＬの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲である。いくつかの実施形態では、送達化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１ｇ／ｍＬの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲であり得る。いくつかの実施形態では、送達化合物濃度は、約１ｐＭから少なくとも約２Ｍの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲であり得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約１０ｍＭである。例えば、いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約１ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、Ｐ無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約１０ｍＭを超える。いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、または約１ｍＭ～約１０ｍＭのいずれかである。いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１０μＭである。いくつかの実施形態では、無核細胞またはＡＡＣとインキュベートされるＨＰＶ抗原の濃度は、約１μＭである。

【0143】

いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約１０ｍＭである。例えば、いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭ、または約１０ｍＭ未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約１０ｍＭを超える。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、または約１ｍＭ～約１０ｍＭのいずれかである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１０μＭである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原の濃度は、１μＭである。

【0144】

いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１～約１：１００００のいずれかである。例えばいくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１、約１０００：１、約１００：１、約１０：１、約１：１、約１：１０、約１：１００、約１：１０００、または約１：１００００のいずれかである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１～約１０００：１、約１０００：１～約１００：１、約１００：１～約１０：１、約１０：１～約１：１、約１：１～約１：１０、約１：１０～約１：１００、約１：１００～約１：１０００、約１：１０００～約１：１００００のいずれかである。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原のアジュバントに対するモル比は、約２００：１である。いくつかの実施形態では、摂動インプット無核細胞とインキュベートされる抗原のアジュバントに対するモル比は、約２０：１である。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１ｎＭ～約１ｍＭの濃度のアジュバントを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約１ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満のいずれかの濃度のアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１０ｍＭを超える濃度のアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、または約１ｍＭ～約１０ｍＭのいずれかの濃度のアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約０．１μＭ～約１ｍＭの濃度のアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１μＭの濃度のアジュバントを含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１ｎＭ～約１ｍＭの濃度の少なくとも一つ抗原を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約１ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満のいずれかの濃度の少なくとも一つ抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１０ｍＭのいずれかよりも高い濃度の少なくとも一つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、または約１ｍＭ～約１０ｍＭのいずれかの濃度の少なくとも一つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約０．１μＭ～約１ｍＭの濃度の少なくとも一つ抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、約１μＭの濃度の少なくとも一つ抗原を含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣ中の抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１～約１：１００００のいずれかである。例えばいくつかの実施形態では、ＡＡＣ中の抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１、約１０００：１、約１００：１、約１０：１、約１：１、約１：１０、約１：１００、約１：１０００、または約１：１００００のいずれかである。いくつかの実施形態では、改変ＰＢＭＣ中の抗原のアジュバントに対するモル比は、約１００００：１～約１０００：１、約１０００：１～約１００：１、約１００：１～約１０：１、約１０：１～約１：１、約１：１～約１：１０、約１：１０～約１：１００、約１：１００～約１：１０００、約１：１０００～約１：１００００のいずれかである。いくつかの実施形態では、ＡＡＣ中の抗原のアジュバントに対するモル比は、約２００：１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＣ中の抗原のアジュバントに対するモル比は、約２０：１である。

【0148】

ＡＡＣの特徴および抗原提示細胞による内在化
本明細書に記載される方法、バイアル、または製剤のいずれか一つによる実施形態では、ＡＡＣは、以下を含むプロセスにて生成される：ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させること、ｂ）少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間、摂動インプット無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントとインキュベートし、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成すること。いくつかの実施形態では、ペイロード（ＨＰＶ抗原およびアジュバントなど）を含むＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して異なる特徴を示す。いくつかの実施形態では、ペイロード（ＨＰＶ抗原およびアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、他の送達方法（溶血性負荷またはエレクトロポレーションなど）によって導入されたペイロードを含む無核細胞と比較して異なる特徴を示す。

【0149】

いくつかの実施形態では、哺乳動物への投与後のＡＡＣの半減期は、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣのヘモグロビン含有量は、インプット無核細胞のヘモグロビン含有量と比較して減少する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣのＡＴＰ産生は、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは球状形態を示す。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、ＡＡＣは、インプット赤血球と比較して減少した両凹形状を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは赤血球ゴーストである。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製されたＡＡＣ胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１．５倍を超えるホスファチジルセリンを有する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製されたＡＡＣの集団プロファイルは、インプット無核細胞と比較して、表面上でより高い平均ホスファチジルセリンレベルを呈する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製された少なくとも５０％以上のＡＡＣの集団プロファイルは、インプット無核細胞と比較して、表面上でより高いホスファチジルセリンレベルを呈する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞において優先的な取り込みを示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、食細胞および／または抗原提示細胞において優先的な取り込みを示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における取り込みを増強するように修飾される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、修飾されていない無核細胞由来小胞と比較して、食細胞および／または抗原提示細胞における取り込みを増強するように修飾される。いくつかの実施形態では、食細胞および／または抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージの一つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組織または細胞は、肝臓または脾臓の一つ以上を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、その表面上にＣＤ４７を含む。

【0150】

ＡＡＣを生成するための上記の方法のいくつかの実施形態では、狭窄部は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄部を含む。いくつかの実施形態では、複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置される。いくつかの実施形態では、狭窄部は、複数のマイクロピラーの間、アレイに構成された複数のマイクロピラーの間、または一つ以上の移動可能なプレートの間である。いくつかの実施形態では、狭窄部は、細孔であるか、または細孔内に含まれる。いくつかの実施形態では、細孔は、表面内に含まれる。いくつかの実施形態では、表面は、フィルタである。いくつかの実施形態では、表面は、膜である。いくつかの実施形態では、狭窄部サイズは、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数である。いくつかの実施形態では、狭窄部サイズは、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％である。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、または約０．２５μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約２．２μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉの範囲の圧力下で狭窄部を通過する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、狭窄部を通過する前に、同時発生的に、または後に少なくとも一つの抗原と接触する。

【0151】

いくつかの実施形態では、ペイロード（例えば、少なくとも一つのＨＰＶ抗原およびアジュバント）を含むＡＡＣは、インプット無核細胞から調製され、当該ＡＡＣは、以下の特性の一つ以上を有する：（ａ）哺乳動物における循環半減期が、インプット無核細胞と比較して低減する、（ｂ）インプット無核細胞と比較して低減したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状形態、（ｄ）インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、または（ｅ）インプット無核細胞と比較して減少したＡＴＰ産生。

【0152】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球または血小板である。いくつかの実施形態では、赤血球は、赤血球または網赤血球である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、組成物を受ける個体に対して自己である。いくつかの実施形態では、無核細胞は、組成物を受ける個体に対して自己である。

【0153】

いくつかの実施形態では、哺乳動物におけるＡＡＣの循環半減期は、インプット無核細胞と比較して減少する。いくつかの実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプット無核細胞と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％を超えて減少する。

【0154】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞であり、ＡＡＣの循環半減期は、約１分、約２分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約１０日、約２５日、約５０日、約７５日、約１００日、約１２０日未満である。

【0155】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、ＡＡＣ中のヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して減少する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣにおけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、または約１００％減少する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣにおけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％である。

【0156】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、ＡＡＣは、形態的に球状である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して減少した両凹形状を有する。

【0157】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球またはエリスロサイトであり、ＡＡＣは、赤血球ゴースト（ＲＢＣゴースト）である。

【0158】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、その表面にＣＤ４７を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、増加した表面ホスファチジルセリンレベルを有する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製されたＡＡＣ胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１．５倍を超えるホスファチジルセリンを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％、または約１００％以上のホスファチジルセリンを有する。

【0160】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、減少したＡＴＰ産生を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％未満でＡＴＰを産生する。いくつかの実施形態では、ＡＡＣはＡＴＰを産生しない。

【0161】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞において増強された取り込みを示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞の取り込みと比較して、肝臓もしくは脾臓における、または食細胞もしくは抗原提示細胞による優先的な取り込みを示す。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞と比較して、組織または細胞における取り込みを増強するように更に修飾される。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、インプット無核細胞の取り込みと比較して、肝臓もしくは脾臓における、または食細胞もしくは抗原提示細胞による取り込みを増強するように更に修飾される。

【0163】

いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、肝臓もしくは脾臓における、または食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増強された取り込みを示し、ＡＡＣの内在化は、食細胞または抗原提示細胞の成熟マーカーの増加した発現をもたらす。いくつかの実施形態では、食細胞および／または抗原提示細胞は、単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）である。いくつかの実施形態では、成熟マーカーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上の発現は、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触していない食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上の発現は、インプット無核細胞と接触した食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。

【0164】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原、またはＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、肝臓もしくは脾臓における、または食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増加された取り込みを示し、当該ＡＡＣの内在化は、無核細胞由来小胞内に含まれるＨＰＶ抗原の増加した提示をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原の提示は、他の送達方法（溶血性負荷などであるが、これに限定されない）によって導入された同じＨＰＶ抗原を含む対応する無核細胞と接触した食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。

【0165】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原、またはＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣは、肝臓もしくは脾臓における、または食細胞および／もしくは抗原提示細胞による増加された取り込みを示し、当該ＡＡＣの内在化は、当該食細胞および／または抗原提示細胞が抗原特異的免疫応答を誘導する増加した能力をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原、またはＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞によって媒介される抗原特異的免疫応答は、インプット無核細胞と接触した食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原、またはＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞によって媒介される抗原特異的免疫応答は、他の送達方法（溶血性負荷などであるが、これに限定されない）によって導入された同じＨＰＶ抗原を含む無核細胞と接触した食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。

【0166】

いくつかの実施形態では、個体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、および／またはＨＬＡ－Ｃ＊１６に陽性である。

【0167】

本明細書に記載される方法、組成物、または使用のいずれか一つによるいくつかの実施形態では、食細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、および／またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のハプロタイプを有するヒト細胞である。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、またはＨＬＡ－Ｃ＊０８のハプロタイプを有するヒト細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞および／または抗原提示細胞によって提示されるＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞および／または抗原提示細胞によって提示されるＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ１１特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞および／または抗原提示細胞によって提示されるＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ７特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞および／または抗原提示細胞によって提示されるＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｃ８特異的エピトープから構成される。

【0168】

いくつかの実施形態では、方法は、ＨＰＶ抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを個体に投与することを含み、ＡＡＣは、食細胞および／または抗原提示細胞によって取り込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＣは、食細胞および／もしくは抗原提示細胞によって取り込まれ、当該ＡＡＣの内在化は、食細胞または抗原提示細胞の成熟マーカーの発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、食細胞および／または抗原提示細胞は、単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）である。いくつかの実施形態では、成熟マーカーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上の発現は、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触していない食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＭＨＣ－ＩＩの一つ以上の発現は、インプット無核細胞と接触した食細胞および／または抗原提示細胞と比較して、ＨＰＶ抗原を含むＡＡＣと接触した食細胞および／または抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上のいずれか一つで増加する。

【0169】

いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、無核細胞由来小胞の調製中に、（ａ）熱処理、（ｂ）化学処理されず、および／または（ｃ）低張条件もしくは高張条件に供されなかった。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、インプット無核細胞からのＡＡＣの調製中に維持された。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍに維持された。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍに維持された。

【0170】

システムおよびキット
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示される方法で使用するための、狭窄部、無核細胞懸濁液、抗原、またはアジュバントの一つ以上を含むシステムを提供する。このシステムは、上記において開示した方法で説明したあらゆる実施形態を含むことができ、これには、細胞変形狭窄部を提供するマイクロ流体チャネルもしくは細孔を有する面、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、化合物、および／またはアプリケーションなどが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞変形狭窄部は、無核細胞への送達のためにサイズ設定される。いくつかの実施形態では、動作時の流速、細胞および化合物の濃度、狭窄部内の細胞の速度、ならびに細胞懸濁液の組成（例えば、モル浸透圧濃度、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）などの送達パラメータは、免疫応答を抑制するかまたは寛容を誘導するための化合物の応答が最大になるように最適化される。

【0171】

また、ＨＰＶに関連するがんを有する個体の治療において使用するための製作のキットまたは物品も提供する。いくつかの実施形態では、キットは、細胞内に抗原および細胞内にアジュバントを含むＡＡＣを含む。いくつかの実施形態では、キットは、がんなどのＨＰＶに関連する疾患を有する個体の治療において使用するためのＡＡＣの生成において使用するための、狭窄部、無核細胞懸濁液、ＨＰＶ抗原、またはアジュバントの一つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、適したパッケージ内に、本明細書に記載の組成物（例えば、細孔を含むマイクロ流体チャネルもしくは面、細胞懸濁液、および／または化合物）を含む。適したパッケージ材料は当技術分野で公知であり、そのようなものとしては例えば、バイアル（密閉バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージ（例えば、密閉のマイラーバッグまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製造品はさらに、滅菌および／または密封されてもよい。

【0172】

本発明はまた、本明細書に記載される方法の構成要素を含むキットを提供し、ＨＰＶに関連するがんを有する個体を治療する方法を実施するための指示、ならびに／またはＨＰＶ抗原およびアジュバントを無核細胞に導入するための指示を更に含み得る。本明細書に記載のキットは、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するための指示、例えばＨＰＶに関連するがんを有する個体を治療するための指示、または細胞内にＨＰＶ抗原および細胞内にアジュバントを含有させるようにＡＡＣを生成するための指示を伴う、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および添付文書をはじめとする他の材料をさらに含み得る。

【0173】

例示的な実施形態
実施形態１．
活性化抗原担体（ＡＡＣ）を含む医薬製剤であって、製剤が、
ａ）ＡＡＣであって、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む、ＡＡＣと、
ｂ）凍結保存培地と、を含む、医薬製剤。

【0174】

実施形態２．
製剤が、約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含む、実施形態１に記載の医薬製剤。

【0175】

実施形態３．
製剤が、約７×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態１または２に記載の医薬製剤。

【0176】

実施形態４．
製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0177】

実施形態５．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤が、解凍後に約９×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0178】

実施形態６．
製剤が、約０．
５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0179】

実施形態７．
製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0180】

実施形態８．
製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0181】

実施形態９．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤が、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0182】

実施形態１０．
ＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣが機能的である、実施形態１～９のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0183】

実施形態１１．
製剤中のＡＡＣが、約７０％以上の機能性を維持する、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0184】

実施形態１２．
製剤が、約１×１０^８個／ｍＬ～約１×１０^９個／ｍＬの機能性ＡＡＣを含む、実施形態１または２のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0185】

実施形態１３．
ＡＡＣの集団の少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のＡＡＣが、アネキシン染色が陽性である、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0186】

実施形態１４．
約７０％以上の機能性を維持する製剤中のＡＡＣは、アネキシン染色が陽性である、実施形態１～１３のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0187】

実施形態１５．
アネキシンがアネキシンＶである、実施形態１３または１４に記載の医薬製剤。

【0188】

実施形態１６．
凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0189】

実施形態１７．
凍結保存培地が、約０．５％～約５％のＤＭＳＯを含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0190】

実施形態１８．
凍結保存培地が、約２％のＤＭＳＯを含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0191】

実施形態１９．
凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0192】

実施形態２０．
製剤のｐＨが、約６．０～約８．５である、請求項１～１９のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0193】

実施形態２１．
製剤のｐＨが、約７．６である、請求項１～２０のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0194】

実施形態２２．
ＡＡＣの医薬製剤であって、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である、医薬製剤。

【0195】

実施形態２３．
ＡＡＣの医薬製剤であって、製剤は、凍結保存培地中に約０．５×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、医薬製剤。

【0196】

実施形態２４．
製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態２２または２３に記載の医薬製剤。

【0197】

実施形態２５．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤が、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、実施形態２２～２５のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0198】

実施形態２６．
製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態２２～２５のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0199】

実施形態２７．
製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態２２～２６のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0200】

実施形態２８．
製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態２２～２７のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0201】

実施形態２９．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤が、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態２２～２８のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0202】

実施形態３０．
ＡＡＣの医薬製剤であって、製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、医薬製剤。

【0203】

実施形態３１．
凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、実施形態２２～３０のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0204】

実施形態３２．
製剤が、無菌である、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0205】

実施形態３３．
製剤が、約２ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンを含む、実施形態１～３２のいずれか一つに記載の医薬製剤。

【0206】

実施形態３４．
製剤は、マイコプラズマを含まない、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の製剤。

【0207】

実施形態３５．
少なくとも一つの抗原が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である、実施形態１～３４のいずれか一つに記載の製剤。

【0208】

実施形態３６．
ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態３５に記載の製剤。

【0209】

実施形態３７．
抗原が、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む、実施形態３５または３６に記載の製剤。

【0210】

実施形態３８．
抗原が、ＨＰＶ Ｅ６に由来するペプチドおよびＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む、実施形態３５～３７のいずれか一つに記載の製剤。

【0211】

実施形態３９．
抗原が、配列番号１～４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、実施形態３５～３８のいずれか一つに記載の製剤。

【0212】

実施形態４０．
抗原が、配列番号１８～２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、実施形態３５～３９のいずれか一つに記載の製剤。

【0213】

実施形態４１．
ＡＡＣが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗原および配列番号２３のアミノ酸配列を含む抗原を含む、実施形態３５～４０のいずれか一つに記載の製剤。

【0214】

実施形態４２．
アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリＩ：Ｃ、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１～４１のいずれか一つに記載の製剤。

【0215】

実施形態４３．
アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態４２に記載の製剤。

【0216】

実施形態４４．
少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントと、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間、インキュベートし、それによって、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成することと、を含む、プロセスにより調製される、実施形態１～４３のいずれか一つに記載の製剤。

【0217】

実施形態４５．
狭窄部の幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍまたは約１．８μｍ～約２．２μｍである、実施形態４４に記載の方法。

【0218】

実施形態４６．
インプット無核細胞が、赤血球である、実施形態４４または４５に記載の方法。

【0219】

実施形態４７．
実施形態１～４６のいずれか一つに記載の医薬製剤を含む、バイアル。

【0220】

実施形態４８．
医薬製剤を含むバイアルであって、当該医薬製剤は、凍結保存培地中に約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．５である、バイアル。

【0221】

実施形態４９．
医薬製剤を含むバイアルであって、当該医薬製剤は、凍結保存培地中に約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣを含み、ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【0222】

実施形態５０．
製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態４８または４９に記載のバイアル。

【0223】

実施形態５１．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、実施形態４８～５０のいずれか一つに記載のバイアル。

【0224】

実施形態５２．
製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態４８～５１のいずれか一つに記載のバイアル。

【0225】

実施形態５３．
製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態４８～５２のいずれか一つに記載のバイアル。

【0226】

実施形態５４．
製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態４８～５３のいずれか一つに記載のバイアル。

【0227】

実施形態５５．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態４８～５４のいずれか一つに記載のバイアル。

【0228】

実施形態５６．
医薬製剤を含むバイアルであって、当該医薬製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含みＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【0229】

実施形態５７．
ＡＡＣは、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に存在する、実施形態４８～５６または３９のいずれか一つに記載のバイアル。

【0230】

実施形態５８．
医薬製剤を含むバイアルであって、当該医薬製剤は、約９．５ｍＬの凍結保存培地中に約７×１０^９個のＡＡＣを含みＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７．６である、バイアル。

【0231】

実施形態５９．
製剤は、無菌である、実施形態４７～５８のいずれか一つに記載のバイアル。

【0232】

実施形態６０．
ＡＡＣの医薬製剤を作成する方法であって、当該方法は、凍結保存培地を当該ＡＡＣに加えることを含み、当該ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含む、方法。

【0233】

実施形態６１．
ＡＡＣの医薬製剤を作成する方法であって、当該ＡＡＣは少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含み、当該方法が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）摂動無核細胞を、少なくとも一つの抗原およびアジュバントと、少なくとも一つの抗原およびアジュバントが摂動無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間インキュベートし、それによって、少なくとも一つの抗原およびアジュバントを含むＡＡＣを生成することと、
ｃ）当該ＡＡＣを洗浄することと、
ｄ）当該ＡＡＣを凍結保存培地中で製剤化することと、を含む、方法。

【0234】

実施形態６２．
狭窄部の幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、または約１．８μｍ～約２．２μｍである、実施形態６１に記載の方法。

【0235】

実施形態６３．
ＡＡＣを約６回洗浄する、実施形態６１または６２に記載の方法。

【0236】

実施形態６４．
ＡＡＣは、遠心分離および再懸濁によって、または遠心分離および濾過によって洗浄される、実施形態６１～６３のいずれか一つに記載の方法。

【0237】

実施形態６５．
遠心分離が、約４０００ｒｐｍである、実施形態６４に記載の方法。

【0238】

実施形態６６．
約１×１０^９個のＡＡＣ～約１×１０^１０個のＡＡＣが、約９ｍＬ～約１０ｍＬの凍結保存培地中で製剤化される、実施形態６１～６５のいずれか一つに記載の方法。

【0239】

実施形態６７．
医薬製剤が、凍結前に約７×１０^９個のＡＡＣを含む、実施形態６６に記載の方法。

【0240】

実施形態６８．
製剤が、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約９×１０^９個の細胞を含む、実施形態６６または６７のいずれか一つに記載の方法。

【0241】

実施形態６９．
製剤が、約０．５×１０^９個／ｍＬのＡＡＣ～約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態６６～６８のいずれか一つに記載の方法。

【0242】

実施形態７０．
製剤が、約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態６６～６９のいずれか一つに記載の方法。

【0243】

実施形態７１．
製剤が、凍結前に約０．７×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態６６～７０のいずれか一つに記載の方法。

【0244】

実施形態７２．
製剤は、以前に凍結されたＡＡＣを含み、当該製剤は、解凍後に約１×１０^９個／ｍＬのＡＡＣを含む、実施形態６６～７１のいずれか一つに記載の方法。

【0245】

実施形態７３．約７×１０^９個のＡＡＣが、約１０ｍＬの凍結保存培地中で製剤化される、実施形態６６～７２のいずれか一つに記載の方法。

【0246】

実施形態７４．
凍結保存培地が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２である、実施形態６６～７３のいずれか一つに記載の方法。

【0247】

実施形態７５．
インプット無核細胞が、赤血球である、実施形態６１～７４のいずれか一つに記載の方法。

【0248】

実施形態７５．
方法が、約－１７０℃でＡＡＣの製剤を凍結することをさらに含む、実施形態６０～７５のいずれか一つに実施形態に記載の方法。

【0249】

実施形態７６．
ＡＡＣの製剤が、
ａ）製剤をチャンバー内に置くことと
ｂ）チャンバーの温度を、約－３℃に低下させることと
ｃ）チャンバーの温度を、約－２０℃／分の速度で約－１４０℃に低下させることと
ｄ）チャンバーの温度を、約１．５℃／分の速度で約－１５０℃に低下させることと
ｅ）チャンバーの温度を、約１．０℃／分の速度で約－１７０℃に低下させることと
ｆ）チャンバーの温度を、約－１７０℃に少なくとも約１０分間維持することと、を含むプロセスにより凍結される、実施形態７５に記載の方法。

【実施例】

【0250】

当業者は、一部の実施形態が本発明の範囲および趣旨の範疇で可能であることを認識するものとなる。これより、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に記述する。以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然のことながら、形はどうあれその範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

【0251】

実施例１ ＡＡＣ－ＨＰＶの開発
ＡＡＣ－ＨＰＶ原薬製造プロセスの開発については、健康なドナーから採取された全血を使用してプロセス開発試験を実施し、冷蔵条件（２～８℃）で一晩で製造業者に発送した。
全血希釈

【0252】

製造室で血液バッグを受け取った際に、出発物質情報を製造バッチ記録と照合して検証した。血液バッグから試料を無菌で回収し、血液分析器を介して全血球計算（ＣＢＣ）測定値を、情報のみのために取得する。また、コールターベースの細胞カウンターを使用してＲＢＣ数を取得する。ＲＢＣの総数の暫定基準は、≧５×１０^１１の総ＲＢＣである。

【0253】

試料収集後、開始全血をＲＰＭＩ＋５％ＤＭＳＯ（希釈媒体）で希釈し、ＬＯＶＯ細胞洗浄システムでの処理のために細胞濃度を減少させた。希釈媒体は５％のＤＭＳＯを含み、このユニット操作の下流の送達プロセスで使用されるＳＬＰおよびアジュバントの溶解に必要な媒体と類似している。

【0254】

ＬＯＶＯ細胞洗浄前の全血希釈比
全血希釈比の評価を実施した。この評価の目的のために、いくつかの健康なドナーから採取された全血を、異なる比率で希釈媒体で希釈し、ＬＯＶＯ上で処理した。この評価には、血小板除去のために機器ベンダー（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）が推奨するＬＯＶＯパラメータを使用した。細胞洗浄後、採取した生成物を細胞数について評価し、ＲＢＣの段階的な回収を計算した。異なる全血希釈率評価からのＲＢＣ回収結果を、表１に示す。示される測定値は、コールターベースの細胞計数または血液分析器を使用した全血球計算のいずれかから取得された。

【表1】

【0255】

表１に示されるように、１：３～１：９の希釈比はすべて、ＬＯＶＯプロセスにわたって類似のＲＢＣ回収率を示す。ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶプロセスでは、予想される患者出発物質（抗凝固剤を含む全血）の量は２６０～２７０ｍＬであり、製造プロセスを簡略化するために希釈媒体の体積を１Ｌに設定した。全血希釈工程の最終パラメータを表２に示す。全血希釈後、中間生成物を、無菌の単回使用４０μｍ血液フィルタを通して重力濾過し、全ての潜在的な細胞凝集体を除去する。

【表2】

^ａ患者の出発物質には、追加でおよそ６０～７０ｍＬの抗凝固剤が加えられ、予想される容量の合計は２６０～２７０ｍＬとなる。

【0256】

ＲＢＣ精製およびペプチド＋アジュバント導入
希釈血液バッグから試料を無菌で回収し、ＲＢＣを計数した。次いで、希釈された血液をＬＯＶＯ細胞洗浄システムで処理し、細胞は、５０μＭ Ｅ６ ＳＬＰ、２５０μＭ Ｅ７ ＳＬＰおよび５％ＤＭＳＯを有するＲＰＭＩ １６４０媒体中の１．５ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの、無菌の濾過された混合物（送達媒体と称される）で洗浄され、血小板が除去される。血小板除去後、細胞をＬＯＶＯシステムを使用して送達媒体で再懸濁した。送達媒体での再懸濁に続いて、白血球を除去する白血球除去フィルタを通して、生産工程内材料を無菌処理し、送達媒体中に精製されたＲＢＣ懸濁液を得た。次いで、精製細胞懸濁液を、ＲＢＣ数およびＷＢＣおよび血小板を捕捉する全血球計算（ＦＩＯ）について評価した。すべての処理は、環境条件で行われた。

【0257】

ＲＢＣ精製－血小板除去およびペプチド＋アジュバント導入
全血の希釈後、ＲＢＣを洗浄し、環境条件下でＬＯＶＯシステムを使用して送達媒体で再懸濁した。ＬＯＶＯシステムは、４μｍのスピニングメンブレンからなる単回使用のＬＯＶＯキットを利用し、ＲＢＣの回収を最大化しながら血小板の除去を可能にする。可変入口および出口流量を使用して、ＬＯＶＯシステムは、細胞の洗浄および濃縮を可能にする。ＬＯＶＯシステムで、送達媒体を用いてＲＢＣを洗浄および再懸濁するために使用する処理パラメータは、機器ベンダー（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ社）によって提供された。ベンダーが提供した推奨パラメータは、開発活動中に評価された。

【0258】

血小板除去およびＲＢＣ回収の評価を、７人の異なる健康なドナーから採取したＬＯＶＯプロセスにわたって行った。ユニット動作は、図１に示すように８９．１２±５．７５％の平均ＲＢＣ回収および７４．５６±１０．５２％の平均血小板除去を示した。血小板除去のためのＬＯＶＯ処理パラメータを表３に提供する。

【表3】

【0259】

ＲＢＣ精製－白血球除去（ＷＢＣ除去）
ＲＢＣの洗浄および送達媒体への再懸濁の後、中間生成物は、環境条件において、無菌の単回使用白血球除去濾過アセンブリを通して濾過される。濾過アセンブリは、白血球除去フィルタ（ＬＲＦ）、４０μｍの血液フィルタ、および直列に組み立てられた１８μｍの血液フィルタからなる。白血球除去濾過アセンブリは、ＷＢＣ、および任意の潜在的な細胞凝集体の除去を可能にする。白血球除去フィルタはまた、非特異的な様式で血小板を除去することも注目されている。白血球除去濾過工程を用いた最初の試験ランは、他の取り扱いの前に、受入ドナー全血を白血球除去しようと試みたが、濾過時間が、法外に長いことが観察された。最終的に、ＬＯＶＯ上で最初のＲＢＣ精製が行われた後に、濾過時間を＜５分に短縮した、白血球除去工程が最も適していると判定された。

【0260】

図２は、ＬＯＶＯ上の送達媒体での細胞洗浄および再懸濁、ならびに白血球除去フィルタを介した精製を含む、ＲＢＣ精製工程にわたるｎ＝１１のランのＲＢＣ、血小板、およびＷＢＣの平均全体的回収率を示す。データは、後続の処理工程におけるペプチドおよびアジュバント送達のための調製における適切なＲＢＣ精製を示す。

【0261】

ペプチド（Ｅ６およびＥ７ ＳＬＰ）およびアジュバント（ポリＩ：Ｃ）送達
ＲＢＣ送達プロセスの開発には、２．２μｍの狭窄部を有するマイクロ流体チップを使用した。マイクロ流体チップを、前臨床試験中に使用されるチップ狭窄幅と整列するように選択した。送達工程前のＡＡＣ－ＨＰＶの製造中の生産工程内に残された少数の残留ＷＢＣ（図２を参照）は、チップを詰まらせないことに留意されたい。

【0262】

適切な送達パラメータを特定するための予備的研究を、代理送達材料として蛍光標識されたＯｖａｌｂｕｍｉｎ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７）を用いて実施した。最初の設計空間が確立されると、蛍光標識されたＥ６およびＥ７ ＳＬＰ（ＦＡＭ－Ｅ６およびＦＡＭ－Ｅ７）を用いて検証試験が実施された。ポリＩ：Ｃも送達材料として使用されたが、蛍光標識されたポリＩ：Ｃは入手できなかったため、これらの試験では測定されなかった。
Ｅ６ ＳＬＰ：ＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬ（配列番号１９）
Ｅ７ ＳＬＰ：ＱＬＣＴＥＬＱＴＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＹＣＫＱＱＬＬ（配列番号２３）

【0263】

Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７を用いた予備的送達評価
前臨床試験スケールの送達研究に基づく、目標動作温度２～８℃。Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７を使用したＲＢＣ送達をフローサイトメトリーを使用して分析し、各試験についてＯｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋表現型（膜外葉上のホスファチジルセリンの測定）の細胞送達を測定した。

【0264】

圧力評価およびマイクロ流体チップ構成
動作圧力およびマイクロ流体チップ構成の試験を、異なる動作圧力で、並列に配置された異なる数の２．２μｍの収縮チップを利用して、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７送達およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性を評価するために実施した。この試験では、同じチップタイプの三つの個別のチップ構成（１個のチップ、並列な２個のチップ、並列な４個のチップ）と動作圧力（６０ｐｓｉ、７５ｐｓｉ）を評価した。

【0265】

図３は、６０ｐｓｉの動作圧力で行われた試験群と比較して、７５ｐｓｉの動作圧力で行われた試験群におけるアネキシンＶ＋集団の増加を示す。さらに、７５ｐｓｉの動作圧力でＯｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７で送達された集団は、試験した三つのチップ構成すべてにわたって最も一貫した結果（＞９０％送達）を示した。この評価の結果、送達プロセスの細胞内送達およびスループットを最大化するために、７５ｐｓｉの動作圧力および４個のチップ構成が選択された。

【0266】

細胞濃度評価
各ドナーから入ってくる赤血球数の変化により、ペプチドおよびアジュバント送達プロセスには、様々な細胞濃度が予想される。様々な細胞濃度の評価を実施した。様々な濃度の赤血球を、７５ｐｓｉの動作圧力で並列な４個のチップを通して送達材料としてＯｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７で処理し、送達について分析した。

【0267】

図４の結果は、以前に選択された動作パラメータを使用した送達が、０．５×１０^９～４．０×１０^９個／ｍＬのＲＢＣの範囲の細胞濃度にわたって一貫していることを示す。この評価の結果として、ＳＬＰおよびアジュバントを用いたＲＢＣ送達の動作範囲を、試験した細胞濃度に対して設定した。ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの製造プロセスにおける細胞濃度は、試験された範囲内に収まると予想される。

【0268】

標識ペプチド（ＦＡＭ－Ｅ６およびＦＡＭ－Ｅ７ ＳＬＰ）およびポリＩ：Ｃ含有量を用いた送達評価
Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ６４７を使用した予備的研究の後、ＦＡＭ標識されたＥ６およびＥ７ ＳＬＰならびに非標識ポリＩ：Ｃを使用して検証試験を実施した。試験を、送達パラメータ（４ｘチップ構成、７５ｐｓｉ、２～８℃）を使用して実施した。

【0269】

図５は、ＦＡＭ－Ｅ６ ＳＬＰおよびＦＡＭ－Ｅ７ ＳＬＰが送達された集団の％を、それぞれ＞８８％および＞９６％と示す。

【0270】

ペプチド（Ｅ６およびＥ７ ＳＬＰ）およびアジュバント（ポリＩ：Ｃ）送達に対する低減した動作圧力
二つの試験を、送達の比較のための７５ｐｓｉの対照と共に、ＦＡＭ標識Ｅ７ペプチドを用いて７０ｐｓｉで送達された同じドナー全血を使用して実施した。結果を図６に示す。

【0271】

これらの実験の結果は、７０ｐｓｉのより低い動作圧力が、７５ｐｓｉの動作圧力と同等のＦＡＭ－Ｅ７送達をもたらすことを実証した。この評価の結果として、ペプチドおよびアジュバントの送達の目標動作圧力を７０ｐｓｉに変更した。

【0272】

選択された最終送達パラメータを表４に示す。

【表4】

【0273】

送達プロセスパラメータの開発が完了した後、ポリＩ：Ｃ含有量をＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ医薬品バイアルから測定した。代表的なバッチの結果を、表５に示す。

【表5】

【0274】

製品の静置（３７℃インキュベーション）
ペプチドおよびアジュバント送達プロセスの３０分間の周囲静置工程に続いて、ＡＡＣを希釈し、次いで、３７℃でインキュベーター内のロッカー上に２時間置いてさらに静置する。これらのパラメータを決定するために、静置時間および試験前希釈体積の評価を実施した。

【0275】

試験は、１時間および２時間の静置時間を比較し、希釈ＡＡＣ（ＲＰＭＩ媒体で希釈）および非希釈ＡＡＣの静置を比較した。これらの試験は、静置期間にわたる段階的回収および最終医薬品中のＡＡＣの集団の％について測定された。これらの評価の結果は、１時間の静置と比較して、ＡＡＣを２時間静置したときの回収の改善を示した。

【0276】

希釈されたＡＡＣと希釈されていないＡＡＣの製品の静置を用いて、追加の評価を実施した。各試験条件からのそれぞれの医薬品の機能的応答を評価した。

【0277】

図７に報告されたデータは、希釈されたＡＡＣが静置される場合、プロセスにおいて静置される未希釈のＡＡＣと比較して、有意に高い分泌ＩＦＮ－γレベルを示す。この評価に基づいて、３７℃の静置に先立ち、送達されたＡＡＣの１Ｌ希釈を製造プロセスにて実施した。

【0278】

ｎ＝１５試験にわたる製品静置工程にわたる平均ＡＡＣ回収は、９３．６％であると分析された。このデータは、インキュベーションのために評価および実施されるパラメータを用いて、高いＡＡＣ回収率が達成されることを実証する（表６）。

【表6】

【0279】

臨床製造のためのＡＡＣ－ＨＰＶ原薬数
連続処理のため、最小限のＡＡＣ－ＨＰＶ原薬の生産工程内保持時間が望まれる。これを可能にするために、試料は、製品静置工程の前に、生産工程内ＡＡＣから取得される。２時間の静置中、試料を分析し、補正係数０．９で測定された計数を使用して、最終ＡＡＣ－ＨＰＶ原薬中の総ＡＡＣを計算する。０．９の補正係数は、開発中に観察された９３．７％（四捨五入して９０％とした）の平均インキュベーション段階的回収率を考慮して確立された。

【0280】

静置後、送達されたＡＡＣは、無菌単回使用の４０μｍ血液フィルタを通して重力濾過される。４０μｍの濾過後、原薬を洗浄し、ＬＯＶＯを使用して最終製剤媒体に交換する。

【0281】

全血保持時間
全血保持時間は、全血採取の終了（すなわち、患者の採血の終了）から全血希釈の開始（製造の開始）までの時間として定義される。全血保持時間の初期評価は、２～８℃で３６時間および５０時間の保持時間で行った。試験は、健康なドナー血液ユニットの一つを分割し、半分を使用して、対照群として１日保持（約２４時間）後にＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶを産生し、残りの半分は３６時間または５０時間の保持後に産生することにより構成された。得られたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ医薬品を、機能的応答について分析した。いずれかの保持時間（３６時間または５０時間）を使用する経時全血から作製された産物は、対照（２４時間）と同様のアッセイおよびプロセス変動内で機能的応答を誘発する。保守的アプローチとして、３６時間を、患者の出発物質に対する全血保持時間として実施した。この保持時間は、より長い保持時間を支持するより多くのデータが生成されるにつれて延長され得る。

【0282】

実施例２ 医薬品製剤
製剤ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶは、７．０×１０^８個／ｍＬのＡＡＣの濃度（クールターベースの細胞計数（Ｍｏｘｉ ＧＯ ＩＩ）を使用して分析されるように）を目標に、製剤化工程中のＡＡＣ損失を考慮し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２中でＡＡＣ－ＨＰＶ原薬を製剤化し、バイアルに充填することによって、調製される。このバイアルは、チャンバー温度≦－１７０℃の速度制御冷蔵庫を使用して凍結保存されるが、この時、バイアルは、製造、保管および出荷中に≦－１４０℃の温度に到達し、かつ維持されるようにする。

【0283】

解凍後のＡＡＣ回収は、この凍結保存培地がＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ医薬品に適していることを確認する。

【0284】

以下の評価を実施して、医薬品製剤化プロセスを開発する。

【0285】

医薬品製剤のＬＯＶＯシステムパラメータの検証
初期ＬＯＶＯプロトコル（プロトコル１）は、装置ベンダー（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）のガイダンスを得て開発された。このプロトコルの目的は、９９．９７％のプロセスに対して、高い理論的ウォッシュアウト（すなわち、緩衝液交換）を達成することであった。これは、以下の方程式によって与えられる最大出口充填セル体積（出口ＰＣＶ）を作成することによって可能となった。
出口ＰＣＶ＝（入口流量÷出口流量）×入口ＰＣＶ。

【0286】

ＬＯＶＯプロトコル１のパラメータを以下の表７に列挙する。

【表7】

【0287】

８人のドナーからの材料を用いたｎ＝１３の実験でプロトコル１を評価した後、観察された平均図段階的回収率は、図８に示すように４２．４％であった。製剤化工程で観察された低回収率は、製造プロセス収率に著しい影響を与えた。低回収率の結果、製造プロセス収率の増加を目的として、第二のＬＯＶＯプロトコルを評価した。

【0288】

プロトコル２では、ＬＯＶＯ処理パラメータを調整して、６回すべての洗浄サイクルについて、３６％のより低い最大出口ＰＣＶを目標にし、９９．９６％の高理論的ウォッシュアウトを維持しながら、回収率を向上させた。ＬＯＶＯプロトコル２のパラメータは、以下の表８に見出すことができる。プロトコルは、８人の異なるドナーからの材料を用いたｎ＝１０の実験で実施され、図８に示すように、平均ＡＡＣ回収率は７４．５％に増加した。改善された回収のため、プロトコル２をＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの臨床製造に使用するように選択した。

【表8】

【0289】

ＬＯＶＯ処理パラメータを表８に示すものに確定し、図９に示す結果と共に、フルスケールのプロセス開発研究の間に使用した。これらの結果は、最終製剤での７×１０^８個／ｍＬのＡＡＣの目標濃度が、これらのＬＯＶＯパラメータで達成可能であることを実証する。

【0290】

バイアルの充填、検査、およびラベリング
バイアルへの充填を、バイオセーフティキャビネット内で行う。バイアルは、無菌で、完全に栓をされ、すぐに使用できる状態で供給される。充填のために、各バイアルは、９．９８ｇ±５％の生成物（すなわち、９．５ｍＬ、これは、８．９ｍＬの抽出可能体積を許容する）で充填される。充填後、各バイアルは封止され、重量が確認され、その後キャップが付けられる。バイアル充填が完了すると、照明付きの白黒の背景を備えた検査ブースを使用して、視認される欠陥（大きな塊または凝集物を含む）がないか各充填されたバイアルを目視で検査する。その後、各バイアルに、低温貯蔵ラベルが付与される。

【0291】

充填プロセスについて、プロセスパフォーマンス能力（Ｐｐｋ）評価を実施した。技術移転バッチにわたって達成された最小充填Ｐｐｋは４．６６であり、充填プロセスが堅牢であり、制御された状態にあることを示した。この解析結果を表９に示す。

【表9】

^１Ｐｐｋ＝以下の最小値：（ＵＳＬ－Ｍｅａｎ）／３^＊σ）または（Ｍｅａｎ－ＬＳＬ）／（３^＊σ）
^２充填されたバイアルの総数は６２バイアルであり、１バイアルは可視粒子のため却下された

【0292】

凍結保存および保存
標識されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶバイアルを含む二次的貯蔵ボックスは、速度制御冷蔵庫内のラックに装填され、その後、１４０℃以下の製品温度で凍結保存される。凍結保存後、バイアルは放出、特徴解析、安定性試験のためにＱＣに提供され、長期保存のために等温ＬＮ_２タンクに設置される。残りの凍結保存バイアルは、標識された二次的保管箱に保管され、長期保管のために等温ＬＮ_２タンクに設置される。

【0293】

３４Ｌチャンバー容量およびカスタム凍結保存プロトコルを有するＣｒｙｏＭｅｄ（登録商標）速度制御冷蔵庫を使用して、ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ医薬品を凍結保存した。カスタム凍結プロファイルは、製剤の核形成中に放出される潜熱を制御するように設計されている。製剤中の氷核形成は、約－５℃で開始される。製剤の核形成中に放出される潜熱を制御するには、製品温度が核形成点（－５℃）に到達する前にチャンバーの急速冷却を開始しなければならない。ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの凍結保存中、チャンバー温度は、生成物温度が核形成点（－５℃）をわずかに上回る－３℃に達した後、－２０℃／分の冷却速度で－１４０℃まで急速に冷却される。その後、生成物は、－１．５℃／分の冷却速度で－１５０℃に冷却される。製品温度が－１５０℃に達すると、チャンバーは－１℃／分の冷却速度で－１７０℃に冷却され、その後－１７０℃で１０分間保持される。ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの凍結保存用に６４バイアルの最大チャンバー荷重を設定し、バイアルの一つを製品温度観察に使用した。凍結保存プロトコルの詳細を表１０に示す。凍結保存プロトコルから生じるチャンバーおよび製品温度プロファイルを図１０および１１に示す。

【表10】

【0294】

図１０は、開発されたプロトコルを使用して凍結保存されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの４８バイアルの代表的な負荷を示す。上記の製品温度トレースに示されるように、凍結チャンバー内の異なる場所で凍結保存されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶは、類似の時間で核形成され、サイクル完了前に－１４０℃以下の最終製品温度に達する。代表的なチャンバー負荷の合計凍結保存サイクル時間は、約１００分である。

【0295】

図１１は、二つのラック構成を使用して凍結保存されたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの６４バイアルの最大負荷を示す。図１０および１１に示されるように、凍結チャンバー内の異なる位置の両方のラックに置かれたＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶは、類似の時間で核形成され、サイクル完了前に－１４０℃以下の最終製品温度に達する。最大チャンバー負荷の合計凍結保存サイクル時間は、約９５分である。

【0296】

両方のチャンバーの負荷からの温度プロファイルに基づいて、開発されたプロトコルは、最大６４バイアルまでのすべてのバイアル負荷にわたって一貫したプロファイルを達成できることを示す。

【0297】

解凍後のＡＡＣ回収
凍結保存後のＡＡＣの安定性および回収を評価するために、製剤を解凍し、フローサイトメトリーを使用してＡＡＣ数について試験する。注目すべきは、コールターベースの計数とは対照的に、フローサイトメトリー分析を使用して解凍後にＡＡＣ濃度の増加が観察され、その結果、生産工程内データと比較して、リリース時のバイアル当たりのＡＡＣ含有量が高かったことである。コールターベースの細胞カウンターであるＭｏｘｉ ＧＯ ＩＩは、生産工程内のＡＡＣ試料を数えるために使用される。対照的に、フローサイトメトリー法を使用して、ＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ医薬品のＱＣ放出中にＡＡＣ（ＣＤ２３５ａ＋アネキシンＶ＋）を特定し、計数する。感度の低いＭｏｘｉ ＧＯ ＩＩカウンターを使用した生産工程内のＡＡＣ試料分析は、フローサイトメトリー法を使用したＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶの対応する解凍後測定の測定値に対して負バイアスを有する。

【0298】

最終製剤化工程中に標的とされる濃度は、７．０×１０^８個／ｍＬのＡＡＣであり、Ｍｏｘｉ ＧＯ ＩＩを使用したｎ＝５のプロセス開発バッチの生産工程内計数は、平均で７．３６×１０^８個／ｍＬのＡＡＣであった（図９参照）。

【0299】

図１２に示すデータは、ｎ＝５のプロセス開発バッチからの解凍後の数を示す。これら５つのバッチの平均ＡＡＣ数は、１．０３ｘ１０^９個／ｍＬのＡＡＣであり、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２賦形剤における凍結融解サイクルを通じたＡＡＣ回収が、期待された解凍後の目標濃度１．０ｘ１０^９個／ｍＬのＡＡＣを満たすことを示した。解凍後の計数は、これらの結果と一致している（表１１）。

【表11】

^ａ全体的なプロセス回収＝１００％×（バイアル充填×解凍後ＡＡＣ数×９．５ｍＬ）／全血開始ＲＢＣ数。
^ｂ血液分析器で測定。
^ｃフローサイトメトリー法によって測定

【0300】

全血から医薬品への平均プロセス回収（６１．８％）に基づいて、全血中の暫定最小ＲＢＣ、５．０×１０^１１総細胞が、３２バイアルのＳＱＺ－ＡＡＣ－ＨＰＶ（全血中の５．０×１０^１１ＲＢＣ×６１．８％の平均プロセス回収／９．５×１０^９標的ＡＡＣ／医薬品バイアル）をもたらすと推定される。

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】