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特表2024-503395ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント

(51)【国際特許分類】

C12N 15/13 20060101AFI20240118BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20240118BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240118BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240118BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240118BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240118BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240118BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20240118BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240118BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240118BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20240118BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240118BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20240118BHJP

A61K 35/12 20150101ALI20240118BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/00 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023541808

(86)(22)【出願日】2022-01-07

(85)【翻訳文提出日】2023-07-10

(86)【国際出願番号】 CN2022070628

(87)【国際公開番号】W WO2022148414

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】202110025262.3

(32)【優先日】2021-01-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516082925

【氏名又は名称】北京韓美薬品有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧＨＡＮＭＩＰＨＡＲＭ．ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ 家望

(72)【発明者】

【氏名】范菲

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ 洋

(72)【発明者】

【氏名】王礼翠

(72)【発明者】

【氏名】李 ▲キョン▼祐

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085CC23

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントは、特異性及び安定性が高く、ＩＦＮ－γの分泌を増強させることができ、強いＴ細胞機能への調節活性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む、単離された抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２０に示すＬＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱＩＤＮｏ．２１に示すＬＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱＩＤＮｏ．２２に示すＬＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含み、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２３に示すＨＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱＩＤＮｏ．２４、４５、４６又は４７と少なくとも約９４％の同一性を有するＨＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱＩＤＮｏ．２５に示すＨＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含む、
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれ、
好ましくは、前記重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記軽鎖定常領域配列は、κ鎖の定常領域配列から選ばれる、請求項１又は２に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的フラグメント。

【請求項5】

前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、
前記ＦＲ－Ｌ１は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５４に示すアミノ酸配列を有し
前記ＦＲ－Ｌ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５５に示すアミノ酸配列を有し、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第２個のアミノ酸ＹはＩに置換され、
第３個のアミノ酸ＱはＨに置換され、
第９個のアミノ酸ＡはＳに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５６に示すアミノ酸配列を有し、
前記ＦＲ－Ｌ４は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５７に示すアミノ酸配列を有し、
前記ＦＲ－Ｈ１は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５８に示すアミノ酸配列を有し、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１個のアミノ酸ＱはＥに置換され、
第２３個のアミノ酸ＫはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｈ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５９に示すアミノ酸配列を有し、又は、以下の置換により得られたアミノ酸配列であり、
第１３個のアミノ酸ＭはＩに置換され、
前記ＦＲ－Ｈ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ．６０に示すアミノ酸配列を有し、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第２個のアミノ酸ＶはＡに置換され、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＧに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４は、ＳＥＱＩＤＮＯ．６１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

（ａ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０－３７から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
（ｂ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０－３７又は４８－５０から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
（ｃ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４０－４３又は５１－５３から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的フラグメント。

【請求項7】

（ａ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３６又は４８－５０から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
（ｂ）軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４１又は５１－５３から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的フラグメント。

【請求項8】

前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はｓｃＦｖである、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

（１）請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸；から選ばれる、単離された核酸分子。

【請求項10】

効果的にライゲーションした請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項11】

請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項12】

請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。

【請求項13】

請求項１１に記載の宿主細胞を、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む、
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。

【請求項14】

ＰＤ－Ｌ１を介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞の使用であって、
前記疾患又は病症は、好ましくは腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。

【背景技術】

【0002】

プログラム細胞死－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）は、免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）分子であり、主にＴ細胞の活性化に対する調節に関与し、免疫応答の強弱及び持続時間を調節することができる。通常の場合、ＰＤ－１は、生体組織の自己免疫寛容を誘導及び維持することができ、炎症反応の過程において免疫系が過度に活性化して自己組織を傷つけることを防ぎ、自己免疫性疾患の発生を避けるのに積極的な作用がある。病理的状況では、腫瘍免疫及び多種の自己免疫疾患の発生及び発展過程に関与する（ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＡｇｅｎｔｓＭｅｄＣｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７－１３．ＨｅｍａｔｏｌＯｎｃｏｌＳｔｅｍＣｅｌｌＴｈｅｒ．２０１４Ｍａｒ；７（１）：１－１７．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３Ｊｕｌ２５；３９（１）：６１－７３．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２０１５Ｊｕｎ１０；３３（１７）：１９７４－８２．）。

【0003】

ＰＤ－１のリガンドは、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ１）及びＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ２）を含む。そのリガンドは、Ｂ７ファミリー属し、ここで、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、内皮細胞、表皮細胞などを含む多種の免疫細胞の表面で発現が誘導されている一方、ＰＤ－Ｌ２は、マクロファージ、ＤＣ細胞、Ｂ細胞を含むいくつかの免疫細胞のみで発現が誘導されている（ＡｕｔｏｉｍｍｕｎＲｅｖ，２０１３，１２（１１）：１０９１－１１００．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０１３，４：４８１．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ，２０１２，１２（４）：２５２－２６４．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．）。

【0004】

ＰＤ－Ｌ１は、黒色腫、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、膵臓腺癌、腸癌などを含む多種の腫瘍細胞の表面に高発現しており、ＰＤ－Ｌ２は、Ｂ細胞リンパ腫に高発現している。腫瘍細胞は、高発現しているＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２を介してＴ細胞上のＰＤ－１と結合し、免疫阻害シグナルを伝達し、これにより、腫瘍細胞に対する生体の免疫寛容を引き起こし、これにより、腫瘍細胞の成長及び転移に有利である。ＰＤ－１リガンドの高発現は、腫瘍患者の予後不良及び耐薬品性と密接に関連する（ＨｅｍａｔｏｌＯｎｃｏｌＳｔｅｍＣｅｌｌＴｈｅｒ．２０１４Ｍａｒ；７（１）：１－１７．）。さらなる研究によって、ＰＤ－１はＴ細胞の表面、特に腫瘍細胞に浸潤するＴ細胞の表面での発現が向上するのは、予後不良とも密接に関連することを発見した（ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２０１５Ｊａｎ；２１（１）：２４－３３．）。

【0005】

多くの研究によると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓシグナル経路をブロッキングする抗体は抗腫瘍効果を有することが示された。臨床的に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓブロッキング抗体は、まず、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓブロッキング抗体の効果はある種類の腫瘍に限らず、広い範囲の腫瘍では強く且つ持続的な抗腫瘍効果を有し、次に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌｓブロッキング抗体は安全性が良く、疲労、白血球低下、禿げ頭、下痢、発疹などのいくつかの化学療法剤及び標的薬によるよく見られる副作用がなく、いくつかの免疫に関連する副作用しか生じないという特徴を持つ。ＰＤ－１抗体ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）は、末期の黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌及びリンパ腫などを治療するために市販されており、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕａｍｂ）は、末期の黒色腫、非小細胞肺癌及びリンパ腫などを治療するために市販されている。ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）は、末期の非小細胞肺癌及び尿路上皮癌を治療するために市販されており、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）は、末期の非小細胞肺癌及び尿路上皮癌を治療するために市販されており、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）は、末期のメルケル細胞癌を治療するために市販されている。

【0006】

この分野では、依然として、より効果的なＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する抗体を開発する必要がある。

【発明の概要】

【0007】

本発明の第１の態様は、単離された抗ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ１、ＰＤ－Ｌ１）抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体に関し、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、ここで、
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮｏ．２０－２２に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２３に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２４又は４５－４７のいずれかと少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２５に示され、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮｏ．２０－２５又は４５－４７に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：２０－２５又は４５－４７に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。

【0008】

ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。

【0009】

いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８に示されるものであるか、又は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９に示されるものであるか、又は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１９に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。

【0011】

前記ＰＤ－Ｌ１キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．２６及びＳＥＱＩＤＮＯ．２７に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱＩＤＮｏ．２６及びＳＥＱＩＤＮＯ．２７に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．４％、９９．７％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２６及びＳＥＱＩＤＮＯ．２７に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。

【0012】

いくつかの実施形態において、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、ここで、

【0013】

前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５４に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５５に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第２個のアミノ酸ＹはＩに置換され、
第３個のアミノ酸ＱはＨに置換され、
第９個のアミノ酸ＡはＳに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５６に示され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５７に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１個のアミノ酸ＱはＥに置換され、
第２３個のアミノ酸ＫはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５９に示され、又は、以下の置換により得られたアミノ酸配列である：
第１３個のアミノ酸ＭはＩに置換され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．６０に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列である：
第２個のアミノ酸ＶはＡに置換され、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＧに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．６１に示される。

【0014】

いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８、３９又は４４のいずれかに示され、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．３０－３７、４０－４３、４８－５３のいずれかに示され、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０－４４又は４８－５３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０－４４又は４８－５３に示す配列に対して１つ又は複数、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。

【0015】

好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３８に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０－３７から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３９に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０－３７又は４８－５０から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４４に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４０－４３又は５１－５３から選ばれるアミノ酸配列を有する。

【0016】

より好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３９に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３６又は４８－５０から選ばれるアミノ酸配列を有し、又は
軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４４に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４１又は５１－５３から選ばれるアミノ酸配列有する。

【0017】

好ましくは、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．２６及びＳＥＱＩＤＮＯ．２７に示される。

【0018】

本分野において、同一性が言及される場合、アミノ酸配列の長さは自然数でなければならないので、実際に計算して得られた同一性の数値は９５％のような有限の位のパーセントではなく、９５％のようなパーセントに近い数字である可能性があり、例えば１１７位のアミノ酸残基の可変領域配列について、１つだけのアミノ酸残基が変化した場合、それに対応する同一性のパーセントは実際には９９．１５％に近いパーセントであるが、便宜上、このような数字は本明細書では９９％と表記することは周知されている。

【0019】

いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はｓｃＦｖである。

【0020】

本発明の第２の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する：
（１）第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義されたＤＮＡ又はＲＮＡと完全に相補的な核酸。

【0021】

本発明の第３の態様は、効果的にライゲーションした第２の態様に係る核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。

【0022】

本発明の第４の態様は、第２の態様に係る核酸分子又は第３の態様に係るベクターを含む宿主細胞に関する。

【0023】

本発明の第５の態様は、第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物に関する。

【0024】

本発明の第６の態様は、第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体を生産する方法に関し、前記方法は、

【0025】

第４の態様に係る宿主細胞を前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。

【0026】

本発明の第７の態様は、ＰＤ－Ｌ１を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞の使用に関する。

【0027】

本発明の第８の態様は、ＰＤ－Ｌ１を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞に関する。

【0028】

本発明の第９の態様は、必要とする被験者に、第１の態様に係る抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第２の態様に係る核酸分子、第３の態様に係るベクター又は第４の態様に係る宿主細胞を投与するステップを含む、ＰＤ－Ｌ１を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療する方法に関する。

【0029】

いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。

【0030】

いくつかの実施形態において、前記移植体に対する免疫応答は、例えば移植片対宿主病を含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記アレルギー反応は、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。

【0032】

いくつかの実施形態において、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指す。病原性ウイルスの例として、例えばＨＩＶ、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ及びＣＭＶ、ＥＢウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルスを含む。病原性細菌は、例えば梅毒トレポネーマ、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、変形菌、セラチア菌、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ、枯草菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ属細菌及びボレリア・ブルグドルフェリを含む。病原性真菌は、例えばカンジダ菌（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスぺルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｉｍｍｉｔｉｓ）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。病原性寄生虫は、例えば赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属の生物種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属の生物種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア原虫（Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉ）及びブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病及びハンチントン病から選ばれる１種又は複数種である。

【0034】

いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。

【0035】

いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び／又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。

【0036】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。

【0037】

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、特異性が強く、安定性がよく、強いＴ細胞機能への調節活性と良好な薬物動態特性を有し、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。また、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性がアテゾリズマブより強い（図１Ｂを参照）。

【0038】

以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】本発明の実施例１における３４－３５番号のクローンから分泌される抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウス由来モノクローナル抗体のインビトロ活性を示す。ここで、Ａは、マウス由来モノクローナル抗体とＰＤ－Ｌ１との結合活性を示す。Ｂは、マウス由来モノクローナル抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を示す。

【図2】本発明の実施例３における抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体とヒトＰＤ－Ｌ１との結合活性を示す。

【図3】本発明の実施例４における抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体の結合特異性を示す。ここで、Ａは、種結合特異性であり、Ｂは、標的結合特異性である。

【図4】本発明の実施例５における抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を示す。

【図5】本発明の実施例６における抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体のＴ細胞機能に対する調節活性を示す。

【図6】本発明の実施例９における抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体をマウスに単回腹腔内投与した後の血中薬物濃度－時間曲線を示す。

【図7】本発明の実施例１０における抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

定義
用語であるヒト「ＰＤ－Ｌ１」とは、プログラム細胞死リガンド－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ－１）を指し、ＣＤ２７４及びＢ７Ｈ１とも呼ばれ、任意の脊椎動物に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１を指し、前記任意の脊椎動物は、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。

【0041】

本明細書で使用される用語である「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ＰＤ－Ｌ１と結合する抗体」とは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、異種のＰＤ－Ｌ１における保存されたＰＤ－Ｌ１のエピトープと結合する。

【0042】

用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれγ鎖、α鎖、μ鎖、δ鎖及びε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖のジスルフィド結合の数及び位置の違いによって、異なるサブクラスに分けることもでき、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブタイプに分けられてもよく、ＩｇＡは、ＩｇＡ_１とＩｇＡ_２のサブタイプに分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。

【0043】

本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。

【0044】

「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体及び古典補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ）に細かく分けられ、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲドメイン及び４つのＦＲドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で配列される。

【0045】

用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。

【0046】

異なるナンバリングスキーム（例えばＩＭＧＴ（登録商標）、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ）に基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。

【0047】

用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する天然に発生する可能性がある突然変異以外に同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、２種以上のＦａｂドメインから構成されてもよく、これにより、２種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法（例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）に限定されるものではない。

【0048】

用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」又は「ＢｓＡｂ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、２個の異なる抗原結合部位を有する抗体を指し、２つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の２つのアームは、それぞれＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ又はｄＳＦｖなどに由来してもよい。

【0049】

用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基（「エピトープ」）に対する異なる抗体の調製物を指す。

【0050】

用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す（例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい）。抗原結合フラグメントは、このような抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つのＣＤＲドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての６つのＣＤＲドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、１本のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であってもよく、又は、１本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖（それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する）（例えば、二重抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントなど）の一部であってもよく、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。

【0051】

本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂ’又はＦａｂフラグメント；（ｂ）ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｃ）ＶＨ領域及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント；（ｄ）抗体の１つのアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｅ）遺伝工学的手法により抗体ＶＨ及びＶＬを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ、ｓｃＦｖ）；（ｆ）基本的にＶＨ領域からなり且つドメイン抗体（Ｈｏｌｔなど，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２ｉ（ｌｌ）：４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｇ）ラクダ又はナノ抗体（Ｒｅｖｅｔｓなど，ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ．，５（ｌ）：１１１－２４）及び（ｈ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

【0052】

用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し且つ１つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、１種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含む抗体を指す。

【0053】

用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレームワーク領域修飾を行うことができる。

【0054】

用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」（「ｈｕｍＡｂ）又は「ＨｕＭａｂ」）とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）。

【0055】

変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。

【0056】

このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と７０％又はそれ以上（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列（即ち、本願で挙げられた配列）の全長に対して計算して得られたものである。

【0057】

ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標））又はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．,Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，（１９９１），ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２，アメリカ合衆国保健福祉省；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，（１９８７），ＣａｎｏｎｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓＦｏｒＴｈｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓＯｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７に従って、本発明におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、ＫａｂａｔＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。

【0058】

抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域（即ち、エピトープ）と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び／又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０^－７Ｍ、例えば１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ又はそれ以上の親和性でヒトＰＤ－Ｌ１と結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で（例えば、インビボで）結合する。このため、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び／又はこのような条件でＰＤ－Ｌ１に結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。

【0059】

抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約１０^－６Ｍ又はそれ以下のＫ_Ｄに対応する親和性で結合することを指し、このＫ_Ｄは、指定された抗原又は緊密に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍低い。

【0060】

本明細書で使用されるように、用語「ｋ_ｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋ_ｏｆｆ値とも呼ばれる。

【0061】

本明細書で使用されるように、用語「ｋ_ａ」（Ｍ－１ｘｓｅｃ－１又は１／Ｍｓｅｃ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。

【0062】

本明細書で使用されるように、用語「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つｋ_ｄをｋ_ａで割ることにより得られるものである。

【0063】

本明細書で使用されるように、用語「Ｋ_Ａ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つｋ_ａをｋ_ｄで割ることにより得られるものである。

【0064】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲの一部（即ち、結合に必要なＣＤＲ残基サブグループ、ＳＤＲと呼ばれる）のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び／又は経験に応じて、又はＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．など，（２００４），ＳＤＲＧｒａｆｔｉｎｇＯｆＡＭｕｒｉｎｅＡｎｔｉｂｏｄｙＵｓｉｎｇＭｕｌｔｉｐｌｅＨｕｍａｎＧｅｒｍＬｉｎｅＴｅｍｐｌａｔｅｓＴｏＭｉｎｉｍｉｚｅＩｔｓＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１：８６３－８７２に記載されるように、先行研究に基づいて（例えばＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０－Ｈ６５が、通常、不要である）Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ以外に位置するＫａｂａｔＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔなど，（１９９２），ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，公開番号９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．など，（１９８７），ＣａｎｏｎｉｃａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓＦｏｒＴｈｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎｓＯｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７を参照されたい）から関連するエピトープと接触しなく且つＳＤＲに位置しないＣＤＲ残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、１つ又は複数のドナーであるＣＤＲ残基が存在しなく又はドナーであるＣＤＲ全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが望ましい。経験に応じてＣＤＲ内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。

【0065】

ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．など，（１９８２），ＳｉｎｇｌｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎＡｌｔｅｒｉｎｇＡｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））７９（６）：１９７９－１９８３）、代替可能な機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定することができる。このような変異体ＣＤＲを得るための好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して（例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により）置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列における関連する残基の身元と置換された（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の身元とを比較することにより、この置換されたＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊの置換スコアを同定することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いられる（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，（２００４），ＷｈｅｒｅＤｉｄＴｈｅＢＬＯＳＵＭ６２ＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｃｏｒｅＭａｔｒｉｘＣｏｍｅＦｒｏｍ？，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，（１９９２），Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｍａｔｒｉｃｅｓｆｒｏｍｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．など，（１９９０），ＭｅｔｈｏｄｓＦｏｒＡｓｓｅｓｓｉｎｇＴｈｅＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅＯｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｅｑｕｅｎｃｅＦｅａｔｕｒｅｓＢｙＵｓｉｎｇＧｅｎｅｒａｌＳｃｏｒｉｎｇＳｃｈｅｍｅｓ），ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１），ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎＭａｔｒｉｃｅｓＦｒｏｍＡｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＴｈｅｏｒｅｔｉｃＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９、５５５－５６５。現在、最も先進的なＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる）。例えば、得られたＣＤＲを含む抗原結合フラグメントがＰＤ－Ｌ１に結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸（Ｅ）であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、０であり、且つ、より保存的な変化（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン）は、好ましいものである。

【0066】

【表1】

【0067】

そこで、本発明は、改良されたＣＤＲの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の３つの表における１つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。

【0068】

保存的置換を行うアミノ酸残基の種類：

【表2】

【0069】

代替の保存的アミノ酸残基置換の種類：

【表3】

【0070】

アミノ酸残基の物理的及び機能的代替の分類：

【表4】

【0071】

より保存的な置換グループには、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン及びアスパラギン－グルタミンが含まれる。

【0072】

いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ及びＬｙｓから選ばれる。

【0073】

さらに、例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。

【0074】

このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって親抗体のＣＤＲの配列と異なることができ、例えば４、３、２又は１個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ領域におけるアミノ酸は、以上の３つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。

【0075】

「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。

【0076】

このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、７０％又はそれ以上（即ち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０又はそれ以上の本発明で開示される１つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。

【0077】

用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の１種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した（即ち悪化していない）疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。

【0078】

用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも１種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。

【0079】

本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ誘導）により決定される。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗ＰＤ－Ｌ１の抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のＩｇＧ抗体は、クラスを本発明のＩｇＭ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプの切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ２抗体、例えばＩｇＧ２ａである。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。

【0080】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはＩｇＧ抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体－抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。

【0081】

いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、一価抗体であり、好ましくは、ＷＯ２００７０５９７８２（その全体が引用により本明細書に援用される）に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、以下の方法により構築される：ｉ）一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、ＩｇＧ１サブクラスの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このＣＬ領域は、このＣＬ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない；ｉｉ）一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び（例えばＩｇサブクラスに要求される）ＣＨ領域の他の領域（例えばＣＨ３領域）に対応する領域には、ヒトＩｇのＣＨ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている；ｉｉｉ）一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞で（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。

【0082】

同様に、いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、一価抗体であり、
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。

【0083】

他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。

【0084】

他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、Ｎ－結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まない。

【0085】

本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗ＰＤ－Ｌ１結合領域（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ－Ｌ１結合領域）は、１種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である（例えば、第２のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えた、改善された細胞転移作用を示し、又は、第２のエピトープは、他の目的タンパク質を標的とするエピトープである）。このため、他の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一価Ｆａｂは、他の異なるタンパク質を標的とするＦａｂ又はｓｃｆｖに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗ＰＤ－Ｌ１結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。

【0086】

本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のＦｖドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供し、ここで、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｖ中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド（典型的には、約１０、１２、１５又はそれ以上のアミノ酸残基）で連結されて１本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばＵＳ４，９４６，７７８；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄＭｏｏｒｅｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐａｇｅｓ：２６９－３１５（１９９４）；Ｂｉｒｄなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２,４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎなど，ＰＮＡＳＵＳＡ８５,５８７９－５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４８,５５２－５５４（１９９０）に記載されている。単一のＶＨ及びＶＬだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、２つのＶＨ及びＶＬを使用する場合、二価のものであり、又は、２つ以上のＶＨ及びＶＬを使用する場合、多価のものである。

【0087】

当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで製造された装置）を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えＤＮＡ技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。

【0088】

任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び／又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗ＰＤ－Ｌ１抗体に関連するＰＤ－Ｌ１選択性及び／又はＰＤ－Ｌ１特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。１つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。１種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ（例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列におけるＮ－結合型グリコシル化作用）、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばＷａｌｋｅｒ，（１９９８），ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓＯｎＣＤ－Ｒｏｍ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。

【0089】

本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばＵＳ４，７６６，１０６；ＵＳ４，１７９，３３７；ＵＳ４，４９５，２８５及びＵＳ４，６０９，５４６を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量は約１，０００～４０，０００Ｄの間、例えば約２，０００～２０，０００Ｄの間、例えば約３，０００～１２，０００ＤのＰＥＧ）を含む。

【0090】

用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラム或いは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人（例えば１８歳以上の被験者）である。他の実施形態において、被験者は、子供（例えば、１８歳以下の被験者）である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。

【0091】

本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。

【0092】

本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。

【0093】

このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラス）、ＩｇＤ、ＩｇＭ及びＩｇＥ；抗原結合フラグメント、例えばＳＤＲ、ＣＤＲ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体又はナノ抗体；抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体をさらに含む。

【0094】

他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。

【0095】

本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（１組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む）を含む任意の適切なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよい。このようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば線形発現要素（例えばＳｙｋｅｓａｎｄＪｏｈｎｓｔｏｎ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ，１２，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、小型核酸ベクター（例えばＵＳ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載されている）、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８又はｐＵＣ１１８／１１９）、最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉなど，ＭｏＩＴｈｅｒ，３，７９３－８００（２００１）に記載されている）を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばＣａＰＯ_４沈殿型構築物（例えばＷＯ００／４６１４７；ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙａｎｄＲｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳＵＳＡ８３，９５５１－５５（１９８６）；Ｗｉｇｌｅｒなど，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）及びＣｏｒａｒｏａｎｄＰｅａｒｓｏｎ，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，２，６０３（１９８１）に記載されている）としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである（例えばＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、Ｘ０ＧＣ（特許ＷＯ２００８／０４８０３７に由来する）、ｐＣＤＮＡ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｖ７９５２０）、ｐＣＨＯ１．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｒ８０００７）である。

【0096】

いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（ＶａｎＨｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを含む。

【0097】

発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター（例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）を含むベクターを含む（レビューとして、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌなど，ｅｄ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）；Ｇｒａｎｔなど，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ，１５３，５１６－５４４（１９８７）；Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．など，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８２４，３２９－３５８（２０１２）；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．など，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３０（５），１１０８－１１１８（２０１２）；Ｌｉ，Ｐ．など，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４２（２），１０５－１２４（２００７）；Ｂｏｅｒ，Ｅ．など，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（３），５１３－５２３（２００７）；ｖａｎｄｅｒＶａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３５９－３６６（２００２）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３４９－３５７（２００２）を参照されたい）。

【0098】

本発明の発現ベクターにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶＩＥプロモーター／エンハンサー及びＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸は、構成型プロモーター（例えばＣＭＶＩＥ）に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。

【0099】

他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素）を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。

【0100】

本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ細胞系、ＢＨＫ－２１細胞系、マウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）、繊維肉腫細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系、ＨＫＢ－１１細胞系、ＣＡＰ細胞系及びＨｕＨ－７ヒト細胞系で産生することができる（Ｄｕｍｏｎｔなど，２０１５，ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｓｅｐ．１８，１－１３．、その内容が引用により本明細書に援用される）。

【0101】

一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、例えばプロテインＡ－セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。

【0102】

本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。

【0103】

本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に．．．からなる」ことは、少なくとも１種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。

【0104】

一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含む。

【0105】

用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関（例えばＦＤＡオフィスやＥＭＡ）に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。

【0106】

本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。

【0107】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体（即ち、抗体がグリコシル化されていない）を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のＡＤＣＣ活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Ｃｏなどの米国特許Ｎｏ．５，７１４，３５０及びＮｏ．６，３５０，８６１（引用により本明細書に援用される）には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、ＨａｎｇなどのＥＰ１１７６１９５（引用により本明細書に援用される）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ開示ＷＯ０３／０３５８３５（引用により本明細書に援用される）には、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、それらは、フコースをＡｓｎ（２９７）が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．など，２００２Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。ＵｍａｎａなどのＰＣＴ開示ＷＯ９９／５４３４２（引用により本明細書に援用される）には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の向上をもたらすことが記載されている（Ｕｍａｎａなど，１９９９Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照されたい）。ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的ＣＨＯ哺乳動物細胞を説明した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。又は、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる（例えばＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照されたい）。

【0108】

本発明の抗体は、ＰＤ－Ｌ１に作用し、Ｔ細胞の活性化に対する調節に関与し、免疫応答の強弱及び持続時間を調節することができる。通常の場合、ＰＤ－Ｌ１は、生体組織の自己免疫寛容を媒介及び維持することができ、炎症反応の過程において免疫系が過度に活性化して自己組織を傷つけることを防ぎ、自己免疫性疾患の発生を避けるのに積極的な作用がある。病理的状況では、腫瘍免疫及び多種の自己免疫疾患の発生及び発展過程に関与する。臨床的証拠によると、ＰＤ－Ｌ１は黒色腫、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、膵臓腺癌、腸癌などを含む多種の腫瘍細胞の表面に高発現しており、且つ腫瘍細胞は高発現したＰＤ－Ｌ１を介してＴ細胞上のＰＤ－１又はＣＤ８０と結合し、免疫阻害シグナルを伝達し、腫瘍細胞に対する生体の免疫寛容を引き起こし、これにより、腫瘍細胞の成長及び転移に有利であることが示された。ＰＤ－Ｌ１の高発現は、腫瘍患者の予後不良及び耐薬品性と密接に関連する。本発明のＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０シグナル経路をブロッキングすることにより、抗腫瘍免疫反応を増強させ、これにより、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、メルケル細胞癌、黒色腫、腎細胞癌、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、肝癌、胃癌などを含む広い範囲の抗腫瘍効果を発揮する。

【0109】

範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の１０分の１、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が１つ又は２つの限界を含む場合、１つ又は２つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。

【0110】

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用することができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。

【0111】

以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解することができる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。

【0112】

以下の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法であり、具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーにより推奨される条件に従って行い、使用された実験材料は、特に説明しない限り、商業的企業から容易に入手することができる。本発明の以下の実施例で使用される各抗体は、いずれも市販の標準的抗体である。

【実施例】

【0113】

実施例１マウス由来抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物は、ＨＦＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入された６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質（ＢｅｉｊｉｎｇＨａｎｍｉＰｈａｒｍ社製、その中、ヒトＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列はｇｅｎｅｂａｎｋ＃：ＮＰ＿００１２５４６３５．１に由来する）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質とフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、十分に混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を５０μｇ腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、融合を準備した。

【0114】

１．２、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０を採取し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔＮｏ．１１９６５）で細胞を懸濁してからカウントした。必要な数の細胞を取って、上記の不完全培養液で２回洗浄した。同時に、脾臓免疫細胞懸濁液を製造し、不完全培養液で２回洗浄した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを１：１０又は１：５の割合で混合し、５０ｍＬのプラスチック遠心管において不完全培養液で１２００ｒｐｍ、８分間にて１回洗浄した。上澄みを捨てて、スポイトで残留の液体を吸い取った。手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。４０℃のウォーターバスに置いて予熱した。１ｍＬのピペットで１分間程度（最適時間は４５秒）かけて４０℃に予熱した４５％のＰＥＧ－４０００（ｐＨ８．０、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔＮｏ．Ｐ７１８１）を１ｍＬ加えながら穏やかに撹拌し（ピペットで撹拌し）、目視で観察したところ粒子が見られた。ＰＥＧの作用を終止するように、１０ｍＬのピペットで９０秒間かけて３７℃に予熱した不完全培地を２０～３０ｍＬ加えた。２０～３７℃で１０分間静置した。１０００ｒｐｍ、５分間にて上清を捨てた。５ｍＬのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔＮｏ．１Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を加え、沈殿細胞を穏やかに吹きつけて（融合した細胞がばらばらにならないように強く吹きつけることはしない）、懸濁させて均一に混合し、次いで、ＨＡＴ培地を８０～１００ｍＬまで補給した（脾臓細胞の濃度を１～２×１０^６／ｍＬとした）。９６ウェル細胞培養プレートに０．１ｍＬ／ウェルで分注した。２４ウェルプレートに１．０～１．５ｍＬ／ウェルで分注した。次いで、培養プレートを３７℃、６％のＣＯ_２インキュベータに置いてインキュベートした。通常、６枚の９６ウェルプレートに撒いた。５日後にＨＡＴ培地で１／２培地と交換した。さらに７～１０日後にＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＴ、ＳｉｇｍａｃａｔＮｏ．Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と交換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を常に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。

【0115】

１．３、クローンのスクリーニング及び同定
ＥＬＩＳＡは、ハイブリドーマの培養上清での抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体をスクリーニングするために使用された。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（コーニング社、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＰＤ－Ｌ１（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照（免疫マウスの陽性血清（ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質による免疫を経た））を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍでの強弱によって抗ヒトＰＤ－Ｌ１結合抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。

【0116】

ＥＬＩＳＡにより、陽性クローンから分泌される抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の結合をブロッキングできるか否かを測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃをコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体サンプル及び陽性対照であるアテゾリズマブを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４０ｎＭ（最終濃度は２０ｎＭ）のビオチンで標識したＰＤ－１－Ｆｃ（ＢｅｉｊｉｎｇＨａｎｍｉＰｈａｒｍ社）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ／ビオチンで標識したＰＤ－１－Ｆｃの結合を阻害することができる抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体は中和活性を有する。ブロッキング能力の強弱によって抗ヒトＰＤ－Ｌ１中和抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。

【0117】

結果を図１のＡに示し、３４－３５番号のクローンは、強いヒトＰＤ－Ｌ１結合活性を有し、図１のＢに示すように、３４－３５番号のクローンは、強いヒトＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を同時に有し、アテゾリズマブよりやや強い。

【0118】

１．４、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及び抗原中和活性を併せ持つクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、メーカーの説明書に従ってＲＮＡｐｒｅｐＰｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４３０）を使用して細胞ｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＱｕａｎｔＳｃｒｉｐｔＲＴキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＫＲ１０３）を使用してｃＤＮＡの第１鎖を合成した。逆転写により産生されたｃＤＮＡの第１鎖は、後続するＰＣＲ反応に使用された。

【0119】

ＰＣＲ反応に使用されたプライマーを表５に示す。

【0120】

【表5】

【0121】

プライマーを使用する場合、重鎖可変領域プライマー（ＶＨｐｒｉｍｅｒ）のうちのいずれかの上流プライマーは、いずれかの下游プライマーと組み合わせて使用されてもよい。同様に、軽鎖可変領域プライマー（ＶＬｐｒｉｍｅｒ）のうちのいずれかの上流プライマーもいずれかの下游プライマーと組み合わせて使用されてもよい。ＰＣＲ増幅により得られた目的バンドをｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングした。モノクローナルを採取してＤＮＡシーケンシングを行った。

【0122】

実施例２抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体の製造
ＰＣＲ増幅により得られた抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８に示され、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９に示される。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．２０、２１及び２２に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ．２３、２４及び２５に示される。上記の軽鎖及び重鎖をコードする可変領域配列を抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域の配列と連結した真核細胞発現ベクターＸ０ＧＣにそれぞれクローニングし、抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２６に示され、抗体の重鎖定常領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２７に示される。抗体重鎖全長配列（重鎖全長配列は、抗体の重鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ．２７とを連結してなるものである）及び抗体軽鎖全長配列（軽鎖全長配列は、抗体の軽鎖可変領域とＳＥＱＩＤＮＯ．２６とを連結してなるものである）を含む発現ベクターをそれぞれＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）細胞、カタログ番号Ａ２９１２７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を３５＊１０^５細胞／ｍＬの接種密度で接種した。トランスフェクションの当日に、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００－０１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を６０＊１０^５細胞／ｍＬの希釈密度で希釈した。トランスフェクション体積に従ってプラスミドを取り出し、プラスミドの最終濃度を０．５μｇ／ｍＬとし、ＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）ＳＦＭ培地（ＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）ＳＦＭ、カタログ番号１２３０９－０１９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプラスミドをトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。６．４倍のプラスミドの量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取り出し、ＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）ＳＦＭ培地でトランスフェクション試薬をトランスフェクション体積の４％になるように希釈し、転倒混和した。希釈後のトランスフェクション試薬を希釈されたプラスミドに加えて、穏やかに混合し、室温で１～５ｍｉｎ静置し、細胞に徐々に滴下した。その後、細胞インキュベータ（ＣＯ_２濃度は８％）に入れ、シェーカーで１２０ｒｐｍ、３７℃にて２０時間インキュベートした。０．００６倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）エンハンサー（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＨＯＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ、カタログ番号Ａ２９１２９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．２４倍のトランスフェクション体積のＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ（ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）Ｆｅｅｄ、カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に徐々に滴下した。１２０ｒｐｍのシェーカーに入れて３２℃でインキュベートした。遠心により１０日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。

【0123】

ＥＬＩＳＡにより発現量を測定した。クロマトグラフィーカラムによる精製の前に、０．２μｍのフィルター膜によるろ過により沈殿を除去した。このステップを４℃で行った。

【0124】

実施例３抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体とヒトＰＤ－Ｌ１との結合活性及び結合動力学的定数
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＰＤ－Ｌ１との結合活性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１（シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈した抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体サンプル及び陽性対照であるアテゾリズマブを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0125】

結果を図２に示し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体は、優れたヒトＰＤ－Ｌ１結合親和性を有し、アテゾリズマブの結合活性と類似した。

【0126】

ＢｉａｃｏｒｅＸ１００機器により抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＰＤ－Ｌ１との結合動力学的定数を測定した。この機器は、光学の表面プラズマ共鳴技術によりバイオチップに結合及びコーティングされた分子と被験分子との間の結合及び解離を測定した。結合動力学的定数及び解離動力学的定数は、ＢｉａｃｏｒｅＸ１００評価用ソフトウェア（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅ）により分析及び算出した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラ抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表６に示す。データによると、アテゾリズマブよりも、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体は、ＰＤ－Ｌ１とより速く結合することができ、解離速度が同等であることが示された。

【0127】

【表6】

【0128】

実施例４抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体の種結合特異性及び標的結合特異性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体の種結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１、サルＰＤ－Ｌ１、ラットＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－Ｌ１（いずれもシノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈した抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0129】

ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体の標的結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ２（いずれもシノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで段階希釈した抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体サンプル及び対照を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0130】

結果を図３のＡに示し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びサルＰＤ－Ｌ１と結合することができ、且つ親和性が類似したが、ラットやマウスＰＤ－Ｌ１と結合せず、種結合特異性を示す。同時に、図３のＢに示すように、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体は、強い標的結合特異性をさらに有し、ＰＤ－Ｌ１のみと結合し、Ｂ７ファミリーの他のメンバーと結合せず、ＣＤ２８ファミリーメンバーとも結合しない。

【0131】

実施例５抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合へのブロッキング活性
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃをコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラ抗体サンプル及び陽性対照を５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４０ｎＭ（最終濃度は２０ｎＭ）のビオチンで標識したＰＤ－１－Ｆｃを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0132】

結果を図４に示し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体は、アテゾリズマブと類似したＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合へのブロッキング活性を有する。

【0133】

実施例６抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体のＴ細胞機能への調節活性
実験に使用された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌｏｎｚａから購入され、カタログ番号は、ＣＣ－２７０２であった。

【0134】

まず、ＰＢＭＣによりＤＣ細胞を誘導した：ＰＢＭＣを完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で蘇生し、次いで、対応する無血清培地で１回洗浄し、無血清培地に再懸濁させ、細胞培養ボトルに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータに置いてインキュベートした。９０分間後、非接着細胞及び培地を除去した。その後、完全培地＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（インターロイキン４）（シノバイオロジカル社）と交換して単核細胞をインキュベートし、３日後に培養液を１回交換し、さらに３日インキュベートし、次いで、培地を完全培地＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４＋２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子α）（シノバイオロジカル社）と交換して１日インキュベートして、ＤＣ細胞の誘導を完了させた。もう一つの個体由来のＰＢＭＣからＴ細胞を単離した：ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ社からのＰａｎＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（カタログ番号５１５０４１４８２０）によりＴ細胞を単離し、具体的な実験過程は、明細書を参照する。誘導された成熟したＤＣ細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで接種し、さらに単離されたＴ細胞を１００，０００細胞／ウェルで加え、最後に被験サンプルを加え、１２０時間共にインキュベーションした。インキュベート終了後、上清を取って、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈから購入されたＥＬＩＳＡキットによりＩＦＮ－γのレベルを検出した。

【0135】

結果を図５に示し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体を混合リンパ球インキュベーションに入れて、ＩＦＮ－γの分泌を増強させることができ、アテゾリズマブよりやや強いＴ細胞機能への調節活性を有する。

【0136】

実施例７抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体の製造
抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、ＭｏｌｅｃｕｌｅＩｍｍｕｎｏｌ３２：１４１３－２７）の方法により得られたものである。ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＫＶ１－３３＊０１であり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２８に示される。重鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＨＶ１－６９＊０１であり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２９に示される。マウス由来抗体のＣＤＲ領域を選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域及び移植したヒト化抗体の重鎖可変領域を得た。さらに特定のサイトを選択して軽鎖フレームワーク領域に対して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、配列ＳＥＱＩＤＮｏ．３８、３９及び４４に示され、さらに特定のサイトを選択して重鎖フレームワーク領域に対して復帰突然変異を行って、得られた重鎖可変領域配列は、配列ＳＥＱＩＤＮｏ．３０－３７及び４０－４３に示される。さらに配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２４に示すＨＣＤＲ２上のＮＧサイトに対して突然変異を行うことにより脱アミド可能なサイトを除去して、突然変異した重鎖ＨＣＤＲ２が得られ、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４５－４７に示される。ＳＥＱＩＤＮＯ．３６に示す重鎖可変領域のＨＣＤＲ２が突然変異した後の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４８－５０に示される。ＳＥＱＩＤＮＯ．４１に示す重鎖可変領域のＨＣＤＲ２が突然変異した後の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５１－５３に示される。軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２６）とを連結させて、それぞれ対応する軽鎖全長配列が得られ、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２７）とを連結させて、それぞれ対応する重鎖全長配列が得られた。ヒト化配列を表７に示す。ヒト化抗体における重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬの例示的な組み合わせを表８に示す。ヒト化抗体の親和性データ（解離定数）を表９に示す。

【0137】

【表7】

【0138】

【表8】

【0139】

【表9】

【0140】

実施例８抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体の熱安定性
ＷａｔｅｒｓｘｂｒｉｄｇｅＢＨＥ２００３．５ｕｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍクロマトグラフィーカラム（カタログ番号：１８６００７６４０）を使用した。移動相は以下の通りであった：０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、０．１ｍｏｌ／Ｌの硫酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．７。流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；クロマトグラフィーカラム温度：２５℃；サンプルセル温度：４℃；検出波長２８０ｎｍとして；サンプルを１ｍｇ／ｍＬになるようにサンプル緩衝液で希釈し、サンプリング体積を１０μＬとした。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションを使用して実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法により純度である主ピークの割合を算出した。これらのモノクローナル抗体の熱安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＳＥ－ＨＰＬＣ検出を行うことにより、熱安定性を観察し、結果を表１０に示す。ヒト化の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体は、ＶＬＳ１０－ＶＨＳ７Ｐ２以外に、いずれも良好且つ同等な安定性を示した。

【0141】

【表10】

【0142】

実施例９抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体のインビトロでの生物学的活性
ヒトＰＤ－Ｌ１との結合活性、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１結合及びＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０へのブロッキング活性、ヒトＰＤ－Ｌ１との結合動力学的定数を含む抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体のインビトロでの生物学的活性を測定した。測定したヒト化配列は、ＶＬＳ１０－ＶＨＳ７、ＶＬＳ１０－ＶＨＳ７Ｐ１、ＶＬＳ１０－ＶＨＳ７Ｐ２、ＶＬＳ１０－ＶＨＳ７Ｐ３、ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２、ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２Ｐ１、ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２Ｐ２、ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２Ｐ３、対照であるアテゾリズマブ及び抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体を含む。具体的な実験方法は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体のインビトロでの生物学的活性の測定方法と同じであった。

【0143】

実験結果を表１１及び表１２に示す。抗ヒトＰＤ－Ｌ１キメラモノクローナル抗体に比べて、測定されたヒト化配列は、いずれも活性を良好に維持し、強いＰＤ－Ｌ１結合活性及びＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０へのブロッキング活性を示し、中でもＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２－Ｐ３配列が最も優れた。

【0144】

【表11】

【0145】

【表12】

【0146】

実施例１０抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体のヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウスでの薬物動態学的研究
６～８週齢の雌ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、北京バイオサイトジェンバイオテクノロジー社から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２Ｐ３を７０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回腹腔内投与した。０時、投与後から６時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、３１２時間で採血点ごとに２匹のマウスの眼窩静脈叢から採血し、抗凝固処理を行うことなく室温で血液サンプルを３０分間～１時間放置し、凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、得られた血清サンプルを－８０℃で冷凍保存し、測定に供した。

【0147】

ＥＬＩＳＡにより血清中の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体の濃度を測定した。簡単に言えば、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、高吸着型ＥＬＩＳＡプレートにヒト組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的な結合を防ぐために、５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳＴでこのプレートをブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。次いで、１０％の混合したマウス血清及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した被験血清サンプルを入れて２５℃にて１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでこのプレートを洗浄した。５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳＴで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を加え、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでこのプレートを洗浄した。最後に、発色基質ＴＭＢを使用して発色させ、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を加え、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0148】

結果を図６に示し、単回の腹腔内投与量が７０ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウスのインビボで優れた血中薬物濃度－時間曲線及び薬物動態学的特徴を示した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体の薬物動態パラメーターは以下の通りである：半減期ｔ_１／２は１３０時間であった；血中薬物濃度－時間曲線下面積ＡＵＣ_{０－３１２ｈｒ}は７７９１７ｎＭ．ｈｒであった；見かけの分布容積Ｖ_ｄは１４７ｍＬ／Ｋｇであった；クリアランスＣＬは０．７８ｍＬ／ｈｒ／ｋｇであった；平均滞在時間ＭＲＴ_ｌａｓｔは９０時間であった。

【0149】

実施例１１抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体のヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウスでの抗腫瘍薬力学的研究
本実施例において、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体の、ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウスに接種したＭＣ３８／ヒトＰＤ－Ｌ１腫瘍移植体の成長への阻害作用を検出した。

【0150】

６～８週齢の雌ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、北京バイオサイトジェンバイオテクノロジー社）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０^５個のＭＣ３８／ヒトＰＤ－Ｌ１（北京バイオサイトジェンバイオテクノロジー社）を接種し、それは、構築されたヒトＰＤ－Ｌ１を発現させるマウス結腸直腸癌細胞であった。腫瘍体積が約１５０ｍｍ^３まで達した場合、腫瘍体積によって各群６匹のマウスずつ群分けて、それぞれ溶媒対照群、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体ＶＬＳ１５－ＶＨＳ１２Ｐ３投与群に設定した。７０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週間連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２）／２であった。

【0151】

結果を図７に示し、抗ヒトＰＤ－Ｌ１ヒト化モノクローナル抗体は、抗腫瘍活性を有し、ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１両遺伝子ノックインマウスに接種したＭＣ３８／ヒトＰＤ－Ｌ１移植腫瘍の成長を著しく阻害した。

【0152】

最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。

【図1】