特表2024-503396ＣＤ４７と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-25
(54)【発明の名称】ＣＤ４７と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240118BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240118BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240118BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240118BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240118BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240118BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240118BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240118BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240118BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240118BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240118BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240118BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240118BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20240118BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240118BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20240118BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240118BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240118BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240118BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240118BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P1/02
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P11/00
A61P11/02
A61P11/04
A61P13/08
A61P13/10
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P25/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 105
A61K35/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541809
(86)(22)【出願日】2022-01-07
(85)【翻訳文提出日】2023-07-10
(86)【国際出願番号】 CN2022070626
(87)【国際公開番号】W WO2022148412
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】202110025288.8
(32)【優先日】2021-01-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516082925
【氏名又は名称】北京韓美薬品有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＡＮＭＩ ＰＨＡＲＭ． ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 洋
(72)【発明者】
【氏名】▲顧▼ 明月
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲曉▼春
(72)【発明者】
【氏名】王 礼翠
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 家望
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲キョン▼ 祐
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA13
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4C084ZB271
4C085AA14
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4C085BB34
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4C085BB36
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4C085BB43
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
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4C087BB65
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4C087ZA59
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4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA23
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ４７と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。当該抗体及びその抗原結合フラグメントは、特異性及び安定性が高く、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα経路を特異的にブロッキングすることができ、且つ、一定の濃度範囲内で赤血球凝集を引き起こさず、インビボで腫瘍の成長を著しく阻害することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントであって、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すＬＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すＬＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示すＬＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含み、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示すＨＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有するＨＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有するＨＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含む、
抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれ、好ましくは、前記重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記軽鎖定常領域配列は、κ鎖の定常領域配列から選ばれる、請求項１又は２に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６のいずれか１つに示される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその機能的フラグメント。
【請求項5】
前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有し、及び／又は前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示すアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
（１）請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸；から選ばれる、単離された核酸分子。
【請求項10】
効果的にライゲーションした請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項12】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。
【請求項13】
請求項１１に記載の宿主細胞を、前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
【請求項14】
ＣＤ４７を介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞の使用であって、前記疾患又は病症は、好ましくは腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、ＣＤ４７と特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）とも呼ばれ、免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、その構造は、主に細細胞外免疫グロブリンの可変領域様ドメイン、疎水性の高い５回膜貫通領域及び選択的スプライシングによる細胞内カルボキシル末端の細胞質尾部領域を含む。ＣＤ４７は、細胞表面に広く発現しており、シグナル調節タンパク質ＳＩＰＲα、インテグリン及びトロンボスポンジンＴＳＰ１と結合することができ、多種の生理機能に関連し、その主な作用は、貪食細胞の表面のＳＩＰＲαと結合することでマクロファージの貪食作用を阻害することである。ＳＩＰＲαも免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、細胞内領域にチロシンに富んだ免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。ＣＤ４７がマクロファージの表面のＳＩＰＲαと結合すると、ＩＴＩＭはリン酸化して下流分子ＳＨＰ１／ＳＨＰ２と結合し、ファゴサイトーシスシナプスサブメンブレン（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｓｙｎａｐｓｅ ｓｕｂｍｅｍｂｒａｎｃｅ）へのミオシンの蓄積を阻止して貪食作用を阻害する。通常、ＣＤ４７は「自己」のシグナルであり、「私を食べないで」を示し、貪食作用による自己攻撃を阻害することができる。病理的状況では、ＣＤ４７は、腫瘍細胞に高発現しており、腫瘍細胞が貪食細胞の監視から逃れるのに寄与する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８（５４７３）：２０５１－２０５４；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，１１（３）：１３０－１３５．）。
【0003】
腫瘍研究によると、ＣＤ４７は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌及び他の固形腫瘍を含む多種のヒト腫瘍で発現することが発現された。腫瘍細胞は、ＣＤ４７の高発現を向上させてＳＩＰＲαと結合させることにより、マクロファージの免疫監視から逃れる。このため、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα間の相互作用（ＣＤ４７抗体又はＳＩＰＲα－Ｆｃ）をブロッキングすることにより、腫瘍に対するマクロファージの貪食作用を活性化するとともに、ＤＣ細胞よりＣＤ８＋Ｔ細胞へ抗原を提示することで腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的な殺傷作用を発揮することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２，２４（２）：２２５－２３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，２１（１０）：１２０９．）。
【0004】
ほとんどの腫瘍細胞にＣＤ４７が発現しているので、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα経路をブロッキングする抗体は、適用の見通しが広く、抗腫瘍への適用も広い。研究によると、ＣＤ４７は免疫チェックポイントとしており、ＣＤ４７抗体と他の免疫チェックポイントであるＣＴＬＡ４／ＰＤ－１に対する薬剤とを併用することにより薬効を増強させることができる。しかし、赤血球にもＣＤ４７が発現しているので、ＣＤ４７抗体の安全性を考慮する必要がある。研究によると、マクロファージが貪食作用を発揮するには、ＣＤ４７の「私を食べないで」というシグナルをブロッキングすることに加えて、カルレチクリン（ＣＲＴ）を介した「私を食べて」というシグナルが必要となる。通常の場合、カルレチクリンは、腫瘍細胞において高発現するが、正常な細胞に発現しない。また、ＣＤ４７抗体をスクリーニングする場合、赤血球の凝集を起こさない抗体を選択し、且つ、抗体としてＩｇＧ４型を採用すれば、マクロファージによる赤血球への貪食を活性化することができない。この分野は依然としてＣＤ４７抗体に対する需要がある。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様によれば、本発明は、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体に関し、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、ここで、
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個又は４個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個又は４個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0006】
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
【0008】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９又は１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１又は１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される。
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される。
【0010】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれかに示され、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれかに示され、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0011】
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される。
【0012】
本分野において、同一性が言及される場合、アミノ酸配列の長さは自然数でなければならないので、実際に計算して得られた同一性の数値は９５％のような有限の位のパーセントではなく、９５％のようなパーセントに近い数字である可能性があり、例えば１１７位のアミノ酸残基の可変領域配列について、１つだけのアミノ酸残基が変化した場合、それに対応する同一性のパーセントは実際には９９．１５％に近いパーセントであるが、便宜上、このような数字は本明細書では単に９９％と表記することは周知されている。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである。
【0014】
本発明の他の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する：
（１）上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
（１）上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
【0015】
本発明の別の態様は、効果的にライゲーションした上記のような核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
【0016】
本発明の一態様は、上記のような核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【0017】
本発明の別の態様は、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物に関する。
【0018】
本発明の別の態様は、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体を生産する方法に関し、前記方法は、
上記のような宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
上記のような宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
【0019】
本発明の別の態様は、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞の使用に関する。
【0020】
本発明の別の態様は、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞に関する。
【0021】
本発明の別の態様は、必要とする被験者に、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞を投与するステップを含む、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療する方法に関する。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記移植体に対する免疫応答は、例えば移植片対宿主病を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記アレルギー反応は、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。
【0025】
いくつかの実施形態において、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指す。病原性ウイルスの例として、例えばＨＩＶ、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ及びＣＭＶ、ＥＢウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルスを含む。病原性細菌は、例えば梅毒トレポネーマ、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、変形菌、セラチア菌、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ、枯草菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ属細菌及びボレリア・ブルグドルフェリを含む。病原性真菌は、例えばカンジダ菌（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスぺルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。病原性寄生虫は、例えば赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属の生物種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属の種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア原虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ）及びブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病及びハンチントン病から選ばれる１種又は複数種である。
【0027】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
【0028】
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び／又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
【0030】
言い換えれば、本発明は、ハイブリドーマ手段により抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を得るとともに、赤血球凝集を起こさない抗体をスクリーニングした。ＩｇＧ４型の抗体を採用することにより、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα経路を特異的にブロッキングでき且つ一定の濃度範囲内で赤血球凝集を起こさないヒト化のＩｇＧ４抗体を得ることができる。
【0031】
本発明により提供される抗体及びその機能的フラグメントは、１ｎＭ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７と特異的に結合でき、ＣＤ４７と受容体との結合をブロッキングする活性を有し、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を媒介し、及び／又は赤血球凝集を起こさず、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍などを予防及び／又は治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
【図1】実施例１における抗ヒトＣＤ４７陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７マウス由来モノクローナル抗体のインビトロ活性を示す。ここで、図１のＡは、マウス由来モノクローナル抗体とＣＤ４７との結合活性を示す。図１のＢは、マウス由来モノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図2】実施例１における抗ヒトＣＤ４７陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７マウス由来モノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図3】実施例３における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体とヒトＣＤ４７との結合活性を示す。
【図5】実施例５における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図6】実施例６における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体を介した、腫瘍細胞への貪食活性を示す。
【図7】実施例７における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図8】実施例８における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍効果を示す。
【図9】実施例１０における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体の抗原結合活性を示す。
【図10】実施例１１における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図11】実施例１３における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図12】実施例１６における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
定義
用語「ＣＤ４７」とは、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）を指し、任意の哺乳動物由来のＣＤ４７分子であってもよく、いくつかの実施形態において、霊長類動物由来のＣＤ４７分子であり、いくつかの実施形態において、ヒト由来のＣＤ４７分子であってもよい。
用語「ＣＤ４７」とは、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）を指し、任意の哺乳動物由来のＣＤ４７分子であってもよく、いくつかの実施形態において、霊長類動物由来のＣＤ４７分子であり、いくつかの実施形態において、ヒト由来のＣＤ４７分子であってもよい。
【0034】
本明細書で使用される用語「抗ＣＤ４７抗体」、「抗ＣＤ４７」、「ＣＤ４７抗体」又は「ＣＤ４７と結合する抗体」とは、当該抗体がＣＤ４７を標的とする診断剤及び／又は治療剤として使用できるようにＣＤ４７タンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、異種のＣＤ４７における保存されたＣＤ４７のエピトープと結合する。
【0035】
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖のジスルフィド結合の数及び位置の違いによって、異なるサブクラスに分けることもでき、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブタイプに分けられてもよく、ＩｇＡは、ＩｇＡ１とＩｇＡ２のサブタイプに分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
【0036】
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【0037】
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体及び古典補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ）に細かく分けられてもよく、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲドメイン及び４つのＦＲドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で配列される。
【0038】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
【0039】
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
【0040】
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する可能性がある、天然に発生する突然変異以外に同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、２種以上のＦａｂドメインから構成されてもよく、これにより、２種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法（例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）に限定されるものではない。
【0041】
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」又は「ＢｓＡｂ」とは、２個の異なる抗原結合部位を有するものを指し、２つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の２つのアームは、それぞれＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ又はｄＳＦｖなどに由来してもよい。
【0042】
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基（「エピトープ」）に対する異なる抗体の調製物を指す。
【0043】
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す（例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい）。抗原結合フラグメントは、このような抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つのＣＤＲドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての６つのＣＤＲドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、１本のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であってもよく、又は、１本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖（それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する）（例えば、二重抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなど）の一部であってもよく、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
【0044】
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂ’又はＦａｂフラグメント；（ｂ）ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｃ）ＶＨ領域及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント；（ｄ）抗体の１つのアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｅ）遺伝工学的手法により抗体ＶＨ及びＶＬを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）；（ｆ）基本的にＶＨ領域からなり且つドメイン抗体（Ｈｏｌｔなど，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２ｉ（ｌｌ）：４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｇ）ラクダ又はナノ抗体（Ｒｅｖｅｔｓなど，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，５（ｌ）：１１１－２４）及び（ｈ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【0045】
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し且つ１つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、１種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含む抗体を指す。
【0046】
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレームワーク領域修飾を行うことができる。
【0047】
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」（「ｈｕｍＡｂ）又は「ＨｕＭａｂ」）とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）。
【0048】
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。
【0049】
このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と７０％又はそれ以上（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列（即ち、本願で挙げられた配列）の全長に対して計算して得られたものである。
【0050】
ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（登録商標）又はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．,Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２，アメリカ合衆国保健福祉省；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７に従って、本発明におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
【0051】
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域（即ち、エピトープ）と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び／又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０－７Ｍ、例えば１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又はそれ以上の親和性でヒトＰＤ－Ｌ１と結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で（例えば、インビボで）結合する。このため、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び／又はこのような条件でＰＤ－Ｌ１と結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
【0052】
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約１０－６Ｍ又はそれ以下のＫＤに対応する親和性で結合することを指し、このＫＤは、指定された抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍低い。
【0053】
本明細書で使用されるように、用語「ｋｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【0054】
本明細書で使用されるように、用語「ｋａ」（Ｍ－１ ｘ ｓｅｃ－１又は１／Ｍｓｅｃ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【0055】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」（Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つｋｄをｋａで割ることにより得られるものである。
【0056】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＡ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つｋａをｋｄで割ることにより得られるものである。
【0057】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲの一部（即ち、結合に必要なＣＤＲ残基サブグループ、ＳＤＲと呼ばれる）のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び／又は経験に応じて、又はＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．など，（２００４），ＳＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｕｍａｎ ＧｅｒｍＬｉｎｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｔｏ Ｍｉｎｉｍｉｚｅ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１：８６３－８７２に記載されるように、先行研究に基づいて（例えばＣＤＲ Ｈ２における残基Ｈ６０－Ｈ６５が、通常、不要である）Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ以外に位置するＫａｂａｔ ＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔなど，（１９９２），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，公開番号９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．など，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７を参照されたい）から関連するエピトープと接触しなく且つＳＤＲに位置しないＣＤＲ残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、１つ又は複数のドナーであるＣＤＲ残基が存在しなく又はドナーであるＣＤＲ全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスのアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが好ましい。経験に応じてＣＤＲ内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
【0058】
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．など，（１９８２），Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））７９（６）：１９７９－１９８３）、代替可能な機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定することができる。このような変異体ＣＤＲを得るための好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して（例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により）置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列における関連する残基の身元と置換された（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の身元とを比較することにより、この置換されたＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊの置換スコアを同定することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いる（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，（２００４），Ｗｈｅｒｅ Ｄｉｄ Ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ６２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｅ Ｆｒｏｍ？，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，（１９９２），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．など，（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅｓ），ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｆｒｏｍ Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９、５５５－５６５。現在、最も先進的なＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる）。例えば、得られたＣＤＲを含む抗原結合フラグメントがＰＤ－Ｌ１と結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸（Ｅ）であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、０であり、且つ、より保存的な変化（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン）は、好ましいものである。
【表1】
【0059】
そこで、本発明は、改良されたＣＤＲの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の３つの表における１つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
【0060】
【表2】
【表3】
【表4】
【0061】
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ及びＬｙｓから選ばれる。
【0062】
さらに、例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
【0063】
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって親抗体のＣＤＲの配列と異なることができ、例えば４、３、２又は１個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ領域におけるアミノ酸は、以上の３つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
【0064】
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
【0065】
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、７０％又はそれ以上（即ち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０又はそれ以上の本発明で開示される１つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
【0066】
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の１種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した（即ち悪化していない）疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
【0067】
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも１種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
【0068】
本発明の抗体は、組換えＤＮＡにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
【0069】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ誘導）により決定される。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗ＣＤ４７の抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のＩｇＧ抗体は、クラスを本発明のＩｇＭ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプの切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４抗体である。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
【0070】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはＩｇＧ抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体－抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
【0071】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、一価抗体であり、好ましくは、ＷＯ２００７０５９７８２（その全体が引用により本明細書に援用される）に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗ＣＤ４７抗体は、以下の方法により構築される：ｉ）一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗ＣＤ４７抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、ＩｇＧ１サブクラスの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このＣＬ領域は、このＣＬ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない；ｉｉ）一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び（例えばＩｇサブクラスに要求される）ＣＨ領域の他の領域（例えばＣＨ３領域）に対応する領域には、ヒトＩｇのＣＨ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている；ｉｉｉ）一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞で（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
【0072】
同様に、いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、一価抗体であり、
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
【0073】
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
【0074】
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、Ｎ－結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まれていない。
【0075】
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗ＣＤ４７結合領域（例えば、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７結合領域）は、１種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である（例えば、第２のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えた、改善された細胞転移作用を示す）。このため、他の実施形態において、抗ＣＤ４７抗体の一価Ｆａｂは、他の異なるタンパク質を標的とするＦａｂ又はｓｃｆｖに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗ＣＤ４７結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
【0076】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のＦｖドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供し、ここで、本発明の抗ＣＤ４７抗体のＦｖ中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド（典型的には、約１０、１２、１５又はそれ以上のアミノ酸残基）で連結されて１本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばＵＳ ４，９４６，７７８；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ：２６９－３１５（１９９４）；Ｂｉｒｄなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２,４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎなど，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５,５８７９－５８８３（１９８８及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４８,５５２－５５４（１９９０）に記載されている。単一のＶＨ及びＶＬだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、２つのＶＨ及びＶＬを使用する場合、二価のものであり、又は、２つ以上のＶＨ及びＶＬを使用する場合、多価のものである。
【0077】
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで製造された装置）を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えＤＮＡ技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
【0078】
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び／又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗ＣＤ４７抗体に関連するＣＤ４７選択性及び／又はＣＤ４７特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。１つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。１種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ（例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列におけるＮ－結合型グリコシル化作用）、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばＷａｌｋｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｎ ＣＤ－Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
【0079】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばＵＳ ４，７６６，１０６；ＵＳ ４，１７９，３３７；ＵＳ ４，４９５，２８５及びＵＳ ４，６０９，５４６を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量は約１，０００～４０，０００Ｄの間、例えば約２，０００～２０，０００Ｄの間、例えば約３，０００～１２，０００ＤのＰＥＧ）を含む。
【0080】
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているかか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人（例えば１８歳以上の被験者）である。他の実施形態において、被験者は、子供（例えば、１８歳以下の被験者）である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
【0081】
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
【0082】
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
【0083】
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラス）、ＩｇＭ及びＩｇＥ；抗原結合フラグメント、例えばＳＤＲ、ＣＤＲ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体又はナノ抗体；抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体をさらに含む。
【0084】
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
【0085】
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（１組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む）を含む任意の適切なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよい。このようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば線形発現要素（例えばＳｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、小型核酸ベクター（例えばＵＳ ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載されている）、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８又はｐＵＣ１１８／１１９）、最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉなど，ＭｏＩ Ｔｈｅｒ，３，７９３－８００（２００１）に記載されている）を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばＣａＰＯ４沈殿型構築物（例えばＷＯ００／４６１４７；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１－５５（１９８６）；Ｗｉｇｌｅｒなど，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２，６０３（１９８１）に記載されている）としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである（例えばＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。
【0086】
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを含む。
【0087】
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター（例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）を含むベクターを含む（レビューとして、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌなど，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｇｒａｎｔなど，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３，５１６－５４４（１９８７）；Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．など，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８２４，３２９－３５８（２０１２）；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．など，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３０（５），１１０８－１１１８（２０１２）；Ｌｉ，Ｐ．など，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４２（２），１０５－１２４（２００７）；Ｂoｅｒ，Ｅ．など，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（３），５１３－５２３（２００７）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３５９－３６６（２００２）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３４９－３５７（２００２）を参照されたい）。
【0088】
本発明の発現ベクターにおいて、抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー及びＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸は、構成型プロモーター（例えばＣＭＶ ＩＥ）に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
【0089】
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素）を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
【0090】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ細胞系、ＢＨＫ－２１細胞系、マウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）、繊維肉腫細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系、ＨＫＢ－１１細胞系、ＣＡＰ細胞系及びＨｕＨ－７ヒト細胞系で産生することができる（Ｄｕｍｏｎｔなど，２０１５，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｓｅｐ．１８，１－１３．、その内容が引用により本明細書に援用される）。
【0091】
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、例えばプロテインＡ－セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
【0092】
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
【0093】
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に．．．からなる」ことは、少なくとも１種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
【0094】
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体をさらに含む。
【0095】
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関（例えばＦＤＡオフィスやＥＭＡ）に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
【0096】
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
【0097】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体（即ち、抗体がグリコシル化されていない）を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のＡＤＣＣ活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Ｃｏなどの米国特許Ｎｏ．５，７１４，３５０及びＮｏ．６，３５０，８６１（引用により本明細書に援用される）には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、ＨａｎｇなどのＥＰ１１７６１９５（引用により本明細書に援用される）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ開示ＷＯ０３／０３５８３５（引用により本明細書に援用される）には、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、それらは、フコースをＡｓｎ（２９７）が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．など，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。ＵｍａｎａなどのＰＣＴ開示ＷＯ９９／５４３４２（引用により本明細書に援用される）には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の向上をもたらすことが記載されている（Ｕｍａｎａなど，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照されたい）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的ＣＨＯ哺乳動物細胞を説明した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。又は、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる（例えばＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照されたい）。
【0098】
本発明の抗体は、ヒトＣＤ４７に作用し、ヒト腫瘍細胞表面でのＣＤ４７発現を特異的に認識することにより、ＣＤ４７と受容体ＳＩＲＰαとの結合により伝達される抑制的なシグナル経路をブロッキングすることができ、マクロファージを介した腫瘍貪食反応を促進することができ、これにより、腫瘍に対する免疫治療に新たな方法を提供する。本発明の抗体は、例えば関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎などの自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症及びクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性疾患、及び例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌及び黒色腫などの腫瘍を予防及び／又は治療するために使用されてもよい。
【0099】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下のような技術案に関する。
【0100】
第１発明は、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体であって、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、ここで
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
【0101】
第２発明は、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる、第１発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体であって、
好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
【0102】
第３発明は、ＣＤ４７キメラ抗体又はその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９又は１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１又は１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であることを特徴とする第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であることを特徴とする第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0103】
第４発明は、前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0104】
第５発明は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれか１つに示され、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれか１つに示され、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される、第１又は第２発明に記載の前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される、第１又は第２発明に記載の前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0105】
第６発明は、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである、第１～第５発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0106】
第７発明は、以下から選ばれる単離された核酸分子である。
【0107】
（１）第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
【0108】
第８発明は、効果的にライゲーションした第７発明に記載の核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
【0109】
第９発明は、第７発明に記載の核酸分子又は第８発明に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【0110】
第１０発明は、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第７発明に記載の核酸分子、第８発明に記載のベクター又は第９発明に記載の前記宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤及び／又はベクターを含む組成物である。
【0111】
第１１発明は、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体を生産する方法であって、当該方法は、第９発明に記載の宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
【0112】
第１２発明は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第７発明に記載の核酸分子、第８発明に記載のベクター又は第９発明に記載の宿主細胞の使用であって、
好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記移植体に対する免疫応答は、移植片対宿主病であり、好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指し、
好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記移植体に対する免疫応答は、移植片対宿主病であり、好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指し、
好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
【0113】
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の１０分の１、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が１つ又は２つの限界を含む場合、１つ又は２つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
【0114】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用することができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
【0115】
一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
【0116】
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者にとっては、以下の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎなく、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又は製造メーカにより提案される条件に従って行う。使用される試薬又は機器に製造メーカが明記されていないものは、市販から入手できる通常の製品である。
【0117】
実施例
実施例１ マウス由来抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物として、北京維通利華実験動物技術社（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）から購入された６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質及びフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離し、組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質に対し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質を腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）に１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０７６－ＣＶ）を加えて単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、０．２５μＭのＣｐＧ ＯＤＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－１８２６－１）を加えて２４ｈ刺激し、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気融合装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－００１０）を使用して電気融合を行った。
実施例１ マウス由来抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物として、北京維通利華実験動物技術社（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）から購入された６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質及びフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離し、組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質に対し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質を腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）に１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０７６－ＣＶ）を加えて単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、０．２５μＭのＣｐＧ ＯＤＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－１８２６－１）を加えて２４ｈ刺激し、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気融合装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－００１０）を使用して電気融合を行った。
【0118】
１．２、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院細胞バンクから購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁させてからカウントし、必要な数の細胞を取って、０．３Ｍのマンニトール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４２９）、０．１ｍＭの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７７７４）、０．１ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５６７０）からなるＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で２回洗浄し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。同時に、Ｅ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で脾臓細胞を２回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを一定の割合で混合し、５０ｍＬのプラスチック遠心管内においてＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で１回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。２ｍＬのＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液／（１－１．５）＊１０Ｅ７脾臓細胞でＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液を加え、１０ｍｍ間隔をあけた融合セル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－０１０７）ごとに２ｍＬの細胞混合液を加え、パラメータ設定をチェックし、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｒｔを押せばよい。融合後、滅菌条件下でビペットを用いて細胞懸濁液を融合槽から２８ｍＬのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を含有する５０ｍＬの遠心管に慎重に移し、３７℃で１０ｍｉｎ静置し、ＨＡＴ培地を細胞数（３－５）＊１０Ｅ４／ウェルで加えてプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。５日後にＨＡＴ培地で１／２培地と置換した。７～１０日後にＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と置換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院細胞バンクから購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁させてからカウントし、必要な数の細胞を取って、０．３Ｍのマンニトール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４２９）、０．１ｍＭの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７７７４）、０．１ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５６７０）からなるＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で２回洗浄し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。同時に、Ｅ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で脾臓細胞を２回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを一定の割合で混合し、５０ｍＬのプラスチック遠心管内においてＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で１回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。２ｍＬのＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液／（１－１．５）＊１０Ｅ７脾臓細胞でＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液を加え、１０ｍｍ間隔をあけた融合セル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－０１０７）ごとに２ｍＬの細胞混合液を加え、パラメータ設定をチェックし、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｒｔを押せばよい。融合後、滅菌条件下でビペットを用いて細胞懸濁液を融合槽から２８ｍＬのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を含有する５０ｍＬの遠心管に慎重に移し、３７℃で１０ｍｉｎ静置し、ＨＡＴ培地を細胞数（３－５）＊１０Ｅ４／ウェルで加えてプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。５日後にＨＡＴ培地で１／２培地と置換した。７～１０日後にＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と置換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
【0119】
１．３、クローンのスクリーニング及び同定
ＥＬＩＳＡを使用してハイブリドーマの培養上清での抗ヒトＣＤ４７抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって、抗ヒトＣＤ４７選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
ＥＬＩＳＡを使用してハイブリドーマの培養上清での抗ヒトＣＤ４７抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって、抗ヒトＣＤ４７選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
【0120】
ＥＬＩＳＡにより、陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７選択的抗体がＣＤ４７／ＳＩＲＰαの結合をブロッキングできるか否かを測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７選択的抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ヒトＣＤ４７－Ｆｃ／ビオチンで標識したＳＩＲＰαの結合を阻害することができる抗ヒトＣＤ４７選択的抗体は中和活性を有する。ブロッキング能力の強弱によって抗ヒトＣＤ４７中和抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
【0121】
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７中和抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１４１９０２５０）を加えた後、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号３８７９）に５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートした。その後、観察して撮影した。
【0122】
結果を表５に示し、複数の抗ヒトＣＤ４７クローンは強いＣＤ４７結合活性及びＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有し、その中、ＣＤ４７－１８－５クローンマウス由来モノクローナル抗体のインビトロ活性を図１に示す。赤血球凝集の結果を図２に示し、ＣＤ４７－５－６５、ＣＤ４７－８－２１、ＣＤ４７－１６－５クローンは、ヒト赤血球凝集を引き起こすことができるが、ＣＤ４７－５－１９１、ＣＤ４７－１８－５、ＣＤ４７－１８－１０クローンは赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0123】
【表5】
【0124】
１．４、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及び抗原中和活性を同時に有し且つインビトロで赤血球凝集を起こさないクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用して細胞ｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用してハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒトＣＤ４７ ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅用の可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）及びＶＬＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅により得られた目的バンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及び抗原中和活性を同時に有し且つインビトロで赤血球凝集を起こさないクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用して細胞ｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用してハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒトＣＤ４７ ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅用の可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）及びＶＬＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅により得られた目的バンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
【0125】
実施例２ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
ＣＤ４７－１８－５クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び７に示される。ＣＤ４７－１８－５クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－５クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものである。ＣＤ４７－１８－１０クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６及び８に示される。ＣＤ４７－１８－１０クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－１０クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものであり、得られたキメラ抗体の軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、重鎖定常領域の配列情報を表６に示す。
ＣＤ４７－１８－５クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び７に示される。ＣＤ４７－１８－５クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－５クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものである。ＣＤ４７－１８－１０クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６及び８に示される。ＣＤ４７－１８－１０クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－１０クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものであり、得られたキメラ抗体の軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、重鎖定常領域の配列情報を表６に示す。
【0126】
【表6】
【0127】
上記の抗体の軽・重鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して遺伝子合成（蘇州金唯智バイオテクノロジー社）を行うことにより、ヌクレオチド配列を得、さらに真核細胞の発現ベクターＸ０ＧＣにクローニングし、次いで、発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞系（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ、カタログ番号Ａ２９１３３、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。トランスフェクションの当日にカウントした細胞密度は、（７０－２００）×１０５細胞／ｍＬの範囲内にあり、生存率が９５％超えであるべきであった。予熱したＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地で細胞を希釈し、最終密度は６０×１０５細胞／ｍＬとした。トランスフェクション体積に従って、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ培地（カタログ番号１２３０９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、プラスミド及びトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ試薬（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は０．５μｇ／ｍＬとした。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、１～５ｍｉｎ静置し、その後、プラスミド－トランスフェクション試薬の複合物を細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯエンハンサー（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給し、細胞インキュベータは、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３２℃、５％ＣＯ２の条件とした。遠心により、１０日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
【0128】
実施例３ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体とヒトＣＤ４７との結合活性及び動力学的定数
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２（特許配列ＷＯ２０１６１０９４１５に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。結果を図３に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ、ｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２よりも結合活性が強い。
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２（特許配列ＷＯ２０１６１０９４１５に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。結果を図３に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ、ｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２よりも結合活性が強い。
【0129】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器（ＧＥから購入）により、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。この機器は、光学の表面プラズマ共鳴技術によりバイオチップに結合及びコーティングされた分子と被験分子との間の結合及び解離を測定した。使用される主な試薬は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９－１２７５－５７）である。実験の過程を簡単に説明すれば下記の通りであり。抗ヒトＣＤ４７キメラ抗体をランニング緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０,ｐＨ７．４）に希釈した。捕捉及び結合の段階では、濃度が２μｇ／ｍＬの抗体を１０μＬ／ｍｉｎの速度で６０秒間注入した。結合の段階では、抗原ＣＤ４７をランニング緩衝液で複数の濃度に希釈し、それぞれ３０μＬ／ｍｉｎの速度で１２０秒間注入した。解離の段階では、ランニング緩衝液を使用して１０μＬ／ｍｉｎの速度で６００秒間注入した。再生条件は、１０ｍＭのグリシン塩溶液、ｐＨ１．５とした。結合動力学的定数及び解離動力学的定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価用ソフトウェアにより分析及び算出した。抗ヒトＣＤ４７キメラ抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表７に示す。データから、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体がＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターと同等又はそれ以上であることが示された。
【0130】
【表7】
【0131】
実施例４ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７、サルＣＤ４７、ラットＣＤ４７及びマウスＣＤ４７（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７、サルＣＤ４７、ラットＣＤ４７及びマウスＣＤ４７（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0132】
フローサイトメトリーＦＡＣＳにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を確認した。内部から寄付された正常ヒトＲＢＣ、カニクイザルＲＢＣ、ラットＲＢＣ及びマウスＲＢＣ細胞を収集した。２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含む冷たいＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０）で１回洗浄した。ＲＢＣを、チューブ毎に２×１０６個の細胞で２％のＦＢＳを含む１００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２、アイソタイプコントロールを１００μＬ加えた。フローサイトメトリー用チューブを氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。２％のＦＢＳ及び１：１０００にて希釈した、ＦＩＴＣで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（北京中杉金橋、カタログ番号ＺＦ０３０６）を含む冷たいＰＢＳ ２００μＬに再懸濁させた。氷上で、遮光で３０ｍｉｎインキュベートした。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をフローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で検出分析し、ＲＢＣ細胞の蛍光強度を読み取った。
【0133】
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ（いずれもシノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２、アイソタイプコントロールを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0134】
結果を図４のＡ及び表８に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、ヒトＣＤ４７及びサルＣＤ４７と結合することができ、且つ親和性が類似したが、ラット、マウスＣＤ４７と結合せず、種特異性を示す。同時に、図４のＢに示すように、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体はまた、強い結合特異性を有し、ＣＤ４７のみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＳＩＲＰγと結合しない。
【0135】
【表8】
【0136】
実施例５ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0137】
結果を図５に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、ＣＣ－９０００２と類似したＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有する。
【0138】
実施例６ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体を介した腫瘍細胞に対する貪食活性
成熟ヒトマクロファージの製造：ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を蘇生させて収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）に再懸濁させて細胞培養ボトルに接種し、３７℃の二酸化炭素インキュベータで９０ｍｉｎインキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、接着細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）でインキュベートし、且つ、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７９２－ＨＮＡＮ）を加え、７日間インキュベートした。次いで、マクロファージを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７２５－ＨＮＡＳ）を含む完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させた。この細胞懸濁液を４８ウェル細胞培養プレートに５００００個の細胞／ウェルで接種し、１日間インキュベートしてマクロファージを成熟させ、準備した。
成熟ヒトマクロファージの製造：ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を蘇生させて収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）に再懸濁させて細胞培養ボトルに接種し、３７℃の二酸化炭素インキュベータで９０ｍｉｎインキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、接着細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）でインキュベートし、且つ、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７９２－ＨＮＡＮ）を加え、７日間インキュベートした。次いで、マクロファージを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７２５－ＨＮＡＳ）を含む完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させた。この細胞懸濁液を４８ウェル細胞培養プレートに５００００個の細胞／ウェルで接種し、１日間インキュベートしてマクロファージを成熟させ、準備した。
【0139】
ＣＦＳＥキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｃ３４５５４）の説明書を参照してＲａｊｉ腫瘍細胞（北京協和細胞資源センターから購入され、カタログ番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００４６）を染色した。簡単に言えば、ＰＢＳでＣＦＳＥを作用濃度５μＭまで希釈し、且つ３７℃に予熱し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心してＲａｊｉ細胞を収集し、予熱したＣＦＳＥ作用溶液でＲａｊｉを再懸濁させ、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした。完全培地で１回洗浄し、完全培地に再懸濁させ、３０ｍｉｎインキュベートし、さらに完全培地で２回洗浄し、完全培地に再懸濁させて準備した。
【0140】
４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥ染色後のＲａｊｉ細胞、被験抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル、対照ＣＣ－９０００２及びアイソタイプコントロールを１５ｍｉｎ予めインキュベートし、次いで、４８ウェル培養プレートに加え、３７℃の二酸化炭素インキュベータで２ｈｒインキュベートした。インキュベート終了後、４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、完全培地で希釈した小麦胚芽凝集素（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｗ３２４６４）を１０μｇ／ｍＬで加え、遮光で１５ｍｉｎインキュベートした。さらに４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドを加えて１５ｍｉｎ固定した。さらに４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、完全培地を加えた。蛍光顕微鏡により撮影し、細胞数を計数した。貪食指数（％）の計算方法は、以下の通りである：貪食された緑色で標識されたＲａｊｉ細胞の数／存在する赤色で標識されたマクロファージの数×１００。
【0141】
結果を図６に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、マクロファージによるＲａｊｉ腫瘍細胞への貪食を媒介することができ、ＣＣ－９０００２の活性と同等又はそれ以上である。
【0142】
実施例７ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の赤血球への影響
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳを加えて再懸濁させ、次いで、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートし、次いで、観察して撮影した。
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳを加えて再懸濁させ、次いで、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートし、次いで、観察して撮影した。
【0143】
結果を図７に示し、陽性対照だけは、ヒト赤血球凝集を引き起こしたが、ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－１０は赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0144】
実施例８ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
本実施例において、キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長に対する阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のヒトＲａｊｉリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分け、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５投与群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ投与群に設定した。３５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
本実施例において、キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長に対する阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のヒトＲａｊｉリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分け、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５投与群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ投与群に設定した。３５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
【0145】
結果を図８に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５は、抗腫瘍活性を有し、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ移植腫瘍の成長を著しく阻害し、有効性がＣＣ－９０００２と同等であった。
【0146】
実施例９ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）に記載された方法に基づいて得られるものである。
ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）に記載された方法に基づいて得られるものである。
【0147】
ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０２であり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示され、重鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＨＶ１－６９＊０１であり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される。マウス由来抗体のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域と置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域が得られ、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２７に示され、得られた重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９－３３に示される。軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結して、それぞれ対応する軽鎖全長配列が得られ、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とを連結して、それぞれ対応する重鎖全長配列が得られた。親和性及び安定性のスクリーニングにより使用可能なヒト化配列が得られ、得られたヒト化配列の軽鎖及び重鎖可変領域の配列情報を表９に示す。
【0148】
【表9】
【0149】
実施例１０ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性
ヒト化ＣＤ４７モノクローナル抗体は、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂと命名され、ここで、可変領域は、それぞれＺ１１、Ｚ１２に対応しており、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とを連結した。上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性の検出を行った。結果を図９に示し、ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２との結合活性と同等であった。
ヒト化ＣＤ４７モノクローナル抗体は、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂと命名され、ここで、可変領域は、それぞれＺ１１、Ｚ１２に対応しており、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とを連結した。上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性の検出を行った。結果を図９に示し、ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２との結合活性と同等であった。
【0150】
実施例１１ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性
上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。
上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。
【0151】
結果を図１０に示し、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、ＣＣ－９０００２と類似したＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有する。
【0152】
実施例１２ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体及びヒトＣＤ４７の結合動力学的定数
上記のように、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器により、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。抗ヒトＣＤ４７ヒト化抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表１０に示す。データによると、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及びＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターが同等であることが示された。
上記のように、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器により、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。抗ヒトＣＤ４７ヒト化抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表１０に示す。データによると、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及びＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターが同等であることが示された。
【0153】
【表10】
【0154】
実施例１３ ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の赤血球への影響
上記のように、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及び対照ＣＣ－９０００２が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。ここで、陽性対照は、クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２であった。
上記のように、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及び対照ＣＣ－９０００２が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。ここで、陽性対照は、クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２であった。
【0155】
結果を図１１に示し、陽性対照だけはヒト赤血球凝集を引き起こしたが、ＣＣ－９０００２、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0156】
実施例１４ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によるヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の純度及びその熱安定性の検出
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００クロマトグラフィーカラム（カタログ番号：１８６００７６４０）を使用した。移動相は、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６．７であり、流速は、０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液ＤＰＢＳでサンプルを１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、サンプリング体積は、１０μＬであった。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法により純度である主ピークの割合を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＳＥ－ＨＰＬＣ純度の検出を行った。これらのモノクローナル抗体の熱安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＳＥ－ＨＰＬＣ検出を行うことにより、熱安定性を観察し、結果を表１１に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体は、いずれも良好且つ同等な安定性を示した。
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００クロマトグラフィーカラム（カタログ番号：１８６００７６４０）を使用した。移動相は、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６．７であり、流速は、０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液ＤＰＢＳでサンプルを１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、サンプリング体積は、１０μＬであった。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法により純度である主ピークの割合を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＳＥ－ＨＰＬＣ純度の検出を行った。これらのモノクローナル抗体の熱安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＳＥ－ＨＰＬＣ検出を行うことにより、熱安定性を観察し、結果を表１１に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体は、いずれも良好且つ同等な安定性を示した。
【0157】
【表11】
【0158】
実施例１５ イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によるヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の電荷変異体の検出
カチオン交換クロマトグラフィーカラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：７８６５５）を使用し、２０ｍｍｏｌ／Ｌのモルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ａとし、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ｂとし、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル注入量は、４０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。溶出方式は、１０～５５％の直線的な勾配で４３ｍｉｎ運転した。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法によりピーク面積の百分率を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＩＥＸ検出を行った。これらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＩＥＸ検出を行うことにより、電荷変異体の割合の変化を観察し、結果を表１２に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体の電荷変異体の割合変化はいずれも低い。
カチオン交換クロマトグラフィーカラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：７８６５５）を使用し、２０ｍｍｏｌ／Ｌのモルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ａとし、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ｂとし、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル注入量は、４０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。溶出方式は、１０～５５％の直線的な勾配で４３ｍｉｎ運転した。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法によりピーク面積の百分率を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＩＥＸ検出を行った。これらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＩＥＸ検出を行うことにより、電荷変異体の割合の変化を観察し、結果を表１２に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体の電荷変異体の割合変化はいずれも低い。
【0159】
【表12】
【0160】
実施例１６ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
本実施例において、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長への阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分けて、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ投与群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３０１１ｂ投与群に設定した。１７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
本実施例において、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長への阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分けて、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ投与群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３０１１ｂ投与群に設定した。１７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
【0161】
結果を図１２に示し、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、抗腫瘍活性を有し、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ移植腫瘍の成長を著しく阻害し、有効性がＣＣ－９０００２と同等であった。
【0162】
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体及び抗体ヒト化改変研究分野に関し、特に、本発明は、ＣＤ４７と特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）とも呼ばれ、免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、その構造は、主に細細胞外免疫グロブリンの可変領域様ドメイン、疎水性の高い５回膜貫通領域及び選択的スプライシングによる細胞内カルボキシル末端の細胞質尾部領域を含む。ＣＤ４７は、細胞表面に広く発現しており、シグナル調節タンパク質ＳＩＰＲα、インテグリン及びトロンボスポンジンＴＳＰ１と結合することができ、多種の生理機能に関連し、その主な作用は、貪食細胞の表面のＳＩＰＲαと結合することでマクロファージの貪食作用を阻害することである。ＳＩＰＲαも免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、細胞内領域にチロシンに富んだ免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。ＣＤ４７がマクロファージの表面のＳＩＰＲαと結合すると、ＩＴＩＭはリン酸化して下流分子ＳＨＰ１／ＳＨＰ２と結合し、ファゴサイトーシスシナプスサブメンブレン（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｓｙｎａｐｓｅ ｓｕｂｍｅｍｂｒａｎｃｅ）へのミオシンの蓄積を阻止して貪食作用を阻害する。通常、ＣＤ４７は「自己」のシグナルであり、「私を食べないで」を示し、貪食作用による自己攻撃を阻害することができる。病理的状況では、ＣＤ４７は、腫瘍細胞に高発現しており、腫瘍細胞が貪食細胞の監視から逃れるのに寄与する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８（５４７３）：２０５１－２０５４；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，１１（３）：１３０－１３５．）。
【0003】
腫瘍研究によると、ＣＤ４７は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌及び他の固形腫瘍を含む多種のヒト腫瘍で発現することが発現された。腫瘍細胞は、ＣＤ４７の高発現を向上させてＳＩＰＲαと結合させることにより、マクロファージの免疫監視から逃れる。このため、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα間の相互作用（ＣＤ４７抗体又はＳＩＰＲα－Ｆｃ）をブロッキングすることにより、腫瘍に対するマクロファージの貪食作用を活性化するとともに、ＤＣ細胞よりＣＤ８＋Ｔ細胞へ抗原を提示することで腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的な殺傷作用を発揮することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２，２４（２）：２２５－２３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，２１（１０）：１２０９．）。
【0004】
ほとんどの腫瘍細胞にＣＤ４７が発現しているので、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα経路をブロッキングする抗体は、適用の見通しが広く、抗腫瘍への適用も広い。研究によると、ＣＤ４７は免疫チェックポイントとしており、ＣＤ４７抗体と他の免疫チェックポイントであるＣＴＬＡ４／ＰＤ－１に対する薬剤とを併用することにより薬効を増強させることができる。しかし、赤血球にもＣＤ４７が発現しているので、ＣＤ４７抗体の安全性を考慮する必要がある。研究によると、マクロファージが貪食作用を発揮するには、ＣＤ４７の「私を食べないで」というシグナルをブロッキングすることに加えて、カルレチクリン（ＣＲＴ）を介した「私を食べて」というシグナルが必要となる。通常の場合、カルレチクリンは、腫瘍細胞において高発現するが、正常な細胞に発現しない。また、ＣＤ４７抗体をスクリーニングする場合、赤血球の凝集を起こさない抗体を選択し、且つ、抗体としてＩｇＧ４型を採用すれば、マクロファージによる赤血球への貪食を活性化することができない。この分野は依然としてＣＤ４７抗体に対する需要がある。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様によれば、本発明は、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体に関し、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、ここで、
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個又は４個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個又は４個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0006】
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる。好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
【0008】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９又は１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１又は１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．５％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される。
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される。
【0010】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれかに示され、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれかに示され、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又はそれ以上のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列である。
【0011】
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される。
【0012】
本分野において、同一性が言及される場合、アミノ酸配列の長さは自然数でなければならないので、実際に計算して得られた同一性の数値は９５％のような有限の位のパーセントではなく、９５％のようなパーセントに近い数字である可能性があり、例えば１１７位のアミノ酸残基の可変領域配列について、１つだけのアミノ酸残基が変化した場合、それに対応する同一性のパーセントは実際には９９．１５％に近いパーセントであるが、便宜上、このような数字は本明細書では単に９９％と表記することは周知されている。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである。
【0014】
本発明の他の態様は、以下のものから選ばれる単離された核酸分子に関する：
（１）上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
（１）上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
【0015】
本発明の別の態様は、効果的にライゲーションした上記のような核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
【0016】
本発明の一態様は、上記のような核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【0017】
本発明の別の態様は、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物に関する。
【0018】
本発明の別の態様は、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体を生産する方法に関し、前記方法は、
上記のような宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
上記のような宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で発現させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
【0019】
本発明の別の態様は、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞の使用に関する。
【0020】
本発明の別の態様は、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞に関する。
【0021】
本発明の別の態様は、必要とする被験者に、上記のような抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、上記のような核酸分子、上記のようなベクター又は上記のような宿主細胞を投与するステップを含む、ＣＤ４７を介した疾患又は病症、例えば自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療する方法に関する。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、インスリン依存型糖尿病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種である。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記移植体に対する免疫応答は、例えば移植片対宿主病を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記アレルギー反応は、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種である。
【0025】
いくつかの実施形態において、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指す。病原性ウイルスの例として、例えばＨＩＶ、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ及びＣＭＶ、ＥＢウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルスを含む。病原性細菌は、例えば梅毒トレポネーマ、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、変形菌、セラチア菌、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ、枯草菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ属細菌及びボレリア・ブルグドルフェリを含む。病原性真菌は、例えばカンジダ菌（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスぺルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ケカビ（ｍｕｃｏｒ）、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む。病原性寄生虫は、例えば赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属の生物種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属の種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア原虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ）及びブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病及びハンチントン病から選ばれる１種又は複数種である。
【0027】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫及びメルケル細胞癌から選ばれる１種又は複数種である。好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、骨肉腫、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。より好ましくは、前記腫瘍は、リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結腸直腸癌、宮頸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
【0028】
いくつかの実施形態において、前記被験者は、哺乳動物から選ばれ、ヒト及び／又は他の霊長類動物を含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、核酸分子、ベクター又は宿主細胞は、当分野の通常の施用方法、例えば非経口経路、静脈内投与により使用される。
【0030】
言い換えれば、本発明は、ハイブリドーマ手段により抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を得るとともに、赤血球凝集を起こさない抗体をスクリーニングした。ＩｇＧ４型の抗体を採用することにより、ＣＤ４７－ＳＩＰＲα経路を特異的にブロッキングでき且つ一定の濃度範囲内で赤血球凝集を起こさないヒト化のＩｇＧ４抗体を得ることができる。
【0031】
本発明により提供される抗体及びその機能的フラグメントは、１ｎＭ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７と特異的に結合でき、ＣＤ４７と受容体との結合をブロッキングする活性を有し、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を媒介し、及び／又は赤血球凝集を起こさず、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍などを予防及び／又は治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
以下、本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記載に使用する必要がある図面に対して簡単に紹介する。なお、以下の記載における図面は、ただ本発明の一部の実施形態に過ぎない。当業者は、創造的な労働を付与しない前提で、これらの図面によって他の図面を得ることもできる。
【図1】実施例１における抗ヒトＣＤ４７陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７マウス由来モノクローナル抗体のインビトロ活性を示す。ここで、図１のＡは、マウス由来モノクローナル抗体とＣＤ４７との結合活性を示す。図１のＢは、マウス由来モノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図2】実施例１における抗ヒトＣＤ４７陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７マウス由来モノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図3】実施例３における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体とヒトＣＤ４７との結合活性を示す。
【図5】実施例５における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図6】実施例６における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体を介した、腫瘍細胞への貪食活性を示す。
【図7】実施例７における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図8】実施例８における抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍効果を示す。
【図9】実施例１０における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体の抗原結合活性を示す。
【図10】実施例１１における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合へのブロッキング活性を示す。
【図11】実施例１３における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体の赤血球への影響を示す。
【図12】実施例１６における抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
定義
用語「ＣＤ４７」とは、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）を指し、任意の哺乳動物由来のＣＤ４７分子であってもよく、いくつかの実施形態において、霊長類動物由来のＣＤ４７分子であり、いくつかの実施形態において、ヒト由来のＣＤ４７分子であってもよい。
用語「ＣＤ４７」とは、インテグリン関連タンパク質（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ）を指し、任意の哺乳動物由来のＣＤ４７分子であってもよく、いくつかの実施形態において、霊長類動物由来のＣＤ４７分子であり、いくつかの実施形態において、ヒト由来のＣＤ４７分子であってもよい。
【0034】
本明細書で使用される用語「抗ＣＤ４７抗体」、「抗ＣＤ４７」、「ＣＤ４７抗体」又は「ＣＤ４７と結合する抗体」とは、当該抗体がＣＤ４７を標的とする診断剤及び／又は治療剤として使用できるようにＣＤ４７タンパク質又はそのフラグメントと十分な親和性で結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、異種のＣＤ４７における保存されたＣＤ４７のエピトープと結合する。
【0035】
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又は抗原のエピトープと結合する能力を持つ免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含み、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのアイソタイプを含み、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖のジスルフィド結合の数及び位置の違いによって、異なるサブクラスに分けることもでき、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブタイプに分けられてもよく、ＩｇＡは、ＩｇＡ１とＩｇＡ２のサブタイプに分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によってκ鎖とλ鎖に分けられる。
【0036】
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、完全抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【0037】
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のうち、抗体とその抗原との結合に関与するドメインを指す。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと略記する）から構成され、重鎖定常領域は、通常、三つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略記する）から構成される。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には抗原認識を担当するが、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫グロブリンと宿主の組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体及び古典補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を媒介することができる。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域（ＨＶＲ）に細かく分けられてもよく、それらの間にはより保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲドメイン及び４つのＦＲドメインから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で配列される。
【0038】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」とは互換的に使用されてもよい）とは、抗体可変ドメインのうち、配列的に高度に変異し且つ構造的に決定されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する領域を指す。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープとの結合を担当する。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。
【0039】
異なるナンバリングスキームに基づいて得られた同一の抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があることに留意されたい。即ち、異なるナンバリングスキームで定義される同一の抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる。このため、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、可変領域配列が前記特定のＣＤＲ配列を含むが、異なるスキーム（例えば、異なるナンバリングスキームの規則又は組み合わせ）を適用することによって、いわゆるＣＤＲの境界が本発明で定義される特定のＣＤＲの境界と異なる抗体をさらに含む。
【0040】
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単分子組成物の抗体分子製剤としての、基本的に同質の抗体群から得られた抗体を指し、即ち、個体抗体を含む群は、わずかに存在する可能性がある、天然に発生する突然変異以外に同じである。一般的なモノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、２種以上のＦａｂドメインから構成されてもよく、これにより、２種以上のターゲットに対する特異性を向上させる。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、任意の具体的な産生方法（例えば、組換え、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）に限定されるものではない。
【0041】
用語「二重抗体」、「二重機能的抗体」、「二重特異性抗体」、「ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」又は「ＢｓＡｂ」とは、２個の異なる抗原結合部位を有するものを指し、２つのターゲット抗原と同時に結合することができ、抗体の標的性を発揮すると同時に別の特殊な機能エフェクター分子を媒介する作用を持つものである。媒介された特殊な機能エフェクター分子は、毒素、酵素、サイトカイン、放射線核種などであってもよく、抗原と結合する、二重特異性抗体の２つのアームは、それぞれＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ又はｄＳＦｖなどに由来してもよい。
【0042】
用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる抗原決定基（「エピトープ」）に対する異なる抗体の調製物を指す。
【0043】
用語「抗体の抗原結合フラグメント」とは、エピトープと結合できる抗体のフラグメント、部分、領域又はドメインを指す（例えば切断、組換え、合成などによって得られてもよい）。抗原結合フラグメントは、このような抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つのＣＤＲドメインを含むことができ、また、前記エピトープと結合できるにもかかわらず、異なる特異性、親和性又は選択性を示すことができる。好ましくは、抗原結合フラグメントは、前記抗体のすべての６つのＣＤＲドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、１本のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であってもよく、又は、１本のポリペプチド鎖を含むものであるか、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖（それぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する）（例えば、二重抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなど）の一部であってもよく、又は、２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
【0044】
本発明に含まれる抗原結合フラグメントの例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂ’又はＦａｂフラグメント；（ｂ）ジスルフィド結合によってヒンジドメインで連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｃ）ＶＨ領域及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント；（ｄ）抗体の１つのアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなるＦｖフラグメント；（ｅ）遺伝工学的手法により抗体ＶＨ及びＶＬを結合ペプチドセグメントで連結した組換えタンパク質である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）；（ｆ）基本的にＶＨ領域からなり且つドメイン抗体（Ｈｏｌｔなど，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２ｉ（ｌｌ）：４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｇ）ラクダ又はナノ抗体（Ｒｅｖｅｔｓなど，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，５（ｌ）：１１１－２４）及び（ｈ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【0045】
用語「キメラ抗体」とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は同種であるが、鎖の残りの部分が他の種に由来し又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一又は同種であることを指す。本発明は、ヒト抗体由来の可変領域抗原結合配列を提供する。このため、本明細書で主に注目したキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し且つ１つ又は複数の非ヒト抗体由来配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含有する抗体を含む。なお、本明細書で記載されるキメラ抗体は、１種の抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列及び他の抗体クラス又はサブクラスに由来する他の配列、例えばＦＲ又はＣ領域の配列を含む抗体を指す。
【0046】
用語「ヒト化抗体」とは、他の哺乳動物種、例えばマウス種に由来するＣＤＲ配列がヒトフレーム配列に移植された抗体を指す。ヒトフレーム配列において別途のフレームワーク領域修飾を行うことができる。
【0047】
用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」（「ｈｕｍＡｂ）又は「ＨｕＭａｂ」）とは、ヒト種系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト種系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発、又は遺伝子再構成中、又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）。
【0048】
変異体抗体も本発明の範囲内に含まれる。このため、本願で挙げられた配列の変異体も本発明の範囲内に含まれる。当分野で知られている方法を使用することにより改良された親和性を有する抗体配列の他の変異体を得ることができ、且つ、これらの変異体も本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換は、さらに改良された親和性を有する抗体を得るために用いることができる。又は、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、抗体の生産における発現系の翻訳効率を改善するために用いることができる。
【0049】
このような変異体抗体の配列は、本願で挙げられた配列と７０％又はそれ以上（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列相同性を有する。このような配列相同性は、参照配列（即ち、本願で挙げられた配列）の全長に対して計算して得られたものである。
【0050】
ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（登録商標）又はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．,Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２，アメリカ合衆国保健福祉省；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７に従って、本発明におけるアミノ酸残基に番号を割り当てる。特に明記されていない限り、本発明におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従って番号付けされる。
【0051】
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の分子の領域（即ち、エピトープ）と「特異的に」結合することとは、他のエピトープよりも、より頻繁に、より速く且つより長い持続時間及び／又はより大きな親和性で前記エピトープと反応又は結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０－７Ｍ、例えば１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又はそれ以上の親和性でヒトＣＤ４７と結合する。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理条件下で（例えば、インビボで）結合する。このため、ＣＤ４７と特異的に結合することは、この抗体又はその抗原結合フラグメントが上記の特異性及び／又はこのような条件でＣＤ４７と結合する能力を指す。前記結合を決定するのに適した方法は、当分野で知られているものである。
【0052】
抗体と指定された抗原とが結合するという背景下で、用語「結合」とは、通常、約１０－６Ｍ又はそれ以下のＫＤに対応する親和性で結合することを指し、このＫＤは、指定された抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するこの抗体の結合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍低い。
【0053】
本明細書で使用されるように、用語「ｋｄ」（ｓｅｃ－１又は１／ｓ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【0054】
本明細書で使用されるように、用語「ｋａ」（Ｍ－１ ｘ ｓｅｃ－１又は１／Ｍｓｅｃ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【0055】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」（Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、且つｋｄをｋａで割ることにより得られるものである。
【0056】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＡ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）とは、特定の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、且つｋａをｋｄで割ることにより得られるものである。
【0057】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲの一部（即ち、結合に必要なＣＤＲ残基サブグループ、ＳＤＲと呼ばれる）のみがヒト化抗体で結合していればよい。分子モデリング及び／又は経験に応じて、又はＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．など，（２００４），ＳＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｕｍａｎ ＧｅｒｍＬｉｎｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ Ｔｏ Ｍｉｎｉｍｉｚｅ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１：８６３－８７２に記載されるように、先行研究に基づいて（例えばＣＤＲ Ｈ２における残基Ｈ６０－Ｈ６５が、通常、不要である）Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ以外に位置するＫａｂａｔ ＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔなど，（１９９２），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，公開番号９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．など，（１９８７），Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７を参照されたい）から関連するエピトープと接触しなく且つＳＤＲに位置しないＣＤＲ残基を同定することができる。このようなヒト化抗体において、１つ又は複数のドナーであるＣＤＲ残基が存在しなく又はドナーであるＣＤＲ全体が省略される位置で、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において対応する位置（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）を占めるアミノ酸であってもよい。このような置換は、ヒト化抗体におけるマウスのアミノ酸の数を減らし、これにより、潜在的な免疫原性を低下させる点で潜在的に有利である。しかし、置換は、親和性の変化を引き起こす可能性もあり、且つ親和性が著しく低下することを避けることが好ましい。経験に応じてＣＤＲ内の置換位置及び置換されるアミノ酸を選択することもできる。
【0058】
ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸を変えて機能的結合が失われるという事実を利用して（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．など，（１９８２），Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ））７９（６）：１９７９－１９８３）、代替可能な機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定することができる。このような変異体ＣＤＲを得るための好ましい方法において、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの変異を誘発して（例えばランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により）置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機能的）ＣＤＲ配列における関連する残基の身元と置換された（非機能的）変異体ＣＤＲ配列の身元とを比較することにより、この置換されたＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊの置換スコアを同定することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、配列データベースを分析して作成されたアミノ酸置換行列を提供して、信頼性の比較に用いる（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，（２００４），Ｗｈｅｒｅ Ｄｉｄ Ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ６２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｅ Ｆｒｏｍ？，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，（１９９２），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．など，（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅｓ），ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｆｒｏｍ Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９、５５５－５６５。現在、最も先進的なＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど、置換が保存的であるので、この置換は、機能に影響を与えない可能性が高くなる）。例えば、得られたＣＤＲを含む抗原結合フラグメントがＣＤ４７と結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的ではないと考えられ、より高い置換スコアを持つ新たな候補置換を選択して生成する。このため、例えば、元の残基がグルタミン酸（Ｅ）であり且つ非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、０であり、且つ、より保存的な変化（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリジン）は、好ましいものである。
【表1】
【0059】
そこで、本発明は、改良されたＣＤＲの同定におけるランダム変異誘発の使用を考慮した。本発明の背景下で、保存的置換は、以下の３つの表における１つ又は複数のアミノ酸のカテゴリ内の置換により定義されてもよい。
【0060】
【表2】
【表3】
【表4】
【0061】
いくつかの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ及びＬｙｓから選ばれる。
【0062】
さらに、例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている原理を用いて別のアミノ酸グループを作成することもできる。
【0063】
このため、含まれる抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配列は、置換によって親抗体のＣＤＲの配列と異なることができ、例えば４、３、２又は１個のアミノ酸残基の置換が挙げられる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ領域におけるアミノ酸は、以上の３つの表で定義されるように、保存的置換で置換されてもよい。
【0064】
「相同性」又は「配列同一性」とは、配列を整列させて間隙を導入した後のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列変異体と非変異体配列間の同じ残基のパーセンテージを指す。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
【0065】
このような変異体ポリペプチド配列は、本願で挙げられる配列と、７０％又はそれ以上（即ち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているアミノ酸配列の様々な長さの連続した延出セグメントを含むポリペプチドフラグメントを提供する。例えば、適用可能な場合、本発明に提供されるペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０又はそれ以上の本発明で開示される１つ又は複数の配列の連続したペプチド、及びそれらの間の中間程度の長さを有するすべてのペプチドを含む。
【0066】
用語「治療」とは、疾患又は病状の進展又は重症度を改善、緩和、減弱又は逆転させたり、このような疾患又は病状の１種又は複数種の症状又は副作用を改善、緩和、減弱又は逆転させたりすることを指す。本発明において、「治療」はまた、有益又は有望な臨床結果を得るための方法を指し、ここで、「有益又は有望な臨床結果」は、部分的又は全部的なものや、検出可能又は検出不可能なものにもかかわらず、症状の緩和、病状又は疾患程度の減少、安定化した（即ち悪化していない）疾患又は病状の状態、疾患又は病状の状態の進展の遅延又は緩和、疾患又は病状の状態の改善又は軽減及び疾患又は病状の緩和を含むが、これらに限定されない。
【0067】
用語「予防」とは、本発明の抗体及びその機能的フラグメントを投与することにより、疾患又は病况の少なくとも１種の症状の進展を阻止又は阻害することを指す。この用語は、緩和中の被験者を治療して再発を予防又は阻害することをさらに含む。
【0068】
本発明の抗体は、組換えＤＮＡにより産生されたモノクローナル抗体であってもよい。
【0069】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有してもよい。アイソタイプの選択は、通常、所望のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ誘導）により決定される。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κ又はλのいずれか一方を用いることができる。必要であれば、公知の方法により本発明の抗ＣＤ４７の抗体のクラスを変換することができる。例えば、本発明の最初のＩｇＧ抗体は、クラスを本発明のＩｇＭ抗体に変換することができる。なお、クラス変換技術によりＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧｌをＩｇＧ２に変換することができる。このため、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプの切り替えにより例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４抗体である。抗体のアミノ酸配列が他のアイソタイプに対してこのアイソタイプとほとんど同じである場合、この抗体は、特定のアイソタイプに属する。
【0070】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体であり、好ましくはＩｇＧ抗体である。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体－抗原結合フラグメント又は単鎖抗体である。
【0071】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、一価抗体であり、好ましくは、ＷＯ２００７０５９７８２（その全体が引用により本明細書に援用される）に記載されたようなヒンジ領域に欠失を有する一価抗体である。このため、いくつかの実施形態において、抗体は、一価抗体であり、ここで、前記抗ＣＤ４７抗体は、以下の方法により構築される：ｉ）一価抗体の軽鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗ＣＤ４７抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列及びＩｇの定常ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及びＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されており、また、ＩｇＧ１サブクラスの場合、ＣＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、このＣＬ領域は、このＣＬ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドとジスルフィド結合又は共有結合を形成できる任意のアミノ酸を含まない；ｉｉ）一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供し、前記構築物は、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列及びヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、既に修飾されており、これにより、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で又は動物若しくはヒトに投与する場合、ヒンジ領域及び（例えばＩｇサブクラスに要求される）ＣＨ領域の他の領域（例えばＣＨ３領域）に対応する領域には、ヒトＩｇのＣＨ領域の一致したアミノ酸配列を含む他のペプチドと、ジスルフィド結合又は共有結合若しくは安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することに関与する任意のアミノ酸残基が含まれておらず、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ＩｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列は、効果的に連結されている；ｉｉｉ）一価抗体を産生するための細胞発現系を提供する；ｉｖ）（ｉｉｉ）の細胞発現系の細胞で（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸構築物を共発現させて前記一価抗体を産生する。
【0072】
同様に、いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体は、一価抗体であり、
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
（ｉ）本明細書で記載されるような本発明の抗体の可変領域又は前記ドメインの抗原結合部分と、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域又はそのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むドメインと、を含み、
ここで、このＣＨ領域又はそのドメインが既に修飾されることにより、ヒンジ領域及び（この免疫グロブリンがＩｇＧ４サブクラスではない場合）ＣＨ領域の他のドメイン（例えばＣＨ３ドメイン）に対応するドメインには任意のアミノ酸残基が含まれておらず、これらの任意のアミノ酸残基は、同じＣＨ領域とジスルフィド結合を形成し、又は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で同じＣＨ領域と他の共有結合又は安定な非共有結合による重鎖間結合を形成することができる。
【0073】
他のいくつかの実施形態において、一価抗体の重鎖は修飾されることにより、ヒンジ領域全体が欠失している。
【0074】
他の実施形態において、一価抗体の配列は修飾されることにより、Ｎ－結合型グリコシル化のための任意の受容体サイトが含まれていない。
【0075】
本発明は、「二重特異性抗体」をさらに含み、ここで、抗ＣＤ４７結合領域（例えば、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７結合領域）は、１種以上のエピトープを標的とする二価又は多価二重特異性フレームワークの一部である（例えば、第２のエピトープは、アクティブトランスポート受容体のエピトープを含むことができ、これにより、この二重特異性抗体は、生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えた、改善された細胞転移作用を示す）。このため、他の実施形態において、抗ＣＤ４７抗体の一価Ｆａｂは、他の異なるタンパク質を標的とするＦａｂ又はｓｃｆｖに連結されることにより、二重特異性抗体を産生することができる。二重特異性抗体は、例えば抗ＣＤ４７結合領域から付与される治療機能及び受容体分子に結合されて生物学的障壁（例えば血液脳関門）を越えて転移するトランスポート機能を増強させることができるという二重機能を有することができる。
【0076】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体をさらに含む。単鎖抗体は、重鎖及び軽鎖のＦｖドメインが連結されたペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供し、ここで、本発明の抗ＣＤ４７抗体のＦｖ中の重鎖及び軽鎖は、フレキシブルペプチド（典型的には、約１０、１２、１５又はそれ以上のアミノ酸残基）で連結されて１本のペプチド鎖を形成する。このような抗体を産生する方法は、例えばＵＳ ４，９４６，７７８；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ：２６９－３１５（１９９４）；Ｂｉｒｄなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２,４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎなど，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５,５８７９－５８８３（１９８８及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど，Ｎａｔｕｒｅ，３４８,５５２－５５４（１９９０）に記載されている。単一のＶＨ及びＶＬだけを使用する場合、単鎖抗体は、一価のものであり、２つのＶＨ及びＶＬを使用する場合、二価のものであり、又は、２つ以上のＶＨ及びＶＬを使用する場合、多価のものである。
【0077】
当分野で知られている任意の技術により本発明の抗体を産生し、例えば任意の化学的や生物学的や遺伝学的又は酵素学的な技術に限定されなく、単独で又は組み合わせて使用することができる。通常、所望の配列のアミノ酸配列が知られており、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術により前記抗体を容易に産生することができる。例えば、公知の固相方法によりこれらの抗体を合成することができ、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで製造された装置）を用いてメーカーの説明書に従ってこれらの抗体を合成する。又は、当分野における公知の組換えＤＮＡ技術により本発明の抗体を合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでこれらのベクターを所要の抗体の発現に好適な真核又は原核宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物としての抗体が得られ、その後、既知の技術を用いて宿主から抗体を単離することができる。
【0078】
任意の「好適な」数の修飾されたアミノ酸を含み、及び／又はカップリング置換基と結合することにより、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントを修飾することができる。このような場合に、「好適」は、通常、非誘導体化親抗ＣＤ４７抗体に関連するＣＤ４７選択性及び／又はＣＤ４７特異性を少なくとも基本的に保持する能力によって決定される。１つ又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことは、例えばポリペプチド血清半減期の増加、ポリペプチド抗原性の低減又はポリペプチド貯蔵安定性の向上に寄与することができる。１種又は複数種のアミノ酸に対する修飾は、例えば、組換え生産の過程において翻訳と同時に行われ、又は、翻訳後に行われ（例えば、哺乳動物の細胞での発現過程においてＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列におけるＮ－結合型グリコシル化作用）、又は合成手段によって行われる。修飾されたアミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、イソプレン化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などを含む。アミノ酸修飾を行う参考文献は、本分野ではよく知られており、例えばＷａｌｋｅｒ，（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｎ ＣＤ－Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照する。修飾されたアミノ酸は、例えばグリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチンアシル化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸又は有機誘導化剤に結合したアミノ酸から選ばれてもよい。
【0079】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、共価結合によりポリマーに結合して化学修飾を行うことにより、循環半減期を増加させることもできる。例示的なポリマー及びそれをペプチドに連結する方法は、例えばＵＳ ４，７６６，１０６；ＵＳ ４，１７９，３３７；ＵＳ ４，４９５，２８５及びＵＳ ４，６０９，５４６を参照する。また、例示的なポリマーとして、ポリオキシエチル化されたポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量は約１，０００～４０，０００Ｄの間、例えば約２，０００～２０，０００Ｄの間、例えば約３，０００～１２，０００ＤのＰＥＧ）を含む。
【0080】
用語「被験者」とは、温血動物を指し、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜及び農場での動物、動物園での動物、運動動物又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなど）であり、より好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、「患者」、即ち、温血動物であってもよく、より好ましくは、受け入れを待っているかか、又は医療看護を受けているか、又は医療プログラムあるいは疾患進展モニタリングの対象となる、ヒトである。一実施形態において、被験者は、成人（例えば１８歳以上の被験者）である。他の実施形態において、被験者は、子供（例えば、１８歳以下の被験者）である。一実施形態において、被験者は、男性である。他の実施形態において、被験者は、女性である。
【0081】
本発明の一実施形態において、サンプルは、生体サンプルである。生体サンプルの例として、疾患組織、体液を含むが、これらに限らなく、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹膜液、脳脊髄液、胸膜液、心嚢水及び肺胞マクロファージから製造された組織分解物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。
【0082】
本発明の一実施形態において、用語「サンプル」は、任意の分析の前に個体から採取したサンプルを意味する。
【0083】
このため、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合フラグメントは、完全抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラス）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラス）、ＩｇＭ及びＩｇＥ；抗原結合フラグメント、例えばＳＤＲ、ＣＤＲ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体又はナノ抗体；抗体又はその抗原結合フラグメントの変異体配列、例えば上記の抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７又はその抗原結合フラグメントを含む誘導体、例えば完全抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、組換え抗体、二重特異性抗体をさらに含む。
【0084】
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベクターは、組換えにより本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するために用いることができる。
【0085】
本発明において、発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（１組の適切な発現制御要素の核酸配列を含む）を含む任意の適切なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよい。このようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば線形発現要素（例えばＳｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、小型核酸ベクター（例えばＵＳ ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載されている）、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８又はｐＵＣ１１８／１１９）、最小サイズの核酸ベクター（例えばＳｃｈａｋｏｗｓｋｉなど，ＭｏＩ Ｔｈｅｒ，３，７９３－８００（２００１）に記載されている）を含み、又は沈殿型核酸ベクター構築物、例えばＣａＰＯ４沈殿型構築物（例えばＷＯ００／４６１４７；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１－５５（１９８６）；Ｗｉｇｌｅｒなど，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２，６０３（１９８１）に記載されている）としている。このような核酸ベクター及びその使用は、本分野でよく知られているものである（例えばＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。
【0086】
いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の細胞で抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適している。このようなベクターの例として、例えばＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４，５５０３－５５０９（１９８９））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを含む。
【0087】
発現ベクターは、酵母系で発現するのに適したベクターであってもよい。酵母系で発現するのに適した任意のベクターを採用することができる。適切なベクターは、例えば構成型又は誘導性プロモーター（例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）を含むベクターを含む（レビューとして、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌなど，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｇｒａｎｔなど，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３，５１６－５４４（１９８７）；Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．など，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８２４，３２９－３５８（２０１２）；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．など，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３０（５），１１０８－１１１８（２０１２）；Ｌｉ，Ｐ．など，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４２（２），１０５－１２４（２００７）；Ｂoｅｒ，Ｅ．など，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（３），５１３－５２３（２００７）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３５９－３６６（２００２）及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，３４９－３５７（２００２）を参照されたい）。
【0088】
本発明の発現ベクターにおいて、抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及びその他の発現に寄与する要素又はそれとの組み合わせを含むことができる。このような要素の例として、強発現型プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー及びＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）ターミネーター配列、大腸菌でプラスミドを産生するための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）を含む。核酸は、構成型プロモーター（例えばＣＭＶ ＩＥ）に対する誘導性プロモーターを含むこともできる。
【0089】
他の態様によれば、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の二重特異性分子を産生する組換え真核又は原核宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ）に関する。宿主細胞の例として、酵母、細菌及び哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供し、このゲノムは、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、本発明は、非組み込み型の核酸（例えばプラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現要素）を含む細胞を提供し、この核酸は、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む。
【0090】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、異なる細胞系、例えばヒト細胞系、非ヒト哺乳動物細胞系及び昆虫細胞系、例えばＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ細胞系、ＢＨＫ－２１細胞系、マウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）、繊維肉腫細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６細胞系、ＨＫＢ－１１細胞系、ＣＡＰ細胞系及びＨｕＨ－７ヒト細胞系で産生することができる（Ｄｕｍｏｎｔなど，２０１５，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｓｅｐ．１８，１－１３．、その内容が引用により本明細書に援用される）。
【0091】
一般的な免疫グロブリンの精製方法により本発明の抗体と培地とを適切に単離し、前記方法は、例えばプロテインＡ－セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーである。
【0092】
本発明は、さらに、組成物に関し、前記組成物は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
【0093】
本明細書で使用されるように、組成物について、「基本的に．．．からなる」ことは、少なくとも１種の前述したような本発明の抗体が前記組成物において生物学的活性を有する唯一の治療剤又は試薬であることを意味する。
【0094】
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物であり、且つ、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体をさらに含む。
【0095】
用語「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトに投与した際に、不利なもの、アレルギー又は他の不良反応を起こさない賦形剤を指す。それは、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング層、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。ヒトに投与する場合、製剤は、監督機関（例えばＦＤＡオフィスやＥＭＡ）に要求される無菌、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準を満たすべきである。
【0096】
本発明は、さらに、薬剤に関し、前記薬剤は、本発明の抗体を含み、それからなり又は基本的にそれからなる。
【0097】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化の抗体（即ち、抗体がグリコシル化されていない）を製造することができる。グリコシル化を変えることにより、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めたり、抗体のＡＤＣＣ活性を変化させたりすることができる。このような炭水化物に対する修飾は、例えば抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化サイトを変えることにより実現されてもよい。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことにより、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化サイトを解消し、これにより、このサイトでのグリコシル化を解消することができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を向上させることができる。Ｃｏなどの米国特許Ｎｏ．５，７１４，３５０及びＮｏ．６，３５０，８６１（引用により本明細書に援用される）には、このような方法がさらに詳しく記載されている。また、代替として、改変されたグリコシル化のタイプを有する抗体、例えば減少量を有し又はフコシル残基を有しない低フコシル化又は非フコシル化抗体又は付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたフコシル化モードにより抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが既に証明された。このような炭水化物に対する修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることで実現されてもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、本分野で記載されており、且つ、宿主細胞として使用されてもよく、この宿主細胞で本発明の組換え抗体を発現させることにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する。例えば、ＨａｎｇなどのＥＰ１１７６１９５（引用により本明細書に援用される）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞系が記載されており、このＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするので、このような細胞系で発現した抗体は、低フコシル化又はフコシル残基の欠如を示す。このため、いくつかの実施形態において、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、低フコシル化又は非フコシル化モードが示された細胞系、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子発現が欠如している哺乳動物細胞系で組換え発現を行うことにより産生されてもよい。ＰｒｅｓｔａのＰＣＴ開示ＷＯ０３／０３５８３５（引用により本明細書に援用される）には、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、それらは、フコースをＡｓｎ（２９７）が連結した炭水化物に付着させる能力が低下しているので、この宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．など，２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。ＵｍａｎａなどのＰＣＴ開示ＷＯ９９／５４３４２（引用により本明細書に援用される）には、工学的細胞系により糖タンパク質で修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させることにより、工学的細胞系で発現する抗体は、付加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の向上をもたらすことが記載されている（Ｕｍａｎａなど，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照されたい）。Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、さらに、フコース残基が欠如している改変された哺乳動物グリコシル化モードを有する抗体を産生できる遺伝子工学的ＣＨＯ哺乳動物細胞を説明した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。又は、本発明のヒト抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、酵母又は糸状菌で産生することができ、前記酵母又は糸状菌は、哺乳動物様グリコシル化モードに用いられ、且つグリコシル化モードとしてフコースが欠如した抗体を産生することができる（例えばＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照されたい）。
【0098】
本発明の抗体は、ヒトＣＤ４７に作用し、ヒト腫瘍細胞表面でのＣＤ４７発現を特異的に認識することにより、ＣＤ４７と受容体ＳＩＲＰαとの結合により伝達される抑制的なシグナル経路をブロッキングすることができ、マクロファージを介した腫瘍貪食反応を促進することができ、これにより、腫瘍に対する免疫治療に新たな方法を提供する。本発明の抗体は、例えば関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎などの自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症及びクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性疾患、及び例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌及び黒色腫などの腫瘍を予防及び／又は治療するために使用されてもよい。
【0099】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下のような技術案に関する。
【0100】
第１発明は、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体であって、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、ここで
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、２及び３に示され、及び／又は
重鎖可変領域のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、重鎖可変領域のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有し、重鎖可変領域のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有し、又は
示される軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－８に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は
前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－８に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
ここで、前記変異体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体から選ばれる１つである。
【0101】
第２発明は、前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれる、第１発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体であって、
好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
好ましくは、重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、軽鎖定常領域配列は、軽鎖κ鎖の定常領域配列から選ばれる。
【0102】
第３発明は、ＣＤ４７キメラ抗体又はその機能的フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９又は１０に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示されるものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１又は１２に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、及び／又は
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であることを特徴とする第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
前記ＣＤ４７キメラ抗体及びその機能的フラグメントの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示されるものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持しているものであるか、又は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であることを特徴とする第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0103】
第４発明は、前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり：
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、第１又は第２発明に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0104】
第５発明は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれか１つに示され、及び／又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれか１つに示され、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５－２７又は２８－３３に示す配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を削除、置換及び／又は添加して得られた、対応する親配列の生物学的活性を保持した変異体配列であり、
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される、第１又は第２発明に記載の前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
好ましくは、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示され、及び／又は、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示される、第１又は第２発明に記載の前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0105】
第６発明は、前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである、第１～第５発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体。
【0106】
第７発明は、以下から選ばれる単離された核酸分子である。
【0107】
（１）第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸。
【0108】
第８発明は、効果的にライゲーションした第７発明に記載の核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
【0109】
第９発明は、第７発明に記載の核酸分子又は第８発明に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【0110】
第１０発明は、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第７発明に記載の核酸分子、第８発明に記載のベクター又は第９発明に記載の前記宿主細胞、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤及び／又はベクターを含む組成物である。
【0111】
第１１発明は、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体を生産する方法であって、当該方法は、第９発明に記載の宿主細胞を前記抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体の発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む。
【0112】
第１２発明は、自己免疫疾患、移植体に対する免疫応答、アレルギー反応、感染症、神経変性疾患及び腫瘍を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、第１～第６発明のいずれか１つに記載の抗ヒトＣＤ４７抗体、その抗原結合フラグメント又はその変異体、第７発明に記載の核酸分子、第８発明に記載のベクター又は第９発明に記載の宿主細胞の使用であって、
好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記移植体に対する免疫応答は、移植片対宿主病であり、好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指し、
好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、拡張型心筋症、シェーグレン症候群、アトピー性及び接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、動脈周囲性多発動脈炎、リウマチ熱、白斑、インスリン依存型糖尿病、ベーチェット病及び慢性甲状腺炎から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記移植体に対する免疫応答は、移植片対宿主病であり、好ましくは、前記アレルギー反応は、蕁麻疹、湿疹、血管神経性浮腫、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、喉頭浮腫、食物アレルギー胃腸炎、アナフィラキシーショックから選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記感染症とは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などの病原体及び特定の毒素が人体に侵入することによる局所的な組織と全身性炎症反応を指し、
好ましくは、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病から選ばれる１種又は複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である。
【0113】
範囲の値が提供される場合、本明細書において特に明記されていない限り、各挿入値、下限までの単位の１０分の１、この範囲の上限と下限との間及び任意の前記範囲内の他の前記値又は挿入値は、いずれも本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。特に除外された限界を除き、前記範囲内で特定的に除外された境界を除く限り、独立して小さな範囲に含まれてもよいこれらの小さな範囲の上限及び下限も本発明に含まれる。前記範囲が１つ又は２つの限界を含む場合、１つ又は２つの含まれる境界を除外する範囲も本発明に含まれる。
【0114】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術又は科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される通常の意義を意味すべきである。本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の任意のものは、本発明の実施又は試験でも使用することができるが、現在、好ましい方法及び材料が開示されている。本明細書で言及されているすべての出版物は、その全体が引用により本明細書に援用される。
【0115】
一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の製造過程を説明するためのものであり、この製造過程は、関連する方法を説明するためのものに過ぎず、限定的なものではなく、本発明の精神から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることは、当業者に知られている。このような修正も本発明の範囲内に含まれる。一方で、本発明に提供される実施例は、本発明の抗体の特徴及びメリットを示すためのものであるが、本発明は、これらの特徴及びメリットに限定されない。
【0116】
以下、実施例を併せて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者にとっては、以下の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎなく、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又は製造メーカにより提案される条件に従って行う。使用される試薬又は機器に製造メーカが明記されていないものは、市販から入手できる通常の製品である。
【0117】
実施例
実施例１ マウス由来抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物として、北京維通利華実験動物技術社（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）から購入された６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質及びフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離し、組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質に対し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質を腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）に１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０７６－ＣＶ）を加えて単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、０．２５μＭのＣｐＧ ＯＤＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－１８２６－１）を加えて２４ｈ刺激し、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気融合装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－００１０）を使用して電気融合を行った。
実施例１ マウス由来抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
１．１、動物の免疫
実験動物として、北京維通利華実験動物技術社（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）から購入された６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、免疫を始めた。初回免疫は、５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）及びフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８８１）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、２５μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質及びフロインド不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ５８０６）を使用し、両者を混合して乳液を形成し、マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同じ方法で追加免疫を行い、合計３回であった。最終免疫を行ってから１０日目に、マウスの眼窩静脈叢から採血して遠心により血清を分離し、組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質に対し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。抗体価が高いマウスを選択して融合によりハイブリドーマを製造した。融合の３日前に、アジュバントを含まない５０μｇの組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質を腹腔内投与した。融合の当日に、無菌で脾臓を取り、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９６５）に１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０７６－ＣＶ）を加えて単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、０．２５μＭのＣｐＧ ＯＤＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－１８２６－１）を加えて２４ｈ刺激し、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気融合装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－００１０）を使用して電気融合を行った。
【0118】
１．２、ハイブリドーマ細胞の製造
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院細胞バンクから購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁させてからカウントし、必要な数の細胞を取って、０．３Ｍのマンニトール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４２９）、０．１ｍＭの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７７７４）、０．１ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５６７０）からなるＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で２回洗浄し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。同時に、Ｅ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で脾臓細胞を２回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを一定の割合で混合し、５０ｍＬのプラスチック遠心管内においてＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で１回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。２ｍＬのＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液／（１－１．５）＊１０Ｅ７脾臓細胞でＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液を加え、１０ｍｍ間隔をあけた融合セル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－０１０７）ごとに２ｍＬの細胞混合液を加え、パラメータ設定をチェックし、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｒｔを押せばよい。融合後、滅菌条件下でビペットを用いて細胞懸濁液を融合槽から２８ｍＬのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を含有する５０ｍＬの遠心管に慎重に移し、３７℃で１０ｍｉｎ静置し、ＨＡＴ培地を細胞数（３－５）＊１０Ｅ４／ウェルで加えてプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。５日後にＨＡＴ培地で１／２培地と置換した。７～１０日後にＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と置換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
対数増殖期にある骨髄腫細胞ＳＰ２／０（中国科学院細胞バンクから購入）を採取し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上澄みを捨てて、不完全ＤＭＥＭ培養液で細胞を懸濁させてからカウントし、必要な数の細胞を取って、０．３Ｍのマンニトール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８４２９）、０．１ｍＭの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７７７４）、０．１ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５６７０）からなるＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で２回洗浄し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。同時に、Ｅ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で脾臓細胞を２回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを一定の割合で混合し、５０ｍＬのプラスチック遠心管内においてＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液で１回洗浄し、２４０ｇで６ｍｉｎ遠心した。上澄みを捨てて、手のひらで遠心管の底部を軽く叩いて、沈殿細胞をほぐして均一にした。２ｍＬのＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液／（１－１．５）＊１０Ｅ７脾臓細胞でＥ－ｆｕｓｉｏｎ緩衝液を加え、１０ｍｍ間隔をあけた融合セル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号４５－０１０７）ごとに２ｍＬの細胞混合液を加え、パラメータ設定をチェックし、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｒｔを押せばよい。融合後、滅菌条件下でビペットを用いて細胞懸濁液を融合槽から２８ｍＬのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ０２６２－１０ＶＬ）を含有する５０ｍＬの遠心管に慎重に移し、３７℃で１０ｍｉｎ静置し、ＨＡＴ培地を細胞数（３－５）＊１０Ｅ４／ウェルで加えてプレートに撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いてインキュベートした。５日後にＨＡＴ培地で１／２培地と置換した。７～１０日後にＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋ＨＴ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０１３７－１０ＶＬ）でＨＡＴ培地と置換した。ハイブリドーマ細胞の成長状況を定期的に観察し、当該細胞がウェルの底面積の１／１０以上になるまで成長すると、上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養して凍結保存した。
【0119】
１．３、クローンのスクリーニング及び同定
ＥＬＩＳＡを使用してハイブリドーマの培養上清での抗ヒトＣＤ４７抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって、抗ヒトＣＤ４７選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
ＥＬＩＳＡを使用してハイブリドーマの培養上清での抗ヒトＣＤ４７抗体をスクリーニングした。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号４２５９２）に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性血清対照を１００μＬ／ウェルで加え、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強弱によって、抗ヒトＣＤ４７選択的抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
【0120】
ＥＬＩＳＡにより、陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７選択的抗体がＣＤ４７／ＳＩＲＰαの結合をブロッキングできるか否かを測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７選択的抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ヒトＣＤ４７－Ｆｃ／ビオチンで標識したＳＩＲＰαの結合を阻害することができる抗ヒトＣＤ４７選択的抗体は中和活性を有する。ブロッキング能力の強弱によって抗ヒトＣＤ４７中和抗体を分泌できる陽性クローンを選択した。
【0121】
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。陽性クローンから分泌される抗ヒトＣＤ４７中和抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１４１９０２５０）を加えた後、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、カタログ番号３８７９）に５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートした。その後、観察して撮影した。
【0122】
結果を表５に示し、複数の抗ヒトＣＤ４７クローンは強いＣＤ４７結合活性及びＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有し、その中、ＣＤ４７－１８－５クローンマウス由来モノクローナル抗体のインビトロ活性を図１に示す。赤血球凝集の結果を図２に示し、ＣＤ４７－５－６５、ＣＤ４７－８－２１、ＣＤ４７－１６－５クローンは、ヒト赤血球凝集を引き起こすことができるが、ＣＤ４７－５－１９１、ＣＤ４７－１８－５、ＣＤ４７－１８－１０クローンは赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0123】
【表5】
【0124】
１．４、モノクローナル抗体配列の測定
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及び抗原中和活性を同時に有し且つインビトロで赤血球凝集を起こさないクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用して細胞ｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用してハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒトＣＤ４７ ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅用の可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）及びＶＬＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅により得られた目的バンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
スクリーニングで得られた、抗原結合活性及び抗原中和活性を同時に有し且つインビトロで赤血球凝集を起こさないクローンに対して抗体ＤＮＡ配列の測定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４１９）を使用して細胞ｍＲＮＡを抽出した。次いで、ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４８４９）を使用してハイブリドーマから抽出したトータルＲＮＡを逆転写してヒトＣＤ４７ ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、ＰＣＲ増幅用の可変領域のプライマーＶＨＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）及びＶＬＧＳＰ：ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）をそれぞれ設計した。ＰＣＲ増幅により得られた目的バンドをｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ方式により線形化されたｐＲＡＣＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３４８５９）にクローニングし、モノクローナルを選んでＤＮＡシーケンシングを行った。
【0125】
実施例２ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
ＣＤ４７－１８－５クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び７に示される。ＣＤ４７－１８－５クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－５クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものである。ＣＤ４７－１８－１０クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６及び８に示される。ＣＤ４７－１８－１０クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－１０クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものであり、得られたキメラ抗体の軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、重鎖定常領域の配列情報を表６に示す。
ＣＤ４７－１８－５クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び７に示される。ＣＤ４７－１８－５クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－５クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものである。ＣＤ４７－１８－１０クローンをＰＣＲ増幅して得られた抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。マウスの可変領域配列に基づいてフレームワーク領域配列を排除することにより、その相補性決定領域配列を得ることができる。ここで、軽鎖の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３に示される。重鎖の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、６及び８に示される。ＣＤ４７－１８－１０クローンから構築されたキメラＣＤ４７モノクローナル抗体は、それぞれｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａと命名され、両者の抗体の軽鎖は、いずれもＣＤ４７－１８－１０クローンの軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とが連結されたものであり、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａ抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とが連結されたものであり、得られたキメラ抗体の軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、重鎖定常領域の配列情報を表６に示す。
【0126】
【表6】
【0127】
上記の抗体の軽・重鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して遺伝子合成（蘇州金唯智バイオテクノロジー社）を行うことにより、ヌクレオチド配列を得、さらに真核細胞の発現ベクターＸ０ＧＣにクローニングし、次いで、発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞系（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ、カタログ番号Ａ２９１３３、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクションの前日に、細胞を接種し、細胞を新鮮なＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号Ａ２９１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。トランスフェクションの当日にカウントした細胞密度は、（７０－２００）×１０５細胞／ｍＬの範囲内にあり、生存率が９５％超えであるべきであった。予熱したＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地で細胞を希釈し、最終密度は６０×１０５細胞／ｍＬとした。トランスフェクション体積に従って、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ培地（カタログ番号１２３０９、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、プラスミド及びトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ試薬（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ希釈し、プラスミドの最終濃度は０．５μｇ／ｍＬとした。希釈後のトランスフェクション試薬をプラスミドに穏やかに加え、１～５ｍｉｎ静置し、その後、プラスミド－トランスフェクション試薬の複合物を細胞に加え、細胞インキュベータに入れ、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクションの翌日に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯエンハンサー（カタログ番号Ａ２９１３１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（カタログ番号Ａ２９１０１－０２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給し、細胞インキュベータは、シェーカーで１２５ｒｐｍ、３２℃、５％ＣＯ２の条件とした。遠心により、１０日間トランスフェクションした細胞培養の上清を収集した。
【0128】
実施例３ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体とヒトＣＤ４７との結合活性及び動力学的定数
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２（特許配列ＷＯ２０１６１０９４１５に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。結果を図３に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ、ｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２よりも結合活性が強い。
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７（北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２（特許配列ＷＯ２０１６１０９４１５に由来する）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ７０６８）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。結果を図３に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ、ｍＡｂ－１８－１０、ｍＡｂ－１８－１０ Ｎ２９７Ａは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２よりも結合活性が強い。
【0129】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器（ＧＥから購入）により、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。この機器は、光学の表面プラズマ共鳴技術によりバイオチップに結合及びコーティングされた分子と被験分子との間の結合及び解離を測定した。使用される主な試薬は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９－１２７５－５７）である。実験の過程を簡単に説明すれば下記の通りであり。抗ヒトＣＤ４７キメラ抗体をランニング緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０,ｐＨ７．４）に希釈した。捕捉及び結合の段階では、濃度が２μｇ／ｍＬの抗体を１０μＬ／ｍｉｎの速度で６０秒間注入した。結合の段階では、抗原ＣＤ４７をランニング緩衝液で複数の濃度に希釈し、それぞれ３０μＬ／ｍｉｎの速度で１２０秒間注入した。解離の段階では、ランニング緩衝液を使用して１０μＬ／ｍｉｎの速度で６００秒間注入した。再生条件は、１０ｍＭのグリシン塩溶液、ｐＨ１．５とした。結合動力学的定数及び解離動力学的定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価用ソフトウェアにより分析及び算出した。抗ヒトＣＤ４７キメラ抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表７に示す。データから、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体がＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターと同等又はそれ以上であることが示された。
【0130】
【表7】
【0131】
実施例４ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７、サルＣＤ４７、ラットＣＤ４７及びマウスＣＤ４７（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７、サルＣＤ４７、ラットＣＤ４７及びマウスＣＤ４７（いずれも北京シノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプルを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0132】
フローサイトメトリーＦＡＣＳにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の種特異性を確認した。内部から寄付された正常ヒトＲＢＣ、カニクイザルＲＢＣ、ラットＲＢＣ及びマウスＲＢＣ細胞を収集した。２％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３）を含む冷たいＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１４１９０）で１回洗浄した。ＲＢＣを、チューブ毎に２×１０６個の細胞で２％のＦＢＳを含む１００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２、アイソタイプコントロールを１００μＬ加えた。フローサイトメトリー用チューブを氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。２％のＦＢＳ及び１：１０００にて希釈した、ＦＩＴＣで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（北京中杉金橋、カタログ番号ＺＦ０３０６）を含む冷たいＰＢＳ ２００μＬに再懸濁させた。氷上で、遮光で３０ｍｉｎインキュベートした。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をフローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）で検出分析し、ＲＢＣ細胞の蛍光強度を読み取った。
【0133】
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ（いずれもシノバイオロジカル社から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で段階希釈した抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び対照ＣＣ－９０００２、アイソタイプコントロールを１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１００００にて希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ３０９Ｐ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0134】
結果を図４のＡ及び表８に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、ヒトＣＤ４７及びサルＣＤ４７と結合することができ、且つ親和性が類似したが、ラット、マウスＣＤ４７と結合せず、種特異性を示す。同時に、図４のＢに示すように、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体はまた、強い結合特異性を有し、ＣＤ４７のみと結合し、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ２８ファミリーメンバー及びＳＩＲＰγと結合しない。
【0135】
【表8】
【0136】
実施例５ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝溶液を使用して、１００μＬ／ウェルのコーティング量で１μｇ／ｍＬのコーティング濃度にて、９６ウェル高吸着型ＥＬＩＳＡプレート上に組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃ（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）をコーティングした。コーティングを４℃で一晩行った。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で３００μＬ／ウェルにてブロッキングし、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。抗ヒトＣＤ４７抗体サンプルを５０μＬ／ウェルで添加し、且つ、濃度が４ｎＭ（最終濃度は２ｎＭ）のビオチンで標識したＳＩＲＰα（株式会社アクロバイオシステムズ（北京）から購入）を５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で９０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。次いで、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液で１：１０００にて希釈した、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４０６６）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した。発色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１０ｍｉｎ発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することにより、発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0137】
結果を図５に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、ＣＣ－９０００２と類似したＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有する。
【0138】
実施例６ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体を介した腫瘍細胞に対する貪食活性
成熟ヒトマクロファージの製造：ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を蘇生させて収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）に再懸濁させて細胞培養ボトルに接種し、３７℃の二酸化炭素インキュベータで９０ｍｉｎインキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、接着細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）でインキュベートし、且つ、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７９２－ＨＮＡＮ）を加え、７日間インキュベートした。次いで、マクロファージを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７２５－ＨＮＡＳ）を含む完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させた。この細胞懸濁液を４８ウェル細胞培養プレートに５００００個の細胞／ウェルで接種し、１日間インキュベートしてマクロファージを成熟させ、準備した。
成熟ヒトマクロファージの製造：ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２７０２）を蘇生させて収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を５×１０６／ｍＬの細胞密度で無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）に再懸濁させて細胞培養ボトルに接種し、３７℃の二酸化炭素インキュベータで９０ｍｉｎインキュベートした。培養上清及び懸濁細胞を捨て、接着細胞を完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）でインキュベートし、且つ、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７９２－ＨＮＡＮ）を加え、７日間インキュベートした。次いで、マクロファージを採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（北京シノバイオロジカル社、カタログ番号１１７２５－ＨＮＡＳ）を含む完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させた。この細胞懸濁液を４８ウェル細胞培養プレートに５００００個の細胞／ウェルで接種し、１日間インキュベートしてマクロファージを成熟させ、準備した。
【0139】
ＣＦＳＥキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｃ３４５５４）の説明書を参照してＲａｊｉ腫瘍細胞（北京協和細胞資源センターから購入され、カタログ番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００４６）を染色した。簡単に言えば、ＰＢＳでＣＦＳＥを作用濃度５μＭまで希釈し、且つ３７℃に予熱し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心してＲａｊｉ細胞を収集し、予熱したＣＦＳＥ作用溶液でＲａｊｉを再懸濁させ、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした。完全培地で１回洗浄し、完全培地に再懸濁させ、３０ｍｉｎインキュベートし、さらに完全培地で２回洗浄し、完全培地に再懸濁させて準備した。
【0140】
４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥ染色後のＲａｊｉ細胞、被験抗ヒトＣＤ４７抗体サンプル、対照ＣＣ－９０００２及びアイソタイプコントロールを１５ｍｉｎ予めインキュベートし、次いで、４８ウェル培養プレートに加え、３７℃の二酸化炭素インキュベータで２ｈｒインキュベートした。インキュベート終了後、４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、完全培地で希釈した小麦胚芽凝集素（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｗ３２４６４）を１０μｇ／ｍＬで加え、遮光で１５ｍｉｎインキュベートした。さらに４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドを加えて１５ｍｉｎ固定した。さらに４８ウェルプレートを完全培地で３回洗浄し、完全培地を加えた。蛍光顕微鏡により撮影し、細胞数を計数した。貪食指数（％）の計算方法は、以下の通りである：貪食された緑色で標識されたＲａｊｉ細胞の数／存在する赤色で標識されたマクロファージの数×１００。
【0141】
結果を図６に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体は、マクロファージによるＲａｊｉ腫瘍細胞への貪食を媒介することができ、ＣＣ－９０００２の活性と同等又はそれ以上である。
【0142】
実施例７ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の赤血球への影響
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳを加えて再懸濁させ、次いで、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートし、次いで、観察して撮影した。
赤血球（ＲＢＣ）にＣＤ４７が高発現している。いくつかの抗ＣＤ４７抗体は、赤血球の凝集を引き起こすことができる。抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。内部から寄付された抗凝固処理を行った健常人全血にＤＰＢＳを加えて再懸濁させ、次いで、遠心により上清を取り除き、遠心チューブの底にある赤血球を収集し、３回繰り返し洗浄した後、赤血球をＤＰＢＳに再懸濁させて２％の赤血球懸濁液とした。この懸濁液を低吸着型９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで加え、且つ、段階希釈された抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体サンプル及び陽性対照（クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２）を５０μＬ／ウェルで加え、均一に混合した。プレートを３７℃インキュベータに置いて２ｈｒインキュベートし、次いで、観察して撮影した。
【0143】
結果を図７に示し、陽性対照だけは、ヒト赤血球凝集を引き起こしたが、ｍＡｂ－１８－５、ｍＡｂ－１８－１０は赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0144】
実施例８ キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
本実施例において、キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長に対する阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のヒトＲａｊｉリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分け、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５投与群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ投与群に設定した。３５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
本実施例において、キメラ抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長に対する阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のヒトＲａｊｉリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分け、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５投与群、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５ Ｎ２９７Ａ投与群に設定した。３５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
【0145】
結果を図８に示し、抗ヒトＣＤ４７キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ－１８－５は、抗腫瘍活性を有し、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ移植腫瘍の成長を著しく阻害し、有効性がＣＣ－９０００２と同等であった。
【0146】
実施例９ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の製造
ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）に記載された方法に基づいて得られるものである。
ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体は、Ｌｅｕｎｇなど（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１４１３－２７）に記載された方法に基づいて得られるものである。
【0147】
ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースから、マウス由来抗体の可変領域配列と最もマッチングするヒト化テンプレートを選択し、ここで、軽鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＫＶ１－１７＊０２であり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示され、重鎖可変領域のテンプレートは、ＩＧＨＶ１－６９＊０１であり、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される。マウス由来抗体のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域と置換して、移植したヒト化抗体の軽鎖可変領域が得られ、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示され、移植したヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８からサイトを選択して復帰突然変異を行って、得られた軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２７に示され、得られた重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９－３３に示される。軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結して、それぞれ対応する軽鎖全長配列が得られ、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とを連結して、それぞれ対応する重鎖全長配列が得られた。親和性及び安定性のスクリーニングにより使用可能なヒト化配列が得られ、得られたヒト化配列の軽鎖及び重鎖可変領域の配列情報を表９に示す。
【0148】
【表9】
【0149】
実施例１０ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性
ヒト化ＣＤ４７モノクローナル抗体は、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂと命名され、ここで、可変領域は、それぞれＺ１１、Ｚ１２に対応しており、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とを連結した。上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性の検出を行った。結果を図９に示し、ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２との結合活性と同等であった。
ヒト化ＣＤ４７モノクローナル抗体は、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂと命名され、ここで、可変領域は、それぞれＺ１１、Ｚ１２に対応しており、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とを連結した。上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗原結合活性の検出を行った。結果を図９に示し、ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、良好なヒトＣＤ４７結合親和性を有し、対照ＣＣ－９０００２との結合活性と同等であった。
【0150】
実施例１１ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性
上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。
上記のように、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体のＣＤ４７と受容体との結合へのブロッキング活性を検出した。
【0151】
結果を図１０に示し、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、ＣＣ－９０００２と類似したＣＤ４７／ＳＩＲＰαへのブロッキング活性を有する。
【0152】
実施例１２ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体及びヒトＣＤ４７の結合動力学的定数
上記のように、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器により、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。抗ヒトＣＤ４７ヒト化抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表１０に示す。データによると、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及びＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターが同等であることが示された。
上記のように、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器により、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体とその抗原ヒトＣＤ４７との結合動力学的定数を検出した。抗ヒトＣＤ４７ヒト化抗体の結合動力学的定数、解離動力学的定数及び解離平衡定数を表１０に示す。データによると、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及びＣＣ－９０００２の結合解離パラメーターが同等であることが示された。
【0153】
【表10】
【0154】
実施例１３ ヒト化の抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の赤血球への影響
上記のように、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及び対照ＣＣ－９０００２が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。ここで、陽性対照は、クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２であった。
上記のように、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂ及び対照ＣＣ－９０００２が赤血球の凝集を引き起こすか否かを測定した。ここで、陽性対照は、クローン番号ＣＣ２Ｃ６の抗ＣＤ４７抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２３１０２であった。
【0155】
結果を図１１に示し、陽性対照だけはヒト赤血球凝集を引き起こしたが、ＣＣ－９０００２、ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは赤血球凝集を引き起こさなかった。
【0156】
実施例１４ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によるヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の純度及びその熱安定性の検出
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００クロマトグラフィーカラム（カタログ番号：１８６００７６４０）を使用した。移動相は、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６．７であり、流速は、０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液ＤＰＢＳでサンプルを１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、サンプリング体積は、１０μＬであった。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法により純度である主ピークの割合を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＳＥ－ＨＰＬＣ純度の検出を行った。これらのモノクローナル抗体の熱安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＳＥ－ＨＰＬＣ検出を行うことにより、熱安定性を観察し、結果を表１１に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体は、いずれも良好且つ同等な安定性を示した。
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００クロマトグラフィーカラム（カタログ番号：１８６００７６４０）を使用した。移動相は、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６．７であり、流速は、０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液ＤＰＢＳでサンプルを１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、サンプリング体積は、１０μＬであった。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法により純度である主ピークの割合を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＳＥ－ＨＰＬＣ純度の検出を行った。これらのモノクローナル抗体の熱安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＳＥ－ＨＰＬＣ検出を行うことにより、熱安定性を観察し、結果を表１１に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体は、いずれも良好且つ同等な安定性を示した。
【0157】
【表11】
【0158】
実施例１５ イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によるヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の電荷変異体の検出
カチオン交換クロマトグラフィーカラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：７８６５５）を使用し、２０ｍｍｏｌ／Ｌのモルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ａとし、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ｂとし、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル注入量は、４０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。溶出方式は、１０～５５％の直線的な勾配で４３ｍｉｎ運転した。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法によりピーク面積の百分率を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＩＥＸ検出を行った。これらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＩＥＸ検出を行うことにより、電荷変異体の割合の変化を観察し、結果を表１２に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体の電荷変異体の割合変化はいずれも低い。
カチオン交換クロマトグラフィーカラムＭａｂＰａｃ ＳＣＸ－１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：７８６５５）を使用し、２０ｍｍｏｌ／Ｌのモルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ａとし、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを移動相Ｂとし、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルセル温度は、４℃であり、検出波長は、２８０ｎｍであり、サンプル注入量は、４０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）であった。溶出方式は、１０～５５％の直線的な勾配で４３ｍｉｎ運転した。Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィー１２６０システムステーションにより実験結果に対してデータ処理を行い、面積正規化法によりピーク面積の百分率を算出した。上記の製造されたヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂに対してＩＥＸ検出を行った。これらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確定するために、上記のサンプルを４０℃の高温条件下に置き、２週目と４週目にそれぞれサンプリングしてＩＥＸ検出を行うことにより、電荷変異体の割合の変化を観察し、結果を表１２に示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４７抗体の電荷変異体の割合変化はいずれも低い。
【0159】
【表12】
【0160】
実施例１６ ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体の抗腫瘍薬力学的研究
本実施例において、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長への阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分けて、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ投与群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３０１１ｂ投与群に設定した。１７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
本実施例において、ヒト化抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体による、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ腫瘍移植体の成長への阻害作用を検出した。６～８週齢の雌ＮＣＧマウス（南京生物医薬研究院から購入）を実験材料として使用した。マウスを環境に１週間適応させた後、マウス１匹につき、５×１０６個のＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３まで達した場合、腫瘍体積によって、マウスを６匹ずつ群分けて、それぞれ溶媒対照群、ＣＣ－９０００２対照群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ投与群、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３０１１ｂ投与群に設定した。１７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与用量で週２回、２週連続腹腔内投与した。投与日から腫瘍体積を週に２回測量し、その長径ａ、短径ｂを測量した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２）／２であった。
【0161】
結果を図１２に示し、抗ヒトＣＤ４７ヒト化モノクローナル抗体ＢＨ３００８ｂ、ＢＨ３０１１ｂは、抗腫瘍活性を有し、ＮＣＧマウスに接種したＲａｊｉ移植腫瘍の成長を著しく阻害し、有効性がＣＣ－９０００２と同等であった。
【0162】
最後に、以上の各実施例は、本発明の技術案を説明するためのものであり、それを限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者にとっては、前述した各実施例に記載される技術案を修正したり、その技術的特徴の一部又は全部を同等に置き換えることは依然として可能であり、これらの修正又は置き換えは、対応する技術案の本質を本発明の各実施例に係る技術案の範囲から逸脱させるものではないことを理解すべきである。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む、単離された抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントであって、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すＬＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すＬＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示すＬＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含み、及び／又は
重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示すＨＣＤＲ１であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５又は６と少なくとも約９４％の同一性を有するＨＣＤＲ２であるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７又は８と少なくとも約７８％の同一性を有するＨＣＤＲ３であるアミノ酸配列とを含む、
抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記抗体の重鎖定常領域配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記抗体の軽鎖定常領域配列は、κ鎖又はλ鎖から選ばれ、好ましくは、前記重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域配列から選ばれ、及び／又は、前記軽鎖定常領域配列は、κ鎖の定常領域配列から選ばれる、請求項１又は２に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９又は１０に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１又は１２に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４－１６のいずれか１つに示される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４を含み、重鎖可変領域フレームワーク領域は、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含み、及び／又は、前記ＦＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示され、
前記ＦＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第１２個のアミノ酸ＲはＴに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示され、又は、さらに以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第３１個のアミノ酸ＹはＦに置換され、
前記ＦＲ－Ｌ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示され、
前記ＦＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示され、
前記ＦＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２に示され、
前記ＦＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３に示され、又は、以下の置換のいずれか１つ或いはその任意の組み合わせにより得られたアミノ酸配列であり、
第８個のアミノ酸ＥはＴに置換され、
第１１個のアミノ酸ＳはＮに置換され、
第３１個のアミノ酸ＡはＶに置換され、及び／又は
前記ＦＲ－Ｈ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－２７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有し、及び／又は前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－３３のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６又は２７に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に示すアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ラクダ抗体、ＣＤＲ及び抗体認識の最小単位（ｄＡｂ）から選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖである、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
（１）請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；（２）（１）で定義された核酸と完全に相補的な核酸；から選ばれる、単離された核酸分子。
【請求項10】
効果的にライゲーションした請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項９に記載の核酸分子又は請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項12】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。
【請求項13】
請求項１１に記載の宿主細胞を、前記抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に適した培養条件で培養させ、任意選択的に、得られた産物を単離及び精製するステップを含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
【請求項14】
ＣＤ４７を介した疾患又は病症を予防及び／又は治療するための薬剤の製造における、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載の発現ベクター又は請求項１１に記載の宿主細胞の使用であって、前記疾患又は病症は、好ましくは腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓腺癌、胆嚢癌、肝癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫から選ばれる１種又は複数種である、使用。
【手続補正書】
【提出日】2023-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図4】
【国際調査報告】