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特表2024-503462安定化剤を使用せずに安定した、タンパーナセプトを含む眼科用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-25
(54)【発明の名称】安定化剤を使用せずに安定した、タンパーナセプトを含む眼科用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240118BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240118BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240118BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240118BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240118BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240118BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P27/02
A61K9/08
A61K47/02
A61K47/18
A61K47/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542629
(86)(22)【出願日】2022-01-13
(85)【翻訳文提出日】2023-07-28
(86)【国際出願番号】 KR2022000661
(87)【国際公開番号】W WO2022154529
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】10-2021-0005584
(32)【優先日】2021-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514034870
【氏名又は名称】ハノル バイオファーマ カンパニーリミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＡＬＬ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】４３， Ｓａｎｇｓｅｏｄａｎｇ １－ｇｉｌ， Ｄａｅｄｅｏｋ－ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ， ３０６－１２０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】パク スン クク
(72)【発明者】
【氏名】アン ヒェ キュン
(72)【発明者】
【氏名】ジュン ミ ジン
(72)【発明者】
【氏名】シム ヒェ ウン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB24
4C076CC10
4C076DD23D
4C076DD26Z
4C076DD41Z
4C076DD42Z
4C076DD43Z
4C076DD51Z
4C076FF14
4C076FF61
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA26
4C084CA18
4C084CA53
4C084DA25
4C084MA17
4C084MA58
4C084NA03
4C084ZA331
(57)【要約】
本発明は、安定化剤を使用せずに安定した、タンパーナセプトを含む眼科用組成物、及び前記組成物の製造及び使用方法に関する。ヒスチジン、スクロースなどの安定化剤の使用は、タンパーナセプト由来の酸性／塩基性変異体などの不純物の生成を引き起こし、生物学的活性に影響を及ぼすことが本発明により明らかになった。本発明による眼科用薬学組成物は、このような安定化剤の使用を排除する代わりに、ｐＨを調節して冷蔵保存条件だけでなく、加速条件及び過酷条件においてもこのような不純物の生成を著しく減少させて安定したタンパーナセプト眼科用組成物を製造しうる。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパーナセプト及びｐＨ５．０～ｐＨ６．５のバッファーシステムを含み、安定化剤を実質的に含まない安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項2】
前記眼科用組成物において、タンパーナセプトは、０．０１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）で含まれる、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項3】
前記眼科用組成物において、バッファーシステムのｐＨは、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０のバッファーシステムを含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項4】
前記眼科用組成物においてバッファーシステムのｐＨは、ｐＨ５．５～ｐＨ６．０のバッファーシステムを含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項5】
前記バッファーシステムは、ホスフェート緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、アセテート緩衝剤、スクシネート緩衝剤、シートレート緩衝剤、グルタメート緩衝剤及びラクテート緩衝剤からなる群から選ばれる１つまたは２つ以上の緩衝剤を含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項6】
前記バッファーシステムは、バッファーシステムとしてシートレートバッファーシステム、ホスフェートバッファーシステムまたはシートレート－ホスフェートバッファーシステムを含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項7】
前記シートレートバッファーシステムは、緩衝剤としてクエン酸トリナトリウム及びクエン酸を含む、請求項６に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項8】
前記バッファーシステムは、５ｍＭ～５０ｍＭの緩衝剤を含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項9】
前記眼科用組成物は、等張化剤をさらに含む、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項10】
前記等張化剤は、塩化ナトリウムである、請求項９に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項11】
前記眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後、タンパーナセプトの電荷変異体の量が２０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項12】
前記眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後、タンパーナセプトの塩基性変異体の量が１０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項13】
前記眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後、タンパーナセプトの酸性変異体の量が１０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項14】
前記眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後、タンパーナセプトの電荷変異体の量が２０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項15】
前記眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後、タンパーナセプトの塩基性変異体の量が１０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項16】
前記眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後、タンパーナセプトの酸性変異体の量が１０％以下である、請求項１に記載の安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【請求項17】
前記眼科用組成物の浸透圧濃度は、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１に記載のタンパーナセプト含有眼科用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、安定化剤を使用せずに安定した、タンパーナセプトを含む眼科用組成物、及び前記組成物の製造及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に、目に局所投与するための治療剤は、液状またはゲル状のいずれかに剤形化され、投与時まで無菌状態で安定して維持されなければならない。このような眼科用溶液は、緩衝液、様々な界面活性剤、安定化剤、等張化剤などを含み、これらは眼科用組成物がユーザーにとってより快適になるように補助する。眼科用溶液の効能及び商業化にとって特に重要なのは、溶液の安定性である。溶液の安定性は、製剤中に存在するすべての化合物の相互作用、ならびに温度及びｐＨに応じて異なりうる。
【0003】
タンパク質含有薬学組成物は、最適な条件ではない条件下で物理化学的に変性が発生する。特に、タンパク質の濃度、緩衝剤の種類、安定化剤の種類及び濃度、有機共溶媒の種類及び濃度、塩の濃度、ｐＨ、温度、空気との接触などの要因は、タンパク質の酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）、異性化（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）などにかなりの影響を及ぼす。このような変性は、タンパク質の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び異性体（ｉｓｏｍｅｒ）を生成させて生理活性を減少させることができる。
【0004】
一方、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）は、単球及びマクロファージを含む多くの細胞タイプによって生産されるサイトカインである。ＴＮＦ－αは、感染症、自己免疫疾患、敗血症、移植拒否など様々なその他のヒト免疫疾患に関連している。ＴＮＦ－αの過剰発現は、ヒト疾患における否定的な結果をもたらすので、治療剤としての方向は、ＴＮＦ－αの活性を制御するか、または相殺させる方向で考案されてきた。そこで、ＴＮＦ－αに結合して中和させる抗体を開発し、様々なタンパク質製剤として販売されている。しかし、この抗ＴＮＦ－α抗体製剤は、大きな分子量によって局所部位で誘発される炎症疾患には製剤が効率的に到達できないという限界がある。そこで、本出願人は、小サイズの高い活性を有することにより、局所炎症疾患の治療に適したポリペプチド分子を開発したことがある。本発明のＴＮＦ－α阻害剤である変形したヒト腫瘍壊死因子受容体－１ポリペプチド、タンパーナセプトは、出願人の特許出願である大韓民国公開特許公報第２０１２－００７２３２３号に開示されており、その眼球乾燥症に対する治療用途も大韓民国公開特許公報第２０１３－０１４３４８４号に記述されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】大韓民国公開特許公報第２０１２－００７２３２３号
【特許文献2】大韓民国公開特許公報第２０１３－０１４３４８４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
タンパク質組成物は、保管寿命が化学合成医薬品に比べて保管期間が短いこともあり、また、保管期間中に誘発される電荷変異体や凝集物などの物理化学的不純物が誘発され、生物学的活性が低下することもある。
【0007】
本発明は、タンパーナセプトを含む、安定化剤を使用せずに安定した眼科用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、冷蔵保存条件だけでなく、加速及び過酷条件での保管時にも、タンパーナセプト由来不純物（酸性／塩基性変異体）の生成を最小化できる眼科用組成物を開発するために、タンパーナセプトの安定性に対する様々な研究を行った。特に、本発明者らは、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ範囲、機能性賦形剤などを含む様々な製剤化の研究を行った。その結果、本発明者らは、ヒスチジン、スクロースなどの安定化剤の使用が特定のｐＨでは、むしろ、酸性／塩基性変異体を生成させ、タンパーナセプトの組成物の安定性に影響を及ぼすことを見出した。そこで、本発明は、安定化剤を含まないｐＨ５．０～ｐＨ６．５で安定したタンパーナセプト眼科用組成物を提供する。
【0009】
具体的には、本発明は、タンパーナセプト及びｐＨ５．０～ｐＨ６．５のバッファーシステムを含み、安定化剤を実質的に含まない安定したタンパーナセプト含有眼科用組成物を提供する。
【0010】
タンパーナセプトは、大韓民国公開特許公報第２０１３－０１４３４８４号に開示されているＴＮＦＲＩ変異体で、天然型ＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番ないし２１１番からなるアミノ酸配列（ＴＮＦＲＩ１７１）においてＬ６８Ｖ／Ｓ９２Ｍ／Ｈ９５Ｆ／Ｒ９７Ｐ／Ｈ９８Ｇ／Ｋ１６１Ｎのアミノ酸変形を含むアミノ酸配列で表される。
【0011】
タンパーナセプトは、計１７１個のアミノ酸からなるポリペプチドであるため、一般的なタンパク質含有薬学組成物がそうであるように患者に投与する前まで安定性を確保し、最善の薬効を示すようにすることが薬物開発における最も重要な課題の一つである。
【0012】
タンパーナセプトの安定性を確保できる製剤の開発のために、本発明者らは、まず、タンパーナセプトの保管安定性を実験し、その結果、タンパーナセプトが保管過程で電荷変異体を形成することが観察された（実験例１）。本願で使用される用語の「電荷変異体」とは、タンパク質またはポリペプチドの天然状態から変形され、タンパク質またはポリペプチドの電荷が異なることを意味する。一例において、電荷変異体は、本来のタンパク質またはポリペプチドよりも酸性、すなわち、本来のタンパク質またはポリペプチドよりも低いｐＩ値を有する。他の例において、電荷変異体は、本来のタンパク質またはポリペプチドよりも塩基性、すなわち、本来のポリペプチドよりも高いｐＩ値を有する。このような変形は操作されるか、または自然過程、例えば、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ－末端プロセシング、Ｎ－末端ピログルタメート形成、及び非酵素的糖化の結果であってもよい。一例において、タンパク質またはポリペプチド電荷変異体は、タンパク質に付着したグリカンが、例えば、シアル酸またはその誘導体の添加によって変形され、糖タンパク質の電荷が母糖タンパク質と比較して異なる糖タンパク質である。本願で使用される「タンパーナセプト電荷変異体」は、タンパーナセプトの天然状態から変形され、タンパーナセプトの電荷が異なる物質である。
【0013】
電荷変異体は、一般的に薬物の活性低下を引き起こすことがよく知られているので、電荷変異体の生成量を一定水準以下に管理することが必要である。そこで、本発明者らは、眼科用安定化剤として使用可能な成分を用いて電荷変異体のような不純物の発生を最小化できるかを確認し、一次的にスクロースとヒスチジンを含むことが好ましいことを確認した（実験例２）。しかし、タンパーナセプト含有組成物の適正ｐＨを探すさらなる研究過程において、特定のｐＨではこれらの安定化剤を使用しても電荷変異体の生成率が高く、むしろ安定化剤を使用せずにｐＨをｐＨ５．０～ｐＨ６．５のレベルに調節することが電荷変異体の生成率を最も下げることができる方法であることを確認した（実験例３）。
【0014】
そこで、本発明は、タンパーナセプト及びｐＨ５．０～ｐＨ６．５のバッファーシステムを含み、安定化剤を実質的に含まないタンパーナセプト含有眼科用組成物を提供する。
【0015】
タンパーナセプトは、適正の含量で組成物内に含むことが好ましいが、含量が高くなるほど、凝集物などの不純物の含量が増加しうるためである。本発明のタンパーナセプト含有眼科用組成物において、タンパーナセプトは、０．０１～１０％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０１～８％（ｗ／ｖ）、０．０１～６％（ｗ／ｖ）、０．０１～４％（ｗ／ｖ）、０．０１～２％（ｗ／ｖ）、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、０．０２～１％（ｗ／ｖ）、０．０５～０．８％（ｗ／ｖ）、０．１～０．７％（ｗ／ｖ）、０．２～０．６％（ｗ／ｖ）などの含量で含まれてもよい。商業的目的を考慮し、タンパーナセプトは、０．２５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）などの含量で組成物内に含まれてもよい。前記タンパーナセプトの含量は、投与対象患者の疾患の種類、重症度などに応じて異なりうる。
【0016】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、ｐＨ５．０～ｐＨ６．５のバッファーシステムを含む。前記バッファーシステムは、ｐＨ５．０～ｐＨ６．５のｐＨを有するもので十分であり、例えば、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０のバッファーシステム、ｐＨ５．５～ｐＨ６．５のバッファーシステム、ｐＨ５．５～ｐＨ６．０のバッファーシステム、ｐＨ５．８～ｐＨ６．３のバッファーシステムなどのｐＨ５．０～ｐＨ６．５の範囲内に属する数値範囲は、すべて本発明のカテゴリに含まれる。本発明の一具体例において、本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０のバッファーシステムを含む。本発明の他の具体例において、本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、ｐＨ５．５～ｐＨ６．０のバッファーシステムを含む。
【0017】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物においてバッファーシステムを具現する方法は、当業者によく知られている。ｐＨ５．０～ｐＨ６．５のバッファーシステムは、ホスフェート緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、アセテート緩衝剤、スクシネート緩衝剤、シートレート緩衝剤、グルタメート緩衝剤及びラクテート緩衝剤からなる群から選ばれる１つまたは２つ以上の緩衝剤を含んでもよい。いかなるバッファーシステムを使用してもｐＨ５．０～ｐＨ６．５の条件を満たせば、タンパーナセプトの安定性の確保が可能であると判断される。ただし、特定のバッファーシステムの使用が相対的に好ましい場合がある。下記の実施例を通じて、アセテート緩衝剤に比べてシートレート緩衝剤が相対的に凝集物や電荷変異体生成の制御の側面で有利であることが確認された（実験例４）。したがって、本発明の具体例において、前記バッファーシステムは、シートレート緩衝剤を含むバッファーシステム、例えば、シートレートバッファーシステムまたはシートレート－ホスフェートバッファーシステムであってもよいが、これに制限されるものではない。バッファーシステムに含まれる緩衝剤は、緩衝効果を増大させるために、共役酸－共役塩基の組み合わせから構成されてもよい。例えば、本発明の一具体例において、前記バッファーシステムはシートレート緩衝剤を含み、ここで、シートレート緩衝剤としては、クエン酸トリナトリウム（共役塩基）及びクエン酸（共役酸）を含む。
【0018】
本発明のバッファーシステムは、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度の緩衝剤、例えば、１０ｍＭ～３０ｍＭ濃度の緩衝剤を含む。
【0019】
本発明の眼科用組成物は、安定化剤を実質的に含まないことを特徴とする。ここで、安定化剤とは、有効成分として使用されるタンパーナセプトの化学的、物理的安定性または生物学的活性の減少を防ぐために製剤内に含まれる追加の成分を意味する。例えば、眼科用組成物においてタンパク質の凝集阻害のためにスクロースやマンニトールなどの糖類を使用するか、またはプロリン、アルギニン、グリシン、リシンまたはメチオニンなどのアミノ酸系安定化剤を使用してタンパク質の安定化を図ることがよく知られている。本発明は、以下の実施例で確認したように、通常の場合とは異なり、このような安定化剤を含む場合、むしろ、タンパーナセプトの安定性に悪影響を及ぼすことを見出し、安定化剤を実質的に含まない。本発明で説明する緩衝剤や等張化剤は、安定化剤に含まれない。
【0020】
安定化剤を「実質的に含まない」とは、安定化剤を０．１％（ｗ／ｖ）未満、０．０５％（ｗ／ｖ）未満、０．０３％（ｗ／ｖ）未満、０．０２％（ｗ／ｖ）未満、０．０１％（ｗ／ｖ）未満、０．００５％（ｗ／ｖ）未満、０．００１％（ｗ／ｖ）未満で含むか、または最も好ましくは、全く含まないことを意味する。
【0021】
前記眼科用組成物の浸透圧濃度は、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
【0022】
本発明による眼科用組成物は、有効成分であるタンパーナセプトとバッファーシステムの他に等張化剤をさらに含んでもよい。等張化剤は、本発明による眼科用組成物の浸透圧を調節するために使用される。本発明において、等張化剤は、本発明による眼科用組成物が２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧濃度を有するように含まれる。浸透圧は、水単位当たり溶解した粒子の数を測定したものである。溶液において、水の単位数（溶媒）に比例して溶質粒子の数が少ないほど、低－浸透圧溶液が少なく濃縮される。半－透過性膜（溶媒分子のみ透過可能な膜）を使用して他の溶質濃度の溶液を分離する場合、溶媒分子が膜を横切って低濃度から高濃度に交差して濃度平衡を形成する浸透現象が発生する。前記動きを駆動する圧力を浸透圧といい、溶液中の溶質の「粒子」の数によって左右される。同じ濃度の粒子を含有して同じ浸透圧を加える溶液を等－浸透圧という。もし、低－浸透圧または高－浸透圧溶液が目に配置されれば、それは目を損傷させるおそれがあり、したがって、目に使用される薬物のための等－浸透圧溶液が必要である。本発明では、等張化剤として塩化ナトリウムを使用した。本発明による眼科用組成物内において等張化剤の含量は、０．５％（ｗ／ｖ）～１％（ｗ／ｖ）であってもよい。本発明による眼科用組成物において等張化剤の濃度は、１００ｍＭ～１５０ｍＭであってもよい。
【0023】
本発明の一具体例において、本発明による眼科用組成物は、タンパーナセプト、ｐＨ５．５～ｐＨ６．０のバッファーシステム、等張化剤及び水からなる。一実施例において、本発明による眼科用組成物は、タンパーナセプト、シートレート緩衝剤を含むｐＨ５．５～ｐＨ６．０のバッファーシステム、塩化ナトリウム及び水からなる。
【0024】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、加速または過酷な条件下でも非常に安定している。
【0025】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後の電荷変異体の量が２０％以下であってもよい。
【0026】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後の塩基性変異体の量が１０％以下であってもよい。
【0027】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、加速条件下で６ヶ月保管後の酸性変異体の量が１０％以下である。
【0028】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後のタンパーナセプトの電荷変異体の量が２０％以下である。
【0029】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後のタンパーナセプトの塩基性変異体の量が１０％以下である。
【0030】
本発明によるタンパーナセプト含有眼科用組成物は、長期保管条件下で３６ヶ月保管後のタンパーナセプトの酸性変異体の量が１０％以下である。
【0031】
本発明による眼科用薬学組成物は、タンパーナセプトの物理化学的及び生物学的安定性を向上させることにより、眼乾燥症などのＴＮＦ－媒介眼疾患を患っている患者に点滴投与などの通常の方法により投与されてもよい。
【発明の効果】
【0032】
ヒスチジン、スクロースなどの安定化剤の使用は、タンパーナセプト由来の酸性／塩基性変異体などの不純物の生成を引き起こし、生物学的活性に影響を及ぼすことが本発明により明らかになった。本発明による眼科用薬学組成物は、このような安定化剤の使用を排除する代わりに、ｐＨを調節して冷蔵保存条件だけでなく、加速条件及び過酷条件においてもこのような不純物の生成を著しく減少させて安定したタンパーナセプト眼科用組成物を製造しうる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】３７℃で０週～４週間保管後のタンパーナセプトの等電点電気泳動（ＩＥＦ）結果を示す。
【図2】３７℃で０週～４週間保管後のタンパーナセプトのＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図3】電荷変異体のＩＥＦ分析結果を示す。
【図4】電荷変異体のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図5】安定化剤を含まない対照群と、安定化剤としてメチオニン、グリシン、ヒスチジン塩酸塩、スクロースをそれぞれ含む安定化剤スクリーニング溶液群のＩＥＸ－ＨＰＬＣ主ピーク変化量を示す。
【図6】安定化剤を含まない対照群と、安定化剤としてメチオニン、グリシン、ヒスチジン塩酸塩、スクロースをそれぞれ含む安定化剤スクリーニング溶液群のＩＥＸ－ＨＰＬＣ酸性変異体変化量を示す。
【図7】安定化剤を含まない対照群と、安定化剤としてメチオニン、グリシン、ヒスチジン塩酸塩、スクロースをそれぞれ含む安定化剤スクリーニング溶液群のＩＥＸ－ＨＰＬＣ塩基性変異体変化量を示す。
【図8】様々なｐＨ及び安定化剤の条件によるタンパーナセプト眼科用組成物の４０℃、４週間保管後の安定性をＲＰ－ＨＰＬＣ変異体により分析した結果を示す。
【図9】様々なｐＨ及び安定化剤の条件によるタンパーナセプト眼科用組成物の４０℃、４週間保管後の安定性をＩＥＸ－ＨＰＬＣ主ピーク変化量によって示したものである。
【図10】様々なｐＨ及び安定化剤の条件によるタンパーナセプト眼科用組成物の４０℃、４週間保管後の安定性をＩＥＸ－ＨＰＬＣ酸性変異体変化量によって示したものである。
【図11】様々なｐＨ及び安定化剤の条件によるタンパーナセプト眼科用組成物の４０℃、４週間保管後の安定性をＩＥＸ－ＨＰＬＣ塩基性変異体変化量により示したものである。
【図12】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図13】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図14】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図15】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体分析結果を示す。
【図16】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体分析結果を示す。
【図17】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体分析結果を示す。
【図18】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性電荷変異体分析結果を示す。
【図19】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性電荷変異体分析結果を示す。
【図20】４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性電荷変異体分析結果を示す。
【図21】タンパーナセプト眼科用組成物の安定性をＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析結果を通じて示す。
【図22】タンパーナセプト眼科用組成物の安定性をＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析結果を通じて示す。
【図23】タンパーナセプト眼科用組成物の安定性をＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析結果を通じて示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明の利点、特徴、及びそれらを達成する方法は、後述する製造例、実施例、実験例を参照すれば、明らかになるであろう。しかし、これらは本発明の理解を助けるためのものであり、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではない。
【0035】
実験例１：タンパーナセプト電荷変異体の分析
電荷変異体の生成は薬物活性、安定性、安全性に影響を及ぼしうるため、本発明者らは、まず、タンパーナセプトの電荷変異体について分析した。タンパーナセプトを３７℃で４週間保管した後、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析を行った。
電荷変異体の生成は薬物活性、安定性、安全性に影響を及ぼしうるため、本発明者らは、まず、タンパーナセプトの電荷変異体について分析した。タンパーナセプトを３７℃で４週間保管した後、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析を行った。
【0036】
等電点電気泳動法
－ｐＨ３．０～ｐＨ７．０の範囲のゲルでｗｅｌｌ当たり１０μｇをローディングし、１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、５００Ｖで３０分間電気泳動を行った。１２％ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄで３０分間固定させた後、クマシーブルーで染色した。
－ｐＨ３．０～ｐＨ７．０の範囲のゲルでｗｅｌｌ当たり１０μｇをローディングし、１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、５００Ｖで３０分間電気泳動を行った。１２％ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄで３０分間固定させた後、クマシーブルーで染色した。
【0037】
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）は、イオン交換体を使用してタンパク質の純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）によるカラムの固定相との親和度によってタンパク質を分離する。本試験法は、カチオン交換カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２８０ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）は、イオン交換体を使用してタンパク質の純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）によるカラムの固定相との親和度によってタンパク質を分離する。本試験法は、カチオン交換カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２８０ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
【0038】
電荷変異体の分離精製
タンパーナセプト眼科用組成物に存在する電荷変異体の特性によって分離して分析するために、ＳＰ－ＨＰカラムとタンパク質分離用液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いて塩濃度に応じて分離精製を行った。電荷変異体の特性によって酸性変異体（Ａ）、主ピーク試料（Ｂ）、塩基性変異体（Ｃ）で試料を準備し、それぞれＩＥＦとＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析を行った。
タンパーナセプト眼科用組成物に存在する電荷変異体の特性によって分離して分析するために、ＳＰ－ＨＰカラムとタンパク質分離用液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いて塩濃度に応じて分離精製を行った。電荷変異体の特性によって酸性変異体（Ａ）、主ピーク試料（Ｂ）、塩基性変異体（Ｃ）で試料を準備し、それぞれＩＥＦとＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析を行った。
【0039】
図１は、３７℃で０週～４週間保管後のタンパーナセプトの等電点電気泳動（ＩＥＦ）結果を示す。
【0040】
等電点電気泳動の結果、図１Ａに示すように、保管期間が増えるほど低いｐＩ値位置でバンドが濃くなり、タンパーナセプトの酸性変異体の生成が非常に明確であることが確認された。
【0041】
図２は、３７℃で０～４週間保管後のタンパーナセプトのＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【0042】
ＩＥＸ－ＨＰＬＣの結果からも、図２に示すように、保管期間が長くなるほど酸性変異体の量が増加することが確認された。
【0043】
電荷変異体の特性を調べるために、ＳＰ－ＨＰカラムを用いて電荷によって分離して得られた酸性変異体、主ピーク試料、塩基性変異体試料をＩＥＦとＩＥＸ－ＨＰＬＣで分析した。
【0044】
図３は、電荷変異体のＩＥＦ分析結果を示し、図４は、電荷変異体のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。図３及び図４から分かるように、酸性変異体のみを分離したＡ試料は、クロマトグラムで主ピーク試料よりも前部に溶出され、またＩＥＦ結果からも主ピーク試料より低いｐＩを有することが分かる。これに加えて、塩基性変異体試料であるＢ試料は、クロマトグラム結果において主ピーク試料よりも後部に溶出され、ＩＥＦ結果からも主ピーク試料を含めて多少高いｐＩ値を示すことが分かった。
【0045】
実験例２：眼科用安定化剤のスクリーニング
【0046】
タンパク質組成物に添加される安定化剤は、患者に投与する前まで製剤を安定して保管するために必要である。これらを添加して保管中に誘発され得る凝集物や電荷変異体などの不純物を最小化し、保管期間中に安定した製剤に維持できるようにする。したがって、タンパク質組成物において主成分を安定化させる適切な安定化剤を選択して安定した組成物を製造することは何よりも重要である。本発明者らは、主成分であるタンパーナセプトを安定化させる安定化剤の種類を選定するための各安定化剤における過酷試験（４０℃、４週間保管）を行うため、まず、下記のような実験を行った。
【0047】
１）タンパーナセプト溶液試料の製造
１２５ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤に含まれる１０ｍｇ／ｍＬのタンパーナセプト溶液を製造した。
１２５ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤に含まれる１０ｍｇ／ｍＬのタンパーナセプト溶液を製造した。
【0048】
２）緩衝剤ｐＨ７．０、２０ｍＭクエン酸リン酸塩の製造
超純水９００ｍＬにクエン酸無水物０．３７ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５８ｇを加えてよく混合した。３７％塩酸または４０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に滴定した後、超純水を添加して最終１Ｌで製造した。
超純水９００ｍＬにクエン酸無水物０．３７ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５８ｇを加えてよく混合した。３７％塩酸または４０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に滴定した後、超純水を添加して最終１Ｌで製造した。
【0049】
３）安定化剤スクリーニング溶液の製造
２）で製造した緩衝剤１００ｍＬに安定化剤４種（メチオニン０．１４９ｇ、グリシン０．７５１ｇ、ヒスチジン塩酸塩１．５５ｇ、スクロース６．８４ｇ）をそれぞれ添加してｐＨ７．０の４種類の安定化剤スクリーニング用組成物を製造した。
２）で製造した緩衝剤１００ｍＬに安定化剤４種（メチオニン０．１４９ｇ、グリシン０．７５１ｇ、ヒスチジン塩酸塩１．５５ｇ、スクロース６．８４ｇ）をそれぞれ添加してｐＨ７．０の４種類の安定化剤スクリーニング用組成物を製造した。
【0050】
【表1】
【0051】
４）試料の製造及び評価
３．５ｋＤａ遠心分離フィルターにタンパーナセプトと３）で製造した眼科用安定化剤スクリーニング用溶液を１０ｍＬ添加後、４℃、４０００ｒｐｍで試料を遠心分離し、前記１）のタンパーナセプトの緩衝剤から３）の安定化剤スクリーニング用緩衝剤に置換した。前記過程を繰り返してタンパーナセプト１ｍｇ／ｍＬを含む安定化剤スクリーニング用溶液（試料）を製造した。これを４０℃、４週間保管して０週目、４週目試料をＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析して各試料で確認される物理化学的不純物を分析した。
３．５ｋＤａ遠心分離フィルターにタンパーナセプトと３）で製造した眼科用安定化剤スクリーニング用溶液を１０ｍＬ添加後、４℃、４０００ｒｐｍで試料を遠心分離し、前記１）のタンパーナセプトの緩衝剤から３）の安定化剤スクリーニング用緩衝剤に置換した。前記過程を繰り返してタンパーナセプト１ｍｇ／ｍＬを含む安定化剤スクリーニング用溶液（試料）を製造した。これを４０℃、４週間保管して０週目、４週目試料をＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析して各試料で確認される物理化学的不純物を分析した。
【0052】
【表2】
【0053】
表２及び図５～７は、安定化剤を含まない対照群と、安定化剤としてメチオニン、グリシン、ヒスチジン塩酸塩、スクロースをそれぞれ含む安定化剤スクリーニング溶液群のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【0054】
その結果、表２及び図５～７に示すように、スクロースとヒスチジン塩酸塩を含む場合、塩基性変異体及び酸性変異体の生成量が減少する傾向が現れることが確認された。特に、ヒスチジン塩酸塩の場合、対照群や他の安定化剤に対して酸性変異体の生成量を大きく減少させることが確認された。
【0055】
実験例３：様々なｐＨを有する眼科用組成物の製造及び安定性の評価
涙のｐＨは、ｐＨ７．０～７．５であるので、これと類似したｐＨ条件で眼科用組成物を設定することが最も好ましいが、タンパク質の安定性は、ｐＨによっても大きく影響を受けることができるため、様々なｐＨを有する眼科用組成物を製造し、その安定性を評価した。
涙のｐＨは、ｐＨ７．０～７．５であるので、これと類似したｐＨ条件で眼科用組成物を設定することが最も好ましいが、タンパク質の安定性は、ｐＨによっても大きく影響を受けることができるため、様々なｐＨを有する眼科用組成物を製造し、その安定性を評価した。
【0056】
（１）眼科用組成物の製造
１）緩衝剤ｐＨ５．０～ｐＨ７．０、２０ｍＭクエン酸リン酸塩の製造
超純水４００ｍＬにクエン酸無水物とリン酸水素二ナトリウムを各ｐＨに合わせて加えてよく混合した。（ｐＨ５．０／５．５緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．６２ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．９７ｇ／／ｐＨ６．０／６．５緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．４３ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．１１ｇ／／ｐＨ７．０緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．１９ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．２９ｇ）３７％塩酸または４０％水酸化ナトリウムを用いて各条件に合うｐＨ５．０～ｐＨ７．０に滴定した後、超純水を添加して最終５００ｍＬで製造した。
１）緩衝剤ｐＨ５．０～ｐＨ７．０、２０ｍＭクエン酸リン酸塩の製造
超純水４００ｍＬにクエン酸無水物とリン酸水素二ナトリウムを各ｐＨに合わせて加えてよく混合した。（ｐＨ５．０／５．５緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．６２ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．９７ｇ／／ｐＨ６．０／６．５緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．４３ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．１１ｇ／／ｐＨ７．０緩衝剤製造の場合；クエン酸無水物０．１９ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．２９ｇ）３７％塩酸または４０％水酸化ナトリウムを用いて各条件に合うｐＨ５．０～ｐＨ７．０に滴定した後、超純水を添加して最終５００ｍＬで製造した。
【0057】
２）安定化剤を添加した眼科用組成物の製造（ｐＨ５．０～ｐＨ７．０）
１）で製造したｐＨ５．０～ｐＨ７．０に該当する緩衝剤５種の各１００ｍＬにスクロース６．８５ｇとヒスチジン１．５５ｇを添加してスクロース２００ｍＭを含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤５種とヒスチジン１００ｍＭを含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤５種を製造した。安定化剤未含有実験群としては、１）で製造したｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤をそのまま使用し、安定化剤が含まれていない／含まれているｐＨ５．０～ｐＨ７．０の緩衝剤を計１５種製造した。
１）で製造したｐＨ５．０～ｐＨ７．０に該当する緩衝剤５種の各１００ｍＬにスクロース６．８５ｇとヒスチジン１．５５ｇを添加してスクロース２００ｍＭを含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤５種とヒスチジン１００ｍＭを含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤５種を製造した。安定化剤未含有実験群としては、１）で製造したｐＨ５．０～ｐＨ７．０の２０ｍＭのクエン酸リン酸塩緩衝剤をそのまま使用し、安定化剤が含まれていない／含まれているｐＨ５．０～ｐＨ７．０の緩衝剤を計１５種製造した。
【0058】
３）試料の製造及び評価
３．５ｋＤａ遠心分離フィルターを用いて２）で製造した緩衝剤４ｍＬとタンパーナセプトを添加後、４℃、４０００ｒｐｍで試料を遠心分離して従来のタンパーナセプトの緩衝剤から安定化剤を含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の緩衝剤に置換した。前記過程を繰り返して互いに異なるｐＨと安定化剤を含む１５種の試料を製造した。これを４０℃、４週間保管して０週目、４週目試料を分析し、各試料から確認される物理化学的不純物を分析した。
３．５ｋＤａ遠心分離フィルターを用いて２）で製造した緩衝剤４ｍＬとタンパーナセプトを添加後、４℃、４０００ｒｐｍで試料を遠心分離して従来のタンパーナセプトの緩衝剤から安定化剤を含むｐＨ５．０～ｐＨ７．０の緩衝剤に置換した。前記過程を繰り返して互いに異なるｐＨと安定化剤を含む１５種の試料を製造した。これを４０℃、４週間保管して０週目、４週目試料を分析し、各試料から確認される物理化学的不純物を分析した。
【0059】
【表3】
【0060】
（２）ｐＨ及び安定化剤によるタンパーナセプト安定性の評価
１）逆相クロマトグラフィーによる分析
ＲＰ－ＨＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー）は、タンパク質の極性に応じて純度を評価する方法である。本試験法は、逆相クロマトグラフィーカラムと温度制御部（６０℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２１４ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
１）逆相クロマトグラフィーによる分析
ＲＰ－ＨＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー）は、タンパク質の極性に応じて純度を評価する方法である。本試験法は、逆相クロマトグラフィーカラムと温度制御部（６０℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２１４ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
【0061】
前記製造した１５種の試料を過酷条件（４０℃保管）で４週間保管して０週目、４週目試料を分析し、各試料から確認される変異体の生成変化量を比較した。その結果、表４及び図８に示すように、ｐＨ７．０では安定化剤未含有実験群に対してスクロースまたはヒスチジンを安定化剤として含む実験群が低い変異体生成率を示した。しかし、ヒスチジンを安定化剤として含む実験群の場合、ｐＨ５．０～ｐＨ６．５でいずれも対照群より高い変異体生成率を示し、スクロースを安定化剤として含む実験群の場合、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で対照群より高い生成率を示した。
【0062】
【表4】
【0063】
２）イオン交換高性能液体クロマトグラフィーによる分析
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）は、イオン交換体を使用してタンパク質の純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）によるカラムの固定相との親和度によってタンパク質を分離する。本試験法は、カチオン交換カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２８０ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（イオン交換高性能液体クロマトグラフィー）は、イオン交換体を使用してタンパク質の純電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）によるカラムの固定相との親和度によってタンパク質を分離する。本試験法は、カチオン交換カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２８０ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
【0064】
先に製造した１５種の試料を過酷条件（４０℃保管）で４週間保管し、０週目、４週目試料を分析し、各試料から確認される酸性／塩基性変異体の生成変化量を比較した。
【0065】
その結果、表５及び図９～１１に示すように、酸性変異体の生成量の側面からｐＨ５．０～ｐＨ６．５で安定化剤未含有群は、スクロースやヒスチジン含有実験群より良い結果を示した。特に、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で安定化剤未含有実験群は、１０％未満の酸性変異体生成量の変化を示した。塩基性変異体の場合、ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で安定化剤未含有群は、スクロースやヒスチジン含有実験群より良い結果を示した。ｐＨ６．５～ｐＨ７．０では、スクロース含有実験群が最も低い塩基性変異体生成量の変化を示し、ヒスチジン含有実験群の場合、安定化剤未含有群とは大差はなかった。
【0066】
【表5】
【0067】
前記結果を分析した結果、ｐＨ７．０では安定化剤未含有群よりもスクロースやヒスチジン含有群の方が変異体生成量が低い傾向を示したが、ｐＨがｐＨ５．５またはｐＨ６．０と低くなると、むしろスクロースやヒスチジン含有群の変異体生成量が安定化剤未含有群に比べてかなり高くなる傾向性が確認できた。
【0068】
実験結果を総合的に分析した結果、予想とは異なり、タンパーナセプト眼科用組成物は、ｐＨ５．５～ｐＨ６．０で安定化剤を未含有群が最も低い変異体生成量を示すことが把握された。
【0069】
一般的に眼科用組成物は、生体内のｐＨ条件に類似するようにｐＨ７．０に設定することを考慮しているが、眼科用組成物において有効成分の安定性は薬効発揮の重要な要素であるので、本発明によるタンパーナセプト眼科用組成物は、ｐＨ５．５～６．０にｐＨを設定し、スクロースやヒスチジンは含まないことが好ましいという結論を得た。
【0070】
実験例４：バッファーシステムによる安定性の評価
タンパーナセプトの濃度、ｐＨ、塩化ナトリウムの濃度、浸透圧などは固定し、バッファーの組成及び機能性賦形剤２種の添加の有無の差を比較するための４つの群を構成し、４℃、２５℃、４０℃条件で最終製剤の選定のためのスクリーニングを行った。眼科用組成物のｐＨは、先の実験結果を
考慮してｐＨ５．５に固定し、この範囲で一般的に使用可能な基本バッファーとして、酢酸ナトリウム（２０ｍＭ）とクエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を使用してバッファーシステムによるタンパーナセプトの安定性を評価した。
タンパーナセプトの濃度、ｐＨ、塩化ナトリウムの濃度、浸透圧などは固定し、バッファーの組成及び機能性賦形剤２種の添加の有無の差を比較するための４つの群を構成し、４℃、２５℃、４０℃条件で最終製剤の選定のためのスクリーニングを行った。眼科用組成物のｐＨは、先の実験結果を
考慮してｐＨ５．５に固定し、この範囲で一般的に使用可能な基本バッファーとして、酢酸ナトリウム（２０ｍＭ）とクエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を使用してバッファーシステムによるタンパーナセプトの安定性を評価した。
【0071】
下記表６に示すように、４つのタンパーナセプト眼科用組成物を製造してタンパーナセプトの安定性を試験した。
【0072】
【表6】
【0073】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析とＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析を通じて、タンパーナセプト眼科用組成物の安定性試験を行った。安定性試験は、４℃、２５℃、４０℃の条件で計２ヶ月間行い、０週、２週、１ヶ月、２ヶ月の時点でＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析とＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析を行った。
【0074】
（１）ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー）は、多孔質ゲルで満たされたカラムの固定相試料を注入し、サイズに応じた差によってタンパク質を分離する。本試験法は、サイズ排除カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２１４ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー）は、多孔質ゲルで満たされたカラムの固定相試料を注入し、サイズに応じた差によってタンパク質を分離する。本試験法は、サイズ排除カラムと温度制御部（２５℃設定）、自動サンプル抽出器（４℃設定）、２１４ｎｍが駆動されるＵＶ検出器と０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速を維持できる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行った。
【0075】
表７～９、及び図１２～１４は、前記４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果、温度が高いほど凝集物が増加する傾向を示し、特にアセテートバッファー使用製剤の場合に急速に生成されることが把握された。シートレートバッファーを使用した３つの製剤は、ＦＦＳ３が４℃、２ヶ月の結果において高く測定された。２５℃、４０℃２週間、１ヶ月、２ヶ月すべての条件でＦＦＳ２の賦形剤を使用していない場合、最も安定した結果を示した。
【0076】
【表7】
【0077】
【表8】
【0078】
【表9】
【0079】
（２）ＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体の分析
表１０～１２、及び図１５～１７は、前記４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体分析結果を示す。
表１０～１２、及び図１５～１７は、前記４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた酸性変異体分析結果を示す。
【0080】
【表10】
【0081】
【表11】
【0082】
【表12】
【0083】
（３）ＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性変異体分析
表１３～１５、及び図１８～２０は、前記４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性電荷変異体分析結果を示す。
表１３～１５、及び図１８～２０は、前記４種のタンパーナセプト眼科用組成物を４℃、２５℃、４０℃の条件で保管しながら行ったＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた塩基性電荷変異体分析結果を示す。
【0084】
【表13】
【0085】
【表14】
【0086】
【表15】
【0087】
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析では、すべての製剤が４０℃の高温保存条件で酸性及び塩基性電荷変異体が増加する傾向を示し、アセテートバッファー（ＦＦＳ１）製剤では、塩基性変異体がすべての温度で明らかに増加するパターンを示した。
【0088】
結論として、凝集物及び塩基性変異体生成の側面から、シートレートバッファー（ＦＦＳ２～４）に比べてアセテートバッファー（ＦＦＳ１）の安定性が相対的に低下することを確認した。また、シートレートバッファーの組成に基づいて機能性賦形剤を添加した群と機能性賦形剤を添加していない群の比較時、賦形剤を使用していない群が最も安定していたことが示され、製品製造工程の単純化、製造工程上の汚染及び均一性の問題などを総合的に考慮し、シートレートバッファー（ＦＦＳ２）を使用する剤形を最終剤形として選定した。しかし、涙の生理学的ｐＨが中性であることを考慮し、物質安定性が受容可能な水準で患者のコンプライアンスがより高いと予想されるｐＨ６．０を最終製品のｐＨとして選択した。
【0089】
製造例１：タンパーナセプト眼科用組成物の製造
超純水９００ｍｌにクエン酸トリナトリウム二水和物（Ｔｒｉ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）５．３５ｇ、クエン酸無水物（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）０．３５ｇ、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．３ｇを入れて完全に溶かして緩衝剤を製造した。製造した緩衝剤のｐＨは、ｐＨ６．０±０．１であることを確認した後、メスシリンダーを用いて最終１Ｌに合わせて０．２２μｍ ｂｏｔｔｌｅ ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍでろ過した。
超純水９００ｍｌにクエン酸トリナトリウム二水和物（Ｔｒｉ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）５．３５ｇ、クエン酸無水物（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）０．３５ｇ、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．３ｇを入れて完全に溶かして緩衝剤を製造した。製造した緩衝剤のｐＨは、ｐＨ６．０±０．１であることを確認した後、メスシリンダーを用いて最終１Ｌに合わせて０．２２μｍ ｂｏｔｔｌｅ ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍでろ過した。
【0090】
前記製造された緩衝剤にタンパーナセプトを含めて、下記のような組成のタンパーナセプト０．２５％の点眼剤組成物を製造した。
【0091】
【表16】
【0092】
実験例５：タンパーナセプト眼科用組成物の安定性の評価
製造例１によるタンパーナセプト眼科用組成物の安定性を評価した。
製造例１によるタンパーナセプト眼科用組成物の安定性を評価した。
【0093】
長期保管条件は５℃（湿度微調節）、加速条件は、２５℃／６０％ＲＨに設定して製造例１の組成物を保管し、前述したＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析とＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析を行った。
【0094】
【表17】
【0095】
表１７及び図２１は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いた凝集物分析結果を示す。表１７及び図２１に示すように、製造例１の組成物は、５℃長期保管条件で３年間保管したとき、凝集物が５％以内で誘発されて安定していることが確認された。また、２５℃／６０％ＲＨ加速条件で６ヶ月間保管したとき、５％以内で誘発されたことを確認した。
【0096】
【表18】
【0097】
表１８及び図２２～図２３は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣを用いた電荷変異体分析結果を示す。表１８及び図２２～図２３に示すように、製造例１の組成物は、５℃長期保管条件で３年間保管したとき、酸性変異体１０％以内で誘発され、保管期間中に安定していることが確認された。塩基性変異体も１０％以内で誘発され、保管期間中に安定していることが確認された
【0098】
また、２５℃／６０％ＲＨ加速条件で６ヶ月間保管した際、酸性変異体１０％以内で誘発されたことを確認した。塩基性変異体も１０％以内で誘発され、保管期間中に安定していることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【国際調査報告】