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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-25
(54)【発明の名称】ポリペプチドの骨特異的送達法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/663 20060101AFI20240118BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240118BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240118BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240118BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240118BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240118BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240118BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240118BHJP
【ＦＩ】
A61K31/663
A61P35/00
A61P19/08
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/04
A61K47/68
A61K47/64
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K39/395 D
A61K39/395 L
A61K39/395 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023543156
(86)(22)【出願日】2022-01-19
(85)【翻訳文提出日】2023-08-31
(86)【国際出願番号】 US2022012982
(87)【国際公開番号】W WO2022159492
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】63/138,972
(32)【優先日】2021-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510166102
【氏名又は名称】ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＬＬＩＡＭ ＭＡＲＳＨ ＲＩＣＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】６１００ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ７７００５， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(71)【出願人】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】シャオ ハン
(72)【発明者】
【氏名】チャン シャン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA17
4C076AA22
4C076AA29
4C076AA36
4C076AA53
4C076AA94
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076CC09
4C076CC27
4C076EE41
4C076FF67
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA06
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA96
4C084ZB26
4C084ZC75
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085EE05
4C085GG01
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA34
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA06
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA96
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本開示は、骨標的化ポリペプチドコンジュゲートを投与することによって、骨がん、がんの骨転移、又は骨粗しょう症などの骨疾患を治療するための方法を提供する。この骨標的化ポリペプチドコンジュゲートは、骨標的化抗体コンジュゲートであり得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における骨腫瘍を治療又は予防する方法であって、抗体にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項2】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＢＰが、負に帯電している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＢＰが、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、イバンドロネートポミドロネート、ネリドネート、オルパドロネート、又はオキシドロネートである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＢＰが、アレンドロネート（ＡＬＮ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記抗体が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記抗体が、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗体が、トラスツズマブである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
骨標的化コンジュゲートが、トラスツズマブにコンジュゲートされたアレンドロネートを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記抗体が、抗Ｍ－ＣＳＦ抗体ではない、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＢＰが、前記抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンにコンジュゲートされない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＢＰが、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション、ＮＨＳ－エステルケミストリー、又はシステインケミストリーを使用して、前記抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＢＰが、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションを使用して、前記抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＢＰが、前記抗体のＣＨ２－ＣＨ３接合部にコンジュゲートされている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＢＰが、４－フルオロフェニルカルバメートリジン（ＦＰｈｅＫ）を使用して、前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＦＰｈｅＫが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのプロテインＡのＢドメインの断片（ＦＢタンパク質）に結合されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションが、アジド官能性部分を含む抗体の、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）で官能化されたＢＰとのコンジュゲーションを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記骨標的化コンジュゲートが、骨腫瘍ニッチにおける治療用抗体の濃度の増加をもたらし、前記骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他臓器への二次転移を制限する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記骨標的化コンジュゲートが、微小転移誘発性溶骨性病変の減少をもたらす、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
追加の抗がん療法を更に行うことを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記追加の抗がん療法が、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記追加の抗がん療法が、免疫療法又は化学療法を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
がんを有する対象における骨腫瘍の治療又は予防のための、抗体にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む骨標的化コンジュゲートの使用。
【請求項32】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項３１に記載の使用。
【請求項33】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項３２に記載の使用。
【請求項34】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項３２に記載の使用。
【請求項35】
前記ＢＰが、負に帯電している、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項36】
前記ＢＰが、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、イバンドロネートポミドロネート、ネリドネート、オルパドロネート、又はオキシドロネートである、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項37】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項38】
前記抗ＨＥＲ２抗体が、トラスツズマブである、請求項３７に記載の使用。
【請求項39】
前記ＢＰが、前記抗体のＣＨ２－ＣＨ３接合部にコンジュゲートされている、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項40】
前記ＢＰが、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション、ＮＨＳ－エステルケミストリー、又はシステインケミストリーを使用して、前記抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項41】
前記ＢＰが、４－フルオロフェニルカルバメートリジン（ＦＰｈｅＫ）を使用して、前記抗体にコンジュゲートされている、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項42】
対象における骨疾患を治療又は予防する方法であって、１つ以上のポリペプチドにコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項43】
前記骨疾患が、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記骨疾患が、骨がん又は骨転移である、請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
前記ＢＰが、負に帯電している、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記ＢＰが、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、イバンドロネートポミドロネート、ネリドネート、オルパドロネート、又はオキシドロネートである、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記ＢＰが、アレンドロネート（ＡＬＮ）である、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記１つ以上のポリペプチドが、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、サイトトキシン、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、又は腫瘍抑制剤を含む、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記１つ以上のポリペプチドが、抗体を含む、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記抗体が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項５４～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項５４～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記抗体が、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブである、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記抗体が、トラスツズマブである、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
骨標的化コンジュゲートが、トラスツズマブにコンジュゲートされたアレンドロネートを含む、請求項４２～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記抗体が、抗Ｍ－ＣＳＦ抗体ではない、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記ＢＰが、前記抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンにコンジュゲートされない、請求項５４～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記ＢＰが、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション、ＮＨＳ－エステルケミストリー、又はシステインケミストリーを使用して、前記１つ以上のポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされている、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記ＢＰが、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションを使用して、前記１つ以上のポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされている、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記ＢＰが、前記抗体のＣＨ２－ＣＨ３接合部にコンジュゲートされている、請求項５４～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記ＢＰが、４－フルオロフェニルカルバメートリジン（ＦＰｈｅＫ）を使用して、前記１つ以上のポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項４２～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
ＦＰｈｅＫが、スタフィロコッカス・アウレウスからのプロテインＡのＢドメインの断片（ＦＢタンパク質）に結合されている、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションが、アジド官能性部分を含む抗体の、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）で官能化されたＢＰとのコンジュゲーションを含む、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記骨標的化コンジュゲートが、骨腫瘍ニッチにおける治療用抗体の濃度の増加をもたらし、前記骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他臓器への二次転移を制限する、請求項５４～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記骨標的化コンジュゲートが、微小転移誘発性溶骨性病変の減少をもたらす、請求項４４～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
追加の抗がん療法を更に行うことを含む、請求項４４～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記追加の抗がん療法が、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記追加の抗がん療法が、免疫療法又は化学療法を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項75】
対象における骨疾患の治療又は予防のための、１つ以上のポリペプチドにコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む骨標的化コンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２１年１月１９日出願の米国仮出願第６３／１３８，９７２号の優先権の利益を主張し、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月１９日出願の米国仮出願第６３／１３８，９７２号の優先権の利益を主張し、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府支援の研究又は開発に関する声明
本発明は、国防省によって授与された承認Ｗ８１ＸＷＨ－１６－１－００７３及びＷ８１ＸＷＨ－２１－１－０７８９の下、政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において、ある特定の権利を有する。
本発明は、国防省によって授与された承認Ｗ８１ＸＷＨ－１６－１－００７３及びＷ８１ＸＷＨ－２１－１－０７８９の下、政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において、ある特定の権利を有する。
【0003】
１．分野
本開示は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、抗体の部位特異的送達の方法に関する。
本開示は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、抗体の部位特異的送達の方法に関する。
【背景技術】
【0004】
２．関連技術
モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、及び他を使用するものを含む、抗体に基づく療法は、様々ながんを治療するそれらの力量の観点において、臨床的潜在性が認識されている１～４。それにもかかわらず、ほとんどの治療用抗体がそれらの標的に対して高い親和性を有するという事実にもかかわらず、正常な組織におけるこれらの同じ標的の存在は、健康な細胞において許容することができない「オンターゲット」毒性を誘発することなくそれらの標的を攻撃する治療剤の能力を劇的に制限する場合がある５～７。更に、脳又は骨などのいくつかの組織への治療用抗体の送達レベルの低さは、これらの組織における疾患の治療において、それらの有効性を顕著に制限し得る８。したがって、抗体の抗原及び組織特異性の両方を向上することは、最終的にがんの臨床治療のための抗体療法の有効性を変化させる可能性が高い。
モノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、及び他を使用するものを含む、抗体に基づく療法は、様々ながんを治療するそれらの力量の観点において、臨床的潜在性が認識されている１～４。それにもかかわらず、ほとんどの治療用抗体がそれらの標的に対して高い親和性を有するという事実にもかかわらず、正常な組織におけるこれらの同じ標的の存在は、健康な細胞において許容することができない「オンターゲット」毒性を誘発することなくそれらの標的を攻撃する治療剤の能力を劇的に制限する場合がある５～７。更に、脳又は骨などのいくつかの組織への治療用抗体の送達レベルの低さは、これらの組織における疾患の治療において、それらの有効性を顕著に制限し得る８。したがって、抗体の抗原及び組織特異性の両方を向上することは、最終的にがんの臨床治療のための抗体療法の有効性を変化させる可能性が高い。
【0005】
転移性乳がん（ＢＣａ）の初期診断を受けた患者の半数が、骨転移を発症する９。骨格転移のみを有する患者は、通常、重要な臓器転移を有する患者よりも良好な予後を有する９、１０。更に、骨転移は、脊髄圧迫、病理学的骨折、及び高カルシウム血症などの重篤な症状に関連付けられる１１。分子機序の理解の深さ１２、１３にもかかわらず、がん細胞を排除することができる有効な療法は、依然として不足している１４。骨は、播種性転移の最終的な目的地ではない。最近のゲノム分析によって、頻繁な「転移の繰り返し（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－ｔｏ－ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」の播種が明らかになっている１５～１７。骨のみの転移のうちの３分の２以上が、その後の他臓器への二次転移を発症し、最終的には、患者の死をもたらす９、１０。実際、骨ではない臓器で最初に同定されたいくつかの転移は、実際には無症状の骨微小転移（ＢＭＭ）からの播種の結果である。これは明らかに、がん細胞が最初に骨に到達し、次いで、骨及び他の部位の両方でより明白な転移を確立することを可能にする、より攻撃的な表現型を獲得した結果である１８。したがって、ＢＭＭが骨組織及び骨ではない組織の両方でより明白な転移を確立するのを防止するための戦略に対する必要性は、満たされていない。
【0006】
ターゲティングされた抗体療法及び免疫療法は、現在、転移性乳がんを治療するための新しい手段として台頭しているが、骨転移を有する患者におけるこれらの薬剤の性能は、失望的である。例えば、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的とするトラスツズマブ（ハーセプチン）及びペルツズマブ（パージェタ）抗体は、アジュバント及び転移性環境で患者を治療するために使用されている。多くのＢＣａ患者が、これらの治療の恩恵を受けているが、骨転移を有するＢＣａ患者の多数において、疾患は、１年以内に進行し、長い寛解を経験する患者はほとんどいない１９～２２。転移性トリプルネガティブＢＣａを有する患者においてアテゾリズマブを試験する別の第ＩＩＩ相臨床試験では、無増悪生存期間は、プラセボ群よりもアテゾリズマブ群で顕著に長かった。しかしながら、骨転移を有するＢＣａ患者の間では、アテゾリズマブ治療群とプラセボ群との間で、進行又は死亡のリスクについて顕著な差は観察されなかった２３。したがって、骨転移を有するＢＣａ患者の転帰を改善する療法が高く望まれている。
【発明の概要】
【0007】
概要
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における骨疾患を治療又は予防するための方法であって、ポリペプチド又はタンパク質にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。一実施形態では、本開示は、対象における骨腫瘍を治療又は予防するための方法であって、抗体にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における骨疾患を治療又は予防するための方法であって、ポリペプチド又はタンパク質にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。一実施形態では、本開示は、対象における骨腫瘍を治療又は予防するための方法であって、抗体にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む有効量の骨標的化コンジュゲートを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。
【0008】
ある特定の態様では、骨疾患は、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である。本明細書で提供される方法及び組成物は、皮質骨及び／若しくは海綿骨量減少を低減し、皮質骨及び／若しくは海綿骨のミネラル含有量減少を低減し、骨の生体力学的耐性を改善し、骨形成を増加させ、並びに／又は骨吸収を低減するために使用することができる。
【0009】
いくつかの態様では、対象は、骨がん又は骨転移を有する。特定の態様では、骨がんは、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である。ある特定の態様では、骨転移は、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである。特定の態様では、骨転移は、乳がん骨転移である。いくつかの態様では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。ある特定の態様では、乳がんは、ＨＥＲ２陰性乳がんである。他の態様では、乳がんは、ＨＥＲ２陽性乳がんである。
【0010】
ある特定の態様では、ＢＰは、負に帯電している。いくつかの態様では、ＢＰは、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｉｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、イバンドロネートポミドロネート、ネリドネート、オルパドロネート、又はオキシドロネートである。特定の態様では、ＢＰは、アレンドロネート（ＡＬＮ）である。
【0011】
いくつかの態様では、ＢＰは、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、サイトトキシン、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、又は腫瘍抑制剤にコンジュゲートされる。
【0012】
いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである。ある特定の態様では、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。特定の態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体である。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブである。いくつかの態様では、骨ターゲティングコンジュゲートは、トラスツズマブにコンジュゲートされたアレンドロネートを含む。ある特定の態様では、抗体は、抗Ｍ－ＣＳＦ抗体ではない。
【0013】
ある特定の態様では、ＢＰは、抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンにコンジュゲートされない。いくつかの態様では、ＢＰは、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション、ＮＨＳ－エステルケミストリー、又はシステインケミストリーを使用して、抗体に部位特異的にコンジュゲートされる。特定の態様では、ＢＰは、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションを使用して、抗体に部位特異的にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、ＢＰは、抗体のＣＨ２－ＣＨ３接合部にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、ＢＰは、４－フルオロフェニルカルバメートリジン（ＦＰｈｅＫ）を使用して、抗体にコンジュゲートされる。特定の態様では、ＦＰｈｅＫは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのプロテインＡのＢドメインの断片（ＦＢタンパク質）に結合される。特定の態様では、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションは、アジド官能性部分を含む抗体の、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）で官能化されたＢＰとのコンジュゲーションを含む。
【0014】
ある特定の態様では、骨標的化コンジュゲートは、骨腫瘍ニッチにおける治療用抗体の濃度の増加をもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他臓器への二次転移を制限する。いくつかの態様では、骨標的化コンジュゲートは、微小転移誘発性溶骨性病変の減少をもたらす。
【0015】
追加の態様では、方法は、追加の抗がん療法を更に行うことを含む。いくつかの態様では、追加の抗がん療法は、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む。特定の態様では、追加の抗がん療法は、免疫療法又は化学療法を含む。
【0016】
更なる実施形態は、がんを有する対象における骨腫瘍の治療又は予防のための、抗体にコンジュゲートされたビスホスホネート（ＢＰ）を含む骨標的化コンジュゲートの使用を提供する。
【0017】
いくつかの態様では、対象は、骨がん又は骨転移を有する。特定の態様では、骨がんは、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である。ある特定の態様では、骨転移は、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである。特定の態様では、骨転移は、乳がん骨転移である。いくつかの態様では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。ある特定の態様では、乳がんは、ＨＥＲ２陰性乳がんである。他の態様では、乳がんは、ＨＥＲ２陽性乳がんである。
【0018】
ある特定の態様では、ＢＰは、負に帯電している。いくつかの態様では、ＢＰは、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、イバンドロネートポミドロネート、ネリドネート、オルパドロネート、又はオキシドロネートである。特定の態様では、ＢＰは、アレンドロネート（ＡＬＮ）である。
【0019】
いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである。ある特定の態様では、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。特定の態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体である。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブである。いくつかの態様では、骨標的化コンジュゲートは、トラスツズマブにコンジュゲートされたアレンドロネートを含む。ある特定の態様では、抗体は、抗Ｍ－ＣＳＦ抗体ではない。
【0020】
ある特定の態様では、ＢＰは、抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンにコンジュゲートされない。いくつかの態様では、ＢＰは、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション、ＮＨＳ－エステルケミストリー、又はシステインケミストリーを使用して、抗体に部位特異的にコンジュゲートされる。特定の態様では、ＢＰは、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションを使用して、抗体に部位特異的にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、ＢＰは、抗体のＣＨ２－ＣＨ３接合部にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、ＢＰは、４－フルオロフェニルカルバメートリジン（ＦＰｈｅＫ）を使用して、抗体にコンジュゲートされる。特定の態様では、ＦＰｈｅＫは、スタフィロコッカス・アウレウスからのプロテインＡのＢドメインの断片（ＦＢタンパク質）に結合される。特定の態様では、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションは、アジド官能性部分を含む抗体の、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）で官能化されたＢＰとのコンジュゲーションを含む。
【0021】
ある特定の態様では、骨標的化コンジュゲートは、骨腫瘍ニッチにおける治療用抗体の濃度の増加をもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他臓器への二次転移を制限する。いくつかの態様では、骨標的化コンジュゲートは、微小転移誘発性溶骨性病変の減少をもたらす。
【0022】
追加の態様では、使用は、追加の抗がん療法を更に含む。いくつかの態様では、追加の抗がん療法は、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む。特定の態様では、追加の抗がん療法は、免疫療法又は化学療法を含む。
【0023】
本明細書に記載のいずれの方法又は組成物も、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施することができることが企図される。例えば、１つの方法によって合成された化合物を、異なる方法による最終化合物の調製に使用することができる。
【0024】
本開示の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な記載から当業者には明らかになるので、本開示の特定の実施形態を示しているが、詳細な記載及び特定の例は、例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0025】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様を更に実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【0026】
【図1】図１Ａ～図１Ｌ：（Ａ）治療用抗体は、骨ヒドロキシアパタイトマトリックスに結合するビスホスホネート分子のｐＣｌｉｃｋコンジュゲーションによって、骨に部位特異的に送達することができる。（Ｂ）クマシー青色染色（左）及び蛍光スキャナ（右）によって視覚化した、還元及び非還元条件下でのＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ、及びそれらの近赤外線（ＮＩＲ）フルオロフォアコンジュゲートのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの質量分析の分析。（Ｄ）ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋＋＋）、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１（ＨＥＲ２＋＋）、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２）細胞へのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ結合のフローサイトメトリープロファイル。（Ｅ～Ｇ）ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮのインビトロ細胞傷害性。（Ｈ）未修飾Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの差次的な骨標的化能力。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮとともに一晩インキュベートし、続いてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ及び４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で染色した（スケールバー、２００μｍ）。（Ｉ～Ｊ）ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及び天然骨へのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの結合動態。（Ｋ）Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの後眼窩注射の２４時間、９６時間、又は１６８時間後、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスの下肢のエクスビボ蛍光画像。ＩＩＡ注射を介して、ヌードマウスの右肢に腫瘍細胞を接種した。（Ｌ）ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ（緑色）、ＲＦＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）で、生体分布研究からの非脱石灰化骨切片を染色した（スケールバー、１００μｍ）。
【図2】図２Ａ～図２Ｎ：Ｔｒａｓ－ＡＬＮは、骨における乳がん微小転移を阻害する。（Ａ）ヌードマウスの右後肢に、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞をＩＩＡ注射し、続いてＰＢＳ、ＡＬＮ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。毎週の生物発光撮像によって、腫瘍負荷を監視した。（Ｂ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化、ＴｒａｓをＴｒａｓ－ＡＬＮと比較する二元配置分散分析。（Ｃ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける、ＨＥＲ２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の個々の発光強度の倍率変化。（Ｄ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスの安楽死までの時間のカプランマイヤープロット。各個々のマウスの全身のＢＬＩシグナルが、１０７光子秒－１に到達したことをエンドポイントと見なした。（Ｅ）経時的な腫瘍担持マウスの体重変化。（Ｆ）腫瘍移植の８２日後、ＰＢＳ、ＡＬＮ、Ｔｒａｓ、又はＴｒａｓ－ＡＬＮで治療した群の、仰臥位でのＭｉｃｒｏＣＴ走査。（Ｇ）骨体積密度（ＢＶ／ＴＶ）の定量的分析。（Ｈ）海綿の厚さの定量的分析（Ｔｂ．Ｔｈ）。（Ｉ）海綿骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の定量的分析。（Ｊ）各群からの脛骨／大腿骨の代表的な長手方向の矢状面での、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。Ｔ：腫瘍；Ｂ：骨；ＢＭ：骨髄。（Ｋ）各群からの骨切片のＨＥＲ２及びＴＲＡＰ染色の代表的な画像。（Ｌ）各群の腫瘍－骨界面で計算した、画像毎の破骨細胞数（（Ｋ）のピンク色の細胞を破骨細胞陽性細胞と見なした）。（Ｍ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスの、血清ＴＲＡｃＰ ５ｂレベル。（Ｎ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスの、血清カルシウムレベル。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．＝Ｐ＞０．０５。
【図3】図３Ａ～図３Ｃ：（Ａ）Ｔｒａｓ（上）又はＴｒａｓ－ＡＬＮ（下）で治療したマウスの様々な臓器で観察された二次転移。（Ｂ）円グラフは、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）で治療したマウスの様々な臓器で観察された、転移の頻度を示す。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスから生じた転移を測定した、他の骨を含む異なる臓器における生物発光シグナル強度の定量化。ｐ値は、一元配置分散分析に基づく。＊Ｐ＜０．０５及びｎ．ｓ．＝Ｐ＞０．０５。
【図4】図４Ａ～図４Ｅ：ＨＥＲ２陰性モデルにおけるＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮのインビボ比較。（Ａ）生物発光撮像によって、毎週、腫瘍負荷を監視し、（Ｂ）対象領域で検出された放射輝度によって定量化した。（Ｃ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける、ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ－７腫瘍の個々の発光強度の倍率変化。（Ｄ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスの殺傷までの時間のカプランマイヤープロット。各個々のマウスの全身のＢＬＩシグナルが、１０７光子秒－１に到達したことをエンドポイントと見なした。（Ｅ）経時的な腫瘍担持マウスの体重変化。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．＝Ｐ＞０．０５。
【図5】ＢＣＮ－ＡＬＮのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図6】ｓｓＦＢ－ＦＰｈｅＫのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図7】Ｔｒａｓ－アジドのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図8】図８Ａ～図８Ｈ：ＢＴ４７４細胞へのＴｒａｓ結合。Ｔｒａｓの濃度を増加させながら、ＢＴ４７４細胞をインキュベートし、方法に記載されるように処理し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図9】図９Ａ～図９Ｈ：ＢＴ４７４細胞へのＴｒａｓ－ＡＬＮ結合。Ｔｒａｓ－ＡＬＮの濃度を増加させながら、ＢＴ４７４細胞をインキュベートし、方法に記載されるように処理し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｈ：ＳＫ－ＢＲ－３細胞へのＴｒａｓ結合。Ｔｒａｓの濃度を増加させながら、ＳＫ－ＢＲ－３細胞をインキュベートし、方法に記載されるように処理し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図11】図１１Ａ～図１１Ｈ：ＳＫ－ＢＲ－３細胞へのＴｒａｓ－ＡＬＮ結合。Ｔｒａｓの濃度を増加させながら、ＳＫ－ＢＲ－３細胞をインキュベートし、方法に記載されるように処理し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図12】共焦点顕微鏡法によって可視化した、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるＴｒａ－ＡＬＮの結合。培地中３０ｎＭのＴｒａｓ－ＡＬＮとともに、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、ＤｉｌＣ１８（赤色蛍光）及びＨｏｅｃｈｓｔ核染色（青色蛍光）で染色した。
【図13-1】図１３Ａ～図１３Ｄ：主臓器のエクスビボ蛍光画像。後眼窩注射Ｃｙ７．５標識（Ａ）Ｔｒａｓ及び（Ｂ）Ｔｒａｓ－ＡＬＮの９６時間後の、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳。
【図13-2】図１３Ａ～図１３Ｄ：主臓器のエクスビボ蛍光画像。（Ｃ）後眼窩注射Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの７２時間後の、腫瘍を担持するマウスＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び骨。
【図13-3】図１３Ａ～図１３Ｄ：主臓器のエクスビボ蛍光画像。（Ｄ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの薬物動態プロファイル。腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウス（手術の３ヶ月後）に、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮを後眼窩注射した。ＥＬＩＳＡによって、血清中の抗体濃度を決定した（データは、３つの独立した反復の平均±ＳＤを表す）。
【図14】Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの骨生体内分布のためのエクスビボ蛍光画像分析。Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの後眼窩注射の２４時間後、９６時間後、又は１６８時間後。骨を収集し、分析した。図１Ｋから、量データを要約した。Ｔｒａｓ治療マウスからの腫瘍のないシグナルは、ブランクと見なした。以下のように、相対シグナルを計算した。後肢からのシグナル－（Ｔｒａｓ治療群からの）腫瘍のない後肢からのシグナル。
【図15】Ｔｒａｓ－ＡＬＮは、骨における乳がん微小転移を阻害する。ヌードマウスの右後肢に、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞をＩＩＡ注射し、続いてＰＢＳ、ＡＬＮ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。生物発光撮像によって、腫瘍負荷を週２回監視した（６、２０、３３、４８、及び６８日目の撮像データを選択して、図２Ａに示した）。
【図16】図１６Ａ～図１６Ｂ：全身ＢＬＩ定量化。（Ａ）全身で検出された放射輝度によって定量化した各治療群からのＢＬＩ。（Ｂ）図２Ａに記載されるように、異なる治療群の個々の全身発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図17】図１７Ａ～図１７Ｄ：Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の後肢におけるＢＬＩシグナルが定量化され、示されている。（Ａ）（図２Ａに記載の）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮで治療したマウスにおける、後肢の平均発光強度の倍率変化、ＴｒａｓをＴｒａｓ－ＡＬＮと比較する二元配置分散分析。（Ｂ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の後肢の個々の発光強度の倍率変化。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群から定量化した後肢の平均ＢＬＩ。（Ｄ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図18】ＭｉｃｒｏＣＴに基づく骨の３Ｄレンダリング。皮質骨、画像は、広範囲の皮質骨破壊を示す。海綿骨、画像は、海綿破壊を示す。下部パネル（成長プレート）、画像プレートは、成長プレートでの骨量減少を示す。
【図19】各群からの骨切片のＴＲＡＰ染色。
【図20】図２０Ａ～図２０Ｅ：二次転移のインビボ定量化。（Ａ）様々な治療群のマウスの全身及び後肢におけるＢＬＩシグナルが定量化され、示されている。以下のように、二次転移を決定した：全身及び後肢（赤丸によって示される）におけるＢＬＩシグナルを定量化した。各時点において、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して、週２回動物を撮像した。シグナルが「飽和発光画像」を示唆した群については、（画像下に示した）より短い時間の間走査する。以下のように、二次転移を計算した：全身におけるＢＬＩシグナル強度－後肢におけるＢＬＩシグナル強度。（Ｂ）（図２Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける、二次転移の平均発光強度の倍率変化、ＴｒａｓをＴｒａｓ－ＡＬＮと比較する二元配置分散分析。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群における、二次転移の個々の発光強度の倍率変化。（Ｄ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群からの定量化した二次転移の平均ＢＬＩ。（Ｅ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図21】Ｔｒａｓ（上）又はＴｒａｓ－ＡＬＮ（下）で治療したマウスの様々な臓器で観察された二次転移。
【図22】図２２Ａ～図２２Ｃ：ＨＥＲ２陰性モデルにおけるＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮのインビボ比較。ヌードマウスの右後肢に、ＭＣＦ－７細胞をＩＩＡ注射し、続いてＴｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。（Ａ）生物発光撮像によって、腫瘍負荷を週２回監視した（４、１２、１９、２９、及び４２日目の撮像データを選択して、図４Ａに示した。（Ｂ）全身で検出された放射輝度によって定量化した各治療群からのＢＬＩ。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の個々の全身発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図23】図２３Ａ～図２３Ｄ：Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群のＭＣＦ－７モデルの後肢におけるＢＬＩシグナルが定量化され、示されている。（Ａ）（図４Ａに記載の）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮで治療したマウスにおける、後肢の平均発光強度の倍率変化、ＴｒａｓをＴｒａｓ－ＡＬＮと比較する二元配置分散分析。（Ｂ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の後肢の個々の発光強度の倍率変化。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群からの定量化した後肢の平均ＢＬＩ。（Ｄ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図24】図２４Ａ～図２４Ｂ：ＭＣＦ－７ＨＥＲ２陰性モデルに対するＴｒａｓ－ＡＬＮの効果：血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ及びカルシウムレベル分析。（Ａ）実験終了時のＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮにおける血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ濃度（＊Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）実験終了時のＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ群における血清カルシウム濃度（＊Ｐ＜０．０５）。
【図25】図２５Ａ～図２５Ｅ：二次転移のインビボ定量化。（Ａ）様々な治療群のマウスの全身及び後肢におけるＢＬＩシグナルが定量化され、示されている。以下のように、二次転移を決定した：全身及び後肢（赤丸によって示される）におけるＢＬＩシグナルを定量化した。各時点において、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して、週２回動物を撮像した。シグナルが「飽和発光画像」を示唆した群については、（画像下に示した）より短い時間の間走査する。以下のように、二次転移を計算した：全身におけるＢＬＩシグナル強度－後肢におけるＢＬＩシグナル強度。（Ｂ）図２２に記載されるように治療したマウスにおける、二次転移の平均発光強度の倍率変化、ＴｒａｓをＴｒａｓ－ＡＬＮと比較する二元配置分散分析。（Ｃ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群における、二次転移の個々の発光強度の倍率変化。（Ｄ）各治療群からの定量化した二次転移の平均ＢＬＩ。（Ｅ）Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図26】図２６Ａ～図２６Ｂ：ＭＣＦ－７細胞株における多臓器転移に対するＴｒａｓ－ＡＬＮ効果。（Ａ）Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮで治療したマウスの様々な臓器で観察された転移。（Ｂ）円グラフは、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療群の様々な臓器で観察された転移の頻度を示す。
【図27】図２７Ａ～図２７Ｃ：骨転移及び原発腫瘍の両方を有するマウスに対するＴｒａｓ－ＡＬＮの治療効果。（Ａ）ＩＩＡ注射を使用して、ルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を右後肢に注射した。非ルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、同じマウスの乳房脂肪体に接種した。次いで、ＰＢＳ（ｎ＝５）、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、ｎ＝７）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（Ｔｒａｓと同じ、ｎ＝７）でマウスを治療した。生物発光撮像（ＢＬＩ）によって、後肢の腫瘍負荷を監視した。ノギスを使用して、乳房脂肪体の腫瘍負荷を測定した。（Ｂ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける平均発光強度の後肢腫瘍倍率変化、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ群の後肢腫瘍を比較する二元配置分散分析。（Ｃ）（Ａ）に記載されるように治療したマウスにおける平均発光強度の乳房脂肪体腫瘍倍率変化、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ群の乳房脂肪体腫瘍を比較する二元配置分散分析。＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．は、Ｐ＞０．０５を表す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
例示的な実施形態の説明
過去２０年間にわたり、抗体に基づく療法は、がん治療において大きな価値を有するものであることが証明されてきた。これらのバイオ医薬品の臨床的成功にもかかわらず、骨微小環境における標的に到達することは、骨組織の比較的低い血管形成及び薬物浸透を損なう物理的障壁の存在に起因して、おそらく困難であると証明されている。骨における治療薬物の有効濃度を確保しようとする試みは、避けられないことに、他の組織においても同様に高濃度をもたらし、多くの場合、有害な全身作用又は副作用を生じ、それによって薬物の使用を制限又は排除する場合がある２４、２５。この場合、受動的ターゲティングの潜在的利益が失われる。
過去２０年間にわたり、抗体に基づく療法は、がん治療において大きな価値を有するものであることが証明されてきた。これらのバイオ医薬品の臨床的成功にもかかわらず、骨微小環境における標的に到達することは、骨組織の比較的低い血管形成及び薬物浸透を損なう物理的障壁の存在に起因して、おそらく困難であると証明されている。骨における治療薬物の有効濃度を確保しようとする試みは、避けられないことに、他の組織においても同様に高濃度をもたらし、多くの場合、有害な全身作用又は副作用を生じ、それによって薬物の使用を制限又は排除する場合がある２４、２５。この場合、受動的ターゲティングの潜在的利益が失われる。
【0028】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、骨標的化部分のコンジュゲーションを介して、抗体などの治療用ポリペプチドを骨に特異的に送達することを可能にする革新的な骨標的化（ＢｏｎＴａｒｇ）技術を提供する。生じた骨標的化抗体は、骨転移ニッチを特異的に標的として、骨微小転移を排除し、骨病変からの多臓器転移の播種を防止することもできる。骨ヒドロキシアパタイトマトリックスに固有の高いミネラル濃度を利用して、ビスホスホネート（ＢＰ）コンジュゲーションは、骨粗しょう症、原発性及び転移性骨新生物、並びに他の骨障害の治療手段として、骨への小分子薬物、撮像プローブ、核医薬品、及びナノ粒子の選択的送達に使用されている２４、２６～３０。負に帯電したＢＰは、硬質の骨の主要な構成成分であるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などのミネラル化された正に帯電した骨マトリックスに対して高い親和性を有し、骨への優先的結合をもたらす。したがって、ある特定の態様では、本方法は、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション技術を使用して、アレンドロネート（ＡＬＮ）などのＢＰ薬物を、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）などの抗体に部位特異的に結合させることを含む３１。本研究は、内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射に基づく２つの異種移植片モデルにおいて、生じるトラスツズマブ－アレンドロネートコンジュゲート（Ｔｒａｓ－ＡＬＮ）が、骨転移ニッチにおける治療用抗体の濃度を顕著に向上させ、骨におけるがん発生を阻害し、他臓器への二次転移を制限することを示した。骨に対する治療用抗体のこの種類の特異的送達は、骨関連疾患に対する抗体療法の幅及び効力の両方を向上する潜在性を有する。
【0029】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、特定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、特定の構成成分のいずれも、意図的に組成物へと製剤化されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ存在するか若しくは微量のみ存在することを意味するように本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染物質から生じる特定の構成成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましくは、標準的な分析方法では特定の構成成分の量を検出することができない組成物である。
本明細書で使用される場合、特定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、特定の構成成分のいずれも、意図的に組成物へと製剤化されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ存在するか若しくは微量のみ存在することを意味するように本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染物質から生じる特定の構成成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましくは、標準的な分析方法では特定の構成成分の量を検出することができない組成物である。
【0030】
本明細書で使用される場合、「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語とともに使用される場合、単語「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、１つ又は１つ以上を意味し得る。
【0031】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されるか、又は選択肢が互いに排他的であることのない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２の、又はそれ以上を意味し得る。
【0032】
「約」という用語は、一般に、記載の値を測定するための標準的な分析技術を使用して決定される、記載の値の標準偏差内であることを意味する。用語はまた、記載の値のプラス又はマイナス５％を指すことによって使用され得る。
【0033】
「有効量」又は「治療上有効な」という語句は、所望の結果を生じるのに十分な薬物又は薬剤の投薬量を意味する。所望の結果は、投薬のレシピエントにおける主観的若しくは客観的な改善、肺成長の増加、肺修復の増加、組織浮腫の低減、ＤＮＡ修復の増加、アポトーシスの減少、腫瘍サイズの減少、がん細胞の成長速度の減少、転移の減少、又は上の任意の組み合わせであり得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的結合能力を維持するその誘導体、及び免疫グロブリン結合ドメインに相同であるか又は大部分相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然源に由来してもよいか、又は部分的若しくは完全に合成的に産生されてもよい。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラスのうちのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスのメンバー：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥであり得る。抗体は、二重特異性抗体であり得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。抗体という用語はまた、抗原結合抗体断片を指す。そのような抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂｙ、Ｆ（ａｂｙ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、及びＦｄ断片が挙げられる。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、そのままの抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に産生され得、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得るか、又は完全に若しくは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、一本鎖抗体断片であり得る。代替的に、断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。断片はまた、任意選択的に、多分子複合体であり得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約１０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含むであろう。
【0035】
「対象」及び「患者」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒト又は非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【0036】
本明細書で使用される場合、疾患、障害、又は医学的状態に関して使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、又は「改善」という用語は、状態の療法的治療を指し、その目的が、症状又は状態の進行又は重症度を逆転させること、緩和すること、改善すること、阻害すること、減速させること、又は停止させることである。「治療すること」という用語は、状態の少なくとも１つの有害作用又は症状を低減又は緩和することを含む。１つ以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合、治療は、一般に「有効」である。代替的に、状態の進行が低減又は停止される場合、治療は、「有効」である。すなわち、「治療」は、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療の不在下で予想されるであろう症状の進行又は悪化の停止又は少なくとも減速も含む。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されないが、１つ以上の症状の緩和、欠損の程度の減少、腫瘍又は悪性腫瘍の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、腫瘍成長及び／又は転移の遅延又は減速、並びに治療の不在下で予想されるものと比較した寿命の増加が挙げられる。
【0037】
ＩＩ．骨標的化抗体コンジュゲート
本開示は、抗体への、ビスホスホネートなどの骨標的化部分のコンジュゲーションに関する。いくつかの態様では、骨標的化物質は、ＣＨ２－ＣＨ３接合部などの、抗原結合部位及びＦｃ受容体結合部位から遠い部位において抗体にコンジュゲートされ得る。
本開示は、抗体への、ビスホスホネートなどの骨標的化部分のコンジュゲーションに関する。いくつかの態様では、骨標的化物質は、ＣＨ２－ＣＨ３接合部などの、抗原結合部位及びＦｃ受容体結合部位から遠い部位において抗体にコンジュゲートされ得る。
【0038】
ビスホスホネートは、中央（ジェミナル）炭素（Ｐ－Ｃ－Ｐ骨格）に結合した２つのホスホネート基を含有する合成化合物であり、多発性骨髄腫を含むいくつかの代謝性及び腫瘍誘発性骨疾患における骨吸収を防止するために使用される。ビスホスホネート治療は、患者の生存率の増加に関連付けられており、これは、これらの化合物が腫瘍細胞に直接的な効果を有することを示している。ビスホスホネートは、中央のジェミナル炭素に結合した２つの追加の鎖を含有し得る。これらの２つの側鎖の存在は、ビスホスホネート骨格への多数の置換を可能にし、したがって、異なる薬理学的特性を有する様々な類似体の開発を可能にする。例示的なビスホスホネートとしては、限定されないが、アレンドロネート、ゾレドロネート、パミドロネート、リセドロネート、メドロン酸、アミノメチレンビスホン酸、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート（ｔｉｌｕｎｄｒｏｎａｔｅ）、又はイバンドロネートが挙げられる。
【0039】
ある特定の態様では、骨標的化物質は、部位特異的コンジュゲーション方法によって抗体にコンジュゲートされ得る。１つの方法では、反応性チオール基を提供し、免疫グロブリンの折り畳み及び組み立てを妨げず、抗原結合を変化させることもない操作されたシステイン置換を軽鎖及び重鎖上の位置に含むシステインケミストリーによって、抗体はコンジュゲートされる（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａ．，２００８）。別の方法では、コンジュゲーション方法は、ホルミルグリシン生成酵素によって認識される６アミノ酸コンセンサス配列を使用する、組換えタンパク質へのアルデヒド基の部位特異的導入を含む（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この遺伝子的にコードされた「アルデヒドタグ」は、Ｈｉｓ６タグ以下であり、多数のタンパク質標識用途に利用することができる。いくつかの態様では、部位特異的コンジュゲーション方法は、変異型ベータ１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｂｏｅｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）又はトランスグルタミナーゼ媒介性部位特異的コンジュゲーションなどの、変異型グリコシルトランスフェラーゼを使用する抗体の再モデル化Ｆｃ Ｎ－グリカンを含む。特定の態様では、部位特異的コンジュゲーションは、ジスルフィド架橋の使用を含む（その全体が参照により本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ある特定の態様では、部位特異的コンジュゲーション方法は、非正準アミノ酸の組み込みを含む（Ｌｅｉｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、その全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、骨標的化物質は、親和性化合物を使用する近接誘発性部位特異的コンジュゲーションを含むｐＣｌｉｃｋ技術を使用して、抗体にコンジュゲートされ得る（その全体が参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１９／２１７９００）。ｐＣｌｉｃｋは、抗体操作及びいかなる化学的又は酵素的処理も必要としない部位特異的技術である。ｐＣｌｉｃｋ方法は、骨標的化部分と抗体との間の部位特異的共有結合形成を可能にすることができる。特定の態様では、骨標的化抗体コンジュゲートは、ポリマー骨格を含まない。特定の態様では、骨標的化部分は、抗体のＦｃドメインのＮ－グリカンにコンジュゲートされない。
【0040】
具体的には、本方法は、ｎｃＡＡと、リジン又はシステインなどの近くの抗体残基との間の近接誘発性反応性を含み得る。ｐＣｌｉｃｋは、抗体操作を実施することなく、骨標的化部分と、抗体の定義されたリジンなどの残基との間の共有結合形成を可能にし得る。
【0041】
コンジュゲートされた本抗体は、撮像剤又は診断剤に更にコンジュゲートされ得る。
【0042】
本明細書で使用される「治療剤」は、疾患又は健康関連状態の治療上の利益を得る目的で対象に投与することができる、任意の薬剤を指す。例えば、治療剤にコンジュゲートされた抗体は、腫瘍のサイズを低減するか、腫瘍の局所侵襲性を低減若しくは阻害するか、又は転移の発生のリスクを低減する目的で、対象に投与され得る。
【0043】
本明細書で使用される「診断剤」又は「撮像剤」（互換的に言及される）は、対象における疾患又は健康関連状態を診断する目的で対象に投与することができる、任意の薬剤を指す。診断は、疾患が存在するかどうか、疾患が進行しているかどうか、又は疾患状態の任意の変化を決定することを含み得る。
【0044】
治療剤又は診断剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ、又はＲＮＡであり得る。
【0045】
Ａ．製剤及び投与
本開示は、ビスホスホネートなどの骨標的化物質にコンジュゲートされた抗体を含む、薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の抗体若しくはその断片、又はペプチド免疫原、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内投与される場合、特定の担体は水である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。他の好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
本開示は、ビスホスホネートなどの骨標的化物質にコンジュゲートされた抗体を含む、薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の抗体若しくはその断片、又はペプチド免疫原、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内投与される場合、特定の担体は水である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。他の好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【0046】
所望な場合、組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬グレードの標準的な担体を含み得る。好適な薬学的薬剤の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するのに好適な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態の、予防有効量又は治療有効量の抗体又はその断片を含有するであろう。製剤は、経口、静脈内、動脈内、口腔内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入であり得るか、又は機械的換気によって送達され得る投与モードに適合するべきである。
【0047】
開示のもののような抗体が、ポックスウイルス感染のリスクのある対象においてインビボで産生される場合、活性ワクチンも想定される。そのようなワクチンは、非経口投与のために製剤化され得、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、又は更には腹腔内経路を介して注射するために製剤化され得る。皮内経路及び筋肉内経路による投与が企図される。代替的に、ワクチンは、例えば、点鼻、吸入、又はネブライザーによる、粘膜への局所経路によって直接投与され得る。薬学的に許容される塩としては、酸性塩と、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とで形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基と、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基とから誘導され得る。
【0048】
人工的に獲得した受動免疫として知られている抗体の受動的移行は、一般に、静脈内又は筋肉内注射の使用を伴うであろう。抗体の形態は、静脈内（ＩＶＩＧ）又は筋肉内（ＩＧ）使用のためにプールされたヒト免疫グロブリンとしての、免疫化されているか又は疾患から回復中のドナーからの高力価のヒトＩＶＩＧ又はＩＧとしての、及びモノクローナル抗体（ＭＡｂ）としての、ヒト又は動物の血漿又は血清であり得る。そのような免疫は、一般に短期間しか持続せず、過敏症反応、及び特に非ヒト由来のガンマグロブリンからの血清病の潜在的なリスクも存在する。しかしながら、受動的免疫は、即時保護を提供する。抗体は、注射に好適な担体、すなわち、滅菌及び注射可能な担体中に製剤化されるであろう。
【0049】
一般に、本開示の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどの気密容器内の乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、単位剤形で別々に又は一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与されるものである場合、医薬グレードの滅菌水又は生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0050】
本開示の組成物は、中性又は塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンを用いて形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンを用いて形成されるものが挙げられる。
【0051】
Ｂ．過剰増殖性疾患
過剰増殖性疾患は、細胞が制御不能に再生し始めることを引き起こす任意の疾患に関連付けられる場合があるが、原型的な例は、がんである。がんの重要な要素のうちの１つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、したがって、細胞の成長を中断する薬剤は、これらの疾患を治療するための治療剤として重要である。本開示では、骨標的化抗体コンジュゲートを使用して、骨がん及び骨に転移するがんなどの様々な種類のがんを治療することができる。
過剰増殖性疾患は、細胞が制御不能に再生し始めることを引き起こす任意の疾患に関連付けられる場合があるが、原型的な例は、がんである。がんの重要な要素のうちの１つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、したがって、細胞の成長を中断する薬剤は、これらの疾患を治療するための治療剤として重要である。本開示では、骨標的化抗体コンジュゲートを使用して、骨がん及び骨に転移するがんなどの様々な種類のがんを治療することができる。
【0052】
本開示の化合物で治療することができるがん細胞としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、膵臓、精巣、舌、子宮頸部、又は子宮からの細胞が挙げられる。加えて、がんは、これらに限定されないが、具体的には、以下の組織学的種類のものであり得る：新生物、悪性；がん；がん、未分化；巨細胞及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛様体がん；移行細胞がん；乳頭状移行細胞がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；複合的な肝細胞がん及び胆管がん；海綿状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性多発性大腸腺腫症；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞上皮がん；乳頭状腺がん；嫌色素性細胞がん；好酸性がん；酸親和性腺がん；好塩基球がん；透明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞性腺がん；乳頭状及び濾胞性腺がん；非被包性硬化がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞線がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞性腺がん；粘液腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；莢膜細胞種、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性胚腫、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂肪細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑におけるマリグ（ｍａｌｉｇ）メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；肺胞性横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性がん；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉系軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質星細胞腫；原線維性星細胞腫；星芽腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；並びに有毛細胞白血病。ある特定の態様では、腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、膠芽腫、神経芽腫、又は白血病を含み得る。
【0053】
Ｃ．治療の方法
特に、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんの治療に使用され得る組成物が、本明細書に開示される。上記の組成物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）に、有効量、すなわち、治療される対象において所望の結果を生じることが可能である（例えば、がん性細胞のアポトーシスを引き起こすか、又は細菌細胞を殺傷する）量で投与されることが好ましい。本開示の方法で利用される組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができる。医学及び獣医学分野で周知であるように、任意の１匹の動物の投薬量は、対象のサイズ、体表面積、体重、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び投与経路、一般的な健康、感染症又はがんの臨床症状、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。本明細書に記載の組成物は、典型的には、血液学的パラメータ（全血球数（ＣＢＣ））、又はがん細胞成長若しくは増殖の低減を同定することによってアッセイして、細菌細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、バイオフィルムの成長を阻害するか、又はがん性細胞の死を誘発する（例えば、がん細胞のアポトーシスを誘発する）投薬量で投与される。
特に、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんの治療に使用され得る組成物が、本明細書に開示される。上記の組成物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）に、有効量、すなわち、治療される対象において所望の結果を生じることが可能である（例えば、がん性細胞のアポトーシスを引き起こすか、又は細菌細胞を殺傷する）量で投与されることが好ましい。本開示の方法で利用される組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができる。医学及び獣医学分野で周知であるように、任意の１匹の動物の投薬量は、対象のサイズ、体表面積、体重、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び投与経路、一般的な健康、感染症又はがんの臨床症状、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。本明細書に記載の組成物は、典型的には、血液学的パラメータ（全血球数（ＣＢＣ））、又はがん細胞成長若しくは増殖の低減を同定することによってアッセイして、細菌細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、バイオフィルムの成長を阻害するか、又はがん性細胞の死を誘発する（例えば、がん細胞のアポトーシスを誘発する）投薬量で投与される。
【0054】
本開示の治療方法（予防治療を含む）は、一般に、その必要のある、哺乳類、特にヒトを含む対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。そのような治療は、疾患、障害、又はその症状に罹患しているか、有するか、感受性があるか、又はそのリスクのある対象、特にヒトに好適に行われるであろう。これらの「リスクのある」対象の決定は、対象又は医療提供者の診断試験又は意見による任意の客観的又は主観的決定（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義される）、家族歴など）によって行われ得る。
【0055】
一実施形態では、本開示は、治療の進行を監視する方法を提供する。方法は、対象が、治療量の本明細書に記載の組成物を投与されている、がん（例えば、白血病）に関連付けられる障害又はその症状に罹患しているか又は感受性がある対象における、診断マーカー（例えば、限定されないが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、及びＣＤ１１７を含み得る）又は診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）として、細胞表面タンパク質を用いる血液学的パラメータ及び／又はがん幹細胞（ＣＳＣ）分析の変化のレベルを決定するステップを含む。方法で決定されるマーカーのレベルは、対象の疾患状態を確立するために、健康な正常対照又は他の罹患している患者のいずれかにおけるマーカーの既知のレベルと比較され得る。好ましい実施形態では、対象におけるマーカーの第２のレベルは、第１のレベルの決定より後の時点で決定され、２つのレベルを比較して、疾患の経過又は治療の有効性が監視される。ある特定の好ましい実施形態では、対象におけるマーカーの治療前レベルは、本明細書に記載の方法に従って治療を開始する前に決定され、次いで、マーカーのこの治療前レベルを、治療を開始した後の対象におけるマーカーのレベルと比較して、治療の有効性が決定され得る。
【0056】
Ｄ．追加の療法
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２の又は追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体コンジュゲートを含む。そのような療法は、骨腫瘍を伴う任意の疾患の治療に適用され得る。例えば、疾患は、骨がん又は骨転移であり得る。
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２の又は追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体コンジュゲートを含む。そのような療法は、骨腫瘍を伴う任意の疾患の治療に適用され得る。例えば、疾患は、骨がん又は骨転移であり得る。
【0057】
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体コンジュゲートを含む。追加の療法は、放射線療法、手術（例えば、腫瘍摘出手術及び乳房切除）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、又は前述の組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
【0058】
併用療法を含む方法及び組成物は、治療又は保護効果を向上し、かつ／又は別の抗がん療法若しくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加する。治療及び予防の方法及び組成物は、がん細胞の殺傷及び／又は細胞過剰増殖の阻害などの所望の効果を達成するのに有効な組み合わせた量で提供され得る。このプロセスは、細胞を、抗体又は抗体断片、及び第２の療法の両方と接触させることを含み得る。組織、腫瘍、又は細胞を、薬剤（すなわち、抗体若しくは抗体断片、又は抗がん剤）のうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物若しくは薬理学的製剤と接触させてもよいか、又は組織、腫瘍、及び／若しくは細胞を、２つ以上の別個の組成物若しくは製剤と接触させることによるものであり得、１つの組成物が、１）抗体若しくは抗体断片、２）抗がん剤、又は３）抗体若しくは抗体断片、及び抗がん剤の両方を提供する。また、そのような併用療法は、化学療法、放射線療法、手術療法、又は免疫療法と同時に使用され得ることが企図される。
【0059】
「接触させる」及び「曝露させる」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書では、治療構築物及び化学療法剤又は放射線療法剤が、標的細胞に送達されるか、又は標的細胞と直接並置して配置されるプロセスについて記載するために使用される。細胞殺傷を達成するために、例えば、両方の薬剤は、細胞を殺傷するか、又は細胞が分裂するのを防止するのに有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【0060】
阻害抗体は、抗がん治療と比較して、その前、その間、その後、又は様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時～数分～数日～数週間の範囲の間隔であり得る。抗体又は抗体断片が、抗がん剤とは別々に患者に提供される実施形態では、一般に、２つの化合物が、依然として患者に有利な複合効果を発揮することが可能であるように、各送達時間の間に顕著な期間が過ぎてしまわないことが確認されるであろう。そのような場合、互いに約１２～２４又は７２時間以内、より具体的には、互いに約６～１２時間以内に、抗体療法及び抗がん療法が患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況では、治療期間を顕著に延長することが望ましい場合があり、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、又は７）～数週間（１、２、３、４、５、６、７、又は８）が経過する。
【0061】
ある特定の実施形態では、治療過程は、１～９０日又はそれ以上続くであろう（このそのような範囲は、介在する日数を含む）。１つの薬剤は、１日目～９０日目のうちの任意の日（このそのような範囲は、介在する日を含む）又はそれらの任意の組み合わせに投与され得、別の薬剤は、１日目～９０日目のうちの任意の日（このそのような範囲は、介在する日を含む）又はそれらの任意の組み合わせに投与されることが企図される。１日（２４時間の期間）以内に、患者は、薬剤のうちの１つ又は複数の投与を受ける場合がある。更に、治療過程の後、抗がん治療が投与されない期間が存在することが企図される。この期間は、患者の予後、体力、健康などの状態に応じて、１～７日、及び／又は１～５週間、及び／又は１～１２ヶ月若しくはそれ以上続き得る（このそのような範囲は、介在する日数を含む）。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されるであろうことが予想される。
【0062】
一部の実施形態では、追加の療法は、小分子酵素阻害剤又は抗転移剤の投与である。一部の実施形態では、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、抗吐き気剤などの、治療の副作用の発生及び／又は重症度を軽減することが意図される薬剤）の投与である。一部の実施形態では、追加の療法は、放射線療法である。一部の実施形態では、追加の療法は、手術である。一部の実施形態では、追加の療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。一部の実施形態では、追加の療法は、ガンマ線照射である。一部の実施形態では、追加の療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／又は化学抗がん剤（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）である。追加の療法は、当該技術分野で既知の化学療法剤のうちの１つ以上であり得る。
【0063】
様々な組み合わせが用いられ得る。以下の例では、骨標的化抗体コンジュゲートは、「Ａ」であり、抗がん療法は、「Ｂ」である：
【0064】
本実施形態の任意の化合物又は療法を患者に投与することは、存在する場合、薬剤の毒性を考慮して、そのような化合物を投与するための一般プロトコルに従うであろう。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性を監視するステップが存在する。
【0065】
１．化学療法
本実施形態に従って、多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、及びどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替的に、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘発する能力に基づいて、特徴評価され得る。
本実施形態に従って、多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、及びどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替的に、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘発する能力に基づいて、特徴評価され得る。
【0066】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチイレンエチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホマイド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード及びウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロスレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマｌＩ及びカリケアミシンオメガＩ１）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメトルヒオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、並びに上のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【0067】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の組み立て及び維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたって、５０～２００レントゲンの１日用量から２０００～６０００レントゲンの単回用量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の組み立て及び維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたって、５０～２００レントゲンの１日用量から２０００～６０００レントゲンの単回用量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【0068】
３．免疫療法
当業者は、追加の免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせで、又は同時に使用され得ることを理解するであろう。がん治療の文脈において、免疫療法剤は、一般に、がん細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして機能することができるか、又は実際に細胞殺傷に影響を及ぼすように他の細胞を動員することができる。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ得、標的化剤として機能し得る。代替的に、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
当業者は、追加の免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせで、又は同時に使用され得ることを理解するであろう。がん治療の文脈において、免疫療法剤は、一般に、がん細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして機能することができるか、又は実際に細胞殺傷に影響を及ぼすように他の細胞を動員することができる。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ得、標的化剤として機能し得る。代替的に、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【0069】
抗体－薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発への画期的なアプローチとして浮上している。がんは、世界的に主要な死因のうちの１つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合しているモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせ、ペイロード（薬物）を腫瘍細胞に送達する「アーム型」ＭＡｂを生じ、抗原のレベルを豊富にする（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｔｅｉｃｈｅｒ ２０１４、Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。薬物の標的化送達はまた、正常な組織における曝露を最小限に抑え、毒性の減少及び治療指数の改善をもたらす。２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ－ＤＭ１）の２つのＡＤＣ薬物のＦＤＡによる承認によって、このアプローチが妥当であると認められた。現在、様々な段階の臨床試験中である、がん治療のための３０以上のＡＤＣ薬物候補が存在する（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体操作及びリンカーペイロード最適化がより一層成熟するにつれて、新しいＡＤＣの発見及び開発は、このアプローチに好適である新しい標的の同定及び検証、並びに標的化ＭＡｂの生成への依存が増加している（Ｔｅｉｃｈｅｒ ２００９）。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞における上方制御／高レベルの発現、及び堅牢な内在化である。
【0070】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的とすることが容易である、すなわち、大部分の他の細胞に存在しない、いくつかのマーカーを担持する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちのいずれも、本実施形態の文脈における標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子が存在する。
【0071】
現在調査中又は使用中の免疫療法の例としては、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、及びｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号及び同第５，８４６，９４５号）、並びにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）が挙げられる。１つ以上の抗がん療法が、本明細書に記載の抗体療法とともに用いられ得ることが企図される。
【0072】
一部の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上げるか、又はシグナルを下げるかのいずれかである、免疫系の分子である。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害チェックポイント分子としては、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、並びにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸及び／又はＣＴＬＡ－４を標的とする。
【0073】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え形態のリガンド若しくは受容体などの薬物であり得るか、又は特にヒト抗体などの抗体であり得る（例えば、両方が参照により本明細書に援用される、国際特許公開第２０１５／０１６７１８号、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２）。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の既知の阻害剤が使用され得、特に、抗体のキメラ化、ヒト化、又はヒト形態が使用され得る。当業者であれば分かるように、代替名及び／又は等価名は、本開示で言及される特定の抗体のために使用され得る。そのような代替名及び／又は等価名は、本発明の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ－３４７５及びペムブロリズマブという代替名及び等価名でも知られている。
【0074】
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、全て参照により本明細書に援用される、米国特許第８７３５５５３号、同第８３５４５０９号、及び同第８００８４４９号に記載されている。全て参照により本明細書に援用される、米国特許出願第２０１４／０２９４８９８号、同第２０１４／０２２０２１号、及び同第２０１１／０００８３６９号に記載のものなどの、本明細書で提供される方法で使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、当該技術分野で既知である。
【0075】
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外部分又はＰＤ－１結合部分を含む、イムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られているニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られているペムブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ－１としても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られているＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載のＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【0076】
本明細書で提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合した場合、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に類似し、両方の分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれ、Ｂ７－１及びＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に抑制性シグナルを伝達し、一方、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見出され、それらの機能に重要であり得る。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現の増加をもたらす。
【0077】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
【0078】
本方法における使用に好適な抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（又は、それに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当該技術分野で周知の方法を使用して生成され得る。代替的に、当該技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が使用され得る。例えば、ＵＳ８，１１９，１２９、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブ、以前チシリムマブとしても知られているＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；及びＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書に開示の方法で使用され得る。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に援用される。これらの技術分野で認識されているＣＴＬＡ－４への結合に対する抗体のうちのいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、全て参照により本明細書に援用される、国際特許出願第２００１／０１４４２４号、同第２０００／０３７５０４号、及び米国特許第８，０１７，１１４号に記載されている。
【0079】
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）又はその抗原結合断片及びバリアントである（例えば、ＷＯＯ１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と同じＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合に対して競合し、かつ／又はそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【0080】
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子としては、全て参照により本明細書に援用される、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号、及び国際特許出願第１９９５／００１９９４号及び同第１９９８／０４２７５２号に記載のものなどのＣＴＬＡ－４リガンド及び受容体、並びに参照により本明細書に援用される、米国特許第８３２９８６７号に記載のものなどのイムノアドヘシンが挙げられる。
【0081】
４．手術
がんを有する人のおよそ６０％は、予防、診断、又は病期分類、治癒、及び緩和手術を含む、何らかの種類の手術を受けるであろう。治癒的手術としては、がん性組織の全部又は一部を物理的に除去、切り取り、かつ／又は破壊する切除が挙げられ、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と同時に使用され得る。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡によって制御される手術（モーズ手術）が挙げられる。
がんを有する人のおよそ６０％は、予防、診断、又は病期分類、治癒、及び緩和手術を含む、何らかの種類の手術を受けるであろう。治癒的手術としては、がん性組織の全部又は一部を物理的に除去、切り取り、かつ／又は破壊する切除が挙げられ、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と同時に使用され得る。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡によって制御される手術（モーズ手術）が挙げられる。
【0082】
がん性細胞、組織、又は腫瘍の一部分又は全部を切り取ると、身体に空洞が形成され得る。治療は、灌流、直接注射、又は追加の抗がん療法による領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日毎、又は１、２、３、４、及び５週間毎、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月毎に繰り返され得る。これらの治療も同様に、変動する投薬量のものであり得る。
【0083】
５．他の薬剤
他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤又は分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる、抗体ｃ２２５などの他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが、更に企図される。
他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤又は分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる、抗体ｃ２２５などの他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが、更に企図される。
【0084】
ＩＩＩ．キット
実施形態の様々な態様では、治療剤、並びに／又は他の治療剤及び送達剤を含有する、キットが想定される。一部の実施形態では、本実施形態は、実施形態の抗体組成物を調製及び／又は投与するためのキットを企図する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のうちのいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを備え得る。キットは、例えば、本実施形態の構成成分を調製、製剤化、及び／若しくは投与するか、又は本発明の方法の１つ以上のステップを実施するための、コンジュゲート抗体、並びに試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しないであろう容器である、好適な容器を備え得る。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。
実施形態の様々な態様では、治療剤、並びに／又は他の治療剤及び送達剤を含有する、キットが想定される。一部の実施形態では、本実施形態は、実施形態の抗体組成物を調製及び／又は投与するためのキットを企図する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のうちのいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを備え得る。キットは、例えば、本実施形態の構成成分を調製、製剤化、及び／若しくは投与するか、又は本発明の方法の１つ以上のステップを実施するための、コンジュゲート抗体、並びに試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しないであろう容器である、好適な容器を備え得る。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。
【0085】
キットは、本明細書に記載された方法の手順ステップを概説する指示書を更に含み得、本明細書に記載のものと実質的に同じ手順に従うか、又は当業者に既知である。指示書情報は、コンピュータを使用して実行される場合に薬学的有効量の治療剤の送達の実際の又は仮想の手順を表示させる機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体内に存在する場合がある。
【実施例】
【0086】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示の技術は、本開示の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、依然として本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似の又は同様の結果を得ることができることを理解するべきである。
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示の技術は、本開示の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、依然として本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似の又は同様の結果を得ることができることを理解するべきである。
【0087】
実施例１－骨転移のための抗体
ＢｏｎＴａｒｇを使用する第１の骨標的化抗体の開発
ＢＰ分子へのコンジュゲーションを介して骨に治療用抗体を特異的に送達する可能性を調べるために、ＨＥＲ２標的化抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）及びＢＰ薬物アレンドロネート（ＡＬＮ）を使用してモデルを設計した。ＡＬＮは、骨標的化物質として、並びに骨粗しょう症及び骨転移を治療するためのレジメンとして使用される、第２世代のＢＰ薬物である３１。ＡＬＮコンジュゲーションが抗体の治療有効性を損なわないことを確実にするために、ｐＣｌｉｃｋと呼ばれる新規の近接誘発性抗体コンジュゲーション戦略を用いた３１。ｐＣｌｉｃｋ技術は、穏やかな条件下で天然抗体へのペイロードの部位特異的結合を可能にし、したがって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性化を担う受容体である抗原受容体又はＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合の破壊を最小限に抑える。ｐＣｌｉｃｋ技術は、抗体操作にも、ほとんどの治療用抗体の生成を特徴とするＵＶ／化学／酵素処理にも依存しない。トラスツズマブ－アレンドロネートコンジュゲート（Ｔｒａｓ－ＡＬＮ）を調製するために、ｐＣｌｉｃｋを使用して、アジド官能性部分を含有するＴｒａｓを生成し、続いて、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）官能化ＡＬＮと反応させた（図１Ａ、及び図５～図８）。生じたＴｒａｓ－ＡＬＮを脱塩カラムで更に精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳによって完全に特徴評価した（図１Ｂ、図１Ｃ）。コンジュゲートされていない重鎖又は分解生成物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで明らかにならず、９５％超のカップリング効率が示された。ＥＳＩ－ＭＳ分析はまた、重鎖の９５％超がＡＬＮ分子とコンジュゲートされたことを明らかにした。
ＢｏｎＴａｒｇを使用する第１の骨標的化抗体の開発
ＢＰ分子へのコンジュゲーションを介して骨に治療用抗体を特異的に送達する可能性を調べるために、ＨＥＲ２標的化抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）及びＢＰ薬物アレンドロネート（ＡＬＮ）を使用してモデルを設計した。ＡＬＮは、骨標的化物質として、並びに骨粗しょう症及び骨転移を治療するためのレジメンとして使用される、第２世代のＢＰ薬物である３１。ＡＬＮコンジュゲーションが抗体の治療有効性を損なわないことを確実にするために、ｐＣｌｉｃｋと呼ばれる新規の近接誘発性抗体コンジュゲーション戦略を用いた３１。ｐＣｌｉｃｋ技術は、穏やかな条件下で天然抗体へのペイロードの部位特異的結合を可能にし、したがって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性化を担う受容体である抗原受容体又はＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合の破壊を最小限に抑える。ｐＣｌｉｃｋ技術は、抗体操作にも、ほとんどの治療用抗体の生成を特徴とするＵＶ／化学／酵素処理にも依存しない。トラスツズマブ－アレンドロネートコンジュゲート（Ｔｒａｓ－ＡＬＮ）を調製するために、ｐＣｌｉｃｋを使用して、アジド官能性部分を含有するＴｒａｓを生成し、続いて、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）官能化ＡＬＮと反応させた（図１Ａ、及び図５～図８）。生じたＴｒａｓ－ＡＬＮを脱塩カラムで更に精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳによって完全に特徴評価した（図１Ｂ、図１Ｃ）。コンジュゲートされていない重鎖又は分解生成物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで明らかにならず、９５％超のカップリング効率が示された。ＥＳＩ－ＭＳ分析はまた、重鎖の９５％超がＡＬＮ分子とコンジュゲートされたことを明らかにした。
【0088】
ＡＬＮに対する抗体コンジュゲーションは、抗原結合及び特異性を保持する
抗原結合親和性及び特異性に対するＡＬＮコンジュゲーションの効果を調査するために、ＨＥＲ２陽性細胞株及びＨＥＲ２陰性細胞株のフローサイトメトリー分析によって、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの結合親和性を評価した。図１Ｄは、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの両方が、ＨＥＲ２発現細胞株ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－３６１に対して強い結合親和性を有するが、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対しては強くないことを明らかにし、抗体特異性が、ＡＬＮコンジュゲーションによって変化しなかったことを示唆している（表１）。ＨＥＲ２陽性細胞への結合についてのＫｄ値は、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮについて同様の範囲内であり（それぞれ、ＢＴ４７４、３．０対３．８ｎＭ；ＳＫ－ＢＲ－３、２．３対３．０ｎＭ）、ＡＬＮコンジュゲーションが、抗原結合の強度に影響を及ぼさないことを示している（図８～図１１）。共焦点蛍光撮像は、Ｔｒａｓ－ＡＬＮが、抗原結合及び特異性を保持していることを更に確認している（図１２）。ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４及びＳＫ－ＢＲ－３細胞、並びにＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｔｒａｓ－ＡＬＮとともに３０分間インキュベートした。共焦点撮像は、細胞表面に関連する蛍光が、ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４及びＳＫ－ＢＲ－３細胞でのみ呈され、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では呈されないことを示している（図１２）。したがって、ＴｒａｓのＡＬＮ修飾は、その抗原結合親和性及び特異性に影響を及ぼさない。次に、ＨＥＲ２発現乳がん細胞及びＨＥＲ２陰性乳がん細胞に対する選択的細胞傷害性について、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートを試験した。図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、及び表１に示されるように、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートは、ＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞（２．３±０．７μｇ／ｍｌのＥＣ５０）及びＭＤＡ－ＭＢ－３６１（７８±２１μｇ／ｍｌのＥＣ５０）に対する細胞傷害活性を呈し、Ｔｒａｓ（１．４±０．９μｇ／ｍｌのＥＣ５０及び５７±１０μｇ／ｍｌのＥＣ５０）のものと区別不能である。いずれの抗体も、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を殺傷しない（ＥＣ５０＞５００μｇ／ｍｌ）。これらの結果は、負に帯電した部分ＡＬＮのコンジュゲーションが、Ｔｒａｓ抗体の抗原結合及びインビトロ抗腫瘍細胞活性を維持することを示している。
抗原結合親和性及び特異性に対するＡＬＮコンジュゲーションの効果を調査するために、ＨＥＲ２陽性細胞株及びＨＥＲ２陰性細胞株のフローサイトメトリー分析によって、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの結合親和性を評価した。図１Ｄは、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの両方が、ＨＥＲ２発現細胞株ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－３６１に対して強い結合親和性を有するが、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対しては強くないことを明らかにし、抗体特異性が、ＡＬＮコンジュゲーションによって変化しなかったことを示唆している（表１）。ＨＥＲ２陽性細胞への結合についてのＫｄ値は、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮについて同様の範囲内であり（それぞれ、ＢＴ４７４、３．０対３．８ｎＭ；ＳＫ－ＢＲ－３、２．３対３．０ｎＭ）、ＡＬＮコンジュゲーションが、抗原結合の強度に影響を及ぼさないことを示している（図８～図１１）。共焦点蛍光撮像は、Ｔｒａｓ－ＡＬＮが、抗原結合及び特異性を保持していることを更に確認している（図１２）。ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４及びＳＫ－ＢＲ－３細胞、並びにＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｔｒａｓ－ＡＬＮとともに３０分間インキュベートした。共焦点撮像は、細胞表面に関連する蛍光が、ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４及びＳＫ－ＢＲ－３細胞でのみ呈され、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では呈されないことを示している（図１２）。したがって、ＴｒａｓのＡＬＮ修飾は、その抗原結合親和性及び特異性に影響を及ぼさない。次に、ＨＥＲ２発現乳がん細胞及びＨＥＲ２陰性乳がん細胞に対する選択的細胞傷害性について、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートを試験した。図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、及び表１に示されるように、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートは、ＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞（２．３±０．７μｇ／ｍｌのＥＣ５０）及びＭＤＡ－ＭＢ－３６１（７８±２１μｇ／ｍｌのＥＣ５０）に対する細胞傷害活性を呈し、Ｔｒａｓ（１．４±０．９μｇ／ｍｌのＥＣ５０及び５７±１０μｇ／ｍｌのＥＣ５０）のものと区別不能である。いずれの抗体も、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を殺傷しない（ＥＣ５０＞５００μｇ／ｍｌ）。これらの結果は、負に帯電した部分ＡＬＮのコンジュゲーションが、Ｔｒａｓ抗体の抗原結合及びインビトロ抗腫瘍細胞活性を維持することを示している。
【0089】
インビトロ及びインビボでのＴｒａｓ－ＡＬＮによる骨転移ニッチ標的化の向上
次に、骨組織を標的とするＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの能力を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートとともに４℃で一晩インキュベートし、続いてＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧで標識した。共焦点レーザー走査顕微鏡を介して撮像する前に、これらの骨切片を、４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で３０分間更に染色した。ＦＩＴＣシグナルは、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートで染色した切片で観察されたが、非修飾Ｔｒａｓで染色した切片では観察されなかった（図１Ｈ）。更に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮシグナルの局在化は、ＸＯシグナルと良好に相関し、Ｔｒａｓ－ＡＬＮによる骨の特異的標的化を確認した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの結合と未修飾Ｔｒａｓの結合との間の親和性の差を定量化するために、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ及びＴｒａｓを、ヒドロキシアパタイト又は天然骨とともにインキュベートした。図１Ｉ及び図１Ｊに示されるように、未修飾Ｔｒａｓは、ＨＡ又は天然骨への結合をわずかのみ呈した。インキュベーション時間を増加させた場合でさえ、Ｔｒａｓの結合親和性は顕著に変化しなかった。対照的に、およそ８０％～９０％のＴｒａｓ－ＡＬＮは、それぞれ、２時間及び１０時間後にＨＡ及び天然骨に結合した。
次に、骨組織を標的とするＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの能力を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートとともに４℃で一晩インキュベートし、続いてＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧで標識した。共焦点レーザー走査顕微鏡を介して撮像する前に、これらの骨切片を、４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で３０分間更に染色した。ＦＩＴＣシグナルは、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートで染色した切片で観察されたが、非修飾Ｔｒａｓで染色した切片では観察されなかった（図１Ｈ）。更に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮシグナルの局在化は、ＸＯシグナルと良好に相関し、Ｔｒａｓ－ＡＬＮによる骨の特異的標的化を確認した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの結合と未修飾Ｔｒａｓの結合との間の親和性の差を定量化するために、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ及びＴｒａｓを、ヒドロキシアパタイト又は天然骨とともにインキュベートした。図１Ｉ及び図１Ｊに示されるように、未修飾Ｔｒａｓは、ＨＡ又は天然骨への結合をわずかのみ呈した。インキュベーション時間を増加させた場合でさえ、Ｔｒａｓの結合親和性は顕著に変化しなかった。対照的に、およそ８０％～９０％のＴｒａｓ－ＡＬＮは、それぞれ、２時間及び１０時間後にＨＡ及び天然骨に結合した。
【0090】
ＡＬＮコンジュゲートＴｒａｓのインビトロ骨標的化能力による後押しを受けて、腫瘍異種移植片モデルを使用して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートを用いたインビボ生体内分布研究を実行した。インビボでの抗体の検出を容易にするために、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮを最初にシアニン７．５（Ｃｙ７．５）－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとコンジュゲートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、生じたＣｙ７．５標識コンジュゲートを分析した。予想通り、蛍光は、Ｃｙ７．５標識コンジュゲートにのみ関連した（図１Ｂ）。ＢＰの重要な特徴は、骨転移性微小環境の比較的低いｐＨに起因して、骨転移へのビスホスホネートの取り込みが、健康な骨組織よりもはるかに高いことである３２～３５。ＡＬＮ－Ｔｒａｓが骨転移を特異的に標的とし、したがって、正常な骨組織に対する、標的に対する毒性を最小限に抑えることができるかどうかを調査するために、ＡＬＮ－Ｔｒａｓの標的化特性を骨腫瘍モデルにおいて評価した。ヌードマウスの右後肢への、ルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識されたＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞の内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射を使用することによって、骨微小転移モデルを作製した。ＩＩＡ注射は、骨の微小転移を確立するために最近開発された新規技術である。方法は、組織損傷を引き起こすことなく、後肢骨へのがん細胞の選択的送達を可能にする３６～３８。この技術は、いくつかの低悪性細胞が最終的に骨をコロニー化し、かつ多数のがん細胞が骨を特異的にコロニー化するのに十分な時間を与え、それによって初期段階で微小転移を豊富にすることを可能にする。これによって、微小転移の迅速な検出及び堅牢な定量化が可能になる。微小転移の確立に続いて、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。抗体又は抗体コンジュゲートの投与の２４、９６、又は１６８時間後に、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び骨を含む主要な臓器を取り出し、Ｃａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ撮像機を使用して分析した（図１Ｋ及び図１３）。顕著なことに、抗体の注射の９６時間後のエクスビボ蛍光画像によって、Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓと比較して、骨内にＣｙ７．５標識Ｔｒａｓ－ＡＬＮの明確な蓄積が確認された（図１Ｋ及び図１４）。更に、がんを担持する骨へのＴｒａｓ－ＡＬＮの取り込みは、健康な骨組織への取り込みよりも顕著に高かった。これは、ＢＰ分子が、酸性腫瘍環境で骨マトリックスに優先的に結合するという以前の観察と一致する３９。別々の研究では、標識されていないＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）を、右後肢にＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持するヌードマウスに投与した。この研究からの骨切片も、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ、ＲＦＰ、及びＤＡＰＩで染色した。ＦＩＴＣシグナルは、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を有する右脚からの切片でのみ観察された。腫瘍のない左脚では、ＦＩＴＣシグナルは検出されなかった（図１Ｌ）。顕著なことに、ＦＩＴＣシグナルは、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞の赤色蛍光と十分に相関しており、Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートが、健康な骨ではなく、骨転移部位を選択的に標的とすることを示唆している。これらの結果は、ＡＬＮコンジュゲーションが、骨転移部位における治療用抗体の送達及び濃度を顕著に向上することができることを実証している。
【0091】
次に、抗体の薬物動態及びＦｃＲｎ結合に対するＡＬＮコンジュゲーションの効果を評価した。ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの単回投与を後眼窩に注射し、血清を定期的に７日間収集し、トラスツズマブＥＬＩＳＡキットによって分析した。Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの両方の血清濃度は減少し、顕著差を示さなかった（図１３）。次に、ＦｃＲｎ結合に対するＡＬＮコンジュゲーションの効果を決定した。ＡＬＮコンジュゲーションが、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合に明らかな効果を有しないことが見出された（表４）。
【0092】
骨微小転移に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの治療有効性の向上
骨標的化トラスツズマブが、骨における乳がんの微小転移を治療するための新規の治療アプローチを表すかどうかを決定するために、異種移植片研究をヌードマウスで実行した。内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射を使用して、ヌードマウスの右後肢に、ホタルルシフェラーゼで標識された５×１０５のＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を接種した。ＩＩＡ注射の５日後、後眼窩注射を介して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＡＬＮ（１０μｇ／ｋｇ）、Ｔｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）でマウスを治療した。図２Ａ及び図１５に示されるように、ＰＢＳ及びＡＬＮ治療マウスにおける微小転移は急速に蓄積したが、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスにおける病変の発生は遅延した。全身の生物発光撮像（ＢＬＩ）シグナルは、Ｔｒａｓ－ＡＬＮでの治療が、Ｔｒａｓ治療マウスで見られるものと比較して、微小転移進行のより顕著な阻害を生じたことを示唆した（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。６日目から８７日目までのＢＬＩの増加は、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群が、Ｔｒａｓ治療群と比較して、腫瘍サイズの倍数増加が少なかったことを示した（Ｔｒａｓ対Ｔｒａｓ－ＡＬＮ：１９６５．１±７９８．３対４２．６±２３．４、図２Ｂ及び図２Ｃ）。骨転移が後肢に構築されたので、後肢におけるＢＬＩシグナルに対するＴｒａｓ－ＡＬＮの効果も定量化した。全身ＢＬＩシグナルと同様に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群は、ＢＬＩシグナル強度が低く、後肢の倍数増加が少なかった（図１７）。更に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスの生存率は、ＰＢＳ、ＡＬＮ、及びＴｒａｓ治療マウスのものと比較して著しく向上し、インビボでのＨＥＲ２陽性細胞に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの有効性を実証している（図２Ｄ）。更に、治療したマウスのうちのいずれにおいても、不健康の徴候としての体重減少は観察されず、骨標的化抗体に関連付けられる毒性が存在しないことを示唆している（図２Ｅ）。
骨標的化トラスツズマブが、骨における乳がんの微小転移を治療するための新規の治療アプローチを表すかどうかを決定するために、異種移植片研究をヌードマウスで実行した。内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射を使用して、ヌードマウスの右後肢に、ホタルルシフェラーゼで標識された５×１０５のＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を接種した。ＩＩＡ注射の５日後、後眼窩注射を介して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＡＬＮ（１０μｇ／ｋｇ）、Ｔｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）でマウスを治療した。図２Ａ及び図１５に示されるように、ＰＢＳ及びＡＬＮ治療マウスにおける微小転移は急速に蓄積したが、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスにおける病変の発生は遅延した。全身の生物発光撮像（ＢＬＩ）シグナルは、Ｔｒａｓ－ＡＬＮでの治療が、Ｔｒａｓ治療マウスで見られるものと比較して、微小転移進行のより顕著な阻害を生じたことを示唆した（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。６日目から８７日目までのＢＬＩの増加は、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群が、Ｔｒａｓ治療群と比較して、腫瘍サイズの倍数増加が少なかったことを示した（Ｔｒａｓ対Ｔｒａｓ－ＡＬＮ：１９６５．１±７９８．３対４２．６±２３．４、図２Ｂ及び図２Ｃ）。骨転移が後肢に構築されたので、後肢におけるＢＬＩシグナルに対するＴｒａｓ－ＡＬＮの効果も定量化した。全身ＢＬＩシグナルと同様に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群は、ＢＬＩシグナル強度が低く、後肢の倍数増加が少なかった（図１７）。更に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスの生存率は、ＰＢＳ、ＡＬＮ、及びＴｒａｓ治療マウスのものと比較して著しく向上し、インビボでのＨＥＲ２陽性細胞に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの有効性を実証している（図２Ｄ）。更に、治療したマウスのうちのいずれにおいても、不健康の徴候としての体重減少は観察されず、骨標的化抗体に関連付けられる毒性が存在しないことを示唆している（図２Ｅ）。
【0093】
これらの結果は、マイクロコンピューティング断層撮影（ｍｉｃｒｏＣＴ）データ及び組織学によって更に確認され、これは、骨標的化抗体が、溶骨性病変の数及び程度の両方を減少させることができるという発見を強調している。図２Ｆ及び図１８に示されるように、ＰＢＳ、ＡＬＮ、及びＴｒａｓ治療群からの大腿骨は、骨質量の顕著な減少を呈したが、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群の骨量減少は大幅に低減された。定量的分析は、Ｔｒａｓ治療群と比較して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群が顕著により高い骨体積（図２Ｇ、６Ｂ：ＢＶ／ＴＶ（％）、３５．０８±２．６５対５６．６７±１．０２、ｐ＝０．０００５）、より太い海綿骨（図２Ｈ、Ｔｂ．Ｔｈ（ｍｍ）、０．０６１±０．００３対０．０９４±０．００２、ｐ＝０．００３）、及びより高い海綿骨ミネラル密度（図２Ｉ、ＢＭＤ（ｍｇ／ｍｍ３）、１０１．１６±１２．２４対１６５．９４±１２．８４、ｐ＝０．０３５）を有することを明らかにした。
【0094】
また、骨切片の組織型測定分析によって、腫瘍サイズを分析した。ＰＢＳ治療群及びＡＬＮ治療群からの脛骨及び大腿骨は、高い腫瘍負荷を有した（図２Ｊ）。Ｔｒａｓ治療は、腫瘍負荷をわずかに低減したが、低減は、統計的に顕著ではなかった。対照的に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群では、腫瘍負荷の顕著な低減が観察された。一般に、骨マトリックスは、高い腫瘍負荷を有する骨において破壊されるが、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群における、より少ない腫瘍負荷を有する骨は、そのままの骨マトリックスを呈することが、様々な治療群からの骨試料の組織学的検査によって明らかである。また、ＨＥＲ２免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、腫瘍負荷の低減が確認された。図２Ｋに示されるように、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞の数は、個々の腫瘍細胞によるＨＥＲ２発現が変化しなかったにもかかわらず、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスにおいて劇的に減少した。これは、Ｔｒａｓ－ＡＬＮでの長期治療が、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞によるＨＥＲ２発現に効果を有しないことを示唆している。
【0095】
腫瘍誘発性溶骨性骨破壊のＴｒａｓ－ＡＬＮ阻害を調べるために、骨試料における骨吸収性、酒石酸耐性、酸性ホスファターゼ陽性多核破骨細胞を調べた（図２Ｋ）。酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色によって、Ｔｒａｓ治療マウスと比較して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスでは、侵食された骨表面を包む破骨細胞（ピンク色の細胞）の数の低減が同定された（図２Ｋ、図２Ｌ、及び図１９）。骨吸収の指標である、血清ＴＲＡｃＰ ５ｂ及びカルシウムレベルも、実験エンドポイントで測定した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群では、骨吸収の顕著に高い低減が観察された（図２Ｍ及び図２Ｎ）。総合すると、これらの結果は、治療用抗体のビスホスホネート修飾が、微小転移誘発性溶骨性病変の発生を遅らせる能力を顕著に向上したことを示している（表２）。
【0096】
原発腫瘍及び二次腫瘍の両方の存在下でのＴｒａｓ－ＡＬＮの治療有効性を更に評価するために、乳房脂肪体及びＩＩＡ注射の両方を使用して、異種移植片研究をヌードマウスで実行した。右後肢に接種した細胞には、ルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（２×１０５）を使用した。乳房脂肪体注射には、非標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（１×１０６）を注射した。注射の６日後、マウスをＴｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。原発腫瘍進行及び骨転移を、それぞれ、腫瘍サイズ測定及び生物発光によって監視した。Ｔｒａｓ治療群と比較して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮは、後肢における腫瘍成長の防止に顕著な効果を有した（図２７Ａ～図２７Ｂ）。しかしながら、乳房脂肪体腫瘍では顕著な成長差はなかった（図２７Ｃ）。これらの結果は、野生型Ｔｒａｓと比較して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮが、骨転移に対してより良好な治療効果を有するが、原発腫瘍に対しては同様の効果を有することを示唆した。
【0097】
Ｔｒａｓ－ＡＬＮは、骨病変からの多臓器転移を阻害する
症例のうちの３分の２超では、骨転移は、骨格に限定されず、むしろ他臓器へのその後の転移を引き起こす９、１０。早期の骨コロニー化を調査するために、ＩＩＡ注射を使用したが、これらの骨病変が８～１２週間にわたって進行するにつれて、転移は、追加の骨、肺、肝臓、腎臓、及び脳を含む他臓器に現れ始める。したがって、ＨＥＲ２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－３６１がん細胞の他臓器への転移を低減するＴｒａｓ－ＡＬＮの能力を調査した。前のように、ホタルルシフェラーゼで標識された５×１０５のＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ＩＩＡ注射を介してヌードマウスの右後肢に導入し、続いてＴｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。次いで、腫瘍細胞注射後、週２回、マウスを全身ＢＬＩに供した。全身及び後肢ＢＬＩシグナルを定量化し、図２０Ａに示した。様々な臓器における二次転移を、以下のように計算した：全身におけるＢＬＩシグナル－後肢におけるＢＬＩシグナル。図２０に示されるように、Ｔｒａｓ治療群では、１０６光子秒－１までの臓器ＢＬＩシグナルに時間依存的な増加があった。また、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群の臓器におけるＢＬＩシグナル蓄積に顕著な阻害が存在した（Ｐ＜０．０００１）。研究のエンドポイントで、マウスを安楽死させ、生物発光撮像のために臓器を採取した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ群における右後肢（４２．９％）及び肝臓（１４．３％、図３Ａ、図３Ｂ、及び図２１）と比較して、Ｔｒａｓ治療群において、右後肢（１００％）、心臓（２０％）、肝臓（８０％）、脾臓（４０％）、肺（６０％）、腎臓（６０％）、及び脳転移（４０％）のはるかに高いレベルが観察された。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスでは、肺、脾臓、腎臓、及び脳などの他臓器に転移はなかった。本発明者らのデータは、骨標的化抗体が、未修飾抗体と比較して、初期の骨微小転移の伝播から生じる多臓器転移を顕著に阻害することができることを示した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮで治療したマウスは、他の治療群のマウスよりも他臓器への少ない転移を呈し、「転移の繰り返しの播種」を阻害する骨標的抗体の能力を確立した。
症例のうちの３分の２超では、骨転移は、骨格に限定されず、むしろ他臓器へのその後の転移を引き起こす９、１０。早期の骨コロニー化を調査するために、ＩＩＡ注射を使用したが、これらの骨病変が８～１２週間にわたって進行するにつれて、転移は、追加の骨、肺、肝臓、腎臓、及び脳を含む他臓器に現れ始める。したがって、ＨＥＲ２陽性ＭＤＡ－ＭＢ－３６１がん細胞の他臓器への転移を低減するＴｒａｓ－ＡＬＮの能力を調査した。前のように、ホタルルシフェラーゼで標識された５×１０５のＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ＩＩＡ注射を介してヌードマウスの右後肢に導入し、続いてＴｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。次いで、腫瘍細胞注射後、週２回、マウスを全身ＢＬＩに供した。全身及び後肢ＢＬＩシグナルを定量化し、図２０Ａに示した。様々な臓器における二次転移を、以下のように計算した：全身におけるＢＬＩシグナル－後肢におけるＢＬＩシグナル。図２０に示されるように、Ｔｒａｓ治療群では、１０６光子秒－１までの臓器ＢＬＩシグナルに時間依存的な増加があった。また、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群の臓器におけるＢＬＩシグナル蓄積に顕著な阻害が存在した（Ｐ＜０．０００１）。研究のエンドポイントで、マウスを安楽死させ、生物発光撮像のために臓器を採取した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ群における右後肢（４２．９％）及び肝臓（１４．３％、図３Ａ、図３Ｂ、及び図２１）と比較して、Ｔｒａｓ治療群において、右後肢（１００％）、心臓（２０％）、肝臓（８０％）、脾臓（４０％）、肺（６０％）、腎臓（６０％）、及び脳転移（４０％）のはるかに高いレベルが観察された。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスでは、肺、脾臓、腎臓、及び脳などの他臓器に転移はなかった。本発明者らのデータは、骨標的化抗体が、未修飾抗体と比較して、初期の骨微小転移の伝播から生じる多臓器転移を顕著に阻害することができることを示した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮで治療したマウスは、他の治療群のマウスよりも他臓器への少ない転移を呈し、「転移の繰り返しの播種」を阻害する骨標的抗体の能力を確立した。
【0098】
（表１）乳がん上皮細胞株に対するＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの効力及び細胞表面反応性
略語：ＭＦＩ、蛍光強度中央値。結合は、ＰＢＳ対照に対する蛍光中央値の平均倍率増加として決定した。
【0099】
（表２）複数のアッセイにおける異なる治療群の比較（ＭＤＡ－ＭＢ－３６１モデル）
略語：ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光撮像；ＴＲＡＰ、酒石酸耐性酸ホスファターゼ。ａ実験過程にわたる全身におけるＢＬＩのシグナル強度。ｂ治療後のＢＬＩのシグナル強度倍率増加（８７日目のＢＬＩ／６日目のＢＬＩ）。Ｃ実験終了時にＴＲＡＰ染色した脛骨／大腿骨切片からの破骨細胞数測定値。ｄ実験終了時の血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ濃度。ｅ実験終了時の血清カルシウム濃度。ｆ実験過程にわたる体重進行。ｇ１０７超のマウスＢＬＩ強度は、エンドポイントに到達したと見なした。ａ、ｂは、二元配置反復測定分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して、統計的に分析した。ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用することによって分析した。ｇは、ログランク検定を使用することによって分析した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳは、Ｐ＞０．０５を表す。
【0100】
（表３）複数のアッセイにおけるＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ群の比較（ＭＣＦ７モデル）
略語：ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＢＬＩ、生物発光撮像；ＴＲＡＰ、酒石酸耐性酸ホスファターゼ。ａ実験過程にわたる全身のＢＬＩのシグナル強度。ｂ治療後のＢＬＩのシグナル強度倍率増加（６８日目のＢＬＩ／６日目のＢＬＩ）。ｃ実験終了時の血清カルシウム濃度。ｄ実験終了時の血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ濃度。ｅ実験過程にわたる体重進行。ｆ１０７超のマウスＢＬＩ強度は、エンドポイントに到達したと見なした。ａ、ｂは、二元配置反復測定分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較検定を使用することによって、統計的に分析した。ｃ、ｄ、ｅは、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用することによって分析した。ｆは、ログランク検定を使用することによって分析した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳは、Ｐ＞０．０５を表す。
【0101】
（表４）ｐＨ＝６でのヒトＦｃＲｎへの結合
【0102】
ＨＥＲ２陰性モデルにおけるＴｒａｓ－ＡＬＮの治療有効性の向上
それにもかかわらず、ＨＥＲ２陰性患者において見られる最小残存疾患の実質的な部分は、ＨＥＲ２シグナル伝達に起因し得ることを、以前の報告は示している４０、４１。また、ＨＥＲ２シグナル伝達は、ＨＥＲ２陰性細胞のサブ集団における幹細胞特性を媒介し得ることが報告され、これは、抗ＨＥＲ２治療が、ＨＥＲ２陽性乳がん及びＨＥＲ２陰性乳がんの両方の骨転移を根絶することが可能であり得る可能性を高める４２。したがって、ＨＥＲ２陽性ではないが、特に骨においてＨＥＲ２上方制御を呈する乳がん細胞を使用して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮの治療効果を評価した。内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射を使用して、ＭＣＦ－７（ＨＥＲ２－、ＥＲ＋）がん細胞を後肢骨に送達し３６、３８、続いて、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮで治療した（群当たり７匹のマウス、１ｍｇ／ｋｇ）。マウスを週２回撮像し、全身及び後肢及びのシグナル強度を定量化した。図４、図２２、及び図２３に示されるように、Ｔｒａｓ－ＡＬＮでの治療は、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られるよりも腫瘍成長のより顕著な阻害を生じ、インビボでのＨＥＲ２陰性細胞に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの有効性を実証している（ｐ＜０．００５）。一方、血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ（４．４１±１．１２Ｕ／Ｌ、ｐ＜０．０５）及び血清カルシウム（１０．３６±０．５３ｍｇ／ｄＬ、ｐ＜０．０５）レベルの顕著な低減が、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群において観察された（図２４）。ＨＥＲ２＋モデルと同様に、様々な臓器における二次転移も、研究過程にわたってＢＬＩシグナルの顕著な低減（Ｐ＜０．０００１）を呈した（図２５）。次に、骨病変からの多臓器転移を阻害するＴｒａｓ－ＡＬＮの能力を、エクスビボでも評価した。６８日目に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスの右後肢（５０％）、肺（５０％）、及び脳（５０％、図２６）に見出される値と比較して、Ｔｒａｓ治療群において右後肢（８３．４％）、肝臓（３３．４％）、肺（８３．４％）、及び脳（６６．７％）に転移性細胞が観察された。これらのデータは、骨標的化Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートが、ＨＥＲ２陰性骨微小転移から明白な骨転移への進行を防止すること、並びにＨＥＲ２陰性細胞の他臓器への二次転移をブロックすることに有用であり得ることを示唆している（表３）。
それにもかかわらず、ＨＥＲ２陰性患者において見られる最小残存疾患の実質的な部分は、ＨＥＲ２シグナル伝達に起因し得ることを、以前の報告は示している４０、４１。また、ＨＥＲ２シグナル伝達は、ＨＥＲ２陰性細胞のサブ集団における幹細胞特性を媒介し得ることが報告され、これは、抗ＨＥＲ２治療が、ＨＥＲ２陽性乳がん及びＨＥＲ２陰性乳がんの両方の骨転移を根絶することが可能であり得る可能性を高める４２。したがって、ＨＥＲ２陽性ではないが、特に骨においてＨＥＲ２上方制御を呈する乳がん細胞を使用して、Ｔｒａｓ－ＡＬＮの治療効果を評価した。内腸骨動脈内（ＩＩＡ）注射を使用して、ＭＣＦ－７（ＨＥＲ２－、ＥＲ＋）がん細胞を後肢骨に送達し３６、３８、続いて、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮで治療した（群当たり７匹のマウス、１ｍｇ／ｋｇ）。マウスを週２回撮像し、全身及び後肢及びのシグナル強度を定量化した。図４、図２２、及び図２３に示されるように、Ｔｒａｓ－ＡＬＮでの治療は、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られるよりも腫瘍成長のより顕著な阻害を生じ、インビボでのＨＥＲ２陰性細胞に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの有効性を実証している（ｐ＜０．００５）。一方、血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ（４．４１±１．１２Ｕ／Ｌ、ｐ＜０．０５）及び血清カルシウム（１０．３６±０．５３ｍｇ／ｄＬ、ｐ＜０．０５）レベルの顕著な低減が、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療群において観察された（図２４）。ＨＥＲ２＋モデルと同様に、様々な臓器における二次転移も、研究過程にわたってＢＬＩシグナルの顕著な低減（Ｐ＜０．０００１）を呈した（図２５）。次に、骨病変からの多臓器転移を阻害するＴｒａｓ－ＡＬＮの能力を、エクスビボでも評価した。６８日目に、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスの右後肢（５０％）、肺（５０％）、及び脳（５０％、図２６）に見出される値と比較して、Ｔｒａｓ治療群において右後肢（８３．４％）、肝臓（３３．４％）、肺（８３．４％）、及び脳（６６．７％）に転移性細胞が観察された。これらのデータは、骨標的化Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートが、ＨＥＲ２陰性骨微小転移から明白な骨転移への進行を防止すること、並びにＨＥＲ２陰性細胞の他臓器への二次転移をブロックすることに有用であり得ることを示唆している（表３）。
【0103】
したがって、骨標的化部分のコンジュゲーションを使用して、抗原及び骨特異性の両方を有する抗体の調製を可能にする革新的な骨標的化（ＢｏｎＴａｒｇ）技術を開発することができることが示された。データは、骨標的化ビスホスホネート分子であるアレンドロネート（ＡＬＮ）での治療用ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）の修飾が、他の組織と比較して、骨転移ニッチ内でコンジュゲート局在化の向上をもたらし、このことは、骨標的化抗体が骨転移を有する患者に標的療法の向上を提示するという興味深い可能性を高めている。骨組織に対するＡＬＮの親和性は、治療用抗体の送達を妨げる骨微小環境における物理的及び生物学的障壁を克服するのを助け、それによって骨においてＴｒａｓが豊富になり、保持される。Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートは、骨腫瘍部位の低いｐＨに起因して、健康な骨組織と比較して、骨転移ニッチにおいてより高い濃度に到達することができる５０。
【0104】
骨標的化部分を用いる部位特異的修飾の使用を介して、ＢｏｎＴａｒｇ技術は、骨転移部位への治療用抗体の特異的送達のための革新的なプラットフォームを提示する。生じた骨標的化抗体は、乳がん微小転移の治療において、及び最初の骨病変からの二次転移伝播の防止において、改善されたインビボ治療有効性を呈する。骨ニッチへの生物学的医薬品のこの種類の精密な送達は、骨関連疾患を治療するための有望な道筋を表している。微視的なＢＣａ骨転移の治療における、本発明者らの骨を標的とするＨＥＲ２抗体の治療プロファイルの向上は、他の転移性がん及び骨疾患の治療に対するＢｏｎＴａｒｇ戦略の拡張を告げるであろう。
【0105】
実施例２－材料及び方法
Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの構築
固相ペプチド合成を介して、ｓｓＦＢ－ＦＰｈｅＫペプチドのＣ末端に非正準アミノ酸アジド－Ｌｙｓを組み込んだ（図６）。ＨＰＬＣ精製後、ペプチドを６Ｍの尿素で変性させ、段階的に透析して尿素を除去し、ペプチドを再び折り畳むことを可能にした。ＰＢＳ（ｐＨ８．５）への緩衝液交換後、３２当量のｓｓＦＢ－アジドペプチドを、ＰＢＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中のＴｒａｓ（Ｓｙｄ ｌａｂｓからのＢＳ０４６Ｄ）とともに３７℃で２日間共インキュベートした。次いで、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＴｒａｓ－アジドコンジュゲートを精製して、過剰なｓｓＦＢ－アジドを除去した。ＥＳＩ－ＭＳによって、Ｔｒａｓ－アジドコンジュゲートを特徴評価した。ＥＳＩ－ＭＳ：予想値５３５６４、実測値：５３５５８（図７）。１０当量のＢＣＮ－ＡＬＮを室温で一晩溶液に添加して、コンジュゲート上のアジド基と選択的に反応させた。最後に、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＡＬＮ標識抗体コンジュゲートを精製して、過剰なＡＬＮ－ＢＣＮを除去した。ＥＳＩ－ＭＳによって、コンジュゲートを特徴評価した。ＥＳＩ－ＭＳ：予想値５３９８８、実測値：５３９８４（図１Ｃ）。
Ｔｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲートの構築
固相ペプチド合成を介して、ｓｓＦＢ－ＦＰｈｅＫペプチドのＣ末端に非正準アミノ酸アジド－Ｌｙｓを組み込んだ（図６）。ＨＰＬＣ精製後、ペプチドを６Ｍの尿素で変性させ、段階的に透析して尿素を除去し、ペプチドを再び折り畳むことを可能にした。ＰＢＳ（ｐＨ８．５）への緩衝液交換後、３２当量のｓｓＦＢ－アジドペプチドを、ＰＢＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中のＴｒａｓ（Ｓｙｄ ｌａｂｓからのＢＳ０４６Ｄ）とともに３７℃で２日間共インキュベートした。次いで、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＴｒａｓ－アジドコンジュゲートを精製して、過剰なｓｓＦＢ－アジドを除去した。ＥＳＩ－ＭＳによって、Ｔｒａｓ－アジドコンジュゲートを特徴評価した。ＥＳＩ－ＭＳ：予想値５３５６４、実測値：５３５５８（図７）。１０当量のＢＣＮ－ＡＬＮを室温で一晩溶液に添加して、コンジュゲート上のアジド基と選択的に反応させた。最後に、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＡＬＮ標識抗体コンジュゲートを精製して、過剰なＡＬＮ－ＢＣＮを除去した。ＥＳＩ－ＭＳによって、コンジュゲートを特徴評価した。ＥＳＩ－ＭＳ：予想値５３９８８、実測値：５３９８４（図１Ｃ）。
【0106】
細胞株
ＡＴＣＣの指示に従って、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＭＣＦ－７、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株を培養した。ホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰで標識したＭＤＡ－ＭＢ－３６１及びＭＣＦ７細胞株を、前述のように生成した５１。
ＡＴＣＣの指示に従って、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＭＣＦ－７、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株を培養した。ホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰで標識したＭＤＡ－ＭＢ－３６１及びＭＣＦ７細胞株を、前述のように生成した５１。
【0107】
ＨＡ結合アッセイ
簡潔には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の１ｍＬのＰＢＳにＴｒａｓ又はＡＬＮ－Ｔｒａｓを希釈した。ヒドロキシアパタイト（１５当量、１５ｍｇ）を添加し、生じた懸濁液を３７℃、２２０ｒｐｍで振盪させた。対照として、ヒドロキシアパタイトを含まない試料を使用した。０．２５、０．５、１、２、４、及び８時間後、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、３分）、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。ＨＡへの結合パーセントを以下のように計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤＨＡを含まない－ＯＤＨＡを含む）／（ＯＤＨＡを含まない）］×１００％。
簡潔には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の１ｍＬのＰＢＳにＴｒａｓ又はＡＬＮ－Ｔｒａｓを希釈した。ヒドロキシアパタイト（１５当量、１５ｍｇ）を添加し、生じた懸濁液を３７℃、２２０ｒｐｍで振盪させた。対照として、ヒドロキシアパタイトを含まない試料を使用した。０．２５、０．５、１、２、４、及び８時間後、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、３分）、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。ＨＡへの結合パーセントを以下のように計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤＨＡを含まない－ＯＤＨＡを含む）／（ＯＤＨＡを含まない）］×１００％。
【0108】
天然骨結合アッセイ
マウスの長骨を小断片へと切断し、蒸留Ｈ２Ｏ及び無水エタノールで洗浄し、次いで室温で一晩乾燥させた。結合研究のために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の１ｍＬのＰＢＳにＴｒａｓ又はＡＬＮ－Ｔｒａｓを希釈した。３０ｍｇの乾燥骨断片をチューブに添加し、生じた懸濁液を３７℃、２２０ｒｐｍで振盪させた。対照として、骨断片を含まない試料を使用した。０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、及び８．０時間後、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、５分）、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。天然骨への結合パーセントを以下の式に従って計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤ天然骨を含まない－ＯＤ天然骨を含む）／（ＯＤ天然骨を含まない）］×１００％。
マウスの長骨を小断片へと切断し、蒸留Ｈ２Ｏ及び無水エタノールで洗浄し、次いで室温で一晩乾燥させた。結合研究のために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の１ｍＬのＰＢＳにＴｒａｓ又はＡＬＮ－Ｔｒａｓを希釈した。３０ｍｇの乾燥骨断片をチューブに添加し、生じた懸濁液を３７℃、２２０ｒｐｍで振盪させた。対照として、骨断片を含まない試料を使用した。０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、及び８．０時間後、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、５分）、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって、２８０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。天然骨への結合パーセントを以下の式に従って計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤ天然骨を含まない－ＯＤ天然骨を含む）／（ＯＤ天然骨を含まない）］×１００％。
【0109】
Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮのインビトロ細胞傷害性
ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、２００μＬの培養培地中２×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートして、付着させた。次いで、培養培地を除去し、培養培地に溶解させた異なる濃度のＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮに置き換え、次いで、４日間インキュベートした。次いで、２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、更に４時間インキュベートした。培地を吸引し、１５０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎによるＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ Ｐｌｅｘ）によって、５７０ｎｍでの吸光度を測定して、生細胞を定量化した。
ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、２００μＬの培養培地中２×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートして、付着させた。次いで、培養培地を除去し、培養培地に溶解させた異なる濃度のＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮに置き換え、次いで、４日間インキュベートした。次いで、２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、更に４時間インキュベートした。培地を吸引し、１５０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎによるＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ Ｐｌｅｘ）によって、５７０ｎｍでの吸光度を測定して、生細胞を定量化した。
【0110】
フローサイトメトリー
９６ウェルプレート中に、がん細胞（３×１０３）を再懸濁し、３０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮで、４℃で３０分間染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでフルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（コード：１０９－０９５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）とともに、４℃で３０分間更にインキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、蛍光強度を決定した。
９６ウェルプレート中に、がん細胞（３×１０３）を再懸濁し、３０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮで、４℃で３０分間染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでフルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（コード：１０９－０９５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）とともに、４℃で３０分間更にインキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、蛍光強度を決定した。
【0111】
Ｋｄ値の決定
ＨＥＲ２に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの機能的親和性を、報告通りに決定した５２。簡潔には、２×１０５のＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、Ｔｒａ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの濃度を増加させながら、氷上で４時間インキュベートした。結合していない材料を洗い流した後、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を使用して、結合した抗体を検出した。ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）染色後、蛍光強度について細胞を分析した。飽和曲線の線形部分を使用して、抗体濃度の逆関数として中央蛍光値の逆数をプロットするＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ方法を使用して、解離定数、ＫＤを計算した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］）、式中、Ｆが、バックグラウンドを差し引いた中央蛍光値に対応し、Ｆｍａｘは、プロットから計算した。
ＨＥＲ２に対するＴｒａｓ－ＡＬＮの機能的親和性を、報告通りに決定した５２。簡潔には、２×１０５のＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、Ｔｒａ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの濃度を増加させながら、氷上で４時間インキュベートした。結合していない材料を洗い流した後、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を使用して、結合した抗体を検出した。ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）染色後、蛍光強度について細胞を分析した。飽和曲線の線形部分を使用して、抗体濃度の逆関数として中央蛍光値の逆数をプロットするＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ方法を使用して、解離定数、ＫＤを計算した。以下のように、ＫＤを決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］）、式中、Ｆが、バックグラウンドを差し引いた中央蛍光値に対応し、Ｆｍａｘは、プロットから計算した。
【0112】
共焦点撮像
８ウェル共焦点撮像チャンバープレート中約８０％のコンフルエンシーまで、がん細胞を成長させた。３０ｎＭのＴｒａｓ－ＦＩＴＣとともに細胞を３０分間インキュベートし、次いで、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次いで、ＤｉＩＣ１８（３）（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに２０分間、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号Ｈ１３９９、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））とともに５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、共焦点撮像に使用した。４０５／４８８／５６１／６３８ｎｍのレーザーを装備したＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ｓｉ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（日本）を使用して、細胞の共焦点蛍光画像を得た。
８ウェル共焦点撮像チャンバープレート中約８０％のコンフルエンシーまで、がん細胞を成長させた。３０ｎＭのＴｒａｓ－ＦＩＴＣとともに細胞を３０分間インキュベートし、次いで、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次いで、ＤｉＩＣ１８（３）（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに２０分間、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号Ｈ１３９９、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））とともに５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、共焦点撮像に使用した。４０５／４８８／５６１／６３８ｎｍのレーザーを装備したＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ｓｉ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（日本）を使用して、細胞の共焦点蛍光画像を得た。
【0113】
骨の凍結切片への結合
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化長骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮとともにインキュベートし、４℃で一晩コンジュゲートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧを用いて、室温で６０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、キシレノールオレンジ（ＸＯ）（原液：２ｍｇ／ｍｌ、希釈１：５００、希釈緩衝液：ＰＨ６．５のＰＢＳ）とともに、３７℃で３０分間標本をインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（原液１０ｍｇ／ｍｌ、希釈１：２０００）で１０分間標本を染色した。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、空気乾燥させ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの）Ｐｒｏｌｏｎｇ（商標）金退色防止封入剤を用いて密封した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化長骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＡＬＮとともにインキュベートし、４℃で一晩コンジュゲートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧを用いて、室温で６０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、キシレノールオレンジ（ＸＯ）（原液：２ｍｇ／ｍｌ、希釈１：５００、希釈緩衝液：ＰＨ６．５のＰＢＳ）とともに、３７℃で３０分間標本をインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（原液１０ｍｇ／ｍｌ、希釈１：２０００）で１０分間標本を染色した。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、空気乾燥させ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの）Ｐｒｏｌｏｎｇ（商標）金退色防止封入剤を用いて密封した。
【0114】
Ｔｒａｓ－ＡＬＮのインビボ評価
内腸骨動脈内注射及びＩＶＩＳ撮像を前述のように実施した５３。注射の５日後、動物を４つの群：ＰＢＳ治療対照、ＡＬＮ（ＢＰを含まないものの代表、ＰＢＳ中１０μｇ／ｋｇの後眼窩注射、週２回）、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｋｇの後眼窩注射、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）へと無作為化した。注射後、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して、週２回動物を撮像した。１１０日目に、マウスを麻酔し、心臓穿刺によって血液を収集し、その後安楽死させた。更なる試験のために、腫瘍を担持する脛骨、心臓、肝臓、脾臓、肺、脳、及び腎臓を収集した。
内腸骨動脈内注射及びＩＶＩＳ撮像を前述のように実施した５３。注射の５日後、動物を４つの群：ＰＢＳ治療対照、ＡＬＮ（ＢＰを含まないものの代表、ＰＢＳ中１０μｇ／ｋｇの後眼窩注射、週２回）、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｋｇの後眼窩注射、週２回）、及びＴｒａｓ－ＡＬＮコンジュゲート（Ｔｒａｓと同じ）へと無作為化した。注射後、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して、週２回動物を撮像した。１１０日目に、マウスを麻酔し、心臓穿刺によって血液を収集し、その後安楽死させた。更なる試験のために、腫瘍を担持する脛骨、心臓、肝臓、脾臓、肺、脳、及び腎臓を収集した。
【0115】
エクスビボでの転移の繰り返しの分析
酸素中２．５％のイソフルランでマウスを麻酔し、後眼窩にルシフェリンを注射した。次いで、マウスを安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、及び脛骨を収集した。これらの臓器のエクスビボ生物発光及び蛍光撮像を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａで直ちに実施した。
酸素中２．５％のイソフルランでマウスを麻酔し、後眼窩にルシフェリンを注射した。次いで、マウスを安楽死させ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、及び脛骨を収集した。これらの臓器のエクスビボ生物発光及び蛍光撮像を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａで直ちに実施した。
【0116】
骨組織学及び免疫組織化学
１０％のホルマリン中で１週間、採取した長骨を固定し、次いで、１２％のＥＤＴＡ中４℃で２週間、脱石灰化させた。標準的な手順を使用して、標本をパラフィンに包埋した。これらのブロックから、５μｍの切片を切り出し、スライドガラス上に収集した。切片をオーブンで一晩（３７℃）乾燥させ、次いで、キシレン溶液中で１０分間、パラフィン除去した。従来の方法を介して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を実施した。製造業者のプロトコルに従って、ＨＲＰ／ＤＡＢ ＡＢＣ ＩＨＣキット（ａｂｃａｍ）を使用して、脱石灰化パラフィン包埋組織切片に対して、免疫組織化学分析を実施した。
１０％のホルマリン中で１週間、採取した長骨を固定し、次いで、１２％のＥＤＴＡ中４℃で２週間、脱石灰化させた。標準的な手順を使用して、標本をパラフィンに包埋した。これらのブロックから、５μｍの切片を切り出し、スライドガラス上に収集した。切片をオーブンで一晩（３７℃）乾燥させ、次いで、キシレン溶液中で１０分間、パラフィン除去した。従来の方法を介して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を実施した。製造業者のプロトコルに従って、ＨＲＰ／ＤＡＢ ＡＢＣ ＩＨＣキット（ａｂｃａｍ）を使用して、脱石灰化パラフィン包埋組織切片に対して、免疫組織化学分析を実施した。
【0117】
Ｘ線写真分析
脛骨を解剖し、固定し、６．６４μｍ／ピクセルの解像度のマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ、Ｓｋｙｓｃａｎ１２７２、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって走査した。未修正画像をＮＲｅｃｏｎｎで再構築し、対象領域（ＲＯＩ）を使用して、ＣＴａｎ（ＳｋｙＳｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で分析した。分析した骨パラメータは、海綿の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ）、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、及びＢＳ／ＢＶ（骨表面／骨体積比）を含んだ。
脛骨を解剖し、固定し、６．６４μｍ／ピクセルの解像度のマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ、Ｓｋｙｓｃａｎ１２７２、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって走査した。未修正画像をＮＲｅｃｏｎｎで再構築し、対象領域（ＲＯＩ）を使用して、ＣＴａｎ（ＳｋｙＳｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で分析した。分析した骨パラメータは、海綿の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ）、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、及びＢＳ／ＢＶ（骨表面／骨体積比）を含んだ。
【0118】
生体内分布
内腸骨動脈内注射を介して、雌の無胸腺ヌードマウス（体重＝１３～１５ｇ）に、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を導入した。３ヶ月後、腫瘍を担持するヌードマウスに、後眼窩注射によってＣｙ７．５標識Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。注射の２４時間、９６時間、又は１６８時間後、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び骨腫瘍組織を含む主要な臓器を取り出した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像機（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用することによって、臓器及び骨腫瘍組織における蛍光強度を半定量的に決定した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスからの骨を固定し、切片化して、生体内分布を更に評価した。
内腸骨動脈内注射を介して、雌の無胸腺ヌードマウス（体重＝１３～１５ｇ）に、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を導入した。３ヶ月後、腫瘍を担持するヌードマウスに、後眼窩注射によってＣｙ７．５標識Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。注射の２４時間、９６時間、又は１６８時間後、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び骨腫瘍組織を含む主要な臓器を取り出した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像機（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用することによって、臓器及び骨腫瘍組織における蛍光強度を半定量的に決定した。Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスからの骨を固定し、切片化して、生体内分布を更に評価した。
【0119】
別々の研究では、後眼窩注射を介して、右後肢にＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持するヌードマウスに、標識されていないＴｒａｓ－ＡＬＮ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４８時間後、Ｔｒａｓ－ＡＬＮ治療マウスからの長骨を単離し、脱石灰化することなく直ちに切片化した。次いで、骨切片を固定し、抗ＲＦＰ（ウサギ）抗体（１：２００、Ｒｏｃｋｌａｎｄから購入）とともに４で一晩インキュベートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから購入）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で、室温で１２０分間染色した。（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒからの）ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ（商標）金退色防止封入剤を用いて切片を封入し、カバースリップで密封し、次いで、共焦点撮像に使用した。
【0120】
薬物動態分析及びＦｃＲｎ結合アッセイ
ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの単回投与を無胸腺ヌードマウスに後眼窩注射し、血清を定期的に７日間収集し、トラスツズマブＥＬＩＳＡキット（Ｌａｂ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）によって分析した。マニュアルに従ってＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ結合免疫アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＦｃＲｎ結合を決定した。
ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＡＬＮの単回投与を無胸腺ヌードマウスに後眼窩注射し、血清を定期的に７日間収集し、トラスツズマブＥＬＩＳＡキット（Ｌａｂ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）によって分析した。マニュアルに従ってＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ結合免疫アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＦｃＲｎ結合を決定した。
【0121】
血清中のＴＲＡＰ及びカルシウムレベルの定量化
終末時点で、心臓穿刺によって血液を収集し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を得た。マウスＡＣＰ５／ＴＲＡＰ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＩＴ５１８０、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって、破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ ５ｂの濃度を測定した。カルシウム検出キット（カタログ番号ＤＩＣＡ－５００、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を使用して、比色測定的に血清カルシウムレベルを測定した。
終末時点で、心臓穿刺によって血液を収集し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を得た。マウスＡＣＰ５／ＴＲＡＰ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＩＴ５１８０、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって、破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ ５ｂの濃度を測定した。カルシウム検出キット（カタログ番号ＤＩＣＡ－５００、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を使用して、比色測定的に血清カルシウムレベルを測定した。
【0122】
統計的方法
データを平均プラス又はマイナスＳＥＭとして提示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、統計的に分析する。時間経過にわたって収集した全てのデータには、二元配置分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較を使用した。Ｍｉｃｒｏ－ＣＴデータには、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較を使用した。多臓器転移データには、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を表すと見なした。
データを平均プラス又はマイナスＳＥＭとして提示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、統計的に分析する。時間経過にわたって収集した全てのデータには、二元配置分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較を使用した。Ｍｉｃｒｏ－ＣＴデータには、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較を使用した。多臓器転移データには、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を表すと見なした。
【0123】
ＢＣＮ－ＡＬＮの合成
ＢＣＮ－ＰＮＰ（ＥＮＤＯ）（３１．５ｍｇ）及びＤＩＰＥＡ（３８．７ｍｇ）を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、続いて２７．４ｍｇの（脱イオン水０．３ｍＬに溶解させた）ＡＬＮを混合物に滴加した。生じた混合物を４時間撹拌した。酢酸エチル（１ｍＬ）を反応溶液に添加し、生じた沈殿物を濾過し、酢酸エチルで３回すすいだ。逆相カラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。ＭＳによって、ＢＣＮ－ＡＬＮの構造を確認した。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ－Ｈ］－：Ｃ１５Ｈ２５ＮＯ９Ｐ２での計算値４２４．１、実測値：４２４．１（図５）。
ＢＣＮ－ＰＮＰ（ＥＮＤＯ）（３１．５ｍｇ）及びＤＩＰＥＡ（３８．７ｍｇ）を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、続いて２７．４ｍｇの（脱イオン水０．３ｍＬに溶解させた）ＡＬＮを混合物に滴加した。生じた混合物を４時間撹拌した。酢酸エチル（１ｍＬ）を反応溶液に添加し、生じた沈殿物を濾過し、酢酸エチルで３回すすいだ。逆相カラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。ＭＳによって、ＢＣＮ－ＡＬＮの構造を確認した。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ－Ｈ］－：Ｃ１５Ｈ２５ＮＯ９Ｐ２での計算値４２４．１、実測値：４２４．１（図５）。
【0124】
ｓｓＦＢ－ＦＰｈｅＫペプチドの固相合成
Ｆｍｏｃに基づくペプチド合成のプロトコルに従って、ｓｓＦＢペプチドを合成した。アミノ酸配列：ＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＸＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳ－ＡｚＫ（Ｘ＝ＭＭＴ－Ｌｙｓ）（配列番号１）。固体支持体として、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を使用した。ＤＭＦ中２５％のピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。生成物をＤＭＦで５回洗浄した後、アミド結合形成のために、ＤＭＦ中の予め活性化させたＨＡＴＵ／Ｆｍｏｃ－アミノ酸混合物を反応容器に添加した。次いで、同じ反応サイクルを介して、次のアミノ酸をビーズに結合させた。ペプチド合成が完了したら、Ｎ末端を無水酢酸によってキャップした。ＦＰｈｅＫをペプチドに組み込むために、１０％の酢酸（ＡｃＯＨ：ＴＦＥ：ＤＣＭ＝１：２：７）を使用して、最初にＭＭＴ保護基を選択的に除去した。その後、２当量の４－フルオロフェニルクロロホルメート及び４当量のＤＩＥＡを反応容器に添加して、ＦＰｈｅＫ形成のために、Ｌｙｓ側鎖上の露出した遊離アミンと反応させた。反応が完了したら、適切な量のＴＦＡ及びスカベンジャー（水、アニソール、トリイソプロピルシラン）を容器に添加して、ペプチドを樹脂から切断し、全ての保護基を除去しクエンチした。次いで、氷冷エーテルの添加によってペプチドを沈殿させ、ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥させた。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値４５２４、実測値：４５２４（図６）。
Ｆｍｏｃに基づくペプチド合成のプロトコルに従って、ｓｓＦＢペプチドを合成した。アミノ酸配列：ＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＸＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳ－ＡｚＫ（Ｘ＝ＭＭＴ－Ｌｙｓ）（配列番号１）。固体支持体として、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を使用した。ＤＭＦ中２５％のピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。生成物をＤＭＦで５回洗浄した後、アミド結合形成のために、ＤＭＦ中の予め活性化させたＨＡＴＵ／Ｆｍｏｃ－アミノ酸混合物を反応容器に添加した。次いで、同じ反応サイクルを介して、次のアミノ酸をビーズに結合させた。ペプチド合成が完了したら、Ｎ末端を無水酢酸によってキャップした。ＦＰｈｅＫをペプチドに組み込むために、１０％の酢酸（ＡｃＯＨ：ＴＦＥ：ＤＣＭ＝１：２：７）を使用して、最初にＭＭＴ保護基を選択的に除去した。その後、２当量の４－フルオロフェニルクロロホルメート及び４当量のＤＩＥＡを反応容器に添加して、ＦＰｈｅＫ形成のために、Ｌｙｓ側鎖上の露出した遊離アミンと反応させた。反応が完了したら、適切な量のＴＦＡ及びスカベンジャー（水、アニソール、トリイソプロピルシラン）を容器に添加して、ペプチドを樹脂から切断し、全ての保護基を除去しクエンチした。次いで、氷冷エーテルの添加によってペプチドを沈殿させ、ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥させた。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値４５２４、実測値：４５２４（図６）。
【0125】
本明細書に開示及び請求される全ての方法は、本開示に照らして、過度の実験なしに作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本明細書に記載の方法及びステップ又は方法の一連のステップに、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形例が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方で関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えることができ、一方で、同じ又は同様の結果が達成され得ることが明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような全ての類似の置き換え及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあると見なされる。
【0126】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に援用される。
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】