特表 2024-503503 認知機能障害を治療するためのマイクロＲＮＡ １９５組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】認知機能障害を治療するためのマイクロＲＮＡ １９５組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20240118BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240118BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240118BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240118BHJP

   A61K 31/4422 20060101ALI20240118BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240118BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

A61P25/28

A61P43/00 111

A61P37/02

A61P25/00

A61P43/00 105

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K31/4422

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023543342

(86)(22)【出願日】2022-01-19

(85)【翻訳文提出日】2023-09-14

(86)【国際出願番号】 US2022012922

(87)【国際公開番号】W WO2022159452

(87)【国際公開日】2022-07-28

(31)【優先権主張番号】63/139,083

(32)【優先日】2021-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518399047

【氏名又は名称】ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ リプレゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＡＳ ＲＥＰＲＥＳＥＮＴＥＤ ＢＹ ＴＨＥ ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＶＥＴＥＲＡＮＳ ＡＦＦＡＩＲＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ツァイ ドンミン

【テーマコード（参考）】

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC24

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA22

4C086MA24

4C086MA41

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZB07

4C086ZB21

4C086ZC41

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA08

4C087CA12

4C087MA05

4C087MA22

4C087MA24

4C087MA41

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZB07

4C087ZB21

4C087ZC41

(57)【要約】

本開示は、対象の軽度認知機能障害を治療する組成物及び方法に関する。方法はまた、治療を必要としている対象に、有効量のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントを投与することを含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の認知機能障害を治療する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物の前記投与前に、前記対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを判定することを更に含み、前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料と比較してより低い、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記参照試料が、認知機能障害を有しない対象又は認知機能障害を有すると診断されていない対象から得られる、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

対象の認知機能障害を治療する方法であって、
前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物を投与することを含み、前記対象が、
ｉ）前記対象から得られた試料内で、ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを判定すること、及び
ｉｉ）前記対象から得られた前記試料内の前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの前記発現レベルを、参照試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと比較することによって、認知機能障害と診断されており、
前記対象から得られた前記試料内の前記ｍｉＲ－１９５－５ｐのより低い発現レベルが、前記対象の認知機能障害を示す、方法。

【請求項5】

前記参照試料が、前記認知機能障害を有しない対象又は前記認知機能障害を有すると診断されていない対象から得られる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

対象の認知機能障害の１つ以上の症状を寛解させる方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項7】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を低減する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項8】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を阻害する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項9】

対象のアミロイドβタンパク質（Ａβ）クリアランスを増加させる方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項10】

対象の、タウ過剰リン酸化の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）誘導性上昇を低減する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項11】

対象のアミロイドプラーク負荷を低減する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項12】

対象のタウ過剰リン酸化を低減する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項13】

対象のＩＬ－６又はＴＮＦα放出を低減する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項14】

対象のリン酸化タウ産生を減少させる方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項15】

対象の虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を治療又は緩和する方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項16】

対象のアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューする方法であって、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項17】

前記認知機能障害が、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、血管性認知症、混合性認知症、又はダウン症候群である、請求項１～６に記載の方法。

【請求項18】

前記対象が、投与ステップの前に、治療を必要としていると特定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記対象が、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその前記断片若しくはバリアントが、全身投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその前記断片若しくはバリアントが、ベクター内に位置する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ベクターが、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソームを更に含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

ｍｉＲ－１９５－５ｐ又は前記断片若しくはバリアントが、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソーム内に含まれる、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスである、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐが、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

以下からなる群から選択される化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【化1】

【化2】

【化3】

【請求項28】

方法であって、
（ａ）血漿、血清、又は脳脊髄液試料を対象から得る又は得ていることと、
（ｂ）前記血漿、血清、又は脳脊髄液試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを測定することと、
（ｃ）前記ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルが、対照試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも低いときに、前記対象が、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物での治療を必要としていると特定することと、
（ｄ）治療を必要としていると特定された前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む組成物を投与することと、を含む、方法。

【請求項29】

前記対象が、認知機能障害を有する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記認知機能障害が、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、血管性認知症、脳血管疾患、虚血性、混合性認知症、又はダウン症候群である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物が、全身投与、鼻腔内投与、又は髄腔内投与される、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐが、ベクター内に位置する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はウイルスベクターである、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ベクターが、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソームを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐが、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソーム内に含まれる、請求項２８に記載の方法。

【請求項36】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスである、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記ベクターが、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソームを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

以下からなる群から選択される化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを更に含む、請求項２８に記載の方法。

【化4】

【化5】

【化6】

【請求項39】

対象を認知機能障害と診断する方法であって、
ａ）前記対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを測定することと、
ｂ）前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルよりも低い場合、前記対象が前記認知機能障害を有すると判定することであって、対応する参照値が、健常対象のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルの平均値である、判定することと、
ｃ）前記対象を前記認知機能障害のために治療することと、を含む、方法。

【請求項40】

前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、定量的ＰＣＲによって判定される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記対象を前記認知機能障害のために治療するステップが、前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

対象が認知機能障害を有するかを判定する方法であって、
ａ）前記対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを検出することと、
ｂ）前記対象からの前記試料内の前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを、参照試料からのｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと比較することと、
ｃ）前記対象の試料内の前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料からの前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと同じである若しくはそれよりも高いときに、前記対象が認知機能障害を有しないと判定すること、又は前記対象の試料内の前記ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、前記参照試料からの前記ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも低いときに、前記対象が認知機能障害を有すると判定することと、を含む、方法。

【請求項43】

前記認知機能障害と診断された前記対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む治療有効量の組成物を投与することを更に含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記試料が、血清、脳脊髄液、又は血漿である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１９日に出願された米国特許仮出願第６３／１３９，０８３号の優先権を主張する。この以前に出願された出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｆｆａｉｒｓによって授与されたＢＸ００３３８０に基づき、政府支援で作製された。政府は、本発明において、ある権利を有する。

【0003】

配列表の援用
本出願は、配列表を含有し、配列表は、本出願の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、「３７７５９＿０３４７Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名を含有し、これは、サイズが４，０９６バイトであり、２０２２年１月５日に作成され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害は、普及した増大している問題である。神経変性障害は、ニューロンに影響する状態に関連し、ニューロンは、これらの障害において損傷又は破壊され得る。ニューロンは、典型的には、再生することができないため、これらの状態は、しばしば、不可逆的な問題を導き、認知機能、運動機能、又は両方の問題をもたらす。

【0005】

老化の最も普及した神経変性疾患であるアルツハイマー病は、より高齢の米国人の８人のうちの１人に発症している。最近の証拠は、（ＡＤの９０％を占める）散発性ＡＤが、Ａβクリアランスの機能障害によって引き起こされる可能性があることを示している。軽度認知機能障害（ＭＣＩ）は、わずかな減少が、認知機能、例えば、記憶（すなわち、健忘ＭＣＩ）、又は思考若しくは言語能力（又は非健忘ＭＣＩ）において見られる状態である。ＭＣＩにおいて見られる変化は、顕著であるが、概して、罹患者の日常活動を妨害せず、介護生活を必要とせず、このため、ＭＣＩは、認知症とは区別される。

【0006】

あるカルシウムチャネル遮断薬は、神経変性障害を治療するための手法を示唆する特徴を有する。しかしながら、あいにく、カルシウムチャネル遮断薬は、いくつかの副作用を示し、これらの副作用は、神経変性疾患の治療において不利である。したがって、有効でありより少ない毒性の治療薬が必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

対象の認知機能障害を治療する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0008】

対象の認知機能障害を治療する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物を投与することを含み、対象が、ｉ）対象から得られた試料内で、ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを判定すること、及びｉｉ）対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを、参照試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと比較することによって、認知機能障害と診断されており、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐのより低い発現レベルが、対象の認知機能障害を示す、方法が、本明細書に開示される。

【0009】

対象の認知機能障害の１つ以上の症状を寛解させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0010】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0011】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を阻害する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0012】

対象のアミロイドβタンパク質（Ａβ）クリアランスを増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0013】

対象の、タウ過剰リン酸化の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）誘導性上昇を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0014】

対象のアミロイドプラーク負荷を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0015】

対象のタウ過剰リン酸化を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0016】

対象のＩＬ－６又はＴＮＦα放出を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0017】

対象のリン酸化タウ産生を減少させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0018】

対象の虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を治療又は緩和する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0019】

対象のアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューする方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0020】

方法であって、（ａ）脳脊髄液試料を対象から得る又は得ていることと、（ｂ）脳脊髄液試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを測定することと、（ｃ）ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルが、対照試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも低いときに、対象が、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物での治療を必要としていると特定することと、（ｄ）治療を必要としていると特定された対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む組成物を投与することと、を含む、方法が、本明細書に開示される。

【0021】

方法であって、（ａ）血漿又は血清試料を対象から得る又は得ていることと、（ｂ）血漿又は血清試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを測定することと、（ｃ）ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルが、対照試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも低いときに、対象が、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物での治療を必要としていると特定することと、（ｄ）治療を必要としていると特定された対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む組成物を投与することと、を含む、方法が、本明細書に開示される。

【0022】

対象を認知機能障害と診断する方法であって、ａ）対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを測定することと、ｂ）ｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルよりも低い場合、対象が当該認知機能障害を有すると判定することであって、対応する参照値が、健常対象のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルの平均値である、判定することと、ｃ）対象を当該認知機能障害のために治療することと、を含む、方法が、本明細書に開示される。

【0023】

対象が認知機能障害を有するかを判定する方法であって、ａ）対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを検出することと、ｂ）対象からの試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルを、参照試料からのｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと比較することと、ｃ）対象の試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料からのｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルと同じである若しくはそれよりも高いときに、対象が認知機能障害を有しないと判定すること、又は対象の試料内のｍｉＲ－１９５－５ｐの発現レベルが、参照試料からのｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも低いときに、対象が認知機能障害を有すると判定することと、を含む、方法が、本明細書に開示される。

【0024】

本発明の組成物及び方法の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面、及び特許請求の範囲に示されている。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】ｍｉＲ－１９５が、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位ｍｉＲＮＡ候補として特定されることを示す。図１Ａは、ｍｉＲ－１９５を、４つの群のうちで共通して共有されるｍｉＲＮＡとして示すベン図を示し、４つの群は、ヒトＲＯＳＭＡＰデータセットにおける、ＡｐｏＥ４⁺キャリアとＡｐｏＥ４^-キャリアとの間の差次的に発現されるｍｉＲＮＡ、マウスｍｉＲＮＡアレイ研究における、ＡｐｏＥ４⁺とＡｐｏＥ４^-との間の差次的に発現されるｍｉＲＮＡ、ＲＯＳＭＡＰにおける、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡと負相関するｍｉＲＮＡ、及びｍｕｌｔｉＭｉＲデータベースによって、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡを標的とすると予測されるｍｉＲＮＡである。サブ群のうちで重複するｍｉＲＮＡの数が示される（赤い数字）。

【図1B】ｍｉＲ－１９５が、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位ｍｉＲＮＡ候補として特定されることを示す。図１Ｂは、ＲＯＳＭＡＰデータセットにおける、ＡｐｏＥ４⁺キャリアとＡｐｏＥ４^-キャリアとの間のｍｉＲ－１９５レベルの差、及び雌性ＡｐｏＥ４⁺キャリアと雌性ＡｐｏＥ４^-キャリアとの間のｍｉＲ－１９５レベルの差、並びにマウスＡｐｏＥ４⁺処置ニューロンとマウスＡｐｏＥ４^-処置ニューロンとの間のｍｉＲ－１９５レベルの差の対数倍率変化（ＬｏｇＦＣ）及びｐ値を示す。

【図1C】ｍｉＲ－１９５が、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位ｍｉＲＮＡ候補として特定されることを示す。図１Ｃは、ＲＯＳＭＡＰデータベースのヒト対象のｍｉＲ－１９５とｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡとの間の相関の解析を示す。

【図2A】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図２Ａは、ＡｐｏＥ４^+/-対象（ＣＤＲ０．５～１）のヒト頭頂皮質組織内の（Ｌｏｇ₂倍率変化として提示される）ｍｉＲ－１９５の量が、ＡｐｏＥ４^-/-対象のものよりも低かったことを示す。Ｎ＝１７～１８／群、ｌｏｇ₂ＦＣ倍率変化：ＡｐｏＥ４^-/- ０．０５４±０．１１３対ＡｐｏＥ４^+/- －０．５７０±０．１７８、独立試料ｔ検定での＊＊ｐ＜０．０１。

【図2B】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図２Ｂは、正常老化からＭＣＩ及び早期ＡＤへのＡＤ疾患進行に伴う、（Ｌｏｇ₂倍率変化として提示される）ｍｉＲ－１９５レベルの低減のパターンを示す。Ｎ＝１２～１９／群、ｌｏｇ₂ＦＣ：ＣＤＲ０の対象の１．６２６±０．６９６対ＣＤＲ０．５のＭＣＩ患者の０．２４２±０．１０４対ＣＤＲ１のＡＤ対象の－０．６６３±０．１３５、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図2C】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図２Ｃは、ＣＳＦ ｍｉＲ－１９５レベルとＭＭＳＥスコアとの間の正相関を示す（ｒ＝０．４５５、ｐ＝０．０２９、Ｎ＝２３）。

【図2D】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図２Ｄは、ＣＳＦ ｍｉＲ－１９５レベルと総タウレベルとの間の負相関を示す（ｒ＝－０．４０８、ｐ＝０．０４、Ｎ＝２３）。

【図3A】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図３Ａは、ｍｉＲ－１９５のレベルが、１２か月齢のＡｐｏＥ４海馬脳組織内で（ｌｏｇ₂ＦＣ：－０．２８３±０．０６９）、ＡｐｏＥ３マウスのもの（ｌｏｇ₂ＦＣ：－０．０３６±０．０３４）と比較して低減されたことを示す。Ｎ＝１１～１３／雄及び雌の両方を有する群、ＡＮＯＶＡ検定での＊＊ｐ＝０．００９６。ｍｉＲ－１９５レベルの名目低減は、ＡｐｏＥ^-/-脳内で、統計的有意性なく見られた（ｌｏｇ₂ＦＣ：－０．１２５±０．０６７、ｐ＝０．４８）。

【図3B】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図３Ｂは、ＡｐｏＥ４－ＣＭで処置されたＡｐｏＥ^-/-ニューロン内のｍｉＲ－１９５のレベル（ｌｏｇ₂ＦＣ＝－０．３１４±０．０７３）が、ＡｐｏＥ３－ＣＭで処置されたもののレベル（ｌｏｇ₂ＦＣ：０．１８４±０．０９４）と比較して低減されたことを示す。Ｎ＝５／群、独立試料ｔ検定での＊＊ｐ＝０．００３。

【図3C】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図３Ｃは、ＡｐｏＥ３－ＣＭ処置ニューロンとＡｐｏＥ４－ＣＭ処置ニューロンとの間のｍｉＲ－１９５発現レベルの差が、ＲＡＰの存在下で消失したことを示す。ＡｐｏＥ３－ＣＭの存在下でのＲＡＰの処置は、ｍｉＲ－１９５レベルの低減（ｌｏｇ₂ＦＣ：－１．６４８±０．１２５、ｐ＜０．０００１）を導いたが、ＡｐｏＥ４－ＣＭ処置状態において、ｍｉＲ－１９５レベルは、ベースラインにおいてはるかにより低く、ＲＡＰ処置の存在下で改善の傾向があった（ＡｐｏＥ４ ＣＭ＋ＢＳＡ ｌｏｇ₂ＦＣ：－３．１９３±０．１４４対ＡｐｏＥ４ ＣＭ＋ＲＡＰ ｌｏｇ₂ＦＣ：－２．６７８±０．０５４、ｐ＝０．０５２）。Ｎ＝３／群、一元配置ＡＮＯＶＡ検定による＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図3D】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図３Ｄは、ｓｙｎｊ１タンパク質レベルが、ＡｐｏＥ^-/-海馬ニューロン内で、ＡｐｏＥ４－ＣＭの存在下で、ｍｉＲ－１９５過剰発現で低減されたが、ｍｉＲ－３７４過剰発現で低減されなかったことを示す。Ｎ＝４／群、ｍｉＲ－１９５でのｓｙｎｊ１レベル：対照の６２．８７±４．４８％、＊＊ｐ＝０．００１；ｍｉＲ－３７４でのｓｙｎｊ１レベル：対照の１０２．４±７．７７％、ｐ＝０．９３。

【図4A】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ａは、ＡｐｏＥ４^+/+スクランブル注射、ＡｐｏＥ４^+/+ ｍｉＲ－１９５注射、ＡｐｏＥ３^+/+スクランブル注射、及びＡｐｏＥ３^+/+ ｍｉＲ－１９５注射の４つのマウス群における、選好指標＝（新規物体探索時間）／（新規物体探索時間＋慣れた物体探索時間）、及び識別指標＝（新規物体探索時間－慣れた物体探索時間）／（新規物体探索時間＋慣れた物体探索時間）を示す。Ｎ＝１９～２３／雄及び雌の両方を有する群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５。

【図4B】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ｂは、ＫＩマウス海馬内のｐＴａｕのレベルを示す。Ｎ＝８／雄及び雌の両方を有する群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１。

【図4C】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ｃは、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤ雄性スクランブル注射、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤ雄性ｍｉＲ－１９５注射、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤ雌性スクランブル注射、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤ雌性ｍｉＲ－１９５注射、ＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤ雄性スクランブル注射、ＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤ雄性ｍｉＲ－１９５注射、ＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤ雌性スクランブル注射、及びＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤ雌性ｍｉＲ－１９５注射の８つのマウス群における、選好指標及び識別指標を示す。Ｎ＝６～１０／群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５。

【図4D】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ｄ及び図４Ｅは、ＥＦＡＤマウス海馬内のｐＴａｕ（図４Ｄ）及びオリゴマーＡβ₄₂（図４Ｅ）のレベルを示す。Ｎ＝６／雄及び雌の両方を有する群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１ ＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図4E】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ｄ及び図４Ｅは、ＥＦＡＤマウス海馬内のｐＴａｕ（図４Ｄ）及びオリゴマーＡβ₄₂（図４Ｅ）のレベルを示す。Ｎ＝６／雄及び雌の両方を有する群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１ ＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図4F】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図４Ｆは、ＥＦＡＤマウス海馬内のアミロイドプラーク負荷を示す。アミロイドプラークロードは、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤスクランブル注射、ＡｐｏＥ４^+/+ ＦＡＤ ｍｉＲ－１９５注射、ＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤスクランブル注射、及びＡｐｏＥ３^+/+ ＦＡＤ ｍｉＲ－１９５注射の４つのマウス群において、脳領域の１ｍｍ²当たりのプラークの面積として測定される密度と、プラーク／μｍ²の総数とによって定量化される。Ｎ＝３／群、ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１。

【図5A】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図５Ａは、スクランブル対照（ｃｔｒｌ）、ｍｉＲ－１９５、及びｍｉＲ－１９５阻害剤（ｍｉＲ ｉｎｈ）の様々な条件を有する、ＡｐｏＥ４^+/+正常老化（ＮＡ）及びＡｐｏＥ４^+/+ ＡＤ対象のｉＰＳＣ由来ニューロン及びアストロサイト共培養物の、サイズによるリソソームの定量化を示す。代替として、ＡｐｏＥ３^+/+及びＡｐｏＥ４^+/+ Ｎ＝３～６／条件である。

【図5B】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図５Ｂは、各実験条件におけるニューロンのリソソームの平均サイズ、及びリソソームサイズ／細胞の分布の定量化（これらは、直径０～１０μｍ、１０～２０μｍ、２０～３０μｍ、及び３０μｍ超によって測定される）、並びに各細胞内のリソソームの数の定量化（これは、１つ～５つ、６つ～１０個、１１個～１５個、１６個～２０個、及び２０超個のリソソーム／細胞によって群化される）を示す。

【図5C】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図５Ｃは、各実験条件における６０個～９０個のニューロン（ＭＡＰ－２⁺）のサイズによるリソームの定量化（これは、面積μｍ²によって測定される）、リソソームサイズ／細胞の分布の定量化（これは、直径０～１０μｍ、１０～２０μｍ、２０～３０μｍ、及び３０μｍ超によって測定される）、及び各細胞内のリソソームの数の定量化（これは、１つ～５つ、６つ～１０個、１１個～１５個、１６個～２０個、及び２０超個のリソソーム／細胞によって群化される）を示す。ＡＮＯＶＡ検定での＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図6A】ｍｉＲ１９５が、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位ｍｉＲＮＡ候補として特定されることを示す。図６Ａは、マイクロアレイ解析における、ＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４条件培地（ＣＭ）処置ＡｐｏＥ^-/-海馬ニューロン間の３０個の差次的発現ｍｉＲＮＡのうち、１５個が、ＡｐｏＥ４条件において下方制御されることを示す。

【図6B】ｍｉＲ１９５が、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位ｍｉＲＮＡ候補として特定されることを示す。図６Ｂは、ヒト及びマウスｍｕｌｔｉＭｉＲデータベースを使用する、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡにおいて標的とされるｍｉＲ－１９５の予測スコアを示す。

【図7A】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図７Ａは、雌性対象のｍｉＲ－１９５レベルの有意な低減が、雄性対象と比較して見られ（雄性対象のｌｏｇ₂ＦＣ：０．２８４±０．１４１対雌性対象のｌｏｇ₂ＦＣ：－０．３４３±０．１２３、ｐ＝０．００８）、また、差が、雄性ＡｐｏＥ４^-/-対象対雌性ＡｐｏＥ４^+/-対象の間で認められた（雄性ＡｐｏＥ４^-/-対象のｌｏｇ₂ＦＣ：０．３４０±０．１２０対雌性ＡｐｏＥ４^+/-対象のｌｏｇ₂ＦＣ：－０．５９８±０．１７５、ｐ＝０．０２）ことを示す。

【図7B】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図７Ｂは、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルの相互上昇が、ＡｐｏＥ４^+/-対象において、ＡｐｏＥ４^-/-対象のレベルと比較して見られた（ｌｏｇ₂ＦＣ：ＡｐｏＥ４^-/- １．０７３±０．２８６対ＡｐｏＥ４^+/- ２．０９３±０．３１０、ｐ＝０．０２）ことを示す。

【図7C】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図７Ｃは、ＣＤＲ０．５～１を有するＡｐｏＥ４^-/-キャリアの脳ｍｉＲ－１９５レベルとＰＩＰ₂レベルとの間の正相関（ｒ＝０．４７２ ｐ＝０．０４８、Ｎ＝１８）を示し、ＣＤＲ０～１の対象において、ＡｐｏＥ遺伝子型にかかわらず、正相関傾向（ｒ＝０．２８３ ｐ＝０．０６）を示す。

【図7D】ヒト脳及びＣＳＦ試料内の脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図７Ｄは、ＣＤＲ０．５～１のコホートの脳ｍｉＲ１９５とＢＡＣＥ－１発現との間の負相関（ｒ＝－０．５２ ｐ＝０．００４）を示す。

【図8A】脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ヒト脳及びＣＳＦ試料内で、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図８Ａは、ＡｐｏＥ４^+/-対象（ＣＤＲ０．５～１）のヒト頭頂皮質組織内のｍｉＲ－３７４の量が、ＡｐｏＥ４^-/-対象のものよりも低かったことを示す。Ｎ＝１７～１８／群、ｌｏｇ₂ＦＣ：ＡｐｏＥ４^-/- ０．２８５±０．１０５対ＡｐｏＥ４^+/- －０．３０６±０．１７１、独立試料ｔ検定での＊＊ｐ＜０．０１。しかしながら、疾患進行に伴って、ｍｉＲ－３７４レベルの一過性上昇が、ＭＣＩ期においてあったが、有意差は、ＣＤＲ０（正常老化）のコホートとＣＤＲ１（早期ＡＤ）のコホートとの間で見られなかった（ｌｏｇ₂ＦＣ：ＣＤＲ０の対象の－１．１６０±０．８３０対ＣＤＲ０．５のＭＣＩ患者の０．２９９±０．０９８、ｐ＝０．０４）。

【図8B】脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ヒト脳及びＣＳＦ試料内で、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図８Ｂは、ＡｐｏＥ４^+/-対象において見られたより高いｍｉＲ－１５５レベル（ｌｏｇ₂ＦＣ：ＡｐｏＥ４^-/- －２．２７５±０．２８０対ＡｐｏＥ４^+/- －１．１０７±０．４５１、ｐ＝０．０３５）を示す。

【図8C】脳ｍｉＲ－１９５レベルの低減が、ヒト脳及びＣＳＦ試料内で、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連することを示す。図８Ｃは、ＣＳＦ ｍｉＲ－１９５レベルとＣＳＦカルジオリピンレベルとの間の正相関を示す（ｒ＝０．６８４、ｐ＝０．０００３、Ｎ＝２３）。

【図9A】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図９Ａは、ｍｉＲ－３７４のレベルが、１２か月齢のＡｐｏＥ４海馬脳組織内で（Ｌｏｇ２ＦＣ －０．４５５±０．０９８）、ＡｐｏＥ３マウスのもの（Ｌｏｇ２ＦＣ －０．０２６±０．０５０、ｐ＝０．０２）と比較して低減されたことを示す。ｍｉＲ－３７４レベルの名目低減は、ＡｐｏＥ－／－マウス脳内で見られたが、統計的有意性は見られなかった（Ｌｏｇ２ＦＣ －０．１９７±０．１２４、ｐ＝０．４０）。Ｎ＝８～１０／群。名目差が、ＡｐｏＥ４ ＣＭで処置されたニューロン内のｍｉＲ－３７４レベル（ｌｏｇ２ＦＣ：－０．０３７±０．２４５）において、ＡｐｏＥ３ ＣＭで処置されたもの（ｌｏｇ２ＦＣ：０．３２８±０．２５４、ｐ＝０．３３）と比較して認められたが、統計的有意性は、試料のうちの大きい変動に起因して認められなかった。Ｎ＝５／群。

【図9B】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図９Ｂは、ｍｉＲ－１９５又はｍｉＲ－３７４を過剰発現するニューロン内のｄｙｎタンパク質レベルの変化がない（ｍｉＲ－１９５過剰発現 対照の９７．７％；ｍｉＲ－３７４過剰発現 対照の１０７．２％）ことを示す。Ｎ＝４／群。ウェスタンブロット研究の代表的な例が示される。

【図9C】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図９Ｃは、ＡｐｏＥ３＋／＋又はＡｐｏＥ４＋／＋ニューロン内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルを低減したことを示す。ＡｐｏＥ４＋／＋ニューロンは、ｍｉＲ－１９５の過剰発現での、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルのより劇的な変化を、ＡｐｏＥ３＋／＋と比較して示した（ｍｉＲ－１９５を有するＡｐｏＥ３＋／＋ ｌｏｇ２ＦＣ：－１．０８４±０．０３５対ｍｉＲ－１９５を有するＡｐｏＥ４＋／＋ ｌｏｇ２ＦＣ：－７．７５１±０．０４３）。独立試料ｔ検定での＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図9D】ｍｉＲ－１９５発現が、ＡｐｏＥ４マウスの海馬脳組織及び培養一次ニューロン内で低減され、ｍｉＲ－１９５レベルを調節することが、シナプトジャニン１発現を制御することを示す。図９Ｄは、ＡｐｏＥ３＋／＋又はＡｐｏＥ４＋／＋ニューロン内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｓｙｎｊ１タンパク質レベルを低減したことを示す。同様に、ＡｐｏＥ４＋／＋ニューロンは、ｍｉＲ－１９５の過剰発現での、ｓｙｎｊ１タンパク質レベルのより劇的変化を、ＡｐｏＥ３＋／＋ニューロン内の変化と比較して示した（ｍｉＲ－１９５を有するＡｐｏＥ３＋／＋ 対照の７０．９±２１．２％対ｍｉＲ－１９５を有するＡｐｏＥ４＋／＋ 対照の４８．０±９．８４％）。独立試料ｔ検定での＊＊ｐ＝０．０１。

【図10A】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ａは、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡのレベル及びタンパク質レベルが、ｍｉＲ－１９５過剰発現を有するＡｐｏＥ４＋／＋マウス脳内で低減されることを示す。ＡｐｏＥ４＋／＋スクランブル対照対ＡｐｏＥ４＋／＋ ｍｉＲ－１９５：ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ Ｌｏｇ２ＦＣ ０．５２対－１．２９、＊＊ｐ＝０．０００５。ｓｙｎｊ１タンパク質 対照の７７．７対５６．４％、＊＊ｐ＝０．００６。ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの、より少ない程度の低減の傾向が、ｍｉＲ－１９５過剰発現を有するＡｐｏＥ３＋／＋マウス脳内で見られた。

【図10B】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ｂは、ＡｐｏＥ４＋／＋又はＡｐｏＥ３＋／＋脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、内因性マウスＡβ４０又はＡβ４２レベルの有意な変化が観察されなかったことを示す。

【図10C】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ｃは、ＡｐｏＥ４＋／＋又はＡｐｏＥ３＋／＋マウス脳内のｍｉＲ－１９５の過剰発現での、ＡｐｏＥレベルの有意な変化が存在しなかったことを示す。しかしながら、ＡｐｏＥレベルは、ｍｉＲ－１９５の過剰発現後のＡｐｏＥ３＋／＋マウス脳内で、ＡｐｏＥ４＋／＋対照又はｍｉＲ－１９５注射マウスのものと比較してはるかにより高い。ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５。

【図10D】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ｄは、ウイルス操作後のＡｐｏＥ４＋／＋及びＡｐｏＥ３＋／＋マウス脳の両方内の上昇したｍｉＲ－１９５レベルが、ｑＰＣＲによって確認されることを示す。ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図10E】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ｅは、ｍｉＲ－１９５操作を有しない又は有するＥ４ＦＡＤ及びＥ３ＦＡＤマウス脳内のｐＴａｕ、総タウ、ｓｙｎｊ１タンパク質、及びβ－アクチンのウェスタンブロット解析の代表的な例が示されることを示す。

【図10F】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４マウスモデルにおいて、認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させることを示す。図１０Ｆは、有意な変化が、ｍｉＲ－１９５操作を有しない又は有するＥ４ＦＡＤ及びＥ３ＦＡＤマウス脳内の可溶性Ａβ４０及びＡβ４２レベルにおいて見られないことを示す。しかしながら、Ｅ４ＦＡＤマウス脳は、ｍｉＲ－１９５操作にかかわらず、Ｅ３ＦＡＤマウスにおけるレベルと比較して、より高いレベルの可溶性Ａβ４０を示す。

【図11A】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ａは、対照、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５阻害剤トランスフェクション後のｉＰＳＣ由来ニューロン及びアストロサイト共培養物内のｐＴａｕ染色（ＡＴ８）の代表的な例を示す。下部パネルで示される免疫蛍光強度の定量化。ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５。

【図11B】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ｂは、スクランブル対照（ｃｔｒｌ）又はｍｉＲ－１９５トランスフェクションを有する、ＡｐｏＥ３＋／＋正常老化（ＮＡ）及びＡｐｏＥ４＋／＋ ＡＤ対象からのｉＰＳＣ由来脳細胞培養物のｐＴａｕ及びｓｙｎｊ１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す。

【図11C】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ｃは、ＡｐｏＥ３＋／＋正常老化（ＮＡ）及びＡｐｏＥ４＋／＋ ＡＤ対象からの培養ｉＰＳＣ由来アストロサイト内のｍｉＲ－１９５レベルを示す。独立試料ｔ検定での＊＊ｐ＜０．０１。

【図11D】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ｄは、ｉＰＳＣ由来ニューロン及びアストロサイト共培養物の、ニューロンマーカーＭＡＰ－２（赤色蛍光）、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ（緑色蛍光）、及びＤＡＰＩ（青色蛍光）の免疫蛍光共染色、並びにアストロサイトマーカーＧＦＡＰ（緑色蛍光）、リソソーム（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ：赤色蛍光）、及びＤＡＰＩ（青色蛍光）の免疫蛍光共染色の代表的な例を示す。各実験条件における、６０個～９０個のアストロサイト（ＧＦＡＰ＋）の、サイズによるリソソームの定量化（これは、面積μｍ²によって測定される）。ＡＮＯＶＡ検定での＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図11E】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ｅは、１アストロサイト当たりのリソソームサイズの分布の定量化（これは、直径０～１０μｍ、１０～２０μｍ、２０～３０μｍ、及び３０μｍ超によって測定される）、及び各アストロサイト内のリソソームの数の定量化（これは、１つ～５つ、６つ～１０個、１１個～１５個、１６個～２０個、及び２０個超のリソソーム／細胞によって群化される）を示す。

【図11F】ｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常をレスキューすることを示す。図１１Ｆは、ｓｙｎｊ１＋／＋＋対照、ｓｙｎｊ１＋／＋＋ｍｉＲ－１９５、ｓｙｎｊ１－／－＋対照、及びｓｙｎｊ１－／－＋ｍｉＲ－１９５の各実験条件における、７０個～１００個のニューロン（ＭＡＰ２＋）の、サイズによるリソソームの定量化（これは、面積μｍ²によって測定される）を示す。ＡＮＯＶＡ検定での＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。

【図12A】アストロサイトに由来するエクソソーム内のｍｉＲ－１９５の虚血誘導性変化を示す。図１２Ａは、ｍｉＲ－１９５レベルの低減の傾向が、ＡｐｏＥ３／３由来エクソソーム内のレベルと比較して、ＡｐｏＥ４／４由来エクソソーム内であり、虚血状態においてよりそうであったことを示す。

【図12B】アストロサイトに由来するエクソソーム内のｍｉＲ－１９５の虚血誘導性変化を示す。ＡｐｏＥ４／４アストロサイトのエクソソーム内の（図１２Ｂ）ｐＴａｕ及び（図１２Ｃ）ｓｙｎｊ１のレベルは、ＡｐｏＥ３／３由来エクソソーム内のものよりも高い傾向があり、虚血状態においてよりそうであった。Ｎ＝３。

【図12C】アストロサイトに由来するエクソソーム内のｍｉＲ－１９５の虚血誘導性変化を示す。ＡｐｏＥ４／４アストロサイトのエクソソーム内の（図１２Ｂ）ｐＴａｕ及び（図１２Ｃ）ｓｙｎｊ１のレベルは、ＡｐｏＥ３／３由来エクソソーム内のものよりも高い傾向があり、虚血状態においてよりそうであった。Ｎ＝３。

【図13A】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現を示す。図１３Ａは、ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害することを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｎ＝８。

【図13B】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現を示す。図１３Ｂは、ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ＬＰＳ誘導性ＩＬ－６及びＴＮＦα放出を減衰させることを示す。＊ｐ＜０．０５。Ｎ＝４。

【図13C】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現を示す。図１３Ｃは、ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、抗炎症応答を、増加したｉｌ１０ａ遺伝子発現で増強することを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝８。

【図13D】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現を示す。図１３Ｄは、エクソソームｍｉＲ－１９５レベルを示す。

【図13E】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現を示す。図１３Ｅは、様々なエクソソームの存在下でのＬＰＳ処置ＢＶ２細胞内のＩＬ－６及びＴＮＦαレベルを示す。＊ｐ＜０．０５。Ｎ＝４。

【図14A】エクソソームｍｉＲ－１９５は、ミクログリア及びニューロン内の虚血誘導性変化をレスキューすることができることを示す。図１４Ａは、ＩＬ－６のレベルが、ＡｐｏＥ４／４由来エクソソームに曝露された虚血性ＡｐｏＥ４／４／ミクログリア内でより高かったが、ＡｐｏＥ４／４過剰発現ｍｉＲ－１９５アストロサイト由来エクソソームに曝露されたときに有意に低減されたことを示す。

【図14B】エクソソームｍｉＲ－１９５は、ミクログリア及びニューロン内の虚血誘導性変化をレスキューすることができることを示す。図１４Ｂは、虚血性ＡｐｏＥ４／４ニューロン内のｐＴａｕのレベルが、ｍｉＲ－１９５過剰発現アストロサイトに由来するエクソソームの存在下で有意に低減されたことを示す。Ｎ＝４～５。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。

【図15A】Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化を示す。図１５Ａは、クラスター遺伝子マーカー発現に基づくクラスター割り当てによって着色された、対照及びｍｉＲ－１９５（処置）を有するＥＦＡＤから選別された脳細胞のｔＳＮＥ（ｔ分布型確率的近傍埋め込み）プロット（１条件当たりＮ＝４つのプールマウス）を示す。クラスター０は、ミクログリアエンリッチクラスターである。

【図15B】Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化を示す。図１５Ｂは、遺伝子セット重複のフィッシャー正確検定による、クラスター特異的ＤＥＧでエンリッチされた最上位ＧＯ経路を示す。

【図15C】Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化を示す。図１５Ｃは、ミクログリアクラスター（Ｃ０）のサブクラスタリングが、３つの主要なサブセットを特定したことを示す。

【図15D】Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化を示す。図１５Ｄは、ＧＯ経路エンリッチメント解析が、各ミクログリアサブクラスター内の異なる遺伝子シグネチャーを示唆することを示す。

【図15E】Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化を示す。図１５Ｅは、サブクラスターＤＥＧでエンリッチされた最上位ＧＯ経路の研究が、ｍｉＲ－１９５過剰発現が、Ｍｉｃ．Ｃ０及びＭｉｃ．Ｃ２サブクラスター内の自然免疫系及びエフェクター応答、並びにＭｉｃ．Ｃ１サブクラスター内の翻訳及びリボソーム活性を下方制御し、３つのサブクラスター内の酸化的リン酸化及びＡＴＰ代謝プロセスに関与する遺伝子を上方制御することを示唆することを示す。

【図16A】低減されたｍｉＲ－１９５発現及び増加したｓｙｎｊ１発現を有するＡＰＯＥ４⁺ミクログリアが、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大で出現し、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大が、ｓｙｎｊ１ハプロ不全によってレスキューされ得ることを示す。図１６Ａは、ＡＰＯＥ４^+/+ミクログリア対ＡＰＯＥ３^+/+ミクログリア内のｍｉＲ－１９５レベルを示し、結果は、ｌｏｇ₂ＦＣとして提示され、＊＊＊ｐ＝０．０００５、Ｎ＝３である。

【図16B】低減されたｍｉＲ－１９５発現及び増加したｓｙｎｊ１発現を有するＡＰＯＥ４⁺ミクログリアが、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大で出現し、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大が、ｓｙｎｊ１ハプロ不全によってレスキューされ得ることを示す。図１６Ｂは、ＡＰＯＥ４^+/+ ｓｙｎｊ１^+/+及びｓｙｎｊ１^+/-ミクログリア対ＡＰＯＥ３^+/+ ｓｙｎｊ１^+/+及びｓｙｎｊ１^+/-ミクログリア内のｓｙｎｊ１タンパク質発現を示し、結果は、１００％をＡＰＯＥ３^+/+ ｓｙｎｊ１^+/+細胞内のｓｙｎｊ１レベルとして、対照の％として提示される。＊ｐ＜０．０５。Ｎ＝３。

【図16C】低減されたｍｉＲ－１９５発現及び増加したｓｙｎｊ１発現を有するＡＰＯＥ４⁺ミクログリアが、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大で出現し、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大が、ｓｙｎｊ１ハプロ不全によってレスキューされ得ることを示す。図１６Ｃは、ＡＰＯＥ４^+/+（円形及び四角形曲線）ｓｙｎｊ１^+/+（実線曲線）及びｓｙｎｊ１^+/-（破線曲線）ミクログリア対ＡＰＯＥ３^+/+（三角形曲線）ｓｙｎｊ１^+/+（実線曲線）及びｓｙｎｊ１^+/-（破線曲線）ミクログリア内のミエリン取り込みアッセイを示す。Ｘ軸は、（時間での）インキュベーション時間を表し、Ｙ軸は、蛍光シグナルの量（細胞内に取り込まれるミエリン）を表す。ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリア内のミエリン取り込みの機能障害は、ｓｙｎｊ１ハプロ不全（ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/-）によってレスキューされる。ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/+シグナルは、他の群よりも統計的に低いことに留意されたい（＊ｐ＜０．０５）。データは、３つ以上の独立した実験の代表的なデータである。

【図17A】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｎ＝８であり（図１７Ａ）；ＬＰＳ誘導性ＩＬ－６及びＴＮＦα放出を減衰させ、＊ｐ＜０．０５．Ｎ＝４であり（図１７Ｂ）；抗炎症応答を、増加したｉｌ１０ａ遺伝子発現で増強し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝８である（図１７Ｃ）ことを示す。

【図17B】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｎ＝８であり（図１７Ａ）；ＬＰＳ誘導性ＩＬ－６及びＴＮＦα放出を減衰させ、＊ｐ＜０．０５．Ｎ＝４であり（図１７Ｂ）；抗炎症応答を、増加したｉｌ１０ａ遺伝子発現で増強し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝８である（図１７Ｃ）ことを示す。

【図17C】ミクログリア内のｍｉＲ－１９５の過剰発現が、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｎ＝８であり（図１７Ａ）；ＬＰＳ誘導性ＩＬ－６及びＴＮＦα放出を減衰させ、＊ｐ＜０．０５．Ｎ＝４であり（図１７Ｂ）；抗炎症応答を、増加したｉｌ１０ａ遺伝子発現で増強し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｎ＝８である（図１７Ｃ）ことを示す。

【図18A】ミクログリア内へのエクソソームｍｉＲ－１９５取り込みが、炎症応答を調節することを示す。図１８Ａは、エクソソームｍｉＲ－１９５が、Ｅ４アストロサイト内のｍｉＲ－１９５の過剰発現で増加することを示す。

【図18B】ミクログリア内へのエクソソームｍｉＲ－１９５取り込みが、炎症応答を調節することを示す。図１８Ｂは、エクソソームを有するＬＰＳ処置ミクログリア内のＩＬ－６及びＴＮＦαレベル（ｍｉＲ－１９５過剰発現を有しない又は有する培養ＡＰＯＥ３／３又は４／４アストロサイトからのＡＤＥ）を示す。＊ｐ＜０．０５。Ｎ＝４。

【図19A】脳及び血清エクソソームｍｉＲ－１９５レベルの評価の結果を示す。図１９Ａは、９～１０か月齢のＡｐｏＥ３ ｓｙｎｊ１^+/+及びｓｙｎｊ１^+/-マウス並びにＡｐｏＥ４ ｓｙｎｊ１^+/+及びｓｙｎｊ１^+/-マウスの脳及び血清エクソソーム内のｍｉＲ－１９５のレベルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｎ＝３。

【図19B】脳及び血清エクソソームｍｉＲ－１９５レベルの評価の結果を示す。図１９Ｂは、血清エクソソームｍｉＲ－１９５のレベルが、Ｃｐｄ＃６又はＣｐｄ＃９処置５ｘＦＡＤマウスにおいて、ビヒクル対照と比較して有意に上昇したことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ＝６～８／群。

【図19C】脳及び血清エクソソームｍｉＲ－１９５レベルの評価の結果を示す。図１９Ｃは、薬物処置コホートにおいて、血清エクソソームｍｉＲ－１９５レベルが、脳エクソソームｍｉＲ－１９５と正相関し、ＮＯＲ選好指標（０～１）及びＹ迷路ＳＡＰスコア（０～１）によって測定された場合、認知パフォーマンスと正相関し、脳不溶性ｐＴａｕ及びｓｙｎｊ１タンパク質レベルと逆相関することを示す。＊ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本開示は、本明細書に含まれる、以下の本発明の詳細な説明、図、及び実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。

【0027】

本発明の組成物及び方法を開示し、説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬（当然、変化し得るため）に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定することが意図されないことも理解されるべきである。本明細書に記載される方法及び材料と類似の又は均等ないずれかの方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得るが、例示的な方法及び材料が、ここで記載される。

【0028】

更に、特に明記されない限り、本明細書に示される任意の方法が、そのステップが特定の順序で実施されることを要求するものとして解釈されることは決して意図されないことが理解されるべきである。したがって、方法の請求項が、そのステップが従う順序を実際に列挙していないか、又は特許請求の範囲若しくは説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであると具体的に記述されない場合、いかなる点においても、順序が推論されることは決して意図されない。これは、ステップ又は操作フローの配置、文法的な構成若しくは句読点に由来する明白な意味、及び明細書に記載される態様の数若しくはタイプに関する論理事項を含む、解釈のための任意の可能な非明示的根拠について保持される。

【0029】

本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような公開に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、本明細書で提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認することができる。

【0030】

本明細書に述べられる全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたときと同じ程度に、本明細書において参照により組み込まれる。

【0031】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に指定しない限り、複数の言及を含む。

【0032】

本明細書で使用される「又は」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

【0033】

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの単語の変形は、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味し、例えば、他の添加剤、構成要素、整数、又はステップを除外することは意図されていない。特に、１つ以上のステップ又は動作を含むと記載される方法において、各ステップが（このステップが、「からなる」などの限定用語を含まない限り）列挙されるものを含むことが具体的に企図され、これは、各ステップが、例えば、このステップにおいて列挙されない他の添加剤、構成要素、整数、又はステップを除外することは意図されていないことを意味する。

【0034】

本明細書では、範囲は、「約」又は「およそ」ある特定の値から、及び／又は「約」又は「およそ」別の特定の値までのように表現され得る。そのような範囲が表されるときに、更なる態様は、１つの特定の値から、かつ／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」又は「およそ」の使用により近似値として表される場合、特定の値が更なる態様を形成することを理解されたい。更に、範囲の各終点は、他の終点と関連して、及び他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解されたい。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４もまた開示される。

【0035】

本明細書で使用される場合、「任意選択的な」又は「任意選択的に」という用語は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよく、又は生じなくてもよいことを意味し、この説明には、当該事象又は状況が生じる場合、及び生じない場合が含まれることを意味する。

【0036】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、開示される方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、又は両生類であることができる。「対象」という用語はまた、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）を含む。いくつか態様では、対象は、哺乳動物である。別の態様では、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。したがって、成人、子供、青年期及び新生児の対象、並びに雌雄を問わない胎児が包含されることが意図される。

【0037】

「対象」又は「それを必要としている対象」又は「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、治療される基礎疾患又は障害と診断されている患者を指す。対象は、現在、疾患若しくは障害に関連する症状を経験していてもよく、又は過去に症状を経験していてもよい。加えて、「それを必要としている対象」は、特定の疾患を発症するリスクがある患者であってもよく、又は疾患の生理学的系のうちの１つ以上を報告するが、この疾患の診断がなされていなくてもよい患者にであってもよい。非限定的な例として、本出願の目的で、「それを必要としている対象」は、現在の総体症状にかかわらず、現在、認知機能障害と診断されている患者、又は過去に、認知機能障害と診断された患者を含み得る。「それを必要としている対象」はまた、認知欠損を示しているが、特定の疾患又は障害と診断されていない患者を含むことができる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患又は障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。開示される方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与ステップより前に、認知機能障害のための治療の必要があると診断されている。

【0039】

本明細書で使用される場合、「治療すること」又は「治療」という用語は、特定の疾患、障害、及び／若しくは状態、又は他の望ましくない症状を、部分的又は完全に、緩和する、寛解させる、軽減する、その発病を遅延させる、その進行を阻害若しくは遅くする、その重症度を低減する、かつ／又はその１つ以上の症状若しくは特徴の発生率を低減する、あるいはそうでなければ、その進行を防止する、妨げる、遅らせる、又は逆転させることを指す。治療は、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病的状態を発症するリスクを減少させる目的のために、疾患、障害、及び／若しくは状態の徴候を示さない対象、及び／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の初期徴候のみを示す対象に投与され得る。例えば、疾患、障害、及び／又は状態は、認知機能障害であることができる。

【0040】

本発明の剤形に言及して、「投与する」、「投与すること」、又は「投与」という用語は、剤形を、治療を必要としている対象の系内に導入する行為を指す。本発明の剤形が、１つ以上の他の活性剤と（それらのそれぞれの剤形で）組み合わせて与えられるときに、「投与」及びその変形はそれぞれ、剤形及び他の活性剤の同時かつ／又は順次の導入を含むと理解される。記載される剤形のうちのいずれかの投与は、並行投与、同時投与、又は順次投与を含む。いくつかの状況では、療法は、ほぼ同時に、例えば、互いに約数秒～数時間以内に施される。

【0041】

本明細書に記載される化合物の「治療有効」量は、典型的には、所望の効果を達成するのに十分な量であり、疾患状態の性質及び重症度、並びに化合物の効能に従って変動し得る。活動性疾患の治療のための濃度とは異なる濃度が、予防のために使用され得ることを理解されよう。治療利益は、改善が患者において観察されるが、患者が依然として基礎障害に罹患し得るような、基礎障害に関連する生理学的症状のうちの１つ以上の寛解で達成される。治療有効量は、状態若しくは疾患の症状の完全な解消、状態若しくは疾患の症状の重症度の低減、又は状態若しくは疾患の症状の進行の遅延をもたらす、対象に投与される組成物の量であってもよい。本明細書に記載の方法はまた、投薬を最適化するためのモニタリングステップを含み得る。本明細書に記載される組成物は、状態若しくは疾患（例えば、認知機能障害）の防止的治療として、又はその進行を遅延させる若しくは遅くするために投与され得る。

【0042】

本明細書で使用される場合、「疾患」又は「障害」又は「状態」という用語は、互換的に使用され、体の状態又は臓器のうちのいくつかの状態におけるいずれかの変更であって、機能のパフォーマンスを阻止若しくは妨害し、かつ／又は不快感、機能不全、窮迫、若しくは更には死などの症状を、罹患した人若しくは人と接触するものに引き起こす、変更を指す。疾患又は障害又は状態はまた、ジステンパー、病的な状態、病気、病弊、障害、病、疾病、愁訴、罹患に関し得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、「正常」という用語は、認知機能障害を有しない個体、試料、又は対象を指す。

【0044】

「ベクター」又は「構築物」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞内に輸送することが可能な核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に好適な形態の（例えば、転写調節エレメントに連結されている）遺伝子構築物を含有するいずれかのベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はファージ染色体）を含む。「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの一般的に使用される形態であるため、互換的に使用される。また、本発明は、均等な機能を果たす他のベクターを含むことが意図されている。

【0045】

「発現ベクター」という用語は、ベクターが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能であるベクターを本明細書で指す。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態にある。組換え発現ベクターは、宿主細胞内の酸の発現に好適な形態の、本明細書に開示される核酸を含むことができる。換言すれば、組換え発現ベクターは、１つ以上の制御エレメント又はプロモーターを含むことができ、これは、発現される核酸配列に動作可能に連結されている発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。

【0046】

本明細書で使用される場合、「相乗的組成物」という用語は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５の断片、ｍｉＲ－１９５のバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ又はその断片若しくはバリアント、及び追加の治療剤の組み合わせの適用を指す。相乗的に有効な量とは、各構成要素の量であって、組み合わせて、例えば、シナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性若しくは発現の低減若しくは阻害、Ａβクリアランスの増加、タウ過剰リン酸化の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）誘導性上昇の低減、アミロイドプラーク負荷の低減、タウ過剰リン酸化の低減、又はアルツハイマー病関連リソソーム異常のレスキューにおいて有効であり、いずれかの構成要素単独よりも大きい応答をもたらす、量を指す。

【0047】

本明細書で使用される「調節する」、「調節すること」、及び「調節」は、活性又は機能又は数の変化を意味する。変化は、活性、機能、又は数の増加又は減少、増強、又は阻害であってもよい。

【0048】

「変更する」又は「調節する」という用語は、本明細書で互換的に使用され得、例えば、細胞内のヌクレオチド配列の発現を指し、本明細書に記載される方法を適用した後の、細胞内のヌクレオチド配列の発現のレベルが、方法を適用する前の、細胞内のその発現と異なることを意味する。

【0049】

「促進する」、「促進」、及び「促進すること」とは、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータの増加を指す。これは、活性、応答、状態、又は疾患の開始を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患の１０％増加を含み得る。したがって、いくつかの態様では、増加又は促進は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％以上、又はそれらの間のいずれかの量の促進であることができる。いくつかの態様では、増加又は促進は、天然又は対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００％である。いくつかの態様では、増加又は促進は、天然又は対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００％以上、例えば、２００、３００、５００、又は１０００％以上である。いくつかの態様では、増加又は促進は、天然又は対照レベルと比較して、１００パーセント超、例えば、天然又は対照レベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％以上であることができる。本明細書で使用される場合、促進することとはまた、亢進することを意味することができる。

【0050】

本明細書で使用される場合、「阻害する」又は「阻害すること」又は「低減すること」という用語は、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータの低減又は減少を指す。これは、活性、応答、状態、又は疾患の開始を含みことができるが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患の１０％減少を含み得る。したがって、いくつかの態様では、減少又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％以上、又はそれらの間のいずれかの量の促進であることができる。いくつかの態様では、減少又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００％である。いくつかの態様では、減少又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、０～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００％以上、例えば、２００、３００、５００、又は１０００％以上である。いくつかの態様では、減少又は低減は、天然又は対照レベルと比較して、１００パーセント超、例えば、天然又は対照レベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％以上であることができる。

【0051】

ハイフン及び数字が後に続く「ｍｉｒ」という接頭辞は、しばしば、マイクロＲＮＡを指すために使用される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを成熟形態から大文字によって区別することが一般的であり、このため、「ｍｉｒ－」という略語は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに対応し、「ｍｉＲ－」という略語は、成熟マイクロＲＮＡが言及されることを示す。種に言及する略語は、しばしば、前に使用され、したがって、例えば、「ｈｓａ」とは、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのヒトマイクロＲＮＡを指す。

【0052】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」という用語は、開示される抗体、バリアント、又は断片のうちのいずれか内にあり得る２０個の自然発生アミノ酸又はいずれかの非自然類似体のうちの１つを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」とは、自然発生アミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、及びノルロイシンは、本発明の目的で、アミノ酸と考えられる。「アミノ酸」はまた、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのアミノ酸残基を含む。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）構成のいずれかであり得る。いくつかの態様では、アミノ酸は、Ｄ又はＬ構成である。非自然発生側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボ分解を防止する又は遅らせるために使用され得る。

【0053】

「断片」という用語は、参照ペプチドと実質的に同一であり、参照ペプチドの生物学的活性を保持するペプチドの一部分（例えば、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個などのアミノ酸）を指すことができる。いくつかの態様では、断片又は部分は、本明細書に記載される参照ペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を保持する。更に、参照ペプチドの断片は、参照ポリペプチドの連続又は隣接部分であることができる（例えば、１０アミノ酸長であるペプチドの断片は、このペプチド内のいずれかの２～９個の隣接残基であることができる）。

【0054】

「バリアント」とは、１つ以上のＮ及び／又はＣ末端アミノ酸残基の単純な欠失以外の、参照配列とのある様式での差を意味することができる。バリアントが、アミノ酸残基の置換を含む場合、置換は、保存的又は非保存的と考えられ得る。保存的置換は、以下の群、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓ；Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌ；Ｇｌｕ及びＡｓｐ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ；並びにＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、及びＨｉｓ内のものである。バリアントは、少なくとも１つの置換及び／又は少なくとも１つの付加を含むことができ、また、少なくとも１つの欠失があり得る。バリアントはまた、１つ以上の非自然発生残基を含むことができる。例えば、バリアントは、セレノシステイン（例えば、セレノ－Ｌ－システイン）を、システインの位置を含むいずれかの位置において含み得る。多くの他の「非自然」アミノ酸置換基が、当該技術分野で既知であり、市販の供給源から入手可能である。非自然発生アミノ酸の例としては、Ｄ－アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸残基、ペグ化アミノ酸、及び式ＮＨ₂（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨのオメガアミノ酸であって、式中、ｎが、２つ～６つの中性非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、及びノルロイシンである、オメガアミノ酸が挙げられる。フェニルグリシンは、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅに対して置換し得、シトルリン及びメチオニンスルホキシドは、中性非極性であり、システイン酸は、酸性であり、オルニチンは、塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換され得、プロリンの特性を付与する立体構造を保持し得る。

【0055】

上記の開示は、理解の明快の目的で、例示及び例によって若干詳細に説明されているが、ある変化及び修正が、添付の特許請求の範囲内で実施されてもよい。

【0056】

本明細書に記載される化合物は、（「神経変性障害」又は「神経変性疾患」とも本明細書で称される）認知機能障害、例えば、アルツハイマー病、他の認知症（例えば、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体型認知症（ＬＤＢ）、又は混合性認知症）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、虚血性状態（例えば、血管性認知症、脳血管疾患、及び他の虚血性プロセス）、及びダウン症候群において見出されるものを治療するために使用され得る。本明細書に記載される化合物は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療するために使用され得る。ＴＢＩと、アルツハイマー病（ＡＤ）と認知症との間の関係がある。ＴＢＩを患う人々は、遅発性神経変性及びＡＤを発症する可能性が２～４倍より多くある。

【0057】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、β－アミロイドペプチド（Ａβ）と、過剰リン酸化タウからなる神経原線維濃縮体と、を含有する老人斑によって、神経病理学的に特徴付けられる。Ａβの過剰産生又はＡβのクリアランスの機能障害のいずれかが、Ａβ蓄積を導き得る。最近の証拠は、（ＡＤ症例の９０％を占める）遅発性ＡＤ症例が、Ａβクリアランスの全体的な機能障害と相関することを示唆している。更に、いくつかの研究は、エンドソーム／リソソームネットワークの病理学的変化を報告しており、この病理学的変化は、アルツハイマー病が進行するにつれて、ニューロン内で発症し、エンドサイトーシスの調節不全及びリソソームクリアランス機構の進行性不全を含む。また、リソソームタンパク質クリアランス不全と神経変性の機構との間の密接な関係が、十分に記述されている。

【0058】

エンドソーム異常は、最も早期のＡＤ病的状態のうちの１つと考えられ、ｓｙｎｊ１の増加した機能は、早期エンドソームの拡大に関連する。シナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）は、脳及びシナプス内の主要なホスホイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ₂）分解酵素である。最も重要には、ｓｙｎｊ１の下方制御が、Ａβ取り込み及びリソソーム輸送を増加させ、それによって、Ａβクリアランスを刺激することが見出されている。更に、ｓｙｎｊ１の低減は、ＡＤトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイド誘導性神経病理学的変化及び行動欠損を減衰させる。

【0059】

Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、６５歳以上の人々の１５～２０％がＭＣＩに罹患すると推定する。ＭＣＩを導くリスク因子は、認知症及びアルツハイマー病（ＡＤ）についてのものと類似であると考えられ、これらは、高齢、心血管疾患（又はそれを導くリスク因子）、及び／又は認知症若しくはＡＤの家族歴を含む。加えて、ＭＣＩを有する個体は、ＭＣＩに罹患していない個体よりも、ＡＤ又は認知症を発症するリスクが増加する。ＡｐｏＥ４遺伝子のキャリアである人々はまた、ＭＣＩ及び／又はＡＤを発症するリスクがより高いと考えられる。本発明の化合物は、ＡｐｏＥ４遺伝子を保有する患者、ＭＣＩを有する患者、及び／又は前臨床又は活動性ＡＤを有する患者を治療するために使用され得る。

【0060】

ダウン症候群（ＤＳ）は、米国において、約７００人の出生毎に１回発生し、染色体２１の少なくとも一部分の余分なコピーによって引き起こされる。シナプトジャニン１は、おそらく、その遺伝子であるＳＹＮＪ１がヒト染色体２１上に位置すると考えられるため、ダウン症候群に関与すると示されている。ＤＳに罹患した個体は、一般的に、アルツハイマー病を発症する。

【0061】

また、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が、本明細書に開示される化合物のうちのいずれかによって治療され得る。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌによれば、ＴＢＩを患う者は、米国救急室において２５０万回、２０１０年に見られた。ヒトＴＢＩ症例の神経病理学的研究は、神経変性プロセスに関連する神経原線維濃縮体及びアミロイドプラークの発症を記載している。

【0062】

いずれの１つの理論にも束縛されないが、データは、ＡｐｏＥタンパク質が、爆風ＴＢＩに応答した脳リン脂質ホメオスタシスの変化を制御すること、及びＡｐｏＥ４アイソフォームが、このプロセスにおいて機能不全であることを示唆している。ｓｙｎｊ１の下方制御は、爆風誘導性リン脂質調節不全をレスキューし、ＡｐｏＥ４キャリアのタウ過剰リン酸化の発症を防止することが示されている。

【0063】

組成物
認知機能障害の治療のための組成物が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、標的遺伝子は、シナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）遺伝子であることができる。いくつかの態様では、試料は、増加したレベルのシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）を発現することができる。いくつかの態様では、試料は、減少したレベルのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを発現することができる。いくつかの態様では、試料は、減少したレベルのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントを発現することができる。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５と、表１及び２に開示される化合物のうちのいずれかと、を含むことができる。いくつかの態様では、組成物は、相乗的組成物であることができる。

【0064】

いくつかの態様では、認知機能障害は、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、虚血性状態（例えば、血管性認知症、脳血管疾患、及び他の虚血性プロセス）、混合性認知症、又はダウン症候群であることができる。いくつかの態様では、認知機能障害は、外傷性脳損傷に関連し得る。

【0065】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、通常、約２０個～２５個のヌクレオチドのモノカテナリーＲＮＡ分子であって、特定の遺伝子の発現を、ｍｉＲＮＡの転写後サイレンシングによって制御する能力を有し、ｍｉＲＮＡが、相補的である領域内のメッセンジャーＲＮＡに連結する結果として、対合が、メッセンジャーＲＮＡの分解を導く、モノカテナリーＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡは、ゲノム内でコードされ、既知のように、最初は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして形成され、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ビカテナリーＲＮＡの長い分子であり、ビカテナリーＲＮＡは、ヘアピンを分子の内部領域間の相補性によって形成する能力を有する。いわゆる前駆体マイクロＲＮＡであるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡがドローシャ酵素によって処理されたときに形成され、ドローシャ酵素は、ヘアピンの塩基、すなわち、不対末端を切断又は排除する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、細胞質において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ダイサー酵素によって断片化され、ダイサー酵素は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを２０個～２５個のヌクレオチドの最終長に切断し、その後、得られた二本鎖が分離され、２つのモノカテナリーＲＮＡをもたらし、それらのうちの１つは、成熟マイクロＲＮＡであり、成熟マイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体内に組み込まれたそのサイレンシング作用を実行する。

【0066】

ｍｉＲ－１９５は、ストレス誘導性であるｍｉＲ－１５／１０７ファミリーメンバーのうちの１つである。ｍｉＲ－１５／１０７群のメンバーは、類似の配列ＡＧＣＡＧＣを、ＡＧＣｘ２ ｍｉＲＮＡと称される成熟ｍｉＲＮＡの５’末端近くに有する。ヒトｍｉＲ－１９５遺伝子は、イントロン７に起源をもち、イントロン７は、未知の機能タンパク質をコードするｍＲＮＡ遺伝子ＡＫ０９８５０６の染色体１７ｐ１３．１上かつ逆鎖上に位置する。ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）を使用して判定された、ｍｉＲ－１９５の予測ステムループ構造は、ｍｉＲ－１９５の予測ステムループ構造の配列及び構造について、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１８；１１：７１０９－７１２３に示されている。（「ステムループ」とも称される）ｍｉＲ－１９５配列は、ＡＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＣＵＣＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＡＧＵＣＵＧＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＵＧＧＵＧ（配列番号４）である。ｍｉＲ－１９５ヘアピンは、「ガイド鎖」ｍｉＲ－１９５－５ｐ（これは、配列ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣ；配列番号１を有する）、及び姉妹「パッセンジャー」鎖ｍｉＲ－１９５－３ｐ（これは、配列ＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣ；配列番号２を有する）を生じさせる。

【0067】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５であることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ヌクレオチド配列ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣ（配列番号１）を含むことができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－３ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、ヌクレオチド配列ＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣ（配列番号２）を含むことができる。

【0068】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ヌクレオチド配列ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣ（配列番号１）からなることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、ヌクレオチド配列ＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣ（配列番号２）からなることができる。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５に由来する配列からなることができる。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５に由来する配列からなることができ、ｍｉＲ－１９５に由来する配列は、ｍｉＲ－１９５と比較して、増加した安定性を有する。

【0069】

ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐの断片が、本明細書に開示される。本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、全長ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ（配列番号１）、又はｍｉＲ－１９５－３ｐ（配列番号２）の一部分を指す。断片のサイズは、変動し得、機能断片を含まなければならず、すなわち、断片は、本明細書に記載されるように、ｓｙｎｊ１の活性若しくは発現を調節することができなければならず、又はかつｓｙｎｊ１発現細胞に対する治療有用性を有しなければならない。典型的には、断片は、少なくともシード領域配列ＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号３）を含むことができる。いくつかの態様では、断片は、少なくともシード領域配列ＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号３）を含むことができる。

【0070】

また、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐのバリアントが、本明細書に開示される。（ｍｉＲ－１９５バリアントとも本明細書で称される）ｍｉＲ－１９５のバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐのバリアント、及びｍｉＲ－１９５－３ｐのバリアントは、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの配列とそれぞれ実質的に類似であるヌクレオチド配列、及びそれらに由来する前駆体又は配列を含むことができる。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントは、機能断片を含まなければならず、すなわち、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントは、本明細書に記載されるように、ｓｙｎｊ１の活性若しくは発現を調節することができなければならず、又はかつｓｙｎｊ１発現細胞に対する治療有用性を有しなければならない。典型的には、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントは、ｍｉＲ－１９５の少なくともシード領域配列ＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号３）を含むことができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントは、少なくともシード領域配列ＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号３）を含むことができる。

【0071】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントは、ｍｉＲ－１９５シード領域配列を含む、ｍｉＲ－１９５配列若しくはその断片、ｍｉＲ－１９５－５ｐ配列若しくはその断片、又はｍｉＲ－１９５－３ｐ配列若しくはその断片と実質的に類似であるヌクレオチド配列を含む。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、及びｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントはまた、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡの配列と実質的に類似であるヌクレオチド配列を含むことができる。「バリアント」とは、Ｎ及び／又はＣ末端ヌクレオチドの単純な欠失以外の、参照配列とのある様式での差を意味することができる。加えて又は代替として、バリアントは、少なくとも１つの置換及び／又は少なくとも１つの付加を含むことができ、また、少なくとも１つの欠失があり得る。いくつかの態様では、投与されるバリアントｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１９５－５ｐ（配列番号１）、ｍｉＲ－１９５－３ｐ（配列番号２）、又はｍｉＲ－１９５（配列番号４）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す配列を含むことができる。いくつかの態様では、投与されるｍｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４）と少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を含むことができる。いくつかの態様では、投与されるｍｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４）と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を示す配列を含むことができる。代替として又は加えて、バリアントは、修飾を含むことができ、例えば、非自然残基を、ｍｉＲ－１９５配列、ｍｉＲ－１９５－５ｐ配列、又はｍｉＲ－１９５－３ｐ配列に対して１つ以上の位置において含むことができる。いくつかの態様では、バリアントは、ｍｉＲＮＡの最後のヌクレオチドが変化する配列であることができる。いくつかの態様では、バリアントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの置換を、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの５’末端において含む配列であることができる。いくつかの態様では、ヌクレオチド置換は、参照配列に対するヌクレオチド置換であって、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらのバリアントの安定性を増加させる、ヌクレオチド置換を含むことができる。いくつかの態様では、ヌクレオチド置換は、ナノ粒子を形成するためのポリマー又はコポリマーへのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらのバリアントのコンジュゲーションを可能にするものであることができる。ヌクレオチド置換は、１つ又は２つの塩基の置換であることができる。いくつかの態様では、ヌクレオチド置換は、３つの塩基の置換であることができる。欠失及び挿入は、１つ～約３つの塩基を含むことができる。

【0072】

置換、欠失、挿入、又はそれらのいずれかの組み合わせは、最終の誘導体又はバリアントに到達するために使用され得る。概して、これらの変化は、分子の変更を最小化するために、いくつかのヌクレオチド上で行われる。しかしながら、より大きい変化が、ある状況において許容され得る。

【0073】

概して、個々のバリアント配列間のヌクレオチド同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であることができる。したがって、「バリアント配列」は、本発明の親又は参照配列と、指定される同一性を有するものであることができ、生物学的機能を共有し、生物学的機能の共有は、親配列の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含むが、これらに限定されない。例えば、「バリアント配列」は、本発明の親又は参照配列と比較して、１つ、２つ、３つ、又は４つのヌクレオチド塩基変化を含有する配列であって、親配列の生物学的機能、特異性、及び／又は活性を共有又は改善する、配列であることができる。いくつかの態様では、親又は参照配列は、１９５であることができる。

【0074】

いくつかの態様では、本明細書に開示される配列のうちのいずれかは、親又は参照配列と比較して、単一ヌクレオチド変化を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される配列のうちのいずれかは、親又は参照配列と比較して、少なくとも２つのヌクレオチド変化を含むことができる。個々のバリアント配列間のヌクレオチド同一性は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であることができる。したがって、「バリアント配列」は、本発明の親配列と、指定される同一性を有するものであることができ、生物学的機能を共有し、生物学的機能の共有は、親配列の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含むが、これらに限定されない。バリアント配列はまた、親配列の特異性及び／又は活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を共有することができる。

【0075】

いくつかの態様では、本明細書に記載されるｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５のアミノ酸配列は、本明細書に開示されるｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５配列のうちのいずれかとある程度の同一性又は相同性を有するペプチド配列を含むことができる。同一性の程度は、変動し得、当業者に既知の方法によって判定され得る。「相同性」及び「同一性」という用語はそれぞれ、２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。相同性及び同一性はそれぞれ、各配列内の位置を比較することよって判定され得、各配列内の位置は、比較の目的で、アライメントされ得る。比較される配列内の位置が、同じアミノ酸残基によって占有されているときに、ポリペプチドは、この位置において同一であると称され得、均等な部位が、同じアミノ酸（例えば、同一のアミノ酸）又は類似のアミノ酸（例えば、立体及び／又は電子的性質において類似のアミノ酸）によって占有されているときに、分子は、この位置において相同であると称され得る。配列間の相同性又は同一性の百分率は、配列によって共有される一致する又は相同な位置の数の関数である。本明細書に記載されるデコイペプチド又はポリペプチドは、配列番号１、２、又は４のうちの１つ以上であるデコイペプチド又はポリペプチドと少なくとも又は約２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性又は相同性を有することができる。

【0076】

また、表１及び表２に記載の化合物が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物は、表１又は表２に開示される化合物のうちの１つ以上を更に含むことができる。表１及び２の化合物は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて有用であることができる。

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて有用な追加の化合物は、表２に開示される。

【0079】

【表3】

【0080】

【表4】

【0081】

【表5】

【0082】

方法
認知機能障害を有する対象を診断する方法が、本明細書に開示される。また、認知機能障害を有する対象を診断及び治療する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを測定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントの発現レベルを測定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルが、参照試料のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルよりも低い場合、対象が当該認知機能障害を有すると判定することを含むことができ、対応する参照値は、健常対象のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルの平均値である。いくつかの態様では、方法は、対象を当該認知機能障害のために治療することを含むことができる。いくつかの態様では、対象を当該認知機能障害のために治療するステップは、対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む治療有効量の組成物を投与することを含む。いくつかの態様では、対象を当該認知機能障害のために治療するステップは、対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐと配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含むことができる。

【0083】

対象が認知機能障害を有するかを判定する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、対象からの試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを、参照試料からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントの発現レベルを検出することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、対象からの試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントの発現レベルを、参照試料からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントの発現レベルと比較することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、対象の試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルが、参照試料からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルと同じである若しくはそれよりも高いときに、対象が認知機能障害を有しないと判定すること、又は対象の試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルが、参照試料からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも低いときに、対象が認知機能障害を有すると判定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、当該認知機能障害と診断された対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む治療有効量の組成物を投与することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、当該認知機能障害と診断された対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを更に含むことができる。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含むことができる。

【0084】

方法であって、（ａ）脳脊髄液試料を対象から得る又は得ていることと、（ｂ）脳脊髄液試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを測定することと、（ｃ）ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルが、対照試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも低いときに、対象が、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物での治療を必要としていると特定することと、（ｄ）治療を必要としていると特定された対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物を投与することと、を含む、方法が、本明細書に更に開示される。いくつかの態様では、対象は、認知機能障害を有する。

【0085】

また、方法であって、（ａ）血漿又は血清試料を対象から得る又は得ていることと、（ｂ）血漿又は血清試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを測定することと、（ｃ）ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルが、対照試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも低いときに、対象が、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物での治療を必要としていると特定することと、（ｄ）治療を必要としていると特定された対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物を投与することと、を含む、方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、対象は、認知機能障害を有する。

【0086】

また、対象の認知機能障害を治療する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物を投与することを含むことができ、対象は、ｉ）対象から得られた試料内で、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを判定すること、ｉｉ）対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを、参照試料からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルと比較することによって、認知機能障害と診断されており、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのより低い発現レベルは、対象の認知機能障害を示す。いくつかの態様では、参照試料は、当該認知機能障害を有しない対象又は当該認知機能障害を有すると診断されていない対象から得られ得る。

【0087】

対象の自然免疫系又はエフェクター応答を下方制御する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0088】

対象の認知機能障害を治療する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、ｍｉＲ－１９５を含む組成物の投与前に、対象から得られた試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルを判定することを更に含むことができ、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルは、参照試料と比較してより低い。いくつかの態様では、参照試料は、認知機能障害を有しない対象又は認知機能障害を有すると診断されていない対象から得られ得る。

【0089】

対象が認知機能障害を患うと判定することは、参照値と比較して、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのより低い発現レベルに基づいて行われ得る。対象が認知機能障害を患うと判定することは、参照値と比較して、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐバリアントのより低い発現レベルに基づいて行われ得る。

【0090】

いくつかの態様では、認知機能障害を患う対象及び対照対象から測定されたｍｉＲＮＡの相対的レベル間の厳密な比較を確立するために、測定された試料のｍｉＲＮＡの発現レベルを比較するための参照値又は対照値を確立することが重要である。本明細書で使用される場合、参照値及び対照値という用語は、同義であると理解される。当該対照値は、様々な様式で、例えば、症例と対照との比較であることができる以前の研究から得られ得る。いくつかの態様では、参照値は、健常個体における統計的研究において得られる、当該ｍｉＲＮＡの発現のレベルの平均値であると考えられる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐは、その発現のレベルの値が、健常個体における発現の平均レベルの半分以下であるときに、参照値よりも低い値を有すると考えられ得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐは、その発現のレベルの値が、年齢一致個体における発現の平均レベルの半分以下であるときに、参照値よりも低い値を有すると考えられ得る。

【0091】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現の平均レベルの判定は、当業者が使用可能であるいずれかの既知の方法を使用して、例えば、算術平均を計算することによって達成され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現の平均レベルの判定は、有効な重複物の平均を比較することによる計算によって達成され得、有効な重複物の平均は、マイクロアレイの一部分を形成する相補的プローブでのハイブリダイゼーション研究におけるそれらの平均実験値を参照して得られる。

【0092】

いくつかの態様では、また、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現のレベルが、その参照値よりも少なくとも４倍低いときに、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐは、参照値よりも低い値を有することができると判定され得る。また、他の値が、参照値として選択され得、例えば、例えば、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの、健常個体から７５パーセンタイル値のレベルが選択され得る。

【0093】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって判定され得る。

【0094】

対象の認知機能障害の１つ以上の症状を寛解させる方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0095】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を低減する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0096】

対象のシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の活性又は発現を阻害する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0097】

対象のアミロイドβタンパク質（Ａβ）クリアランスを増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0098】

対象の、タウ過剰リン酸化の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）誘導性上昇を低減する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0099】

対象のアミロイドプラーク負荷を低減する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0100】

対象のタウ過剰リン酸化を低減する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。

【0101】

対象のＩＬ－６又はＴＮＦα放出を低減する方法が、本明細書に開示される。対象のＩＬ－６又はＴＮＦα放出を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象のＩＬ－６又はＴＮＦα放出を低減する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0102】

対象の減少したリン酸化タウ産生の方法が、本明細書に開示される。対象のリン酸化タウ産生を減少させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象のリン酸化タウ産生を減少させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0103】

対象の虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を治療する方法が、本明細書に開示される。対象の虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を治療する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象の虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を治療する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0104】

対象のアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューする方法が、本明細書に開示される。対象のアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューする方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象のアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューする方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0105】

対象のｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現を減少させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象のｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現を減少させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0106】

対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現を減少させ、ｉｌ１０ａ発現を増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現を減少させ、ｉｌ１０ａ発現を増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0107】

対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を防止する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を防止する方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0108】

対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を防止し、ｉｌ１０ａ発現を増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される、対象の、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を防止し、ｉｌ１０ａ発現を増加させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0109】

対象のリポ多糖誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。対象のリポ多糖誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させる方法であって、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。

【0110】

対象の自然免疫系又はエフェクター応答関与する１つ以上の遺伝子を下方制御する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、自然免疫系又はエフェクター応答関与する１つ以上の遺伝子は、図１５Ａ～図１５Ｅのうちのいずれかの経路のうちの１つ以上に関与し得る。

【0111】

対象の、ミクログリアクラスター内のミトコンドリア及びシナプス機能に関与する遺伝子を上方制御する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、ミクログリアクラスター内のミトコンドリア及びシナプス機能に関与する１つ以上の遺伝子は、図１５Ａ～図１５Ｅのうちのいずれかの経路のうちの１つ以上に関与し得る。

【0112】

対象の、酸化的リン酸化又はＡＴＰ代謝プロセスに関与する１つ以上の遺伝子を上方制御する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ若しくはそれらのバリアント及び断片と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含むことができる。いくつかの態様では、酸化的リン酸化又はＡＴＰ代謝プロセスに関与する１つ以上の遺伝子は、図１５Ａ～図１５Ｅのうちのいずれかの経路のうちの１つ以上に関与し得る。

【0113】

認知機能障害を有する対象の認知機能障害治療の有効性若しくは効力を評価若しくはモニタリングする方法、又は認知機能障害を有すると疑われる対象の認知機能障害を診断する方法が、本明細書に開示される。方法は、試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルを測定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでの初期治療前の、試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルを判定することができる。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでの治療後のいずれかのときの、試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルを判定することができる。いくつかの態様では、方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルが、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでのいずれかの治療後に、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでの治療のうちのいずれかの前のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも高いときに、認知機能障害治療が有効であると特定することを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルが、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでのいずれかの治療後に、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかでの治療のうちのいずれかの前のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも低いときに、認知機能障害治療が有効でないと特定することを含むことができる。

【0114】

いくつかの態様では、方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む治療有効量の組成物を投与することと、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物の投与前に、その投与後に、又はその投与中に、対象に、表１又は表２の化合物のうちのいずれかの治療有効量の化合物を投与することとを含む。いくつかの態様では、方法はまた、標準治療療法の施しを含むことができる。

【0115】

いくつかの態様では、認知機能障害は、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、虚血性状態（例えば、血管性認知症、脳血管疾患、及び他の虚血性プロセス）、混合性認知症、又はダウン症候群であることができる。いくつかの態様では、認知機能障害は、外傷性脳損傷であることができる。

【0116】

いくつかの態様では、治療を必要としている対象は、投与ステップより前に又は投与ステップ前に、認知機能障害と診断されている。

【0117】

いくつかの態様では、対象は、ヒトであることができる。

【0118】

いくつかの態様では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、検出されるｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐ発現レベルは、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと少なくとも９０％の配列同一性を含む配列であることができる。

【0119】

いくつかの態様では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、投与されるｍｉＲ－１９５は、ｍｉＲ－１９５と少なくとも８０％の配列同一性を含む配列を含むことができる。

【0120】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、全身投与又は髄腔内投与され得る。

【0121】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、又はｍｉＲ－１９５と配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、鼻腔内投与され得る。

【0122】

いくつかの態様では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、投与されるｍｉＲ－１９５－５ｐは、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を含む配列を含むことができる。

【0123】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－５ｐと配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、全身投与又は髄腔内投与され得る。

【0124】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－５ｐと配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、鼻腔内に投与され得る。

【0125】

いくつかの態様では、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、投与されるｍｉＲ－１９５－３ｐは、ｍｉＲ－１９５－３ｐ又はその断片若しくはバリアントと少なくとも８０％の配列同一性を含む配列を含むことができる。

【0126】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、全身投与又は髄腔内投与され得る。

【0127】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、鼻腔内投与され得る。

【0128】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－３ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むｈｓａ－ｍｉＲ－１９５であることができる。

【0129】

いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらのバリアントの投与を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片の投与を含むことができる。

【0130】

いくつかの態様では、試料は、脳脊髄液、脳組織、血清、又は血漿であることができる。

【0131】

いくつかの態様では、試料は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐを含む組成物の投与前に、参照試料と比較して、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐの低減された発現を有し得る。

【0132】

いくつかの態様では、試料は、対象（例えば、対象からの脳脊髄液試料）から得られ得、試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐの発現のレベルは、参照試料と比較され得る。参照試料又は対照試料又は参照細胞は、認知機能障害を有しない対象からのものであることができ、概して、細胞又は試料と同じタイプであることができる。いくつかの態様では、参照試料は、対象からの正常試料又は細胞であることができ、認知機能障害を有すると疑われる対象からの組織又は細胞が得られる。参照試料は、同じ対象からのものであることができるが、そうであることは必要とされない。いくつかの態様では、参照試料は、比較されている特定の認知機能障害を有しないことが確立されている又は既知である異なる対象から提供され得る。いくつかの態様では、参照試料は、試料が比較されている対象と、性別が一致する、年齢が一致する、かつ／又は人種が一致するものことができる。いくつかの態様では、参照試料は、いくつかの個体からのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐの発現レベルから得られる（使用される試料又は細胞の数の尺度としての）平均発現レベルであることができ、アッセイされている細胞と同じ組織学的タイプが、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ発現レベルを測定するために使用され、平均発現又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ発現レベルを得るために使用される個体の全てが、認知機能障害を有しない。この場合、個体は、異なる年齢群、人種、及び性別からのものであることができる。代替として、個体は、同じ年齢群、人種、及び／又は性別からのものであることができる。

【0133】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、１つ以上の遺伝子の発現又は発現レベルを判定又は検出する文脈で使用されるときに、遺伝子の転写を判定若しくは検出すること（すなわち、ｍＲＮＡレベルを判定すること）、及び／又は遺伝子の翻訳を判定若しくは検出すること（例えば、産生されるタンパク質を判定又は検出すること）を指すことができる。遺伝子の発現レベルを判定することとは、遺伝子が発現されているか否かを判定することを意味し、発現されている場合、相対的程度を判定することを意味する。本明細書に開示される１つ以上の遺伝子の発現レベルは、直接（例えば、イムノアッセイ、質量分析）又は間接的に（例えば、タンパク質又はペプチドのｍＲＮＡ発現を判定する）判定され得る。質量分析の例としては、ＥＩ、ＣＩ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩなどのイオン化源、及びＱｕａｄ、イオントラップ、ＴＯＦ、ＦＴ、若しくはそれらの組み合わせなどの解析、分光測定、同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）、熱イオン化質量分析（ＴＩＭＳ）、スパーク源質量分析、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、又はＳＲＭが挙げられる。これらの技法のうちのいずれかが、前分画又はエンリッチメント方法と組み合わせて実施され得る。イムノアッセイの例としては、イムノブロット、ウェスタンブロット、酵素結合イムノソルバントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイが挙げられる。抗原のレベルの検出及び判定のために抗体を使用するイムノアッセイ方法は、当該技術分野で既知である。抗体は、スティック、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、又はアレイなどの固体支持体上に固定化され得る。

【0134】

本明細書に記載される遺伝子のうちの１つ以上の発現レベルはまた、組織試料内の１つ以上の遺伝子についてのｍＲＮＡ発現を判定することによって間接的に判定され得る。ＲＮＡ発現方法は、遺伝子の全て又は一部分をコードする転写産物にハイブリダイゼーションする標識プローブを使用する、細胞ｍＲＮＡの抽出及びノーザンブロッティング、遺伝子特異的プライマーを使用する、ｍＲＮＡの増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、並びに逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、続いて、多様な方法による遺伝子産物の定量的検出；細胞からのＲＮＡの抽出、続いて、標識、次いで、インサイツハイブリダイゼーションにおける、遺伝子をコードするｃＤＮＡ又はオリグニオヌクレオチドのプローブとしての使用；ＲＮＡシークエンシング；及びレポーター遺伝子の検出を含むが、これらに限定されない。

【0135】

タンパク質発現レベルを測定する方法は、ウェスタンブロット、イムノブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学解析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及びフローサイトメトリーを含むが、これらに限定されない。方法はまた、特定のタンパク質特性ベースのアッセイベースを含むことができ、これは、酵素活性又は他のタンパク質パートナーとの相互作用を含むが、これらに限定されない。また、結合アッセイが使用され得、当技術分野で周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅマシンが、２つのタンパク質間の複合体の結合定数を判定するために使用され得る。１つのタンパク質の別のタンパク質への結合を判定又は検出するための他の好適なアッセイは、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイを含む。分光の変化をモニタリングすることによって結合を判定することが、使用されてもよく、又はタンパク質の光学特性が、蛍光、紫外線吸収、円形二色性、若しくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）を介して判定されてもよい。代替として、特定の抗体を使用するイムノアッセイが、腫瘍細胞上の特定のタンパク質の上の発現を検出するために使用され得る。

【0136】

本明細書で使用される場合、「参照」、「参照発現」、「参照試料」、「参照値」、「対照」、及び「対照試料」という用語などは、１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡの試料又は発現レベルの文脈で使用されるときに、参照標準であって、参照が、異なる組織（すなわち、同じ組織でないが、複数の組織）のうち、一定のレベルで発現され、実験条件によって影響されず、所定の疾患状態の（例えば、認知機能障害を患わない）試料内のレベルを示す、参照標準を指す。参照値は、疾病又は所定のタイプ若しくは重症度の疾病を表さない、所定の標準値又は一連の所定の標準値であることができる。

【0137】

参照発現は、認知機能障害又は所定の重症度若しくはタイプの認知機能障害を患わない対象又は対象プールからの参照試料内の、本明細書に記載される１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡのレベルであることができる。いくつかの態様では、参照値は、認知機能障害を患っていない１つ以上の対象の組織内の、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡのレベルであることができる。

【0138】

本明細書に開示される１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡの発現レベルを判定することは、遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡが、対照若しくは参照試料と比較して、上方制御されている若しくは増加しているかを判定すること、対照若しくは参照試料と比較して、下方制御されている若しくは減少している（例えば、低い）かを判定すること、又は対照若しくは参照試料と比較して、変化していないかを判定することを含むことができる。本明細書で使用される場合、「上方制御された：及び「増加した発現レベル」又は「発現の増加したレベル」という用語は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡに対応する、発現された配列であって、配列の量の程度が、参照試料又は「正常」対照と比較して、発現の増加したレベル（例えば、高い）を示す、配列を指す。例えば、「上方制御された」及び「増加した発現レベル」又は「発現の増加したレベル」という用語は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子に対応する、発現された配列であって、配列の量の程度が、参照試料又は「正常」対照からの同じｍＲＮＡの発現と比較して、タンパク質及び／又はｍＲＮＡのうちの１つ以上の発現の増加したレベルを示す、配列を指す。「増加した発現レベル」とは、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、又は１倍超、最大２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍以上の、発現の増加を指す。本明細書で使用される場合、「下方制御された」、「発現の減少したレベル」、又は「減少した発現レベル」という用語は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子又はタンパク質又はマイクロＲＮＡに対応する、発現された配列であって、配列の量の程度が、参照試料又は「正常」対照と比較して、発現の減少したレベルを示す、配列を指す。例えば、「下方制御された」、「発現の減少したレベル」、又は「減少した発現レベル」という用語は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子に対応する、発現された配列であって、配列の量の程度が、参照試料又は「正常」対照からの同じｍＲＮＡの発現と比較して、１つ以上のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現の減少したレベルを示す、配列を指す。「発現の減少したレベル」とは、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、又は１倍超、最大２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍以上の、発現の減少を指す。

【0139】

いくつかの態様では、認知機能障害治療の効力が判定され得る。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルは、認知機能障害治療の効力についてのバイオマーカーとして役立ち得る。例えば、治療後の細胞内のｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルは、治療前の細胞内のｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルよりも高いことがあり、次いで、治療は有効であると考えられ得る。いくつかの態様では、方法は、対象に、ｍｉＲ－１９５－５ｐを含む組成物を対象に投与した後に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルを測定することを更に含むことができる。

【0140】

いくつかの態様では、シナプトジャニン１の相対的レベルが測定され得る。高い又は増加したレベルのシナプトジャニン１は、低いレベルのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐに対応する。

【0141】

いくつかの態様では、認知機能障害のための治療の効力が判定され得る。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルは、認知機能障害のための治療の効力についてのバイオマーカーとして役立ち得る。例えば、試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルは、それぞれ、治療前の試料内のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐのレベルよりも高いことがあり、次いで、治療は有効であると考えられ得る。

【0142】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５であることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５は、ヌクレオチド配列ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣ（配列番号５）を含むことができる。いくつかの態様では、組成物は、ｍｉＲ－１９５に由来する配列を含むことができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ヌクレオチド配列ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣ（配列番号１）を含むことができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－３ｐであることができる。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、ヌクレオチド配列ＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣ（配列番号２）を含むことができる。

【0143】

細胞内のシナプトジャニン１遺伝子の発現を抑制する方法が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ｍｉＲ－１９５、その断片、又はそのバリアントと接触させることを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、その断片、又はそのバリアントと接触させることを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片、又はそのバリアントと接触させることを含むことができる。いくつかの態様では、シナプトジャニン１遺伝子は、膜ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェートのレベルを制御するホスホイノシチドホスファターゼをコードし、それによって、参照試料と比較して、細胞内のシナプトジャニン１遺伝子の発現を抑制する。いくつかの態様では、細胞は、脳細胞であり得る。方法は、細胞を、治療有効量のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと接触させることを含むことができる。

【0144】

細胞を、ｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの発現又は活性を刺激又は亢進することが可能な分子と接触させることは、当該技術分野で既知のいずれかの方法によって達成され得る。いくつかの態様では、細胞とｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐとを接触させることは、インビボで発生する。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐの発現若しくは活性を刺激若しくは亢進することが可能な分子、又は分子は、細胞と直接接触させてもよく、例えば、認知機能障害の１つ以上の症状関連する細胞に直接適用されてもよく、又は代替として、例えば、分子を対象の血流内に注射し、次いで、血流が、分子を、認知機能障害の１つ以上の症状関連する細胞に運ぶことによって、細胞と間接的に組み合わされてもよい。更に、試料は、対象から除去され得、試料の少なくとも一部分を対象に戻す前に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐの発現若しくは活性を刺激若しくは亢進することが可能な分子とインビトロで組み合わされ得る。例えば、試料は、血液、血清、血漿、又は脳脊髄液試料であることができ、血液、血清、血漿、又は脳脊髄液試料は、対象から除去され得、血液、血清、血漿、又は脳脊髄液の少なくとも一部分を対象に注射し戻す前に、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐと組み合わされ得る。

【0145】

本明細書に記載される組成物は、治療有効量の、本明細書に記載される、ｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアントを含むように製剤化され得る。治療的投与は、予防的適用を包含する。遺伝子試験及び他の予後方法に基づいて、患者を診察する医師は、患者が、あるタイプの認知機能障害への臨床的に判定された素因又は増加した易罹患性（いくつかの場合、大きく増加した易罹患性）を有する場合、予防的投与を選択することができる。

【0146】

本明細書に記載される組成物は、多様な組み合わせで製剤化され得る。ｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアントと、表１及び表２の化合物のうちのいずれかとの特定の組み合わせは、多くの因子、例えば、特定のタイプ及び重症度の認知機能障害に従って変動し得る。

【0147】

本明細書に記載される組成物は、対象（例えば、ヒト患者）に、臨床疾患の発病を遅延させる、低減する、又は好ましくは、防止するのに十分な量で投与され得る。したがって、いくつかの態様では、患者は、ヒト患者であることができる。いくつかの態様では、ヒト対象又は患者は、小児又は成人であることができる。治療的適用において、組成物は、認知機能障害を既に有する又は認知機能障害と既に診断された対象（例えば、ヒト患者）に、徴候若しくは症状を少なくとも部分的に改善するのに、又は状態の症状、その合併症、及び結果の進行を阻害する（好ましくは、抑止する）のに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。組成物（例えば、薬学的組成物）の治療有効量は、治癒を達成する量であって、転帰が、達成され得るいくつかのもののうち、１つのみである、量であることができる。上記のように、治療有効量は、治療を提供する量であって、治療において、認知機能障害の発病又は進行が、遅延する、妨げられる、若しくは防止されるか、又は認知機能障害若しくは認知機能障害の症状が寛解する、量を含む。症状のうちの１つ以上は、より少ない重度であり得る。回復は、治療された個体において加速され得る。

【0148】

本明細書に記載される組成物は、治療有効量のｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアントを、単独で又は表１及び表２に開示される化合物のうちの１つ以上と組み合わせて含むように製剤化され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアントは、薬学的製剤内に含有され得る。いくつかの態様では、薬学的製剤は、単位投与量製剤であることができる。

【0149】

哺乳類（例えば、ヒト）に適用される、本明細書に開示される方法において使用される、ｍｉＲ－１９５、その断片又はバリアント、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はその断片若しくはバリアント、あるいはｍｉＲ－１９５－３ｐ、その断片又はバリアント、並びに表１及び表２に記載される化合物のうちのいずれかの治療有効量又は投与量は、年齢、体重、性別の個体差、投与される他の薬物、及び担当臨床医の判断を考慮して、当業者によって判定され得る。必要とされる投与量の変動が予想され得る。投与量レベルの変動は、最適化のための標準の経験的経路を使用して調整され得る。患者に投与される薬学的組成物の特定の投与量は、多様な考慮事項（例えば、認知機能障害症状の重症度）、対象の年齢及び身体的特徴、並びに当業者に既知の他の考慮事項に依存する。投与量は、当業者に既知の臨床的手法を使用して確立され得る。

【0150】

本明細書で提供されるいずれかの組成物での治療の期間は、例えば、短くても１日から、長くても宿主の寿命（例えば、多年）までのいずれかの時間の長さであることができる。例えば、組成物は、（例えば、４週間～多くの月又は多年間）週１回、（例えば、３～１２か月間又は多年間）月１回、又は５年、１０年以上の期間、年１回投与され得る。また、治療の頻度は可変であり得ることに留意されたい。例えば、本組成物は、１日、１週、１か月、又は１年に１回（又は２回、３回など）投与され得る。

【0151】

ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐ（それらの断片及びバリアントを含む）を含む組成物は、対象に、約又は少なくとも約０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００μｇ若しくはｍｇ、又は０．５μｇ若しくはｍｇ～３０００μｇ若しくはｍｇのいずれかの範囲の１つ以上の用量で投与され得る。指定される量は、平均１日、平均１週、若しくは平均１か月用量として投与される量であってもよく、又は指定される量は、ｍｇ／ｋｇで表されてもよく、ｋｇは、患者の体重を指し、ｍｇは、上記で指定される。他の実施形態では、指定される量は、上記のいずれかの数であるが、（腫瘍サイズ又は患者表面積に対して）ｍｇ／ｍ²として表される。臨床医は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの有効量、すなわち、対象の又は細胞内の、内因性ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐ発現レベルを増加させる、シナプトジャニン１活性若しくは発現を減少させる、アミロイドβタンパク質クリアランスを増加させる、アミロイドプラーク負荷を減少させる若しくは低減する、タウ過剰リン酸化を減少させる若しくは低減する、又はアルツハイマー病関連リソソーム異常をレスキューするために必要とされる、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントの量を、対象のサイズ及び体重、疾患浸透の程度、対象の年齢、健康、及び性別、投与経路、並びに投与が局所又は全身投与であるかなどの因子を考慮して、容易に判定することができる。

【0152】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ（それらの断片及びバリアントを含む）の投与量は、表１及び表２に開示される化合物のうちの１つ以上と組み合わされたときに、より少なくてもよい。

【0153】

本明細書に開示される組成物の総有効量は、対象に、単一用量として、ボーラスとして若しくは比較的短い期間にわたる注入によってのいずれかで投与されてもよく、又は分割治療プロトコルを使用して投与されてもよく、分割治療プロトコルにおいて、複数の用量が、より長い期間にわたって投与される。代替として、血液中の治療有効濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入もまた、本開示の範囲内である。

【0154】

本明細書に記載される組成物は、療法を必要としている対象に、他の治療様式とともに投与され得る。例えば、本明細書に開示する方法において、本明細書に記載される組成物は、療法を必要としている対象に、他の治療様式とともに投与され得る。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、他の薬剤又はレジメンでの治療より前に、それでの治療と同時に、又はそれでの治療後に与えられ得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、表１及び表２に記載される化合物のうちの１つ以上、若しくはｍｉＲ－１９５発現レベルを増加させる１つ以上の薬物、又は両方の組み合わせの投与より前に、その投与と同時に若しくはその投与中に、又はその投与後に与えられ得る。例えば、ｍｉＲ－１９５若しくはそのバリアント単独、又は表１及び表２に開示される化合物のうちのいずれかと一緒のｍｉＲ－１９５若しくはそのバリアントは、認知機能障害を治療するために使用される標準療法とともに投与され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、表１及び表２に記載される化合物のうちの１つ以上又はそれらの組み合わせと一緒に投与又は使用され得る。

【0155】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアント、並びに表１及び表２に開示される化合物のうちの１つ以上は、共製剤化され得る。本明細書に記載される組成物は、治療有効量のｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを、表１及び表２に開示される化合物のうちの１つ以上と組み合わせて含むように製剤化され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアント、並びに表１及び表２に開示される１つ以上の化合物を、ナノ粒子内で共製剤化され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、薬学的製剤内に含有され得る。いくつかの態様では、薬学的製剤は、単位投与量製剤であることができる。

【0156】

いくつかの態様では、本明細書に開示される治療方法はまた、治療有効量の免疫療法、幹細胞移植、又はそれらの組み合わせの施しを含むことができる。開示される併用療法は、１つ以上の薬学的組成物として施され得、別個の場合、任意の順序で同時に又は順次施され得る。

【0157】

いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかは、１つ以上の免疫療法剤又は免疫調節剤と一緒に投与され得る。本明細書で使用される場合、「免疫調節」及び「免疫調節剤」という用語は、免疫系応答を所望の免疫系応答へ改変する（例えば、強化する）構成要素（例えば、タンパク質、ペプチド、薬理学的及び／又は免疫学的薬剤）を指す。免疫調節物質はまた、アジュバントであることができる。免疫調節物質は、免疫系応答を特異的に又は非特異的に増強する治療剤であり得る。免疫調節物質又は免疫調節剤の例として、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、又は免疫系応答の増加を提供するいずれかのタンパク質、ペプチド、薬理学的若しくは免疫学的薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。免疫療法剤の例としては、抗体療法、サイトカイン療法、及び併用免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、免疫調節剤は、抗アミロイド抗体又は抗タウ抗体であることができる。本明細書に記載される組成物は、疾患のための併用療法であることができる。

【0158】

ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、「併用」療法として投与され得る。例えば、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はそれらの断片若しくはバリアントは、必要としている対象に、表１及び表２に開示される化合物のうちのいずれか若しくはそれらのいずれかの組み合わせの投与より前に、表１及び表２に開示される化合物のうちの当該いずれか若しくはそれらのいずれかの組み合わせの投与と同時に（同時投与）、又はすぐにその後に提供され得ることを理解されたい。

【0159】

薬学的組成物
本明細書に開示されるように、本明細書に記載される、ｍｉＲ－１９５と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物がある。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５は、経口又は親投与のために製剤化され得る。本明細書に開示されるように、本明細書に記載される、ｍｉＲ－１９５－５ｐと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物がある。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５－３ｐは、経口又は親投与のために製剤化され得る。いくつかの態様では、親投与は、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、又は直接注射である。組成物は、様々な投与経路のいずれかによる投与のために製剤化することができ、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよく、これは投与経路に応じて様々であってもよい。本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、「担体」又は「希釈剤」とも称され得るものを含む、任意の化合物又は物質を意味する。薬理学的及び生理学的に許容される組成物を調製することは、当該技術分野では日常的であると考えられ、したがって、当業者は、必要に応じて、多数の当局に指導を求めることができる。

【0160】

組成物は、対象に直接投与され得る。概して、組成物は、組成物の送達を容易にするために、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水又は緩衝生理食塩水溶液）中に懸濁させることができる。好適な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子又は植込み型デバイス）内への組成物のカプセル封入は、送達の効率を増加させ得る。

【0161】

組成物は、非経口又は非非経口投与のために、様々な様式で製剤化され得る。好適な場合、経口製剤は、錠剤、丸薬、カプセル、又は粉末の形態をとることができ、これらは、腸溶コーティングされてもよく、又は別法で保護されてもよい。また、持続放出製剤、懸濁液、エリキシル剤、及びエアロゾルなどが使用され得る。

【0162】

薬学的に許容される担体及び賦形剤（例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、及びグリコール、（石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む）油、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、及びエタノールなど）が組み込まれ得る。組成物は、滅菌などの従来の薬学的便法に供され得、従来の薬学的添加剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤又は乳化剤、浸透圧を調整するための塩、及び緩衝液などを含有し得る。好適な薬学的担体及びそれらの製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、いずれの事象でも、患者への適切な投与のための適切な剤形を調製するように、有効量の組成物を、好適な量の担体と一緒に含有する。

【0163】

本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与のために調製され得る。非経口投与のために調製される薬学的組成物は、静脈内（又は動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内、又は直腸）、又は経皮（例えば、局所）投与のために調製されるものを含む。また、エアロゾル吸入が使用され得る。したがって、組成物は、非経口投与のために調製され得、これは、許容される担体中に溶解又は懸濁したｍｉＲ－１９５を含み、許容される担体は、水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、及び緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などを含むが、これらに限定されない。含まれる賦形剤のうちの１つ以上は、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、張力調整剤、湿潤剤、洗剤などの生理学的状態に近似させるのを助けることができる。組成物が、固体成分（経口投与のためのものであり得る）を含む場合、賦形剤のうちの１つ以上は、結合剤又は充填剤として機能することができる（例えば、錠剤、カプセルなどの製剤化のために）。

【0164】

薬学的組成物は、滅菌されてもよく、従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、又は滅菌濾過されてもよい。水溶液は、そのまま使用するために包装されてもよく、又は本開示によって包含される凍結乾燥された凍結乾燥調製剤を、投与前に滅菌水性担体と合わせてもよい。薬学的組成物のｐＨは、典型的には、３～１１（例えば、約５～９）、又は６～８（例えば、約７～８）であろう。固体形態で得られた組成物は、複数の単回投与単位で包装されてもよく、各々が所定量の上述の１つ以上の薬剤を含む（例えば、錠剤又はカプセルの密封された包装）。

【0165】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、全身投与され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、静脈内投与され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、髄腔内投与され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、鼻腔内投与され得る。いくつかの態様では、薬学的組成物は、全身投与、静脈内投与、鼻腔内投与、又は髄腔内投与のために製剤化され得る。いくつかの態様では、組成物は、脂質エマルション内で製剤化され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム内での、又はウイルスベクター内での送達のために製剤化され得る。リポソームは、単層膜、多重膜、又は多胞性リポソームであることができる。多種多様なリポソーム及びエクソソームが使用され得る。例えば、いくつかの態様では、シリコーンナノ粒子が、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐを細胞に送達するために使用され得る。いくつかの態様では、ナノベクターが、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを対象に送達するために使用され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを含む組成物は、血液脳関門をバイパスするための脊髄のくも膜下腔中への注射によって、脳脊髄液中に投与され得る。

【0166】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、核酸によってコードされ得る。核酸は、１つ以上の細胞内にトランスフェクトされ得る。トランスフェクションは、エレクトロポレーション又はウイルスベクターとのインキュベーションを含むことができる。いくつかの態様では、核酸は、ベクター内に位置し得る。いくつかの態様では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はウイルスベクターであることができる。いくつかの態様では、ベクターは、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソームを含むことができる。いくつかの態様では、核酸は、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソーム内に含まれ得る。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスであることができる。いくつかの態様では、ベクターは、脂質、脂質エマルション、リポソーム、ナノ粒子、又はエクソソームを含みことができる。

【0167】

ナノ粒子。本明細書に記載される組成物は、１つ以上のナノ粒子を含むことができる。本明細書に開示されるナノ粒子組成物は、コンジュゲートした又は封入された、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドの、血液脳関門をわたる送達を亢進するために使用され得る。（「ナノ担体」という用語と互換的に使用される）ナノ粒子の例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２３３２５１号に見出され得る。ナノ担体の例としては、１つ以上のポリマーを含むナノ担体が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの態様では、１つ以上のポリマーは、水溶性非接着性ポリマーであることができる。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であることができる。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリアルキレングリコール又はポリアルキレンオキシドであることができる。いくつかの態様では、１つ以上のポリマーは、生分解性ポリマーであることができる。いくつかの態様では、１つ以上のポリマーは、生体適合性ポリマーであることができ、生体適合性ポリマーは、水溶性非接着性ポリマー及び生分解性ポリマーのコンジュゲートであることができる。いくつかの態様では、生分解性ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、又はポリ（乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）であることができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、ＰＥＧ－ＰＬＧＡポリマーから構成され得る。

【0168】

いくつかの態様では、ナノ担体は、自己組織化によって形成され得る。自己組織化とは、構成要素を使用する、ナノ担体の形成のプロセスであって、構成要素が、自己を予測可能な様式で配向して、ナノ担体を予測可能かつ再現可能に形成する、プロセスを指す。いくつかの態様では、ナノ担体は、両親媒性生体材料を使用して形成され得、両親媒性生体材料は、自己を互いに対して配向して、予測可能な寸法、構成物、及び構成物の配置のナノ担体を形成する。いくつかの態様では、ナノ担体は、微粒子、ナノ粒子、又はピコ粒子であることができる。いくつかの態様では、微粒子、ナノ粒子、又はピコ粒子は、自己組織化のものであることができる。

【0169】

いくつかの態様では、ナノ担体は、正ゼータ電位を有することができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、正味正電荷を中性ｐＨで有することができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、１つ以上のアミン部分を、ナノ担体の表面において含むことができる。いくつかの態様では、アミン部分は、一級、二級、三級、又は四級アミンであることができる。いくつかの態様では、アミン部分は、脂肪族アミンであることができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、アミン含有ポリマーを含むことができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、アミン含有脂質を含むことができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、正電荷を中性ｐＨで有することができるタンパク質又はペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、ナノ担体は、ラテックス粒子であることができる。いくつかの態様では、１つ以上のアミン部分をナノ担体の表面上に有するナノ担体は、正味正電荷を中性ｐＨで有することができる。

【0170】

ナノ粒子は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドの送達を援助することができる。送達は、特定の目的部位、例えば、脳細胞、前頭側頭皮質細胞への送達であることができる。いくつかの態様では、ナノ粒子は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドの徐放をもたらして、治療応答を亢進及び／又は延長することができる。いくつかの態様では、ナノ粒子は、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドと会合することができる。会合は、例えば、ナノ粒子が、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドと結合又はコンジュゲートすることができる、会合であることができる。「結合した」及び「コンジュゲートした」という用語は、ナノ粒子と、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドとの間の化学結合があることを意味する。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、ナノ粒子内に封入又はカプセル封入され得る。いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、水／油／水エマルション方法によって、ナノ粒子内に封入され得る。いくつかの態様では、ナノ粒子は、ポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧＡ）であることができる。重合のために使用されるラクチド対グリコリドの比に依存して、異なる形態のＰＬＧＡが、得られ得、使用され得る。これらの形態は、典型的には、使用されるモノマー比に関して特定される（例えば、ＰＬＧＡ ７５：２５は、組成が７５％の乳酸及び２５％のグリコール酸であることができるコポリマーを特定する）。異なる比、例えば、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、並びにこれらの比を超える数字及びこれらの比間の数字が、本発明で使用され得る。好適なナノ粒子の追加の例としては、キトシン、リン酸カルシウム、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの様々な細菌の脂質、マイコバクテリア、レプトスピラ、及びそれらの混合物が挙げられる。一例では、組成物は、約１８０ｍｇのＰＬＧＡを、約５ｍｇのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐに（又は約３６ｍｇのＰＬＧＡを、それぞれ１ｍｇのｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐに）混合して導出され得る。ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又はｍｉＲ－１９５－３ｐの封入（カプセル封入）効率は、変動し得る。いくつかの態様では、ナノ粒子は、封入において使用されるｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドの合計量に基づいて計算して、５０～５５％封入／カプセル封入され得る。封入された、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、封入／カプセル封入された、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドと、未封入／未カプセル封入の、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドとの混合物として投与されてもよく、あるいは封入／カプセル封入された、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、更に精製されてもよい。

【0171】

いくつかの態様では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、コポリマーにコンジュゲートすることができる。従来のコポリマーは、世界中の多数の研究所において使用されており、いくつかの臨床治験においても使用されている。（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３７，８８３号を参照されたい）。例えば、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）コポリマーは、（１）生体適合性であり、十分に確立された安全性プロファイルを有し、（２）水溶性であり、低分子量（遊離非結合）薬物と比較して好ましい薬物動態を有し、（３）優れた化学柔軟性を有する（すなわち、異なる側鎖を含有するモノマーは、容易に合成され得、それらの構造内に組み込まれ得る）。しかしながら、ＨＰＭＡポリマーは、分解性でなく、ＨＰＭＡポリマーの分子量は、生体適合性を持続させるために、腎閾値未満に保たれるべきである。これは、ＥＰＲ（血管透過性及び滞留性亢進）効果を介する、固形腫瘍内のＨＰＭＡポリマーの血管内半減期及び蓄積を制限する。

【0172】

骨格分解性ＨＰＭＡコポリマー担体は、ＨＰＭＡに関連する制限を克服するために使用され得る。コポリマー担体は、酵素的に分解可能な配列（すなわち、カテプシンＢ、マトリックスマタロプロテイナーゼなどによる酵素的に分解可能な配列）を、主鎖（すなわち、ポリマー骨格）及び酵素的に分解可能な側鎖（すなわち、薬物放出のための側鎖）内に含有することができる。（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／５８３，２７０号を参照されたい）。細胞のリソソーム区画に到達すると、薬物は放出され得、同時に、ポリマー担体は、腎閾値未満である分子に分解され得、対象から排除され得る。したがって、増加した分子量を有するジブロック又はマルチブロック生分解性コポリマーが生成され得る。これは、本明細書に開示されるコポリマー－ｍｉＲ－１９５、－ｍｉＲ－１９５－５ｐ、又は－ｍｉＲ－１９５－３ｐ治療コンジュゲートの血液循環時間を更に亢進することができる。更に、米国特許第４，０６２，８３１号は、一連の水溶性ポリマーを記載しており、米国特許第５，０３７，８８３号は、多様なペプチド配列を記載しており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0173】

いくつかの事例では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、開示される方法において投与されたＨＰＭＡコポリマーにコンジュゲートすることができ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０個のＨＰＭＡコポリマーを含むことができる。いくつかの事例では、各ＨＰＭＡコポリマーは、酵素的に分解可能なペプチドを介して接続され得る。

【0174】

いくつかの事例では、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドは、開示される方法において投与されたＨＰＭＡコポリマーにコンジュゲートすることができ、リンカーも含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは、ペプチドリンカーであることができる。

【0175】

ベクターは、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、並びに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含むことができる。ベクターは、標的分子を含むことができる。標的分子は、所望の核酸を、対象の体内の特定の臓器、組織、細胞、又は他の場所に向けるものである。概して、ベクターは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル）と会合したときに、複製をもたらす。当該技術分野で通例使用されるベクターの例として、プラスミド及びウイルスが挙げられる。「ベクター」という用語は、発現ベクターを含み、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。多様な様式が、発現ベクターを細胞内に導入するために使用され得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、ウイルス、又はウイルスゲノムに由来する操作されたベクターを含む。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、制御領域を含むベクターである。多様な宿主／発現ベクター組み合わせが、本明細書に開示される核酸配列を発現するために使用され得る。発現ベクターの例として、例えば、バクテリオファージ、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、及び他のウイルス（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）に由来するプラスミド及びウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクター及び発現系は、市販されており、当業者に既知である。

【0176】

製造物品
本明細書に記載される組成物は、好適な容器内に包装され得、容器は、例えば、認知機能障害を治療するための療法又は本明細書に開示される方法のうちのいずれかとしての使用のためのものと標識される。したがって、少なくとも、本明細書に記載される、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドと、使用説明書と、を含む、包装製品（例えば、貯蔵、出荷、又は販売のために、濃縮されて又は使用準備済みの濃度で包装された、本明細書に記載される組成物を収容する滅菌容器）及びキットはまた、本開示の範囲内である。製品は、本明細書に記載される組成物を収容する容器（例えば、バイアル、ジャー、ボトル、又はバッグなど）を含むことができる。加えて、製造物品は、例えば、包装材料、使用説明書、シリンジ、緩衝液、又は予防若しくは治療が必要とされる状態を治療又はモニタリングするための他の対照試薬を更に含み得る。製品はまた、レジェンド（例えば、製品の使用を説明する、印刷された標識若しくは添付文書、又は他の媒体（例えば、音声又はビデオテープ））を含み得る。レジェンドは、容器に付随する（例えば、容器に添付される）ことができ、容器内の化合物が投与されるべき様式（例えば、投与頻度及び投与経路）、そのための適応症、及び他の使用を説明することができる。化合物は、投与準備済みである（例えば、用量に適切な単位で存在する）ことができ、薬学的に許容されるアジュバント、担体、又は他の希釈剤を含み得る。代替として、化合物は、濃縮形態で、希釈剤及び希釈のための説明書と一緒に提供され得る。

【0177】

いくつかの態様では、キットは、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐに由来する分子、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド；ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐに由来する１つ以上の分子、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター；試料を脳脊髄液試料から調製するための試薬のうちの１つ以上を含むことができる。キットは、１つ以上の薬学的に許容される担体を含むことができる。加えて、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドの投与のためのデバイス又は材料（例えば、シリンジ（ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、又はｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、若しくはｍｉＲ－１９５－３ｐとそれぞれ配列少なくとも８０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドを有するプレフィルドシリンジ）、針、リポソームなど）もまた含まれ得る。

【実施例】

【0178】

実施例１：マイクロＲＮＡ－１９５－５ｐは、アルツハイマー病の病因におけるＡｐｏＥ４誘導性認知欠損及びリソソーム異常をレスキューする。
要約。脳ホスホイノシトールビホスフェート（ＰＩＰ₂）ホメオスタシスにおけるアポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）特異的変化と、アルツハイマー病（ＡＤ）を発症する易罹患性との間の関連を、本明細書に記載する。ｍｉＲ－１９５－５ｐを、ＡｐｏＥ／ＰＩＰ₂経路に関与する最上位マイクロＲＮＡ候補として、ヒトＲＯＳＭＡＰデータセット及びマウスマイクロアレイ研究におけるｍｉＲＮＡプロファイルを使用して特定した。更なる検証研究は、ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルが、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）又は早期ＡＤの臨床診断を有するＡｐｏＥ４^+/-患者のヒト脳組織内で、ＡｐｏＥ４^-/-対象と比較して有意により低いことを実証している。加えて、脳ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、正常老化から早期ＡＤへの疾患進行に伴って低減され、ＭＣＩ対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）によって測定された場合、認知パフォーマンスと正相関し、ＣＳＦタウレベルと負相関し、これは、認知への潜在的な影響を有するＡＤの早期発症へのｍｉＲ－１９５－５ｐの関与を示唆する。ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの類似の差が、ＡｐｏＥ４^+/+マウス海馬脳組織及び培養ニューロン内で、ＡｐｏＥ３^+/+対応物と比較して見られる。過剰発現ｍｉＲ－１９５－５ｐは、脳ＰＩＰ₂分解酵素である、その最上位予測標的シナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の発現レベルを低減する。更に、上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐは、ＡｐｏＥ４^+/+マウスの認知欠損、アミロイドプラーク負荷、及びタウ過剰リン酸化を寛解させる。加えて、上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐは、ＡｐｏＥ４^+/+ ＡＤ対象の誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来脳細胞内のＡＤ関連リソソーム異常をレスキューし、ｍｉＲ－１９５－５ｐを阻害することは、これらの表現型を悪化させる。まとめると、本明細書に記載されるデータは、ＡｐｏＥ４関連脳ＰＩＰ₂ホメオスタシス不全、認知欠損、及びＡＤ病的状態において標的とされるｍｉＲ－１９５－５ｐの制御機構を提供する。

【0179】

序文。アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）アレルは、アルツハイマー病（ＡＤ）についての主要なリスク因子として特定されている（Ｍａｙｅｕｘ Ｒ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００３）。多数の研究は、ＡｐｏＥ４が、Ａβクリアランス（Ｆａｇａｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ２００２、Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐｌ ２００８、Ｊｏｒｄａｎ Ｊｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９８、Ｍａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９４、Ｓｈａｒｍａｎ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１０、Ｙａｎｇ ＤＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７、及びＦａｇａｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ２００２）、神経原線維濃縮体負荷（Ｏｙａｍａ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒａｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９５、Ｓｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１７、Ｔｉｒａｂｏｓｃｈｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４、及びＷａｎｇ Ｙｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１６）、シナプス形成及びシナプス可塑性（Ｌｏｖｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ２００６、Ｎａｔｈａｎ ＢＰ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４、Ｔｅｔｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９、及びＴｒｏｍｍｅｒ ＢＬ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００４）、グリア活性化及び神経炎症（Ｋｅｒｅｎ－Ｓｈａｕｌ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１７、Ｙｅｈ ＦＬｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ２０１６、及びＺｈｕ Ｙｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ ２０１２）をもたらすことを示唆している。また、ＡｐｏＥタンパク質は、脂質代謝及びニューロンホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす（Ｈｕａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１４）。先行研究は、死後ＡＤ脳内の脳膜リン脂質組成、代謝、及び選択された酵素活性の明確な変更を明らかにしており（Ｐｅｔｔｅｇｒｅｗ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１、Ｍａｎｄａｌ ＰＫｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４、Ｋａｎｆｅｒ ＪＮ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３、Ｋａｎｆｅｒ ＪＮ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １９９６、及びＣｈａｎ ＲＢ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２）、これは、ＡｐｏＥ４によって悪化し得る（Ｋｌｕｎｋ ＷＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ １９９８）。ＡｐｏＥタンパク質は、脳ホスホイノシトールビホスフェート（ＰＩＰ₂）ホメオスタシスの重要な決定因子であり、ＡｐｏＥ４アイソフォームは、このプロセスにおいて機能不全であり、これは、ＡＤにおける認知低下の増加した易罹患性に寄与することが報告されている（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）。また、脳ＰＩＰ₂レベルは、ＰＩＰ₂分解酵素であるシナプトジャニン１（ｓｙｎｊ１）の増加した発現に起因して、ＡｐｏＥ４脳及びニューロン内でより低いことが示されている（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）。

【0180】

ＰＩＰ₂及びｓｙｎｊ１の機能的役割は、ＡＤ病因において示されている（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５、Ｂｅｒｍａｎ ＤＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００８、Ｖｏｒｏｎｏｖ ＳＶ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８、ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＬＢ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２、Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３、Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７、及びＭｉｒａｎｄａ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１８）。例えば、ｓｙｎｊ１の増加した発現は、初期エンドソーム拡大（Ｃｏｓｓｅｃ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１２）、及びＡＤにおけるＡｐｏＥ４関連認知欠損（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）に関連する。ｓｙｎｊ１の低減は、ＡＤにおけるいくつかの有益な効果、例えば、リソソーム分解経路を介するＡβクリアランスの加速（Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３）、タウ過剰リン酸化の軽度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）誘導性上昇の寛解（Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７）、及びＡｐｏＥ４関連認知機能障害のレスキュー（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）を提供する。しかしながら、ＡｐｏＥ４を脳ＰＩＰ₂／ｓｙｎｊ１経路に関連付け、認知機能に影響する分子シグナル伝達機構は、依然として理解されていない。ＡｐｏＥ４脳内の増加したｓｙｎｊ１レベルは、部分的に、効率的なｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ分解の不全に起因する（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）。ｍＲＮＡ安定性は、しばしば、ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ領域に結合するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって制御される（Ｆａｂｉａｎ ＭＲ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１０）。脳ｓｙｎｊ１発現が、ＡｐｏＥアイソフォームによって、ｍｉＲＮＡ調節を介して差次的に制御され得るかを評価した。

【0181】

いくつかのｍｉＲＮＡは、様々なＡＤプロセスにおいて以前に示されている（Ｗａｎｇ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１９）。また、ＡＤ対象と正常老化対照との間の様々な脳ｍｉＲＮＡレベルの変化が報告されている（Ｇｏｏｄａｌｌ ＥＦ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３、及びＬｕｋｉｗ ＷＪｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００７）。Ｒｅｌｉｇｉｏｕｓ Ｏｒｄｅｒｓ Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ Ｒｕｓｈ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＯＳＭＡＰ）からの既存のｍｉＲＮＡデータセット（Ｂｅｎｎｅｔｔ ＤＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ２００５、及びＡ Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２）を、ＡｐｏＥ４⁺及びＡｐｏＥ４^-皮質ニューロンにおいて実行されたｍｉＲＮＡアレイ研究と組み合わせて使用した。ｍｉｒＤＢを含む複数のバイオインフォマティクスデータベースによって予測された場合、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１９５は、ＡｐｏＥ４⁺キャリアとＡｐｏＥ４^-キャリアとの間で差次的に発現され、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡを標的とすると特定された（Ｗｏｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５、及びＷａｎｇ Ｘ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１６）。ｍｉＲ－１９５レベルの変化を、死後ヒト及びマウス脳組織、並びに培養ニューロンを使用して更に検証する。更に、ｍｉＲ－１９５の制御役割を、ＡｐｏＥ４関連脳ＰＩＰ₂ホメオスタシス不全、認知欠損、及びＡＤ病的状態において特徴付けた。

【0182】

材料及び方法。ヒトｍｉＲＮＡ発現プロファイル及びデータ前処理。ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、ＲＯＳＭＡＰ研究からダウンロードした（Ｓｙｎａｐｓｅ ｄｏｉ：１０．７３０３／ｓｙｎ３３８８５６４）。５０％未満の試料内の、９５％未満のコールレート及び１５未満の絶対値を有するｍｉＲＮＡを除去した。ｍｉＲＮＡ発現値を、分散安定化正規化法を使用して正規化した。カートリッジを、バッチとして指定し、Ｒパッケージｓｖａ（Ｖ３．２０．０）におけるＣｏｍｂａｔ機能で補正した。データ前処理により、５１１個の試料内の３０９個のｍｉＲＮＡを得た。また、前処理されたＲＮＡ－ｓｅｑ ＦＰＫＭ遺伝子発現存在量データを、ＲＯＳＭＡＰ研究からダウンロードした（Ｓｙｎａｐｓｅ ｄｏｉ：１０．７３０３／ｓｙｎ３３８８５６４）。少なくとも１０％の試料内の、少なくとも１つのＦＰＫＭを有する遺伝子を選択し、次いで、データを、バッチ、ＰＭＩ、及びＲＩＮスコアを含む交絡因子について補正した。前処理された遺伝子発現プロファイルは、１６，２３５個の遺伝子及び６１９個の試料を含有する。

【0183】

差次的発現及びｍｉＲＮＡ－遺伝子相関解析。差次的発現解析を、１１１個のＡＰＯＥ４^-/-（ε３／３）キャリアと２４個のＡＰＯＥ４^+/-（ε３／４）キャリアとの間のｍｉＲＮＡにおいて、Ｒパッケージｌｉｍｍａ（Ｖ３．３４．０）を使用して実行した（Ｓｍｙｔｈ ＧＫ，Ｓｔａｔ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００４）。複数の試験を、ベンジャミニ－ホッホベルグ（ＢＨ）ＦＤＲ法を使用して調整した。相関解析を、ｍｉＲＮＡと遺伝子との間で、スピアマン相関検定を使用して実行した。また、ｍｉＲＮＡ－遺伝子相関を、ＡＤ診断、性別、及びＡＰＯＥ遺伝子型のサブ群のそれぞれにおいて検査した。

【0184】

マウス一次ニューロン試料のｍｉＲＮＡアレイ研究。胚性１７日齢のＡｐｏＥ^-/-皮質ニューロンを、７日間、インビトロで、ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４一次アストロサイト培養物に由来する条件培地の存在下で培養した（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５、及びＺｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１３）（Ｎ＝３／群）。ｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＣＵＲＹ抽出キット（Ｅｘｉｑｏｎ Ｉｎｃ．）を使用して抽出し、次いで、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｈｉ－Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ｈｙ３／Ｈｙ５を使用して標識し、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｒｒａｙにおいてハイブリダイゼーションした。対照スパイクインオリゴヌクレオチドを使用する品質評価は、予想される範囲のシグナルを生成した 標識に成功したことを示した。グローバルＬｏｗｅｓｓ回帰アルゴリズムを使用するバックグラウンド補正後の定量化シグナルの正規化に続いて、教師なし及び教師ありデータ解析を実行した。マイクロＲＮＡプロファイリングは、ＡｐｏＥ３処置ニューロン対ＡｐｏＥ４処置ニューロン内で差次的に発現されるマイクロＲＮＡのサブセットを特定した。

【0185】

ｍｉＲＮＡ標的予測。ｍｉＲＮＡの標的を、１４個の異なるデータベースからの約５０００万個のヒト及びマウスデータ従うｍｉＲＮＡ－標的相互作用データベースであるＲパッケージｍｕｌｔｉＭｉＲ（Ｖ２．２．０）で予測した（Ｒｕ Ｙｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４）。

【0186】

ヒト脳及びＣＳＦ試料調製。等量の、ＮＩＨ脳及び組織リポジトリ（ＮＢＴＲ）からの死後ヒト頭頂皮質脳組織（正味重量で５０μｇ）、並びにＪａｍｅｓ Ｊ Ｐｅｔｅｒｓ ＶＡＭＣ研究（「Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ＡＤ ｉｎ ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒａｎｓ ｗｉｔｈ ＭＣＩ」）に登録された軽度認知機能障害（ＭＣＩ）対象及びＩｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ（ＩＳＭＭＳ）ＡＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒの参加者からの脳脊髄液（正味重量で１ｍｌ）を、研究のために使用した。

【0187】

動物モデル。５ｘＦＡＤバックグラウンドを有しないヒトＡｐｏＥ４^+/+若しくはＡｐｏＥ３^+/+ノックイン（ＫＩ）マウスモデル（Ｇｒｏｏｔｅｎｄｏｒｓｔ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｂｒａｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅａｒｎ Ｍｅｍ ２０１３、及びＷａｎｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ２００５）、又は５ｘＦＡＤバックグラウンドを有するヒトＡｐｏＥ４^+/+若しくはＡｐｏＥ３^+/+ ＫＩマウスモデル（Ｂａｌｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１９、及びＴａｉ ＬＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２０１７）の遺伝子型を同定した（Ｚｈｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ ２０１６）。生物学的変数としての性別を考慮して、雄性マウス及び雌性マウスの両方を、実験において含めた。

【0188】

リン脂質解析。試料を、脂質抽出に供し、続いて、アニオン交換ＨＰＬＣによる定量化を行った（Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３、及びＮａｓｕｈｏｇｌｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２）。

【0189】

マウスニューロン及びヒトｉＰＳＣ培養物。一次皮質ニューロンを培養し（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５、及びＺｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１３）、その後、共焦点顕微鏡法解析（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ）のために固定及び染色した（Ｂｅｒｇ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１０）。いくつかの条件において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）を、培養培地中に含めた（Ｎ＝３／群）。代替として、培養ニューロンを、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）含有ｍｉＲ－１９５－５ｐ若しくはｍｉＲ－３７４、又はスクランブル対照で、５日間トランスフェクトし、その後、解析に供した。ＡｐｏＥ４^+/+及びＡｐｏＥ３^+/+ ｉＰＳＣを、二重ＳＭＡＤ阻害、続いて、神経ロゼット選択、及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２曝露による前脳特異的パターニングによって、神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化させた（Ｂｏｗｌｅｓ ＫＲ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１９、及びＴｃｗ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７）。これらのＮＰＣを、ＭＡＣＳによって、ＣＤ２７１^-／ＣＤ１３３⁺について精製し（Ｂｏｗｌｅｓ ＫＲ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１９）、皮質ニューロン（Ｂａｒｄｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５、及びＰａｑｕｅｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１６）、及びアストロサイトの均質な集団（Ｔｃｗ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７、及びＳｈａｌｔｏｕｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１３）に分化させ、その後、ウイルストランスフェクション及び共焦点顕微鏡法解析に供した。代替として、ｓｙｎｊ１^+/+又はｓｙｎｊ１^-/-遺伝子型を有するＡｐｏＥ４^+/+及びＡｐｏＥ３^+/+ ＫＩマウスに由来するマウス皮質ニューロンを、ＡｐｏＥ４^+/+及びＡｐｏＥ３^+/+ ｉＰＳＣ由来純粋アストロサイトと共培養した。いくつかの実験において、培養ニューロンを、ＡＡＶ２含有ｍｉＲ－１９５－５ｐ、スクランブル対照、又はｍｉＲ－１９５－５ｐの標的ｍＲＮＡへのその結合を特異的に防止するｍｉＲ１９５阻害剤でトランスフェクトし、その後、ｉＰＳＣ由来アストロサイトと共培養した。次いで、培養ｉＰＳＣ由来ニューロン及びアストロサイトを、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄと、様々な期間インキュベートし、その後、固定し、共焦点顕微鏡解析（Ｚｅｉｓｓ）のために、ｐＴａｕ及び核マーカーＤＡＰＩ（青色）について二重染色した。Ｎ＝４～５／条件。

【0190】

脳定位注射及び行動研究。５ｘＦＡＤバックグラウンドを有しない（Ｎ＝１９～２３／群）又は５ｘＦＡＤバックグラウンドを有する（Ｎ＝１５～１７／群）８～９週齢の雄性及び雌性ＡｐｏＥ３^+/+及びＡｐｏＥ４^+/+ ＫＩマウスを、脳定位固定装置内に配置し、ＡＡＶ２又はスクランブルウイルスを、両側海馬脳領域の背側ＣＡ１領域内に、加圧注射を使用して投与した（Ｌａｂｏｎｔｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１７、及びＰａｓｓｉｎｉ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００６）。注射量（０．５～２．０μｌ）を、組織損傷を回避するために、１０分間にわたって送達した。ウイルス送達の６～９か月後に、マウスを、ＮＯＲタスクで試験した（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５、Ｅｌｄｅｒ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ２０１２、及びＨｏｗｌｅｔｔ ＤＲ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２００４）。マウスを、遺伝子型及び性別についてランダム化し、行動データ収集及び解析、手術操作、並びに試料収集にわたって盲検化した。合計探索時間が、４秒未満であった場合、又は動物が、行動試験を確実に完了することを妨げる疾病を有した場合、動物を行動解析から除外した。

【0191】

脳及びニューロン試料調製及び生化学解析。瞬間凍結マウス半脳又は培養ニューロンを、溶解緩衝液中で回収し（Ｌａｎｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０）、段階的可溶化を介して処理し（Ｌａｎｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０、及びＫａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１）、続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って、ｓｙｎｊ１、ｄｙｎ１、ｈｏｌｏＡＰＰ、及びＣＴＦのレベルを判定した。Ａβ₄₂、Ａβ₄₀、ｐＴａｕ、タウ、及びＡｐｏＥのレベルを、高感度ＥＬＩＳＡキットを使用して判定した。いくつかの組織を使用して、ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡを抽出し、続いて、ｑＰＣＲ及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。いくつかの動物は、アミロイドプラーク、ｓｙｎｊ１、及びｐＴａｕの免疫組織化学染色のために、灌流、続いて、脳組織切片を受けた。

【0192】

ｍｉＲ－１９５－５ｐ処置マウスについての差次的遺伝子発現解析。マウス脳から収集されたＲＮＡ－ｓｅｑ試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォームにおいてプロファイリングした。生成されたリードの品質管理を、ＦＡＳＴＱＣ（０．１１．８）を使用して実行した。生シークエンシングリードを、ＧＲＣｍ３８マウスゲノム（リリース９５）に、ｓｔａｒアライナ（Ｖ２．５．０ｂ）を使用してアライメントした。リードアラインメントに続いて、遺伝子発現を、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子モデルＧＲＣｍ３８．９５に基づいて、ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して、遺伝子レベルで定量化した（Ｌｉａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１４）。試料内の１００万当たり少なくとも１カウント（ＣＰＭ）を有する遺伝子を、発現されたと考え、したがって、更なる解析のために保持した。Ｍ値正規化法のトリム平均（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＭＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１０）を使用して、シークエンシングライブラリサイズ差について調整した。次いで、差次的発現解析を、品質管理及び正規化された遺伝子発現データにおいて、Ｒパッケージｌｉｍｍａ（Ｖ３．３４．０）を使用して実行した。比較を、性別及びＡＰＯＥ遺伝子型によって層別化された、ｍｉＲ１９５処置試料とスクランブル対照試料との間で実施した。複数の試験を、ＢＨ ＦＤＲ法を使用して調整した。

【0193】

機能エンリッチメント解析。機能エンリッチメント解析を、ヒトＲＯＳＭＡＰデータセットにおけるｍｉＲＮＡと有意に相関する遺伝子、目的の各ｍｉＲＮＡの予測標的遺伝子、及びｍｉＲ１９５－５ｐ処置マウスＲＮＡ－ｓｅｑデータセットから特定された差次的発現遺伝子について実施した。これらの遺伝子を、分子シグネチャーデータベース（ＭＳｉｇＤＢ ｖ６．１）に対して、フィッシャー正確検定及び遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を使用してクエリーした（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５）。

【0194】

抗体及び試薬。抗ｓｙｎｊ１（ウサギポリクローナルＡｂ、Ｎｏｖｕｓ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１０４７６５３）、抗ｐＴａｕ ＡＴ８及びタウ－５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２３６４７及び１０９８０６３１）、抗Ｒａｂ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６２８１９１）、抗βアクチン及びチューブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６６９７及び４７７４９８）、抗ｈｏｌｏＡＰＰ ＭＡＢ３４８及び６Ｅ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿９４８８２及び５６４２０１）、抗βアミロイド（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０５６５８５）、抗ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２９７８８５）、のための抗ダイナミンクローン４１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３９７６４１３）、抗マウス及びウサギＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５５６５４２及び２５４０６１８）、Ｔｅｘａｓ－Ｒｅｄ及びＡｌｅｘａ₅₅₅コンジュゲート抗マウス及びウサギＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０３７４７１３、１０９８３９４４、２５３５９８７、及び１０９０２７１）を購入した。ＡＡＶ２含有ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－３７４、スクランブル対照、及びｍｉＲ－１９５阻害剤を、産生し入手可能な詳細な配列情報（Ａｍ００１００、Ａｍｍ１０１７２００、及びＡｍｍ３０２６７００）を、ＡＢＭ Ｉｎｃ．から得た。特定のｍｉＲＮＡのためのｍｉＲＮＡ抽出キット及びｑＰＣＲプローブを、Ｅｘｉｑｏｎ Ｉｎｃ．から購入した。また、アクチン（Ｈｓ１０６０６６５＿ｇ１）、ｓｙｎｊ１（Ｈｓ００９５３２３４＿ｍ１及びＭｍ０１２１０５３９＿ｍ１）、ｇａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）、ＲＮＵ６Ｂ（ＮＲ＿００２７５２）、１８ｓ及び４５ｓ（４３３１１８２、Ｍｍ０３９２８９９０＿ｇ１）のためのｑＰＣＲプローブを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。

【0195】

統計解析。各実験の試料サイズを、統計的に有意な結果を達成するために必要とされる群サイズの判定を可能にする以前の類似の研究から導出された冪乗計算に基づいて選択した。対照を含む実験は、ランダムに割り当てられた群において実行した。実験者は、実験を実施する間、動物の実験条件に対して盲検化された。定量化が完了した後に、条件を明らかにした。ｍｉＲ－１９５－５ｐ及びｍｉＲ－３７４のレベルを、Ｕ６及びＲＮＵ６Ｂ（内部対照）に正規化し、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡを、ＧＡＰＤＨ及び１８ｓに正規化し、次いで、対照と比較して、Ｌｏｇ₂倍率変化として表した。ｓｙｎｊ１、ｄｙｎ１、ｐＴａｕ、タウ、及びｈｏｌｏＡＰＰのレベルを、β－アクチンレベルに正規化し、対照の百分率として表した。絶対Ａβ₄₂、Ａβ₄₀、ｐＴａｕ、タウ、及びＡｐｏＥ濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量的に判定し、対照の百分率として表した。独立試料ｔ検定を使用して、有意平均差（有意性についての閾値をｐ＜０．０５に設定）を判定した。ＡＮＯＶＡ及び事後検定を使用して、多重比較のための群差を判定した。ピアソン相関係数を計算して、２つの変数間の線形関係を判定した。等分散性を、統計的比較のために確認した。独立試料ｔ検定を使用し、比較群の等分散性が同じでなかったときに、ウエルチ補正を適用した。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ８．０を使用して実行した。

【0196】

結果。ｍｉＲ－１９５を、ＡＰＯＥ制御的ｓｙｎｊ１発現に関与する最上位候補ｍｉＲＮＡとして特定する。最初に、差次的発現解析を、ＲＯＳＭＡＰデータセットにおけるヒトｍｉＲＮＡプロファイル上のＡｐｏＥ４^-/-（ε３／ε３；Ｎ＝１１１）キャリアとＡｐｏＥ４^+/-（ε３／ε４；Ｎ＝２４）キャリアとの間で実行した。１６個の有意に差次的に発現されたｍｉＲＮＡ（ｐ＜０．０５）を特定し、それらのうちの１２個は、ＡｐｏＥ４^+/-キャリアにおいて、低減された発現を有した（図１Ａ）。並行して、ＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４条件培地（ＣＭ）で処置されたＡｐｏＥ^-/-海馬ニューロンのｍｉＲＮＡアレイ研究を実行した（図１Ａ）。３０個の有意に差次的に発現されたｍｉＲＮＡ（ｐ＜０．０５）を特定し、それらのうちの１５個は、ＡｐｏＥ４処置条件下で、低減された発現を有した（図６Ａ）。これらのｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ－１９５は、ＡｐｏＥ４⁺条件とＡｐｏＥ４^-条件との間の差次的発現ｍｉＲＮＡであり、これは、ヒトデータセットとマウスデータセットとの間で共通して共有される（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐ及びｍｍｕ－ｍｉＲ－１９５ａ－５ｐ；図１Ｂ）。また、別のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１５５を、ヒトデータセット及びマウスデータセットの両方において特定する（ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５及びｍｍｕ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ）が、逆の傾向（ヒトＡｐｏＥ４^+/-キャリアにおいてより高く、マウスＡｐｏＥ４処置条件においてより低い）で特定する。

【0197】

次に、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡと推定的に結合するｍｉＲＮＡの予測を、１４個のコンパイルされたｍｕｌｔｉＭｉＲデータベースを使用して実行した（Ｒｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４；４２（１７）：ｅ１３３－ｅ１３３）。ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡにおいて標的とされる合計３９２（ヒト）個／１９４（マウス）個のｍｉＲＮＡ（図１Ａ）から、ｍｉＲ－１９５－５ｐを、ヒトｍｉｒＤＢデータベースにおける最上位候補として予測した（Ｗｏｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５、及びＷａｎｇ Ｘ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１６）（予測スコア：９９．９／１００）。また、ｍｉＲ－１９５を、ｅｌｍｍｏ（予測スコア：０．８０／１）及びｄｉａｎａ＿ｍｉｃｒｏ（予測スコア：０．７９／１）などのいくつかの他のデータベース（図６Ｂ）における、ｓｙｎｊ１において標的とされる最上位候補ｍｉＲＮＡとして予測した。

【0198】

更に、ＲＯＳＭＡＰデータセットにおけるｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡとの間の相関を、スピアマン相関検定を使用して検査した。ｍｉＲ－１９５－５ｐは、ヒト対象のｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルと負相関する（図１Ｃ：ｒ＝－０．１１５、ｐ＝０．００９３）。類似して、ｍｉＲ－１９５－５ｐとｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルとの間の負相関が、雌性対象において見られる（ｒ＝－０．１６７、ｐ＝０．００２６）及びＡｐｏＥ３^+/+キャリア（ｒ＝－０．１２７、ｐ＝０．０２７）。負相関傾向が、ＡｐｏＥ４^+/-キャリアにおいても見られるが、統計的有意性はなく（ｒ＝－０．１７８、ｐ＝０．０５７）、これは、ＡｐｏＥ４アレルの存在下でのｍｉＲ－１９５とｓｙｎｊ１との間のネットワーク制御の衰弱又は混乱の可能性を示唆する。別個に、ｍｉＲ－３７４ｂもまた、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡと負相関を示した（ｒ＝－０．０９、ｐ＝０．０４）。加えて、ｍｍｕ－ｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐは、ＡｐｏＥ３処置条件とＡｐｏＥ４処置条件との間で差次的に発現されるが、ヒトＡｐｏＥ４^+/-キャリアとＡｐｏＥ４^-/-キャリアとの間のｈｓａ－ｍｉＲ－３７４－５ｐレベルの差は、統計的に有意でない（ｐ＝０．１８８）。

【0199】

分子経路をより良好に理解するために、ｍｉＲ－１９５－５ｐが制御する、ＲＯＳＭＡＰデータセットにおける、予測ｍｉＲ－１９５－５ｐ標的遺伝子の機能及びｍｉＲ－１９５－５ｐと有意に相関するものの機能を調査した。標的遺伝子及びｍｉＲ－１９５－５ｐと負相関する遺伝子についての最上位のエンリッチされた機能は、ニューロン及びシナプス機能の制御、ニューロン新生、及び分化を含み、ｍｉＲ－１９５－５ｐと正相関する遺伝子の機能は、循環系及び脈管構造発達においてエンリッチされる。

【0200】

まとめると、これらの結果は、ＡｐｏＥ－ｓｙｎｊ１－ＰＩＰ₂経路の制御における最上位候補ｍｉＲＮＡとしてのｍｉＲ－１９５－５ｐの役割を示す。

【0201】

脳ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減は、ＡｐｏＥ４遺伝子型、疾患進行、及び認知低下に関連する。ＡｐｏＥ４^+/-キャリアとＡｐｏＥ４^-/-キャリアとの間のｍｉＲ－１９５の差次的発現パターンを検証するために、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを、ヒト脳組織及びＣＳＦ試料内で検査した。ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、０．５～１の臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）スコアを有するＡｐｏＥ４^+/-軽度認知機能障害（ＭＣＩ）及び早期ＡＤ対象に由来する頭頂皮質組織内で、ＡｐｏＥ４^-/-ドナーにおけるレベルと比較して低減されたことが見出された（図２Ａ）。興味深いことに、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減のパターンは、正常老化からＭＣＩ及び早期ＡＤへの疾患進行と伴って観察され（図２Ｂ）、これは、早期ＡＤ発症におけるＰＩＰ₂及びホスホイノシトール（ＰＩ）変化で以前に見られたもの（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）と類似であった。ｍｉＲ－１９５－５ｐの有意な低減は、雌性対象において、雄性対象と比較して見出され（図７Ａ）、差が、雄性ＡｐｏＥ４^-/-対象対雌性ＡｐｏＥ４^+/-対象の間にも認められた。一貫して、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルの相互上昇が、ＡｐｏＥ４^+/-対象において、ＡｐｏＥ４^-/-対象におけるレベルと比較して観察された（図７Ｂ）。正相関が、ＣＤＲ０．５～１を有するＡｐｏＥ４^-/-キャリアの脳ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルとＰＩＰ₂レベルとの間で認められ、正相関傾向が、ＡｐｏＥ遺伝子型にかかわらず、ＣＤＲ０～１の対象において見られた（図７Ｃ）。相関関係は、脳ｍｉＲ－１９５－５ｐと、他のリン脂質種、例えば、ＰＩ及びホスホイノシトールホスフェート（ＰＩＰ）との間で見られなかった。相関は、脳ｍｉＲ－１９５－５ｐと、他の変数、例えば、死後間隔（ＰＭＩ）及び年齢との間で見られなかった。負相関が、ＣＤＲ０．５～１のコホートの、脳ｍｉＲ１９５と、ｍｉＲ－１９５の別の既知の標的であるベータセクレターゼ１（ＢＡＣＥ－１）（Ｚｈｕ ＨＣ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ２０１２）発現との間で観察された（図８Ｄ）。しかしながら、ｍｉＲ－１９５レベルとＡβレベルとの間の相関は観察されなかった。

【0202】

ヒトｍｉＲ－３７４レベルの統計的有意差が、ＡｐｏＥ４^+/-対象とＡｐｏＥ４^-/-対象との間であった（ｈｓａ－ｍｉＲ３７４－５ｐ；図８Ａ）。しかしながら、疾患進行に伴うｍｉＲ－３７４レベルの有意な変化は、ＭＣＩ期における一過性上昇を除いてなかった（図８Ａ）。ＲＯＳＭＡＰデータと一貫して、ＡｐｏＥ４^+/-対象のヒトｍｉＲ－１５５レベルの統計的有意差及びより高いレベルが観察された（ｈｓａ－ｍｉＲ１５５－５ｐ；図８Ｂ）。有意差は、ｍｉＲ－１５５レベルにおいて、疾患進行に伴って見られなかった。また、有意差は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ又はｍｉＲ－３７４レベルにおいて、正常老化又は進行したＡＤ（ＣＤＲ０又は３以上）のいずれかのＡｐｏＥ４^+/-対象とＡｐｏＥ４^-/-対象との間で見られなかったが、これは、ＡｐｏＥ４遺伝子型による早期疾患発症及び加速へのｍｉＲ－１９５－５ｐの機能的関与を示唆する。

【0203】

ＣＤＲ０．５（臨床検査及び神経心理学的評価によって定義されたＭＣＩ）を有するＭＣＩ対象のコホートからの脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を使用して、ＣＳＦ ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、精神状態短時間検査によって測定された認知パフォーマンスと正相関し（ＭＭＳＥ、図２Ｃ）、総タウレベルと負相関する（図２Ｄ）ことが見出された。ＣＳＦ ＰＩＰ₂レベルは、検出可能な範囲未満であり、正相関が、ＣＳＦカルジオリピンとｍｉＲ－１９５－５ｐとの間に見られた（図８Ｃ）が、これは、ミトコンドリア機能へのｍｉＲ－１９５－５ｐの潜在的な関与を示唆する（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ－Ｃａｒｄｏｓｏ ＶＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１５、及びＣｈｉｃｃｏ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００７）。

【0204】

まとめると、これらの結果は、脳及びＣＳＦ ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減が、早期ＡＤ発症中のＡｐｏＥ４遺伝子型、認知低下、及びタウ病的状態に関連することを示す。

【0205】

ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現は、ＡｐｏＥ４マウス脳及び培養ニューロン内で低減される。次に、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの差が、マウスモデル及び一次ニューロン内で再現され得るかを調査した。ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルは、１２か月齢のＡｐｏＥ４^+/+マウス脳内で、ＡｐｏＥ３^+/+マウスと比較してより低いこと（図３Ａ）が見出された。ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの名目低減は、ＡｐｏＥ^-/-脳内で見られた。類似して、ｍｉＲ－３７４は、ＡｐｏＥ４^+/+マウス脳内で、ＡｐｏＥ３条件及びＡｐｏＥ^-/-マウスの名目低減と比較して減少した（図９Ａ）。培養ＡｐｏＥ^-/-海馬ニューロン内で、ｍｉＲ－１９５－５ｐのレベルは、アストロサイトからのＡｐｏＥ４ ＣＭで、ＡｐｏＥ３ ＣＭを有するものと比較して一貫してより低かった（図３Ｂ）。名目差が、ＡｐｏＥ４ ＣＭで処置されたニューロン内のｍｉＲ－３７４レベルにおいて、ＡｐｏＥ４ ＣＭで処置されたものと比較して認められたが（図９Ａ）、試料のうちの大きい変動に起因して、統計的有意性を達成することができなかった。

【0206】

ＡｐｏＥ受容体の阻害剤であるＡｐｏＥ受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の処置（ＬａＤｕ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００１、及びＱｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４）は、ｍｉＲ－１９５－５ｐの差次的発現パターンを、対照（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）に対して消失させた。ＡｐｏＥ３－ＣＭの存在下でのＲＡＰ処置は、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減を導き（図３Ｃ）、ＡｐｏＥ４－ＣＭ処置条件下において、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、ベースラインにおいてはるかにより低く、ＲＡＰ処置後に改善の傾向があった。これらの結果は、アストロサイト由来ＡｐｏＥが、ニューロン上のＡｐｏＥ受容体に結合して、ニューロンｍｉＲ－１９５－５ｐの変化を導く可能性があり、ＡｐｏＥ４が、ニューロンｍｉＲ－１９５－５ｐ発現への機能喪失効果を示すことを示唆する。

【0207】

次に、ＡｐｏＥ４条件におけるｍｉＲ－１９５－５ｐの上方制御が、ｍｉＲ－１９５－５ｐの予測標的遺伝子であるｓｙｎｊ１の発現レベルを調節することができるかを判定した。ｍｉＲ－３７４ではなく、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ＡｐｏＥ４ ＣＭで処置されたＡｐｏＥ^-/-ニューロン内のｓｙｎｊ１タンパク質レベルを有意に低減した（図３Ｄ；ｍｉＲ－１９５－５ｐでのｓｙｎｊ１レベル：対照の６２．８７±４．４８％、ｐ＝０．００１；ｍｉＲ－３７４でのｓｙｎｊ１レベル：対照の１０２．４±７．７７％、ｐ＝０．９３）。変化は、別のエンドサイトーシスアダプタータンパク質であるダイナミン１の発現レベルにおいて見られなかった（ｄｙｎ１；図９Ｂ）が、これは、ｓｙｎｊ１発現へのｍｉＲ－１９５－５ｐの特異的効果を示唆する。類似して、ＡｐｏＥ３^+/+又はＡｐｏＥ４^+/+ニューロン内のｍｉＲ－１９５過剰発現は、ｓｙｎｊ１発現低減を、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方においてもたらした（図９Ｃ及び図９Ｄ）。ＡｐｏＥ４^+/+ニューロンは、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現で、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ（ｍｉＲ－１９５－５ｐを有するＡｐｏＥ３^+/+ ｌｏｇ₂ＦＣ：－１．０８４±０．０３５対ｍｉＲ－１９５－５ｐを有するＡｐｏＥ４^+/+ ｌｏｇ₂ＦＣ：－７．７５１±０．０４３；図９Ｃ）、及びタンパク質レベル（ｍｉＲ－１９５－５ｐを有するＡｐｏＥ３^+/+ 対照の７０．９±２１．２％対ｍｉＲ－１９５－５ｐを有するＡｐｏＥ４^+/+ 対照の４８．０±９．８４％；図９Ｄ）において、ＡｐｏＥ３^+/+ニューロンよりも劇的な変化を示したが、これは、おそらく、ＡｐｏＥ４^+/+細胞内のはるかにより低いベースラインレベルにより、ＡｐｏＥ４^+/+細胞が、ｍｉＲ－１９５－５ｐ操作により感受性があったことに起因したことに留意されたい。

【0208】

ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ＡｐｏＥ４マウスモデルの認知欠損をレスキューし、ＡＤ関連病的状態を寛解させる。次に、過剰発現ｍｉＲ－１９５－５ｐが、ＡｐｏＥ４関連認知機能不全をインビボでレスキューすることができるかを、ＡＤトランスジェニックバックグラウンドを有しない又は有するＡｐｏＥ４^+/+及びＡｐｏＥ３^+/+ ＫＩマウスを使用して判定した。雄性ヒトＡｐｏＥ４^+/+ ＫＩマウスが、新規物体認識（ＮＯＲ）試験によって測定された場合、記憶機能障害を示し、新規物体と慣れた物体とを区別することができなかったことが以前に実証された²⁶。ここで、ＡｐｏＥ４^+/+ ＫＩマウスは、新規物体を探索する時間が、ＡｐｏＥ３^+/+ ＫＩマウスよりも少ないことが見出された（図４Ａ 選好指標：ＡｐｏＥ４^+/+対ＡｐｏＥ３^+/+スクランブル対照：４２．９％対６１．７％、ｐ＝０．０３２）が、これは、以前の観察²⁶と一貫する。この欠損は、ＡｐｏＥ４^+/+ ＫＩマウスのｍｉＲ－１９５－５ｐ両側海馬のウイルス送達によって完全に消失した（図４Ａ、ＡｐｏＥ４^+/+スクランブル対照と比較して、６１．５％、ｐ＝０．０２３）。しかしながら、統計的有意差は、スクランブルとｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現ＡｐｏＥ３^+/+動物との間で見られなかった。また、新規物体対慣れた物体についての探索時間の差を使用する識別指標研究（Ａｎｔｕｎｅｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ２０１２）は、一貫した結果を示し、結果は、ＡｐｏＥ４^+/+ ＫＩマウスの識別行動の機能障害が、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現によって完全にレスキューされた（図４Ａ 識別指標：ＡｐｏＥ４^+/+対ＡｐｏＥ３^+/+スクランブル対照：－０．１４４対０．２３４、ｐ＝０．０３３；ＡｐｏＥ４^+/+スクランブル対照対ＡｐｏＥ４^+/+ ｍｉＲ－１９５－５ｐ：－０．１４４対０．２３１、ｐ＝０．０２４）ことを示唆した。探索時間の総量は、群のうち、同等であった。

【0209】

過剰発現ｍｉＲ－１９５はまた、ＡｐｏＥ４マウス脳内の脳ホスホ－タウ（ｐＴａｕ）レベルを低減した（図４Ｂ；ＡｐｏＥ４^+/+スクランブル対照対ＡｐｏＥ４^+/+ ｍｉＲ－１９５－５ｐ：対照の８１．３対３９．１％、ｐ＝０．０４）。一貫して、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡのレベル及びタンパク質レベルが、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現を有するＡｐｏＥ４^+/+マウス脳内で低減された（図１０Ａ）。ｐＴａｕ、ｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ、及びタンパク質レベルの低減の傾向が、より少ない程度でなく、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現を有するＡｐｏＥ３^+/+マウスにおいて見られた。有意な変化は、内因性Ａβ₄₀、Ａβ₄₂、又はＡｐｏＥレベルにおいて、ＡｐｏＥ４^+/+又はＡｐｏＥ３^+/+マウス脳内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現で見られなかった（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。ｑＰＣＲは、ウイルス操作後に、上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを確認した（図１０Ｄ）。

【0210】

類似の実験を、ＡＤ関連病理学的神経炎症性行動表現型が４～８か月齢で出現した、５ｘＦＡＤバックグラウンドを有するＡｐｏＥ４^+/+又はＡｐｏＥ３^+/+マウスモデルにおいて実行した（Ｂａｌｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１９、及びＴａｉ ＬＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２０１７）。性的二形応答が、これらのマウスモデルにおいて認められ、雄性ＡｐｏＥ４^+/+ＦＡＤマウスが、ｍｉＲ－１９５－５ｐ操作に最も感受性があった（図４Ｃ 選好指標：ＡｐｏＥ４^+/+ＦＡＤスクランブル対照対ｍｉＲ－１９５－５ｐ：３７．８％対６３．１％、ｐ＝０．０１；識別指標：ＡｐｏＥ４^+/+スクランブル対照対ｍｉＲ－１９５：－０．２４５対０．２６２、ｐ＝０．０１６）。また、ｐ－Ｔａｕ低減が、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現を有するＡｐｏＥ４^+/+ＦＡＤマウスにおいて観察された（図４Ｄ及び図１０Ｅ）。類似の変化が、ＡｐｏＥ４^+/+ＦＡＤ ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現マウス脳内の総タウレベルにおいて見られた。ＡｐｏＥ４^+/+及びＡｐｏＥ３^+/+ＦＡＤマウス脳内の、ＥＬＩＳＡによって測定された脳オリゴマーＡβ₄₂（図４Ｅ）、並びにプラーク数及びプラーク密度によって判定されたアミロイドプラーク負荷（図４Ｆ）の劇的低減が、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現で見出された。しかしながら、有意な変化は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現後に、可溶性Ａβ₄₀、Ａβ₄₂（図１０Ｆ）、ｈｏｌｏ－ＡＰＰ、又はＢＡＣＥ－１のレベルにおいて見られなかった。

【0211】

また、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現が、ＥＦＡＤマウス脳内の遺伝子発現パターン及び下流経路の変化を導くかを検査した。同様に、最も差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）は、ニューロン、シナプス、及び免疫機能の制御においてエンリッチされる。更なるＧＳＥＡ研究Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５；１０２（４３）：１５５４５－１５５５０）は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現によって混乱した最上位経路が、ミトコンドリア機能関連経路であると示唆したが、これは、ｍｉＲ－１９５－５ｐと負相関する遺伝子についてのエンリッチされた最上位経路が、ミトコンドリア機能に関与するという、ヒト脳データセットにおける研究と一貫する。

【0212】

まとめると、これらの結果は、ＡＤバックグラウンドを有しないＡｐｏＥ４マウスモデル及びＡＤバックグラウンドを有するＡｐｏＥ４マウスモデルの上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐレベルが、ＡｐｏＥ４及びＡＤ関連認知欠損及び病理学的変化をレスキューすることができることを示唆する。

【0213】

ＡｐｏＥ４ ＡＤ対象のｉＰＳＣ由来脳細胞内のｍｉＲ－１９５エンドリソソーム異常の過剰発現。次に、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを操作することが、ＡＤ関連病的状態を寛解させることができるかを、ＡｐｏＥ４^+/+ ＡＤ対象及びＡｐｏＥ３^+/+正常老化対象からのヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロン及びアストロサイト共培養物を使用して調査した（ＴＣＷ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７１３３６２）。ベースラインにおいて、ＡｐｏＥ４^+/+ニューロン（ヒトｉＰＳＣ又はマウス）は、ＡｐｏＥ３^+/+対応物と比較して、各細胞内の拡大したリソソーム及びリソソームの増加した数を示した（図５Ａ～図５Ｃ）。面積によって測定されたリソソームの平均サイズは、ＡｐｏＥ４^+/+ニューロン内で１６３．５μｍ²対ＡｐｏＥ３^+/+ニューロン内で９０．４μｍ²であった（図５Ｃ、ｐ＜０．００００１）。４６．７％のＡｐｏＥ４^+/+ニューロンが、１０～２０μｍの範囲のリソソームの直径を有し、６６．１％のＡｐｏＥ３^+/+ニューロンが、０～１０μｍの範囲のリソソームの直径を有した。１８．４％のＡｐｏＥ４^+/+ニューロンが、１０個超のリソソーム／細胞を有し、１．６％のＡｐｏＥ３^+/+ニューロンが、１０個超のリソソーム／細胞を有した。ＡｐｏＥ４^+/+ニューロン内のｍｉＲ－１９５の過剰発現は、リソソームサイズの有意な低減を導いた（１０９．９μｍ²、ｐ＜０．００００１）。ｍｉＲ－１９５過剰発現後のＡｐｏＥ４^+/+ニューロン内のリソソームの直径及び１細胞当たりのリソソームの数（０～１０μｍの範囲の直径を有する５３．３％のニューロン；１０個超のリソソーム／細胞を有する１．７％のニューロン）はまた、ベースラインにおいて、ＡｐｏＥ３^+/+ニューロン内のリソソーム表現型へシフトした。対照的に、ｍｉＲ－１９５阻害剤での処置は、ＡｐｏＥ４^+/+ニューロンのリソソーム表現型を悪化させ（平均サイズ：２０５．４μｍ²、ｐ＜０．００００１）、１細胞当たりのリソソームの数を増加させた（３０μｍ超のリソソームの直径を有する４０％のニューロン；１０個超のリソソーム／細胞を有する２５％の細胞）。有意差は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現又は阻害で処置されたＡｐｏＥ３^+/+ニューロン内で、ベースラインと比較して見られなかった。蛍光染色（図１１Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図１１Ｂ）によって実証された場合、ｐＴａｕレベルは、過剰発現ｍｉＲ－１９５－５ｐで低減され、ｍｉＲ－１９５－５ｐ阻害で増加した。

【0214】

ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルはまた、ＡｐｏＥ４^+/+ ＡＤ対象からの培養ｉＰＳＣ由来アストロサイト内で、ＡｐｏＥ３^+/+正常老化（ＮＡ）ｉＰＳＣ由来アストロサイト内のものと比較してより低かった（図１１Ｃ、ｐ＝０．００２）。リソソームへのｍｉＲ－１９５－５ｐ阻害剤の効果はまた、ＡｐｏＥ４^+/+アストロサイト内で見られ得、ＡｐｏＥ４^+/+アストロサイトは、リソソームの平均サイズの有意な増加を有し（図１１Ｄ、対照対ｍｉＲ－１９５－５ｐ阻害剤処置 ３６．５μｍ²対６７．７μｍ²、ｐ＜０．００００１；図１１Ｅ ３０μｍ超のリソソームの直径を有する８．３％の対照アストロサイト対１７．６％のｍｉＲ－１９５－５ｐ阻害剤処置）。しかしながら、有意差は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ処置ＡｐｏＥ４^+/+アストロサイトのリソソームにおいて、対照と比較して見られなかったか、又はＡｐｏＥ４^+/+アストロサイトとＡｐｏＥ３^+/+アストロサイトとの間で、ベースラインにおいて見られなかった。

【0215】

類似の実験を、ＡｐｏＥ４^+/+ ｉＰＳＣ由来アストロサイトと共培養されたマウスｓｙｎｊ１^+/+及びｓｙｎｊ１^-/-ニューロンを使用して、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現の存在又は非存在下で実行した。ｓｙｎｊ１の遺伝子ノックアウトは、リソソーム表現型への、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現と類似の効果を示したことが見出された。リソソームの平均サイズは、ｓｙｎｊ１^+/+ニューロン内で１０１．５μｍ²対ｓｙｎｊ１^-/-ニューロン内で７７．０μｍ²であった（図１１Ｆ、ｐ＜０．００００１）。ｍｉＲ－１９５過剰発現で、リソソームのサイズは、ｓｙｎｊ１^+/+ニューロン内で７５．８μｍ²に低減された（ｐ＜０．００００１）。しかしながら、ｓｙｎｊ１^-/-ニューロン内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、いずれの相加効果も示さなかった（６９．７μｍ²）が、これは、ｍｉＲ－１９５－５ｐが、実際に、その標的遺伝子であるｓｙｎｊ１を介して作用して、ＡＤ関連リソソーム異常をレスキューすることを示唆する。

【0216】

まとめると、これらの結果は、ヒトｉＰＳＣ由来ＡｐｏＥ４^+/+ ＡＤ脳細胞内の上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐレベルが、リソソーム異常をレスキューすることができ、ｍｉＲ－１９５－５ｐの阻害が、これらの表現型を悪化させ得ることを示す。

【0217】

考察。ＡＤは、複雑な多因子神経変性プロセスであり、証拠の蓄積は、ＡＤ病因におけるｍｉＲＮＡの重要性を示す。本明細書に記載される研究は、ＡｐｏＥ４関連病的状態へのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１９５－５ｐの機能的関与を特徴付ける。より重要なことに、これらのデータは、ＡＤ発症に寄与するＡｐｏＥ４遺伝子型関連認知及びリソソーム異常におけるｍｉＲ－１９５－５ｐの制御役割を明らかにする。

【0218】

脳ｍｉＲＮＡの調節不全は、ＡＤのヒト対象及びマウスモデルにおいて記載されており、Ａβ依存性及びＡβ非依存性経路の関与が提唱されている（Ｇｏｏｄａｌｌ ＥＦ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３、Ｌｕｋｉｗ ＷＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００７、及びＳｉｅｒｋｓｍａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ ２０１８）。本明細書に記載される研究は、ＡＤ発症中のｍｉＲ－１９５－５ｐ低減を実証し、これは、早期疾患進行と相関するが、ＡＤの進行期と相関しない。ＡｐｏＥ４遺伝子型は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ低減を加速し、これは、認知低下及び増加したタウ病的状態と一致する、（図２）。ホスホイノシトール（ＰＩ）代謝産物の変化のパターンは、正常老化から早期ＡＤへの疾患転換と相関した（Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）。本明細書に開示される結果は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ変化が脳ＰＩＰ₂レベルの変更と一致することを更に示す（図７Ｃ）。これらの知見は、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを代替バイオマーカーとして使用して、脳ＰＩＰ₂ホメオスタシス及び認知パフォーマンスをモニタリングし、早期ＡＤ発症及び進行を検出することを強調する。

【0219】

ヒトデータセット及びマウストランスクリプトームデータセットの機能エンリッチメント研究は、神経及びシナプス機能、ニューロン新生、及び分化の制御におけるｍｉＲ－１９５－５ｐの役割を示す。データは、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルをインビボで回復することが、ＡｐｏＥ４関連認知欠損をレスキューし（図４Ａ及び図４Ｃ）、アミロイドプラーク負荷（図４Ｅ及び図４Ｆ）及びｐＴａｕレベル（図４Ｂ及び図４Ｄ）を寛解させ、培養ヒトｉＰＳＣ由来脳細胞内のリソソーム異常を改善する（図５）ことを示す。ＡｐｏＥ ＫＩマウスモデルの内因性マウスＡβの低減（図１０Ｂ）又はＥＦＡＤマウスの可溶性Ａβレベルの低減（図１０Ｆ）は見出されなかったが、オリゴマーＡβレベル及びプラーク負荷の劇的減少が、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現で観察された（図４Ｅ及び図４Ｆ）。加えて、負相関が、ヒト脳組織内のｍｉＲ－１９５とＢＡＣＥ１発現との間で見出された（ｒ＝－０．５１６、ｐ＝０．００４；図７Ｄ）が、これは、以前の報告（Ｚｈｕ ＨＣ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ２０１２）と一貫する。しかしながら、ＢＡＣＥ－１レベルの変化は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現で見られなかった。まとめると、これらのデータは、ｓｙｎｊ１低減がＡβのリソソームクリアランスを加速するという以前の報告（Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１３）で示されているように、ｍｉＲ－１９５－５ｐが、Ａβ産生の代わりに、Ａβクリアランスを制御する可能性が最もあり、リソソーム機能の回復が、これらのプロセスを容易にし得ることを示唆する。

【0220】

また、ｐＴａｕレベルの制御におけるｍｉＲ－１９５－５ｐの機能的役割が示され（図４、並びに図１１Ａ及び図１１Ｂ）、これは、ｓｙｎｊ１の下方制御が、軽度ＴＢＩ誘導性タウ過剰リン酸化を防止するという最近の知見（Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７）と一貫する。タウのエクソソーム分泌は、ｍｉＲＮＡによって制御され得るタウ拡散において重要な役割を果たし得ることが以前に報告された（Ａｓａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１５）。ｍｉＲ－１９５－５ｐは、リソソーム経路を介するクリアランスの機能障害及び／又はエクソソーム分泌経路を介する拡散の加速に二次的なタウ病的状態の調節において重要な役割を果たし得る。

【0221】

結果は、ＡｐｏＥアイソフォームによるｍｉＲ－１９５－５ｐ発現の差次的制御が、ニューロン上のＡｐｏＥ受容体への結合を介して媒介され、ＡｐｏＥ４遺伝子型は、ｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを制御する能力を失うことを示す（図３Ｃ）。加えて、ＡｐｏＥ４のようにより低いｍｉＲ－１９５－５ｐ発現を有するＡｐｏＥ^-/-を示すこれらのデータ（図３Ａ）は、増加したｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を導く、ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現へのＡｐｏＥ４の機能喪失効果を更に支持する。ｓｙｎｊ１^-/-ニューロン内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、リソソーム拡大へのいずれの相加効果も示さず（図１１Ｆ）、これは、ｍｉＲ－１９５が、その標的遺伝子であるｓｙｎｊ１を介して、ＡＤ関連表現型をレスキューするという概念を更に強化する。ＡｐｏＥ４^+/-キャリアは、ＡｐｏＥ４^-/-対象よりも、ｍｉＲ－１９５－５ｐ操作への高い感受性を示し（図４及び図１０、図５及び図１１）、おそらく、これは、はるかにより低いベースラインｍｉＲ－１９５－５ｐレベルに起因することに留意されたい。更に、ＡｐｏＥ４^+/-条件とＡｐｏＥ４^-/-条件との間のｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの差は、ニューロン内で、かつアストロサイトなどの他の脳細胞内で見られる（図１１Ｃ）。ｍｉＲ－１９５－５ｐの細胞型特異的変化は、疾患病因の異なる態様に寄与し得る。これらのデータは、ニューロンｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減が、認知及びシナプス機能不全に寄与し、アストロサイトｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの低減が、タウ蓄積及び拡散の加速を導く、分泌経路の異常において役割を果たすことを示す。

【0222】

また、ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現への性的影響を検査した。ＲＯＳＭＡＰデータセットにおいて、ＡｐｏＥ４^+/-キャリアとＡｐｏＥ４^-/-キャリアとの間のｍｉＲ－１９５－５ｐレベルの差は、脳ＰＩＰ₂ホメオスタシスへの性別特異的効果の以前の報告（Ｚｈｕ Ｌｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５）と類似して、雌性対象において存続する（図１Ｂ）。また、性的二形性が、ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現において認められ、雌性対象において、特に、ＡｐｏＥ４^-/-キャリアにおいて、はるかに低いレベルで認められる（図７Ａ）。ＥＦＡＤマウスはまた、ｍｉＲ－１９５－５ｐ操作への性的二形応答を示し、改善された認知機能及び低減されたオリゴマーＡβレベルは、雄性ＥＦＡＤマウスにおいて示されるが、雌性ＥＦＡＤマウスにおいて示されない（図４Ｃ及び図４Ｅ）。また、ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現及びｓｙｎｊ１ ｍＲＮＡレベルの年齢関連変化が、ＡｐｏＥ ＫＩ及びＥＦＡＤマウス脳内で認められており、差次的発現は、ＡｐｏＥ４^+/+マウスとＡｐｏＥ４^-/-マウスとの間でより顕著であり、より若い年齢と比較して、１２か月齢でより顕著であり、ＥＦＡＤマウスのｍｉＲ－１９５－５ｐの差は、４か月齢で既に明らかであり、これは、ＡｐｏＥ遺伝子型関連ｍｉＲ－１９５－５ｐ変化が、老化及び／又はＡＤ病的状態の出現によって悪化され得ることを示唆する。

【0223】

ＡＤは、多面的疾患プロセスとして出現するが、ネットワーク及び経路の調節不全を複数のレベルで回復させるために特定のｍｉＲＮＡを標的とすることは、将来の薬物開発のための有望な手段を提供し得る。ＡｐｏＥ４に向けられた治療戦略は、いくつかの前臨床及び臨床研究において、例えば、免疫療法、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療、遺伝子編集、ＡｐｏＥ発現の調節因子、及びＡｐｏＥ脂質化を亢進し、その構造を補正し、受容体結合を競合し、ＡｐｏＥ－Ａβ相互作用を阻害するための小分子において探求されており、積極的に探求されている（Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ ２０１８、及びＷｉｌｌｉａｍｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ ２０２０）。ここでの知見は、ＡｐｏＥ４病原性機能を、ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－１９５－５ｐによって、脳ＰＩＰ₂脂質シグナル伝達経路を介して調節し、Ａβ及びタウ病的状態への影響に加えて複数の有益な効果を有する治療方向を示す。

【0224】

要約すると、これらの研究は、脳ｍｉＲ－１９５－５ｐ発現のＡｐｏＥ４遺伝子型特異的変化と、脳リン脂質調節不全、認知欠損、リソソーム異常、及びタウ病的状態を含むＡＤ関連表現型との間の機構的関連を示す。これらの研究はまた、特定のｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－１９５－５ｐを標的とするための治療戦略を提供する。

【0225】

略語。ＡＡＶ２：アデノ随伴ウイルス２；ＡＤ：アルツハイマー病；ＡｐｏＥ：アポリポタンパク質Ｅ；ＢＨ：ベンジャミニ－ホッホベルグ；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＣＳＦ：脳脊髄液；ＤＥＧ：差次的発現遺伝子；ＦＤＲ：偽発見率；ＦＧＦ２：線維芽細胞成長因子２；ＦＰＫＭ：１００万個のマッピングされたリード当たりの転写産物の１キロベース当たりの断片；ＧＳＥＡ：遺伝子セットエンリッチメント解析；ｈｉＰＳＣ：ヒト誘導性多能性幹細胞；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィーｉＰＳＣ：誘導性多能性幹細胞；ＫＩ：ノックイン；ＭＣＩ：軽度認知機能障害；ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ；ＮＢＴＲ：ＮＩＨ脳及び組織リポジトリ；ＮＰＣ：神経前駆細胞；ＰＩ：ホスホイノシトール；ＰＩＰ：ホスホイノシトールモノホスフェート；ＰＩＰ₂：ホスホイノシトールビホスフェート；ＰＭＩ：死後間隔；ＲＡＰ：受容体関連タンパク質；ＲＩＮ：ＲＮＡ完全性数；ＲＯＳＭＡＰ：Ｒｅｌｉｇｉｏｕｓ Ｏｒｄｅｒｓ Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ Ｒｕｓｈ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｓｙｎｊ１：シナプトジャニン１；ＴＢＩ：外傷性脳損傷；ＴＭＭ：Ｍ値のトリム平均。

【0226】

実施例２：マイクロＲＮＡ－１９５－５ｐは、ミクログリア機能を制御する抗炎症性ｍｉＲＮＡであり、虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷を緩和することができる。
ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４ ｉＰＳＣ由来アストロサイトを、３日間インキュベートし、その後、ナトリウムハイドロサルファイト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）で、１時間処理して、虚血を誘導し、続いて、エクソソームの収集のために血清不含有培地中に一晩変えた。次いで、エクソソーム含有物を特徴付け、虚血状態に由来するエクソソーム内のｍｉＲ－１９５－５ｐレベルが、対照条件におけるものよりも有意に低く、エクソソームｓｙｎｊ１及びｐＴａｕレベルの相互的増加が見出された（図１２）。

【0227】

図１２に示されるように、ＡｐｏＥ４エクソソーム内のｍｉＲ－１９５－５ｐの量は、ＡｐｏＥ３／３エクソソーム内のものよりも少なく、虚血状態において更に低減された。対照的に、ＡｐｏＥ４／４のエクソソーム（＋／－虚血状態）内のｐＴａｕ及びｓｙｎｊ１のレベルは、対照のものよりもはるかに高い（１００％を、虚血状態を有しないＡｐｏＥ３／３対照として、対照の百分率として提示される）。

【0228】

また、ミクログリア内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害し、ＬＰＳ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させ、抗炎症遺伝子発現を増強することが見出された（図１３）。例えば、ＢＶ２細胞内での一晩の（０．２μｇ／ｍｌの）ＬＰＳ処置は、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の増加した発現（図１３Ａ）、並びにｉｌ１０ｒａの低減された発現（図１３Ｃ）を導く。しかしながら、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ＬＰＳの存在下で、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現レベルを劇的に低減し、ｉｌ１０ａ発現を増加させる。ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現はまた、ＬＰＳ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させる（ＩＬ－６及びＴＮＦα；図１３Ｂ）。興味深いことに、ＡＰＯＥ４／４アストロサイトに由来するエクソソーム（ＡＤＥ）は、ＡＰＯＥ３／３からのＡＤＥと比較してより少ないｍｉＲ－１９５－５ｐを含有し（図１３Ｄ）、ｉＰＳＣ由来アストロサイト内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、エクソソーム内の増加したｍｉＲ－１９５レベルを導き、これは、ＬＳＰ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させることができる（図１３Ｅ）。これらの実験のために、精製エクソソームは、エクソソームマーカーであるＡＬＩＸによって検出されたｍｉＲ－１９５過剰発現を有する／有しないヒトＡＰＯＥ３／３及び４／４ ｉＰＳＣ由来アストロサイトに由来した。蛍光標識エクソソームは、ＩＢＡ１＋ミクログリア細胞によって取り込まれた。まとめると、これらの結果は、ミクログリア機能の制御における抗炎症性ｍｉＲＮＡとしてのｍｉＲ－１９５の役割を支持する。

【0229】

Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₄誘導性虚血状態に曝露されたＡｐｏＥ４ミクログリア又はニューロンを、ｍｉＲ－１９５を過剰発現するＡｐｏＥ４アストロサイトに由来するエクソソームで処置することは、炎症促進性サイトカインＩＬ－６放出を低減し、ｐＴａｕ産生を減少させた（図１４）。これらのデータは、虚血誘導性ミクログリア機能不全及びニューロン損傷の緩和におけるエクソソームｍｉＲ－１９５の治療的役割を示す。

【0230】

実施例３：マイクロＲＮＡ－１９５－５ｐは、アルツハイマー病におけるミクログリア機能及び神経炎症を制御する
Ｅ４ＦＡＤマウス脳内のｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現での、ミクログリア特異的遺伝子プロファイルの変化。ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現を有するＥＦＡＤマウス脳ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実行した（図１５；Ｎ＝４つのプールマウス／条件）。単一細胞懸濁液を、調製し、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームで処理した。品質管理（ＱＣ）後に、遺伝子レベルＵＭＩデータを、規則化された負の二項回帰解析によって正規化した（Ｈａｆｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．＆ Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０，２９６，（２０１９））。２つ以上の細胞内で検出された遺伝子、並びに２００個～４，０００個の遺伝子のシークエンシングリード及び５０％未満のミトコンドリアリードレートを有する細胞を選択した。これにより、更なる解析のための合計２６，３３２個の細胞及び１８，８３４個の遺伝子のデータセットを得た。次に、線形次元低減を、最初に、主成分解析（ＰＣＡ）を使用して実行した。ＪａｃｋＳｔｒａｗ置換手順によって判定された場合の有意な主成分を、Ｓｅｕｒａｔのグラフベースのクラスタリング手法を使用する細胞クラスタリングのために選択した（Ｂｕｔｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６，４１１，（２０１８））。正規化されたデータセットを、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ；図１５Ａ及び図１５Ｃ）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｔｅｎ，Ｌ．＆ Ｈｉｎｔｏｎ，Ｇ．Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ８７，３３－５５（２０１２））又は次元低減のための均一マニホールド近似投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ、ＵＭＡＰ）（ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｌ．，Ｈｅａｌｙ，Ｊ．＆ Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｊ．ａｒＸｉｖ １８０２．０３４２６（２０１８））を使用して、２Ｄ空間上に投影した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるダブレットアーチファクトを特定及び除去するために、Ｓｅｕｒａｔとインターフェースするように実装されたＲパッケージであるＤｏｕｂｌｅｔＦｉｎｄｅｒ（ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ８，３２９－３３７（２０１９））を使用した。予測ダブレットをクラスターから除去した後に、クラスターマーカー遺伝子を観察し、既知の遺伝子マーカーの発現パターンを解析して、クラスターを、興奮性ニューロン（Ｅｘ；ＮＲＧＮによってマークされる）、阻害性ニューロン（Ｉｎ；ＧＡＤ１）、アストロサイト（Ａｓｔ；ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイト（Ｏｌｉ；ＰＬＰ１、ＭＢＰ）、ミクログリア（Ｍｉｃ；ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ７４）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（Ｏｐｃ；ＶＣＡＮ）、及び内皮細胞（Ｅｎｄ；ＦＬＴ１）の主要な細胞型にアノテートした。試料群間のクラスター特異的シグネチャー又は差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を特定するために、ウィルコクソン順位和検定などのノンパラメトリック検定を使用した。ディープニューラルネットワークベースの単一細胞クラスタリング手法であるＤＥＳＣ（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ，５３０３７８（２０１９））を使用することによって、１２個の細胞クラスターを特定し、１２個の細胞クラスターを、ミクログリア（Ｃ０）、アストロサイト（Ｃ１）、ニューロン（Ｃ３）、及びオリゴデンドロサイト（Ｃ２）を含む既知の主要な脳細胞タイプにアノテートした（図１５Ａ）。クラスター特異的ＤＥＧの最上位ＧＯ経路エンリッチメント研究は、ｍｉＲ－１９５－５ｐ過剰発現が、ミクログリアクラスター（Ｃ０）内のミトコンドリア及びシナプス機能に関与する遺伝子を上方制御することを示唆する（図１５Ｂ）。ミクログリアクラスター（Ｃ０）のサブクラスタリングは、３つの主要なサブセット（図１５Ｃ）を特定し、３つの主要なサブセットは、各ミクログリアサブクラスター内で異なる遺伝子シグネチャーを有した（図１５Ｄ）。例えば、サブクラスターＭｉｃ．Ｃ０は、細胞死の制御及びサイトカインへの応答に関与する遺伝子についてエンリッチされ、サブクラスターＭｉｃ．Ｃ１は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質複合体、骨髄性白血球活性化、及び空胞についてエンリッチされ、サブクラスターＭｉｃ．Ｃ２は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性についてエンリッチされた。サブクラスターＤＥＧでエンリッチされた最上位ＧＯ経路の研究は、ｍｉＲ－１９５－５ｐが、Ｍｉｃ．Ｃ０及びＭｉｃ．Ｃ２ミクログリアサブクラスター内の自然免疫系及びエフェクター応答、並びにＭｉｃ．Ｃ１サブクラスター内の翻訳及びリボソーム活性を下方制御し、３つのサブクラスター内の酸化的リン酸化及びＡＴＰ代謝プロセスに関与する遺伝子を上方制御することを示唆する。これらのデータは、ＡＤにおけるミクログリア機能及び神経炎症の制御におけるｍｉＲ－１９５－５ｐの役割を示す。

【0231】

低減されたｍｉＲ－１９５レベル及び増加したｓｙｎｊ１発現を有するＡＰＯＥ４⁺ミクログリアは、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大で出現し、食作用活性の機能障害及びリソソーム拡大は、ｓｙｎｊ１低減によってレスキューされる。ＡＰＯＥ４⁺ニューロン及びアストロサイト内のｍｉＲ－１９５レベルは、ＡＰＯＥ３⁺細胞内のものと比較して、増加したｓｙｎｊ１発現で低減される（Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，（２０２０））。データは、ｍｉＲ１９５レベルが、より高いｓｙｎｊ１タンパク質発現レベルで、培養ＡＰＯＥ４⁺ミクログリア内で、ＡＰＯＥ３⁺ミクログリア内のものと比較してより低いことを更に示唆する（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ＰＨｒｏｄｏコンジュゲートミエリンを使用して、ミクログリア食作用活性を判定すると、ＡＰＯＥ３^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリアと比較して、ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリアは、ミエリン取り込みの低減された量で出現すること、及びこれらの表現型は、インキュベーションの最初の６時間で最も顕著であり、研究の７２時間にわたって依然として一定であることが見出されたが、これは、これらのミクログリア内の食作用活性の機能障害を示唆する（図１６Ｃ）。加えて、ミクログリア内で採取されたミエリンの分解の勾配は、ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリア内で、ＡＰＯＥ３^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリアのものよりも遅かった。更に、リソソーム拡大が、ヒトｉＰＳＣ由来ＡＤ ＡＰＯＥ４^+/+ニューロン及びアストロサイト共培養物における観察と類似して、培養ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/+ミクログリア内で観察された（図１６Ｂ及びＣａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，（２０２０）。これらの表現型は、ｓｙｎｊ１ハプロ不全（図１６Ｃ ＡＰＯＥ４^+/+ｓｙｎｊ１^+/-ミクログリアについて黒色破線曲線）でレスキューされ得、有意差は、ＡＰＯＥ３^+/+ｓｙｎｊ１^+/+遺伝子型のミクログリア培養物とＡＰＯＥ３^+/+ｓｙｎｊ１^+/-遺伝子型のミクログリア培養物との間で見られない。これらの知見は、ＡＰＯＥ４誘導性ミクログリア機能不全におけるｍｉＲ－１９５／ｓｙｎｊ１の制御役割を示唆する。

【0232】

ミクログリア内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ＬＰＳ誘導性炎症促進性応答を阻害し、抗炎症応答を増強する。結果は、ミクログリア内のｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現が、炎症性遺伝子であるｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現のＬＰＳ誘導性増加を阻害し、ＬＰＳ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させ、抗炎症性遺伝子発現を増強することを示す。結果はまた、ＢＶ２細胞内の一晩の（０．２μｇ／ｍｌの）ＬＰＳ処置が、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の増加した発現（図１７Ａ）、並びにｉｌ１０ｒａの低減された発現（図１７Ｃ）を導くことを示す。しかしながら、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、ＬＰＳの存在下で、ｐｄｃｄ４及びｓｍａｄ７の発現レベルを低減し、ｉｌ１０ａ発現を増加させる。ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現はまた、ＬＰＳ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させる（ＩＬ－６及びＴＮＦα、図１７Ｂ）。

【0233】

また、ＡＰＯＥ４／４アストロサイトに由来するエクソソーム（ＡＤＥ）は、ＡＰＯＥ３／３からのＡＤＥ内のｍｉＲ－１９５－５ｐレベルよりもはるかに低いｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを含有し、ｍｉＲ－１９５－５ｐの過剰発現は、エクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐレベルを増加させた（図１８Ａ）が、これは、ＬＳＰ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を減衰させることができる（図１８Ｂ）。培養ミクログリア内への蛍光標識エクソソームの取り込みの写真は、ミクログリア内へのエクソソームｍｉＲ－１９５取り込みが、炎症応答を調節することを示す。ｍｉＲ－１９５過剰発現を有するヒトＡＰＯＥ３／３及び４／４ ｉＰＳＣ由来アストロサイト及びｍｉＲ－１９５過剰発現を有しないヒトＡＰＯＥ３／３及び４／４ ｉＰＳＣ由来アストロサイトに由来する精製エクソソームを、エクソソームマーカーであるＡＬＩＸによって検出した。蛍光標識エクソソームは、ＩＢＡ１⁺マウスＥ３ＦＡＤ又はＥ４ＦＡＤミクログリアによって取り込まれた。まとめると、これらの結果は、ミクログリア機能の調節における抗炎症性ｍｉＲＮＡとしてのｍｉＲ－１９５－５ｐの役割を支持する。

【0234】

実施例４：脳ＡｐｏＥ－ｓｙｎｊ１－ＰＩＰ₂経路についての標的エンゲージメントバイオマーカーとしてのエクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐの役割
本明細書に開示されるように、ｓｙｎｊ１ハプロ不全マウス（ＡｐｏＥ３ ｓｙｎｊ１^+/-及びＡｐｏＥ４ ｓｙｎｊ１^+/-）及びｓｙｎｊ１低下剤（ＳｙｎａｐｔｏＣｐｄ ＃９及びＣｐｄ ＃６）で処置されたマウスの脳及び血清試料のエクソソーム画分を検査するために、研究を実行した。エクソソームを、スクロース勾配分画法を使用して精製し、エクソソーム画分の純度を、ＡＬＩＸなどのエクソソームタンパク質マーカーのウェスタンブロット解析、及びヒトｉＰＳＣ由来アストロサイト培養物による蛍光タグ付きエクソソームの取り込み研究によって評価した。結果は、脳及び血清エクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐレベルが、ＡｐｏＥ４ ｓｙｎｊ１^+/+マウスにおいて、ＡｐｏＥ３ ｓｙｎｊ１^+/+マウス比較して低かったことを示す。ｓｙｎｊ１ハプロ不全マウスにおいて、ＡｐｏＥ４ ｓｙｎｊ１^+/-マウスの脳及び血清試料内の有意に増加したエクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐがあった（図１９Ａ）。また、血清及び脳エクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、Ｃｐｄ＃６又はＣｐｄ＃９処置マウスにおいて、対照と比較してはるかに高いことが見出された（図１９Ｂ）。加えて、血清エクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐレベルは、薬物処置マウスコホートにおいて、脳エクソソームｍｉＲ－１９５－５ｐレベル及び認知パフォーマンス（ＮＯＲ選好指標及びＹ迷路ＳＡＰスコア）と正相関し、脳不溶性ｐＴａｕ及びｓｙｎｊ１タンパク質レベルと逆相関した（図１９Ｃ）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【配列表】

2024503503000001.app

【国際調査報告】