特表 2024-503540 新規ペプチドおよびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-25

(54)【発明の名称】新規ペプチドおよびその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20240118BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240118BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240118BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240118BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

A61P3/04

A61K38/16

A61P3/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023562446

(86)(22)【出願日】2021-12-22

(85)【翻訳文提出日】2023-06-28

(86)【国際出願番号】 KR2021019658

(87)【国際公開番号】W WO2022139487

(87)【国際公開日】2022-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2020-0180639

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523236515

【氏名又は名称】メディアンドジーン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】シン ミン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン イン ヒョク

(72)【発明者】

【氏名】パク チャン

(72)【発明者】

【氏名】イ ス ヨン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA19

4C084NA14

4C084ZA70

4C084ZC35

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＩＦ１タンパク質由来ペプチドおよびその医薬用途に関し、前記ペプチドは、肥満動物モデルで食欲を抑制し、脂肪細胞の脂質蓄積および分化を阻害し、糖尿動物モデルではインスリン分泌を促進し、耐糖能を改善するので、抗肥満および抗糖尿用途に有用に使用できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を含むペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学組成物。

【請求項3】

前記組成物は、食欲を抑制する、請求項２に記載の肥満の予防または治療用薬学組成物。

【請求項4】

前記食欲の抑制は、ＡｇＲＰ（ａｇｏｕｔｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＮＰＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ）ペプチド抑制によるものである、請求項３に記載の肥満の予防または治療用薬学組成物。

【請求項5】

前記組成物は、脂肪細胞の脂質蓄積および分化を抑制する、請求項２に記載の肥満の予防または治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記組成物は、脂肪組織内熱発生とエネルギー恒常性を活性化させるＵＣＰ－１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）遺伝子の発現を増加させる、請求項２に記載の肥満の予防または治療用薬学組成物。

【請求項7】

請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む糖尿病または糖尿合併症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項8】

前記組成物は、インスリン分泌を促進する、請求項７に記載の糖尿病または糖尿合併症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項9】

前記組成物は、耐糖能を改善する、請求項７に記載の糖尿病または糖尿合併症の予防または治療用薬学組成物。

【請求項10】

請求項２に記載の組成物を治療が必要な個体に投与する段階を含む肥満の治療方法。

【請求項11】

請求項７に記載の組成物を治療が必要な個体に投与する段階を含む糖尿病または糖尿合併症治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体タンパク質に由来する新規ペプチドおよびその抗肥満、抗糖尿用途に関する。

【背景技術】

【0002】

病気の治療および予防に使用される医薬品は、化学物質からなる医薬品とバイオ医薬品とに分けられる。バイオ医薬品は、ホルモン、抗体などで構成されるタンパク質医薬品が主になっており、さらに遺伝体などで構成される。低分子物質からなる化学物質中心の医薬品とは異なって、バイオ医薬品は、高分子物質が大部分であるから、そのサイズから始まる多様な問題点が発生する。代表的に、大きいサイズに応じたターゲット物質へのアクセス性の低下と自己免疫反応などのような活性の観点の問題点と、サイズが大きくなるにつれて生産するのにかかる複雑度が上昇し、これによる費用および時間所要の増加のような産業的問題点がある。これは、タンパク質の機能に主要な影響を及ぼす活性部位以外にも、付随的な構造物が構成要素として存在するので起こる現象であり、タンパク質の主要活性部位を探知すると、生体内機能は維持しつつ、タンパク質医薬品のサイズを減らすことができるので、タンパク質医薬品の様々な副作用と費用の観点から相当な改善を達成することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

上記のような状況下で、本発明者らは、生体内で発現するＩＦ１（ＡＴＰａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １）タンパク質の機能改善のためにＩＦ１タンパク質に由来するペプチドの発明に集中した。その結果、肥満と糖代謝を含んで代謝障害改善効果を示すＩＦ１由来新規ペプチドを発見した。

【0004】

したがって、本発明の目的は、前記新規ペプチドおよびその医薬用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記目的を達成するために、本発明の一態様は、生体タンパク質に由来する配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。

【0006】

ＩＦ１（ＡＴＰａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １）は、細胞内で発現してミトコンドリア膜に存在するＡＴＰａｓｅに結合して回転運動を妨害し、その結果、電子伝達系によるＡＴＰ合成／分解を妨害し、細胞内エネルギー調節およびミトコンドリア恒常性に影響を及ぼす主要なタンパク質と知られている。

【0007】

本発明者は、ＩＦ１タンパク質（配列番号３および４）から新規の機能性を有するペプチドを探すために研究し、抗肥満および抗糖尿活性を有する配列番号１および２のペプチドを発掘した。

【0008】

本発明の他の態様は、前記ペプチドを有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0009】

本発明において使用される用語「予防」は、本発明による薬学組成物の投与により疾患の進行を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

【0010】

本発明において使用される用語「治療」は、本発明による薬学組成物の投与により疾患の症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。

【0011】

本発明者らは、ＩＦ１タンパク質に由来するペプチド（以下、機能性ペプチドという）の生理活性を確認するために、マウスに高脂肪食と機能性ペプチドを共に投与したり（肥満予防実験）、肥満を誘導したマウスに高脂肪食と機能性ペプチドを共に投与した（肥満治療実験）。

【0012】

該投与結果、マウスに高脂肪食と機能性ペプチドを共に投与すると、対照群に比べて体重増加が抑制されることを確認し（図１Ｃ）、肥満を誘導したマウスに高脂肪食と機能性ペプチドを共に投与すると、体重増加が抑制され、実験終了時点ではかえって体重が減少したことを確認した（図１Ａおよび１Ｂ）。

【0013】

したがって、前記組成物は、肥満の予防および治療の両方に有用に使用できる。

【0014】

なお、前記機能性ペプチドは、脂肪細胞の脂質蓄積と分化を抑制し、これは、脂肪細胞で脂肪分化の指標であるＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、ＦＡＢＰ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、Ｃ／ＥＢＰα（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ）およびＬＰＬ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）遺伝子の発現を抑制することによって達成される。

【0015】

また、機能性ペプチドは、食欲を抑制し、これは、視床下部細胞で食欲を促進するペプチドであるＡｇＲＰ（ａｇｏｕｔｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＮＰＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ）の発現を抑制することによって達成することができる。

【0016】

したがって、前記肥満の予防または治療用組成物は、脂肪細胞の分化抑制および食欲抑制を通じて抗肥満効果を示すことができる。

【0017】

本発明のさらに他の態様は、前記機能性ペプチドを有効成分として含む糖尿病または糖尿合併症の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0018】

本発明者らは、機能性ペプチドの生理活性をさらに確認するために、肥満誘導マウスおよび２型糖尿病マウスを禁食させた後、ブドウ糖溶液を注射して、耐糖能検査を実施した。その結果、機能性ペプチドの投与により血糖値が減少し（図４および図５Ａ、５Ｂ）、インスリン分泌が増加することを確認した（図５Ｅ）。

【0019】

したがって、前記糖尿病の予防または治療用組成物は、耐糖能改善およびインスリン分泌促進を通じて抗糖尿効果を示すことができる。

【0020】

糖尿合併症は、長期間の高血糖状態によって血管壁が損傷して現れる心筋梗塞、脳卒中、網膜症、腎不全などの合併症をいう。高血糖状態を改善すると、糖尿合併症を改善することができるので、本発明の機能性ペプチドは、糖尿合併症の予防または治療用途に使用できる。

【0021】

なお、本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む形態で製造することができ、前記担体は、非自然発生担体（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃａｒｒｉｅｒ）を含んでもよい。

【0022】

具体的には、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用できる。

【0023】

本発明において、前記薬学組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

【0024】

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。

【0025】

経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。

【0026】

前記薬学組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液であり、滅菌注射用製剤の形態でありうる。この懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）および懸濁化剤を使用して本分野に公知となった技術により剤形化することができる。滅菌注射用製剤は、また、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液）でありうる。許容的に使用できるビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌不揮発性オイルが、通常、溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性が少ないいかなる不揮発性オイルも使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸が薬剤学的に許容される天然オイル（例えば、オリーブ油またはひまし油）、特にこれらのポリオキシエチル化したものと同様に注射製剤に有用である。

【0027】

本発明による薬学組成物の非経口投与は、目的とする治療が局所適用で接近が容易な部位または器官と関連があるとき、特に有用である。本発明の化合物を局所投与するための担体としては、これらに限定されるものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。

【0028】

本発明の薬学組成物に含まれた前記有効成分の含有量は、特にこれに制限されないが、最終組成物の全重量を基準として０．０００１～５０重量％、より好ましくは、０．０１～１０重量％の含有量で含んでもよい。

【0029】

本発明の他の態様は、前記肥満の予防または治療用薬学的組成物を治療が必要な個体に投与する段階を含む肥満の治療方法、前記糖尿病または糖尿合併症の予防または治療用薬学組成物を治療が必要な個体に投与する段階を含む糖尿病または糖尿合併症の治療方法を提供する。

【0030】

本発明の治療方法は、前述した薬学組成物を用いるので、この両方に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

【0031】

薬学的組成物の投与方法は、上記で記載したように、経口または非経口的に投与することができ、薬学的組成物の投与量は、治療専門家により判断可能である。

【発明の効果】

【0032】

本発明は、生体タンパク質由来ペプチドおよびその医薬用途に関し、前記ペプチドは、肥満動物モデルで食欲を抑制し、脂肪細胞の脂質蓄積と分化を阻害し、糖尿動物モデルではインスリン分泌を促進し、耐糖能を改善するので、抗肥満および抗糖尿の用途に有用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１のＡは、高脂肪食で肥満が誘導されたマウスモデルにＩＦ１由来ペプチド（以下、機能性ペプチドという）を６週間投与しつつ、体重変化を確認した結果であり、Ｂは、６週間投与した後、最終体重を確認した結果であり、Ｃ～Ｅは、マウスに高脂肪食と機能性ペプチドを一緒に投与した後、それぞれ投与期間中に全体体重変化量の割合（Ｃ）、投与期間中に食事摂取効率（Ｄ）および投与期間中に一日食事摂取量（Ｅ）を確認した結果である：ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群；およびｐｅｐｔｉｄｅ：機能性ペプチド投与群（以下、図面でも同一）。

【図2】図２は、マウスに高脂肪食と機能性ペプチドを３０日間一緒に投与した後、血清中の中性脂肪レベル（Ａ）、血清中の遊離脂肪酸レベル（Ｂ）、脂肪組織における脂肪球が占める面積（Ｃ）および脂肪組織においてＵＣＰ－１発現変化（Ｄ）を確認した結果であり、Ｅは、肥満が誘導されたマウスに高脂肪食と機能性ペプチドを６週間一緒に投与した後、脂肪組織においてＵＣＰ－１発現変化を確認した結果である。

【図3】図３のＡは、脂肪細胞の分化過程に機能性ペプチドを処理した後、脂肪分化および生長に関する遺伝子の発現変化を確認した結果であり、ＢおよびＣは、視床下部細胞にそれぞれマウス由来およびヒト由来機能性ペプチドを処理した後、食欲促進遺伝子の発現変化を確認した結果である。

【図4】図４は、高脂肪食で肥満が誘導されたマウスモデルを絶食させた後、ブドウ糖溶液を注射して全体血糖変化量を確認した結果である。

【図5】図５のＡは、２型糖尿病マウスモデルを絶食させた後、ブドウ糖溶液を注射して血糖値を確認した結果であり、Ｂは、全体血糖変化量を定量した結果であり、Ｃは、前記マウスから分離した膵臓の重さを測定した結果であり、Ｄは、膵臓の重さをマウス体重で補正した結果値を比較した結果であり、Ｅは、血中インスリン濃度を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、１つ以上の具体例を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、１つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0035】

実施例１：ＩＦ１由来ペプチドの分離および精製
ＩＦ１タンパク質とＩＦ１由来ペプチド（以下、機能性ペプチドという；配列番号１または２）コーディング配列をそれぞれｐＧＥＸ－４Ｔ－１およびｐｅｔ２８ａベクターに配列を挿入させた。前記ベクターを発現用大腸菌菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させて、安定的にＩＦ１および機能性ペプチドを発現する細胞モデルを確立した。当該大腸菌細胞を培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理してタンパク質発現を誘導した。その後、遠心分離、超音波粉砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）過程を通じて得られた溶液を親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離してＩＦ１および機能性ペプチドを分離し、Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇを用いてｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で塩の濃度を合わせて純度を高めて精製した。対照群に使用したＧＳＴは、ｐｅｔ２８ａベクターの代わりに、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１ベクターを使用して生産した。

【0036】

ＩＦ１タンパク質および機能性ペプチドの配列を下記表１に記載した。

【0037】

【表1】

【0038】

実施例２：機能性ペプチドの抗肥満効果の分析
２－１．肥満マウスモデルの製作
オリエントバイオ（ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ）から４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの分譲を受け、１週間正常食（Ｎｏｒｍａｌ ｄｉｅｔ ｃｈｏｗ；ＮＤ）を提供して適応する時間を経た。この際、実験期間全体飼育環境で飼育空間の温度は１８～２４℃、湿度は５０～６０％を常時維持し、適応期間および実験期間ともに自由給食を実施した。適応期間を経たマウスは、肥満予防実験群と肥満治療実験群とに分けて各目的に合うように飼育した。正常食および高脂肪食は、下記の表２のように製造して提供した。

【0039】

【表2】

【0040】

－肥満予防実験群：対照群と実験群とに分けて、それぞれ次のような条件で３０日間飼育した。
対照群：高脂肪食（Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ；ＨＦＤ）＋ＰＢＳ投与（ｎ＝１０）
実験群：高脂肪食（ＨＦＤ）＋機能性ペプチド投与（ｎ＝１０）
－肥満治療実験群：１週間の適応期後に８週間高脂肪食（表１参照）を提供して肥満を誘導し、対照群と実験群とに分けて、それぞれ次のような条件で６週間飼育した。
対照群：高脂肪食（ＨＦＤ）＋ＰＢＳ投与（ｎ＝１０）
実験群：高脂肪食（ＨＦＤ）＋機能性ペプチド投与（ｎ＝１０）

【0041】

２－２．機能性ペプチドの抗肥満効果
実施例２－１の実験条件によって実験期間中に毎日１回腹腔注射を通じてＰＢＳとペプチドを投与した。これに該当する条件は、次の通りである。
対照群：ＰＢＳ腹腔注射（下記の機能性ペプチド溶液に対応する体積）
実験群：機能性ペプチド腹腔注射（５ｍｇ／ｋｇ）

【0042】

実験期間中にすべてのマウスの体重を測定し、高脂肪食の摂取による体重変化を観察した。その結果、肥満治療実験群の機能性ペプチド投与群においてペプチドを投与してから１週間が経過した時点から体重増加抑制効果が現れることを確認し、このような体重増加抑制現象は、実験終了時点まで持続した（図１Ａ）。最終実験終了時点の体重を比較した結果、対照群は、高脂肪食による体重増加で肥満が急激に誘導されたが、機能性ペプチド投与群は、かえって体重減少効果を示した（図１Ｂ）。

【0043】

肥満予防実験群でも、全体実験期間中に機能性ペプチド投与群において体重変化率が低い水準を示し（図１Ｃ）、食事効率比（体重増加量を食事摂取量で割った比率、Ｆｏｏｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒａｔｉｏ）（図１Ｄ）および一日食事摂取量も、機能性ペプチド投与群において減少したことを確認し（図１Ｅ）、機能性ペプチドの効果的な抗肥満効能を確認した。

【0044】

該実験終了後、肥満予防および肥満治療実験群のマウスを１２時間絶食させ、組織を分離して保管し、血清を分離した。血清内脂質指標を分析した結果、対照群に比べて、機能性ペプチド投与群において遊離脂肪酸（図２Ａ）と中性脂肪（図２Ｂ）の減少を確認した。

【0045】

また、脂肪組織をＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）染色および免疫染色で観察した結果、機能性ペプチドの投与により脂肪球が占める面積が１５％減少し、機能性ペプチドが脂質蓄積を防止することを確認した（図２Ｃ）。脂肪組織内熱発生とエネルギー恒常性活性因子であるＵＣＰ－１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）の発現量も、機能性ペプチド投与群において３５５％増加した（図２Ｄ）。

【0046】

肥満治療実験群から得られた脂肪組織の免疫染色を通じて観察した結果、肥満予防実験群の結果と同様に、ＵＣＰ－１の発現量が２６３％増加することを観察し（図２Ｅ）、機能性ペプチドによる抗肥満効果が脂質蓄積およびエネルギー代謝活性化を含むことを確認した。

【0047】

２－３．機能性ペプチドの抗肥満効果作用機序の分析
３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞を脂肪に分化させるために、１次分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、０．５ｍＭ ３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、１ｕＭ ｄｅｘａｍｅｔａｈａｓｏｎｅ、１０μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で２日、２次分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１０μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で６日、総８日間培養して分化を誘導した。この際、培地に各物質（対照群：ＰＢＳ、実験群：機能性ペプチド１００ｎＭ）を分化期間中に添加して使用した。

【0048】

該実験結果、脂肪分化の指標であるＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、ＦＡＢＰ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、Ｃ／ＥＢＰα（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ）およびＬＰＬ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）遺伝子レベルが全て機能性ペプチド処理群において減少したことを確認し、機能性ペプチドが脂肪分化を調節して抗肥満効果を示すことが分かった（図３Ａ）。

【0049】

また、ｍＨｙｐｏＥ－Ｎ４１視床下部細胞で機能性ペプチドによる食欲調節効果を確認するために、視床下部細胞にＰＢＳ（対照群）とマウス由来機能性ペプチド１００ｎＭ（実験群）を２４時間処理した。該実験終了後、細胞を回収して食欲を促進すると知られたＡｇｒｐ（ａｇｏｕｔｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＮＰＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ）遺伝子のレベルを観察した結果、Ａｇｒｐ遺伝子は、対照群に比べて、５０．２％減少、ＮＰＹ遺伝子は、４８．８％が減少し、また、機能性ペプチドが食欲抑制作用を有することを確認した（図３Ｂ）。

【0050】

同様に、視床下部細胞にＰＢＳ（対照群）とヒト由来機能性ペプチド１００ｎＭ（実験群）を２４時間処理して食欲関連因子の遺伝子レベルを観察した結果、Ａｇｒｐ遺伝子は、対照群に比べて４７．５％減少、ＮＰＹ遺伝子は、５９．６％が減少し、ｈｕｍａｎ ｐｅｐｔｉｄｅによる食欲抑制作用を確認した（図３Ｃ）。

【0051】

本実施例の結果を通じて、機能性ペプチドの抗肥満効果を最終検証した。

【0052】

実施例３：機能性ペプチドの糖代謝関連効能の分析
３－１．２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）モデルの飼育
機能性ペプチドの糖代謝関連効果を確認するために、２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）を使用した。２型糖尿病マウスに該当するｄｂ／ｄｂモデルは、食事調節を担当するレプチン受容体に遺伝子変異を誘発した動物モデルでインスリン信号経路および満腹感調節が不可能で、肥満が誘導される糖尿病の代表的なモデルである。

【0053】

中央実験動物（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ）から８週齢の雄Ｃ５７ＢＬＫＳ／６Ｊ－ｄｂ／ｍ＋（Ｈｅｔｅｒｏ変異）、Ｃ５７ＢＬＫＳ／６Ｊ－ｄｂ／ｄｂ（Ｈｏｍｏ変異）マウスの分譲を受け、１週間正常食（Ｎｏｒｍａｌ ｄｉｅｔ ｃｈｏｗ；ＮＤ）を提供して適応する時間を経た。この際、実験期間全体飼育環境で飼育空間の温度は１８～２４℃、湿度は５０～６０％を常時維持し、適応期間および実験期間ともに自由給食を実施した。

【0054】

３－２．機能性ペプチドの糖代謝改善効能の分析
適応期間を経たマウスを対照群と実験群とに分けて、それぞれ次のような条件で４４日間飼育した。正常食は、前記表１のように製造して提供した。
ｄｂ／ｍ＋対照群：正常食（ＮＤ）＋ＰＢＳ腹腔投与（ｎ＝１０）
ｄｂ／ｄｂ対照群：正常食（ＮＤ）＋ＰＢＳ腹腔投与（ｎ＝１０）
ｄｂ／ｄｂ実験群：正常食（ＮＤ）＋機能性ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）腹腔投与（ｎ＝１０）

【0055】

実験期間４４日が終了した後、マウスを１４時間絶食させた後、安楽死させ、その後、解剖してさらなる分析のために組織を採取した。また、血液を採集して、遠心分離で血清を分離し、分析した。

【0056】

具体的には、機能性ペプチドの糖代謝改善効能を評価するために、肥満による耐糖能障害と遺伝子変異による耐糖能障害改善効果を耐糖能検査を通じて確認した。

【0057】

まず、実験終了時点に実施例２－１の肥満予防マウスモデルを１２時間絶食させ、腹腔注射でブドウ糖２０％溶液を注入して、血液内血糖値の変化を観察した。この際、ブドウ糖溶液の注射３０分前に実施例３－１のように各グループに該当する物質を注射した。血糖値の変化を確認した結果、ブドウ糖注射３０分後から血糖レベルが機能性ペプチド投与群において減少することが分かった。全体血糖変化量を定量した結果（血糖値×時間；ＧＬＵＡＵＣ）でも、機能性ペプチドによる血糖値の減少を確認し（図４）、機能性ペプチドが糖代謝を改善する効果があることを確認した。

【0058】

実施例３－１の糖尿病マウスモデルを１２時間絶食させ、腹腔注射でブドウ糖２０％溶液を注入して、血液内血糖値の変化を観察した。この際、ブドウ糖溶液の注射３０分前に実施例３－１のように各グループに該当する物質を注射した。血糖値の変化を確認した結果、ブドウ糖注射６０分、９０分、１２０分後に、血糖レベルが、ｄｂ／ｄｂ対照群に比べて、機能性ペプチド投与群において有意に減少することが分かった。また、全体血糖変化量を定量した結果（血糖値×時間；ＧＬＵＡＵＣ）でも、機能性ペプチドによる血糖値の減少を確認し（図５Ｂ）、機能性ペプチドが糖代謝を改善する効果があることを確認した。

【0059】

糖尿病から始まるホルモン分泌の変化および障害を観察するために、前記実施例３－１の糖尿病マウスモデルから分離した組織を分析し、ホルモン分泌に主要な役割をする膵臓の重さと糖の吸収を誘導するインスリンホルモンの血液内濃度を特定的に検査した。

【0060】

該検査結果、膵臓の重さ（図５Ｃ）とこれを体重で補正した値（図５Ｄ）は、いずれも、機能性ペプチド投与群において増加したことを確認し、機能性ペプチドがホルモン分泌システムに肯定的な影響を及ぼすことを確認した。また、機能性ペプチド投与群において血中インスリン分泌が高まったことが示され、機能性ペプチドによりホルモン分泌が促進されたことが分かった（図５Ｅ）。総合すれば、機能性ペプチドが代謝に肯定的な影響を及ぼすことを最終検証した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】