特表 2024-503685 Ｉ型膜タンパク質ヘテロダイマー及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-26

(54)【発明の名称】Ｉ型膜タンパク質ヘテロダイマー及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240119BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240119BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240119BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240119BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240119BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240119BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240119BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240119BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240119BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240119BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240119BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z

C07K14/705 ZNA

C07K16/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N5/078

A61P35/00

A61P35/02

A61K38/17

A61K39/395 W

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023542757

(86)(22)【出願日】2022-01-13

(85)【翻訳文提出日】2023-09-11

(86)【国際出願番号】 IL2022050055

(87)【国際公開番号】W WO2022153307

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】63/136,687

(32)【優先日】2021-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/139,331

(32)【優先日】2021-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517307924

【氏名又は名称】カール メディカル リミテッド

【住所又は居所原語表記】２８ Ｄａｍ ＨａＭａｃｂｉｍ Ｓｔｒｅｅｔ， ＰＯ Ｂｏｘ ９， ＭｏｄｉＩｎ Ｍａｋａｂｉｍ－ＲｅＵｔ， Ｉｓｒａｅｌ

(71)【出願人】

【識別番号】516241599

【氏名又は名称】トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タミール アミ

(72)【発明者】

【氏名】チコシンスキ マーク エル．

(72)【発明者】

【氏名】ブレマー エドウィン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE11

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB19

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA41

4C084BA44

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C085AA33

4C085BB42

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA50

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA23

4H045GA26

(57)【要約】

Ｉ型膜タンパク質ヘテロダイマーが提供される。したがって、ＳＩＲＰアルファ、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のポリペプチドを含むヘテロダイマーであって、２種のポリペプチドのそれぞれがその天然の結合相手に結合することができ、ヘテロダイマーが、その天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない、ヘテロダイマーが提供される。ヘテロダイマーをコードする核酸構築物及びシステム、それを発現する宿主細胞並びにその使用方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のポリペプチドを含むヘテロダイマーであって、前記２種のポリペプチドのそれぞれがその天然の結合相手に結合することができ、前記ヘテロダイマーが、その天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない、ヘテロダイマー。

【請求項2】

前記２種のポリペプチドに結合されたダイマー化部分を含む、請求項１に記載のヘテロダイマー。

【請求項3】

前記ダイマー化部分が抗体又はその断片のＦｃドメインである、請求項２に記載のヘテロダイマー。

【請求項4】

前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、その免疫活性化機能の低下、及び／又は融合体の半減期の改善が得られるように修飾されている、請求項３に記載のヘテロダイマー。

【請求項5】

前記ＳＩＲＰαポリペプチド及び前記ＰＤ１ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項6】

前記ＳＩＲＰαポリペプチド及び前記ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項7】

前記ＳＩＲＰαポリペプチド及び前記ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項8】

前記ＳＩＲＰαポリペプチド及び前記ＴＩＧＩＴポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項9】

前記ＴＩＧＩＴポリペプチド及び前記ＰＤ１ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項10】

前記ＴＩＧＩＴポリペプチド及び前記ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項11】

前記ＴＩＧＩＴポリペプチド及び前記ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項12】

前記ＰＤ１ポリペプチド及び前記ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項13】

前記ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド及び前記ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項14】

前記ＰＤ１ポリペプチド及び前記ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項15】

前記ヘテロダイマー中で、前記ポリペプチドのそれぞれがモノマーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項16】

前記２種のポリペプチドが、前記ヘテロダイマーのモノマー中に含まれる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマーを含む組成物であって、前記組成物中の前記２種のポリペプチドの優勢形態が前記ヘテロダイマーである、組成物。

【請求項18】

請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマーをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドと、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指示する制御因子とを含む、核酸構築物又はシステム。

【請求項19】

請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー或いは請求項１８に記載の核酸構築物又はシステムを含む、宿主細胞。

【請求項20】

ヘテロダイマーの製造方法であって、請求項１８に記載の核酸構築物又はシステムを宿主細胞に導入すること、或いは請求項１９に記載の細胞を培養することを含む、方法。

【請求項21】

前記ヘテロダイマーを単離することを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー、請求項１７に記載の組成物、請求項１８に記載の核酸構築物又はシステム、或いは請求項１９に記載の細胞を前記対象に投与し、それにより前記対象において前記疾患を治療することを含む方法。

【請求項23】

前記ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患の治療を、それを必要とする対象において行うのに使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー、請求項１７に記載の組成物、請求項１８に記載の核酸構築物又はシステム、或いは請求項１９に記載の細胞。

【請求項24】

前記疾患が、免疫細胞の活性化が有効に作用し得るものである、請求項２２に記載の方法或いは請求項２３に記載の使用のためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞。

【請求項25】

前記疾患に関連する細胞が前記天然の結合相手を発現する、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法或いは使用のためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞。

【請求項26】

前記疾患が癌である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法或いは使用のためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞。

【請求項27】

前記癌が、リンパ腫、白血病、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法或いは使用のためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞。

【請求項28】

前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は中皮腫である、請求項２６に記載の方法或いは使用のためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞。

【請求項29】

免疫細胞を活性化する方法であって、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー、請求項１７に記載の組成物、請求項１８に記載の核酸構築物又はシステム、或いは請求項１９に記載の細胞の存在下において免疫細胞をｉｎ－ｖｉｔｒｏで活性化することを含む方法。

【請求項30】

前記活性化が、前記天然の結合相手を発現する細胞の存在下におけるものである、請求項２９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０２１年１月１３日に出願された米国特許出願第６３／１３６，６８７号及び２０２１年１月２０日に出願された米国特許出願第６３／１３９，３３１号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表に関する陳述
本願の出願と同時に提出された、２０２２年１月１３日に作製された３０３，１０４バイトを含む８９９６２ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のＡＳＣＩＩファイルは、参照によって本明細書に援用される。

【0003】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、Ｉ型膜タンパク質ヘテロダイマー及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

癌と免疫系との間の相互作用は、複雑で多面的である。多くの癌患者は、抗腫瘍免疫応答を示すように見えるが、癌も、免疫検出及び免疫破壊を回避する戦略を示す。癌細胞は、その表面での腫瘍抗原の発現を低下させて、免疫系がそれを検出することを困難にし、免疫細胞の不活性化を誘導するタンパク質をその表面で発現させ、及び／又は微小環境内の細胞に免疫応答を抑制する物質を放出させて、腫瘍細胞の増殖及び生存を促進することができる。

【0005】

近年、免疫系の特定の成分を刺激するか、又は癌細胞により生成される免疫応答を抑制するシグナルを相殺することにより、腫瘍に対する免疫応答を増強するための免疫療法が開発されている。免疫応答を調節する機構及び分子の定義の進歩により、癌を治療するための新規の治療標的がもたらされた。これらの標的の中には、Ｔ細胞免疫応答の制御において中心的な役割を果たす共刺激分子及び共阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１）、インターロイキン及びインターフェロンなど、免疫系活性の制御又は調節に役立つタンパク質、腫瘍抗原並びに自然免疫系の活性に関与する成分（例えば、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα「ドント・イート・ミー（私を食べないで、ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ－ｍｅ）」シグナル）が含まれる。

【0006】

付加的な背景技術には、以下のものが含まれる：
国際公開第２０２０／１４６４２３号、国際公開第２０１７１２７７０号、国際公開第２０１７１５２１３２号、国際公開第２０１６０２３００１号及び国際公開第２０１３１１２９８６号、並びに
米国特許第７，５６９，６６３号明細書及び米国特許第８，０３９，４３７号明細書。

【発明の概要】

【0007】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のポリペプチドを含むヘテロダイマーであって、２種のポリペプチドのそれぞれがその天然の結合相手（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）に結合することができ、ヘテロダイマーが、その天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない、ヘテロダイマーが提供される。

【0008】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、２種のポリペプチドに結合されたダイマー化部分を含む。

【0009】

本発明のいくつかの実施形態によると、ダイマー化部分は、抗体又はその断片のＦｃドメインである。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態によると、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、その免疫活性化機能の低下、及び／又は前記融合体の半減期の改善が得られるように修飾されている。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＰＤ１ポリペプチドを含む。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＴＩＧＩＴポリペプチドを含む。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＰＤ１ポリペプチドを含む。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＰＤ１ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＰＤ１ポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態によると、ヘテロダイマー中で、ポリペプチドのそれぞれがモノマーである。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態によると、２種のポリペプチドは、ヘテロダイマーのモノマー中に含まれる。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマーを含む組成物であって、組成物中の２種のポリペプチドの優勢形態がヘテロダイマーである組成物が提供される。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマーをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドと、宿主細胞内でポリヌクレオチドの発現を指示する制御因子とを含む核酸構築物又はシステムが提供される。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマー又は核酸構築物又はシステムを含む宿主細胞が提供される。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマーの製造方法であって、核酸構築物又はシステムを宿主細胞に導入すること又は細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態によると、本方法は、ヘテロダイマーを単離することを含む。

【0028】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量のヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞を対象に投与し、それにより対象において疾患を治療することを含む方法が提供される。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患の治療を、それを必要とする対象において行うのに使用するためのヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞が提供される。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態によると、疾患は、免疫細胞の活性化が有効に作用し得るものである。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態によると、疾患に関連する細胞は、天然の結合相手を発現する。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態によると、疾患は、癌である。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態によると、癌は、リンパ腫、白血病、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌及び肝細胞癌からなる群から選択される。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態によると、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は中皮腫である。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、免疫細胞を活性化する方法であって、ヘテロダイマー、組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞の存在下において免疫細胞をｉｎ－ｖｉｔｒｏで活性化することを含む方法が提供される。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態によると、活性化は、天然の結合相手を発現する細胞の存在下におけるものである。

【0037】

特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下では、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者に明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1A】図１Ａは、ヘテロダイマーの可能な配座／コンホメーション（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ／ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）の非限定的な例の概略図である。

【図1B】図１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態で企図されるヘテロダイマーの組成及び配置の概略図を示す。

【図2】図２Ａは、本明細書において「ＤＳＰ１２０Ｖ１」（配列番号５及び７）と称されるＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーの概略図である。図２Ｂ～Ｃは、ＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ１２０Ｖ１（配列番号５及び７）の予測される３Ｄ構造を示す。図２Ｂは、概略的３Ｄモデルであり、図２Ｃは、全原子３Ｄモデルである。ＳＩＲＰα（「ノブ」鎖中）は、濃いグレーのリボン表示で示されている（右側下）。ＰＤ１（「ホール」鎖中）は、グレーのリボン表示で示されている（右側上）。「ノブ」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側下に白いリボンで示されている。「ホール」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側上にグレーのリボンで示されている。「スペーサー」／「リンカー」セグメントは、ＳＩＲＰα、ｈＩｇＧ４及びＰＤ１の構造要素間にグレーのリボン及び白いリボンで示されている。ｈＩｇＧ４のＦｃドメインのヒンジシステイン残基（複合体を安定化する）は、ＣＰＫ表示で示されている。

【図3】図３Ａは、本明細書において「ＤＳＰ２１６Ｖ１」（配列番号５及び１５）と称されるＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーの概略図である。図３Ｂ～Ｃは、ＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６Ｖ１（配列番号５及び１５）の予測される３Ｄ構造を示す。図３Ｂは、概略的３Ｄモデルであり、図３Ｃは、全原子３Ｄモデルである。ＳＩＲＰα（「ノブ」鎖中）は、濃いグレーのリボン表示で示されている（右側下）。ＬＩＬＲＢ２（「ホール」鎖中）は、濃いグレーのリボン表示で示されている（右側上）。「ノブ」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側下に白いリボンで示されている。「ホール」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側上にグレーのリボンで示されている。「スペーサー」／「リンカー」セグメントは、ＳＩＲＰα、ｈＩｇＧ４及びＬＩＬＲＢ２の構造要素間にグレーのリボン及び白いリボンで示されている。ｈＩｇＧ４のＦｃドメインのヒンジシステイン残基（複合体を安定化する）は、ＣＰＫ表示で示されている。

【図4】図４Ａは、本明細書において「ＤＳＰ４０４Ｖ１」（配列番号１３及び３０）と称されるＴＩＧＩＴ－ＳＩＧＬＥＣ１０ヘテロダイマーの概略図である。図４Ｂ～Ｃは、ＴＩＧＩＴ－ＳＩＧＬＥＣ１０ヘテロダイマーＤＳＰ４０４Ｖ１（配列番号１３及び３０）の予測される３Ｄ構造を示す。図４Ｂは、概略的３Ｄモデルであり、図４Ｃは、全原子３Ｄモデルである。ＴＩＧＩＴ（「ノブ」鎖中）は、グレーの表面表示で示されている（右側下）。ＳＩＧＬＥＣ１０（「ホール」鎖中）は、グレーの表面表示で示されている（右側上）。「ノブ」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側下に白い表面で示されている。「ホール」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側上にグレーの表面で示されている。「スペーサー」／「リンカー」セグメントは、ＴＩＧＩＴ、ｈＩｇＧ４及びＳＩＧＬＥＣ１０の構造要素間にグレーのリボン及び白いリボンで示されている。ｈＩｇＧ４のＦｃドメインのヒンジシステイン残基（複合体を安定化する）は、ＣＰＫ表示で示されている。

【図5】図５Ａは、本明細書において「ＤＳＰ５０２Ｖ１」（配列番号１３及び７）と称されるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの概略図である。図５Ｂ～Ｃは、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２Ｖ１（配列番号１３及び７）の予測される３Ｄ構造を示す。図５Ｂは、概略的３Ｄモデルであり、図５Ｃは、全原子３Ｄモデルである。ＴＩＧＩＴ（「ノブ」鎖中）は、グレーのリボン表示で示されている（右側下）。ＰＤ１（「ホール」鎖中）は、グレーのリボン表示で示されている（右側上）。「ノブ」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側下に白いリボンで示されている。「ホール」配列のｈＩｇＧ４は、図の右側上にグレーのリボンで示されている。「スペーサー」／「リンカー」セグメントは、ＴＩＧＩＴ、ｈＩｇＧ４及びＰＤ１の構造要素間にグレーのリボン及び白いリボンで示されている。ｈＩｇＧ４のＦｃドメインのヒンジシステイン残基（複合体を安定化する）は、ＣＰＫ表示で示されている。

【図6-1】図６Ａ～Ｂは、製造したいくつかのヘテロダイマー（以下の表１の記述及び配列を参照されたい）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析を示す。図６Ａは、還元（Ｒ）及び／又は非還元（ＮＲ）条件下で分離された、表示したヘテロダイマーをコードするプラスミドをトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の粗（未精製）５日目上清サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を提示する。対照サンプルは、非トランスフェクトＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の５日目の培養物の上清である。図６Ｂは、表示したプロテインＡ又はアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、表示したヘテロダイマーをコードする構築物をトランスフェクトした細胞の５日目上清から精製されたサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を提示する。

【図6-2】同上

【図6-3】同上

【図7】図７Ａ～Ｃは、製造したいくつかのヘテロダイマー（以下の表１の記述及び配列を参照されたい）のウエスタンブロット分析を提示する。図に示したサンプルは、表示したヘテロダイマーをコードするプラスミドをトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の粗（未精製）５日目上清である。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて非還元（ＮＲ）又は還元（Ｒ）条件で上清を分離した後、抗ＰＤ１（図７Ａ）、抗ＳＩＲＰα（図７Ｂ）又は抗ＬＩＬＲＢ２（図７Ｃ）抗体による免疫ブロッティングを行った。

【図8】図８Ａ～Ｂは、本明細書において「ＤＳＰ１２０」（配列番号１及び３）と称されるＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーのＣＤ４７及びＰＤＬ１への結合を示す。ＣＤ４７又はＰＤＬ１でプレコートした９６ウェルプレートにおいて、ヘテロダイマーを含有する上清又は対照上清（非トランスフェクトＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からのもの）をインキュベートした。インキュベーション後、抗ＰＤ－１（ＣＤ４７でコートしたプレートの場合）又はウサギ抗ヒトＳＩＲＰα抗体（ＰＤＬ１でコートしたプレートの場合）を用いて検出を行い、その後、対応するＨＲＰ結合二次抗体と共にインキュベートした。６２０を参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。図８Ａは、ＣＤ４７でコートしたプレートへのＤＳＰ１２０の濃度依存的結合を示し、図８Ｂは、ＰＤＬ１でコートしたプレートへのＤＳＰ１２０の濃度依存的結合を示す。

【図9-1】図９Ａ～Ｃは、本明細書において「ＤＳＰ２１６」（配列番号１及び１１、図９Ａ）及び「ＤＳＰ２１６Ｖ１」（配列番号５及び１５、図９Ｂ～Ｃ）と称されるＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーのＨＬＡ－Ｇへの結合を示す。ＨＬＡ－Ｇでプレコートした９６ウェルプレートにおいて、ヘテロダイマーを含有する上清又は対照上清（非トランスフェクトＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からのもの）をインキュベートした。６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダーを使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ウサギ抗ヒトＳＩＲＰα抗体と共にインキュベートした後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質と共にインキュベートすることによって結合を検出した。図９Ａは、ＨＬＡ－Ｇタンパク質でコートしたプレートへのＤＳＰ２１６の濃度依存的結合を示す。対照上清（対照）では結合が観察されなかった。図９Ｂ～Ｃは、ＤＳＰ２１６Ｖ１を含有する粗製上清（図９Ｂ）又は精製ＤＳＰ２１６Ｖ１（図９Ｃ）の、ＨＬＡ－Ｇでコートしたプレートに対する濃度依存的結合を示す。

【図9-2】同上

【図10】図１０Ａ～Ｂは、本明細書において「ＤＳＰ５０２」（配列番号９及び３）と称されるＰＤ１－ＴＩＧＩＴヘテロダイマーの、そのＰＶＲ対応物に対する結合を示す。ＰＶＲでプレコートした９６ウェルプレートにおいて、ヘテロダイマーを含有する上清若しくは対照上清（非トランスフェクトＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からのもの）（図１０Ａ）又は精製タンパク質（図１０Ｂ）をインキュベートした。インキュベーション後、抗ＰＤ１抗体を用いて検出を行い、その後、対応するＨＲＰ結合二次抗体と共にインキュベートした。６２０を参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。図１０Ａ～Ｂは、ＰＶＲでコートしたプレートへのＤＳＰ５０２の濃度依存的結合を示す。

【図11-1】図１１Ａ～Ｅは、フローサイトメトリー分析で決定される、ＰＤＬ１又はＣＤ４７を発現する細胞に対するＤＳＰ１２０及びＤＳＰ１２０Ｖ１の結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図１１Ａは、ＤＬＤ１－ＰＤＬ１過剰発現細胞株におけるＰＤＬ１の発現を示すヒストグラムである。ＰＤＬ１の表面発現レベルは、蛍光標識抗ＰＤＬ１抗体によるＤＬＤ１ ＷＴ及びＰＤＬ１過剰発現細胞株（ＤＬＤ１－ＰＤＬ１）の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。図１１Ｂは、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ４７ ＨＢ９クローン細胞におけるＣＤ４７受容体の発現を示すヒストグラムである。ＣＤ４７の表面発現レベルは、抗ＣＤ４７抗体によるＣＨＯ－Ｋ１ ＷＴ及びＣＤ４７過剰発現細胞株（クローンＨＢ９）の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。図１１Ｃ～Ｄは、ＤＬＤ１－ＷＴと比較して、ＤＬＤ１－ＰＤＬ１過剰発現細胞株に対するＤＳＰ１２０（図１１Ｃ）及びＤＳＰ１２０Ｖ１（図１１Ｄ）の結合を示す。ヘテロダイマーの細胞株への結合は、インキュベーション後、抗ＳＩＲＰα抗体を用いたそのＳＩＲＰαドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。図１１Ｅは、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ４７ ＨＢ９クローン細胞へのＤＳＰ１２０Ｖ１の結合を示す。ｈＣＤ４７過剰発現細胞株へのヘテロダイマーの結合は、インキュベーション後、抗ＩｇＧ４抗体を用いたそのＩｇＧ－Ｆｃドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＣＨＯ－Ｋ１ ＷＴ細胞は、結合アッセイのための陰性細胞対照として使用した。

【図11-2】同上

【図11-3】同上

【図12-1】図１２Ａ～Ｆは、フローサイトメトリー分析で決定される、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇを発現する細胞に対するＤＳＰ２１６及びＤＳＰ２１６Ｖ１の結合を示す。図１２Ａ及び１２Ｃは、ＨＴ１０８０（図１２Ａ）及びＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ（図１２Ｃ）細胞株におけるＣＤ４７の発現を示す。ＣＤ４７の細胞表面発現は、抗ヒト－ＣＤ４７抗体及びＩｇＧ１アイソタイプ対照による細胞株の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。図１２Ｂ及び１２Ｄは、ＨＴ１０８０（図１２Ｂ）及びＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ（図１２Ｄ）細胞株におけるＨＬＡ－Ｇの発現を示す。ＨＬＡ－Ｇの表面発現レベルは、抗ヒト－ＨＬＡ－Ｇ抗体及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照による細胞株の免疫染色によって決定した。図１２Ｅは、ＣＤ４７発現細胞ＨＴ１０８０へのＤＳＰ２１６の結合を示す。細胞株へのヘテロダイマーの結合は、インキュベーション後、ＬＩＬＲＢ２抗体を用いたそのＬＩＬＲＢ２ドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＬＩＬＲＢ２に対して陽性の細胞のパーセンテージを示し、これを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図１２Ｆは、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞株に対するヘテロダイマーＤＳＰ２１６Ｖ１を含有する上清の結合を示す。細胞株へのヘテロダイマーの結合は、抗ＩｇＧ４抗体を用いたＩｇＧ４骨格の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＭＦＩ値を示し、これを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図12-2】同上

【図12-3】同上

【図13】図１３は、フローサイトメトリー分析で決定される、本明細書において「ＤＳＰ４０２」（配列番号２４及び３）と称されるＳＩＧＬＥＣ１０－ＰＤ１ヘテロダイマーの、ＤＬＤ１ ＷＴ及びＰＤＬ１過剰発現細胞株への結合を示す。ＤＳＰ４０２と共に細胞をインキュベートした後、ＤＬＤ１ ＰＤＬ１過剰発現細胞株に対するヘテロダイマーの結合は、抗ＰＤ１抗体を使用したそのＰＤ１ドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＤＬＤ－１ ＷＴ細胞は、結合アッセイのための陰性細胞対照として使用した。ＭＦＩ値を示し、これを使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図14-1】図１４Ａ～Ｇは、本明細書において「ＤＳＰ５０２」（配列番号９及び３）と称されるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの、ＰＶＲ及びＰＤＬ１を発現する細胞に対する結合を示す。図１４Ａ～Ｃは、ＤＬＤ－１ ＷＴ（図１４Ａ）、ＤＬＤ－１ ＰＤＬ１（図１４Ｂ）及びＨＴ１０８０（図１４Ｃ）細胞株におけるＰＶＲの発現を示す。ＰＶＲの細胞表面発現は、ＡＰＣ標識抗ＰＶＲ抗体による細胞株の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＭＦＩ値を示した。図１４Ｄは、ＨＴ１０８０細胞におけるＰＤＬ１の発現を示す。ＰＤＬ１の表面発現レベルは、ＡＰＣ標識抗ＰＤＬ１抗体又はアイソタイプ対照による細胞株の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。図１４Ｅ～Ｆは、ＤＬＤ１ ＰＤＬ１（図１４Ｅ）又はＨＴ１０８０（図１４Ｆ）細胞に対するＤＳＰ５０２の結合を示す。細胞株へのヘテロダイマーの結合は、インキュベーション後、抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いたそのＩｇＧ１－Ｆｃドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＤＳＰ５０２の各ドメインに対する結合の特異性は、ＰＶＲ又はＰＤ－Ｌ１に対する遮断抗体と共に細胞をインキュベートすることによって試験した。図１４Ｇは、ＰＶＲを発現し、且つＰＤ１を発現しないＤＬＤ－１ ＷＴ細胞への結合によって示される、本明細書において「ＤＳＰ５０２Ｖ１」（配列番号１３及び７）、「ＤＳＰ５０２Ｖ２」（配列番号３１及び７）、「ＤＳＰ５０２Ｖ３」（配列番号３３及び７）と称されるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーのＰＶＲへの特異的結合を示す。ヘテロダイマーの結合は、抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いたそのＩｇＧ４－Ｆｃドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＭＦＩ値を示し、これを使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図14-2】同上

【図14-3】同上

【図14-4】同上

【図15】図１５は、製造したいくつかのヘテロダイマー（以下の表１の記述及び配列を参照されたい）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析を示す。図は、還元（Ｒ）及び／又は非還元（ＮＲ）条件下で分離された、表示したヘテロダイマーをコードするプラスミドをトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の粗（未精製）５日目上清サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を提示する。

【図16-1】図１６Ａ～Ｆは、ＨＴ１０８０－ＷＴ細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｇ（ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ）を過剰発現する細胞に対する、本明細書において「ＤＳＰ２１６」（配列番号１及び１１、図１６Ａ）、「ＤＳＰ２１６Ｖ１」（配列番号５及び１５、図１６Ｂ）、「ＤＳＰ２１６Ｖ３」（配列番号１３８及び１１、図１６Ｃ）、「ＤＳＰ２１６Ｖ４」（配列番号１４０及び１５、図１６Ｄ）、「ＤＳＰ２１６Ｖ５」（配列番号１４２及び１５０、図１６Ｅ）又は「ＤＳＰ２１６Ｖ６」（配列番号１４４及び１５０、図１６Ｆ）と称されるＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーの結合を示す。細胞株へのヘテロダイマーの結合は、表示されるように、遮断抗体の有無にかかわらずにインキュベートした後、ＡＰＣ結合抗ヒト－ＩｇＧ１抗体を用いたＩｇＧ骨格の免疫染色又はＤＳＰ２１６Ｖ１及びＤＳＰ２１６Ｖ４に対する抗ＳＩＲＰαを用いたＳＩＲＰαドメインの免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＧＭＦＩ値を示し、これを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図16-2】同上

【図16-3】同上

【図16-4】同上

【図17-1】図１７Ａ～Ｆは、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇの両方を発現するＪＥＧ－３細胞に対する、ＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６（配列番号１及び１１、図１７Ｃ）、ＤＳＰ２１６Ｖ３（配列番号１３８及び１１、図１７Ｄ）、ＤＳＰ２１６Ｖ５（配列番号１４２及び１５０、図１７Ｅ）又はＤＳＰ２１６Ｖ６（配列番号１４４及び１５０、図１７Ｆ）の結合を示す（図１７Ａ～Ｂ）。細胞株へのヘテロダイマーの結合は、表示されるように、遮断抗体の有無にかかわらずにインキュベートした後、抗ヒト－ＩｇＧ１抗体を用いたＩｇＧ骨格の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。ＧＭＦＩ値を示し、これを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図17-2】同上

【図17-3】同上

【図18-1】図１８Ａ～Ｄは、プレート結合（ＰＢ）組換えヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６（配列番号１及び１１、図１８Ａ）、ＤＳＰ２１６Ｖ１（配列番号５及び１５、図１８Ｂ）、ＤＳＰ２１６Ｖ３（配列番号１３８及び１１、図１８Ｃ）及びＤＳＰ２１６Ｖ４（配列番号１４０及び１５、図１８Ｄ）の結合を示す。ＣＤ４７でプレコートした９６ウェルプレートにおいて、ヘテロダイマーを含有する上清をインキュベートした。抗ヒトＩｇＧ１－又はＩｇＧ４－ＨＲＰ抗体と共にインキュベートし、６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出することによって結合を検出した。Ｏ．Ｄ．値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図18-2】図１８Ｅ～Ｈは、プレート結合（ＰＢ）組換えヒトＨＬＡ－Ｇに対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６（配列番号１及び１１、図１８Ｅ）、ＤＳＰ２１６Ｖ１（配列番号５及び１５、図１８Ｆ）、ＤＳＰ２１６Ｖ３（配列番号１３８及び１１、図１８Ｇ）及びＤＳＰ２１６Ｖ４（配列番号１４０及び１５、図１８Ｈ）の結合を示す。ＨＬＡ－Ｇでプレコートした９６ウェルプレートにおいて、ヘテロダイマーを含有する上清をインキュベートした。抗ヒトＩｇＧ１－又はＩｇＧ４－ＨＲＰ抗体と共にインキュベートし、６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出することによって結合を検出した。Ｏ．Ｄ．値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【図19-1】図１９Ａ～Ｉは、フローサイトメトリー分析で決定される、ＰＤＬ１及び／又はＰＶＲを発現する細胞に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）及び本明細書において「ＤＳＰ５０２Ｖ４」（配列番号１４６及び１４８）と称されるヘテロダイマーの結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図１９Ａは、ＤＳＰ５０２のＫ５６２ＰＤ－Ｌ１細胞への結合を示し、図１９Ｂは、ＤＳＰ５０２のＫ５６２ＰＤ－Ｌ１／ＰＶＲ細胞への結合を示し、図１９Ｃは、ＤＳＰ５０２Ｖ４のＫ５６２ＰＤ－Ｌ１細胞への結合を示し、図１９Ｄは、ＤＳＰ５０２Ｖ４のＫ５６２ＰＤ－Ｌ１／ＰＶＲ細胞への結合を示し、図１９Ｇは、ＤＳＰ５０２のＫ５６２ＰＶＲ細胞への結合を示し、及び図１９Ｈは、ＤＳＰ５０２Ｖ４のＫ５６２ＰＶＲ細胞への結合を示す。図１９Ｅ、１９Ｆ及び１９Ｉは、Ｋ５６２ＰＤ－Ｌ１、Ｋ５６２ＰＶＲ及びＫ５６２ＰＤ－Ｌ１／ＰＶＲ細胞において、表示されるようなＰＤＬ１又はＰＶＲの発現を示すヒストグラムである。ＰＤＬ１及びＰＶＲの表面発現レベルは、表示されるように、蛍光標識抗ＰＤＬ１又は抗ＰＶＲ抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。

【図19-2】同上

【図19-3】同上

【図20】図２０Ａは、表示されるように、遮断抗体の有無にかかわらずにインキュベートした後、フローサイトメトリー分析で決定される、ＰＶＲを発現するＳＫＯＶ３細胞に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図２０Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞におけるＰＶＲの発現を示すヒストグラムである。ＰＶＲの表面発現レベルは、蛍光標識抗ＰＶＲ抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。

【図21】図２１Ａは、表示されるように、遮断抗体の有無にかかわらずにインキュベートした後、フローサイトメトリー分析で決定される、マウスＰＤＬ１及びＰＶＲを発現するＲｅｎｃａ細胞に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図２１Ｂは、Ｒｅｎｃａ細胞におけるＰＤＬ－１及びＰＶＲの発現を示すヒストグラムを示す。ＰＤＬ１及びＰＶＲの表面発現レベルは、表示されるように、蛍光標識抗ＰＤＬ１又は抗ＰＶＲ抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。

【図22】図２２Ａは、フローサイトメトリー分析で決定される、マウス細胞株ＡＢ１２に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図２２Ｂは、ＡＢ１２細胞におけるＰＤＬ１及びＰＶＲの表面発現レベルを示すヒストグラムである。ＰＤＬ１及びＰＶＲの表面発現レベルは、表示されるように蛍光標識抗ＰＤＬ１又は抗ＰＶＲ抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。

【図23】図２３Ａは、表示されるように、遮断抗体の有無にかかわらずにインキュベートした後、フローサイトメトリー分析で決定される、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６細胞に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の結合を示す。示したＭＦＩ値を使用して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。図２３Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６細胞におけるＣＤ１６の発現を示すヒストグラムである。ＣＤ１６の表面発現レベルは、表示されるように、蛍光標識抗ＣＤ１６抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定した。

【図24】図２４は、種々の濃度のＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の存在下におけるＫ５６２－ＷＴ細胞又はＰＤＬ１及びＰＶＲ過剰発現Ｋ５６２細胞との共培養後のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６細胞からのルシフェラーゼ分泌レベルを示す。ルシフェラーゼ分泌レベルは、ルシフェラーゼと添加基質（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ）との相互作用によって生じる発光シグナルとして測定した。

【図25-1】図２５Ａは、ＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）のＴＩＧＩＴ及びＰＤ１ドメインの、その対応物であるリガンド／受容体に対する同時結合を示す。図２５Ａは、プレート結合ＰＤＬ１への結合を示し、続いてヒトＣＤ１５５（ＰＶＲ）－マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃとのインキュベーションを行った。５４０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ストレプトアビジンＨＲＰの後にＴＭＢ基質を添加することによって検出を行った。図２５Ｂ～Ｄは、種々の濃度のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の存在下におけるＮＫ細胞及びＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞のダブレット形成を示す。図２５Ｂは、蛍光標識抗ＣＤ１６抗体による細胞の免疫染色と、その後のフローサイトメトリー分析とによって決定される、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の発現レベルを示すヒストグラムである。図２５Ｃは、表示される濃度のＤＳＰ５０２の存在下でのダブレット形成を示す。図２５Ｄは、遮断剤抗体（表示されるように、Ｆｃ遮断、ＰＶＲ遮断又はＰＤ－Ｌ１遮断）と共にインキュベートした後、表示される濃度のＤＳＰ５０２の存在下でのダブレット形成を示す。Ｑ１（各パネルの左上４分の１）は、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１ ＣＦＳＥ標識細胞（Ｙ軸の陽性細胞）を表し、Ｑ３（各パネルの右下４分の１）は、ＮＫ ＣＰＤ標識細胞（Ｘ軸の陽性細胞）を表し、及びＱ２（各パネルの右上４分の１）は、ＮＫ－Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞のダブレットをダブレットのパーセンテージと共に表す。

【図25-2】同上

【図25-3】同上

【図26】図２６は、ビヒクル対照と比較した腫瘍体積の減少によって明らかである、ヒト化ＮＳＧマウスのＡ５４９－ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）のｉｎ－ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。各実験群でｎ＝５。

【図27】図２７は、ビヒクル対照と比較した生存期間の延長によって明らかである、ＡＢ１２中皮腫腫瘍を有するマウスにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）のｉｎ－ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。各実験群でｎ＝５。

【図28】図２８は、顆粒球による癌細胞の食作用に対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６（配列番号１及び１１、図１６Ａ）の効果を示す。ＨＴ１０８０又はＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞を標識し、０、１、２又は５μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６と共にプレインキュベートし、次に顆粒球と１：１で共培養し、フローサイトメトリーで分析した。３人のドナーから採取した顆粒球による食作用のパーセンテージを示した。

【図29】図２９Ａは、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の細胞傷害性効果を示す。ＤＳＰ５０２の存在下、表示したＫ５６２細胞を表示した比率でＮＫ細胞と共培養した後の、死細胞のパーセンテージを示す。バーの上のアスタリスクは、未処理の共培養物に対する統計的有意性を表す。図２９Ｂは、表示したＫ５６２細胞との共培養後、ＮＫ細胞からのグランザイムＢの分泌に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２（配列番号９及び３）の効果を示す。バーの上のアスタリスクは、未処理の共培養物に対する統計的有意性を表す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、Ｉ型膜タンパク質ヘテロダイマー及びその使用方法に関する。

【0041】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途が必ずしも以下の説明に示される詳細又は実施例によって例示される詳細に限定されるとは限らないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態又は様々な方法で実践若しくは実行することが可能である。

【0042】

癌の免疫療法は、免疫系の特定の成分を刺激するか、又は癌細胞により生成される免疫応答を抑制するシグナルを相殺することにより、腫瘍に対する免疫応答を増強することを目標とする。

【0043】

本発明の特定の実施形態を実行する間、本発明者らは、ここで、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のＩ型膜タンパク質の細胞外部分を含むヘテロダイマーを作製した（例えば、以下の表１を参照されたい）。

【0044】

したがって、本発明の一態様によると、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のポリペプチドを含むヘテロダイマーであって、前記２種のポリペプチドのそれぞれがその天然の結合相手に結合することができ、前記ヘテロダイマーが、その天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない、ヘテロダイマーが提供される。

【0045】

本明細書で使用する場合、「ヘテロダイマー」という用語は、２つの異なるタンパク質（本明細書においてモノマーと称する）の人工的な結合によって形成される天然に存在しないダイマータンパク質を指す。

【0046】

ダイマー化、特にヘテロダイマー化を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、ＮＡＴＩＶＥ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ ２Ｄゲル、ゲル濾過、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、分析超遠心分離（ＡＵＣ）質量分析（ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0047】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーは、共有結合されていない。

【0048】

他の特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーは、共有結合されている。

【0049】

他の特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーは、ジスルフィド結合で結合されている。

【0050】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーは、複数のジスルフィド結合で結合されている。

【0051】

本明細書で使用する場合、「ＳＩＲＰαポリペプチド」、「ＰＤ１ポリペプチド」、「ＴＩＧＩＴポリペプチド」、「ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド」及び「ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチド」という用語は、以下にさらに記載されるように、それぞれが少なくともその天然の結合相手に結合することができるＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０のアミノ酸配列又はその機能的ホモログを指す。

【0052】

本明細書で使用する場合、「機能的ホモログ」という表現は、少なくともその天然の結合相手に結合する全長タンパク質の活性を維持する保存的及び非保存的アミノ酸置換を含む断片、ホモログ（天然に存在するか若しくは合成的に／組換えで産生されたもの）及び／又はアミノ酸配列を指す。

【0053】

本明細書で使用する場合、「その天然の結合相手」という表現は、記載されるポリペプチドの本来のリガンド又は受容体を指す。

【0054】

結合を試験するためのアッセイは、当技術分野でよく知られており、フローサイトメトリー、ＢｉａＣｏｒｅ、バイオレイヤー干渉法Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイ、ＨＰＬＣが含まれるが、これらに限定されない。

【0055】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＰＤ１ポリペプチドを含む。

【0056】

本明細書で使用する場合、「ＰＤ１（プログラム死１、ＣＤ２７９としても知られている）」という用語は、ＰＤＣＤ１遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１３３）によりコードされるポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、ＰＤ１は、ヒトＰＤ１である。特定の実施形態によると、ＰＤ１は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００５００９で提供されるようなヒトＰＤ１を指す。

【0057】

これまで、ＰＤ１に対する２つのリガンド、ＰＤＬ１及びＰＤＬ２（Ｂ７－ＤＣとしても知られている）が特定されている。特定の実施形態によると、ＰＤＬ１タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１２５４６３５及びＮＰ＿０５４８６２で提供されるようなヒトタンパク質を指す。特定の実施形態によると、ＰＤＬ２タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０７９５１５で提供されるようなヒトタンパク質を指す。

【0058】

特定の実施形態によると、ＰＤ１アミノ酸配列は、配列番号３７を含む。

【0059】

特定の実施形態によると、ＰＤ１アミノ酸配列は、配列番号３７からなる。

【0060】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、１ｎＭ～１００μＭ、１０ｎＭ～１０μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、２００ｎＭ～１０μＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0061】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、約２７０ｎＭのＫｄでＰＤＬ１に結合する。

【0062】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、約８～９μＭのＫｄでＰＤＬ１に結合する。

【0063】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、ＰＤ１の細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0064】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４１、４２若しくは４３又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0065】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４１、４２又は４３を含む。

【0066】

特定の実施形態によると、ＰＤ１アミノ酸配列は、配列番号４１、４２又は４３からなる。

【0067】

「ＰＤ１ポリペプチド」という用語は、所望の活性（即ちＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号３７、４１、４２若しくは４３又は本明細書に開示される任意の他のＰＤ１アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一又は相同であり得るか、或いはそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であり得る。

【0068】

本明細書で使用する場合、「同一性」又は「配列同一性」は、包括的な同一性、即ち本明細書に開示されるアミノ酸又は核酸配列全体にわたる同一性を指し、その一部分にわたるものではない。

【0069】

配列同一性又は相同性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＭＵＳＣＬＥなど、任意のタンパク質又は核酸配列アライメントアルゴリズムを用いて決定することができる。

【0070】

ホモログは、以下でさらに記載されるように、オルソログ、欠失、挿入又は置換バリアント（アミノ酸置換を含む）も指すことができる。

【0071】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換を含み得る。このような置換は、当技術分野で知られており、例えばMaute et al. PNAS, 2015 Nov 24;112(47): E6506-14；Ju Yeon et al. Nature Communications 2016 volume 7, Article number: 13354 (DOI: 10.1038/ncomms13354)；Zack KM et al. Structure. 2015 23(12): 2341-2348 (DOI:10.1016/j.str.2015.09.010)及び米国特許出願公開第２０１６／００３９９０３号明細書に開示されており、これらの内容は、参照によって本明細書に完全に援用される。

【0072】

特定の実施形態によると、変異は、配列番号３７と比較して、ＰＤ１ポリペプチドのＰＤＬ１に対する親和性の増大をもたらす。

【0073】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応して、Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｖ７２、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｒ９０、Ｙ９６、Ｌ９７、Ａ１００、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６及びＡ１０７から選択されるアミノ酸残基に位置する。特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応して、Ｖ３９、Ｌ４０、Ｎ４１、Ｙ４３、Ｒ４４、Ｍ４５、Ｓ４８、Ｎ４９、Ｑ５０、Ｔ５１、Ｄ５２、Ｋ５３、Ａ５６、Ｑ６３、Ｇ６５、Ｑ６６、Ｃ６８、Ｖ７２、Ｈ８２、Ｍ８３、Ｒ９０、Ｙ９６、Ｌ９７、Ａ１００、Ｓ１０２、Ｌ１０３、Ａ１０４、Ｐ１０５、Ｋ１０６及びＡ１０７から選択されるアミノ酸残基に位置する。

【0074】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変化は、配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応して、（１）Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ、（２）Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ、（３）Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ、（４）Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ、（５）Ｒ４４Ｙ又はＲ４４Ｌ、（６）Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ又はＭ４５Ｄ、（７）Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ又はＳ４８Ｖ、（８）Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ又はＮ４９Ｓ、（９）Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ又はＱ５０Ｈ、（１０）Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ又はＴ５１Ａ、（１１）Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ又はＤ５２Ｖ、（１２）Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ、（１３）Ａ５６Ｓ又はＡ５６Ｌ、（１４）Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ又はＱ６３Ｐ、（１５）Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ又はＧ６５Ｖ、（１６）Ｑ６６Ｐ、（１７）Ｖ７２Ｉ、（１８）Ｈ８２Ｑ、（１９）Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ、（２０）Ｒ９０Ｋ、（２１）Ｙ９６Ｆ、（２２）Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ又はＬ９７Ｉ、（２３）Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ、（２４）Ｓ１０２Ｔ又はＳ１０２Ａ、（２５）Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ又はＬ１０３Ｆ、（２６）Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ又はＡ１０４Ｄ、（２７）Ｐ１０５Ａ、（２８）Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ又はＫ１０６Ｔ、及び（２９）Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ又はＡ１０７Ｖからなる群から選択される。

【0075】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変化は、配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応して、（１）Ｖ３９Ｈ又はＶ３９Ｒ、（２）Ｌ４０Ｖ又はＬ４０Ｉ、（３）Ｎ４１Ｉ又はＮ４１Ｖ、（４）Ｙ４３Ｆ又はＹ４３Ｈ、（５）Ｒ４４Ｙ又はＲ４４Ｌ、（６）Ｍ４５Ｑ、Ｍ４５Ｅ、Ｍ４５Ｌ又はＭ４５Ｄ、（７）Ｓ４８Ｄ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ４８Ｎ、Ｓ４８Ｇ又はＳ４８Ｖ、（８）Ｎ４９Ｃ、Ｎ４９Ｇ、Ｎ４９Ｙ又はＮ４９Ｓ、（９）Ｑ５０Ｋ、Ｑ５０Ｅ又はＱ５０Ｈ、（１０）Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ又はＴ５１Ａ、（１１）Ｄ５２Ｆ、Ｄ５２Ｒ、Ｄ５２Ｙ又はＤ５２Ｖ、（１２）Ｋ５３Ｔ又はＫ５３Ｌ、（１３）Ａ５６Ｓ又はＡ５６Ｌ、（１４）Ｑ６３Ｔ、Ｑ６３Ｉ、Ｑ６３Ｅ、Ｑ６３Ｌ又はＱ６３Ｐ、（１５）Ｇ６５Ｎ、Ｇ６５Ｒ、Ｇ６５Ｉ、Ｇ６５Ｌ、Ｇ６５Ｆ又はＧ６５Ｖ、（１６）Ｑ６６Ｐ、（１７）Ｃ６８Ｓ（１８）、Ｖ７２Ｉ、（１９）Ｈ８２Ｑ、（２０）Ｍ８３Ｌ又はＭ８３Ｆ、（２１）Ｒ９０Ｋ、（２２）Ｙ９６Ｆ、（２３）Ｌ９７Ｙ、Ｌ９７Ｖ又はＬ９７Ｉ、（２４）Ａ１００Ｉ又はＡ１００Ｖ、（２５）Ｓ１０２Ｔ又はＳ１０２Ａ、（２６）Ｌ１０３Ｉ、Ｌ１０３Ｙ又はＬ１０３Ｆ、（２７）Ａ１０４Ｓ、Ａ１０４Ｈ又はＡ１０４Ｄ、（２８）Ｐ１０５Ａ、（２９）Ｋ１０６Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｉ、Ｋ１０６Ｖ、Ｋ１０６Ｒ又はＫ１０６Ｔ、及び（３０）Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｉ又はＡ１０７Ｖからなる群から選択される。

【0076】

特定の実施形態によると、アミノ酸変異は、配列番号３７に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応するアミノ酸残基Ｃ９３（例えば、配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応するアミノ酸残基Ｃ６８に相当する）に位置する。

【0077】

したがって、特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号３９又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0078】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号３９を含む。

【0079】

特定の実施形態によると、ＰＤ１アミノ酸配列は、配列番号３９からなる。

【0080】

本明細書で使用する場合、「配列番号３７に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応する」、「配列番号３７に対応する」、「配列番号４２に記載されるＰＤ１アミノ酸配列に対応する」又は「配列番号４２に対応する」という表現は、任意の他のＰＤ１アミノ酸配列に関連して、対応するアミノ酸残基を含むことが意図される。

【0081】

保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、上記及び以下においてさらに提供される。

【0082】

本発明のいくつかの実施形態のＰＤ１ポリペプチドは、ポリペプチド配列番号３９、４１、４２、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９若しくは８１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であるか、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であり、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0083】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４３に対応するアミノ酸セグメントＰ１～Ｌ５及び／又はＦ１４６～Ｖ１５０のいずれも含まない。

【0084】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４３に対応するアミノ酸残基Ｐ１～Ｌ５及び／又はＦ１４６～Ｖ１５０のいずれも含まない。

【0085】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、１００～２８８アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１２０～１８０アミノ酸、１２０～１６０、１３０～１７０アミノ酸、１３０～１６０、１３０～１５０、１４０～１６０アミノ酸、１４５～１５５アミノ酸、１２３～１６６アミノ酸、１３８～１４５アミノ酸、１２３～１４８アミノ酸、１２６～１４８アミノ酸、１２３～１４０アミノ酸、１２６～１４０アミノ酸、１２７～１４０アミノ酸、１３０～１４０アミノ酸を含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0086】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号３９、４１、４２、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0087】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号３９、４１、４２、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0088】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４９又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0089】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４９を含む。

【0090】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドは、配列番号４９からなる。

【0091】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８、４０、４４、４６、４８、５０、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０又は８２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0092】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８、４０、４４、４６、４８、５０、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０及び８２からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0093】

特定の実施形態によると、ＰＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３８、４０、４４、４６、４８、５０、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０及び８２からなる群から選択される核酸配列からなる。

【0094】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチドを含む。

【0095】

本明細書で使用する場合、「ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質アルファ、ＣＤ１７２ａとしても知られている）」という用語は、ＳＩＲＰＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ １４０８８５）によりコードされるポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαは、ヒトＳＩＲＰαである。特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαは、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０３５１１１、ＮＰ＿００１０３５１１２、ＮＰ＿００１３１７６５７又はＮＰ＿５４２９７０で提供されるようなヒトＳＩＲＰαを指す。

【0096】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号８３を含む。

【0097】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαアミノ酸配列は、配列番号８３からなる。

【0098】

ＳＩＲＰαの既知の結合相手は、ＣＤ４７である。特定の実施形態によると、ＣＤ４７タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１７６８又はＮＰ＿９４２０８８で提供されるようなヒトタンパク質を指す。

【0099】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、０．１～１００μＭ、０．１～１０μＭ、１～１０μＭ、０．１～５μＭ又は１～２μＭのＫｄでＣＤ４７に結合し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0100】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、前記ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0101】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0102】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５を含む。

【0103】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５からなる。

【0104】

「ＳＩＲＰαポリペプチド」という用語は、所望の活性（即ちＣＤ４７への結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号８３若しくは８５又は本明細書に開示される任意の他のＳＩＲＰαアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一又は相同であり得るか、或いはそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であり得る。

【0105】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換を含み得る。このような置換は、当技術分野で知られており、例えばWeiskopf K et al. Science. (2013); 341(6141):88-91に開示されており、その内容は、参照によって本明細書に完全に援用される。

【0106】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応して、Ｌ４、Ｖ６、Ａ２１、Ａ２７、Ｉ３１、Ｅ４７、Ｋ５３、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｖ６３、Ｌ６６、Ｋ６８、Ｖ９２及びＦ９６から選択されるアミノ酸残基に位置する。

【0107】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応して、Ｌ４、Ａ２７、Ｅ４７及びＶ９２からなる群から選択されるアミノ酸残基における変異を含む。

【0108】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応して、Ｌ４Ｖ又はＬ４Ｉ、Ｖ６Ｉ又はＶ６Ｌ、Ａ２１Ｖ、Ａ２７Ｉ又はＡ２７Ｌ、Ｉ３１Ｆ又はＩ３１Ｔ、Ｅ４７Ｖ又はＥ４７Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ又はＨ５６Ｒ、Ｖ６３Ｉ、Ｌ６６Ｔ又はＬ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ及びＦ９４Ｌ又はＦ９４Ｖからなる群から選択される。

【0109】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応して、Ｌ４Ｉ、Ａ２７Ｉ、Ｅ４７Ｖ及びＶ９２Ｉからなる群から選択される変異を含む。

【0110】

本明細書で使用する場合、「配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαアミノ酸配列に対応する」又は「配列番号８５に対応する」という表現は、任意の他のＳＩＲＰαアミノ酸配列に関連して、対応するアミノ酸残基を含むことが意図される。

【0111】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８９又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0112】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８９を含む。

【0113】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８９からなる。

【0114】

保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、上記及び以下においてさらに提供される。

【0115】

本発明のいくつかの実施形態のＳＩＲＰαポリペプチドは、ポリペプチド配列番号８５、８７、８９、９１若しくは９３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であるか、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であり、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0116】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に対応するアミノ酸セグメントＫ１１７～Ｙ３４３を含まない。

【0117】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に対応するアミノ酸残基Ｋ１１７～Ｙ３４３のいずれも含まない。

【0118】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に対応するアミノ酸セグメントＰ１１８～Ｙ３４３を含まない。

【0119】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５に対応するアミノ酸残基Ｐ１１８～Ｙ３４３のいずれも含まない。

【0120】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、１００～５０４、１００～５００アミノ酸、１５０～４５０アミノ酸、２００～４００アミノ酸、２５０～４００アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３２０～４２０アミノ酸、３４０～３５０アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３４０～４５０アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１００～１５０アミノ酸、１００～１２５アミノ酸、１００～１２０アミノ酸、１００～１１９アミノ酸、１０５～１１９アミノ酸、１１０～１１９アミノ酸、１１５～１１９アミノ酸、１０５～１１８アミノ酸、１１０～１１８アミノ酸、１１５～１１８アミノ酸、１０５～１１７アミノ酸、１１０～１１７アミノ酸、１１５～１１７アミノ酸を含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0121】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５、８７、８９、９１及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0122】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５、８７、８９、９１及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0123】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号８５、８７、８９、９１及び９３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0124】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号８６、８８、９０、９２又は９４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0125】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号８６、８８、９０、９２及び９４からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0126】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号８６、８８、９０、９２及び９４からなる群から選択される核酸配列からなる。

【0127】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチドを含む。

【0128】

本明細書で使用する場合、「ＴＩＧＩＴ（Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）」という用語は、ＴＩＧＩＴ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ ２０１６３３）によりコードされるポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴは、ヒトＴＩＧＩＴである。特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴは、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿７７６１６０又はＸＰ＿０２４３０９１５６で提供されるようなヒトＴＩＧＩＴを指す。

【0129】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴアミノ酸配列は、配列番号１０６を含む。

【0130】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴアミノ酸配列は、配列番号１０６からなる。

【0131】

ＴＩＧＩＴの既知の結合相手は、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）である。特定の実施形態によると、ＣＤ１５５タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１１２９２４０、ＮＰ＿００１１２９２４１、ＮＰ＿００１１２９２４２、ＮＰ＿００６４９６で提供されるようなヒトタンパク質を指す。

【0132】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、０．０１～１００μＭ、０．１～１００μＭ、０．１～１０μＭ又は０．１～５μＭのＫｄでＣＤ１５５に結合し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0133】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0134】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０７、１１３若しくは１１５又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0135】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０７、１１３又は１１５を含む。

【0136】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０７、１１３又は１１５からなる。

【0137】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１１３を含む。

【0138】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１１３からなる。

【0139】

「ＴＩＧＩＴポリペプチド」という用語は、所望の活性（即ちＣＤ１５５への結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号１０６、１０７、１１３若しくは１１５又は本明細書に開示される任意の他のＴＩＧＴアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一又は相同であり得るか、或いはそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であり得る。

【0140】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換を含み得る。

【0141】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号１０６に記載されるＴＩＧＩＴアミノ酸配列に対応して、Ｉ４２及びＣ６９から選択されるアミノ酸残基に位置する。

【0142】

特定の実施形態によると、１つ又は複数のアミノ酸変異は、配列番号１０６位記載されるＴＩＧＩＴアミノ酸配列に対応して、Ｉ４２Ａ及びＣ６９Ｓからなる群から選択される。

【0143】

本明細書で使用する場合、「配列番号１０６に記載されるＴＩＧＩＴアミノ酸配列に対応する」又は「配列番号１０６に対応する」という表現は、任意の他のＴＩＧＩＴアミノ酸配列に関連して、対応するアミノ酸残基を含むことが意図される。

【0144】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０９若しくは１１１又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0145】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０９又は１１１を含む。

【0146】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０９又は１１１からなる。

【0147】

保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、上記及び以下においてさらに提供される。

【0148】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、１００～２４４アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１００～１５０アミノ酸、１２０～１４０アミノ酸を含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0149】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０８、１１０、１１２又は１１４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する。

【0150】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０８、１１０、１１２及び１１４からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0151】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０８、１１０、１１２及び１１４からなる群から選択される核酸配列からなる。

【0152】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0153】

本明細書で使用する場合、「ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２）」という用語は、ＬＩＬＲＢ２遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ １０２８８）によりコードされるポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２は、ヒトＬＩＬＲＢ２である。特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０７４４４７、ＮＰ＿００１２６５３３２、ＮＰ＿００１２６５３３３、ＮＰ＿００１２６５３３４、ＮＰ＿００１２６５３３５で提供されるようなヒトＬＩＬＲＢ２を指す。

【0154】

ＬＩＬＲＢ２の既知の結合相手は、主要組織適合性分子（ＭＨＣ、例えばＨＬＡ－Ｇ）である。特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、０．１ｎＭ～１００μＭ、０．１ｎＭ～１０μＭ、１ｎＭ～１μＭ、１～１００ｎＭ又は１～１０ｎＭのＫｄでＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ－Ｇ）に結合し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0155】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、前記ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0156】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９５又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0157】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９５を含む。

【0158】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９５からなる。

【0159】

ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメインは、Ｄ１～Ｄ４として知られている４つのＩｇ様ドメインを含む。

【0160】

したがって、特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。

【0161】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、少なくとも２つのＩｇ様ドメイン、少なくとも３つのＩｇ様ドメイン又は４つのＩｇ様ドメインを含む。

【0162】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１及びＤ２、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３、ＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ４又はＬＩＬＲＢ２のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４を含む。

【0163】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９６若しくは９８又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0164】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９６又は９８を含む。

【0165】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９６又は９８からなる。

【0166】

「ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド」という用語は、所望の活性（即ちＭＨＣ、例えばＨＬＡ－Ｇへの結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号９５、９６若しくは９８又は本明細書に開示される任意の他のＬＩＬＲＢ２アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一又は相同であり得るか、或いはそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であり得る。

【0167】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、上記及び以下においてさらに提供される。

【0168】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、１００～５９７アミノ酸、１００～５００アミノ酸、１００～４００アミノ酸、１５０～４００アミノ酸、３００～４００アミノ酸、３５０～４００アミノ酸、１５０～２５０アミノ酸を含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0169】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９６を含む。

【0170】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドは、配列番号９６からなる。

【0171】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９７又は９９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する。

【0172】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９７を含む。

【0173】

特定の実施形態によると、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９７からなる。

【0174】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0175】

本明細書で使用する場合、「ＳＩＧＬＥＣ－１０（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０）」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ１０遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ ８９７９０）によりコードされるポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０は、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１１６４６２７、ＮＰ＿００１１６４６２８、ＮＰ＿００１１６４６２９、ＮＰ＿００１１６４６３０、ＮＰ＿００１１６４６３２で提供されるようなヒトＳＩＧＬＥＣ１０を指す。

【0176】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列は、配列番号１００を含む。

【0177】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣアミノ酸配列は、配列番号１００からなる。

【0178】

ＳＩＧＬＣ１０の既知の結合相手は、ＣＤ２４及び／又はＣＤ５２上で発現されるシアル酸である。特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、ＳＰＲ分析で決定したとき、１ｎＭ～１００μＭ、０．０１～１００μＭ、０．０１～１０μＭ、０．１～１０μＭ、０．１～５μＭ又は０．１～１μＭのＫｄでＣＤ２４又はＣＤ５２に結合し、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0179】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ－１０ポリペプチドは、ＳＩＧＬＥＣ１０の細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0180】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。

【0181】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、少なくとも２つのＩｇ様ドメインを含む。

【0182】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、配列番号１０５又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0183】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、配列番号１０５を含む。

【0184】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列は、配列番号１０５からなる。

【0185】

「ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチド」という用語は、所望の活性（即ちＣＤ２４及び／又はＣＤ５２上で発現されるシアル酸への結合）を示す機能的ホモログも包含する。このようなホモログは、例えば、ポリペプチド配列番号１００若しくは１０５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一若しくは相同であり得るか、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列（以下でさらに記載される）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であり得る。

【0186】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ－１０ポリペプチドは、保存的及び非保存的アミノ酸置換を含み得る。

【0187】

特定の実施形態によると、１つの変異は、配列番号１００に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列に対応するアミノ酸残基Ｃ３６に位置する。

【0188】

特定の実施形態によると、１つのアミノ酸変異は、配列番号１００に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列に対応するＣ３６Ｓである。

【0189】

本明細書で使用する場合、「配列番号１００に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列に対応する」又は「配列番号１００に対応する」という表現は、任意の他のＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列に関連して、対応するアミノ酸残基を含むことが意図される。

【0190】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、配列番号１０３又はその機能的ホモログ（例えば、断片）を含む。

【0191】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドは、配列番号１０３を含む。

【0192】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ－１０ポリペプチドは、配列番号１０３からなる。

【0193】

保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、上記及び下記においてさらに提供する。

【0194】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０アミノ酸配列は、１００～６３９アミノ酸、１００～６００アミノ酸、１００～５５０アミノ酸、１００～３００アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１００～１５０アミノ酸を含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0195】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０２又は１０４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する。

【0196】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０４を含む。

【0197】

特定の実施形態によると、ＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０４からなる。

【0198】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＰＤ１ポリペプチド、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＴＩＧＩＴポリペプチド、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチド、ＰＤ１ポリペプチド及びＴＩＧＩＴポリペプチド、ＰＤ１ポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、ＰＤ１ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチド、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチド、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチド又はＬＩＬＲＢ２ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含み、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0199】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＰＤ１ポリペプチドを含む。

【0200】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαポリペプチドと、配列番号４９に記載されるＰＤ１ポリペプチドとを含む。

【0201】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0202】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαポリペプチドと、配列番号９６に記載されるＬＩＬＲＢ２ポリペプチドとを含む。

【0203】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９３に記載されるＳＩＲＰαポリペプチドと、配列番号９６に記載されるＬＩＬＲＢ２ポリペプチドとを含む。

【0204】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0205】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαポリペプチドと、配列番号１０３に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドとを含む。

【0206】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＳＩＲＰαポリペプチド及びＴＩＧＩＴポリペプチドを含む。

【0207】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号８５に記載されるＳＩＲＰαポリペプチドと、配列番号１０９に記載されるＴＩＧＩＴポリペプチドとを含む。

【0208】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＰＤ１ポリペプチドを含む。

【0209】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１０９、１１１又は１１３に記載されるＴＩＧＩＴポリペプチドと、配列番号４９に記載されるＰＤ１ポリペプチドとを含む。

【0210】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0211】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１０９に記載されるＴＩＧＩＴポリペプチドと、配列番号９６に記載されるＬＩＬＲＢ２ポリペプチドとを含む。

【0212】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＴＩＧＩＴポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0213】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１０９に記載されるＴＩＧＩＴポリペプチドと、配列番号１０３に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドとを含む。

【0214】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＰＤ１ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0215】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号４９に記載されるＰＤ１ポリペプチドと、配列番号１０３に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドとを含む。

【0216】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチド及びＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含む。

【0217】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９６に記載されるＬＩＬＲＢ２ポリペプチドと、配列番号１０３に記載されるＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドとを含む。

【0218】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ＰＤ１ポリペプチド及びＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含む。

【0219】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号４９に記載されるＰＤ１ポリペプチドと、配列番号９６に記載されるＬＩＬＲＢ２ポリペプチドとを含む。

【0220】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、その天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない。

【0221】

本明細書で使用する場合、「ＩＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列」という表現は、少なくともその天然の結合相手に結合することができるＩＩ型膜タンパク質の連続したアミノ酸配列を指す。特定の実施形態によると、このようなアミノ酸配列は、ＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメイン又はその機能的断片を含む。

【0222】

本明細書で使用する場合、「ＩＩ型膜タンパク質」という表現は、Ｃ末端細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を指す。

【0223】

このようなＩＩ型膜タンパク質の非限定的な例としては、４－１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＬＩＧＨＴ、ＶＥＧＩ、ＧＩＴＲＬ、ＥＤＡｌ／２、リンホトキシンアルファ及びリンホトキシンベータが挙げられる。

【0224】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、本明細書に開示される２種のポリペプチド以外に、その天然の結合相手に結合することができるＩ型膜タンパク質のアミノ酸配列を含まない。

【0225】

本明細書で使用する場合、「Ｉ型膜タンパク質のアミノ酸配列」という表現は、少なくとも天然の結合相手に結合することができるＩ型膜タンパク質の連続したアミノ酸配列を指す。特定の実施形態によると、このようなアミノ酸配列は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメイン又はその機能的断片を含む。

【0226】

本明細書で使用する場合、「Ｉ型膜タンパク質」という表現は、Ｎ末端細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を指す。

【0227】

このようなＩ型膜タンパク質の非限定的な例としては、ＬＡＧ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＥＮＧ、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＣＤ８４、ＣＤ４０、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１６４、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＩＬＲＢ１、ＴＹＲＯＢＰ、ＩＣＯＳ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＧＤＮＦ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＭＩＣＡ、ＮＲＧ１、ＨＶＥＭ、ＤＲ３、ＴＥＫ、ＴＧＦＢＲ（例えば、ＴＧＦＢＲ１）、ＬＹ９６、ＣＤ９６、ＫＩＴ、ＣＤ２４４及びＧＦＥＲが挙げられる。

【0228】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、本明細書に開示される２種のポリペプチド及び任意選択で、以下でさらに記載されるダイマー化部分（例えば、抗体又はその断片のＦｃドメイン）以外に、タンパク性のターゲティング、シグナル伝達、免疫調節部分及び／又は治療部分を含まない。

【0229】

このような部分の非限定的な例としては、サイトカイン、リガンド、受容体、免疫調節ポリペプチド及び抗体の結合ドメイン（例えば、ＳｃＦｖ）が挙げられる。

【0230】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、本明細書に記載される２種のポリペプチドと、任意選択で、以下でさらに記載されるダイマー化部分（例えば、抗体又はその断片のＦｃドメイン）とからなる。

【0231】

他の特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、異種の治療部分に結合するか、又は異種の治療部分を含む。治療部分は、小分子化合物及びポリペプチドを含む任意の分子であり得る。

【0232】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができる治療部分の限定的な例としては、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、免疫調節部分、ポリペプチド、抗体、薬物、化学物質及び／又は放射性同位体が挙げられる。

【0233】

本発明のいくつかの実施形態によると、治療部分は、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療部分をコードする核酸配列と翻訳的に融合させることによって結合される。

【0234】

付加的又は代替的に、治療部分は、当業者に知られている任意の結合方法を用いて、本発明のいくつかの実施形態のヘテロダイマーに化学的に結合（カップリング）させることができる。例えば、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナートとも呼ばれる）（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ－３４１５、例えばCumber et al. 1985, Methods of Enzymology 112: 207-224を参照されたい）、グルタルアルデヒド結合手順（例えば、G.T. Hermanson 1996, “Antibody Modification and Conjugation, in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diegoを参照されたい）又はカルボジイミド結合手順［例えば、J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction’s, Mechanism, and Structure, pp. 349-50 & 372-74 (3d ed.), 1985；B. Neises et al. 1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522；A. Hassner et al. 1978, Tetrahedron Lett. 4475；E.P. Boden et al. 1986, J. Org. Chem. 50:2394及びL.J. Mathias 1979, Synthesis 561を参照されたい］を用いて、ペプチドを目的の薬剤に結合させることができる。

【0235】

治療部分は、例えば、当技術分野において広く実施されている標準的な化学合成技術［例えば、hypertexttransferprotocol://worldwideweb (dot) chemistry (dot) org/portal/Chemistry)を参照されたい］を用いて、例えばペプチド結合（機能的部分がポリペプチドである場合）又はリンカーペプチド若しくは他の化学部分（有機ポリマーなど）などの介在リンカーエレメントへの共有結合による直接又は間接的な任意の好適な化学結合を用いて、本発明のいくつかの実施形態のヘテロダイマーに結合させることができる。キメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）若しくはアミノ（Ｎ）末端における結合又は直鎖状、分枝状若しくは環状側鎖などの内部化学基、内部炭素若しくは窒素原子などへの結合によって結合され得る。

【0236】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、検出可能なタグを含む。したがって、特定の実施形態によると、ヘテロダイマー中に含まれるポリペプチドのいずれも検出可能なタグを含み得る。本明細書で使用する場合、一実施形態では、「検出可能なタグ」という用語は、当技術分野で既知の技術を用いて当業者が検出することができる任意の部分を指す。検出可能なタグは、ペプチド配列であり得る。任意選択で、検出可能なタグは、化学薬品又はタンパク質分解などの酵素的手段によって除去可能であり得る。本発明のいくつかの実施形態の検出可能なタグは、ポリペプチド又はヘテロダイマーの精製のために使用することができる。例えば、「検出可能なタグ」という用語は、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、エピトープタグ、例えばＶ５タグ、ｃ－ｍｙｃタグ及びＨＡタグ並びに蛍光タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）並びにこれらのタグの誘導体又は当技術分野で知られている任意のタグを含む。「検出可能なタグ」という用語は、「検出可能なマーカー」という用語も含む。

【0237】

特定の実施形態によると、ポリペプチドは、そのＮ末端に結合した検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含む。

【0238】

特定の実施形態によると、ポリペプチドは、そのＣ末端に結合した検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含む。

【0239】

特定の実施形態によると、ポリペプチドのＮ末端は、検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含まない。

【0240】

特定の実施形態によると、ポリペプチドのＣ末端は、検出可能なタグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）を含まない。

【0241】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、切断可能な部分を含む。したがって、特定の実施形態によると、ヘテロダイマー中に含まれるポリペプチドのいずれも切断可能な部分に融合され得る。したがって、例えば回収を容易にするために、発現されるコード配列は、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドと、融合した切断可能な部分とをコードするように工学的に操作することができる。一実施形態では、ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば切断可能な部分に特異的なカラムにおける固定化によって容易に単離されるように設計される。一実施形態では、切断部位は、ポリペプチドと、切断可能な部分との間で工学的に操作され、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素又は薬剤による処理により、ペプチドをクロマトグラフィーカラムから放出させることができる［例えば、Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)及びGardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)を参照されたい］。特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、本明細書に開示される２種のポリペプチドに結合されたダイマー化部分を含む。

【0242】

本明細書で使用する場合、「ダイマー化部分」という用語は、ヘテロダイマーを形成するために２種の異なるモノマーを結合することができる部分を指す。このようなダイマー化部分は、当技術分野で知られており、化学部分及びタンパク性部分を含む。

【0243】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ポリペプチドに直接結合されている。

【0244】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ポリペプチドに非直接的に結合されている。

【0245】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ポリペプチドに共有結合されている。

【0246】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ポリペプチドに共有結合されていない。

【0247】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ポリペプチドに対して異種である。

【0248】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、少なくとも２種の異なる分子の組成物である。

【0249】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、２種のポリペプチドの少なくとも１つの天然の結合相手を発現する細胞及び／又は２種のポリペプチドの天然の結合相手を発現する細胞に対してヘテロダイマーが結合したとき、免疫応答を活性化することができる。

【0250】

本明細書で使用する場合、「活性化する」という表現は、細胞の増殖、成熟化、サイトカインの生成及び／又は調節機能若しくはエフェクター機能の誘導をもたらす免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ）の刺激を指す。免疫細胞の活性化又は機能を評価する方法は、当技術分野でよく知られており、ＢＲＤＵ及びチミジン取込みなどの増殖アッセイ、クロム放出などの細胞傷害性アッセイ、細胞内サイトカイン染色ＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡなどのサイトカイン分泌アッセイ、フローサイトメトリーを用いたＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ６９などの活性化マーカーの発現並びにマルチマー（例えば、テトラマー）アッセイが含まれるが、これらに限定されない。

【0251】

特定の実施形態と共に使用され得るこのようなダイマー化部分の非限定的な例は、以下でさらに記載されるように、抗体のＦｃドメインである。

【0252】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、非タンパク性部分、例えば架橋剤、有機ポリマー、合成ポリマー、小分子等である。

【0253】

複数のこのような非タンパク性部分が当技術分野で知られており、例えば下記から購入可能である：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｐｒｏｔｅｏｃｈｅｍ社等。特定の実施形態によると、非タンパク性部分は、ヘテロ二機能性架橋剤である。ヘテロ二機能性架橋剤は、２つの異なる反応末端を有する。典型的には、第一の工程において、ヘテロ二機能性架橋剤の１つの反応性基でモノマーを修飾し、残存する遊離試薬を除去する。第二の工程において、修飾したモノマーを第２のモノマーと混合し、且つ試薬のもう一方の末端の修飾基と反応させる。最も広く使用されているものは、アミン基及びスルフヒドリル基を介してタンパク質をカップリングさせる（最も不安定なアミン反応性ＮＨＳエステルが初めにカップリングし、未結合試薬を除去した後、スルフヒドリル基のカップリングが進行する）。スルフヒドリル反応基は、通常、マレイミド、ピリジルジスルフィド及びアルファ－ハロセチルである。他の架橋剤としては、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）と一級アミン（－ＮＨ_２）との間を繋ぐカルボジイミドが挙げられる。別の手法は、１つのモノマーのリシン残基をチオールに修飾し、第２のモノマーをマレイミド基の付加によって修飾し、続いてモノマー間に安定なチオエステル結合を形成する。モノマーの内の１種が元々チオールを有する場合、これらの基を他のモノマーに結合したマレイミドと直接反応させることができる。ビス［２－（４－アジドサリチルアミド）エチル）］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）等、１つの光反応性末端を有するヘテロ二機能性架橋剤も存在する。光反応性基は、反応するための特定の基が存在しないときに使用され、これは、ＵＶ光への暴露によって光反応性基が非特異的に反応するためである。このようなヘテロ二機能性架橋剤の非限定的な具体例としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない：アルキン－ＰＥＧ４－マレイミド、アルキン－ＰＥＧ５－Ｎ－ヒドロキシサクシニミジルエステル、マレイミド－ＰＥＧ－サクシニミジルエステル、アジド－ＰＥＧ４－フェニルオキサジアゾールメチルスルホン、ＬＣ－ＳＭＣＣ（サクシニミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート））、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩化水素＋１／２ジオキサン）、ＰＤＰＨ（３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、ＳＩＡＢ（Ｎ－サクシニミジル（４－イオドアセチル）アミノ安息香酸）、ＳＭＰＨ（サクシニミジル－６－（（ｂ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸）、スルホ－ＫＭＵＳ（Ｎ－（κ－マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホサクシニミドエステル）、スルホ－ＳＩＡＢ（スルホサクシニミジル（４－イオドアセチル）アミノベンゾエート）、３－（マレイミド）プロピオン酸 Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステル、塩化メトキシカルボニルスルフェニル、プロパルギル－ＰＥＧ－酸、アミノ－ＰＥＧ－ｔ－ブチルエステル、ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ５－酸、ＢＭＰＨ（Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩）、ＡＮＢ－ＮＯＳ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＬＣ－ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＳＢＡ、ＳＩＡ、スルホ－ＳＩＡ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＰＤＰ、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＡＮＰＡＨ、スルホ－ＳＭＣＣ。

【0254】

他の特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、タンパク性部分である。

【0255】

他の特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、タンパク性ダイマー部分である。

【0256】

特定の実施形態によると、ポリペプチドは、ダイマー化タンパク性部分のＮ末端に結合されている。

【0257】

特定の実施形態によると、２種のポリペプチドは、ダイマー化タンパク性部分のＮ末端に結合されている。

【0258】

特定の実施形態によると、ポリペプチドは、ダイマー化タンパク性部分のＣ末端に結合されている。

【0259】

特定の実施形態によると、２種のポリペプチドは、ダイマー化タンパク性部分のＣ末端に結合されている。

【0260】

特定の実施形態によると、２種のポリペプチドの１つは、ダイマー化タンパク性部分のＮ末端に結合されており、２種のポリペプチドの第２のものは、ダイマー化タンパク性部分のＣ末端に結合されている。

【0261】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、２種の異なる親和性相補性タグのための２種の別個の親和性部分を有するポリペプチドの親和性ペアを含む。このような親和性ペアは、当技術分野で知られており、下記が挙げられるが、これらに限定されない：ヘマグルチニン（ＨＡ）、抗ＨＡ、ＡｖｉＴａｇＴＭ、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｈｉｓ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、リザベジン、金属親和性タグ、レクチン親和性タグ。当業者は、いずれのタグを選択すべきかわかるであろう。

【0262】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、任意の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）又はその断片のＦｃドメインである。

【0263】

特定の実施形態によると、Ｆｃは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥのものである。

【0264】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ＩｇＧのものである。

【0265】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のものである。

【0266】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のものである。本発明の特定の実施形態と共に使用することができるヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号１３４に提供される。

【0267】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のものである。本発明の特定の実施形態と共に使用することができるヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号１３７及び１５６に提供される。

【0268】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、Ｆｃドメインモノマーである。

【0269】

他の特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、Ｆｃドメインダイマーである。

【0270】

抗体のＦｃドメインを用いてヘテロダイマーを作製する際に使用可能な複数の機構が存在し、ノブ・イントゥ・ホール法又は電荷ペア法（例えば、Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. (2010) 285(25):19637を参照されたく、参照によってその全てが本明細書に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0271】

したがって、特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、保存的及び非保存的アミノ酸置換（本明細書において変異とも称する）を有し得る。

【0272】

タンパク質に参照して配列同一性のパーセンテージが使用されるとき、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なり、このとき、アミノ酸残基は、類似した化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基によって置換され、そのため、分子の機能的性質は、変更されない。配列が保存的置換によって異なる場合、置換の保存的性質について修正するためにパーセント配列同一性は、上向きに調製され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると考えられる。このような調整を行うための手段は、当業者に広く知られている。典型的には、保存的置換を完全なミスマッチではなく、部分的なミスマッチとしてスコア付けすることを含み、それによりパーセンテージ配列同一性を増やす。したがって、例えば同一アミノ酸のスコアが１であり、非保存的置換のスコアが０であるとき、保存的置換に０～１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアを例えばHenikoff S and Henikoff JG.［Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992,89(22): 10915-9］のアルゴリズムに従って計算する。

【0273】

保存的アミノ酸及び非保存的アミノ酸置換に関するさらなる説明は、後述される。

【0274】

このようなＦｃドメインの置換は、当技術分野で公知である。

【0275】

本発明の特定の実施形態と共に使用可能な代表的な例は、「ノブ・イントゥ・ホール」（「ＫＩＨ」）型である。このようなノブ及びホール変異は、当技術分野で広く知られており、例えば米国特許第８，２１６，８０５号明細書、Shane Atwell et Al. J. Mol. Biol. (1997) 270, 26-35、Cater et al.（Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621, 1996）及びA. Margaret Merchant et.al. Nature Biotechnology (1998) 16 Julyに開示されており、これらの内容は、参照によって本明細書に援用される。さらにMerchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)に記載されているように、これらの「ノブ及びホール」変異は、ヘテロダイマー化を防ぐためにジスルフィド結合と組み合わせることができる。

【0276】

したがって、特定の実施形態によると、モノマーの内の１つは、ノブ変異を含むＦｃドメインを含み、他のモノマーは、ホール変異を含むＦｃドメインを含む。

【0277】

特定の免疫グロブリンのクラス及びサブクラスから特定の免疫グロブリンのＦｃドメインを選択することと、ノブ変異に対する第１のＦｃバリアント及びホール変異に対する他方のＦｃバリアントを選択することとは、当業者の範囲内である。特定の実施形態と共に使用することができる置換の非限定的な例としては、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｔ３６６Ｗ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び／若しくはＥ３５６Ｃ［全長抗体の一部としてのヒトＩｇＧ４に対応して、ＥＵ番号付け（Kabat, E.A., T.T. Wu, M. Reid-Miller, H.M. Perry and K.S. Gottesman. 1987. Sequences of proteins of Immunological Interest. US. Dept. of Health and Human Services, Bethesda）に従う］又はＬ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３５４Ｃ、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／若しくはＹ４０７Ｖ［全長抗体の一部としてのヒトＩｇＧ１に対応して、ＥＵ番号付け（Kabat, E.A., T.T. Wu, M. Reid-Miller, H.M. Perry and K.S. Gottesman. 1987. Sequences of proteins of Immunological Interest. US. Dept. of Health and Human Services, Bethesda）に従う］が挙げられる。

【0278】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができるノブ変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号１３５、１５７、１５８及び１６３に提供される。

【0279】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができるホール変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号１３６、１５９及び１６４に提供される。

【0280】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができるノブ変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号２７、５１、１５４及び１６０に提供される。

【0281】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができるホール変異を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインの非限定的な例は、配列番号２８、５２、１５２、１６１及び１６２に提供される。

【0282】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、配列番号２７、２８、５１、５２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５２、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３及び１６４からなる群から選択されるアミノ酸配列又は本明細書に開示されるような所望の活性を示すその機能的断片に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性若しくは相同性を有するアミノ酸配列或いはそれをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0283】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、配列番号１３５～１３６、２７～２８又は５１～５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0284】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、その免疫活性化機能の低下、及び／又は融合体の半減期の改善が生じるように修飾される。

【0285】

特定の実施形態によると、天然の結合相手が健康な細胞において発現されることが知られている場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合及び／又はその免疫活性化機能が低下するように修飾される。

【0286】

特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーは、Ｆｃ受容体に対するその結合及び／又はその免疫活性化機能が低下するように修飾される。

【0287】

他の特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、その免疫活性化機能の低下、及び／又は融合体の半減期の改善が生じるようには修飾されない。

【0288】

特定の実施形態によると、天然の結合相手が病的細胞（例えば、癌細胞）において単独で発現又は過剰発現されることが知られている場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、及び／又はその免疫活性化機能の低下が生じるようには修飾されない。

【0289】

特定の実施形態によると、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーは、Ｆｃ受容体に対するその結合の変更、及び／又はその免疫活性化機能の低下を生じるようには修飾されていないＦｃドメインを含む。

【0290】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩ、Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩ及びＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩ）に対する結合を低減又は防止するように修飾される。このような修飾は、例えば、一連の変異体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆｃドメイン並びにこれらのＦｃ、ガンマ、Ｒ結合特性を設計及び記載したＣｌａｒｋらによって記載されている（Armour et al., 1999；Armour et al., 2002、これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおいてＦｃ受容体に対するその結合を低下させるような付加的又は代替的な修飾は、アミノ酸Ｌ２３４及びＬ２３５［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］がＦｃ受容体の結合にとって必須であると同定したＣＨＡＰＰＥＬら（Proc. Natl. Acad. Sci (1991) 88: 9036-9040、その内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）によって記載されている。Ｐ３２９のＧへの付加的な置換によって結合はさらに弱くなり、このＬＡＬＡ－ＰＧの置換の組合せは、例えば、Schlothauer, T., et al. (2016) Protein Eng. Des. Sel. 29, 457-466及び国際公開第２０１２／１３０８３１号（これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）によって記載されている。Ｆａｂアーム交換を防止し、Ｆｃ受容体に対するその結合を低下させるようなヒトＩｇＧ４のＦｃにおける付加的又は代替的な修飾は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］をそれぞれ同定した、John-Paul Silva et al.（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2015), 290: 9, 5462-5469、その内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）及びNewman et al.（Clinical Immunology (2001) 98:2、その内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）によって記載されている。

【0291】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を最大にするように修飾される。このような修飾は、例えば、Shields RL J Biol Chem. (2001) 276:6591、Smith P, Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109:6181、Stavenhagen et al., Cancer Res (2007) 67:8882、Lazar et al., Proc Natl Acad Sci UCA (2006) 103:4005、Richards et al., 2008 Cancer Ther 7:2517及びMimoto et al., (2013) MAbs 5:229（これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される）によって記載されている。特定の実施形態と共に使用することができるこのような修飾の非限定的な例には、Ｓ２９８、Ｅ３３３及びＫ３３４（例えば、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及びＡ３３０Ｌ、２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅから選択される１つ又は複数のアミノ残基における置換［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］並びに非対称置換（一方の重鎖におけるＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ及び反対の重鎖におけるＤ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅが含まれる）。

【0292】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、エフェクター機能の変更（例えば、補体結合の低減）、及び／又は補体依存性細胞傷害の低下又は消失が生じるように修飾される。このような修飾は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号、Wines et al., 2000、Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661及びCanfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173: 1483に記載されており、これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。特定の実施形態と共に使用することができるこのような修飾の非限定的な例には、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２；３２９、３３１及び３２２；Ｌ２３４及び／又はＬ２３５（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ）；Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１（例えば、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ及びＰ３３１Ａ）から選択される位置［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］における１つ又は複数のアミノ酸の置換が含まれる。

【0293】

特定の実施形態によると、Ｆｃドメインは、融合タンパク質の半減期の改善が生じるように修飾される。このような改変は、例えば、米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載されており、これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。例えば、２５２（例えば、Ｔｈｒを導入するため）、２５４（例えば、Ｓｅｒを導入するため）及び２５６（例えば、Ｐｈｅを導入するため）から選択される位置［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］における１つ又は複数のアミノ酸の置換である。半減期を改善するための別の修飾は、ＣＨ１又はＣＬ領域を改変して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループにおいて見られるようなサルベージ受容体モチーフを導入することによるものであり得る。

【0294】

ＦｃＲｎ結合を最大にし、半減期を延長することは、例えば、Stapleton NM, Nat Commun. (2011) 2:599、Shields RL. J Biol Chem. (2001) 276:6591、Dall’acqua WF J Immunol. (2002) 169:5171、Zalevsky J, Nat Biotechnol. (2010) 28:157、Ghetie V,.Nat. Biotechnol. (1997) 15:637及びMonnet C, MAbs. (2014) 6:422にも記載されており、これらの内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。特定の実施形態と共に使用することができるこのような修飾の非限定的な例には、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ；Ａｓｎ４３４Ａｌａ；Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ及びＴｈｒ２５６Ｇｌｕ；Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ；Ｔｈｒ２５２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒ及びＴｈｒ２５４Ｐｈｅ；Ｇｌｕ２９４ｄｅｌｔａ、Ｔｈｒ３０７Ｐｒｏ及びＡｓｎ４３４Ｔｙｒ；Ｔｈｒ２５６Ａｓｎ、Ａｌａ３７８Ｖａｌ、Ｓｅｒ３８３Ａｓｎ及びＡｓｎ４３４Ｔｙｒから選択される１つ又は複数のアミノ酸残基［全長抗体に対応するＥＵ番号付け（Kabat et al.）に従う］の置換が含まれる。

【0295】

特定の実施形態によると、ダイマー化部分は、ロイシンジッパー又はヘリックス－ループ－ヘリックスを含む。

【0296】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマー中に含まれる部分のそれぞれは、部分間、例えばポリペプチド（例えば、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２、ＳＩＧＬＥＣ１０）とダイマー化部分との間を隔てるリンカーを含み得る。

【0297】

他の特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ポリペプチド（例えば、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２、ＳＩＧＬＥＣ１０）とダイマー化部分との間にリンカーを含まない。

【0298】

当技術分野で知られているリンカーのいずれも本発明の特定の実施形態と共に使用することができる。

【0299】

特定の実施形態によると、リンカーは、天然に存在する多ドメインタンパク質に由来し得るか、又は例えばChichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2): 153-167、Chen et al, (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369（これらの全内容は、参照によって本明細書に援用される）に記載されるような経験的リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369及びCrasto et al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312（これらの全内容は、参照によって本明細書に援用される）に記載されるものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを用いて設計され得る。

【0300】

特定の実施形態によると、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。

【0301】

特定の実施形態によると、リンカーは、機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、フォールディング及び／又は安定性の改善、発現の改善、薬物動態の改善、及び／又はヘテロダイマーの生物学的活性の改善を生じるように機能し得る。別の例では、リンカーは、ヘテロダイマーを特定の細胞型又は位置に向けるように機能し得る。

【0302】

特定の実施形態によると、リンカーは、ポリペプチドである。

【0303】

ポリペプチドリンカーの非限定的な例には、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２４）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ｎ＝１～４）（配列番号１２３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１２２）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ２（配列番号１２５）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ２＋ＧＧＧＧ（配列番号１２１）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ３（配列番号１１７）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ４（配列番号１１８）、（Ｇｌｙ）_８（配列番号１１９）、（Ｇｌｙ）_６（配列番号１２０）、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１～３）（配列番号１２６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号１２７）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１２８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号１２９）、ＰＡＰＡＰ（配列番号１３０）、Ｋ ＥＳＧＳＶＳＳ ＥＱ ＬＡＱ ＦＲＳ ＬＤ（配列番号１３１）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１３２）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１３３）及び（ＸＰ）_ｎ（Ｘは、任意のアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを指定する）を有するリンカーが含まれる。

【0304】

特定の実施形態によると、リンカーは、配列番号１１７を含む（限定されないが、例えばＬＩＬＲＢ２ポリペプチドとＦｃドメインとの間のリンカーとして）。

【0305】

特定の実施形態によると、リンカーは、配列番号１２５を含む（限定されないが、例えばＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ又はＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドとＦｃドメインとの間のリンカーとして）。

【0306】

特定の実施形態によると、リンカーは、１～６アミノ酸の長さである。

【0307】

特定の実施形態によると、リンカーは、実質的にグリシン及び／又はセリン残基で構成される（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％、又は１００％のグリシン及びセリン）。

【0308】

特定の実施形態によると、リンカーは、単一アミノ酸のリンカーである。

【0309】

本発明のいくつかの実施形態では、１つのアミノ酸は、グリシンである。

【0310】

特定の実施形態によると、リンカーは、抗体又はその断片のＦｃドメイン又はヒンジ領域ではない。

【0311】

本明細書に開示されるヘテロダイマーは、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０からなる群から選択される２種のポリペプチドを含む。このようなヘテロダイマーの可能な配置の非限定的な例は、図１Ａに概略的に示される。

【0312】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーの配置は、図１Ａのパネル１～６に示される配置から選択され、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0313】

特定の実施形態によると、２種のポリペプチドは、ヘテロダイマーのモノマー中に含まれる。本発明の特定の実施形態と共に使用され得るこのようなヘテロダイマー配置の非限定的な例は、図１Ａのパネル１～２に示される。

【0314】

したがって、特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーの１つは、２種のポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。

【0315】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーの１つは、タンパク性ダイマー化部分（例えば、抗体又はその断片のＦｃドメイン）によって結合された２種のポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。

【0316】

本明細書で使用する場合、「融合ポリペプチド」という用語は、天然では単一のアミノ酸配列中に一緒に見出されない２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。

【0317】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーの１つは、ノブ変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインによって結合された２種のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであり、他方のモノマーは、ホール変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインを含む。

【0318】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーのモノマーの１つは、ホール変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインによって結合された２種のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであり、他方のモノマーは、ノブ変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインを含む。

【0319】

他の特定の実施形態によると、２種のポリペプチドのそれぞれは、ヘテロダイマー中のモノマーである。本発明の特定の実施形態と共に使用され得るこのようなヘテロダイマー配置の非限定的な例は、図１Ａのパネル３～６に示される。特定の実施形態によると、ヘテロダイマー配置は、図１Ａのパネル５に示される通りである。

【0320】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、タンパク性ダイマー化部分（例えば、抗体又はその断片のＦｃドメイン）に結合された（例えば、翻訳融合として）２種のポリペプチドの１つを含む第１のモノマーと、タンパク性ダイマー化部分（例えば、抗体又はその断片のＦｃドメイン）に結合された（例えば、翻訳融合として）２種のポリペプチドの第２のものを含む第２のモノマーとを含む。

【0321】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、ノブ変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインに結合された（例えば、翻訳融合として）２種のポリペプチドの１つを含む第１のモノマーと、ホール変異を含む抗体又はその断片のＦｃドメインに結合された（例えば、翻訳融合として）２種のポリペプチドの第２のものを含む第２のモノマーとを含む。

【0322】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーの組成及び配置は、図１Ｂに概略的に示されるヘテロダイマーから選択され、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0323】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができるヘテロダイマーの非限定的な例は、以下の表１に示される。

【0324】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１又は５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３又は７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ１ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0325】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１を含むモノマーと、配列番号３を含むモノマーとを含む。

【0326】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１に記載されるモノマーと、配列番号３に記載されるモノマーとを含む。

【0327】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0328】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0329】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９又は１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを含むモノマー及び配列番号１１又は１５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0330】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９を含むモノマーと、配列番号１１を含むモノマーとを含む。

【0331】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９に記載されるモノマーと、配列番号１１に記載されるモノマーとを含む。

【0332】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３を含むモノマーと、配列番号１５を含むモノマーとを含む。

【0333】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３に記載されるモノマーと、配列番号１５に記載されるモノマーとを含む。

【0334】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１、５、１７、１３８、１４０、１４２又は１４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαポリペプチドを含むモノマー及び配列番号１１、１５、１９又は１５０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＬＩＲＢ２ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0335】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１、５又は１７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαポリペプチドを含むモノマー及び配列番号１１、１５又は１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＬＩＲＢ２ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0336】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１を含むモノマーと、配列番号１１を含むモノマーとを含む。

【0337】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１に記載されるモノマーと、配列番号１１に記載されるモノマーとを含む。

【0338】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５を含むモノマーと、配列番号１５を含むモノマーとを含む。

【0339】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５に記載されるモノマーと、配列番号１５に記載されるモノマーとを含む。

【0340】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１７を含むモノマーと、配列番号１９を含むモノマーとを含む。

【0341】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１７に記載されるモノマーと、配列番号１９に記載されるモノマーとを含む。

【0342】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３８を含むモノマーと、配列番号１１を含むモノマーとを含む。

【0343】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３８に記載されるモノマーと、配列番号１１に記載されるモノマーとを含む。

【0344】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４０を含むモノマーと、配列番号１５を含むモノマーとを含む。

【0345】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４０に記載されるモノマーと、配列番号１５に記載されるモノマーとを含む。

【0346】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４２を含むモノマーと、配列番号１５０を含むモノマーとを含む。

【0347】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４２に記載されるモノマーと、配列番号１５０に記載されるモノマーとを含む。

【0348】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４４を含むモノマーと、配列番号１５０を含むモノマーとを含む。

【0349】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４４に記載されるモノマーと、配列番号１５０に記載されるモノマーとを含む。

【0350】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２１又は２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３又は７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ１ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0351】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２１を含むモノマーと、配列番号３を含むモノマーとを含む。

【0352】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２１に記載されるモノマーと、配列番号３に記載されるモノマーとを含む。

【0353】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２２を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0354】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２２に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0355】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４又は２５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３又は７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ１ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0356】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４を含むモノマーと、配列番号３を含むモノマーとを含む。

【0357】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４に記載されるモノマーと、配列番号３に記載されるモノマーとを含む。

【0358】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２５を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0359】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２５に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0360】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１又は５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαポリペプチドを含むモノマー及び配列番号２９又は３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0361】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１を含むモノマーと、配列番号２９を含むモノマーとを含む。

【0362】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１に記載されるモノマーと、配列番号２９に記載されるモノマーとを含む。

【0363】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５を含むモノマーと、配列番号３０を含むモノマーとを含む。

【0364】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５に記載されるモノマーと、配列番号３０に記載されるモノマーとを含む。

【0365】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９又は１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを含むモノマー及び配列番号２９又は３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0366】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９を含むモノマーと、配列番号２９を含むモノマーとを含む。

【0367】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９に記載されるモノマーと、配列番号２９に記載されるモノマーとを含む。

【0368】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３を含むモノマーと、配列番号３０を含むモノマーとを含む。

【0369】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３に記載されるモノマーと、配列番号３０に記載されるモノマーとを含む。

【0370】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４又は２５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ１０ポリペプチドを含むモノマー及び配列番号１１又は１５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0371】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４を含むモノマーと、配列番号１１を含むモノマーとを含む。

【0372】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２４に記載されるモノマーと、配列番号１１に記載されるモノマーとを含む。

【0373】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２５を含むモノマーと、配列番号１５を含むモノマーとを含む。

【0374】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号２５に記載されるモノマーと、配列番号１５に記載されるモノマーとを含む。

【0375】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９、１３、３１、３３又は１４６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３、７又は１４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ１ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0376】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９、１３、３１又は３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３又は７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ１ポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0377】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９を含むモノマーと、配列番号３を含むモノマーとを含む。

【0378】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号９に記載されるモノマーと、配列番号３に記載されるモノマーとを含む。

【0379】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0380】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１３に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0381】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号３１を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0382】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号３１に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0383】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号３３を含むモノマーと、配列番号７を含むモノマーとを含む。

【0384】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号３３に記載されるモノマーと、配列番号７に記載されるモノマーとを含む。

【0385】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４６を含むモノマーと、配列番号１４８を含むモノマーとを含む。

【0386】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１４６に記載されるモノマーと、配列番号１４８に記載されるモノマーとを含む。

【0387】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１又は５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＰαポリペプチドを含むモノマー及び配列番号３５又は３６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを含むモノマーを含む。

【0388】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１を含むモノマーと、配列番号３５を含むモノマーとを含む。

【0389】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号１に記載されるモノマーと、配列番号３５に記載されるモノマーとを含む。

【0390】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５を含むモノマーと、配列番号３６を含むモノマーとを含む。

【0391】

特定の実施形態によると、ヘテロダイマーは、配列番号５に記載されるモノマーと、配列番号３６に記載されるモノマーとを含む。

【0392】

特定の実施形態によると、本明細書に開示されるヘテロダイマーは、可溶性である（即ち合成表面又は天然に存在する表面に固定化されない）。

【0393】

特定の実施形態によると、本明細書に開示されるヘテロダイマーは、合成表面又は天然に存在する表面に固定化される。

【0394】

本発明の付加的又は代替的な態様によると、本明細書に開示されるヘテロダイマーを含む組成物であって、ヘテロダイマーが前記組成物における２種のポリペプチドの優勢形態である、組成物が提供される。

【0395】

ダイマー化、特にヘテロダイマー化を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、上記及び下記においてさらに記載される。

【0396】

特定の実施形態によると、優勢形態は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％を占め、それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

【0397】

特定の実施形態によると、本明細書に記載されるヘテロダイマー又はそれを含む組成物の製造収率、安定性、活性、選択性及び／又は安全性は、同じ２つのポリペプチドを含むホモダイマーを含む組成物の製造収率、安定性、活性、選択性及び／又は安全性よりも高く、ホモダイマーは、組成物における２つのポリペプチドの優勢形態であり、単離されたモノマーは、同じ２つのポリペプチド及び／又は２つのポリペプチドのそれぞれを単剤として含む。

【0398】

特定の実施形態によると、本明細書に記載されるヘテロダイマー又はそれを含む組成物の製造収率、安定性、活性、選択性及び／又は安全性は、抗体、例えば本明細書に記載される２種のポリペプチドの天然の結合相手を標的とする二重特異性抗体の造収率、安定性、活性、選択性及び／又は安全性よりも高い。

【0399】

特定の実施形態によると、選択性及び／又は安全性の増大は、ヘテロダイマーが両方のポリペプチドの天然の結合相手に結合したときにのみ、選択的活性によって明らかにされ得る（例えば、天然の結合相手の一方のみを発現する細胞と比較した、ヘテロダイマーの両方のポリペプチドの天然の結合相手を発現する細胞）。特定の実施形態では、ダイマー化部分がＦｃドメインである場合、選択性及び／又は安全性は、両方のポリペプチドの天然の結合相手に結合したときにのみ、Ｆｃ受容体の結合及び／又は活性化によって明らかにされ得る。

【0400】

特定の実施形態によると、「より高い」という用語は、統計的に有意な増大を指す。

【0401】

特定の実施形態によると、「より高い」という用語は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍の増大を指す。

【0402】

特定の実施形態によると、本明細書に記載されるヘテロダイマー又はそれを含む組成物は、単剤としての２種のポリペプチドのそれぞれと比較して、組み合わされて改善された活性を有する。本明細書で使用する場合、「組み合わされて改善された活性」という表現は、少なくとも相加的であるが、好ましくは相乗的に改善された活性を指す。

【0403】

特定の実施形態によると、本明細書に記載されるヘテロダイマー又はそれを含む組成物の凝集体の量は、同じ２つのポリペプチドを含むホモダイマーを含む組成物の凝集体の量よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％少なく、ホモダイマーは、組成物における２つのポリペプチドの優勢形態であり、単離されたモノマーは、同じ２つのポリペプチド及び／又は２つのポリペプチドのそれぞれを単剤として含む。

【0404】

本発明のいくつかの実施形態のヘテロダイマーは、ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０から選択される２種のポリペプチドを含むため、ヘテロダイマーは、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ、ｅｘ－ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ－ｖｉｖｏで免疫細胞を活性化する方法で使用され得る。

【0405】

したがって、本発明の一態様によると、免疫細胞を活性化する方法であって、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを含む宿主細胞の存在下において免疫細胞をｉｎ－ｖｉｔｒｏで活性化することを含む方法が提供される。

【0406】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。

【0407】

本明細書で使用する場合、「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」という用語は、単核の血液細胞を指し、リンパ球、単球及び樹状細胞（ＤＣ）を含む。

【0408】

特定の実施形態によると、ＰＢＭＣは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される。

【0409】

特定の実施形態によると、ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を含む。

【0410】

ＰＢＭＣを得る方法は、対象から全血を採血し、抗凝固薬（例えば、ヘパリン又はクエン酸塩）を含む容器に収集すること及びアフェレーシスなど、当技術分野で周知である。続いて、特定の実施形態によると、少なくとも１種類のＰＢＭＣを末梢血から精製する。全血からＰＢＭＣを精製するために、白血球アフェレーシス、沈降、密度勾配遠心分離（例えば、ｆｉｃｏｌｌ）、遠心溶出法、分画、例えば赤血球の化学的溶解（例えば、ＡＣＫによるもの）、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社等から市販されているＦＡＣＳソーター又は磁気細胞分離技術の使用）及び特定の細胞型を除去する方法であって、特異的な抗体を用いる根絶（例えば、死滅）に基づく方法や、（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又は捕捉ＥＬＩＳＡ標識化を使用する）負の選択による親和性に基づく精製といった当業者に公知のいくつかの方法及び試薬がある。そのような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)及びFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)に記載されている。

【0411】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球を含む。

【0412】

本明細書で使用する場合、「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）」という用語は、血流から離れて腫瘍中に遊走した単核白血球を示す。

【0413】

特定の実施形態によると、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単球からなる群から選択される。

【0414】

ＴＩＬを得るための方法は、例えば、生検又は剖検によって対象から腫瘍試料を得て、その単細胞懸濁液を調製する方法のように、当技術分野で周知である。単細胞懸濁液は、任意の好適な様式、例えば機械的に（例えば、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（カリフォルニア州、オーバーンのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用した腫瘍の脱凝集）又は酵素的に（例えば、コラゲナーゼ又はＤＮａｓｅで）得ることができる。続いて、この細胞懸濁液から少なくとも１種類のＴＩＬが精製され得る。所望の種類のＴＩＬを精製するために、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社等から市販されているＦＡＣＳソーター又は磁気細胞分離技術の使用）及び特定の細胞型を除去する方法であって、特異的な抗体を用いる根絶（例えば、死滅）に基づく方法や、（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーター及び／又は捕捉ＥＬＩＳＡ標識化を使用する）負の選択による親和性に基づく精製といった当業者に公知のいくつかの方法及び試薬がある。そのような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)及びFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)に記載されている。

【0415】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、食細胞を含む。

【0416】

本明細書で使用する場合、「食細胞」という用語は、食作用を実行可能である細胞を指し、プロフェッショナル食細胞及びノンプロフェッショナル食細胞の両方を含む。食作用を分析する方法は、当技術分野で周知であり、例えば殺滅アッセイ、フローサイトメトリー及び／又は顕微評価（生細胞の画像化、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡）を含む。特定の実施形態によると、貪食細胞は、単球、樹状細胞（ＤＣ）及び顆粒球からなる群から選択される。

【0417】

特定の実施形態によると、食細胞は、顆粒球を含む。

【0418】

特定の実施形態によると、食細胞は、単球を含む。

【0419】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、単球を含む。

【0420】

特定の実施形態によると、「単球」という用語は、組織内に存在する循環単球及びマクロファージ（別称、単核食細胞）の両方を示す。

【0421】

特定の実施形態によると、単球は、マクロファージを含む。典型的には、マクロファージの細胞表面表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ－１／ＭＡＣ－３及びＣＤ６８を含む。

【0422】

特定の実施形態によると、単球は、循環単球を含む。典型的には、循環単球の細胞表面表現型は、ＣＤ１４及びＣＤ１６（例えば、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６－、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋）を含む。

【0423】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＤＣを含む。

【0424】

本明細書で使用する場合、「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、リンパ様又は非リンパ様の組織内に見出される、形態学的に同様の細胞型の多様な集団の任意のメンバーを示す。ＤＣは、プロフェッショナル抗原提示細胞のクラスであり、ＨＬＡ制限Ｔ細胞を感作する能力が高い。ＤＣとしては、例えば、形質細胞様樹状細胞、骨髄樹状細胞（未成熟型及び成熟型の樹状細胞を含む）、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、濾胞樹状細胞が挙げられる。樹状細胞は、機能又は表現型、特に細胞表面表現型によって認識され得る。これらの細胞は、ベール様の突起を細胞表面に有する特徴的な形態、中レベルから高レベルの表面ＨＬＡクラスＩＩの発現及びＴ細胞（特にナイーブＴ細胞）に対して抗原提示する能力を特徴とする（Steinman R, et al., Ann. Rev. Immunol. 1991; 9:271-196を参照されたい）。典型的には、ＤＣの細胞表面表現型としては、ＣＤｌａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋又はＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。ＤＣという用語には、未成熟型ＤＣ及び成熟型ＤＣの両方が包含される。

【0425】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、顆粒球を含む。

【0426】

本明細書で使用する場合、「顆粒球」という用語は、細胞質内の顆粒の存在を特徴とする、多形核白血球を示す。

【0427】

特定の実施形態によると、顆粒球は、好中球を含む。

【0428】

特定の実施形態によると、顆粒球は、マスト細胞を含む。

【0429】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。

【0430】

本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかの表現型を有するＣＤ３＋、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）＋の分化型リンパ球を示す。Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞又は調節性Ｔ細胞のいずれでもあり得る。

【0431】

本明細書で使用する場合、「エフェクターＴ細胞」という用語は、例えば、サイトカインを生成することによって他の免疫細胞を活性化するか若しくは方向付けるＴ細胞又は細胞傷害活性を有するＴ細胞であり、例えばＣＤ４＋、Ｔｈ１／Ｔｈ２、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を示す。

【0432】

本明細書で使用する場合、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞及び自然免疫系細胞の活性化を負に調節するＴ細胞を示す。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続的抑制を特徴とする。特定の実施形態によると、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。

【0433】

特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。

【0434】

他の特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0435】

特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。メモリーＴ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－の表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋の表現型を有するセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７－の表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＣＲ７＋の表現型を有するセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。

【0436】

特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、目的の発現産物をコードする核酸配列が形質導入された、工学的に操作されたＴ細胞を含む。

【0437】

特定の実施形態によると、目的の発現産物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

【0438】

本明細書で使用する場合、「ＴＣＲをコードする核酸配列が形質導入された」又は「ＴＣＲをコードする核酸配列を形質導入する」という表現は、ＭＨＣとの関連で提示される所望の抗原に対して特異性を有するＴ細胞から可変α－鎖及びβ－鎖をクローニングすることを示す。ＴＣＲを形質導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えばNicholson et al. Adv Hematol. 2012; 2012:404081、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22 (2):85-94)及びLamers et al, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623に開示されている。

【0439】

本明細書で使用する場合、「ＣＡＲをコードする核酸配列が形質導入された」又は「ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入する」という表現は、抗原認識部分及びＴ細胞活性化部分を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列のクローニングを示す。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン又はＴ細胞活性化ドメインに結合した抗体の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲを形質導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えばDavila et al. Oncoimmunology. 2012 Dec 1;1 (9):1577-1583、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22 (2):85-94)、Maus et al. Blood. 2014 Apr 24;123 (17):2625-35、Porter DL The New England journal of medicine. 2011, 365 (8):725-733、Jackson HJ, Nat Rev Clin Oncol. 2016;13 (6):370-383及びGloberson-Levin et al. Mol Ther. 2014;22 (5):1029-1038に開示されている。

【0440】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、Ｂ細胞を含む。

【0441】

本明細書で使用する場合、「Ｂ細胞」という用語は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）＋、ＣＤ１９＋及び／又はＢ２２０＋の表現型を有するリンパ球を示す。Ｂ細胞は、特異的抗原に結合し、液性応答を引き起こす能力を特徴とする。

【0442】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＮＫ細胞を含む。

【0443】

本明細書で使用する場合、「ＮＫ細胞」という用語は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－の表現型を有する分化型リンパ球を示す。ＮＫは、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、特異的な細胞溶解性酵素の活性化によってこの細胞を死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の罹患細胞を死滅させる能力及び免疫応答を刺激若しくは阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。

【0444】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞を含む。

【0445】

本明細書で使用する場合、「ＮＫＴ細胞」という用語は、セミインバリアントなαβＴ細胞受容体を発現するが、典型的にはＮＫ細胞に関連する種々の分子マーカー（例えば、ＮＫ１．１）も発現する、特殊化したＴ細胞集団を示す。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋及びＣＤ８－の細胞が挙げられる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ－Ｉ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識する点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを生成する能力があるため、保護効果を有する場合もあれば、有害効果を有する場合もある。

【0446】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、健康な対象から得る。

【0447】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、病気（例えば、癌）を患う対象から得る。

【0448】

特定の実施形態によると、活性化は、２種のポリペプチドの少なくとも１つの天然の結合相手又は２種のポリペプチドの少なくとも１つの外因性の結合相手を発現する細胞の存在下におけるものである。

【0449】

特定の実施形態によると、活性化は、２種のポリペプチドの天然の結合相手又は２種のポリペプチドの外因性の結合相手を発現する細胞の存在下におけるものである。

【0450】

特定の実施形態によると、外因性の結合相手は、可溶性である。

【0451】

他の特定の実施形態によると、外因性の結合相手は、固体支持体に固定化される。

【0452】

特定の実施形態によると、結合相手を発現する細胞は、病的（罹患）細胞、例えば癌細胞を含む。

【0453】

特定の実施形態によると、活性化は、細胞の増殖、成熟化、サイトカインの生成、食作用及び／又は免疫細胞の調節機能若しくはエフェクター機能の誘導をもたらす、少なくとも一次活性化シグナル［例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のライゲーション］を伝達することが可能な刺激剤の存在下で行う。特定の実施形態によると、刺激因子剤は、二次共刺激シグナルを伝達することもできる。

【0454】

刺激剤の量及び刺激剤と免疫細胞との間の比を決定する方法は、十分に当業者の能力の範疇にあるため、本明細書では特定しない。

【0455】

刺激剤は、抗原依存的様式又は抗原非依存的（即ちポリクローナル）様式で免疫細胞を活性化することができる。

【0456】

特定の実施形態によると、刺激剤は、抗原非特異的な刺激因子を含む。

【0457】

非特異的な刺激因子は、当業者に公知である。したがって、免疫細胞がＴ細胞を含む場合、抗原非特異的な刺激因子の非限定的な例は、限定されないが、抗ＣＤ２８抗体などの共刺激タンパク質と組み合わせた抗ＣＤ３抗体といったＴ細胞表面構造に結合し、Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導することが可能な薬剤であり得る。他の非限定的な例としては、単独又は抗ＣＤ３との様々な組み合わせにおける抗ＣＤ２、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３４、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ様１／４）、Ｊａｇｇｅｄ１／２が挙げられる。Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導し得る他の薬剤としては、マイトジェン、ＰＨＡ、ＰＭＡ－イオノマイシン、ＣＥＢ及びＣｙｔｏＳｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によると、抗原非特異的な刺激因子は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の実施形態によると、Ｔ細胞刺激因子は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社から入手できるＣＤ３ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓなどの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８被覆ビーズを含む。

【0458】

特定の実施形態によると、刺激剤は、抗原特異的な刺激因子を含む。

【0459】

抗原特異的なＴ細胞刺激因子の非限定的な例としては、抗原を担持した抗原提示細胞［ＡＰＣ、例えば樹状細胞］及びペプチドを担持した組換えＭＨＣが挙げられる。したがって、例えば、Ｔ細胞刺激因子は、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）を予め担持しておいた樹状細胞又は所望の抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞であり得る。

【0460】

特定の実施形態によると、抗原は、癌抗原である。

【0461】

本明細書で使用する場合、「癌抗原」という用語は、非癌性細胞と比較して、癌性細胞によって過剰発現されるか又は癌性細胞のみによって発現される抗原を示す。癌抗原は、公知の癌抗原又は癌細胞において発生する新たな特異的抗原（即ちネオ抗原）であり得る。

【0462】

公知の癌抗原の非限定的な例としては、ＭＡＧＥ－ＡＩ、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－ＡＳ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－ＡＳ、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－ＡＩＯ、ＭＡＧＥ－Ａｌｌ、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＧＡＧＥ－Ｉ、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＢＡＧＥ－ｌ、ＲＡＧＥ－１、ＬＢ３３／ＭＵＭ－１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃｌ／ＣＴ７、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳ０－１、ＬＡＧＥ－１、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－３、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１及びＸＡＧＥ、メラノサイト分化抗原、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣＩ、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、メランＡ、ＭＡＲＴ－Ｉ、ｇｐｌＯＯ、ｇｐ７５、アルファアクチニン－４、Ｂｃｒ－Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ－８、ベータ－カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａｌｌ、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡ０２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－２及び３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、ＮＡ－８８、ＳＰ１７及びＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ－Ｉ）、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐｌＳＯｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、アルファ－フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、Ｃ０－０２９、ＦＧＦ－５、０２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／１７０Ｋ、ＮＹＣＯ－Ｉ、ＲＣＡＳＩ、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ－１又はＴＲＰ－２が挙げられる。

【0463】

発現させることができる他の腫瘍抗原は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第００／２０５８１号、Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridgeを参照されたい）。これらの腫瘍抗原の配列は、公知データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６号Ａ１、国際公開第１９９４／００５３０４号Ａ１、国際公開第１９９４／０２３０３１号Ａ１、国際公開第１９９５／０２０９７４号Ａ１、国際公開第１９９５／０２３８７４号Ａ１及び国際公開第１９９６／０２６２１４号Ａ１でも確認することができる。

【0464】

上記の代わりに又は上記に加えて、腫瘍抗原は、例えば、生検によって対象から得られた癌細胞を使用して識別することもできる。

【0465】

したがって、特定の実施形態によると、刺激剤は、癌細胞を含む。

【0466】

特定の実施形態によると、活性化は、抗癌剤の存在下で行われる。

【0467】

特定の実施形態によると、免疫細胞は、活性化後に精製する。

【0468】

したがって、本発明は、本発明の方法によって得ることができる単離された免疫細胞も企図する。

【0469】

特定の実施形態によると、本発明において使用され及び／又は得られる免疫細胞は、単離したばかりの、例えば液体窒素温度において、任意の段階で、将来使用するために長期間（例えば、数か月、数年）にわたって保存（例えば、凍結保存）（即ち冷凍）されたもの及び細胞株であり得る。

【0470】

凍結保存の方法は、当業者に広く公知であり、例えば国際公開第２００７／０５４１６０号及び同第２００１／０３９５９４号並びに米国特許出願公開第２０１２／０１４９１０８号明細書に開示されている。

【0471】

特定の実施形態によると、本発明によって得られる細胞は、細胞バンク、又は保管所、又は保存施設において保存され得る。

【0472】

結果として、本教示は、免疫細胞の活性化が有効に作用し得る疾患（例えば、過剰増殖性疾患）や、免疫抑制及び感染症に関連する疾患のための養子免疫細胞療法の原料としての、本発明の単離された免疫細胞の使用及び方法をさらに示唆するが、これに限定されない。

【0473】

したがって、特定の実施形態によると、本発明の方法は、免疫細胞の養子移入を必要とする対象に対して、活性化後に免疫細胞を養子移入することを含む。

【0474】

特定の実施形態によると、養子細胞療法において使用するための、本発明の方法によって得ることができる免疫細胞を提供する。

【0475】

本発明の特定の実施形態において使用する細胞は、自家性又は非自家性であり得、同系又は非同系であり得、対象に対して同種又は異種であり得る。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

【0476】

本教示は、ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患を治療する方法における、本発明の組成物（例えば、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを発現する宿主細胞）の使用も企図する。

【0477】

したがって、本発明の一態様によると、ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象にヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを含む宿主細胞を投与し、対象の疾患を治療する方法が提供される。

【0478】

本発明の追加の又は代替の態様によると、ヘテロダイマーによる治療が有効に作用し得る疾患を治療するために使用する、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを含む宿主細胞が提供される。

【0479】

「治療すること」又は「治療」という用語は、病気（疾患、障害又は医学的状態）の発症を阻害、防止若しくは抑止すること及び／又は病気若しくは病気の症状の低減、軽快若しくは軽減をもたらすことを示す。当業者は、病気の発症を評価するために様々な方法論及びアッセイを使用することができ、同様に病気の低減、軽快又は軽減を評価するために様々な方法論及びアッセイが使用可能であることが理解されるであろう。

【0480】

本明細書で使用する場合、「対象」という用語には、任意の年齢及び任意の性別の哺乳動物、例えばヒトが含まれる。特定の実施形態によると、「対象」という用語は、病気（疾患、障害又は医学的状態）を患う対象を示す。特定の実施形態によると、この用語には、病気を発症するリスクを有する個体が包含される。

【0481】

特定の実施形態によると、疾患（例えば、癌細胞）に関連する細胞は、２種のポリペプチドの少なくとも１つの天然の結合相手を発現する。

【0482】

特定の実施形態によると、疾患（例えば、癌細胞）に関連する細胞は、２種のポリペプチドの天然の結合相手を発現する。

【0483】

特定の実施形態によると、疾患は、免疫細胞の活性化が有効に作用し得る。

【0484】

本明細書で使用する場合、「免疫細胞の活性化が有効に作用し得る疾患」という表現は、対象の免疫応答活性が、少なくとも疾患の症状を寛解させるか又は症状の発症を遅延させるには十分であり得るが、これを行う対象の免疫応答の活性が何らかの理由で最適未満である疾患を示す。

【0485】

免疫細胞の活性化が有効に作用し得る疾患の非限定的な例としては、過剰増殖性疾患、免疫抑制に関連する疾患、薬物（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイド）により引き起こされる免疫抑制及び感染症が挙げられる。

【0486】

特定の実施形態によると、疾患は、過剰増殖性疾患を含む。

【0487】

特定の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、硬化症、線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発肺線維症の防止、骨髄線維症又は後腹膜線維症を含む。

【0488】

他の特定の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、癌を含む。

【0489】

本明細書で使用する場合、癌という用語には、悪性癌及び前悪性癌の両方が包含される。

【0490】

前悪性又は良性形態の癌に関して、任意選択で、前悪性癌が悪性形態に進行することを停止するために、本組成物及びその方法を適用することができる。

【0491】

本発明のいくつかの実施形態の方法によって治療され得る癌は、任意の固形癌若しくは非固形癌及び／又は転移癌であり得る。

【0492】

特定の実施形態によると、癌は、悪性癌を含む。

【0493】

本発明のいくつかの実施形態の方法によって治療することのできる癌は、任意の固形又は非固形癌及び／又は転移癌である。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、（胃腸癌を含む）胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ又はｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭頸部癌並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）及びメイグス症候群が挙げられる。

【0494】

特定の実施形態によると、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の治療に適した癌性状態としては、転移性癌が挙げられる。

【0495】

特定の実施形態によると、癌は、前悪性癌を含む。

【0496】

前悪性癌（又は前癌）は、十分に特徴付けられ、当技術分野で公知である（例えば、Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8を参照されたい）。本発明の方法による治療に適した前悪性癌のクラスとしては、後天的な小型又は顕微鏡的前悪性癌、核異型を伴う後天的な大型病変、癌に進行する遺伝性過形成症候群と共に起こる前駆病変並びに後天的なびまん性過形成及びびまん性異形成が挙げられる。小型又は顕微鏡的前悪性癌の例としては、ＨＧＳＩＬ（子宮頸部の高悪性度扁平上皮内病変）、ＡＩＮ（肛門上皮内腫瘍）、声帯の形成異常、（結腸の）異常腺窩巣、ＰＩＮ（前立腺上皮内腫瘍）が挙げられる。核異型を伴う後天的な大型病変の例としては、管状腺腫、ＡＩＬＤ（タンパク異常血症を伴う血管免疫芽球性リンパ節症）、非定型髄膜腫、胃ポリープ、大斑型の類乾癬、骨髄形成異常、乳頭状移行上皮内癌、過剰な芽細胞を伴う難治性貧血及びシュナイダー乳頭腫が挙げられる。癌に進行する遺伝性過形成症候群と共に起こる前駆病変の例としては、異常なほくろ症候群（ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｏｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｃ細胞腺腫症（Ｃ ｃｅｌｌ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ）及びＭＥＡが挙げられる。後天的なびまん性過形成及びびまん性異形成の例としては、ＡＩＤＳ、非定型リンパ増殖、骨パジェット病、移植後リンパ増殖性疾患及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。

【0497】

特定の実施形態によると、癌は、急性骨髄性白血病、肛門癌、基底細胞癌腫、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、濾胞性リンパ腫、胃癌、食道胃（ＧＥ）接合部癌腫、胚細胞腫瘍、胚細胞腫（精上皮腫）、胚細胞腫瘍、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、膠肉腫、頭部及び頸部癌、肝細胞性癌腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、外套細胞リンパ腫、黒色腫、メルケル細胞癌腫、多発性黒色腫、神経内分泌腫瘍、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔（口）癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢神経鞘腫瘍（神経線維肉腫）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、腹膜癌、前立腺癌、腎細胞癌腫、唾液腺癌、皮膚癌、小細胞肺癌、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌腫、甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、子宮癌、膣癌又は外陰癌である。

【0498】

特定の実施形態によると、癌は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、卵巣上皮癌、上皮性腫瘍、卵管癌、濾胞性リンパ腫、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌である。

【0499】

特定の実施形態によると、癌は、リンパ腫、白血病及び癌腫（例えば、結腸癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌）からなる群から選択される。

【0500】

特定の実施形態によると、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。

【0501】

特定の実施形態によると、癌は、中皮腫［例えば、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）］である。

【0502】

特定の実施形態によると、白血病は、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球白血病、慢性顆粒球白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ）白血病、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血球母細胞性（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、血球芽細胞性（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、組織球白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、Ｒｉｅｄｅｒ細胞白血病、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病及び未分化細胞白血病からなる群から選択される。

【0503】

特定の実施形態によると、白血病は、前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病である。

【0504】

特定の実施形態によると、癌は、リンパ腫である。

【0505】

特定の実施形態によると、リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。

【0506】

特定の実施形態によると、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性ＮＨＬ、形質転換ＮＨＬ、緩徐進行性ＮＨＬ、再発性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、低悪性度非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫及び菌状息肉症／Ｓｅｚｒｙ症候群を含む皮膚Ｔ細胞癌からなる群から選択される。

【0507】

特定の実施形態によると、癌は、多発性骨髄腫である。

【0508】

少なくともいくつかの実施形態によると、多発性骨髄腫は、カッパ型の軽鎖及び／又はラムダ型の軽鎖を生成する多発性骨髄腫癌、原発性形質細胞白血病（ＰＣＬ）を含む侵襲性多発性骨髄腫、多発性骨髄腫に進行し得るＭＧＵＳ（良性単クローン性ガンマグロブリン血症）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ、別名、リンパ形質細胞性リンパ腫）などの良性形質細胞障害、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、緩徐進行性多発性骨髄腫、同様に多発性骨髄腫に進行し得る前悪性形態の多発性骨髄腫、原発性アミロイドーシスからなる群から選択される。

【0509】

特定の実施形態によると、癌は、腫瘍微小環境中に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍及び／又は腫瘍微小環境中での天然の結合相手の発現が比較的高い腫瘍の存在によって定義される。

【0510】

特定の実施形態によると、疾患は、免疫抑制に関連する疾患又は薬物（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイド）により引き起こされる免疫抑制を含む。

【0511】

特定の実施形態によると、疾患は、ＨＩＶ、麻疹、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ又はパルボウイルスによるものを含む。

【0512】

特定の実施形態によると、疾患は、感染症を含む。

【0513】

本明細書で使用する場合、「感染症」又は「感染性疾患」という用語は、病原体によって引き起こされる疾患を示す。病原体の特定例としては、ウイルス病原体、細菌病原体、例えば細胞内マイコバクテリア病原体（例えば、Mycobacterium tuberculosisなど）、細胞内細菌病原体（例えば、Listeria monocytogenesなど）又は細胞内原虫病原体（例えば、Leishmania及びTrypanosomaなど）が挙げられる。

【0514】

本発明の教示に従って治療可能な感染性疾患を引き起こす特定の種類のウイルス病原体としては、レトロウイルス、サーコウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス及びフィロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0515】

本発明の教示に従って治療され得るウイルス感染症の特定例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導性後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、インフルエンザ、ライノウイルス感染症、ウイルス性髄膜炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス感染症、麻疹、パピローマウイルス感染症／疣贅、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、黄熱、エボラウイルス感染症、狂犬病などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0516】

特定の実施形態によると、本願で開示する組成物（例えば、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム及び／又はそれを発現する宿主細胞）は、鎮痛薬、化学療法剤、放射線治療剤、細胞傷害性療法（コンディショニング）、ホルモン療法、抗体及び当技術分野で周知の他の治療レジメン（例えば、手術）を含むが、これらに限定されない、疾患を治療するための他の確立された治療レジメン又は実験的な治療レジメンと組み合わせて対象に投与することができる。

【0517】

特定の実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗体を含む。

【0518】

特定の実施形態によると、本願で開示する組成物（例えば、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物及び／又はそれを発現する宿主細胞）は、骨髄細胞、造血幹細胞、ＰＢＭＣ、臍帯血幹細胞及び／又は誘導多能性幹細胞の移植などの養子細胞移植と組み合わせて対象に投与することができるが、これに限定されない。

【0519】

特定の実施形態によると、いくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗癌剤を含む。

【0520】

特定の実施形態によると、いくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗感染症剤（例えば、抗生物質及び抗ウイルス剤）を含む。

【0521】

特定の実施形態によると、いくつかの実施形態の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、免疫抑制剤（例えば、ＧＣＳＦ及び他の骨髄刺激因子、ステロイド）を含む。

【0522】

特定の実施形態によると、併用療法には、相加効果がある。

【0523】

特定の実施形態によると、併用療法には、相乗効果がある。

【0524】

本発明の別の態様によると、疾患を治療するための治療剤をパッケージングするパッケージング材料と、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを含む宿主細胞とを含む製品を提供する。

【0525】

特定の実施形態によると、製品は、ヘテロダイマーによる治療が有効となり得る疾患、例えば免疫細胞の活性化が有効となり得る疾患の治療用と特定されている。

【0526】

特定の実施形態によると、疾患を治療するための治療剤と、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを発現する宿主細胞とは、別々の容器に収容されている。

【0527】

特定の実施形態によると、その疾患を治療するための治療剤と、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム又はそれを発現する宿主細胞とは、合剤として収容されている。

【0528】

本明細書で使用されるように、「アミノ酸配列」、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク性部分」という用語は、本明細書において代替的に使用され、本来のペプチド（分解生成物、人工的に合成されたペプチド又は組換えペプチドのいずれか）及びペプチドミメティック（一般には人工的に合成されたペプチド）並びに例えばペプチドを体内でより安定性にするか、又は細胞内にさらに浸透することができるようにする修飾を有し得るペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイドを包含する。かかる修飾としては、限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、主鎖修飾及び残基修飾などが挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)において特定されている。この文献は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により援用される。これに関するさらなる詳細を本明細書で後述する。

【0529】

ペプチド内のペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、例えば、Ｎ－メチル化結合（－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（Ｒ）Ｈ－Ｃ－Ｏ－Ｏ－Ｃ（Ｒ）－Ｎ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ_２－）、スルフィニルメチレン結合（－Ｓ（＝Ｏ）－ＣＨ_２－）、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）（式中、Ｒは、任意のアルキル、例えばメチルである）、アミン結合（－ＣＨ_２－ＮＨ－）、スルフィド結合（－ＣＨ_２－Ｓ－）、エチレン結合（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ_２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、フッ化オレフィン二重結合（－ＣＦ＝ＣＨ－）、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ_２－ＣＯ－）（式中、Ｒは、炭素原子に天然で生じる「正常な」側鎖である）によって置換され得る。

【0530】

これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれかで起こり得、さらにいくつか（２～３）の結合において同時に起こり得る。

【0531】

天然の芳香族アミノ酸であるＴｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（ＴＩＣ）、ナフチルアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅ又はＯ－メチル－Ｔｙｒのハロゲン化誘導体などの合成の非天然酸に置換され得る。

【0532】

本発明のいくつかの実施形態におけるペプチドは、１つ又は複数の修飾アミノ酸又は１つ又は複数の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合炭水化物等）も含み得る。

【0533】

１つ又は複数の「アミノ酸」という用語は、２０の天然アミノ酸、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後に修飾されることが多いアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホトレオニンなど、及び他の珍しいアミノ酸、限定されないが、２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン及びオルニチンなどを包含すると理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸との両方を含む。

【0534】

以下の表２及び表３には、本発明のいくつかの実施形態で使用することができる天然アミノ酸（表２）及び非慣例的又は修飾アミノ酸（例えば、合成、表３）を列挙する。

【0535】

【表1】

【0536】

【表2-1】

【0537】

【表2-2】

【0538】

【表2-3】

【0539】

【表2-4】

【0540】

本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、好ましくは、線状形態で用いられるが、環化がペプチドの特徴に著しく干渉しない場合、環状形態のペプチドを用い得ることが理解されるであろう。

【0541】

本発明のヘテロダイマーは、ヘテロダイマーが可溶型であることが要求される療法に使用されることが好ましいため、本発明のいくつかの実施形態におけるポリペプチドは、１種又は複数の非天然又は天然の極性アミノ酸（ヒドロキシル含有側鎖によってペプチドの可溶性を上げることのできるセリン及びスレオニンが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。

【0542】

本発明のポリペプチドのアミノ酸は、保存的又は非保存的に置換され得る。

【0543】

本明細書に記載の「保存的置換」という用語は、ペプチドにおける天然配列に存在するアミノ酸を、天然又は非天然のアミノ又は同様の立体特性を有するペプチドミメティックで置換することを示す。置換されるべき天然アミノ酸の側鎖が極性又は疎水性である場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）同様に極性又は疎水性である天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチドミメティック部位との置換であるべきである。

【0544】

天然アミノ酸は、一般に、その特性に従って分類され、本発明によれば、立体的に類似した非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換は、保存的置換であるとみなされることから、天然アミノ酸による保存的置換を容易に決定することができる。

【0545】

非天然アミノ酸による保存的置換を行うために、当技術分野でよく知られているアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然アミノ酸のペプチドミメティックは、当業者に公知の文献に十分に記述されている。

【0546】

保存的置換を起こす場合、置換するアミノ酸は、側鎖に元のアミノ酸と同じ又は類似の置換基を有さなければならない。

【0547】

機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。いずれのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関する指針は、Bowie et al., 1990, Science 247: 1306 1310でも確認することができる。このような保存的に修飾された変異体は、多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。典型的な保存的置換としては、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。アミノ酸は、側鎖に関連する特性に基づいて置換することができる。例えば、極性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）、側鎖の電荷に基づくアミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）並びに疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）の置換が可能である。示されるように、典型的に変化は、わずかな性質のものであり、例えばタンパク質のフォールディング又は活性に著しく影響しない保存的アミノ酸置換などである。

【0548】

本明細書で使用される「非保存的置換」という語句は、異なる電気化学特性及び／又は立体特性を有する他の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸により、親配列に存在するアミノ酸が置換されることを示す。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖より著しく大きい（又は小さい）及び／又は置換されるアミノ酸と比べて著しく異なる電子特性を有する官能基を有し得る。このタイプの非保存的置換の例としては、アラニンをフェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンで置換、グリシンをイソロイシンで置換又はアスパラギン酸を－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ_２）_５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－で置換することが挙げられる。本発明の範囲内であるこれらの非保存的置換は、抗細菌特性を有するペプチドを依然として構成する置換である。

【0549】

本発明のペプチドのＮ及びＣ末端は、官能基によって保護され得る。適切な官能基は、その教示が参照により本明細書に援用される、Green and Wuts, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991に記述されている。好ましい保護基は、例えば、化合物の親水性を低減し、化合物の親油性を高めることにより、それに結合した化合物の細胞内への輸送を促進する基である。

【0550】

特定の実施形態において、官能基の付加によって１つ又は複数のアミノ酸を修飾し得、例えば概念的に「化学修飾」し得る。例えば、天然の配列に存在する側鎖アミノ酸残基は、任意選択で修飾され得るが、しかし、代替的に、後述するように、タンパク質の他の部分は、側鎖アミノ酸残基に加えて又はその代わりに任意選択で修飾され得る。化学合成プロセスが続く場合、修飾は、任意選択で、分子の合成中、例えば化学修飾されたアミノ酸を付加することによって行われ得る。しかしながら、分子中に既に存在するアミノ酸の化学修飾（「ｉｎ ｓｉｔｕ」修飾）も可能である。ペプチド又はタンパク質に対する修飾は、例えば、遺伝子合成、エキソヌクレアーゼ欠失による部位指向性（例えば、ＰＣＲベースの）突然変異誘発若しくはランダム突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ）、化学修飾又は異種ドメイン若しくは結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の融合によって導入することができる。

【0551】

本明細書で使用する場合、「化学修飾」という用語は、ペプチドに言及している場合、そのアミノ酸残基の少なくとも１つが、プロセシング若しくは他の翻訳後修飾などの天然プロセス又は当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されているペプチドを示す。非限定的な代表的な修飾としては、カルボキシメチル化、アセチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化、アミド化、ＡＤＰ－リボシル化、脂肪酸のアシル化、ファルネシル基、イソファルネシル基、炭化水素基、脂肪酸基、結合のためのリンカーの付加、官能化、ＧＰＩアンカー形成、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ＰＥＧ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化又は任意の同様のプロセス並びに公知の保護基／ブロッキング基が挙げられる。エーテル結合を任意選択で使用して、セリン又はスレオニンのヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合させ得る。アミド結合を任意選択で使用して、グルタメート又はアスパルテートのカルボキシル基を糖のアミノ基に結合させ得る（Garg and Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985)、Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)）。アミノ酸と炭水化物との間にアセタール結合及びケタール結合を任意選択で形成し得る。例えば、遊離アミノ基（例えば、リジン）のアシル化により、脂肪酸アシル誘導体を任意選択で作り得る（Toth et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)）。

【0552】

特定の実施形態によると、修飾には、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用される国際出願第２００６／０５０２６２号に記載のように、ペプチドへのシクロアルカン部分の付加が含まれる。これらの部分は、生体分子と共に使用されるように設計され、任意選択で、様々な特性をタンパク質に与えるために使用され得る。

【0553】

さらに、任意選択で、ペプチドのいずれの部分も修飾し得る。例えば、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用される国際出願第２００６／０５０２４７号に記載のように、タンパク質のグリコシル化部分のＰＥＧ化を任意選択で行い得る。１つ又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をＯ－結合型及び／又はＮ－結合型グリコシル化に任意選択で付加し得る。ＰＥＧ基は、任意選択で、分枝状又は直鎖状であり得る。任意選択で、任意の種類の水溶性ポリマーを、グリコシルリンカーを介してタンパク質のグリコシル化部位に結合させ得る。

【0554】

「ＰＥＧ化されたタンパク質」とは、タンパク質のアミノ酸残基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が共有結合した、生物学的活性を有するタンパク質又はその断片を示す。

【0555】

「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」とは、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味し、カップリング剤又はカップリング部分若しくは活性化部分での（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシランでの又は好ましくはマレイミド部分での）誘導体化の有無を問わない。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物は、例示的な又は活性化された本発明のＰＥＧ化合物である。本発明では、他のポリアルキレングリコール化合物、例えばポリプロピレングリコールを使用し得る。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、以下の種類の荷電ポリマー又は中性ポリマー：デキストラン、コロミン酸又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー及びビオチン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0556】

特定の実施形態によると、ペプチドは、改変された（即ち元の又は本来のグリコシル化パターンから改変された）グリコシル化パターンを有するように修飾され得る。本明細書で使用する場合、「改変された」とは、１つ又は複数の炭水化物部分が欠失していること及び／又は少なくとも１つのグリコシル化部位が元のタンパク質に付加されていることを示す。

【0557】

タンパク質のグリコシル化は、典型的には、Ｎ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合していることを示す。アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニンのトリペプチド配列（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への酵素的な炭水化物部分の結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ－結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用され得るが、最も一般的にはセリン又はスレオニン）に対する、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの糖類の１つの結合を示す。

【0558】

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、ペプチドのアミノ酸配列が前述のトリペプチド配列の１つ又は複数を含有するようにこれを改変することにより、簡便に遂行される（Ｎ－結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、本来のペプチドの配列における１つ又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又はこれらによる置換によって作製することもできる（Ｏ－結合型グリコシル化部位の場合）。ペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルで変化を導入することによって改変することもできる。

【0559】

ペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ペプチドのアミノ酸残基にグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングする方法である。使用するカップリング様式に応じて、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのもの、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に糖類を結合させ得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306 (1981)に記載されている。

【0560】

ペプチドに存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に又はＤＮＡレベルで変化を導入することにより遂行され得る。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物にタンパク質を曝露させることを必要とする。この治療は、結合糖（ｌｉｎｋｉｎｇ ｓｕｇａｒ）（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖の切断をもたらし、アミノ酸配列を未変化のままにする。

【0561】

化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)及びEdge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)に記載されている。タンパク質にある炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを使用することによって達成することができる。

【0562】

本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド及びそれを含むヘテロダイマーは、限定されないが、固相技術及び組換え技術など、ペプチド合成の当業者に知られている任意の技術によって合成及び精製され得る。

【0563】

特定の実施形態によると、ポリペプチド及び／又はヘテロダイマーの調製には、固相ペプチド合成が含まれる。

【0564】

固相ペプチド合成については、多くの技術の概要をJ. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963及びJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973で確認することができる。従来型の溶液合成については、G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965を参照されたい。

【0565】

一般的に、これらの方法は、成長中のペプチド鎖に１つ又は複数のアミノ酸又は適宜保護されたアミノ酸を連続的に付加することを含む。通常、第１のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基を適切な保護基で保護する。保護又は誘導化されたアミノ酸は、次に、アミド結合の形成に適した条件下において、不活性な固体支持体に取り付けるか、溶液中で使用されて、適切に保護された相補的な（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸に付加される。次に、この新たに付加したアミノ酸残基から保護基が取り除かれて、次の（適切に保護された）アミノ酸が付加され、このように続いていく。所望のアミノ酸の全てが正しい順番に結合したら、残存する保護基（及び固体支持体）を順次又は同時に除去し、最終ペプチド化合物を得る。この一般的な方法の単純な改変、例えば脱保護後にペンタペプチド等が形成されるように、保護されたトリペプチドを正しく保護されたジペプチドと（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングすることにより、成長する鎖に一度に複数のアミノ酸を付加することも可能である。ペプチド合成のさらなる説明は、米国特許第６，４７２，５０５号明細書に開示されている。

【0566】

大規模ペプチド合成は、Andersson Biopolymers 2000; 55(3):227-50によって記載されている。

【0567】

特定の実施形態によると、ポリペプチド又はそれを含むヘテロダイマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を用いて合成される。

【0568】

したがって、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれもポリヌクレオチドからコードすることができる。これらのポリヌクレオチドは、それ自体で使用するか、又は本明細書に開示されるポリペプチドの組換え産生において使用することができる。

【0569】

「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドを指し、即ち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物で形質転換された細胞から産生される。

【0570】

したがって、本発明の別の態様によると、ヘテロダイマーをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドと、宿主細胞内でポリヌクレオチドの発現を指示する制御因子とを含む核酸構築物又はシステムが提供される。

【0571】

本発明の特定の実施形態と共に使用され得るポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、上記及び以下の表１に記載されている。

【0572】

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列及び／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で提供される一本鎖又は二本鎖の核酸配列を示す。

【0573】

特定の実施形態によると、本願で開示する任意のポリヌクレオチド及び核酸配列は、保存的核酸置換を有し得る。保存的に修飾されたポリヌクレオチドとは、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一の又は関連した（例えば、天然に連続した）配列を示す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載した対応するコドンを別のものに改変することができる。このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。本明細書におけるポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチド及び核酸配列は、その核酸のサイレント変異のことも表す。特定の文脈において、機能的に同一の分子をもたらすように核酸内の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾され得ることが当業者に認識されるであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載される配列に黙示されている。

【0574】

哺乳動物細胞において外因性ポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、好ましくは哺乳動物細胞での発現に好適な核酸構築物中にライゲーションする。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的又は誘導性の様式で指示するプロモーター配列を含む。

【0575】

特定の実施形態によると、調節因子は、異種調節因子である。

【0576】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも呼ばれる）は、このベクターを、原核生物、真核生物又は好ましくは両方（例えば、シャトルベクター）における複製及び組み込みに好適なものにするさらなる配列を含む。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター並びにポリアデニル化シグナルも含有し得る。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点及び３’ＬＴＲ又はその一部分を含む。

【0577】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、典型的には、構築物が入っている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。

【0578】

真核生物プロモーターは、典型的には、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモーターエレメントという２種類の認識配列を含有する。転写開始部位から２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の開始に関与していると考えられている。他方の上流プロモーターエレメントは、転写開始の頻度を決定する。

【0579】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物に用いられるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性を示すものが好ましい。細胞型特異的プロモーター及び／又は組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277］、リンパ様特異的プロモーター［Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275］、特にＴ細胞受容体のプロモーター［Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733］及び免疫グロブリンのプロモーター、［Banerji et al. (1983) Cell 33729-740］、ニューロン特異的プロモーター、例えば神経フィラメントプロモーター［Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477］、膵臓特異的プロモーター［Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916］又は乳腺特異的プロモーター、例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。

【0580】

エンハンサーエレメントは、結合した相同プロモーター又は異種プロモーターによる転写を最大で１，０００倍まで増加させることができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流にあっても上流にあっても活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントが広い宿主範囲を有し、種々の組織において活性を示す。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に好適である。本発明のいくつかの実施形態に好適な他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒト又はマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するものや、マウス白血病ウイルス、マウス又はラウス肉腫ウイルス及びＨＩＶなどの様々なレトロウイルスに由来する末端反復配列が挙げられる。参照により本明細書に援用されるEnhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1983を参照されたい。

【0581】

発現ベクターの構築において、プロモーターは、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけ異種の転写開始部位から離れた位置にあるのが好ましい。しかしながら、当技術分野で公知であるように、プロモーター機能を失うことなく、この距離のいくらかの差異が許容され得る。

【0582】

ｍＲＮＡ翻訳効率を増加させるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加することもできる。正確且つ効率的なポリアデニル化には、２つの特徴的な配列エレメントが必要である。それらは、ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵリッチ配列又はＵリッチ配列と、１１～３０ヌクレオチド上流に位置する、高度に保存された６つのヌクレオチドのＡＡＵＡＡＡ配列とである。本発明のいくつかの実施形態に好適な終結シグナル及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。

【0583】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、既に記載したエレメントに加えて、典型的にはクローニングされた核酸の発現レベルを上昇させること又は組換えＤＮＡを有する細胞の識別を容易にすることを目的とした、他の特殊化したエレメントを含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。こうしたウイルスのレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド上又は宿主細胞のゲノム上の遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。

【0584】

ベクターは、真核生物レプリコンを含む場合もあれば、含まない場合もある。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択可能マーカーを使用して真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は、不可能である。代わりに、組換えＤＮＡは、工学的に操作された細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターが所望の核酸を発現させる。

【0585】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、例えば、単一のｍＲＮＡからいくつかのタンパク質を翻訳することを可能にする、さらなるポリヌクレオチド配列、例えば内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びプロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含むことができる。

【0586】

したがって、特定の実施形態によると、ヘテロダイマーに含まれる両方のモノマーが１つの構築物から発現される。

【0587】

他の特定の実施形態によると、ヘテロダイマーに含まれるモノマーのそれぞれが異なる構築物から発現される。

【0588】

発現ベクターに含まれる個々のエレメントは、種々の構成で配置され得ることが理解されるであろう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、及びさらにヘテロダイマーのモノマーをコードするポリヌクレオチド配列は、「ヘッドトゥテール」構成で配置され得、逆相補鎖又は逆平行鎖中の相補鎖として存在し得る。このような構成の多様性は、発現ベクターの非コードエレメントで生じる可能性がより高いが、発現ベクターにおけるコード配列の代替的な構成も考えられる。

【0589】

哺乳動物の発現ベクターの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ及びｐＢＫ－ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳ並びにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0590】

レトロウイルスなどの真核生物ウイルスに由来する調節エレメントを含有する発現ベクターを使用することもできる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしては、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルスに由来するベクターとしては、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ及びＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター又は真核細胞における発現に有効であることが報告されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。

【0591】

前述のように、ウイルスは、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた、非常に特殊化した感染性因子である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞型に感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性は、所定の細胞型を特異的に標的とする天然の特異性を用いることにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入する。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用するベクターの種類は、形質転換される細胞型によって決まる。形質転換する細胞型によって好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範疇にあり、したがって本明細書では選択に関する検討事項の概説を提供しない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）を使用して標的化することができ、腎臓細胞は、Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149: 51-60)に記載の、バキュロウイルスであるAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化することができる。

【0592】

組換えウイルスベクターは、水平感染及び標的化特異性などの利点をもたらすため、モノマー及びヘテロダイマーのｉｎ ｖｉｖｏ発現に有用である。水平感染は、例えば、レトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が出芽して隣接細胞に感染する、多くの子孫ビリオンを生成するプロセスである。その結果、広い範囲が急速に感染し、そのほとんどは、最初は元のウイルス粒子に感染していなかったものである。これは、感染性因子が娘子孫を通してのみ伝播する垂直型の感染と対照的である。水平に伝播することができないウイルスベクターを作製することもできる。この特徴は、特定の遺伝子を限局的な数の標的細胞のみに導入することが所望の目的である場合に有用であり得る。

【0593】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を使用することができる。そのような方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)及びGilboa et at.［Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986］に概説されており、例えば安定トランスフェクション又は一過性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔及び組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、陽性－陰性の選択方法に関しては、米国特許第５，４６４，７６４号明細書及び同第５，４８７，９９２号明細書を参照されたい。

【0594】

ウイルス感染による核酸の導入には、リポフェクション及び電気穿孔などの他の方法と比べていくつかの利点がある。これは、ウイルスの感染性の性質のため、より高いトランスフェクション効率を得ることができるからである。

【0595】

現在好ましいｉｎ ｖｉｖｏでの核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び脂質ベースの系といったウイルス構築物又は非ウイルス構築物のトランスフェクションが挙げられる。脂質を介した遺伝子の移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ－Ｃｈｏｌである［Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)］。遺伝子療法において使用するのに最も好ましい構築物は、ウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座決定エレメント又はメッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送若しくは翻訳後修飾といった他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物は、ウイルス構築物に既に存在する場合を除き、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部分並びに使用されるウイルスに適切なプラス鎖及びマイナス鎖のプライマー結合部位も含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が入っている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。任意選択で、構築物は、ポリアデニル化をもたらすシグナル並びに１つ又は複数の制限部位及び翻訳終結配列を含み得る。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点及び３’ＬＴＲ又はその一部分を含む。カチオン性脂質、ポリリジン及びデンドリマーなど、ウイルスではない他のベクターを使用し得る。

【0596】

既に述べたように、本発明のいくつかの実施形態の発現構築物は、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含有する他にも、発現されるモノマー又はヘテロダイマーの安定性、生成、精製、収率又は毒性を増進するように工学的に操作された配列を含むこともできる。例えば、本発明のいくつかの実施形態のモノマー又はヘテロダイマーと異種タンパク質とを含む融合タンパク質又は切断可能な融合タンパク質の発現を工学的に操作することができる。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば異種タンパク質に対して特異的なカラムに固定化することにより、融合タンパク質が容易に単離され得るように設計することができる。本発明のいくつかの実施形態のモノマー又はヘテロダイマーと異種タンパク質との間に切断部位を工学的操作によって設けた場合、切断部位を破壊する適切な酵素又は薬剤を用いて処理することにより、クロマトグラフィーカラムからモノマー又はヘテロダイマーを遊離させることができる［例えば、Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70及びGardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859を参照されたい］。

【0597】

本発明は、本明細書に記載の構築物を含む細胞も企図する。

【0598】

したがって、本発明の一態様によると、ヘテロダイマー又はヘテロダイマーをコードする核酸構築物又はシステムを含む宿主細胞を提供する。

【0599】

本明細書で前述したように、本発明のいくつかの実施形態のヘテロダイマーを発現させるための宿主発現系として、種々の原核細胞又は真核細胞を使用することができる。これらは、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母などの微生物、コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、又はＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系を含むが、これらに限定されない。哺乳動物の発現系を使用して、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドを発現させることもできる。

【0600】

細菌構築物の例としては、ｐＥＴシリーズのE. coli発現ベクターが挙げられる（Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89）。

【0601】

本発明の教示と併せて使用され得る真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻細胞又は植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0602】

酵母において、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されているように、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを含有するいくつかのベクターを使用することができる。代替的に、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用し得る。

【0603】

植物発現ベクターを使用する場合、いくつかのプロモーターによってコード配列の発現を駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514］又はＴＭＶのコートタンパク質プロモーター［Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311］を使用することができる。代替的に、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680及びBrogli et al., (1984) Science 224:838-843］又は熱ショックプロモーター、例えばダイズｈｓｐ１７．５－Ｅ又はｈｓｐ１７．３－Ｂ［Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565］を使用し得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔及び当業者に周知の他の技術を使用して、植物細胞に導入することができる。例えば、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463を参照されたい。

【0604】

当技術分野で周知である昆虫及び哺乳動物の宿主細胞系といった他の発現系も本発明のいくつかの実施形態によって使用され得る。

【0605】

特定の実施形態によると、細胞は、哺乳動物細胞である。

【0606】

特定の実施形態によると、細胞は、ヒト細胞である。

【0607】

特定の実施形態によると、細胞は、細胞株である。

【0608】

別の特定の実施形態によると、細胞は、初代細胞である。

【0609】

細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄又は様々な種類の体液を含むが、これらに限定されない好適な組織に由来し得る。細胞は、胚期、胎生期及び成体期を含む任意の発生段階並びに任意の発生起源、即ち外胚葉起源、中胚葉起源及び内胚葉起源に由来し得る。

【0610】

哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ、例えばＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児由来腎臓株（ＨＥＫ２９３細胞又は懸濁培養下で増殖させるためにサブクローニングしたＨＥＫ２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982）、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞並びにヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる。

【0611】

本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。

【0612】

本発明のいくつかの実施形態によると、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又は２９３（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）細胞を含む。

【0613】

本発明の別の態様によると、ヘテロダイマーの製造方法であって、本明細書に記載される核酸構築物又はシステムを宿主細胞に導入すること、或いは本明細書に記載される核酸構築物又はシステムを発現する細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0614】

特定の実施形態によると、製造は、３２～３７℃、５～１０％のＣＯ_２で５～１３日間培養することを含む。

【0615】

本発明の特定の実施形態と共に使用することができる製造条件の非限定的な例は、以下の実施例の項において開示される。

【0616】

したがって、例えば、ヘテロダイマーをコードする発現ベクターは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１又はＣＨＯ－ＤＧ４４などの哺乳類細胞に導入される。次に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＥｘｐｉＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｋ１又はＣＨＯ－ＤＧ４４細胞の製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ社）に従い、細胞特異的培地中、３２～３７℃、５～１０％のＣＯ_２で形質導入細胞を培養し、少なくとも５日間の培養後、タンパク質を上清から収集し、精製する。

【0617】

特定の実施形態によると、培養は、バッチ式、スプリットーバッチ式、フィードバッチ式又は潅流モードで実施する。

【0618】

特定の実施形態によると、培養は、フィードバッチ条件で実施される。

【0619】

特定の実施形態によると、培養は、３６．５℃で実施される。

【0620】

特定の実施形態によると、培養は、３６．５℃で実施され、３２℃への温度変化を伴う。この温度変化は、定常状態に達する前に細胞の代謝を遅らせるために実施することができる。

【0621】

特定の実施形態によると、方法は、発現されたポリペプチドにダイマー化部分を付加することを含む。

【0622】

特定の実施形態によると、本方法は、ヘテロダイマーを単離することを含む。

【0623】

特定の実施形態によると、組換えヘテロダイマーの回収は、適切な時間にわたり培養した後に実施する。特定の実施形態によると、組換えヘテロダイマーの回収は、ヘテロダイマーを含有する培養培地全体を収集することを指し、必ずしもさらなる分離又は精製のステップを暗示するとは限らない。特定の実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のヘテロダイマーは、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及びＤＳ法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）など、種々の標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。

【0624】

特定の実施形態によると、製造及び精製に続き、ヘテロダイマーの治療有効性は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで検出することができる。このような方法は、当技術分野で知られており、例えば細胞生存率、トランスジェニックマウスの生存及び活性化マーカーの発現を挙げることができる。

【0625】

本発明のいくつかの実施形態の組成物（例えば、ヘテロダイマー、それを含む組成物、それをコードする核酸構築物又はシステム及び／又は細胞）は、それ自体で又は組成物を好適な担体若しくは賦形剤と混合した医薬組成物として生物に投与することができる。

【0626】

したがって、本発明は、いくつかの実施形態において、本願で開示する組成物を治療有効量で含む医薬組成物を特色とする。

【0627】

本明細書において、「活性成分」という用語は、生物学的効果の要因となる組成物（例えば、本明細書に記載のヘテロダイマー、それを含む組成物、核酸構築物又はシステム及び／又は細胞）を示す。

【0628】

本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を示す。限定されないが、賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが挙げられる。

【0629】

以降では、交換可能に使用され得る「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という表現は、生物に著しい刺激作用をもたらさず、また投与される化合物の生物学的活性及び特性を無効にすることのない担体又は希釈剤を示す。これらの表現には、アジュバントが含まれる。

【0630】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は上皮投与（例えば、注射又は注入による投与）に好適である。活性化合物は、投与ルートに応じて１つ又は複数の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒性効果を与えない塩を指す（例えば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照されたい）。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無毒の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などに由来するもの並びに無毒の有機酸、例えば脂肪族のモノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸などに由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの並びに無毒の有機アミン、例えばＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが挙げられる。

【0631】

本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど、及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る医薬組成物は、洗剤及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（ポリソルベート－２０）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート－８０））及び保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）並びに増量物質（ｂｕｌｋｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含み得る。

【0632】

本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る医薬組成物に用いられ得る好適な水性及び非水性の担体の例としては、水、様々なバッファー成分（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）並びにこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。

【0633】

適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合には必要な粒径を維持すること及び界面活性剤の使用によって維持することができる。

【0634】

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在は、滅菌手順（上記を参照されたい）と、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含との両方により、確実に防止することができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの包含により、注射用医薬品形態の持続的吸収がもたらされ得る。

【0635】

薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。このような媒体及び薬剤を薬学的活性物質に使用することは、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。

【0636】

治療用組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム又は高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることにより、注射用組成物の持続的吸収がもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙したもののうち、必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。これらの方法により、予め滅菌濾過された活性成分及び任意のさらなる所望の成分の溶液から、それらの粉末が得られる。

【0637】

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙したもののうち、必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。これらの方法により、予め滅菌濾過された活性成分及び任意のさらなる所望の成分の溶液から、それらの粉末が得られる。

【0638】

単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与様式に応じて異なる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、概して、治療効果をもたらす組成物の量である。この量は、概して、１００パーセントのうち、活性成分の約０．０１パーセント～約９９パーセント、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約０．１パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント～約３０パーセントの範囲である。

【0639】

投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整する。例えば、単回ボーラス投与であり得るか、いくつかの分割用量を経時的に投与し得るか、又は治療状況の緊急性により必要に応じて用量を相対的に低減若しくは増加させ得る。非経口組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、治療される対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体の感受性を治療するためにかかる活性化合物を調合する技術分野に固有の制約によって決まり、これらに直接左右される。

【0640】

薬物の製剤化及び投与のための技術は、参照により本明細書に援用される“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版で確認することができる。

【0641】

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ作製、湿式粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル封入、捕捉又は凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。

【0642】

本発明の組成物は、当技術分野で公知である種々の方法の１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の投与ルートを介して投与することができる。当業者に理解されるであろうが、投与のルート及び／又は様式は、所望の結果に応じて異なる。本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る治療剤の好ましい投与ルートとしては、血管内送達（例えば、注射又は注入）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、経口、経腸、直腸、肺（例えば、吸入）、経鼻、局所（経皮、頬側及び舌下を含む）、膀胱内、硝子体内、腹腔内、腟内、脳送達（例えば、脳室内、脳内及び対流強化拡散（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ））、ＣＮＳ送達（例えば、くも膜下腔内、脊髄周囲（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）及び脊髄内）若しくは非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）及び皮内を含む）、経皮（受動的又はイオン泳動若しくは電気穿孔の使用のいずれか）、経粘膜（例えば、舌下投与、経鼻、腟内、直腸又は舌下）の各種投与、又はインプラントによる投与、又は例えば注射若しくは注入による他の非経口投与ルート、又は当技術分野で公知の他の送達ルート及び／若しくは投与形態が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という表現は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常、注射によるものである。限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨下の注射及び注入又は生体内分解性挿入物の使用を含み、各投与ルートに適切な剤形で製剤化することができる。特定の実施形態において、本発明の少なくともいくつかの実施形態に係るタンパク質、治療剤又は医薬組成物は、腹腔内又は静脈内に投与することができる。

【0643】

特定の実施形態によると、本願で開示する組成物は、水溶液として非経口注射で投与される。製剤は、懸濁液又はエマルションの形態であり得る。通常、非経口注射のための医薬組成物は、有効量の本願で開示する組成物を含み、任意で薬学的に許容される希釈剤保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含むものが提供される。このような組成物は、任意選択で、希釈剤、滅菌水、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水並びに洗剤及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（ポリソルベート－２０）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート－８０））、抗酸化剤（例えば、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロール及び金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸）及び保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）並びに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤の１つ又は複数を含む。非水性の溶媒又はビヒクルの例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）又は真空乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過すること、組成物に滅菌剤を組み込むこと、組成物を照射処理すること又は組成物を加熱することにより滅菌することができる。

【0644】

本明細書で開示する様々な組成物（例えば、ポリペプチド）は、局所適用することができる。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤で効果的でないが、特に肺、鼻腔、口腔（舌下、頬側）、腟内又は直腸の粘膜に適用した場合に有効であり得る。

【0645】

本発明の組成物は、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達された場合、吸入中に肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に入ることができる。治療用製剤を肺に送達するように設計された様々な機械デバイスを使用することができる。この機械デバイスは、限定されないが、ネブライザー、計量式吸入器及び粉末吸入器を含み、これらは、全て当業者によく知られている。市販のデバイスのいくつかの特定例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（ミズーリ州、セントルイス、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．製）、Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザー（コロラド州、エングルウッド、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量式吸入器（ノースカロライナ州、リサーチ・トライアングル・パーク、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．製）及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（マサチューセッツ州、ベドフォード、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ製）である。Ｎｅｋｔａｒ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社及びＭａｎｎｋｉｎｄ社の各社は、吸入可能なインスリン粉末調製物が承認されているか、又はこの技術が本明細書に記載の製剤に適用され得る臨床試験段階にある。

【0646】

粘膜に投与するための製剤は、典型的には、噴霧乾燥した薬物粒子であり、これは、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液又はエマルションに組み込むことができる。標準的な薬学的賦形剤は、いずれの製薬会社からも入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲル片、錠剤又はロゼンジの形態であり得る。

【0647】

経皮製剤を調製することもできる。これらは、典型的には、軟膏、ローション、スプレー又はパッチであり、これらは、全て標準的な技術を使用して調製することができる。経皮製剤は、浸透促進剤の包含を必要とする。本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して有毒となることなく、特定の患者、組成物及び投与様式に関して所望される治療応答を達成するために有効な量の活性成分が得られるように変更され得る。選択する投薬量レベルは、用いる特定の本発明の組成物の活性、投与ルート、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、治療の期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び過去の病歴を含む種々の薬物動態学的要因並びに医学分野で周知である同様の要因に依存する。

【0648】

特定の実施形態によると、本明細書で開示する組成物を治療有効量で対象に投与する。本明細書で使用する場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療されている障害の１つ又は複数の症状を治療、阻害若しくは緩和するのに十分であるか、さもなければ所望の薬理的効果及び／又は生理学的効果をもたらすのに十分な投薬量を示す。治療有効量の決定は、特に、本明細書に提供する詳細な開示内容を踏まえれば、当業者の能力の範囲内である。

【0649】

本発明の方法で使用される任意の製剤について、治療上有効な量又は用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイから最初に推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するように動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞培養物で又は実験動物で標準医薬手順によって決定され得る。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の処方において使用され得る。投与量は、使用される投与形態及び利用される投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics,” Ch. 1 p.1のFingl et al. (1975)を参照されたい）。

【0650】

投与量及び投与間隔は、有効成分のレベルが、生物学的効果を誘導又は抑制するのに十分な量（最小有効濃度、ＭＥＣ）となるように、個別に調整することができる。ＭＥＣは、各製剤によって変化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴及び投与経路に応じて変化する。血漿中濃度を調べるために、検出アッセイが使用され得る。

【0651】

治療されるべき状態の重症度及び応答性に応じて、投与量は、数日から数週間持続する治療の過程で又は治癒が達成されるか若しくは疾患状態の消失が達成されるまでの単回又は複数回投与のものであり得る。

【0652】

投与する組成物の量は、当然のことながら、治療される対象、苦痛の重症度、投与方式、担当医師の判断などに依存するものである。

【0653】

特定の実施形態では、組成物（例えば、ヘテロダイマー、それを含む組成物、核酸構築物又はシステム、或いは細胞）は、例えば、治療すべき部位に直接注射することにより局所投与される。典型的には、注射により、組成物の局所濃度は、全身投与によって達成され得る濃度よりも高い濃度に上昇する。ヘテロダイマー組成物を前述のマトリックスと組み合わせると、治療すべき部位から出るポリペプチドの受動的拡散を低減させることにより、ポリペプチド組成物の局所濃度の上昇をもたらすのに役立ち得る。

【0654】

本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態において、本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号明細書、同第５，３８３，８５１号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書又は同第４，５９６，５５６号明細書に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分注するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通して薬品を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、精確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、持続的な薬物送達のための流量可変植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書及び浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に援用される。このようなインプラント、送達系及びモジュールは、他にも多くが当業者に公知である。

【0655】

活性化合物は、化合物の急速な放出を防ぐ担体と共に調製することができ、これは、例えば、徐放性製剤であり、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を調製するための多くの方法が特許取得済みであるか、又は一般的に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

【0656】

ポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の植込み又は注射（微粒子）後に長期にわたって全身に放出するための徐放性ポリマーデバイスを製造することができる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス中に分散したマイクロスフェア又はコアがポリマーシェルと異なる材料からなり、ペプチドがコア内に分散若しくは懸濁されたマイクロカプセル（このコアは、実質的に液体であるか又は固体であり得る）などの微粒子の形態であり得る。本明細書において明確に定義されない限り、微粒子、マイクロスフェア及びマイクロカプセルは、交換可能に使用される。代替的に、ポリマーは、数ナノメートルから４センチメートルまでの範囲の薄いスラブ又はフィルムとしてキャスティングされ得るか、粉砕若しくは他の標準的な技術によって作製された粉末であり得るか、又はヒドロゲルなどのゲルであり得る。

【0657】

本願で開示する活性成分を送達するには、生分解性ではないマトリックス又は生分解性であるマトリックスのいずれも使用し得るが、生分解性であるマトリックスが好ましい。これらは、天然ポリマー又は合成ポリマーであり得るが、合成ポリマーの分解及び放出プロファイルの特徴がより良好であるため、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択する。場合により、線形放出が最も有用であり得るが、他の場合、パルス放出又は「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であり得、任意選択で多価イオン又はポリマーと架橋され得る。

【0658】

マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出及び当業者に公知の他の方法によって形成することができる。生体内分解性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)、Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)及びMathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988)に記載されているような、薬物送達のためのマイクロスフェアを作るために開発された方法のいずれを使用しても調製され得る。

【0659】

これらのデバイスは、典型的には、体全体の治療のための投薬量よりも大幅に低い投薬量を送達する植込み若しくは注射した領域を治療する局所放出のために製剤化され得るか、又は全身送達のために製剤化され得る。これらのデバイスは、皮下、筋肉内、脂肪内に植込み若しくは注射され得るか、又は嚥下され得る。

【0660】

特定の実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態に係る治療用化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために（所望される場合）、これらの治療用化合物は、例えば、リポソームで製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、同第５，３７４，５４８号明細書及び同第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送されることにより、標的の薬物送達を増進する１つ又は複数の部分を含み得る（例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例示的な標的化部分としては、葉酸塩又はビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照されたい）、マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140、M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）、界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134）、ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられる。K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123、J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。

【0661】

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパック又はディスペンサーデバイスとして提供することができる。パックは、例えば、金属箔又はプラスチック箔、例えばブリスターパックを含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与に関する説明書が付属し得る。パック又はディスペンサーには、医薬品の製造、使用又は販売を規制する行政機関が規定した形態における、容器に付随した通知が収容され得る。この通知は、組成物の形態又はヒト若しくは動物への投与がその機関によって承認されたことを反映するものである。このような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって承認された処方薬のラベル又は承認された製品の添付文書に関するものであり得る。適合性のある薬学的担体において製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、詳細に前述した適応症状の治療に関するラベルを付すこともできる。

【0662】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を示す。

【0663】

「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」という用語及びその活用形は、「限定されないが、含む」を示す。

【0664】

「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを示す。

【0665】

「から実質的になる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び／又は部分を含み得ることを示す。但し、これは、追加の成分、工程及び／又は部分が、請求項に記載の組成物、方法又は構造の基本的且つ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。

【0666】

本明細書において、単数形を表す「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物」又は「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物も含まれ得る。

【0667】

本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く限定ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部及びその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１～６といった範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさにかかわらず適用される。

【0668】

本明細書において数値範囲を示す場合、それは、常に、示す範囲内の任意の引用数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現とは、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、それらの間の分数及び整数の全部とを含むことを意図する。

【0669】

本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の各分野の従事者に既知のもの又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加をもたらす他の改変に起因する、わずかな配列変化を含む相補的配列に実質的に対応する配列も包含するものと理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、代替的に１００ヌクレオチド中１未満、代替的に２００ヌクレオチド中１未満、代替的に５００ヌクレオチド中１未満、代替的に１０００ヌクレオチド中１未満、代替的に５，０００ヌクレオチド中１未満、代替的に１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを条件とする。

【0670】

明確にするために別個の実施形態に関連して記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、明確にするために単一の実施形態に関連して記載される本発明の種々の特徴は、別々に若しくは任意の好適な部分的組合せにおいて又は本発明の任意の他の記載される実施形態において好適であるとして提供され得る。種々の実施形態に関連して記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴であるとみなされてはならない。

【0671】

上記で詳述され、以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。

【実施例】

【0672】

上記で列挙し、下記の特許請求の範囲に記載した本発明の種々の実施形態及び態様について、以下の実施例が実験的根拠を示す。

【0673】

本明細書で使用される命名法及び本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術及び組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号明細書及び同第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広く記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８３９，１５３号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，８５０，５７８号明細書、同第３，８５３，９８７号明細書、同第３，８６７，５１７号明細書、同第３，８７９，２６２号明細書、同第３，９０１，６５４号明細書、同第３，９３５，０７４号明細書、同第３，９８４，５３３号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，０３４，０７４号明細書、同第４，０９８，８７６号明細書、同第４，８７９，２１９号明細書、同第５，０１１，７７１号明細書及び同第５，２８１，５２１号明細書、“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)及び“Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照されたい。上記文献の全ては、参照により本明細書に完全に援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれる全ての情報は、参照により本明細書に援用される。

【0674】

材料及び方法
試薬 － ＥｘｃｅｌＢａｎｄ（商標）３色広範囲タンパク質マーカー又はＥｘｃｅｌＢａｎｄ（商標）３色エクストラ範囲タンパク質マーカー（ＳＭＯＢＩＯ社製、それぞれＣａｔ＃ＰＭ２６００又はＰＭ２８００）、サンプルバッファー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、Ｃａｔ＃Ｍ００６７６）、ポリアクリルアミドゲル８％又は４～２０％（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、それぞれＣａｔ＃Ｍ００６６２又はＭ００６５６）、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ基質（Ｐｉｅｒｃｅ社製、Ｃａｔ＃３２１３２）、ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ＃Ｔ０４４０）、ＴＭＢ停止溶液（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ♯０４１２－０１）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ社製、Ｃａｔ＃ＴＳ２１１２６）。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃ＴＭ３２８）。Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｉＤ細胞標識溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、Ｃａｔ＃Ｖ２２８８７）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）密度勾配培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０７８０１）。

【0675】

抗体 － ＬＥＡＦＴＭ精製マウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）Ｂ７Ｈ１クローン２９Ｅ．２Ａ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ♯３２９７１１、抗ヒトＰＤ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、Ｃａｔ＃Ａ０１８２９－４０）、ＡＰＣ標識抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２９９０８）、ＡＰＣマウスＩｇＧ２ｂ、κＩＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃４００３２２）、ビオチン化ウサギ抗ヒトＳＩＲＰα（ＬｓＢｉｏ社製、Ｃａｔ＃ＬＳ－Ｃ３７０３３７）、ウサギ抗ヒトＳＩＲＰα抗体（抗薬物抗体ＤＳＰ１０７）バッチ＃１０４、抗ヒトＬＩＬＲＢ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃａｔ＃ＭＡＢ２０７８）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１５５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３３７６１８）、ＡＰＣマウスＩｇＧ１ ｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃４００１２０）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２３１２４）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２７４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２９７０８）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１７２ａ／ｂ ＳＩＲＰαクローンＳＥ５Ａ５抗体、マウスＩｇＧ１、κ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２３８０９）、ＰＥマウス抗ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９０５４－０９）、ＰＥマウス抗ヒトＩｇＧ４（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９１９０－０９）、ＡＦ６４７抗ヒトＩｇＧ４－Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９２００－３１）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８５ｄ（ＩＬＴ４）抗体クローン４１Ｄ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３３８７０８）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃａｔ＃１７０－６５１５）、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製、Ｃａｔ＃１７０－６５１６）、ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－Ｇ（米国特許出願公開第２０２０／０１０２３９０Ａ１号明細書から）、ＡＰＣヒトＩｇＧ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃４０３７０６）、ＣＤ４７遮断剤抗体（国際公開第２０１１／１４３６２４Ａ２号から）、ＨＬＡ－Ｇ遮断剤抗体（米国特許出願公開第２０２０／０１０２３９０Ａ１号明細書から）、マウス抗ヒトＩｇＧ１ ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９０５４－０５）、マウス抗ヒトＩｇＧ４ ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９２００－０５）、ＰＥマウス抗ヒトＩｇＧ１ ＦＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９０５４－０９）、ＰＥマウス抗ヒトＩｇＧ４－Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ♯９１９０－０９）、抗ヒトＰＶＲ（ＮＯＶＵＳ社製、Ｃａｔ＃ＮＢ６００１２４１）、ＡＰＣマウス抗ヒトＩｇＧ１ヒンジ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃９０５４－０９）、ＡＰＣ抗ヒトＴＩＧＩＴ、ｍＩｇＧ２ａクローンＡ１５１５３Ｇ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３７２７０６）、ＡＰＣｍＩｇＧ２ａ ＭＯＰＣ－１７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ♯４００２２０）、ＰＥ抗ヒトＰＤ－Ｌ１、２９Ｅ２Ａ３、ｍＩｇＧ２ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２９７０６）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１６、ｍＩｇＧ１クローンＩＣＲＦ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３０１３１０）。

【0676】

組換えタンパク質 － ヒト組換えＨＬＡ－Ｇタンパク質（Ｈｉｓタグ）、（Ａｂｃａｍ社製、Ｃａｔ＃ａｂ２２５６６０）、ヒトＰＤＬ－１ ＦＣタグ（Ａｃｒｏ社製、Ｃａｔ＃ＰＤ１－Ｈ５２５８）、ヒトＰＤＬ－１－Ｆｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、Ｕ３４２０ＤＫ１４０－１）、ヒトＣＤ４７タンパク質ＨＩＳタグ（Ａｃｒｏ社製、Ｃａｔ＃ＣＤ７－Ｈ５２２７）、ヒトＣＤ１５５（ＰＶＲ）タンパク質Ｆｃタグ（Ａｃｒｏ社製、Ｃａｔ＃ＣＤ５－Ｈ５２５１及びＣＤ５－Ｈ５２５４）。

【0677】

細胞株 － Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃Ａ１４２５７）、ＤＬＤ１－ＷＴ細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２２１）、ＤＬＤ１－ＰＤＬ１細胞株（Hendriks et al 2016）、ＨＴ１０８０ ＷＴ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１２１）、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ４７、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ４７（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、ＣＢＡ－０１４６）、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ（細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現プラスミドによるウイルス感染によって生成された）、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３６）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）、Ｋ５６２ＰＶＲ、Ｋ５６２ＰＤ－Ｌ１、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１（ＰＤＬ１及び／又はＰＶＲ発現プラスミドによるＫ５６２細胞のトランスフェクション並びに安定発現細胞の選択により生成される）、ＡＢ１２（ＥＣＡＣＣ、１００９２３０６）、Ｒｅｎｃａ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２９４７）、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ｊｋｔｌ－ｎｆａｔ－ｃｄ１６）、ＳＫ－ＯＶ－３（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－７７）。

【0678】

培地及び組織培養試薬 － Ｅｘｐｉ２６９培地（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃Ａ－１４３５１－０１）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０１－１００－１Ａ）、ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ♯１２６５７－０２９）、ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ社製、Ａ７０３０、ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ社製、Ｅ７８８９、細胞解離バッファー、Ｇｉｂｃｏ社製、１３１５１－０１４、ＥＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０１－０４０－１Ａ）、ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０１－０５５－１Ａ）、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃１２６０４－１３）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃３５０５０－０３８）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製、Ｃａｔ＃１５１１４０－１２２）、ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０３－０４２－１Ｂ）、ＩＭＤＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃０１－０５８－１Ａ）。

【0679】

機器 － ＦＡＣＳデバイス、Ｓｔｒａｔａｄｉｇｍ社製のＣｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓ１０００ＥＸＩ、ＥＬＩＳＡリーダー、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ、ＥＬＩＳＡソフトウェア、マイクロプレートリーダーＲＥ用ＳｋａｎＩｔソフトウェア４．１、ｖｅｒ．４．１．０．４３。

【0680】

ヘテロダイマー－タンパク質の構造解析 － ホモログのＸ線構造に基づいて、各部分についてホモロジーモデリングを実施した。ＰＤ１の場合： ＰＤＢ ＩＤ：３ＲＲＱ、５ＧＧＲ、５ＧＧＳ、５ＪＸＥ及び４ＺＱＫをテンプレートとして使用した。ｈＩｇＧ４の場合： ＰＤＢ ＩＤ：４Ｃ５４、４Ｃ５５、５Ｗ５Ｍ及び５Ｗ５Ｎをテンプレートとして使用した。ＳＩＲＰαの場合： ＰＤＢ ＩＤ：２ＵＶ３、２ＷＮＧ、４ＣＭＭ、６ＢＩＴ、２ＪＪＳ及び２ＪＪＴをテンプレートとして使用した。ＬＩＬＲＢ２の場合： ＰＤＢ ＩＤ：２ＧＷ５、４ＬＬＡ、２ＤＹＰ及び６ＢＣＰをテンプレートとして使用した。ＳＩＧＬＥＣ１０の場合： ＳＩＧＬＥＣ８ホモログのＰＤＢ ＩＤ：２Ｎ７Ａ及び２Ｎ７Ｂをテンプレートとして使用した。ＴＩＧＩＴの場合： ＰＤＢ ＩＤ：３ＱＯＨ、３ＲＱ３、３ＵＣＲ、３ＵＤＷ及び５Ｖ５２をテンプレートとして使用した。

【0681】

リンカーセグメントは、構造違反（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖｉｏｌａｔｉｏｎ）を回避し、可能な「スペーサー」長のもっともらしい推定を可能にするために、主にＣＨＡＲＭＭのループモデリングを用いてモデル化した。

【0682】

ヘテロダイマーの製造 － 比較機能分析及び製造評価のために、いくつかのヘテロダイマー（本明細書において「ＤＳＰ」と称される）を設計し、及び／又は「ノブ」イントゥ「ホール」法（例えば、米国特許第８２１６８０５号明細書に記載される）を用いて製造した。以下の表１を参照されたい。所望のＦｃ融合タンパク質に対するコード配列でクローニングされたｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターによってトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞において製造を行った（以下の表１を参照されたい）。

【0683】

配列は、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶなどの制限酵素を使用し、Ｋｏｚａｋ配列及び終止コドンの上に人工シグナルペプチド（ＭＥＳＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＧＶＨＡ、配列番号１１６）を加えて、ベクターにクローニングした。細胞培養物の上清からタンパク質を収集し、場合によりプロテインＡ（ＰＡ）Ｐｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ樹脂又はアニオン交換Ｈｉｇｈ Ｔｒａｐ Ｑ ＦＦ樹脂を用いて一段階精製によってタンパク質を精製した。

【0684】

【表3-1】

【0685】

【表3-2】

【0686】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析 － 各ヘテロダイマーサンプルからの３５μｌの細胞培養上清又は３μｇの精製タンパク質をβ－メルカプトエタノールを含むか又は含まないローディングバッファー（それぞれ還元条件及び非還元条件）と混合し、９５℃で５分間加熱し、８％又は４～２０％勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。ｅ－Ｓｔａｉｎ装置（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）により、製造業者の説明書に従ってゲル上のタンパク質の移動を可視化した。

【0687】

ウエスタンブロット分析 － 製造したヘテロダイマー（５０～５００ｎｇ／レーン）を含有するサンプルを還元条件又は非還元条件（それぞれβ－メルカプトエタノールを含むか又は含まないローディングバッファー中）で処理し、９５℃５分間加熱し、８％又は４～２０％勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。続いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に移し、一次抗体と共に１時間又は一晩インキュベートした後、ＨＲＰ結合二次抗体と共に１時間インキュベートした。ＥＣＬの発生後にシグナルを検出した。

【0688】

サンドイッチＥＬＩＳＡによる、その対応物であるリガンド／受容体に対するヘテロダイマーの結合 － ＣＤ４７タンパク質、ＰＤＬ１タンパク質、ＨＬＡ－Ｇタンパク質又はＰＶＲタンパク質などの組換え対応物タンパク質と共に４℃で一晩インキュベートすることにより、分析されるヘテロダイマーの一方のアーム受容体／リガンドで平底９６ウェルプレートをプレコートした後、ブロッキング及び洗浄を行った。製造したヘテロダイマーを含有する段階希釈した細胞培養上清又は精製タンパク質サンプルを、対応するプレコートウェルに添加した。付加的な洗浄ステップに続いて、ヘテロダイマーの第２のアーム又はＩｇＧ骨格に対するビオチン化した非標識抗体又はＨＲＰ標識抗体を添加し、捕捉したタンパク質に結合させた。その後、検出された抗体がＨＲＰ標識されていない場合、ＨＲＰ結合二次抗体又はストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。検出は、６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて行った。Ｏ．Ｄ．値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【0689】

細胞表面で発現されるその対応物－リガンド／受容体に対するヘテロダイマーの結合 － 分析されるヘテロダイマーの対応物の１つを発現する細胞を、製造されたヘテロダイマーの連続希釈物と共に４℃で３０分間インキュベートした後、ヘテロダイマーの第２の成分（即ち、細胞により発現される対応物に結合しないもの）に特異的であるか、又はＩｇＧ骨格に特異的である蛍光標識抗体により免疫染色し、フローサイトメトリーにより分析した。任意選択で、細胞が両方の対応物を発現する場合、ヘテロダイマーとのインキュベーション前に、細胞に、それらの一方に対する遮断剤抗体とのプレインキュベーションを行った。Ｏ．Ｄ．値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【0690】

ＳＩＲＰα及びＬＩＬＲＢ２ドメインを含むヘテロダイマーのマクロファージ及びＰＭＮ細胞に対する効果 － 顆粒球による癌細胞の食作用を試験するために、ヒトＣＤ４７を発現するＨＴ１０８０又はヒトＣＤ４７及びヒトＨＬＡ－Ｇを発現するＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞をＤｉＤで標識し、０、１、２又は５μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６と共に室温で１５分間プレインキュベートした。続いて、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で細胞を顆粒球と共に３７℃で一晩共培養し、フローサイトメーターにより分析した。ＭＦＩ値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより結合曲線グラフを作成した。

【0691】

細胞傷害性アッセイ － ＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞の死滅を共培養アッセイで試験した。一晩のインキュベーション後、死滅した標的細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）で分析した。前標識した標的細胞［Ｋ５６２ＷＴ、ＰＶＲを過剰発現するＫ５６２（本明細書ではＫ５６２ＰＶＲ）細胞、ＰＤＬ１を過剰発現するＫ５６２（本明細書ではＫ５６２ＰＤＬ１）細胞又はＰＶＲ／ＰＤＬ１を過剰発現するＫ５６２（本明細書ではＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤＬ１）細胞］を９６ウェルプレートに入れ、異なる濃度のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの存在下、種々のエフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比で初代ＮＫ細胞と共にインキュベートした。３７℃でのＯＮインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｋ５６２ＷＴ標的細胞は、標的細胞上で発現されるＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１リガンドの存在下での死滅効果の阻害の参照として使用した。ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー処理の参照は、未処理の標的細胞であった。

【0692】

グランザイムＢの分泌 － グランザイムＢは、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の顆粒中に最も一般的に見出されるセリンプロテアーゼである。グランザイムＢは、細孔形成タンパク質パーフォリンと共にこれらの細胞によって分泌され、標的細胞のアポトーシスを媒介する。前標識した標的細胞（Ｋ５６２ＷＴ、Ｋ５６２ＰＶＲ、Ｋ５６２ＰＤＬ１及びＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤＬ１過剰発現細胞）を９６ウェルプレートに入れ、異なる濃度のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの存在下、種々のエフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比で初代ＮＫ細胞と共にインキュベートした。３７℃でのＯＮインキュベーション後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡを用いてグランザイムＢレベルについて分析した。

【0693】

レポーター遺伝子システムによるルシフェラーゼ活性アッセイを用いたＦｃγＲＩＩＩａの結合 － ＩｇＧ１－ＦｃによるＦｃγＲＩＩＩａの活性化は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＤ１６過剰発現細胞のレポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて検出した。このシステムでは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、細胞内カルシウムレベルの増大と、ＮＦＡＴタンパク質を急速に脱リン酸化するカルシウム感受性ホスファターゼのカルシニューリンの活性化とを含むシグナル処理のカスケードを誘導する。脱リン酸化されたＮＦＡＴは、核内に移動し、ルシフェラーゼの発現及び分泌を誘導する。ルシフェラーゼの分泌レベルは、ルシフェラーゼと添加基質（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ）との相互作用によって生じる発光シグナルとして測定した。Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６過剰発現細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーのＩｇＧ１－Ｆｃアームの結合は、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤＬ－１細胞（標的細胞）と、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６過剰発現細胞（エフェクター細胞）との共培養アッセイで試験した。この目的のために、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１を９６ウェルプレート内で培養し、異なる濃度のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの存在下でインキュベートした。３７℃での１時間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＤ１６過剰発現細胞を２：１のＥ：Ｔ比で標的細胞に添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターによって分析した。Ｋ５６２ＷＴ標的細胞は、標的細胞上で発現されるＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１リガンドの存在下でのルシフェラーゼ活性の参照として使用した。ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー処理の対照は、未処理の標的細胞であった。

【0694】

ＥＬＩＳＡにより決定される、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーのその対応物に対する同時結合 － 平底９６ウェルプレートをｈｒＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質でプレコートした後、ブロッキング及び洗浄を行った。段階希釈した精製ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーサンプルを、対応するプレコートウェルに添加した。インキュベーション及び付加的な洗浄ステップに続いて、検出タンパク質－マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃに対するヒトＣＤ１５５（ＰＶＲ）コンジュゲートを添加し、捕捉したタンパク質に結合させた。付加的な洗浄に続いて、ペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、インキュベーション及び洗浄後、６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。

【0695】

ＮＫ細胞及び腫瘍細胞に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの同時結合 － ＮＫ及び腫瘍細胞に対するＴＩＧＩＴ及びＰＤ１の同時結合は、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの存在下、ＮＫ初代細胞及びＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞の共培養細胞系において試験した。異なる細胞型への２つの部分の同時結合は、ダブレットの形成をもたらし、これは、フローサイトメトリーにより二重陽性染色細胞集団として検出された。ダブレット細胞形成の検出を可能にするために、ＣＰＤ色素で前標識した初代ＮＫ細胞の共培養物を、ＣＦＳＥ色素で前標識したＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞と２：１の比率で混合した。４℃での２時間のインキュベーション後、異なる濃度のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの存在下でダブレット細胞形成を試験した。加えて、ヘテロダイマーを添加する前に、遮断抗体：Ｆｃ遮断剤、ＰＶＲ抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体との１時間のインキュベーション後、ダブレット細胞形成の特異性を試験した。

【0696】

Ｉｎ ｖｉｖｏ同系モデル：ＡＢ１２マウス中皮腫癌モデルにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの効果 － ７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにＡＢ１２マウス悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した後、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー又はビヒクル対照で処置した。ヘテロダイマーの効果は、マウスの生存に対するその影響によって評価した。

【0697】

処置プロトコル：
研究の０日目に１０^５個のＡＢ１２細胞をｉ．ｐ．接種した。

【0698】

実験では２つの群を割り当てた：
群１ － 接種に続いて、６日目から開始して、２００μｌのビヒクル／マウスによりマウスをｉ．ｐ．処置した。ビヒクルを３日ごとに投与した。
群２ － 接種に続いて、６日目から開始して、容積２００μｌの１５０μｇのＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーによりマウスをｉ．ｐ．処置した。３日おきに合計４回の投与を行った。

【0699】

罹患率及び死亡率について動物を毎日評価した。

【0700】

Ｉｎ ｖｉｖｏ ＮＳＧモデル：
Ａ５４９ヒト肺腺癌モデルにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの効果 － １１～１３週齢のＮＳＧマウスにヒト肺腺癌細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した後、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー又はビヒクル対照で処置した。ヘテロダイマーの効果は、腫瘍体積を評価し、腫瘍成長の阻害（ＴＧＩ）を計算することによって評価した。

【0701】

処置プロトコル：
研究の０日目に５．０×１０^６個のＡ５４９細胞をｓ．ｃ．接種した。９日目にマウスに放射線を照射し、ヒトＰＢＭＣ（５×１０^６）をｉ．ｖ．注射した後、１６日目にヒトＰＢＭＣ（５×１０^６）の２回目の注射を行った。

【0702】

実験では２つの群を割り当てた：
群１ － ９日目から開始して、１日おき（ＥＯＤ）に２００μｌ／マウスのＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射した。
群２ － ９日目から開始して、ＥＯＤで容積２００μｌ／マウスの１５０μｇのＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーによりマウスをｉ．ｐ．処置した。合計４回の投与を行った。

【0703】

１回目の処置日（９日目）から、追跡調査期間中ＥＯＤで腫瘍体積を測定した。全ての動物を１８日目に屠殺した。

【0704】

実施例１
２種のＦｃ融合タンパク質を含むヘテロダイマーの選択、設計、製造及び特徴付け
ＳＩＲＰα、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＧＬＥＣ１０から選択される２種のタンパク質（ここで、タンパク質のそれぞれは、「ノブ」イントゥ「ホール」法（例えば、米国特許第８２１６８０５号明細書に記載される）を用いてＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインに融合される）を含むいくつかのヘテロダイマーを設計した（上記の表１を参照されたい）。

【0705】

以下のパラメータを最適化するためにヘテロダイマー－タンパク質の構造解析を行った：
・フォールディング： 標的への結合を可能にする適切なフォールディングは、潜在的なジスルフィドスクランブリングを最小限にする、
・完全性： タンパク質分解性部位の露出がない、
・哺乳類発現系における高発現、及び
・低い免疫原性。

【0706】

図２Ａ～５Ｃは、本明細書において「ＤＳＰ１２０Ｖ１」、「ＤＳＰ２１６Ｖ１」、「ＤＳＰ４０４Ｖ１」、「ＤＳＰ５０２Ｖ１」と称されるヘテロダイマー（上記の表１の記述及び配列を参照されたい）の概略図並びに特定されたドメイン及びセグメントに対して生成された３Ｄモデルを提示する。この分析により、リガンドへの可能な結合及び異なるドメイン間の干渉のないことが予想された。

【0707】

続いて、いくつかのヘテロダイマーを製造し、分析した。図６Ａ～Ｂ及び図１５に示されるように、予測されるヘテロダイマー分子量形態のタンパク質の大部分は、非還元条件下で観察され、２つのサブユニットの発現は、還元条件で確認された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、低レベルのホモダイマー（２つの「ノブ」断片又は２つの「ホール」断片を含むダイマー）のみが検出された。

【0708】

さらに、製造したヘテロダイマーは、設計されたその全てのドメインを含有し、例えば、ＤＳＰ１２０Ｖ１は、ＰＤ１及びＳＩＲＰαドメインの両方を含有し（図７Ａ～Ｂ及び８Ａ～Ｂ）、ＤＳＰ２１６及びＤＳＰ２１６Ｖ１は、ＬＩＬＲＢ２及びＳＩＲＰαドメインの両方を含有し（図７Ｃ及び９Ａ～Ｃ）、ＤＳＰ４０２は、ＰＤ１ドメインを含有し（図７Ａ）、ＤＳＰ５０２は、ＰＤ１及びＴＩＧＩＴドメインの両方を含有する（図７Ａ及び１０Ａ～Ｂ）。

【0709】

次のステップでは、製造したヘテロダイマーは、その組成に応じて以下の実施例２～８に従ってさらに分析される。

【0710】

実施例２
ヘテロダイマーは、その対応物であるリガンド／受容体に結合する
細胞表面で発現されるＣＤ４７及びＰＤＬ１に対するＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーの結合分析
本明細書において「ＤＳＰ１２０」及び「ＤＳＰ１２０Ｖ１」と称されるＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーのＰＤ１ドメインの、細胞上で発現されるヒトＰＤＬ１に対する結合は、抗ＳＩＲＰαを検出抗体として、ＰＤＬ１を過剰発現するＤＬＤ１－ＰＤＬ１細胞株（図１１Ａ）を用いて決定した。低レベルの内因性ＰＤＬ１を発現するＤＬＤ１－ＷＴ細胞（図１１Ａ）は、対照としての役割を果たした。図１１Ｃ～Ｄに示されるように、ＤＳＰ１２０及びＤＳＰ１２０Ｖ１は、用量依存的にＤＬＤ１ ＰＤＬ１過剰発現細胞に結合した。

【0711】

ＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ１２０のＳＩＲＰαドメインの、細胞上で発現されるヒトＣＤ４７に対する結合は、ＰＥ結合抗ＩｇＧ４抗体を検出抗体として、ヒトＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（図１１Ｂ）を用いて決定した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ヒトＣＤ４７を発現しない（図１１Ｂ）ため、対照としての役割を果たした。図１１Ｅに示されるように、ＤＳＰ１２０は、用量依存的にＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ４７過剰発現細胞に結合した。

【0712】

プレート結合ＣＤ４７又はＰＤＬ１に対するＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーの結合分析
ＳＩＲＰα－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ１２０のＰＤ１及びＳＩＲＰαドメインの、プレート結合ＰＤＬ１又はＣＤ４７に対する結合は、抗ヒトＰＤ－１（ＣＤ４７コートしたプレートの場合）又は抗ヒトＳＩＲＰα抗体（ＰＤＬ１コートしたプレートの場合）を用いてインキュベーション後に決定し、続いて対応するＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを行った。ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。図８Ａは、ＣＤ４７でコートしたプレートに対するＤＳＰ１２０の濃度依存的結合を示し、図８Ｂは、ＰＤＬ１でコートしたプレートに対するＤＳＰ１２０の濃度依存的結合を示す。

【0713】

細胞表面で発現されるＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇに対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーの結合分析
本明細書において「ＤＳＰ２１６」と称されるＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーのＳＩＲＰαドメインの、細胞上で発現されるヒトＣＤ４７に対する結合は、ヒトＣＤ４７を発現する（図１２Ａ）及びＨＬＡ－Ｇを発現しない（図１２Ｂ）ＨＴ１０８０細胞株と、検出抗体としてのＡＰＣ結合抗ＬＩＬＲＢ２とを用いて決定した。図１２Ｅに示されるように、ＤＳＰ２１６は、用量依存的にＣＤ４７発現細胞に結合した。

【0714】

本明細書において「ＤＳＰ２１６Ｖ１」と称されるＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーのＳＩＲＰα及びＬＩＬＲＢ２ドメインの、細胞上で発現されるＨＬＡ－Ｇ及び／又はヒトＣＤ４７に対する結合は、ＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０細胞株（図１２Ｄ）及び抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いて決定した。図１２Ｆに示されるように、ＤＳＰ２１６Ｖ１は、用量依存的にＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ４７発現細胞に結合した。

【0715】

ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７の両方を発現するため、リガンドのそれぞれに対する遮断抗体を用いて、ヒトＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｇへの特異的な結合をさらに試験した。図１６Ａに示されるように、ＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞株上で発現されるＨＬＡ－Ｇに対するＤＳＰ２１６の特異的な用量依存的結合は、抗ヒトＨＬＡ－Ｇ遮断抗体を用いて確認した（ＡＰＣ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を検出抗体として使用した）。同様に、ＨＴ１０８０細胞株上のヒトＣＤ４７並びにＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞株上で発現されるヒトＣＤ４７及びヒトＨＬＡ－Ｇに対するＤＳＰ２１６Ｖ１の特異的な用量依存的結合は、抗ヒトＣＤ４７及び抗ヒトＨＬＡ－Ｇ遮断抗体を用いて確認した（図１６Ｂ、ＡＰＣ結合抗ＳＩＲＰα抗体を検出抗体として使用した）。

【0716】

同様に、本明細書において「ＤＳＰ２１６Ｖ３」、「ＤＳＰ２１６Ｖ４」、「ＤＳＰ２１６Ｖ５」及び「ＤＳＰ２１６Ｖ６」と称される他のＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーの、ＬＩＬＲＢ２ドメインのヒトＨＬＡ－Ｇへの特異的な用量依存的結合及びＳＩＲＰαドメインのＣＤ４７への特異的な用量依存的結合は、ＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇ細胞株又はＪＥＧ３細胞株（いずれの株もヒトＣＤ４７及びヒトＨＬＡ－Ｇの両方を発現する）を使用し、抗ヒトＨＬＡ－Ｇ遮断抗体又は抗ヒトＣＤ４７遮断抗体を用いて決定した（図１６Ｃ～１７Ｆ、ＡＰＣ結合抗ヒトＩｇＧ１又はＡＰＣ結合抗ＳＩＲＰα抗体を検出抗体として使用した）。

【0717】

プレート結合ヒトＣＤ４７又はヒトＨＬＡ－Ｇに対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーの結合分析
ＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６、ＤＳＰ２１６Ｖ１、ＤＳＰ２１６Ｖ３及びＤＳＰ２１６Ｖ４のＳＩＲＰα及びＬＩＬＲＢ２ドメインの、プレート結合ＣＤ４７又はＨＬＡ－Ｇに対する結合は、抗ヒトＳＩＲＰα抗体（ＨＬＡ－Ｇコートしたプレートの場合）を用いてインキュベーション後に決定し、続いて対応するＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを行うか、又は抗ヒト抗ＩｇＧ１－ＨＲＰ若しくは抗ヒトＩｇＧ４－ＨＲＰを用いた。ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。図９Ａ～Ｃ及び１８Ａ～Ｈに示されるように、試験した全てのヘテロダイマーは、濃度依存的にプレート結合ＣＤ４７及びプレート結合ＨＬＡ－Ｇの両方に結合した。

【0718】

細胞表面で発現されるＣＤ２４及びＰＤＬ１に対するＳＩＧＬＥＣ－１０－ＰＤ１ヘテロダイマーの結合分析
本明細書において「ＤＳＰ４０２」と称されるＳＩＧＬＥＣ－１０－ＰＤ１ヘテロダイマーのＰＤ１ドメインのヒトＰＤＬ１への結合は、ＰＤＬ１を過剰発現するＤＬＤ１－ＰＤＬ１細胞株と、検出抗体としてのＡＰＣ結合抗ＰＤ１とを用いて決定した（図１１Ａ）。低レベルの内因性ＰＤＬ１を発現するＤＬＤ１－ＷＴ細胞は、対照としての役割を果たした（図１１Ａ）。図１３に示されるように、ＤＳＰ４０２は、用量依存的にＤＬＤ１ ＰＤＬ１過剰発現細胞に結合した。

【0719】

ＳＩＧＬＥＣ－１０ドメインのその受容体への結合は、ＣＤ２４発現細胞を用いて試験される。

【0720】

細胞表面で発現されるＰＶＲ、ＰＤＬ１及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に対するＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの結合分析
本明細書において「ＤＳＰ５０２」と称されるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーのＰＤ１ドメインのヒトＰＤＬ１への結合は、ＰＤＬ１を過剰発現するＤＬＤ１－ＰＤＬ１細胞株（図１１Ａ）及びＰＤ－Ｌ１を内因的に発現するＨＴ１０８０細胞株（図１４Ｄ）を用いて決定した。ＤＳＰ５０２のＴＩＧＩＴドメインのヒトＰＶＲへの結合は、いずれも高レベルの内因性ＰＶＲを発現するＤＬＤ１－ＰＤＬ１及びＨＴ１０８０細胞株を用いて決定した（１４Ｂ及び１４Ｃ）。ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を両方のアッセイで検出抗体として使用した。

【0721】

図１４Ｅ～Ｆに示されるように、ＤＳＰ５０２は、用量依存的にＰＤＬ１発現細胞に結合し、結合は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１遮断剤抗体により遮断された。

【0722】

図１４Ｅ～Ｆは、抗ヒトＰＶＲ遮断抗体を用いてこれらの細胞へのＤＳＰ５０２の結合を遮断することにより示されるように、ＰＶＲ発現細胞に対するＤＳＰ５０２のＴＩＧＩＴドメインの用量依存的結合も示す。

【0723】

図１４Ｇは、ＰＶＲを発現し、且つＰＤ１を発現しないＤＬＤ－１ ＷＴ細胞に対する、他のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー（本明細書において「ＤＳＰ５０２Ｖ１」、「ＤＳＰ５０２Ｖ２」及び「ＤＳＰ５０２Ｖ３」と称される）のＴＩＧＩＴドメインの用量依存的結合を示す（図１４Ａ及び１１Ａ）。ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ４抗体を検出抗体として使用した。これらの３種のタンパク質の結合のパターンは、類似している。

【0724】

加えて、ＤＳＰ５０２及び本明細書において「ＤＳＰ５０２Ｖ４」と称される別のＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマー（Ｆｃ－ＩｇＧ１ドメイン上にＬＡＬＡ変異を含有する）のＰＤ１及びＴＩＧＩＴドメインの、ヒトＰＤＬ１及びヒトＰＶＲに対する用量依存的結合は、それぞれＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＫ５６２ ＰＤ－Ｌ１細胞株、ＰＶＲを過剰発現するＫ５６２細胞株並びにＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の両方を過剰発現するＫ５６２ ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞株を用いて決定した（図１９Ａ～Ｉ）。

【0725】

ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体又はＡＰＣ結合抗ＴＩＧＩＴ及び抗ヒトＩｇＧ１抗体を、図に示されるように、結合アッセイにおいて検出抗体として使用した。

【0726】

高レベルの内因性ＰＶＲを発現するＳＫＯＶ３細胞株に対するＤＳＰ５０２のＴＩＧＩＴドメインの用量依存的結合も観察した（図２０Ａ～Ｂ、ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を検出抗体として使用した）。

【0727】

ＰＶＲを内因的に発現するＡＢ１２細胞株（図２２Ａ～Ｂ、ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を検出抗体として使用した）又はＰＤ－Ｌ１及びＰＶＲの両方を内因的に発現するＲｅｎｃａ細胞株（図２１Ａ～Ｂ、ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を検出抗体として使用した）を用いて、細胞上で発現されるマウスＰＤＬ１及びマウスＰＶＲに対するＤＳＰ５０２のＰＤ１及びＴＩＧＩＴドメインの用量依存的結合も観察した。Ｒｅｎｃａ細胞上で発現されるリガンド（ＰＤＬ１及びＰＶＲ）のそれぞれに対するＤＳＰ５０２の特異的結合は、抗ｍＰＤＬ１及び抗ｍＰＶＲ遮断剤抗体を用いて実証した。

【0728】

さらに、ヒトＦｃ受容体ＣＤ１６に対するＤＳＰ５０２のＦｃドメインの結合は、ＣＤ１６を過剰発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞株を用いて実証した（図２３Ｂ）。ＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ１抗体を検出抗体として使用した。図２３Ａに示されるように、ＤＳＰ５０２は、用量依存的に細胞に結合した。ＣＤ１６への結合の特異性は、ヘテロダイマーの細胞への結合を完全に遮断するＦｃ遮断剤を用いて実証した。

【0729】

ヘテロダイマーのＦｃ受容体への結合の効果をさらに試験するために、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤＬ－１細胞（標的細胞）と、ＣＤ１６を過剰発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞（エフェクター細胞）との共培養アッセイ後、６時間のインキュベーション後にルシフェラーゼシグナルの分析を行った。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６細胞は、ＮＦＡＴエレメントに融合したＩＳＧ５４プロモーターの制御下でＬｕｃｉａルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現する。ＦｃγＲＩＩＩａ結合は、検出試薬を添加したときにルシフェラーゼによって生成される生物発光シグナルとして測定された。図２４に示されるように、ＤＳＰ５０２の存在下で細胞を共培養すると、ルシフェラーゼの分泌が増大した。重要なことに、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６細胞をＤＳＰ５０２との単一培養アッセイ（即ちＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤＬ－１細胞の非存在下）としてインキュベートしたとき、ルシフェラーゼの分泌は、検出されなかった。したがって、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現されるＦｃγＲＩＩＩａに対するＤＳＰ５０２の結合は、ＰＶＲ及び／又はＰＤＬ１に固定されていない場合、シグナル伝達の開始のために十分ではない。

【0730】

ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーのプレート結合ＰＶＲへの結合分析
ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２のＴＩＧＩＴドメインのプレート結合ＰＶＲに対する結合は、抗ヒトＰＤ１抗体を用いてインキュベーション後に決定し、続いて対応するＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを行った。ＴＭＢ基質を用いて検出を行った。図１０Ａ～Ｂに示されるように、ＤＳＰ５０２は、濃度依存的にプレート結合ＰＶＲに結合した。

【0731】

実施例３Ａ
ヘテロダイマーは、ＥＬＩＳＡにより決定したとき、その対応物であるリガンド／受容体に同時に結合する
ヘテロダイマーの両側のその対応物への結合、即ちＰＤ１のＰＤＬ１への結合、ＬＩＬＲＢ２のＨＬＡ－Ｇへの結合、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合、ＴＩＧＩＴのＰＶＲへの結合及びＳＩＧＬＥＣ－１０のＣＤ２４への結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡに基づくアッセイによって試験される。このアッセイは、ヘテロダイマータンパク質の異なるバリアントの機能的特性を比較するためにも使用される。

【0732】

平底９６ウェルプレートは、ＣＤ４７タンパク質、ＰＤＬ１タンパク質、ＨＬＡ－Ｇタンパク質、ＰＶＲ又はＣＤ２４などの組換えの対応物タンパク質と共にインキュベートすることにより一方のアームの受容体／リガンドでプレコートされ、続いてブロッキング及び洗浄が行われる。製造されたヘテロダイマーを含有する段階希釈した細胞培養上清又は精製タンパク質サンプルは、対応するプレコートウェルに添加される。付加的な洗浄ステップに続いて、ヘテロダイマーの第２のアームに対するビオチン化又は非標識の可溶性受容体／リガンドが添加され、捕捉したタンパク質に結合される。その後、第２の受容体／リガンドに対するストレプトアビジン－ＨＲＰ又はＨＲＰ結合抗体が添加され、６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ＴＭＢ基質を用いて検出が行われる。

【0733】

代わりに、プレートは、等モル量の２種のタンパク質の混合物でコートされ、ＩｇＧ特異的抗体を用いて結合が検出される。

【0734】

図２５Ａに示されるように、ＴＩＧＩＧ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２は、同時にＰＶＲ及びＰＤＬ１の両方に結合した。

【0735】

実施例３Ｂ
ヘテロダイマーは、フローサイトメトリーにより決定したとき、その対応物であるリガンド／受容体に同時に結合する
ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２のその全ての対応物への同時結合（即ち例えばＩｇＧ１－ＦｃのＦｃγＲＩＩＩａへの結合、ＴＩＧＩＴのＰＶＲへの結合及びＰＤ１のＰＤＬ１への結合）は、ＦｃγＲＩＩＩａを発現するＮＫ初代細胞（図２５Ｂ）と、ＰＶＲ及びＰＤＬ１を発現するＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１（図１９Ｆ）とを用いて、フローサイトメトリーにより試験した。具体的には、ＣＰＤ色素で前標識したＮＫ細胞を、異なる濃度のＤＳＰ５０２の存在下、それぞれ２：１の比率において、ＣＦＳＥ色素で前標識したＫ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞と共培養した。ダブレットの形成は、フローサイトメトリーを用いて分析し、二重染色イベントとして現れた。図２５Ｃに示されるように、ＤＳＰ５０２は、ダブレット形成を媒介し、ＤＳＰが両方の細胞型に同時に結合することが示された。さらに、ＤＳＰ５０２によるこれらのダブレット形成媒介活性は、ＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１又はＦｃγＲＩＩＩに対する特異的遮断剤抗体により遮断され（図２５Ｄ）、ダブレット形成の最適条件は、３つの受容体が関与する場合であることが示された。

【0736】

実施例４
リガンド－受容体結合の遮断に対するヘテロダイマーの効果
ヘテロダイマーは、標的細胞上で発現される内因性リガンド／受容体と本来の受容体／リガンドとの相互作用を遮断するように設計される。

【0737】

したがって、例えば、関連のヘテロダイマーのＰＤ１部分は、Ｔ細胞上で発現される内因性ＰＤ１と、腫瘍細胞上で発現されるＰＤＬ１との相互作用を遮断するように設計される。この目的のために、この相互作用の遮断剤としての、製造したヘテロダイマーの有効性が評価される。プレートを組換えヒトＰＤＬ１でコートする。続いて、プレートを洗浄し、異なる濃度の製造したＰＤ１含有ヘテロダイマー（例えば、上記の表１を参照されたい）又は陽性対照の抗ＰＤ１遮断剤抗体と共に１時間インキュベートする。ビオチン化ＰＤ１が添加され、続いて付加的なインキュベーションが行われ、次にプレートが洗浄され、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従い、ストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＴＭＢ基質でブロッティングされる。６２０ｎｍを参照波長として４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）を用いてプレートを分析した。

【0738】

同様に、ＰＶＲ－ＴＩＧＩＴ、ＳＩＧＬＥＣ１０－ＣＤ２４、ＬＩＬＲＢ２－ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７－ＳＩＲＰαの結合を遮断するためのその有効性を評価するために、関連のヘテロダイマーの遮断活性が研究される。

【0739】

実施例５
ヘテロダイマーのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
実験設計：
製造したヘテロダイマーの癌の治療における有効性を試験するために、３つの異なるｉｎ－ｖｉｖｏマウスモデルを使用する。
１．ヒト幹細胞、又はヒトＰＢＭＣ、又は固定化ヒトＰＢＭＣと、ヘテロダイマーの標的を発現するヒト腫瘍細胞とを接種したＮＳＧマウス。
２．ヒト腫瘍細胞を接種したＮｕｄｅ－ＳＣＩＤマウス。
３．試験したヘテロダイマーの代替マウスタンパク質を用いた同系マウス腫瘍モデル。

【0740】

全モデルにおいて、マウスは、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）又は同所性に腫瘍細胞を接種されている。腫瘍が検知可能（約８０ｍｍ^３）になったら、製造したヘテロダイマーを異なる用量及び異なるレジメで使用し、マウスをＩＶ、ＩＰ、ＳＣ又は同所性に処置した。

【0741】

マウスの体重及び臨床兆候を追跡した。１週間に数回、腫瘍をカリパスで測定し、腫瘍体積は、式：Ｖ＝長さ×幅^２／２に基づいて計算した。マウスの体重は、毎日測定した。腫瘍成長及び生存率は、実験全体を通してモニタリングした。

【0742】

腫瘍内の免疫細胞の浸潤及びサブタイピングは、腫瘍の切除又はリンパ節の抜き取り、消化及び特異的抗体による染色及びフローサイトメトリー解析を用いた免疫表現型決定で試験した。加えて又は代わりに、腫瘍を切除し、パラフィンに包埋し、切片化して特異的抗体による免疫組織学的染色し、免疫細胞の浸潤又は腫瘍の壊死グレードを決定した。

【0743】

賭殺時、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣ染色のためにマウスの臓器を回収し、パラフィンブロックに包埋した。

【0744】

下記の試験のために、一般的な手順に従い、異なる時点でマウスから血液サンプルを採取した。ＰＫ解析、血漿中のサイトカインの測定、循環中の血液細胞副集団のＦＡＣＳプロファイリング、血液学的試験、血清化学試験、抗薬物抗体（ＡＤＡ）解析及び中和抗体解析（Ｎａｂ）。

【0745】

結果：
ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍を有するＮＳＧマウスにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの抗腫瘍効果
ヒト肺腺癌細胞株であるＡ５４９細胞を接種した１１～１３週齢のオスＮＳＧマウスにおいて、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２の抗腫瘍ｉｎ－ｖｉｖｏ効果を評価した。ＤＳＰ５０２で処置したマウスの腫瘍体積は、腫瘍接種後１８日間ほとんど増大しなかったが、対照マウスの腫瘍体積は、４００ｍｍ^３の体積に達し、ＤＳＰ５０２による処置が腫瘍成長の有意な阻害をもたらすことが示された（図２６）。

【0746】

マウス中皮腫腫瘍を有するマウスにおけるＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーの抗腫瘍効果
マウス悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）細胞株であるＡＢ１２細胞を接種した７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２の抗腫瘍ｉｎ－ｖｉｖｏ効果を評価した。ＤＳＰ５０２による処置は、対照マウスと比較してマウスの生存を有意に延長した（図２７）。例えば、対照処置マウスの８７．５％は、腫瘍接種後３３日目までに死亡したが、ＤＳＰ５０２処置マウスの６２％は、腫瘍接種後８０日を超えて生存した。

【0747】

実施例６
Ｍ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟に対する、関連ヘテロダイマーのＬＩＬＲＢ２アームの効果
ヘテロダイマーのＬＩＬＲＢ２アームは、マクロファージ及び樹状細胞等のＡＰＣ上に発現されている内因性ＬＩＬＲＢ２と、それに対して腫瘍又は免疫細胞上に発現されたＨＬＡ－Ｇとの相互作用に対して競合するか又は相互作用を遮断することで、誘導される免疫抑制シグナルを遮断するように設計される。Ｍ１様マクロファージは、抗腫瘍活性を示す一方、Ｍ２マクロファージは、腫瘍進行の促進について報告されている。Ｍ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟時のアンタゴニスト様抗体によるＬＩＬＲＢ２の遮断は、ＣＤ１４及びＣＤ１６３の発現が低く、より丸く、強く結合したＭ１様（抗腫瘍）表現型をもたらすことが示された。作製したマクロファージのＬＰＳによる刺激後、プロ炎症性サイトカインであるＴＮＦαの分泌の増強及び抗炎症性ＩＬ－１０の分泌の減少が検出された。

【0748】

このために、ＬＩＬＲＢ２を含む製造されたヘテロダイマーのＭ－ＣＳＦ依存性マクロファージ成熟に対する効果を、フローサイトメトリーに基づくＣＤ１４及びＣＤ１６３の検出及びＬＰＳで前処理したマクロファージの刺激後のＴＮＦα及びＩＬ－１０放出の測定によって評価する。

【0749】

実施例７
ＳＩＲＰα又はＬＩＬＲＢ２ドメインを含むヘテロダイマーのマクロファージ及び多形核細胞に対する効果
いくつかの実施形態のヘテロダイマーのＳＩＲＰα部分は、腫瘍細胞上のＣＤ４７と内因性ＳＩＲＰαとの相互作用を競合及び遮断することにより、マクロファージ及び顆粒球などのＡＰＣ上で発現される内因性ＳＩＲＰαに向けてＣＤ４７発現腫瘍細胞により誘導される「ドント・イート・ミー」シグナルを遮断するように設計される。「ドント・イート・ミー」シグナルのこの遮断は、腫瘍細胞の食作用を誘導する。

【0750】

いくつかの実施形態のヘテロダイマーのＬＩＬＲＢ２部分は、一部分において、腫瘍及び免疫細胞上のＨＬＡ－Ｇと内因性ＬＩＬＲＢ２との相互作用を競合及び遮断することにより、マクロファージ及びＤＣなどのＡＰＣ上で発現される内因性ＬＩＬＲＢ２に向けて、腫瘍又は免疫細胞上で発現されるＨＬＡ－Ｇによって誘導される免疫抑制シグナルを遮断するように設計される。ＨＬＡ－Ｇの「ドント・イート・ミーシグナル」のこの遮断は、腫瘍細胞の食作用を誘導し、免疫細胞間の阻害性ＨＬＡ－Ｇ－ＬＩＬＲＢ２シグナルの伝達を防止し、その結果、食作用が増強される。

【0751】

ヒトマクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ）による腫瘍細胞の食作用に対する製造したＳＩＲＰαを含むヘテロダイマーの効果及びヒトマクロファージ又はＤＣによる腫瘍細胞の食作用に対するＬＩＬＲＢ２を含むヘテロダイマーの効果は、フローサイトメトリーに基づくアッセイ又は蛍光顕微鏡法を用いて評価される。

【0752】

この目的のために、ヒトＰＭＮ（顆粒球）による腫瘍細胞の食作用に対するＳＩＲＰα－ＬＩＬＲＢ２ヘテロダイマーＤＳＰ２１６の効果を、フローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて評価した。異なる３ドナーからの顆粒球を１、２又は５μｇ／ｍＬのＤＳＰ２１６と共にインキュベートし、次にヒトＣＤ４７を発現する腫瘍細胞株ＨＴ１０８０又はヒトＣＤ４７及びヒトＨＬＡ－Ｇの両方を発現するＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇと１：１のＥ：Ｔ比で共培養した（図１２Ａ及び１２Ｄ）。図２８に示されるように、ＤＳＰ２１６処置は、ＨＴ１０８０細胞の食作用パーセンテージ及びＨＴ１０８０－ＨＬＡ－Ｇの食作用パーセンテージをより大きい程度まで増大した。

【0753】

実施例８
ＴＩＧＩＴドメインを含むヘテロダイマーによるＮＫ細胞の細胞傷害活性
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞のように特異的抗原を認識することなく、直接的な細胞傷害性又はサイトカイン／ケモカインの分泌を誘導する。ＮＫ細胞傷害性は、感染細胞、悪性腫瘍及びストレスを受けた細胞に対する免疫応答において重要な役割を果たし、種々の疾患の病理学的過程に関与する。

【0754】

製造したヘテロダイマーのＮＫ活性化に対する効果を決定するために、限定されないが、以下を含む、当技術分野で知られている多数のアッセイを使用した。

【0755】

・細胞傷害性アッセイ： 共培養アッセイにおけるＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞の死滅。死滅のパーセンテージは、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって分析する。前標識した標的細胞（例えば、Ｋ５６２ＰＶＲ／ＰＤ－Ｌ１細胞又はＫ５６２ＷＴ細胞）を９６ウェルプレートに入れ、種々のエフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比において、前標識した初代ＮＫ細胞と共に３７℃でインキュベートする。任意選択で、アッセイ前にＮＫ細胞を１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２と共に４８時間培養する。４、１２及び／又は２４時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーにより検定する。ＮＫ細胞を含まない培養物から回収された標的細胞の数を参照として使用する。

【0756】

・細胞傷害性アッセイ： 共培養アッセイにおけるＮＫ細胞（エフェクター細胞）による標的細胞の死滅。死滅のパーセンテージは、標識標的細胞及びカスパーゼ感受性蛍光基質を用いてＩｎｃｕｃｙｔｅ装置で決定する。

【0757】

・炎症性サイトカインの分泌： 種々の比率の種々の標的細胞で初代ＮＫ細胞を２４時間刺激する。無細胞培養上清中のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のレベルは、ＥＬＩＳＡ又はＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）で決定する。

【0758】

・グランザイムＢの分泌： 種々の比率の種々の標的細胞で初代ＮＫ細胞を１２時間刺激する。無細胞培養上清中のグランザイムＢのレベルは、ＥＬＩＳＡで決定する

【0759】

結果：
ＮＫ細胞によるＫ５６２ＷＴ標的細胞の死滅は、ＰＶＲ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞の死滅と比較して高かった（図２９Ａ）。標的細胞としてＫ５６２ＷＴ細胞を含む共培養物にＴＩＧＩＴ－ＰＤ１ヘテロダイマーＤＳＰ５０２を添加しても、ＮＫ細胞傷害性は、増大しなかった（データは示さず）。しかしながら、標的細胞としてＰＶＲ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞を含む共培養物にＤＳＰ５０２を添加すると、試験した全てのＥ：Ｔ比において、未処理の細胞と比較してＮＫ細胞傷害性が有意に増大した（図２９Ａ）。最も有意な細胞傷害性効果は、ＤＳＰ５０２ヘテロダイマーで処理されたＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の両方を発現するＫ５６２細胞で観察された。

【0760】

上記に記載される細胞傷害性アッセイと一致して、標的細胞としてＫ５６２ＷＴと共培養したＮＫ細胞からのグランザイムＢの分泌は、標的細胞としてＰＶＲ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞との共培養と比較して高かった（図２９Ｂ）。標的細胞としてＰＶＲ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現するＫ５６２細胞を含む共培養物にＤＳＰ５０２を添加すると、試験した全てのＥ：Ｔ比において、未処理の細胞と比較してグランザイムＢの分泌が有意に増大した（図２９Ｂ）。細胞傷害性アッセイの場合と同様に、グランザイムＢの分泌の最も有意な増大は、ＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の両方を発現するＫ５６２細胞で観察された。

【0761】

本発明がその特定の実施形態に関連して記載されたが、多くの代替形態、修正形態及び変形形態が当業者に明らかであることは、明白である。したがって、特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれるこのような代替形態、修正形態及び変形形態の全てを包含することが意図される。

【0762】

本明細書で参照される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照されるとき、具体的及び個別に参照によって本明細書に援用されると言及されているかのように、参照によってその全体が本明細書に援用されることが本出願人の意図である。さらに、本願における参考文献の引用又は特定のいずれも、このような参考文献が本発明の従来技術として利用可能であることを認めると解釈されてはならない。セクションの見出しが使用される限り、これらは、必ずしも限定であると解釈されてはならない。さらに、本願のいかなる優先権文献も参照によってその全体が本明細書に援用される。

【配列表フリーテキスト】

【0763】

配列番号１： ＳＩＲＰ Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ） ５８５ＡＡ ＤＳＰ１２０、ＤＳＰ２１６、ＤＳＰ４０３、ＤＳＰ５０３の第１のモノマー
配列番号２： ＃１の核酸
配列番号３： ＰＤ１ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホール） ３８２ＡＡ ＤＳＰ１２０、ＤＳＰ２２０、ＤＳＰ４０２、ＤＳＰ５０２の第２のモノマー
配列番号４： ＃３の核酸
配列番号５： ＳＩＲＰアルファ（ＩｇＧ４ノブ） ５８２ＡＡ ＤＳＰ１２０Ｖ１、ＤＳＰ２１６Ｖ１、ＤＳＰ４０３Ｖ１、ＤＳＰ５０３Ｖ１の第１のモノマー
配列番号６： ＃５の核酸
配列番号７： ＰＤ１（ＩｇＧ４ホール） ３７９ＡＡ ＤＳＰ１２０Ｖ１、ＤＳＰ４０２Ｖ１、ＤＳＰ５０２Ｖ２、ＤＳＰ５０２Ｖ３の第２のモノマー
配列番号８： ＃７の核酸
配列番号９： ＴＩＧＩＴ Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ） ３５４ＡＡ ＤＳＰ２０５、ＤＳＰ４０４、ＤＳＰ５０２の第１のモノマー
配列番号１０： ＃９の核酸
配列番号１１： ＬＩＬＲＢ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホール） ６４５ＡＡ ＤＳＰ２０５、ＤＳＰ２１６、ＤＳＰ４１２の第２のモノマー
配列番号１２： ＃１１の核酸
配列番号１３： ＴＩＧＩＴ Ｆｃ（ＩｇＧ４ノブ） ３５１ＡＡ ＤＳＰ２０５Ｖ１の第１のモノマー
配列番号１４： ＃１３の核酸
配列番号１５： ＬＩＬＲＢ Ｆｃ（ＩｇＧ４ホール） ６４２ＡＡ ＤＳＰ２０５Ｖ１、ＤＳＰ２１６Ｖ１、ＤＳＰ４１２Ｖ１の第２のモノマー
配列番号１６： ＃１５の核酸
配列番号１７： ＳＩＲＰアルファ Ｆｃ（ＩｇＧ４としてのＩｇＧ１ノブ） ５８５ＡＡ ＤＳＰ２１６Ｖ２の第１のモノマー
配列番号１８： ＃１７の核酸
配列番号１９： ＬＩＬＲＢ２ ＦＣ（ＩｇＧ４としてのＩｇＧ１ホール） ６４５ＡＡ ＤＳＰ２１６Ｖ２の第２のモノマー
配列番号２０： ＃１９の核酸
配列番号２１： ＬＩＬＲＢ２ Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ） ６４５ＡＡ ＤＳＰ２２０の第１のモノマー
配列番号２２： ＬＩＬＲＢ２ Ｆｃ ＩｇＧ４ノブ ６４２ＡＡ ＤＳＰ２２０Ｖ１の第１のモノマー
配列番号２３： ＃２２の核酸
配列番号２４： ＳＩＧＬＥＣ１０ Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ） ３７５ＡＡ ＤＳＰ４０２、ＤＳＰ４１２の第１のモノマー
配列番号２５： ＳＩＧＬＥＣ１０ Ｆｃ（ＩｇＧ４） ３６７ＡＡ ＤＳＰ４０２Ｖ１、ＤＳＰ４１２Ｖ１の第１のモノマー
配列番号２６： ＃２５の核酸
配列番号２７： ｈＩｇＧ１ Ｆｃリンカー（ＤＳＰ２１６Ｖ２ではノブＶ１のみ） ２３２ａａ
配列番号２８： ｈＩｇＧ１ Ｆｃリンカー（ＤＳＰ２１６Ｖ２ではノブＶ１のみ） ２３２ａａ
配列番号２９： ＳＩＧＬＥＣ１０ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホール） ４７５ＡＡ ＤＳＰ４０４、ＤＳＰ４０３の第１のモノマー
配列番号３０： ＳＩＧＬＥＣ１０ Ｆｃ（ＩｇＧ４ホール） ＤＳＰ４０４Ｖ１、ＤＳＰ４０３Ｖ１の第２のモノマー
配列番号３１： ＴＩＧＩＴ Ｎｏ Ｉ４２Ｄ Ｆｃ（ＩｇＧ４ノブ） ３５１ＡＡ ＤＳＰ５０２Ｖ２の第１のモノマー
配列番号３２： ＃３１の核酸
配列番号３３： ＴＩＧＩＴ ＷＴ Ｆｃ（ＩｇＧ４ノブ） ３５５ＡＡ ＤＳＰ５０２Ｖ３の第１のモノマー
配列番号３４： ＃３３の核酸
配列番号３５： ＴＩＧＩＴ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホール） ３５４ＡＡ ＤＳＰ５０３の第２のモノマー
配列番号３６： ＴＩＧＩＴ Ｆｃ（ＩｇＧ４ホール） ３５１ＡＡ ＤＳＰ５０３Ｖ１の第２のモノマー
配列番号３７： 全長ＰＤ１のアミノ酸配列
配列番号３８： 全長ＰＤ１の核酸配列
配列番号３９： ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換を有するＰＤ１ ＥＣＤ全長
配列番号４０： 配列番号３９をコードする核酸配列
配列番号４１： ＰＤ１ ＥＣＭ公知断片
配列番号４２： ＰＤ１ ＥＣＭ公知断片
配列番号４３： １５０ａａの本来のＰＤ１ドメイン
配列番号４４： 配列番号４３の核酸
配列番号４５： ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換を有する、１５０ａａの本来のＰＤ１ドメイン
配列番号４６： 配列番号４５の核酸
配列番号４７： ＰＤ１ドメインの１４０ａａ －５－５
配列番号４８： 配列番号４７の核酸
配列番号４９： ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換を有するＰＤ１ドメインの１４０ａａ －５－５
配列番号５０： 配列番号４９の核酸
配列番号５１： ｈＩｇＧ１ Ｆｃリンカー（ノブ） ２３２ａａ
配列番号５２： ｈＩｇＧ１ Ｆｃリンカー（ホール） ２３２ａａ
配列番号５３： １２８ａａのＰＤ１セグメント
配列番号５４： ＃５３の核酸
配列番号５５： １３５ａａのＰＤ１セグメント
配列番号５６： ＃５５の核酸
配列番号５７： １３３ａａのＰＤ１セグメント
配列番号５８： ＃５７の核酸
配列番号５９： ＰＤ１ －１０－５（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号６０： ＃５９の核酸
配列番号６１： ＰＤ１ －１０－１２（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号６２： ＃６１の核酸
配列番号６３： ＰＤ１ －５－１２（新規、Ｖ２０由来）（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号６４： ＃６３の核酸
配列番号６５： ＰＤ １－１１－１２
配列番号６６： ＃６５の核酸
配列番号６７： ＰＤ１ －１１－１２（新規、Ｖ１８由来）（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号６８： ＃６７の核酸
配列番号６９： ＰＤ１ －１１－５
配列番号７０： ＃６９の核酸
配列番号７１： ＰＤ１ －１１－５（新規、Ｖ１９由来）（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号７２： ＃７１の核酸
配列番号７３： ＰＤ１ －５－７
配列番号７４： ＃７３の核酸
配列番号７５： ＰＤ１ －５－７（新規、Ｖ２１由来）（ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換有）
配列番号７６： ＃７５の核酸
配列番号７７： （ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換無）由来のＰＤ１ －５－９
配列番号７８： ＃７７の核酸
配列番号７９： （ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換無）由来のＰＤ１ －０－５
配列番号８０： ＃７９の核酸
配列番号８１： （ＣＹＳ９３＞Ｓｅｒ置換無）由来のＰＤ１ －０－７ １４３ａａ
配列番号８２： ＃８１の核酸
配列番号８３： 全長ＳＩＲＰアルファのアミノ酸配列
配列番号８４： ＃８３の核酸
配列番号８５： 本来のＳＩＲＰａドメイン（３４３ＡＡ）
配列番号８６： ＃８５の核酸
配列番号８７： １１６ａａ ＳＩＲＰａセグメント
配列番号８８： ＃８７の核酸
配列番号８９： ４つの点変異を有するＳＩＲＰａの３４３アミノ酸配列
配列番号９０： ＃８９の核酸
配列番号９１： ４つの点変異を有するＳＩＲＰａの１１６アミノ酸配列
配列番号９２： ＃９１の核酸
配列番号９３： ａａ ＳＩＲＰａセグメント－配列番号８７（１１７ａａのＳＩＲＰａセグメント）のＣ末にＫの付加有
配列番号９４： ＃９３の核酸
配列番号９５： ＬＩＬＲＢ２全長ＥＣＤアミノ酸配列
配列番号９６： ＬＩＬＲＢ２ Ｄ１－４、ＡＡ２２－４１９（Ｑ８Ｎ４２３－１ ＵｎｉＰａｒｃ）アミノ酸配列
配列番号９７： ＬＩＬＲＢ２ Ｄ１－４、ＡＡ２２－４１９（Ｑ８Ｎ４２３－１ ＵｎｉＰａｒｃ）核酸配列
配列番号９８： ＬＩＬＲＢ２ Ｄ１－２、ＡＡ２２－２１９（Ｑ８Ｎ４２３－１ ＵｎｉＰａｒｃ）アミノ酸配列
配列番号９９： ＬＩＬＲＢ２ Ｄ１－２、ＡＡ２２－２１９（Ｑ８Ｎ４２３－１ ＵｎｉＰａｒｃ）核酸配列
配列番号１００： Ｓｉｇｌｅｃ １０全長（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）アミノ酸配列
配列番号１０１： Ｓｉｇｌｅｃ １０、ＡＡ１８－１４５変異無（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）アミノ酸配列
配列番号１０２： Ｓｉｇｌｅｃ １０、ＡＡ１８－１４５変異無（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）核酸配列
配列番号１０３： Ｓｉｇｌｅｃ １０、ＡＡ１８－１４５とＣ３６Ｓ（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）アミノ酸配列
配列番号１０４： Ｓｉｇｌｅｃ １０、ＡＡ１８－１４５とＣ３６Ｓ（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）核酸配列
配列番号１０５： Ｓｉｇｌｅｃ １０全長ＥＣＤ、ＡＡ１７－５５０（Ｑ９６ＬＣ７－１ Ｕｎｉｐｒｏｔ）アミノ酸配列
配列番号１０６： ＴＩＧＩＴ全長（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）アミノ酸配列
配列番号１０７： ＴＩＧＩＴ、ＡＡ２２－１３４変異無（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）アミノ酸配列
配列番号１０８： ＴＩＧＩＴ、ＥＣＤ ＡＡ２２－１３４変異無（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）核酸配列
配列番号１０９： ＴＩＧＩＴ、ＡＡ２２－１３４とＩ４２Ａ Ｃ６９Ｓ（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）アミノ酸配列
配列番号１１０： ＴＩＧＩＴ、ＡＡ２２－１３４とＩ４２Ａ Ｃ６９Ｓ（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）核酸配列
配列番号１１１： ＴＩＧＩＴ、ＡＡ２２－１３４Ｃ６９Ｓ（Ｑ４９５Ａ１ ＤＳＰ ５０２Ｖ２内のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤｉｎ）１１２ＡＡ、配列
配列番号１１２： ＴＩＧＩＴ、ＡＡ２２－１３４ Ｃ６９Ｓ（Ｑ４９５Ａ１ＤＳＰ ５０２Ｖ２内のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）３３６核酸、配列
配列番号１１３： ＴＩＧＩＴ、ＥＣＤ ＡＡ２２－１３７（Ｑ４９５Ａ１ ＤＳＰ ５０２Ｖ３内のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）１１６ＡＡ、配列
配列番号１１４： ＴＩＧＩＴ、ＥＣＤ ＡＡ２２－１３７（Ｑ４９５Ａ１ ＤＳＰ ５０２Ｖ３内のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）３４８核酸、配列
配列番号１１５： ＴＩＧＩＴ全長ＥＣＤ ＡＡ２２－１４１（Ｑ４９５Ａ１ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ）１２０ＡＡ、配列
配列番号１１６： 人工シグナルペプチド
配列番号１１７： リンカーアミノ酸配列
配列番号１１８： リンカーアミノ酸配列
配列番号１１９： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２０： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２１： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２２： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２３： リンカーアミノ酸配列；６～１０位は無くてもよい；１１～１５位は無くてもよい；１６～２０位は無くてもよい
配列番号１２４： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２５： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２６： リンカーアミノ酸配列；６～１０位は無くてもよい；１１～１５位は無くてもよい
配列番号１２７： リンカーアミノ酸配列；１２～１６位は無くてもよい；１７～２１位は無くてもよい；２２～２６位は無くてもよい
配列番号１２８： リンカーアミノ酸配列
配列番号１２９： リンカーアミノ酸配列
配列番号１３０： リンカーアミノ酸配列
配列番号１３１： リンカーアミノ酸配列
配列番号１３２： リンカーアミノ酸配列
配列番号１３３： リンカーアミノ酸配列
配列番号１３４： ｈＩｇＧ４ Ｆｃリンカー ２２９ａａ
配列番号１３５： ｈＩｇＧ４ Ｆｃリンカー（ノブ） ２２９ａａ
配列番号１３６： ｈＩｇＧ４ Ｆｃリンカー（ホール） ２２９ａａ
配列番号１３７： ｈＩｇＧ１ Ｆｃリンカー、（Ｐ０１８５７－１のＡＡ９９－３３０とＣ２２０Ｓ（ｋａｂａｔ）置換２３２アミノ酸
配列番号１３８： 短いＳＩＲＰａ－Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ）３５９ＡＡ、ＤＳＰ２１６Ｖ３の第１のモノマー
配列番号１３９： ＃１３８の核酸
配列番号１４０： 短いＳＩＲＰａ－Ｆｃ（ＩｇＧ４ノブ）３５６ＡＡ、ＤＳＰ２１６Ｖ４の第１のモノマー
配列番号１４１： ＃１４０の核酸
配列番号１４２： ＳＩＲＰａ－Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ ＬＡＬＡ）３５８ＡＡ、ＤＳＰ２１６Ｖ５の第１のモノマー
配列番号１４３： ＃１４２の核酸
配列番号１４４： 短いＳＩＲＰａ－Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ ＬＡＬＡ）３５９ＡＡ、ＤＳＰ２１６Ｖ６の第１のモノマー
配列番号１４５： ＃１４４の核酸
配列番号１４６： ＴＩＧＩＴ－ Ｆｃ（ＩｇＧ１ノブ ＬＡＬＡ）３５４ＡＡ、ＤＳＰ５０２Ｖ４の第１のモノマー
配列番号１４７： ＃１４６の核酸
配列番号１４８： ＰＤ１－ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホール ＬＡＬＡ）３８２ＡＡ、ＤＳＰ５０２Ｖ４の第２のモノマー
配列番号１４９： ＃１４８の核酸
配列番号１５０： ＬＩＬＲＢ２－ Ｆｃ（ＩｇＧ１ホールＬＡＬＡ）３８２ＡＡ、ＤＳＰ２１６Ｖ５及びＤＳＰ２１６Ｖ６の第２のモノマー
配列番号１５１： ＃１５０の核酸
配列番号１５２： ＩｇＧ１ ＦｃホールＬＡＬＡ、 Ｆｃ（ＡＡ９９－３３０）Ｃ２２０Ｓ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａと“ホール”Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ）及びＹ３４９Ｃ（番号はＫＡＢＡＴに基づく）、ＤＳＰ２１６Ｖ５、ＤＳＰ２１６Ｖ６及びＤＳＰ５０２Ｖ４で使用
配列番号１５３： ＃１５２の核酸
配列番号１５４： ＩｇＧ１ Ｆｃ “ノブ”ＬＡＬＡ（Ｆｃ ＩｇＧ１（ＡＡ９９－３３０） Ｐ０１８５７－１ Ｃ２２０Ｓ（ｋａｂａｔ）と、“ノブ”Ｔ３６６Ｗ（ｋａｂａｔ）及びＳ３５４Ｃ（ｋａｂａｔ）とＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ｋａｂａｔ）、ＤＳＰ２１６ｖ５及びＤＳＰ５０２Ｖ４で使用
配列番号１５５： ＃１５４の核酸；１位のｎはａ、ｃ、ｇ、又はｔ
配列番号１５６： ｈＩｇＧ１ Ｆｃ
配列番号１５７： ｈＩｇＧ４－ＳＰＬＥ－ Ｆｃ ノブ
配列番号１５８： ｈＩｇＧ４ Ｆｃ ノブ
配列番号１５９： ｈＩｇＧ４ Ｆ ｃホール
配列番号１６０： ｈＩｇＧ１ Ｆｃ ノブのみ
配列番号１６１： ｈＩｇＧ１ Ｆｃ ホールのみ
配列番号１６２： ｈＩｇＧ１ Ｃ２２０Ｓ Ｆｃ ホール
配列番号１６３： ｈＩｇＧ４－ＳＰＬＥ－Ｆｃ ノブ Ｙ３４９Ｃ無
配列番号１６４： ｈＩｇＧ４－ＳＰＬＥ－Ｆｃ ホール Ｅ３５６Ｃ無

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図16-4】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

2024503685000001.app

【国際調査報告】