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特表2024-503821タガトースを産生する枯草菌の遺伝子工学菌及びタガトースの調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-29
(54)【発明の名称】タガトースを産生する枯草菌の遺伝子工学菌及びタガトースの調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20240122BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240122BHJP
C12P 19/02 20060101ALI20240122BHJP
C12N 15/61 20060101ALI20240122BHJP
C12N 15/74 20060101ALI20240122BHJP
C12N 11/14 20060101ALI20240122BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240122BHJP
C12N 9/90 20060101ALI20240122BHJP
C12N 9/92 20060101ALI20240122BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240122BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N1/21 ZNA
C12P19/02
C12N15/61
C12N15/74 Z
C12N11/14
C12N9/16 B
C12N9/90
C12N9/92
C12N9/10
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540968
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(85)【翻訳文提出日】2023-07-04
(86)【国際出願番号】 CN2021108983
(87)【国際公開番号】W WO2022148008
(87)【国際公開日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】202110006046.4
(32)【優先日】2021-01-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523166348
【氏名又は名称】天工生物科技（天津）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】馬 延和
(72)【発明者】
【氏名】シー ティン
(72)【発明者】
【氏名】李 運杰
(72)【発明者】
【氏名】韓 平平
(72)【発明者】
【氏名】李 元
【テーマコード（参考）】
4B033
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B033NA12
4B033NA22
4B033NA25
4B033NA26
4B033NA35
4B033NA36
4B033NB22
4B033ND11
4B033NH10
4B064AF02
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA11
4B065AA19X
4B065AA19Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA20
4B065CA27
4B065CA29
4B065CA31
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
(57)【要約】
タガトースを産生する枯草菌の遺伝子工学菌及びタガトースの調製方法を提供し、前記遺伝子工学菌は、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼをそれぞれ発現させた、又は共発現させたものの構築を含む。前記遺伝子工学菌を用いて、澱粉をタガトースに効果的に転化することができる。該方法は、タガトースの従来の生産方法と比べて、全細胞のリサイクルに適しており、安全性が高く、収率が高く、生産プロセスが簡単であり、コストが低く、量産が容易であるなどの利点がある。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タガトースを産生する枯草菌の遺伝子工学菌であって、前記遺伝子工学菌はα－グルカンホスホリラーゼ（α－Ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）遺伝子、タガトース６－リン酸エピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）遺伝子及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子を共発現させた枯草菌の遺伝子工学菌、又はα－グルカンホスホリラーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子、タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子をそれぞれ発現させた枯草菌の遺伝子工学菌の混合物であることを特徴とする、前記枯草菌の遺伝子工学菌。
【請求項2】
前記枯草菌の出発菌株は、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）がノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）された枯草菌菌株であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子工学菌。
【請求項3】
前記遺伝子工学菌は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させる発現ベクターを含むか、又はα－グルカンホスホリラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、ホスホグルコムターゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、ホスホグルコースイソメラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、タガトース６－リン酸エピメラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌及びタガトース６－リン酸ホスファターゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子工学菌。
【請求項4】
前記α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼはそれぞれ耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子工学菌。
【請求項5】
前記耐熱性とは４０℃以上で酵素活性を有することであることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子工学菌。
【請求項6】
前記遺伝子工学菌中の内因性のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、α－アミラーゼ（α－Ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子、胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子遺伝子、及びサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）シンターゼサブユニット３遺伝子がすべて不活性化又はノックアウトされることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子工学菌。
【請求項7】
発現ベクターであって、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼの遺伝子を含み、これらの遺伝子を共発現可能であることを特徴とする、前記発現ベクター。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子工学菌の全細胞（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製及び生産方法であって、前記枯草菌の工学菌を発酵して全細胞を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた枯草菌の全細胞を細胞膜透過性処理して、透過性全細胞を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた透過性全細胞の触媒作用によりデンプンからタガトースを調製し、共発現型の枯草菌工学菌全細胞の場合は、そのまま触媒作用に用い、各種酵素をそれぞれ発現させた枯草菌工学菌全細胞の場合、これらを混合して触媒作用に用いるステップ（３）と、を含む、方法。
【請求項9】
ステップ（２）で得られた枯草菌透過性全細胞を固定化処理して、固定化全細胞又は固定化全細胞混合物を得て、触媒作用に用いるステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ステップ（１）の全細胞の調製は外来タンパク質の発現に適する発酵方法によって行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ステップ（２）の細胞膜透過性処理は熱処理、有機溶剤及び／又は界面活性剤の添加により行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記有機溶剤はアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）及びアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）から選択され、前記界面活性剤は臭化セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ－８０から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記熱処理温度は４５～１００℃であり、熱処理時間は１０～１００ｍｉｎであり、処理時の細胞濃度はＯＤ６００＝１０～３００であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記熱処理温度は７０～８０℃であり、熱処理時間は５０～７０ｍｉｎであり、処理時の細胞濃度はＯＤ６００＝３０～１５０であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記熱処理はＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸塩緩衝液から選択される緩衝液にて行われることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記ステップ（３）の触媒反応系において、基質澱粉の濃度は５０～３００ｇ／Ｌであり、反応条件は、ｐＨ５．０～８．０、４０～８０℃で０．５～９６ｈ反応させることであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項17】
前記ステップ（３）の触媒反応系において、基質澱粉の濃度は１００～２００ｇ／Ｌであり、反応条件は、ｐＨ６．５～７．５、４５～７５℃で１２～６０ｈ反応させることであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ステップ（３）の触媒反応はＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸塩緩衝液から選択される緩衝液にて行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項19】
各種酵素をそれぞれ発現させた枯草菌工学菌透過性全細胞の場合、その混合物はα－グルカンホスホリラーゼを発現させた透過性全細胞、ホスホグルコムターゼを発現させた透過性全細胞、ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた透過性全細胞、タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた透過性全細胞、タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた透過性全細胞を（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）の割合で混合したものであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項20】
前記透過性全細胞の固定化処理方法においては、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液で前記透過性全細胞を再懸濁させ、無機土を加えて、均一に撹拌し、続いて、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）水溶液を加えて凝集させ、次に架橋剤を加えて架橋し、その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞を得ることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項21】
前記無機土はモンモリロナイト（ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、珪藻土、カオリン及びベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）から選択され、前記架橋剤はグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、トリヒドロキシメチルホスフィン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－メチレンビスアクリルアミド（Ｎ，Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）及びゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物工学の技術分野に関し、特にタガトースを産生する遺伝子工学菌及びそのタガトースの調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タガトース（Ｔａｇａｔｏｓｅ）は天然に存在する希少な単糖で、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）のケトース（ｋｅｔｏｓｅ）の形態であり、フルクトースのエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）である。タガトースは甘味特性がショ糖に似ており、カロリーがショ糖の３分の１程度で、低カロリー甘味料と呼ばれている。天然のタガトースは主に酸乳や粉ミルクなどの乳製品に含まれている。タガースは非常に新鮮でピュアな甘さを提供し、フルクトースに似た味の特徴を持つ。研究により、タガトースは低カロリー、低糖質指数、抗虫歯、抗酸化、プレバイオティクス（Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、腸機能改善、免疫調節、薬物前駆体（Ｐｒｏｄｒｕｇ）などの重要な生理機能特性を持ち、食品、飲料、医薬、健康維持などの分野に広く応用でき、巨大な経済価値を持つことが明らかになった（Ｏｈ Ｄ－Ｋ： Ｔａｇａｔｏｓｅ： ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ａｐｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７， ７６：１－８）。
【0003】
２００１年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）はタガトースの安全性を確認し、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）製品として承認した。ＦＤＡは２００２年１２月に歯にやさしい成分としてタガトースを、２００３年１０月に甘味料として食品飲料業や医薬分野で使用できる食品添加剤として承認している。２００１年、国際連合食糧農業機関と世界保健機関合同食品添加物専門家会議（ＪＥＣＦＡ）は、タガトースを食品添加剤として使用できる新たな低カロリー甘味料として推奨して、食品添加物として使用できる。２００４年の第６３回会議では、タガトースの許容日摂取量（ＡＤＩ）を制限する必要がないことが宣言され、ＪＥＣＦＡが手配可能な食品成分の中で最も安全なリストに「指定されていない」ＡＤＩが割り当てられた。韓国、オーストラリア（オーストラリア、ニュージーランド）、ＥＵは、それぞれ２００３年、２００４年、２００５年にタガトースを域内で発売することを承認しており、２００５年１２月には、タガトースがＥＵで使用制限のない新規食品成分として正式に承認された。中国でも、２０１４年５月にタガトースが新たな食品原料として承認された。現在、タガトースは世界３０カ国以上、ＷＨＯ／ＦＡＯ及び国際食品規格委員会の承認を受けており、許容日摂取量や使用用途に制限はない。
【0004】
タガトースの生産方法には主に化学合成法と生物転化法がある。一般的にはガラクトースを原料とし、化学的方法や生物転化による異性化反応によって作られる。化学合成法は可溶性アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を触媒として用い、ガラクトースからアルカリ性条件下でタガトースを生成し、金属水酸化物－タガトース複合体を生成させるように促進した後、酸で中和してタガトースを得るものである。化学法はエネルギー消費量が高く、生成物が複雑で、精製が困難で、副反応が多く、化学汚染を発生する。生物法はガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）又はガラクトースを利用し、酵素又は微生物の触媒作用により対応する基質をタガトースに変換するものである。ガラクチトールは価格が高く、しかも入手しにくいため、工業的生産の原料として使用するのに適さない。現在、タガトースの主流の生産方法はガラクトースの異性化、脱塩、脱色、分離、濃縮、結晶化などのステップを経てタガトース純品を製造するものである。しかし、この方法にも、ガラクトースを完全にタガトースに変換することができず、最終生成物がガラクトースとタガトースの混合物であるため、タガトースの分離プロセスが複雑で、転化率が低く、分離コストが高く、また原料であるガラクトースの価格が安くなく、最終的にタガトースの生産コストが高くなるという欠点がある（Ｒｈｉｍｉ Ｍ， Ａｇｈａｊａｒｉ Ｎ， Ｊｕｙ Ｍ， Ｃｈｏｕａｙｅｋｈ Ｈ， Ｍａｇｕｉｎ Ｅ， Ｈａｓｅｒ Ｒ， Ｂｅｊａｒ Ｓ： Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ： Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． ２００９， ９１：６５０－６５３． Ｏｈ Ｈ－Ｊ， Ｋｉｍ Ｈ－Ｊ， Ｏｈ Ｄ－Ｋ： Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２００６， ２８：１４５－１４９． Ｂｏｓｓｈａｒｔ Ａ， Ｈｅｅ ＣＳ， Ｂｅｃｈｔｏｌｄ Ｍ， Ｓｃｈｉｒｍｅｒ Ｔ， Ｐａｎｋｅ Ｓ：Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｈｅｘｏｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６：５９２－６０１．）。
【0005】
韓国ＣＪ社はフルクトースキナーゼ（ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、アルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ）、フィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）を含む複数種の酵素でフルクトースを触媒してタガトースに転化する技術（Ｏｈ ＤＫ ，ＨＯＮＧ ＳＨ ，Ｌｅｅ ＳＨ： Ａｌｄｏｌａｓｅ， ａｌｄｏｌａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔａｇａｔｏｓｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ＷＯ ２０１５０１６５４４Ａ１）を発明しているが、フルクトースからフルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産するにはＡＴＰがフルクトースについて基質リン酸化を行う必要があり、高価なＡＴＰを添加するとタガトースの生産コストが高くなり、工業的生産価値がない（ＴＷ１０７１１１５００、ＵＳ２０１６０１８６１６２Ａ１）。韓国ＣＪ社はヘキスロン酸４－エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ Ｃ４－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）を発見して改造してフルクトースをタガトース（ＣＮ１０５４３１５４１Ｂ、ＣＮ１０９４１５７１５Ａ）に転化したが、改造したヘキスロン酸４－エピメラーゼは酵素活性が極めて低く、工業的には応用価値がない。韓国ＣＪ社はまた、新規由来のタガトース６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発見し、それをデンプンや、マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）やショ糖などの基質転化に用いてタガトースを生産したが（ＷＯ２０１８００４３１０Ａ１、ＣＮ １０９７９０５２４Ａ）、このタガトース６－リン酸ホスファターゼは酵素活性が極めて低く、現段階では工業的には応用価値がない。
【0006】
中国科学院天津工業生物技術研究所は安価なコーンスターチ、マルトデキストリン、ショ糖などを原料とし、タガトースを体外で多酵素により合成するような新しい経路を構築し、既存のタガトースの生産プロセスを根本的に変えた（ＣＮ１０６３９９４２７Ａ）。これを踏まえた上で、中国科学院天津工業生物技術研究所は安価なコーンスターチ、セルロース、マルトデキストリン、ショ糖などを原料とし、全細胞（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）の触媒作用によるタガトースの調製方法（ＣＮ１０７９８８２８６Ａ）を利用しており、同プロセスは多酵素精製プロセスのステップを減らし、生産コストを低下させて環境汚染を低減し、タガトースの収率を高めた。しかし、この方法におけるキー酵素（ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ）の発酵生産宿主は食品製剤の生産に関連する酵素の生産菌株として工業的生産に適さないが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、そのほか、体外酵素の分離精製ステップが煩雑で、酵素の回収利用率が低く、リサイクルが困難であり、生産コストを更に下げることができず、高濃度生成物を工業的に量産して応用することを実現できない。
【0007】
そのため、全細胞のリサイクルが可能であり、安全性が高く、収率が高く、生産プロセスが簡単で、コストが低く、基質を高濃度で投入して生成物のタガトースを高収率で生産することに適し、タガトースを大規模で調製することが容易である新方法の開発が急務となっている。
【発明の概要】
【0008】
従来の多酵素触媒作用によるタガトースの製造方法の問題点、例えば、大腸菌が食品製剤の工業的製造に不利であることに対処し、精製工程の煩雑さ、酵素の回収利用率の低さ、リサイクルの困難さ、低濃度の基質澱粉の投入の課題を解決するために、枯草菌の全細胞の触媒作用による高濃度の澱粉調製から高濃度のタガトースへの調製及び生産方法を提供することを主な目的とする。
【0009】
本発明は、まず、α－グルカンホスホリラーゼ（α－Ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）遺伝子、タガトース６－リン酸エピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）遺伝子及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子を共発現させた枯草菌の遺伝子工学菌、又はα－グルカンホスホリラーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子、タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子をそれぞれ発現させた枯草菌の遺伝子工学菌の混合物であるタガトースを産生する枯草菌の遺伝子工学菌を提供する。
【0010】
上記の技術案の原理は、関連する触媒経路を十分に利用して生体において細胞レベルで発現させ、有効な触媒反応を実現することであり、α－グルカンホスホリラーゼによって無機リンの存在下で基質である澱粉を中間体であるグルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化することと、ホスホグルコムターゼによって中間体であるグルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を別の中間体であるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）となるように移動することと、ホスホグルコースイソメラーゼによって中間体であるグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を別の中間体であるフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）となるように移動することと、タガトース６－リン酸エピメラーゼによって中間体であるフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を異性化して別の中間体であるタガトース－６－リン酸（Ｔ６Ｐ）にすることと、タガトース６－リン酸ホスファターゼによって中間体であるタガトース－６－リン酸（Ｔ６Ｐ）からリン酸基を離脱して生成物であるタガトース（Ｔａｇａｔｏｓｅ）にすることと、を含む。
【0011】
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８、ＤＢ１０４、ＷＢ８００、ＷＢ６００、ＳＣＫ６、１Ａ７５１、ＡＴＣＣ６０５１ａ、ＡＴＣＣ６０５１など本分野に知られている各種の枯草菌菌株はすべて本発明の出発菌株として有用である。好ましくは、前記枯草菌の出発菌株はノックアウトプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）の枯草菌菌株、例えばＷＢ８００、ＷＢ６００、ＳＣＫ６、１Ａ７５１などである。より好ましくは、前記枯草菌の出発菌株はＳＣＫ６である。
【0012】
特定実施形態においては、前記枯草菌の遺伝子工学菌は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させる発現ベクター、又はα－グルカンホスホリラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、ホスホグルコムターゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、ホスホグルコースイソメラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌、タガトース６－リン酸エピメラーゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌及びタガトース６－リン酸ホスファターゼの発現ベクターを含む遺伝子工学菌の混合物である。
【0013】
好ましくは、前記の各種酵素は耐熱性のものであって、すなわち、熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼである。耐熱性ではない常温酵素に対しては、耐熱性の酵素は菌株の不活性化において好ましく、すなわち、後者は発酵終了後に加熱処理によって菌株を不活性化することができ、また、タガトース合成に関連する酵素は活性を維持し、これによって、不活性化菌株を混合してタガトースを生産することができ、これは工業的適応により適している。常温の関連酵素を使用すれば、タガトースを生産するための関連酵素を得るには、発酵・生産終了後、菌体破砕と酵素精製のステップによって純酵素を取得する必要がある。
【0014】
具体的には、前記耐熱性α－グルカンホスホリラーゼとは、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、又は８０℃以上で澱粉をグルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）にリン酸化する機能を有する酵素を指す。さらに好ましくは、前記耐熱性α－グルカンホスホリラーゼは好熱性微生物、例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓなどに由来し、又は前記耐熱性α－グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は前記好熱性微生物に由来する耐熱性α－グルカンホスホリラーゼとは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。より好ましくは、前記耐熱性α－グルカンホスホリラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。
【0015】
具体的には、耐熱性ホスホグルコムターゼとは、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、又は８０℃以でグルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に移動させる機能を有する酵素を指す。さらに好ましくは、前記耐熱性ホスホグルコムターゼは好熱性微生物、例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓなどに由来し、又は前記耐熱性ホスホグルコムターゼのアミノ酸配列は前記好熱性微生物に由来の耐熱性ホスホグルコムターゼと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。より好ましくは、前記耐熱性ホスホグルコムターゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。
【0016】
具体的には、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼとは、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、又は８０℃以上でグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に移動させる機能を有する酵素を指す。さらに好ましくは、前記耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼは好熱性微生物、例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓなどに由来し、又は前記耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列は前記好熱性微生物に由来の耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するものを指す。より好ましくは、前記耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。
【0017】
具体的には、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼとは、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、又は８０℃以上でフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース－６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に異性化する機能を有する酵素を指す。さらに好ましくは、前記耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼは、好熱性微生物、例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓなどに由来し、又は前記耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼのアミノ酸配列は前記好熱性微生物に由来の耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。より好ましくは、前記耐タガトース６－リン酸エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来する。
【0018】
具体的には、前記タガトース６－リン酸ホスファターゼとは、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、又は８０℃以上でタガトース－６－リン酸（Ｔ６Ｐ）からリン酸基を離脱して生成物タガトース（Ｔａｇａｔｏｓｅ）にする機能を有する酵素を指す。さらに好ましくは、前記タガトース６－リン酸ホスファターゼは好熱性微生物、例えばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓなどに由来し、又は前記タガトース６－リン酸ホスファターゼのアミノ酸配列は前記好熱性微生物に由来のタガトース６－リン酸ホスファターゼと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。より好ましくは、前記タガトース６－リン酸ホスファターゼはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する。
【0019】
本発明はまた、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子を含み、これらの遺伝子を共発現させることができる上記の遺伝子工学菌用の発現ベクターを提供する。
【0020】
当業者が理解できるように、本発明に係るベクター及び遺伝子工学菌は本分野に知られている一般的な方法によって調製されてもよく、例えば、組換えＤＮＡ技術によってα－グルカンホスホリラーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子、タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子、タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子を構築して取得し、組換え発現ベクターを構築し、次に、既知の方法によって枯草菌に形質導入して、遺伝子工学菌を得る。
【0021】
より好ましくは、前記ベクターは、プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子、耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子及びターミネータを含む。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させる前記ベクターはそれぞれ、プロモータ、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子、ターミネータを含み、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させる前記ベクターはプロモータ、耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子、ターミネータを含み、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させる前記ベクターはプロモータ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子、ターミネータを含み、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させる前記ベクターはプロモータ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子、ターミネータを含み、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させる前記ベクターはプロモータ、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子、ターミネータを含む。
【0022】
当業者が理解できるように、本分野に知られている各種のプロモータはすべて、本発明のプロモータとして利用可能であり、Ｐ４３プロモータ、Ｐｙｌｂプロモータ、ＰａｍｙＬプロモータ、Ｐｌａｐｓプロモータ、ＰｈｐａＩＩプロモータ、ＰａｍｙＥプロモータ、Ｐｇｒａｃプロモータ、ＰｓａｃＢプロモータ、ＰｓｉｇＸプロモータ、ＰａｐｒＥプロモータ、ＰｇｒｏＥＳプロモータなどを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明のプロモータとして、ＰｈｐａＩＩプロモータとＰｙｌｂプロモータを選択して直列に接続する。本分野に知られている各種ターミネータも本発明のターミネータとして有用である。
【0023】
好ましい実施形態では、前記遺伝子工学菌における内因性のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、及び／又はα－アミラーゼ遺伝子、及び／又は胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子遺伝子、及び／又はサーファクチンシンターゼサブユニット３遺伝子は不活性化又はノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）される。最も好ましくは、前記遺伝子工学菌における内因性のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、α－アミラーゼ（α－Ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子、胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子遺伝子、及びサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）シンターゼサブユニット３遺伝子はいずれも不活性化又はノックアウトされる。ここでは、上記の遺伝子の不活性化又はノックアウトは遺伝子工学菌からタガトースを生産する効率をさらに高めることができ、その理由は具体的には以下のとおりである。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化又はノックアウトはトレースレス遺伝子操作系を構築し、後続の遺伝子操作（すなわち、遺伝子ノックアウト）をトレースレス操作にし、耐性遺伝子などの外来遺伝子の導入を必要とせず、α－アミラーゼ遺伝子の不活性化又はノックアウトは菌株が外因性澱粉を利用する経路を切断し、タガトースを生産する基質である澱粉が菌株により炭素源として代謝、利用されることを回避し、胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子遺伝子の不活性化又はノックアウトは、菌種を代謝してタガトース合成に関連する異種タンパク質の合成発現に用いることを可能とし、また、胞子を生成しないように菌株の発酵を制御することもでき、サーファクチンシンターゼサブユニット３遺伝子の不活性化又はノックアウトは、菌体の発酵生産における制御をより容易にし、泡を少なく抑えることができる。したがって、上記の４つの遺伝子の不活性化又はノックアウトは、遺伝子工学菌によるタガトース産生により有利であるので、好ましい実施形態である。
【0024】
内因性遺伝子の不活性化又はノックアウトは、本分野に知られている方法、好ましくは遺伝子編集方法によって行われ得る。
【0025】
本発明はまた、上記の遺伝子工学菌の全細胞（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製及び生産方法であって、
前記枯草菌の工学菌を発酵して全細胞を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた枯草菌の全細胞を細胞膜透過性処理して、透過性全細胞を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた透過性全細胞の触媒作用によりデンプンからタガトースを調製し、共発現型の枯草菌工学菌の場合、そのまま触媒作用に用い、各種酵素をそれぞれ発現させた枯草菌工学菌の場合、これらを混合して触媒作用に用いるステップ（３）と、を含む。
前記枯草菌の工学菌を発酵して全細胞を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた枯草菌の全細胞を細胞膜透過性処理して、透過性全細胞を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた透過性全細胞の触媒作用によりデンプンからタガトースを調製し、共発現型の枯草菌工学菌の場合、そのまま触媒作用に用い、各種酵素をそれぞれ発現させた枯草菌工学菌の場合、これらを混合して触媒作用に用いるステップ（３）と、を含む。
【0026】
好ましくは、ステップ（２）で得られた枯草菌透過性全細胞を固定化処理して、固定化全細胞、又は固定化全細胞混合物を得て、触媒作用に用いるステップをさらに含む。
【0027】
特定実施形態においては、ステップ（１）の前記全細胞は本分野に公知の方法によって調製される。発酵には、外来タンパク質の発現に適する、ＬＢ培地、ＳＲ培地、ＴＢ培地などを含むが、これらに限定されない任意の培地を使用することができる。
【0028】
好ましい実施形態においては、ステップ（２）では、前記細胞膜透過性処理は、熱処理、添加有機溶剤及び／又は添加界面活性剤などを含むが、これらに限定されない既知の方法を採用してもよい。ここでは、有機溶剤はアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）及びアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）などを含むが、これらに限定されない。界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ：Ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ－８０などを含むが、これらに限定されない。好ましくは、細胞膜透過性処理は熱処理である。細胞膜を透過性処理する目的は、細胞外の澱粉が細胞膜を経て細胞内に入るためである。
【0029】
好ましくは、前記熱処理温度は４５～１００℃、より好ましくは７０～８０℃である。好ましくは、熱処理時間は１０～１００ｍｉｎ、より好ましくは５０～７０ｍｉｎである。好ましくは、熱処理時の細胞濃度はＯＤ６００＝１０～３００、より好ましくは、ＯＤ６００＝３０～１５０である。また、前記熱処理は緩衝液無し系又は緩衝液系にて行われてもいが、好ましくは、前記熱処理は緩衝液系にて行われ、前記緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸塩緩衝液などであってもよい。リン酸塩緩衝液は例えばリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液などである。
【0030】
特定実施形態においては、触媒反応系において、基質澱粉の濃度は５０～３００ｇ／Ｌ、より好ましくは、１００～２００ｇ／Ｌである。好ましくは、反応条件は、ｐＨ ５．０～８．０、４０～８０℃で０．５～９６ｈ反応させ、より好ましくはｐＨ ６．５～７．５、４５～７５℃で１２～６０ｈ反応させ、最も好ましくはｐＨ ７．５、６０～７０℃で１２～９６ｈ反応させることである。前記触媒は緩衝液無し系又は緩衝液系にて行われてもよいが、好ましくは、緩衝液系にて行われ、前記緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸塩緩衝液などであってもよい。リン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などである。
【0031】
好ましくは、各種酵素をそれぞれ発現させた枯草菌工学菌の透過性全細胞に対しては、これらの混合物では、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた透過性全細胞の割合は、（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）：（０．１～１０）、より好ましくは（０．５～５）：（０．５～５）：（０．５～５）：（０．５～５）：（０．５～５）、最も好ましくは１：１：１：１：１である。
【0032】
特定実施形態においては、前記透過性全細胞の固定化処理方法においては、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液で耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた透過性全細胞を再懸濁させ、適量の無機土を加えて、均一に撹拌する。ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）水溶液を加えて室温条件下で凝集させ、次に架橋剤を加えて架橋する。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞を得る。
【0033】
前記固定化透過性全細胞の混合物の処理方法においては、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液を用いて、耐熱性α－－グルカンホスホリラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた透過性全細胞を再懸濁させ、適量の無機土を加えて、均一に撹拌する。ポリエチレンイミン水溶液を加えて室温条件下で凝集させ、次に架橋剤を加えて架橋する。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞を得る。
【0034】
ここで、前記無機土は、モンモリロナイト（ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、珪藻土、カオリン及びベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）等を含むが、これらに限定されず、好ましくは、前記無機土は珪藻土であり、前記架橋剤はグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、トリヒドロキシメチルホスフィン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－メチレンビスアクリルアミド（Ｎ，Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）、ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）等を含むが、これらに限定されず、好ましくは、前記架橋剤はグルタルアルデヒドである。
【発明の効果】
【0035】
従来技術と比べて、本発明は以下の有益な効果を有する。
【0036】
（１）本発明は、初めて耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞の触媒作用を初めて利用して澱粉からタガトースを生産するものであり、簡単でスケールアップしやすいタガトースの新しい調製方法を開発する。
【0037】
（２）枯草菌は一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ：Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）食品グレードの微生物であり、エンドトキシンを生成することはない。さらに、α－アミラーゼコード遺伝子のノックアウトは後続の基質澱粉の触媒用に有利であり、胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子コード遺伝子のノックアウトは、後続の基質からタガトースへの転化生産における遺伝子工学菌株の発酵生産の適用に有利であり、表面活性ペプチドシンターゼサブユニット３コード遺伝子のノックアウトは、後続の基質からタガトースへの転化生産における遺伝子工学菌株の発酵生産の適用に有利である。
【0038】
（３）好ましい実施形態では、耐熱性の各種酵素を用いると、タガトースの調製は高温度で行われ得、これにより、基質澱粉の溶解度を高めることができ、従来技術と比べて、本発明は、高基質濃度でタガトースを調製することができ、生産効率の向上、さらに生産コストの削減に有利である。
【0039】
（４）本発明の方法では、タガトースの転化反応は緩衝液無し体又は緩衝液系にて行われてもよく、炭素源、窒素源、無機塩及び抗生物質を含有する培地を必要とせず、これよって、生産コストの削減に有利である一方、生成物であるタガトースの分離精製に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】本発明の全細胞触媒作用による澱粉からタガトースの生産の概略図である。
【図2】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰのマップである。
【図3】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭのマップである。
【図4】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩのマップである。
【図5】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥのマップである。
【図6】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰのマップである。
【図7】組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰのマップである。
【図8】タガトースの収量の反応時間に伴う変化の曲線図である。
【図9】共発現組み換え菌株を固定化してタガトースを生産する場合の収量の傾向図である。
【図10】個別発現組み換え菌株を固定化してタガトースを生産する場合の収量の傾向図である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明に使用される技術手段及びその効果をさらに説明するために、以下は、特定実施例によって本発明の技術案をさらに説明する。ただし、前記実施例は例示的なものに過ぎず、かつ好ましい実施例であるが、本発明の範囲を何ら制限するものではない。当業者にとって明らかなように、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の技術案の詳細及び形態について修正又は置換を行うことができ、これらの修正又は置換はすべて本発明の特許範囲に含まれる。
【0042】
実施例１：枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼコード遺伝子ｕｐｐ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３９１５７０）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ｕｐｐ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼコード遺伝子ｕｐｐ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３９１５７０）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ｕｐｐ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを得た。
【0043】
（２）枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ６のスーパーコンピテント細胞（２００μｌ）（Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． Ｐ． （２０１１）． Ｓｉｍｐｌｅ， ｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４（１）， ９８－１０５． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７５１－７９１５．２０１０．００２３０．ｘ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＳＣＫ６のスーパーコンピテント細胞（２００μｌ）（Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． Ｐ． （２０１１）． Ｓｉｍｐｌｅ， ｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４（１）， ９８－１０５． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７５１－７９１５．２０１０．００２３０．ｘ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて１４～１６ｈ培養した。
【0044】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単交換形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片と２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲにおけるベクター中のｕｐｐコード遺伝子の上下流相同性アーム（ａｒｍ）の断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｕｐｐコード遺伝子の上流相同性アーム、ｕｐｐコード遺伝子及びｕｐｐコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンである。
【0045】
陽性クローンを選択して、抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μｌを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）基礎塩培地固体プレート（４０％グルコース２０．０ｍｌ／Ｌ、４％グルタミン５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％トリプトファン１０．０ｍＬ／Ｌ、１％ビタミンＢ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－フルオロウラシル５００μＬ／Ｌ、１０×基礎塩１００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｕｐｐノックアウトを受けた目的形質転換体を得ることである。
【0046】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択し、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ｕｐｐ遺伝子ノックアウト枯草菌工学菌株、すなわちウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ８と命名した。
【0047】
実施例２ 枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のα－アミラーゼのコード遺伝子ａｍｙＧ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３８８１８６）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ａｍｙＧ遺伝子上流の５００ｂｐ相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のα－アミラーゼのコード遺伝子ａｍｙＧ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３８８１８６）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ａｍｙＧ遺伝子上流の５００ｂｐ相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲを得た。
【0048】
（２）枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ８スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＳＣＫ８スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて１４～１６ｈ培養した。
【0049】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単交換形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片と２０００ｂｐ ＤＮＡ断片２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ａｍｙＥ－ＦＲにおいてベクター中のａｍｙＥコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてａｍｙＥコード遺伝子の上流相同性アーム、ａｍｙＥコード遺伝子及びａｍｙＥコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0050】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μｌを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％グルコース２０．０ｍｌ／Ｌ、４％グルタミン５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％トリプトファン１０．０ｍＬ／Ｌ、１％ビタミンＢ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－フルオロウラシル５００μＬ／Ｌ、１０×基礎塩１００．０ｍＬ／Ｌ，１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｍｙＥノックアウトを受けた目的形質転換体を得ることである。
【0051】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択し、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ａｍｙＧ遺伝子ノックアウト枯草菌工学菌株、すなわちα－アミラーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ８－ＳＴ１と命名した。
【0052】
実施例３ 枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来の胞子形成ＲＮＡポリメラーゼ σＦ 因子のコード遺伝子ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３９０２２６）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、胞子形成ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来の胞子形成ＲＮＡポリメラーゼ σＦ 因子のコード遺伝子ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３９０２２６）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、胞子形成ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲを得た。
【0053】
（２）枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ１スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0054】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単交換形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片と２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｓｐｏＩＩＡＣ－ＦＲにおけるベクター中のｓｐｏＩＩＡＣコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｓｐｏＩＩＡＣコード遺伝子の上流相同性アーム、ｓｐｏＩＩＡＣコード遺伝子及びｓｐｏＩＩＡＣコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0055】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μｌを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％グルコース２０．０ｍｌ／Ｌ、４％グルタミン５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％トリプトファン１０．０ｍＬ／Ｌ、１％ビタミンＢ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－フルオロウラシル５００μＬ／Ｌ、１０×基礎塩１００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｓｐｏＩＩＡＣノックアウトを受けた目的形質転換体を得ることである。
【0056】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択し、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、胞子形成ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子ノックアウト枯草菌組み換え工学菌株、すなわち胞子形成ＲＮＡポリメラーゼσＦ因子活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ８－ＳＴ２と命名した。
【0057】
実施例４ 枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ３の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来の表面活性ペプチドシンターゼサブユニット３コード遺伝子ｓｒｆＡＣ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３８８２３３）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ｓｒｆＡＣ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来の表面活性ペプチドシンターゼサブユニット３コード遺伝子ｓｒｆＡＣ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＮＰ＿３８８２３３）に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ｓｒｆＡＣ遺伝子上流５００ｂｐの相同断片と下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式（Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１）によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲを得た。
【0058】
（２）枯草菌組換え菌株ＳＣＫ８－ＳＴ３の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ８－ＳＴ２スーパーコンピテント細胞（２００μｌ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に菌液を塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0059】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単交換形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片と２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｓｒｆＡＣ－ＦＲにおけるベクター中のｓｒｆＡＣコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｓｒｆＡＣコード遺伝子の上流相同性アーム、ｓｒｆＡＣコード遺伝子及びｓｒｆＡＣコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0060】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μｌを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％グルコース２０．０ｍｌ／Ｌ、４％グルタミン５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％トリプトファン１０．０ｍＬ／Ｌ、１％ビタミンＢ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－フルオロウラシル ５００μＬ／Ｌ、１０×基礎塩１００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｓｒｆＡＣノックアウトを受けた目的形質転換体を得ることである。
【0061】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択し、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ｓｒｆＡＣ遺伝子ノックアウト枯草菌組み換え工学菌株、すなわち表面活性ペプチドシンターゼサブユニット３酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ８－ＳＴ３と命名した。
【0062】
実施例５：組換えベクターの構築
（１）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰの構築
本実施例では、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５５９５）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ遺伝子は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー２９９－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｔｇａａｃｇｔｔｔｃｃａａｔｇｃｃｇｔｔｇ－３´と３００－Ｒ：５´－ｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｃａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃａｃｔｔｇａｃｃａ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３０１－Ｆ：５´－ｔｇｇｔｃａａｇｔｇｇａａｇｇｇａｃｔｔｇａｃｔｇａｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃ－３´と３０２－Ｒ：５´－ｃａａｃｇｇｃａｔｔｇｇａａａｃｇｔｔｃａｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されたものである。遺伝子のＰＣＲ条件としては、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
（１）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰの構築
本実施例では、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５５９５）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ遺伝子は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー２９９－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｔｇａａｃｇｔｔｔｃｃａａｔｇｃｃｇｔｔｇ－３´と３００－Ｒ：５´－ｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｃａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃａｃｔｔｇａｃｃａ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３０１－Ｆ：５´－ｔｇｇｔｃａａｇｔｇｇａａｇｇｇａｃｔｔｇａｃｔｇａｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃ－３´と３０２－Ｒ：５´－ｃａａｃｇｇｃａｔｔｇｇａａａｃｇｔｔｃａｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されたものである。遺伝子のＰＣＲ条件としては、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0063】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子断片とｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ、５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として、９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図２に示すとおりである。
【0064】
（２）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭの構築
本実施例では、耐熱性ホスホグルコムターゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５２９７）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３２７－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃｇ－３´と３２８－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡａｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｇｃ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３２９－Ｆ：５´－ｇｃｔｇｇａａｇａａｇｃａｃｔｇａａａｇｇｔＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３３０－Ｒ：５´－ｃｇａａｇｇｔａｃｃａａａｃａｇｔｔｔｇｃｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
本実施例では、耐熱性ホスホグルコムターゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５２９７）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３２７－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃｇ－３´と３２８－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡａｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｇｃ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３２９－Ｆ：５´－ｇｃｔｇｇａａｇａａｇｃａｃｔｇａａａｇｇｔＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３３０－Ｒ：５´－ｃｇａａｇｇｔａｃｃａａａｃａｇｔｔｔｇｃｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0065】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子断片とｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ；５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として、９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図３に示すとおりである。
【0066】
（３）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩの構築
本実施例では、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＳ８２０５２）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３１－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣ－３´と３３２－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３３３－Ｆ：５´－ＧＡＣＴＣＧＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３３４－Ｒ：５´－ＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
本実施例では、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＳ８２０５２）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３１－Ｆ：５´－ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣ－３´と３３２－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３３３－Ｆ：５´－ＧＡＣＴＣＧＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３３４－Ｒ：５´－ＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0067】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子断片とｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ；５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図４に示すとおりである。
【0068】
（４）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥの構築
本実施例では、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： Ｂ０４４＿ＲＳ０１０１５３０）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３５－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇａａａｇｔｔｔｇｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔｇｃｃｔ－３´と３２４－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡｔｔｔｃａｇｇｔｔｇｃｔａｔａｃｃａｔｔｃｔ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３２５－Ｆ：５´－ａｇａａｔｇｇｔａｔａｇｃａａｃｃｔｇａａａＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３２６－Ｒ：５´－ａｇｇｃａｃｃａａｃｃａｇｃｃａａａｃｔｔｔｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
本実施例では、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来する。耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： Ｂ０４４＿ＲＳ０１０１５３０）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３５－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇａａａｇｔｔｔｇｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔｇｃｃｔ－３´と３２４－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡｔｔｔｃａｇｇｔｔｇｃｔａｔａｃｃａｔｔｃｔ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー３２５－Ｆ：５´－ａｇａａｔｇｇｔａｔａｇｃａａｃｃｔｇａａａＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３２６－Ｒ：５´－ａｇｇｃａｃｃａａｃｃａｇｃｃａａａｃｔｔｔｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用され、
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0069】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子断片とｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ；５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図５に示すとおりである。
【0070】
（５）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰの構築
本実施例では、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する。耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＢ９０７９１）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３９－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧ－３´と３４０－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー；３４１－Ｆ：５´－ ＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３４２－Ｒ：５´－ ＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用された。
本実施例では、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する。耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐ配列（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＢ９０７９１）は蘇州金唯智生物科技有限公司により合成されて普通プラスミドに連結された。耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐは１対のプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより取得された。プライマー３３９－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧ－３´と３４０－Ｒ：５´－ａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格は１対のプライマーを用いてＰＣＲにより取得された。プライマー；３４１－Ｆ：５´－ ＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔ－３´と３４２－Ｒ：５´－ ＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用された。
【0071】
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0072】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子断片とｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ；５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図６に示すとおりである。
【0073】
（６）ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰの構築
本実施例では、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性ホスホグルコムターゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来し、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５５９５）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５０－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｔｇａａｃｇｔｔｔｃｃａａｔｇｃｃｇｔｔｇ－３´と３５１－Ｒ：５´－ ｃｇａａｇｇｔａｃｃａａａｃａｇｔｔｔｇｃｃｃａｔＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴｔｃａｇｔｃａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃａｃｔｔｇａｃｃ－３´は使用され、耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５２９７）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５２－Ｆ：５´－ ｇｇｔｃａａｇｔｇｇａａｇｇｇａｃｔｔｇａｃｔｇａＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡａｔｇｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃｇ－３´と３５３－Ｒ：５´－ ＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡａｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｇｃ－３´は使用され、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＳ８２０５２）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５４－Ｆ：５´－ ｇｃｔｇｇａａｇａａｇｃａｃｔｇａａａｇｇｔＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣ－３´と３５５－Ｒ：５´－ ＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣ－３´は使用され、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： Ｂ０４４＿ＲＳ０１０１５３０）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５６－Ｆ：５´－ ＧＡＣＴＣＧＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡ－３´と３５７－Ｒ：５´－ ＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴｔｔａＡＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＣＴＧ－３´は使用され、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＢ９０７９１）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５８－Ｆ：５´－ ＣＡＧＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴｔａａＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴ－３´と３５９－Ｒ：５´－ ｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格はＰＣＲにより取得され、プライマー；３６０－Ｆ：５´－ ＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃ－３´と３６１－Ｒ：５´－ ｃａａｃｇｇｃａｔｔｇｇａａａｃｇｔｔｃａｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用される。
本実施例では、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性ホスホグルコムターゼはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来し、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｅｎｓｉｓに由来し、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼはＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓに由来する。耐熱性α－グルカンホスホリラーゼコード遺伝子ａｇｐ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５５９５）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５０－Ｆ：５´－ ＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＴａｔｇｇｔｇａａｃｇｔｔｔｃｃａａｔｇｃｃｇｔｔｇ－３´と３５１－Ｒ：５´－ ｃｇａａｇｇｔａｃｃａａａｃａｇｔｔｔｇｃｃｃａｔＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴｔｃａｇｔｃａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃａｃｔｔｇａｃｃ－３´は使用され、耐熱性ホスホグルコムターゼコード遺伝子ｐｇｍ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＢＡＤ８５２９７）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５２－Ｆ：５´－ ｇｇｔｃａａｇｔｇｇａａｇｇｇａｃｔｔｇａｃｔｇａＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡａｔｇｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃｇ－３´と３５３－Ｒ：５´－ ＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡａｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｇｃ－３´は使用され、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼコード遺伝子ｐｇｉ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＳ８２０５２）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５４－Ｆ：５´－ ｇｃｔｇｇａａｇａａｇｃａｃｔｇａａａｇｇｔＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣ－３´と３５５－Ｒ：５´－ ＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣ－３´は使用され、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼコード遺伝子ｔｐｅ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： Ｂ０４４＿ＲＳ０１０１５３０）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５６－Ｆ：５´－ ＧＡＣＴＣＧＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡ－３´と３５７－Ｒ：５´－ ＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴｔｔａＡＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＣＴＧ－３´は使用され、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼコード遺伝子ｔｐｐ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ： ＡＡＢ９０７９１）はＰＣＲにより取得され、プライマー３５８－Ｆ：５´－ ＣＡＧＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴｔａａＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴ－３´と３５９－Ｒ：５´－ ｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡ－３´は使用され、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格はＰＣＲにより取得され、プライマー；３６０－Ｆ：５´－ ＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃ－３´と３６１－Ｒ：５´－ ｃａａｃｇｇｃａｔｔｇｇａａａｃｇｔｔｃａｃｃａｔＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴ－３´は使用される。
【0074】
プライマーはすべて蘇州金唯智生物科技有限公司により合成された。遺伝子のＰＣＲ条件として、９４℃ ５ｍｉｎ変性とし、９４℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ １ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ １０ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。ＰＣＲ反応で得られた生成物のそれぞれについて０．８％アガロースゲル電気泳動によって結果を分析した。ゲル画像システムによりイメージングした結果、断片のサイズが正しいと確認した後、ＤＮＡ精製回収キット（天根生化科技有限公司、中国）を用いて目的断片を回収し、組換え発現ベクターの構築に用いた。
【0075】
その後、ＰＯＥ－ＰＣＲを用いて耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子断片、耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子断片、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子断片、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子断片及びｐＭＡ５－Ｐｙｌｂベクター骨架を組み立てた。ＰＯＥ－ＰＣＲ系は以下のとおりである。精製後のｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ線状骨格、２００ｎｇ；精製後の耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ、耐熱性ホスホグルコムターゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼ遺伝子断片、１３１ｎｇ；２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（大連宝生物、中国）、２５μＬ；５０μＬまで残量の水。ＰＯＥ－ＰＣＲ条件として９８℃ ２ｍｉｎ変性とし、９８℃ １５ｓ変性、５８℃ １５ｓアニーリング、７２℃ ３．５ｍｉｎ伸長、最後に７２℃ ５ｍｉｎ伸長のようなパラメータに従って３０サイクルとした。連結産物を塩化カルシウム法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に形質転換し、形質転換体を選択してコロニーのＰＣＲ及び二重酵素消化による同定を行い、２～３個の陽性形質転換体を選択してさらにシーケンシングして検証し、シーケンシングの結果、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰ組換え共発現ベクターが得られ、プラスミドのマップは図７に示すとおりである。
【0076】
実施例６ 組換え組み換え菌の構築
構築した組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰをそれぞれ枯草菌工学菌ＳＣＫ８－ＳＴ３に形質転換し、ＬＢ試験管で一晩培養し、プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、正しいクローンＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、及びＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰを保存した。
構築した組換え発現ベクターｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰをそれぞれ枯草菌工学菌ＳＣＫ８－ＳＴ３に形質転換し、ＬＢ試験管で一晩培養し、プラスミド抽出キットでプラスミドを抽出し、正しいクローンＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、及びＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰを保存した。
【0077】
実施例７ 組換え組み換え菌全細胞の調製
組換え組み換え菌ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、及びＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰをそれぞれ選択して、スペクチノマイシン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃で振とうさせて一晩培養した。培養物を１％の接種量でスペクチノマイシン含有の新しいＬＢ培地に接種し、３７℃で振とうさせて一晩培養し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞、及び耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた全細胞を得た。
組換え組み換え菌ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＭ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＰＧＩ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＥ、ＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ＴＰＰ、及びＳＣＫ８－ＳＴ３／ｐＭＡ５－Ｐｙｌｂ－ａＧＰ－ＰＧＭ－ＰＧＩ－ＴＰＥ－ＴＰＰをそれぞれ選択して、スペクチノマイシン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃で振とうさせて一晩培養した。培養物を１％の接種量でスペクチノマイシン含有の新しいＬＢ培地に接種し、３７℃で振とうさせて一晩培養し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞、及び耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた全細胞を得た。
【0078】
実施例８ 共発現する全細胞の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製
実施例７で調製した、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた全細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で１回洗浄し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、沈殿に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）緩衝液を加え、菌体をＯＤ６００＝約３００となるまで再懸濁させた。再懸濁菌体を７５℃で９０ｍｉｎ熱処理した。
実施例７で調製した、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた全細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で１回洗浄し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、沈殿に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）緩衝液を加え、菌体をＯＤ６００＝約３００となるまで再懸濁させた。再懸濁菌体を７５℃で９０ｍｉｎ熱処理した。
【0079】
１Ｌ反応系に、終濃度１００ｇ／Ｌ澱粉、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）及び熱処理全細胞をそれぞれ加えて、ＯＤ６００＝約２０とした。７０℃の水浴シェーカーにて４６ｈ反応させ、サンプリングして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。ＨＰＬＣ検出条件として、クロマトグラフィーカラム Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＨＰＸ－８７Ｈ；流速 ０．６ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度は６０℃；検出器は示差屈折率検出器；注入量は２０μＬとした。
【0080】
合計３回の並行重複実験を行って、タガトースの収量の反応時間に伴う変化の曲線図を図８に示し、７０℃水浴シェーカーにて４６ｈ反応後、ＨＰＬＣにより試験の結果、タガトースの収量は５０ｇ／Ｌに達し、収率は５０％に達した。
【0081】
実施例９ 全細胞混合物の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製
実施例７で調製した、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞を、それぞれ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で１回洗浄し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、沈殿に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）をそれぞれ加え、菌体をＯＤ６００＝約３００となる再懸濁させた。再懸濁菌体を７５℃で９０ｍｉｎ熱処理した。
実施例７で調製した、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞を、それぞれ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で１回洗浄し、５５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて、沈殿に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）をそれぞれ加え、菌体をＯＤ６００＝約３００となる再懸濁させた。再懸濁菌体を７５℃で９０ｍｉｎ熱処理した。
【0082】
１Ｌ反応系に、終濃度１００ｇ／Ｌ澱粉、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）及び以上の４種の熱処理全細胞を加えて、ＯＤ６００＝約２０とし、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた全細胞の添加割合を１：１：１：１：１とした。７０℃水浴シェーカーにて４６ｈ反応させ、サンプリングしてＨＰＬＣ分析を行った。合計３回の並行重複実験を行って、ＨＰＬＣ検出条件として、実施例８に同様にした。７０℃水浴シェーカーにて４６ｈ反応後、ＨＰＬＣ試験の結果、タガトースの収量は７３ｇ／Ｌに達し、収率は７３％に達した。
【0083】
実施例１０ 固定化全細胞の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）１Ｌを用いて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた透過性全細胞を再懸濁させ、ＯＤ６００＝約４００とし、モンモリロナイト１ｇを加えて、均一に撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水溶液４０ｍｌを加えて室温条件下で凝集させ、５０％グルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌを加えて、室温で３ｈ架橋した。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞を得た。
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）１Ｌを用いて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼ、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼ及び耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを共発現させた透過性全細胞を再懸濁させ、ＯＤ６００＝約４００とし、モンモリロナイト１ｇを加えて、均一に撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水溶液４０ｍｌを加えて室温条件下で凝集させ、５０％グルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌを加えて、室温で３ｈ架橋した。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞を得た。
【0084】
反応系１Ｌに、終濃度１００ｇ／Ｌ澱粉、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）及び固定化全細胞をそれぞれ加えて、ＯＤ６００＝約２０とし、７０℃水浴シェーカーにて反応させた。反応終了後、反応液を４℃で遠心分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ってタガトースの含有量を分析し、固定化粒子を収集して、緩衝液で洗浄し、次のロットの反応を行う。実験結果は図９に示したとおりであり、結果により、固定化全細胞の触媒作用により澱粉からタガトースを生産する過程において、所定の生成物の収率は最高５０％に達し、連続触媒反応のロットが増えるに伴い、生成物の収率は徐々に低下し、５０ロット連続触媒後にも、生成物の収率は約３６％に保持されることが明らかになった。
【0085】
実施例１１ 固定化全細胞混合物の触媒作用による澱粉からタガトースへの調製
１Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を用いて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた透過性全細胞を１：１：１：１：１の割合で再懸濁させ、ＯＤ６００＝約３００とし、モンモリロナイト０．８ｇを加えて、均一に撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水溶液３５ｍｌを加えて室温条件下で凝集させ、５０％グルタルアルデヒド水溶液１８ｍｌを加えて室温で３ｈ架橋した。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞混合物を得た。
１Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）を用いて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコムターゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性ホスホグルコースイソメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸エピメラーゼを発現させた透過性全細胞、耐熱性タガトース６－リン酸ホスファターゼを発現させた透過性全細胞を１：１：１：１：１の割合で再懸濁させ、ＯＤ６００＝約３００とし、モンモリロナイト０．８ｇを加えて、均一に撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン水溶液３５ｍｌを加えて室温条件下で凝集させ、５０％グルタルアルデヒド水溶液１８ｍｌを加えて室温で３ｈ架橋した。その後、吸引ろ過して濾過ケーキ層を得、濾過ケーキを脱イオン水で洗浄した後に押し出して、粒子に調製し、乾燥して固定化全細胞混合物を得た。
【0086】
反応系１Ｌに、終濃度１００ｇ／Ｌ澱粉、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）及び固定化全細胞をそれぞれ加えて、ＯＤ６００＝約２０とし、７０℃水浴シェーカーにて反応させた。反応終了後、反応液を４℃で遠心分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行ってタガトースの含有量を分析し、固定化粒子を収集し、緩衝液で洗浄して、次のロットの反応を行った。実験結果は図１０に示したとおりであり、結果より、６０ロット連続触媒の場合、生成物の収率はすべて５０％を超え、最高７３％以上に達することが明らかになった。実験の結果を図１０に示し、結果により、固定化全細胞混合物を連続して触媒反応させた場合、初期生成物の収率は最高７３％以上に達し、連続触媒反応が進むに伴い、生成物の収率は徐々に低下し、６０ロット連続触媒後にも、生成物の収率は５２％に保持されることが明らかになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】