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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-29
(54)【発明の名称】新規アレルゲンアイソフォームバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20240122BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20240122BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240122BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240122BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240122BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240122BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240122BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240122BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240122BHJP
A61K 39/35 20060101ALI20240122BHJP
A61K 39/36 20060101ALI20240122BHJP
A61K 36/736 20060101ALN20240122BHJP
A61K 36/14 20060101ALN20240122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29
C07K14/415 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P37/08
A61P37/04
A61K39/35
A61K39/36
A61K36/736
A61K36/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542748
(86)(22)【出願日】2022-01-13
(85)【翻訳文提出日】2023-07-13
(86)【国際出願番号】 EP2022050663
(87)【国際公開番号】W WO2022152803
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】2150022-8
(32)【優先日】2021-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500139981
【氏名又は名称】ファディア・アクチボラゲット
【氏名又は名称原語表記】Ｐｈａｄｉａ ＡＢ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】リドホルム ヨナス
(72)【発明者】
【氏名】マットソン ラース
(72)【発明者】
【氏名】ラーソン ホーカン
(72)【発明者】
【氏名】エーレンベルク アンジェリカ
(72)【発明者】
【氏名】エストリング ヨナス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C088
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA02
4C085BB03
4C085BB04
4C085BB11
4C085CC21
4C085CC40
4C085EE01
4C088AB03
4C088AB52
4C088AC03
4C088AC04
4C088BA08
4C088BA16
4C088NA14
4C088ZB09
4C088ZB13
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA30
4H045DA86
4H045EA22
4H045FA74
4H045GA20
4H045GA21
4H045GA22
4H045GA25
4H045GA31
(57)【要約】
本発明は、アレルゲンの分野に関し、より具体的には、位置２３にイソロイシンを含む、Ｃｕｐ ｓ ７の新規アレルゲンアイソフォームバリアント及び関連アレルゲンに関する。新規アレルゲンアイソフォームバリアントは、１型Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｃｅ花粉アレルギー及びＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｃｅ花粉関連食物アレルギーのインビトロ診断、治療、並びに／又は予防において使用が見出される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５３に従うアミノ酸配列を含む単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントであって、位置２３にイソロイシンを含み、かつ少なくとも８５％の配列番号５３との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアント。
【請求項2】
前記配列番号５３との配列同一性が、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である、請求項１に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項3】
前記タンパク質又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントが、配列番号５２に従う以下のアミノ酸配列を含み、【表1】
【請求項4】
前記タンパク質又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントが、配列番号９に従う以下のアミノ酸配列を含み、【表2】
【請求項5】
配列番号９の前記位置Ｘのうちの最大４つが、任意のアミノ酸を含むが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、残りの位置Ｘにおいて、前記アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、若しくはＱのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、請求項４に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項6】
前記残りの位置Ｘにおいて、前記アミノ酸は、位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、請求項５に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項7】
位置Ｘにおいて、前記アミノ酸は、位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、請求項４に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項8】
位置Ｘにおいて、前記アミノ酸は、位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、請求項７に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項9】
配列番号９の前記位置Ｘのうち最大４つは、位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択され、
残りの位置Ｘにおいて、前記アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一である、請求項４に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項10】
前記位置Ｘのうち最大４つにおいて、前記アミノ酸は、位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される、請求項９に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項11】
前記タンパク質が、配列番号５３～５８のうちのいずれか１つに従うアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項12】
前記タンパク質が、配列番号６３に従うアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項13】
前記タンパク質が、配列番号６４に従うアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項14】
前記タンパク質、断片又はバリアントが、組換え的に産生されており、任意に、前記タンパク質が、構造的に修飾されており、非天然起源タンパク質をもたらす、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントをコードする、単離核酸分子。
【請求項16】
前記核酸分子が、配列番号１０によってコードされる、請求項１５に記載の単離核酸分子。
【請求項17】
請求項１５又は１６に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項18】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項19】
アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物及び／又は少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントを添加するステップを含む、方法。
【請求項20】
請求項１９に記載の方法によって得られる、アレルゲン組成物。
【請求項21】
１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントの使用。
【請求項22】
前記１型アレルギーが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされる、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記１型アレルギーが、食物に関連している、例えば、柑橘類果物又はモモなどの果物に関連している、請求項２１に記載の使用。
【請求項24】
前記１型アレルギーが、花粉食物に関連している、例えば、花粉食物関連症候群（ＰＦＡＳ）に関連している、請求項２１に記載の使用。
【請求項25】
１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための方法であって、－１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントと接触させるステップと、
－前記試料において、前記タンパク質、断片又はバリアントと特異的に結合する抗体、例えば、ＩｇＥ抗体の存在を決定するステップと、を含み、
前記タンパク質、断片又はバリアントと特異的に結合する前記試料中の抗体の存在が、前記対象における１型アレルギーに関して有益である、方法。
【請求項26】
キットオブパーツであって、可溶性又は固体支持体に固定化された、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントを含み、前記キットが、任意に、検出試薬及び／又は使用説明書を更に含む、キットオブパーツ。
【請求項27】
１型アレルギーの治療又は予防に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアント。
【請求項28】
前記１型アレルギーが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされ、食物関連アレルギー、例えば、柑橘類果物若しくはモモなどの果物関連アレルギーであり、かつ／又は花粉食物関連症候群（ＰＦＡＳ）に関連している、請求項２７に記載の使用のための単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアント。
【請求項29】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片又はバリアントと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項30】
１型アレルギーの治療又は予防のための方法であって、その治療又は予防を必要とする対象に、薬学的有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離アレルゲンタンパク質、断片若しくはバリアント、請求項２０に記載のアレルゲン組成物、又は請求項２９に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項31】
前記１型アレルギーが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされる１型アレルギーであり、食物関連アレルギー、例えば、柑橘類果物若しくはモモなどの果物関連アレルギーであり、かつ／又は花粉食物関連症候群（ＰＦＡＳ）に関連している、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アレルギーの分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ科に属する種の花粉からのアレルゲンの新規アイソフォームバリアントの特定、並びにかかる花粉に対するアレルギー及び特異的に関連する食物アレルギーの診断及び治療に関する。
【背景技術】
【0002】
工業先進国における人口のおよそ２０％が、様々な環境生物物質又は食物からの抗原に曝露されると、過敏性（アレルギー）となる。即時型及び／又は遅延型の過敏症を誘導する抗原は、主にタンパク質又は糖タンパク質であり、アレルゲンと称され［１］、花粉、ヒョウヒダニ、動物の皮屑、昆虫の毒液、植物又は動物由来食物など、様々な源に見られる。アレルギー性疾患の基本的な免疫学的機序は、一般に感作と称される、かかるアレルゲンに対するアレルゲン特異的免疫グロブリンＥ（immunoglobulin E、ＩｇＥ）抗体の形成である。ＩｇＥ抗体は、特定の高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩを介して、好塩基球、肥満細胞、及び樹状細胞に結合する。アレルゲンに曝露されると、細胞表面上のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、各アレルゲン分子の少なくとも２つの異なるエピトープの認識を通して架橋され、これらの細胞からヒスタミン及びロイコトリエンなどの炎症性媒介物が放出される。その結果、組織炎症及びアレルギーの生理学的症状が生じる［２］。
【0003】
臨床診療では、医師によるアレルギーの診断は通常、同じアレルゲンに対する感作の証拠と組み合わせた、アレルゲンに対する過敏性の納得できる病歴に基づいている。アレルゲン感作の診断検査手順は、患者の血液試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのインビトロイムノアッセイ、又は患者の皮膚へのアレルゲン抽出物の局所適用によって実行される皮膚プリック検査（skin prick test、ＳＰＴ）のいずれかを利用することができる［３］。どちらの様式でも、アレルゲン源からのタンパク質抽出物を含むアレルゲン試薬が従来使用されている。かかる検査は高い感受性、それによる高い陰性の予測値を有し得るが、天然アレルゲン抽出物における成分に対する感作は、必ずしもアレルギーの臨床症状が発生することを意味するわけではない。検出可能な感作と臨床的アレルギーとの間のかかる解離は、部分的には、天然抽出物に存在する異なるアレルゲンタンパク質の不等な有意性によるものである。アレルゲン源における特定のタンパク質に対する感作が他のものよりも臨床疾患と密接に関連しているという事実は、診断検査に純粋な形態でかかる特定のタンパク質を利用することにより、改善された臨床的有用性を伴う診断検査の開発へ向かう手段を開いた。個々のアレルゲンタンパク質に対するＩｇＥ抗体についてのインビトロ診断検査は、多くの場合、成分分解診断（component-resolved diagnostics、ＣＲＤ）と称される［４］。
【0004】
アレルゲン抽出物を使用する従来のＩｇＥ分析と比較して、ＣＲＤにはいくつかの明確な利点があることが現在広く認識されている。ＣＲＤの１つの重要な特徴は、アレルゲン源に対する一次感作と交差反応性による感作とを区別する能力であり、前者はより重度の症状に、後者は軽度の症状又は臨床的耐性に関連している。食物アレルギーでは、一次感作は通常、豊富で多くの場合安定したタンパク質に指向する。結果として、問題の食物を少量でも誤って摂取すると、相当量のかかる食物タンパク質に曝露され、感作された個体において高いリスクの重度の反応をもたらすであろう。対照的に、花粉アレルゲンと相同で交差反応する食物タンパク質は、通常、少量しか存在しないため、重度の症状を引き起こすことはめったにない［５、６］。関連する食物アレルゲン成分に対するＩｇＥ抗体の分析は、小麦、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、及びカシューナッツに対するアレルギーによって例示されるように、試験の診断値及び臨床的有用性を有意に増加させることが示されている［７～１３］。ＣＲＤを使用することにより、重度で生命を脅かす可能性のあるアレルギー反応のリスクが高い患者を特定し、食物への曝露を厳密に回避し、緊急治療のためにアドレナリン自動注入器を常に携帯するように指示することができる一方で、かかる重篤な反応のリスクがない患者は、不当な不安から解放され、改善された生活の質から恩恵を受けることができる。同様に、呼吸器アレルギーでは、一次感作と交差反応性感作とを区別するＣＲＤの能力により、重要性の低い交差反応性感作ではなく、アレルギー症状の真の原因を対象としたアレルゲン免疫療法治療（allergen immunotherapy treatment、ＡＩＴ）の最適な選択が容易になる［１４］。
【0005】
精製された天然又は組換えアレルゲン成分の別の用途は、天然アレルゲン抽出物中の対応するタンパク質の不均衡又は不足に対抗するためのスパイク試薬としてのそれらの使用である。これは、アレルゲンマイクロアレイ又は診療所での検査など、小型化された又は実験室以外のイムノアッセイで特に重要となり得、あまり好ましくないアッセイ条件、抗体結合アレルゲン試薬の能力の低下、及び効力が制限された天然アレルゲン抽出物の組み合わせは、不十分な診断感度を引き起こし得る。
【0006】
２０１６年、欧州アレルギー学会（European Academy of Allergy and Clinical Immunology、ＥＡＡＣＩ）は、「ＥＡＡＣＩ分子アレルギー学－ユーザガイド」を発表した［１］。これは、より信頼性の高い診断のために、アレルギー患者をアレルゲン成分で検査することの重要性を認識する上で画期的な出来事であった。このガイドを使用することにより、アレルギー専門医及び他の医療専門家は、交差反応性及び特定の感作パターンに関連するリスクのレベルをよりよく理解し、それによって適切なアレルゲン回避戦略を含む、患者のより適切な管理を提供することができる。
【0007】
アレルギーの最も一般的な治療法は薬理学的（例えば、抗ヒスタミン薬）であり、一時的に症状を緩和するように作用するが、治癒的ではない。アレルギーの長期的及び治癒的な治療は、患者の免疫学的脱感作を引き起こすアレルゲン免疫療法（ＡＩＴ）で達成することができる。治療は、皮下又は舌下のいずれかで、原因アレルゲンの抽出物の用量を、非常に低いレベルから１００～１０００倍高い維持用量まで徐々に増加させる用量の投与を含む。この制御され、徐々に増加するアレルゲン曝露は、時に免疫系の再教育とも称される、アレルゲンタンパク質に対する防御免疫応答の特異的な活性化を引き起こす。免疫療法の確立された形態の可能な更なる発展は、天然のアレルゲン抽出物の代わりに、１つ又はいくつかの精製アレルゲンタンパク質の使用である。このような免疫療法の試験は、イネ科草本［１５、１６］及びカバノキ［１７］の花粉アレルギーに対して成功裏に実施されており、ペット動物に対するアレルギーの治療にも提案されている［４、１８］。
【0008】
ＡＩＴの疾患修飾機序は完全には理解されていないが、それが主にＩｇＧ４サブクラスからなるアレルゲン特異的ＩｇＧ応答を誘導することが周知である。これらのＩｇＧ抗体は、アレルゲンを遮断することによって直接的に、又はＦｃ受容体を介して作用することによって間接的にＩｇＥ抗体の効果を調節し得る［１９～２１］。ＩｇＧ抗体応答は免疫療法の成功の機序の一部であると考えられているため［２０、２１］、アレルゲン特異的ＩｇＧの分析は、治療の関連する免疫学的効果をモニタリングする方法であり得る。結論として、アレルゲン特異的ＩｇＧレベルの測定は、環境曝露又は免疫療法治療を通したアレルゲンに対する自然又は誘導耐性を反映している可能性があり、ＩｇＥ測定と組み合わせて、アレルギーにおける診断検査の臨床的関連性を高める可能性がある。
【0009】
花粉アレルゲンは工業先進国における呼吸器アレルギーの主な原因であり、おそらく気候変動の結果として、花粉症は過去数十年の間に着実に増加している［２２］。花粉症は、季節性鼻炎、結膜炎、喘息などの様々な症状を示す。花粉粒は、イネ科草本、雑草、樹木の花から放出され、風又は昆虫のいずれかによって飛散される。樹木からのほとんどのアレルギー性花粉は風で運ばれ、ブナ目、シソ目、ヤマモガシ目、及びマツ目に属する種によって産生される。マツ目は裸子植物であり、別々に雄花及び雌花を有することによって特徴付けされる。アレルギーに関連するＰｉｎａｌｅｓ種は、主にＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ科に属し、主に比較的温暖な気候において見られる［２３］。地中海地域では、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（地中海又はイタリアのヒノキ）が冬の花粉症の重要な原因であり、ヒノキ花粉に対する感作の有病率は過去数十年で劇的に増加している。特定の地域では、感作率は、アトピー性個体の間で４２％高く達し得る［２４、２５］。地中海ヒノキはアリゾナヒノキ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ）と密接に関連しており、北米及び日本でそれぞれ見られるマウンテンシダ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ、別名Ｊ．ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、二ホンヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ）、及び二ホンシダ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）とは、いくらかより遠縁である。これらの種の主要なアレルゲンであるＣｕｐ ｓ １、Ｃｕｐ ａ １、Ｊｕｎ ａ １、Ｃｈａ ｏ １、及びＣｒｙ ｊ １は、それぞれ９０％を超えるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルギー患者を感作している。これらのアレルゲンは全て糖タンパク質であり、４０～５０ｋＤａの分子量を有し、ペクチン酸リアーゼタンパク質ファミリーに属する。アレルゲンは交差反応性が高く、７０％～９５％の配列同一性を共有する［２６、２７］。２群アレルゲン（Ｃｕｐ ｓ ２、Ｃｕｐ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ２、Ｃｈａ ｏ ２、及びＣｒｙ ｊ ２）はポリガラクツロナーゼファミリーに属し、７１％～９７％の配列同一性を示す。感作率はＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルギー患者では８０％にもなる可能性があり、したがってそれを主要なアレルゲンとみなすこともできる［２４］。３群及び４群のＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルゲンは、それぞれタウマチン様タンパク質ファミリー及びポルカルシンタンパク質ファミリーに属し、少数アレルゲンとして記載されている［２７、２８］。これらの４つの群を超えて、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉において約１５個の他のアレルゲンタンパク質が報告されている。
【0010】
花粉に対する感作は、多くの場合相同な花粉と食物タンパク質との間の交差反応性による、異なる植物性食物に対するアレルギーに関連している。かかる交差反応性は、花粉及び植物由来食物中に存在する相同タンパク質間の構造的類似性の結果として生じる。関連するタンパク質のかかる対間のアミノ酸配列同一性及び三次元構造類似性のレベルが高いほど、交差反応性の確率及び強度が高くなる。互いに６０％以上の配列同一性を有するタンパク質間で広範な交差反応性が期待することができるが、関連性の低いタンパク質間で生じ得る［２９］。
【0011】
花粉関連食物アレルギーは、主に又は完全に花粉感作によって駆動されると考えられている。これは通常、口腔症状を引き起こすため、口腔アレルギー症候群（oral allergy syndrome、ＯＡＳ）と称される。花粉関連食物アレルギーの最も周知である広く見られる例は、カバノキ花粉によって引き起こされ、様々な果物及び野菜におけるいわゆるＰＲ－１０タンパク質Ｂｅｔ ｖ １及び相同タンパク質が関係している［３０］。別の例は、任意の花粉感作によって駆動され得るプロフィリン媒介性食物アレルギーであり、これは頻度が低く、メロン、バナナ、及び他の果物などの食物に対してアレルギーを引き起こし得る［３１、３２］。
【0012】
更に別の例では、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉感作とモモアレルギーとの関連を示すいくつかの患者症例が報告された［３３］。その調査では、４５ｋＤａのモモアレルゲンが、免疫ブロット阻害実験によって交差反応性の原因の可能性があると特定された。最近では、Ｐｒｕ ｐ ７又はｐｅａｍａｃｌｅｉｎと称された新規モモアレルゲンが、南イタリアのモモアレルギー患者の主要なアレルゲンとして報告された［３４］。Ｐｒｕ ｐ ７は、日本において果物アレルギーの重要な原因としても報告されているジベレリン制御タンパク質（gibberellin regulated protein、ＧＲＰ）ファミリーに属する７ｋＤａのシステインに富むタンパク質である［３５］。フランス南部では、Ｐｒｕ ｐ ７感作を特徴とする重度のモモアレルギーとＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉症との間に有意な関連が観察されている［３６］。阻害実験を行うことにより、ヒノキ花粉抽出物は、Ｐｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合を凌駕することが見出され、ヒノキ花粉におけるＰｒｕ ｐ ７と交差反応するタンパク質の存在を示している。ヒノキ花粉由来のＢＰ１４と称される１４ｋＤａのタンパク質は、ＧＲＰファミリーの別のメンバーであるジャガイモタンパク質ｓｎａｋｉｎ－１［３７］と配列相同性のある１３アミノ酸残基のペプチドを含むことが報告されている。この配列伸展は、１３残基のＢＰ１４配列を使用したＢｌａｓｔ検索によって証明されるように、４０を超える植物種からのＧＲＰにおいて同一である高度に保存されたＧＲＰセグメントを含むが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種からの他の利用可能な配列は含まれない。したがって、報告されたＢＰ１４ペプチドには、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰに特徴的かつ区別的な配列情報が含まれておらず、したがって、かかるタンパク質の特定の特徴に向けたガイダンスは提供されていない。Ｔｕｐｐｏらは、ＧＲＰタンパク質ファミリーからの７ｋＤａタンパク質の精製を最初に報告したが［３８］、このタンパク質の配列は部分的にしか解明されなかった。Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓからの７ｋＤａ ＧＲＰタンパク質（現在、Ｃｕｐ ｓ ７と命名されている）の完全配列は、２つの部位、すなわち、アミノ酸位置１８及び位置５２におけるアイソフォーム変異を含め、Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇらによって開示された［３９］。
【0013】
しかしながら、１型アレルギー、特に食物中のタンパク質との交差反応性を示し、かつ感作を誘発して食物アレルギー反応を引き起こし得るアレルゲンの診断、予後、治療及び／又は予防に使用することができる、更なるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルゲンを更に特定するための当技術分野における必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0014】
上記の必要性は、本明細書において代替的にＣｕｐ ｓ ＧＲＰと称されるアレルゲンタンパク質である、Ｃｕｐ ｓ ７の新規アイソフォームバリアントを本明細書において特定及び提供することによって、現在満たされているか、又は少なくとも軽減されている。現在特定され、Ｃｕｐ ｓ ７において開示されているバリアントアミノ酸残基は、モモアレルゲンＰｒｕ ｐ ７（ジベレリン制御タンパク質（ＧＲＰ）ファミリーに属する７ｋＤａ塩基性システインに富むタンパク質）において保存されていない。かかる新規アレルゲンアイソフォームバリアントの発見により、アレルゲンタンパク質Ｃｕｐ ｓ ７の理解が完全なものとなる。これは、１型アレルギー診断の分野、並びに果物及び潜在的な他の植物性食物に対して重度のアレルギーを発症するリスクのあるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルギー個体の特定において用途が見出される。
【0015】
位置２３にイソロイシンを含む本明細書で特定されたＣｕｐｓ ＧＲＰのアイソフォームバリアント（以下、Ｉｌｅ及びＩとも略記される）は、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ科からの他の種における花粉タンパク質にも存在し得る。したがって、Ｊ．ａｓｈｅｉ及びＣ．ｊａｐｏｎｉｃａからの新規花粉ＧＲＰアレルゲンアイソフォームバリアントもまた、位置２３にイソロイシンを有し得る。少なくとも、これまでに、Ｊ．ａｓｈｅｉ（配列番号６３）においても位置２３にイソロイシンを含むアイソフォームバリアントが存在することが本明細書において更に確認された。
【0016】
本出願において開示される知見の前に、位置２３のアミノ酸は、植物種にかかわらず全ての既知のＧＲＰタンパク質においてロイシン（以下、Ｌｅｕ及びＬとも略記される）であり、厳密に保存されていることが一般的に理解されていた。しかしながら、位置２３にイソロイシンを有する一部のＧＲＰタンパク質のアイソフォームバリアントの存在が今回初めて示された。本明細書で研究された３つのＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種が、今までに特徴付けられた他の全てのＧＲＰタンパク質が由来する被子植物（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）から進化的に区別され、離れている植物のグループである裸子植物（Ａｃｒｏｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属することは注目に値する。この事実は、ＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅのＧＲＰ配列が、それ以外の場合は保存されているアミノ酸位置で他の既知のＧＲＰ配列から逸脱し得る理由を提供する。
【0017】
したがって、本明細書に開示される新規アイソフォームバリアントは、それらがコンセンサス配列（配列番号５２及び配列番号９）のアミノ酸配列の位置２３にロイシンの代わりにイソロイシンを有するという共通の知見に基づく。
【0018】
位置１８にイソロイシンを有するＣｕｐ ｓ ＧＲＰアレルゲンアイソフォームバリアントが本明細書に更に開示される。位置２３にイソロイシン及び位置１８にイソロイシンを有するＣｕｐ ｓ ＧＲＰアレルゲンアイソフォームバリアントも本明細書に開示される。
【0019】
したがって、本明細書に提供される第１の態様では、配列番号５３（すなわち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ）に従うアミノ酸配列を含む単離アレルゲンタンパク質（すなわち、本明細書で特定されたアレルゲン）、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントであって、位置２３にイソロイシンを含み、かつ少なくとも８５％の配列番号５３との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントが提供される。また、本明細書では、位置２３にイソロイシンを含み、かつ少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列番号５３との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントも提供される。
【0020】
また、本明細書では、配列番号５３～５８（すなわち、表１のＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃ～ｈ）、配列番号６３（すなわち、表１のＪｕｎ ａ ＧＲＰｂ）、若しくは配列番号６４（すなわち、表１のＣｒｙ ｊ ＧＲＰｂ）のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、単離アレルゲンタンパク質も提供される。また、本明細書では、位置２３にイソロイシンを含み、かつ、それぞれ少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性の配列番号５３～６２、配列番号６３、又は配列番号６４のうちのいずれか１つとの配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントも提供される。
【0021】
更なる態様では、本明細書に示されるそれぞれの単離タンパク質をコードする単離核酸分子が提供される。かかる単離核酸分子は、ＩＵＰＡＣ多義性コードに従う同義コドン及びバリアントを含む花粉ＧＲＰの縮重ＤＮＡ配列を提示する配列番号１０に従う配列によって表される。
【0022】
更なる態様では、本明細書の他の場所に開示される単離核酸配列を含む単離核酸分子を含む、発現ベクター（本明細書では単にベクターとも称される）が提供される。
【0023】
更に別の態様では、本明細書に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞が提供される。当該宿主細胞は、発現ベクターによってコードされる目的のタンパク質を発現させるために使用される。
【0024】
更に別の態様では、アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物及び／又は少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、本明細書に記載の単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントを添加するステップを含む、方法が提供される。
【0025】
更に別の態様では、本明細書に記載のアレルゲン組成物を産生するための方法によって得られるアレルゲン組成物であって、当該アレルゲン組成物が、本明細書の他の場所で更に定義される単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントを含む、アレルゲン組成物が提供される。
【0026】
また、本明細書に記載の単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアント、並びにアレルゲン抽出物及び／又は少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む、アレルゲン組成物も提供される。
【0027】
更に別の態様では、１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための、本明細書に開示される単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントの使用が提供される。
【0028】
更に別の態様では、本明細書において、１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための方法であって、１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、本明細書に開示の単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントと接触させるステップと、当該試料において、当該タンパク質、断片若しくはバリアントと特異的に結合する抗体、例えば、ＩｇＥ抗体、又はその機能的に同等な断片の存在を決定するステップと、を含み、当該タンパク質、断片若しくはバリアントと特異的に結合する当該試料中の抗体、又はその機能的に同等な断片の存在が、当該対象における１型アレルギーに関して有益である、方法が提供される。
【0029】
更に別の態様では、キットオブパーツであって、可溶性又は固体支持体に固定化された、本明細書に記載の単離アレルゲンタンパク質、又は断片若しくはバリアントを含み、当該キットが、任意に、検出試薬及び／又は使用説明書を更に含む、キットオブパーツが提供される。
【0030】
別の態様では、１型アレルギーの治療又は予防に使用するための、本明細書に開示される単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントが提供される。
【0031】
更に別の態様では、本明細書に開示される単離アレルゲンタンパク質、又はその断片若しくはバリアントと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物が提供される。
【0032】
更に別の態様では、１型アレルギーの治療又は予防のための方法であって、その治療又は予防を必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書で提供される単離アレルゲンタンパク質、又はその断片若しくはバリアント、あるいはアレルゲン組成物、あるいは薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】カチオン交換クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕ ｐ ７の第１の精製ステップを示す。２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。
【図2】サイズ排除クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕ ｐ ７の第２の精製ステップを示す。２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。
【図3】抗Ｐｒｕ ｐ ３モノクローナル抗体を使用する親和性免疫吸着クロマトグラフィを含む天然Ｐｒｕ ｐ ７の第３の精製ステップを示す。２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更に精製するために収集した非結合の物質を示す。
【図4a】逆相クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕ ｐ ７の第４の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及びパーセンテージアセトニトリルを伴うクロマトグラムをそれぞれ実線及び斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された画分を示し、括弧は、更なる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）図４ａに示した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。レーン７～９には、図４ａの括弧で示した画分が含まれる。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図4b】逆相クロマトグラフィによる天然Ｐｒｕ ｐ ７の第４の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及びパーセンテージアセトニトリルを伴うクロマトグラムをそれぞれ実線及び斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された画分を示し、括弧は、更なる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）図４ａに示した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。レーン７～９には、図４ａの括弧で示した画分が含まれる。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図5】カチオン交換クロマトグラフィによる組換えＰｒｕ ｐ ７の第１の精製ステップを示す。２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。
【図6a】サイズ排除クロマトグラフィによる組換えＰｒｕ ｐ ７の第２の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更なる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）サイズ排除クロマトグラフィステップからのプールの還元（レーン１）及び非還元（レーン２）試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図6b】サイズ排除クロマトグラフィによる組換えＰｒｕ ｐ ７の第２の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更なる分析のためにプールされた画分を示す。ｂ）サイズ排除クロマトグラフィステップからのプールの還元（レーン１）及び非還元（レーン２）試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図7a】ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの、ａ）組換えＰｒｕ ｐ ７及びｂ）Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物との異なる抗血清希釈での結合を示す。同じウサギからの免疫前血清を陰性対照として使用した。
【図7b】ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの、ａ）組換えＰｒｕ ｐ ７及びｂ）Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物との異なる抗血清希釈での結合を示す。同じウサギからの免疫前血清を陰性対照として使用した。
【図8】サイズ排除クロマトグラフィによるＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物からのｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第１のステップを示す。２１４ｎｍでの吸光度（Ａ214）及び導電率を、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。
【図9a】イオン交換クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第２のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び点線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）画分と結合するウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図９ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図９ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図9b】イオン交換クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第２のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び点線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）画分と結合するウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図９ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図９ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図9c】イオン交換クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第２のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び点線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）画分と結合するウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図９ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図９ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図10a】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第３のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を伴うクロマトグラムを実線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示し、括弧は、更なる精製のためにプールした画分を示す。ｂ）画分と結合する抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図１０ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｄ）画分のプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す（ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、レーン１）及びｒＰｒｕ ｐ ７（レーン２）。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図10b】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第３のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を伴うクロマトグラムを実線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示し、括弧は、更なる精製のためにプールした画分を示す。ｂ）画分と結合する抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図１０ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｄ）画分のプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す（ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、レーン１）及びｒＰｒｕ ｐ ７（レーン２）。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図10c】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第３のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を伴うクロマトグラムを実線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示し、括弧は、更なる精製のためにプールした画分を示す。ｂ）画分と結合する抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図１０ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｄ）画分のプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す（ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、レーン１）及びｒＰｒｕ ｐ ７（レーン２）。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図10d】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製の第３のステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を伴うクロマトグラムを実線で示す。矢印は、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について試験した画分を示し、括弧は、更なる精製のためにプールした画分を示す。ｂ）画分と結合する抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧのレベルを図１０ａに示す。ｃ）画分の銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｄ）画分のプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１０ａに示す（ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、レーン１）及びｒＰｒｕ ｐ ７（レーン２）。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図11a】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９のヌクレオチド配列（配列番号２）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。中断された仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列（仮説上ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされる配列から逸脱するアミノ酸に下線を付し、代替アミノ酸は配列の上に示された２つの多型部位で特定されている）。ｄ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図11b】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９のヌクレオチド配列（配列番号２）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。中断された仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列（仮説上ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされる配列から逸脱するアミノ酸に下線を付し、代替アミノ酸は配列の上に示された２つの多型部位で特定されている）。ｄ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図11c】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９のヌクレオチド配列（配列番号２）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。中断された仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列（仮説上ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされる配列から逸脱するアミノ酸に下線を付し、代替アミノ酸は配列の上に示された２つの多型部位で特定されている）。ｄ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図11d】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９のヌクレオチド配列（配列番号２）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。中断された仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列（仮説上ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされる配列から逸脱するアミノ酸に下線を付し、代替アミノ酸は配列の上に示された２つの多型部位で特定されている）。ｄ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図12a】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、クロマトグラムに示される３つの吸光度ピーク（プール１～３）のプールされた画分を示す。ｂ）図１２ａに示されるサイズ排除クロマトグラフィから選択された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。プール１～３を含む画分は、括弧で示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１２ａに示される３つのプールによるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図12b】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、クロマトグラムに示される３つの吸光度ピーク（プール１～３）のプールされた画分を示す。ｂ）図１２ａに示されるサイズ排除クロマトグラフィから選択された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。プール１～３を含む画分は、括弧で示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１２ａに示される３つのプールによるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図12c】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。括弧は、クロマトグラムに示される３つの吸光度ピーク（プール１～３）のプールされた画分を示す。ｂ）図１２ａに示されるサイズ排除クロマトグラフィから選択された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。プール１～３を含む画分は、括弧で示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１２ａに示される３つのプールによるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図13a】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合による分析のために選択した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）図１３ａに示した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１３ａに示す画分によるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図13b】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合による分析のために選択した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）図１３ａに示した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１３ａに示す画分によるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図13c】サイズ排除クロマトグラフィによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰの第３の及び最後の精製ステップを示す。ａ）２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）及び導電率を伴うクロマトグラムを、それぞれ実線及び斜線で示す。矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合による分析のために選択した画分を示す。括弧は、更に精製するためにプールされた画分を示す。ｂ）図１３ａに示した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。ｃ）図１３ａに示す画分によるウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合のレベルを示す棒グラフ。
【図14a】ＭＳ／ＭＳによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９の修正バージョンのヌクレオチド配列（配列番号３）は、精製された７ｋＤａのＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致である。仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、補正された前の終止コドン（ＴＧＹ）及び末端終止コドン（ＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列、修正されたＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定される配列から逸脱するアミノ酸に下線を付す。ｄ）Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図14b】ＭＳ／ＭＳによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９の修正バージョンのヌクレオチド配列（配列番号３）は、精製された７ｋＤａのＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致である。仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、補正された前の終止コドン（ＴＧＹ）及び末端終止コドン（ＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列、修正されたＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定される配列から逸脱するアミノ酸に下線を付す。ｄ）Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図14c】ＭＳ／ＭＳによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９の修正バージョンのヌクレオチド配列（配列番号３）は、精製された７ｋＤａのＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致である。仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、補正された前の終止コドン（ＴＧＹ）及び末端終止コドン（ＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列、修正されたＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定される配列から逸脱するアミノ酸に下線を付す。ｄ）Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図14d】ＭＳ／ＭＳによるｎＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９の修正バージョンのヌクレオチド配列（配列番号３）は、精製された７ｋＤａのＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致である。仮定のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、補正された前の終止コドン（ＴＧＹ）及び末端終止コドン（ＴＡＧ）に下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された４つのペプチド（Ｐｅｐ１～４）と、ＢＹ８７８０７９の修正バージョンによってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列、修正されたＢＹ８７８０７９によってコードされると仮定される配列から逸脱するアミノ酸に下線を付す。ｄ）Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図15a】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０のヌクレオチド配列（配列番号７、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。仮定のオープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＧ）コドンに下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された５つのペプチド（Ｐｅｐ１～５）と、ＢＹ９００４８０によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列。ｄ）Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図15b】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０のヌクレオチド配列（配列番号７、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。仮定のオープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＧ）コドンに下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された５つのペプチド（Ｐｅｐ１～５）と、ＢＹ９００４８０によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列。ｄ）Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図15c】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０のヌクレオチド配列（配列番号７、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。仮定のオープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＧ）コドンに下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された５つのペプチド（Ｐｅｐ１～５）と、ＢＹ９００４８０によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列。ｄ）Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図15d】ＭＳ／ＭＳによるｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列決定を示す。ａ）ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０のヌクレオチド配列（配列番号７、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列）は、精製された７ｋＤａのＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質から得られたＭＳ／ＭＳデータとの最良のデータベース一致を表す。仮定のオープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）及び停止（ＴＡＧ）コドンに下線を付す。ｂ）ＭＳ／ＭＳ分析によって特定された５つのペプチド（Ｐｅｐ１～５）と、ＢＹ９００４８０によってコードされると仮定されるアミノ酸配列とのアラインメント。予測されるシグナルペプチドには下線を付し、終止コドンはアスタリスクで示す。ｃ）ＭＳ／ＭＳによって決定されたＣｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列。ｄ）Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列のアラインメント。垂直線、コロン、及びピリオドは、それぞれ同一、保存、及び半保存の位置を示す。
【図16a】Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉由来ＧＲＰの配列及び電気泳動の比較を示す。ａ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰアミノ酸配列のマルチアラインメント。全ての配列において同一のアミノ酸を有する位置はアスタリスクで示す。ｂ）上記のアミノ酸配列のマトリックス比較は、パーセント配列同一性を示す。ｃ）Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（レーン１）、Ｊ．ａｓｈｅｉ（レーン２）、及びＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ（レーン３）花粉並びに組換えＰｒｕ ｐ ７（レーン４）から精製された３つの７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図16b】Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉由来ＧＲＰの配列及び電気泳動の比較を示す。ａ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰアミノ酸配列のマルチアラインメント。全ての配列において同一のアミノ酸を有する位置はアスタリスクで示す。ｂ）上記のアミノ酸配列のマトリックス比較は、パーセント配列同一性を示す。ｃ）Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（レーン１）、Ｊ．ａｓｈｅｉ（レーン２）、及びＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ（レーン３）花粉並びに組換えＰｒｕ ｐ ７（レーン４）から精製された３つの７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図16c】Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉由来ＧＲＰの配列及び電気泳動の比較を示す。ａ）Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰアミノ酸配列のマルチアラインメント。全ての配列において同一のアミノ酸を有する位置はアスタリスクで示す。ｂ）上記のアミノ酸配列のマトリックス比較は、パーセント配列同一性を示す。ｃ）Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（レーン１）、Ｊ．ａｓｈｅｉ（レーン２）、及びＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ（レーン３）花粉並びに組換えＰｒｕ ｐ ７（レーン４）から精製された３つの７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を右側に示す。
【図17】ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ（レーン１）、ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ（レーン２）、精製された天然Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ（レーン３）、及びｒＰｒｕ ｐ ７（レーン４）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。マーカータンパク質の分子量（レーンＭ）を左側に示す。
【図18】４４人のモモアレルギー対象におけるｒＰｒｕ ｐ ７及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰとのＩｇＥ結合の比較を示す。アッセイの０．１ｋＵA／Ｌの定量限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ、ＬｏＱ）を下回る値は、０．１ ｋＵA／Ｌに設定した。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図19a】１８人のモモアレルギー対象におけるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及び組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰの２つのバリアントとのＩｇＥ結合の比較を示す。ａ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｂ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ。ｃ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図19b】１８人のモモアレルギー対象におけるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及び組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰの２つのバリアントとのＩｇＥ結合の比較を示す。ａ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｂ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ。ｃ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図19c】１８人のモモアレルギー対象におけるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及び組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰの２つのバリアントとのＩｇＥ結合の比較を示す。ａ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｂ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ。ｃ）ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ対ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図20】４人の異なる対象の血清において、天然及び組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂによるｒＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合の阻害を示す。結果は、希釈緩衝液対照の割合として表される。
【図21a】１８人のモモアレルギー対象におけるａ）ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、ｂ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｃ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＪｕｎ ａ ＧＲＰとのＩｇＥ結合の対比較を示す。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図21b】１８人のモモアレルギー対象におけるａ）ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、ｂ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｃ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＪｕｎ ａ ＧＲＰとのＩｇＥ結合の対比較を示す。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図21c】１８人のモモアレルギー対象におけるａ）ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、ｂ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、並びにｃ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ及びｎＪｕｎ ａ ＧＲＰとのＩｇＥ結合の対比較を示す。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図22】ヒノキ花粉に感作された８８人の対象の血清におけるｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対するＩｇＥ抗体の保有率及びレベルを示す。アッセイの０．１ｋＵA／Ｌの定量限界（ＬｏＱ）を下回る値（斜垂直線及び水平線で示される）は、０．０５ｋＵA／Ｌに設定した。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【図23a】プロフィリンＢｅｔ ｖ ２、Ｃｏｒ ａ ２、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｙｒ ｃ ４、Ａｐｉ ｇ ４、Ｄａｕ ｃ ４、及びＰｈｌ ｐ １２間の免疫学的比較及び配列比較を示す。ａ）異なるプロフィリンとのＩｇＥ結合の対比較。斜水平線及び垂直線は０．３５ｋＵA／Ｌのレベルを示し、対角線は１：１の勾配を示す。ｂ）対配列比較は、パーセント配列同一性を示す。
【図23b】プロフィリンＢｅｔ ｖ ２、Ｃｏｒ ａ ２、Ｍａｌ ｄ ４、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｙｒ ｃ ４、Ａｐｉ ｇ ４、Ｄａｕ ｃ ４、及びＰｈｌ ｐ １２間の免疫学的比較及び配列比較を示す。ａ）異なるプロフィリンとのＩｇＥ結合の対比較。斜水平線及び垂直線は０．３５ｋＵA／Ｌのレベルを示し、対角線は１：１の勾配を示す。ｂ）対配列比較は、パーセント配列同一性を示す。
【図24】Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ（本明細書ではＪｕｎ ａ ＧＲＰａとも称する）、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰ配列、並びにこれら５つの配列に基づくＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅコンセンサス配列のアラインメントを示す。Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａのアミノ酸から逸脱するアミノ酸のみは、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰの配列において示される。変動性を示すアミノ酸位置は、他の配列の上部にアラインメントしたＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号９）においてＸで示される。
【図25】３７個の既知のＧＲＰ配列の多重配列アラインメントを示す。アスタリスクは、比較された全ての配列の中で系統的に保存されたアミノ酸を示す。
【図26】Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列、配列番号９、及びＰｒｕ ｐ ７の配列アラインメントを示す。行Ａにおいて、Ｚで示されるアミノ酸の位置は、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰとＰｒｕ ｐ ７とで異なる。行Ｂにおいて、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉とＰｒｕ ｐ ７との間で保存されているが、図２５に示すようにアラインメントされた３７個の配列間で異なるアミノ酸が示されている。行Ｃにおいて、３７個のアラインメントされた配列全ての間で保存されているアミノ酸を示す。配列番号５２は、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰ配列とＰｒｕ ｐ ７との間のコンセンサス配列であり、Ｘはこの比較において保存されていないアミノ酸を表す。
【図27】２３人のモモアレルギー対象におけるｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃ（位置２３にＬｅｕの代わりにＩｌｅを有するアイソフォーム）へのＩｇＥ結合の比較を示す。斜線対角線は１：１の勾配を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
定義
本発明の詳細を以下に示す。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の材料及び方法を本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで、好ましい材料及び方法を記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、記載から明らかになるであろう。本明細書において、単数形は、別段に文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本発明の詳細を以下に示す。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の材料及び方法を本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで、好ましい材料及び方法を記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、記載から明らかになるであろう。本明細書において、単数形は、別段に文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【0035】
「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、当技術分野においてそれらの通常の意味を有すると解釈されるべきである。別段に明記されない限り、これらの用語は本明細書では互換的に使用される。
【0036】
「単離」タンパク質とは、その天然環境から単離又は除去されたタンパク質を指す。また、ヒトの介入によって産生されており、タンパク質産生環境で共存する材料から実質的に分離されていることも示す。
【0037】
「単離タンパク質」又は「タンパク質」が本明細書で言及される場合はいつでも、これは本明細書において更に説明される単離タンパク質との配列同一性を有し、起源の全長タンパク質と機能的に同等である、当該単離タンパク質の断片又はバリアントを指し得る。「機能的に同等」は、本明細書の他の場所で更に定義される。
【0038】
本明細書において、「タンパク質」、「単離タンパク質」、「アレルゲンタンパク質」、「その断片又はバリアント」、「単離アレルゲンタンパク質の断片又はバリアント」、及び「アレルゲン」という用語は、は互換的に使用することができ、本開示の全ての文脈及び態様で想定される。
【0039】
「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が、アラインメントにおける同じ位置に同じ残基を有する程度に関連し、割合で表される。この点での「アラインメント」は、最大レベルの同一性を達成するために２つ以上の生物学的配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を一致させるプロセス又は結果、アミノ酸配列の場合、類似性の程度及び相同性の可能性を評価する目的での保存に関する。「全体的な」配列同一性を決定するために、その断片若しくはバリアントと比較したそれぞれの単離タンパク質のアミノ酸配列、又はそれらをコードする核酸配列を、アラインメントに使用することができる［４０、４１］。
【0040】
タンパク質の「長さ」は、タンパク質のアミノ酸残基の数である。
【0041】
本明細書において、タンパク質の「断片」は、参照タンパク質の全長にわたって計算されるように、参照タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する断片を意味すると解釈されるべきである。換言すると、本開示に従うと、全長参照タンパク質のアミノ酸残基の少なくとも８５％が断片に存在する。本明細書に開示されるように、参照タンパク質は、配列番号５３に従うアミノ酸配列を有し得る。結果として、本明細書に開示される「断片」は、配列番号５３の全長にわたって計算されるように、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し得る。タンパク質断片は、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー配列、又はベクター由来アミノ酸など、それらの産生の結果として追加のアミノ酸を更に含み得る。このような断片は、配列番号５３の位置２３にイソロイシンを含む。
【0042】
タンパク質の「バリアント」は、バリアントタンパク質の全長にわたって計算されるように、参照タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアントに関する。参照タンパク質は、配列番号５３に従うアミノ酸配列を有し得る。結果として、本明細書に開示される「バリアント」は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し得る。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）が提供するＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａなど、起源タンパク質とバリアントタンパク質とアラインメントし、配列同一性を計算するための多数のソフトウェアツールが市販されている。タンパク質バリアントは、ヘキサヒスチジンタグ、リンカー配列、又はベクター由来アミノ酸など、それらの産生の結果として追加のアミノ酸を更に含み得る。このようなバリアントは、配列番号５３の位置２３にイソロイシンを含む。
【0043】
本明細書において、タンパク質の「機能的に同等なタンパク質断片又はバリアント」、又はタンパク質の「機能的に同等な断片又はバリアント」に言及する場合はいつでも、これはタンパク質及びその断片又はバリアントが同等のＩｇＥ結合特性を有することを意味することが意図される。より詳細には、起源の単離アレルゲンタンパク質の機能的に同等なバリアント又は断片であるために：
（ａ）バリアント又は断片は、起源アレルゲンタンパク質に感作された代表的な患者の血清試料からのＩｇＥ抗体の、起源アレルゲンタンパク質による結合を、緩衝液のみによる模擬阻害と比較して少なくとも５０％阻害する（ＩｇＥ希釈剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。バリアント又は断片のこの特性は、例えば、実施例９に記載されるように、当技術分野で既知の任意の好適な阻害アッセイを使用することによってアッセイすることができる。
（ｂ）バリアント又は断片は、起源アレルゲンタンパク質と実質的に同じレベルでＩｇＥ抗体と結合する。結合レベルは、例えば、実施例８に記載されるように、バリアント又は断片を固相に固定化し、個々の血清のＩｇＥ反応性を測定し、測定されたＩｇＥ反応性を起源単離アレルゲンタンパク質のＩｇＥ反応性と比較することによって測定することができる。この定義の目的について、「実質的に同じレベル」とは、バリアントの結合レベルが起源タンパク質の結合レベルと最大で２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％異なることを意味すると解釈されるべきである。
（ｃ）バリアント又は断片は、ＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅＧＲＰコンセンサス配列の全ての保存アミノ酸を含む（すなわち、配列番号９、保存アミノ酸については図２６を参照されたい）。
（ｄ）（ｉ）それがバリアントである場合、バリアントは、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が交換されている、例えば、配列番号５３と比較して９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基が交換されているか、又は
（ｉｉ）それが断片である場合、断片は、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が削除されている、例えば、配列番号５３と比較して９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基が削除されているか、又は
（ｉｉｉ）それがバリアント及び断片の組み合わせである場合、バリアント及び断片の組み合わせは、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が交換若しくは削除されている。
（ａ）バリアント又は断片は、起源アレルゲンタンパク質に感作された代表的な患者の血清試料からのＩｇＥ抗体の、起源アレルゲンタンパク質による結合を、緩衝液のみによる模擬阻害と比較して少なくとも５０％阻害する（ＩｇＥ希釈剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。バリアント又は断片のこの特性は、例えば、実施例９に記載されるように、当技術分野で既知の任意の好適な阻害アッセイを使用することによってアッセイすることができる。
（ｂ）バリアント又は断片は、起源アレルゲンタンパク質と実質的に同じレベルでＩｇＥ抗体と結合する。結合レベルは、例えば、実施例８に記載されるように、バリアント又は断片を固相に固定化し、個々の血清のＩｇＥ反応性を測定し、測定されたＩｇＥ反応性を起源単離アレルゲンタンパク質のＩｇＥ反応性と比較することによって測定することができる。この定義の目的について、「実質的に同じレベル」とは、バリアントの結合レベルが起源タンパク質の結合レベルと最大で２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％異なることを意味すると解釈されるべきである。
（ｃ）バリアント又は断片は、ＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅＧＲＰコンセンサス配列の全ての保存アミノ酸を含む（すなわち、配列番号９、保存アミノ酸については図２６を参照されたい）。
（ｄ）（ｉ）それがバリアントである場合、バリアントは、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が交換されている、例えば、配列番号５３と比較して９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基が交換されているか、又は
（ｉｉ）それが断片である場合、断片は、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が削除されている、例えば、配列番号５３と比較して９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基が削除されているか、又は
（ｉｉｉ）それがバリアント及び断片の組み合わせである場合、バリアント及び断片の組み合わせは、配列番号５３と比較して最大９個のアミノ酸残基が交換若しくは削除されている。
【0044】
上述の当該単離アレルゲンタンパク質のバリアント又は断片は、本明細書の他の箇所に記載される配列番号５３の位置２３にイソロイシンを含む。
【0045】
実施例１０及び１２は、交差反応性によるアレルゲンタンパク質のＩｇＥ結合が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するアレルゲンタンパク質間で非常に類似していることを示している。互いに少なくとも８０％、例えば、９０％以上の配列同一性を有する相同タンパク質は、著しく類似したＩｇＥ反応性を示す。
【0046】
アミノ酸配列の特定の位置にあるアミノ酸残基は、当該位置のアミノ酸残基が、比較されたアラインメントタンパク質配列間で同一である場合、同じタンパク質ファミリーの異なるタンパク質間で「系統的に保存された」、時には単に「保存された」と記される。したがって、異なるタンパク質間で「保存されていない」アミノ酸残基は、比較したタンパク質配列間で同一ではない。保存されていないアミノ酸残基は、比較されるタンパク質配列にわたって「系統的に制限された」又は「系統的に制限された変動性」を有し得、これは、特定の位置におけるアミノ酸が、例えば、ＧＲＰタンパク質ファミリーからの類似のタンパク質の群の系統的比較において見出される制限された数のアミノ酸からなる群から選択されることを意味することが意図される。
【0047】
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、外来遺伝物質を別の細胞に人工的に運び、そこで複製及び／又は発現させることができるビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子に関する。
【0048】
「宿主細胞」は、目的のタンパク質、断片又はバリアントを発現するために本明細書に開示されるベクターによって形質転換されている細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞に関する。
【0049】
タンパク質「アイソフォーム」又はタンパク質「アイソフォームバリアント」は、高い類似性を有するタンパク質の群のメンバーであり、単一遺伝子の対立遺伝子バリアント又は遺伝子ファミリーの非同一メンバーに由来し、遺伝的差異から生じる。多くのアイソフォームは、同じ又は類似の生物学的機能を実行する。
【0050】
本明細書において、「Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ」及び「Ｃｕｐ ｓ ７」という用語は、同じタンパク質、すなわち、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓからの７ｋＤａ ＧＲＰタンパク質を示す。これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。同様に、「Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ」及び「Ｊｕｎ ａ ７」という用語は、同じタンパク質、すなわちＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉからの７ｋＤａ ＧＲＰタンパク質を意味し、互換的に使用される。更に、「Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ」及び「Ｃｒｙ ｊ ７」という用語は、同じタンパク質、すなわち、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａからの７ｋＤａ ＧＲＰタンパク質を意味し、本明細書において互換的に使用される。
【0051】
詳細な説明
本明細書で前述したように、本発明者らは、Ｐｒｕ ｐ ７によって媒介される重度のモモアレルギーに対する一次感作物質であると考えられる、Ｐｒｕ ｐ ７に対応するＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉タンパク質の新規アイソフォームを今回特定した（実施例８に提示した結果を参照されたい）。天然起源からの高純度のＰｒｕ ｐ ７の単離は、真に特異的な抗Ｐｒｕ ｐ ７ウサギ抗血清を得るための前提条件であった。Ｐｒｕ ｐ ７タンパク質は、Ｐｒｕ ｐ ３と同様の生化学的特性を有するので、Ｐｒｕ ｐ ３の市販の調製物におけるＰｒｕ ｐ ７混入の実証によって証明されるように［３４］、Ｐｒｕ ｐ ３を除去するための生体特異的親和性吸着、及び他の共精製タンパク質を除去するための逆相クロマトグラフィ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＲＰＣ）のステップなど、本目的のために精巧な精製方法を開発した（実施例１を参照されたい）。高度に精製された天然Ｐｒｕ ｐ ７調製物を用いてウサギを免疫化することによって得られた抗Ｐｒｕ ｐ ７抗血清を更に使用して、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉｃａ ｊａｐｏｎｉｃａ、及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ花粉抽出物の溶出画分においてＰｒｕ ｐ ７相同体を検出できる。以前に本明細書で言及したＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓからの以前に報告された１４ｋＤａのＢＰ１４タンパク質を考慮して予想され得たこととは対照的に、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ抗体は、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物、並びにＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａの花粉抽出物において７ｋＤａタンパク質（すなわち、ＢＰ－１４の半分のサイズのタンパク質）のみを検出した。特定されると、これらのタンパク質は、質量分析による分析並びに生化学的及び免疫学的特性評価のために均一に精製され得る。
本明細書で前述したように、本発明者らは、Ｐｒｕ ｐ ７によって媒介される重度のモモアレルギーに対する一次感作物質であると考えられる、Ｐｒｕ ｐ ７に対応するＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉タンパク質の新規アイソフォームを今回特定した（実施例８に提示した結果を参照されたい）。天然起源からの高純度のＰｒｕ ｐ ７の単離は、真に特異的な抗Ｐｒｕ ｐ ７ウサギ抗血清を得るための前提条件であった。Ｐｒｕ ｐ ７タンパク質は、Ｐｒｕ ｐ ３と同様の生化学的特性を有するので、Ｐｒｕ ｐ ３の市販の調製物におけるＰｒｕ ｐ ７混入の実証によって証明されるように［３４］、Ｐｒｕ ｐ ３を除去するための生体特異的親和性吸着、及び他の共精製タンパク質を除去するための逆相クロマトグラフィ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＲＰＣ）のステップなど、本目的のために精巧な精製方法を開発した（実施例１を参照されたい）。高度に精製された天然Ｐｒｕ ｐ ７調製物を用いてウサギを免疫化することによって得られた抗Ｐｒｕ ｐ ７抗血清を更に使用して、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉｃａ ｊａｐｏｎｉｃａ、及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ花粉抽出物の溶出画分においてＰｒｕ ｐ ７相同体を検出できる。以前に本明細書で言及したＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓからの以前に報告された１４ｋＤａのＢＰ１４タンパク質を考慮して予想され得たこととは対照的に、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ抗体は、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物、並びにＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａの花粉抽出物において７ｋＤａタンパク質（すなわち、ＢＰ－１４の半分のサイズのタンパク質）のみを検出した。特定されると、これらのタンパク質は、質量分析による分析並びに生化学的及び免疫学的特性評価のために均一に精製され得る。
【0052】
Ｎ末端配列決定データ、各調製物の異なる酵素消化からのＭＳ／ＭＳデータ、及び反復プロセスにおけるＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａからの中断／不完全なＥＳＴ配列を組み合わせることにより、７ｋＤａタンパク質の完全なアミノ酸配列は、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉから一緒に推定／解明（ｐｕｚｚｌｅｄ）され得る。Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａからのＰｒｕ ｐ ７相同体の完全な配列は、ＥＳＴデータベースにおけるＭＳ／ＭＳデータを分析することによって決定された。３つの天然Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉アレルゲン間の免疫学的類似性は、実施例１０で証明され、考察される。
【0053】
本プロジェクトの別の必要条件は、正確に折りたたまれた免疫反応性組換えＧＲＰアレルゲンを実用的に有用な量で産生するための方法論の開発であった。これは、ｒＰｒｕ ｐ ７及びｒＣｕｐ ｓ ７の産生のための様々な発現系、ベクタークローニングバリアント、及び発酵戦略の調査を伴う。異なる標準的な手順に従ういくつかの最初の試みは、生化学的及び免疫学的に欠陥のあるタンパク質産物を生成したが、最終的に精巧に作られた方法論は、品質と及び収量の両方に関して非常に成功した。
【0054】
本明細書で確立及び開示されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰの配列に基づいて、組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生され、天然精製タンパク質と同様の生化学的特性及びＩｇＥ反応性を有することが示された。組換えタンパク質は、Ｐｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合を阻害し、モモタンパク質Ｐｒｕ ｐ ７とＣｕｐ ｓ ＧＲＰとの間に交差反応性があり、後者が一次感作物質として作用し得ることを示す。Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの天然調製物を、ＨＣＤ ＭＳ3（第３レベルの多段階断片化の高エネルギー衝突解離）、及びＥＴＤ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、電子移動解離）ＨＣＤ ＭＳ3評価を使用して詳細に分析し、新規アミノ酸アイソフォームバリアントを明らかにした（実施例１４～１５）。
【0055】
このタンパク質の特定及びそれに続くその組換え産生、並びにいくつかのそのアイソフォームの特定は、１型アレルギーの新しくかつ改善された診断への道を築く。重度のモモアレルギーとＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉症との関連が確立されているため、現在開示されている知見は、花粉及び食物アレルギーの両方の診断、治療、及び／又は予防に応用することができるであろう。
【0056】
本明細書で言及したように、何年にもわたって、花粉からジベレリン制御性タンパク質ファミリーのアレルゲンタンパク質を特定し、単離し、特徴付ける多くの試みがあった。このタンパク質ファミリーの花粉アレルゲンの重要性についての推測された理解にもかかわらず、最近まで、かかるタンパク質の完全な配列を単離及び決定することに成功した者は誰もいなかった。本明細書で言及したように、配列情報の一部は以前に報告されているが、完全な配列、タンパク質の構造及びそれが同じタンパク質ファミリーの他のメンバーとどのように比較されるかを理解するための、並びに診断及び治療用途のための組換えタンパク質を生成するための必要条件は、Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇらによる出版物［３９］の前にはまだ明らかにされていなかった。
【0057】
最近まで進展しなかったことは、花粉からこのタンパク質ファミリーのタンパク質を特定及び単離することの難しさを示している。特に、本発明者らは、この問題を解決する方式を発見した。例として、本明細書に記載の新規アイソフォームバリアントを含むアレルゲンタンパク質の完全な詳細の供給をもたらす機能的な実験プロトコル、並びに単離及び特徴付けのプロセスを通して得られた発見を取得して適用する方式を特定するには、実質的な発明の要点が必要であった。しかしながら、最終的に、アレルゲンタンパク質は、本明細書で更に示され、記載されるように、単離され、評価され、利用された。
【0058】
したがって、本明細書では、配列番号５３に従うアミノ酸配列を含む単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントであって、位置２３にイソロイシンを含み、かつ少なくとも８５％の配列番号５３との配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントが提供される。更に、当該配列番号５３との配列同一性は、少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。
【0059】
以前に単離されたタンパク質［３９］は、本明細書において、相同性の高いタンパク質であるＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、すなわちタンパク質アイソフォームバリアントａ（配列番号４）及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、すなわちタンパク質アイソフォームバリアントｂ（配列番号５））、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ（配列番号６、本明細書ではＪｕｎ ａ ＧＲＰａとも称する）、並びにＣｒｙ ｊ ＧＲＰ（配列番号８）によって表され、例示されている。
【0060】
ここで、以前に記載されたタンパク質の更なる新規アイソフォームバリアントが本明細書に開示され、当該アイソフォームバリアントは位置２３にイソロイシンを含む（配列番号５２、配列番号９）。本明細書で前述したように、本開示まで、位置２３のアミノ酸は厳密に保存されており、植物種にかかわらず全ての既知のＧＲＰタンパク質においてロイシンであると一般的に理解されていた。しかしながら、驚くべきことに、位置２３にイソロイシンを有する一部のＧＲＰタンパク質のアイソフォームバリアントの存在が今回初めて示された。そのような新規アイソフォームバリアントは、本明細書の他の箇所で示され、説明されるように、Ｉ型アレルギーの診断のための非常に有用な代替物であることが示された。実施例１７において確認されるように、このようなバリアントは、他の以前に記載されたタンパク質と同様に、高いＩｇＥ結合活性を有し、それによって診断目的に有効であることが証明された。これは、Ｉ型アレルギーの診断の分野における大きな必要性を満たし、個体におけるこの型のアレルギーを特定するための代替手段を提供する。
【0061】
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの以下の新規アイソフォームバリアントが今回特定されており、本明細書に開示される（表１も参照されたい）：
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、アイソフォームバリアントｃ（配列番号５３）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｄ、アイソフォームバリアントｄ（配列番号５４）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｅ、アイソフォームバリアントｅ（配列番号５５）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｆ、アイソフォームバリアントｆ（配列番号５６）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｇ、アイソフォームバリアントｇ（配列番号５７）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｈ、アイソフォームバリアントｈ（配列番号５８）。
配列番号５３～配列番号５８は、当該配列の位置２３にＬｅｕの代わりにＩｌｅを有するアイソフォームバリアントを含む。
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、アイソフォームバリアントｃ（配列番号５３）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｄ、アイソフォームバリアントｄ（配列番号５４）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｅ、アイソフォームバリアントｅ（配列番号５５）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｆ、アイソフォームバリアントｆ（配列番号５６）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｇ、アイソフォームバリアントｇ（配列番号５７）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｈ、アイソフォームバリアントｈ（配列番号５８）。
配列番号５３～配列番号５８は、当該配列の位置２３にＬｅｕの代わりにＩｌｅを有するアイソフォームバリアントを含む。
【0062】
また、本明細書では、以下も言及される：
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｉ、アイソフォームバリアントｉ（配列番号５９）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｊ、アイソフォームバリアントｊ（配列番号６０）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｋ、アイソフォームバリアントｋ（配列番号６１）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｌ、アイソフォームバリアントｌ（配列番号６２）。
配列番号５９～配列番号６２は、当該配列の位置２３にＬｅｕを有するアイソフォームバリアントを含む。
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｉ、アイソフォームバリアントｉ（配列番号５９）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｊ、アイソフォームバリアントｊ（配列番号６０）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｋ、アイソフォームバリアントｋ（配列番号６１）；
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｌ、アイソフォームバリアントｌ（配列番号６２）。
配列番号５９～配列番号６２は、当該配列の位置２３にＬｅｕを有するアイソフォームバリアントを含む。
【0063】
更に、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰの以下の新規アイソフォームバリアント（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａ）が今回特定されており、本明細書に開示される（表１も参照されたい）。このアイソフォームバリアントをＪｕｎ ａ ＧＲＰｂ、アイソフォームバリアントｂ（配列番号６３）と称する。そのようなアイソフォームバリアントはまた、本明細書の他の箇所に記載されるようなＩ型アレルギーの分野における使用を提示する。
【0064】
Ｐｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＧＳＳＦＣＤＳＫＣＧＶＲＣＳＫＡＧＹＱＥＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＳＧＴＹＧＮＫＤＥＣＰＣＹＲＤＬＫＮＳＫＧＮＰ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号１（Ｐｒｕ ｐ ７）
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号４（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ）
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号５（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ）
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＫＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号６（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ）
Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＨＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＮＣＶＰＰＧＴＹＧＮＥＤＳＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号８（Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ）
ＧＳＳＦＣＤＳＫＣＧＶＲＣＳＫＡＧＹＱＥＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＳＧＴＹＧＮＫＤＥＣＰＣＹＲＤＬＫＮＳＫＧＮＰ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号１（Ｐｒｕ ｐ ７）
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号４（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ）
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号５（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ）
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＫＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号６（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ）
Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰのアミノ酸配列は、以下の配列を含む：
ＡＨＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＮＣＶＰＰＧＴＹＧＮＥＤＳＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨ ６０
ＫＣＰ ６３
配列番号８（Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ）
【0065】
以下の実施例１３に記載及び示されるように、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ－Ｐｒｕ ｐ ７ ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号５２）が設計されており、本明細書に開示される。配列番号５２に従う当該コンセンサス配列において、本明細書に開示される異なるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰの一部（すなわち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰ）の間でアミノ酸が異なる位置、並びに本明細書に開示されるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰとモモＧＲＰ（すなわち、Ｐｒｕ ｐ ７）との間でアミノ酸が異なる位置が、Ｘで示される（図２６）。図２６の行Ａにおいて、本明細書に開示されるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰとモモＧＲＰ（すなわち、Ｐｒｕ ｐ ７）との間でアミノ酸が異なる位置が、Ｚで示される。
【0066】
【表1】
【0067】
したがって、本開示は、単離アレルゲンタンパク質であって、当該タンパク質が、配列番号５２に従う以下のアミノ酸配列を含み、
【0068】
【表2】
残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一であるが、ただし、位置２３がイソロイシンを含むことを条件とする、単離アレルゲンタンパク質を提供する。
【0069】
特に、本開示は、単離アレルゲンタンパク質であって、当該タンパク質が、配列番号５２に従う以下のアミノ酸配列を含み、
【0070】
【表3】
【0071】
表３に列挙されるアミノ酸残基は、配列番号５２の位置Ｘにおいて系統的に制限された変動性を有するアミノ酸残基であることに留意されたい。
【0072】
位置２３にイソロイシンを含有し、かつ、それぞれ少なくとも８５％の配列番号５３～５８、又は配列番号６３、又は配列番号６４のうちのいずれか１つとの配列同一性を有する、単離アレルゲンタンパク質、又はその機能的に同等なタンパク質断片若しくはバリアントが更に提供される。更に、当該配列番号５３～６４との配列同一性は、それぞれ少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。
【0073】
本明細書において言及されるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ科からの例示的な単離タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるように最大８つのアミノ酸位置においてのみ互いに異なるが、ただし、本開示によって包含されるアイソフォームバリアントが位置２３に（すなわち、当該８つの位置のうちの１つに）イソロイシンを含むことを条件とする。上記のファミリーメンバーの一部の間の相違性及び類似性を示す配列アラインメントを図２４に示す。本明細書の実施例１０において、少なくともこれらの位置のうちの７つでアミノ酸残基が異なっていても、それらの意図された目的のためのタンパク質の機能性に影響を及ぼさないことが証明された。したがって、それにより、アミノ酸配列におけるある程度の構造的柔軟性が示され、これは、配列番号５３によって示される単離タンパク質の機能的に同等なバリアント又は断片が想定され、本開示の文脈において有用であることが証明されることを意味する。本明細書に提示される配列番号５３に従う単離タンパク質の機能的に同等なバリアント又は断片の定義は、本明細書の他の箇所に記載される。本明細書中に開示される単離タンパク質の機能的に同等なバリアント又は断片は、配列番号５３の位置２３にイソロイシンを含む。
【0074】
したがって、本明細書ではまた、単離アレルゲンタンパク質であって、当該タンパク質が、配列番号９に従う以下のアミノ酸配列を含み、
【0075】
【表4】
【0076】
本明細書において、配列番号９又は配列番号５２における位置Ｘ（のうちのいずれか）が「任意のアミノ酸」を含み得ると述べる場合、この表現は、任意の天然又は非天然起源アミノ酸を意味することを意図する。特に、本明細書では、配列番号９又は配列番号５２における位置Ｘ（のうちのいずれか）が任意の天然起源アミノ酸を含み得ることが開示される。配列番号９及び配列番号５２における位置２３は、本開示のアイソフォームバリアントにおいてイソロイシンを含む。
【0077】
配列番号９は、本明細書で特定及び考察された単離タンパク質を表すＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列の例とみなすことができ、当該最大８つのアミノ酸位置（位置２、１８、２３、３１、３４、４１、４６、及び５２）において、アミノ酸残基が、任意の他のアミノ酸について１つ以上の位置において異なり得る、すなわち交換され得るが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、かつ、かかるタンパク質が、本明細書の他の箇所に記載される意図された目的に関して、起源タンパク質と機能的に同等である活性を維持することを条件とする。しかしながら、本明細書に開示されるアイソフォームバリアントでは、位置２３はイソロイシンであり、したがって、異ならない。また、本明細書では、同じ配列類似性を有するが、追加又は代替のアミノ酸残基が異なる、配列番号９の他のバリアントも想定されており、当該バリアントは、起源タンパク質と同じ機能的活性を維持する、すなわち、当該バリアントは、アミノ酸が起源タンパク質、又は上記の８つの位置において本明細書で更に記載されるように異なっているタンパク質と機能的に同等である。本明細書には、本明細書の他の箇所で定義される配列番号９に従う単離タンパク質の機能的に同等な断片も提供される。
【0078】
実施例１３に示されるように、当該８つのアミノ酸位置Ｘにおいて、アミノ酸は、系統的に制限されたアミノ酸からなる群から選択されることが想定される。
【0079】
図２５によれば、配列番号９の各位置Ｘにおいて、以下であるアミノ酸が、系統的に好ましい：
位置２：Ａ Ｅ Ｓ Ｄ Ｔ Ｌ Ｙ
位置１８：Ｙ Ｌ Ｉ Ｖ Ｆ Ｍ Ｒ
位置３１：Ｅ Ｄ Ｑ Ａ Ｇ Ｓ Ｋ
位置３４：Ｑ Ｎ Ｈ Ｋ
位置４１：Ｙ Ｆ Ａ Ｓ
位置４６：Ｅ Ｖ Ａ Ｑ
位置５２：Ｄ Ｅ Ｎ
位置２：Ａ Ｅ Ｓ Ｄ Ｔ Ｌ Ｙ
位置１８：Ｙ Ｌ Ｉ Ｖ Ｆ Ｍ Ｒ
位置３１：Ｅ Ｄ Ｑ Ａ Ｇ Ｓ Ｋ
位置３４：Ｑ Ｎ Ｈ Ｋ
位置４１：Ｙ Ｆ Ａ Ｓ
位置４６：Ｅ Ｖ Ａ Ｑ
位置５２：Ｄ Ｅ Ｎ
【0080】
位置Ｘにおいて上に開示される好ましいアミノ酸残基は全て、系統的に制限された相互の変動性を有し、図２５にアラインメントされた既知のＧＲＰ配列において見られるものと一致している。加えて、本明細書に開示される新規の知見によれば、配列番号９の位置２３は、本開示によって包含されるアイソフォームバリアントではイソロイシン（Ｉ）である。
【0081】
更に、本明細書に開示されるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰタンパク質の配列によれば、配列番号９の各位置Ｘにおいて、以下であるアミノ酸が、系統的に好ましい：
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｌ若しくはＩであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮである。
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｌ若しくはＩであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮである。
【0082】
当該上に開示されるアミノ酸残基は、系統的に制限された変動性を有し、本明細書に開示されるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰアイソフォームバリアント、すなわち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｄ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｅ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｆ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｇ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｈ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｉ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｊ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｋ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｌ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰｂに見出されるものと一致し、これらは全て表１に列挙されている。当該アイソフォームバリアントのうち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰを図２４のアラインメントに示す。
【0083】
したがって、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大６つ、例えば、５、４、３、２、又は１つが、任意のアミノ酸を含むが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、若しくはＱのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、若しくはＱのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0084】
特に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、又は１つが、任意のアミノ酸を含むが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、若しくはＱのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
残りの位置Ｘにおいて、アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、若しくはＱのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0085】
また、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大６つ、例えば、５、４、３、２、又は１つが、任意のアミノ酸を含むが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、
当該残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
当該残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0086】
特に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、又は１つが、任意のアミノ酸を含むが、ただし、ＸがＣではないことを条件とし、
当該残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
当該残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0087】
より詳細には、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、位置Ｘにおいて、当該アミノ酸は、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択される単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0088】
更に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、及び／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮである、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、及び／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮである、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0089】
更に、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、又は１つは、
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択され、
残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
位置２におけるＸが、Ｑ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、若しくはＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｍ、若しくはＲのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｇ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｑ、若しくはＫのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ、Ｙ、Ｆ、若しくはＳのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ａ、Ｑのうちのいずれか１つから選択され、かつ／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ、Ｎ、Ｄ、若しくはＥのうちのいずれか１つから選択される、アミノ酸の群から選択され、
残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0090】
より詳細には、本明細書では、単離アレルゲンタンパク質であって、配列番号９に従うアミノ酸配列を含み、配列番号９の当該位置Ｘのうちの最大４つ、例えば、３、２、又は１つは、
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、及び／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
位置２におけるＸが、Ｑ若しくはＨであり、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ若しくはＬであり、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ若しくはＥであり、
位置３４におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
位置４１におけるＸが、Ａ若しくはＹであり、
位置４６におけるＸが、Ｖ若しくはＳであり、及び／又は
位置５２におけるＸが、Ｈ若しくはＮであり、
残りの位置Ｘにおいて、当該アミノ酸が、配列番号５３の対応する位置におけるアミノ酸と同一である、単離アレルゲンタンパク質が提供される。
【0091】
詳細には、本開示は、それぞれ配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、又は配列番号６４に従うアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、単離アレルゲンタンパク質を更に提供する。
【0092】
本明細書に記載のタンパク質はまた、起源配列に化学的に修飾されたアミノ酸を付加することができ、これは、側鎖が化学的に修飾されているアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、フルオロフォア又は放射性標識などのシグナル伝達部分を含むように修飾され得る。側鎖は、チオール、カルボン酸、又はアミノ基などの新しい官能基を含むように修飾され得る。翻訳後修飾されたアミノ酸も、化学的に修飾されたアミノ酸の定義に含まれる。
【0093】
本明細書を通して開示される単離タンパク質、そのバリアント又は断片は、組換え的に産生され得る。一般に、研究、診断又は他の用途におけるアレルゲンタンパク質の実用的な利用は、組換え形態でのそれらの利用可能性によって大いに促進される。アレルゲンタンパク質が特定され、そのアミノ酸配列が確立されると、それは周知の方法を使用して組換えタンパク質として産生することができる［４２］）。しかしながら、教科書的な例として挙動しない困難な場合において、有用な量の機能性タンパク質を得るという目標を達成するために、発現系構成、培養方法、及び／又は精製戦略を広範に適応させるか、更には新たに開発する必要性があり得る。かかる広範な適応をどのように達成するかは、当業者にとってさえ容易に予見することはできない。タンパク質をコードする遺伝子は、アレルゲン起源物質から調製されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの形態でクローン化するか、又は所望のＤＮＡ配列に従って合成することができる。同じアミノ酸を指定する最大６つの異なるコドンを有する遺伝暗号の冗長性により、所与のアミノ酸配列は、多数の同義ＤＮＡ配列によってコード化することができる。必要に応じて、タンパク質への機能的な追加又は修飾は、合成遺伝子の設計を通じて、部位特異的変異誘発によって、又はクローニング戦略の一部として導入することができる。目的のアレルゲンをコードする遺伝子は、様々な異なる発現ベクターのうちのいずれかにクローン化され、様々な原核生物又は真核生物の発現宿主のうちのいずれかに導入される［４２］。一般的な発現宿主には、グラム陰性菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ又はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来する昆虫細胞株、並びに哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【0094】
組換えタンパク質は、可溶性若しくは不溶性の形態で細胞内に発現されるか、又は培養培地に分泌され得る。組換えタンパク質の回収及び精製は、様々な周知の方法又はそれらの組み合わせによって実施することができる。一般的なクロマトグラフィ技術には、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＭＡＣ）、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィが含まれる。
【0095】
本明細書に提示される単離タンパク質は、組換え的に産生される場合、特定の目的のために意図的に修飾され得、それにより、例えば、抗体結合特性に関してタンパク質に機能的に影響を与えることなく、非天然起源タンパク質をもたらす。非天然起源タンパク質は、発現レベル又は溶解性を高めるために別のタンパク質と融合された組換えタンパク質であり得る。かかる融合パートナーの例には、チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、ＴＲＸ）、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）、及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）が含まれる。別の例は、タンパク質を培養培地に分泌することを可能にするシグナルペプチドの添加であり、そこからそれを可溶性形態で容易に回収することができる。非天然起源タンパク質はまた、短いペプチドタグが親和性精製を可能にする目的で当該タンパク質に遺伝的に移植されている組換えタンパク質であり得る。かかるペプチドタグの例には、金属イオン親和性を付与するためのヘキサヒスチジン、又は抗ヘマグルチニン、抗ｃ－ｍｙｃ若しくは抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体などの特定の抗体のためのペプチドエピトープが含まれる。
【0096】
組換えタンパク質へのかかる付加物の分離及び削除を可能にするために、部位特異的タンパク質分解切断のための短いペプチド配列を、目的のタンパク質と融合パートナー又はペプチドタグとの間に挿入することができる。タンパク質分解酵素のかかる標的部位の例には、エンテロキナーゼのＤＤＤＤＫ、第Ｘａ因子のＩＥＧＲ、ＴＥＶプロテアーゼのＥＮＬＹＦＱＡ、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるインビボプロセシングのためのＫｅｘ２／Ｓｔｅ１３のＥＫＲＥＡＥＡＥＦが含まれる。かかる標的配列のいくつかのアミノ酸残基は、切断後に、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌発現の場合、ＥＡＥＦＥＦ又はその一部が残存し得る。
【0097】
本明細書に開示される単離タンパク質、断片又はバリアントをコードする単離核酸分子もまた本明細書に提供される。単離核酸は、配列番号１０によってコードされ得る。配列番号１０は、コンセンサスＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅアミノ酸配列（すなわち、配列番号９）をコードする縮重ＤＮＡ配列であり、これは、本明細書に記載のＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｃ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰ配列、すなわち、ＩＵＰＡＣ多義性コードに従った同義コドン及びバリアントを含む、本明細書に開示される単離タンパク質に基づき（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｕｐａｃ．ｏｒｇ／）、配列番号９の位置Ｘにおけるアミノ酸に対応するヌクレオチドは、以下のアミノ酸群：
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、をコードするように選択されている。
位置２におけるＸが、Ｑ又はＨのうちのいずれか１つから選択され、
位置１８におけるＸが、Ａ、Ｉ又はＬのうちのいずれか１つから選択され、
位置２３におけるＸが、Ｉであり、
位置３１におけるＸが、Ｋ又はＥのうちのいずれか１つから選択され、
位置３４におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択され、
位置４１におけるＸが、Ａ又はＹのうちのいずれか１つから選択され、
位置４６におけるＸが、Ｖ又はＳのうちのいずれか１つから選択され、かつ
位置５２におけるＸが、Ｈ又はＮのうちのいずれか１つから選択される、をコードするように選択されている。
【0098】
配列番号１０に従うコンセンサスＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ核酸配列は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａアミノ酸配列（すなわち、配列番号４）から開始し、逆翻訳され、同義コドンを含み、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ～ｊ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ、及び／又はＣｒｙ ｊ ＧＲＰｂがＣｕｐ ｓ ＧＲＰａアミノ酸配列と異なる８つのアミノ酸位置を考慮して構築された。８つの可変アミノ酸位置をコードするヌクレオチドは、以下の太字のテキストでマークアップされる。
【0099】
配列番号１０、すなわちＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅコンセンサス核酸配列：
【0100】
【表5】
Ｎ＝Ｔ、Ｃ、Ａ、又はＧ；
Ｒ＝Ａ又はＧ；
Ｈ＝Ｔ、Ｃ、又はＡ；
Ｙ＝Ｔ又はＣ；
Ｍ＝Ｃ又はＡ；
Ｗ＝Ｔ又はＡ；
Ｓ＝Ｇ又はＣ；
Ｂ＝Ｃ、Ｇ、又はＴ；
Ｋ＝Ｇ又はＴ；及び
Ｄ＝Ａ、Ｇ又はＴ。
ただし、コドン１８におけるＮＹＮが、Ａｌａ（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ）、Ｌｅｕ（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ）、又はＩｌｅ（ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ）のうちのいずれか１つをコードすることを条件とし、アイソフォームバリアントがアミノ酸位置２３にイソロイシンを含む場合、コドン２３（すなわち、ヌクレオチド位置６７～６９）がＡＴＨを含むことを条件とする。
【0101】
本明細書には、以下の核酸配列も提供される：
配列番号５０、すなわち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａが逆翻訳され、同義コドンを考慮する：
配列番号５０、すなわち、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａが逆翻訳され、同義コドンを考慮する：
【0102】
【表6】
【0103】
【表7】
【0104】
配列番号５０及び配列番号５１のコドン２３（すなわち、ヌクレオチド位置６７～６９）は、アイソフォームバリアントがアミノ酸配列位置２３にイソロイシンを含む場合、ＡＴＨを含む。
【0105】
本明細書には、配列番号１０、５０、若しくは５１のうちのいずれか１つに従う核酸配列、又は少なくとも８５％のそれとの配列同一性、例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％のそれとの配列同一性を有する配列を含む、核酸分子も提供され、当該配列のコドン２３はイソロイシンをコードする。
【0106】
本明細書に開示される単離核酸分子を含む、ベクター又は発現ベクターも提供される。単離核酸分子は、本明細書に開示される単離タンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードし得、したがって、本明細書に開示される任意の核酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
【0107】
加えて、本明細書に記載のベクター又は発現ベクターを含む、単離宿主細胞も提供される。本明細書で前述したように、当該ベクター又は発現ベクターは、本明細書の他の場所に開示されているように、単離タンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする核酸分子を含む。
【0108】
アレルゲン組成物を産生するための方法であって、アレルゲン抽出物及び／又は少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に、本明細書に記載の単離タンパク質又はその機能的に同等な断片若しくはバリアントを追加するステップを含む、方法が提供される。また、かかる方法によって得られるアレルゲン組成物も提供される。かかるアレルゲン組成物は、本明細書に提示されるように、単離タンパク質、その断片、又はバリアントに「スパイク」することができる。かかるアレルゲン組成物は、アレルゲン抽出物、又は本明細書に提示される単離タンパク質を含まないか若しくは低い含有量でそれを有する精製された天然又は組換えアレルゲン成分の混合物であり得、単離タンパク質、その断片又はバリアントは、ＩｇＥが他の方法ではアレルゲン組成物と結合しないか、又は不十分に結合する患者からのＩｇＥを結合するために、当該アレルゲン組成物に追加される（すなわち、アレルゲン組成物が「スパイク」される）。したがって、この態様は、かかる組成物を産生するための方法に関し、方法は、アレルゲン抽出物（任意に他の成分をスパイクすると言及したように）又は精製された天然又は組換えアレルゲン成分の混合物などのアレルゲン組成物に当該タンパク質を追加するステップを含む。また、本明細書に記載の単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントと、アレルゲン抽出物及び／又は少なくとも１つの精製アレルゲン成分と、を含む、アレルゲン組成物も提供される。
【0109】
また、本明細書では、１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための、単離タンパク質又はその機能的に同等な断片若しくはバリアントの使用も提供される。
【0110】
また、本明細書では、当該１型アレルギー症状がＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって誘発される場合の使用も提供される。加えて、当該１型アレルギーが、モモ、アプリコット、プラム、柑橘類果物又はザクロなどの食物によって誘発される症状を伴う花粉関連食物アレルギーである場合の使用も提供される。
【0111】
ヒト又は動物検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出又は測定は、いくつかの異なる方式で実行され得るが、通常、問題のアレルゲンと結合する抗体を捕捉する最初のステップと、それに続く非結合抗体を除去するための洗浄ステップ、ＩｇＥ検出試薬を適用するステップ、非結合のかかる試薬を除去するための洗浄ステップ、及びＩｇＥ検出試薬からのシグナルを生成して記録する最終ステップが含まれる。アレルゲンは、アレルゲン特異的抗体を捕捉するために固体又は可溶性の支持体に固定化するか、又はかかる複合体のその後の捕捉及び定量化のために溶液中の抗体と複合体を形成することができる。アレルゲン検出試薬は、通常、レポーター物質又は蛍光法又は比色法で定量可能な生成物の形成を触媒することができる酵素のいずれかと結合したモノクローナル抗体である。アレルゲン特異的抗体を測定するためのアッセイには、一次応答単位を抗体濃度単位に変換することを可能にする較正システムも含まれる。同じアッセイ原理が他のアイソタイプのアレルゲン特異的抗体の測定にも適用されるが、唯一の違いは使用される検出試薬の特異性である。
【0112】
更に、本明細書では、１型アレルギーのインビトロ診断又は評価のための方法であって、１型アレルギーを有すると疑われる対象からの免疫グロブリン含有体液試料を、本明細書に開示の単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアントと接触させるステップと、当該試料において、当該タンパク質、断片若しくはバリアントと特異的に結合する抗体、例えば、ＩｇＥ抗体の存在を決定するステップと、を含み、当該タンパク質と特異的に結合する当該試料中の抗体の存在が、当該対象における１型アレルギーに関して有益である、方法が提供される。ＩｇＥ抗体が当該試料中に存在し、当該タンパク質と特異的に結合する一実施形態では、これは、当該対象におけるＩ型アレルギーを示す。
【0113】
体液試料は、対象からの血液又は血清試料であり得、当該体液試料は、当該対象試料が、単離タンパク質、そのバリアント、又は断片と特異的に結合するＩｇＥ抗体を含むかを決定するために、単離タンパク質、又はその断片若しくはバリアント、又は当該タンパク質、又はその断片若しくはバリアントを含む組成物と接触させる。
【0114】
本明細書で言及される任意の単離タンパク質の断片又はバリアントは、起源タンパク質と機能的に同等である天然又は人工的な断片又はバリアントであり得る。
【0115】
キットオブパーツであって、可溶性又は固体支持体に固定化された、単離アレルゲンタンパク質、又は断片若しくはバリアントを含み、当該キットが、任意に、検出試薬及び／又は使用説明書を更に含む、キットオブパーツが更に提供される。固体支持体は、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、及びプラスチックの群から選択することができ、並びに／又はマイクロアレイチップ、若しくは当技術分野で利用可能な任意の他の好適な固体支持体である。
【0116】
本明細書の他の場所で言及されるように、キットは、固定化されたタンパク質と結合したＩｇＥ抗体などの抗体と結合することができる検出剤も更に含み得る。かかる検出剤は、例えば、免疫アッセイの分野で既知である、色素、フルオロフォア又は酵素などの検出可能な標識で標識された抗ＩｇＥ抗体であり得る。
【0117】
タンパク質及びペプチドの固定化に好適な支持体は当技術分野で周知であり、本明細書では、この態様において、タンパク質又はタンパク質断片の免疫原性に実質的な程度で悪影響を及ぼさない任意の支持体が含まれる。この文脈において、「固定化された」という用語は、特定の支持体に好適な任意の種類の付着物であり得ることが理解される。単離タンパク質又はタンパク質断片は、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ、又は別の固相ベースのイムノアッセイなどの診断方法での使用に好適な固体支持体に固定化してもよい。代替的に、タンパク質又はタンパク質断片は、溶液中の１つ以上の樹状突起構造など、溶液中の天然又は合成ポリマー構造に固定化され得る。
【0118】
標識又は標識要素が提供されている、本明細書に記載の単離タンパク質、その断片又はバリアントもまた本明細書に提供される。したがって、本明細書には、光発光標識、蛍光標識又はリン光標識、化学発光標識又は放射線ルミネセンス標識などの発光標識が提供されているタンパク質又はタンパク質断片若しくはバリアントも提供される。親和性機能などの特定され得る要素で誘導体化された単離タンパク質、その断片若しくは誘導体もまた、本開示に含まれる。タンパク質及びペプチドの標識のための親和性機能は当技術分野で周知であり、当業者は、ビオチンなどの任意の好適な機能を選択することができるであろう。
【0119】
１型アレルギーの治療又は予防に使用するための、単離タンパク質又はその機能的に同等な断片若しくはバリアントもまた、本明細書に提供される。１型アレルギーは、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされ得、及び／又はモモ、アプリコット、プラム、柑橘類果物、又はザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉関連食物アレルギーであり得る。同様に、１型アレルギーの治療又は予防のための医薬の製造において、本明細書に開示される単離タンパク質又はその機能的に同等な断片若しくはバリアントの使用も提供される。１型アレルギーは、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされ得、及び／又はモモ、アプリコット、プラム、柑橘類果物、又はザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉関連食物アレルギーであり得る。
【0120】
本明細書では、薬学的組成物であって、単離タンパク質又はその機能的に同等な断片若しくはバリアントと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物が更に提供される。
【0121】
本明細書における薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤は、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又はカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを指す。各成分は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「薬学的に許容される」ものである必要がある。また、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織又は臓器と接触して使用するのに好適である必要がある。
【0122】
１型アレルギーの治療又は予防のための方法であって、その治療及び予防を必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に記載の単離タンパク質、その断片若しくはバリアント、アレルゲン組成物、又は当該単離タンパク質、その断片若しくはバリアントを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法も本明細書に提供される。免疫療法におけるタンパク質、そのバリアント又は断片の使用には、例えば成分分解免疫療法が含まれる［４３］。単離タンパク質は、その天然の形態で、又は天然のタンパク質と同様の生化学的及び免疫学的特性を示す組換え形態で使用することができる。単離タンパク質は、化学的又は遺伝的に生成される修飾形態で使用され得る。単離タンパク質への修飾の例には、タンパク質の断片化、トランケーション、タンデマー化（tandemerization）若しくは凝集、内部セグメントの削除、アミノ酸残基の置換、ドメインの再配置、又はジスルフィド架橋の破壊若しくは別の高分子構造若しくは他の低分子量化合物へのその結合による三次構造の少なくとも一部の破壊が含まれるが、それらに限定されない。
【0123】
本明細書に開示される薬学的組成物の任意の好適な投与方法は、単離タンパク質の投与の目的に応じて使用され得る。投与の用量及びタイミングは、治療される対象に好適であるとして医師によって決定されるであろう。
【0124】
本明細書の他の場所で言及されているように、タンパク質はその天然起源から精製することができる。それはまた、組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、又は当業者に既知である方法によって、又は本出願に記載されるように化学的に合成され得る。
【0125】
本明細書では、当該１型アレルギーが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉によって引き起こされる１型アレルギーであり、かつ／又はモモ、アプリコット、プラム、柑橘類果物、又はザクロなどの果物の摂取によって誘発される症状を伴うＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉関連食物アレルギーである、方法が更に提供される。
【0126】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明を限定するものとみなされるべきではない。
【0127】
実験セクション
表
以下の表１は、本開示の一部である配列表による配列番号、及び当該配列の対応する定義／名称を特定する。
表
以下の表１は、本開示の一部である配列表による配列番号、及び当該配列の対応する定義／名称を特定する。
【0128】
【表8】
【0129】
表２：ａ）ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、ｂ）ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアイソフォームバリアント、ｃ）ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ、及びｄ）ｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰのＭＳ／ＭＳ分析で特定されたペプチド配列のリスト。列１は、ペプチドの配列を示し、列２は、対応する配列番号を示し、列３は、統計的有意性値－ｌｏｇＰを示し、列４は、ペプチドの実験的に決定した質量（Ｍ／Ｚ－１．００７９４）をＤａ単位で示し、列５は、生物学的又は実験的修飾について補正した、実験的に決定した質量（ＰＴＭ）を示し、列６は、ペプチドの理論的に計算した質量を示し、列７～８は、ペプチドが表す成熟タンパク質のアミノ酸配列における開始位置及び終了位置を示し、列９は、分析したペプチド内に存在する修飾を示す。ＭＳ／ＭＳ分析の前に、全てのシステイン残基がプロピオンアミド残基に修飾された結果、システイン残基当たり７１．０３７１２Ｄａの質量が増加した。いくつかのペプチドでは、以下の列９に示すように、末端グルタミン酸のアミド化が発生し、０．９８４Ｄａの質量の減少を引き起こした。このＭＳ／ＭＳ分析の文脈では、生物学的又は実験的なアミノ酸修飾はＰＴＭと称される。以下に示すペプチドにおいて、位置２３のロイシン（Ｌ）はロイシン又はイソロイシン（Ｉ）残基を表し、表２ｂに示すペプチドにおける位置１８のロイシン（Ｌ）も同様である。
【0130】
【表9】
【0131】
【表10】
【0132】
【表11】
【0133】
【表12】
【0134】
表３は、配列番号５２の位置Ｘにおいて系統的に制限された変動性を有するアミノ酸、すなわち、２２個の可変位置を有するＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ－Ｐｒｕ ｐ ７ ＧＲＰコンセンサス配列を特定する。
【0135】
【表13】
【0136】
位置１、３、４、７、８、１０、１１、１７、１９、２０、４４、５１、５９、及び６０におけるアミノ酸は、本明細書に開示されるＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｊ．ａｓｈｅｉ及びＣ．ｊａｐｏｎｉｃａからのＧＲＰタンパク質の異なるアイソフォームバリアント間で保存されているが、Ｐｒｕ ｐ ７の対応する位置におけるアミノ酸とは異なる。当該位置は、図２６の行ＡではＺで示されるが、配列番号５２ではＸで示される。
【0137】
位置２、１８、２３、３１、３４、４１、４６、及び５２におけるアミノ酸は、本明細書に開示され、言及される上記のＧＲＰタンパク質間で異なる。当該位置は、配列番号９及び配列番号５２の両方においてＸで示される。
【0138】
本開示によって包含されるアイソフォームバリアントは、コンセンサス配列（配列番号９及び配列番号５２）の位置２３にＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【実施例】
【0139】
別段に明記されない限り、全てのフィルタ、クロマトグラフィ媒体、及び機器は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手した。
【0140】
実施例１：缶詰のモモからの天然Ｐｒｕ ｐ ７の生成及び分析
天然Ｐｒｕ ｐ ７の精製
天然Ｐｒｕ ｐ ７は、４つのクロマトグラフィステップを使用して缶詰のモモから精製した。換言すると、缶詰のモモを１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）の台所用ブレンダーで混合し、４℃で粉砕球（Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇｅｒ ＭＴＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）と撹拌しながら２時間インキュベートした。抽出物を遠心分離によって清澄化し、濾過し、１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに負荷した。洗浄及び溶出は、１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で、それぞれ０．１５及び０．５ＭのＮａＣｌの均一濃度ステップで実施した（図１）。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、顕著な７ｋＤａバンドを含むその画分をプールして、２０ｍＭのＮａＰＯ4、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ3（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製グレード（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ、ｐｇ）サイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）カラムに適用した。溶出を平衡化緩衝液（図２）を用いて実施し、顕著な７ｋＤａバンドを含む画分をプールした。
天然Ｐｒｕ ｐ ７の精製
天然Ｐｒｕ ｐ ７は、４つのクロマトグラフィステップを使用して缶詰のモモから精製した。換言すると、缶詰のモモを１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）の台所用ブレンダーで混合し、４℃で粉砕球（Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇｅｒ ＭＴＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）と撹拌しながら２時間インキュベートした。抽出物を遠心分離によって清澄化し、濾過し、１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに負荷した。洗浄及び溶出は、１３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で、それぞれ０．１５及び０．５ＭのＮａＣｌの均一濃度ステップで実施した（図１）。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、顕著な７ｋＤａバンドを含むその画分をプールして、２０ｍＭのＮａＰＯ4、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ3（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５調製グレード（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ、ｐｇ）サイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）カラムに適用した。溶出を平衡化緩衝液（図２）を用いて実施し、顕著な７ｋＤａバンドを含む画分をプールした。
【0141】
Ｐｒｕ ｐ ７と同様のサイズ及び等電点を有するＰｒｕ ｐ ３の残留量を特異的に除去するために、生物特異的親和性吸着ステップを適用した。この目的のために、Ｐｒｕ ｐ ３抗体に対する独自のモノクローナル抗体をＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムと結合させた。ＳＥＣプールを、２０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ3で平衡化した抗Ｐｒｕ ｐ ３親和性カラムに適用した。平衡化緩衝液で溶出した後（図３）、未結合の物質を収集し、０．１％ＴＦＡで平衡化したＳｏｕｒｃｅ １５ ＲＰＣ逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）カラムに適用した（図４ａ）。結合タンパク質は、０～５５％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し（図４ｂ）、純粋な７ｋＤａのバンドを含む画分を図４ａに示すようにプールし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上で２０ｍＭのＭＯＰＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）に脱塩した。
【0142】
ｎＰｒｕ ｐ ７の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）
天然Ｐｒｕ ｐ ７のプールは、トリプシン又はキモトリプシンのいずれかによる還元、アルキル化、及び酵素的切断の後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。データ分析は、これらの消化から得られたＭＳスペクトルの組み合わせで行った。データは、Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ データベースの分類ＩＤ ３３０９０に対して分析し、精製したタンパク質がＰｒｕ ｐ ７（配列番号１）であることを確認した。Ｐｒｕ ｐ ３又は他のモモタンパク質の痕跡は調製物中に検出されなかった。
天然Ｐｒｕ ｐ ７のプールは、トリプシン又はキモトリプシンのいずれかによる還元、アルキル化、及び酵素的切断の後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。データ分析は、これらの消化から得られたＭＳスペクトルの組み合わせで行った。データは、Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ データベースの分類ＩＤ ３３０９０に対して分析し、精製したタンパク質がＰｒｕ ｐ ７（配列番号１）であることを確認した。Ｐｒｕ ｐ ３又は他のモモタンパク質の痕跡は調製物中に検出されなかった。
【0143】
結論として、実施例１は、天然Ｐｒｕ ｐ ７の精製、及びＭＳ／ＭＳによるその同一性の確認について記載する。続いて、この調製物を、Ｐｒｕ ｐ ７に対するポリクローナルウサギ抗体の産生に使用した。
【0144】
実施例２：組換えＰｒｕ ｐ ７の発現及び精製
Ｐｒｕ ｐ ７をコードする合成遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ構築物を調製し、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。形質転換株を増殖させ、誘導して、３リットルバイオリアクタ（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ，Ｓｋｏｇａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で組換えＰｒｕ ｐ ７を産生した。培地を遠心分離により収集し、上清を回収した。ＨＡｃでｐＨを４．５に調整し、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｆガラスマイクロファイバフィルタを通して濾過した後、上清を５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに適用した。組換えタンパク質は、同じ緩衝液中で直線０～１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した（図５）。ｒＰｒｕ ｐ ７を含む画分を収集し、５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムでＳＥＣにより更に精製した（図６ａ）。ｒＰｒｕ ｐ 含む画分をプールし、０．７２ｍｇ-1ｍＬ ｃｍ-1の計算された吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって濃度を決定した。アレルゲン調製物の純度及び同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６ｂ）及び質量分析によって検証した。実験的ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ試験（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、以前に記載されたように調整し［４４］、免疫学的活性は、関連する患者の血清試料を使用して評価した。
Ｐｒｕ ｐ ７をコードする合成遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ構築物を調製し、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。形質転換株を増殖させ、誘導して、３リットルバイオリアクタ（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ，Ｓｋｏｇａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で組換えＰｒｕ ｐ ７を産生した。培地を遠心分離により収集し、上清を回収した。ＨＡｃでｐＨを４．５に調整し、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｆガラスマイクロファイバフィルタを通して濾過した後、上清を５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに適用した。組換えタンパク質は、同じ緩衝液中で直線０～１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した（図５）。ｒＰｒｕ ｐ ７を含む画分を収集し、５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムでＳＥＣにより更に精製した（図６ａ）。ｒＰｒｕ ｐ 含む画分をプールし、０．７２ｍｇ-1ｍＬ ｃｍ-1の計算された吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって濃度を決定した。アレルゲン調製物の純度及び同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図６ｂ）及び質量分析によって検証した。実験的ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ試験（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、以前に記載されたように調整し［４４］、免疫学的活性は、関連する患者の血清試料を使用して評価した。
【0145】
結論として、実施例２は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｒＰｒｕ ｐ ７の発現及び組換えタンパク質の精製を記載する。組換えＰｒｕ ｐ ７を使用して、ｎＰｒｕ ｐ ７に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体を特徴付け、関連する患者の血清中のＰｒｕ ｐ ７に対するＩｇＥ反応性を研究することができる。
【0146】
実施例３：Ｐｒｕ ｐ ７に対するポリクローナルＩｇＧ抗体の生成及び利用
実施例１に記載したように調製した精製したｎＰｒｕ ｐ ７を使用して、Ｐｒｕ ｐ ７に対するポリクローナルウサギ抗体を産生した。ウサギを抗原の４回の追加免疫注入を含むプロトコルに従って、ｎＰｒｕ ｐ ７で免疫した。免疫化の前に、免疫前の血清試料をウサギから採取し、その後の実験で対照として使用した。全ての手順は、地域倫理承認の下で、Ａｇｒｉｓｅｒａ ＡＢ（Ｖａｎｎａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実施された。
実施例１に記載したように調製した精製したｎＰｒｕ ｐ ７を使用して、Ｐｒｕ ｐ ７に対するポリクローナルウサギ抗体を産生した。ウサギを抗原の４回の追加免疫注入を含むプロトコルに従って、ｎＰｒｕ ｐ ７で免疫した。免疫化の前に、免疫前の血清試料をウサギから採取し、その後の実験で対照として使用した。全ての手順は、地域倫理承認の下で、Ａｇｒｉｓｅｒａ ＡＢ（Ｖａｎｎａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実施された。
【0147】
得られた抗Ｐｒｕ ｐ ７抗血清は、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化されたｒＰｒｕ ｐ ７及びＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物の両方に対して一連の希釈で試験した。抗血清は、最高希釈率（１：８０００）でも、前血清と比較して固定化ｒＰｒｕ ｐ ７との強いＩｇＧ結合を示し（図７ａ）、Ｐｒｕ ｐ ７反応性ＩｇＧの含有を確認した。更に、血清はＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉抽出物との結合を示し（図７ｂ）、Ｐｒｕ ｐ ７と交差反応する今まで未知であったタンパク質の存在を示唆する。したがって、以下の実施例に示すように、抗Ｐｒｕ ｐ ７抗血清をプローブとして使用して、Ｐｒｕ ｐ ７のこの潜在的なＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉相同体を追跡し、精製することができる。
【0148】
実施例４：新規Ｐｒｕ ｐ ７関連Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉アレルゲンの精製
実施例３において、Ｐｒｕ ｐ ７に対して産生されたポリクローナルウサギＩｇＧ抗体が、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉の固定化タンパク質抽出物と結合することが示された。同じ抗体を利用して、Ｐｒｕ ｐ ７と交差反応するＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質を特定、精製、及び特性付けすることができた。
実施例３において、Ｐｒｕ ｐ ７に対して産生されたポリクローナルウサギＩｇＧ抗体が、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉の固定化タンパク質抽出物と結合することが示された。同じ抗体を利用して、Ｐｒｕ ｐ ７と交差反応するＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質を特定、精製、及び特性付けすることができた。
【0149】
換言すると、Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉（Ａｌｌｅｒｇｏｎ，Ｖａｌｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を５０ｍＭのＮａＡｃ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．５）で、４℃で７２時間撹拌しながら抽出し、遠心分離によって清澄化し、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｆガラスマイクロファイバフィルタで濾過し、５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで脱塩した（図８）。空隙容量で溶出するタンパク質含有画分をプールし、５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムに負荷した。溶出を同じ緩衝液中で０～１ＭのＮａＣｌの直線勾配で実施した（図９ａ）。９つの選択した画分をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化し、抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合活性をアッセイし（図９ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図９ｃ）。抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの最高の結合を示し、顕著な７ｋＤａタンパク質バンドを含む画分７～９を、図９ａに示すようにプールし、ＳＰセファロースＨＰカラムに濃縮した。濃縮したプールは、２０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）、２５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇカラムでのＳＥＣによって更に精製した。溶出を同じ緩衝液で実施した（図１０ａ）。８つの選択した画分をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に固定化し、上述のように抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ結合活性を試験し（図１０ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図１０ｃ）。抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの最も高い結合は、７ｋＤａで単一の明確なバンドを示した画分３～５で見られた。したがって、図１０ａに示すように画分３～５をプールし、この広範に精製したＰｒｕ ｐ ７関連Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質を以下に記載するように生化学的及び免疫学的に分析した。精製したＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓタンパク質は、Ｐｒｕ ｐ ７と同等の見かけ上の分子量を示した（図１０ｄ）。
【0150】
結論として、実施例４は、一連のクロマトグラフィステップ及び実施例３に記載の抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ抗体を使用して、以下でＣｕｐ ｓ ＧＲＰと称される、新規Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質をどのように精製したかを記載する。
【0151】
実施例５：Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列の解明
実施例４で精製した７ｋＤａのＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質の同一性及び一次構造を確立するために、それをＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、又はＬｙｓ－Ｃのいずれかで酵素切断した。ＭＳデータ分析は、７ｋＤａタンパク質の３つの消化物から得られたスペクトルの組み合わせで行った。
実施例４で精製した７ｋＤａのＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質の同一性及び一次構造を確立するために、それをＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、又はＬｙｓ－Ｃのいずれかで酵素切断した。ＭＳデータ分析は、７ｋＤａタンパク質の３つの消化物から得られたスペクトルの組み合わせで行った。
【0152】
ＮＣＢＩタンパク質データベースの記録は、ＭＳデータとの確証的で完全な配列一致を提供しなかった。したがって、ＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ、発現配列タグ）データベースに存在するヌクレオチド配列の仮想上翻訳に対して検索を行った。このデータベースにおいて最も一致したのは、記録ＢＹ８７８０７９（配列番号２）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列であった（図１１ａ）。このＥＳＴ配列は、位置３０２～３０４での終止コドンによって分離された２つの仮想上アミノ酸配列（図１１ｂ）に翻訳された、中断されたオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置４４～３９７）を含んでいた。ＭＳ／ＭＳによって特定した４つのペプチドは、図１１ｂに示すように、ＢＹ８７８０７９の仮想上アミノ酸配列と完全に一致し、２つは終止コドンのうちのいずれかの側にある。この観察により、位置３０２～３０４の終止コドンが配列決定エラーの結果である可能性が生じた。
【0153】
この概念を支持して、中断されたＢＹ８７８０７９由来配列とＰｒｕ ｐ ７のアミノ酸配列との間のアラインメントは、位置３０２～３０４での終止コドンにわたって伸びる相同性を示した（示さず）。実際に、ＴＧＡ終止コドンにおけるＡがＴ又はＣのいずれかに変更された場合、その代わりにシステイン残基をコードし、対応する位置でＰｒｕ ｐ ７と完全に一致する。ＢＹ８７８０７９（配列番号３）のかかる修正を導入した後、ＭＳ／ＭＳデータの改善された全体的な一致が得られ、精製したＣｕｐ ｓ ＧＲＰタンパク質が、修正されたＢＹ８７８０７９に由来する仮想上アミノ酸配列の残基８７に対応する位置に実際にシステインを有していたことを示す（図１１ｂ）。
【0154】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの分析についてＰＥＡＫＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの完全な６３残基のアミノ酸配列（図１１ｃ、配列番号４）は、４つの反復ステップで決定され得る。Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ配列は、図１１ｃに示すように、更に４つの位置で修正されたＢＹ８７８０７９由来配列とは異なった。ＭＳ／ＭＳ分析は、修正されたＢＹ８７８０７９記録によってコードされた配列の残基５５～１１７に対応する、このアミノ酸配列の完全な適用範囲を示した。この配列の一部である特定したペプチドの例を表２ａに示す。
【0155】
更に、新たに決定したＣｕｐ ｓ ＧＲＰ配列を標的配列として使用するＭＳ／ＭＳデータの再分析は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ配列の２つの位置：位置１８（Ａｌａ／Ｌｅｕ）及び位置５２（Ａｓｎ／Ｈｉｓ）に多型が存在することを明らかにした（図１１ｃ、表２ｂ）。位置１８にＡｌａ及び位置５２にＡｓｎを含む最初に決定したＣｕｐ ｓ ＧＲＰ配列は、以下ではＣｕｐ ｓ ＧＲＰａと称され、代替アミノ酸、すなわち位置１８にＬｅｕ及び位置５２位にＨｉｓの両方を含む配列は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰｂ（配列番号５）と称される。Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂに加えて、２つの代替アミノ酸のうちのいずれか一方又は他方を含む２つの他のアイソフォームの存在が考えられる。
【0156】
ＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９によってコードされたアミノ酸配列には、予測した２４残基のシグナルペプチドが含まれた（図１１ｂにおける下線付き配列）。加えて、ＭＳ／ＭＳによって特定したシグナルペプチドとＣｕｐ ｓ ＧＲＰペプチド１（図１１ｂにおけるＰｅｐ １）に一致する配列との間に、一致するＣｕｐ ｓ ＧＲＰペプチドが特定されなかった３０個のアミノ酸の伸展が存在した。
【0157】
それにもかかわらず、精製したＣｕｐ ｓ ＧＲＰがかかるＮ末端ペプチドを含むかを決定するために、タンパク質を、［４５］に記載されるように、エドマン分解によるＮ末端配列決定に供した。タンパク質の最初の４つのアミノ酸残基は、Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ－Ａｓｐとして特定され、ＭＳ／ＭＳによって特定されたＣｕｐ ｓ ＧＲＰペプチド１のＮ末端部分と正確に一致した。したがって、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの前駆体は、ＢＹ８７８０７９由来配列の残基２５～５４に対応する部分を含み得るが、それは切断され、成熟Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰタンパク質中にはもはや存在しない。
【0158】
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ調製の完全性及びタンパク質の新規に決定したアミノ酸配列の証拠は、試料の還元及びアルキル化の後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得られ、その無傷の分子量を決定した。分析は、全てのシステイン残基が減少した非修飾タンパク質の分子量６８２８．９８Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝７６８２．４３で優勢なピークが明らかになった。これは、全てのシステイン残基が減少したＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ配列（配列番号４）について計算したモノアイソトピック分子量と完全に一致する。
【0159】
Ｎ末端配列及び全質量ＭＳ分析は、ＭＳ／ＭＳ分析によって得られたアミノ酸配列がＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉から精製した７ｋＤａタンパク質の完全なアミノ酸配列を網羅していることを確認した。ＰｆａｍシグネチャについてのＣｕｐ ｓ ＧＲＰのこのアミノ酸配列の分析（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）により、このタンパク質が、ＧＡＳＡタンパク質ファミリーとしても知られるジベレリン制御タンパク質ファミリーに属することが確認された。ＧＲＰ配列は植物界全体で高度に保存されており、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ配列の両方がＰｒｕ ｐ ７と６８％の配列同一性を示した（図１１ｄ）。
【0160】
結論として、実施例５は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列がＭＳ／ＭＳ及びＮ末端配列決定によってどのように決定したかを記載する。ＭＳ分析により、無傷タンパク質の質量を決定し、計算した理論上質量と完全に一致することを見出した。６３残基配列は、２つの位置に代替アミノ酸を有し、その天然状態におけるタンパク質の４つの可能なアイソフォームをもたらすことを示した。
【0161】
実施例６：Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのＰｒｕ ｐ ７関連タンパク質の精製及びアミノ酸配列決定
上記の実施例４に記載したＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製のために作成した手順は、２つの他のＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａの花粉からの対応するタンパク質の精製に使用した。
上記の実施例４に記載したＣｕｐ ｓ ＧＲＰの精製のために作成した手順は、２つの他のＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａの花粉からの対応するタンパク質の精製に使用した。
【0162】
Ｊ．ａｓｈｅｉからの花粉を抽出し、記載した精製及びモニタリングステップに供した。第３の精製ステップでは、ＳＥＣを使用して、以前のカチオン交換クロマトグラフィステップからの画分の濃縮プールに存在するタンパク質を分離した。ＳＥＣカラムから溶出した３つの顕著なピーク（図１２ａ）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる個々の画分の分析（図１２ｂ）は、３つのピークの各々に明確に異なるタンパク質バンドを明らかにした。３つのピークを図１２ａに示すように別々にプールし、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相と結合させ、ウサギ抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧ抗体と結合する能力を分析した（図１２ｃ）。
【0163】
ピーク２は、約７ｋＤａに優勢なタンパク質バンドを含むことを見出し、強い抗体結合活性を示した。以下ではＪｕｎ ａ ＧＲＰと称される、Ｊ．ａｓｈｅｉ花粉からのこのタンパク質調製物は、以下に記載するように生化学的及び免疫学的に分析した。
【0164】
同様に、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａからの花粉の抽出物を調製し、脱塩し、カチオン交換クロマトグラフィに供した。抗体結合活性を示す画分をプールし、ＳＥＣに適用した（図１３ａ）。このＳＥＣクロマトグラムは、Ｊ．ａｓｈｅｉ花粉抽出物で得られたものよりも複雑な外観を示した。選択した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗Ｐｒｕ ｐ ７ ＩｇＧの結合について分析した。分析は、画分２及び３において約７ｋＤａのタンパク質バンドを明らかにし（図１３ｂ、レーン２及び３）、これらの画分も強い抗体結合活性を示した（図１３ｃ）。結果に基づいて、画分２及び３は図１３ａの括弧で示したように、プールした。以下ではＣｒｙ ｊ ＧＲＰと称される、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのこのタンパク質調製物は、以下に記載するように生化学的及び免疫学的に分析した。
【0165】
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ調製物は、実施例５に記載されるように、試料調製後にＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳ分析によって分析した。この場合も、得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの最適なデータベースの致はＥＳＴ記録ＢＹ８７８０７９であった（図１１ａ、配列番号２）。図１４ａは、ＢＹ８７８０７９の修正バージョンを示し、実施例５において特定したように、位置３０２～３０４の誤ったＴＧＡ終止コドンは、システインコドンＴＧＹ（配列番号３）によって置き換えられ、Ｙは、ＩＵＰＡＣ多義性コードシステム［４６］で定義されるようにＣ又はＴを表す。図１４ｂには、修飾ＢＹ８７８０７９（配列番号６）のヌクレオチド４４～３９４によってコードされるアミノ酸配列を示し、ＭＳ／ＭＳによって特定したＪｕｎ ａ ＧＲＰペプチドが下を配置した。
【0166】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの分析にＰＥＡＫＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰの完全なアミノ酸配列（図１４ｃ、配列番号６）を４つの反復ステップで決定され得る。Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ配列は、図１４ｃに示すように、５つの位置で修正されたＢＹ８７８０７９由来配列とは異なった。ＭＳ／ＭＳ分析は、修正されたＢＹ８７８０７９記録によってコードされた配列の残基５５～１１７に対応する、このアミノ酸配列の完全な適用範囲を示した。この配列を表す特定したペプチドの例を表２ｃに示す。分析において多型は検出されず、配列はＰｒｕ ｐ ７と６７％の同一性を示した（図１４ｄ）。
【0167】
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ調製物の完全性の証拠、及び新規に決定したアミノ酸配列の確証は、試料をＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ＴＣＥＰ）で還元した後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得た。分析により、分子量６８２８．０３Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝６８２９．０４で優勢なピークが明らかになった。これは、配列番号６の全てのシステイン残基が減少したＪｕｎ ａ ＧＲＰ配列で計算したモノアイソトピック質量と完全に一致する。
【0168】
Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ調製物は、実施例５に記載されるように、試料調製後にＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器でＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの最適なデータベースの致は、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ雄球花からのｃＤＮＡ配列である、ＥＳＴ記録ＢＹ９００４８０であった（図１５ａ、配列番号７）。図１５ｂには、ＢＹ９００４８０のヌクレオチド位置１５～３６５に及ぶオープンリーディングフレームの翻訳されたアミノ酸配列を示し、ＭＳ／ＭＳによって特定したＣｒｙ ｊ ＧＲＰペプチドを下に配置した。タンパク質全体を表す、ＭＳ／ＭＳによって特定した選択Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰペプチドのリストを表２ｄに示す。Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰの完全なアミノ酸配列を図１５ｃ、配列番号８に示す。分析において多型は検出されず、配列はＰｒｕ ｐ ７と６８％の同一性を示した（図１５ｄ）。
【0169】
Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＪｕｎ ａ ＧＲＰの場合と同様に、Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰは、最も一致するデータベース記録によってコードされたアミノ酸配列の最初の５４残基を欠いていた。この場合も、最初の２４残基は予測したシグナルペプチドを含み、続く３０残基はタンパク質成熟中に切断されたプロペプチドを表すと結論付けた。
【0170】
Ｃｒｙ ｊ ＧＲＰ調製物の完全性の証拠、及び新規に決定したアミノ酸配列の確証は、試料をＴＣＥＰで還元した後に実行した非切断タンパク質のＭＳ分析によって得た。分析により、分子量６８９４．９５Ｄａに対応する、ｍ／ｚ＝６８９５．９６で大きなピークが明らかになった。これは、配列番号８の全てのシステイン残基が減少したＣｒｙ ｊ ＧＲＰ配列で計算したモノアイソトピック分子量質量と完全に一致する。
【0171】
３つのＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉由来ＧＲＰ配列、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰは、９０～９８％の配列同一性を共有し（図１６ａ～ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて同じ電気泳動移動度を有する（図１６ｃ）。
【0172】
結論として、実施例６は、Ｊ．ａｓｈｅｉ及びＣ ｊａｐｏｎｉｃａからのＰｒｕ ｐ ７関連花粉タンパク質Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰの精製、アミノ酸配列決定、並びに質量決定をそれぞれ記載する。
【0173】
実施例７：２つの組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰアイソフォームのクローニング及び精製
実施例５からのＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂのアミノ酸配列をコードするように設計した合成遺伝子を、発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａにクローン化し、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。２つの組換えタンパク質は、実施例２においてｒＰｒｕ ｐ ７について記載しものと同じ手順を使用して発現及び精製した。ＭＳ／ＭＳ分析により、精製した組換えタンパク質の同一性及び完全性を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＣｕｐ ｓ ＧＲＰの２つの組換えアイソフォーム、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、及びｒＰｒｕ ｐ ７の比較は、見かけ上の分子量が７ｋＤａで、４つのタンパク質調製物のほぼ同一の電気泳動的外観を示した（図１７）。
実施例５からのＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂのアミノ酸配列をコードするように設計した合成遺伝子を、発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａにクローン化し、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ－３３に形質転換した。２つの組換えタンパク質は、実施例２においてｒＰｒｕ ｐ ７について記載しものと同じ手順を使用して発現及び精製した。ＭＳ／ＭＳ分析により、精製した組換えタンパク質の同一性及び完全性を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＣｕｐ ｓ ＧＲＰの２つの組換えアイソフォーム、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ、及びｒＰｒｕ ｐ ７の比較は、見かけ上の分子量が７ｋＤａで、４つのタンパク質調製物のほぼ同一の電気泳動的外観を示した（図１７）。
【0174】
結論として、実施例７は、実施例５において決定したアミノ酸配列バリアントのうちの２つを表す、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの２つの組換えアイソフォームのクローニング及び精製を記載する。
【0175】
実施例８：ｒＰｒｕ ｐ ７と比較した天然及び組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰのＩｇＥ結合活性
４４人のモモアレルギー対象の血清中の精製したｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析して、ｒＰｒｕ ｐ ７と比較した（図１８）。試験した４４個の血清のうち、４３個（９８％）がｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して、３８個（８６％）がｒＰｒｕ ｐ ７に対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵA／Ｌ）を示した。ｒＰｒｕ ｐ ７に対して陰性であると試験された６つの血清のうち５つはｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して陽性ＩｇＥ応答を示した。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｒＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合のレベルは有意に相関しており（ｒ＝０．６８）、結合の中央値はｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰよりも約２倍高かった。分析は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７が免疫学的に関連していることを示したが、Ｐｒｕ ｐ ７はＣｕｐ ｓ ＧＲＰと比較して不完全なエピトープ提示を保有することも示した。
４４人のモモアレルギー対象の血清中の精製したｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析して、ｒＰｒｕ ｐ ７と比較した（図１８）。試験した４４個の血清のうち、４３個（９８％）がｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して、３８個（８６％）がｒＰｒｕ ｐ ７に対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵA／Ｌ）を示した。ｒＰｒｕ ｐ ７に対して陰性であると試験された６つの血清のうち５つはｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して陽性ＩｇＥ応答を示した。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｒＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合のレベルは有意に相関しており（ｒ＝０．６８）、結合の中央値はｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰよりも約２倍高かった。分析は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ及びＰｒｕ ｐ ７が免疫学的に関連していることを示したが、Ｐｒｕ ｐ ７はＣｕｐ ｓ ＧＲＰと比較して不完全なエピトープ提示を保有することも示した。
【0176】
産生した２つの組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰタンパク質の免疫学的活性及び確実性を評価するために、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰを用いたＩｇＥ結合活性の比較を、１９人のモモアレルギー対象の血清を使用するＩｍｍｕｎｏＣＡＰで実行した。図１９ａ及び１９ｂに示すデータは、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰと比較したｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ（配列番号３）及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂ（配列番号４）の両方の本質的に同等のＩｇＥ結合活性（それぞれｒ＝０．９８及びｒ＝０．９９）、ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａよりもｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂとのわずかに高いＩｇＥ結合を明らかにした。結果は、組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰタンパク質の構造的及び免疫学的確実性の両方の証拠を提供する。
【0177】
結論として、実施例８は、ヒトＩｇＥ抗体による認識に関しても、ウサギＩｇＧ抗体によって最初に確立したモモアレルゲンＰｒｕ ｐ ７とＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰとの間の免疫学的関連を確認する。第２に、Ｐｒｕ ｐ ７よりもＣｕｐ ｓ ＧＲＰと結合するＩｇＥレベルが高いことは、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰが一次感作物質として作用し、Ｐｒｕ ｐ ７と交差反応するＩｇＥ抗体を誘発し得ることを示唆する。
【0178】
実施例９：Ｐｒｕ ｐ ７とＣｕｐ ｓ ＧＲＰとの間の交差反応性
Ｐｒｕ ｐ ７とＣｕｐ ｓ ＧＲＰとの間の免疫学的関連を更に特徴付けするために、ＩｇＥ競合実験を実行した。４つのＰｒｕ ｐ ７反応性ヒト血清を、２０μｇ／ｍＬの最終濃度でｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ若しくはｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂと個別に、又は陰性対照としての役割を果たす同じ容量比率の希釈緩衝液のみと組み合わせた。抗体／抗原複合体形成を可能にするために室温で２時間インキュベートした後、全ての試料をＩｍｍｕｎｏＣＡＰによってＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合について試験した。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂによるＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合の阻害レベルを、希釈緩衝液対照の割合として計算した。
Ｐｒｕ ｐ ７とＣｕｐ ｓ ＧＲＰとの間の免疫学的関連を更に特徴付けするために、ＩｇＥ競合実験を実行した。４つのＰｒｕ ｐ ７反応性ヒト血清を、２０μｇ／ｍＬの最終濃度でｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ若しくはｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂと個別に、又は陰性対照としての役割を果たす同じ容量比率の希釈緩衝液のみと組み合わせた。抗体／抗原複合体形成を可能にするために室温で２時間インキュベートした後、全ての試料をＩｍｍｕｎｏＣＡＰによってＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合について試験した。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂによるＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合の阻害レベルを、希釈緩衝液対照の割合として計算した。
【0179】
実験結果を図２０に示す。試験した４つの血清のうちの３つにおいて、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂの両方が、ｒＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合を本質的に完全に阻害した。また、第４の血清において、ｒＰｒｕ ｐ ７とのＩｇＥの結合は、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰによって完全に打ち負かされたが、ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂは約８０％の阻害を引き起こした。別の対照実験において、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰが非関連のカバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ ｖ １とのＩｇＥ結合に対して阻害効果を発揮しないこと、Ｐｒｕ ｐ ７とのＩｇＥ結合に対するその効果の特異性を確信 させることを確認した。
【0180】
結論として、ＩｇＥ競合実験は、Ｐｒｕ ｐ ７及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰとのＩｇＥ結合における相関が、他の理由による共変動ではなく、２つのタンパク質に共通するエピトープ構造の抗体認識によって本当に引き起こされることを示す。
【0181】
実施例１０：Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ、Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ、及びＣｒｙ ｊ ＧＲＰ間の免疫学的類似性
この研究において特定及び精製した３つの天然Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰ間の免疫学的類似性の程度は、比較ＩｇＥ結合分析で評価した。各樹木アレルゲンをＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相と結合させ、アッセイを使用して、１８人のモモアレルギー対照の血清中のＩｇＥ抗体結合を測定した。比較を図２１ａ～図２１ｃに示す。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｎＪｕｎ ａ ＧＲＰとのＩｇＥ結合のレベル（図２１ａ）は、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰとわずかに高い結合傾向（中央値レベル比１．１２）で、非常に高い相関関係があることを見出した（ｒ＝０．９８）。ｎＣｕｐ ａ ＧＲＰ及びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ（図２１ｂ）はまた、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰとわずかに高い結合ではあるが（中央値レベル比１．４６）、ＩｇＥ結合と強い相関関係を示し（ｒ＝０．８４）、血清を分析において使用した対象におけるＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉に対する一次感作の欠如を反映している可能性がある。ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ及びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰの比較（図２１ｃ）は、ＩｇＥ結合において同様の相関（ｒ＝０．８７）を示したが、再びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰとのわずかに低い結合を伴った（中央値レベル比１．２８）。
この研究において特定及び精製した３つの天然Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰ間の免疫学的類似性の程度は、比較ＩｇＥ結合分析で評価した。各樹木アレルゲンをＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相と結合させ、アッセイを使用して、１８人のモモアレルギー対照の血清中のＩｇＥ抗体結合を測定した。比較を図２１ａ～図２１ｃに示す。ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びｎＪｕｎ ａ ＧＲＰとのＩｇＥ結合のレベル（図２１ａ）は、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰとわずかに高い結合傾向（中央値レベル比１．１２）で、非常に高い相関関係があることを見出した（ｒ＝０．９８）。ｎＣｕｐ ａ ＧＲＰ及びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰ（図２１ｂ）はまた、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰとわずかに高い結合ではあるが（中央値レベル比１．４６）、ＩｇＥ結合と強い相関関係を示し（ｒ＝０．８４）、血清を分析において使用した対象におけるＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ花粉に対する一次感作の欠如を反映している可能性がある。ｎＪｕｎ ａ ＧＲＰ及びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰの比較（図２１ｃ）は、ＩｇＥ結合において同様の相関（ｒ＝０．８７）を示したが、再びｎＣｒｙ ｊ ＧＲＰとのわずかに低い結合を伴った（中央値レベル比１．２８）。
【0182】
この例は、ＧＲＰタンパク質ファミリーからの４つのタンパク質（＞９０％の配列同一性）が非常に類似したＩｇＥ反応性を有することを示す。これは、アミノ酸配列において小さな変動があるにもかかわらず、ＩｇＥ反応性が本質的に同じままであるという、高い配列同一性の他の小さなアレルゲンタンパク質について行われた観察を支持する。更に実施例１２を参照されたく、これは、交差反応性によるＩｇＥ反応性が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するタンパク質間で非常に類似していることも示す。
【0183】
実施例１１：ヒノキ花粉症を有する対象間のＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対する感作の有病率
８８人のヒノキ花粉感作対象（ｔ２３＞０．１ｋＵA／Ｌ）の血清中の精製したｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析した（図２２）。これらの血清のうち、２８個（３２％）がｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵA／Ｌ）を示した。血清のうちの１３個（１５％）において、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びヒノキ花粉抽出物と同様のレベルのＩｇＥを観察し、このサブセットにおける対象のヒノキ花粉感作におけるＣｕｐ ｓ ＧＲＰの優勢な役割を示す。
８８人のヒノキ花粉感作対象（ｔ２３＞０．１ｋＵA／Ｌ）の血清中の精製したｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰと結合するＩｇＥ抗体を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰで分析した（図２２）。これらの血清のうち、２８個（３２％）がｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対して検出可能なＩｇＥ応答（≧０．１ｋＵA／Ｌ）を示した。血清のうちの１３個（１５％）において、ｎＣｕｐ ｓ ＧＲＰ及びヒノキ花粉抽出物と同様のレベルのＩｇＥを観察し、このサブセットにおける対象のヒノキ花粉感作におけるＣｕｐ ｓ ＧＲＰの優勢な役割を示す。
【0184】
分析は、ヒノキ花粉感作対象の約３分の１が、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰに相同なタンパク質を含む食物に対してアレルギー反応のリスクを与える感作プロファイルを有することを示唆する。かかる個体は、好適で代表的なＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰを含むＩｇＥ試験を使用して特定することができる。
【0185】
より詳細には、モモアレルギーに関して選択されていない花粉症患者の分子分析は、これらの個体のうちの３分の１のみがＣｕｐ ｓ ＧＲＰに対する検出可能なＩｇＥを有し、３分の２の大多数がこのアレルゲンに対する感作を欠いていることを示した。この発見は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰがヒノキ花粉においてマイナー的なアレルゲンであることを明らかにし、ヒノキ花粉感作患者の特定可能な亜群がモモ又は他のＧＲＰ含有食物に対するアレルギー反応のリスクがあることを示唆する。Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉曝露が高い地域においてこの亜群を構成する実質的な絶対数及びＧＲＰ媒介性食物アレルギー反応の潜在的な重症度を考慮すると、ＧＲＰ感作を伴うそれらを特定することは、この患者群の管理におけるリスク低減の貴重なステップとなるであろう。この目的のために、実施例７において記載したように、インビトロ診断用途のための試薬として好適な、完全に免疫反応性の組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰの生成が、第１の重要なステップである。
【0186】
実施例１２：同じタンパク質ファミリーからの密接に関連するタンパク質－プロフィリンのＩｇＥ反応性の分析
類似アレルゲンの互換性を実証するために、異なるアレルゲン起源からの８つの異なるプロフィリンタンパク質を比較した。カバノキ（ｒＢｅｔ ｖ ２）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒ ａ ２）、リンゴ（Ｍａｌ ｄ ４）、サクランボ（Ｐｒｕ ａｖ ４）、ナシ（Ｐｙｒ ｃ ４）、セロリ（Ａｐｉ ｇ ４）、ニンジン（Ｄａｕ ｃ ４）、及びチモシー牧草（Ｐｈｌ ｐ １２）からの組換えプロフィリンを、ｉｍｍｕｎｏＣＡＰに固定化し、いくつかの血清を使用して試験した。タンパク質の各対間のＩｇＥ反応性の比較は、試験した血清の大部分について、試験した全てのタンパク質の強い相関及び非常に類似したＩｇＥ結合活性を示した（図２３ａ）。
類似アレルゲンの互換性を実証するために、異なるアレルゲン起源からの８つの異なるプロフィリンタンパク質を比較した。カバノキ（ｒＢｅｔ ｖ ２）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒ ａ ２）、リンゴ（Ｍａｌ ｄ ４）、サクランボ（Ｐｒｕ ａｖ ４）、ナシ（Ｐｙｒ ｃ ４）、セロリ（Ａｐｉ ｇ ４）、ニンジン（Ｄａｕ ｃ ４）、及びチモシー牧草（Ｐｈｌ ｐ １２）からの組換えプロフィリンを、ｉｍｍｕｎｏＣＡＰに固定化し、いくつかの血清を使用して試験した。タンパク質の各対間のＩｇＥ反応性の比較は、試験した血清の大部分について、試験した全てのタンパク質の強い相関及び非常に類似したＩｇＥ結合活性を示した（図２３ａ）。
【0187】
これらのタンパク質の配列は、Ｅｍｂｏｓｓ針プログラム［４７］を使用して対合アラインメントした（図２３ｂ）。対合配列同一性は、これらのタンパク質間で７４％～９３％の範囲であった。
【0188】
配列データをＰｈｙｒｅ２［４８］などの構造予測プログラムによって分析した場合、これら８つの配列は全て、プロフィリンについて実験的に決定したものに近い折りたたみ構造と一致すると結論付けすることができる（データは示さず）。
【0189】
ＩｇＥデータは、これらのプロフィリンのうち４つを比較したＳｃｈｅｕｒｅｒらのデータと良好に一致する［４９］。その研究において、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｐｒｕ ａｖ ４、Ｐｙｒ ｃ ４、及びＡｐｉ ｇ ４が比較され、これらのタンパク質は細胞媒介物放出試験でほぼ同一のアレルゲン特性を示すと結論付けられた。これらの４つのタンパク質の対合配列同一性は７６～８６％の間で変動した。同様の結論及びプロフィリン間の高い交差反応性の更なる証拠が、Ｖｉｌｌａｌｔａらによる研究で提示された［５０］。
【0190】
結論として、この実施例は、交差反応性によるＩｇＥ反応性が、同じタンパク質ファミリー内の密接に関連するタンパク質間で非常に類似していることを示す。この研究において、タンパク質は可溶性で折りたたまれた小さなサイズのタンパク質であり、対合配列同一性は約８０％であった。上述の研究は全て天然起源タンパク質バリアントを用いて実行したが、特定のプロフィリンと高い配列同一性を有するこれらのタンパク質の人工的なバリアントも、バリアントが可溶性の折りたたみタンパク質で提供される場合、非常に高い類似性のＩｇＥ反応性を示すであろう。依然として可溶性及び折りたたみプロフィリンの人工的なバリアントは、アミノ酸が系統的に保存されていない位置での制限された数のアミノ酸置換によって設計され得る。かかる置換が任意のかかる位置で他のプロフィリンにおいて生じるアミノ酸で行われる場合、これは可溶性の折りたたみタンパク質を産生する可能性を高めるであろう。
【0191】
実施例１３：異なるＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ種の花粉から実験的に決定したＧＲＰの配列の分析
本発明者らが同様のＩｇＥ抗体結合反応性を割り当てた４つの配列、及び本明細書において特定された位置２３にイソロイシンを有するＣｕｐ ｓ ＧＲＰの新規アイソフォームバリアント配列（詳細については実施例１４を参照されたい）をアラインメントした（図２４）。これらの５つの配列から、非保存的な全てのアミノ酸がＸでマークされているＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号９）を構築することができる。
本発明者らが同様のＩｇＥ抗体結合反応性を割り当てた４つの配列、及び本明細書において特定された位置２３にイソロイシンを有するＣｕｐ ｓ ＧＲＰの新規アイソフォームバリアント配列（詳細については実施例１４を参照されたい）をアラインメントした（図２４）。これらの５つの配列から、非保存的な全てのアミノ酸がＸでマークされているＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号９）を構築することができる。
【0192】
更に、このコンセンサス配列を使用してＢＬＡＳＴ検索を実行し、このコンセンサス配列と相同性を有する全ての既知の配列を特定した。特に、このＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰコンセンサス配列に対して６８％（４３／６３）を超えるアミノ酸同一性を示す既知の配列は存在せず、本明細書で特定したＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉からの配列が、Ｐｒｕ ｐ ７などの食物に存在するＧＲＰタンパク質から系統的に比較的離れていることを示す。
【0193】
コンセンサス配列と５７％（３６／６３）を超える配列同一性を有する３７個の記録配列の選択を使用して、多重配列アラインメントを行った。ｃｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａプログラムを使用して作成したこの多重配列アラインメント（図２５）から、図２６の行Ｃに示すように、分析した全ての配列で同一である２２個の高度に保存されたアミノ酸を特定した。これらの位置におけるアミノ酸交換は、タンパク質のＩｇＥ結合能力に影響を与え得る構造変化をもたらし得る。加えて、Ｐｒｕ ｐ ７と系統的に比較的離れたＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉コンセンサス配列との間で１９個のアミノ酸が同一であり、図２６の行Ｂを参照されたい。これらの位置におけるアミノ酸交換は、タンパク質のＩｇＥ結合能力に影響を与え得る構造変化を誘導する高い可能性を有するであろう。最後に、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉コンセンサス配列とＰｒｕ ｐ ７との間で異なる１４個のアミノ酸残基が存在し、図２６の行ＡにおいてＺで示した。表３に列挙したように、系統的に関連するタンパク質において生じるアミノ酸残基へのこれらの１４個のアミノ酸位置Ｚのうちのいずれか１つ以上のアミノ酸置換は、タンパク質の全体的な構造を妨害しない可能性が高い。
【0194】
これらの配列から、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ－Ｐｒｕ ｐ ７ ＧＲＰコンセンサス配列（配列番号５２）を設計し、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰ間で非保存的であるか、又はＣｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉及びＰｒｕ ｐ ７ ＧＲＰ間で非保存的であるかのいずれかである全てのアミノ酸をＸで示す（図２６及び配列番号５２）。
【0195】
図２５に示すアラインメントを調査することにより、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ－Ｐｒｕ ｐ ７ ＧＲＰコンセンサス配列の系統的に非保存的な位置（図２６における２２個のＸ位置）で使用されている全てのアミノ酸を特定することができた。表３において、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ花粉ＧＲＰ配列から実験的に決定したものを含む、これらの系統的に試験したアミノ酸を列挙した（図２４）。
【0196】
実施例１４：ＭＳ分析によるＣｕｐ ｓ ＧＲＰの選択的配列アイソフォームの解明
イソロイシン及びロイシン残基に関しては、実施例４で精製された７ｋＤａ Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質の一次構造は、密接に関連するタンパク質配列及びＥＳＴ ｍＲＮＡ配列に対する相同性によって以前に決定された。本実施例に記載されるように、質量分析（mass spectrometry、ＭＳ）分析を使用する相補的で詳細な研究は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ配列におけるイソロイシン／ロイシンアミノ酸の正確な同一性を実験的に評価する目的を有した。
イソロイシン及びロイシン残基に関しては、実施例４で精製された７ｋＤａ Ｃ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ花粉タンパク質の一次構造は、密接に関連するタンパク質配列及びＥＳＴ ｍＲＮＡ配列に対する相同性によって以前に決定された。本実施例に記載されるように、質量分析（mass spectrometry、ＭＳ）分析を使用する相補的で詳細な研究は、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰ配列におけるイソロイシン／ロイシンアミノ酸の正確な同一性を実験的に評価する目的を有した。
【0197】
分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器上で実行した。ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン又はキモトリプシンのいずれかで酵素切断した。ＭＳデータ分析は、７ｋＤａタンパク質のこれら２つの消化物から得られたスペクトルの組み合わせで行った。
【0198】
第１に、ＨＣＤ ＭＳ3（第３レベルの多段階断片化の高エネルギー衝突解離）
評価を、Ｘｉａｏら［５１］に従って選択されたペプチドに対して実行した。この分析は、１つのＬ*（Ｉｌｅ又はＬｅｕ）残渣を含むペプチドのＨＣＤ－ＭＳ2評価（第２レベルの多段階断片化）に基づく。８６ＤａのＩｌｅ／Ｌｅｕ－特徴的インモニウムイオンのその後のＨＣＤ ＭＳ3断片化により、これら２つのアミノ酸の区別が可能になる。イソロイシンは、スペクトルにおいて６９Ｄａイオンの高い存在量をもたらすが、ロイシン残基は、この断片の低い存在量をもたらす。例えば、ＨＣＤ断片化後のアルキル化ペプチドＨＤＲＣＬ*ＫＹ（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの位置１９～２５）の分析は、Ｌ*－インモニウムイオンの有意な強度を有する４つのＭＳ2スペクトルを明らかにした。Ｌ*－インモニウムイオンの更なるＨＣＤ断片化の後、ＭＳ3スペクトルのその後の分析は、６９ｋＤａイオンの高い相対存在量を明らかにし、これは、このペプチド中のイソロイシンの存在を示した（表４）。したがって、位置２３にイソロイシンを含むアイソフォームの存在を確認することができる。したがって、このペプチドアイソフォームの配列は、ＨＤＲＣＩＫＹ（配列番号６５）である。
評価を、Ｘｉａｏら［５１］に従って選択されたペプチドに対して実行した。この分析は、１つのＬ*（Ｉｌｅ又はＬｅｕ）残渣を含むペプチドのＨＣＤ－ＭＳ2評価（第２レベルの多段階断片化）に基づく。８６ＤａのＩｌｅ／Ｌｅｕ－特徴的インモニウムイオンのその後のＨＣＤ ＭＳ3断片化により、これら２つのアミノ酸の区別が可能になる。イソロイシンは、スペクトルにおいて６９Ｄａイオンの高い存在量をもたらすが、ロイシン残基は、この断片の低い存在量をもたらす。例えば、ＨＣＤ断片化後のアルキル化ペプチドＨＤＲＣＬ*ＫＹ（Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの位置１９～２５）の分析は、Ｌ*－インモニウムイオンの有意な強度を有する４つのＭＳ2スペクトルを明らかにした。Ｌ*－インモニウムイオンの更なるＨＣＤ断片化の後、ＭＳ3スペクトルのその後の分析は、６９ｋＤａイオンの高い相対存在量を明らかにし、これは、このペプチド中のイソロイシンの存在を示した（表４）。したがって、位置２３にイソロイシンを含むアイソフォームの存在を確認することができる。したがって、このペプチドアイソフォームの配列は、ＨＤＲＣＩＫＹ（配列番号６５）である。
【0199】
表４はまた、天然Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰからの他の選択されたＬ*含有ペプチドのＨＣＤ ＭＳ3分析を示す。分析により、位置３、２８及び５３における配列、より厳密にはアミノ酸の以前の決定が確認された。位置１８由来のＬ*－インモニウムイオンを含むスペクトルは１つしか得られなかったが、このペプチドではイソロイシンを検出することができた（表４）。したがって、本発明者らのデータは、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰの位置１８における更なるアミノ酸アイソフォーム変異の存在を示唆している（表４）。
【0200】
位置２３におけるイソロイシンの発見を確認するために、天然７ｋＤａタンパク質もまた、ＥＴＤ ＨＣＤ ＭＳ3（electron-transfer dissociation、ＥＴＤ＝電子移動解離）プロトコルを使用した分析に供した（Ｘｉａｏら、上記）。このプロトコルでは、選択されたＬ*含有ペプチドのＥＴＤ断片化により、Ｎ末端ロイシン又はイソロイシンを有するＭＳ2ｚ－イオン断片が得られた。これらのＭＳ2ｚ－イオン断片をＨＣＤ断片化に供し、－２９（Ｉｌｅからのエチル損失）又は－４３（Ｌｅｕからのプロピル損失）のいずれかのニュートラルロスを生じた。ペプチドＳＡＨＤＲＣＬ*ＫＹを分析した合計８つの異なるＭＳ3スペクトル（表５）において、２９Ｄａの特徴的な重量損失が検出され、全てこのペプチド中のイソロイシンの存在を示した。したがって、このペプチドの配列は、ＳＡＨＤＲＣＩＫＹ（配列番号６６）である。
【0201】
結論として、本実施例は、ロイシンに加えて位置２３にイソロイシンを有するＣｕｐ ｓ ＧＲＰのアミノ酸配列の代替アイソフォームの特定を記載する。位置１８のイソロイシンの検出により、この位置で先に検出されたものに追加のアイソフォーム変異を加えることができた。配列中にアイソフォーム変異を有する２つの他のアミノ酸位置と共に、これは、Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰアミノ酸配列（配列番号５３～配列番号６２）の１２の可能なアイソフォームバリアントをもたらす。
【0202】
【表14】
【0203】
【表15】
【0204】
配列
配列番号５３～６２：位置１８、２３及び／又は５２に異なるアミノ酸残基を有する配列番号４のバリアント。
配列番号５３：ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５４：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５５：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５６：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５７：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５８：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５９：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６０：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６１：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６２：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６５～７８：配列番号４のペプチド（アイソフォーム）
配列番号６５：
ＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号６６：
ＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号６７：
ＡＱＩＤＣＤＫＥ
配列番号６８：
ＳＬＨＤＲ
配列番号６９：
ＳＩＨＤＲ
配列番号７０：
ＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号７１：
ＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号７２：
ＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号７３：
ＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７４：
ＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号７５：
ＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号７６：
ＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７７：
ＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７８：
ＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号５３～６２：位置１８、２３及び／又は５２に異なるアミノ酸残基を有する配列番号４のバリアント。
配列番号５３：ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５４：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５５：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５６：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５７：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５８：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号５９：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６０：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＩＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６１：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＨＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６２：
ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＬＨＤＲＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６５～７８：配列番号４のペプチド（アイソフォーム）
配列番号６５：
ＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号６６：
ＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号６７：
ＡＱＩＤＣＤＫＥ
配列番号６８：
ＳＬＨＤＲ
配列番号６９：
ＳＩＨＤＲ
配列番号７０：
ＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号７１：
ＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号７２：
ＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号７３：
ＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７４：
ＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号７５：
ＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号７６：
ＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７７：
ＣＬＫＹＣＧＩＣＣＥＫ
配列番号７８：
ＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
【0205】
実施例１５：ＭＳ分析によるＪｕｎ ａ ＧＲＰ及び／又はＣｒｙ ｊ ＧＲＰの選択的配列アイソフォームの解明
実施例１４の手順に従ってＭＳ分析を実行して、実施例６のＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのＰｒｕ ｐ ７関連タンパク質のアイソフォームバリアントを特定する。予想は、実施例１４でＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓについて示したものと同様のアイソフォームバリアントを特定することである。
実施例１４の手順に従ってＭＳ分析を実行して、実施例６のＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ及びＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ花粉からのＰｒｕ ｐ ７関連タンパク質のアイソフォームバリアントを特定する。予想は、実施例１４でＣ．ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓについて示したものと同様のアイソフォームバリアントを特定することである。
【0206】
Ｊｕｎ ａ及びＣｒｙ ｊの各々は、それぞれ配列番号６３及び配列番号６４に従って、位置２３にイソロイシンを有するアイソフォームバリアントを有し得ると予想される。
【0207】
配列番号６３：位置２３に異なるアミノ酸残基を有する配列番号６のバリアント。
配列番号６３：ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＫＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６４：位置２３に異なるアミノ酸残基を有する配列番号８のバリアント。
配列番号６４：
ＡＨＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＮＣＶＰＰＧＴＹＧＮＥＤＳＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａの選択的配列アイソフォーム（位置２３にロイシンの代わりにイソロイシンを有する）（本明細書ではＪｕｎ ａ ＧＲＰｂと称する）の存在が、以下の実施例１８で確認される。
配列番号６３：ＡＱＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＫＫＣＨＣＶＰＰＧＴＡＧＮＥＤＶＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
配列番号６４：位置２３に異なるアミノ酸残基を有する配列番号８のバリアント。
配列番号６４：
ＡＨＩＤＣＤＫＥＣＮＲＲＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹＣＧＩＣＣＥＫＣＮＣＶＰＰＧＴＹＧＮＥＤＳＣＰＣＹＡＮＬＫＮＳＫＧＧＨＫＣＰ
Ｊｕｎ ａ ＧＲＰａの選択的配列アイソフォーム（位置２３にロイシンの代わりにイソロイシンを有する）（本明細書ではＪｕｎ ａ ＧＲＰｂと称する）の存在が、以下の実施例１８で確認される。
【0208】
実施例１６：組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰ（ｃ）アイソフォームのクローニング及び産生
実施例１４のアイソフォームバリアントＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃのアミノ酸配列（表１、配列番号５３を参照されたい）をコードするように設計された合成遺伝子をクローニングし、実施例７においてＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂについて記載したのと同じ手順を用いて、タンパク質を発現させ、精製した。ＭＳ／ＭＳ分析により、精製した組換えタンパク質の同一性及び完全性を確認した。
実施例１４のアイソフォームバリアントＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃのアミノ酸配列（表１、配列番号５３を参照されたい）をコードするように設計された合成遺伝子をクローニングし、実施例７においてＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰｂについて記載したのと同じ手順を用いて、タンパク質を発現させ、精製した。ＭＳ／ＭＳ分析により、精製した組換えタンパク質の同一性及び完全性を確認した。
【0209】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる組換えアイソフォームＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃ及びＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ（位置２３のＬｅｕ）の比較により、タンパク質調製物の同一の電気泳動的外観が示され、見かけの分子量は７ｋＤａであった（データは示さず）。
【0210】
結論として、実施例１６は、実施例１４において決定したアミノ酸配列バリアントを表す、組換えアイソフォームＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃのクローニング及び精製を記載する。
【0211】
実施例１７：Ｃｕｐ ｓ ＧＲＰａとＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃとの間の免疫学的類似性
２つの組換えアイソフォームバリアントＣｕｐ ｓ ＧＲＰａとＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃとの間の免疫学的類似性の程度を、比較ＩｇＥ結合分析において評価した。２つのアレルゲンの各々をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に結合させ、ＩｇＥ抗体結合を２３人のモモアレルギー対象の血清中で測定した。比較を図２７に示す。
２つの組換えアイソフォームバリアントＣｕｐ ｓ ＧＲＰａとＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃとの間の免疫学的類似性の程度を、比較ＩｇＥ結合分析において評価した。２つのアレルゲンの各々をＩｍｍｕｎｏＣＡＰ固相に結合させ、ＩｇＥ抗体結合を２３人のモモアレルギー対象の血清中で測定した。比較を図２７に示す。
【0212】
ｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰａ及びｒＣｕｐ ｓ ＧＲＰｃへのＩｇＥ結合のレベル（図２７）は、１．０４の中央値レベル比で、非常に高度に相関する（ｒ＝０．９９２）ことが判明した。結果は、２つの組換えＣｕｐ ｓ ＧＲＰアイソフォームの機能的同等性の証拠を提供する。
【0213】
この実施例は、位置２３におけるロイシンからイソロイシンへの置換がＩｇＥ反応性に顕著な影響を及ぼさないことを実証する。これは、高い配列同一性の他の小さなアレルゲンタンパク質についてなされた観察と一致しており、それらのＩｇＥ結合活性は、アミノ酸配列における小さな変動によって有意に影響されない。
【0214】
更に、ＩｇＥ反応性が同じタンパク質のアイソフォームバリアント間で非常に類似していることも実証する実施例８及び図１９ａ～ｂも参照されたい。
【0215】
実施例１８：ＭＳ／ＭＳ分析によるＪｕｎ ａ ＧＲＰａの選択的配列アイソフォームの解明
分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器上で実行した。ＭＳ／ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ又はＬｙｓ－Ｃのいずれかで酵素切断した。
分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ機器上で実行した。ＭＳ／ＭＳ分析の前に、タンパク質をＤＴＴによって還元し、アクリルアミドでアルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ又はＬｙｓ－Ｃのいずれかで酵素切断した。
【0216】
第１に、ＨＣＤ ＭＳ3（第３レベルの多段階断片化の高エネルギー衝突解離）評価を、Ｘｉａｏら［５１］に従って選択されたペプチドに対して実行した。この分析は、１つのＬ*（Ｉｌｅ又はＬｅｕ）残渣を含むペプチドのＨＣＤ－ＭＳ2（第２レベルの多段階断片化）断片化に基づく。８６ＤａのＩｌｅ／Ｌｅｕ－特徴的インモニウムイオンのその後のＨＣＤ ＭＳ3断片化により、これら２つのアミノ酸の区別が可能になる。イソロイシンは、スペクトルにおいて６９Ｄａイオンの高い存在量をもたらすが、ロイシン残基は、この断片の低い存在量をもたらす。この方法では、注釈を付けることができる高品質のスペクトルは得られなかった。
【0217】
また、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉからの天然７ｋＤａタンパク質を、ＥＴＤ ＨＣＤ ＭＳ3（ＥＴＤ＝電子移動解離）プロトコルを使用した分析に供した（Ｘｉａｏら、上記）。このプロトコルでは、選択されたＬ*含有ペプチドのＥＴＤ断片化により、Ｎ末端ロイシン又はイソロイシンを有するＭＳ2ｚ－イオン断片が得られた。これらのＭＳ2ｚ－イオン断片をＨＣＤ断片化に供し、－２９（Ｉｌｅからのエチル損失）又は－４３（Ｌｅｕからのプロピル損失）のいずれかのニュートラルロスを生じた。ペプチドＡＳＡＨＤＲＣＬ*ＫＹ並びに翻訳後修飾されたＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬ*ＫＹ及びＡＳＡＨＤＲＣＬ*ＫＹを分析した合計７つの異なるＭＳ3スペクトル（表５）において、２９Ｄａの特徴的な重量損失が検出され、全てこのペプチドにおけるイソロイシンの存在を示した。したがって、これらのペプチドの配列は、ＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ（配列番号８０）及びＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ（配列番号８２）である。
【0218】
結論として、本実施例は、ロイシンに加えて位置２３にイソロイシンを有するＪｕｎ ａ ＧＲＰのアミノ酸配列の代替アイソフォームの特定を記載し、したがって、以前に提案されたアイソフォーム変異を検証する。（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰｂ、配列番号６３）。
【0219】
【表16】
【0220】
配列
配列番号７９～８２：配列番号６（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ）のペプチド（アイソフォーム）
配列番号７９
ＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号８０
ＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号８１
ＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号８２
ＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号７９～８２：配列番号６（Ｊｕｎ ａ ＧＲＰ）のペプチド（アイソフォーム）
配列番号７９
ＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号８０
ＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
配列番号８１
ＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＬＫＹ
配列番号８２
ＣＳＫＡＳＡＨＤＲＣＩＫＹ
【0221】
参考文献
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８． Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ ｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｐｅａｎｕｔ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０．１２５（１）：ｐ．１９１－７ ｅ１－１３．
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１０． Ｅｂｉｓａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｒａ ｈ １－，２－，ａｎｄ ３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２．２３（６）：ｐ．５７３－５８１．
１１． Ｍａｓｔｈｏｆｆ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｒ ａ ９ ａｎｄ Ｃｏｒ ａ １４ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａ ｈａｚｅｌｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｗｉｔｈ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ Ｄｕｔｃｈ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３．１３２（２）：ｐ．３９３－９．
１２． Ｓａｖｖａｔｉａｎｏｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｎａ ｏ ３，ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ａｎｄ ｐｉｓｔａｃｈｉｏ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ Ｇｒｅｅｋ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５．１３６（１）：ｐ．１９２－４．
１３． Ｌａｎｇｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａ ｏ ３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃａｓｈｅｗ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１７．７２（４）：ｐ．５９８－６０３．
１４． Ｓｔｕｍｖｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｇｅｎｕｉｎｅ Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３．１１１（５）：ｐ．９７４－９７９．
１５． Ｊｕｔｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｒａｓｓ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５．１１６（３）：ｐ．６０８－１３．
１６． Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｆｕｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，２００６．２６（２）：ｐ．２６１－８１，ｖｉｉ．
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２４． Ｃｈａｒｐｉｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｐｏｌｌｉｎｏｓｉｓ：ｆｒｏｍ Ｔｒｅｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ．Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９．５６（２）：ｐ．１７４－９５．
２５． Ｓｃａｌａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｒｖｅｙ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ２３，０７７ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１０．４０（６）：ｐ．９１１－２１．
２６． Ａｃｅｉｔｕｎｏ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ ｐｏｌｌｅｎ：Ｃｕｐ ａ １．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０００．３０（１２）：ｐ．１７５０－１７５８．
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２８． Ｐｉｃｏ ｄｅ Ｃｏａｎａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｐ ａ ４，ａ ｎｅｗ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１０．４０１（３）：ｐ．４５１－７．
２９． Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎ ｆ ４：ａ ｄｏｇ ｄａｎｄｅｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ａ ２３ ｋＤａ ｏｄｏｒａｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｏｗ ｄａｎｄｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１０．４０（８）：ｐ．１２７６－８７．
３０． Ｒａｓｈｉｄ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｌｅｎ－ｆｏｏｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｂｅｔ ｖ １／ＰＲ－１０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ ａｌｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｖｅ ｓｐｒｉｎｇ ｒｈｉｎｉｔｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１１．６６（１０）：ｐ．１３９１－２．
３１． Ｗｏｒｍ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ａｌｌｅｒｇｉｅｓ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｌａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＤＧＡＫＩ），ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＤＤＧ），ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎ Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｉｓｔｓ （ＡｅＤＡ）ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＧＰＡ）．Ａｌｌｅｒｇｏ Ｊ Ｉｎｔ，２０１４．２３（１）：ｐ．１－１６．
３２． Ｒｏｓａｃｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｆｉｌｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏｏｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９．１４３（２）：ｐ．６８１－６９０ ｅ１．
３３． Ｈｕｇｕｅｓ，Ｂ．，Ａ．Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，ａｎｄ Ｄ．Ｃｈａｒｐｉｎ，Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｐｒｅｓｓ ｐｏｌｌｅｎ ａｎｄ ｐｅａｃｈ：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｃａｓｅｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２００６．６１（１０）：ｐ．１２４１－３．
３４． Ｔｕｐｐｏ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅａｍａｃｌｅｉｎ－Ａ ｎｅｗ ｐｅａｃｈ ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｐｒｕ ｐ ３．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１３．４３（１）：ｐ．１２８－４０．
３５． Ｉｎｏｍａｔａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａｍａｃｌｅｉｎ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｅａｃｈ ａｌｌｅｒｇｙ．Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４．１１２（２）：ｐ．１７５－１７７ ｅ３．
３６． Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｕ ｐ ７ ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ，ｃｙｐｒｅｓｓ ｐｏｌｌｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅａｃｈ ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１９．４９（４）：ｐ．５２６－３６．
３７． Ｓｅｎｅｃｈａｌ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｏｌｌｅｎ ｆｏｏｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｓｎａｋｉｎ／ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１８．１４１（１）：ｐ．４１１－４１４ ｅ４．
３８． Ｔｕｐｐｏ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｐｒｅｓｓ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ＩｇＥ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９．１１４：ｐ．１８９－１９５．
３９． Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ７ ｋＤａ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ，２０２０．５０（８）：ｐ．９６４－９７２．
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４３． Ｖａｌｅｎｔａ，Ｒ．ａｎｄ Ｖ．Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１１９（４）：ｐ．８２６－３０．
４４． Ｍａｒｋｎｅｌｌ ＤｅＷｉｔｔ，Å．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｉｍｏｔｈｙ ｇｒａｓｓ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎ，Ｐｈｌ ｐ １１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ，２００２．３２（９）：ｐ．１３２９－１３４０．
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４６． Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ＩＵＰＡＣ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０．２６（１０）：ｐ．１３８６－９．
４７． Ｍａｄｅｉｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１９．ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
４８． Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１５．１０（６）：ｐ．８４５－５８．
４９． Ｓｃｈｅｕｒｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｐａｎａｌｌｅｒｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ（Ｐｙｒ ｃ ４），ｃｈｅｒｒｙ（Ｐｒｕ ａｖ ４）ａｎｄ ｃｅｌｅｒｙ（Ａｐｉ ｇ ４）ｗｉｔｈ ｂｉｒｃｈ ｐｏｌｌｅｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎ Ｂｅｔ ｖ ２．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ，２００１．７５６（１－２）：ｐ．３１５－２５．
５０． Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｄ．ａｎｄ Ｒ．Ａｓｅｒｏ，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｐａｎ－ａｌｌｅｒｇｅｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎ．Ｉｓ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ？ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０．２０（７）：ｐ．５９１－５．
５１． Ｘｉａｏ，Ｙ．，Ｍ．Ｍ．Ｖｅｃｃｈｉ，ａｎｄ Ｄ．Ｗｅｎ，Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｂｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＬＣ－ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１６．８８（２１）：ｐ．１０７５７－１０７６６．
１． Ｍａｔｒｉｃａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＡＡＣＩ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ．２０１６．ｐ．１－４０１．
２． Ａｋｄｉｓ，Ｃ．Ａ．，Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６．１８（６）：ｐ．７１８－２６．
３． Ｗａｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ，ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｋｉｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ＩｇＥ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１８（３）：ｐ．２３１－９．
４． Ｖａｌｅｎｔａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（ＣＲＤ ａｎｄ ＣＲＩＴ）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ，１９９９．２９（７）：ｐ．８９６－９０４．
５． Ａｓａｒｎｏｊ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＩｇＥ ｔｏ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｅａｎｕｔ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｌｌｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ８－ｙｅａｒ－ｏｌｄｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１０．６５（９）：ｐ．１１８９－９５．
６． Ａｓａｒｎｏｊ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅａｎｕｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｒａ ｈ ８ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｐｅａｎｕｔ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２．１３０（２）：ｐ．４６８－７２．
７． Ｍａｔｓｕｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｏｍｅｇａ－５ ｇｌｉａｄｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｅｒｃｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２００８．６３（２）：ｐ．２３３－６．
８． Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ ｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｐｅａｎｕｔ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０．１２５（１）：ｐ．１９１－７ ｅ１－１３．
９． Ｃｏｄｒｅａｎｕ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｓ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１．１５４（３）：ｐ．２１６－２６．
１０． Ｅｂｉｓａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｒａ ｈ １－，２－，ａｎｄ ３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２．２３（６）：ｐ．５７３－５８１．
１１． Ｍａｓｔｈｏｆｆ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｒ ａ ９ ａｎｄ Ｃｏｒ ａ １４ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａ ｈａｚｅｌｎｕｔ ａｌｌｅｒｇｙ ｗｉｔｈ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ Ｄｕｔｃｈ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３．１３２（２）：ｐ．３９３－９．
１２． Ｓａｖｖａｔｉａｎｏｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｓｈｅｗ ｎｕｔ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｎａ ｏ ３，ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ ｃａｓｈｅｗ ａｎｄ ｐｉｓｔａｃｈｉｏ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ Ｇｒｅｅｋ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５．１３６（１）：ｐ．１９２－４．
１３． Ｌａｎｇｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａ ｏ ３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃａｓｈｅｗ ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１７．７２（４）：ｐ．５９８－６０３．
１４． Ｓｔｕｍｖｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｇｅｎｕｉｎｅ Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３．１１１（５）：ｐ．９７４－９７９．
１５． Ｊｕｔｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｒａｓｓ ｐｏｌｌｅｎ ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５．１１６（３）：ｐ．６０８－１３．
１６． Ｃｒｏｍｗｅｌｌ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｆｕｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，２００６．２６（２）：ｐ．２６１－８１，ｖｉｉ．
１７． Ｎｏｎｙ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｔａｂｌｅｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｅｔ ｖ １ ｉｎ ｂｉｒｃｈ ｐｏｌｌｅｎ－ａｌｌｅｒｇｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１５．７０（７）：ｐ．７９５－８０４．
１８． Ｇｒｏｎｌｕｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｃａｔ Ａｌｌｅｒｇｅｎ，Ｆｅｌ ｄ １，ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９．１５１（４）：ｐ．２６５－２７４．
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４７． Ｍａｄｅｉｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１９．ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
４８． Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１５．１０（６）：ｐ．８４５－５８．
４９． Ｓｃｈｅｕｒｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎ ｐａｎａｌｌｅｒｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ（Ｐｙｒ ｃ ４），ｃｈｅｒｒｙ（Ｐｒｕ ａｖ ４）ａｎｄ ｃｅｌｅｒｙ（Ａｐｉ ｇ ４）ｗｉｔｈ ｂｉｒｃｈ ｐｏｌｌｅｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎ Ｂｅｔ ｖ ２．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ，２００１．７５６（１－２）：ｐ．３１５－２５．
５０． Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｄ．ａｎｄ Ｒ．Ａｓｅｒｏ，Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｐａｎ－ａｌｌｅｒｇｅｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎ．Ｉｓ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ？ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０．２０（７）：ｐ．５９１－５．
５１． Ｘｉａｏ，Ｙ．，Ｍ．Ｍ．Ｖｅｃｃｈｉ，ａｎｄ Ｄ．Ｗｅｎ，Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｂｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＬＣ－ＭＳ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１６．８８（２１）：ｐ．１０７５７－１０７６６．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図17】
【図18】
【図19a】
【図19b】
【図19c】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図21c】
【図22】
【図23a】
【図23b】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】