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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-29
(54)【発明の名称】組換えポリペプチド及びウイルスの生成の改善
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240122BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20240122BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240122BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240122BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240122BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240122BHJP
A61K 35/76 20150101ALN20240122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/87 Z
C12N15/88 Z
C12P21/02 C
C12N7/01
C12N5/10
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023544056
(86)(22)【出願日】2022-01-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-22
(86)【国際出願番号】 US2022013250
(87)【国際公開番号】W WO2022159662
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】63/139,992
(32)【優先日】2021-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518278029
【氏名又は名称】リジェネクスバイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ギルマイスター マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ボーン スティーブン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
(57)【要約】
本明細書では、組換えポリペプチドまたはウイルス粒子を生成するための改善された方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組換えポリペプチドまたはウイルス粒子を生成する方法は、組換えポリペプチドまたはウイルス粒子を生成可能な細胞及び硫酸デキストランを含む細胞培養物を準備することと、当該培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、当該細胞に形質移入することとを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞に形質移入する方法であって、ａ）前記細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）（ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
【請求項2】
組換えポリペプチドを生成する方法であって、ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【請求項3】
前記ポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
組換えウイルス粒子を生成する方法であって、ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【請求項5】
ａ）の前記培養物が、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
ａ）の前記培養物が、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ａ）の前記培養物が、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
細胞に形質移入する方法であって、ａ）細胞培養物中で前記細胞を培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
【請求項9】
組換えポリペプチドを生成する方法であって、ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を細胞培養物中で培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【請求項10】
前記ポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
組換えウイルス粒子を生成する方法であって、ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【請求項12】
前記開始硫酸デキストラン濃度が、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記開始硫酸デキストラン濃度が、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌである、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記開始硫酸デキストラン濃度が約４ｍｇ／Ｌである、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記最終硫酸デキストラン濃度が、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間である、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記最終硫酸デキストラン濃度が、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌである、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記最終硫酸デキストラン濃度が約２ｍｇ／Ｌである、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記開始硫酸デキストラン濃度が約４ｍｇ／Ｌであり、かつ前記最終硫酸デキストラン濃度が約２ｍｇ／Ｌである、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記組換えウイルス粒子が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子または組換えレンチウイルス粒子である、請求項４～７及び１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記組換えウイルス粒子がｒＡＡＶ粒子である、請求項４～７及び１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
前記ｒＡＡＶ粒子が、導入遺伝子を含むゲノムを含む、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記調節エレメント及びポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが異種である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜結合型スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）をコードする、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記導入遺伝子が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ｒＡＡＶゲノムをコードするポリヌクレオチドと、前記ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶ ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記アデノウイルスヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項２０～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞培養物が、ａ）の前記培養物が硫酸デキストランを含まない参照方法よりも、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍多くのＧＣ／ｍｌとして測定されたｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項２０～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記細胞培養物が浮遊細胞培養物である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記細胞培養物が浮遊適応性細胞を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞、あるいはこれらの組合せを含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記細胞がＨＥＫ２９３細胞を含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記細胞がＣＨＯ細胞またはＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記形質移入試薬が、脂質、ポリマー、ペプチド、またはこれらの組合せを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記形質移入試薬が脂質を含み、前記脂質が、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、またはこれらの組合せを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記形質移入試薬がポリマーを含み、前記ポリマーが、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、デンドリマー、またはこれらの組合せを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記形質移入試薬がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項50】
請求項２０～４９のいずれか１項に記載の方法によって生成された単離されたｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、硫酸デキストランを含む培養基中で宿主細胞に形質移入することを含む方法に関する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２１日に出願された米国特許出願第６３／１３９，９９２号による利益を主張し、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年１月２１日に出願された米国特許出願第６３／１３９，９９２号による利益を主張し、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0003】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
【0004】
したがって、当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子を大規模に生成するための方法の生産性及び収率の改善が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
概要
１つの態様において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）当該培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
１つの態様において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）当該培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0006】
さらなる態様において、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である。
【0007】
さらなる態様において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0008】
１つの態様において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を細胞培養物中で培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0009】
さらなる態様において、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を細胞培養物中で培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である。
【0010】
さらなる態様において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0011】
さらなる態様において、本開示は、組換えポリペプチドの生成を改善する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない培養物中で細胞に形質移入することを含む方法よりも多くのポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である。
【0012】
さらなる態様において、本開示は、組換えウイルス粒子の生成を改善する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない培養物中で細胞に形質移入することを含む方法よりも多くの組換えウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
【0014】
［１．］細胞に形質移入する方法であって、
ａ）前記細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）（ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
ａ）前記細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）（ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
【0015】
［２．］組換えポリペプチドを生成する方法であって、
ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【0016】
［３．］前記ポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である、請求項［２］に記載の方法。
【0017】
［４．］組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、前記培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、前記準備することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【0018】
［５．］ａ）の前記培養物が、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、請求項［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
【0019】
［６．］ａ）の前記培養物が、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む、請求項［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
【0020】
［７．］ａ）の前記培養物が、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む、請求項［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
【0021】
［８．］細胞を形質移入する方法であって、
ａ）細胞培養物中で前記細胞を培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
ａ）細胞培養物中で前記細胞を培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと
を含む、前記方法。
【0022】
［９．］組換えポリペプチドを生成する方法であって、
ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を細胞培養物中で培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
ａ）前記組換えポリペプチドの生成に適した細胞を細胞培養物中で培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【0023】
［１０．］前記ポリペプチドが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質である、請求項［９］に記載の方法。
【0024】
［１１．］組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
ａ）前記組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、前記培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、前記培養することと、
ｂ）ａ）の前記培養物に、前記組換えウイルス粒子を生成するのに必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、前記細胞に形質移入することと、
ｃ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含む、前記方法。
【0025】
［１２．］前記開始硫酸デキストラン濃度が、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間である、請求項［８］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
【0026】
［１３．］前記開始硫酸デキストラン濃度が、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌである、請求項［８］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
【0027】
［１４．］前記開始硫酸デキストラン濃度が約４ｍｇ／Ｌである、請求項［８］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
【0028】
［１５．］前記最終硫酸デキストラン濃度が、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間である、請求項［８］～［１４］のいずれか１項に記載の方法。
【0029】
［１６．］前記最終硫酸デキストラン濃度が、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌである、請求項［８］～［１４］のいずれか１項に記載の方法。
【0030】
［１７．］前記最終硫酸デキストラン濃度が約２ｍｇ／Ｌである、請求項［８］～［１４］のいずれか１項に記載の方法。
【0031】
［１８．］前記開始硫酸デキストラン濃度が約４ｍｇ／Ｌであり、かつ前記最終硫酸デキストラン濃度が約２ｍｇ／Ｌである、請求項［８］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
【0032】
［１９．］前記組換えウイルス粒子が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子または組換えレンチウイルス粒子である、請求項［４］～［７］及び［１１］～［１８］のいずれか１項に記載の方法。
【0033】
［２０．］前記組換えウイルス粒子がｒＡＡＶ粒子である、請求項［４］～［７］及び［１１］～［１８］のいずれか１項に記載の方法。
【0034】
［２１．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項［２０］に記載の方法。
【0035】
［２２．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項［２０］に記載の方法。
【0036】
［２３．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項［２０］に記載の方法。
【0037】
［２４．］前記ｒＡＡＶ粒子が、導入遺伝子を含むゲノムを含む、請求項［２０］～［２３］のいずれか１項に記載の方法。
【0038】
［２５．］前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、請求項［２４］に記載の方法。
【0039】
［２６．］前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、請求項［２５］に記載の方法。
【0040】
［２７．］前記調節エレメント及びポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが異種である、請求項［２４］または請求項［２５］に記載の方法。
【0041】
［２８．］前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜結合型スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）をコードする、請求項［２４］～［２７］のいずれか１項に記載の方法。
【0042】
［２９．］前記導入遺伝子が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、請求項［２４］～［２７］のいずれか１項に記載の方法。
【0043】
［３０．］前記１つ以上のポリヌクレオチドが、
ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、請求項［２０］～［２９］のいずれか１項に記載の方法。
ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、請求項［２０］～［２９］のいずれか１項に記載の方法。
【0044】
［３１．］前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ｒＡＡＶゲノムをコードするポリヌクレオチドと、前記ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶ ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記アデノウイルスヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項［３０］に記載の方法。
【0045】
［３２．］前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項［３０］または請求項［３１］に記載の方法。
【0046】
［３３．］前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項［２０］～［２８］のいずれか１項に記載の方法。
【0047】
［３４．］前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項［２０］～［３３］のいずれか１項に記載の方法。
【0048】
［３５．］前記細胞培養物が、ａ）の前記培養物が硫酸デキストランを含まない参照方法よりも、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍多くのＧＣ／ｍｌとして測定されたｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項［２０］～［３３］のいずれか１項に記載の方法。
【0049】
［３６．］前記細胞培養物が浮遊細胞培養物である、請求項［１］～［３５］のいずれか１項に記載の方法。
【0050】
［３７．］前記細胞培養物が浮遊適応性細胞を含む、請求項［３６］に記載の方法。
【0051】
［３８．］前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞、あるいはこれらの組合せを含む、請求項［３６］または請求項［３７］に記載の方法。
【0052】
［３９．］前記細胞がＨＥＫ２９３細胞を含む、請求項［３６］または請求項［３７］に記載の方法。
【0053】
［４０．］前記細胞がＣＨＯ細胞またはＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む、請求項［３６］または請求項［３７］に記載の方法。
【0054】
［４１．］前記形質移入試薬が、脂質、ポリマー、ペプチド、またはこれらの組合せを含む、請求項［１］～［４０］のいずれか１項に記載の方法。
【0055】
［４２．］前記形質移入試薬が脂質を含み、前記脂質が、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、またはこれらの組合せを含む、請求項［４１］に記載の方法。
【0056】
［４３．］前記形質移入試薬がポリマーを含み、前記ポリマーが、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、デンドリマー、またはこれらの組合せを含む、請求項［４１］に記載の方法。
【0057】
［４４．］前記形質移入試薬がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、請求項４１に記載の方法。
【0058】
［４５．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、請求項［１］～［４４］のいずれか１項に記載の方法。
【0059】
［４６．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、請求項［４５］に記載の方法。
【0060】
［４７．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、請求項［４５］に記載の方法。
【0061】
［４８．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、請求項［４５］に記載の方法。
【0062】
［４９．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する、請求項［４１］に記載の方法。
【0063】
［５０．］請求項［２０］～［４９］のいずれか１項に記載の方法によって生成された単離されたｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
【0064】
本明細書で説明される組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】形質移入前及び形質移入中に使用するための硫酸デキストランの初期振とうフラスコスクリーニング。１：２，５００、１：５００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：４０，０００、及び１：８０，０００は、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ１０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、６２５□ｇ／Ｌ、及び３１３□ｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図2】形質移入前及び形質移入中に使用するための硫酸デキストランの初期振とうフラスコスクリーニング。６Ｋ、７Ｋ、８Ｋ、９Ｋ、１０Ｋ、１２Ｋ、及び１５Ｋは、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ４．２ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、２．１ｍｇ／Ｌ、及び１．７ｍｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図3】形質移入のためのベンチスケール２Ｌ硫酸デキストラン滴定：ゲノム力価。６Ｋ、７Ｋ、８Ｋ、９Ｋ、及び１０Ｋは、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ４．２ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、及び２．５ｍｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図4】形質移入のためのベンチスケール２Ｌ硫酸デキストラン滴定：細胞イメージング。１：６，０００、１：７，０００、１：８，０００、１：９，０００、及び１：１０，０００は、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ４．２ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、及び２．５ｍｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図5】形質移入のためのベンチスケール２Ｌ硫酸デキストラン滴定：生細胞密度。１：６，０００、１：７，０００、１：８，０００、１：９，０００、及び１：１０，０００は、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ４．２ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、及び２．５ｍｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図6】形質移入のためのベンチスケール２Ｌ硫酸デキストラン滴定：細胞生存率。１：６，０００、１：７，０００、１：８，０００、１：９，０００、及び１：１０，０００は、形質移入時に存在する２５ｇ／Ｌ硫酸デキストランストック溶液の希釈倍率を示し、それぞれ４．２ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、及び２．５ｍｇ／Ｌの濃度に相当する。
【図7】形質移入中に２ｍｇ／Ｌの濃度で硫酸デキストランを用いたベンチスケール５ＬリアクターでのＡＡＶ８生成。
【図8】異なる市販培地を用いた２ＬベンチスケールリアクターでのＡＡＶ８生成。硫酸デキストランは、形質移入中、２ｍｇ／Ｌで存在した。
【図9】異なる宿主細胞クローンを用いた振とうフラスコでのＡＡＶ８生成。硫酸デキストランは、形質移入中、２ｍｇ／Ｌで存在した。
【図10】形質移入中に硫酸デキストランを用いたベンチスケール５ＬリアクターでのＡＡＶ９生成。
【図11】形質移入の前に硫酸デキストランを高密度シードトレインに含めると、ＡＡＶ力価が増加する。
【図12】形質移入の前に硫酸デキストランをシードトレインに含めると、ＡＡＶ力価が増加する。
【発明を実施するための形態】
【0066】
詳細な説明
驚くべきことに、硫酸デキストランが、一過性形質移入に基づく生成方法でｒＡＡＶ力価を増加可能であることが見出された。硫酸デキストランは一過性形質移入を阻害することが知られているため、この発見は予想外であった。例えば、Ｇｅｎｇら（２００７）は５５ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を完全に阻害すると結論付けている。同様に、最近発表されたＰＡＬＬ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈによる“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ ａｎｄ ｉＣＥＬＬｉｓ ５００＋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”（“２０２０ Ｇｕｉｄｅ”）では、９ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を阻害することを教示している。例えばＧｅｎｇら（２００７）及び２０２０ Ｇｕｉｄｅの教示を考慮する当業者であれば、一過性形質移入に基づく方法によるｒＡＡＶ生成は、形質移入中に硫酸デキストランが細胞培養物中に存在することによって阻害されるか、または少なくとも生産性が低くなることを合理的に予想したことであろう。これに対し、実施例で論じているように、硫酸デキストランの存在に対する硫酸デキストランが形質移入培地中に存在すると、驚くほどｒＡＡＶ生成が増加した。異なる細胞培養基、宿主細胞クローン、及び生成体積を用いて異なるカプシド血清型または導入遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生成するプロセスにおいて、ｒＡＡＶ生成の増加が観察された。
驚くべきことに、硫酸デキストランが、一過性形質移入に基づく生成方法でｒＡＡＶ力価を増加可能であることが見出された。硫酸デキストランは一過性形質移入を阻害することが知られているため、この発見は予想外であった。例えば、Ｇｅｎｇら（２００７）は５５ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を完全に阻害すると結論付けている。同様に、最近発表されたＰＡＬＬ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈによる“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ ａｎｄ ｉＣＥＬＬｉｓ ５００＋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”（“２０２０ Ｇｕｉｄｅ”）では、９ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を阻害することを教示している。例えばＧｅｎｇら（２００７）及び２０２０ Ｇｕｉｄｅの教示を考慮する当業者であれば、一過性形質移入に基づく方法によるｒＡＡＶ生成は、形質移入中に硫酸デキストランが細胞培養物中に存在することによって阻害されるか、または少なくとも生産性が低くなることを合理的に予想したことであろう。これに対し、実施例で論じているように、硫酸デキストランの存在に対する硫酸デキストランが形質移入培地中に存在すると、驚くほどｒＡＡＶ生成が増加した。異なる細胞培養基、宿主細胞クローン、及び生成体積を用いて異なるカプシド血清型または導入遺伝子を含むｒＡＡＶ粒子を生成するプロセスにおいて、ｒＡＡＶ生成の増加が観察された。
【0067】
これらの驚くべき発見を、本明細書に記載の細胞に形質移入する方法、組換えポリペプチドを生成する方法、組換えウイルス粒子（例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子）を生成する方法、組換えポリペプチドの生成を改善する方法、及び組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を改善する方法を開発するために使用した。いくつかの実施形態において、当該方法は、細胞及び硫酸デキストランを含む培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長する接着性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞を含む浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0068】
１つの治療単位用量を調製するのに極めて多数のｒＡＡＶ粒子が必要であることを考えると、ｒＡＡＶ収量の任意の増加により、単位用量当たりの製品コストが低減する。ウイルス収量が増加すれば、それに応じて、ｒＡＡＶ粒子の生成に必要な消耗品のコストだけでなく、工業用ウイルス精製施設の建設に関連する設備投資のコストも低減することができる。
【0069】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
【0070】
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示す。
【0071】
「硫酸デキストラン」という用語は、グルコースモノマー間のα－１，６グリコシド結合のポリマー主鎖と、α－１，３結合からの分岐とを含む硫酸化多糖を意味する。硫酸デキストランは、例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から商業的に入手することができる。「硫酸デキストラン」は、遊離酸及びその塩の両方を包含するものと理解されたい。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは遊離酸である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、一価カチオンを含む塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、またはＣｓ塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランはＮａ塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、約１０％～約２５％の硫黄を含む。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、約１５％～約２０％の硫黄を含む。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの各グルコシル残基は、平均１～３個の硫酸基を含む。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの各グルコシル残基は、平均２～３個の硫酸基を含む。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは約１７％の硫黄を含み、これはグルコシル残基当たりおよそ２．３個の硫酸基に相当する。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は、約３ｋＤａ～約５００ｋＤａ、約３ｋＤａ～約２５０ｋＤａ、約３ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約３ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約３ｋＤａ～約２５ｋＤａ、または約３ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は、約５ｋＤａ～約５００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ、または約５ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約３ｋＤａ～約２５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約３ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約４ｋＤａ～約２５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約４ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約５ｋＤａ～約２５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約５ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランの平均分子量は約５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、約３ｋＤａから１０ｋＤａの間の平均分子量を有するナトリウム塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランは、約５ｋＤａの平均分子量を有するナトリウム塩である。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランはナトリウム塩であり、約１５％～２０％の硫黄を含み、約３ｋＤａから１０ｋＤａの間の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、硫酸デキストランはナトリウム塩であり、約１７％の硫黄を含み、約５ｋＤａの平均分子量を有する。
【0072】
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」とは霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」とは非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」とはウシ哺乳類に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。
【0073】
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
【0074】
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターゲノムとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。
【0075】
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。
【0076】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプからなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。
【0077】
「細胞培養物」という用語は、接着してまたは浮遊液中で成長させる細胞、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコなどに加えて、上清または浮遊液自体の構成成分を意味し、このような構成成分としては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞デブリ、細胞混入物、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸、脂質、及び凝集剤が挙げられる。また、バイオリアクターなどの大規模アプローチ（浮遊培養物、及び撹拌バイオリアクター内のマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長させる付着細胞が含まれる）も「細胞培養物」という用語に包含される。タンパク質の大規模生産及び小規模生産いずれのための細胞培養手順も、本開示に包含される。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、浮遊状態で成長した細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長した接着性細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、灌流培養物中で成長した細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養物中で成長した細胞を意味する。
【0078】
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのターゲット生成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶゲノム）の純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。
【0079】
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
【0080】
諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
【0081】
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【0082】
本開示の実施形態がマルクーシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
【0083】
細胞に形質移入する方法
１つの態様において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の当該培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。
１つの態様において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の当該培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。
【0084】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。
【0085】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0086】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0087】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞に形質移入する方法であって、（ａ）細胞を細胞培養物中で培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することとを含む、方法を提供する。
【0088】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0089】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約６ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約７ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約８ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0090】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0091】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0092】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0093】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0094】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0095】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0096】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0097】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0098】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。
【0099】
細胞に形質移入するために、当技術分野で知られている任意の好適な形質移入試薬を使用することができる。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性有機キャリアを含む。例えば、Ｇｉｇａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ １０（１０）：１６９２－１７１８（２０１９）；Ｄａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ ９（９）：１４０４－１４２５（２０１８）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ヘルパー脂質（Ｄｏｐｅ、コレステロール）、及びこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、多価カチオン性脂質、例えば、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、双極性脂質、またはボラ両親媒性物質（ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）（ボラ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、生物学的還元性及び／または二量体化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ジェミニ界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＰＬＵＳ ２０００（商標）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ポリマー、例えば、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖（キトサン、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ））、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、及びデンドリマー（ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ））を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ペプチド、例えば、塩基性アミノ酸に富むペプチド（ＣＷＬ１８）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（Ａｒｇに富むペプチド（オクタアルギニン、ＴＡＴ））、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０）、及びターゲティング（ＲＧＤ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、カチオン性リポソームと組み合わせたポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。Ｐａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５（１４）：３２７７（２０２０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）。 いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを含む。
【0100】
いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ）、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は直鎖状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は分枝状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、約５から約２５ｋＤａの間の分子量を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＧ化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、疎水性部位（例えば、コレステロール、コリン、アルキル基、及びいくつかのアミノ酸）が付着した修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0101】
当技術分野で知られている任意の細胞培養系を使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は接着細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長した接着性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は灌流培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養物である。
【0102】
いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。
【0103】
いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性のＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性のＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、またはＣＨＯ由来細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性ＣＨＯ細胞を含む。
【0104】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する。
【0105】
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書で開示される方法は、形質移入の効率を増加させ、その結果、本明細書で開示される方法に従って形質移入された細胞は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で形質移入された対照細胞よりも、１つ以上のポリヌクレオチドを含む可能性が高くなる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物を用いた対照方法と比較して、形質移入の効率を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％増加させる。形質移入効率を測定する方法は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態において、形質移入効率は、レポーター導入遺伝子コンストラクト（例えば、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）をコードするレポーター導入遺伝子）を用いて測定される。
【0106】
組換えウイルス粒子を生成する方法
１つの態様において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
１つの態様において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
【0107】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
【0108】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0109】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0110】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0111】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
【0112】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、（ａ）組換えウイルス粒子の生成に適した細胞を細胞培養物中で約１日から約５日の間培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）（ａ）の培養物に、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
【0113】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0114】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約６ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約７ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約８ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0115】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0116】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0117】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0118】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0119】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0120】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0121】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0122】
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスまたはチンパンジーアデノウイルス）粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えレンチウイルス粒子である。
【0123】
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0124】
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は導入遺伝子を含む。特定の宿主細胞での使用に適した様々なウイルス導入遺伝子発現系が当業者に知られている。任意のウイルス導入遺伝子発現系を、本明細書で開示される方法に従って使用することができることを理解されたい。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、調節エレメント及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは異種である。
【0125】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜結合型スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0126】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子は異種ウイルスポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ウイルスポリペプチドはコロナウイルスポリペプチドである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えチンパンジーアデノウイルス粒子である。
【0127】
形質移入に基づく組換えウイルス粒子生成系は、当業者に知られている。例えば、Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（１１）：９１０－３（２０００）；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１（１９９８）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７（１１）６１０８－６１１３（２０００）；Ｍｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（２６）：３４２３－３４３０ （２０１７）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。本明細書で開示される方法は、形質移入に基づく生成系で組換えウイルス粒子を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えデングウイルス、組換えエボラウイルス、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えレンチウイルス、組換えインフルエンザウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、組換えポリオウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えワクシニア、組換えレオウイルス、組換え麻疹、組換えニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、組換え帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、または組換えバキュロウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えレンチウイルス、または組換えインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えバキュロウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
【0128】
当技術分野で知られている細胞に形質移入するための任意の好適な形質移入試薬を、本明細書で開示される方法に従って組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成に使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、化学ベースの形質移入法を用いて細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、カチオン性有機キャリアを用いて細胞に形質移入することを含む。例えば、Ｇｉｇａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ １０（１０）：１６９２－１７１８（２０１９）；Ｄａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ ９（９）：１４０４－１４２５（２０１８）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ヘルパー脂質（Ｄｏｐｅ、コレステロール）、及びこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、多価カチオン性脂質、例えば、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、双極性脂質、またはボラ両親媒性物質（ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）（ボラ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、生物学的還元性及び／または二量体化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ジェミニ界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＰＬＵＳ ２０００（商標）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ポリマー、例えば、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖（キトサン、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ））、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、及びデンドリマー（ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ））を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ペプチド、例えば、塩基性アミノ酸に富むペプチド（ＣＷＬ１８）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（Ａｒｇに富むペプチド（オクタアルギニン、ＴＡＴ））、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０）、及びターゲティング（ＲＧＤ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、カチオン性リポソームと組み合わせたポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。Ｐａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５（１４）：３２７７（２０２０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）． いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを含む。
【0129】
いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ）、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は直鎖状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は分枝状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、約５から約２５ｋＤａの間の分子量を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＧ化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、疎水性部位（例えば、コレステロール、コリン、アルキル基、及びいくつかのアミノ酸）が付着した修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0130】
１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物は、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和することによって調製され、これは、形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドの各々を無菌液体（例えば、組織培養基）に希釈することと、希釈された形質移入試薬及び希釈された１つ以上のポリヌクレオチドを混和することとを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及び／または１つ以上のポリヌクレオチドの希釈に使用される組織培養基は、硫酸デキストランを含まない。当業者は、希釈及び混合が、形質移入試薬及びポリヌクレオチドを所望の比率及び濃度で含む組成物を生成するように行われることを理解する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドの希釈及び混合は、形質移入試薬及びポリヌクレオチドを約１：５から５：１の間の重量比で含む組成物を生成する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：３から３：１の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：３から１：１の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：２から１：１．５の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は、約１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７５、１：１．５、１：１．２５、１：１、１．２５：１、１：５：１、１：７５：１、２：１、２：５：１、３：１、４：１、または５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：２である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．７５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．２５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬とポリヌクレオチドとの重量比は約１：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬とポリヌクレオチドとの重量比は約１．２５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬とポリヌクレオチドとの重量比は約１．５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬とポリヌクレオチドとの重量比は約１．７５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬とポリヌクレオチドとの重量比は約２：１である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは３つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは２つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは１つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えＡＡＶであり、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩである。
【0131】
いくつかの実施形態において、形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の形成を可能にするために、培養物に添加する前にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、インキュベートは室温で行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは組成物を、例えば、シェーカーにおいて約１００ｒｐｍから約２００ｒｐｍの間で振とうすることを含む。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約１０分～約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、１５分以下の間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、１０分以下の間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分間、約１０分間、または約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
【0132】
いくつかの実施形態において、培養物に添加される、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物の体積は、培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、添加される組成物の体積は、培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、添加される組成物の体積は、培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0133】
いくつかの実施形態において、培養物は、約４００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約５００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約７００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約１，０００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約４００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約５００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約７００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約１，０００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約５００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約７００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約１，０００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0134】
いくつかの実施形態において、培養物は、約２００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約２００リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約２００リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は、約２００リットルから約５００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0135】
いくつかの実施形態において、培養物は約２００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約３００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約４００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約７５０リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約１，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約３，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物は約５，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、培養物は、約２ｘ１０Ｅ＋６から約１０Ｅ＋７の生存細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約３ｘ１０Ｅ＋６から約８ｘ１０Ｅ＋６の生存細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、培養物は約３ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物は約４ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物は約５ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物は約６ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物は約７ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物は約８ｘ１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0137】
いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。
【0138】
いくつかの実施形態において、培養物は、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加してから約２日から約１０日の間維持される。いくつかの実施形態において、培養物は、組成物を添加してから約５日から約１４日またはそれ以上の間維持される。いくつかの実施形態において、培養物は、組成物を添加してから約２日から約７日の間維持される。いくつかの実施形態において、培養物は、組成物を添加してから約３日から約５日の間維持される。いくつかの実施形態において、培養物は、組成物を添加してから約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される。いくつかの実施形態において、培養物は、組成物を添加してから約５日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、組成物を添加してから約６日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
【0139】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で細胞に形質移入することを含む参照方法と比較して、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で細胞に形質移入することを含む参照方法よりも、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１，９倍、または２倍多くのウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で細胞に形質移入することを含む参照方法よりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多くのウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で細胞に形質移入することを含む参照方法よりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多くのウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約１０％多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約２０パーセント多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約２０パーセント多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約２０パーセント多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約７０パーセント多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、参照方法よりも少なくとも約１００パーセント多いウイルス粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えウイルスの生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えウイルスの生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶの生成を少なくとも約２倍増加させる。いくつかの実施形態において、生成の増加は、生成培養物の組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）力価を比較することによって定量される。いくつかの実施形態において、組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）力価は、生成培養物のミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
【0140】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質属性を維持または改善しながら、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質は、ｒＡＡＶ粒子の濃度（例えば、ＧＣ／ｍｌ）、ｒＡＡＶゲノムのコピーを含む粒子のパーセンテージ、ゲノムを含まない粒子の比率、ｒＡＡＶ粒子の感染性、ｒＡＡＶ粒子の安定性、残留する宿主細胞タンパク質の濃度または残留する宿主細胞核酸の濃度（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、ヘルパー機能をコードするプラスミド、ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド）を定量することにより、評価される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質と同じである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質よりも良好である。
【0141】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【0142】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【0143】
当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られており、これらはいずれも、本明細書で開示される方法の実施に使用することができる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物は、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。
【0144】
当業者は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、ならびにｒＡＡＶゲノム（逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的遺伝子を含む）を細胞に導入して、ｒＡＡＶを生成またはパッケージングすることができる多数の方法を認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という表現は、ＡＡＶが細胞内で効率的に成長するように細胞内で（ＲＮＡまたはタンパク質として）発現する複数のウイルスヘルパー遺伝子を意味する。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含めたヘルパーウイルスがＡＡＶ複製を促進すること、そして、必須機能を提供するある特定の遺伝子が同定されており、例えば、ヘルパーが、このようなＡＡＶ遺伝子発現及び複製を促進する細胞環境への変化を誘導し得ることを理解している。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターの形質移入により、細胞に導入される。
【0145】
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発する分子生物学技法は、当技術分野で一般的に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えばベクターを用いた形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、３つのポリヌクレオチドの混合物（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）を細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型からのものである。
【0146】
任意のベクターの組合せを使用して、ｒＡＡＶ粒子が生成またはパッケージングされる細胞に、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムを導入することができる。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する対象遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクターと、ヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターとを使用することができる。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物を細胞内に同時形質移入する。
【0147】
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターに加えてウイルスベクターを共に使用することにより、形質移入及び感染の組合せが使用される。
【0148】
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のうちの１つ以上ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子は、細胞によって構成的に発現し、細胞に形質移入または形質導入する必要がない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定的な導入遺伝子を含む。
【0149】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲも、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子生成のためのＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型からのものである。例えば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２からのものであり、一方ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９からのものである。
【0150】
当技術分野で知られている任意の好適な培地を、本明細書で開示される方法に従って組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、またはＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む細胞培養物を使用する。いくつかの実施形態において、培地は、動物成分フリー培地である。いくつかの実施形態において、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、ウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、無グルタミン培地である。いくつかの実施形態において、培地は、グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、培地には、栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）のうちの１つ以上が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、グルタミンが補充される。いくつかの実施形態において、培地には、血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ウシ胎児血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ポロキサマー、例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ １８８ Ｂｉｏが補充される。いくつかの実施形態において、培地は、基本培地である。いくつかの実施形態において、培地は、フィード培地である。
【0151】
組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶウイルス生成培養物には、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、及びＳＦ－９細胞が含まれ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。
【0152】
当技術分野で組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成することが知られている任意の細胞または細胞株を、本明細書で開示される方法のいずれか１つで使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成する、または組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を増加させる方法は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＰＫ１５細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、哺乳類細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、昆虫細胞、例えばＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、浮遊培養での成長に適応した細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を使用する。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えＡＡＶ粒子である。
【0153】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される大規模浮遊細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。いくつかの実施形態において、浮遊適応性細胞は、振とうフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクター中で培養される。
【0154】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。
【0155】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される大規模浮遊培養細胞培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0156】
本明細書で開示される方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の生成で使用することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【0157】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0158】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【0159】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0160】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0161】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有する、カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0162】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
【0163】
ｒＡＡＶ粒子
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
【0164】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0165】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0166】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が援用される）で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0167】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
【0168】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）。
【0169】
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
【0170】
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は表１Ａ～１Ｃからのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）抗体の軽鎖Ｆａｂ及び重鎖Ｆａｂ、または少なくとも重鎖または軽鎖Ｆａｂ、ならびに任意選択で重鎖Ｆｃ領域をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトまたは実質的にインタクトなｍＡｂを発現させるためのさらに他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロン；ならびに（３）以下のものの重鎖Ｆａｂをコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）；任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはこれらの修飾Ｆｃ；ならびに以下のものの軽鎖をコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５もしくは抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）。このとき、重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに軽鎖は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーによって分離され、重鎖及び軽鎖ポリペプチドが等しい量で発現するのを確実にする。
【0171】
【表1A】
【0172】
【表1B】
【0173】
【表1C】
【0174】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。より特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＶＥＧＦ受容体１の非膜結合型スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。
【0175】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0176】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質キメラである。
【0177】
ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６：１２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
【0178】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0179】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0180】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0181】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【0182】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクター、ならびに（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されたカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されたシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0183】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質との、ＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ｒＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質との、ＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質との、ＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質との、ＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
【0184】
ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
【0185】
いくつかの実施形態において、本開示はさらに、医薬単位薬用量の単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む、方法を提供する。
【0186】
単離されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0187】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法にしたがって生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0188】
当技術分野では、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含むｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、またはバキュロウイルス生成系の場合は昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めた、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。
【0189】
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
【0190】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
【0191】
提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。
【0192】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の生成のための方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を添加することと、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを包含する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。
【0193】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０２０／０３３８４２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているように生成される。
【0194】
インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を収集することにより、または生成培養物から消費培地を収集することにより、組換えＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
【0195】
収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
【0196】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。
【0197】
いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。
【0198】
いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は濾過によって清澄化され、これはＷＯ２０１９／２１２９２１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
【0199】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度から３７℃までの範囲の温度の最終濃度１～２．５単位／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分～数時間の間実施される。
【0200】
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。
【0201】
いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍から少なくとも１０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍から少なくとも２０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍から少なくとも５０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３から約１０の間の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。
【0202】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
【0203】
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、最終濃縮及び研磨ステップとしてアフィニティークロマトグラフィーの後に使用される。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ－荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で知られているＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ６（５）：６７８－６８６（２００２）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２０７９－２０９１（２０００））。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ－８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者は、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されるものではないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液が特定され得ることを理解することができる。
【0204】
いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＷＯ２０１９／２４１５３５（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示される方法に従って実施される。
【0205】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物中のベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比を定量することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量される。いくつかの実施形態において、カプシド力価は、血清型特異的ＥＬＩＳＡによって定量される。いくつかの実施形態において、完全なカプシド：空のカプシドの比は、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって定量される。
【0206】
いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比は、分光測光法により、例えば、２６０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、定量される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性されない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、分光光度計を用いて定量される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、ＨＰＬＣを用いて定量される。いくつかの実施形態において、吸光度はピーク吸光度である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定するためのいくつかの方法が、当技術分野で知られている。単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価及びカプシド力価を定量する方法は、ＷＯ２０１９／２１２９２２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
【0207】
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法に従って生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【0208】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５を参照）。
【0209】
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、薬用量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ９である。
【0210】
組換えポリペプチドを生成する方法
１つの態様において、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。
１つの態様において、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を含む細胞培養物を準備することであって、当該培養物が、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む、準備することと、（ｂ）ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。
【0211】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランを含む。
【0212】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0213】
いくつかの実施形態において、ａ）の培養物は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む。
【0214】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドの生成に適した細胞を細胞培養物中で培養することであって、当該培養物が、約１ｍｇ／Ｌから約２０ｍｇ／Ｌの間の開始硫酸デキストラン濃度及び約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の最終硫酸デキストラン濃度を含む、培養することと、（ｂ）ａ）の培養物に、ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び形質移入試薬を含む組成物を添加することにより、細胞に形質移入することと、（ｃ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えポリペプチドの生成を可能にする条件下で維持することとを含む、方法を提供する。
【0215】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0216】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約６ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約７ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約８ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0217】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0218】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0219】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約１．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約３．５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0220】
いくつかの実施形態において、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0221】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約３ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約０．５ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌの間、約１ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌの間、または約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約３ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約１ｍｇ／Ｌから約３ｍｇ／Ｌの間の硫酸デキストランである。
【0222】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、または約１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約０．５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、または約５ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0223】
いくつかの実施形態において、開始硫酸デキストラン濃度は、約４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランであり、最終硫酸デキストラン濃度は、約２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランである。
【0224】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した調節エレメントを含む。
【0225】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、酵素、融合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは酵素を含む。
【0226】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、抗体全体及び抗体フラグメント（抗体の任意の機能的ドメイン、例えば、抗原結合フラグメントもしくはその一本鎖、エフェクタードメイン、サルベージ受容体結合エピトープ、またはこれらの一部を含む）を包含する。典型的な抗体は、少なくとも２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）がジスルフィド結合によって相互接続している。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。いくつかの実施形態において、軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ１を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、この領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と称されるより保存的な領域と共に散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＷから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４に並んでいる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが、宿主組織または因子（免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的相補システムの第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む）に結合するのを媒介し得る。本開示の抗体の非限定的なタイプとしては、典型的な抗体、ｓｃＦｖ、及びこれらの組合せが挙げられる。
【0227】
「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部を意味し、また抗体の任意の機能的ドメイン（例えば、抗原結合フラグメントまたはその一本鎖、エフェクタードメインまたはその一部）を意味する。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、直鎖状抗体、一本鎖抗体、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。本明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」は、抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【0228】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」または単に「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味するものと理解されたい。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、（２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、または（５）２つ以上のドメイン及び免疫グロブリンヒンジ領域の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。他のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、及びＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用することもできる。特定の結果を達成するために、特定の免疫グロブリンのクラス及びサブクラスから特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を選択することは、当業者のレベルの範囲内であると考えられる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡコンストラクトの一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部を含み、好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本明細書で開示される方法及び組成物の実施に有用であることが企図されている。一例として、上方のＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減したＦｃバリアントを作出することが考えられる（Ｃｏｌｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３（１９９７））。
【0229】
特定の宿主細胞内で組換えポリペプチドを生成するのに適した様々な組換え発現系が当業者に知られている。任意の組換え発現系を、本明細書で開示される方法に従った組換えポリペプチドの生成に使用することができることを理解されたい。
【0230】
当技術分野で知られている細胞に形質移入するための任意の好適な形質移入試薬を、本明細書で開示される方法に従った組換えポリペプチドの生成に使用することができる。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性有機キャリアを含む。例えば、Ｇｉｇａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ １０（１０）：１６９２－１７１８（２０１９）；Ｄａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｃｈｅｍｃｏｍｍ ９（９）：１４０４－１４２５（２０１８）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ヘルパー脂質（Ｄｏｐｅ、コレステロール）、及びこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、多価カチオン性脂質、例えば、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、双極性脂質、またはボラ両親媒性物質（ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）（ボラ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、生物学的還元性及び／または二量体化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ジェミニ界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＰＬＵＳ ２０００（商標）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ポリマー、例えば、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖（キトサン、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ））、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、及びデンドリマー（ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ））を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ペプチド、例えば、塩基性アミノ酸に富むペプチド（ＣＷＬ１８）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（Ａｒｇに富むペプチド（オクタアルギニン、ＴＡＴ））、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０）、及びターゲティング（ＲＧＤ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、カチオン性リポソームと組み合わせたポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。Ｐａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５（１４）：３２７７（２０２０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）． いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを含む。
【0231】
いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ）、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ））、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は直鎖状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は分枝状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、約５から約２５ｋＤａの間の分子量を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＧ化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、疎水性部位（例えば、コレステロール、コリン、アルキル基、及びいくつかのアミノ酸）が付着した修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
【0232】
当技術分野で知られている任意の細胞培養系を、本明細書で開示される方法に従った組換えポリペプチドの生成に使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は接着細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長した接着性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は灌流培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養物である。
【0233】
いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。
【0234】
いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性のＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性のＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、またはＣＨＯ由来細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊適応性ＣＨＯ細胞を含む。
【0235】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する。
【0236】
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書で開示される方法は、形質移入の効率を増加させ、その結果、本明細書で開示される方法に従って形質移入された細胞は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物中で形質移入された対照細胞よりも、多くの組換えポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、硫酸デキストランを含まない細胞培養物を用いた対照方法よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％多くの組換えポリペプチドを生成する。組換えポリペプチド生成を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチド生成は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳアッセイ、または機能的アッセイ（例えば、組換え発現ポリペプチドの触媒活性を測定するためのアッセイ）を用いて測定される。
【0237】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組換えポリペプチドを生成する方法はさらに、ポリペプチドを単離することを含む。組換え発現ポリペプチドを単離するための様々な方法が当業者に知られている。組換え発現ポリペプチドを単離するための任意の知られている方法を、本明細書で開示される方法に従って使用することができることを理解されたい。いくつかの実施形態において、組換え発現ポリペプチドを単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離もしくは深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。
【実施例】
【0238】
実施例１：硫酸デキストランは、一過性形質移入に基づく系で驚くほどＡＡＶ生成を増加させる。
本発明者らは、驚くべきことに、硫酸デキストランが、一過性形質移入に基づく生成方法でＡＡＶ力価を増加可能であることを見出した。交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養技術について試験して、大規模な一過性形質移入に基づくＡＡＶ生成培養物のためのシード細胞を生成した。高密度灌流リアクターからの浮遊適応性ＨＥＫ細胞を生成培養物の播種に使用した場合、組換えＡＡＶの生成は５倍低減した。力価が低下した原因として考えられることは、高密度灌流培養物でもたらされたシード細胞の凝集の増加であり、これが、播種密度及び成長速度のばらつき、ならびに不正確な形質移入試薬濃度をもたらした可能性がある。硫酸デキストランのような細胞培養物添加剤は、凝集を低減することが知られていたものの、これらの薬剤は一過性形質移入を妨害することが知られているため、これらの薬剤の使用は、一過性形質移入のための細胞の生成においては有力な選択肢とみなされていなかった。例えば、Ｇｅｎｇら（２００７）は５５ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を完全に阻害すると結論付けている。同様に、最近発表されたＰＡＬＬ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈによる“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ ａｎｄ ｉＣＥＬＬｉｓ ５００＋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”では、９ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を阻害することを教示している。
本発明者らは、驚くべきことに、硫酸デキストランが、一過性形質移入に基づく生成方法でＡＡＶ力価を増加可能であることを見出した。交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養技術について試験して、大規模な一過性形質移入に基づくＡＡＶ生成培養物のためのシード細胞を生成した。高密度灌流リアクターからの浮遊適応性ＨＥＫ細胞を生成培養物の播種に使用した場合、組換えＡＡＶの生成は５倍低減した。力価が低下した原因として考えられることは、高密度灌流培養物でもたらされたシード細胞の凝集の増加であり、これが、播種密度及び成長速度のばらつき、ならびに不正確な形質移入試薬濃度をもたらした可能性がある。硫酸デキストランのような細胞培養物添加剤は、凝集を低減することが知られていたものの、これらの薬剤は一過性形質移入を妨害することが知られているため、これらの薬剤の使用は、一過性形質移入のための細胞の生成においては有力な選択肢とみなされていなかった。例えば、Ｇｅｎｇら（２００７）は５５ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を完全に阻害すると結論付けている。同様に、最近発表されたＰＡＬＬ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈによる“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００ ａｎｄ ｉＣＥＬＬｉｓ ５００＋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”では、９ページにおいて、硫酸デキストランがＰＥＩ媒介性形質移入を阻害することを教示している。
【0239】
硫酸デキストランが形質移入を阻害するという教示があるにもかかわらず、本発明者らは、一過性形質移入に基づくＡＡＶ生成系で硫酸デキストランがＡＡＶ力価に及ぼす影響について試験を行った。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、組換えＡＡＶを生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、２５０ｍｌの振とうフラスコで４８時間、０．３～１０ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む培地中で増やした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の５日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＰＣＲに基づく方法を用いて、培養物上清中のＡＡＶ力価を定量した。導入遺伝子１及び導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を用いて得られた力価を、それぞれ図１及び２に示す。驚くべきことに、０．６５２ｍｇ／Ｌから２．５ｍｇ／Ｌの間の濃度（図１）、及び１．７ｍｇ／Ｌから３．６ｍｇ／Ｌの間の濃度で硫酸デキストランが存在すると、ＡＡＶ力価の増加がもたらされた。この知見は、硫酸デキストランが一過性形質移入を阻害するという先行技術の明確な教示を考慮すれば予想外であるが、この教示は、１０ｍｇ／Ｌ以上の硫酸デキストラン（図１）がＡＡＶ生成を阻害したという知見とは整合するものである。硫酸デキストランは、０．３１３ｍｇ／Ｌで使用した場合、ＡＡＶ力価に及ぼす有意な効果を有しなかった（図１）。
【0240】
実施例２：ベンチスケール２Ｌリアクターにおいて硫酸デキストランがＡＡＶ力価に及ぼす効果。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、２Ｌリアクター内で３日間、様々な濃度の硫酸デキストランを含む培地中で増やした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。図３。細胞密度及び細胞生存率を毎日定量した。図５及び図６。細胞形態を４日目に評価した（図４）。２．５～４．２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度範囲は、２Ｌリアクターでの形質移入を阻害せず、生存率及び生細胞密度の増加を含めて細胞形態に有益であった。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、２Ｌリアクター内で３日間、様々な濃度の硫酸デキストランを含む培地中で増やした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。図３。細胞密度及び細胞生存率を毎日定量した。図５及び図６。細胞形態を４日目に評価した（図４）。２．５～４．２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度範囲は、２Ｌリアクターでの形質移入を阻害せず、生存率及び生細胞密度の増加を含めて細胞形態に有益であった。
【0241】
実施例３：ベンチスケール５Ｌリアクターにおいて硫酸デキストランがＡＡＶ力価に及ぼす効果。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、５Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む培地中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を用いて細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。ＡＡＶ上清または溶解力価は、硫酸デキストランの添加により、それぞれ平均３５～４０％増加した。図７。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、５Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む培地中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を用いて細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。ＡＡＶ上清または溶解力価は、硫酸デキストランの添加により、それぞれ平均３５～４０％増加した。図７。
【0242】
実施例４：異なる培養基中で硫酸デキストランがＡＡＶ力価に及ぼす効果。
市販の異なる培養基（図８のＭ１、Ｍ２、及びＭ３）中で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、２Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む異なる培養基中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。図８。Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３培地において、硫酸デキストランを培養に含めると、細胞の溶解から回収される力価がそれぞれ２５％、１３０％、及び１０％増加した。
市販の異なる培養基（図８のＭ１、Ｍ２、及びＭ３）中で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、２Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む異なる培養基中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、培養物上清から、または細胞溶解後の培養物から回収した。図８。Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３培地において、硫酸デキストランを培養に含めると、細胞の溶解から回収される力価がそれぞれ２５％、１３０％、及び１０％増加した。
【0243】
実施例５：異なる宿主細胞クローンを用いた場合に硫酸デキストランがＡＡＶ力価に及ぼす効果。
異なるＨＥＫ２９３宿主細胞クローンを用いて、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。異なるＨＥＫ２９３細胞クローンの一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞クローンを、振とうフラスコで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む培養基中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を培養物上清から回収した。図９。ＡＡＶ８力価は、調べた５つ全てのＨＥＫ細胞クローンにおいて、硫酸デキストランを含めることで増加した。ＡＡＶ８力価は、５つの異なるＨＥＫ細胞クローンにおいて、硫酸デキストランを含めることで平均１８％増加した。
異なるＨＥＫ２９３宿主細胞クローンを用いて、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。異なるＨＥＫ２９３細胞クローンの一過性形質移入により、導入遺伝子２を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞クローンを、振とうフラスコで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含む培養基中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を培養物上清から回収した。図９。ＡＡＶ８力価は、調べた５つ全てのＨＥＫ細胞クローンにおいて、硫酸デキストランを含めることで増加した。ＡＡＶ８力価は、５つの異なるＨＥＫ細胞クローンにおいて、硫酸デキストランを含めることで平均１８％増加した。
【0244】
実施例６：ベンチスケール５Ｌリアクターにおいて硫酸デキストランがＡＡＶ９力価に及ぼす効果。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ９生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子３を含む組換えＡＡＶ９を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、５Ｌリアクターで３日間、硫酸デキストランを４ｍｇ／Ｌの濃度で含む培地中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の５日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。図１０。ＡＡＶ９上清の力価は、硫酸デキストランを含めることで平均３０％増加した。
ベンチスケールリアクター内で、硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ９生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子３を含む組換えＡＡＶ９を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、５Ｌリアクターで３日間、硫酸デキストランを４ｍｇ／Ｌの濃度で含む培地中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して２ｍｇ／Ｌの硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の５日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。図１０。ＡＡＶ９上清の力価は、硫酸デキストランを含めることで平均３０％増加した。
【0245】
実施例７：硫酸デキストランが、形質移入前のシード細胞トレイン中及び生成培養中の両方に使用した場合にＡＡＶ力価に及ぼす効果（導入遺伝子３）。
２００Ｌ生成培養物中のＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子３を含む組換えＡＡＶ９を生成した。４ｍｇ／Ｌ硫酸デキストランの存在下での高密度灌流培養ステップを含むシードトレインを用いて、ＨＥＫ細胞を増やした。２００Ｌの生成培養物にＨＥＫシード細胞を接種し、形質移入の前に、硫酸デキストラン濃度を生成培養物中２ｍｇ／Ｌに調整した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の５日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。培養物上清（図１１の黒色の棒）または細胞溶解後の培養物（図１１の灰色の棒）のいずれかからＡＡＶ粒子を回収した。対照生成培養物には、硫酸デキストラン非存在下で増やしたＨＥＫシード細胞を接種した。図１１。シード細胞増殖中及び生成培養物の形質移入中の両方に硫酸デキストランを使用した場合、ＡＡＶ９力価は３０％増加した。
２００Ｌ生成培養物中のＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子３を含む組換えＡＡＶ９を生成した。４ｍｇ／Ｌ硫酸デキストランの存在下での高密度灌流培養ステップを含むシードトレインを用いて、ＨＥＫ細胞を増やした。２００Ｌの生成培養物にＨＥＫシード細胞を接種し、形質移入の前に、硫酸デキストラン濃度を生成培養物中２ｍｇ／Ｌに調整した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の５日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。培養物上清（図１１の黒色の棒）または細胞溶解後の培養物（図１１の灰色の棒）のいずれかからＡＡＶ粒子を回収した。対照生成培養物には、硫酸デキストラン非存在下で増やしたＨＥＫシード細胞を接種した。図１１。シード細胞増殖中及び生成培養物の形質移入中の両方に硫酸デキストランを使用した場合、ＡＡＶ９力価は３０％増加した。
【0246】
実施例８：硫酸デキストランが、形質移入前のシードトレイン中及び生成培養中の両方に使用した場合にＡＡＶ力価に及ぼす効果（導入遺伝子１）。
ベンチスケールリアクター内で、シードトレイン中の硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子１を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、硫酸デキストランを含むまたは含まない培地中で５継代（１８日間）増やした。次いで細胞を、三重反復の２Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含むまたは含まない（０）培地（シードトレイン）中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して、それぞれ２ｍｇ／Ｌまたは０の硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、細胞の溶解後に培養物から回収した。ＡＡＶ溶解力価は、硫酸デキストランをシードトレイン及び生成培養物に含めることで平均１０～１５％増加した（統計的有意差ｐ＜０．０５）。図１２。
ベンチスケールリアクター内で、シードトレイン中の硫酸デキストランが形質移入に基づくＡＡＶ生成に及ぼす効果について調べた。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入により、導入遺伝子１を含む組換えＡＡＶ８を生成した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、硫酸デキストランを含むまたは含まない培地中で５継代（１８日間）増やした。次いで細胞を、三重反復の２Ｌリアクターで３日間、４ｍｇ／Ｌの硫酸デキストランを含むまたは含まない（０）培地（シードトレイン）中で増やした。形質移入の前に、培養物を新鮮培地で１：１に希釈して、それぞれ２ｍｇ／Ｌまたは０の硫酸デキストラン濃度を得た。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入した培養物を、形質移入後の４日間維持してＡＡＶ生成を可能にした。ＡＡＶ粒子を、細胞の溶解後に培養物から回収した。ＡＡＶ溶解力価は、硫酸デキストランをシードトレイン及び生成培養物に含めることで平均１０～１５％増加した（統計的有意差ｐ＜０．０５）。図１２。
【0247】
本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
【0248】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】