特表 2024-503933 ＣＤ１６Ａに対する単一ドメイン抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-29

(54)【発明の名称】ＣＤ１６Ａに対する単一ドメイン抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240122BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240122BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240122BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240122BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240122BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240122BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240122BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240122BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240122BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240122BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240122BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C07K16/30

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545305

(86)(22)【出願日】2022-01-24

(85)【翻訳文提出日】2023-09-22

(86)【国際出願番号】 CN2022073488

(87)【国際公開番号】W WO2022161314

(87)【国際公開日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】202110112841.1

(32)【優先日】2021-01-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100203828

【弁理士】

【氏名又は名称】喜多村 久美

(72)【発明者】

【氏名】フー スーイー

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA26X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA92Y

4B065AA93X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、上記抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体を一部として含む単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子に関する。本発明は、上記抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子をコードする核酸、および上記核酸を含む宿主細胞、ならびに上記抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子を調製する方法にさらに関する。また、本発明は、急性および慢性感染性疾患（例えば、細菌感染またはウイルス感染）、腫瘍の治療および／または予防または診断に用いられる上記抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体であって、
（ａ）配列番号１で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
（ｂ）配列番号２で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
（ｃ）配列番号３で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、あるいは
（ｄ）配列番号４で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
を含む、単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体。

【請求項2】

（ａ）配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｂ）配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｃ）配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、あるいは
（ｄ）配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１または配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
を含み、
好ましくは、前記単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体は、
（ａ）配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３、あるいは
（ｄ）配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１、配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体。

【請求項3】

（ａ）配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、あるいは
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
を含む、請求項１または２に記載の単離した抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体部分および免疫グロブリンＦｃ領域を含み、場合により、前記Ｆｃ領域は、エフェクター機能に欠け、またはエフェクター機能が低下し、例えば、前記Ｆｃ領域はＬＡＬＡ変異を有する、
単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項5】

多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片であって、
（ｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体部分、（ｉｉ）第２の抗原に結合するＦａｂ断片、および場合により前記（ｉ）と前記（ｉｉ）のＣ末端にある（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域を少なくとも含み、場合により、前記Ｆｃ領域は、エフェクター機能に欠け、またはエフェクター機能が低下し、例えば、前記Ｆｃ領域はＬＡＬＡ変異を有し、
好ましくは、前記多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である、
多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項6】

前記免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンであり、好ましくは、前記免疫グロブリンはＩｇＧ１免疫グロブリンで、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである、
請求項４に記載の単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または請求項５に記載の多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体分子の重鎖は、各々のＦｃドメインにそれぞれ突起または空孔が含まれ、かつ一方の重鎖のＦｃドメインにおける前記突起または空孔は、それぞれ他方の重鎖のＦｃドメインにおける前記空孔または突起に配置されてもよく、これにより、前記抗体分子の重鎖同士は「ノブ－イン－ホール」の安定的な会合を形成する、
請求項４～６のいずれか一項に記載の単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項8】

前記第２の抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス関連抗原および細菌関連抗原から選ばれ、好ましくは、前記腫瘍関連抗原は、例えば、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ４、ＰＬＡＰ、ＰＳＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＰＤ－Ｌ１、ＭＵＣ１およびＭＵＣ１６から選ばれる、
請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項9】

請求項５～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片であって、
ｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体部分およびＨＥＲ２と特異的に結合する抗体断片を含む、抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体もしくは抗原結合断片であって、
例えば、ＨＥＲ２と特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１５で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、および配列番号１６で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体を含み、
例えば、ＨＥＲ２と特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１５で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲおよび配列番号１６で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲを含み、
例えば、ＨＥＲ２と特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１５で示される重鎖可変領域アミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、かつ、配列番号１６で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体もしくは抗原結合断片であるか、
あるいは、
ｉｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体部分およびＢＣＭＡと特異的に結合する抗体断片を含む抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体もしくは抗原結合断片であって、
例えば、ＢＣＭＡと特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１７で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体を含み、かつ、配列番号１８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または前記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体を含み、
例えば、ＢＣＭＡと特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１７で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲおよび配列番号１８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲを含み、
例えば、ＢＣＭＡと特異的に結合する前記抗体断片は、配列番号１７で示される重鎖可変領域アミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、かつ、配列番号１８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体もしくは抗原結合断片である、
多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片をコードする、
単離した核酸。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである、
ベクター。

【請求項12】

請求項１０に記載の核酸または請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は原核のものまたは真核のものであり、より好ましくは、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体もしくは抗原結合断片の調製に適用される他の細胞から選ばれ、最も好ましくは、前記宿主細胞はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、
宿主細胞。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片をコードする核酸の発現に適する条件で請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、場合により、前記宿主細胞からまたは培地から、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子を回収することを含む、
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片を調製する方法。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む、
医薬組成物。

【請求項15】

少なくとも１つの他の活性成分を更に含む、
請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

個体において疾患を治療および／または予防する薬剤の調製に用いられ、あるいは個体における疾患への診断ツールの調製に用いられ、好ましくは、前記個体は哺乳動物で、より好ましくはヒトである、
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片および請求項１４および１５に記載の医薬組成物の使用。

【請求項17】

腫瘍の治療および／または予防または診断に用いられ、例えば、前記腫瘍は、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの骨髄腫）および転移性病巣から選ばれる、
請求項１６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的に、抗体およびその使用に関する。より具体的に、本発明は、ＣＤ１６Ａに対する単一ドメイン抗体、それを含む単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子に関する。本発明は、急性および慢性感染性疾患（例えば、細菌感染またはウイルス感染）、腫瘍の治療および／または予防または診断におけるそれらの使用にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ、ＮＫ）は、人体における早期防御に関与する先天性免疫細胞の大部分である。自然免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）とは異なり、ＮＫ細胞は、構成的活性化状態で存在する傾向があり、抗原提示または組織適合性複合体（ＭＨＣ）により予め感作させることなく、外来微生物、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を直接殺傷することができる。従って、あらゆる免疫エフェクター細胞のうち、ＮＫ細胞は、免疫治療のための比較的魅力的な候補細胞の１つであり、かつ現在、ＣＤ１６／ＥＧＦＲまたはＣＤ１６／ＣＤ３０などに対する二重特異性抗体が既に開発されている（Ｋｒｉｓｔｉｎａ Ｅｌｌｗａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１９，１１（５），８９９－９１８；Ｕｗｅ Ｒｅｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，２０１４，６：３、７２７－３８）。

【0003】

抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）は、ＮＫ細胞が標的細胞と外来宿主細胞の殺傷を媒介する主なメカニズムの１つであり、抗体のＦｃ領域がＮＫ細胞に発現されるＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）と結合することにより、ＮＫ細胞をＡＤＣＣ作用を果たすように活性化する。目標とする腫瘍細胞の抗原を再指向するために、ＮＫ細胞を動員することで抗原依存性ＡＤＣＣを産生する二重特異性抗体は、ますます多くの研究者に重視されるようになっている。しかし、ＮＫ細胞に発現されるＣＤ１６Ａは、異なる抗体のＦｃ領域に対する親和性が異なり、ＡＤＣＣの効果にばらつきがある。従って、ＡＤＣＣ作用を強化するために、ＣＤ１６Ａと特異的に結合する高親和性抗体を開発することが期待されている。

【0004】

現在、Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ社により開発されたＮＫエフェクター細胞に基づく４価二重特異性抗体：抗ＣＤ１６Ａ／ＣＤ３０抗体（「ＡＦＭ１３」ともいう）および抗ＣＤ１６Ａ／ＥＧＦＲ抗体（「ＡＦＭ２４」ともいう）ＴａｎｄＡｂは、既にそれぞれ臨床第ＩＩ相と臨床第Ｉ相試験に入り、それぞれホジキン型リンパ腫とＥＧＦＲ陽性発現固形がんの治療に用いられている。Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ社のＡＦＭ１３ ＴａｎｄＡｂおよびＡＦＭ２４ ＴａｎｄＡｂは主にＮＫ細胞上の活性化型受容体ＣＤ１６Ａを特異的に標的とするそれらの抗体断片（「４ＬＳ２１ ｓｃＦｖ」ともいう）により、ＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣ活性を活性化し、さらに標的腫瘍細胞を殺傷する。上記４ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａのみと結合し、好中球または多形核球上のＣＤ１６Ｂとは結合しない。同時に、４ＬＳ２１ ｓｃＦｖは、その特異的抗原結合エピトープ（ＣＤ１６Ａ－Ｙ１４０）が、血漿中の大量のＩｇＧとＣＤ１６Ａの競合的結合を生じないため、その治療活性が無関係なＩｇＧの影響を受けない。また、４ＬＳ２１ ｓｃＦｖの特異的結合エピトープ（ＣＤ１６Ａ－Ｙ１４０）により、その治療活性がＣＤ１６Ａアイソフォーム（１５８Ｖまたは１５８Ｆ）に依存しないことも決められ、異なる患者に対するＡＤＣＣを媒介する治療用抗体の選好が回避される。

【0005】

ＣＤ１６Ａ（すなわち、ＦｃγＲＩＩＩＡ）は、ＮＫ細胞、マクロファージおよびマスト細胞に発現される、低い親和性かつ支配的な活性化型膜貫通受容体であり、免疫グロブリンスーパーファミリー膜貫通受容体メンバーに属する。ＮＫ細胞において、ＦｃγＲＩＩＩＡのα鎖は、ＦｃεＲＩγ鎖を含む免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３ζ鎖と結合してシグナル伝達する（Ｗｉｒｔｈｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１７５：１３８１－１３９０）。ＣＤ１６Ａは、そのＮ末端の１５８位の対立遺伝子多型の差異によって、１５８位のバリンまたはフェニルアラニンの差次的発現があることで、ヒト集団にＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ／Ｖ（約１５％）、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ／Ｆ（約２５％）およびＣＤ１６Ａ－１５８Ｆ／Ｆ（約６０％）のアイソフォームがある。異なるＣＤ１６ＡアイソフォームとＩｇＧの親和性に５倍～１０倍の差があり、ここで、１５８Ｖ／Ｖ型は親和性が最も強く、治療用抗体ＡＤＣＣの臨床効果が最も高い。

【0006】

ＣＤ１６Ｂは、その細胞外部分がＣＤ１６Ａと９６％のアミノ酸相同性を有し、３つの異なるアイソフォーム、すなわち、ＮＡ１、ＮＡ２とＳＨを含むグリコシル－ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）によりアンカーされる膜貫通シグナル受容体である。アジア人は主にＮＡ１型（～６８％）、コーカサス人は主にＮＡ２型（～６５％）であるが、ＳＨは主にコーカサス人とアフリカ人に存在し、２．５％程度を占めている。

【0007】

細胞レベルにおいて、ＣＤ１６Ｂは、ほぼすべて多形核球（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ、ＰＭＮ）に発現し、その細胞発現コピー数が一般的に１００，０００個／細胞～３００，０００個／細胞であり、多形核球の生存および脱顆粒に対して重要な役割を果たす。同時に、血清には、金属プロテアーゼＡＤＡＭ１７の酵素分解作用により産生された大量の遊離型ＣＤ１６Ｂもあり、血清中の抗体とキレートして複合体を形成し、重篤な有害反応が発生する。

【0008】

従って、親和性が高く、ＣＤ１６Ａアイソフォームに依存せず、ＣＤ１６Ａと特異的に結合しかつＣＤ１６Ｂと結合しないＣＤ１６Ａ抗体の開発は、特に必要とされている。

【0009】

Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ社のＣＤ１６Ａヒト化抗体４ＬＳ２１はこれらの利点を組み合わせており、投与されるヒト集団が拡大されるのみならず、ＮＫ細胞作用の選択性が極めて大きく向上し、血清中のＩｇＧと競合せず、好中球上のＣＤ１６Ｂとの結合による予見不可能な有害反応を効果的に回避することができる。

【0010】

しかし、４ＬＳ２１に基づくＴａｎｄＡｂ二重特異性抗体は、８つの結合ドメイン（サブドメイン）を有する「１つの抗原に対する２つのｓｃＦｖドメイン＋もう１つの抗原に対する２つのｓｃＦｖドメイン」（以下、「２＋２」ともいう）形態で、少なくとも６つのリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）により連結され、これにより、ＴａｎｄＡｂ二重特異性抗体の発現、精製、工学的改変、および生産プロセスに多くの課題が提出されており、その理由としては、４ＬＳ２１は６つのＣＤＲを有する通常の抗体クローンであり、二重特異性抗体を構築する時に、一般的にｓｃＦｖ形態で組み立てられ、そのプロセスの難易度を増加するだけでなく、二重特異性抗体の構築時の自由度を制限し、その対応する生物活性メカニズムに適合するために最適な二重特異性抗体形態を生成することに不利である。同時に、ＴａｎｄＡｂは大きな分子量を有することを考慮すると、免疫原性を増加させるだけでなく、腫瘍組織に浸入しにくく、その治療効果をある程度低減し、または毒性や副作用を増加させる。さらに、複数のリンカーにより連結されるその「２＋２」形態の４価構造を考慮すると、ＴａｎｄＡｂは、非特異的なＮＫ細胞ＣＤ１６Ａの活性化が生じやすいリスクを有し、さらに計り知れない有害反応が誘発される。

【0011】

シングルドメイン抗体または単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）は、現在最も小さい抗体分子であり、その分子量が完全な抗体の１／１０である。シングルドメイン抗体は、完全な抗体の抗原反応性を備えるうえに、分子量が小さく、安定性が高く、可溶性が高く、発現しやすく、免疫原性が弱く、透過性が高く、標的性が高く、製造コストが低いといったいくつかの独特な機能特性を有し、従来の抗体において開発サイクルが長く、安定性が低く、保存条件が厳しいなどの欠陥をほぼ完全に克服している。

【0012】

従って、分子量が小さく、腫瘍透過性が高く、二重特異性抗体への自由な組み立てに利用可能であり、かつ４ＬＳ２１のあらゆる生物学的特性（すなわち、ＣＤ１６Ａの高特異性、ＣＤ１６Ａアイソフォーム（１５８Ｖまたは１５８Ｆ）の非依存性、ＣＤ１６Ｂと結合せず、かつ体内ＩｇＧと競合しない）を同時に備える高親和性のシングルドメイン（以下、「単一ドメイン」ともいう）ＣＤ１６Ａ抗体の研究と開発は、特に必要とされている。

【発明の概要】

【0013】

本発明者は、広くて深い研究により、大量のスクリーニングを経て、ヒトＣＤ１６Ａと特異的に結合し、ヒトＣＤ１６Ｂと結合せず、サルＣＤ１６Ａと交差反応する高親和性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を得ることに成功した。実験結果から分かるように、このような単一ドメイン抗体は、ヒトＣＤ１６Ａと特異的に結合可能で、ヒトＣＤ１６Ｂと結合せず、サルＣＤ１６Ａと交差反応し、結合親和性が高く、分子量が小さく、安定性が高く、ヒトＮＫ細胞の抗原特異的活性化および腫瘍抑制作用が強く、二重特異性抗体またはＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ）の構築および抗腫瘍活性薬の研究と開発に用いられる望ましい単一ドメイン抗体である。

【0014】

従って、本発明は、ヒトＣＤ１６Ａと特異的に結合し、ヒトＣＤ１６Ｂと結合せず、サルＣＤ１６Ａと交差反応する高親和性単一ドメイン抗体を提供し、
１）他の抗原に対する異なる抗体および抗体断片と自由に組み合わせ、様々な構造形態の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の構築および組み立てを行うことにより、ＮＫ細胞を最大限に活性化し、例えば抗腫瘍免疫を媒介するようにＮＫ細胞を動員することができ、
２）通常のｓｃＦｖもしくはＦａｂの分子量および立体障害が大きすぎることによる腫瘍組織の透過性が低い、免疫原性が高いといった問題を解決することを特徴とする。

【0015】

従って、第１の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または上記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
（ｂ）配列番号２で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または上記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
（ｃ）配列番号３で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または上記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、あるいは
（ｄ）配列番号４で示される重鎖可変領域アミノ酸配列における３つのＣＤＲ、または上記３つのＣＤＲのうちのいずれか１つのＣＤＲに対して３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有するＣＤＲ変異体、
を含む、単離した抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明の単離した抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体は、
（ａ）配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｂ）配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｃ）配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、あるいは
（ｄ）配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１または配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、および配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
を含み、
ここで、上記ＨＣＤＲの番号付け方法は、Ｋａｂａｔ番号付け方法である。

【0017】

好ましくは、上記単離した抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体は、
（ａ）配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３、あるいは
（ｄ）配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１、配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３、
を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、本発明の単離した抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、あるいは
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
を含む。

【0019】

第２の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体部分および免疫グロブリンＦｃ領域を含む単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片を提供し、場合により、上記Ｆｃ領域は、エフェクター機能に欠け、またはエフェクター機能が低下し、例えば、ＬＡＬＡ変異がある。

【0020】

第３の態様において、本発明は、（ｉ）本発明に記載の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体部分、（ｉｉ）第２の抗原に結合するＦａｂ断片、および場合により上記（ｉ）と（ｉｉ）のＣ末端にある（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域を少なくとも含む多重特異性抗体分子または抗原結合断片を提供し、場合により、上記Ｆｃ領域は、エフェクター機能に欠け、またはエフェクター機能が低下し、例えば、上記Ｆｃ領域はＬＡＬＡ変異を有する。

【0021】

一実施形態において、上記多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。

【0022】

いくつかの実施形態において、本発明の単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子（例えば、二重特異性抗体分子）もしくは抗原結合断片において、上記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンであり、好ましくは、上記免疫グロブリンはＩｇＧ１免疫グロブリンで、より好ましくは、上記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0023】

いくつかの実施形態において、本発明の単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子（例えば、二重特異性抗体分子）もしくは抗原結合断片における重鎖は、各々のＦｃドメインにそれぞれ突起または空孔が含まれ、かつ一方の重鎖のＦｃドメインにおける上記突起または空孔は、それぞれ他方の重鎖のＦｃドメインにおける上記空孔または突起に配置されてもよく、これにより、上記抗体分子の重鎖同士は「ノブ－イン－ホール」の安定的な会合を形成する。

【0024】

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体分子（例えば、二重特異性抗体分子）もしくは抗原結合断片における上記第２の抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス関連抗原および細菌関連抗原から選ばれ、上記腫瘍関連抗原は、例えば、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ４、ＰＬＡＰ、ＰＳＭＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＰＤ－Ｌ１、ＭＵＣ１およびＭＵＣ１６から選ばれる。

【0025】

一実施形態において、本発明の多重特異性抗体分子は、抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体または抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体である。

【0026】

第４の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子（例えば、二重特異性抗体分子）もしくは抗原結合断片をコードする、単離した核酸を提供する。

【0027】

第５の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片をコードする核酸を含むベクターを提供し、好ましくは、上記ベクターは発現ベクターである。

【0028】

第６の態様において、本発明は、本発明の単離した核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、好ましくは、上記宿主細胞は、原核のものまたは真核のものであり、より好ましくは、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞または抗体もしくは抗原結合断片の調製に適用される他の細胞から選ばれ、最も好ましくは、上記宿主細胞はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。

【0029】

第７の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片を調製する方法を提供し、上記方法は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子をコードする核酸の発現に適する条件で本発明の宿主細胞を培養し、場合により、上記宿主細胞からまたは培地から本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子を回収することを含む。

【0030】

第８の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0031】

いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの他の活性成分をさらに含む。

【0032】

第９の態様において、本発明は、個体において疾患を治療および／または予防する薬剤として用いられ、あるいは疾患の診断ツールとして用いられる、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片および本発明の医薬組成物の使用を提供し、好ましくは、上記個体は哺乳動物で、より好ましくはヒトである。

【0033】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子もしくは抗原結合断片または多重特異性抗体分子もしくは抗原結合断片および本発明の医薬組成物は、急性および慢性感染性疾患（例えば、細菌感染またはウイルス感染）、腫瘍の治療および／または予防あるいは診断に用いられ、例えば、上記腫瘍は、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの骨髄腫）および転移性病巣から選ばれる。

【0034】

以下の図面と合わせて読めば、次に詳細に記載される本発明の好ましい実施形態がより良く理解される。本発明を説明するために、図面には現在の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の精確な配置および手段に限定されないと理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A】本発明の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体とヒトＣＤ１６Ａを発現したＧＳ－ＣＨＯ細胞の結合を示す。ＭＦＩは平均蛍光強度を示し、

【図1B】本発明の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体がヒトＣＤ１６Ｂを発現したＧＳ－ＣＨＯ細胞と結合しないことを示す。

【図2A】本発明の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体とＳＬＢ１９００８４というドナーＩＤからのヒト初代ＮＫ細胞の結合を示す。

【図2B】本発明の抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体とＳＬＢ１９００７１というドナーＩＤからのヒト初代ＮＫ細胞の結合を示す。

【図3A】本発明の二重特異性抗体の構造形態を示し、ここで、「構造形態」という列における二重特異性抗体は、左半部分が抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体－Ｆｃ、右半部分が抗ＴＡＡ Ｆａｂ－Ｆｃであり、上記Ｆｃ領域に対してＬＡＬＡ修飾およびノブ－イン－ホール修飾が行われた。

【図3B】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体とヒト初代ＮＫ細胞の結合レベルを示す。

【図3C】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体とヒト初代ＮＫ細胞の結合レベルを示す。

【図4A】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体がＡＤＣＣによりＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＨＥＲ２高発現乳がん細胞株である）を殺傷することを示す。図中の「ＲＬＵ」は「相対発光単位」を示し、抗体を加えないＰＢＳがブランク対照として使用される。

【図4B】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体がＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＨＥＲ２発現陰性の多発性骨髄腫細胞株である）に対する殺傷作用をもたらさないことを示す。

【図5A】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体がＡＤＣＣによりＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９はＢＣＭＡ発現陽性の多発性骨髄腫細胞株である）を殺傷することを示す。

【図5B】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体がＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＢＣＭＡ発現陰性の乳がん細胞株である）に対する殺傷作用をもたらさないことを示す。

【図6A】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＨＥＲ２高発現乳がん細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化することを示し、縦軸はＩＦＮ－γ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図6B】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＨＥＲ２発現陰性の多発性骨髄腫細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示し、縦軸はＩＦＮ－γ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図6C】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＨＥＲ２高発現乳がん細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化することを示し、縦軸はＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図6D】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＨＥＲ２発現陰性の多発性骨髄腫細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示し、縦軸はＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図7A】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９はＢＣＭＡ発現陽性の多発性骨髄腫細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化することを示し、縦軸はＩＦＮ－γ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図7B】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＢＣＭＡ発現陰性の乳がん細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示し、縦軸はＩＦＮ－γ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図7C】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９はＢＣＭＡ発現陽性の多発性骨髄腫細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化することを示し、縦軸はＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図7D】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＳＫ－ＢＲ３細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞はＢＣＭＡ発現陰性の乳がん細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示し、縦軸はＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞％を示す。

【図8A】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＨＥＲ２高発現陽性腫瘍細胞株を殺傷するようにＮＫ細胞を抗原特異的に媒介することを示す。

【図8B】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＨＥＲ２低発現陽性腫瘍細胞株を殺傷するようにＮＫ細胞を抗原特異的に媒介することを示す。

【図8C】抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＨＥＲ２発現陰性の多発性骨髄腫細胞株である）を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示す。

【図9A】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞株を殺傷するようにＮＫ細胞を抗原特異的に媒介することを示す。

【図9B】抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体が、ＢＣＭＡ陰性腫瘍細胞株を標的とするＮＫ細胞を活性化しないことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

発明の詳細な説明
本発明を詳しく説明するに先立ち、上記方法および条件は変更可能であるため、本発明は、本明細書における特定の方法および実験条件に限定されないと理解しておくべきである。なお、本明細書に使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定する意図はない。

【0037】

Ｉ．定義
本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数形が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。

【0038】

「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0039】

本明細書に使用されるように、「および／または」という用語は、選択可能なオプションのうちのいずれか１つ、または選択可能なオプションの２つもしくは複数を指す。

【0040】

本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある具体的な配列を「含む」抗体可変領域が言及される場合、この具体的な配列からなる抗体可変領域を含むことも意図する。

【0041】

「抗体」という用語は、本説明書において最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、さまざまな構造の天然抗体および人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、完全な抗体および抗体断片を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の抗体は、シングルドメイン抗体または重鎖抗体である。

【0042】

「抗体断片」または「抗原結合断片」は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全な抗体とは異なる分子を指し、完全な抗体の一部を含み、かつ完全な抗体の結合する抗原と結合する。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重抗体、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、二価もしくは二重特異性抗体またはその断片、ラクダ科由来の抗体（重鎖抗体）、および抗体断片により形成された二重特異性抗体または多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0043】

本明細書に使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗原（例えば、ヒトＣＤ１６Ａ）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を指す。

【0044】

参照抗体と同様もしくは類似の結合親和性および／または特異性を示す抗体は、参照抗体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％以上の結合親和性および／または特異性があり得る抗体を指す。これは、当該分野での既知の結合親和性および／または特異性の任意の測定方法により測定することができる。

【0045】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインにおいて、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号付けられる。１つの所定の重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１つまたはその組み合わせにより決定することができ、上記割り当てシステムは、例えば、抗体の３次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３，Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。

【0046】

特に断りのない限り、本発明において、「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」という用語は、上記のいずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列を含む。

【0047】

ＣＤＲは、参照ＣＤＲの配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＡｂＭ番号付け位置を有することで決定されてもよい。一実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ番号付け方法によって位置が決定される。

【0048】

特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域およびＣＤＲにおける残基位置（重鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、ＡｂＭ番号付けシステムに基づく番号付け位置を指す。

【0049】

異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、ＣＤＲが抗体間で異なるにもかかわらず、ＣＤＲにおいては、抗原との結合に直接関与するアミノ酸位置の数が限られている。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも２つを使用することにより、最小の重複領域を決定することができ、それによって抗原と結合するための「最小結合単位」を提供する。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であってもよい。当業者に知られているように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を決定することができる。従って、本発明は、本明細書に提供されるいずれのＣＤＲの変異体についても考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基はそのままにしてもよいが、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｂＭに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は、保存的なアミノ酸残基で置換されてもよい。

【0050】

「単一ドメイン抗体」、「シングルドメイン抗体」という用語は一般に、単一の可変ドメイン（例えば、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメインＶＨＨ）が抗原結合を付与できるような抗体を指す。すなわち、当該単一の可変ドメインは、別の可変ドメインと相互作用することなく、標的抗原を認識することができる。「シングルドメイン抗体」は、１つの可変領域（可変ドメインともいう）のみからなり、Ｃ末端からＮ末端へ、ＦＲ４－ＣＤＲ３－ＦＲ３－ＣＤＲ２－ＦＲ２－ＣＤＲ１－ＦＲ１を含み、ラクダにより天然に産生されるかまたは遺伝子工学技術により産生されることができる。シングルドメイン抗体は、現在の既知の標的抗原と結合可能な最小単位である。

【0051】

本明細書に使用されるように、「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｈｃＡｂ）」という用語は、軽鎖を有しない抗体を指し、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、またはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含むことができ、ホモ二量体、例えば、軽鎖を有しない重鎖二量体抗体を構成することができる。本発明の重鎖抗体は、標準抗体からのＶＨまたはシングルドメイン抗体からのＶＨを含むことができる。例えば、本発明の重鎖抗体におけるＶＨは、シングルドメイン抗体であってもよい。

【0052】

本明細書に使用されるように、「多重特異性」抗体という用語は、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体を指し、上記少なくとも２つの抗原結合部位における各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープまたは異なる抗原の異なるエピトープと結合する。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体である。一実施形態において、本明細書は、第１の抗原および第２の抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体を提供する。

【0053】

「エフェクター機能」という用語は、免疫グロブリンアイソタイプによって変化する免疫グロブリンＦｃ領域による生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体介在性抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレートおよびＢ細胞活性化を含む。

【0054】

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞より産生されるかまたは非ヒト由来で、ヒト抗体ライブラリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についての当該定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。

【0055】

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するためであり、上記領域は少なくとも一部の定常領域を含む。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル基末端に延長している。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよく、または存在しなくてもよい。特に断りのない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによるもので、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載された通りである。

【0056】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは一般に類似の構造を有し、ここで、各ドメインは、４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．ｐ９１（２００７）参照）。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。

【0057】

本明細書に使用されるように、「結合」または「特異的に結合」という用語は、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ好ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗体の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法または当該分野で公知の他の通常結合測定法により測定することができる。

【0058】

「有効量」という用語は、１回分もしくは複数回分の用量で患者に投与された後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという本発明のＣＤ１６Ａまたは組成物の量または用量を指す。有効量は、当業者である主治医が、例えば、哺乳動物の生物種、体重、年齢および一般的健康状態、かかる具体的な疾患、疾患の程度もしくは重症度、個々の患者の応答、投与される具体的な抗体、投与形態、投与製剤の生物学的利用能の特徴、選ばれる投与計画、および任意の併用療法の適用などの様々な要因を考慮して容易に決定することができる。

【0059】

「治療有効量」は、必要な用量で必要な期間にわたって、所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。抗体もしくは抗体断片またはその複合体もしくは組成物の治療有効量は、例えば、疾患の状態、個体の年齢、性別と重量、および抗体もしくは抗体部分が個体に所望の反応を起こす能力などの様々な要因によって変更されてもよい。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片またはその複合体もしくは組成物の任意の毒性または有害作用が有益な治療効果に及ばないという量であってもよい。治療を受けていない対象に対して、「治療有効量」は、計測可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖率、腫瘍体積など）の少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、６０％もしくは７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％が抑制されることが好ましい。ヒト腫瘍における効能を示す動物モデルシステムにおいて、計測可能なパラメータ（例えば、がん）に対する化合物の抑制能力を評価することができる。

【0060】

「予防有効量」は、必要な用量で必要な期間にわたって、所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

【0061】

「個体」または「対象」という用語は、入れ替えて使用可能であり、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含むが、これらに限定されない。特に、個体または対象はヒトである。

【0062】

「腫瘍」および「がん」という用語は、本明細書において入れ替えて使用され、固形腫瘍と液性腫瘍を含む。

【0063】

「がん」および「がん性」という用語は、哺乳動物における、細胞の成長が調節されない生理障害を指す。

【0064】

「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長と増殖、およびすべての前がん性（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）とがん性の細胞と組織を指す。「がん」、「がん性」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、互いに排他的ではない。

【0065】

「がん関連抗原」、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」または「腫瘍抗原」という用語は、正常な細胞に比べて、好ましくはがん細胞の表面において完全に、または断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現された分子（一般にタンパク質、炭水化物もしくは脂質）を入れ替えて指すことができ、またそれは、薬剤ががん細胞を優先的に標的にするために用いることができる。いくつかの実施形態において、がん関連抗原は、正常な細胞と比べて腫瘍細胞において過剰発現された細胞表面分子であり、例えば、正常な細胞と比べて１倍過剰発現され、２倍過剰発現され、３倍過剰発現され、またはそれ以上過剰発現されたものである。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において不適当に合成される細胞表面分子であり、例えば、正常な細胞に発現された分子に対して欠失、追加または変異を含む分子である。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連の糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、メソテリン、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、細胞表面関連の粘性タンパク質１（ＭＵＣ１）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有の粘性タンパク質様ホルモン受容体２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）を含むが、これらに限定されない。

【0066】

「腫瘍免疫回避」とは、腫瘍が免疫学的認識および除去を回避するプロセスである。このように、治療概念として、腫瘍免疫は、このような回避が弱まれる場合に「治療」されるとともに、腫瘍は免疫系により認識されて攻撃される。腫瘍認識の例として、腫瘍結合、腫瘍収縮、および腫瘍除去を含む。

【0067】

「感染性疾患」という用語は、病原体による疾患を指し、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫などの原生動物感染を含む。

【0068】

「慢性感染」という用語は、感染源（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫などの原生動物、真菌などの病原体）が感染した宿主において免疫応答を既に誘導したが、急性感染の場合のように宿主から消去または除去されていないというような感染を指す。慢性感染は、持続的、潜伏的または緩徐的であってもよい。

【0069】

ＣＤ１６Ａ「結合分子」という用語は、ＣＤ１６Ａと選択的・特異的に結合する任意の抗体および抗原結合断片、その融合タンパク質および複合体を含み、それらはいずれもＣＤ１６Ｂと特異的に結合することができない。ＣＤ１６Ａ結合分子は、本発明の具体的な抗ＣＤ１６Ａのシングルドメイン抗体、単一特異性抗体分子または多重特異性抗体分子を含むが、これらに限定されない。

【0070】

「単離した」ＣＤ１６Ａ結合分子は、その自然環境の成分と単離したものを指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６Ａ結合分子は、９５％もしくは９９％を超える純度に精製され、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。抗体純度を評価するための方法についての概要は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９８７（２００７）が参照される。

【0071】

「単離した」核酸は、その自然環境の成分と単離した核酸分子を指す。単離した核酸は、一般に当該核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子を含むが、当該核酸分子は染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。「ＣＤ１６Ａ結合分子をコードする単離した核酸」は、ＣＤ１６Ａ結合分子の鎖もしくはその断片をコードする１つもしくは複数の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクターにおける当該核酸分子、および宿主細胞における１つもしくは複数の位置に存在する当該核酸分子を含む。

【0072】

以下のように、配列間の配列同一性を算出する。

【0073】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセンテージを決定するために、上記配列を最適比較のためにアラインメントを行う（例えば、最適アラインメントのために第１と第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方もしくは両方にギャップを導入してもよく、あるいは比較のために、非相同配列を捨ててもよい）。好ましい一実施形態において、比較のために、アラインメントされる参照配列の長さは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％の参照配列の長さである。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応の位置での同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、上記分子はこの位置において同一である。

【0074】

数学アルゴリズムにより、２つの配列間の配列比較および同一性パーセンテージの計算を実現することができる。好ましい一実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに統合されたＮｅｅｄｌｅｍａおよびＷｕｎｓｃｈ （（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列もしくはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定する。別の好ましい実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定する。特に好ましいパラメータセット（および特に断りのない限り使用すべき１つのパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を採用する。

【0075】

また、ＰＡＭ１２０重み剰余テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４）を利用し、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に統合されたＥ． ＭｅｙｅｒｓとＷ． Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム （（１９８９） ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１－１７）により、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定してもよい。

【0076】

追加的にまたは選択的に、本明細書に記載の核酸配列とタンパク質配列を「問い合わせ配列」として利用してパブリックデータベースに対して検索を実行することにより、例えば、他のファミリーメンバーの配列または関連配列を同定することができる。

【0077】

本明細書に使用されるように、「低いストリンジェンシー条件、中等度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、または極高ストリンジェンシー条件でのハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応の実行についての手引きは、援用により組み込まれたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１－６．３．６において見つけることができる。参考文献には、含水の方法と非含水の方法が記載されており、いずれの方法も利用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に言及される特異的ハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである。１）低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）において、次に少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件では、洗浄温度を５５℃に上げることができる）で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて２回洗浄することであり、２）中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６ＸのＳＳＣにおいて、次に６０℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて１回または複数回洗浄することであり、３）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６ＸのＳＳＣにおいて、次に６５℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて１回または複数回洗浄することであり、好ましくは、４）極高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５のＭのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳにおいて、次に６５℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて１回または複数回洗浄することである。極高ストリンジェンシー条件（４）は好ましい条件で、特に断りのない限り、利用すべき条件である。

【0078】

「医薬組成物」という用語は、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、上記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。

【0079】

本明細書に使用される場合、「治療」は、存在している症状、病症、病状または疾患の進行または重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。所望の治療效果は、疾病の発生または再発の防止、症状の軽減、疾病の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、病状進展速度の低減、病的状態の改善もしくは緩和、および予後の緩和もしくは改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の発展または疾患の進行を遅延させるために用いられる。

【0080】

本明細書に使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。いくつかの実施形態において、がん家族歴がある対象は、予防プログラムの候補である。一般的に、がんの背景では、「予防」という用語は、がんにかかる病徴または症状が生じる前に、特に、がんに罹患するリスクのある対象にがんが生じる前の医薬投与を指す。

【0081】

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書に使用される場合、それに連結される別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造であるベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。いくつかのベクターは、それに効果的に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかるベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

【0082】

「宿主細胞」という用語は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、初代より形質転換された細胞およびそれより誘導された子孫を含むが、継代数を考慮しない。子孫は、核酸の内容において親細胞とは全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体分子を産生するために利用可能な任意のタイプの細胞株であり、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核細胞、および大腸菌細胞などの原核細胞を含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物または培養された植物組織もしくは動物組織の内部の細胞を含む。

【0083】

ＩＩ．本発明のＣＤ１６Ａ結合分子
ヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩともいう）は、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）およびＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）という２つのアイソフォームを有し、それらの細胞外免疫グロブリン結合領域配列が９６％のアミノ酸配列同一性を有する（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌとＣａｐｅｌ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５－２２１）。

【0084】

ＣＤ１６Ａは、マクロファージ、マスト細胞およびＮＫ細胞に発現された膜貫通受容体である。ＣＤ１６Ｂは、多形核球（ＰＭＮ）に存在し、腫瘍細胞に対する殺傷作用を誘発することができない（ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌとＣａｐｅｌ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４（５）：２１５－２２１）。また、ＣＤ１６Ｂは、可溶性受容体で血清に存在してもよく、体内で抗体に結合すると、免疫複合体を形成することで副作用を引き起こす恐れがある。

【0085】

細胞先天免疫性の媒体として、ＮＫ細胞は専門的な細胞キラーであり、Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、構成的活性化状態で存在する傾向があり、追加の事前刺激を必要としない。逆に、静止している細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ抗原複合体との結合により、その後ＣＤ２８の共刺激により活性化する必要がある。従って、あらゆる免疫エフェクター細胞のうち、ＮＫ細胞は、免疫治療のための興味のある候補細胞の１つである。

【0086】

従来技術において、抗ＣＤ１６抗体のほとんどは、ＣＤ１６ＡとＣＤ１６Ｂという２つのアイソフォームを区別することができないが、本発明の抗ＣＤ１６抗体は、ＣＤ１６Ｂと結合せずにＣＤ１６Ａと特異的に結合可能であり、かつＣＤ１６Ａと結合した後、ＮＫ細胞を活性化することができる。
ＣＤ１６Ａは、特にＩｇＧ結合領域の４８位および１５８位で、いくつかの対立遺伝子多型を有する。ＣＤ１６Ａ１５８ＦおよびＣＤ１６Ａ１５８Ｖという対立遺伝子の遺伝子頻度は、それぞれ約０．６と０．４である。本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、ＣＤ１６Ａ１５８ＦおよびＣＤ１６Ａ１５８Ｖという２つの対立遺伝子を認識することができるため、いずれの患者にもＣＤ１６Ａと結合することでＮＫ細胞集団を活性化することができる。

【0087】

一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、抗ＣＤ１６Ａのシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であり、Ｎ末端からＣ末端へ３つの相補性決定領域を含み、それぞれ以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ番号付け方法）：
（ａ）アミノ酸配列ＹＮＦＴＲＶＹＭＧ（配列番号２３）で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、アミノ酸配列ＡＩＳＷＧＧＧＳＴＨ（配列番号２４）で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２４で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、およびアミノ酸配列ＡＬＤＤＹＳＧＶＬＳＰ（配列番号２５）で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２５で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｂ）アミノ酸配列ＦＴＦＤＭＹＶＭＴ（配列番号２６）で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２６で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、アミノ酸配列ＡＩＨＥＤＧＧＫＴＤ（配列番号２７）で示されるＨＣＤＲ２または配列番号２７で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、およびアミノ酸配列ＶＡＹＤＹＳＹＳＥＷＹＤＹ（配列番号２８）で示されるＨＣＤＲ３または配列番号２８で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、
（ｃ）アミノ酸配列ＦＫＦＮＳＦＶＭＴ（配列番号２９）で示されるＨＣＤＲ１または配列番号２９で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、アミノ酸配列ＡＩＨＥＤＧＧＫＴＤ（配列番号３０）で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３０で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、およびアミノ酸配列ＡＡＶＴＨＳＬＹＤＹ（配列番号３１）で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３１で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、あるいは
（ｄ）アミノ酸配列ＦＴＦＤＷＹＷＭＧ（配列番号３２）で示されるＨＣＤＲ１または配列番号３２で示されるＨＣＤＲ１の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、アミノ酸配列ＡＩＨＤＤＧＴＥＴＨ（配列番号３３）で示されるＨＣＤＲ２または配列番号３３で示されるＨＣＤＲ２の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体、およびアミノ酸配列ＡＴＶＲＳＤＳＹＹＤＹ（配列番号３４）で示されるＨＣＤＲ３または配列番号３４で示されるＨＣＤＲ３の３つ以下、２つ以下、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を有する変異体
である。

【0088】

ここで、上記アミノ酸変異は、アミノ酸の追加、欠失または置換で、例えば、上記アミノ酸変異は保存的なアミノ酸置換である。

【0089】

一実施形態において、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＮＦＴＲＶＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＡＩＳＷＧＧＧＳＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＬＤＤＹＳＧＶＬＳＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＭＹＶＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＡＩＨＥＤＧＧＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＹＤＹＳＹＳＥＷＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、あるいは
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＦＮＳＦＶＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＡＩＨＥＤＧＧＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＴＨＳＬＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３）
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＷＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＡＩＨＤＤＧＴＥＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＶＲＳＤＳＹＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）
を含む。

【0090】

一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、単一特異性抗体分子であり、本発明の抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体をその一方の構造部分として含み（本明細書では、「抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体部分」ともいう）、かつ免疫グロブリンＦｃ領域をその他方の構造部分として含む。場合により、上記抗ＣＤ１６Ａシングルドメイン抗体と免疫グロブリンＦｃ領域はアミノ酸リンカーにより連結され、例えば、長さが１個～２０個のアミノ酸の間にあるアミノ酸リンカーにより連結される。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸リンカーにおいて、少なくとも９０％であるグリシンおよび／またはセリンアミノ酸がある。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４などのＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域はＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１に由来する。
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変異はアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である。

【0091】

好ましい実施形態において、本発明に記載のアミノ酸変異は、ＣＤＲ以外の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。より好ましくは、本発明に記載のアミノ酸変異は、シングルドメイン抗体部分以外の領域に生じる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換は、１つのアミノ酸が同種の別のアミノ酸によって置換され、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換され、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換され、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。例示的な置換は下記の表Ａに示す通りである。

【0092】

【表1】

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＣＤ１６Ａ結合分子は、そのグリコシル化の程度を増加または低減させるように改変される。ＣＤ１６Ａ結合分子に対するグリコシル化部位の追加または欠失は、１つもしくは複数のグリコシル化部位を生成または除去するようにアミノ酸配列を改変することにより容易に実現することができる。ＣＤ１６Ａ結合分子はＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に連結される糖類を変更することができる。いくつかの応用において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を向上させるためにフコースモジュールを除去するなど、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３参照）。他の応用において、ガラクトシド化修飾を行うことにより、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を調節することができる。一部の実施形態において、本明細書に提供されるＣＤ１６Ａ結合分子のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域の変異体を産生することにより、例えば、がんまたは感染性疾患の治療における本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の有効性を増強させることができる。

【0094】

一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、免疫グロブリンＦｃ領域によるエフェクター機能を低減または除去するために、その免疫グロブリンＦｃ領域にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の結合親和性を低減する修飾が含まれる。一実施形態において、上記修飾は、上記免疫グロブリン分子のＦｃ領域、特にそのＣＨ２領域にある。一実施形態において、上記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の第３２９位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、上記アミノ酸置換はＰ３２９Ｇである。一実施形態において、上記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の第２３４位および２３５位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、上記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（本明細書では、「ＬＡＬＡ変異」ともいう）である。

【0095】

一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、その免疫グロブリンＦｃ領域の２つの鎖にそれぞれ突起（「ノブ（ｋｎｏｂ）」）または空孔（「ホール（ｈｏｌｅ）」）が含まれ、かつ一方の鎖のＦｃ領域における上記突起または空孔がそれぞれ他方の鎖のＦｃ領域における上記空孔または突起に配列されてもよく、これにより、上記２つの鎖同士は「ノブ－イン－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」の安定的な会合を形成する。一実施形態において、一方の鎖のＦｃ領域にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗが含まれ、かつ他方の鎖のＦｃ領域にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡとＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）が含まれる。これにより、一方の鎖における突起は他方の鎖における空孔に配置され、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の正確なペアリングを促進することができる。

【0096】

一具体的な実施形態において、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号５で示されるＩｇＧ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡ共通重鎖である。

【0097】

ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５）

【0098】

一具体的な実施形態において、上記免疫グロブリンＦｃ領域における一方の鎖は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する。

【0099】

ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－Ｆｃ－Ｋｎｏｂ、配列番号１４）

【0100】

一具体的な実施形態において、上記免疫グロブリンＦｃ領域における他方の鎖は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する。

【0101】

ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＣＨ－Ｈｏｌｅ、配列番号１９）

【0102】

一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、ヒト細胞に発現されたＣＤ１６Ａに結合すると、当該細胞を活性化したり、一連の生物学的反応、特にシグナル反応を誘発したりすることができる。好ましくは、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、細胞に結合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような方法で標的細胞への殺傷を誘発することができる。

【0103】

本発明は、ＣＤ１６Ａに対して特異性を有し、ＣＤ１６Ｂに対して特異性がないだけでなく、１種または複数種の他の抗原に対して特異性を有する結合分子をさらに提供する。従って、一実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は多重特異性抗体分子である。本明細書における多重特異性という用語は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子が、ＣＤ１６Ｂに対して特異性を有さずに少なくとも２つの特異性を有し、そのうちの１つがＣＤ１６Ａに対する特異性であることを意味する。本発明の多重特異性抗体分子は、例えば、二重特異性、三重特異性および四重特異性の分子を含む。例えば、二重特異性抗体は、単鎖二重特異性抗体、二本鎖二重特異性抗体、三本鎖二重特異性抗体などを含む。

【0104】

本発明の多重特異性結合分子は、マクロファージまたはＮＫ細胞を他の抗原、例えば、上記他の抗原を携帯または発現した細胞に標的化することができ、これにより、マクロファージまたはＮＫ細胞は、貪食作用またはＮＫ細胞により媒介された細胞殺傷作用によって、上記他の抗原を携帯又は発現した細胞を消滅することができる。

【0105】

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は、ＮＫ細胞を腫瘍細胞に標的化することができるために、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する１種または複数種の特異性をさらに有し、ここで、上記多重特異性結合分子はＣＤ１６Ａと結合して、ＮＫ細胞を活性化し、腫瘍細胞を殺傷する。

【0106】

いくつかの実施形態において、上記他の抗原は、細胞表面抗原の１つであり、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆タンパク質（胎児腫瘍抗原未熟ラミニン受容体ＯＦＡ－ｉＬＲともいう）、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ－１、ＥｒｂＢ１ともいう）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ－２、ＥｒｂＢ２、ｎｅｕともいう）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ－３ともいう）、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＰＬＡＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＩＬ４－Ｒα、ＩＬ１３－Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＣＤ５である。

【0107】

さらなる実施形態において、上記他の抗原はアレルゲンで、または体のアレルギー反応に関連する分子であり、例えば、（特に）マスト細胞におけるＩｇＥまたはＦｃεＲＩ受容体である。

【0108】

従来技術において、本発明に用いられる、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ラミニン受容体前駆タンパク質、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ－１（ｍｕｃｉｎ）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４－Ｒα、ＩＬ１３－Ｒ、ＦｃεＲＩおよびＩｇＥと特異的に結合可能な抗体および抗原結合断片が記載されており、例えば、ＥＰ－Ａ－１３１４７４１；Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５－４４５；ＥＰ－Ａ－１００５８７０；ＷＯ ０１／９２３４０；ＵＳ ６，０３３，８７６；ＷＯ ８６／０３２２３；Ｂｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ １２：１－５；ＵＳ ６，６９９，４７３；ＷＯ ９８／５０４３３；ＵＳ ５，７７０１９５；ＥＰ－Ａ－０５０２８１２；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＰＮＡＳ ８９：４２８５－４２８９；ＵＳ ５，９６８，５１１；ＷＯ ０４／１０６３８３；Ｎｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＢＪＵ Ｉｎｔ．８６：８９４－９００；ＥＰ－Ａ－０４２９２４２；Ｒａｖｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４３：９８５－９９６；Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６３－７１；ＷＯ ８８／０５０５４；ＷＯ０２／０５３５９６；ＷＯ ０４／０７１５２９；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，７：８０５－８１４；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３－２６３２）が参照される。当業者は、これらの従来の技術文献に開示された抗体および抗体断片の配列により、本発明に記載される多重特異性抗体分子中の他の抗原に対する結合部分を調製することができる。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、類似の親和性で対立遺伝子ＣＤ１６Ａ １５８ＦとＣＤ１６Ａ １５８Ｖに結合可能であり、例えば、本発明の結合分子は、この２つのＣＤ１６Ａ １５８対立遺伝子に結合する親和性が２倍以下相異する。本発明の好ましい一実施形態において、ＣＤ１６Ａに対する特異性は、本発明の単一ドメイン抗体により提供される。

【0110】

本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、もう１つの機能ドメインを含んでもよい。当該機能ドメインは、分子エフェクターに結合する特性を有することができる。例えば、機能ドメインは、ＦｃＲ結合ペプチドまたはＦｃ受容体と結合可能な抗体Ｆｃ領域であってもよく、結合分子においてエフェクターの特性を有する。場合により、当該機能ドメインは、プロドラッグを活性薬に転化する能力を有する酵素であってもよい。従って、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に用いることができる。一具体的な実施形態において、結合分子の機能ドメインは、結合分子の血清半減期を延長可能なタンパク質またはペプチドで、例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧのＦｃ部分であり、ＦｃγＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）と結合することにより、結合分子の血清における半減期を向上させることができる。一具体的な実施形態において、当該機能ドメインは、サイトカインであってもよい。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、標識分子または毒素と結合することができる。上記標識分子または毒素は、タンパク質である場合、ペプチド結合により、または化学的カップリングにより結合分子と抱合することができる。「カップリング」という用語は、２つの成分が化学結合で連結されることを指し、上記化学結合は、ペプチド結合、エステル結合またはジスルフィド結合を含む。

【0112】

本発明の結合分子と例えば、放射性標識、蛍光標識または発光（化学発光を含む）標識などの標識分子との結合により、結合分子は免疫染色試薬として使用可能になる。上記免疫染色試薬は、ＣＤ１６Ａを発現した組織浸潤ＮＫ細胞、マクロファージまたはマスト細胞の検出、あるいは、疾患の診断または疾患の悪化もしくは疾患の緩和のモニターに適用可能である。

【0113】

本発明の結合分子は、例えば、リボシルトランスフェラーゼ、セリンプロテアーゼ、ＤＮＡアルキル化剤または有糸分裂抑制剤（例えば、アドリアマイシン）などの毒素分子と抱合して、ＮＫ細胞とマクロファージを標的にして殺すために用いることができる。このような結合分子は、免疫抑制剤として適用可能である。当業者であれば、本発明のこの態様において、結合分子は、１つの抗原、すなわち、ＣＤ１６Ａのみに特異性を有することが好ましいことを理解できる。ＣＤ１６Ａに選択的・特異的に結合する単価抗原結合断片からなる結合分子を利用して免疫系への抑制作用を得る。このような単価抗原結合分子は、ＣＤ１６Ａ受容体を阻害する分子として好ましいが、架橋のものではないため、ＮＫ細胞またはマクロファージを活性化することができない。

【0114】

ＩＩＩ．本発明の核酸およびそれを含む宿主細胞
一態様において、本発明は、上記任意のＣＤ１６Ａ結合分子またはその断片もしくはそのいずれか１つの鎖をコードする核酸を提供する。一実施形態において、上記核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。一実施形態において、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）または抗体もしくはその抗原結合断片の調製に適する他の細胞から選ばれる。別の実施形態において、宿主細胞は原核のものである。

【0115】

例えば、本発明の核酸は、配列番号１～４から選ばれるいずれか１つで示されるアミノ酸配列をコードする核酸、または配列番号１～４から選ばれるいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。

【0116】

本発明は、下記の核酸とストリンジェンシー条件でハイブリダイゼーションした核酸、または下記の核酸に対して、１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失もしくは挿入を有するポリペプチド配列をコードする核酸をさらに含む。配列番号１～４から選ばれるいずれか１つで示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列の核酸、または配列番号１～４から選ばれるいずれか１つで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列の核酸。

【0117】

一実施形態において、上記核酸を含む１つまたは複数のベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ベクターはｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。

【0118】

発現用の発現ベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションまたは導入することができる。この目的を達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、脂質ベースのトランスフェクションまたは他の通常技術のような様々な技術を利用することができる。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地において培養して適切な活性をスクリーニングする。産生されたトランスフェクション細胞の培養と産生された抗体分子の回収のための方法と条件は、当業者に知られているもので、かつ本明細書および従来技術で既知の方法により、使用される特定の発現ベクターと哺乳動物宿主細胞によって変更または最適化することができる。

【0119】

また、トランスフェクションされた宿主細胞を選択可能な１つまたは複数のマーカーを導入することにより、その染色体にＤＮＡが安定的に導入された細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性、殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性または重金属（例えば、銅）耐性などを付与することができる。選択可能な標識遺伝子は、発現すべきＮＡ配列と直接連結され、または同時形質転換により同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡ合成の最適化のために、追加の要素を必要とする可能性がある。これらの要素は、スプライシングシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含んでもよい。

【0120】

一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体の調製に適用される他の細胞から選ばれる。好適な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物を含む。宿主細胞は、糸状真菌もしくは酵母などの真核微生物、または昆虫細胞などのさまざまな真核細胞であってもよい。脊椎動物の細胞を宿主として用いてもよい。例えば、懸濁成長に適するように改変された哺乳動物細胞株を使用することができる。使用可能な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ ２９３または２９３Ｆ細胞）、２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＨＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質の産生に適する哺乳動物宿主細胞株についての概要は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５～２６８（２００３）が参照される。好ましい一実施形態において、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞または２９３細胞である。

【0121】

ＩＶ．本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の生産および精製
一実施形態において、本発明は、ＣＤ１６Ａ結合分子を調製する方法を提供し、ここで、上記方法は、上記ＣＤ１６Ａ結合分子をコードする核酸の発現に適する条件で上記ＣＤ１６Ａ結合分子をコードする核酸または上記核酸の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、場合により上記ＣＤ１６Ａ結合分子を単離することとを含む。一部の実施形態において、上記方法は、上記宿主細胞（または宿主細胞培地）からＣＤ１６Ａ結合分子を回収することをさらに含む。

【0122】

組換えにより本発明のＣＤ１６Ａ結合分子を産生するために、まず、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子をコードする核酸を単離し、宿主細胞においてさらにクローニングおよび／または発現されるように、上記核酸をベクターに挿入する。このような核酸は、通常のプロセスにより単離してシークエンシングすることが容易であり、例えば、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子をコードする核酸と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより行われる。

【0123】

本明細書に記載されるように調製された本発明のＣＤ１６Ａ結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の従来技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの要因にも依存し、かつこれらは当業者にとって自明である。本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の純度は、さまざまなよく知られている分析方法のいずれか１つによって決定することができ、上記よく知られている分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。

【0124】

Ｖ．本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の活性測定法
当該分野で既知の様々な測定法により、本明細書に提供されるＣＤ１６Ａ結合分子を同定し、スクリーニングし、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性を特徴付けることができる。一態様において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子に対する抗原結合活性の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングなどの既知の方法で行われる。当該分野で既知の方法によりＣＤ１６Ａへの結合を測定することができ、本明細書には例示的な方法が開示されている。いくつかの実施形態において、ＳＰＲまたはバイオレイヤー干渉法により、本発明のＣＤ１６Ａに対するＣＤ１６Ａ結合分子の結合を測定する。

【0125】

本発明は、生物学的活性を有するＣＤ１６Ａ結合分子を同定するための測定法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、細胞（例えば、ＮＫ細胞）表面ＣＤ１６Ａに対する結合、細胞傷害作用などを含んでもよい。

【0126】

いずれの上記インビトロ測定法に使用される細胞も、ＣＤ１６Ａを天然に発現し、或いは改変によりＣＤ１６Ａを発現する細胞株を含む。改変によりＣＤ１６Ａを発現する上記細胞株は、正常な場合にＣＤ１６Ａを発現しないが、ＣＤ１６ＡをコードするＤＮＡが細胞にトランスフェクションされた後にＣＤ１６Ａを発現する細胞株である。

【0127】

ＶＩ．医薬組成物および医薬製剤
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のいずれかのＣＤ１６Ａ結合分子またはその免疫複合体の組成物を提供し、好ましくは、組成物は医薬組成物である。一実施形態において、上記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。一実施形態において、組成物（例えば、医薬組成物）は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子またはその免疫複合体と、１種もしくは複数種の他の治療剤（例えば、化学療法剤、細胞傷害剤、他の抗体、抗感染症剤、低分子薬または免疫調節剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体）との組み合わせを含む。

【0128】

いくつかの実施形態において、上記組成物は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍はがんである。

【0129】

本発明は、ＣＤ１６Ａ結合分子もしくはその免疫複合体を含む組成物（医薬組成物もしくは医薬製剤を含む）および／またはＣＤ１６Ａ結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物（医薬組成物もしくは医薬製剤を含む）をさらに含む。これらの組成物は、緩衝剤を含め、当該分野で既知の薬用賦形剤などの適切な薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。

【0130】

本明細書に使用されるように、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合する溶剤、分散媒体、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかまたはそのすべてを含む。本発明に適する薬学的に許容可能な担体は、石油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油などの動物もしくは植物に由来するまたは合成されたものを含め、水および油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は担体として好ましい。さらに、生理食塩水溶液および水性デキストロースとグリセリン溶液を液体担体として、特に注射可能な溶液に用いてもよい。好適な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその使用については、『Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ』，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ、Ｐ．Ｊ．ＳｅｓｋｅｙおよびＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏも参照される。必要に応じて、上記組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用することができる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの、標準的な薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでもよい。

【0131】

所望の純度を有する本発明のＣＤ１６Ａ結合分子を１つ又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することにより、本明細書に記載のＣＤ１６Ａ結合分子を含む医薬製剤を調製することができ、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形態である。

【0132】

本発明の医薬組成物または製剤は、１種以上の活性成分をさらに含んでもよく、上記活性成分は、治療される特定の適応症に必要なものであり、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する活性成分を有する。例えば、好ましくは、他の抗がん活性成分または抗感染活性成分、例えば、化学療法剤、細胞傷害剤、他の抗体、抗感染症剤、低分子薬もしくは免疫調節剤、例えば抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などをさらに提供する。上記活性成分は、目的とする使用に有効な量で適切に組み合わせて存在する。

【0133】

持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の好適な実例は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、上記マトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態のような成形品である。

【0134】

ＶＩＩ．組み合わせ製品または試薬キット
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子またはその抗体断片、またはその免疫複合体と、１種もしくは複数種の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、抗感染症剤、低分子薬もしくは免疫調節剤など）とを含む組み合わせ製品をさらに提供する。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体である。

【0135】

いくつかの実施形態において、上記組み合わせ製品は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍はがんなどである。

【0136】

いくつかの形態において、上記組み合わせ製品における２種もしくは多種の成分は、対象に順次投与、個別投与、または同時併用投与してもよい。

【0137】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子、医薬組成物、免疫複合体または組み合わせ製品を含む試薬キット、および任意の投与指導用包装付加頁をさらに提供する。

【0138】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子、医薬組成物、免疫複合体、組み合わせ製品を含む医薬製品をさらに提供し、場合により、上記薬物製品は、投与指導用包装付加頁をさらに含む。

【0139】

ＶＩＩＩ．本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の使用
一実施形態において、本発明は、対象の腫瘍（例えば、がん）を予防または治療する方法に関し、上記方法は、上記対象に有効量の本明細書に開示されたＣＤ１６Ａ結合分子またはそれを含む医薬組成物もしくは免疫複合体もしくは組み合わせ製品を投与することを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は免疫回避した腫瘍である。

【0140】

一実施形態において、本発明は、対象の感染性疾患を予防または治療する方法に関し、上記方法は、上記対象に有効量の本明細書に開示されたＣＤ１６Ａ結合分子またはそれを含む医薬組成物もしくは免疫複合体もしくは組み合わせ製品を投与することを含む。

【0141】

別の態様において、本発明は、対象においてＮＫ細胞媒介性の細胞傷害を誘発する方法に関し、上記方法は、上記対象に有効量の本明細書に開示されたＣＤ１６Ａ結合分子またはそれを含む医薬組成物もしくは免疫複合体もしくは組み合わせ製品を投与することを含む。

【0142】

対象は、霊長類などの哺乳動物であってもよく、好ましくは、人間（例えば、本明細書に記載の疾患に罹患しているかまたは本明細書に記載の疾患に罹患するリスクのある患者）などの高等霊長類である。一実施形態において、対象は本明細書に記載の疾患（例えば、本明細書に記載の腫瘍もしくは感染性疾患）に罹患しており、または本明細書に記載の疾患に罹患するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、化学療法治療および／または放射線治療などの他の治療を受けるか、または既に受けた。選択的に、または組み合わせでは、対象は、感染により免疫不全が生じ、または感染により免疫不全になるリスクがある。

【0143】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のがんなどの腫瘍は、固形腫瘍、血液がん、軟部組織腫瘍および転移性病巣を含むが、これらに限定されない。

【0144】

固形腫瘍の例は、例えば、肝、肺、乳腺、リンパ、消化管（例えば、結腸）、尿生殖路（例えば、腎・膀胱上皮細胞）、前立腺および咽頭に浸潤するようながんなどの複数の器官系における肉腫とがん（例えば、腺がんと扁平上皮がんを含む）といった悪性腫瘍を含む。腺がんは、ほとんどの結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、肺がんにおける非小細胞肺がん、小腸がんと食道がんなどの悪性腫瘍を含む。扁平上皮がんは、肺、食道、皮膚、頭頸部領域、口腔、肛門と子宮頚におけるがんなどの悪性腫瘍を含む。一実施形態において、がんは進行性黒色腫などの黒色腫である。一実施形態において、がんは腎細胞がんである。上記がんの転移性病巣も、本発明の方法および組成物により治療または予防することができる。
治療に用いられる好適ながんの非限定的な例は、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、乳がん（例えば、転移性乳がん）、肝がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ））、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、例えば、ステージＩＶもしくは再発性非小細胞肺がん、ＮＳＣＬＣ腺がん、またはＮＳＣＬＣ扁平上皮がん）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病）、皮膚がん（例えば、黒色腫（例えば、ステージＩＩＩもしくはステージＩＶ黒色腫）またはＭｅｒｋｅｌ細胞がん）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ））、骨髄異形成症候群、膀胱がん（例えば、移行細胞がん）、腎がん（例えば、腎細胞がん、例えば、進行性または転移性明細胞腎細胞がんなどの明細胞腎細胞がん）と結腸がんを含む。なお、難治性または再発性悪性腫瘍は、本明細書に記載のＣＤ１６Ａ結合分子またはそれを含む医薬組成物もしくは免疫複合体もしくは組み合わせ製品により治療することができる。

【0145】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子またはそれを含む免疫複合体もしくは組成物もしくは組み合わせ製品は、病症および／または病症に関連する症状の発作を遅延することができる。

【0146】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の予防または治療方法は、上記対象または個体に本明細書に開示されたＣＤ１６Ａ結合分子または医薬組成物もしくは免疫複合体もしくは組み合わせ製品、および１種もしくは複数種の他の治療法、例えば、治療方法および／または他の治療剤を併用投与することをさらに含む。

【0147】

いくつかの実施形態において、治療方法は、外科的手術（例えば、腫瘍切除術）、放射線治療（例えば、照射領域が設定された３次元原体放射線治療に関わる外部粒子ビーム療法）、局所照射（例えば、所定の標的もしくは器官に対する照射）または集中的照射）などを含む。上記集中的照射は、定位放射線手術、分割定位放射線手術および強度変調放射線療法から選ばれてもよい。上記集中的照射は、例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４に記載されるように、粒子ビーム（プロトン）、コバルト－６０（フォトン）および線形加速器（Ｘ線）から選ばれる放射線源を有してもよい。

【0148】

放射線治療は、幾つかの方法の１つ又は方法の併用で投与することができ、上記方法は、外部粒子ビーム療法、内部照射療法、インプラント照射、定位放射線手術、全身照射療法、放射線治療、および永久または短期の間質性近接照射療法を含むが、これらに限定されない。

【0149】

いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、細胞傷害剤、他の抗体、抗感染症剤、低分子薬または免疫調節剤（例えば、共刺激分子の活性化剤もしくは免疫チェックポイント分子の抑制剤）から選ばれる。

【0150】

本発明の併用療法は、併用投与（ここで、２種または多種の治療剤が同一の製剤または別個の製剤に含まれる）および個別投与を含む。個別投与の場合は、他の治療法を投与する前、同時および／またはその後に本発明のＣＤ１６Ａ結合分子または免疫複合体などの投与を実施することができる。

【0151】

一実施形態において、ＣＤ１６Ａ結合分子の投与および他の治療法（例えば、治療方法または治療剤）の投与は、約１か月内、または約１、２もしくは３週間内、または約１、２、３、４、５もしくは６日間内に行われる。

【0152】

本発明のＣＤ１６Ａ結合分子（およびそれを含む医薬組成物または免疫複合体）は、非経口投与、肺内投与と鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療に必要なの場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射により投与することができる。本明細書において、単回投与または複数の時点での複数回投与、ボーラス投与およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投与スケジュールが含まれる。

【0153】

疾患を予防または治療するために、本発明のＣＤ１６Ａ結合分子の好適な用量（単独で、または１種もしくは複数種の他の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患のタイプ、ＣＤ１６Ａ結合分子のタイプ、疾患の重症度と進行、予防のためか治療のためかという上記ＣＤ１６Ａ結合分子の投与目的、過去の治療、患者の臨床病歴と上記ＣＤ１６Ａ結合分子に対する応答、および主治医の判断力によって決定される。上記ＣＤ１６Ａ結合分子は、単回の治療で、または一連の治療を経て患者に適当に投与される。ＣＤ１６Ａ結合分子の用量と治療計画は、当業者によって決定することができる。

【0154】

なお、上記何れの予防または治療も、本発明の免疫複合体または組成物または組み合わせ製品によりＣＤ１６Ａ結合分子を置換することで行うことができる。

【0155】

ＩＸ．診断と検出のための方法および組成物
一部の実施形態において、本明細書に提供されるいずれのＣＤ１６Ａ結合分子も、生体試料におけるＣＤ１６Ａの存在の検出に用いることができる。「検出」という用語は本明細書に使用される場合、定量的または定性的検出を含み、例示的な検出方法としては、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子複合磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定法が挙げられる。一部の実施形態において、生体試料は、血、血清または生物に由来する他の体液試料である。一部の実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、過剰増殖性またはがん性病巣に由来する。

【0156】

一実施形態において、診断又は検出方法に用いられるＣＤ１６Ａ結合分子を提供する。他の態様において、生体試料におけるＣＤ１６Ａの存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、生体試料におけるＣＤ１６Ａタンパク質の存在を検出することを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１６Ａは、ヒトＣＤ１６Ａである。一部の実施形態において、上記方法は、ＣＤ１６Ａ結合分子とＣＤ１６Ａの結合が許容される条件で、生体試料を本明細書に記載のＣＤ１６Ａ結合分子と接触するとともに、ＣＤ１６Ａ結合分子とＣＤ１６Ａの間に複合物が形成されたか否かを検出することを含む。複合物の形成は、ＣＤ１６Ａの存在を示す。当該方法は、インビトロまたはインビボ方法であってもよい。一実施形態において、ＣＤ１６Ａ結合分子は、ＣＤ１６Ａ結合分子による治療に適する対象の選択に用いられ、例えば、ここで、ＣＤ１６Ａは上記対象を選択するためのバイオマーカーである。

【0157】

なお、例えば、疾患、治療剤、治療方法と投与などの本発明の各部分に記載の各実施形態は、同様に本発明の他の部分の実施形態に適用され、或いは他の部分の実施形態と組み合わせることができる。本発明の各部分に記載のＣＤ１６Ａ結合分子に適する特性、使用、および方法などの実施形態は、同様にＣＤ１６Ａ結合分子を含む組成物、複合体、組み合わせ製品および試薬キットなどに適用される。

【0158】

本発明の理解を助けるために、以下の実施例を説明する。いかなる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。

【実施例1】

【0159】

実施例
以下の実施例を参照することにより、本明細書に一般的に記載された本発明をさらに容易に理解し、これらの実施例は、例を挙げて説明することで提供されるもので、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。これらの実施例は、下記の実験がすべて行われるか、または行われる実験のみを示すことを意図するものではない。

【0160】

実施例１ 抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン（シングルドメイン）抗体合成ライブラリーのスクリーニングおよびフローサイトメトリー染色による同定
本実施例により、ＣＤ１６Ａを標的にする４つの全合成されたヒト単一ドメイン抗体をスクリーニングした。具体的な操作は、以下の通りである。

【0161】

ヒト生殖細胞系遺伝子の再構成後の単一ドメイン抗体合成ライブラリーを構築する（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）ことで、各単一ドメイン抗体を酵母細胞表面にディスプレイした。

【0162】

Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別により、１回目のスクリーニングを実施した。具体的に、各ライブラリーから２×１０^９個の酵母細胞を取り、抗原としてビオチン化ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＡ－Ｈ８２Ｅ９）を加え、室温で３０分間インキュベートした。５０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％のウシ血清アルブミン含有）で１回洗浄した。１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁した後、４０μＬのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳ）を加え、４℃で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた後に１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに入れた。試料を加えた後、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液でＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを３回洗浄した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを取り外し、５ｍＬの成長培地ＹＰＤ（生工生物、Ａ５０７０２２－０２５０）で酵母細胞を溶出した。溶出された酵母細胞を収集し、培養フラスコに入れ、３０℃で一晩培養した後、２０℃で２４時間振とう誘導した。

【0163】

フローサイトメトリーを利用して磁気ビーズにより濃縮された酵母ライブラリー細胞に対して２回目の選別を行った。ライブラリーから４×１０^７個の酵母細胞を取り、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ビオチン化ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖタンパク質およびウサギ抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ７４２５）を含むＦＡＣＳ緩衝液を加え、室温で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ストレプトアビジンＳＡ－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２－４３１７－８７）（１：２００で希釈）およびＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ－６４７で抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ２１２３５）（１：２００で希釈）を含むＦＡＣＳ緩衝液を加え、４℃で暗所で１５分間インキュベートした。予冷したＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した後、ＭｏＦｌｏ＿ＸＤＰ超高速フローサイトメトリー選別システム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＭＬ９９０３０）により細胞選別を行い、選別した酵母細胞を３０℃で一晩振とうして成長した。

【0164】

ビオチン化ＣＤ１６Ａ－１５８Ｆタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＡ－Ｈ８２Ｅ８）、ビオチン化ＣＤ１６Ｂ－ＮＡ１タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＢ－Ｈ８２Ｅ４）、ビオチン化ＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＢ－Ｈ８２Ｅａ）およびビオチン化ｃｙｎｏ ＣＤ１６タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＣ６－Ｃ８２Ｅ０）を抗原としてそれぞれ使用してその後のスクリーニングを実施し、方法は上記２回目のフローサイトメトリーによる選別と同じである。

【0165】

選別が完成した後に、酵母単クローンを選択し、４８ウェルプレートに置いて３０℃で一晩培養し、酵母プラスミドを抽出してシークエンシングするとともに、酵母細胞をフローサイトメトリー染色により同定した。各酵母クローンから１×１０^６個の細胞を取り、染色方法は上記２回目のフローサイトメトリーによる選別と同じである。最後に、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｆおよびｃｙｎｏ ＣＤ１６と結合し、かつＣＤ１６Ｂ－ＮＡ１およびＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２と結合しない単一ドメイン抗体分子が得られ、真核細胞に発現されたプラスミドベクターに構築して同定した。

【0166】

上記の複数回のスクリーニング実験を経て、ＣＤ１６Ａと結合する４つのクローン、すなわち、クローンＹ８８Ａ３、クローンＹ９５Ｈ１、クローンＹ９９Ｆ６およびクローンＹ１００Ｄ６が得られ、発現したヒト単一ドメイン抗体は、クローニング番号によってそれぞれＹ８８Ａ３ ｓｄＡｂ（配列番号１）、Ｙ９５Ｈ１ ｓｄＡｂ（配列番号２）、Ｙ９９Ｆ６ ｓｄＡｂ（配列番号３）およびＹ１００Ｄ６ ｓｄＡｂ（配列番号４）と命名した。

【0167】

実施例２ 真核細胞ＨＥＫ２９３Ｆにおける抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体の発現および精製
実施例１の酵母ディスプレイ合成ライブラリによりスクリーニングされた４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体（Ｙ８８Ａ３ ｓｄＡｂ、Ｙ９５Ｈ１ ｓｄＡｂ、Ｙ９９Ｆ６ ｓｄＡｂおよびＹ１００Ｄ６ ｓｄＡｂ）のヌクレオチド配列を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異型のＩｇＧ１重鎖定常領域を含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで、その中のＩｇＧ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡ共有重鎖配列は配列番号５で示される）に構築し、得られた相応するプラスミドを抽出した。

【0168】

密度が３．０×１０^６個の細胞／ｍＬになるようにＨＥＫ２９３Ｆ細胞を培養し、得られた相応するプラスミドをトランスフェクション試薬ＰＥＩと質量比１：３で均一に混合した後に２０ｍｉｎ静置し、その後ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に徐々に加え、３７℃で、８％のＣＯ_２シェーカーインキュベーターにおいて６日間～７日間培養した。

【0169】

遠心分離して細胞上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ精製樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で１時間結合し、ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）でＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製樹脂を洗浄して不純タンパク質を除去し、さらにｐＨ３．０の０．１Ｍのクエン酸でタンパク質を溶出し、溶出したタンパク質をＰＢＳに限外ろ過し、２つの重鎖からなる抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体が得られた。

【0170】

得られた抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体の収率を測定した後、少量の試料を取って分子サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）により、その中の重鎖抗体タンパク質に複数の重鎖抗体の凝集が生じたか否かを測定した。その結果、上記操作で精製した、Ｎ末端からＣ末端へｓｄＡｂ－Ｆｃ－ＬＡＬＡである鎖を２つ含む抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体の純度は、いずれも９０％以上に達することができることが示された。試料を分注した後に－８０℃の冷蔵庫に保存した。

【0171】

実施例３ 抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体のヒトＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ、およびカニクイザルＣＤ１６Ａとの結合親和性の測定
バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）により、実施例２で得られた精製した４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体がヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｆ、ＣＤ１６Ｂ－ＮＡ１およびＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２、ならびにカニクイザルＣＤ１６Ａ（ｃｙｎｏ－ＣＤ１６Ａ）抗原と結合する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。実施例２において、Ｆｃ断片にあり得るＣＤ１６との結合への影響を排除するために、Ｆｃ部分として、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａで変異したＩｇＧ１－Ｆｃ、すなわち、ＩｇＧ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡを使用することで、Ｆｃ部分とＣＤ１６の結合を除去し、これにより、バックグラウンド干渉を最大限に低減させた。

【0172】

親和性の測定は、従来技術で知られている方法（Ｅｓｔｅｐ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ，ｍＡｂｓ，２０１３，５（２），２７０－８）により実施された。簡単に言えば、センサーを分析緩衝液においてオフラインで３０分間平衡化し、次にオンラインで６０秒間検出して基線を確立し、上述したように得られた精製された重鎖抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ａセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－５０１０）にオンラインでロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性検出を行った。さらに、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体がロードされたセンサーを、１００ｎＭの濃度を有するヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖタンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤ９－Ｈ５２Ｈ４）、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｆタンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＡ－Ｈ５２２０）、ＣＤ１６Ｂ－ＮＡ１タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＢ－Ｈ５２２７）とＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤＢ－Ｈ５２２２）、およびｃｙｎｏ－ＣＤ１６Ａタンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＣ６－Ｃ５２Ｈ９）の抗原タンパク質溶液にそれぞれ１００秒間暴露した後、解離速度測定のために、センサーを分析緩衝液に移して１２０秒間解離した。１：１の結合モデルを利用して結合動力学のフィッティングと分析を行い、Ｋ_Ｄ値を算出した。

【0173】

その結果、表１に示すように、上記４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体は、いずれもヒトＣＤ１６Ａ－１５８ＶおよびＣＤ１６Ａ－１５８Ｆに対して高い親和性を示し、かつ親和性がＣＤ１６Ａ抗原アイソフォーム（１５８Ｖまたは１５８Ｆ）の影響を受けず、Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ社のＣＤ１６Ａヒト化抗体４ＬＳ２１（配列番号６＆配列番号７で、配列がＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６１２５６６８Ａ２より）に相当し、対照抗体ＩｇＧ１－ＦｃのＣＤ１６Ａ－１５８Ｖとの親和性（～１００ｎＭ）よりも明らかに高い。同時に、上記４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体は、いずれもヒトＣＤ１６Ｂ－ＮＡ１およびＣＤ１６Ｂ－ＮＡ２と結合せず、対照であるＣＤ１６Ａヒト化抗体４ＬＳ２１のＣＤ１６に対する結合方法と同じであり、ヒトＣＤ１６Ａと結合する選択性を有し、ここで、上記抗体４ＬＳ２１はＳｃＦｖ－Ｆｃ形態である。

【0174】

なお、上記４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体は、いずれもカニクイザルＣＤ１６Ａと結合したため、上記抗ヒトＣＤ１６Ａ重鎖抗体は、サルＣＤ１６Ａと交差結合したことが明らかになる。

【0175】

【表2】

【0176】

実施例４ 抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体のヒトＣＤ１６Ａと結合するエピトープの測定
ヒトＣＤ１６ＡとＣＤ１６Ｂとのアミノ酸配列の主な区別部位は、Ｎ末端の１２９位と１４０位である（Ｅｌｌｗａｎｇｅｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ（ＲＯＣＫ（登録商標））：Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｉｔ－ｆｏｒ－ｐｕｒｐｏｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＭＡｂｓ，２０１９，１１（５），８９９－９１８）。従って、本実施例は、アミノ酸の部位特異的変異と遺伝子クローニングの方法により、ヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ抗原におけるＧ１２９位をＣＤ１６ＢのＤ１２９（すなわち、Ｇ１２９Ｄ）に変異し、またはヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ抗原におけるＹ１４０位をＡ１４０（すなわち、Ｙ１４０Ａ）に変異し、それぞれヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖの変異抗原ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｇ１２９Ｄ（配列番号８）およびＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｙ１４０Ａ（配列番号９）を調製した。各変異抗原配列のＣ末端には、精製のために、６ｘ Ｈｉｓタグを付加した。上記２つの変異抗原の遺伝子配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのヌクレオチド配列が配列番号１０で示される）に構築し、実施例２の発現方法により発現し、Ｎｉ－ＮＴＡにより精製した。

【0177】

抗原を精製した後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ法により本発明における４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体がヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｇ１２９ＤおよびＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｙ１４０Ａと結合するＫ_Ｄ値を測定することにより、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるシングルドメイン断片が結合する抗原エピトープを決定した。ＳｃＦｖ－Ｆｃ形態の４ＬＳ２１抗体を対照として使用した。

【0178】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、実施例３に記載の方法に従って行われ、抗原は、それぞれヒトＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｇ１２９ＤおよびＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｙ１４０Ａを使用した。その結果、表２に示すように、４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるＹ８８Ａ３シングルドメイン抗体断片、Ｙ９９Ｆ６シングルドメイン抗体断片、Ｙ１００Ｄ６シングルドメイン抗体断片およびＹ９５Ｈ１シングルドメイン抗体断片は、いずれもＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｙ１４０Ａ抗原と結合しないが、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｖ－Ｇ１２９Ｄと正常に結合したことを示しており、Ｇ１２９ではなくＹ１４０は、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるＹ８８Ａ３シングルドメイン断片、Ｙ９９Ｆ６シングルドメイン断片、Ｙ１００Ｄ６シングルドメイン断片およびＹ９５Ｈ１シングルドメイン断片がＣＤ１６ＢではなくＣＤ１６Ａと選択的に結合することに非常に重要であり、Ｙ１４０は抗原エピトープにおける重要なアミノ酸残基の１つを構成することが明らかになる。このことは、４ＬＳ２１ ＳｃＦｖと同じである。

【0179】

【表3】

【0180】

実施例５ 抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体とヒトＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂを発現したＧＳ－ＣＨＯ細胞の結合
本実施例は、フローサイトメトリーにより、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体（勾配希釈）と表面にヒトＣＤ１６Ａ（１５８Ｖ型）およびＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）を過剰発現したＧＳ－ＣＨＯ安定細胞株の結合を検出した。

【0181】

具体的に、ヒトＣＤ１６Ａ（１５８Ｖ型）およびＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）をコードするｃＤＮＡをｐＸＣ１７．４のプラスミドベクター（Ｌｏｎｚａ、配列番号１１）にクローニングし、エレクトロトランスフェクション法により、それをＧＳ－ＣＨＯ細胞（Ｌｏｎｚａ）にトランスフェクションして細胞膜にヒトＣＤ１６Ａ（１５８Ｖ型）およびＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）を発現した。スクリーニングにより、ヒトＣＤ１６Ａ（１５８Ｖ型）およびＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）を発現したＧＳ－ＣＨＯ安定発現の細胞株をそれぞれ産生した。

【0182】

フローサイトメトリーの検出ステップは、以下の通りである。それぞれヒトＣＤ１６Ａ（１５８Ｖ型）和ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）を発現した上記ＧＳ－ＣＨＯ細胞を４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培地を除去し、ＰＢＳで細胞を再懸濁し、計数した後、細胞密度を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、Ｕ型底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで細胞懸濁液を加えた。その後、最終濃度が１００ｎＭになるように、測定待ちの抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体を加え、６倍希釈した１０個の勾配を設定した。細胞と試料を氷上で静置して１ｈｒ反応させた。３００ｇ、５ｍｉｎで上清を除去し、ＰＢＳにより細胞を１回洗浄した。３００ｇ、５ｍｉｎでＰＢＳを除去し、各ウェルに１：２００で希釈したＰＥ－抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）を１００μＬ加えた。氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇ、５ｍｉｎで上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、さらに１００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｆａｃｓｃｅｌｅｓｔａ）を利用して蛍光偏光検出を行った。検出結果は、図１Ａと図１Ｂに示す通りである。

【0183】

図１Ａと図１Ｂから見られるように、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるＹ８８Ａ３、Ｙ９９Ｆ６、Ｙ９５Ｈ１およびＹ１００Ｄ６シングルドメイン部分は、いずれもＣＤ１６Ａを過剰発現したＧＳ－ＣＨＯ安定細胞株と強く結合し、結合の半数効果濃度（ＥＣ_５０）が対照抗体４ＬＳ２１よりも優れており、また、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるＹ８８Ａ３、Ｙ９９Ｆ６、Ｙ９５Ｈ１およびＹ１００Ｄ６シングルドメイン部分は、いずれもＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１型）を過剰発現したＧＳ－ＣＨＯ安定細胞株と結合せず、ＣＤ１６Ａ選択性の特性を備えている。図１Ａと図１Ｂにおいて、陰性対照であるアイソタイプＩｇＧ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡは、ニワトリ卵リゾチーム（Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＨＥＬ）抗体であり、その可変領域配列は配列番号１２＆配列番号１３で示される。

【0184】

実施例６ 抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体と初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の結合
本実施例は、フローサイトメトリーにより抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体（勾配希釈）と初代ＮＫ細胞の結合を検出した。実験プロセスは、以下の通りである。

【0185】

ヒトのＰＢＭＣ細胞（Ｓａｉｌｙｂｉｏ、ＳＬＢ１９００８４＆ＳＬＢ１９００７１）を蘇生させ、ヒトＮＫ細胞濃縮試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１９０５５）を用いてＮＫ細胞を濃縮して分離し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を再懸濁した。計数した後、細胞密度を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、Ｕ型底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで加えた。その後、最終濃度が１００ｎＭになるように、測定待ちの抗体を加え、６倍希釈した１０個の勾配を設定した。氷上で静置して１ｈｒ反応させた。３００ｇ、５ｍｉｎで上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗った。３００ｇ、５ｍｉｎでＰＢＳを除去し、各ウェルに１：２００で希釈したＰＥ－抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）を１００μＬ加えた。氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、さらに１００μＬのＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｆａｃｓｃｅｌｅｓｔａ）を利用して蛍光偏光検出を行った。検出結果は、図２Ａと図２Ｂに示す通りである。

【0186】

図２Ａと図２Ｂから見られるように、抗ＣＤ１６Ａ重鎖抗体におけるＹ８８Ａ３、Ｙ９９Ｆ６、Ｙ９５Ｈ１およびＹ１００Ｄ６シングルドメイン部分は、いずれも初代ＮＫ細胞と結合可能であり、結合活性が４ＬＳ２１に相当し、またはそれよりも優れる。図２Ａと図２Ｂに使用された対照抗体は、実施例５と同じである。

【0187】

実施例７ 抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２二重特異性抗体および抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体の調製
本願で得られたＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体がＮＫ細胞の活性化と殺傷を媒介する能力を有するか否かを検証するために、本実施例は、ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体をそれぞれ抗ＨＥＲ２抗体（クローン：４Ｄ５）および抗ＢＣＭＡ抗体（クローン：ＡＤＩ３８４－５６）と二重特異性抗体を構築し、二重特異性抗体の構造形態が「１＋１」形態（各抗体の番号および構造形態が表３と図３Ａに示されている）を採用し、重鎖二量化がノブ－イン－ホール（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ）技術を採用し、具体的な構築方法は、以下の通りである：上記４つの例示的な抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体（Ｙ８８Ａ３、Ｙ９５Ｈ１、Ｙ９９Ｆ６およびＹ１００Ｄ６）配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１－ＳＰ－ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ－Ｆｃ－Ｋｎｏｂベクター（ｐｃＤＮＡ３．１がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ＬＡＬＡ変異およびＫｎｏｂ変異がＰＣＲ部位特異的変異法を採用し、配列番号１４である）に構築し、抗ＨＥＲ２抗体（クローンＩＤ：４Ｄ５、配列番号１５＆配列番号１６）および抗ＢＣＭＡ抗体（クローンＩＤ：ＡＤＩ３８４－５６、配列番号１７＆配列番号１８）の重鎖可変領域（ＶＨ）をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１－ＳＰ－ＩｇＧ１ＬＡＬＡ－ＣＨ－Ｈｏｌｅベクター（ｐｃＤＮＡ３．１がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、ＬＡＬＡ変異およびＨｏｌｅ変異（ホール変異）がＰＣＲ部位特異的変異法を採用し、ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ－ＣＨ－ホール配列が配列番号１９で示される）に構築すると同時に、その軽鎖可変領域（ＶＬ）をそれぞれＩｇＧ１軽鎖定常領域のベクターｐｃＤＮＡ３．１－ＳＰ－ＩｇκＣＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、Ｉｇκ ＣＬのアミノ酸配列が配列番号２０で示される）に構築した。試薬キットの取扱説明書に従って相応するプラスミドを抽出した。

【0188】

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を３．０×１０^６個の細胞／ｍＬに培養し、Ｋｎｏｂ重鎖をコードするプラスミド、Ｈｏｌｅ重鎖をコードするプラスミドおよび軽鎖をコードするプラスミドを１：１：１の割合で混合し、その後、得られたプラスミド混合物とトランスフェクション試薬ＰＥＩを１：３の体積比で均一に混合した後に２０ｍｉｎ静置し（二重特異性抗体の構造形態が表３と図３Ａに示されている）、その後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に徐々に加え、実施例２中の方法を参照して発現・精製し、ＳＥＣ法により二重特異性抗体試料に凝集が生じたか否かを測定した。ＳＥＣの結果から分かるように、精製後の二重特異性抗体の純度はいずれも９０％以上に達することができる。

【0189】

【表4】

【0190】

実施例８ 抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２および抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体とＮＫ細胞の結合
本実施例は、フローサイトメトリーにより、本発明における抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２および抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体（勾配希釈）と初代ＮＫ細胞の結合を検出した。検出方法は実施例６と同じである。

【0191】

検出結果は、図３Ｂと図３Ｃに示す通りである：本発明の抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２、抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体は、いずれも初代ＮＫ細胞と結合する能力を有し、かつ対照である４ＬＳ２１／抗ＴＡＡ二重特異性抗体に相当する。

【0192】

実施例９ 抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体の、ＣＤ１６Ａおよび腫瘍抗原との結合による抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の特異的媒介についての予備検証
本実施例は、ＣＤ１６Ａ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をエフェクター細胞（ＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）として採用することで抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体のＡＤＣＣを特異的に媒介する能力を検出した。

【0193】

抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体とＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃレポーター細胞および腫瘍細胞（ＳＫ－ＢＲ３細胞は、ＨＥＲ２高発現、ＢＣＭＡ発現陰性の乳がん細胞株であり、ＡＴＣＣから得られ、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞は、ＨＥＲ２発現陰性、ＢＣＭＡ発現陽性の多発性骨髄腫細胞株であり、ＡＴＣＣから得られ）を共インキュベートし、インキュベートした後にＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃレポーター細胞から放出された蛍光シグナル値を検出することにより、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体の、ＣＤ１６Ａおよび腫瘍抗原との結合によりエフェクター細胞シグナルの活性化とＡＤＣＣを特異的に媒介する能力を反映し、その詳しい実験プロセスは以下の通りである。

【0194】

１０％の不活化したウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ、１０６８７－０１０）、２５０μｇ／ｍＬの抗生素Ｇ－４１８硫酸塩溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８０９１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｇｉｂｃｏ、１１３６０）と０．１ｍＭのＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４）を含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ、１１１８３５－０３０）でＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７１０２）を蘇生させ、４８時間継代戦略に従って継代培養し、継代密度が２×１０^５個の細胞／ｍＬである。実験前に、３％の低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０分析培地でＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞を３回洗浄した後、細胞密度が２．０×１０^６個の細胞／ｍＬになるように再懸濁し、使用に備えた。予熱した０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡでＳＫ－ＢＲ３（ＨＥＲ２^＋、ＢＣＭＡ^－）およびＮＣＩ－Ｈ９２９（ＨＥＲ２^－、ＢＣＭＡ^＋）腫瘍細胞をそれぞれ消化し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞を収集して計数し、上記分析培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度を０．８×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、使用に備えた。上記分析培地で各抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体を最終濃度１００ｎＭに希釈した後、１０個の勾配で５倍希釈した。実験群の各ウェルに５０μＬのＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞、５０μＬの抗体試料溶液、および５０μＬの腫瘍細胞をそれぞれ加え、マルチチャンネルピペットにより順に均一に混合した後、２００ｇ×３ｍｉｎ遠心分離し、さらに均一に混合した。細胞培養プレートを５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて３７℃で一晩インキュベートした後、各ウェルに調製済みのＢｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）を１００μＬ加え、暗所で５分間～１０分間静置し、プレートを読み取った：Ｍａｘ ｉ３型プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、全波長走査で蛍光シグナル値を読み取った。

【0195】

実験結果は、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａと図５Ｂに示す通りである。本発明の二重特異性抗体に含まれる抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体は、腫瘍特異的にＡＤＣＣ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞を活性化してＡＤＣＣ作用を発生させることができ、対照抗体４ＬＳ２１／抗ＴＡＡと比べて、より良い細胞活性化とＡＤＣＣの能力を有し、同時にＡＤＣＣ増強型のＩｇＧ１抗体、例えば、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ、ＭＧＡＨ２２ともいう）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓより、配列番号２１＆配列番号２２）よりも優れている。

【0196】

実施例１０ 抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体の、ＣＤ１６Ａおよび腫瘍抗原との結合によるＮＫ細胞活性化の特異的媒介
本実施例は、細胞内フローサイトメトリー染色法により、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体の、ＣＤ１６Ａおよび腫瘍抗原との結合によるＮＫ細胞活性化の特異的媒介能力を検出し、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体とＮＫ細胞および腫瘍細胞を共インキュベートし、ＮＫ細胞におけるＩＦＮγの分泌と活性化後の細胞膜表面のＣＤ１０７ａの発現レベルを検出することで、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体における抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体部分のＮＫ細胞への腫瘍抗原特異的活性化効果を反映し、詳しい実験プロセスは以下の通りである。

【0197】

ＰＢＭＣ細胞（Ｓａｉｌｙｂｉｏ、ＳＬＢ１９００７１）を蘇生させ、２００μＬ／１０ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、０７９００）と１０％の不活化したウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）を含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ、１１１８３５－０３０）で細胞を再懸濁し、３７℃のインキュベーターで２ｈｒインキュベートした後、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮＫ濃縮試薬キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９０５５）より提供された方法によりＮＫ細胞を濃縮し、最後に、濃度が２×１０^６／ｍＬになるように調整した。予熱した０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡでＳＫ－ＢＲ３（ＨＥＲ２^＋、ＢＣＭＡ^－）とＮＣＩ－Ｈ９２９（ＢＣＭＡ^＋、ＨＥＲ２^－）腫瘍細胞をそれぞれ消化し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞を収集して計数し、２μｇ／ｍＬの最終濃度を有するＡＦ４８８－抱合の抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３２８６３０）を含むＲＰＭＩ－１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、濃度を４×１０^５／ｍＬに調整した。ＲＰＭＩ－１６４０完全培地で各抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体を最終濃度１００ｎＭに希釈した後、１０個の勾配で６倍希釈した。ＲＰＭＩ－１６４０完全培地を利用して１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有するＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８１３９）と１μｇ／ｍＬの最終濃度を有するイオノマイシン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９９９５Ｓ）の混合試料溶液を調製し、陽性対照として使用した。ＲＰＭＩ－１６４０完全培地を利用して１０μｇ／ｍＬの最終濃度を有するＢＦＡ（ＢＤ、３４７６８８）と１０μｇ／ｍＬの最終濃度を有するＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭ（ＢＤ、５１－２０９２ＫＺ）の混合溶液を適量に調製して、サイトカインの細胞外への輸送を遮断することで、細胞におけるサイトカインの蓄積を測定した。

【0198】

実験群の各ウェルに５０μＬのＮＫ細胞、５０μＬのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭ／ＢＦＡ溶液、５０μＬの抗体試料またはＰＭＡ／イオノマイシン溶液、および５０μＬの腫瘍細胞懸濁液をそれぞれ加え、マルチチャンネルピペットにより順に均一に混合した後、２００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、さらに均一に混合した。細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて６ｈｒインキュベートした後、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、各ウェルに２００μＬのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ^ＴＭ Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ、５５４６５５）を加え、４℃で暗所で２０ｍｉｎ固定した。固定した後、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ、５５８０５０）で細胞を再懸濁し、４℃で暗所で４０ｍｉｎ染色してから、２００μＬ／ウェルのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ^ＴＭ緩衝液（ＢＤ、５１－２０９１ＫＺ）で細胞を２回洗浄した。１μｇ／ｍＬのＰＥ－抱合の抗ＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５０６５０７）、ＡＰＣ－抱合の抗ＣＤ５６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１７－０５６７－４１）およびＢＶ４２１－抱合の抗ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３００４３４）を含むＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ^ＴＭ緩衝液により、４℃で暗所で１ｈｒ染色し、洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）により機上検出し、ＣＤ３^－／ＣＤ５６^＋細胞に丸をつけて選定した後、ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａとＩＦＮ－γの発現状況を検出した。

【0199】

実験結果は、図６Ａ～図６Ｄと図７Ａ～図７Ｄに示す通りである。本発明の抗ＣＤ１６Ａ／ＨＥＲ２および抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体は、腫瘍特異的にＮＫ細胞のＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの発現レベルをアップレギュレートすることができ、対照である４ＬＳ２１／抗ＴＡＡ二重特異性抗体と比べて、ＮＫ細胞活性化能力が同等またはそれ以上であり、かつＡＤＣＣ増強型のＩｇＧ１抗体、例えば、マルゲツキシマブよりも優れている。

【0200】

実施例１１ 標的細胞を殺傷するＮＫ細胞に対する抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体の特異的媒介
本研究は、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体とＮＫ細胞および腫瘍細胞を共インキュベートし、反応系における乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）のレベルを検出することにより、抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体が腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の抗原特異的殺傷を媒介する能力を反映し、詳しい実験プロセスは以下の通りである。

【0201】

ヒトのＰＢＭＣ細胞（ＳａｉｌｙＢｉｏ、ＳＬＢ１９００８４）を蘇生させ、２時間静置して接着した後に接着細胞を捨て、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮＫ濃縮試薬キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９０５５）から提供された方法によりＮＫ細胞を濃縮し、最後に、ＲＰＭＩ－１６４０培地（５％のウシ胎児血清を含む）で細胞濃度が１×１０^６個の細胞／ｍＬになるように調整した。予熱した０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡでＳＫ－ＢＲ３（ＨＥＲ２^ｈｉｇｈ、ＢＣＭＡ^－）（すなわち、ＨＥＲ２高発現乳がん細胞株）、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＨＥＲ２^ｌｏｗ）（すなわち、ＨＥＲ２低発現乳がん細胞株）およびＮＣＩ－Ｈ９２９（ＨＥＲ２^－、ＢＣＭＡ^＋）腫瘍細胞をそれぞれ消化し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞を収集して計数し、ＲＰＭＩ－１６４０培地（５％のウシ胎児血清を含む）で細胞を再懸濁し、細胞濃度を２×１０^５／ｍＬに調整した。ＲＰＭＩ－１６４０培地（５％のウシ胎児血清を含む）で各抗ＣＤ１６Ａ／ＴＡＡ二重特異性抗体を最終濃度１００ｎＭにした後、１０個の勾配で６倍希釈した。プレートレイアウトによって細胞をプレートに播種し、実験群の各ウェルに５０μＬのＮＫ細胞懸濁液、５０μＬの抗体試料溶液、および５０μＬの腫瘍細胞懸濁液をそれぞれ加え、マルチチャンネルピペットにより順に均一に混合した後、２００ｇ×３ｍｉｎ遠心分離し、さらに均一に混合した。細胞培養プレートを５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて３７℃で６ｈｒインキュベートした後、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標） Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）から提供された検出方法により、各反応系におけるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の分泌量を検出した。

【0202】

上記試験において、実験結果は、図８Ａ～図８Ｃと図９Ａ～図９Ｂに示す通りである。抗ＣＤ１６Ａ単一ドメイン抗体と２つの腫瘍抗原（ＨＥＲ２とＢＣＭＡ）特異性抗体はそれぞれ二重特異性抗体として組み立てられた後、いずれも腫瘍特異的にＮＫ細胞を誘導して腫瘍を殺傷することができ、対照である４ＬＳ２１／抗ＴＡＡ二重特異性抗体およびＡＤＣＣ増強型のＩｇＧ１抗体マルゲツキシマブと比べて、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷を媒介する能力が同等またはそれ以上である。

【0203】

以上、本発明の例示的な実施形態について説明したが、当業者は、これらの開示が単に例示的なものであり、本発明の範囲内で種々の他の置換、適用と修正を行うことができると理解すべきである。したがって、本発明は、本明細書に挙げられた具体的な実施形態に限定されない。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】