特表 2024-503996 生体分子中のスクランブルジスルフィドを同定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-30

(54)【発明の名称】生体分子中のスクランブルジスルフィドを同定するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240123BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240123BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240123BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20240123BHJP

   C12N 9/64 20060101ALN20240123BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240123BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240123BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N27/62 X ZNA

G01N30/26 A

G01N30/34 E

G01N30/06 E

G01N30/72 C

G01N30/86 G

G01N33/68

C12Q1/37

G01N30/88 J

C12N9/50

C12N9/64 Z

C12P21/08

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023537251

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2023-06-19

(86)【国際出願番号】 US2021064116

(87)【国際公開番号】W WO2022133262

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/128,146

(32)【優先日】2020-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・クラインバーグ

(72)【発明者】

【氏名】ユェン・マオ

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4B063

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA02

2G041LA08

2G045BB11

2G045DA37

2G045FB06

4B063QA18

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QR48

4B063QR90

4B063QS36

4B063QX01

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA50

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA50

(57)【要約】

生体分子（例えば、抗体）中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定するための方法が開示される。一例では、方法は、非還元条件下で生体分子の消化を実行して、複数の生体分子断片を含む試料を提供することと、試料を分離カラムに接触させることと、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び小分子添加剤を含む第１の移動相勾配を分離カラムに適用することと、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡ及び小分子添加剤を含む第２の移動相勾配を分離カラムに適用することと、溶出された試料に対して部分還元手順を実行することと、部分還元された溶出試料成分を質量分析計に適用することと、部分還元された溶出試料成分に対して質量分析を実行して、生体分子中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定することと、を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体分子中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定するための方法であって、
非還元条件下で前記生体分子の消化を実行して、前記生体分子の複数の断片を含む試料を得ることと、
試料成分がカラム基質に結合することを可能にする条件下で、前記試料を分離カラムに接触させることと、
第１の移動相勾配であって、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び約１～２ｍＭの濃度の小分子添加剤を含む、第１の移動相勾配を前記分離カラムに適用することと、
第２の移動相勾配であって、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡ及び前記約１～２ｍＭの濃度の小分子添加剤を含む、第２の移動相勾配を前記分離カラムに適用することと、
溶出された試料成分を１０～１００μＭの濃度のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理することによって、部分還元手順を実行することと、
部分還元された溶出試料成分を質量分析計に適用することと、
前記部分還元された溶出試料成分に対して質量分析を実行して、前記生体分子中の前記１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定することと、を含む、方法。

【請求項2】

第１の移動相中の前記小分子添加剤が、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、又はＮ－メチルグリシンから選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記小分子添加剤が、グリシンである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

第２の移動相中の前記小分子添加剤が、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、又はＮ－メチルグリシンから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記小分子添加剤が、グリシンである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の移動相中のＴＦＡ濃度が、Ｈ_２Ｏ中約０．０５％～０．１％ＴＦＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の移動相中のＴＦＡ濃度が、８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．０５％ＴＦＡ、又は８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．１％ＴＦＡを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記部分還元手順が、５００ｍｓ～３ｓの持続時間にわたって行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記生体分子の前記消化を実行することが、
変性及びアルキル化工程を実行して、変性アルキル化生体分子を得ることと、
前記変性アルキル化生体分子に対して予備消化工程を実行して、予備消化された変性アルキル化生体分子を得ることと、
前記予備消化工程の後に、前記予備消化された変性アルキル化生体分子に対して消化工程を実行して、前記分離カラムに接触させる前記試料を得ることと、を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記変性及びアルキル化工程が、約５．５～５．９のｐＨでアルキル化剤の存在下で７～９Ｍ尿素中で前記生体分子を変性することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記変性及びアルキル化工程を４５～５５℃で実行することを更に含む、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記アルキル化剤が、５～１５ｍＭの濃度のＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）である、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

前記アルキル化剤が、約０．５～５ｍＭの濃度のヨード－アセトアミド（ＩＡＭ）である、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項14】

前記変性及びアルキル化工程を２０～４０分間実行することを更に含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記予備消化工程を実行することが、前記変性アルキル化生体分子を、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼの存在下、５～５．６のｐＨでインキュベートすることを更に含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記予備消化工程を３５～４０℃で実行することを更に含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記予備消化工程を３０分～９０分間実行することを更に含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼと前記変性アルキル化生体分子との比が、それぞれ１：５～１：２０である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記消化工程を実行することが、前記予備消化された変性アルキル化生体分子を、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼ及びトリプシンプロテアーゼの存在下、５～５．６のｐＨでインキュベートすることを更に含む、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記消化工程中の組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼと前記予備消化された変性アルキル化生体分子との比が、それぞれ約１：５～１：２０である、請求項９～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

トリプシンプロテアーゼと前記予備消化された変性アルキル化生体分子との比が、それぞれ１：２～１：１０である、請求項９～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記消化工程を３５～４０℃で実行することを更に含む、請求項９～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記消化工程を２～４時間実行することを更に含む、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記部分還元された溶出試料成分が、１つ以上のジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記１つ以上のジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドの各々が、同時に前記質量分析計に入る、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記質量分析計が、タンデム質量分析計であり、
前記質量分析を実行することが、ＭＳ１スペクトル及びＭＳ２スペクトルを取得することを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記対応する還元パートナーペプチドを用いて並行反応モニタリング（ＰＲＭ）包含リストを構築することを更に含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

信頼度スコアリングシステムに基づく前記１つ以上のジスルフィドペプチドに対してジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることを更に含む、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

前記信頼度スコアリングシステムが、
ジスルフィドペプチドのＭＳ１質量が、前記質量分析によって同定されているかどうかを表示することと、
前記ジスルフィドペプチドに対応する第１の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が、前記質量分析によって同定されているかどうかを表示することと、
前記ジスルフィドペプチドに対応する第２の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が、前記質量分析によって同定されているかどうかを表示することと、
前記第１の還元パートナーペプチドのＭＳ２質量が、所定の閾値よりも大きいスコアで同定されているかどうかを表示することと、
前記第２の還元パートナーペプチドのＭＳ２質量が、前記所定の閾値よりも大きいスコアで同定されているかどうかを表示することと、
前記信頼度スコアリングシステムの前記表示する工程の各々について、前記対応するペプチドが同定されている単一点を割り当て、前記対応するペプチドが同定されていない点を割り当てないことと、
前記単一点を合計することと、
前記合計することに基づいて前記ジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることであって、前記合計が大きいほど信頼性が高い、割り当てることと、を更に含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記質量分析を実行することが、
前記生体分子中の前記１つ以上の非天然ジスルフィド結合の各々について、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定することを更に含み、
前記ジスルフィドスクランブリングパーセンテージが、非天然ジスルフィド結合を含むペプチドの平均ピーク面積の、前記非天然ジスルフィド結合を含む前記ペプチドの前記平均ピーク面積＋前記非天然ジスルフィド結合に関与するシステイン残基に対応する天然ジスルフィド結合を含む２つのペプチドの別の平均ピーク面積の合計に対する比である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＴＣＥＰの濃度が、２０μＭ～８０μＭである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＴＣＥＰの濃度が、４０μＭである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記生体分子がモノクローナル抗体であり、
前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は混合アイソタイプのモノクローナル抗体である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記モノクローナル抗体が、組換え産生される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

生体分子中の１つ以上のスクランブルジスルフィド結合を同定する方法であって、
非還元条件下及び酸性ｐＨで前記生体分子の消化を実行して、１つ以上のジスルフィドペプチドを含む試料を得ることと、
前記試料を分離カラムに接触させて、前記試料の成分を分離することであって、前記成分の分離が１～２ｍＭの濃度のグリシンの存在下で実行される、分離することと、
前記分離カラムによる分離後に溶出された試料成分を部分還元することと、
部分還元された溶出試料成分に対して、タンデム質量分析計を介して質量分析を実行することであって、第１の質量分析器を介して、前記１つ以上のジスルフィドペプチド及び／又は対応する還元パートナーペプチドの各々のＭＳ１質量を同定すること、並びに前記対応する還元パートナーペプチドのみを標的とし、前記１つ以上のジスルフィドペプチドの各々を標的としないことによって、第２の質量分析器を介して、前記対応する還元パートナーペプチドのうちの１つ以上のＭＳ２質量のみを同定することを含む、実行することと、を含む、方法。

【請求項36】

前記対応する還元パートナーペプチドのみを標的とし、前記１つ以上のジスルフィドペプチドの各々を標的としないことが、
前記対応する還元パートナーペプチドのみを用いて、並行反応モニタリング包含リストを構築することを更に含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記１つ以上のジスルフィドペプチドの各々に対してジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることを更に含む、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることが、特定のジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドについて、同定可能な各ＭＳ１質量についての点及び所定の閾値検出レベルを超える各同定可能なＭＳ２質量についての点を割り当てることと、
前記点を合計して、前記ジスルフィド同定信頼度スコアを取得することと、を含むジスルフィド信頼度スコアリングシステムに基づいており、最大スコアが、最も高い信頼度スコアに対応する５である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記質量分析を実行することが、
前記生体分子中の前記１つ以上のスクランブルジスルフィド結合の各々について、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定することを更に含み、
前記ジスルフィドスクランブリングパーセンテージが、スクランブルジスルフィド結合を含むペプチドの平均ピーク面積の、前記スクランブルジスルフィド結合を含む前記ペプチドの前記平均ピーク面積と前記スクランブルジスルフィド結合に関与するシステイン残基に対応する天然ジスルフィド結合を含む２つのペプチドの別の平均ピーク面積との合計に対する比である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記分離カラムによる分離後に溶出された試料成分を部分還元することが、１０～１００μＭの濃度のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）による溶出された試料成分の処理によるものである、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＴＣＥＰの濃度が、２０～８０μＭである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ＴＣＥＰの濃度が、４０μＭである、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

溶出された試料成分を約１～３秒間にわたって部分還元することを更に含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項44】

溶出された試料成分を部分還元することが、約１～３％の還元効率で行われる、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記分離カラムが、逆相高速液体クロマトグラフィカラムである、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記分離カラムが親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）カラムである、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記分離カラム上での前記成分の分離が、０．０５～０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下及びＮＨ_４ＯＨの非存在下で実行される、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記酸性ｐＨが５～５．６である、請求項３５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記消化を実行することが、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼ及びトリプシンプロテアーゼの存在下で前記生体分子をインキュベートすることを含む、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記消化を実行する前に、５．５～５．９のｐＨで１つ以上のアルキル化剤の存在下で前記生体分子を変性させることを更に含む、請求項３５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記生体分子がモノクローナル抗体であり、前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は混合アイソタイプのモノクローナル抗体である、請求項３５～５０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照
本出願は、２０２１年１２月１７日に作成され、１２，４６６バイトを含むファイル１０８７０ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照することにより組み込む。

【0002】

本明細書の実施形態は、質量スペクトル分析に関し、より具体的には、生体分子中の低存在量のスクランブルジスルフィドを同定するために質量スペクトル分析を使用する能力を改善するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ジスルフィド結合は、真核生物プロテオーム中の多数のタンパク質（ほぼ３分の１）に存在する。ジスルフィド結合の形成は、２つのシステイン残基のスルフヒドリル（sulfhydryl、ＳＨ）側鎖間の反応を伴う。天然のジスルフィド結合形成は、タンパク質を安定化するように作用し、ジスルフィド結合は、有効なタンパク質機能性にとって重要である。

【0004】

治療用モノクローナル抗体は、細胞表面受容体又は他の生物学的標的上の特異的エピトープに結合することができ、そのような治療用抗体の有効性及び安定性は、天然ジスルフィド結合の適切な形成に依存する。あるいは、治療用モノクローナル抗体を含むがこれに限定されないタンパク質における非天然（例えば、スクランブル）ジスルフィド結合の形成は、不安定化、不適切な折り畳み、凝集体形成、及び特定のタンパク質が効果的に機能できないことをもたらし得る。したがって、タンパク質、例えば治療用抗体におけるスクランブルジスルフィドの存在の解明は重要である。タンパク質中のジスルフィドスクランブリングの存在を決定する現在の課題としては、存在量が少ないこと、したがって、質量スペクトル分析などの方法論に依存する場合にジスルフィドスクランブリングを検出することが困難であることが挙げられる。本明細書では、治療用モノクローナル抗体などの生体分子中の低存在量のスクランブルジスルフィドを同定するために質量スペクトル分析を使用する能力を改善するための方法が論じられる。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、本発明は、生体分子中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定するための方法を提供する。本方法は、非還元条件下で生体分子の消化を実行して、生体分子の複数の断片を含む試料を得ることと、試料成分がカラム基質に結合することを可能にする条件下で、試料を分離カラムに接触させることと、第１の移動相勾配であって、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び約１～２ｍＭの濃度の小分子添加剤を含む、第１の移動相勾配を分離カラムに適用することと、第２の移動相勾配であって、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡ及び約１～２ｍＭの濃度の小分子添加剤を含む、第２の移動相勾配を分離カラムに適用することと、溶出された試料成分を１０～１００μＭの濃度のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）で処理することによって、部分還元手順を実行することと、部分還元された溶出試料成分を質量分析計に適用することと、部分還元された溶出試料成分に対して質量分析を実行して、生体分子中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合を同定することと、を含む。

【0006】

一部の実施形態では、第１の移動相中の小分子添加剤は、グリシンである。

【0007】

一部の実施形態では、第１の移動相中の小分子添加剤はグリシンであり、グリシン濃度は約１ｍＭである。

【0008】

一部の実施形態では、第１の移動相中の小分子添加剤はグリシンであり、グリシン濃度は約２ｍＭである。

【0009】

一部の実施形態では、第２の移動相中の小分子添加剤はグリシンであり、グリシン濃度は約１ｍＭである。

【0010】

一部の実施形態では、第２の移動相中の小分子添加剤はグリシンであり、グリシン濃度は約２ｍＭである。

【0011】

一部の実施形態では、第１の移動相及び第２の移動相のうちの１つ以上中の小分子添加剤は、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、又はＮ－メチルグリシンから選択される。

【0012】

一部の実施形態では、第１の移動相中のＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中約０．０５％～０．１％ＴＦＡである。

【0013】

一部の実施形態では、第２の移動相中のＴＦＡ濃度は、８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．０５％ＴＦＡ、又は８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．１％ＴＦＡを含む。

【0014】

一部の実施形態では、生体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は混合アイソタイプのモノクローナル抗体である。

【0015】

一部の実施形態では、生体分子は組換え産生される。

【0016】

一部の実施形態では、部分還元手順は、５００ｍｓ～３ｓの持続時間にわたって行われる。

【0017】

一部の実施形態では、生体分子の消化を実行することは、変性及びアルキル化工程を実行して、変性アルキル化生体分子を得ることと、変性アルキル化生体分子に対して予備消化工程を実行して、予備消化された変性アルキル化生体分子を得ることと、予備消化工程の後に、予備消化された変性アルキル化生体分子に対して消化工程を実行して、分離カラムに接触させる試料を得ることと、を含む。

【0018】

一部の実施形態では、変性及びアルキル化工程は、約５．５～５．９のｐＨでアルキル化剤の存在下で７～９Ｍ尿素中で生体分子を変性することを含む。場合によっては、変性及びアルキル化工程は、４５～５５℃の温度で行われる。場合によっては、アルキル化剤は、５～１５ｍＭの濃度のＮ－エチルマレイミド（N-ethyl maleimide、ＮＥＭ）である。場合によっては、アルキル化剤は、約０．５～５ｍＭの濃度のヨード－アセトアミド（iodo-acetamide、ＩＡＭ）である。場合によっては、本方法は、変性及びアルキル化工程を２０～４０分間実行することを含む。

【0019】

一部の実施形態では、予備消化工程を実行することは、変性アルキル化生体分子を、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼの存在下、５～５．６のｐＨでインキュベートすることを含む。場合によっては、予備消化工程は、３５～４０℃の温度で実行される。場合によっては、予備消化工程は、３０分～９０分の持続時間にわたって実行される。場合によっては、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼと変性アルキル化生体分子との比は、それぞれ１：５～１：２０である。

【0020】

一部の実施形態では、消化工程を実行することは、予備消化された変性アルキル化生体分子を、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼ及びトリプシンプロテアーゼの存在下、５～５．６のｐＨでインキュベートすることを含む。場合によっては、消化工程中の組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼと予備消化された変性アルキル化生体分子との比は、それぞれ約１：５～１：２０である。場合によっては、トリプシンプロテアーゼと予備消化された変性アルキル化生体分子との比は、それぞれ約１：２～約１：１０である。場合によっては、消化工程は、３５～４０℃の温度で実行される。場合によっては、消化工程は、２～４時間実行される。

【0021】

一部の実施形態では、部分還元された溶出試料成分は、１つ以上のジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む。場合によっては、１つ以上のジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドの各々は、同時に質量分析計に入る。場合によっては、質量分析計は、タンデム質量分析計であり、質量分析を実行することは、ＭＳ１スペクトル及びＭＳ２スペクトルを取得することを含む。場合によっては、並行反応モニタリング（parallel reaction monitoring、ＰＲＭ）包含リストが、対応する還元パートナーペプチドを用いて構築される。場合によっては、ジスルフィド同定信頼度スコアが、信頼度スコアリングシステムに基づく１つ以上のジスルフィドペプチドに対して割り当てられる。

【0022】

一部の実施形態では、信頼度スコアリングシステムは、ジスルフィドペプチドのＭＳ１質量が、質量分析によって同定されているかどうかを表示する工程と、ジスルフィドペプチドに対応する第１の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が、質量分析によって同定されているかどうかを表示する工程と、ジスルフィドペプチドに対応する第２の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が、質量分析によって同定されているかどうかを表示する工程と、第１の還元パートナーペプチドのＭＳ２質量が、所定の閾値よりも大きいスコアで同定されているかどうかを表示する工程、及び／又は第２の還元パートナーペプチドのＭＳ２質量が、所定の閾値よりも大きいスコアで同定されているかどうかを表示する工程と、信頼度スコアリングシステムの表示する工程の各々について、対応するペプチドが同定されている単一点を割り当て、対応するペプチドが同定されていない点を割り当てない工程と、単一点を合計する工程と、合計することに基づいてジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることであって、合計が大きいほど信頼性が高い、割り当てる工程と、を含む。

【0023】

一部の実施形態では、質量分析を実行することは、生体分子中の１つ以上の非天然ジスルフィド結合の各々について、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定することを含む。例では、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージは、非天然ジスルフィド結合を含むペプチドの平均ピーク面積の、非天然ジスルフィド結合を含むペプチドの平均ピーク面積＋非天然ジスルフィド結合に関与するシステイン残基に対応する天然ジスルフィド結合を含む２つのペプチドの別の平均ピーク面積の合計に対する比である。

【0024】

一部の実施形態では、ＴＣＥＰの濃度は、２０μＭ～８０μＭである。

【0025】

一部の実施形態では、ＴＣＥＰの濃度は、約４０ｍＭである。

【0026】

様々な実施形態では、上記又は本明細書で考察される実施形態の特徴又は構成要素のうちのいずれも組み合わされ得、かかる組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記又は本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記又は本明細書で考察される別の関連する値と組み合わされて、それらの値が範囲の上限及び下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲及びかかる範囲内にある全ての値は本開示の範囲内に包含される。上記又は本明細書で考察される値のうちの各々は、１％、５％、１０％、又は２０％の変動で表され得る。例えば、１０ｍＭの濃度は、１０ｍＭ±０．１ｍＭ（１％変動）、１０ｍＭ±０．５ｍＭ（５％変動）、１０ｍＭ±１ｍＭ（１０％変動）、又は１０ｍＭ±２ｍＭとして表され得る（２０％変動）。他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

実施形態は、添付の図面及び添付の特許請求の範囲と併せて以下の詳細な説明によって容易に理解されるであろう。実施形態は、添付の図面の図において限定としてではなく例として示される。

【図1A】生体分子（例えば、治療用モノクローナル抗体）中の天然ジスルフィド結合及び非天然ジスルフィド結合の実例を示す。

【図1B】ジスルフィドスクランブリングが生体分子中でどのように起こるかの実例を示す。

【図2】液体クロマトグラフィ質量分析（liquid chromatography mass spectrometry、ＬＣ－ＭＳ）によって分析した、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）から形成されたジスルフィドについての全イオン電流（total ion current、ＴＩＣ）及び抽出イオンクロマトグラフ（extracted ion chromatograph、ＥＩＣ）、並びにＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）ではなくＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）に対応するペプチド断片を検出する能力を示すタンデム質量分析を示す。

【図3】様々な濃度のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理したトリプシン消化モノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）の例示的なＬＣ－ＭＳ分析を示す。５０μｌ／分（０．０２％ＴＦＡ及び０．０８％ＦＡ）の流速での高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）による分離後に、ジスルフィド結合を維持するために非還元条件下でｍＡｂをトリプシンで消化した。分離後、カラム溶出液を様々な濃度のＴＣＥＰ（０ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭ）及びＮＨ_４ＯＨ（最終濃度０．１２％）で処理した後、質量分析によって分析した。ＴＣＥＰ及びＮＨ_４ＯＨを、２μＬ／分の流速で混合Ｔ字管を使用して溶出液に添加した。データは、カウント対質量電荷比（ｍ／ｚ）として示される。様々なＴＣＥＰ濃度でのジスルフィド及び対応する還元ペプチド（Ｒ１及びＲ２）が示されている。

【図4】ＴＣＥＰ、ＮＨ_４ＯＨ及びグリシン濃度の関数としての、ｍＡｂ１に対応するペプチド断片ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３）のＭＳシグナルを示すグラフである。対照（ＴＣＥＰなし、ＮＨ_４ＯＨなし、グリシンなし）、試料１（２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ）、試料２（２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ、２ｍＭグリシン）、試料３（２ｍＭ ＴＣＥＰ、２ｍＭグリシン、ＮＨ_４ＯＨなし）、及び試料４（２ｍＭグリシンのみ）を含む５つの条件が示されている。対照と比較して、０．１２％ＮＨ_４ＯＨの存在下での２ｍＭ ＴＣＥＰは、ＭＳシグナルの減少を引き起こす（試料１）。２ｍＭ ＴＣＥＰ及び０．１２％ＮＨ_４ＯＨを含有する試料に２ｍＭグリシンを含めると、試料１の条件を上回るわずかな改善（試料２）が得られる。ＮＨ_４ＯＨの非存在下での２ｍＭ ＴＣＥＰ及び２ｍＭグリシン（試料３）は、同様に、試料１及び試料２の条件を上回るわずかな改善しかもたらさない。２ｍＭグリシンのみを含有する試料（試料４）は、ＴＣＥＰ及びグリシンを含有する試料と比較して、およそ１０倍のシグナル増強を示す。図４に示される試料の各々について、条件は、移動相中に０．０５％ＴＦＡを有する０．１μｇのローディング量のｍＡｂ１を含んだ。

【図5A】ＴＣＥＰ濃度の関数としてのｍＡｂ１に対応する２つのペプチド断片ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３）（図５Ａ）及びＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号４）（図５Ｂ）のＭＳシグナルを示す。試料条件は、０．１μｇのローディング量のｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシンを含み、様々な濃度のＴＣＥＰ（０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ及び２０００μＭ）で処理した。図示されるように、ＭＳシグナルは、ＴＣＥＰの濃度の増加と共に減少する。

【図5B】ＴＣＥＰ濃度の関数としてのｍＡｂ１に対応する２つのペプチド断片ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３）（図５Ａ）及びＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号４）（図５Ｂ）のＭＳシグナルを示す。試料条件は、０．１μｇのローディング量のｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシンを含み、様々な濃度のＴＣＥＰ（０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ及び２０００μＭ）で処理した。図示されるように、ＭＳシグナルは、ＴＣＥＰの濃度の増加と共に減少する。

【図6A】様々な濃度のＴＣＥＰの存在下でｍＡｂ１のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図６Ａは、ペプチドＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号５）及びＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号６）に対応するジスルフィドについてのＭＳシグナルを示し、図６Ｂは、対応する個々の還元ペプチドについてのＭＳシグナルを示す。試料条件は、１μｇのローディング量のｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシンを含み、示されたＴＣＥＰ濃度で処理した。

【図6B】様々な濃度のＴＣＥＰの存在下でｍＡｂ１のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図６Ａは、ペプチドＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号５）及びＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号６）に対応するジスルフィドについてのＭＳシグナルを示し、図６Ｂは、対応する個々の還元ペプチドについてのＭＳシグナルを示す。試料条件は、１μｇのローディング量のｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシンを含み、示されたＴＣＥＰ濃度で処理した。

【図7A】ＴＣＥＰによる還元を伴わないｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量（図７Ａ）、及び４０μＭ ＴＣＥＰによる部分還元後のｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量（図７Ｂ）を示す。図７Ａ～図７Ｂの各々について、還元ペプチドは、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応し、これらは非還元形態でジスルフィドペプチドを含む。ＨＰＬＣ溶出液を４０μＭ ＴＣＥＰと混合してジスルフィドの部分還元を誘導し、それと共に２ｍＭグリシンを添加して、グリシンを欠く試料と比較してＭＳシグナルを１０～２０倍増強した。溶出後の部分還元方法論は、ジスルフィドペプチドが、還元パートナーペプチドと同時に質量分析計に入ることをもたらす。

【図7B】ＴＣＥＰによる還元を伴わないｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量（図７Ａ）、及び４０μＭ ＴＣＥＰによる部分還元後のｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量（図７Ｂ）を示す。図７Ａ～図７Ｂの各々について、還元ペプチドは、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応し、これらは非還元形態でジスルフィドペプチドを含む。ＨＰＬＣ溶出液を４０μＭ ＴＣＥＰと混合してジスルフィドの部分還元を誘導し、それと共に２ｍＭグリシンを添加して、グリシンを欠く試料と比較してＭＳシグナルを１０～２０倍増強した。溶出後の部分還元方法論は、ジスルフィドペプチドが、還元パートナーペプチドと同時に質量分析計に入ることをもたらす。

【図8A】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8B】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8C】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8D】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8E】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8F】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図8G】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示し、移動相中の小分子添加剤（例えば、グリシン）及び／又はイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡ又はＦＡ）の関数としての、ジスルフィドペプチド及び還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する。図８Ｆ～８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態においてジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々についての試料条件は、以下の通りであった。５μｇの消化ｍＡｂ２及び４０μＭ ＴＣＥＰを含み、図８Ａはグリシンを含まない０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｂは２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含み、図８Ｃはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｄはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｅは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含み、図８Ｆはグリシンを含まない０．１％ＦＡを含み、図８Ｇは２ｍＭグリシン及び０．１％ＦＡを含む。

【図9A】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図９Ａ～図９Ｂには、非還元形態でジスルフィドペプチドを含む還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）が示されている。図９Ａ～図９Ｂの各々に示された状態は、以下を含む。４０μＭ ＴＣＥＰ、２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡ；２０００μＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．０５％ＴＦＡ；並びに２０００μＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．１％ＦＡ。図９Ｂは、図９Ａに示したものと同じデータを示すが、４０μＭ ＴＣＥＰ及び２ｍＭグリシンによるＭＳシグナルの改善を示すためにｙ軸をズームしている。図９Ａ～９Ｂの各々についてのｍＡｂ２ローディング量は５μｇであった。

【図9B】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図９Ａ～図９Ｂには、非還元形態でジスルフィドペプチドを含む還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）が示されている。図９Ａ～図９Ｂの各々に示された状態は、以下を含む。４０μＭ ＴＣＥＰ、２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡ；２０００μＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．０５％ＴＦＡ；並びに２０００μＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．１％ＦＡ。図９Ｂは、図９Ａに示したものと同じデータを示すが、４０μＭ ＴＣＥＰ及び２ｍＭグリシンによるＭＳシグナルの改善を示すためにｙ軸をズームしている。図９Ａ～９Ｂの各々についてのｍＡｂ２ローディング量は５μｇであった。

【図10A】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図１０Ａ～図１０Ｂには、還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）（Ｒ１と標識）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）（Ｒ２と標識）に対応するデータが示されており、これらは、示されるように非還元形態でジスルフィドペプチドを含む。図１０Ａは、ジスルフィド及び対応する還元パートナーペプチドの相対存在量を示す。図１０Ｂは、質量分析の第２ステージ（ＭＳ２）についてのｍ／ｚを示し、第１ステージ（ＭＳ１）からのイオンが選択的に断片化されて、ＭＳ２スペクトルを生成する。図１０Ａ～図１０Ｂについて、試料条件は、５μｇのローディング量のｍＡｂ２、４０μＭ ＴＣＥＰ、２ｍＭグリシン及び０．０５％のＴＦＡを含んだ。

【図10B】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルを示す。図１０Ａ～図１０Ｂには、還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）（Ｒ１と標識）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）（Ｒ２と標識）に対応するデータが示されており、これらは、示されるように非還元形態でジスルフィドペプチドを含む。図１０Ａは、ジスルフィド及び対応する還元パートナーペプチドの相対存在量を示す。図１０Ｂは、質量分析の第２ステージ（ＭＳ２）についてのｍ／ｚを示し、第１ステージ（ＭＳ１）からのイオンが選択的に断片化されて、ＭＳ２スペクトルを生成する。図１０Ａ～図１０Ｂについて、試料条件は、５μｇのローディング量のｍＡｂ２、４０μＭ ＴＣＥＰ、２ｍＭグリシン及び０．０５％のＴＦＡを含んだ。

【図10C】１６個の固有のシステイン残基を含有する例示的なｍＡｂを示す。

【図11】ジスルフィド並びに対応する還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ｍＡｂ２のトリプシン消化からペプチド断片を生成した。図１１に示されるデータは、ジスルフィドのＭＳ／ＭＳスペクトルが、対応する還元パートナーペプチドと比較してかなりの程度の複雑性を含むこと、及び４０μＭ ＴＣＥＰを用いたポストカラム部分還元を実行することが、任意の検出可能なスクランブルジスルフィドのより単純な特徴付けを可能にすることを示す。

【図12】ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたシステイン含有ペプチドを示す。参照のために、システイン残基番号、及びシステインがｍＡｂ２の重（Ｈ）鎖又は軽（Ｌ）鎖上に位置するかどうかの表示を示す。トリプシンペプチドは、以下を含む：ＬＳＣＡＧＳＧＦＴＦＲ（配列番号８）、ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号９）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）、ＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）、ＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＣＫ、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号３７）、ＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号１１）、ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲ（配列番号１２）、ＶＥＡＥＤＶＧＦＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫ（配列番号１３）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号１４）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１５）、及びＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１６）。

【図13】ヒンジ領域ペプチドＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号４６）を除いて、ｍＡｂ２からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合を示す。ヒンジ領域ペプチドは、そのようなペプチドが２つ以上のシステイン（例えば、２つ）を含有し、したがって２つ以上のジスルフィド結合を形成し、したがって、このペプチドのスクランブルバージョンが非常に大きく複雑であると予想されるため、除外される。本明細書に開示される標的化ＭＳ２アプローチを使用するタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して、スクランブルジスルフィド結合を同定した。５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２を分離し、４０μＭ ＴＣＥＰを使用して部分還元した。２ｍＭグリシンを使用して、ＭＳシグナルを増強した。各ジスルフィド結合は、決定における信頼度レベル（検出されず、低信頼度、中程度の信頼度、高信頼度、超高信頼度）に従ってコード化される。全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の７１．６％が高信頼度又は超高信頼度で同定され、全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の１７％が中程度の信頼度で同定され、全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の１１．３％が低信頼度で同定された。

【図14A】ｍＡｂ２についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含むペプチド断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ２のための標準操作手順（standard operating procedure、ＳＯＰ）（図１４Ａ）、ｍＡｂ３のためのＳＯＰ（図１４Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図１４Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。ｍＡｂ２のＳＯＰを使用して、図１３に示すデータを生成したことに留意されたい。

【図14B】ｍＡｂ２についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含むペプチド断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ２のための標準操作手順（standard operating procedure、ＳＯＰ）（図１４Ａ）、ｍＡｂ３のためのＳＯＰ（図１４Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図１４Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。ｍＡｂ２のＳＯＰを使用して、図１３に示すデータを生成したことに留意されたい。

【図14C】ｍＡｂ２についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含むペプチド断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ２のための標準操作手順（standard operating procedure、ＳＯＰ）（図１４Ａ）、ｍＡｂ３のためのＳＯＰ（図１４Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図１４Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。ｍＡｂ２のＳＯＰを使用して、図１３に示すデータを生成したことに留意されたい。

【図15A】トリプシン消化の前に遊離システイン残基を標識するために図１４に示される手順と共に使用されるアルキル化剤ヨード－アセトアミド（ＩＡＭ）及びＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を示す。

【図15B】トリプシン消化の前に遊離システイン残基を標識するために図１４に示される手順と共に使用されるアルキル化剤ヨード－アセトアミド（ＩＡＭ）及びＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を示す。

【図16】図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される消化手順の各々、具体的にはｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キットを用いてトリプシン消化ｍＡｂ２に対応するＵＶクロマトグラムのオーバーレイを示す。クロマトグラムを取得するために実行された試料は、２ｍＭグリシンの存在下で５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）を含んだ。

【図17A】図１６に示されるＵＶクロマトグラムのオーバーレイに対応する選択時間窓を示す。図１７Ａは、約１４分から３０分までの時間窓を示し、図１７Ｂは、約３４分から４９分までの時間窓を示す。

【図17B】図１６に示されるＵＶクロマトグラムのオーバーレイに対応する選択時間窓を示す。図１７Ａは、約１４分から３０分までの時間窓を示し、図１７Ｂは、約３４分から４９分までの時間窓を示す。

【図18】図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される３つの異なる消化手順の各々によって得られた、ｍＡｂ２に対応する様々な天然ジスルフィドについてのＭＳシグナルを表すグラフを示す。天然ジスルフィドとしては、Ｃ１５２Ｈ－Ｃ２０８Ｈ、Ｃ１３９Ｈ－Ｃ２１９Ｌ、Ｃ１３９Ｈ－Ｃ２１９Ｌ（欠損、誤切断を指す）、Ｃ２２Ｈ－Ｃ９６Ｈ、Ｃ３７２Ｈ－Ｃ４３０Ｈ、Ｃ２６６Ｈ－Ｃ３２６Ｈ、Ｃ１３９Ｌ－Ｃ１９９Ｌ、Ｃ２３Ｌ－Ｃ９３Ｌ、Ｃ２３１Ｈ－Ｃ２３１Ｈ及びＣ２３４Ｈ３－Ｃ２３４Ｈが挙げられる。各ジスルフィドについて、条件は、左から右にｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キット手順を含む。ＭＳシグナルとして示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図１８のデータを生成するために実行された試料は、２ｍＭグリシンの存在下で５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）を含む。

【図19A】ｍＡｂ２消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成され、図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される。図１９ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図１９ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図１９ＣはＣＨ２ドメインを示し、図１９ＤはＣＨ３ドメインを示す。図１９Ａ（上）はペプチドＤＹＡＭＴＷＶＲ（配列番号１７）を含み、（下）はペプチドＳＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲ（配列番号１８）を含む。図１９Ｂ（上）はペプチドＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫ（配列番号１９）を含み、（下）はペプチドＡＤＹＥＫ（配列番号２０）を含む。図１９Ｃ（上）はペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号３９）を含み、（下）はＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３８）を含む。図１９Ｄ（上）はペプチドＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号２１）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲ（配列番号２２）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図19B】ｍＡｂ２消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成され、図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される。図１９ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図１９ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図１９ＣはＣＨ２ドメインを示し、図１９ＤはＣＨ３ドメインを示す。図１９Ａ（上）はペプチドＤＹＡＭＴＷＶＲ（配列番号１７）を含み、（下）はペプチドＳＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲ（配列番号１８）を含む。図１９Ｂ（上）はペプチドＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫ（配列番号１９）を含み、（下）はペプチドＡＤＹＥＫ（配列番号２０）を含む。図１９Ｃ（上）はペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号３９）を含み、（下）はＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３８）を含む。図１９Ｄ（上）はペプチドＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号２１）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲ（配列番号２２）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図19C】ｍＡｂ２消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成され、図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される。図１９ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図１９ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図１９ＣはＣＨ２ドメインを示し、図１９ＤはＣＨ３ドメインを示す。図１９Ａ（上）はペプチドＤＹＡＭＴＷＶＲ（配列番号１７）を含み、（下）はペプチドＳＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲ（配列番号１８）を含む。図１９Ｂ（上）はペプチドＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫ（配列番号１９）を含み、（下）はペプチドＡＤＹＥＫ（配列番号２０）を含む。図１９Ｃ（上）はペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号３９）を含み、（下）はＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３８）を含む。図１９Ｄ（上）はペプチドＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号２１）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲ（配列番号２２）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図19D】ｍＡｂ２消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成され、図１４Ａ～図１４Ｃに例示的に示される。図１９ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図１９ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図１９ＣはＣＨ２ドメインを示し、図１９ＤはＣＨ３ドメインを示す。図１９Ａ（上）はペプチドＤＹＡＭＴＷＶＲ（配列番号１７）を含み、（下）はペプチドＳＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲ（配列番号１８）を含む。図１９Ｂ（上）はペプチドＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫ（配列番号１９）を含み、（下）はペプチドＡＤＹＥＫ（配列番号２０）を含む。図１９Ｃ（上）はペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号３９）を含み、（下）はＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３８）を含む。図１９Ｄ（上）はペプチドＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号２１）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲ（配列番号２２）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図20A】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ２消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ２について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図２０Ａ～図２０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図20B】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ２消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ２について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図２０Ａ～図２０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図20C】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ２消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ２について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図２０Ａ～図２０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図20D】図２０Ａ～図２０Ｃに要約された実験においてスクランブリングパーセンテージを決定するために使用される、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定するための式を示す。

【図20E】上の図２０Ａの表に含まれるＣ２０８Ｈ－Ｃ９３Ｌジスルフィドペプチドに対応する干渉の代表例を示す。

【図21A】図２０Ａ～図２０Ｃに示される定量により決定された、高存在量スクランブルジスルフィドの相対存在量を示す。特に、図２１Ａは、対応する還元パートナーペプチドＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）のジスルフィドに対応するＣ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈを示す。図２１Ｂは、対応する還元パートナーペプチドＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲ（配列番号１２）及びＬＳＣＡＧＳＧＦＴＦＲ（配列番号８）のジスルフィドに対応するＣ２３Ｌ－Ｃ２２Ｈを示す。図２１Ａ～図２１Ｂの各々について、相対存在量を消化プロトコル（ｍＡｂ２プロトコル、ｍＡｂ３プロトコル、又は低ｐＨ消化プロトコル）の関数として示す。図２１Ａ～図２１Ｂの両方に示すように、ｍＡｂ２プロトコル及びｍＡｂ３プロトコルを用いて消化を実行した場合、クロマトグラフは、高存在量ジスルフィドを容易に区別するが、スクランブルジスルフィドのクロマトグラフは、低ｐＨ消化条件ではベースラインノイズから区別できない。各条件について、試料は、５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図21B】図２０Ａ～図２０Ｃに示される定量により決定された、高存在量スクランブルジスルフィドの相対存在量を示す。特に、図２１Ａは、対応する還元パートナーペプチドＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）のジスルフィドに対応するＣ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈを示す。図２１Ｂは、対応する還元パートナーペプチドＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲ（配列番号１２）及びＬＳＣＡＧＳＧＦＴＦＲ（配列番号８）のジスルフィドに対応するＣ２３Ｌ－Ｃ２２Ｈを示す。図２１Ａ～図２１Ｂの各々について、相対存在量を消化プロトコル（ｍＡｂ２プロトコル、ｍＡｂ３プロトコル、又は低ｐＨ消化プロトコル）の関数として示す。図２１Ａ～図２１Ｂの両方に示すように、ｍＡｂ２プロトコル及びｍＡｂ３プロトコルを用いて消化を実行した場合、クロマトグラフは、高存在量ジスルフィドを容易に区別するが、スクランブルジスルフィドのクロマトグラフは、低ｐＨ消化条件ではベースラインノイズから区別できない。各条件について、試料は、５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図22】図１４で上述した３つの異なる方法、すなわち、ｍＡｂ２ ＳＯＰ、ｍＡｂ３ ＳＯＰ及び低ｐＨ消化キット手順の各々を介して消化された高存在量スクランブルジスルフィド（Ｃ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈ）のＵＶオーバーレイを示す。ＵＶクロマトグラムオーバーレイは、還元パートナーペプチドＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）に対応するＣ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈジスルフィドが、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３消化プロトコルによって生成されるが、低ｐＨ消化プロトコルによっては生成されないことを示す。３つ全ての消化手順についての試料条件は、５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図23A】ｍＡｂ ５についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ４プロトコル（図２３Ａ）、ｍＡｂ５プロトコル（図２３Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図２３Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。

【図23B】ｍＡｂ ５についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ４プロトコル（図２３Ａ）、ｍＡｂ５プロトコル（図２３Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図２３Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。

【図23C】ｍＡｂ ５についてのジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む断片を生成するために使用される様々なトリプシン消化プロトコルを示す。ｍＡｂ４プロトコル（図２３Ａ）、ｍＡｂ５プロトコル（図２３Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図２３Ｃ）を含む３つの異なるプロトコルが示されている。

【図24】図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示される消化手順の各々、具体的にはｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル及び低ｐＨ消化キットを使用した、トリプシン消化ｍＡｂ５に対応するＵＶクロマトグラムのオーバーレイを示す。クロマトグラムを取得するために実行された試料は、２ｍＭグリシンの存在下で５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ５（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）を含んだ。

【図25A】図２４に示されるＵＶクロマトグラムのオーバーレイに対応する選択時間窓を示す。図２５Ａは、約１５分から３３分までの時間窓を示し、図２５Ｂは、約３５分から６７分までの時間窓を示す。

【図25B】図２４に示されるＵＶクロマトグラムのオーバーレイに対応する選択時間窓を示す。図２５Ａは、約１５分から３３分までの時間窓を示し、図２５Ｂは、約３５分から６７分までの時間窓を示す。

【図26】図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示される３つの異なる消化手順の各々によって得られた、ｍＡｂ５に対応する様々な天然ジスルフィドについてのＭＳシグナルを表すグラフを示す。天然ジスルフィドとしては、Ｃ２２Ｈ－Ｃ９６Ｈ、Ｃ１４５Ｈ－Ｃ２０１Ｈ、Ｃ２２１Ｈ－Ｃ２１３Ｌ、Ｃ２２１Ｈ－Ｃ２１３Ｌ（欠損、誤切断を指す）、Ｃ２２７Ｈ－Ｃ２２７Ｈ、Ｃ２３０Ｈ－Ｃ２３０Ｈ、Ｃ２６２Ｈ－Ｃ３２２Ｈ、Ｃ３６８Ｈ－Ｃ４２６Ｈ、Ｃ２３Ｌ－Ｃ８８Ｌ、及びＣ１３３Ｌ－Ｃ１９３Ｌが挙げられる。各ジスルフィドについて、条件は、左から右にｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル及び低ｐＨ消化キット手順を含む。ＭＳシグナルとして示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図２６のデータを生成するために実行された試料は、２ｍＭグリシンの存在下で５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ５（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）を含む。

【図27A】ｍＡｂ５消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示されるように、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成した。図２７ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図２７ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図２７ＣはＣＨ２ドメインを示し、図２７ＤはＣＨ３ドメインを示す。図２７Ａ（上）はペプチドＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ（配列番号２３）を含み、（下）はペプチドＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号２４）を含む。図２７Ｂ（上）はペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号２５）を含み、（下）はＡＤＹＥＫ（配列番号４０）を含む。図２７Ｃ（上）はペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号２６）を含み、（下）はＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号２７）を含む。図２７Ｄ（上）はペプチドＤＥＬＴＫ（配列番号２８）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２９）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図27B】ｍＡｂ５消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示されるように、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成した。図２７ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図２７ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図２７ＣはＣＨ２ドメインを示し、図２７ＤはＣＨ３ドメインを示す。図２７Ａ（上）はペプチドＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ（配列番号２３）を含み、（下）はペプチドＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号２４）を含む。図２７Ｂ（上）はペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号２５）を含み、（下）はＡＤＹＥＫ（配列番号４０）を含む。図２７Ｃ（上）はペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号２６）を含み、（下）はＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号２７）を含む。図２７Ｄ（上）はペプチドＤＥＬＴＫ（配列番号２８）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２９）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図27C】ｍＡｂ５消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示されるように、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成した。図２７ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図２７ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図２７ＣはＣＨ２ドメインを示し、図２７ＤはＣＨ３ドメインを示す。図２７Ａ（上）はペプチドＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ（配列番号２３）を含み、（下）はペプチドＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号２４）を含む。図２７Ｂ（上）はペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号２５）を含み、（下）はＡＤＹＥＫ（配列番号４０）を含む。図２７Ｃ（上）はペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号２６）を含み、（下）はＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号２７）を含む。図２７Ｄ（上）はペプチドＤＥＬＴＫ（配列番号２８）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２９）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図27D】ｍＡｂ５消化物の様々なｍＡｂドメイン（例えば、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３）からのペプチドのピーク面積を示す。各ドメインについて、示されるペプチドは、図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示されるように、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル、又は低ｐＨ消化キットを用いて生成した。図２７ＡはＶＨ／ＶＬドメインを示し、図２７ＢはＣＨ１／ＣＬドメインを示し、図２７ＣはＣＨ２ドメインを示し、図２７ＤはＣＨ３ドメインを示す。図２７Ａ（上）はペプチドＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ（配列番号２３）を含み、（下）はペプチドＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号２４）を含む。図２７Ｂ（上）はペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号２５）を含み、（下）はＡＤＹＥＫ（配列番号４０）を含む。図２７Ｃ（上）はペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号２６）を含み、（下）はＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号２７）を含む。図２７Ｄ（上）はペプチドＤＥＬＴＫ（配列番号２８）を含み、（下）はペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２９）を含む。示される各ペプチド及び対応する消化プロトコルについて、試料条件は、５μｇの消化ｍＡｂ２及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図28】ｍＡｂ５のトリプシン消化から生成されたシステイン含有ペプチドを示す。参照のために、システイン残基番号、及びシステインがｍＡｂ５の重（Ｈ）鎖又は軽（Ｌ）鎖上に位置するかどうかの表示を示す。トリプシンペプチドは、以下を含む：ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＳＳＳＹＡＭＮＷＶＲ（配列番号３０）、ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号４１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号３１）、ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号３２）、ＳＣＤＫ（配列番号３３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号３４）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号４２）、ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号４３）、ＶＴＩＴＣＲ（配列番号３５）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＬＴＦＧＱＧＴＲ（配列番号３６）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号４４）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号４５）、及びＧＥＣ／ＳＦＮＲＧＥＣ。システインＣ２１３Ｌ（ＧＥＣ／ＳＦＮＲＧＥＣ）に関しては、ＧＥＣ予想／予測されたトリプシンペプチドであるが、ＳＦＮＲＧＥＣは、非常に一般的で豊富なトリプシン欠損切断を含む。特定のジスルフィド結合を扱う場合、ＧＥＣペプチド及びＳＦＮＲＧＥＣペプチドの両方が同じシステイン残基を含有するので、一方の形態の存在が他方の形態の存在を確認する。したがって、Ｃ２１３Ｌ残基は、ここではＧＥＣ／ＳＦＮＲＧＥＣとして表され、ＳＦＮＲＧＥＣは配列番号１６に対応する。

【図29】ヒンジ領域ペプチドＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号４７）を除いて、ｍＡｂ５からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合を示す。本明細書で考察される標的化ＭＳ２アプローチを使用するタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して、スクランブルジスルフィド結合を同定した。５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ５を分離し、４０μＭ ＴＣＥＰを使用して部分還元した。２ｍＭグリシンを使用して、ＭＳシグナルを増強した。消化手順は、ｍＡｂ４プロトコルを含んだ（図２３Ａ参照）。各ジスルフィド結合は、決定における信頼度レベル（検出されず、低信頼度、中程度の信頼度、高信頼度、超高信頼度）に従ってコード化される。全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の６３．３％が高信頼度又は超高信頼度で同定され、全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の２０％が中程度の信頼度で同定され、全ての可能なスクランブルジスルフィド結合の１６．７％が低信頼度で同定された。

【図30A】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ５消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ５について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図３０Ａ～図３０Ｃに要約された実験においてスクランブリングパーセンテージを決定するために使用された、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定するための式は、図２０Ｄに示される式である。図３０Ａ～図３０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇ消化ｍＡｂ５及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図30B】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ５消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ５について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図３０Ａ～図３０Ｃに要約された実験においてスクランブリングパーセンテージを決定するために使用された、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定するための式は、図２０Ｄに示される式である。図３０Ａ～図３０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇ消化ｍＡｂ５及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図30C】様々な消化プロトコルの関数として、ｍＡｂ５消化物についてのジスルフィドスクランブリングパーセンテージを示す表を示す。具体的には、ｍＡｂ４プロトコル、ｍＡｂ５プロトコル及び低ｐＨ消化キットをｍＡｂ５について個別に試験して、ジスルフィドスクランブリングの割合が消化プロトコルに依存するかどうかを決定した。全ての可能なジスルフィドと、使用した消化プロトコルに依存する、対応するスクランブルパーセンテージとを示す。示されるデータは、全ての主要な荷電状態の全ての同位体ピークを含む。図３０Ａ～図３０Ｃに要約された実験においてスクランブリングパーセンテージを決定するために使用された、ジスルフィドスクランブリングパーセンテージを決定するための式は、図２０Ｄに示される式である。図３０Ａ～図３０Ｃに示される各消化プロトコルについて、試料条件は５μｇ消化ｍＡｂ５及び２ｍＭグリシンを含んだ。

【図31】ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号３１）の二量体ジスルフィドに対応する一連のｍ／ｚ決定を示す。上のクロマトグラフはジスルフィドのみについてのｍ／ｚを示し、真ん中のクロマトグラフはジスルフィドペプチドに対応する完全に還元されたペプチドのみについてのｍ／ｚを示し、下のクロマトグラフはジスルフィドペプチドに対応する部分的に還元されたペプチドについてのｍ／ｚを示す。合わせて、データは、部分還元された試料における変化した同位体ピークパターンを示す。同位体ピークは、より高いＭＳ１分解能で収集されたデータ（ＴＣＥＰなし、したがって「ジスルフィドのみ」）に起因して、上部クロマトグラフにおいてよりシャープである。標的化ＭＳ２方法論を使用して、各還元ペプチドピークの頂点付近のシグナルを増加させるために収集されるＭＳ２スキャンの数を最大化するために、ポストカラムＴＣＥＰ還元を実行する場合、ＭＳ１分解能は減少した。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明が記載される前に、記載される特定の方法及び実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法及び条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するようには意図されていないことも、理解されたい。いずれの実施形態又は実施形態の特徴も、互いに組み合わせることができ、かかる組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成し、実施され得る例示的な実施形態として示される添付の図面を参照する。範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、構造的又は論理的変更が行われてもよいことを理解されたい。

【0029】

様々な操作は、実施形態を理解するのに役立ち得るような様式で、複数の個別の操作として説明され得る。しかしながら、説明の順序は、これらの動作が順序に依存することを意味するものと解釈されるべきではない。

【0030】

説明は、上／下、後／前、及び上部／底部などの斜視図ベースの説明を使用し得る。そのような説明は、単に議論を容易にするために使用され、開示された実施形態の適用を制限することを意図しない。

【0031】

「結合された」及び「接続された」という用語は、それらの派生語と共に使用され得る。これらの用語は、互いに同義語として意図されていないことを理解されたい。むしろ、特定の実施形態では、「接続された」は、２つ以上の要素が互いに、物理的又は電気的に直接接触していることを示すために使用され得る。「結合された」は、２つ以上の要素が、物理的又は電気的に直接接触していることを意味し得る。しかしながら、「結合された」はまた、２つ以上の要素が互いに直接接触していないが、依然として協同するか、又は互いに相互作用することを意味し得る。

【0032】

説明のために、「Ａ／Ｂ」という形式又は「Ａ及び／又はＢ」という形式の句は、（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ａ及びＢ）を意味する。説明のために、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」という形式の句は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ａ及びＢ）、（Ａ及びＣ）、（Ｂ及びＣ）、又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味する。説明のために、「（Ａ）Ｂ」という形式の句は、（Ｂ）又は（ＡＢ）を意味し、すなわち、Ａは任意選択的な要素である。

【0033】

説明は、「実施形態（embodiment）」又は「実施形態（embodiments）」という用語を使用することがあり、これらは各々、同じ又は異なる実施形態のうちの１つ以上を指すことがある。更に、実施形態に関して使用される場合、用語「備える（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」などは同義であり、一般に「オープン」用語として意図される（例えば、用語「含む（including）」は「含むがこれに限定されない（including but not limited to）」と解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は「少なくとも有する（having at least）」と解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は「含むがこれに限定されない（includes but is not limited to）」と解釈されるべきであるなど）。

【0034】

本明細書における任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形／複数形の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載され得る。

【0035】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１並びにそれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

【0036】

本明細書に記載されるものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料をこれから説明する。本明細書において言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0037】

本明細書で使用される略語
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＡＵ：吸光度単位
ＣＨ：定常重
ＣＬ：定常軽
Ｃｙｓ：システイン
ＤＤＡ：データ依存的取得
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
Ｅ／Ｓ：酵素／基質
ＦＡ：ギ酸
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィ
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィ
ＩＡＭ：ヨード－アセトアミド
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：液体クロマトグラフィ
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィ－質量分析
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＰＡ：移動相Ａ
ＭＰＢ：移動相Ｂ
ＭＳ：質量分析
ＭＳ／ＭＳ：タンデム質量分析
ＭＳ１：タンデム質量分析計の第１の質量分析計
ＭＳ２：タンデム質量分析計の第２の質量分析計
ＭＷ：分子量
ＮＥＭ：Ｎ－エチルマレイミド
ＰＲＭ：並行反応モニタリング
ＲＰＬＣ：逆相液体クロマトグラフィ
ＲＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィタンデム質量分析
ＴＣＥＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＣ：総イオン電流
ＵＶ：紫外線
ＶＨ：可変重
ＶＬ：可変軽

【0038】

定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）又はその抗原結合断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ、heavy chain variable region」又は「Ｖ_Ｈ」）及び重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、及びＣ_Ｈ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。場合によっては、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態では、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１又はＩｇＧ４であり、任意選択的に、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２又はＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ、light chain variable region又は「Ｖ_Ｌ」）及び軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と称される超可変領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ又はサブクラスの、グリコシル化免疫グロブリン及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体分子を含む。抗体構造に関する概説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；及びＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。

【0039】

抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む「二重特異性抗体」を包含する。単一の重鎖及び単一の軽鎖及び６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原又はエピトープに結合し、抗体の他の半分は、異なる抗原又はエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープ又は非重複エピトープに結合することができる。場合によっては、二重特異性抗体の両方の半分は、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、概して、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に記載されている。

【0040】

抗体（又は「抗体断片」）の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）、（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、（ｖ）ｄＡｂ断片（ＶＨドメインからなる、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、並びに（ｖｉｉ）ｓｃＦｖ（単一のタンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって連結され、ＶＬ領域及びＶＨ領域の対が一価の分子を形成する、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）からなる）が挙げられる。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体もまた、「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｔ．（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｔ．（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３を参照されたい）。

【0041】

更に、抗体及びその抗原結合断片は、当該技術分野で一般的に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法はまた、当該技術分野で知られている。例えば、モノクローナル抗体を生成するためにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）又は任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を生成するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。

【0042】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは企図されない。この用語は、非ヒト哺乳類において、又は非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、又はヒト対象において産生された抗体を含むことを意図するものではない。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ジスルフィド」という用語は、２つのチオール基に由来する共有結合を指すことが意図される。タンパク質、例えばモノクローナル抗体では、これらは２つのシステインアミノ酸のチオール基間から結合する。ジスルフィド結合は、タンパク質球状構造を安定化させ、タンパク質をそれぞれの立体構造に保持することに寄与し、したがって、タンパク質の折り畳み及び安定性において重要な役割を有する。本明細書において考察されるように、ジスルフィド又はジスルフィドペプチドは、各対応するペプチド上のシステイン残基を介して共有結合された２つのペプチドを包含し、還元形態の２つのペプチドの各々は、「還元パートナーペプチド」と呼ばれる。このようなジスルフィドペプチドは、ジスルフィド結合が無傷のままである非還元条件下でのプロテアーゼ消化（例えば、トリプシンプロテアーゼ消化及び／又は組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼ消化）により生成され得る。次いで、このようなジスルフィドペプチドは、還元剤（例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰなど）を用いて、それらの対応する還元パートナーペプチドに還元され得る。本明細書で使用される場合、「スクランブルジスルフィド」又は「ジスルフィドスクランブリング」という用語は、モノクローナル抗体などの特定の生体分子に対して非天然であるジスルフィド結合を包含する。

【0044】

用語「親水性相互作用クロマトグラフィ」又はＨＩＬＩＣは、親水性化合物が疎水性化合物より長く保持される、親水性固定相及び疎水性有機移動相を使用するプロセスを含むことが意図される。特定の実施形態では、本方法は、水混和性溶媒移動相を利用する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、少なくとも分析物分子（例えば、モノクローナル抗体から得られるようなジスルフィドペプチド及び／又は対応する還元パートナーペプチド）を含む分子の混合物を含み、これは、例えば、分離、分析、抽出、又は濃縮を含む、本発明の方法に従って操作される。

【0046】

「分析」又は「分析する」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、目的の分子（例えば、モノクローナル抗体、ジスルフィドペプチド及び／又は対応する還元パートナーペプチドを含むがこれらに限定されない生体分子）を分離する、検出する、単離する、精製する、可溶化する、及び／又は特徴付ける様々な方法のいずれかを指す。例としては、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、質量分析（例えば、ＥＳＩ－ＭＳ、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、又はＭＡＬＤＩ－ＭＳ、液体クロマトグラフィ、例えば、高性能、例えば、逆相、順相、若しくはサイズ排除、イオン対液体クロマトグラフィ、液体－液体抽出、例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレー抽出、沈殿、清澄、電気化学的検出、染色、元素分析、Ｅｄｍｕｎｄ分解、核磁気共鳴、赤外線分析、フローインジェクション分析、キャピラリー電気クロマトグラフィ、紫外線検出、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

「エレクトロスプレーイオン化質量分析」又は「ＥＳＩ－ＭＳ」は、エアロゾルを生成するために高電圧が液体に印加されるエレクトロスプレーを使用してイオンを生成するために質量分析において使用される技法である。例えば、エレクトロスプレーでは、溶液中のタンパク質／ペプチドからイオンが生成され、これにより、脆弱な分子を無傷でイオン化することができ、非共有結合相互作用を保存することができる。エレクトロスプレーイオン化は、液体クロマトグラフィを質量分析（ＬＣ－ＭＳ）と組み合わせるために選択されるイオン源である。分析は、ＬＣカラムから溶出する液体をエレクトロスプレーに直接供給することによってオンラインで、又は古典的なナノエレクトロスプレー質量分析装置で後に分析される画分を収集することによってオフラインで実行することができる。ＬＣ－ＭＳは、バイオマーカーの定量、配列変異体の分析、並びにジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドの同定及び定量を含む、タンパク質の特徴付けのために使用することができる。

【0048】

「タンデム質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」又は「ＭＳ^２」は、タンパク質及びペプチドなどの生体分子の分析に使用される技法である。タンデム質量分析では、第１の質量分析器（ＭＳ１）は、イオン源を介して供給されるイオンから、１つの特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）（又は質量電荷比の範囲）のイオン（例えば、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩなどを介してイオン化される試料）を選択する。イオンは断片化され、第２の質量分析器（ＭＳ２）が断片イオンの質量スペクトルを記録する。タンデム質量分析は、選択、断片化及び検出の３つの異なる工程を含む。これらの工程の分離は、空間的又は時間的に実現することができる。空間機器における典型的なタンデム質量分析には、ＱｑＱ（三連四重極）、ＱＴＯＦ（四重極飛行時間型）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ（フーリエ変換質量分析）などが含まれる。時間的タンデムＭＳ／ＭＳ機器には、イオントラップ及びＦＴ－ＩＣＲ ＭＳ（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析）が含まれる。断片化の工程は、一般に、衝突活性化（collisional activation、ＣＡ）又は衝突誘起解離（collision-induced dissociation、ＣＩＤ）と呼ばれるプロセスにおいて、選択されたイオンを中性ガスと衝突させることによって行われる。

【0049】

本明細書で論じられる「部分還元された」又は「部分還元」は、試料（例えば、生体分子又は生体分子の断片）を、試料内に存在するジスルフィド結合の一部をそれらの対応する還元対応物に還元するような濃度及び／又は時間で還元剤で処理することを包含するが、試料中に存在するジスルフィドの全てが還元されるわけではない。

【0050】

本明細書で論じられる「並行反応モニタリング」又は「ＰＲＭ」は、同じ実験において複数のタンパク質／ペプチドを定量するために使用される標的化プロテオミクス技術を指す。ＰＲＭでは、選択された断片イオンのみではなく、全ての断片イオンが、選択された前駆体の断片化後に測定される。ＰＲＭは、典型的には、Ｏｒｂｉｔｒａｐ又は飛行時間型（Time of flight、ＴｏＦ）分析器上で実行される。ＰＲＭは、標的遷移（生成物イオン）が事前選択される必要がないため、アッセイ開発時間を短縮することができる。ＰＲＭは、ほとんどの干渉を排除し、検出及び定量の精度及びアトモルレベル限界を改善する。

【0051】

本明細書で論じられる「データ依存的取得」又は「ＤＤＡ」は、タンデム質量分析における取得モードを指す。ＤＤＡモードでは、質量分析計は、タンデム質量分析の第１段階において最も強いペプチドイオンを選択し、次いで、それらは、質量分析の第２段階において断片化され、分析される。

【0052】

一般的な説明
治療用抗体は、癌、感染症、及び他の状態などの疾患の治療においてますます使用されている。治療用抗体は、例えば、抗原（例えば、標的細胞上に存在する）に結合することによって機能しそれによって、疾患と戦う分子を誘引し、かつ／又は免疫系応答を介して細胞死を誘発し、かつ／又はそうでなければ感染及び／若しくは疾患をもたらすプロセス（例えば、細胞へのウイルス侵入又は受容体とリガンドとの相互作用）を遮断する。有効であるためには、治療用抗体は、安定であり、適切に折り畳まれている必要がある。不適切な折り畳み及び／又は安定性の低下は、このような分子の無効性に寄与し得る。不適切な折り畳み及び／又は安定性の低下の１つの理由には、治療用抗体開発のプロセスにおけるある時点で非天然（例えば、スクランブル）ジスルフィド結合が形成されることが含まれる。したがって、治療用抗体を含むがこれに限定されない治療用生体分子におけるスクランブルジスルフィド結合の決定を容易に可能にする方法が必要とされている。

【0053】

本明細書に開示されるのは、生体分子におけるスクランブルジスルフィド結合の質量分析に基づく特徴付けの新しい方法論である。開示される方法論は、モノクローナル抗体を含むがこれに限定されない生体分子中のスクランブルジスルフィド結合を確実に検出及び定量する能力を改善する。本明細書で論じられるように、驚くべきことに、液体クロマトグラフィ移動相溶液中に小分子添加剤（例えば、グリシン）を含めることによる質量スペクトルシグナルの改善は、液体クロマトグラフィ分離カラムから溶出された試料成分を部分還元するために使用される還元剤の濃度に特異的に依存することが見出された。また、驚くべきことに、質量スペクトルシグナルの改善及び生体分子のジスルフィドペプチド断片に対応する還元パートナーペプチドを検出するために質量スペクトル分析を使用する能力は、液体クロマトグラフィ分離の間に移動相に含まれるイオン対形成剤の選択に高度に依存することが見出された。更に、驚くべきことに、消化された試料成分が分離され、質量分析によって分析される前の生体分子消化条件が、特定の条件下で人工ジスルフィドスクランブリングを確実に誘導し得ること、及びこの人工ジスルフィドスクランブリングが、酸性ｐＨで消化手順を実行することによって回避され得ることが見出された。上記の発見は、本明細書に開示されるように、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して、生体分子中のスクランブルジスルフィド結合を高い信頼度で確実に検出及び定量する改善された能力を可能にする。したがって、開示される方法論は、ジスルフィドスクランブリングについて治療用生体分子（例えば、モノクローナル抗体）をスクリーニングする能力を可能にすることに関して、非常に広範囲の用途を有し、これは次に、そのような分子の使用に由来する治療薬の有効性を改善し得る。

【0054】

本明細書で論じられる、液体クロマトグラフィ法によるプロテアーゼ消化生体分子の分離は、使用される１つ以上の緩衝液の勾配を含むことができる。当該緩衝液のうちの１つ以上は、一部の例では、イオン対形成剤を含むことができ、イオン対形成剤としては、ギ酸塩、酢酸塩、ＴＦＡ、及び塩が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、イオン対形成剤はＴＦＡを含む。

【0055】

２つの緩衝液が使用される場合、第１の緩衝液の濃度は減少し得るが、第２の緩衝液の濃度又はパーセンテージは、クロマトグラフィ実行の過程にわたって増加する。例えば、第１の緩衝液のパーセンテージは、クロマトグラフィ実行の過程にわたって、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、又は約４０％から約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％まで減少し得る。別の例として、第２の緩衝液のパーセンテージは、同実行の過程にわたって、約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％から、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、又は約４０％まで増加し得る。任意選択的に、第１及び第２の緩衝液の濃度又はパーセンテージは、クロマトグラフィ実行の終了時にそれらの出発値に戻ることができる。一例として、第１の緩衝液のパーセンテージは、８５％から６３％へ、５９％へ、１０％へ、８５％への５段階で変化することができる。同工程における第２の緩衝液のパーセンテージは、１５％から３７％へ、４１％へ、９０％へ、１５％へと変化する。パーセンテージは、線形勾配として徐々に、又は非線形的（例えば、段階的）に変化することができる。例えば、勾配は、多相（例えば、二相、三相など）であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、イオン対形成剤を使用せずに移動相の極性の増加に対応するアセトニトリル緩衝液勾配の減少を使用する。

【0056】

一部の実施形態では、分離カラムに移動勾配を適用することは、第１の移動勾配緩衝液を分離カラムに適用することであって、第１の移動相緩衝液がＴＦＡ及び小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、第２の移動勾配緩衝液を分離カラムに適用することであって、第２の移動相緩衝液がＡＣＮ中のＴＦＡ及び小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、を含む。

【0057】

様々な実施形態では、小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、又はＮ－メチルグリシンから選択される。場合によっては、アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリン又はバリンから選択される。一部の実施形態では、アミノ酸は、アラニンである。一部の実施形態では、アミノ酸は、セリンである。一部の実施形態では、アミノ酸は、バリンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のアミノ酸は、グリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸は、グリシンである。一部の実施形態では、第１及び第２の移動相緩衝液中のアミノ酸は、グリシンである。一部の実施形態では、第１及び／又は第２の移動相緩衝液中の小分子添加剤（例えば、アミノ酸）は、小分子（例えば、修飾アミノ酸）又は上記若しくは本明細書中で同定される他のアミノ酸のうちの１つである。

【0058】

移動相緩衝液中の小分子添加剤（例えば、アミノ酸）の濃度は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．５ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ及び約２ｍＭであり、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３．０ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４．０ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭ、又は５．０ｍＭを含む。一部の実施形態では、小分子添加剤（例えば、アミノ酸）は、５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、小分子添加剤は、５ｍＭ未満の濃度のグリシンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度は約１～約２ｍＭグリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度は約１～約２ｍＭグリシンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度は約１～約２ｍＭグリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。一部の実施形態では、第１及び第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度は約１～約２ｍＭグリシンである。

【0059】

一部の実施形態では、第１の移動相中のＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中約０．０３％～０．１５％ＴＦＡ、例えば、約０．０３％～０．１％である。一部の実施形態では、ＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中約０．０５％～約０．１％ＴＦＡである。例えば、ＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中約０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、又は０．１％である。一部の実施形態では、第２の移動相中のＴＦＡ濃度は、８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．０５％ＴＦＡ、又は８０％ＡＣＮ及び２０％Ｈ_２Ｏ中約０．１％ＴＦＡを含む。一部の実施形態では、第２の移動相中のＡＣＮの濃度は、約６０％～１００％、例えば、８０％～１００％であり、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％を含む。

【0060】

一部の実施形態では、試料は、ペプチドを含む。一部の実施形態では、試料は、ジスルフィド結合連結を通じてシステイン残基を介して連結されたペプチドを含む。例えば、試料は、非還元条件下でのモノクローナル抗体又は他の生体分子のタンパク質分解消化によって得られるジスルフィドペプチドを含み得る。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は混合アイソタイプのモノクローナル抗体である。

【0061】

一部の実施形態では、本方法は、試料成分が基質に結合することを可能にする条件下で試料を分離カラムに接触させる前に試料を調製することを含む。一部の実施形態では、試料調製は、試料の変性及びアルキル化を可能にする条件下で試料を変性／アルキル化溶液と接触させることを含む。例では、変性剤は尿素である。試料変性（例えば、タンパク質変性）を引き起こすのに十分な尿素の濃度は、７～９Ｍ尿素、例えば、８Ｍ尿素であり得る。例では、変性／アルキル化溶液はアルキル化剤を含む。一例では、アルキル化剤はヨード－アセトアミド（ＩＡＭ）を含んでもよい。加えて、又は代わりに、アルキル化剤は、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含んでもよい。例では、変性／アルキル化溶液中のアルキル化剤は、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約８ｍＭの濃度である。一部の例では、変性／アルキル化溶液中のアルキル化剤はＮＥＭであり、濃度は約６ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば８ｍＭである。一部の例では、変性／アルキル化溶液中のアルキル化剤はＩＡＭであり、濃度は約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば約１ｍＭ、又は約２ｍＭ、又は約３ｍＭ、又は約４ｍＭ、又は約５ｍＭ、例えば２．４ｍＭである。一部の例では、変性／アルキル化溶液は、約１０分～約６０分、例えば、２０分、又は３０分、又は４０分、又は５０分の期間にわたって試料に接触させる。例では、変性／アルキル化溶液は、約４０℃～約６０℃、例えば、約５０℃の温度のものである。例では、変性／アルキル化溶液のｐＨは酸性である。例えば、ｐＨは、約５～約６．５、例えば約５．５～約６．０、例えば約５．７であってもよい。

【0062】

一部の例では、試料成分が基質に結合することを可能にする条件下で試料を分離カラムに接触させる前に試料を調製することは、試料を変性／アルキル化溶液と接触させた後に、試料を予備消化溶液と接触させることを含む。例では、予備消化溶液は、プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼを含む。例では、プロテアーゼは、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣである。例では、プロテアーゼは、組換えプロテアーゼ、例えば組換えエンドプロテイナーゼＬｙｓＣである。例では、予備消化溶液は、それぞれ約１：２～約１：２０、例えば約１：５～約１：１５、例えば約１：１０の酵素／基質比でプロテアーゼを含む。例では、予備消化溶液を試料に約３０分～２時間、例えば１時間接触させる。例では、予備消化溶液は、約３５～４０℃、例えば約３７℃の温度のものである。例では、予備消化溶液は、酸性ｐＨ、例えば約５～約６、例えば約５．２～５．５、例えば約５．３のｐＨのものである。

【0063】

一部の例では、試料成分が基質に結合することを可能にする条件下で試料を分離カラムに接触させる前に試料を調製することは、試料を変性／アルキル化溶液と接触させ、試料を予備消化溶液と接触させた後に、試料を消化溶液と接触させることを含む。例では、消化溶液は、第１のプロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼを含む。例では、第１のプロテアーゼは、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣである。例では、第１のプロテアーゼは、組換えプロテアーゼ、例えば組換えエンドプロテイナーゼＬｙｓＣである。例では、消化溶液は、それぞれ約１：２～約１：２０、例えば約１：５～約１：１５、例えば約１：１０の酵素／基質比で第１のプロテアーゼを含む。例では、消化溶液は、第２のプロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼを含む。例では、第２のプロテアーゼは、トリプシンである。例では、消化溶液は、それぞれ約１：２～約１：１０、例えば約１：５の酵素／基質比で第２のプロテアーゼを含む。例では、消化溶液を試料に約１時間～約４時間、例えば３時間接触させる。例では、消化溶液は、約３５～４０℃、例えば約３７℃の温度のものである。例では、消化溶液は酸性ｐＨ、例えば約５～約６、例えば約５．２～５．５、例えば約５．３のｐＨのものである。

【0064】

本明細書で論じるように、液体クロマトグラフィカラムから溶出された試料成分に対して、それらを分離した後に部分還元手順が実行される。部分還元手順の前、試料成分は、非還元消化生体分子（複数可）（例えば、モノクローナル抗体）を含むことが理解され得る。部分還元手順は、溶出された試料成分を還元剤で処理することを含む。例では、還元剤はＴＣＥＰである。例では、溶出された試料成分を部分還元するために使用される還元剤の濃度は、約２０μＭ～約１００μＭ、例えば約３０μＭ～約６０μＭ、例えば約４０μＭである。以下の実施例１及び少なくとも図６Ａ～図６Ｂで考察されるように、驚くべきことに、還元パートナーペプチドのＭＳシグナルは、特定の範囲のＴＣＥＰ濃度（約２０μＭ～約１００μＭ）に高度に依存し、減少したＭＳシグナルは、特定の範囲外の（例えば、より高い濃度及びより低い濃度の両方の）ＴＣＥＰ濃度に関連することが見出された。より高い濃度のＴＣＥＰ（例えば、４００μＭ～２ｍＭ以上）は、ジスルフィドペプチドに対応する還元パートナーペプチドの存在量の増加をもたらし、それによって、より高いＴＣＥＰ濃度で対応する還元パートナーペプチドについてのＭＳシグナルの増加をもたらすことが予想されたので、この知見は特に驚くべきものであった。したがって、より低いＴＣＥＰ濃度（例えば、２０～１００μＭ、例えば約４０μＭ）が、対応する還元パートナーペプチドを検出する能力を低下させるのではなく改善するという知見は、予想外であった。例では、部分還元手順は、溶出された試料成分をＮＨ_４ＯＨで更に処理することを含む。例では、ＮＨ_４ＯＨの最終パーセンテージは、約０．０５％～約０．２％、例えば、約０．１２％である。例では、部分還元手順は、約０．５秒～約５秒、例えば約１～３秒、例えば約２秒の持続時間の間、溶出された試料成分に対して実行される。例では、部分還元手順に対応する効率は、約１～３％である。

【0065】

一部の実施形態では、分離カラムは、液体クロマトグラフィ（liquid chromatography、ＬＣ）分離カラムである。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィを使用して、ジスルフィドペプチドを含むペプチドなどの構造を分離することができる。これらの構造を分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、高速陰イオン交換クロマトグラフィ、及び順相（normal phase、ＮＰ）クロマトグラフィ（ＮＰ－ＨＰＬＣを含む）を含む様々な形態の液体クロマトグラフィを使用することができる（例えば、Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ６７６：１９１－２０２（１９９４）を参照されたい）。親水性相互作用クロマトグラフィ（hydrophilic interaction chromatography、ＨＩＬＩＣ）は、部分的に水性の移動相を用いて実行することができるＮＰ－ＨＰＬＣの変形であり、ペプチド、ジスルフィドペプチド、炭水化物、核酸、及び多くのタンパク質の順相分離を可能にする。ＨＩＬＩＣの溶出順序は、最も極性が低いものから最も極性が高いものであり、逆相ＨＰＬＣにおけるものとは反対である。ＨＰＬＣは、例えば、Ｗａｔｅｒｓ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステム）、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＧｉｌｓｏｎなどからのＨＰＬＣシステム上で実行することができる。

【0066】

ＮＰ－ＨＰＬＣ、好ましくはＨＩＬＩＣは、一部の例では、本明細書に記載の方法において使用することができる。ＮＰ－ＨＰＬＣは、分析物と固定相（例えば、基質）との極性相互作用に基づいて分析物を分離する。極性分析物は、極性固定相と会合し、極性固定相によって保持される。吸着強度は、分析物極性の増加と共に増加し、極性分析物と極性固定相との相互作用（移動相に対する）は、溶出時間を増加させる。移動相におけるより極性の溶媒の使用は、分析物の保持時間を減少させるが、より疎水性の溶媒は、保持時間を増加させる傾向がある。

【0067】

シリカ、アミノ、アミド、セルロース、シクロデキストリン及びポリスチレン基質を含む様々なタイプの基質をＮＰ－ＨＰＬＣと共に、例えば、カラムクロマトグラフィのために使用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィにおいて使用することができる有用な基質の例としては、ポリスルホエチルアスパルタミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、スルホベタイン基質、例えば、ＺＩＣ（登録商標）－ＨＩＬＩＣ（例えば、ＳｅＱｕａｎｔ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ポリヒドロエチルアルパルトアミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＣＸ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ製）、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ（登録商標）（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、アミド－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ＴＳＫ ＧＥＬ（登録商標）アミド－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ポリヒドロキシエチルＡ（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｇｌｙｃｏ－Ｓｅｐ－Ｎ（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製）、及びＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ製）が挙げられる。一部の実施形態では、開示される方法は、以下の官能基：カルバモイル基、スルホプロピル基、スルホエチル基（例えば、ポリ（２－スルホエチルアスパルタミド））、ヒドロキシエチル基（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルタミド））及び芳香族スルホン酸基のうちの１つ以上を利用するカラムを含む。

【0068】

一部の実施形態では、逆相ＨＰＬＣを本明細書に記載の方法と共に使用することができる。逆相ＨＰＬＣは、分析物と固定相（例えば、基質）との非極性相互作用に基づいて分析物を分離する。非極性分析物は、非極性固定相と会合し、非極性固定相によって保持される。吸着強度は、分析物の非極性と共に増加し、非極性分析物と非極性固定相（移動相に対して）との相互作用は、溶出時間を増加させる。移動相におけるより非極性の溶媒の使用は、分析物の保持時間を減少させるが、より極性の溶媒は、保持時間を増加させる傾向がある。

【0069】

カラム温度は、例えば市販のカラムヒーターを使用して、クロマトグラフィ実行全体を通して一定温度に維持することができる。一部の実施形態では、カラムは、約１８℃～約７０℃の温度で維持され、例えば、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約５０℃、例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃である。一部の実施形態では、カラム温度は、約４０℃である。

【0070】

移動相の流速は、約０～約１００ｍＬ／分であり得る。分析目的では、流速は典型的には０～１０ｍＬ／分の範囲であり、分取ＨＰＬＣでは、１００ｍＬ／分を超える流速を使用することができる。例えば、流速は、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、又は約５ｍＬ／分（又は分取ＨＰＬＣについてはそれ以上）であり得る。同じ充填、同じ長さであるが、より小さい直径を有するカラムを置換することは、より広い直径のカラムで見られるのと同じ保持時間及びピークについての分解能を保持するために、流速の減少を必要とする。一部の実施形態では、４．６×１００ｍｍ、５μｍカラムにおいて約１ｍＬ／分に相当する流速が使用される。

【0071】

一部の実施形態では、実行時間は、約１５～約２４０分、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０～約８０分であり得る。

【0072】

例では、部分還元手順に続いて、部分還元された試料を質量分析によって分析する。例では、部分還元された試料は、ジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドを含む。例では、ジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドは、ほぼ同時に質量分析計に入る。

【0073】

例では、質量分析によって試料を分析することは、タンデム質量分析計構成への依存を介して、ＭＳ１スペクトル及びＭＳ２スペクトルを取得することを含む。例では、ＭＳ２スペクトルを取得することは、標的化ＭＳ２アプローチを伴う。そのような標的化ＭＳ２アプローチは、システイン残基を含有するジスルフィドペプチドに対応するプロテアーゼ消化（例えば、トリプシン消化）還元パートナーペプチドのみを標的とすることを含み得る。例では、システインを含有する対応する還元パートナーペプチドのみを標的とすることは、ジスルフィドペプチドがそれらの対応する還元パートナーペプチドと比較して指数関数的により多くの可能な断片化を有することに起因して、ジスルフィドペプチドを標的とする試みにおいてＭＳ／ＭＳが使用されるアプローチと比較して、任意のスクランブルジスルフィドの劇的により単純な特徴付けを可能にする。モノクローナル抗体を例として使用すると、このようなモノクローナル抗体は、特定の数のシステイン残基（例えば、１６個）を含有し得る。本明細書において考察される部分還元手順を用いることによって、システインを含有するわずか１５個の還元されたトリプシンペプチド（１５個のトリプシンペプチドから抗体のヒンジ領域を差し引いたもの）が、ＭＳ２段階において標的とされる必要がある。したがって、例では、質量分析によって試料を分析することは、システインを含有するプロテアーゼ生成断片のみを用いてＰＲＭ包含リストを構築することと、勾配全体にわたってスキャンすることと、を含み得る。例では、ＭＳ１解像度は、ＭＳ２スキャンの数が増えると低下され得る。

【0074】

例では、質量分析によって試料を分析することは、特定の生体分子における各可能なジスルフィドペプチドの可能性に対してジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることを含む。ジスルフィド同定信頼度スコアを割り当てることは、例では、生成されたＭＳ／ＭＳデータに関連するいくつかのクエリのうちの肯定で回答された各クエリに対して点を割り当てることを含む。例では、クエリは、ジスルフィドペプチドのＭＳ１質量が同定されているかどうか、第１の対応する還元ペプチドのＭＳ１質量が同定されているかどうか、第２の対応する還元ペプチドのＭＳ１質量が同定されているかどうか、第１の対応する還元ペプチドのｂｙｏｎｉｃ ＭＳ２同定が所定の閾値より大きいスコアで同定されているかどうか、及び第２の対応する還元ペプチドのｂｙｏｎｉｃ ＭＳ２同定が別の所定の閾値より大きいスコアで同定されているかどうかを含み得るが、これらに限定されない。例では、所定の閾値は同じであるが、所定の閾値が異なることは本開示の範囲内である。例では、質量分析によって試料を分析することは、特定の生体分子（例えば、モノクローナル抗体）における各可能なジスルフィド結合に対してスクランブリングパーセンテージを割り当てることを含む。

【実施例】

【0075】

以下の実施例は、本発明の方法をどのように作製及び使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。

【0076】

実施例１：ジスルフィドの最適化されたポストカラム部分還元及びＭＳシグナル増強
抗体（例えば、モノクローナル抗体）及び他の生体分子は、安定性及び有効な機能性に寄与する天然のジスルフィド結合を有する。しかしながら、特定の条件（例えば、アルカリ条件）下では、非天然（本明細書においてスクランブルとも称される）ジスルフィド結合が生じ、それによって安定性及び機能的有効性を低下させることがある。図１Ａは、複数の天然ジスルフィド結合を有するｍＡｂ（左）、及びいくつかのスクランブルジスルフィド結合を有する同じｍＡｂ（右）を示す。図１Ｂは、ジスルフィド結合が塩基性条件下でどのように再配列（例えば、スクランブル）され得るかを示す簡略化されたスキームを示す。本開示は、ｍＡｂに重点を置いて、生体分子中のスクランブルジスルフィド結合を検出することに関する。

【0077】

スクランブルジスルフィドを有する治療用ｍＡｂ（又は他の治療用生体分子）は、低下した機能性を示す可能性があり、したがって、スクランブルジスルフィドを検出する能力は重要である。図２は、ｍＡｂ中の低存在量のスクランブルジスルフィドを明確に同定することが困難であり得ることを示す。液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）（上パネル）及びタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析（下パネル）によって分析した、対応する還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）から形成されたジスルフィド（Ｃ１３３Ｈ－Ｃ２０２Ｈ、相対存在量０．２％）を図２に示す。ＥＩＣはジスルフィドに対応するｍ／ｚ比を示すが、ＭＳ／ＭＳ分析は、ＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応する断片を同定するには複雑すぎる。

【0078】

ＭＳ／ＭＳ分析におけるジスルフィド対の断片化に関連する複雑さの問題は、質量スペクトル分析の前にジスルフィド対を少なくとも部分還元することによって低減され得る。図３を参照すると、増加するＴＣＥＰ濃度（０ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ）の関数として、ジスルフィド及び対応する還元パートナーペプチドのカウント対質量電荷（ｍ／ｚ）を示す一連のプロットが示されている。簡単に説明すると、ジスルフィド結合を維持するためにｍＡｂを非還元条件下でトリプシン消化し、非還元消化物をＨＰＬＣによって分離した。分離後、図示した濃度のＴＣＥＰを、質量分析計に入れる前に、溶出したジスルフィドと１～３秒間反応させた（例えば、部分還元）。更に、ジスルフィド還元におけるＴＣＥＰの有効性を増加させるために、ＮＨ_４ＯＨ（最終濃度０．１２％）をＴＣＥＰと共に添加した。この方法論を使用して、ジスルフィドは、全ての成分が正確に同じ保持時間を有するように、還元されたペプチドと共溶出する。実験手順のために、消化ｍＡｂを５０μＬ／分（０．０２％ＴＦＡ、０．０８％ＦＡ）でカラムに通し、ＴＣＥＰ及びＮＨ_４ＯＨを、シリンジ及び混合Ｔ字管を介して分離後の試料に添加した。実験は、２ｍＭ ＴＣＥＰで還元パートナーペプチドについて最も高いシグナルを示す。

【0079】

低存在量のジスルフィドは、ＭＳシグナルが低すぎる場合、検出、同定、及び定量することが困難であり得るため、ＴＣＥＰを含有する移動相溶出液へのグリシンの添加がスクランブルジスルフィドのＭＳシグナルを改善し得るかどうかを決定するために実験を実行した。具体的には、２ｍＭ ＴＣＥＰも含む試料においてグリシンがＭＳシグナルを改善することができるかどうかを決定するために実験を実行した。実験手順は、図４に示すような様々な条件下で、ｍＡｂ１からのペプチド断片ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３）のＭＳシグナルを調べることを含んだ。結果は、２ｍＭ ＴＣＥＰが、そうでなければグリシン（２ｍＭ）の添加によって観察されるＭＳシグナル増強を抑制することを示す。左から右に進むと、ＴＣＥＰ及びＮＨ_４ＯＨを含有する試料１は、ＴＣＥＰ、ＮＨ_４ＯＨ及びグリシンを欠く対照と比較してシグナルの減少を示した。ＴＣＥＰ及びＮＨ_４ＯＨを含有する試料への２ｍＭグリシンの添加（試料２）は、わずかな改善しか示さず、ＴＣＥＰ及びグリシンの添加を維持しながらのＮＨ_４ＯＨの除去（試料３）は、試料３を上回るＭＳシグナルのわずかな改善しか示さなかった。試料４（ＴＣＥＰ及びＮＨ_４ＯＨの非存在下で２ｍＭグリシン）のみが実質的なＭＳシグナル増強を示し、これは２ｍＭ ＴＣＥＰが２ｍＭグリシンの任意のＭＳシグナル増強効果を抑制することを示している（試料３を試料４と比較されたい）。

【0080】

グリシン誘導性ＭＳシグナル増強に対するＴＣＥＰのこの抑制効果を、用量反応研究において更に調べた。図５Ａは、０μＭ～２０００μＭのＴＣＥＰ濃度の範囲にわたるｍＡｂ１からのペプチド断片ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３）のＭＳシグナルを示し、図５Ｂは、同じ範囲のＴＣＥＰ濃度にわたる別のペプチドＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号４）のＭＳシグナルを示す。図５Ａ及び図５Ｂの両方は、ＭＳシグナルがＴＣＥＰの濃度の増加と共に減少することを示す。図５Ａ～図５Ｂの各々について、試料条件は、０．１μｇの濃度のｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシン、並びに示された濃度のＴＣＥＰを含んだ。

【0081】

図５Ａ～図５Ｂの結果は、より高いＭＳシグナルがより低いＴＣＥＰ濃度に関連することを示した。より低い濃度のＴＣＥＰが、ジスルフィド連結ペプチド対に対応する還元パートナーペプチドを検出する能力を保持しながら、ＭＳシグナルに対する抑制効果を少なくとも部分的に回避することができるかどうかを決定するために、更なる実験を行った。ペプチドＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号５）及びＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号６）に対応するジスルフィドについてのＭＳシグナルを図６Ａに示し、対応する還元パートナーペプチドについてのＭＳシグナルを図６Ｂに示す。図６Ａ～図６Ｂの各々について、図５Ａ～５Ｂについて上記で考察したものと同様に、０μＭ～２０００μＭの範囲の様々なＴＣＥＰ濃度を試験した。図６Ａ～図６Ｂの試料条件は、１μｇのローディング量のトリプシン消化ｍＡｂ１、０．０５％ＴＦＡ及び２ｍＭグリシン、並びに指定されたＴＣＥＰ濃度を含んだ。データは、漸増濃度のＴＣＥＰがジスルフィドに対応するＭＳシグナルを抑制すること（図６Ａ）、及びＴＣＥＰがジスルフィド連結ペプチド対を効果的に還元し、かつＭＳシグナルが望ましくなく抑制されない範囲（約２０μＭ～約１００μＭ）が存在することを示す。対応する還元パートナーペプチドのＭＳシグナルの増加（図６Ｂ）は、ＭＳ／ＭＳ同定に望ましい。最良のＭＳシグナルは、約４０μＭ ＴＣＥＰにおけるものであることが分かった。

【0082】

したがって、ジスルフィドを対応する還元パートナーペプチドに部分還元するために、４０μＭ ＴＣＥＰを用いて更なる実験を実行した。図７Ａ～図７Ｂを参照すると、ＴＣＥＰによる処理を伴わない場合（図７Ａ）及び４０μＭ ＴＣＥＰによる処理を介したジスルフィドの部分還元を伴う場合（図７Ｂ）の、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）から構成されるジスルフィド並びに対応する還元パートナーペプチドについての相対存在量が示されている。分析したペプチド断片は、ＨＰＬＣに供する前にｍＡｂ２のトリプシン消化から生成した。ジスルフィドの部分還元が行われない場合、対応する還元パートナーペプチドについてシグナルは見られなかったが（図７Ａ）、ジスルフィドペプチドが４０μＭ ＴＣＥＰによって部分還元された場合、対応する還元パートナーペプチドについて良好なシグナルが観察された（図７Ｂ）。

【0083】

図８Ａ～図８Ｂを参照すると、グリシンは、４０μＭ ＴＣＥＰ及びＴＦＡ（０．０５％）の存在下で、ジスルフィドペプチド及び対応する還元パートナーペプチドのＭＳシグナルを１０倍超（例えば、１０倍～２０倍）改善することが観察された。図８Ｃ～図８Ｇは、グリシンを含む又は含まないＦＡが、還元パートナーペプチドの検出を改善するために使用され得るかどうかを示すデータを示す。図８Ａ～図８Ｅの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドペプチドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）に対応し、図８Ｆ～図８Ｇの各々について、還元パートナーペプチドは、非還元形態でジスルフィドを含むＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）に対応する。図８Ａ～図８Ｇの各々は、４０μＭのポストカラム分離ＴＣＥＰで処理した、ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片の相対存在量を示す。図示されるように、グリシン（例えば、２ｍＭ）は、イオン対形成剤がＴＦＡ（図８Ａ～図８Ｂを参照されたい）であっても、ＦＡ（図８Ｃ～図８Ｅ及び図８Ｆ～図８Ｇを参照されたい）であっても、対応する還元パートナーペプチドを検出するために必要とされる。

【0084】

図９Ａ～９Ｂを参照すると、ｍＡｂ２のトリプシン消化から生成されたペプチド断片のＭＳシグナルが示されている。ジスルフィドは、還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）のジスルフィドに対応する。図９Ａ～９Ｂの両方には同じデータが示されており、図９Ｂは図９Ａのｙ軸ズームを示している。データは、２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．０５％ＴＦＡ、又は２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ及び０．１％ＦＡで処理した試料と比較して、４０μＭ ＴＣＥＰを用いて部分還元を実行し、かつ移動相が２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含む条件下で、ジスルフィド及び対応する還元パートナーペプチドの両方について最大のＭＳシグナルが観察されたことを示している。移動相が２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．１２％ＮＨ_４ＯＨ、及び０．１％ＦＡを含む条件下で得られたデータは、グリシンを含まないＦＡを使用して還元パートナーペプチドを検出することが可能であることを示す。しかしながら、これは、高濃度の他の成分（２ｍＭ ＴＣＥＰ及び０．１２％ＮＨ_４ＯＨ）の条件を必要とするようであり、これは、上記で考察したように、改善されたＭＳシグナルを得るために回避することが望ましい。より穏やかな濃度（例えば、４０μＭ ＴＣＥＰ、０％ＮＨ_４ＯＨ）では、還元されたペプチドの検出には、移動相中のＴＦＡが必要である。

【0085】

実施例２：スクランブルジスルフィドのＭＳ／ＭＳ検出の最適化
ＴＣＥＰ（例えば、２０～１００μＭ）を使用する、上記で考察した部分還元戦略は、そもそもスクランブルジスルフィドの存在量が低いことに加えて、典型的な１～３％の還元効率をもたらすと推測される。したがって、妥当なＭＳ１シグナルであっても、ＭＳ２スキャンは、データ依存的取得（ＤＤＡ）では存在しない可能性があり、及び／又はＭＳ２スキャンがピークの最後に発生する場合には弱すぎる可能性があることが認識された。

【0086】

これらの問題を説明するために、５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２を、４０μＭ ＴＣＥＰを用いた部分還元後にタンデム質量分析に供した。移動相は、２ｍＭグリシン及び０．０５％ＴＦＡを含んだ。図１０Ａには、ジスルフィドペプチド並びに対応する還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）（Ｒ１と標識）及びＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫ（配列番号２）（Ｒ２と標識）の相対存在量（ＭＳ１）が示されている。図１０Ｂは、ＭＳ／ＭＳ分析の第２段階（ＭＳ２）についてのｍ／ｚの関数として相対存在量を示す。示されるように、適切なＭＳ１シグナルがあっても、ＭＳ２シグナルは弱いか、又は存在しない可能性がある。

【0087】

したがって、ＭＳ２スキャンが存在し、各ピークの頂点付近であることを確実にするために、全ての還元システイン含有ペプチドに対応する標的化ＭＳ２アプローチを開発した。具体的には、図１０Ｃを参照すると、ヒンジを含む１５個のトリプシン還元ペプチドに対応する、示されるような１６個の固有のシステイン残基を含有するｍＡｂの例示的な図が示されている。上記の部分還元戦略に依存することなく、全てのジスルフィドの組み合わせを別々に標的とすると、１２０個の固有のジスルフィドペプチドが得られ、そのうちの８個は天然である。したがって、部分還元を実行することによって、システインを含有する約１５個の還元されたトリプシンペプチドを標的とすることのみが必要である。したがって、方法論は、約１５個のペプチドを用いて並行反応モニタリング（ＰＲＭ）包含リストを構築することと、勾配全体にわたってスキャンすることと、を含み得る。減少したペプチドの数（例えば、約１５個）は、ヒンジペプチドの除外に起因して概算として記載されるが、使用者の好みに依存して含まれ得る他の誤切断されたペプチドも潜在的に存在し得る。更に、ＭＳ１解像度は、ＭＳ２スキャンの数が増えると低下され得る。

【0088】

図１１は、ジスルフィド並びに対応する還元パートナーペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）及びＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ｍＡｂ２のトリプシン消化からペプチド断片を生成した。図１１に示されるデータは、ジスルフィドのＭＳ／ＭＳスペクトルが、対応する還元パートナーペプチドと比較してかなりの程度の複雑性を含むこと、及び４０μＭ ＴＣＥＰを用いたポストカラム部分還元を実行することが、任意の検出可能なスクランブルジスルフィドのより単純な特徴付けを可能にすることを示す。別の言い方をすれば、還元ペプチドは、ジスルフィドペプチドよりもはるかに単純なＭＳ／ＭＳスペクトルを有し、これは、ジスルフィドのＭＳ／ＭＳスペクトルが、単一ペプチドと比較して指数関数的により多くの可能な断片化を有することに起因して複雑さが増大しているためである。

【0089】

スクランブルジスルフィドのＭＳ／ＭＳ検出を容易にするために、以下の信頼度スコアリングシステムを開発した。信頼度スコアリングシステムは、５つのイエス／ノークエリから構成される。第１のクエリは、特定のジスルフィドのＭＳ１質量が同定されているかどうかを判断する。第２のクエリは、第１の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が同定されているかどうかを判断する。第３のクエリは、第２の還元パートナーペプチドのＭＳ１質量が同定されているかどうかを判断する。本開示に基づいて、第１の還元パートナーペプチド及び第２の還元パートナーペプチドは、システイン残基を介して連結される場合、第１のクエリにおいて言及されたジスルフィドを含むことが理解され得る。第４のクエリは、第１の還元パートナーペプチドのｂｙｏｎｉｃ ＭＳ２ ＩＤが所定の閾値（例えば、＞２００）より大きいスコアを有するかどうかを判断する。第５のクエリは、第２の還元パートナーペプチドのｂｙｏｎｉｃ ＭＳ２ ＩＤが別の所定の閾値（例えば、＞２００）より大きいスコアを有するかどうかを判断する。各クエリについて、「イエス」は１点となり、各「ノー」はなし又は０点となる。したがって、ジスルフィドＩＤ信頼度スコアは以下の通りである：０＝検出されず、１＝低信頼度、２＝中程度の信頼度、３＝高信頼度、及び４又は５＝超高信頼度。信頼度決定における精度を改善するために、選択肢は、還元されたペプチドのピークが同じ保持時間で消失するかどうかを決定するために、部分還元を伴わずに（例えば、ＴＣＥＰの非存在下で）追加の試料を実行することであり得る。そのような信頼度決定スキームを複雑にし得るいくつかの問題は、短い（例えば、２～３残基ペプチド）が検出可能でない場合があり、二量体ジスルフィドペプチドが、それらの対応する還元パートナーペプチドと同じｍ／ｚを有することである（図３１に関して以下を参照されたい）。

【0090】

実施例３：ｍＡｂ２ジスルフィドスクランブリングの定量
スクランブルジスルフィドを同定し、それに対して信頼度値を割り当てるための上記で設計した標的化ＭＳ２アプローチをｍＡｂ２に適用した。具体的には、ｍＡｂ２を非還元条件下でトリプシン消化に供し、ペプチド断片をＨＰＬＣによって分離し、溶出成分を４０μＭ ＴＣＥＰによって部分還元した後、ＭＳ／ＭＳ分析を行った（例えば、標的化ＭＳ２）。２ｍＭグリシンを使用して、ＭＳシグナルを増強した。図１２は、システイン残基を含有するｍＡｂ２のトリプシンペプチド、並びに残基番号及び残基が軽鎖（Ｌ）上にあるか重鎖（Ｈ）上にあるかについての指定を含む対応するシステイン標識を示す。

【0091】

結果を図１３に示し、これは、信頼度レベルによってコード化された、ｍＡｂ２からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合を示す。スクランブルジスルフィド結合の７１．６％が高信頼度レベル又は超高信頼度レベルで同定され、１７％が中程度の信頼度レベルで同定され、１１．３％が低信頼度レベルで同定された。ヒンジに対応するスクランブルペプチドは分析から除外した。データは、全ての可能なスクランブルジスルフィドの大部分がある程度同定可能であることを示した。結果は、ジスルフィドスクランブリングがトリプシン消化に使用されたプロトコルによって人工的に引き起こされ得るかどうかという疑問を提起した。したがって、この問題を以下で考察するように調査した。

【0092】

図１４Ａ～図１４Ｃは、ｍＡｂ２プロトコル（図１４Ａ、図１３に示されるデータを生成するために使用した）、ｍＡｂ３プロトコル（図１４Ｂ）及び低ｐＨ消化キット（図１４Ｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に対応する異なる消化プロトコルを示す。図１４Ａ～図１４Ｃに示されるように、各プロトコルは、類似の工程（例えば、緩衝液交換、変性、アルキル化、消化）を含むが、示されるようにいくつかの違いがある。各プロトコルはアルキル化工程を含み、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３プロトコルではヨード－アセトアミド（ＩＡＭ）によるアルキル化を含み、低ｐＨ消化キットではＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含む。ＩＡＭ及びＮＥＭの構造及びそれらがどのようにシステイン残基を標識するかを、それぞれ図１５Ａ及び図１５Ｂに参考のために示す。プロトコル間の他の主な差異は、変性、アルキル化及び消化工程が実行されるｐＨに集中する。更に、低ｐＨ消化キット手順は、トリプシンを更に含む消化工程の前に、組換えＬｙｓ－Ｃプロテアーゼによる追加の予備消化工程を含む。重要なことに、低ｐＨ消化キット手順のための変性／アルキル化工程はｐＨ５．７で行われ、予備消化工程はｐＨ５．３で行われ、消化工程はｐＨ５．３で行われる。これは、より高いｐＨ（例えば、７．５）で行われるｍＡｂ２及びｍＡｂ３プロトコルに対応する同様の工程とは対照的である。

【0093】

図１６を参照すると、ＵＶクロマトグラフが示されており、これは、低ｐＨキット手順に関連する低ｐＨにもかかわらず、低ｐＨキット手順がｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順の結果に匹敵する結果をもたらすことを示している。図１６は、約９分～約７２分のＵＶクロマトグラフを示す。図１７Ａは、約１４分から約３０分までの時間窓を強調するためのＵＶクロマトグラフの一部分を示し、図１７Ｂは、約３４分から約４９分までの時間窓を強調するための図１６のＵＶクロマトグラフの別の部分を示す。まとめると、図１６～図１７Ｂは、より高いｐＨのトリプシン消化手順（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順）と比較して、同等のトリプシン消化が、低ｐＨキット手順に関連するより低いｐＨを使用して達成され得ることを示す。図１６～図１７Ｂに示されるＵＶクロマトグラフについて、個々の試料は、ｍＡｂ２手順、ｍＡｂ３手順及び低ｐＨ消化キット手順を介して消化された５μｇのｍＡｂ２に対応する。

【0094】

同じ試料を使用して、使用される消化手順（例えば、ｍＡｂ２手順、ｍＡｂ３手順、又は低ｐＨ消化キット手順）に応じてＭＳシグナルに何らかの識別可能な差異が存在するかどうかを評価した。図１８を参照すると、トリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）に対応するいくつかの異なる天然ジスルフィドペプチドについてのＭＳシグナルを示すグラフが示されている。図１８に見られるように、ジスルフィドペプチド断片を生成するためにｍＡｂ２手順、ｍＡｂ３手順又は低ｐＨ消化キット手順のいずれを使用したかに関係なく、各天然ジスルフィドについて同等のシグナル強度が観察された。

【0095】

図１９Ａ～図１９Ｄは、低ｐＨ消化が、塩基性消化手順（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順）と比較して、タンパク質全体にわたって同様の消化効率を有することを示す。図１９Ａ～図１９Ｄのバーは、ｍＡｂの様々な領域の全て（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ）内の非システイン含有ペプチドのＭＳ１ピーク積分を表す。図１９Ａ～図１９Ｄのデータは、図１８に示されるデータと組み合わせて、報告されたスクランブルジスルフィドレベル（図２０Ａ～図２０Ｃを参照されたい）が低ｐＨ消化条件に関して正確であることを裏付ける。データは、酸性条件下（例えば、低ｐＨ消化キット手順）で消化された試料における同等の消化及びＭＳシグナルレベルを示唆したので、最初に同定されたスクランブルジスルフィドの量（図１３を参照されたい）が、消化手順の選択によって人工的に引き起こされたかどうかを評価した。図２０Ａ～図２０Ｃは各々、標的化ＭＳ２アプローチを含む上記で考察した手順を介して検出されたジスルフィドペプチドを示す表を示す。ｍＡｂ２手順、ｍＡｂ３手順及び低ｐＨ消化キット手順に対応する３つの異なる消化手順（図１４Ａ～図１４Ｃを参照されたい）の各々についてのスクランブルジスルフィドの定量された存在量に対応するヒートマップとして示される、ｍＡｂ２からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合が図２０Ａ～図２０Ｃに示される。各可能なスクランブルジスルフィドについて、スクランブルパーセンテージを、特定の消化方法（例えば、ｍＡｂ２手順、ｍＡｂ３手順、又は低ｐＨキット消化手順）の関数として計算した。スクランブルパーセンテージを計算するための式は、図２０Ｄに示される。簡単に説明すると、スクランブルパーセンテージは、スクランブルジスルフィドのピーク面積を、両方の天然ジスルフィドの平均ピーク面積とスクランブルジスルフィドのピーク面積との合計で割ることによって決定した。図２０Ａ～図２０Ｃに見られるように、全てのスクランブルジスルフィドは、高ｐＨ消化手順（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順）を使用した場合に同定されたより高いパーセンテージと比較して、低ｐＨ消化手順を使用した場合に０．０１％未満と定量された。ジスルフィドのいくつかについては干渉があり、図２０Ｅは、そのような干渉の代表例を示す。

【0096】

図２０Ａは、図２０Ｃ（Ｃ２３Ｌ－Ｃ２２Ｈ）と同様に、同定された特に高い存在量のスクランブルジスルフィド（Ｃ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈ）を強調する楕円を含む。図２１Ａ～２１Ｂに関して考察したように、これらを更に調べた。具体的には、図２１Ａ～図２１Ｂは、トリプシン消化手順がより高いｐＨ（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順）又はより低いｐＨ（低ｐＨ消化キット手順）で行われた場合の、高存在量スクランブルジスルフィドの相対存在量を示す。図２１Ａは、還元パートナーペプチドＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）に対応するＣ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈを示し、図２１Ｂは、対応する還元パートナーペプチドＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲ（配列番号１２）及びＬＳＣＡＧＳＧＦＴＦＲ（配列番号８）のジスルフィドに対応するＣ２３Ｌ－Ｃ２２Ｈを示す。図２１Ａ～図２１Ｂの各々について、相対存在量を消化プロトコル（ｍＡｂ２プロトコル、ｍＡｂ３プロトコル、又は低ｐＨ消化プロトコル）の関数として示す。図２１Ａ～図２１Ｂの両方に示すように、ＥＩＣは、ｍＡｂ２プロトコル及びｍＡｂ３プロトコルを用いて消化を実行した場合、高存在量ジスルフィドをベースラインノイズから容易に区別するが、スクランブルジスルフィドのＥＩＣは、低ｐＨ消化条件ではベースラインノイズから区別できなかった。各条件について、試料は、５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ２（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）及び２ｍＭグリシンを含んだ。この観察は、ｍＡｂ２又はｍＡｂ３消化プロトコルのいずれかを使用して試料を生成した場合に、高存在量のスクランブルジスルフィドを含むことが示されたＣ１５２Ｈ－Ｃ１３９Ｈスクランブルジスルフィド（還元パートナーペプチドＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号７）及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号１）に対応する）のＵＶクロマトグラフを示す、図２２に示すデータと一致する。具体的には、図２２は、試料がｍＡｂ２及びｍＡｂ３消化手順を介して調製された場合に見られる観察されたピークと比較して、低ｐＨ消化キット手順を介して調製された試料について対応するピークが存在しないことを示す。

【0097】

実施例４：ｍＡｂ５ジスルフィドスクランブリングの定量
実施例３に関して上記で考察したものと同様の一連の実験を、本明細書においてｍＡｂ５と称する別のモノクローナル抗体に対して行った。図２３Ａ～図２３Ｃは、調べた異なる消化プロトコル、具体的には、ｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順、及び上記で考察され、図１４Ｃに示される同じ低ｐＨ消化キット手順を示す。各手順の詳細を図２３Ａ～図２３Ｃに示すが、主な違いは、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５消化手順と比較して、低ｐＨ消化キット手順に関連する変性／アルキル化工程（例えば、ｐＨ５．７）及び消化工程（例えば、ｐＨ５．３）のｐＨが低いことである。

【0098】

図２４は、図２３Ａ～図２３Ｃに例示的に示される消化手順（例えば、ｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順及び低ｐＨ消化キット手順）の各々を使用した、トリプシン消化ｍＡｂ５（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合は低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）に対応するＵＶクロマトグラムのオーバーレイを示す。ｍＡｂ２抗体について上に示したもの（図１６～図１７Ｂを参照されたい）と同様に、図２４は、低ｐＨ消化キット手順に関連する低ｐＨにもかかわらず、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５消化手順を使用する消化と比較して同等の消化が達成されたことを示す。図２４に示すクロマトグラムを取得するために実行された試料は、２ｍＭグリシンの存在下で５μｇのトリプシン消化ｍＡｂ５（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）を含んだ。図２５Ａ～２５Ｂは、より高いｐＨ消化条件（例えば、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５消化手順）又はより低いｐＨ消化条件（例えば、低ｐＨ消化キット手順）が使用されたかどうかにかかわらず、ｍＡｂ５の消化が類似していたという事実を強調するために、より良好な視覚的分解能のために、図２４に示されるクロマトグラフ全体の一部を描写する。

【0099】

図２４～２５Ｂに関して論じた同じ試料を使用して、使用した消化手順（例えば、ｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順又は低ｐＨ消化キット手順）に応じてＭＳシグナルに何らかの識別可能な差があったかどうかを評価した。図２６を参照すると、トリプシン消化ｍＡｂ５（又は低ｐＨ消化プロトコルの場合、低ｐＨ耐性組換えＬｙｓＣと共にトリプシン）に対応するいくつかの異なる天然ジスルフィドペプチドについてのＭＳシグナル（例えば、ピーク面積）を示すグラフが示されている。図２６に見られるように、ジスルフィドペプチド断片を生成するためにｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順又は低ｐＨ消化キット手順のいずれを使用したかに関係なく、各天然ジスルフィドについて同等のシグナル強度が観察された。

【0100】

図２７Ａ～Ｄは、低ｐＨ消化が、塩基性消化手順（例えば、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５手順）と比較して、タンパク質全体にわたって同様の消化効率を有することを示す。図２７Ａ～図２７Ｄのバーは、ｍＡｂの様々な領域の全て（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ）内の非システイン含有ペプチドのＭＳ１ピーク積分を表す。図２７Ａ～図２７Ｄのデータは、図２６に示されるデータと組み合わせて、報告されたスクランブルジスルフィドレベル（図３０Ａ～図３０Ｃを参照されたい）が低ｐＨ消化条件に関して正確であることを裏付ける。

【0101】

スクランブルジスルフィドを同定し、それに対して信頼度値を割り当てるための上記で考察した標的化ＭＳ２アプローチをｍＡｂ５に適用した。具体的には、ｍＡｂ４消化手順を介して非還元条件下でｍＡｂ５をトリプシン消化に供し、ペプチド断片をＨＰＬＣによって分離し、溶出成分を４０μＭ ＴＣＥＰによって部分還元した後、ＭＳ／ＭＳ分析を行った（例えば、標的化ＭＳ２）。２ｍＭグリシンを使用して、ＭＳシグナルを増強した。図２８は、システイン残基を含有するｍＡｂ５のトリプシンペプチド、並びに残基番号及び残基が軽鎖（Ｌ）上にあるか重鎖（Ｈ）上にあるかについての指定を含む対応するシステイン標識を示す。

【0102】

結果を図２９に示し、これは、信頼度レベルによってコード化された、ｍＡｂ２からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合を示す。スクランブルジスルフィド結合の６３．３％が高信頼度レベル又は超高信頼度レベルで同定され、２０％が中程度の信頼度レベルで同定され、１６．７％が低信頼度レベルで同定された。ヒンジに対応するスクランブルペプチドは分析から除外した。データは、全ての可能なスクランブルジスルフィドの大部分がある程度同定可能であることを示した。再び、結果は、ジスルフィドスクランブリングがトリプシン消化に使用されたプロトコルによって人工的に引き起こされ得るかどうかという疑問を提起した。

【0103】

したがって、この問題を、ｍＡｂ２抗体について上記で考察したものと同様の様式で調査した。具体的には、ｍＡｂ５抗体について、同定されたスクランブルジスルフィドの量（図２９を参照されたい）が消化手順（例えば、より高いｐＨ消化手順）の選択によって人工的に引き起こされたかどうかを決定するために実験を実行した。図３０Ａ～図３０Ｃは各々、各同定されたジスルフィドペプチド断片に信頼度レベルを割り当てる信頼度スコアリングシステムと組み合わせた標的化ＭＳ２アプローチを含む上記で考察した手順を介して検出されたジスルフィドを示す表を示す。図３０Ａ～図３０Ｃに示されているのは、ｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順及び低ｐＨ消化キット手順（図２３Ａ～図２３Ｃ参照）に対応する３つの異なる消化手順の各々について、図２９について考察したのと同様に信頼度レベルによってコード化された、ｍＡｂ５からの全ての可能なスクランブルジスルフィド結合である。各可能なスクランブルジスルフィドについて、スクランブルパーセンテージを、特定の消化方法（例えば、ｍＡｂ４手順、ｍＡｂ５手順、又は低ｐＨキット消化手順）の関数として計算した。スクランブリングパーセンテージを計算するための式は、図２０Ｄに示され、上記で考察された。図３０Ａ～図３０Ｃに見られるように、全てのスクランブルジスルフィドは、高ｐＨ消化手順（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３手順）を使用した場合に同定されたより高いパーセンテージと比較して、低ｐＨ消化手順を使用した場合に０．０１％未満と定量される。一部のジスルフィドについては、上記で考察され、図２０Ｅに例示的に示されるものと同様の干渉があった。

【0104】

まとめると、本明細書中で議論される方法論は、生体分子（例えば、モノクローナル抗体）中の低存在量のスクランブルジスルフィドを同定するために効果的に使用され得る。

【0105】

これらの例は、ポストカラムＴＣＥＰ部分還元が、（無傷のジスルフィドペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルと比較して）より単純なＭＳ／ＭＳスペクトルの生成によってスクランブルジスルフィドペプチドを同定するための単純かつ有効な方法であり、全ての成分が正確に同じ保持時間を共有することを実証する。更に、実験は、より塩基性（例えば、ｐＨ７．５）条件下での消化条件が、人工的なジスルフィドスクランブリングを誘導し得ることを示す。したがって、人工スクランブルジスルフィドペプチドの存在量は消化プロトコルに依存する可能性があり、遊離チオールはジスルフィドスクランブルに寄与する可能性があるが、ジスルフィドスクランブリングに単独で関与しているわけではない。より酸性の条件下（例えば、ｐＨ５．７）で非還元消化を実行することにより、人工的なジスルフィドスクランブリングを防止することができる。最後に、本明細書で考察されるｍＡｂ（例えば、ｍＡｂ２及びｍＡｂ５）は、無視できるレベルの実際のスクランブルジスルフィドを含有することが示された。

【0106】

本明細書では特定の実施形態を図示及び説明してきたが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、図示及び説明した実施形態の代わりに、同じ目的を達成するように計算された多種多様な代替及び／又は同等の実施形態又は実装を用いてもよいことを理解するであろう。当業者は、実施形態が非常に多種多様な方法で実装され得ることを容易に理解するであろう。本出願は、本明細書で考察される実施形態の任意の適合又は変形を包含することが意図される。したがって、実施形態は、特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されることが明白に意図されている。

【図1A-1】

【図1A-2】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19A-1】

【図19A-2】

【図19B-1】

【図19B-2】

【図19C-1】

【図19C-2】

【図19D-1】

【図19D-2】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【図28】

【図29-1】

【図29-2】

【図30A-1】

【図30A-2】

【図30B-1】

【図30B-2】

【図30C-1】

【図30C-2】

【図31】

【配列表】

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【国際調査報告】