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特表2024-504031コロナウイルスまたは細菌による感染症の治療に使用するためのウスニン酸またはその包接複合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-30
(54)【発明の名称】コロナウイルスまたは細菌による感染症の治療に使用するためのウスニン酸またはその包接複合体
(51)【国際特許分類】
A61K 31/343 20060101AFI20240123BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240123BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240123BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240123BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240123BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20240123BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240123BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20240123BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240123BHJP
【ＦＩ】
A61K31/343
A61P31/14
A61P11/00
A61P31/04
A61P31/10
A61K9/20
A61K9/14
A61K9/08
A61K9/48
A61K9/10
A61K9/107
A61K9/06
A61K47/42
A61K47/36
A61K47/12
A61K47/38
A61K47/44
A61K47/20
A61K47/22
A61K9/72
A61K47/69
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540112
(86)(22)【出願日】2021-12-30
(85)【翻訳文提出日】2023-08-25
(86)【国際出願番号】 IB2021062486
(87)【国際公開番号】W WO2022144835
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】102020000032909
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522200410
【氏名又は名称】ヴェスタティス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＳＴＡＴＩＳ ＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(74)【代理人】
【識別番号】100136696
【弁理士】
【氏名又は名称】時岡 恭平
(72)【発明者】
【氏名】チェラーナ，ジョルジョ ステファノ
(72)【発明者】
【氏名】ボス，ペーテル
(72)【発明者】
【氏名】フランク，ペーター
(72)【発明者】
【氏名】ボナー，トーマス デトレフ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA12
4C076AA17
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA29
4C076AA36
4C076AA53
4C076CC03
4C076DD41
4C076DD42
4C076DD55
4C076DD59
4C076EE30
4C076EE31
4C076EE32
4C076EE39
4C076EE43
4C076EE51
4C076FF51
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA05
4C086GA16
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA13
4C086MA16
4C086MA21
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA27
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA56
4C086MA57
4C086MA59
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB33
4C086ZB35
(57)【要約】
本発明は、（ａ）ウスニン酸、および／または（ｂ）その関連の塩、および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩、および（ｉｉ）シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリン、を含む、または、からなる、包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、を含む、または、からなる、混合物Ｍであって、ウイルス感染症を治療する方法に使用するためのものであり、有利にはコロナウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができる、混合物Ｍに関する。さらに、本発明は、本発明による治療方法に使用するための、好ましくは口腔または経鼻の使用のための組成物であって、混合物Ｍ、および、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を含む、組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのコロナウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するための混合物Ｍであって、（ａ）ウスニン酸、および／または、
（ｂ）その関連の塩、または、
（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含む、または、からなる、包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、
を含む、または、からなる、混合物Ｍ。
【請求項2】
混合物Ｍが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって誘発または引き起こされる呼吸器系のウイルス感染症を治療する方法に使用するためのものであり、好ましくは、混合物Ｍは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質、と結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができる、請求項１に記載の混合物Ｍ。
【請求項3】
混合物Ｍが、前記（ｃ）包接化合物（ｃｉ）を含むかまたはそれからなり、包接化合物（ｃｉ）は、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、好ましくはウスニン酸ナトリウム塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのβ－シクロデキストリン、
を含むかまたはそれらからなる、請求項１または２に記載の混合物Ｍ。
【請求項4】
包接化合物（ｃｉ）において、（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンと、（ｉ）ウスニン酸および／またはその関連の塩との重量比［（ｉｉ）：（ｉ）］が、３：１～１：３、好ましくは２：１～１：２、より好ましくは１．５：１～１：１．５、さらに好ましくは２：１または１：１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項5】
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸が、右旋性の天然ウスニン酸Ｄ（＋）と左旋性の天然ウスニン酸Ｌ（－）との組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）であり；好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）は、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％含まれ、および／または、左旋性形態Ｌ（－）は、組み合わせまたは会合体の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％含まれ、好ましくは、天然由来の前記（ａ）ウスニン酸は、５０％（＋）および５０％（－）のラセミ形態である、あるいは、実質的に１００％の右旋性形態Ｄ（＋）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項6】
天然由来の前記（ｂ）ウスニン酸が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であり；好ましくは、天然由来のウスニン酸塩は、ウスニン酸ナトリウム塩Ｄ（＋）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項7】
ウスニン酸が、本質的に、化合物：（＋）－ウスニン酸、化学名２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオン；ウスネア由来の（＋）－ウスニン酸；ＣＡＳ番号：７５６２－６１－０、ＥＣ：２３１－４５６－０、からなり；好ましくは、ウスニン酸ナトリウム塩が、本質的に、化合物：２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオンの一ナトリウム塩；ＣＡＳ番号：３４７６９－４４－３、ＥＣ：２５２－２０４－６、からなり；好ましくは、前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）ウスニン酸塩の純度は、９５％～９９．９％、好ましくは９６％～９９．５％、より好ましくは９７％～９８％または９９％（％重量／重量）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項8】
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩が、１ミクロン～１００ミクロン、好ましくは５ミクロン～５０ミクロン、より好ましくは１０ミクロン～２０ミクロンの平均粒径を有する、粉末固体形態である、請求項１～７のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項9】
前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩と、前記（ｉｉ）の少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンとの重量比［（ａ）および／または（ｂ）：（ｉｉ）］が、実質的に１：２または１：１である、請求項１～８のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項10】
前記包接化合物（ｃｉ）が、前記（ａ）ウスニン酸、好ましくは実質的に純粋なエナンチオマーとしてのＤ（＋）－ウスニン酸、またはその関連の塩の、固体粒子を含み、該固体粒子は、０．０１μｍ～５０μｍ、好ましくは０．１μｍ～３０μｍ、より好ましくは０．１５μｍ～２０μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ～１５μｍの平均粒径分布を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
【請求項11】
グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって誘発または引き起こされる細菌感染症を治療する方法に使用するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の混合物Ｍであって、（ａ）ウスニン酸、および／または、
（ｂ）その関連の塩、および／または、
（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含む、または、からなる、包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、
を含む、または、からなる、混合物Ｍ。
【請求項12】
混合物Ｍが、ヒトまたは獣医学の分野において、抗菌剤、抗増殖細菌剤、静菌剤、殺菌剤、抗カビ剤、抗酵母剤（例えばカンジダ）、抗真菌薬または抗真菌剤（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）として使用するためのものであり、好ましくはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌に対するもの、例えば、科学的名称が、クレブシエラ、腸内細菌科細菌、エンテロバクター、シュードモナス、およびエシェリキアであるものに対するものである、請求項１１に記載の混合物Ｍ。
【請求項13】
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する抗菌剤または静菌剤として使用される、請求項１１または１２に記載の混合物Ｍであって、細菌は、好ましくは、大腸菌、クレブシエラ、アシネトバクター・バウマニ、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、エンテロコッカス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス種（ＶＲＥ）、アクチノバクター（Actinobacter）、アクチノバクター種（Actinobacter spp.）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、およびそれらの組み合わせを含むかそれらからなる群から選択される、混合物Ｍ。
【請求項14】
医薬組成物、規則（ＵＥ）２０１７／７４５に従った医療機器組成物、特殊医療用食品（ＦＳＭＰ）用の組成物、規則（ＵＥ）２０１５／２２８３に従った新規食品用の組成物、または食品用の組成物であって、該組成物が、請求項１～１３のいずれか１項に記載の混合物Ｍ、および少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を含み、内服用、外用、非経口、局所、皮膚科学的に使用するためのもの；または、組織、真皮、または粘膜に使用するためのもの；または、口、鼻、眼に使用するもの；または、外耳道、喉、気管、食道、目、鼻、または耳に使用するためのもの；または、口腔粘膜、鼻粘膜、鼻上皮、眼粘膜または外耳道に使用するためのもの；または、胃、腸、胃腸に使用するためのもの；または、膣または直腸で使用するためのもの、である、組成物。
【請求項15】
該組成物が、錠剤、チュアブル錠、口内溶解錠、顆粒、粉末、フレーク、可溶性または水溶性の粉末または顆粒、口内溶解性の粉末または顆粒、カプセル、から選択される、固体形態；または、
溶液、懸濁液、分散液、エマルション、または、スプレーの形態で分配できる液体、喉スプレー、経口スプレーまたは鼻スプレー、エアロゾル、経口エアロゾルまたは鼻エアロゾル、シロップ、から選択される、液体形態；または、
ソフトゲル、ゲル、鼻用ゲル、経口用ゲル、軟膏、クリーム、局所用、経口用または鼻用のクリームまたはゲル、から選択される、半液体または半固体の形態、
である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物が、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸またはその塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ビタミン、アミノ酸、抗酸化剤、シリカ、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポロキサマー、ファイバー、イヌリン、マルトデキストリン、脂肪、ワックス、油、動物油、植物油、ワセリン、炭酸塩、重炭酸塩、アンモニウム塩、塩化ナトリウム、クレー、カオリン、抗酸化剤、例えば、グルタチオン、ケルセチン、コエンザイムＱ１０、またはビタミン、特にグループＣまたはＥのビタミン、例えばトコフェロールおよびトコトリエノール、植物由来のトコトリエノール、例えば、米由来のトコトリエノールなど、保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸カリウム、またはソルビン酸ナトリウムまたはソルビン酸カリウムなど、無機塩、塩化ナトリウム、および、ｐＨ緩衝剤、例えば、クエン酸およびその可溶性塩、例えばクエン酸一水和物など、から選択される、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を使用して、製剤化されている、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項17】
該組成物が、噴霧器、スプレー、またはスプレー缶を使用して投与される水溶液であり；好ましくは、該組成物は、食品または医薬品グレードの添加剤および／または賦形剤を使用して製剤化され、液体組成物が、例えば約２０℃または５℃の室温で、例えば３６℃～４０℃の体温を有する対象に経鼻経路を通じて適用されると、液体水性組成物を室温にしてゲルの粘稠度にすることを可能にする、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項18】
該組成物が、（ａ）および／または（ｂ）および（ｉｉ）シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびトコトリエノール、好ましくは米由来のトコトリエノールによって、霧化され、組み合わされ、または会合される、水性組成物で用いられ；好ましくは、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）由来のトコトリエノールは、例えば、トコトリエノール含量が、５重量％～７５重量％、好ましくは１５重量％～６０重量％、例えば、２５重量％、または３０重量％、または４０重量％、または５０重量％である、水分散性粉末の形態であってもよい（商品名ＴｈｅｒａＰｒｉｍＥ（登録商標）－ＢＧＧの製品）、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
水分散性粉末が、トコトリエノールとともに、好ましくは、マルトデキストリン（９０５０－３６－６）、デンプン、および二酸化ケイ素ＳｉＯ２（７６３１－８６－９）を含んでもよく；好ましくは、水分散性粉末は、３０％～６０％の米ぬか油抽出物、２５％～４５％の加工デンプン、２０％～４０％のマルトデキストリン、および０．２％～１．５％のＳｉＯ２を含んでもよく；より好ましくは、水分散性粉末は、トコトリエノールとトコフェロールの混合物を総量で１５重量％～６０重量％、例えば、２５％、または３０％、または４０％、または５０％含む水分散性粉末が用いられ；さらにより好ましくは、混合物中の総含量が２５重量％の場合には、例えば、トコトリエノールの量が約１０重量％であってトコフェロールの量が約１５重量％（ＨＰＬＣによって測定される量）であってよく、一方、混合物中の総含量が３０重量％の場合には、トコトリエノールの量が約１５重量％であってトコフェロールの量が約１５重量％であってよく、１００％における残りの部分は、デンプン、マルトデキストリン、ＳｉＯ２およびその他であり得る、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項20】
ウスニン酸Ｄ（＋）が、好ましくは、１９０℃～２１０℃、好ましくは１９２℃～１９８℃の、融点（ＤＳＣ）；４８０°～５４０°、好ましくは４９０°～５２０°の、分子旋光度；ＰＳＤ値：１ミクロン～１５ミクロン、好ましくは２ミクロン～１０ミクロン、例えば５ミクロンの、Ｄ５０、を有してもよく；より好ましくは、ウスニン酸は、病原体に対する低濃度ＭＩＣ、例えば、５００ｐｐｍ以下の黄色ブドウ球菌ＭＩＣおよび１０００ｐｐｍ以下の大腸菌ＭＩＣ、を有する、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
該組成物が、下記の表：【表1】
【請求項22】
該組成物が、水溶液の形態であり、９０重量％～９９．５重量％、好ましくは９４重量％～９９重量％の、水、好ましくは脱塩水；
０．０００１重量％～０．５重量％、好ましくは０．０１～０．２５重量％の、好ましくはＤ（＋）の形態である、（ａ）ウスニン酸および／または（ｂ）ウスニン酸塩および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはそれらの混合物；
０．２５重量％～２．５重量％、好ましくは０．５重量％～１．５重量％の、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポロキサマー、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、ポリマー；
グルタチオン、ケルセチン、コエンザイムＱ１０、ビタミン、特にグループＣまたはＥのビタミン、例えばトコフェロールおよびトコトリエノール、好ましくは植物由来のトコトリエノール、例えば米由来のトコトリエノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、抗酸化活性を有する化合物；
好ましくは、当産業で一般的に使用される、無機塩、保存剤、およびｐＨ緩衝剤または安定剤、
を含む、または、からなる、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
水溶液の形態の前記組成物が、好ましくは、２０℃で約２４０±４０の粘度値（ｍＰａ・ｓ）；約５±０．２のｐＨ値；約１．０１±０．１ｇ／ｃｃの密度値を有してよく、微生物学的負荷（総負荷、酵母、カビ、２つの病原体（黄色ブドウ球菌およびシュードモナス））において、総負荷が１００ＣＦＵ以下、酵母が１００ＣＦＵ以下、カビが１０ＣＦＵ以下、および病原体が存在しない、性状を有し得る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
請求項１４～２３のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法であって、下記の工程：１）粉末、好ましくは活性成分（ａ）および／または（ｂ）および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）、およびポリマーＣＭＣ、またはＨＰＣ、またはＨＰＭＣを、好ましくは９０℃～１５０℃、より好ましくは１００℃～１１０℃の温度で、乾燥する工程；
２）工程１）により得た粉末を、予め５０℃～９０℃、好ましくは６０℃～８０℃±２℃の温度に加熱した適量の水、例えば１００リットルの脱塩水に、加えて、溶液を得る工程；
３）工程２）により得た溶液を、好ましくはマグネティックミキサーを用いて、例えば３０分～２４０分、好ましくは６０分～１２０分の時間混合して、最終の水溶液を得る工程；および、任意に行われ得る
４）ｐＨ値を５±０．１～７±０．１、好ましくは５．５±０．１～６．５±０．１の値に制御および調整して、包装可能な最終の溶液を得る工程、
を含む、または、からなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、（ａ）ウスニン酸、および／または（ｂ）その関連の塩、および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、（ｉｉ）シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリンを含む、または、からなる、包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、を含む、または、からなる混合物Ｍであって、医薬として使用するための混合物Ｍ、に関する。さらに、本発明は、組成物、好ましくは、口腔用または耳鼻咽喉科用（口、喉、鼻および耳）の組成物であって、前記混合物Ｍ、および、任意に少なくとも１種の許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を含み、医薬として使用するための組成物、に関する。最後に、本発明は、前記混合物Ｍおよび前記組成物であって、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって誘発または引き起こされる細菌感染症を治療する方法に使用するための、または、ウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染を治療する方法に使用するための、前記混合物Ｍおよび前記組成物、および、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含むまたはそれからなる群から選択されるウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができる、前記混合物Ｍ、および前記混合物Ｍを含む前記組成物、に関する。コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＳＡＲＳ＝重症急性呼吸器症候群）によって引き起こされる感染症である。
【0002】
本発明は、混合物Ｍおよび組成物であって、該組成物は該混合物Ｍを含み、抗ウイルス剤として、好ましくは口腔用または耳鼻咽喉科用（口、喉、鼻および耳）で使用する抗ウイルス剤として、好ましくは、呼吸器系のウイルス感染、および前記ウイルス感染に由来または関連する症状または障害、好ましくはＳＡＲＳコロナウイルスによるウイルス感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９疾患を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス感染）の治療に使用するための抗ウイルス剤としての、混合物Ｍおよび組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
気道のウイルス感染症は、その名前が示すとおり、上部および／または下部の呼吸器系の器官（鼻、口、喉、咽頭、喉頭、気管、気管支、および肺）に影響を及ぼすウイルスによって引き起こされる感染症である。好ましくは、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと略称される重症急性呼吸器症候群コロナウイルス種の少なくとも１つのウイルスによって引き起こされるウイルス感染症に関する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ種のウイルスは、ベータコロナウイルス属に属するプラス鎖ＲＮＡウイルス（ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）分類のグループＩＶ）である。重症急性呼吸器症候群コロナウイルスという種のウイルスは、２００２年から２００３年に中国でＳＡＲＳの流行を引き起こしたウイルスであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ株と称される。２００２年１１月に中国の広東省で初めて発見された。２００２年１１月１日から２００３年８月３１日までに、このウイルスは、約３０か国で、８，０９６人に感染し、主に中国、香港、台湾および東南アジア全域で、７７４人が死亡した。２０１９年の年末にかけて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株または２０１９－ｎＣｏＶと称される重症急性呼吸器症候群コロナウイルス種の第２のウイルスが、中国および世界のその他の地域で、新たなＳＡＲＳの流行を引き起こし、これは、一般的に、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患１９、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２急性呼吸器疾患またはコロナウイルス疾患２０１９、あるいはコロナウイルス症候群２０１９とも称される）として知られている。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株における、さまざまな濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の存在下での、８時間後の細胞生存率のパーセンテージを示すヒストグラムである。
【図2】Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株における、さまざまな濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の存在下での、２４時間後の細胞生存率のパーセンテージを示すヒストグラムである。
【図3】Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株における、シュードウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）の変化に応じた発光値を示すヒストグラムである。
【図4A】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞における発光量を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図4B】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞へのシュードウイルス侵入を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図5A】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞における発光量を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図5B】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞へのシュードウイルス侵入を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図6A】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞における発光量を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図6B】ＭＯＩが１０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と１時間プレインキュベートした後の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞へのシュードウイルス侵入を示すヒストグラムであり、殺ウイルス複合体とのプレインキュベーションを行わなかったシュードウイルスから得られた結果（対照）と比較している。
【図7】可能な実施形態による、ウスニン酸の製造プロセスのフローチャートの例である。
【図8】可能な実施形態による、ウスニン酸の固体粒子の平均分布を示す。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様において、本発明は、ウイルス感染症、好ましくは呼吸器のウイルス感染症、より好ましくはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる（例えば呼吸器の）ウイルス感染症を治療する方法に使用するための、本発明で定義される、混合物Ｍ（または混合物Ｍおよび添加剤／賦形剤を含む組成物）に関する。
【0006】
第２の態様において、本発明は、ウイルス感染症、好ましくは呼吸器のウイルス感染症、より好ましくはコロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる（例えば呼吸器の）ウイルス感染症を治療する方法であって、該治療方法は、本発明で定義される治療有効量の混合物Ｍ（または混合物Ｍおよび添加剤／賦形剤を含む組成物）を必要とする対象に投与することを提供する、ウイルス感染症の治療方法に関する。
【0007】
第３の態様において、本発明は、細菌感染症、好ましくは呼吸器の細菌感染症、より好ましくはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症を治療する方法に使用するための、本発明で定義される混合物Ｍ（または混合物Ｍおよび添加剤／賦形剤を含む組成物）に関する。
【0008】
第４の態様において、本発明は、細菌感染症、好ましくは呼吸器の細菌感染症、より好ましくはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症を治療する方法であって、該治療方法は、本発明で定義される治療有効量の混合物Ｍ（または混合物Ｍおよび添加剤／賦形剤を含む組成物）を必要とする対象に投与することを提供する、細菌感染症の治療方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0009】
広範な研究開発活動を経て、出願人は、細菌感染症およびウイルス感染症、好ましくは呼吸器（上気道および下気道）のウイルス感染症、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス種（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／２０１９－ｎＣｏＶ株（その疾患はＣＯＶＩＤ－１９またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－などとして知られる））の少なくとも１つのウイルスによって引き起こされる呼吸器のウイルス感染症の治療に関連する問題に取り組み、医薬として使用するための、好ましくは経口または経鼻用の、混合物Ｍ、および混合物Ｍを含む組成物を提供することにより、その問題を解決した。
【0010】
本発明の目的により、医薬として使用するための混合物Ｍであって、（ａ）ウスニン酸、および／または（ｂ）その関連の塩、および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩、および（ｉｉ）シクロデキストリンを含む、または、からなる、包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、を含む、または、からなる、混合物Ｍ、を提供する。
【0011】
本発明の目的により、医薬として使用するための組成物であって、混合物Ｍ、および、任意に、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を含む、組成物、を提供する。
【0012】
混合物Ｍおよび混合物Ｍを含む組成物は、抗菌活性または静菌活性および抗ウイルス活性を有し、コロナウイルスを含むまたはコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスの、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質を阻害することができる。
【0013】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって誘発または引き起こされる細菌感染症を治療する方法に使用するためのものである。
【0014】
別の実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、ウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するためのものである。好ましくは、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、コロナウイルスを含むまたはコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスの、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質を阻害することができる。
【0015】
ウスニン酸、好ましくは、天然由来の右旋性ウスニン酸Ｄ（＋）と天然由来の左旋性ウスニン酸Ｌ（－）の５０％－５０％の組み合わせまたは会合体の、あるいは好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）のみの、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に結合する能力／可能性を、観察および評価した。天然ウスニン酸、天然ウスニン酸ナトリウム塩、天然ウスニン酸と天然ウスニン酸ナトリウム塩、好ましくは右旋性形態Ｄ（＋）のみのウスニン酸およびその塩は、重量比（ウスニン酸：ウスニン酸ナトリウム塩）が、１：１０～１０：１（例えば、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１）であって、好ましくは、１：５～５：１、例えば、１：３～３：１、１：２～２：１または１：１で、少なくとも１つの主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に対して、良好な結合親和性（例えば、６Ｍ０Ｊ）があるという、驚くべき肯定的な評価がなされた。
【0016】
向上した結合親和性に関する同様の傾向は、（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩、および（ｉｉ）シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリンを含むか、またはそれらからなる包接化合物（ｃｉ）においても観察された。またこの場合、ウスニン酸は、好ましくは、天然由来の右旋性ウスニン酸Ｄ（＋）と天然由来の左旋性ウスニン酸Ｌ（－）の５０％－５０％の組み合わせまたは会合体であり、また、好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）のみである。このウスニン酸は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼ、および／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に結合することができる。天然ウスニン酸、天然ウスニン酸ナトリウム塩、天然ウスニン酸と天然ウスニン酸ナトリウム塩、好ましくは右旋性形態Ｄ（＋）のみのウスニン酸およびその塩は、重量比（ウスニン酸：ウスニン酸ナトリウム塩）が、１：１０～１０：１（例えば、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１）であって、好ましくは、１：５～５：１、例えば、１：３～３：１、１：２～２：１または１：１で、少なくとも１つの主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に対して、良好な結合親和性（例えば、６Ｍ０Ｊ）があるという、肯定的な評価がなされた。
【0017】
少なくとも１つの主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に対する本発明の混合物Ｍまたは組成物の良好な結合親和性（例えば、６Ｍ０Ｊ）は、混合物Ｍが、前記（ａ）ウスニン酸および（ｉｉ）シクロデキストリン：α、βおよび／またはγ－シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリン、を含むかまたはそれらからなる（ｃｉ）包接化合物であって、好ましくは、（ａ）ウスニン酸と（ｉｉ）シクロデキストリン（好ましくはβ－シクロデキストリン）との重量比［（ａ）：（ｉｉ）］（ウスニン酸：シクロデキストリン）が、１：５～５：１、好ましくは１：３～３：１、より好ましくは１：２～２：１、例えば約１：１または１：２である、（ｃｉ）包接化合物、を含むかまたはそれらからなる場合に、特に観察された。
【0018】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、好ましくは５０％（＋）および５０％（－）のラセミ形態であるか、または右旋性形態Ｄ（＋）のみである、天然由来の、（ａ）ウスニン酸を含むかまたはそれらからなる。前記（ｂ）は、好ましくは、天然由来のウスニン酸塩である。前記塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であり、好ましくは、天然由来のウスニン酸塩は、ウスニン酸ナトリウム塩である。
【0019】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、天然由来の（ａ）ウスニン酸、を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、ヒトおよび動物に影響を与える細菌感染症またはウイルス感染症を治療する方法における口腔用または耳鼻咽喉科用（口、喉、鼻および耳）での使用のためのものであり、好ましくは、ヒトおよび獣医学の分野での経口使用のためのものである。本発明の主題である混合物Ｍおよび混合物Ｍを含む組成物は、齲蝕の治療および齲蝕原性歯垢の予防的処置には使用されず、さらには齲蝕および齲蝕原性病変を引き起こす主な病原体の１つである細菌ストレプトコッカス・ミュータンス（グラム陽性菌）に対しても使用されない。
【0020】
別の実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、天然由来の（ａ）ウスニン酸を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、呼吸器系のウイルス感染、およびウイルス感染に由来するかそれに関連する症状および／または障害の、好ましくは、上気道および／または下気道のウイルス感染症、を治療する方法に使用するためのものである。ウイルス感染症は、コロナウイルス科（Coronaviridae）、亜科（subfamily）：コロナウイルス（Coronavirinae）、属（genus）：ベータコロナウイルス（Betacoronavirus）、種（species）：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（severe acute respiratory syndrome coronavirus）、株（strains）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または２０１９－ｎＣｏＶ）、および、ＣＯＶＩＤ－１９の原因、および、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス様（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ様またはＳＬ－ＣｏＶ）、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、から選択されるものである、ウイルスによって誘発されるか、または引き起こされる。混合物Ｍは、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのスパイクタンパク質、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質と結合することができる（例えば、６Ｍ０Ｊ）。
【0021】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、症状および／または障害を治療する方法に使用するためのものであり、前記症状および／または障害（呼吸器系のウイルス感染に由来するかまたはそれに関連する）は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、呼吸器合併症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、咳、百日咳、肺炎、胸膜炎、細気管支炎、風邪、副鼻腔炎、鼻炎、気管炎、咽頭炎、喉頭炎、急性喉頭気管気管支炎、喉頭蓋炎、気管支拡張症、呼吸困難、呼吸不全、息切れ、息苦しさ、発熱、倦怠感、筋肉痛、筋肉疲労、鼻づまり、鼻水、喉の痛み、胃腸症状、吐き気、下痢、腎不全、食欲不振、全身倦怠感、から選択される。
【0022】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、右旋性の天然ウスニン酸Ｄ（＋）および左旋性の天然ウスニン酸Ｌ（－）の組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）として存在する、天然由来の（ａ）ウスニン酸を含むかまたはそれらからなり；好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）は、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％（例えば、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）で含まれ、および／または、左旋性形態Ｌ（－）は、組み合わせまたは会合体の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％）で含まれる。好ましくは、天然由来の（ａ）ウスニン酸は、５０％（＋）および５０％（－）のラセミ形態、または右旋性形態Ｄ（＋）（１００％）である。
【0023】
一実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として存在する、天然由来の（ｂ）ウスニン酸塩を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、天然由来のウスニン酸塩は、ウスニン酸ナトリウム塩である。好ましくは、（ｂ）天然ウスニン酸塩は、ラセミ形態または右旋性形態Ｄ（＋）であり、好ましくは、前記塩は、右旋性形態Ｄ（＋）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％（例えば、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）の重量で存在し、および／または、左旋性形態Ｌ（－）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％）の重量で存在し得る。
【0024】
好ましくは、天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および前記（ｂ）その関連の塩は、１：１０～１０：１（例えば、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１）の重量比で、好ましくは１：５～５：１、より好ましくは１：３～３：１、例えば１：１の重量比で、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）中に存在する。
【0025】
好ましくは、天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩は、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）中に、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）の総重量（混合物Ｍの重量を１０とする）に対して、１：１０～９：１０（例えば、１．５：１０、２：１０、２．５：１０、３：１０、３．５：１０、４：１０、４．５：１０、５：１０、５．５：１０、６：１０、６．５：１０、７：１０、７．５：１０、８：１０、または８．５：１０）、好ましくは１：１０～６：１０、または４：１０～８：１０、の重量で、存在する。
【0026】
ウスニン酸（Ｄ（＋）および／またはＬ（－））の化学名は、２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチル－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジベンゾフランジオン、または、２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオン、である。
【0027】
好ましくは、本発明で使用され得るウスニン酸は、化合物：（＋）－ウスニン酸、２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオン；ウスネア（Ｕｓｎｅａ）由来の（＋）－ウスニン酸；例えば、ＣＡＳが７５６２－６１－０の（＋）－ウスニン酸、ＥＣが２３１－４５６－０の（＋）－ウスニン酸、で表すことができ；好ましくは、本発明で使用され得るウスニン酸ナトリウム塩は、化合物：２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオンの一ナトリウム塩；ＣＡＳ番号：３４７６９－４４－３、ＥＣ：２５２－２０４－６、で表すことができ；好ましくは、前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）ウスニン酸塩の純度は、９５％～９９．９％、好ましくは９６％～９９．５％、より好ましくは９７％～９８％または９８％、例えば９８％（％重量／重量）である。
【0028】
本発明の目的により、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）であって、（ｃ）（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩、および（ｉｉ）シクロデキストリン：α、βおよび／またはγ－シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリン、を含むかまたはそれらかなる、包接化合物（ｃｉ）、を含むかまたはそれらかなる、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）、を提供し、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、医薬として使用されるものであり、好ましくは、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌によって誘発または引き起こされる細菌感染症を治療する方法に使用され、またはウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用されるものである。好ましくは、包接化合物（ｃｉ）を含む混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、コロナウイルスを含むかまたはそれらからなる群から選択されるウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができ、より好ましくは、包接化合物（ｃｉ）は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／または少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質に結合することができる（例えば６Ｍ０Ｊ）。
【0029】
本明細書の文脈において、「包接化合物」との表現は、化合物（ホスト）が、互いに同一または異なる特定の寸法の空洞（キャビティ）（例えば、１つまたは２つまたは３つの空洞、好ましくは１つ）を有し、その中にそれぞれの空洞の寸法と同様の寸法を有する分子（例えば、１つまたは２つまたは３つの分子、好ましくは１つ）の第２の化合物（ゲスト）を割り当てまたは配置または確立することができる、化学的複合体に類似したタイプの化学構造を示すために使用され、ここで、ホストとゲストは、一般的に、ファンデルワールス力などの分子間力、または反対の符号の電荷を帯びたホストとゲスト間の静電結合または相互作用によって、非共有結合的に結合する。
【0030】
「包接化合物」は、例えば、（ａ）および／または（ｂ）と（ｉｉ）シクロデキストリンとを、所定の重量比で接触させ、好ましくは、粉末または顆粒またはフレークの形態で、例えば、ボールミルなどの機械的混合を行うことができる装置内で所定の時間、（ａ）および／または（ｂ）と（ｉｉ）シクロデキストリンとを混合することにより、（ｃｉ）を生成することによって、得ることができる。シクロデキストリンは、６、７、または８個のＤ－（＋）グルコピラノースモノマーがα，１－４グルコシド結合で結合し、互いに同一または異なる所定の寸法の空洞（例えば、１つまたは２つの空洞）を有する環で閉じることによって形成される、天然の環状オリゴ糖である。
【0031】
本発明の包接化合物（ｃｉ）において、シクロデキストリン（ｉｉ）は、例えば、ボールミルによって与えられる、機械的衝撃および／または混合力によって提供される、エネルギーによって、ウスニン酸（ａ）またはその塩（ｂ）またはそれらの混合物などの前記（ｉ）を収容可能な親油性の空洞を定める、分子ケージを形成する。
【0032】
好ましくは、包接化合物（ｃｉ）に使用されるシクロデキストリン（ｉｉ）は、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリンおよびそれらの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される。より好ましくは、前記シクロデキストリン（ｉｉ）は、β－シクロデキストリンである。
【0033】
好ましくは、（ａ）および／または（ｂ）とともに包接化合物（ｃｉ）に含まれる前記少なくとも１つのシクロデキストリン（ｉｉ）は、β－シクロデキストリンであり、好ましくは、それは、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンであり、少なくとも１つのシクロデキストリン（ｉｉ）は、前記（ａ）および／または前記（ｂ）に対して（すなわち、［（ｉｉ）：（ａ）］または［（ｉｉ）：［（ａ）＋（ｂ）］］）、重量比で、３：１～１：３で、好ましくは２：１～１：２で、より好ましくは１．５：１～１：１．５で、さらにより好ましくは１：１で、前記包接化合物（ｃｉ）中に存在する。本発明において使用され得る（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンの例は、約１３５０～１３８０から１４６０～１４８０の平均分子量を有する、および／またはＣＡＳ番号１２８４４６－３５－５である、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンである。
【0034】
好ましい実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、前記（ａ）ウスニン酸（またはその塩）および（ｉｉ）β－シクロデキストリン、好ましくは、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン、を含むかまたはそれらからなる、前記（ｃ）包接化合物（ｃｉ）からなる。
【0035】
好ましい実施形態において、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、前記（ａ）ウスニン酸（またはその塩）および前記（ｉｉ）β－シクロデキストリン（好ましくは（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン）を含むかまたはそれらからなる前記（ｃ）包接化合物（ｃｉ）からなり、前記（ａ）ウスニン酸および前記（ｉｉ）β－シクロデキストリンは、［（ａ）：（ｉｉ）］の重量比において（ウスニン酸：シクロデキストリン）、１：５～５：１、好ましくは１：３～３：１、より好ましくは１：２～２：１、例えば約１：１または１：２で、存在する。
【0036】
包接化合物（ｃｉ）の例によれば、（ａ）ウスニン酸（またはその塩）および（ｉｉ）β－シクロデキストリン（好ましくは（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリン）を、［（ａ）：（ｉｉ）］の重量比において、約１：１または１：２で含むかまたはそれらからなり、好ましくは、前記（ａ）ウスニン酸は、実質的に純粋なエナンチオマーとしてのＤ（＋）ウスニン酸であり、そして、前記（ｉｉ）β－シクロデキストリンは、β－シクロデキストリン ＝ （２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンである。
【0037】
好ましくは、記載される実施形態のいずれか１つによる混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、固体または半固体の状態、分散または懸濁した形態、ゲルの形態、または液体状態であってもよく、好ましくは、混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、フレーク、顆粒、粉末、ペレットの形態であってもよく、あるいは、水溶液もしくは水アルコール溶液、あるいは有機溶媒中、例えば、水性スプレー溶液（噴霧することができる（スプレー可能））であってもよい。
【0038】
好ましくは、天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩は、０．１または１ミクロンから１００ミクロン（例えば、０．５μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、または９０μｍ）、好ましくは５ミクロン～５０ミクロン、より好ましくは１０ミクロン～２０ミクロン（ミクロン＝μｍ、１μｍ＝１０－６ｍ、細胞の寸法は約１０μｍ～約５０μｍの大きさオーダーである）の平均粒径を有する粉末固体の形態である。
【0039】
一実施形態において、記載される実施形態のいずれか１つによる混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、ヒトまたは獣医学の分野において、抗菌剤、抗菌増殖剤、静菌剤、殺菌剤、抗カビ剤、抗酵母剤（例えばカンジダ）、抗真菌薬または抗真菌剤（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）として使用するためのものであり、好ましくは、グラム陽性菌および／またはグラム陽性菌に対して、例えば、科学的名称が、クレブシエラ（Klebsiella）、腸内細菌科細菌（Enterobatteriacee）、エンテロバクター（Enterobacter）、シュードモナス（Pseudonomas）、およびエシェリキア（Escherichia）に対して、使用するためのものである。
【0040】
記載された実施形態のいずれか１つによる混合物Ｍ（または混合物Ｍを含む組成物）は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する抗菌剤または静菌剤としても使用され、ここで、細菌は、好ましくは、大腸菌（Escherichia Coli）、クレブシエラ（Klebsiella）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、エンテロコッカス（Enterococcus）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス種（Vancomycin-resistant Enterococcus spp.）（ＶＲＥ）、アクチノバクター（Actinobacter）、アクチノバクター種（Actinobacter spp.）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、およびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0041】
有利には、本発明において（例えば、包接化合物（ｃｉ）において）使用され得るウスニン酸および／またはその関連の塩は、地衣類（ライケン）（lichens）から抽出され、好ましくは、前記地衣類は、ウスネア（Usnea）、クラドニア（Cladonia）、ヒポトラキナ（Hypotrachyna）、レカノラ（Lecanora）、ラマリナ（Ramalina）、エバーニア（Evernia）、パーメリア（Parmelia）、アレクトリア（Alectoria）、およびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択され、より好ましくは、前記地衣類は、ウスネア（Usnea）（サルオガセ）から、より好ましくは、ウスネア・ロンギッシマ・アク（Usnea longissima Ach）（ナガサルオガセ）から選択される。
【0042】
本発明の包接化合物（ｃｉ）において、前記シクロデキストリン（ｉｉ）は、β－シクロデキストリンを含むかまたはβ－シクロデキストリンからなり、好ましくは、シクロデキストリン（ｉｉ）は、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンであり、より好ましくは、（ｉｉ）：（ｉ）の重量比が、約１：１に等しい。
【0043】
包接化合物（ｃｉ）は、前記（ｉｉ）シクロデキストリンと一緒に、前記（ａ）ウスニン酸、好ましくは純粋なエナンチオマー（または実質的に純粋なエナンチオマー）としてのＤ（＋）－ウスニン酸、またはその関連の塩の、固体粒子を含み、前記固体粒子は、０．０１μｍ～５０μｍ（例えば、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、または４０μｍ）、好ましくは０．１μｍ～３０μｍ、より好ましくは０．１５μｍ～２０μｍ、さらに好ましくは０．２μｍ～１５μｍの、平均粒径分布を有する。
【0044】
（ａ）ウスニン酸の平均粒径分布は、例えば、ＧＢ／Ｔ １９０７７－２０１６規格に従って、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ３０００装置を使用するレーザー回折法を用いて、測定および決定することができる。前記規格は、本特許出願の実際に有効なバージョンを意味する。
【0045】
好ましくは、（ａ）ウスニン酸の固体粒子は、Ｄ１０＝０．２３６μｍ、Ｄ５０＝１．５７０μｍ、およびＤ９０＝３１．８００μｍなどの平均粒径分布を有する。
【0046】
本発明の一実施形態において、前記固体粒子は、図８のチャートに従った分布を有する。
【0047】
本発明の目的により、混合物Ｍを含み、および、任意に、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を含んでもよい、組成物であって、医薬として使用するための組成物、を提供する。
【0048】
一実施形態において、前記組成物は、医薬組成物、規則（ＥＵ）２０１７／７４５に従った医療機器組成物、特殊医療用食品（ＦＳＭＰ）用の組成物、規則（ＥＵ）２０１５／２２８３に従った新規食品用の組成物、または食品（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ）用もしくは栄養補助食品用の組成物である。
【0049】
一実施形態において、前記組成物は、内服用、外用、非経口、局所、皮膚科学的に使用のためのものであり；または、組織、真皮、または粘膜に使用するためのものであり；または、口、鼻、眼に使用するためのものであり、または、外耳道、喉、気管、食道、目、鼻、または耳に使用するためのものであり；または、口腔粘膜、鼻粘膜、眼粘膜、または外耳道に使用するためのものであり；または、胃、腸、胃腸に使用するためのものであり；または、膣または直腸に使用するためのものであり、これらは、ヒトおよび動物のためにヒトと獣医学の両方の分野においてものである。
【0050】
好ましくは、前記組成物は、錠剤、チュアブル錠、口内溶解錠、顆粒、粉末、フレーク、可溶性または水溶性の粉末または顆粒、口内溶解性の粉末または顆粒、カプセルから選択される、固体形態であるか；または、溶液、懸濁液、分散液、エマルション、スプレーの形態で分配できる液体、経口スプレーまたは鼻スプレー、経口吸入用の乾燥粉末、エアロゾル、経口エアロゾルまたは鼻エアロゾル、シロップ、から選択される、液体形態であるか；または、ソフトゲル、ゲル、軟膏、クリーム、および、局所（皮膚）、経口、眼または鼻用のクリーム、から選択される、半液体または半固体の形態である。
【0051】
一実施形態において、本発明の組成物は、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸またはその塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ビタミン、アミノ酸、抗酸化剤、シリカ、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポロキサマー、ファイバー、イヌリン、マルトデキストリン、脂肪、ワックス、油、動物油、植物油、ワセリン、炭酸塩、重炭酸塩、アンモニウム塩、塩化ナトリウム、クレー、カオリン、抗酸化剤、例えば、グルタチオン、ケルセチン、コエンザイムＱ１０、またはビタミン、特にグループＣまたはＥのビタミン、例えばトコフェロールおよびトコトリエノール、植物由来のトコトリエノール、例えば、米由来のトコトリエノールなど、保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸カリウム、またはソルビン酸ナトリウムまたはソルビン酸カリウムなど、無機塩（mineral salts）、塩化ナトリウム、および、ｐＨ緩衝剤、例えば、クエン酸およびその可溶性塩、例えばクエン酸一水和物など、から選択される、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤を使用して、製剤化されている。
【0052】
本発明の主題である組成物の好ましい実施形態は、噴霧器またはスプレー缶を使用して投与される水性液体溶液を提供することを目的とする。前記組成物は、液体組成物が、例えば約２０℃または５℃の室温で、例えば３６℃から４０℃の体温を有する対象に経鼻経路を通じて適用されると、液体水性組成物を室温にしてゲルの粘稠度にすることを可能にする、食品または医薬品グレードの添加剤および／または賦形剤を使用して、製剤化される。例えば、それらは、（ａ）および／または（ｂ）および（ｉｉ）シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびトコトリエノール、好ましくは、米由来のトコトリエノールによって、霧化され、組み合わされ、または会合される、水性組成物で用いられ得る。好ましくは、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）由来のトコトリエノールは、例えば、トコトリエノール含有量が、５重量％～７５重量％、好ましくは１５重量％～６０重量％、例えば、２５重量％、または３０重量％、または４０重量％、または５０重量％である、水分散性粉末の形態であってもよい（商品名ＴｈｅｒａＰｒｉｍＥ（登録商標）－ＢＧＧの製品）。水分散性粉末は、トコトリエノールとともに、好ましくは、マルトデキストリン（９０５０－３６－６）、デンプンおよび二酸化ケイ素ＳｉＯ２（７６３１－８６－９）を含んでもよい。好ましくは、水分散性粉末は、３０％～６０％の米ぬか油抽出物、２５％～４５％の加工デンプン、２０％～４０％のマルトデキストリン、および０．２％～１．５％のＳｉＯ２を含んでもよい。好ましくは、トコトリエノールとトコフェロールの混合物を総量で１５重量％～６０重量％、例えば、２５％、または３０％、または４０％、または５０％含む、水分散性粉末を使用することができ、好ましくは、混合物中の総含量が２５重量％の場合には、例えば、トコトリエノールの量が約１０重量％であってトコフェロールの量が約１５重量％（ＨＰＬＣによって測定される量）であってよく、一方、混合物中の総含量が３０重量％の場合には、トコトリエノールの量が約１５重量％であってトコフェロールの量が約１５重量％であってよく、１００％における残りの部分は、デンプン、マルトデキストリン、ＳｉＯ２およびその他であり得る。本発明のウスニン酸Ｄ（＋）は、好ましくは、１９０℃～２１０℃、好ましくは１９２℃～１９８℃の、融点（ＤＳＣ）；４８０°～５４０°、好ましくは４９０°～５２０°の、分子旋光度；ＰＳＤ値：１ミクロン～１５ミクロン、好ましくは２ミクロン～１０ミクロン、例えば５ミクロンの、Ｄ５０、を有していてもよい。好ましくは、ウスニン酸は、病原体に対する低濃度ＭＩＣ、例えば、５００ｐｐｍ以下の黄色ブドウ球菌ＭＩＣおよび１０００ｐｐｍ以下の大腸菌ＭＩＣ、を有する。
【0053】
本発明の主題である組成物の好ましい実施形態は、下記の表に示すような水性液体溶液を提供することを目的とする。
【表1】
【0054】
一実施形態において、本発明の組成物は、例えば上記の表に記載されているものと同様に、水溶液の形態であり、
９０重量％～９９．５重量％、好ましくは９４重量％～９９重量％の、水、好ましくは脱塩水；
０．０００１重量％～０．５重量％、好ましくは０．０１～０．２５重量％の、好ましくはＤ（＋）の形態である、（ａ）ウスニン酸および／または（ｂ）ウスニン酸塩および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはそれらの混合物；
０．２５重量％～２．５重量％、好ましくは０．５重量％～１．５重量％の、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポロキサマー、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、ポリマー；
グルタチオン、ケルセチン、コエンザイムＱ１０、ビタミン、特にグループＣまたはＥのビタミン、例えばトコフェロールおよびトコトリエノール、好ましくは植物由来のトコトリエノール、例えば米由来のトコトリエノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、抗酸化活性を有する化合物；
好ましくは、当産業で一般的に使用される、無機塩、保存剤、およびｐＨ緩衝剤または安定剤、
を含む、または、それらからなる。
９０重量％～９９．５重量％、好ましくは９４重量％～９９重量％の、水、好ましくは脱塩水；
０．０００１重量％～０．５重量％、好ましくは０．０１～０．２５重量％の、好ましくはＤ（＋）の形態である、（ａ）ウスニン酸および／または（ｂ）ウスニン酸塩および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはそれらの混合物；
０．２５重量％～２．５重量％、好ましくは０．５重量％～１．５重量％の、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポロキサマー、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、ポリマー；
グルタチオン、ケルセチン、コエンザイムＱ１０、ビタミン、特にグループＣまたはＥのビタミン、例えばトコフェロールおよびトコトリエノール、好ましくは植物由来のトコトリエノール、例えば米由来のトコトリエノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、抗酸化活性を有する化合物；
好ましくは、当産業で一般的に使用される、無機塩、保存剤、およびｐＨ緩衝剤または安定剤、
を含む、または、それらからなる。
【0055】
水溶液の形態の前記組成物は、好ましくは、２０℃で約２４０±４０の粘度値（ｍＰａ・ｓ）；約５±０．２のｐＨ値；約１．０１±０．１ｇ／ｃｃの密度値を有してよく、微生物学的負荷（総負荷、酵母、カビ、２つの病原体（黄色ブドウ球菌およびシュードモナス））において、総負荷が１００ＣＦＵ以下、酵母が１００ＣＦＵ以下、カビが１０ＣＦＵ以下、および病原菌が存在しない、性状を有していてよい。
【0056】
好ましくは、本発明の組成物（例えば、上記の表に記載されているものと同様）は、下記の工程：
１）粉末、好ましくは活性成分（ａ）および／または（ｂ）および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）、およびポリマーＣＭＣ、またはＨＰＣ、またはＨＰＭＣを、好ましくは９０℃～１５０℃、より好ましくは１００℃～１１０℃の温度で、乾燥する工程；
２）工程１）により得た粉末を、予め５０℃～９０℃、好ましくは６０℃～８０℃±２℃の温度に加熱した適量の水、例えば１００リットルの脱塩水に、加えて、溶液を得る工程；
３）工程２）により得た溶液を、好ましくはマグネティックミキサーを用いて、例えば３０分～２４０分、好ましくは６０分～１２０分の時間混合して、最終の水溶液を得る工程；および、任意に行われ得る
４）ｐＨ値を５±０．１～７±０．１、好ましくは５．５±０．１～６．５±０．１の値に制御および調整して、最終の溶液（本発明の主題）を得る工程、
を含む、または、からなる製造方法を用いて、製造することができる。
好ましくは、前記最終の溶液は、特に前記溶液が経鼻経路を通して適用される場合、対象の体温と接触するとゲルまたはクリームと同様の粘稠度となるスプレー溶液を得るために、例えばアトマイザー容器に包装するように準備される。
１）粉末、好ましくは活性成分（ａ）および／または（ｂ）および／または（ｃ）包接化合物（ｃｉ）、およびポリマーＣＭＣ、またはＨＰＣ、またはＨＰＭＣを、好ましくは９０℃～１５０℃、より好ましくは１００℃～１１０℃の温度で、乾燥する工程；
２）工程１）により得た粉末を、予め５０℃～９０℃、好ましくは６０℃～８０℃±２℃の温度に加熱した適量の水、例えば１００リットルの脱塩水に、加えて、溶液を得る工程；
３）工程２）により得た溶液を、好ましくはマグネティックミキサーを用いて、例えば３０分～２４０分、好ましくは６０分～１２０分の時間混合して、最終の水溶液を得る工程；および、任意に行われ得る
４）ｐＨ値を５±０．１～７±０．１、好ましくは５．５±０．１～６．５±０．１の値に制御および調整して、最終の溶液（本発明の主題）を得る工程、
を含む、または、からなる製造方法を用いて、製造することができる。
好ましくは、前記最終の溶液は、特に前記溶液が経鼻経路を通して適用される場合、対象の体温と接触するとゲルまたはクリームと同様の粘稠度となるスプレー溶液を得るために、例えばアトマイザー容器に包装するように準備される。
【0057】
添付の図７は、天然由来のウスニン酸、好ましくは、Ｄ（＋）－ウスニン酸を得るプロセスの一実施形態のフローチャートを概略的に示している。この方法の実施形態によれば、乾燥形態のウスニン酸は、下記の工程：
（ａ．１）地衣類（lichens）、好ましくは、ウスネア（Usnea）、クラドニア（Cladonia）、ヒポトラキナ（Hypotrachyna）、レカノラ（Lecanora）、ラマリナ（Ramalina）、エバーニア（Evernia）、パーメリア（Parmelia）、アレクトリア（Alectoria）、およびそれらの組み合わせ、好ましくはウスネア、より好ましくはウスネア・ロンギッシマ・アク（Usnea longissima Ach）、を含むかそれらからなる群から選択される地衣類、から選択される植物材料から、有機溶媒、好ましくは、ベンゼン、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、またはアルコール溶媒、より好ましくはエタノール、を含むかそれらからなる群から選択される溶媒を用いて、浸漬し、抽出して、抽出溶液を得て、そして、前記抽出溶液を濃縮して濃縮抽出溶液および残留溶媒を得る工程、
（ａ．２）工程（ａ．１）により得られた濃縮抽出溶液を結晶化および濾過し、結晶化および濾過された抽出生成物を得る工程；
（ａ．３）工程（ａ．２）により得られた、結晶化および濾過された抽出生成物を、溶解、濾過および濃縮して、濃縮抽出物および残留溶媒を得る工程；
（ａ．４）工程（ａ．３）により得られた濃縮抽出物を、結晶化、濾過し、続いて乾燥および粉砕して、好ましくは８０％～９９．９％、より好ましくは９０％～９９．５％、さらにより好ましくは９５％～９８％の（％重量／重量または％体積／体積）、力価を有する、ウスニン酸の乾燥粉砕抽出物を得る工程、
によって得られる。
（ａ．１）地衣類（lichens）、好ましくは、ウスネア（Usnea）、クラドニア（Cladonia）、ヒポトラキナ（Hypotrachyna）、レカノラ（Lecanora）、ラマリナ（Ramalina）、エバーニア（Evernia）、パーメリア（Parmelia）、アレクトリア（Alectoria）、およびそれらの組み合わせ、好ましくはウスネア、より好ましくはウスネア・ロンギッシマ・アク（Usnea longissima Ach）、を含むかそれらからなる群から選択される地衣類、から選択される植物材料から、有機溶媒、好ましくは、ベンゼン、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、またはアルコール溶媒、より好ましくはエタノール、を含むかそれらからなる群から選択される溶媒を用いて、浸漬し、抽出して、抽出溶液を得て、そして、前記抽出溶液を濃縮して濃縮抽出溶液および残留溶媒を得る工程、
（ａ．２）工程（ａ．１）により得られた濃縮抽出溶液を結晶化および濾過し、結晶化および濾過された抽出生成物を得る工程；
（ａ．３）工程（ａ．２）により得られた、結晶化および濾過された抽出生成物を、溶解、濾過および濃縮して、濃縮抽出物および残留溶媒を得る工程；
（ａ．４）工程（ａ．３）により得られた濃縮抽出物を、結晶化、濾過し、続いて乾燥および粉砕して、好ましくは８０％～９９．９％、より好ましくは９０％～９９．５％、さらにより好ましくは９５％～９８％の（％重量／重量または％体積／体積）、力価を有する、ウスニン酸の乾燥粉砕抽出物を得る工程、
によって得られる。
【0058】
工程（ａ．１）の浸漬および抽出は、好ましくは、撹拌および加熱手段を備えた、好ましくはステンレス鋼製の抽出タンク内で行われる。好ましくは、工程（ａ．１）の浸漬および抽出において、［植物材料の重量］：［有機溶媒の体積］比は、１０：１～１：５０、好ましくは５：１～１：４０、より好ましくは１：１～１：３５で、使用される。工程（ａ．１）の浸漬および抽出は、好ましくは、周囲圧力、および１０℃～８０℃、好ましくは２０℃～７０℃、より好ましくは２５℃～６０℃の温度で、行われる。
【0059】
工程（ａ．１）において、ウスネア（Usnea Longissima Ach）の葉状体（thallus）（新芽（sprout）または若枝（scion））は、好ましくは酢酸エチル溶媒とともに、例えば植物部分３５０ｋｇおよび溶媒２６００リットルの量で、使用される。浸漬は、好ましくは、約２５℃の温度および１気圧の圧力で、２時間～１０時間、好ましくは４時間～８時間、例えば５時間～６時間の時間、実施される。浸漬は、液体を撹拌し、加熱し、再循環するための手段を備えた反応器内で実施することができる。例えば、浸漬は、植物部分上に蒸留物（溶媒）を連続的に再循環させることによって行われる。単一工程として行われる抽出は、好ましくは約２５℃の温度および１気圧の圧力で行われる。植物部分から抽出されるウスニン酸を含む、使用された抽出溶媒の濃縮は、好ましくは、酢酸エチルの沸点である約７７．１℃を考慮し、また抽出圧力の影響も考慮して、実施される。濃厚な濃縮液体と溶媒のほぼ完全な回収が得られる。
【0060】
工程（ａ．１）に続く工程（ａ．２）の結晶化および濾過において、結晶化および濾過された抽出生成物を得るために、ベンゼン、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、またはアルコール溶媒、より好ましくはエタノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、有機溶媒が、好ましく使用される。工程（ａ．２）の結晶化および濾過では、［濃縮抽出溶液］：［有機溶媒］は、体積比で、１０：１～１：４０、好ましくは５：１～１：３０、より好ましくは１：１～１：２０で、使用されることが好ましい。工程（ａ．２）の結晶化において、工程（ａ．１）から得られた濃縮抽出溶液は、結晶化を促進するために好ましくは冷却され、より好ましくは周囲圧力で１℃～２０℃の温度、さらにより好ましくは周囲圧力で５℃～１５℃の温度で、冷却される。工程（ａ．２）の終わりに、少なくとも８０％、８５％～９０％の純度を有し、約３５０ｋｇの植物部分から出発する場合には約２０ｋｇの量の結晶材料が得られる。
【0061】
工程（ａ．２）に続く工程（ａ．３）において、工程（ａ．２）から得られた結晶化および濾過された抽出生成物を、溶解し、濾過し、濃縮して、濃縮抽出物および残留溶媒を得る。工程（ａ．３）において、有機溶媒、好ましくは、ベンゼン、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、またはアルコール溶媒、より好ましくはエタノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、有機溶媒が、好ましく使用される。工程（ａ．３）の溶解では、［結晶化および濾過された抽出生成物の重量］：［有機溶媒の体積］の比が、１０：１～１：４０、好ましくは５：１～１：３０、より好ましくは１：１～１：２０で、使用されることが好ましい。工程（ａ．３）において、それらをクロロホルム２×２０ｋｇに溶解して、最低純度９８％のウスニン酸２０ｋｇが得られる。
【0062】
工程（ａ．３）に続く工程（ａ．４）において、工程（ａ．３）から得られた濃縮抽出物を、結晶化し、濾過し、続いて乾燥および粉砕して、ウスニン酸の乾燥粉砕抽出物を得る。工程（ａ．４）の結晶化では、有機溶媒、好ましくは、ベンゼン、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、トリクロロエチレン、またはアルコール溶媒、より好ましくはエタノール、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、有機溶媒が、好ましく使用される。工程（ａ．４）の結晶化では、［濃縮抽出物の重量］：［有機溶媒の体積］の比が、１０：１～１：４０、好ましくは５：１～１：３０、より好ましくは１：１～１：２０で、使用されることが好ましい。工程（ａ．４）の結晶化において、工程（ａ．３）から得られた濃縮抽出物は、結晶化を促進するために好ましくは冷却され、より好ましくは周囲圧力で１℃～２０℃の温度、さらに好ましくは周囲圧力で５℃～１５℃の温度で、冷却される。工程（ａ．４）の乾燥は、残留溶媒含量が、ウスニン酸の乾燥抽出物の総重量に対して、０．５重量％～１０重量％、好ましくは１重量％～５重量％、より好ましくは１．５重量％～３重量％になるまで行われることが好ましい。好ましくは、工程（ａ．４）の粉砕は、ミル、より好ましくはロータリーボールミルを用いて行われる。工程（ａ．４）から得られた濾過および結晶化された固体の乾燥は、例えば、残留溶媒含有量が、初期重量に対して約２重量％～５重量％となって残ったときに終了する。プレート乾燥機（減圧装置なし）を、好ましくは約９５℃～９９℃の温度で、空気を循環させながら使用する。粉砕された固体は、例えば、２０メッシュから４０メッシュの平均粒径分布を有し、９８重量％のウスニン酸を含有する（シグマ・アルドリッチ法によるＨＰＬＣ）。プロセスの開始時に２×３５０ｋｇの植物部分（出発材料）から出発して、プロセスの終了時に、約３％～４％の収率で材料（乾燥固体）を得ることができ、これは、含有量が９８重量％（１３．７２ｋｇ－２７．４４ｋｇ）のウスニン酸約１４ｋｇ－２８ｋｇに相当する。得られたウスニン酸は、Ｄ（＋）形態９９．９％の純粋なウスニン酸、または、ラセミ体である。
【0063】
ウスニン酸の乾燥粉砕抽出物（工程（ａ．４））をラセミ混合物として得た後、前記乾燥抽出物を、シクロデキストリン、好ましくはβ－シクロデキストリンと選択的に複合体化し、前記の包接化合物（ｃｉ）を得る。好ましくは、前記選択的複合体は、ウスニン酸またはその塩あるいはそれらの混合物（ｉ）と、シクロデキストリン（ｉｉ）を共沈（co-precipitation）させることによって得られる。包接化合物（ｃｉ）は、好ましくは、ウスニン酸（好ましくはＤ（＋）－ウスニン酸）またはその塩あるいはそれらの混合物（ｉ）と、シクロデキストリン（ｉｉ）、好ましくはβ－シクロデキストリンとを、共沈させることにより得られる。例えば、シクロデキストリン（ｉｉ）をまず、水または他の適切な水性溶媒に溶解し、続いてシクロデキストリン（ｉｉ）を含む水溶液を撹拌しながら、工程（ａ．４）のウスニン酸の乾燥粉砕抽出物を加える。溶液中の十分に高濃度のシクロデキストリン（ｉｉ）の存在下では、シクロデキストリン（ｉｉ）によるウスニン酸またはその塩あるいはそれらの混合物（ｉ）の複合体形成反応が徐々に進行するにつれて、包接化合物（ｃｉ）の沈殿が始まる。好ましくは、包接化合物（ｃｉ）を含む溶液は、沈殿を開始させるために、好ましくは撹拌しながら、１℃～１８℃の温度に冷却する必要があり得る。包接化合物（ｃｉ）は、デカンテーション、遠心分離、または濾過によって収集することができる。包接化合物（inclusion compound）（ｃｉ）は、好ましくは水溶性包接化合物（water-soluble clathrate）または水懸濁性包接化合物（water-suspendable clathrate）であり、前記ウスニン酸（純粋なエナンチオマーＤ（＋）として、またはラセミ体として）またはその塩、またはそれらの混合物（ｉ）は、該Ｄ－ウスニン酸またはその塩またはそれらの混合物（ｉ）が前記シクロデキストリン（ｉｉ）と接触すると、前記包接化合物の空洞内（キャビティ）にホストされる。
【0064】
本発明の実施形態（ＦＲｎ）を以下に報告する。
ＦＲ１．
少なくとも１つのウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するための混合物Ｍであって、
（ａ）ウスニン酸、および／または、
（ｂ）その関連の塩、および／または、
（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含む、または、からなる包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、
を含む、または、からなる、混合物Ｍ。
ＦＲ２．
混合物Ｍが、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するためのものであり、より好ましくは、混合物Ｍは、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができる、ＦＲ１に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ３．
混合物Ｍが、前記（ｃ）包接化合物（ｃｉ）を含むかまたはそれからなり、
包接化合物（ｃｉ）は、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含むかまたはそれらからなる、ＦＲ１またはＦＲ２に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ４．
前記（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリンが、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなる、ＦＲ１～ＦＲ３のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ５．
前記（ｉｉ）少なくとも１つのβ－シクロデキストリンが、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなる、ＦＲ４に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ６．
包接化合物（ｃｉ）において、（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンと、（ｉ）ウスニン酸および／またはその関連の塩との重量比［（ｉｉ）：（ｉ）］が、３：１～１：３、好ましくは２：１～１：２、より好ましくは１．５：１～１：１．５、さらにより好ましくは１：１である、ＦＲ１～ＦＲ５のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ７．
前記（ａ）ウスニン酸が天然由来であり；好ましくは、混合物Ｍは、ヒトおよび動物に影響を与えるウイルス感染症を治療する方法において経口で使用のためのものであり；より好ましくはヒトの分野での経口使用のものである、ＦＲ１～ＦＲ６のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ８．
呼吸器系のウイルス感染、および前記ウイルス感染に由来するかそれに関連する症状および／または障害を治療する方法に使用するための混合物Ｍであって、好ましくは、上気道および／または下気道のウイルス感染症のためのものである、ＦＲ１～ＦＲ７のいずれか１つに記載の混合物Ｍ
ＦＲ９．
前記ウイルス感染症が、コロナウイルス科、亜科：コロナウイルス科、属：ベータコロナウイルス、種：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、株：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または２０１９－ｎＣｏＶ）、およびＣＯＶＩＤ－１９疾患の原因となるウイルス、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス様ＳＡＲＳ－ＣｏＶ様またはＳＬ－ＣｏＶ）、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、から選択されるものである、ウイルスによって誘発または引き起こされる、ＦＲ８に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１０．
混合物Ｍが、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と結合することができ；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質と結合することができる、ＦＲ８またはＦＲ９に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１．
少なくとも１つのウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するための混合物Ｍであって、
（ａ）ウスニン酸、および／または、
（ｂ）その関連の塩、および／または、
（ｃ）包接化合物（ｃｉ）またはその混合物であって、包接化合物（ｃｉ）が、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含む、または、からなる包接化合物（ｃｉ）またはその混合物、
を含む、または、からなる、混合物Ｍ。
ＦＲ２．
混合物Ｍが、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって誘発または引き起こされるウイルス感染症を治療する方法に使用するためのものであり、より好ましくは、混合物Ｍは、コロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を阻害することができる、ＦＲ１に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ３．
混合物Ｍが、前記（ｃ）包接化合物（ｃｉ）を含むかまたはそれからなり、
包接化合物（ｃｉ）は、
（ｉ）前記（ａ）ウスニン酸、および／または前記（ｂ）その関連の塩、および、
（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、
を含むかまたはそれらからなる、ＦＲ１またはＦＲ２に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ４．
前記（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリンが、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなる、ＦＲ１～ＦＲ３のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ５．
前記（ｉｉ）少なくとも１つのβ－シクロデキストリンが、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなる、ＦＲ４に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ６．
包接化合物（ｃｉ）において、（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンと、（ｉ）ウスニン酸および／またはその関連の塩との重量比［（ｉｉ）：（ｉ）］が、３：１～１：３、好ましくは２：１～１：２、より好ましくは１．５：１～１：１．５、さらにより好ましくは１：１である、ＦＲ１～ＦＲ５のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ７．
前記（ａ）ウスニン酸が天然由来であり；好ましくは、混合物Ｍは、ヒトおよび動物に影響を与えるウイルス感染症を治療する方法において経口で使用のためのものであり；より好ましくはヒトの分野での経口使用のものである、ＦＲ１～ＦＲ６のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ８．
呼吸器系のウイルス感染、および前記ウイルス感染に由来するかそれに関連する症状および／または障害を治療する方法に使用するための混合物Ｍであって、好ましくは、上気道および／または下気道のウイルス感染症のためのものである、ＦＲ１～ＦＲ７のいずれか１つに記載の混合物Ｍ
ＦＲ９．
前記ウイルス感染症が、コロナウイルス科、亜科：コロナウイルス科、属：ベータコロナウイルス、種：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、株：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または２０１９－ｎＣｏＶ）、およびＣＯＶＩＤ－１９疾患の原因となるウイルス、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス様ＳＡＲＳ－ＣｏＶ様またはＳＬ－ＣｏＶ）、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、から選択されるものである、ウイルスによって誘発または引き起こされる、ＦＲ８に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１０．
混合物Ｍが、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プロテアーゼおよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と結合することができ；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤスパイクタンパク質と結合することができる、ＦＲ８またはＦＲ９に記載の混合物Ｍ。
【0065】
ＦＲ１１．
呼吸器系のウイルス感染に由来するかまたはそれに関連する症状および／または障害が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、呼吸器合併症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、咳、百日咳、肺炎、胸膜炎、細気管支炎、風邪、副鼻腔炎、鼻炎、気管炎、咽頭炎、喉頭炎、急性喉頭気管気管支炎、喉頭蓋炎、気管支拡張症、呼吸困難、呼吸不全、息切れ、息苦しさ、発熱、倦怠感、筋肉痛、筋肉疲労、鼻づまり、鼻水、喉の痛み、胃腸症状、吐き気、下痢、腎不全、食欲不振、全身倦怠感倦怠、から選択される、ＦＲ１～ＦＲ１０のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１２．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸が、右旋性の天然ウスニン酸Ｄ（＋）と左旋性の天然ウスニン酸Ｌ（－）との組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）であり；好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）は、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％含まれ、および／または、左旋性形態Ｌ（－）は、組み合わせまたは会合体の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％含まれる、ＦＲ１～ＦＲ１１のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１３．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸が、５０％（＋）および５０％（－）のラセミ形である、または、実質的に１００％の右旋性形態Ｄ（＋）である、ＦＲ１～ＦＲ１２のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１４．
天然由来の前記（ｂ）ウスニン酸の塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であり；好ましくは、天然由来のウスニン酸塩は、ウスニン酸ナトリウム塩である、ＦＲ１～ＦＲ１３のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１５．
（ｂ）天然ウスニン酸塩が、ラセミ形、または、右旋性形Ｄ（＋）であり；好ましくは、前記塩は、右旋性形態Ｄ（＋）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％の量で存在してよく、および／または、左旋性形態Ｌ（－）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％の量で存在してよい、ＦＲ１～ＦＲ１４のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１６．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および前記（ｂ）その関連の塩が、重量比［（ａ）：（ｂ）］において、１：１０～１０：１、好ましくは１：５～５：１、より好ましくは１：３～３：１または１：１で存在する、ＦＲ１～ＦＲ１５のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１７．
ウスニン酸が、化合物：（＋）－ウスニン酸、化学名２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオン；ウスネア由来の（＋）－ウスニン酸；ＣＡＳ番号：７５６２－６１－０、ＥＣ：２３１－４５６－０、からなり；好ましくは、ウスニン酸ナトリウム塩が、化合物：２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオンの一ナトリウム塩；ＣＡＳ番号：３４７６９－４４－３、ＥＣ：２５２－２０４－６、からなり；好ましくは、前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）ウスニン酸塩の純度は、９５％～９９．９％、好ましくは９６％～９９．５％、より好ましくは９７％～９８％または９８％（％重量／重量）である、ＦＲ１～ＦＲ１６のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１８．
混合物Mが、固体または半固体の状態、分散または懸濁した形態、ゲルの形態、または液体状態であってよく；好ましくは、混合物Ｍは、フレーク、顆粒、粉末、ペレットの形態であってよく、あるいは、水溶液もしくは水アルコール溶液、あるいは有機溶媒中であってもよい、ＦＲ１～ＦＲ１７のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１９．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩が、１ミクロン～１００ミクロン、好ましくは５ミクロン～５０ミクロン、より好ましくは１０ミクロン～２０ミクロンの平均粒径を有する、粉末固体形態である、ＦＲ１～ＦＲ１８のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２０．
前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩は、地衣類から抽出され、好ましくは、ウスネア、クラドニア、ヒポトラキナ、レカノラ、ラマリナ、エバーニア、パーメリア、アレクトリアおよびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択される地衣類、より好ましくはウスネア、さらにより好ましくはウスネア・ロンギッシマ・アク（Usnea longissima Ach）（ナガサルオガセ）から抽出され、そして、前記少なくとも１つのシクロデキストリン（ｉｉ）は、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなり、好ましくは、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンは、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンである、ＦＲ１～ＦＲ１９のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
呼吸器系のウイルス感染に由来するかまたはそれに関連する症状および／または障害が、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、呼吸器合併症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、咳、百日咳、肺炎、胸膜炎、細気管支炎、風邪、副鼻腔炎、鼻炎、気管炎、咽頭炎、喉頭炎、急性喉頭気管気管支炎、喉頭蓋炎、気管支拡張症、呼吸困難、呼吸不全、息切れ、息苦しさ、発熱、倦怠感、筋肉痛、筋肉疲労、鼻づまり、鼻水、喉の痛み、胃腸症状、吐き気、下痢、腎不全、食欲不振、全身倦怠感倦怠、から選択される、ＦＲ１～ＦＲ１０のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１２．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸が、右旋性の天然ウスニン酸Ｄ（＋）と左旋性の天然ウスニン酸Ｌ（－）との組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）であり；好ましくは、右旋性形態Ｄ（＋）は、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％含まれ、および／または、左旋性形態Ｌ（－）は、組み合わせまたは会合体の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％含まれる、ＦＲ１～ＦＲ１１のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１３．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸が、５０％（＋）および５０％（－）のラセミ形である、または、実質的に１００％の右旋性形態Ｄ（＋）である、ＦＲ１～ＦＲ１２のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１４．
天然由来の前記（ｂ）ウスニン酸の塩が、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であり；好ましくは、天然由来のウスニン酸塩は、ウスニン酸ナトリウム塩である、ＦＲ１～ＦＲ１３のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１５．
（ｂ）天然ウスニン酸塩が、ラセミ形、または、右旋性形Ｄ（＋）であり；好ましくは、前記塩は、右旋性形態Ｄ（＋）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、０．１重量％～９９．９重量％の量で存在してよく、および／または、左旋性形態Ｌ（－）が、組み合わせまたは会合体（Ｃ／Ａ）の総重量に対して、９９．９重量％～０．１重量％の量で存在してよい、ＦＲ１～ＦＲ１４のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１６．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および前記（ｂ）その関連の塩が、重量比［（ａ）：（ｂ）］において、１：１０～１０：１、好ましくは１：５～５：１、より好ましくは１：３～３：１または１：１で存在する、ＦＲ１～ＦＲ１５のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１７．
ウスニン酸が、化合物：（＋）－ウスニン酸、化学名２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオン；ウスネア由来の（＋）－ウスニン酸；ＣＡＳ番号：７５６２－６１－０、ＥＣ：２３１－４５６－０、からなり；好ましくは、ウスニン酸ナトリウム塩が、化合物：２，６－ジアセチル－７，９－ジヒドロキシ－８，９ｂ－ジメチルジベンゾ－１，３（２Ｈ，９ｂＨ）－ジオンの一ナトリウム塩；ＣＡＳ番号：３４７６９－４４－３、ＥＣ：２５２－２０４－６、からなり；好ましくは、前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）ウスニン酸塩の純度は、９５％～９９．９％、好ましくは９６％～９９．５％、より好ましくは９７％～９８％または９８％（％重量／重量）である、ＦＲ１～ＦＲ１６のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１８．
混合物Mが、固体または半固体の状態、分散または懸濁した形態、ゲルの形態、または液体状態であってよく；好ましくは、混合物Ｍは、フレーク、顆粒、粉末、ペレットの形態であってよく、あるいは、水溶液もしくは水アルコール溶液、あるいは有機溶媒中であってもよい、ＦＲ１～ＦＲ１７のいずれか１項に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ１９．
天然由来の前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩が、１ミクロン～１００ミクロン、好ましくは５ミクロン～５０ミクロン、より好ましくは１０ミクロン～２０ミクロンの平均粒径を有する、粉末固体形態である、ＦＲ１～ＦＲ１８のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２０．
前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩は、地衣類から抽出され、好ましくは、ウスネア、クラドニア、ヒポトラキナ、レカノラ、ラマリナ、エバーニア、パーメリア、アレクトリアおよびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択される地衣類、より好ましくはウスネア、さらにより好ましくはウスネア・ロンギッシマ・アク（Usnea longissima Ach）（ナガサルオガセ）から抽出され、そして、前記少なくとも１つのシクロデキストリン（ｉｉ）は、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンを含むかまたはそれからなり、好ましくは、少なくとも１つのβ－シクロデキストリンは、（２－ヒドロキシプロピル）－β－シクロデキストリンである、ＦＲ１～ＦＲ１９のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
【0066】
ＦＲ２１．
前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩と、前記（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンとの重量比［（ａ）および／または（ｂ）：（ｉｉ）］が、実質的に１：１である、ＦＲ２０に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２２．
前記包接化合物（ｃｉ）が、前記（ａ）ウスニン酸、好ましくは実質的に純粋なエナンチオマーとしてのＤ（＋）－ウスニン酸、またはその関連の塩の固体粒子を含み、該固体粒子は、０．０１μｍ～５０μｍ、好ましくは０．１μｍ～３０μｍ、より好ましくは０．１５μｍ～３０μｍ、さらにより好ましくは０．２μｍ～１５μｍの平均粒径分布を有する、ＦＲ１～ＦＲ２１のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２３．
ＦＲ１～ＦＲ２およびＦＲ８～ＦＲ１１のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、ＦＲ１～２２のいずれか１つに記載の混合物Ｍ、および、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤、を含む、組成物。
ＦＲ２４．
前記組成物が、医薬組成物、規則（ＥＵ）２０１７／７４５に従った医療機器組成物、特殊医療用食品（ＦＳＭＰ）用の組成物、規則（ＥＵ）２０１５／２２８３に従った新規食品用の組成物、または食品用の組成物である、ＦＲ２３に記載の組成物。
ＦＲ２５．
組成物が、内服用、外用、非経口、局所、皮膚科学的に使用するものである；または、組織、真皮、または粘膜に使用するためのものである；または、口、鼻、眼に使用するためのものである；または、耳道、喉、気管、食道、目、鼻、耳に使用するためのものである；または、口腔粘膜、鼻粘膜、眼粘膜、または耳道の粘膜に使用するためのものである；または、胃、腸、胃腸に使用するためのものである；または、膣または直腸で使用するためのものである、ＦＲ２３～ＦＲ２４のいずれか１つに記載の組成物。
ＦＲ２６．
該組成物が、
錠剤、チュアブル錠、口内溶解錠、顆粒、粉末、フレーク、可溶性または水溶性の粉末または顆粒、口内溶解性の粉末または顆粒、カプセル、から選択される、固体形態；または、
溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、スプレーの形態で分配できる液体、経口スプレーまたは鼻スプレー、エアロゾル、経口エアロゾルまたは鼻エアロゾル、シロップ、から選択される、液体形態；または、
ソフトゲル、ゲル、軟膏、クリーム、局所用、経口用、または鼻用のクリームから選択される、半液体または半固体の形態、
である、ＦＲ２３～ＦＲ２５のいずれか１つに記載の組成物。
ＦＲ２７．
前記少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤が、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸またはその塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ビタミン、アミノ酸、抗酸化剤、シリカ、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポロキサマー、ファイバー、イヌリン、マルトデキストリン、脂肪、ワックス、油、動物油、植物油、ワセリン、炭酸塩、重炭酸塩、アンモニウム塩、塩化ナトリウム、クレー、カオリン、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、ＦＲ２３～ＦＲ２６のいずれか１つに記載の組成物。
前記（ａ）ウスニン酸および／または前記（ｂ）その関連の塩と、前記（ｉｉ）少なくとも１つのシクロデキストリン、好ましくは少なくとも１つのβ－シクロデキストリンとの重量比［（ａ）および／または（ｂ）：（ｉｉ）］が、実質的に１：１である、ＦＲ２０に記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２２．
前記包接化合物（ｃｉ）が、前記（ａ）ウスニン酸、好ましくは実質的に純粋なエナンチオマーとしてのＤ（＋）－ウスニン酸、またはその関連の塩の固体粒子を含み、該固体粒子は、０．０１μｍ～５０μｍ、好ましくは０．１μｍ～３０μｍ、より好ましくは０．１５μｍ～３０μｍ、さらにより好ましくは０．２μｍ～１５μｍの平均粒径分布を有する、ＦＲ１～ＦＲ２１のいずれか１つに記載の混合物Ｍ。
ＦＲ２３．
ＦＲ１～ＦＲ２およびＦＲ８～ＦＲ１１のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、ＦＲ１～２２のいずれか１つに記載の混合物Ｍ、および、少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤、を含む、組成物。
ＦＲ２４．
前記組成物が、医薬組成物、規則（ＥＵ）２０１７／７４５に従った医療機器組成物、特殊医療用食品（ＦＳＭＰ）用の組成物、規則（ＥＵ）２０１５／２２８３に従った新規食品用の組成物、または食品用の組成物である、ＦＲ２３に記載の組成物。
ＦＲ２５．
組成物が、内服用、外用、非経口、局所、皮膚科学的に使用するものである；または、組織、真皮、または粘膜に使用するためのものである；または、口、鼻、眼に使用するためのものである；または、耳道、喉、気管、食道、目、鼻、耳に使用するためのものである；または、口腔粘膜、鼻粘膜、眼粘膜、または耳道の粘膜に使用するためのものである；または、胃、腸、胃腸に使用するためのものである；または、膣または直腸で使用するためのものである、ＦＲ２３～ＦＲ２４のいずれか１つに記載の組成物。
ＦＲ２６．
該組成物が、
錠剤、チュアブル錠、口内溶解錠、顆粒、粉末、フレーク、可溶性または水溶性の粉末または顆粒、口内溶解性の粉末または顆粒、カプセル、から選択される、固体形態；または、
溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、スプレーの形態で分配できる液体、経口スプレーまたは鼻スプレー、エアロゾル、経口エアロゾルまたは鼻エアロゾル、シロップ、から選択される、液体形態；または、
ソフトゲル、ゲル、軟膏、クリーム、局所用、経口用、または鼻用のクリームから選択される、半液体または半固体の形態、
である、ＦＲ２３～ＦＲ２５のいずれか１つに記載の組成物。
ＦＲ２７．
前記少なくとも１つの許容される医薬品または食品グレードの添加剤および／または賦形剤が、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸またはその塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ビタミン、アミノ酸、抗酸化剤、シリカ、セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポロキサマー、ファイバー、イヌリン、マルトデキストリン、脂肪、ワックス、油、動物油、植物油、ワセリン、炭酸塩、重炭酸塩、アンモニウム塩、塩化ナトリウム、クレー、カオリン、を含むかまたはそれらからなる群から選択される、ＦＲ２３～ＦＲ２６のいずれか１つに記載の組成物。
【実施例】
【0067】
実験パート（Ｉ）
１． 研究デザイン
本インビトロ研究の目的は、ウスニン酸およびβ－シクロデキストリンを含む複合体（本発明による包接複合体）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス効果を評価することである。
この目的のために、Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＣＲＬ－１５８６（ＡＴＣＣ）アフリカミドリザル腎臓細胞株とともにインキュベートしたシュードウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ）に対する本発明の前記複合体の阻害効果を試験した。国際レベルでは、シュードウイルスを含むコロナウイルスが細胞に侵入する際に経由するＡＣＥ２受容体が豊富であるため、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株が選ばれている。コロナウイルスおよびシュードウイルスは、スパイクと称されるウイルスの表面の糖タンパク質を介してＡＣＥ２受容体に結合することが知られている。
試験された本発明の複合体は、ウスニン酸のβ－シクロデキストリンとの複合体（重量比１：１および１：２）である。
このＶｅｒｏ Ｅ６細胞株は、主に、分析中の複合体の細胞毒性の可能性をテストするために使用された。
１． 研究デザイン
本インビトロ研究の目的は、ウスニン酸およびβ－シクロデキストリンを含む複合体（本発明による包接複合体）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する抗ウイルス効果を評価することである。
この目的のために、Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＣＲＬ－１５８６（ＡＴＣＣ）アフリカミドリザル腎臓細胞株とともにインキュベートしたシュードウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ）に対する本発明の前記複合体の阻害効果を試験した。国際レベルでは、シュードウイルスを含むコロナウイルスが細胞に侵入する際に経由するＡＣＥ２受容体が豊富であるため、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株が選ばれている。コロナウイルスおよびシュードウイルスは、スパイクと称されるウイルスの表面の糖タンパク質を介してＡＣＥ２受容体に結合することが知られている。
試験された本発明の複合体は、ウスニン酸のβ－シクロデキストリンとの複合体（重量比１：１および１：２）である。
このＶｅｒｏ Ｅ６細胞株は、主に、分析中の複合体の細胞毒性の可能性をテストするために使用された。
【0068】
２． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株におけるウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の細胞毒性アッセイ
２．１． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株の培養
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株を、１％のＬ－グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（％重量／重量または％重量／体積）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃でインキュベートした。
細胞の増殖は、細胞毒性アッセイに供される９６ウェルプレートに接種するのに十分な数の細胞を得るために、１０ｍｌの細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコ中で行われる。
２．１． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株の培養
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株を、１％のＬ－グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（％重量／重量または％重量／体積）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃でインキュベートした。
細胞の増殖は、細胞毒性アッセイに供される９６ウェルプレートに接種するのに十分な数の細胞を得るために、１０ｍｌの細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコ中で行われる。
【0069】
２．２． ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解性
細胞毒性アッセイを実施する前に、滅菌蒸留水とダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の両方で、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解度試験を実施した。
複合体の溶解度は、温度２０℃で、脱塩水中で１％重量／重量に相当する。複合体の良好な分散を得るには、強力な混合、例えば、機械的混合が必要である。このようにして得られた溶液は、ゆっくりと沈殿を形成する可能性がある。より良好な可溶化のために、複合体の溶解性を高めるために、１％溶液を５０℃の水に浸すことが推奨され、また、例えば、機械的ものなどの混合の補助も受ける。
滅菌蒸留水およびＤ－ＭＥＭにおけるウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解度を検証するために、その後の細胞毒性アッセイでの使用のために、以下の濃度をテストした。
・１０ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５００μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１００μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５０μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．００５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１０μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．００１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
溶解度試験では、使用した蒸留水と培地の両方で溶解度の差が観察されないことが示された。その結果、細胞毒性アッセイに使用する複合体の溶解にはＤ－ＭＥＭ細胞培養液を使用した。細胞はＤ－ＭＥＭ細胞培養培地中で生存を維持するため、この手順が最適であることが確かめられた。
１％、０．５％、および０．１％の濃度の、Ｄ－ＭＥＭに溶解したウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解は、試験した複合体の濃度に比例してゆっくりと沈殿の形成を示した。したがって、これらの濃度では上清のみを収集し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株とともにインキュベートした。より低い濃度、つまり０．０５％、０．０１％、０．００５％、および０．００１％では沈殿物の存在が示されなかったため、上清を収集する必要はなかった。
細胞毒性アッセイを実施する前に、滅菌蒸留水とダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の両方で、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解度試験を実施した。
複合体の溶解度は、温度２０℃で、脱塩水中で１％重量／重量に相当する。複合体の良好な分散を得るには、強力な混合、例えば、機械的混合が必要である。このようにして得られた溶液は、ゆっくりと沈殿を形成する可能性がある。より良好な可溶化のために、複合体の溶解性を高めるために、１％溶液を５０℃の水に浸すことが推奨され、また、例えば、機械的ものなどの混合の補助も受ける。
滅菌蒸留水およびＤ－ＭＥＭにおけるウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解度を検証するために、その後の細胞毒性アッセイでの使用のために、以下の濃度をテストした。
・１０ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５００μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１００μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・５０μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．００５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
・１０μｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．００１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体。
溶解度試験では、使用した蒸留水と培地の両方で溶解度の差が観察されないことが示された。その結果、細胞毒性アッセイに使用する複合体の溶解にはＤ－ＭＥＭ細胞培養液を使用した。細胞はＤ－ＭＥＭ細胞培養培地中で生存を維持するため、この手順が最適であることが確かめられた。
１％、０．５％、および０．１％の濃度の、Ｄ－ＭＥＭに溶解したウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解は、試験した複合体の濃度に比例してゆっくりと沈殿の形成を示した。したがって、これらの濃度では上清のみを収集し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株とともにインキュベートした。より低い濃度、つまり０．０５％、０．０１％、０．００５％、および０．００１％では沈殿物の存在が示されなかったため、上清を収集する必要はなかった。
【0070】
２．３． 細胞毒性アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の非細胞毒性濃度を決定するために、この複合体の細胞毒性試験を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して、異なる濃度および２つのインキュベーション時間で実施した。
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミドまたはＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、さまざまな濃度でのウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の可能性のある細胞毒性活性をチェックした。ＭＴＴアッセイは、生細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酸化還元酵素による、黄色テトラゾリウムブロミド化合物の、ホルマザンへの還元に基づく、比色アッセイであり、ホルマザンは生細胞内で不溶性の紫色の結晶の形で沈殿する。観察される紫色が強いほど、存在する生細胞の数が多くなる。
詳細には、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から事前に取り出した細胞を、最終濃度１×１０４細胞／ウェルで播種した９６ウェルマルチウェルを、細胞毒性実験に使用した。続いて、細胞を含むマルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において３７℃で２４時間、インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、培地を除去し、事前にＤ－ＭＥＭに溶解した（パラグラフ２．２．）、１００μｌのウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、および０．００１％といった異なる濃度で添加した。そして、マルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で８時間および２４時間インキュベートした。
８時間および２４時間のインキュベーション後、異なる濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を含む培地をマルチウェルから除去し、１００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄を行った。
この時点で、細胞毒性試験のためにＭＴＴアッセイを実施した。
光源がない状態で、ＰＢＳに溶解した０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を１００μｌ／ウェルで加え、マルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター中、暗所において、３７℃で３時間インキュベートした。
３時間後、ＭＴＴ溶液をマルチウェルから除去し、ＰＢＳで洗浄を行った後、１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯを加えた。マルチウェルを、暗所において、室温で１５分間インキュベートした。次いで、分光光度計による読み取りを波長５７０ｎｍで行った。
ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の非細胞毒性濃度を決定するために、この複合体の細胞毒性試験を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して、異なる濃度および２つのインキュベーション時間で実施した。
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミドまたはＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、さまざまな濃度でのウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の可能性のある細胞毒性活性をチェックした。ＭＴＴアッセイは、生細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酸化還元酵素による、黄色テトラゾリウムブロミド化合物の、ホルマザンへの還元に基づく、比色アッセイであり、ホルマザンは生細胞内で不溶性の紫色の結晶の形で沈殿する。観察される紫色が強いほど、存在する生細胞の数が多くなる。
詳細には、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から事前に取り出した細胞を、最終濃度１×１０４細胞／ウェルで播種した９６ウェルマルチウェルを、細胞毒性実験に使用した。続いて、細胞を含むマルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において３７℃で２４時間、インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、培地を除去し、事前にＤ－ＭＥＭに溶解した（パラグラフ２．２．）、１００μｌのウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、および０．００１％といった異なる濃度で添加した。そして、マルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で８時間および２４時間インキュベートした。
８時間および２４時間のインキュベーション後、異なる濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を含む培地をマルチウェルから除去し、１００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄を行った。
この時点で、細胞毒性試験のためにＭＴＴアッセイを実施した。
光源がない状態で、ＰＢＳに溶解した０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液を１００μｌ／ウェルで加え、マルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター中、暗所において、３７℃で３時間インキュベートした。
３時間後、ＭＴＴ溶液をマルチウェルから除去し、ＰＢＳで洗浄を行った後、１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯを加えた。マルチウェルを、暗所において、室温で１５分間インキュベートした。次いで、分光光度計による読み取りを波長５７０ｎｍで行った。
【0071】
２．４． 細胞毒性試験の結果。
細胞毒性試験から得られた結果について、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とＶｅｒｏ Ｅ６細胞とのインキュベーションの、８時間および２４時間の結果を、それぞれ、図１および図２に報告する。
図１および図２では、細胞生存率がパーセンテージで表されている。複合体の存在下での細胞生存率が約７０％未満であれば、その濃度では複合体は細胞毒性があるものとして分類される。
図１および図２から分かるように、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、１％、０．５％、および０．１％の濃度で、８時間のインキュベーション後と２４時間のインキュベーション後の両方で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に対して細胞毒性を示す。
濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の細胞毒性に関しては、８時間のインキュベーション後は、細胞毒性なし（生存率７１％）になるが（図１）、２４時間のインキュベーション後は、細胞生存率は７０％をわずかに下回る（図２）。
アッセイを行ったウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の他の濃度、つまり、０．０１～０．００１％に関しては、これらの濃度は、８時間のインキュベーション後および２４時間のインキュベーション後の両方で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して細胞毒性を示していない（図１および図２）。
したがって、複合体の抗ウイルス活性は、０．０１％の濃度でテストされる。
細胞毒性試験から得られた結果について、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とＶｅｒｏ Ｅ６細胞とのインキュベーションの、８時間および２４時間の結果を、それぞれ、図１および図２に報告する。
図１および図２では、細胞生存率がパーセンテージで表されている。複合体の存在下での細胞生存率が約７０％未満であれば、その濃度では複合体は細胞毒性があるものとして分類される。
図１および図２から分かるように、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、１％、０．５％、および０．１％の濃度で、８時間のインキュベーション後と２４時間のインキュベーション後の両方で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に対して細胞毒性を示す。
濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の細胞毒性に関しては、８時間のインキュベーション後は、細胞毒性なし（生存率７１％）になるが（図１）、２４時間のインキュベーション後は、細胞生存率は７０％をわずかに下回る（図２）。
アッセイを行ったウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の他の濃度、つまり、０．０１～０．００１％に関しては、これらの濃度は、８時間のインキュベーション後および２４時間のインキュベーション後の両方で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して細胞毒性を示していない（図１および図２）。
したがって、複合体の抗ウイルス活性は、０．０１％の濃度でテストされる。
【0072】
３． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株において試験した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対するウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の抗ウイルス活性
３．１． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株の培養
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対するウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の抗ウイルス活性の可能性を、０．０１％の濃度でテストした。
細胞毒性アッセイと同様に、アフリカミドリザル腎臓細胞株Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＣＲＬ－１５８６（ＡＴＣＣ）を抗ウイルス活性にも使用した。この細胞株を、１％のＬ－グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（％重量／重量または％重量／体積）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃でインキュベートした。
細胞の増殖は、細胞をウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の抗ウイルス活性の試験に供する９６ウェルプレートに接種するのに十分な数の細胞を得るために、１０ｍｌの細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコ中で行われる。
３．１． Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株の培養
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対するウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の抗ウイルス活性の可能性を、０．０１％の濃度でテストした。
細胞毒性アッセイと同様に、アフリカミドリザル腎臓細胞株Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＣＲＬ－１５８６（ＡＴＣＣ）を抗ウイルス活性にも使用した。この細胞株を、１％のＬ－グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（％重量／重量または％重量／体積）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃でインキュベートした。
細胞の増殖は、細胞をウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の抗ウイルス活性の試験に供する９６ウェルプレートに接種するのに十分な数の細胞を得るために、１０ｍｌの細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコ中で行われる。
【0073】
３．２． ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の溶解
ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、１００μｇ／ｍｌに等しい濃度に相当する０．０１％でＤ－ＭＥＭ（細胞培養培地）に溶解した。
ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、１００μｇ／ｍｌに等しい濃度に相当する０．０１％でＤ－ＭＥＭ（細胞培養培地）に溶解した。
【0074】
３．３． シュードウイルス
本実験に使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスストック（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ、ＵＳＡ）には、１０７の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌが含まれており、ここで、ＴＵは、シュードウイルスの量を定義するために使用される測定単位である。この実験で使用したシュードウイルスには、細胞単層に感染したウイルス粒子が発する発光の定量を可能にするホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素のレポーター遺伝子も含まれていることを観察する必要がある。
実施した実験では、感染多重度（ＭＯＩ）１０に相当する１０５ＴＵの濃度を使用した。感染多重度は、ウェルあたりの所定の数の細胞（１×１０４）と接触するウイルス粒子の数を示す。したがって、本実験では、さまざまなＭＯＩをテストした後、細胞あたり１０個のシュードウイルス粒子（ＭＯＩ １０）を接触させた（図３）。図３から分かるように、ＭＯＩ １００で観測された過剰発光に適用されるのと同様に、より低い濃度が標準曲線の線形領域内に収まらないことを考慮すると、最適濃度はＭＯＩ １０で得られた濃度である。
本実験に使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスストック（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ、ＵＳＡ）には、１０７の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌが含まれており、ここで、ＴＵは、シュードウイルスの量を定義するために使用される測定単位である。この実験で使用したシュードウイルスには、細胞単層に感染したウイルス粒子が発する発光の定量を可能にするホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素のレポーター遺伝子も含まれていることを観察する必要がある。
実施した実験では、感染多重度（ＭＯＩ）１０に相当する１０５ＴＵの濃度を使用した。感染多重度は、ウェルあたりの所定の数の細胞（１×１０４）と接触するウイルス粒子の数を示す。したがって、本実験では、さまざまなＭＯＩをテストした後、細胞あたり１０個のシュードウイルス粒子（ＭＯＩ １０）を接触させた（図３）。図３から分かるように、ＭＯＩ １００で観測された過剰発光に適用されるのと同様に、より低い濃度が標準曲線の線形領域内に収まらないことを考慮すると、最適濃度はＭＯＩ １０で得られた濃度である。
【0075】
３．４． 抗ウイルス活性アッセイ
Ｖｅｒｏ Ｅ６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合とその後のウイルスの細胞への侵入のためのＡＣＥ２受容体を有しているため、ウイルス感染の研究に最適な細胞株である。詳細には、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から事前に取り出した細胞を、最終濃度１×１０４細胞／ウェルでＤ－ＭＥＭに播種した９６ウェルマルチウェルを、抗ウイルス活性実験に使用した。続いて、細胞を含むマルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で２４時間インキュベートした。
翌日、細胞計数を実施してその非複製を確認し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内において、０．０１％濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とともに、ＭＯＩ １０で、３７℃で１時間プレインキュベートした。プレインキュベートは１．５ｍｌ試験管中で実施した。
シュードウイルスと、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体との接触時間が終了したあと、懸濁液全体を試験管から回収し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の細胞単層に加えた。単層を、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で８時間、インキュベートした。
８時間のインキュベートの後、シュードウイルスとともにウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を含む培養培地をマルチウェルから除去し、細胞に浸透しなかったウイルスを除去するのに十分な１００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄を行った。
続いて、新しいＤ－ＭＥＭ培地を単層に加え、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で４８時間、インキュベートした。
この時間が経過した後、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、イタリア）を使用して細胞単層を溶解した。次いで、ルシフェラーゼ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ、イタリア）を実施した。ルシフェラーゼ試験は、シュードウイルス内でクローン化されたホタルルシフェラーゼ酵素を使用した、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化に基づいている。この反応の生成物は電子遷移により光シグナルを発し、これはルミノメーター（Ｂｉｏｎｔｅｋ）によって検出される。
その結果、放出される光の強度は、細胞単層に感染したシュードウイルス粒子の数に直接比例し、したがって、シュードウイルス（シュードウイルススパイク）に対する本発明の複合体の親和性に反比例する。
シュードウイルスを、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とともにプレインキュベートしたサンプルによって放出される発光の量を、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の非存在下で３７℃でインキュベートしたシュードウイルスを用いて得られる発光の量（対照）と比較した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合とその後のウイルスの細胞への侵入のためのＡＣＥ２受容体を有しているため、ウイルス感染の研究に最適な細胞株である。詳細には、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から事前に取り出した細胞を、最終濃度１×１０４細胞／ウェルでＤ－ＭＥＭに播種した９６ウェルマルチウェルを、抗ウイルス活性実験に使用した。続いて、細胞を含むマルチウェルを、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で２４時間インキュベートした。
翌日、細胞計数を実施してその非複製を確認し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスを、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内において、０．０１％濃度のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とともに、ＭＯＩ １０で、３７℃で１時間プレインキュベートした。プレインキュベートは１．５ｍｌ試験管中で実施した。
シュードウイルスと、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体との接触時間が終了したあと、懸濁液全体を試験管から回収し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の細胞単層に加えた。単層を、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で８時間、インキュベートした。
８時間のインキュベートの後、シュードウイルスとともにウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を含む培養培地をマルチウェルから除去し、細胞に浸透しなかったウイルスを除去するのに十分な１００μｌ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄を行った。
続いて、新しいＤ－ＭＥＭ培地を単層に加え、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター内において、３７℃で４８時間、インキュベートした。
この時間が経過した後、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、イタリア）を使用して細胞単層を溶解した。次いで、ルシフェラーゼ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ、イタリア）を実施した。ルシフェラーゼ試験は、シュードウイルス内でクローン化されたホタルルシフェラーゼ酵素を使用した、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化に基づいている。この反応の生成物は電子遷移により光シグナルを発し、これはルミノメーター（Ｂｉｏｎｔｅｋ）によって検出される。
その結果、放出される光の強度は、細胞単層に感染したシュードウイルス粒子の数に直接比例し、したがって、シュードウイルス（シュードウイルススパイク）に対する本発明の複合体の親和性に反比例する。
シュードウイルスを、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とともにプレインキュベートしたサンプルによって放出される発光の量を、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の非存在下で３７℃でインキュベートしたシュードウイルスを用いて得られる発光の量（対照）と比較した。
【0076】
３．５． 抗ウイルス活性アッセイの結果。
図４に、濃度０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体について、ＭＯＩ １０でシュードウイルスと１時間プレインキュベートし、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞と８時間接触させた、抗ウイルス活性の試験により得られた結果を報告する。
シュードウイルスを、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とプレインキュベートしたサンプルの結果を、殺ウイルス性の複合体とプレインキュベートしなかったシュードウイルス（対照）から得られた結果と比較した。データは、放出される発光量（図４Ａ）、および、細胞単層へのシュードウイルスの侵入率（図４Ｂ）の両方で報告される。
図４から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、高度に強調された対照と比べて、発光が減少する（それぞれ、４１９５対２８４０５）（図４Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照と比較してウイルスの細胞への侵入が８５．２％阻害されたことを示している（図４Ｂ）。
結論として、示された実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対して、０．０１％に等しい非細胞毒性濃度で、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の殺ウイルス活性を示した。
図４に、濃度０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体について、ＭＯＩ １０でシュードウイルスと１時間プレインキュベートし、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞と８時間接触させた、抗ウイルス活性の試験により得られた結果を報告する。
シュードウイルスを、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とプレインキュベートしたサンプルの結果を、殺ウイルス性の複合体とプレインキュベートしなかったシュードウイルス（対照）から得られた結果と比較した。データは、放出される発光量（図４Ａ）、および、細胞単層へのシュードウイルスの侵入率（図４Ｂ）の両方で報告される。
図４から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０１％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、高度に強調された対照と比べて、発光が減少する（それぞれ、４１９５対２８４０５）（図４Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照と比較してウイルスの細胞への侵入が８５．２％阻害されたことを示している（図４Ｂ）。
結論として、示された実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対して、０．０１％に等しい非細胞毒性濃度で、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体の殺ウイルス活性を示した。
【0077】
実験パート（ＩＩ）
１． 実験の目的
実験パート（Ｉ）で報告した、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株におけるウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）の細胞毒性アッセイ、およびＶｅｒｏ Ｅ６細胞株におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対する前記複合体の抗ウイルス活性アッセイを、Ｄ－ＭＥＭ細胞培養培地中、濃度０．０３％（濃度３００μｇ／ｍｌに相当）、および濃度０．０５％（濃度５００μｇ／ｍｌに相当）のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）を用いて、繰り返して行った。
１． 実験の目的
実験パート（Ｉ）で報告した、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞株におけるウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）の細胞毒性アッセイ、およびＶｅｒｏ Ｅ６細胞株におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対する前記複合体の抗ウイルス活性アッセイを、Ｄ－ＭＥＭ細胞培養培地中、濃度０．０３％（濃度３００μｇ／ｍｌに相当）、および濃度０．０５％（濃度５００μｇ／ｍｌに相当）のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）を用いて、繰り返して行った。
【0078】
２． 細胞毒性アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）（本発明による包接複合体）の細胞毒性アッセイを、実験パート（Ｉ）のパラグラフ２．１．～２．３で報告した条件下で正確に実施した。
濃度０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）とともに８時間インキュベートした後のＶｅｒｏ Ｅ６細胞株の細胞生存率は、８３％であることが分かった。
濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）とともに８時間インキュベートした後のＶｅｒｏ Ｅ６細胞株の細胞生存率は、１回目の試験で６８％、２回目の試験で６９％であることが分かった（非細胞毒性濃度を定義するための最小値として確立された７０％生存率閾値で安定した値）。
上記を考慮すると、濃度０．０３％および濃度０．０５％の両方のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（本発明による包接複合体）は、８時間のインキュベーション後にＶｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して細胞毒性がないことが確かめられた。
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）（本発明による包接複合体）の細胞毒性アッセイを、実験パート（Ｉ）のパラグラフ２．１．～２．３で報告した条件下で正確に実施した。
濃度０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）とともに８時間インキュベートした後のＶｅｒｏ Ｅ６細胞株の細胞生存率は、８３％であることが分かった。
濃度０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）とともに８時間インキュベートした後のＶｅｒｏ Ｅ６細胞株の細胞生存率は、１回目の試験で６８％、２回目の試験で６９％であることが分かった（非細胞毒性濃度を定義するための最小値として確立された７０％生存率閾値で安定した値）。
上記を考慮すると、濃度０．０３％および濃度０．０５％の両方のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（本発明による包接複合体）は、８時間のインキュベーション後にＶｅｒｏ Ｅ６細胞株に対して細胞毒性がないことが確かめられた。
【0079】
３． 抗ウイルス活性アッセイ
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）（本発明による包接複合体）の抗ウイルス活性アッセイを、実験パート（Ｉ）のパラグラフ３．１～３．４に報告された条件下で正確に実施した。
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を、ＭＯＩ １０のシュードウイルスとともに１時間プレインキュベートし、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞と８時間接触させた、抗ウイルス活性の試験により得た結果を、図５および６に報告する。
シュードウイルスをウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とプレインキュベートしたサンプルの結果を、殺ウイルス複合体とプレインキュベートしなかったシュードウイルス（対照）により得た結果と比較した。データは、放出される発光の量（図５Ａおよび図６Ａ）および細胞単層へのシュードウイルスの侵入率（図５Ｂおよび図６Ｂ）の両方で報告する。
図５から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、強く強調された対照と比べて発光が減少する（それぞれ２５５８対２５１７８）（図５Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照に比べてウイルスの細胞への侵入が８９．８％阻害されたことを示している（図５Ｂ）。
図６から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、強く強調された対照と比べて発光が減少する（それぞれ３９８対１５１５）（図６Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照に比べてウイルスの細胞への侵入が７３．７％阻害されたことを示している（図６Ｂ）。
結論として、示された実験は、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対して、０．０３％および０．０５％に相当する非細胞毒性濃度で、殺ウイルス活性を示した。
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体（１：１）（本発明による包接複合体）の抗ウイルス活性アッセイを、実験パート（Ｉ）のパラグラフ３．１～３．４に報告された条件下で正確に実施した。
濃度０．０３％および０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体を、ＭＯＩ １０のシュードウイルスとともに１時間プレインキュベートし、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞と８時間接触させた、抗ウイルス活性の試験により得た結果を、図５および６に報告する。
シュードウイルスをウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体とプレインキュベートしたサンプルの結果を、殺ウイルス複合体とプレインキュベートしなかったシュードウイルス（対照）により得た結果と比較した。データは、放出される発光の量（図５Ａおよび図６Ａ）および細胞単層へのシュードウイルスの侵入率（図５Ｂおよび図６Ｂ）の両方で報告する。
図５から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０３％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、強く強調された対照と比べて発光が減少する（それぞれ２５５８対２５１７８）（図５Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照に比べてウイルスの細胞への侵入が８９．８％阻害されたことを示している（図５Ｂ）。
図６から分かるように、ＭＯＩ １０のシュードウイルスを０．０５％のウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体と接触させると、強く強調された対照と比べて発光が減少する（それぞれ３９８対１５１５）（図６Ａ）。これは、シュードウイルスの侵入が減少し、対照に比べてウイルスの細胞への侵入が７３．７％阻害されたことを示している（図６Ｂ）。
結論として、示された実験は、ウスニン酸とβ－シクロデキストリンの複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含むシュードウイルスに対して、０．０３％および０．０５％に相当する非細胞毒性濃度で、殺ウイルス活性を示した。
【0080】
以下の表に報告する組成物は、特に、細胞生存率、特に鼻細胞のもの、鼻上皮の保護およびミトコンドリアバランス、ならびに、Ｃｏｖｉｄ－１９感染に関与する最初の障壁である鼻上皮へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの侵入を防ぐ組成物の能力の決定を評価するために、出願人によって試験された。
上記の表で報告した製剤はすべて良好な結果を示した。
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】