特表 2024-504194 自己寛容を破壊するためのワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-30

(54)【発明の名称】自己寛容を破壊するためのワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240123BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 14/525 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240123BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20240123BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240123BHJP

   C12N 15/28 20060101ALN20240123BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240123BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

C12N15/62 Z

C07K19/00

C07K14/54

C07K14/525

C07K14/33

A61P43/00 121

A61P37/04

A61K48/00

A61K39/39

A61K31/7088

A61K31/7125

A61P37/02

A61P35/00

A61P37/08

A61P29/00

A61P11/00

A61P17/00

A61P17/04

A61P17/06

G01N33/53 N

G01N33/543 545A

C12N15/117 Z ZNA

C12N15/24

C12N15/28

C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545831

(86)(22)【出願日】2022-01-29

(85)【翻訳文提出日】2023-09-25

(86)【国際出願番号】 EP2022052153

(87)【国際公開番号】W WO2022162204

(87)【国際公開日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】21154244.4

(32)【優先日】2021-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508270727

【氏名又は名称】エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｌａｎｃｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】イルグ，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ワイス，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】フォイト，サブリナ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB131

4C084ZB132

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC551

4C084ZC552

4C084ZC611

4C084ZC612

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA38

4C085BB11

4C085BB17

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF14

4C085FF17

4C085FF24

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA59

4C086ZA89

4C086ZB07

4C086ZB09

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZB26

4C086ZC55

4C086ZC61

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA11

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA83

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するための、特に動物宿主における内因性サイトカインに対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物に関する。本発明のワクチン組成物は、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含有する。ポリタンパク質は、宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープと、を含む。本発明は更に、掻痒状態及び／又はアレルギー状態の予防及び／又は治療を含む疾患の予防及び／又は治療のためのワクチン組成物の使用に関する。別の態様では、本発明は、本発明のワクチン組成物で生成され得る自己タンパク質に対する自己抗体の存在を検出する方法を提供する。
【選択図】図３９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物は、前記ワクチン組成物が前記宿主に投与された場合、前記自己タンパク質に対する自己抗体を生じさせることができ、前記ワクチン組成物は、
ａ）ポリタンパク質、前記ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又は前記ポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、前記ポリタンパク質が、
－前記宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメント；及び
－前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープ
を含む、ポリタンパク質、前記ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又は前記ポリタンパク質をコードするＲＮＡと、
ｂ）１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、
を含む、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物。

【請求項2】

前記１又は複数のＴ細胞エピトープが、人工Ｔ細胞エピトープペプチド配列及び非自己タンパク質、特に病原性タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチド配列からなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

前記１又は複数のＴ細胞エピトープが、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ、特に、
（ｉ）配列番号１、配列番号３９又は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、
又は
（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される、
破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

前記ポリタンパク質が、少なくとも３つ、特に３つの自己タンパク質セグメントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

前記自己タンパク質セグメントが、
（ｉ）完全長自己タンパク質；又は
（ｉｉ）Ｂ細胞エピトープを含有する切断型自己タンパク質；又は
（ｉｉｉ）全長自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する自己タンパク質の誘導体
である、請求項１～４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、サイトカイン、特に、ＩＬ－３１、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３３及びＴＮＦ－αタンパク質からなる群から選択されるサイトカインに由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、ＩＬ－３１タンパク質、特にイヌＩＬ－３１（配列番号３）、ネコＩＬ－３１（配列番号６０）、ブタＩＬ－３１（配列番号６８）、ニワトリＩＬ－３１、ウシＩＬ－３１、又はヒトＩＬ－３１（配列番号６９）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項8】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、ＩＬ－５タンパク質、特にイヌＩＬ－５（配列番号４１）、ネコＩＬ－５（配列番号７６）、ブタＩＬ－５（配列番号７７）、ニワトリＩＬ－５（配列番号７８又は７９）、ウシＩＬ－５（配列番号８０）又はヒトＩＬ－５（配列番号８１）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項9】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、ＩＬ－４タンパク質、特にイヌＩＬ－４（配列番号５６）、ネコＩＬ－４（配列番号７０）、ブタＩＬ－４（配列番号７１）、ニワトリＩＬ－４（配列番号７２）、ウシＩＬ－４（配列番号７３）又はヒトＩＬ－４（配列番号７４又は７５）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、ＩＬ－１３タンパク質、特にイヌＩＬ－１３（配列番号４６）、ネコＩＬ－１３（配列番号８２）、ブタＩＬ－１３（配列番号８３）、ニワトリＩＬ－１３（配列番号８４）、ウシＩＬ－１３（配列番号８５）又はヒトＩＬ－１３（配列番号８６）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントが、ＩＬ－３３タンパク質、特にイヌＩＬ－３３（配列番号５０又は５１）、ネコＩＬ－３３（配列番号８７、８８、８９又は９０）、ブタＩＬ－３３（配列番号９１、９２、９３又は９４）、ウシＩＬ－３３（配列番号９５又は９６）又はヒトＩＬ－３３（配列番号９７、９８、９９又は１００）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項12】

前記ポリタンパク質が、
（ｉ）配列番号４、４０、４２、４３、４７、５４、５７、６１又は６５との少なくとも８５％の配列同一性；
あるいは
（ｉｉ）配列番号４、４０、４２、４３、４７、５４、５７、６１又は６５の配列
を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項13】

前記ポリタンパク質が、
（ｉ）配列番号４又は配列番号４０との少なくとも８５％の配列同一性；
あるいは
（ｉｉ）配列番号４又は配列番号４０の配列
を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項14】

前記１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、Ａクラス、Ｂクラス及びＣクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチド並びにそれらの混合物からなる群から選択され、
好ましくは、前記１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、Ｂクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項15】

前記１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドの少なくとも１つ又はそれぞれが、
（ｉ）配列番号５又は配列番号６と少なくとも７５％の配列同一性を含むか、又は
（ｉｉ）配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項16】

前記１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチド中の少なくともいくつかのホスホジエステル部分が、ヌクレアーゼ耐性を増大させるために化学修飾されており、特にホスホロチオエート部分によって置き換えられている、請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項17】

デポー効果を付与するアジュバントを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項18】

宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためにワクチン組成物において使用するための、ポリタンパク質、前記ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又は前記ポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、
前記ポリタンパク質が、前記宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又は前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントに隣接する非宿主起源の１つ又は複数のＴ細胞エピトープとを含む、ポリタンパク質、前記ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又は前記ポリタンパク質をコードするＲＮＡ。

【請求項19】

宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのポリタンパク質の使用であって、
前記自己寛容は、前記ポリタンパク質が前記宿主に投与されたときに自己抗体の産生によって破壊され、
前記ポリタンパク質は、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、前記少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１つ又は複数のＴ細胞エピトープと、を含む、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのポリタンパク質の使用。

【請求項20】

対象の疾患を予防又は治療する方法に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物又は請求項１８に記載のポリタンパク質であって、
前記方法が、前記ワクチン組成物又は前記ポリタンパク質を前記対象に投与する工程を含む、対象の疾患を予防又は治療する方法に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物又は請求項１８に記載のポリタンパク質。

【請求項21】

前記対象が、ヒト及び非ヒト動物を含む哺乳動物である、請求項２０に記載の使用のためのワクチン組成物又はポリタンパク質。

【請求項22】

前記対象が、ウシ、家禽、ブタ、並びにネコ及びイヌ等のコンパニオンアニマルからなる群から選択される動物である、請求項２１に記載の使用のためのワクチン組成物又はポリタンパク質。

【請求項23】

前記疾患が、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
であり、
好ましくは、前記疾患が掻痒状態又はアレルギー状態、特にアトピー性皮膚炎である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物又はポリタンパク質。

【請求項24】

自己抗体、特に請求項１～１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物に含まれるポリタンパク質に対して得られた自己抗体を検出するための酵素結合免疫吸着測定方法であって、前記方法が、
ａ）試験表面に抗原を吸着させる工程と、
ｂ）前記試験表面上の遊離結合部位をブロックする工程と、
ｃ）前記抗原でコーティングされ、ブロックされた試験表面を、前記抗原に対する標識抗体及び前記抗原に対する試験対象の自己抗体を含む混合物とインキュベートする工程と、
ｄ）前記標識抗体の結合を検出する工程と、
を含む、酵素結合免疫吸着測定方法。

【請求項25】

前記抗原が、請求項１８に記載のポリタンパク質若しくは請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリタンパク質、又はそれらの単一タンパク質セグメント若しくはエピトープ担持ペプチドを含むか、又はそれらである、請求項２４に記載の酵素結合免疫吸着測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、哺乳動物宿主において、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するための、特に、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３及びＴＮＦ－αタンパク質に由来するサイトカインを含む内因性サイトカイン、特に内因性ＩＬ－３１タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物に関する。本発明は更に、掻痒状態及び／又はアレルギー状態の予防及び／又は治療を含む疾患の予防及び／又は治療のためのワクチン組成物の使用に関する。本発明は更に、自己タンパク質に由来し、ワクチン組成物中の免疫原として使用されるポリタンパク質に関する。別の態様では、本発明は、本発明のワクチン組成物で生成され得る自己タンパク質に対する自己抗体の存在を検出する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

ワクチンは、感染症の予防及び／又は治療にとって最も重要である。しかしながら、ワクチン技術はまた、アレルギー、自己免疫疾患及び癌等の非感染性、しばしば慢性疾患の予防及び／又は治療のためにますます重要になっている。これらの疾患の標的は、一般に外来分子ではなく、自己タンパク質又は他の自己抗原である。免疫系は全ての自己タンパク質及び自己抗原に対する耐性を保証するように進化しているため、自己タンパク質に対してワクチン接種することは非常に困難である。本発明の基礎となる研究は、自己寛容を回避又は破壊する方法を見出すことを目的とした。

【0003】

自己反応性Ｂ細胞は、循環中に低レベルで存在し得るが、主にＴ細胞の助けがないため、増殖しないか、又はいかなる害も引き起こさない。対照的に、発生する自己反応性Ｔ細胞はいずれも、胸腺においてクローン欠失又は末梢においてアネルギー化される。しかしながら、自己抗原が外来（非自己）タンパク質又はその一部に共有結合している場合、すなわち自己及び非自己タンパク質又はタンパク質部分を含む融合タンパク質が提供される場合、非自己タンパク質（部分）に特異的なＴ細胞が動員され、活性化されることが知られている。

【0004】

並行して、自己反応性Ｂ細胞は、自己及び非自己のタンパク質／タンパク質部分を含有する融合タンパク質を選択的に取り込み、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子上に自己及び外来ペプチドの両方を提示し得る。次いで、自己反応性Ｂ細胞によって提示された非自己ペプチドは、自己反応性Ｂ細胞を刺激して自己タンパク質／自己抗原に対する免疫応答を拡大及び開始させる活性化Ｔ細胞によって認識される。免疫応答が十分に強い場合、これらの自己産生抗体は標的自己タンパク質のレベルを低下させる能力を有する。疾患の原因であるか又は疾患に寄与する自己タンパク質が標的として選択される場合、インビボで生成された自己抗体は、標的自己タンパク質を中和することによって治療用抗体として作用することができる。しかしながら、このような強固な免疫応答を得ることは困難である。

【0005】

アレルギー、自己免疫、癌及びＡＩＤＳを含む様々な病状において、サイトカインの異常な放出が病因及び／又は疾患進行に寄与する。

【0006】

例えば、アトピー性皮膚炎は、インターロイキン（ＩＬ）－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３及びＩＬ－３１を含む２型サイトカインの強い発現、並びに他のサイトカイン、特にＩＬ－２２及びＩＬ－３３だけでなくＩＬ－１７、ＩＬ－９及びＩＦＮ－γの可変的な活性化を伴う、異常且つ過剰なＴｈ２細胞及びＩＬＣ２活性化を特徴とする頻繁なアレルギー性皮膚障害である（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２８：７５６－７６８；Ｒｅｎｅｒｔ－Ｙｕｖａｌ＆Ｇｕｔｔｍａｎ－Ｙａｓｓｋｙ（２０１９）Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ ３７：２０５－２１３）。アトピー性皮膚炎は、ヒトだけでなく、動物、特にイヌにおいても頻繁な障害である。実際、アトピー性皮膚炎はイヌにおいて最も一般的なアレルギーであり、イヌ集団の約１０％が罹患しており、欧州及び米国だけで１５００万～２０００万匹のイヌがこの疾患に罹患している（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），”Ｔｈｅ ＡＣＶＤ ｔａｓｋ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＸＩＶ）：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８１（３－４），２５５－２６９）。このアレルギー性皮膚疾患によって引き起こされるかゆみ又は掻痒は、通常、再発性又は慢性である。それは、イヌ及びその所有者の両方の生活の質に深く影響する。

【0007】

特に、内因性起痒物質であるインターロイキン－３１（ＩＬ－３１）は、アトピー性かゆみにおいて重要な役割を果たすようである。ＩＬ－３１は、ヒト及びイヌのアトピー性皮膚炎における掻痒症の重要な調節因子であると思われるので（Ｓｏｎｋｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，“ＩＬ－３１：ａ ｎｅｗ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１７．２（２００６）：４１１－４１７；Ｆｕｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，Ａｌｌｅｒｇｙ ７３．１（２０１８）：２９－３６；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１：ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．”Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２４．１（２０１３）：４８－ｅ１２）、ＩＬ－３１自体及びその受容体結合は、アトピー性皮膚炎の状況においてかゆみを薬理学的に介入するための主要な焦点であった。

【0008】

喘息は、２型だけでなく１型の両方のサイトカインの異常な放出に関連する病態生理を伴う別の非常に広まっている状態である。喘息関連治療研究の主な標的には、ＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３、並びにＩＬ－３３が含まれる。

【0009】

異常なサイトカイン産生に関連する状態を治療するために、様々な戦略が追求されてきた。例えば、アトピー性皮膚炎では、戦略の１つは、例えばキナーゼ阻害剤を使用して下流シグナル伝達を阻害することに焦点を当てている。しかしながら、この戦略は、阻害剤をヒト又は動物の患者に短い時間間隔で繰り返し与えなければならないという欠点を有する。広く使用されている別の戦略は、循環リガンドレベルを低下させるために、及び／又はそうでなければそれらの受容体結合、したがって生物学的活性を阻害するために、目的の特定のサイトカインに対する中和モノクローナル抗体を開発することである。アトピー性皮膚炎では、例えば、抗４、抗５、抗１３、抗１７Ａ、抗１７Ｃ、抗２２、抗３１、及び抗３３抗体が、この状態を予防及び／又は治療するために開発されている（Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２８：７５６－７６８；Ｒｅｎｅｒｔ－Ｙｕｖａｌ＆Ｇｕｔｔｍａｎ－Ｙａｓｓｋｙ（２０１９）Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ ３７：２０５－２１３）。しかしながら、この戦略は、細胞培養における高価な抗体産生手順及び短い間隔で抗体処理を繰り返す必要性に起因して、高い産生コストという欠点を有する。この戦略の別の欠点は、典型的にはモノクローナル治療用抗体に対する進行性免疫が患者において起こり、その結果、長期的には治療用抗体治療がもはや有効ではないことである。

【0010】

Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８は、キュウリモザイクウイルスに由来し、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に化学的に結合した天然の完全長ＩＬ－３１を含有するワクチンを投与することによって、サイトカインＩＬ－３１に対するワクチン接種を試みた（Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＩＬ－３１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｉｎ ｄｏｇｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２．１（２０１８）：２７９－２８１）。天然ＩＬ－３１のＶＬＰへの化学的カップリングは、ＩＬ－３１及びＶＬＰコートタンパク質を誘導体化することによって達成された。ＩＬ－３１をＮ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテートで誘導体化した後、脱アセチル化して反応性ＳＨ基をＩＬ－３１に導入した。ＳＨ反応性化学部分を導入するために、ＶＬＰコートタンパク質をスクシンイミジル－６－（（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート）で誘導体化した。ＩＬ－３１及びＶＬＰの誘導体化調製物を互いに反応させ、精製した。しかしながら、この戦略は、ＩＬ－３１－ＶＬＰコンジュゲートの産生が非常に複雑且つ高価であり、精製されたＶＬＰ及びＩＬ－３１、誘導体化及び化学的カップリングのための複数の化学的工程及びその後の精製を必要とするという欠点を有する。更に、この製造方法では、明確な化学的生成物が得られない。得られたＩＬ－３１－ＶＬＰコンジュゲートはまた、生分解性が問題となり得る非天然成分及び化学結合を含有する。

【0011】

本発明の基礎となる研究の目的は、免疫応答、特に有害なサイトカインに対する免疫応答を刺激することができる治療ワクチンの形態のヒト及び獣医学医薬品を提供することであった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｍｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２８：７５６－７６８；Ｒｅｎｅｒｔ－Ｙｕｖａｌ ＆ Ｇｕｔｔｍａｎ－Ｙａｓｓｋｙ（２０１９）Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｃｌｉｎ ３７：２０５－２１３

【非特許文献2】Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），“Ｔｈｅ ＡＣＶＤ ｔａｓｋ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＸＩＶ）：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８１（３－４），２５５－２６９

【非特許文献3】Ｓｏｎｋｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，“ＩＬ－３１：ａ ｎｅｗ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１７．２（２００６）：４１１－４１７

【非特許文献4】Ｆｕｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐３１ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，Ａｌｌｅｒｇｙ ７３．１（２０１８）：２９－３６

【非特許文献5】Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１：ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃａｎｉｎｅ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．”Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２４．１（２０１３）：４８－ｅ１２

【非特許文献6】Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＩＬ－３１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｉｎ ｄｏｇｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２．１（２０１８）：２７９－２８１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

前述の背景に対して、本発明の目的は、当技術分野で公知の手段と比較して、疾患を引き起こす又は疾患に寄与する標的自己タンパク質の機能を阻害又は摂動するための有効な薬理学的手段を提供することである。本発明の目的はまた、宿主において標的自己タンパク質に対する長期持続効果を誘導する薬理学的手段を提供することであり、その結果、薬理学的手段は、長い時間間隔、好ましくは週の範囲、最も好ましくは月の範囲の後にのみ再投与される必要がある。本発明の更なる目的は、経済的に製造することができ、それらの成分において化学的に十分に定義される薬理学的手段を提供することである。

【0014】

上記の目的に関連して、本発明の別の目的は、疾患に関与するか又は疾患を引き起こす標的自己タンパク質の機能を阻害又は摂動する本発明の薬理学的手段の効果を調査するための単純で効果的な方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

これらの目的は、請求項１に記載のワクチン組成物、請求項１８に記載のポリタンパク質、請求項１９及び２０に記載の使用、並びに請求項２４に記載の方法によって達成される。

【0016】

本発明は、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物における使用のための、ポリタンパク質、このポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はこのポリタンパク質をコードするＲＮＡを提供し、ここで、ポリタンパク質は、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又は少なくとも２つの自己タンパク質セグメントに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープと、を含む。

【0017】

本発明の基礎となる研究は、驚くべきことに、自己タンパク質セグメントと、これらの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれと隣接する非宿主Ｔ細胞エピトープとを含むポリタンパク質が、ポリタンパク質の自己タンパク質セグメントに対する宿主の自己寛容を破壊又は回避することができることを見出した。本発明のポリタンパク質の設計は、免疫学的利点を有するだけでなく、ポリタンパク質中の自己タンパク質セグメントがそれらの正常な生物学的機能及び／又は疾患を引き起こす機能を発揮することによって引き起こされる有意な悪影響を生じることなく、本発明のポリタンパク質の大量の投与、特に皮下投与も可能にする。これにより、本発明によるポリタンパク質は、ワクチン組成物に特に適した抗原となる。

【0018】

本発明のワクチン組成物は、本発明によるポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡを含む。より正確には、本発明は、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物であって、ワクチン組成物が宿主に投与された場合に当該自己タンパク質に対する自己抗体を生じさせることができるワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、
ａ）ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、ポリタンパク質が、
－宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメント；及び
－少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１つ又は複数のＴ細胞エピトープ
を含む、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡと、
ｂ）１つ以上の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、
を含む。

【0019】

本発明者らは、驚くべきことに、アジュバントとしての１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと組み合わせて、自己タンパク質セグメントと、自己タンパク質セグメントの間及び／又は自己タンパク質セグメントに隣接する非宿主Ｔ細胞エピトープとを含有するポリタンパク質を含むワクチンが、ワクチン組成物が投与される宿主中のポリタンパク質の自己タンパク質セグメントに対する強力な免疫応答を誘導することができることを見出した。宿主におけるこの強力な免疫応答には、ポリタンパク質の自己タンパク質セグメントに対する自己抗体の産生が含まれる。本発明者らの実験は、本発明によるワクチン組成物によるワクチン接種後に産生された自己抗体が、自己タンパク質セグメントが由来する天然自己タンパク質にも結合することを示した。本発明者らは更に、産生された自己抗体が数週間にわたって宿主の循環系に存在し、結合した自己タンパク質の機能を乱すか又は中和することさえできることを観察した。したがって、本発明によるワクチン組成物は、インビボでの長期持続性の治療的自己抗体応答の誘導を可能にする。

【0020】

本発明はまた、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのポリタンパク質の使用に関し、自己寛容は、ポリタンパク質が宿主に投与されたときに自己抗体の産生によって破壊され、ポリタンパク質は、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１つ又は複数のＴ細胞エピトープとを含む。この使用は、予防的及び治療的な医療用途に特に関連する。

【0021】

更に、本発明は、対象の疾患を予防又は治療する方法に使用するための本発明によるワクチン組成物に関し、方法は、ワクチンを対象に投与する工程を含む。

【0022】

最後に、本発明は、中和自己抗体を検出するための酵素結合免疫吸着測定であって、
ａ）試験表面への抗原の吸着の工程と、
ｂ）試験表面上の遊離結合部位の遮断の工程と、
ｃ）抗原でコーティングされ、ブロックされた試験表面を、抗原に対する標識中和抗体及び抗原に対する試験される中和自己抗体を含む混合物のインキュベートの工程と、
ｄ）標識中和抗体の結合の検出の工程と、
を含む、中和自己抗体を検出するための酵素結合免疫吸着測定に関する。

【0023】

本発明によるアッセイは、特に本発明によるワクチン組成物による宿主のワクチン接種後に、目的の抗原に対する中和自己抗体の存在を堅牢で明確な様式で決定することを可能にする。

【発明を実施するための形態】

【0024】

ポリタンパク質
本発明のポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ又はポリタンパク質をコードするＲＮＡは、例えば本発明のワクチン組成物において、宿主に投与された場合に当該宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するように設計される。ポリタンパク質は、宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープと、を含む。

【0025】

宿主の自己タンパク質に対する自己寛容の遮断は、宿主の自己タンパク質に対する自己抗体、好ましくは中和自己抗体の産生を含む免疫応答を宿主において誘発することを意味する。したがって、「宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊すること」は、「宿主の自己タンパク質に対する自己抗体、好ましくは中和自己抗体の産生を誘発すること」を意味する。本明細書で使用される「自己抗体」という用語は、この宿主の自己タンパク質に結合する宿主によって産生される抗体を指す。「中和自己抗体」は、それが結合する宿主の自己タンパク質の生物学的機能を乱し、好ましくは完全に阻害する。一例として、ＩＬ－３１に対する中和自己抗体は、宿主におけるＩＬ－３１の生物学的機能を乱し、好ましくは実質的に完全に阻害する。特に、ＩＬ－３１に対する中和自己抗体は、掻痒の誘発及び発症におけるＩＬ－３１の役割を乱し、好ましくは完全に阻害する。

【0026】

本発明のポリタンパク質は、２つの重要な構造要素：宿主の自己タンパク質セグメント及び非宿主起源のＴ細胞エピトープを含む。

【0027】

本発明のポリタンパク質は、少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、好ましくは少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含む。最も好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、３つの自己タンパク質セグメントを含む。本発明者らの実験は、宿主に投与した場合、少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含有するポリタンパク質が、ポリタンパク質の自己タンパク質セグメントに対する、したがってまたポリタンパク質の自己タンパク質セグメントが由来する宿主の天然自己タンパク質に対する自己抗体の産生を宿主において誘発することにおいて非常に強力であることを示した。

【0028】

本発明のポリタンパク質に含まれる自己タンパク質セグメントは、同じであっても異なっていてもよい。特に、自己タンパク質セグメントは、長さ及び／又はアミノ酸配列が異なり得る。少なくとも２つの自己タンパク質セグメントは、同じ自己タンパク質に由来する。ポリタンパク質の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントを構成するために同じ自己タンパク質セグメントを使用した場合、良好な結果が達成された。これらの場合、ポリタンパク質は、宿主に投与されると、１つのタイプの自己タンパク質又は更には１つのタイプの自己タンパク質セグメントに対する自己抗体の産生に焦点を合わせた宿主における免疫応答を誘導し、その両方が、タンパク質セグメントが由来する宿主の天然自己タンパク質に対する自己免疫応答をもたらす。

【0029】

本発明によるポリタンパク質の自己タンパク質セグメントは、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。本明細書で使用されるＢ細胞エピトープという用語は、自己抗体が結合する自己タンパク質セグメントの線状又は立体配座の割合を意味する。

【0030】

本明細書で使用される「セグメント」は、区別可能で別個のタンパク質実体又はドメインを意味する。したがって、宿主の単一の連続した自己タンパク質配列は、自己タンパク質配列内で、セグメントが介在配列（例えば、Ｔ細胞エピトープ）によって分離されている場合にのみ、本発明による少なくとも２つの自己タンパク質セグメントを構成するとみなすことができる。複数の同じタンパク質セグメント又は異なるタンパク質セグメントを、介在配列が存在することなく互いに直接融合することもできる。好ましくは、介在配列は、非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープを含むか、又はそれからなる。

【0031】

宿主の自己タンパク質セグメントは、
（ｉ）完全長自己タンパク質；又は
（ｉｉ）Ｂ細胞エピトープを含有する切断型自己タンパク質；又は
（ｉｉｉ）全長自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する自己タンパク質の誘導体
であり得る。

【0032】

本発明によるポリタンパク質に含まれる自己タンパク質セグメントは全て、同じ自己タンパク質セグメントタイプ又は異なる自己タンパク質セグメントタイプであってもよく、自己タンパク質セグメントタイプは、
（ｉ）完全長自己タンパク質；又は
（ｉｉ）Ｂ細胞エピトープを含有する切断型自己タンパク質；又は
（ｉｉｉ）自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する自己タンパク質の誘導体
を含む。

【0033】

好ましくは、本発明によるポリタンパク質の自己タンパク質セグメントは、完全長自己タンパク質、好ましくは同じ完全長自己タンパク質、例えばＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－αの複数コピーである。完全長形態が成熟形態とは異なる自己タンパク質の場合、本発明の目的のための「完全長」という用語は、当該自己タンパク質の完全長成熟形態を指す。

【0034】

より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、３つの自己タンパク質セグメントを含み、自己タンパク質セグメントは全て完全長自己タンパク質である。本発明によるポリタンパク質における完全長自己タンパク質の使用（選択肢（ｉ））は、個々の自己タンパク質セグメントが原則としてそれらの天然の折畳みを適合させることができるという利点を有する。このため、自己タンパク質セグメントは、宿主の自己タンパク質セグメントが由来する天然自己タンパク質と同じ線状エピトープだけでなく、同じコンフォメーションＢ細胞エピトープも提供する。これにより、本発明によるポリタンパク質中のこのタイプの自己タンパク質セグメントは、標的自己タンパク質に対する宿主の自己寛容を破壊するのに特に有効になる。

【0035】

本発明によるポリタンパク質に含まれる（１又は複数の）自己タンパク質セグメントは、切断型自己タンパク質であってもよい。この場合、切断は、残りのタンパク質セグメントが依然として少なくとも１つの機能性Ｂ細胞エピトープを含有するように行われなければならない。本発明によるポリタンパク質におけるＢ細胞エピトープを含有する切断型自己タンパク質の使用（選択肢（ｉｉ））は、自己タンパク質セグメントのサイズを縮小して、（１又は複数の）関連するＢ細胞エピトープを主に含有することができるという利点を有する。このようにして、本発明によるポリタンパク質はサイズを小さくすることができ、これはクローン性及び送達を助けることができ、及び／又はポリタンパク質の特定のサイズ制限を超えずに、本発明によるポリタンパク質に更に多くの自己タンパク質セグメントを付加することが可能になる。

【0036】

本発明によるポリタンパク質に含まれる（１又は複数の）自己タンパク質セグメントは、全長自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する自己タンパク質の誘導体であり得る。更により好ましくは、自己タンパク質の誘導体は、全長自己タンパク質に対して９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。本発明による自己タンパク質セグメントは、同時に、本発明による切断型自己タンパク質及び自己タンパク質の誘導体の定義を満たすことができる。

【0037】

好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、全長自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する自己タンパク質及び／又は自己タンパク質の誘導体のみを含有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、３つの自己タンパク質セグメントを含有し、自己タンパク質セグメントは、全長自己タンパク質及び／又は全長自己タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する自己タンパク質の誘導体である。本発明によるポリタンパク質における誘導体自己タンパク質の使用（選択肢（ｉｉｉ））は、複数の理由で有利であり得、例えば、本発明によるより安定な又はより可溶性のポリタンパク質の発現を可能にし得る。これらの誘導体自己タンパク質の損なわれた又は完全に阻害された生物学的機能をもたらす突然変異を有する、本発明によるポリタンパク質中の誘導体自己タンパク質を使用することも有利である。これに関して、受容体関与及び／又はシグナル伝達能の喪失につながる突然変異を有する自己タンパク質を使用することが特に考えられる。そのような誘導体自己タンパク質は、例えば、受容体結合に重要な残基の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。

【0038】

一実施形態では、本発明によるポリタンパク質の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントは、サイトカインに由来する。本明細書で定義されるサイトカインは、当技術分野におけるその通常の意味を有する。サイトカインは、例えば、構造によってファミリー、例えば、ＩＬ－１ファミリー、造血因子スーパーファミリー、インターフェロン及び腫瘍壊死因子ファミリーに分類することができる。ＩＬ－１ファミリーの場合、このファミリーのほとんどのメンバーは、切断されて（アミノ末端ペプチドを除去して）成熟サイトカインを産生する不活性プロタンパク質として産生されることが知られている。そのような場合、全長タンパク質は、当該自己タンパク質の成熟形態を指す。この規則の例外はＩＬ－１－アルファであり、プロタンパク質とその切断型の両方が生物学的に活性である。サイトカインの造血系スーパーファミリーには、エリスロポエチン及び成長ホルモン等の非免疫系成長及び分化因子、並びに先天性免疫及び適応免疫における役割を有するインターロイキンが含まれる。活性化Ｔ細胞によって作られる可溶性サイトカインの多くは、造血因子ファミリーのメンバーである。ＴＮＦ－αがプロトタイプであるＴＮＦファミリーは、適応免疫及び自然免疫において重要な機能を有する１７を超えるサイトカインを含む。サイトカインには、コロニー刺激因子も含まれる。

【0039】

一実施形態では、本発明によるポリタンパク質の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントは、インターロイキンファミリーメンバー、腫瘍壊死因子ファミリーメンバー、インターフェロンファミリーメンバー及び／又はコロニー刺激因子ファミリーメンバーからなる群から選択されるサイトカインに由来する。インターロイキンファミリーメンバーの例は、ＩＬ－１－ａｌｐｈａ、ＩＬ－１－ｂｅｔａ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ－Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８Ａ，Ｂ、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６－ａｌｐｈａ、ｂｅｔａ、若しくはｇａｍｍａ、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－３９、ＩＬ－４０、ＩＬ－４１、及びＩＬ－４２、ＴＳＬＰ、白血病抑制因子及びオンコスタチンからなる群から選択されるインターロイキン、又はそのファミリーメンバーである。ＴＮＦファミリーメンバー自己タンパク質の例は、ＴＮＦ－α、リンホトキシン（ＬＴ）－α、ＬＴ－β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＷＥＡＫ及びＢＡＦＦからなる群から選択されるタンパク質である。ＩＦＮファミリーメンバー自己タンパク質の例は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－γからなる群から選択されるタンパク質である。コロニー刺激因子サイトカインの例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。好ましくは、自己タンパク質セグメントは、単量体、ホモ二量体、ホモ三量体又はホモ四量体である自己タンパク質、特にサイトカインに由来する。好ましい実施形態では、本発明によるポリタンパク質は、少なくとも２つ、特に２つ又は３つの自己タンパク質セグメントを含み、ここで自己タンパク質セグメントは、ＩＬ－１－ａｌｐｈａ、ＩＬ－１－ｂｅｔａ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ－Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２８Ａ，Ｂ、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３６－ａｌｐｈａ、ｂｅｔａ、若しくはｇａｍｍａ、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－４０、ＩＬ－４１及びＩＬ－４２、ＴＳＬＰ、白血病阻害因子、オノコスタチン、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインに由来する。

【0040】

特に好ましい実施形態では、本発明によるポリタンパク質の少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの自己タンパク質セグメントは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－α、特にイヌＩＬ－４、イヌＩＬ－５、イヌＩＬ－１３、イヌＩＬ－３１、イヌＩＬ－３３又はイヌＴＮＦ－αに由来する。好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、３つの同じ自己タンパク質セグメントを含み、これらは全て、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３及びＴＮＦ－αからなる群から、特にイヌＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３及びＴＮＦ－α（この場合、宿主はイヌ種である）からなる群から選択される同じ自己タンパク質に由来する。

【0041】

別の特に好ましい実施形態では、本発明によるポリタンパク質の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントは、ＩＬ－３１、特にイヌＩＬ－３１に由来する。したがって、好ましくは、自己タンパク質はＩＬ－３１、特にイヌＩＬ－３１であり、この場合、宿主はイヌ種である。

【0042】

（イヌ）自己タンパク質（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－α）に関連する「由来する」という用語は、自己タンパク質セグメントが、（ｉ）それぞれの全長（イヌ）タンパク質、（ｉｉ）Ｂ細胞エピトープを含有する切断型（イヌ）形態のタンパク質、又は（ｉｉｉ）それぞれの全長（イヌ）自己タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する（イヌ）タンパク質の誘導体から選択されることを意味する。

【0043】

本発明者らの実験は、ＩＬ－３１に由来する自己タンパク質セグメント、特にイヌＩＬ－３１に由来するタンパク質セグメントを有する本発明によるポリタンパク質をイヌ宿主に投与することによって、（イヌ）ＩＬ－３１タンパク質に対する自己抗体を効率的に生じさせることができることを示した。本発明によるこのポリタンパク質は、（イヌ）ＩＬ－３１に対する自己寛容を特に効率的に破壊することができることが実証された。

【0044】

これは、特に、イヌＩＬ－４、イヌＩＬ－５、イヌＩＬ－１３、及びイヌＩＬ－３３に由来し、イヌ宿主に投与される自己タンパク質セグメント、並びにネコＩＬ－３１に由来し、ネコ宿主に投与される自己タンパク質セグメント、並びにウシＴＮＦ－α－ポリタンパク質に由来し、ウサギ宿主に投与される自己タンパク質セグメントと共に、本発明によるポリタンパク質を投与することによって、多数の他の自己タンパク質に由来する自己タンパク質セグメントで示された。それぞれの（イヌ／ネコ／ウシ）ＩＬタンパク質に対する抗体が効率的に産生され、それに対する自己寛容が中和抗体産生の形態で効率的に破壊された。したがって、本発明は、本明細書に提示される例に決して限定されないが、種内及び種間の両方で他の自己タンパク質を容易に包含する。

【0045】

アミノ酸配列に関連して本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性」等の用語は、２つ以上のアミノ酸配列間の配列関係を説明するために使用され、ａ）参照配列、ｂ）比較ウィンドウ、ｃ）配列同一性及びｄ）配列同一性のパーセンテージを含む用語の文脈で、及びそれと組み合わせて理解される。

【0046】

ｄ）「パーセント同一性」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加、置換又は欠失を含まない）と比較して付加、置換又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

【0047】

本発明によるポリタンパク質は、第２の構造成分として、非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープを含む。本明細書で使用される「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、したがってそれによって提示され得る短いペプチドを指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、８～１０アミノ酸長の短いペプチド及び１３～１７アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩペプチドに結合することができる。Ｔ細胞は、抗原の細胞内プロセシングに由来するペプチドエピトープが結合したＭＨＣ分子を認識することがよく知られている。所与のエピトープの免疫原性は、３つの因子：抗原からの適切なペプチド断片の生成、この断片に結合するＭＨＣ分子の存在、及び複合体を認識することができるＴ細胞の存在に依存する。

【0048】

Ｔ細胞エピトープに関連する「１又は複数」という用語は、同じ又は異なるＴ細胞エピトープが本発明によるポリタンパク質中に存在し得ることを意味する。したがって、本発明のポリタンパク質に含まれるＴ細胞エピトープは、長さ及び／又は配列が互いに異なり得る。

【0049】

１又は複数のＴ細胞エピトープは、人工Ｔ細胞エピトープペプチド配列及び非自己タンパク質、特に、しばしば特に強力なＴ細胞エピトープを有する病原性タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチド配列からなる群から選択することができる。Ｔ細胞エピトープが由来し得る適切な人工Ｔ細胞エピトープ又は適切な病原性タンパク質は、当業者に公知である。そのようなＴ細胞エピトープは、宿主への投与時に特に免疫原性である。

【0050】

好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、非宿主起源の１又は複数のユニバーサルＴ細胞エピトープを含む。最も好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、全てのＴ細胞エピトープがユニバーサルである１又は複数のＴ細胞エピトープを含む。本明細書で使用される「ユニバーサルＴ細胞エピトープ」という用語は、普遍的に免疫原性であり、多数のクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関連して認識され得るＴ細胞エピトープを指す。本発明によるポリタンパク質においてユニバーサルＴ細胞エピトープを使用することは、Ｔ細胞エピトープが選択された宿主から独立して特に免疫原性であるという利点を有する。

【0051】

最も好ましくは、本発明によるポリタンパク質に含まれる１又は複数のＴ細胞エピトープは、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ、特に（ｉ）配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を含む、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３９からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。更により好ましくは、１又は複数のＴ細胞エピトープは、配列番号１又は配列番号２に由来するか、又はそれと同一である。これらのＴ細胞エピトープは、特に免疫原性のユニバーサルＴ細胞エピトープである（Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ”，Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９．１２（１９８９）：２２３７－２２４２）。

【0052】

更により好ましくは、本発明によるポリタンパク質に含まれるＴ細胞エピトープは、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ、特に
（ｉ）配列番号１、配列番号３９若しくは配列番号２と少なくとも９６、より好ましくは９７、最も好ましくは９８若しくは９９％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。

【0053】

本発明によるポリタンパク質では、非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープは、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間に及び／又はそれに隣接して位置する。好ましくは、非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープは、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間に位置し、更には隣接されていてもよい。この文脈における「隣接する」という用語は、「最もＮ末端のタンパク質セグメントの上流及び／又は最もＣ末端のタンパク質セグメントの下流」を意味する。

【0054】

本発明によるポリタンパク質は、更なる成分を更に含むことができる。そのような更なる成分の一例は、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープとの間の１又は複数のリンカーである。これらのリンカーは、特に、４～５０アミノ酸長、好ましくは４～３０アミノ酸長、最も好ましくは４～２０アミノ酸長であり得る。柔軟なリンカーは、本発明によるポリタンパク質中の個々の自己タンパク質セグメントの独立した折畳みを促進することができるので、リンカーの使用は有利である。

【0055】

ポリタンパク質自体の代わりに、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを使用する場合、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡは、１又は複数のＥＲ導入シグナルを更にコードすることもできる。人工ＥＲシグナルのアミノ酸配列の例は、配列番号６７である。これにより、宿主においてＤＮＡ又はＲＮＡからポリタンパク質が発現されると、ポリタンパク質がＥＲに導入され、その後分泌されることが保証される。

【0056】

好ましくは、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物に使用するためのポリタンパク質は、サイトカインに由来する、好ましくは配列番号３、４１、４６、５０、５１、５６、６０、６４、又は配列番号６８～２０１のいずれかのアミノ酸配列を有する自己タンパク質からなる群から選択される自己タンパク質に由来する宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する１つ又は複数のＴ細胞エピトープと、を含み、１つ以上のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１、配列番号３９若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。最も好ましくは、１又は複数のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１及び配列番号２からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。

【0057】

より好ましくは、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破るためにワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－α、最も好ましくはＩＬ－３１に由来する宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する１つ又は複数のＴ細胞エピトープと、を含み、１つ又は複数のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１、配列番号３９又は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。最も好ましくは、１又は複数のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１及び配列番号２からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。

【0058】

より好ましくは、イヌ宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためにワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、イヌインターロイキンに由来する、特にイヌＩＬ－４、イヌＩＬ－５、イヌＩＬ－１３、イヌＩＬ－３１又はイヌＩＬ－３３に由来する、最も好ましくはイヌＩＬ－３１に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する１つ又は複数のＴ細胞エピトープと、を含み、１つ又は複数のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１、配列番号３９又は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。最も好ましくは、１又は複数のＴ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１及び配列番号２からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである。

【0059】

本発明者らの実験は、そのようなポリタンパク質をイヌ宿主に投与することによって、イヌＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１又はＩＬ－３３タンパク質に対する自己抗体、特に中和自己抗体を、特にＢクラス効率的な様式で生じさせることができることを示している。本発明者らの同様の実験はまた、そのようなポリタンパク質をネコ宿主に投与することによって、ネコＩＬ－３１に対する自己抗体、特に中和自己抗体も、特にＢクラス効率的な様式で産生され得ることを示した。同様に、本発明によるポリタンパク質形態のＴＮＦ－αをウサギに投与すると、ＴＮＦ－α抗原に応答する効率的な抗体産生が誘導された。したがって、本発明によるそのようなポリタンパク質は、イヌ、ネコ、並びにウシ自己タンパク質を含むがこれらに限定されない自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するのに非常に効率的である。

【0060】

更により好ましくは、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物に使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４若しくは配列番号４０と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号４０の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４若しくは配列番号４０と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号４０の配列を有する。配列番号４及び配列番号４０は、それらのＮ末端のみが異なる。配列番号４と比較して、配列番号４０は、Ｎ末端に３つの更なるアミノ酸（「ＳＨＭ」）を有する。配列番号４及び配列番号４０によってコードされるポリタンパク質の異なるＮ末端は、Ｎ末端ＥＲシグナル配列の異なる切断事象に起因する。本発明者らの実験は、配列番号４若しくは配列番号４０又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、イヌ宿主に投与すると、サイトカインＩＬ－３１に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0061】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号６１と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号６１の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号６１と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号６１の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号６１又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、ネコ宿主に投与すると、サイトカインＩＬ－３１に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0062】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４２又は４３と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４２又は４３の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４２と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４２又は４３の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号４２若しくは４３又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、イヌ宿主に投与すると、サイトカインＩＬ－５に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0063】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号５７と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号５７の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号５７と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号５７の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号５７又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、イヌ宿主に投与すると、ＩＬ－４に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0064】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４７と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４７の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号４７と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号４７の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号４７又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、イヌ宿主に投与すると、ＩＬ－１３に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0065】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号５４と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号５４の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号５４と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号５４の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号５４又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、イヌ宿主に投与すると、サイトカインＩＬ－３３に対する自己抗体、特に中和抗体の産生を含む非常に効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0066】

別の好ましい実施形態では、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物において使用するためのポリタンパク質は、（ｉ）配列番号６５と少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号６５の配列を有する。より好ましくは、本発明によるポリタンパク質は、（ｉ）配列番号６５と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は（ｉｉ）配列番号６５の配列を有する。本発明者らの実験は、配列番号６５又は前述の配列同一性を有するその誘導体をコードするポリタンパク質を使用して、ウサギ宿主に投与すると、サイトカインＴＮＦ－αに対する効率的な免疫応答を誘導することができることを示した。

【0067】

当業者は、本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を適切な発現ベクターにクローニングする方法及び本発明のポリタンパク質を産生する方法を知っている。

【0068】

いくつかの実施形態では、本発明のポリタンパク質は、培養細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、特にＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３－Ｆ）の急速増殖変異体、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞での発現によって産生される。真核細胞における発現は、発現されたポリタンパク質が宿主のものと類似又は同一のグリコシル化パターンを備えるという利点を有する。好ましくは、（イヌ）ＩＬ－４、（イヌ）ＩＬ－５、（イヌ）ＩＬ－１３及び／又は（イヌ又はネコ）ＩＬ－３１を含むポリタンパク質は、哺乳動物発現を用いて産生される。

【0069】

いくつかの実施形態では、本発明のポリタンパク質は、原核細胞、例えばエシェリキア（Ｅ．）コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）ｃｏｌｉ）等の細菌細胞での発現によって産生される。任意の適切な細菌株を使用することができる。適切な細菌株は当技術分野で周知であり、当業者はそれらの系に適合するものを選択することができる。適切な株には、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１－ＡＩ、Ｔｕｎｅｒ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ、ＢＬ２１ｔｒｘＢ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＮＥＢｅｘｐｒｅｓｓ及びＭ１５が含まれるが、これらに限定されない。本発明のポリタンパク質、特に本発明の（イヌ）ＩＬ－３３及びウシＴＮＦ－αポリタンパク質の発現に特に適した株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びその変異体である。細菌細胞における発現は、細菌の生理学がより複雑でなく、コストが比較的低く、生成時間が短く、生成物の収率が高いため、簡単な手順という利点を有する。

【0070】

本発明のポリタンパク質は、核酸によってコードされ得る。核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。核酸はまた、修飾核酸塩基を有する１又は複数のヌクレオチドを含むことができる。これにより、例えば、使用される核酸をヌクレアーゼの攻撃に対して特に安定にすることができる。特に適切なベクターに包含される場合、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、本発明のワクチン組成物に直接使用することができる。次いで、ポリタンパク質は、他のＤＮＡ及びＲＮＡワクチンについて周知であるように、宿主の内部で発現される。

【0071】

本発明のポリタンパク質をコードする核酸は、真核細胞又は目的の宿主におけるポリタンパク質の効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、コドンを、ヒト、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、細菌等における発現のために最適化することができる（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅを参照のこと）。コドン最適化のためのプログラムはフリーウェア（例えば、ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲのＯＰＴＩＭＩＺＥＲ；ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ＿ｏｐｔ．ｈｔｍｌのＧｅｎＳｃｒｉｐｔからのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標））として入手可能である。市販のコドン最適化プログラムも入手可能である。

【0072】

本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡは、少なくとも１つのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。ＤＮＡコード配列は、目的の真核細胞又は宿主における発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。プロモーター制御配列は、構成的プロモーター制御配列であり得る。

【0073】

真核細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞における発現に適した構成的プロモーター制御配列としては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）－αプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの断片、又は前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0074】

細菌細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞での発現に適したプロモーター制御配列には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｃ及びｔａｃプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ファージプロモーターｐＬ、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーター、ＰＰＢＡＤプロモーター、ＰＢＡＤプロモーター、それらの断片、又は前述のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0075】

本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡはまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル等）及び／又は少なくとも１つの転写終結配列に連結することができる。これは、哺乳動物発現系を使用する場合に特に有利である。

【0076】

本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡは、ベクター中に存在することができる。適切なベクターには、プラスミドベクターが含まれる。好適なプラスミドベクターの非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ及びそれらの変異体が挙げられ、ｐｃＤＮＡ型ベクターが特に好適である。ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列等）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点等を含むことができる。更なる情報は、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３ ｏｒ ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１に見出すことができる。

【0077】

本発明のポリタンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡは、５’キャップ及び／又は３’ポリアデニル化され得る。

【0078】

更に、本発明のポリタンパク質をコードする核酸は、自己複製ＲＮＡであり得る。免疫に適した自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡワクチンの分野で周知である。自己複製ＲＮＡ分子は、真核細胞に送達されると、それ自体の転写によって複数の娘ＲＮＡの産生をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得る＋鎖分子である。自己複製ＲＮＡ分子の翻訳は、本発明のコードされたポリタンパク質に隣接して、最初に送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物及びセンス転写物の両方を産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼも提供する。この一連の転写の全体的な結果は、導入された自己複製ＲＮＡの数の増幅である。このようにして、コードされたポリタンパク質は、送達された自己複製ＲＮＡを有する細胞の主要なポリペプチド産物になる。適切なアルファウイルス自己複製ＲＮＡは、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東ウマ脳炎ウイルス又はベネズエランウマ脳炎ウイルス由来のレプリカーゼを使用することができる。

【0079】

したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）本発明のポリタンパク質をコードする。ポリメラーゼは、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。天然のアルファウイルスゲノムは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするが、本発明では、自己複製ＲＮＡ分子がアルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、本発明に使用される好ましい自己複製ＲＮＡは、それ自体のＲＮＡコピーの細胞産生をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生はもたらさない。ＲＮＡワクチンの分野から知られているように、感染性ビリオンを産生するのに必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明で使用される自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの場所は本発明のポリタンパク質をコードする構築物によって取られる。したがって、本発明に適した自己複製ＲＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを有することができる。１つのオープンリーディングフレームはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、他方のオープンリーディングフレームは本発明のポリタンパク質をコードする。自己複製ＲＮＡは、例えば、本発明の１又は複数の更なるポリタンパク質をコードするために、更なる（例えば下流）オープンリーディングフレームを有し得る。

【0080】

ワクチン組成物
本発明は更に、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物を提供する。本発明によるワクチン組成物は、２つの必須成分：
ａ）ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、ポリタンパク質が、
－宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメント；及び
－少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１つ又は複数のＴ細胞エピトープ
を含む、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡと、
ｂ）１つ以上の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、
を含む。

【0081】

ワクチン組成物は、ワクチン組成物が宿主に投与された場合、自己タンパク質に対する自己抗体を産生することができる。

【0082】

ポリタンパク質は、上記の通りである。

【0083】

本発明のワクチン組成物は、アジュバントとして１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに関連して使用される用語「１又は複数」は、化学的に異なるオリゴヌクレオチドが本発明のワクチン組成物の一部であり得ることを意味する。例えば、異なる長さ、塩基配列又は糖リン酸骨格の相違のオリゴヌクレオチドを使用することができる。「１又は複数」の「１つ」は、単一のオリゴヌクレオチド分子を指すことを意味しない。

【0084】

本明細書で使用される「免疫賦活性オリゴヌクレオチド」は、脊椎動物の自然免疫系によって外来として検出され、それによって自然免疫応答経路を活性化することによって、脊椎動物において免疫応答を誘発するオリゴヌクレオチドである。

【0085】

典型的には、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは合成起源のものである。したがって、それらは、任意の所望の配列及び／又は糖リン酸骨格の修飾を用いて合成することができる。

【0086】

１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、線状の少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ分子である。しかしながら、一本鎖ＤＮＡ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、とりわけワトソン－クリック塩基対形成によってそれら自体又は互いに相互作用して、二次構造及び凝集体を形成し得る。しかしながら、一本鎖伸長は、免疫賦活性オリゴヌクレオチド中に常に存在するであろう。

【0087】

好ましくは、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドはＣｐＧオリゴデスオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。これらは、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」とそれに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指すが、本発明によるＯＤＮは、代わりに修飾されたホスホロチオエート骨格を有し得る。免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしてＣｐＧＯＤＮを使用することは、ＣｐＧジヌクレオチドがＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９によって感知される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を表すという利点を有する。ＴＬＲ９の活性化は、例えば、活性化Ｂ細胞の核因子「カッパ軽鎖エンハンサー」（ＮＦ－κＢ）に依存する異なる炎症促進性シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＮＦ－κＢの活性化は、典型的には、炎症促進性サイトカインの発現をもたらす。したがって、ＣｐＧ ＯＤＮは、本発明によるワクチン組成物中の特に強力なワクチンアジュバントである。

【0088】

好ましくは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ａクラス、Ｂクラス及びＣクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される。免疫賦活性オリゴヌクレオチドの「Ａ－クラス」、「Ｂ－クラス」及び「Ｃ－クラス」への分類は当業者に周知であり、例えばＶｏｌｌｍｅｒ，Ｊｏｒｇ．”ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２５．３－４（２００６）：１２５－１３４に記載されている。

【0089】

Ａクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、典型的には、中央ホスホジエステルＣｐＧ含有回文モチーフ及び部分的ホスホロチオエート修飾骨格、特にホスホロチオエート３’ポリＧストレッチを特徴とする。

【0090】

Ｂクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、典型的には、１又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを有する完全なホスホロチオエート骨格を特徴とする。

【0091】

Ｃクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、クラスＡ及びクラスＢの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの特性を示す。それらは、完全なホスホロチオエート骨格及び１又は複数の回文ＣｐＧ含有モチーフを含有する。

【0092】

本発明による免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、典型的には、１４ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、好ましくは１４ヌクレオチド～４００ヌクレオチド、より好ましくは１４ヌクレオチド～３００ヌクレオチド、更により好ましくは１４ヌクレオチド～２００ヌクレオチド、更により好ましくは１６ヌクレオチド～４０ヌクレオチド、最も好ましくは１８ヌクレオチド～３０ヌクレオチドの長さを有する。このサイズの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、インビトロで容易に合成することができ、ワクチンアジュバントとして有効であることが分かった。

【0093】

好ましくは、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ｂクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される。本発明の基礎となる研究は、本発明によるワクチン組成物中のＢクラス免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、本発明によるワクチン組成物に使用されるポリタンパク質の免疫原性を増強するのに特に効率的であることを実証した。

【0094】

１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドはまた、好ましくは、配列番号５又は配列番号６との少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、更により好ましくは８５％の配列同一性、更により好ましくは９０％、９５％又は９７％の配列同一性を含むことができる。

【0095】

核酸配列に関連して本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性」等の用語は、２つ以上の核酸間の配列関係を説明するために使用され、ａ）参照配列、ｂ）比較ウィンドウ、ｃ）配列同一性及びｄ）配列同一性の割合を含む用語の文脈で、及びそれと組み合わせて理解される。

【0096】

ａ）「参照シーケンス」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセット又はその全体、例えば、完全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であり得る。この場合、参照配列は配列番号５又は配列番号６である。

【0097】

ｂ）「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続した特定のセグメントへの言及を含み、ポリヌクレオチド配列は参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加、置換又は欠失を含まない）と比較して付加、置換、又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列にギャップを含めることによる参照配列との誤解を招くほど高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが典型的に導入され、マッチ数から減算されることを理解する。

【0098】

ｃ）比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０による相同性アライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：２４４４，１９８８による類似性検索方法によって；限定されるものではないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡののＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムを含む、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって行われ得、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－２４４，１９８８；Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１－６，１９９２；ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：７－３３１，１９９４によって十分に説明されている。データベース類似性検索に使用され得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーには、以下が含まれる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列についてのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；及び、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５．を参照されたい。上記のプログラムの新しいバージョン又は新しいプログラムは、間違いなく将来的に利用可能になり、本開示と共に使用され得る。

【0099】

ｄ）「パーセント同一性」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加、置換又は欠失を含まない）と比較して付加、置換又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

【0100】

好ましくは、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される。実験研究により、本発明によるワクチン組成物における配列番号５又は配列番号６をコードする免疫賦活性オリゴヌクレオチドの使用は、イヌ細胞におけるＮＦ－κＢ炎症誘発性応答経路の活性化において特に効率的であり、したがって、本発明によるワクチン組成物におけるポリタンパク質の免疫原性を強く増強することが示された。

【0101】

好ましくは、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、糖－リン酸骨格にホスホロチオエート、すなわち部分的にホスホロチオエート修飾された骨格を含む。より好ましくは、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオエート骨格を含む。ホスホロチオエート修飾は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる分解から保護されるという利点を有する。結果として、これらの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性が増加する。

【0102】

本発明のワクチン組成物は、追加の成分を含むことができる。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、本発明のワクチン組成物に含まれるポリタンパク質及び／又は免疫賦活性オリゴヌクレオチドにデポー効果を付与するアジュバントｃ）を更に含む。用語「デポー効果」は、注射部位からのポリタンパク質及び／又は免疫賦活性オリゴヌクレオチドの持続放出を指す。このようなアジュバントを本発明によるワクチン組成物に使用することは、ワクチン組成物中のポリタンパク質及び免疫賦活性オリゴヌクレオチドの免疫原性が更に増加し、その結果、ポリタンパク質中の自己タンパク質に対する自己寛容が特に効率的に破壊されるという利点を有する。

【0103】

最も好ましくは、デポー効果を付与するアジュバントは、溶液中で架橋された高分子量ゲルを形成することができるコポリマーアジュバントである。そのようなアジュバントの例は、Ｐｏｌｙｇｅｎ（商標）である。デポー効果を付与する適切なアジュバントはまた、界面活性剤系と組み合わせたミネラル又は代謝可能な油であり得る。本発明者らの実験は、溶液中で架橋高分子量ゲルを形成することができるコポリマーアジュバントが、本発明によるワクチン組成物の他の成分と高度に適合性であり、それに適した担体であり、同時に、伴侶動物及び家畜において特に高度の安全性を提供することを示した。

【0104】

本発明によるワクチン組成物は、特にポリタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含有する場合、リポソーム、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー又はカチオン性細胞透過性ペプチド及び／又は導入された核酸の半減期、細胞取込み及び翻訳能を増強する他の化学的手段を含有することができる。

【0105】

したがって、好ましくは、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するための本発明によるワクチン組成物は、ワクチン組成物が宿主に投与された場合、当該自己タンパク質に対する自己抗体を生じさせることができ、ワクチン組成物が、
ａ）ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、ポリタンパク質が、
－宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメント；及び
－少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープ
を含む、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡと、
ｂ）１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、
ｃ）デポー効果を付与するアジュバントと、
を含む。

【0106】

更により好ましくは、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するための本発明によるワクチン組成物は、ワクチン組成物が宿主に投与された場合に当該自己タンパク質に対する自己抗体を生じさせることができ、ワクチン組成物は、
ａ）ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡであって、ポリタンパク質が、
－宿主のサイトカイン、好ましくは宿主のＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－α、最も好ましくは宿主のＩＬ－３１に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント；及び
－少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープであって、１又は複数のＴ細胞エピトープが、（ｉ）配列番号１、配列番号３９若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１、配列番号３９及び配列番号２からなる群から選択される、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ、好ましくは、１又は複数のＴ細胞エピトープが、（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は（ｉｉ）配列番号１及び配列番号２からなる群から選択される破傷風毒素Ｔ細胞エピトープである、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープと、
を含む、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡと、
ｂ）１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドであって、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、配列番号５若しくは配列番号６との少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、更により好ましくは８５％の配列同一性、更により好ましくは９０％、９５％若しくは９７％の配列同一性を含むか、又は配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される、１又は複数の免疫賦活性オリゴヌクレオチドと、
ｃ）デポー効果を付与するアジュバントであって、溶液中で架橋高分子量ゲルを形成することができるコポリマーアジュバントである、デポー効果を付与するアジュバントと、
を含む。

【0107】

本発明者らの実験は、そのようなワクチン組成物が、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３及びＴＮＦ－α、特にイヌＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１及びＩＬ－３３、並びにネコＩＬ－３１及びウシＴＮＦ－αに対する自己寛容を破壊するのに特に有効であることを示した。これらの結果は、本発明が、多数の自己タンパク質を発現し、ワクチン接種するための柔軟なプラットフォームを提供し、本明細書に記載されたもののみに限定されないことを示す。

【0108】

当業者は、ワクチン組成物の個々の成分を同定及び分析する方法を知っている。特許請求されたワクチン組成物を分析するために、当業者は、典型的には、最初に、例えば液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣを使用することによって、個々の成分を互いに分離するための抽出及び／又は分離手順を行う。特許請求されるワクチン組成物に使用される核酸は、例えば、質量分析及び／又は配列決定分析によって分析することができる。ワクチン組成物中のタンパク質は、例えば質量分析によって分析することもできる。本発明のワクチン組成物に含有されるオリゴヌクレオチドの免疫賦活性特性は、レポーター細胞株、例えばイヌ単球細胞株（ＤＨ８２）を使用することによって評価することができ、これらのオリゴヌクレオチドのＮＦｋＢ刺激能を評価することが可能になる。

【0109】

ポリタンパク質の使用
本発明はまた、宿主の自己タンパク質に対する自己寛容を破壊するためのワクチン組成物における、本明細書に記載の、ポリタンパク質、ポリタンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はポリタンパク質をコードするＲＮＡの使用に関し、ポリタンパク質は、宿主の少なくとも２つの自己タンパク質セグメントと、少なくとも２つの自己タンパク質セグメントの間及び／又はそれらに隣接する非宿主起源の１又は複数のＴ細胞エピトープとを含む。本発明に至った研究では、本発明によるポリタンパク質の使用により、ポリタンパク質の自己タンパク質セグメントに対する自己抗体、特に中和自己抗体、したがってポリタンパク質の自己タンパク質セグメントが由来する宿主の天然自己タンパク質の産生を効率的に誘導することが可能になることが見出された。

【0110】

本発明によるポリタンパク質中の非宿主起源のＴ細胞エピトープの存在、特に破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの存在は、宿主の自己タンパク質セグメントに対する自己寛容を効率的に破壊することを可能にすると思われる。

【0111】

好ましい使用において、ポリタンパク質は、上記の本発明によるポリタンパク質について定義された特徴の１又は複数を有する。

【0112】

ワクチン組成物の使用
本明細書に記載のワクチン組成物は、対象の疾患を予防又は治療する方法での使用に適しており、方法は、ワクチン組成物を対象に投与する工程を含む。この方法は、対象において免疫応答を誘発するために有効量の免疫賦活性ワクチンを対象に投与することを含む。免疫応答は、対象の標的自己タンパク質に対する自己抗体、好ましくは中和抗体の誘導を含む。「対象」及び「宿主」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0113】

本明細書に記載のワクチン組成物を、特に（イヌ）ＩＬ－４、Ｌ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３又はＴＮＦ－αに由来する自己タンパク質セグメントを含有するポリタンパク質と共に使用すると、目的の対象において、それぞれの自己タンパク質に対する自己寛容を破壊することが可能である。

【0114】

自己抗体は自己タンパク質の機能を中和し、及び／又は対象における自己タンパク質の利用可能なレベルを低下させるのを助けるので、疾患を引き起こす自己タンパク質に対する対象の自己寛容の破壊は、この自己タンパク質によって引き起こされる又は影響される疾患を予防又は治療することを可能にすると考えられる。本発明のポリタンパク質中の自己タンパク質セグメントが由来する自己タンパク質は、本明細書では宿主中の標的自己タンパク質とも呼ばれる。

【0115】

本明細書で使用される対象は、特に、ヒト及び非ヒト動物等の哺乳動物種を意味し得る。したがって、対象は、ヒト及び非ヒト動物を含む哺乳動物である。好ましくは、対象は、非ヒト動物、特にウシ、家禽、ブタ、並びにネコ及びイヌ等のコンパニオンアニマルからなる群から選択される非ヒト動物である。最も好ましくは、対象は動物、特にウシ、家禽、ブタ、並びにネコ及びイヌ等のコンパニオンアニマルからなる群から選択される動物である。更により好ましくは、対象はイヌである。

【0116】

好ましくは、本明細書に記載のワクチン組成物は、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0117】

「アレルギー状態」という用語は、本明細書では、免疫系と身体に外来の物質との間の相互作用によって引き起こされる疾患又は障害として定義される。

【0118】

「掻痒状態」という用語は、本明細書では、緩和を得るために皮膚を擦る又は引っ掻くという衝動を生じさせる強い掻痒感を特徴とする疾患又は障害として定義される。

【0119】

より好ましくは、本明細書に記載のワクチン組成物は、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0120】

最も好ましくは、本明細書中に記載されるワクチン組成物は、アトピー性皮膚炎を予防又は治療するために使用される。

【0121】

好ましい実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－３１に由来する自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0122】

最も好ましくは、本明細書中に記載されるワクチン組成物は、イヌＩＬ－３１に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、アトピー性皮膚炎を予防又は処置するために使用される。

【0123】

別の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－５に由来する自己タンパク質セグメントを含み、
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；及び／又は
－好酸球性障害、特に好酸球性喘息、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、及び慢性副鼻腔炎、特に鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎
を予防及び／又は治療するために使用される。

【0124】

より好ましくは、本明細書中に記載されるワクチン組成物は、イヌＩＬ－５に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－アトピー性皮膚炎；又は
－好酸球性喘息又は鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎
を予防及び／又は治療するために使用される。

【0125】

別の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－４に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0126】

より好ましくは、本明細書中に記載されるＩＬ－４を含むワクチン組成物は、イヌＩＬ－４に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0127】

最も好ましくは、本明細書中に記載されるワクチン組成物は、イヌＩＬ－４に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、アトピー性皮膚炎を予防又は処置するために使用される。

【0128】

更なる実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－１３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0129】

より好ましくは、本明細書中に記載されるＩＬ－１３を含むワクチン組成物は、イヌＩＬ－１３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0130】

最も好ましくは、本明細書中に記載されるワクチン組成物は、イヌＩＬ－１３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、アトピー性皮膚炎を予防又は処置するために使用される。

【0131】

別の実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－３３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0132】

より好ましくは、本明細書中に記載されるＩＬ－３３を含むワクチン組成物は、イヌＩＬ－３３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、
－自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び癌からなる群から選択される慢性疾患；又は
－特にアトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症及び掻痒症からなる群から選択される掻痒状態；又は
－特にアレルギー性皮膚炎、夏季湿疹、蕁麻疹、ウマの肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、アレルギー性喘息、好酸球性喘息、及び好中球性喘息、鼻炎、慢性閉塞性肺疾患及び自己免疫に起因する炎症過程からなる群から選択されるアレルギー状態
を予防又は治療するために使用される。

【0133】

最も好ましくは、本明細書に記載のワクチン組成物は、イヌＩＬ－３３に由来する少なくとも２つの自己タンパク質セグメント、特に少なくとも３つの自己タンパク質セグメントを含み、アトピー性皮膚炎及び／又はアレルギー性鼻炎を予防又は治療するために使用される。

【0134】

「治療」、「治療すること」等は、治療的処置を指す。「予防」及び「予防すること」という用語は、予防的又は防止的手段を指す。処置又は予防を必要とする動物には、既に障害又は疾患状態を有する動物、並びに障害又は疾患状態が予防されるべき動物が含まれる。疾患又は障害の「治療すること」又は「予防すること」という用語は、疾患又は障害を予防又は保護すること（すなわち、臨床症状を発現させない）、疾患又は障害を阻害すること（すなわち、臨床症状の発生の停止又は抑制）、及び／又は疾患又は障害を軽減すること（すなわち、臨床症状の退行を引き起こす）を含む。最終的な１又は複数の誘導事象が未知であるか潜在的であり得るので、疾患又は障害を「予防すること」と「抑制すること」とを区別することは必ずしも可能ではない。したがって、ある種の「治療」を構成すると理解することもできる「予防的」という用語は、「予防すること」及び「抑制すること」の両方を包含する。したがって、「治療」という用語は、「予防」を含むことができる。

【0135】

本発明のワクチン組成物を投与するための様々な投与経路が利用可能である。選択される特定のモードは、選択される特定の対象群、対象の年齢及び全般的健康状態、治療される特定の状態、並びに治療有効性及び／又は予防有効性に必要な投与量に依存する。本発明の方法は、臨床的に許容できない有害作用を引き起こすことなく有効レベルの免疫応答をもたらす任意の投与様式を使用して実施され得る。

【0136】

治療は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。有効量は、レシピエント対象の標的自己タンパク質に対する自己抗体の産生を特徴とする免疫応答を誘発するのに十分である。そのような有効量は、レシピエント対象において自己抗体の産生を含む免疫応答を引き起こす任意の量である。自己抗体の産生を含む、本発明のワクチン組成物によって誘発される免疫応答の強度及び質を測定する方法も本発明の一部である（下記参照）。当業者は、有効量が、動物種、年齢、体重、疾患の病期、並びに当技術分野で公知の他の因子等の宿主因子に依存することを知っている。「ワクチン組成物の適切な有効量」という用語は、本発明のワクチン組成物に含まれる、タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡ、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを指し、及び任意選択的にデポー効果を付与するアジュバントの形態のポリタンパク質のμｇ単位の合計を指す。

【0137】

適切な有効量は、対象当たり約０．１μｇ～５０００μｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、有効量は、約０．５μｇ～約４５００μｇ、約０．５μｇ～約４５００μｇ、約０．５μｇ～約４５００μｇ、約１μｇ～約４０００μｇ、約１μｇ～約３５００μｇ、約１μｇ～約３０００μｇ、約１μｇ～約２５００μｇ、約１μｇ～約２０００μｇ、約１μｇ～約１５００μｇ、約１μｇ～約１０００μｇ、約１μｇ～約９００μｇ、約１μｇ～約８００μｇ、約１μｇ～約７００μｇ、約１μｇ～約６００μｇ、約１μｇ～約５００μｇ、約１μｇ～約４００μｇ、約１μｇ～約３００μｇの範囲であり得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかをヒト対象に投与することによって、ヒトにおいて免疫応答を誘発することができる。有効量は、レシピエント対象において標的化自己タンパク質に対する自己抗体の産生を含む免疫応答を誘発するのに十分である。例えば、ヒト用ワクチン組成物の有効量は、約０．１μｇ～約５０００μｇ／対象、約０．５μｇ～約５０００μｇ／対象、約１μｇ～約４５００μｇ／対象、約１μｇ～約４０００μｇ／対象又は約１μｇ～約３５００μｇ／対象であり得る。例として、ヒト対象に適した有効量は、約５０００μｇ、約４７５０μｇ、約４５００μｇ、約４２５０μｇ、約４０００μｇ、約３７５０μｇ、約３５００μｇ、約３２５０μｇ、約３０００μｇ、約２７５０μｇ、約２５００μｇ、約２２５０μｇ、約２０００μｇ、約１７５０μｇ、約１５００μｇ、１２５０μｇ、約１０００μｇ、約５００μｇ、約１００μｇ、約７５μｇ、約５０μｇ、約２５μｇ、約１０μｇ、約１μｇ又は約０．１μｇであり得る。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれかの有効量を非ヒト対象に投与することによって、非ヒト動物、特にイヌにおいて免疫応答を誘発することができる。有効量は、レシピエント対象、特にイヌにおける自己抗体の産生を含む免疫応答を誘発するのに十分である。例えば、非ヒト動物、特にイヌに対するワクチン組成物の有効量は、約０．１μｇ～約５０００μｇ／対象、約０．５μｇ～約５０００μｇ／対象、約１μｇ～約４５００μｇ／対象、約１μｇ～約４０００μｇ／対象又は約１μｇ～約３５００μｇ／対象であり得る。例として、非ヒト対象に適した有効量は、約５０００μｇ、約４７５０μｇ、約４５００μｇ、約４２５０μｇ、約４０００μｇ、約３７５０μｇ、約３５００μｇ、約３２５０μｇ、約３０００μｇ、約２７５０μｇ、約２５００μｇ、約２２５０μｇ、約２０００μｇ、約１７５０μｇ、約１５００μｇ、１２５０μｇ、約１０００μｇ、約５００μｇ、約１００μｇ、約７５μｇ、約５０μｇ、約２５μｇ、約１０μｇ、約１μｇ、０．５μｇ又は約０．１μｇであり得る。

【0140】

本明細書における数値に関連する「約」という用語の使用は、典型的には±５％以下で数値を変化させる測定誤差の影響を数値が受け得ることを示す。本明細書で「約」という用語と共に開示される数値はまた、そのまま、すなわち「約」という用語なしで開示されることを意味する。更に、本明細書に記載の数値範囲は、その範囲内のありとあらゆる値を含み、開示することを意味する。本明細書に開示される同じパラメータの範囲の上側及び下側の端点は全て、互いに組み合わせることができる。本明細書に開示される異なるパラメータの全ての範囲は、互いに組み合わせることができる。特に、異なる又は同じ「嗜好レベル」の範囲は、互いに特に適合する。

【0141】

ワクチン組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー、羽毛包法による卵内、経口、眼内、気管内、鼻腔内、又は当技術分野で公知の他の方法によって投与され得る。ワクチン組成物は皮下投与することができる。ワクチン組成物は、筋肉内投与することもできる。ワクチン組成物はまた、経口投与され得る。

【0142】

本発明の方法は、対象における疾患が予防又は治療されるように、対象において免疫応答を誘発する。

【0143】

投与は様々な方法で達成することができる。例えば、針（例えば皮下注射針）を介した注射は、特に筋肉内、皮下、眼内、腹腔内又は静脈内投与に使用することができる。代替として、無針注射を使用することができる。

【0144】

酵素結合免疫吸着測定
本発明のワクチン組成物、ポリタンパク質及び使用は、本発明者らが、本発明のポリタンパク質又はワクチン組成物を宿主において使用したときに産生される自己抗体を特異的に検出するために開発したアッセイによって補足される。このアッセイ法は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）であり、
ａ）試験表面に抗原を吸着させる工程と、
ｂ）試験表面上の遊離結合部位をブロックする工程と、
ｃ）抗原でコーティングされ、ブロックされた試験表面を、抗原に対する標識抗体及び抗原に対する試験対象の自己抗体を含む混合物とインキュベートする工程と、
ｄ）標識抗体の結合を検出する工程と、
を含む。

【0145】

自己抗体、特にサイトカインに対する自己抗体の検出は、典型的には困難を伴うが、本発明のアッセイによって克服される。例えば、従来技術のアッセイは、インタクトＩｇＧ分子とプラスチック又はニトロセルロース膜に付着した（組換え）抗原との間に生じる非特異的且つ低親和性の結合のために、偽陽性の試験結果をもたらすことが多い。真核細胞で産生されたサイトカイン等のグリコシル化抗原を検出のために使用すると、試験した血清中の抗多糖抗体のために偽陽性の結果をもたらすこともある。驚くべきことに、本発明のアッセイは、目的の標的宿主タンパク質に対する標識された既知の抗体と試験されるべき自己抗体との競合に依存するため、これらの困難を克服するとみられる。このアッセイの競合原理は、偽陽性結果を最小限に抑える。

【0146】

本発明によるアッセイの工程ａ）において、抗原が試験表面に吸着される。本明細書で使用される「吸着する」という用語は、「抗原が試験表面に接着するように試験表面を抗原とインキュベートする」ことを意味する。この文脈における「接着される」は、「結合される」又は「付着される」の意味で意味される。試験表面は、ウェルプレートの表面、特にプラスチックウェルプレート、好ましくはポリスチレンウェルプレートの表面等、ＥＬＩＳＡフォーマットに典型的に使用される任意の表面であり得る。

【0147】

本明細書で使用される「抗原」は、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するように宿主を誘導することが更に可能な、抗体が結合することができる分子又は分子の一部を指す。抗原は、１又は複数のエピトープを有し得る。好ましくは、工程ａ）で使用される抗原は、本発明のポリタンパク質、その単一タンパク質セグメント、又は本発明のポリタンパク質中のタンパク質セグメントが由来する標的自己タンパク質であるか、又はそれを含む。

【0148】

本発明によるアッセイの工程ｂ）において、試験表面上の遊離結合部位がブロックされる。これにより、試験表面への標識抗体及び試験される自己抗体の非特異的結合が防止される。工程ｂ）を達成するための適切な溶液、いわゆるブロッキング溶液は、他の典型的なＥＬＩＳＡフォーマットから当業者に知られている。ブロッキング液は、常にブロッキング剤を含む。ブロッキング剤は、タンパク質又はタンパク質の混合物であり得る。特に、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、カゼイン、脱脂粉乳又はゼラチンであり得る。好ましくは、ブロッキング剤はゼラチンである。ブロッキング剤として本発明のアッセイにおいてゼラチンを使用する場合、本発明者らの実験は、バックグラウンドシグナルが特に低いことを示した。

【0149】

本発明によるアッセイの工程ｃ）は、アッセイの競合原理を反映する。工程ｃ）は、工程ａ）の試験表面吸着抗原への結合のための標識抗体と試験対象自己抗体との競合を含む。好ましくは、標識抗体は標識中和抗体である。アッセイのために、目的の抗原に対する標識抗体が使用されるので、この抗体は、試験される自己抗体が標識抗体として使用される抗原に対して少なくとも同様に高い結合親和性を有する場合にのみ置換又はより優れている可能性がある。標識抗体及び試験対象の自己抗体を含む工程ｃ）で使用される混合物は、規定量の標識抗体を含む。この文脈における「定義された量」という用語は、当業者がアッセイに使用された標識抗体の量又は濃度を知っていることを意味する。好ましくは、２５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの標識抗体、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの標識抗体、最も好ましくは７５ｎｇ／ｍｌ～１２５ｎｇ／ｍｌの標識抗体が工程ｃ）の混合物において使用される。本発明者らの実験は、本発明のアッセイにおいてそのような濃度の標識抗体を使用すると、試験される自己抗体との競合が特に良好に検出され得ることを示した。

【0150】

好ましくは、工程ｃ）の２つの抗体間の競合は、一連の混合物を提供することによって試験され、一連の混合物は、試験される自己抗体の希釈度が異なる。試験対象の自己抗体は、１：１～１：２０．０００、好ましくは１：１～１：１５．０００、最も好ましくは１：１から１：１０．０００の希釈で使用することができる。

【0151】

「標識抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子並びにその部分、断片、ペプチド及び誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｓｅ、ＣＤＲ領域、パラトープ、又は工程ａ）の抗原に結合することができる抗体の任意の部分若しくはペプチド配列の両方を含むことを意味する。標識抗体は、抗原分子と特異的に反応し、それによって抗原分子を抗体に結合させることができる場合、工程ａ）の抗原と「結合することができる」と言われる。

【0152】

標識抗体には、キメラ抗体又はヘテロキメラ抗体、並びにその断片、部分、領域、ペプチド又は誘導体も含まれ、
任意の公知の技術、例えば、限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成又は組換え技術によって提供される。

【0153】

本発明のアッセイの工程ｄ）は、抗原結合標識抗体の検出に関する。標識された抗体の検出は、その標識に基づく。抗原に結合した標識抗体の量は、最終的に、試験対象の自己抗体が、試験表面に結合した抗原への結合において、標識抗体よりどれだけ効果的に優れていたかに依存する。

【0154】

抗体の適切な標識は当業者に公知である。例えば、当業者は、^１４Ｃ等の放射性同位体又はビオチン等のタグを標識として使用することができる。好ましくは、ビオチンが標識として使用される。標識としてのビオチンは、既存のタンパク質に直接結合することができるという利点を有する。

【0155】

放射標識された抗体は、放射活性を、例えば、放射測定検出器を用いて、又はシンチレーションカクテル及びシンチレーションカウンターを用いて測定することによって、直接検出することができる。

【0156】

タグの形態の抗体の標識は、レポーターにカップリングされた適切な標識結合部分を用いて検出することができる。ビオチンに適した標識結合部分は、例えばアビジン又はストレプトアビジンであり得る。ビオチン－ストレプトアビジン又はビオチン－アビジンのマッチング系は、２つのマッチングパートナーの結合が特に特異的且つ強力であるという利点を有する。

【0157】

標識結合部分にカップリングされた適切なレポーターは、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、又はＧＦＰ等の蛍光タグであり得る。蛍光タグは、それらの蛍光を測定することによって直接検出することができるが、レポーター酵素を使用して、測定可能な着色生成物をもたらす反応を触媒することができる。

【0158】

アルカリホスファターゼのための好適な比色基質は、例えば、４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ）である。ｐＮＰＰの脱リン酸化により、４０５ｎｍで強い吸収を有する水溶性黄色生成物が得られる。４０５ｎｍでの吸収は、ＥＬＩＳＡリーダー、例えばＥｐｏｃｈ Ｒｅａｄｅｒ（１５０１１５Ｅ）又はＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１Ｒｅｄｅｒ（１８０４２７Ｃ）で測定することができる。アルカリホスファターゼのための他の好適な比色基質は、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）であり、紫色の沈殿物を生じる。

【0159】

西洋ワサビペルオキシダーゼに適した比色基質は、例えば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び２，２’－アジノ－ジ［３－エチルベンズチアゾリン］スルホネート（ＡＢＴＳ）である。

【0160】

本発明のアッセイは、工程ａ）～ｄ）の間に、試験表面に吸着した抗原に結合していない抗体材料を除去するための洗浄工程等の追加の工程を含むことができる。

【0161】

本発明者らの実験は、本発明のアッセイが、ＩＬ－３１、特にイヌＩＬ－３１に対する自己抗体を検出するために特によく適していることを示した。この場合、（イヌ）ＩＬ－３１又はこのポリタンパク質の（イヌ）ＩＬ－３１タンパク質セグメントを含有する上記のようなポリタンパク質が抗原として使用され、標識抗体として、（イヌ）ＩＬ－３１の機能を乱すか又は更には中和する標識抗体が使用される。

【0162】

好ましくは、
－アミノ酸配列ＹＹＤＩＮ（配列番号８）、ＳＹＤＭＳ（配列番号９）又はＮＹＧＭＳ（配列番号１０）を有する可変重（Ｖ_Ｈ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
－アミノ酸配列ＷＩＦＰＧＤＧＧＴＫＹＮＥＴＦＫＧ（配列番号１１）、ＴＩＴＳＧＧＧＹＴＹＳＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、又はＴＩＳＹＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＩＫＧ（配列番号１３）を有する可変重鎖ＣＤＲ２；及び
－アミノ酸配列ＡＲＧＧＴＳＶＩＲＤＡＭＤＹ（配列番号１４）、ＡＲＱＮＷＶＶＧＬＡＹ（配列番号１５）、又はＶＲＧＹＧＹＤＴＭＤＹ（配列番号１６）を有する可変重鎖ＣＤＲ３
からなる群のうちの少なくとも１つを含む、イヌＩＬ－３１に対する標識抗体が、本発明のアッセイにおいて使用される。

【0163】

更に好ましくは、
－アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＨ（配列番号１７）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１を含む可変軽（Ｖ_Ｌ）鎖；
－ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１８）、又はＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＧＬＭＨ（配列番号１９）；
－アミノ酸配列ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２０）、ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号２１）、又はＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号２２）を有する可変軽鎖ＣＤＲ２；及び
－アミノ酸配列ＱＱＳＮＫＤＰＬＴ（配列番号２３）、ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ（配列番号２４）、又はＱＱＳＲＥＹＰＷＴ（配列番号２５）を有する可変軽鎖ＣＤＲ３
からなる群の少なくとも１つを含むイヌＩＬ－３１に対する標識抗体が、本発明のアッセイにおいて使用される。

【0164】

より好ましくは、
ａ）（配列番号２６）、（配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、（配列番号３１）又は（配列番号３２）を含む可変軽鎖；
ｂ）（配列番号３３）、（配列番号３４）、（配列番号３５）、（配列番号３６）、（配列番号３７）又は（配列番号３８）を含む可変重鎖
からなる群の少なくとも１つを含む、イヌＩＬ－３１に対する標識抗体が、本発明のアッセイにおいて使用される。

【0165】

このような標識中和抗体は、イヌＩＬ－３１に非常に効率的に結合する（国際公開第２０１３／０１１４０７を参照）。市販の抗体ロキベトマブは、イヌＩＬ－３１に対する中和自己抗体を検出するための本発明によるアッセイ方法における使用に特に適している。

【0166】

配列表
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該配列表ファイルの名前は２１０７４１ＷＯ＿ＳＴ２５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿．ｔｘｔであり、サイズは９７３ＫＢである。
配列番号１は、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープｐ２のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープｐ４のアミノ酸配列である。
配列番号２は、破傷風毒素Ｔ細胞エピトープｐ３０のアミノ酸配列である。
配列番号３は、イヌＩＬ－３１のアミノ酸配列である。
配列番号４は、実施例１３ａのワクチンに使用されるｃＩＬ－３１ポリタンパク質のアミノ酸配列の一バージョンである。
配列番号４０は、実施例１３ａのワクチンに使用されるｃＩＬ－３１ポリタンパク質のアミノ酸配列の別のバージョンである。
配列番号４０は、そのＮ末端のみが配列番号４と異なる。配列番号４と比較して、配列番号４０は、Ｎ末端に３つの更なるアミノ酸（「ＳＨＭ」）を有する。配列番号４及び配列番号４０によってコードされるポリタンパク質の異なるＮ末端は、Ｎ末端ＥＲシグナル配列の異なる切断事象に起因する。
配列番号５は、免疫賦活性オリゴヌクレオチド１６６８－ＰＴＯの核酸配列である。
配列番号６は、免疫賦活性オリゴヌクレオチド２００６－ＰＴＯの核酸配列である。
配列番号７は、実施例１ａのｃＩＬ－３１ポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリの核酸配列である。
以下の配列は、本発明によるアッセイ方法に適した抗イヌＩＬ－３１標識中和抗体に関連するアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８に関する。
配列番号４１は、イヌＩＬ－５のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、実施例１３ｂのワクチン構築物に使用されるｃＩＬ－５ポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、実施例１３ｂのワクチン構築物に使用することができるｃＩＬ－５ポリタンパク質の代替アミノ酸配列である。
配列番号４４は、実施例１ｂのｃＩＬ－５ポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５－ポリの核酸配列である。
配列番号４５は、実施例３ｂのｃＩＬ－５タンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５の核酸配列である。
配列番号４６は、イヌＩＬ－１３のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、実施例１３ｃのワクチン構築物に使用したｃＩＬ－１３ポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４８は、実施例１ｃのｃＩＬ－１３ポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－１３－ポリの核酸配列である。
配列番号４９は、実施例３ｃのｃＩＬ－１３タンパク質構築物をコードする細菌発現プラスミドｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－１３の核酸配列である。
配列番号５０は、完全長イヌＩＬ－３３タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ９７８６３）イヌＩＬ－３３－ＷＴのアミノ酸１１０～２６３のアミノ酸配列である。
配列番号５１は、イヌＩＬ－３３－ＣＳの変更されたアミノ酸配列であり、これは完全長イヌＩＬ－３３タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ９７８６３）のアミノ酸１１０～２６３であり、遺伝子産物の安定性を改善するために３つのシステイン残基がセリン（ＩＬ－３３－ＣＳ）で置き換えられている。
配列番号５２は、実施例３ｄのｃＩＬ－３３＿ＷＴタンパク質構築物をコードするプラスミドｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ３３－ＷＴの核酸配列である。
配列番号５３は、実施例３ｅのｃＩＬ－３３＿ＣＳタンパク質構築物をコードするプラスミドｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ３３－ＣＳの核酸配列である。
配列番号５４は、実施例１３ｄのワクチン構築物に使用されるｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５５は、実施例１ｄのｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ３３－（ＣＳ－）ポリの核酸配列である。
配列番号５６は、イヌＩＬ－４のアミノ酸配列である。
配列番号５７は、実施例１３ｅのワクチン構築物に使用したｃＩＬ－４ポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５８は、実施例１ｅのｃＩＬ－４ポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５－ポリの核酸配列である。
配列番号５９は、実施例３ｆのｃＩＬ－４タンパク質構築物をコードする細菌発現プラスミドｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－４の核酸配列である。
配列番号６０は、ネコＩＬ－３１のアミノ酸配列である。
配列番号６１は、実施例１３ｆのワクチン構築物に使用したネコＩＬ－３１ポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６２は、実施例１ｇのネコＩＬ－３１ポリタンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌＩＬ３１－ポリの核酸配列である。
配列番号６３は、実施例３ｇのネコＩＬ－３１タンパク質構築物をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１の核酸配列である。
配列番号６４は、ウシＴＮＦ－αのアミノ酸配列である。
配列番号６５は、実施例６ｆの免疫に使用したウシＴＮＦ－αポリタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６６は、実施例１ｈのウシＴＮＦ－αポリタンパク質構築物をコードする細菌発現プラスミドｐＥＴ３０ａ－ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリの核酸配列である。
配列番号６７は、所与の実施例において哺乳動物発現に使用される人工ＥＲ移入シグナルのアミノ酸配列である。
配列番号６８～２０１は、配列表に記載のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２０２～３２９は、実施例１３ｇのワクチン構築物において特に有用なポリタンパク質実施形態のアミノ酸配列である。

【0167】

［実施例］
［実施例１ａ］
本発明によるＩＬ－３１ポリタンパク質の設計
３コピーの成熟イヌＩＬ－３１タンパク質を含むポリタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を設計し、ここで、成熟イヌＩＬ－３１（ｃＩＬ－３１）タンパク質は破傷風毒素Ｔ細胞エピトープによって互いに分離され、Ｃ末端成熟ｃＩＬ－３１には２つの追加の破傷風毒素Ｔ細胞エピトープが続く（図１参照）。コードされたポリタンパク質は、Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナル及びＣ末端にＨｉｓ_６タグを更に含む（図１参照）。このＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞における発現を改善するためにポリタンパク質の開始コドンの上流にコザック配列を含有し、簡単なクローニングのために隣接する固有の制限酵素部位を含有するように更に設計された。このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにクローニングし、７６３７ｂｐサイズのベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ（配列番号７及び図２のプラスミドマップ）を得た。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0168】

［実施例１ｂ］
本発明によるＩＬ－５ポリタンパク質の設計
実施例１ａのイヌＩＬ－３１ポリタンパク質の場合と同じ様式で、３コピーの成熟イヌＩＬ－５タンパク質を含むポリタンパク質（図３９を参照のこと）をコードするＤＮＡ構築物を設計した。ｃＩＬ－５－ポリタンパク質をコードするＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、７４３０ｂｐサイズのベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５－ポリを得た（配列番号４４及び図４０のプラスミドマップ）。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0169】

［実施例１ｃ］
本発明によるＩＬ－１３ポリタンパク質の設計
実施例１ａのイヌＩＬ－３１ポリタンパク質の場合と同じ様式で、３コピーの成熟イヌＩＬ－１３タンパク質を含むポリタンパク質（図４７を参照のこと）をコードするＤＮＡ構築物を設計した。ｃＩＬ－１３ポリタンパク質をコードするＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、７４１８ｂｐサイズのベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－１３－ポリを得た（配列番号４８及び図４８のプラスミドマップ）。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0170】

［実施例１ｄ］
本発明によるＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質の設計
３コピーの成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳタンパク質を含むｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質（ポリタンパク質－配列番号５４）をコードするＤＮＡ構築物を設計し、ここで成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳ（ｃＩＬ－３３）タンパク質は破傷風毒素Ｔ細胞エピトープによって互いに分離されており、Ｃ末端成熟ｃＩＬ－３３－ＣＳの後に２つの追加の破傷風毒素Ｔ細胞エピトープが続く（図６３参照）。ポリタンパク質は、図６３に示すように、人工的な開始メチオニン及びＨｉｓ_６タグを更に含む。

【0171】

このポリペプチド配列に基づいて、大腸菌における発現を改善するための開始ＡＴＧコドン、及び細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａへの簡単なサブクローニングのための隣接する固有の制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を含む、Ｈｉ６－ｃＩＬ３３－ＣＳ－ポリ（配列番号５５）をコードするＤＮＡを設計及び合成した。

【0172】

ＤＮＡ構築物をｐＥＴ３０細菌発現ベクターにサブクローニングし、６９５４ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－３３－ポリ（すなわち、ｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－３３－ＣＳポリ）を得た（図６４のプラスミドマップ）。

【0173】

本発明者らは、ｃＩＬ－３３－ＷＴの代わりにｃＩＬ－３３－ＣＳを塩基タンパク質として含むｃＩＬ－３３ポリフォームを構築した。本発明者らは、ヒトＩＬ－３３－ＷＴがＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞によって感度よく認識されることが知られているが、イヌＩＬ－３３－ＷＴは、ｃＩＬ－３３－ＣＳの場合のように、遊離システインをセリンに変異させた後にのみ感度よく認識されることを見出した（下記の実施例１２ｃを参照のこと）。理論に束縛されるものではないが、この突然変異は、ｃＩＬ－３３－ポリ構築物において不利であり得る遊離システインの潜在的な構造的責任を克服したと思われる。遊離システインのこの変異は、全てのＩＬ－３３構築物に必要ではないが、有利であり、本発明の好ましい実施形態である。

【0174】

［実施例１ｅ］
本発明によるＩＬ－４ポリタンパク質の設計
実施例１ａのイヌＩＬ－３１ポリタンパク質の場合と同じ様式で、３コピーの成熟イヌＩＬ－４タンパク質を含むポリタンパク質（図６８を参照のこと）をコードするＤＮＡ構築物を設計した。ｃＩＬ－４ポリタンパク質をコードするＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、７３７３ｂｐサイズのベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－４－ポリを得た（配列番号５８及び図６９のプラスミドマップ）。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0175】

［実施例１ｆ］
本発明によるネコＩＬ－３１ポリタンパク質の設計
３コピーの成熟ネコ（フェリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）；フェリス・シルヴェストリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ ｃａｔｕｓ））ＩＬ－３１タンパク質（配列番号６０）を含むポリタンパク質（配列番号６１）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号６２）を設計し、ここで、成熟ネコＩＬ－３１（ｆｅｌ－ＩＬ－３１）タンパク質は破傷風毒素Ｔ細胞エピトープによって互いに分離されており、Ｃ末端成熟ｆｅｌ－ＩＬ－３１には２つの追加の破傷風毒素Ｔ細胞エピトープが続く（図７４を参照）。コードされたポリタンパク質は、Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナル及びＣ末端にＨｉｓ_６タグを更に含む（図７４参照）。このＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞における発現を改善するためにポリタンパク質の開始コドンの上流にコザック配列を含有し、簡単なクローニングのために隣接する固有の制限酵素部位を含有するように更に設計された。このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにサブクローニングして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌＩＬ３１－ポリ（７５９７ｂｐ）を得た。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0176】

［実施例１ｇ］
本発明による更なるポリタンパク質実施形態の設計
ＤＮＡ構築物は、他のポリタンパク質をコードするように設計することができる。これは、以下のように達成することができる。

【0177】

ポリタンパク質は、配列番号６８～２０１の配列の１つを有する自己タンパク質の３つのコピーを含むように設計され、３つのコピーは破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（例えば、ｐ２、ｐ４、又はｐ３０）によって互いに分離され、Ｃ末端成熟タンパク質には、図１の例１ａ）の場合と同じ方法で２つの更なる破傷風毒素Ｔ細胞エピトープが続く。コードされるポリタンパク質は、Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含み、Ｃ末端にＨｉｓ_６タグを含むように設計することができる。

【0178】

このＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞における発現を改善するためにポリタンパク質の開始コドンの上流にコザック配列を含有し、簡単なクローニングのために隣接する固有の制限酵素部位を含有するように更に設計され得る。このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにサブクローニングして、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のための大量のトランスフェクショングレードプラスミドを調製することができる。

【0179】

あるいは、ＤＮＡ構築物は、例えば大腸菌における発現を改善するための開始ＡＴＧコドンを含み、細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａへの直接的なサブクローニングのための隣接する固有の制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を含むことによって、細菌における発現を改善するように設計することができ、ベクターｐＥＴ３０ａ－［ポリ］－ポリが得られる。

【0180】

［実施例１ｈ］
本発明によるウシＴＮＦ－αポリタンパク質の設計
ＴＮＦ－α（配列番号６５）タンパク質の３つのコピーを含むウシＴＮＦ－αポリタンパク質（ポリタンパク質－配列番号６５）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号６６）を設計し、ＴＮＦ－αタンパク質は破傷風毒素Ｔ細胞エピトープによって互いに分離されており、Ｃ末端のＴＮＦ－αには２つの更なる破傷風毒素Ｔ細胞エピトープが続く（図７７を参照）。ポリタンパク質は、図７７に示すように、人工的な開始メチオニン及びＨｉｓ_６タグを更に含む。ヘキサ－Ｇ／Ｓ－リンカーをこの構造で使用した。

【0181】

このポリペプチド配列に基づいて、大腸菌における発現を改善するための開始ＡＴＧコドン、及び細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａへの簡単なサブクローニングのための隣接する固有の制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を含む、Ｈｉ６－ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリ（配列番号６６）をコードするＤＮＡを設計及び合成した。

【0182】

ＤＮＡ構築物をｐＥＴ３０ａ細菌発現ベクターにサブクローニングし、７０１７ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ（＋）－ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリを得た（図７８のプラスミドマップ）。

【0183】

［実施例２ａ］
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における本発明によるｃＩＬ－３１ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を無血清Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、３７℃、８％ＣＯ_２でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓに適切な密度で播種した。トランスフェクションの当日に、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ及びトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備ができた細胞とともにフラスコに添加した。６日目に回収した細胞培養上清を、ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ（配列番号７及び図２のプラスミドマップ）から発現したポリタンパク質の精製に使用した。産生された成熟ポリタンパク質は、もはやＮ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含まず、次いで配列番号４又は配列番号４０の配列を有すると予想される。配列番号４及び配列番号４０は、ＥＲ導入シグナルの開裂事象が異なるため、Ｎ末端が互いに異なる。

【0184】

発現したポリタンパク質の精製及び分析を以下のように行った：
細胞培養液を遠心分離した。その後、細胞培養上清を適切な流速でＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー精製カラムにロードした。洗浄及び適切な緩衝液での溶出後、溶出画分をプールし、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．２）である最終製剤緩衝液に交換した。

【0185】

精製されたポリタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって分析して、その分子量及び純度を決定した。そうするために、精製ポリタンパク質の濃度を、検量線の標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。以下の実施例においてｃＩＬ－３１ポリタンパク質又はｃＩＬ－３１ポリと呼ばれる、約１６ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性（ｃＩＬ－３１）－ｐ４－（ｃＩＬ－３１）－ｐ３０－（ｃＩＬ－３１）－ｐ３０－ｐ４－Ｈｉｓ_６ポリタンパク質を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0186】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、以下のローディング緩衝液を使用した：
－還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８。
－非還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８。

【0187】

還元及び非還元負荷緩衝液をそれぞれポリタンパク質試料に添加した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むポリタンパク質試料は、０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有していた。

【0188】

ポリタンパク質試料を還元負荷緩衝液と混合した後、１００℃で５～１０分間加熱した。

【0189】

還元又は非還元負荷緩衝液を含むポリタンパク質試料を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｎｏ．Ｍ４２０１２）のゲルチャンバに負荷した。これらのゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者によって概説されるように行った（１４０Ｖ、約６０分間）。その後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図３に示す。

【0190】

図３のクーマシーブルー染色ゲルのレーン１の主なバンドは、タンパク質配列から予想されるよりもわずかに大きい（５６８６５．０４Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。ｃＩＬ－３１タンパク質配列は８つのＮ－グリコシル化部位を含み、そのうちの７つは、ＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて修飾されている可能性が高い（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）ので、この差異は広範囲のＮ－グリコシル化から生じる可能性が高い。

【0191】

非還元条件下（図３のクーマシーブルー染色ゲルのレーン２）では、ロードされたタンパク質の約半分のみが、モノマーを示すバンド内を移動した。大きな割合は、二量体形態及び多量体形態であると思われる。

【0192】

［実施例２ｂ］
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における本発明によるｃＩＬ－５ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ（配列番号７）の代わりにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５－ポリ（配列番号４４；図４０のプラスミドマップを参照）を用いた以外は、実施例２ａのｃＩＬ－３１ポリタンパク質の発現と同様にして、ｃＩＬ－５のポリタンパク質の発現を行った。

【0193】

実施例２ａと同様に、産生された成熟ポリタンパク質は、もはやＮ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含まず、次いで配列番号４２の配列を有すると予想される。

【0194】

以下の実施例においてｃＩＬ－５ポリタンパク質又はｃＩＬ－５ポリと呼ばれる、約０．２３ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性（ｃＩＬ－５）－ｐ２－（ｃＩＬ－５）－ｐ３０－（ｃＩＬ－５）－ｐ３０－ｐ２－Ｈｉｓ_６ポリタンパク質を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0195】

染色されたゲルを図４１に示す。

【0196】

図４１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットのレーン１の主なバンドは、タンパク質配列から予想されるよりもはるかに大きい（５０４７７．６７Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。タンパク質配列は８つのＮ－グリコシル化部位を含み、そのうちの５つは、ＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて修飾されている可能性が高い（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）ので、この差異は広範囲のＮ－グリコシル化から生じる可能性が高い。

【0197】

非還元条件下（図４１のＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン２）では、負荷タンパク質の外観は還元条件下と比較して変化し、これはジスルフィド結合オリゴマー又はポリマー形態を示す。

【0198】

［実施例２ｃ］
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における本発明によるｃＩＬ－１３ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ（配列番号７）の代わりにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－１３－ポリ（配列番号４８；図４８のプラスミドマップを参照）を用いた以外は、実施例２ａのｃＩＬ－３１ポリタンパク質の発現と同様にして、ｃＩＬ－１３のポリタンパク質の発現を行った。

【0199】

実施例２ａと同様に、産生された成熟ポリタンパク質は、もはやＮ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含まず、次いで配列番号４７の配列を有すると予想される。

【0200】

以下の実施例においてｃＩＬ－１３ポリタンパク質又はｃＩＬ－１３ポリと呼ばれる、約０．６ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性（ｃＩＬ－１３）－ｐ２－（ｃＩＬ－１３）－ｐ３０－（ｃＩＬ－１３）－ｐ３０－ｐ２－Ｈｉｓ_６ポリタンパク質を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0201】

染色されたゲルを図４９に示す。

【0202】

図４９のＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットのレーン１の主なバンドは、タンパク質配列から予想されるよりもはるかに大きい（４７４９６．３９Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。タンパク質配列は１４つのＮ－グリコシル化部位を含み、そのうちの１３つは、ＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて修飾されている可能性が高い（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）ので、この差異は広範囲のＮ－グリコシル化から生じる可能性が高い。

【0203】

非還元条件下（図４９のＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン２）では、ロードされたタンパク質の外観は還元条件下のものと非常に類似しており、これは主にモノマー形態を示す。

【0204】

［実施例２ｄ］
大腸菌細胞における本発明によるｃＩＬ－３３ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
Ｅ．コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）株（ＤＥ３）を組換えプラスミドで形質転換した。単一コロニーを、関連する抗生物質を含有するＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＳ）培地に接種した。培養物を３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、次いで、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。発現をモニタリングするためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した。

【0205】

発現を以下のようにスケールアップした：グリセロールに保存した組換えＢＬ２１（ＤＥ３）を、関連する抗生物質を含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が約１．２に達したら、細胞培養物をＩＰＴＧを用いて１５℃で１６時間誘導した。遠心分離により細菌を回収した。

【0206】

発現したタンパク質の精製を以下のように行った：細菌ペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、続いて超音波処理した。遠心分離後の沈殿物を変性剤を用いて溶解させた。標的タンパク質を、Ｎｉカラムを使用する一段階精製によって得た。標的タンパク質を０．２２μｍフィルターで滅菌した後、一定分量で保存した。濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。タンパク質純度及び分子量は、標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した。

【0207】

発現タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、実施例２ａに記載のように行った。染色されたゲルを図６５に示す。

【0208】

およそ０．９ｍｇの可溶性（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）ｃＩＬ－１３－Ｈｉｓ_６を１Ｌ培養物の細菌ペレットから得た。図６５に示されるＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン２における主要なバンドのサイズは、タンパク質配列から予想される予測とよく一致している（６３６０４．１１Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。

【0209】

［実施例２ｅ］
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における本発明によるｃＩＬ－４ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリ（配列番号７）の代わりにプラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－４－ポリ（配列番号５８；図６９のプラスミドマップを参照）を用いた以外は、実施例２ａのｃＩＬ－３１ポリタンパク質の発現と同様にして、ｃＩＬ－４のポリタンパク質の発現を行った。

【0210】

ウェスタンブロット分析により、還元型試料では１００ｋＤａ～１２０ｋＤａの広いバンドとして組換え産物が明らかになったが、非還元型試料では１００～１２０ｋＤａ及び＞＞１２０ｋＤａの２つのファジーバンド領域が可視であった。

【0211】

実施例２ａと同様に、産生された成熟ポリタンパク質は、もはやＮ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含まず、次いで配列番号４７の配列を有すると予想される。

【0212】

以下の実施例においてｃＩＬ－４ポリタンパク質又はｃＩＬ－４ポリと呼ばれる、約４．５ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性（ｃＩＬ－４）－ｐ２－（ｃＩＬ－４）－ｐ３０－（ｃＩＬ－４）－ｐ３０－ｐ２－Ｈｉｓ_６ポリタンパク質を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0213】

染色されたゲルを図４９に示す。

【0214】

還元条件下での主なバンドは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算したタンパク質配列（５１０３９．３０Ｄａ）から予想されるよりもはるかに大きい。タンパク質配列は２０つのＮ－グリコシル化部位を含み、そのうちの１７は、ＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて修飾されている可能性が高い（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）ので、この差異は広範囲のＮ－グリコシル化から生じる可能性が高い。

【0215】

潜在的に不均一である可能性が高い大量のグリコシル化は、ウェスタンブロットにおけるタンパク質の広帯域出現、及びアミノ酸組成によって予測されるよりも大きなサイズを説明し得る。

【0216】

［実施例２ｆ］
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における本発明によるｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質の発現及び発現されたポリタンパク質の精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を無血清Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、３７℃、８％ＣＯ_２でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓに適切な密度で播種した。トランスフェクションの当日に、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１－ポリ及びトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備ができた細胞とともにフラスコに添加した。６日目に回収した細胞培養上清を、ｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１－ポリから発現したポリタンパク質の精製に使用した。産生された成熟ポリタンパク質は、もはやＮ末端に人工ＥＲ導入シグナルを含まず、次いで配列番号６１の配列を有すると予想される。

【0217】

発現したポリタンパク質の精製及び分析を以下のように行った：
細胞培養液を遠心分離した。その後、細胞培養上清を適切な流速でＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー精製カラムにロードした。洗浄及び適切な緩衝液での溶出後、溶出画分をプールし、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．２）である最終製剤緩衝液に交換した。

【0218】

精製されたポリタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって分析して、その分子量及び純度を決定した。そうするために、精製ポリタンパク質の濃度を、検量線の標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。およそ７．２９ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリ－Ｈｉｓ_６を１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0219】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、以下のローディング緩衝液を使用した：
－還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８。
－非還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８。

【0220】

還元及び非還元負荷緩衝液をそれぞれポリタンパク質試料に添加した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むポリタンパク質試料は、０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有していた。ポリタンパク質試料を還元負荷緩衝液と混合した後、１００℃で５～１０分間加熱した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むポリタンパク質試料を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｎｏ．Ｍ４２０１２）のゲルチャンバに負荷した。これらのゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者によって概説されるように行った（１４０Ｖ、約６０分間）。その後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。

【0221】

クーマシーブルー染色ＳＤＳゲルにおいて、ｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリは、還元されたゲルにおいて約８０ｋＤａの主なバンドによって表される。これは予想よりも大きく（成熟ポリペプチドの計算分子量：５５６１５．６５Ｄａ）、これはＮ－グリコシル化によって引き起こされ得る。ＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）、最大６つの位置が修正される可能性が高い。

【0222】

非還元ゲルレーンでは、ｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリバンドの移動度は還元されたものよりもいくらか速く、これは鎖内ジスルフィド結合に典型的であり、よりコンパクトな構造をもたらす。主なバンドの上の一部のスメアは、凝集した材料を示す。しかし、全体的にＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリが主に単量体であることを示唆している。

【0223】

［実施例２ｇ］
本発明による更なるポリタンパク質の発現及び精製
実施例１ｇで設計したポリタンパク質の発現は、実施例２ａ又は実施例２ｄのｃＩＬ－３１ポリタンパク質の発現と同様に行うことができる。産生された成熟ポリタンパク質は、構築物に含まれる場合、Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナルをもはや含まないと予想され、配列番号２０２～３２９の対応するアミノ酸配列を有すると予想される。

【0224】

実施例２ｈ：本発明によるウシＴＮＦ－αポリタンパク質の発現及び精製
大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）におけるｐＥＴ３０ａ－ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリの発現及び組換えタンパク質の精製は、他の大腸菌発現について記載されているように本質的に行った（例えば、ｃＩＬ－３３－ＣＳ、ｃＩＬ－１３、ｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリを参照のこと）。

【0225】

簡単に説明すると、封入体を変性溶液に溶解し、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーに供した。次いで、このカラムからの溶出液をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００サイズ排除クロマトグラフィーに供し、溶出液をＰＢＳ、１０％グリセロール、１ＭのＬ－アルギニン、ｐＨ７．４に保存した。１Ｌの培養物は５．８２ｍｇの組換えタンパク質を生じ、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、ウシＴＮＦ－αポリタンパク質の純度が９０％を超えることを示した。

【0226】

［実施例３ａ］
哺乳動物細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－３１の発現
Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナル及びＣ末端にＨｉｓ_６タグを有するｃＩＬ－３１をコードするＤＮＡ構築物を設計した。このｃＩＬ－３１－ＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞における発現を改善するためにタンパク質の開始コドンの上流にコザック配列を含有し、簡単なクローニングのために隣接する固有の制限酵素部位を含有するように更に設計された。このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにクローニングし、６５２１ｂｐサイズのベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１を得た。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0227】

ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１からのｃＩＬ－３１構築物の発現を以下のように達成した：
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を無血清Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、３７℃、８％ＣＯ_２でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓに適切な密度で播種した。トランスフェクションの当日に、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１及びトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備ができた細胞とともにフラスコに添加した。６日目に回収した細胞培養上清を精製に使用した。

【0228】

発現したタンパク質の精製及び分析を以下のように行った：
細胞培養液を遠心分離した。細胞培養上清を適切な流速でＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー精製カラムにロードした。洗浄及び適切な緩衝液での溶出後、溶出画分をプールし、緩衝液を最終製剤緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２）に交換した。

【0229】

精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって分析して、その分子量及び純度を決定した。そうするために、精製ポリタンパク質の濃度を、検量線の標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。以下の実施例ではｃＩＬ－３１と呼ばれる約２．６１ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｃＩＬ３１－Ｈｉｓ_６を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0230】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、以下のローディング緩衝液を使用した：
－還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８。
－非還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８。

【0231】

還元及び非還元負荷緩衝液をそれぞれタンパク質試料に添加した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むタンパク質試料は、０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有していた。

【0232】

タンパク質試料を還元負荷緩衝液と混合した後、１００℃で５～１０分間加熱した。

【0233】

還元又は非還元負荷緩衝液を含むタンパク質試料を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｎｏ．Ｍ４２０１２）のゲルチャンバに負荷した。これらのゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者によって概説されるように行った（１４０Ｖ、約６０分間）。その後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図４に示す。

【0234】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン１の主なバンドは、タンパク質配列から予想されるよりもかなり大きい（１６１９６．５４Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。タンパク質配列は２つのＮ－グリコシル化部位を含み、両方ともＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）修飾されている可能性が高いため、この違いは広範囲のＮ－グリコシル化によって説明される可能性がある。

【0235】

非還元条件下（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるレーン２）では、ロードされたタンパク質の大部分が、モノマーを示すバンドで移動した。ごくわずかな割合が二量体形態及び多量体形態で存在するようである。

【0236】

［実施例３ｂ］
哺乳動物細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－５の発現
ｃＩＬ－５をコードするＤＮＡ構築物の設計、合成及びサブクローニングを、実施例３ａのｃＩＬ－３１について記載されるように行った。６４５２ｂｐのサイズを有するベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５（配列番号４５）を図４２に示す。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0237】

実施例３ａのｃＩＬ－３１構築物と同様に、ｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５からのｃＩＬ－５構築物の発現、並びに発現したタンパク質の精製及び分析を達成した。

【0238】

以下の実施例ではｃＩＬ－５と呼ばれる約７．２８ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｃＩＬ－５－Ｈｉｓ_６を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0239】

還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで観察された見かけの分子サイズ（図４３、レーン「１」）は、予測から予想されるよりもわずかに大きく（１３９２１．９１Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）、を使用して成熟配列から計算）、１つの位置でのＮ－グリコシル化によって説明され得る。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図４３のレーン「２」）は、タンパク質が二量体として発現されることを示唆しており、これは他の種からのＩＬ－５に関する文献の知識と一致している。

【0240】

［実施例３ｃ］
細菌（Ｅ．コリ）細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－１３の発現
Ｎ末端に開始メチオニン（Ｍ）、及びＣ末端にＨｉｓ_６タグを有する配列番号４６のｃＩＬ－１３をコードするＤＮＡ構築物を設計した。このｃＩＬ－１３－ＤＮＡ構築物を、人工開始コドンＡＴＧ、単純なサブクローニングのための隣接する固有な制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、及び終止コドンＴＧＡを含有するように更に設計した。

【0241】

このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物を制限部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＥＴ３０（＋）Ｅ．コリ発現ベクターにサブクローニングし、５６１９ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－１３を得た（配列番号４９；図５０に示すプラスミドマップ）。トランスフェクショングレードプラスミドをＥ．コリ発現のために調製した。

【0242】

ｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－１３からのｃＩＬ－１３構築物の発現を以下のように達成した：Ｅ．コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）株を組換えプラスミドで形質転換した。単一コロニーを、関連する抗生物質を含有するＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＳ）培地に接種した。培養物を３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、次いで、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。発現をモニタリングするためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した。

【0243】

発現を以下のようにスケールアップした：グリセロールに保存した組換えＢＬ２１（ＤＥ３）を、関連する抗生物質を含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が約１．２に達したら、細胞培養物をＩＰＴＧを用いて１５℃で１６時間誘導した。遠心分離により細菌を回収した。

【0244】

発現したタンパク質の精製を以下のように行った：細菌ペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、続いて超音波処理した。遠心分離後の沈殿物を変性剤を用いて溶解させた。標的タンパク質を、Ｎｉカラムを使用する一段階精製によって得た。標的タンパク質を０．２２μｍフィルターで滅菌した後、一定分量で保存した。

【0245】

濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。以下の実施例ではｃＩＬ－１３と呼ばれる約１０．５ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｃＩＬ－１３－Ｈｉｓ_６を、１ＬのＥ．コリ培養物の細菌ペレットから得た。

【0246】

発現したタンパク質のタンパク質純度及び分子量は、還元負荷緩衝液を使用して標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した。ＢＳＡを対照として使用した。タンパク質試料が０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有するように、還元負荷緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８）をタンパク質試料に添加した。

【0247】

タンパク質試料を還元負荷緩衝液と混合した後、それらを１００℃で５～１０分間加熱し、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ４２０１２）のゲルチャンバに負荷した（ＢＳＡ２μｇ；ｃＩＬ－１３１．８６μｇ）。これらのゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者によって概説されるように行った（１４０Ｖ、約６０分間）。その後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。

【0248】

染色されたゲルを図５１に示す。レーン１はＢＳＡのサイズを示す。レーン２は、ｃＩＬ－１３タンパク質のサイズを示す。

【0249】

図５１のＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン１のバンドは、予想されるＢＳＡの６６ｋＤａ分子量とよく一致している。図５１のＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン２における主要なバンドのサイズは、タンパク質配列から予想される予測とよく一致している（１３３９４．３９Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。

【0250】

［実施例３ｄ］
細菌（Ｅ．コリ）細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－３３－ＷＴの発現
ｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質配列（配列番号５０）は、十分に記載されているマウスＩＬ－３３のアミノ酸１０９～２６６形態（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＢＶＺ５）と同様に、完全長イヌＩＬ－３３タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ９７８６３）のアミノ酸１１０～２６３に対応する。

【0251】

ｃＩＬ－３３－ＷＴ（配列番号５０）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号５２）を、開始メチオニン（Ｍ）及びＮ末端のＨｉｓ_６タグもコードするように設計した。この構築物を、人工開始コドンＡＴＧ、単純なサブクローニングのための隣接する固有な制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、及び終止コドンＴＧＡを含有するように設計した。

【0252】

このＤＮＡ構築物を合成した後、制限部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＥＴ３０（＋）Ｅ．コリ発現ベクターにサブクローニングし、５７４２ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ－ｃａｎＩＬ３３－ＣＳを得た（図５７に示すプラスミドマップ）。

【0253】

ｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ３３－ＷＴからのＨｉｓ_６－ｃＩＬ－３３－ＷＴ構築物の発現は以下のように達成された：ｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ－３３－ＷＴ形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．コリを、カナマイシンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が約１．２に達したら、細胞培養物をＩＰＴＧを用いて１５℃で１６時間誘導した。遠心分離により細菌を回収した。

【0254】

ｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質の精製は、Ｎｉ^２＋カラムを使用した典型的なＨｉｓタグタンパク質精製スキームに従った。細胞ペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、続いて超音波処理した。遠心分離後の上清（可溶性発現）をカラムクロマトグラフィーに用いた。標的タンパク質を透析し、０．２２μｍフィルターで滅菌した後、一定分量で保存した。濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。

【0255】

濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。以下の実施例ではｃＩＬ－３３－ＷＴと呼ばれる約１０．０１ｍｇの可溶性（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中）Ｈｉｓ_６－ｃＩＬ－３３－ＷＴを、１Ｌ培養物の細菌ペレットから得た。

【0256】

発現されたタンパク質のタンパク質純度及び分子量を、実施例３ｃのｃＩＬ－１３について記載されるように（それぞれ２．００μｇをゲルチャンバに負荷した）、還元負荷緩衝液及び対照としてのＢＳＡを使用して標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した。染色されたゲルを図５８に示す。レーン１はＢＳＡのサイズを示し、その予想される６６ｋＤａの分子量とよく一致している。レーン２は、ｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質のサイズを示しており、タンパク質配列から予想される予測とよく一致している（１８５７８．５４Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。

【0257】

［実施例３ｅ］
細菌（Ｅ．コリ）細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－３３－ＣＳの発現
ｃＩＬ－３３－ＷＴから出発して、ｃＩＬ－３３－ＣＳをコードするＤＮＡ構築物を設計した。ＩＬ－３３－ＷＴ（配列番号５０）中に存在する３つのシステイン残基の各々をセリン残基で置換して、遺伝子産物の安定性を改善し、ＩＬ－３３－ＣＳ（配列番号５１）を得た。

【0258】

ｃＩＬ－３３－ＣＳをコードするＤＮＡ構築物（配列番号５３）を、開始メチオニン（Ｍ）及びＮ末端にＨｉｓ_６タグを有するように設計した。この構築物を、人工開始コドンＡＴＧ、単純なサブクローニングのための隣接する固有な制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、及び終止コドンＴＧＡを含有するように設計した。

【0259】

このＤＮＡ構築物を合成した後、制限部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＥＴ３０（＋）Ｅ．コリ発現ベクターにサブクローニングし、５７４２ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ－ｃａｎＩＬ３３－ＣＳを得た（図６０に示すプラスミドマップ）。

【0260】

ｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ３３－ＣＳからのｃＩＬ－３３－ＣＳ構築物の発現を以下のように達成した：ｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ－３３－ＣＳ形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｅ．コリ）を、カナマイシンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が約１．２に達したら、細胞培養物をＩＰＴＧを用いて１５℃で１６時間誘導した。遠心分離により細菌を回収した。Ｈｉｓ_６－ｃａｎＩＬ３３－ＣＳタンパク質の精製は、Ｎｉ^２＋カラムを使用した典型的なＨｉｓタグタンパク質精製スキームに従った。細胞ペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、続いて超音波処理した。遠心分離後の沈殿物（封入体）を変性剤を用いて溶解させた後、カラムクロマトグラフィーに供した。標的タンパク質を０．２２μｍフィルターで滅菌した後、一定分量で保存した。

【0261】

濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。上記の手順により、約１０．４ｍｇの可溶性（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］、１０％グリセロール、０．５ＭＬ－アルギニン、ｐＨ７．４中）Ｈｉｓ_６－ｃＩＬ－３３－ＣＳを１Ｌ培養物の細菌ペレットから得た。

【0262】

発現されたタンパク質のタンパク質純度及び分子量を、実施例３ｃのｃＩＬ－１３について記載されるように（それぞれ２．００μｇをゲルチャンバに負荷した）、還元負荷緩衝液及び対照としてのＢＳＡを使用して標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した。染色されたゲルを図６１に示す。レーン１はＢＳＡのサイズを示し、その予想される６６ｋＤａの分子量とよく一致している。レーン２は、ｃＩＬ－３３－ＣＳタンパク質のサイズを示し、主要なバンドは、ｃＩＬ－３３－ＣＳのタンパク質配列から予想される予測とよく一致している（１８５３０．３６Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。

【0263】

［実施例３ｆ］
細菌（Ｅ．コリ）細胞における適切に折り畳まれた天然ｃＩＬ－４の発現
ｃＩＬ－４（配列番号５６）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号５９）を、開始メチオニン（Ｍ）及びＮ末端のＨｉｓ_６タグもコードするように設計した。この構築物を、人工開始コドンＡＴＧ、単純なサブクローニングのための隣接する固有な制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、及び終止コドンＴＧＡを含有するように設計した。

【0264】

このＤＮＡ構築物を合成した後、制限部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＥＴ３０（＋）Ｅ．コリ発現ベクターにサブクローニングし、５６０１ｂｐサイズのベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－４を得た（図７０に示すプラスミドマップ）。

【0265】

ｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－４からのｃＩＬ－４構築物の発現を以下のように達成した：Ｅ．コリＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）株を組換えプラスミドで形質転換した。単一コロニーを、関連する抗生物質を含有するＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＳ）培地に接種した。培養物を３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、次いで、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。発現をモニタリングするためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した。

【0266】

発現を以下のようにスケールアップした：グリセロールに保存した組換えＢＬ２１（ＤＥ３）を、関連する抗生物質を含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が約１．２に達したら、細胞培養物をＩＰＴＧを用いて１５℃で１６時間誘導した。遠心分離により細菌を回収した。

【0267】

発現したタンパク質の精製を以下のように行った：細菌ペレットを溶解緩衝液で再懸濁し、続いて超音波処理した。遠心分離後の沈殿物を変性剤を用いて溶解させた。標的タンパク質を、Ｎｉカラムを使用する一段階精製によって得た。標的タンパク質を０．２２μｍフィルターで滅菌した後、一定分量で保存した。

【0268】

濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって決定した。以下の実施例ではｃＩＬ－４と呼ばれる約１０．７８ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｃＩＬ－４－Ｈｉｓ_６を、１ＬのＥ．コリ培養物の細菌ペレットから得た。

【0269】

発現したタンパク質のタンパク質純度及び分子量は、還元負荷緩衝液を使用して標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した。ＢＳＡを対照として使用した。タンパク質試料が０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有するように、還元負荷緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８）及び非還元負荷緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）をそれぞれタンパク質試料に添加した。

【0270】

混合後、還元負荷緩衝液を含むタンパク質試料を１００℃で５～１０分間加熱した。タンパク質試料を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ４２０１２）のゲルチャンバ及び適切なランニング緩衝液に負荷した（ＢＳＡ２μｇ；ｃＩＬ－４２μｇ）。電気泳動を１４０Ｖで約６０分間行った。クーマシーブルー染色ゲルは、予想されるＢＳＡの６６ｋＤａの分子量とよく一致するレーン１のバンドを示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーン２における主要なバンドのサイズは、ｃＩＬ－４タンパク質配列から予想される予測とよく一致している（１３５８５．８８Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。

【0271】

［実施例３ｇ］
哺乳動物細胞における適切に折り畳まれた天然ｆｅｌ－ＩＬ－３１の発現
Ｎ末端に人工ＥＲ導入シグナル及びＣ末端にＨｉｓ_６タグを有するｆｅｌ－ＩＬ－３１をコードするＤＮＡ構築物（配列番号６３）を設計した。このｆｅｌ－ＩＬ－３１－ＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞における発現を改善するためにタンパク質の開始コドンの上流にコザック配列を含有し、簡単なクローニングのために隣接する固有の制限酵素部位を含有するように更に設計された。このＤＮＡ構築物を合成した後、ＤＮＡ構築物をｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１を得た。大量のトランスフェクショングレードプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞発現のために調製した。

【0272】

ｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１からのｃＩＬ－３１構築物の発現を以下のように達成した：
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を無血清Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、３７℃、８％ＣＯ_２でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓに適切な密度で播種した。トランスフェクションの当日に、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４－ｆｅｌ－ＩＬ３１及びトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備ができた細胞とともにフラスコに添加した。６日目に回収した細胞培養上清を精製に使用した。

【0273】

発現したタンパク質の精製及び分析を以下のように行った：
細胞培養液を遠心分離した。細胞培養上清を適切な流速でＮｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティー精製カラムにロードした。洗浄及び適切な緩衝液での溶出後、溶出画分をプールし、緩衝液を最終製剤緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２）に交換した。

【0274】

精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって分析して、その分子量及び純度を決定した。そうするために、精製ポリタンパク質の濃度を、検量線の標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。以下の実施例ではｆｅｌ－ＩＬ－３１又はｆＩＬ－３１と呼ばれる約７．２９ｍｇ（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中）の可溶性ｆｅｌ－ＩＬ３１－Ｈｉｓ_６を、１００ｍｌの粗細胞培養上清から得た。

【0275】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、以下のローディング緩衝液を使用した：
－還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、２５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．８。
－非還元負荷緩衝液：３００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８。

【0276】

還元及び非還元負荷緩衝液をそれぞれタンパク質試料に添加した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むタンパク質試料は、０．５ｍｇ／ｍｌに近い濃度を有していた。タンパク質試料を還元負荷緩衝液と混合した後、１００℃で５～１０分間加熱した。還元又は非還元負荷緩衝液を含むタンパク質試料を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで、プレキャストゲル（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｎｏ．Ｍ４２０１２）のゲルチャンバに負荷した。これらのゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、製造業者によって概説されるように行った（１４０Ｖ、約６０分間）。その後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。

【0277】

クーマシーブルー染色のレーン１の主なバンドは、タンパク質配列から予想されるよりもかなり大きい（１６１９６．５４Ｄａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用して成熟配列から計算）。ｆｅｌ－ＩＬ－３１タンパク質配列は２つのＮ－グリコシル化部位を含み、その両方がＮｅｔＮＧｌｙｃ分析に基づいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）修飾される可能性が高いので、この違いは広範囲のＮ－グリコシル化から生じる可能性が高い。

【0278】

非還元条件下では、ロードされたタンパク質の大部分は、モノマーを示すバンドで移動した。ごくわずかな割合が、二量体及び多量体又は凝集形態であるようである。

【0279】

［実施例４］
インビボｃＩＬ－３１活性試験（イヌの掻痒／かゆみ誘発）の実施
実施例３で上記のように精製したｃＩＬ－３１を１６匹のイヌに１．７５μｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内投与した。この目的のために、ｃＩＬ－３１を滅菌ＮａＣｌ溶液中の液体製剤として調製した。投与用量体積はイヌ１匹当たり１ｍｌであった。

【0280】

掻痒行動を、ｃＩＬ－３１液体製剤を１２０分間投与した約２０～４０分後にビデオ記録した。

【0281】

１２０分の全観察期間を１分間隔（１２０間隔）に分割した。カテゴリー的な、はい／いいえ（「１／０」）の決定は、観察者によって以下のように行われた：少なくとも１つの掻痒行動がイヌによって示された全ての間隔を「１」としてカウントした。掻痒行動のない全ての間隔を「０」としてカウントした。

【0282】

掻痒行動のタイプは、各間隔で生じる第１の行動によって定義した。１２０分の各観察期間内の累積カウントが掻痒スコアを提供した。イヌが６０回を超える間隔の間に掻痒行動を示した場合、掻痒誘発は成功したとみなした。

【0283】

ｃＩＬ－３１液体製剤の投与後、全てのイヌにおいて掻痒症が観察された。上記の基準に従って、１６匹のイヌのうち１３匹において掻痒症の誘発に成功した。この試験中に有害事象は観察されなかった。したがって、要約すると、この試験は、発現されたｃＩＬ－３１構築物が生物学的に活性であるという証拠を提供する。

【0284】

［実施例５］
ｃＩＬ－３１ポリタンパク質もイヌの掻痒症を誘発するかどうかの試験
実施例２で上記のように精製したｃＩＬ－３１ポリタンパク質を３匹のイヌに２００μｇの単回用量で皮下投与した。この目的のために、ｃＩＬ－３１ポリタンパク質を、Ｐｏｌｙｇｅｎをアジュバントとして含むＰＢＳ中の液体製剤として調製した。用量体積はイヌ１匹当たり１ｍＬであった。

【0285】

注射されたポリタンパク質に対するイヌの局所的及び全身的耐性を評価するために、直腸温度を測定し、腫脹、疼痛、発赤及び発熱の臨床徴候について注射部位の密接な観察及び触診を行った。臨床症状が発見された場合、臨床所見が消失するまで、又は試験が終了するまで、上記の局所及び全身耐性評価を週１回行った。

【0286】

いずれのイヌも掻痒症の徴候を示さなかった。注射部位で発赤及び剥離のような軽度の臨床徴候が観察され、体温の上昇が最初の投与後に全てのイヌ及び２回目の投与後に２匹のイヌで観察され、ポリタンパク質に対する誘導された免疫応答を示した。

【0287】

［実施例６ａ］
ｃＩＬ－３１に対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｃＩＬ－３１を、ニュージーランドホワイトウサギにおける以下の６３日間の免疫レジメン（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ／ＦＲＧ）の抗原として使用した：
１日目：免疫前血清の採取、初回免疫
１４日目：２回目の免疫
２８日目：３回目の免疫
３５日目：中間ＥＬＩＳＡ力価の試験血清
４２日目：４回目の免疫
５６日目：５回目の免疫
６３日目：抗血清の採取

【0288】

［実施例６ｂ］
ｃＩＬ－５に対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｃＩＬ－５を、実施例６ａで上述した６３日間の免疫レジメンにおける抗原として使用した。

【0289】

［実施例６ｃ］
ｃＩＬ－１３に対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｃＩＬ－１３を、実施例６ａで上述した６３日間の免疫レジメンにおける抗原として使用した。

【0290】

［実施例６ｄ］
ｃＩＬ－３３－ＷＴに対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｃＩＬ－１３－ＷＴを、実施例６ａで上述した６３日間の免疫レジメンにおける抗原として使用した。

【0291】

［実施例６ｅ］
ｃＩＬ－４に対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｃＩＬ－４を、実施例６ａで上述した６３日間の免疫レジメンにおける抗原として使用した。

【0292】

［実施例６ｆ］
ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリに対するポリクローナルウサギ抗血清の作製及び特徴づけ
約５００μｇのｂｏｖ－ＴＮＦ－αポリタンパク質（配列番号６５）を、実施例６ａで上述した６３日間の免疫レジメンにおける抗原として使用した。

【0293】

［実施例７］
卵黄からのｃＩＬ－３１に対するニワトリＩｇＹの産生
およそ５００μｇのｃＩＬ－３１を、ニワトリにおける以下の６３日間の免疫レジメン（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ／ＦＲＧ）のための抗原として使用した：
１日目：免疫前の卵黄ＩｇＧ／ＩｇＹの回収、約９０％純粋
１日目：第１の免疫
１４日目：２回目の免疫
２８日目：３回目の免疫
３５日目：４回目の免疫
４５～５５日目：卵の回収
６３日目：独自の（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ；調製物Ｉ）による卵の調製、ウサギからの抗血清に匹敵する純度及び品質をもたらすＩｇＹ調製物

【0294】

［実施例８ａ］
抗ｃＩＬ－３１及び抗ｃＩＬ－３１ポリタンパク質のセットアップ、ウサギ血清抗体及びニワトリ卵黄ＩｇＹ力価測定、天然ｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質への結合試験のためのＥＬＩＳＡフォーマット
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４６４７１８）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．６）に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質（ｃＩＬ－３１：０、２９ｍｇ／ｍｌ、又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質：０、４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルごとに、１０μｌの体積のコーティング溶液を使用した。次いで、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、蓋を閉めて４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２、カタログ番号２００１２－０１９）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）による３回の洗浄を行った。続いて、非特異的結合部位のブロッキングを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（冷水魚の皮膚から、Ｈ_２Ｏ中４０～５０％、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７６５）を用いて行った。このブロッキング工程を室温（ＲＴ）で少なくとも１時間行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン中のウサギ抗血清又はニワトリ卵黄調製物の段階希釈物（非吸着レプリカプレートから）を添加した（ウェル当たり２０μｌ）。連続希釈液とのインキュベーションを室温で少なくとも１時間行った。その後、ウサギ抗血清又はニワトリ卵黄調製物の段階希釈物を除去し、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ中の抗ウサギＩｇＧ（全分子）、ヤギで産生されたＦ（ａｂ’）２断片－アルカリホスファターゼ（ＡＰ）抗体（ＳｉｇｍａＡ３９３７、又は同等品）の１：１５，０００希釈物、又はウサギで産生された抗ニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）（全分子）－ＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ９１７１、又は同等物）の１：５０００希釈物、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（２０μｌ／ウェル）を添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。これらの抗体溶液を除去した後、再びＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。続いて、ウェルをＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６、ウェル当たり５０μｌ）で１回洗浄した。最後に、ＡＰ緩衝液（９０μｌ／ウェル）中５ｍＭ４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ｖｉａＳｉｇｍａ，Ａ１４４２，００５０、又は同等品）を添加した。４０５ｎｍ／分（ｍＯＤ／分）での光学密度（ＯＤ）の増加を、ＲＴでＥＬＩＳＡリーダー、例えばＥｐｏｃｈ Ｒｅａｄｅｒ（１５０１１５Ｅ）又はＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｒｅｄｅｒ（１８０４２７Ｃ）で記録し、曲線勾配を線形増加範囲から決定した。

【0295】

ウサギ免疫前血清及び抗血清の抗原としてｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を図５に示す。この図は、ウサギ抗血清がｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質構築物の両方を認識したが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しなかったことを示す。１：１６０の抗血清希釈までの両抗原について線形シグナル相が観察され、続いて典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線が観察された。エンドポイントの力価（バックグラウンドシグナルより高いシグナル＋２標準偏差による最後の希釈）は、ｃＩＬ－３１については＞１：４０，０００、及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質については＞１：８０，０００であった。これらのデータは、この試験で生成されたウサギ抗ｃＩＬ－３１血清が良質であったことを示唆している。

【0296】

ｃＩＬ－３１ポリタンパク質が、後者のタンパク質に対して産生された抗血清によってｃＩＬ－３１と同様に十分に認識されるという事実は、人工反復ドメイン構造及び破傷風毒素スペーサー配列にもかかわらず、ポリタンパク質中のｃＩＬ－３１のコピーが部分的に折り畳まれていることを示唆している。この結果は驚くべき結果であり、予想できなかった。

【0297】

ニワトリ免疫前血清及び卵黄調製物の抗原としてｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。この図から分かるように、ニワトリ卵黄調製物はｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質を認識したが、ニワトリ免疫前血清は、１：２５０に希釈した場合、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしかもたらさなかった（データは示さず）。６２．５μｇ／ｍｌの卵黄調製物希釈物までのｃＩＬ－３１ポリタンパク質について、線形シグナル相を観察し、続いて典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線を観察した。ｃＩＬ－３１の場合、線状相は１２５μｇ／ｍｌ卵黄タンパク質で終了した。卵黄タンパク質調製物（バックグラウンドシグナル＋２標準偏差より高いシグナルを有する最後の希釈）のエンドポイント力価は、ｃＩＬ－３１については１２２ｎｇ／ｍｌ及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質については６１ｎｇ／ｍｌであった。これらのデータは、この試験で生成されたニワトリ卵黄調製物が良質であったことを示唆している。

【0298】

ｃＩＬ－３１ポリタンパク質が、後者のタンパク質に対して産生されたニワトリ卵黄抗体によってｃＩＬ－３１とほぼ等しく十分に認識されるという事実は、人工反復ドメイン構造及び破傷風毒素スペーサー配列にもかかわらず、ポリタンパク質中のｃＩＬ－３１のコピーが部分的に折り畳まれていることを再度裏付けている。この結果は驚くべき結果であり、予想できなかった。

【0299】

［実施例８ｂ］
ウサギ血清抗体力価測定、天然ｃＩＬ－５及びｃＩＬ－５ポリタンパク質への結合試験のための抗ｃＩＬ－５及び抗ｃＩＬ－５ポリタンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットの設定
ｃＩＬ－３１について実施例８ａと同じ方法でｃＩＬ－５に対して生成した抗血清を試験するためにＥＬＩＳＡを設定した。しかし、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、実施例８ａに記載のようにコーティング緩衝液に溶解した１～５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－５又は０．５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１－ポリでコーティングした。

【0300】

その対応する免疫前血清と比較したウサギ抗ｃＩＬ－５抗血清の力価測定の結果を図４４に示す。ウサギ抗血清はｃＩＬ－５を認識するが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しない。線形シグナル相は、抗血清希釈度約１：５００まで視認可能であり、典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線が続く。終点力価（バックグラウンド＋２標準偏差を超えるシグナルによる最後の希釈）は１：２００，０００に近い。これらのデータは、この試験で生成されたウサギ抗ｃＩＬ－５血清が良質であることを示唆している。

【0301】

ウサギ免疫前血清及び抗血清の抗原としてｃＩＬ－５又はｃＩＬ－５ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を図４５に示す。この図は、ウサギ抗血清がｃＩＬ－５及びｃＩＬ－５ポリタンパク質構築物の両方を認識したが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しなかったことを示す。ｃＩＬ－５と比較してｃＩＬ－５－ポリの場合、絶対信号強度は低いが、曲線形状は図４５において非常に類似している。これは、人工反復ドメイン構造及び破傷風毒素スペーサー配列にもかかわらず、ｃＩＬ－５－ポリ中のｃＩＬ－５ポリペプチドの少なくとも一部が天然様コンフォメーションであることを示唆している。この結果は驚くべき結果であり、予想できなかった。

【0302】

［実施例８ｃ］
ウサギ血清抗体力価測定、天然ｃＩＬ－１３及びｃＩＬ－１３ポリタンパク質への結合試験のための抗ｃＩＬ－１３及び抗ｃＩＬ－１３ポリタンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットの設定
ｃＩＬ－３１について実施例８ａと同じ方法でｃＩＬ－１３に対して生成した抗血清を試験するためにＥＬＩＳＡを設定した。しかし、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、実施例８ａに記載のようにコーティング緩衝液に溶解した５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－１３又は５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－１３－ポリでコーティングした。

【0303】

その対応する免疫前血清と比較したウサギ抗ｃＩＬ－１３抗血清の力価決定の結果を図５３Ａに示す。ウサギ抗血清はｃＩＬ－１３を認識するが、免疫前血清は適用されたＥＬＩＳＡ形式では無視できるシグナルしか生成しない。線形シグナル相は、抗血清希釈度約１：５０００まで視認可能であり、典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線が続く。エンドポイントの力価（バックグラウンド＋２標準偏差を超えるシグナルによる最後の希釈）は１：５００，０００を超える。これらのデータは、この試験で生成されたウサギ抗ｃＩＬ－１３血清が良質であることを示唆している。

【0304】

コーティング抗原としてのｃＩ１－１３－ポリの場合、エンドポイント力価は１：１００，０００に近く（図５３Ｂ）、ワクチン抗原構築物上の抗ｃＩＬ－１３抗体結合部位の豊富な存在が確認された。

【0305】

［実施例８ｄ］
ウサギ血清抗体力価測定、天然ｃＩＬ－３３及びｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質への結合試験のための抗ｃＩＬ－３３－ＷＴ及び抗ｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットのセットアップ
ｃＩＬ－３１について実施例８ａと同じ方法でｃＩＬ－３３－ＷＴに対して生成した抗血清を試験するためにＥＬＩＳＡを設定した。しかし、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、実施例８ａに記載されているように、コーティング緩衝液に溶解した５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３３－ＷＴ又はｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリでコーティングした。

【0306】

その対応する免疫前血清と比較したウサギ抗ｃＩＬ－１３－ＷＴ抗血清の力価測定の結果を図５９に示す。ウサギ抗血清はｃＩＬ－３３－ＷＴを認識するが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しない。エンドポイントの力価（バックグラウンド＋２標準偏差を超えるシグナルによる最後の希釈）は１：１０，０００を超える。これらのデータは、この試験で生成されたウサギ抗ｃＩＬ－３３－ＷＴ血清がかなりの品質であることを示唆している。

【0307】

その対応する免疫前血清と比較したウサギ抗ｃＩＬ－１３－ＣＳ－ポリ抗血清の力価測定の結果を図６６に示す。ｃＩＬ－３３－ＷＴに対して惹起されたウサギ抗血清はｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリを認識するが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしかもたらさない。線形シグナル相は、抗血清希釈度約１：３２０まで視認可能であり、典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線が続く。エンドポイントの力価（バックグラウンド＋２標準偏差を超えるシグナルによる最後の希釈）は１：１００，０００を超える。これらのデータは、ｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリが実際には親抗原よりも良好な抗ｃＩＬ－３３－ＷＴ血清に対する結合パートナーであることを示唆している。ｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリのポリマー性がこの特性に寄与する可能性がある。また、Ｃ→Ｓ変異は、ｃＩＬ－３３－ＷＴと比較して、ｃＩＬ－３３－ＣＳの抗原性を大きく変化させていないことが示唆された。

【0308】

［実施例８ｅ］
ウサギ血清抗体力価測定、天然ｃＩＬ－４、ｃＩＬ－４ポリタンパク質及びｃＩＬ－１３への結合試験のための抗ｃＩＬ－４及び抗ｃＩＬ－４ポリタンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットの設定
ｃＩＬ－３１について実施例８ａと同じ方法でｃＩＬ－４に対して生成した抗血清を試験するためにＥＬＩＳＡを設定した。しかし、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、実施例８ａに記載のようにコーティング緩衝液に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－４（図７１Ａ）又は２．５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－４－ポリ（図７１Ｂ）でコーティングした。

【0309】

ウサギ免疫前血清及び抗血清の抗原としてｃＩＬ－４又はｃＩＬ－４ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を図７１Ａに示す。

【0310】

ウサギ抗血清はｃＩＬ－４を認識するが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しない。線形シグナル相は、抗血清希釈度約１：８０まで視認可能であり、典型的なＥＬＩＳＡ滴定曲線が続く。エンドポイントの力価（バックグラウンド＋２標準偏差を超えるシグナルによる最後の希釈）は１：１５０，０００を超える。これらのデータは、この試験で生成されたウサギ抗ｃＩＬ－４血清が良質であることを示唆している。

【0311】

コーティング抗原としてのｃＩＬ－４－ポリの場合、エンドポイント力価は１：５０，０００に近く（図７１Ｂ）、ワクチン抗原構築物上の抗ｃＩＬ－４抗体結合部位の豊富な存在が確認された。

【0312】

更に、ｃＩＬ－１３に対して産生されたウサギ血清を試験した。この血清は、特異的抗ｃＩＬ－４抗血清よりも低い程度の低希釈度でわずかなシグナルしかもたらさなかった（図７１Ｂ）。これらのデータは、ｃＩＬ－４－ポリ構築物がイヌＩＬ－４の抗原決定基を含有することを実証している。

【0313】

［実施例８ｆ］
ウサギ血清抗体力価測定のための抗ｂｏｖ－ＴＮＦ－αポリタンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットの設定
ｃＩＬ－３１について実施例８ａと同じ方法でウシＴＮＦ－α－ポリタンパク質に対して生成された抗血清を試験するためにＥＬＩＳＡを設定した。しかし、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、実施例８ａに記載のようにコーティング緩衝液に溶解した１μｇ／ｍｌのｂｏｖ－ＴＮＦ－α（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。

【0314】

その対応する免疫前血清と比較したウサギ抗ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリ抗血清の力価測定の結果を図７９に示す。ウサギ抗血清はウシＴＮＦ－αを認識するが、免疫前血清は、適用されたＥＬＩＳＡフォーマットにおいて無視できるシグナルしか生成しない。したがって、ウサギをｂｏｖ－ＴＮＦ－ポリで免疫すると、高力価抗ウシ－ＴＮＦ－ａ抗血清が得られる。この抗血清のエンドポイントは１：４０，０００希釈を超えており、飽和は最大１：２００希釈で見られる。これは、本発明のポリタンパク質構築物を使用して、ｂｏｖ－ＴＮＦａ－ポリの意図された免疫原性が達成されたことを実証する。

【0315】

［実施例９］
ｃＩＬ－３１中和イヌモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ロキベトマブの天然ｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質への結合のためのＥＬＩＳＡフォーマットの設定
ロキベトマブは、イヌＩＬ－３１に対するイヌ化モノクローナル抗体であり（Ｍｉｃｈｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｂｌｉｎｄｅｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｌｏｋｉｖｅｔｍａｂ（ＺＴＳ－００１０３２８９），ａ ｃａｎｉｎｉｚｅｄ，ａｎｔｉ－ｃａｎｉｎｅ ＩＬ－３１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｃｌｉｅｎｔ ｏｗｎｅｄ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ”，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ２７．６（２０１６）：４７８－ｅ１２９）、獣医学薬物Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ（登録商標）の活性物質を形成する。

【0316】

ｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質へのロキベトマブの結合を試験するための以下のＥＬＩＳＡフォーマットを開発した：
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４６４７１８）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．６）に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質（ｃＩＬ－３１：０、２９ｍｇ／ｍｌ、又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質：０、４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルごとに、１０μｌの体積のコーティング溶液を使用した。次いで、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、蓋を閉めて４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、カタログ番号２００１２－０１９）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）による３回の洗浄を行った。続いて、非特異的結合部位のブロッキングを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（冷水魚の皮膚から、Ｈ_２Ｏ中４０～５０％、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７６５）を用いて行った。このブロッキング工程を室温で少なくとも１時間行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン中のロキベトマブの段階希釈液（非吸着レプリカプレートから）を添加した（ウェル当たり２０μｌ）。ロキベトマブの段階希釈液とのインキュベーションを室温で少なくとも１時間行った。その後、ロキベトマブの段階希釈液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）を行った。次に、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（２０μｌ／ウェル）中のプロテインＡ－ＡＰ（Ｐ７４８８ Ｓｉｇｍａ）の１：５０００希釈物又はａｎｔｉ－ｄｏｇ－ＩｇＧ－ＡＰ（ＳｉｇｍａロットＲＩ６０８２ ０．６１ｍｇ／ｍｌ）の１：２０００希釈物を添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。これらの溶液を除去した後、再びＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。続いて、ウェルをＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６、ウェル当たり５０μｌ）で１回洗浄した。最後に、ＡＰ緩衝液（９０μｌ／ウェル）中５ｍＭ４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ｖｉａＳｉｇｍａ，Ａ１４４２，００５０、又は同等品）を添加した。４０５ｎｍ／分（ｍＯＤ／分）での光学密度（ＯＤ）の増加をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＲＴで記録し、曲線勾配を線形増加範囲から決定した。

【0317】

ロキベトマブの抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。これらの結果は、ロキベトマブがｃＩＬ－３１に結合すること、及びそれが抗イヌＩｇＧ試薬によって検出され得ることを示唆する。しかしながら、ｃＩＬ－３１に結合したロキベトマブは、プロテインＡによってほとんど認識されない。

【0318】

ロキベトマブの抗原としてｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。これらの結果は、ロキベトマブがｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質に結合することを実証している。これは、ポリタンパク質中のｃＩＬ－３１のコピーが天然折畳みを有することを示唆している。

【0319】

［実施例１０］
ビオチン化ロキベトマブの作製及び特徴付け
ロキベトマブをビオチン化するために、Ｚｅｂａの０．５ｍｌスピン脱塩カラム（４０Ｋ）を最初に５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５で平衡化した。次に、１００μｌのロキベトマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）を平衡化したカラムに２回通した。その後、２０μｌの１０ｍＭのＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）スルホン－ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２１３３８）をロキベトマブ含有溶液に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション後、１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０ １μｌを添加した。更なるＺｅｂａ０．５ｍｌのスピン脱塩カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化した後、ロキベトマブを含有する反応混合物をＰＢＳ平衡化カラムに通し、ＰＢＳで２００μｌの最終容量まで満たし、５ｍｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの濃度が想定された。

【0320】

次に、ビオチン化ロキベトマブのｃＩＬ－３１結合を試験するためのＥＬＩＳＡフォーマットを開発した：
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４６４７１８）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．６）に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質（ｃＩＬ－３１：０、２９ｍｇ／ｍｌ、又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質：０、４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルごとに、１０μｌの体積のコーティング溶液を使用した。次いで、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、蓋を閉めて４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、カタログ番号２００１２－０１９）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）による３回の洗浄を行った。続いて、非特異的結合部位のブロッキングを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（冷水魚の皮膚から、Ｈ_２Ｏ中４０～５０％、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７６５）を用いて行った。このブロッキング工程を室温で少なくとも１時間行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン中のロキベトマブの段階希釈液（非吸着レプリカプレートから）を添加した（ウェル当たり２０μｌ）。ビオチン化ロキベトマブの段階希釈液とのインキュベーションを室温で少なくとも１時間行った。その後、ビオチン化ロキベトマブの段階希釈液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）を行った。次に、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（２０μｌ／ウェル）中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）－ＡＰ（Ｓｉｇｍａ Ｅ２６３６）の１：１７．０００希釈物を添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。この溶液を除去した後、再びＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。続いて、ウェルをＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６、ウェル当たり５０μｌ）で１回洗浄した。最後に、ＡＰ緩衝液（９０μｌ／ウェル）中５ｍＭ４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ｖｉａＳｉｇｍａ，Ａ１４４２，００５０、又は同等品）を添加した。４０５ｎｍ／分（ｍＯＤ／分）での光学密度（ＯＤ）の増加をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＲＴで記録し、曲線勾配を線形増加範囲から決定した。

【0321】

ビオチン化ロキベトマブの抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を図９に示す。これらの結果は、使用したＥＬＩＳＡ設定で強い滴定可能なシグナルが観察されたため、ロキベトマブのビオチン化が成功したことを示唆している。

【0322】

［実施例１１］
ビオチン化ロキベトマブ競合アッセイフォーマットの設定
ウサギ免疫前血清、ウサギ抗ｃＩＬ－３１抗血清（実施例６参照）、ｃＩＬ－３１ポリタンパク質０、４ｍｇ／ｍｌ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｃＩＬ－３１ ０．２９ｍｇ／ｍｌ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）及びロキベトマブ－ビオチン（実施例１０参照）を使用して、ロキベトマブ競合アッセイを設定した。

【0323】

ビオチン化ロキベトマブ競合アッセイフォーマットを以下のように設計した：
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号１０１９２７８１）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．６）に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質（ＰＢＳ中のストック溶液：ｃＩＬ－３１：０、２９ｍｇ／ｍｌ、又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質：０．４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルごとに、１０μｌの体積のコーティング溶液を使用した。次いで、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、蓋を閉めて４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、カタログ番号２００１２－０１９）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（３５μｌ／ウェル）による３回の洗浄を行った。続いて、非特異的結合部位のブロッキングを、３５μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（冷水魚の皮膚から、Ｈ_２Ｏ中４０～５０％、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７６５）を用いて行った。このブロッキング工程は、蓋を閉じて室温で少なくとも１時間行った。ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン中の１００ｎｇ／ｍｌビオチン化ロキベトマブ中のウサギ免疫前、ウサギ抗ｃＩＬ－３１免疫血清又はニワトリ卵黄ＩｇＹ調製物からの連続希釈液を別個の非吸収性ＥＬＩＳＡプレート中で調製し、室温で約１時間インキュベートした。ｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質コーティングＥＬＩＳＡプレートからブロッキング溶液を除去した後、プレインキュベートした連続抗体希釈液を添加した（２０μｌ／ウェル）。連続抗体希釈物とのインキュベーションを室温で約１時間行った。その後、連続抗体希釈液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（３５μｌ／ウェル）を行った。次に、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（２０μｌ／ウェル）中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）－ＡＰ（Ｓｉｇｍａ Ｅ２６３６）の１：１７．０００希釈物を添加し、蓋を閉じて室温で少なくとも１時間インキュベートした。この溶液を除去した後、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（３５μｌ／ウェル）で再度２回洗浄した。続いて、ウェルをＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６、ウェル当たり５０μｌ）で１回洗浄した。最後に、ＡＰ緩衝液（９０μｌ／ウェル）中５ｍＭ４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ｖｉａＳｉｇｍａ，Ａ１４４２，００５０、又は同等品）を添加した。４０５ｎｍ／分（ｍＯＤ／分）での光学密度（ＯＤ）の増加をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＲＴで記録し、曲線勾配を線形増加範囲から決定した。

【0324】

ｃＩＬ－３１中和抗体としてのビオチン化ロキベトマブとＥＬＩＳＡプレートに固定化されたｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質との間の相互作用のために、ウサギ免疫前血清＋ビオチン化ロキベトマブの混合物又はウサギ免疫血清＋ビオチン化ロキベトマブのプローブの混合物を使用するＥＬＩＳＡ設定。図１０及び図１１の結果は、ウサギ免疫前血清がｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質のいずれかへのロキベトマブの結合を妨害しないことを示す。しかしながら、抗ｃＩＬ－３１ウサギ免疫血清は、１：１２８～１：６４の希釈からこの相互作用に対する阻害活性を示し、１：２の希釈でのロキベトマブ結合の完全阻害をもたらす。

【0325】

ｃＩＬ－３１中和抗体としてのビオチン化ロキベトマブとＥＬＩＳＡプレートに固定化されたｃＩＬ－３１との間の相互作用のためのニワトリ卵黄ＩｇＹ調製物＋ビオチン化ロキベトマブプローブの混合物を使用するＥＬＩＳＡ設定。図１２の結果は、抗ｃＩＬ－３１ニワトリ卵黄ＩｇＹ調製物が、１２２μｇ／ｍｌ～２４４μｇ／ｍｌで開始し、１５．６ｍｇ／ｍｌでのビオチン化ロキベトマブ結合の完全な阻害をもたらすこの相互作用に対する阻害活性を示したことを示す。

【0326】

［実施例１２ａ］
オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）のＮＦｋＢ刺激能を評価することを可能にするイヌ単球細胞株（ＤＨ８２）の作製
イヌ単球細胞株ＤＨ８２（Ｗｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８８）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｂｓｄ－ＮＦｋＢ－ＳＥＡＰでトランスフェクトした（プラスミドマップは図１３として含まれる）。これにより、多数のＮＦｋＢ経路活性化リガンド（ＬＰＳ又はＴＮＦ－α等）によって分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）分泌を刺激することができるブラストサイジンＳ選択細胞株が得られた。クローン細胞株を得るために、単一細胞クローニングを行った。

【0327】

このクローン細胞株（ＤＨ８２－ｂｓｄ－ＮＦＳＥＡＰ）を異なるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＴＯ－ＯＤＮ）に曝露した。強力な濃度依存性ＳＥＡＰシグナルが、効力の程度が１６６８－ＰＴＯ＞＞２００６－ＰＴＯ＞２００７－ＰＴＯの３つの異なるＰＴＯ－ＯＤＮについて観察された（図１４を参照のこと）。

【0328】

図１４の結果は、ＰＴＯ－ＯＤＮを認識し、ＮＦｋＢシグナル伝達をもたらす唯一の公知の受容体であるので、ＤＨ８２が機能的Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を発現することを示唆する。更に、図１４の結果は、驚くべきことに、特に１６６８－ＰＴＯ（配列番号Ａ）がイヌＴＬＲ９の強力な活性化剤であることを示している。

【0329】

［実施例１２ｂ］
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１３細胞におけるｃＩＬ－１３の刺激能
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｈｋｂ－ｉｌ４１３）をヒトＳＴＡＴ６遺伝子で安定にトランスフェクトして、完全に活性なＳＴＡＴ６経路を得る。更に、細胞をＳＴＡＴ６誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子でトランスフェクトする。受容体サブユニットＩＬ４Ｒα及びＩＬ－１３Ｒα１並びにシグナル伝達経路の他の遺伝子は、十分な量で天然に発現される。

【0330】

これらの細胞は、ヒトＩＬ－４及びヒトＩｌ－１３に応答性である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈｅｋ－ｂｌｕｅ－ｉｌ４－ｉｌ１３、データは示さず）。

【0331】

これらの細胞をｃＩＬ－１３で試験したところ、このサイトカインがＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞によって感受性的に認識され、約２ｎｇ／ｍｌ（２０００ｐｇ／ｍｌ）のＥＣ_５０でＳＥＡＰレポーター酵素の読み出しをもたらすことが明らかになった（図５２参照）。

【0332】

［実施例１２ｃ］
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞におけるｃＩＬ－３３－ＷＴ及びｃＩＬ－３３－ＣＳの刺激能
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｈｋｂ－ｈｉＬ３３）を使用して、ｃＩＬ－３３－ＷＴ及びｃＩＬ－３３－ＣＳタンパク質の刺激能を評価した。細胞は、ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３由来細胞のヒトＩＬ１ＲＬ１遺伝子による安定なトランスフェクションによって作製した。更に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの応答が遮断された。したがって、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞はＩＬ－３３に特異的に応答する。これらの細胞は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を発現する。これらの細胞の表面上のヘテロ二量体ＩＬ－１ＲＬ１／ＩＬ－１ＲＡｃＰへのヒトＩＬ－３３の結合は、ＮＦ－κＢの活性化及びその後のＳＥＡＰの産生をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こすことが知られている。

【0333】

これらの細胞は、ヒトＩＬ－３３に応答性である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈｅｋ－ｂｌｕｅ－ｉｌ３３）。これらの細胞をイヌＩＬ－３３で試験したところ、おそらくチオール含有システイン残基の酸化に起因して、異なる供給源由来のｃＩＬ－３３－ＷＴが様々に認識され（図６２、黒塗りの三角形を有する「ｃＩＬ－３３－ＷＴバッチ１」及び黒塗りの四角を有する「ｃＩＬ－３３－ＷＴバッチ２」）、経時的に刺激活性を失うようであることが明らかになった（発明者自身の観察、データは図示せず）。

【0334】

しかしながら、ｃＩＬ－３３－ＣＳは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－３３細胞によって感受性的に認識され、ｃＩＬ－３３－ＷＴ中の３つのシステインがセリンに変異した後（ｃＩＬ－３３－ＣＳ）、約１０ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０によるＳＥＡＰレポーター酵素の読み出しをもたらす（図６２、黒塗りの丸）。

【0335】

［実施例１３ａ］
ｃＩＬ－３１ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
ｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンは、以下を含有すると定義された：
２００μｇのｃＩＬ－３１－ポリ（配列番号４及び／又は配列番号４０）
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ

【0336】

イヌの免疫は、以下のように皮下注射によって行った：
０日目：上で定義されるようなｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンによる一次免疫及び血液試料（免疫前試料）の採取
７日目：血液試料の採取
１４日目：血液試料の採取
２１日目：血液試料の採取
２８日目：上で定義されるようなｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンによる二次免疫及び血液試料の採取
３５日目：血液試料の採取
４２日目：血液試料の採取
４９日目：血液試料の採取
５６日目：血液試料の採取
６３日目：血液試料の採取
７０日目：血液試料の採取

【0337】

［実施例１３ｂ］
ｃＩＬ－５－ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
ｃＩＬ－５ポリタンパク質ワクチンは、以下を含有すると定義された：
２３μｇのｃＩＬ－５－ポリ（配列番号４２）
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
１０００μｌのＰＢＳ中
＋１１０μｌのＰｏｌｙｇｅｎ
試料採取が７０日目を含まなかったことを除いて、３匹のイヌ（イヌ１（０３６８）、イヌ２（９６４１）、イヌ３（０８５２））の免疫及び採血スキームを実施例１３ａについて記載されるように実施した。

【0338】

［実施例１３ｃ］
ｃＩＬ－１３ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
ｃＩＬ－５ポリタンパク質ワクチンの１回の注射用量は、以下を含有すると定義された：
５０μｇのｃＩＬ－１３－ポリ（配列番号４７）
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ

【0339】

試料採取が７０日目を含まなかったことを除いて、３匹のイヌ（イヌｃＩＬ－１３－１（０５２１）、イヌｃＩＬ－１３－２（２５７９）、イヌｃＩＬ－１３－３（６０４８））の免疫及び採血スキームを実施例１３ａについて記載されるように実施した。

【0340】

［実施例１３ｄ］
ｃＩＬ－３３ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
ｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質ワクチンは、以下を含有すると定義された：
１００μｇのｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリ（配列番号５４）
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ

【0341】

試料採取が７０日目を含まなかったことを除いて、一匹のイヌ（イヌ４０２）の免疫及び採血スキームを実施例１３ａについて記載されるように実施した。特異的な抗ｃＩＬ－３３抗体の存在を古典的なプレート結合抗原ＥＬＩＳＡ設定で評価した。野生型形態のｃＩＬ－３３をこの分析で使用して、Ｃ→Ｓ変異に特異的なあらゆる効果を除外した。

【0342】

［実施例１３ｅ］
ｃＩＬ－４ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
ｃＩＬ－４ポリタンパク質ワクチンの１回の注射用量は、以下を含有すると定義された：
２００μｇのｃＩＬ－４－ポリ（配列番号５７）
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ

【0343】

試料採取が７０日目を含まなかったことを除いて、３匹のイヌ（イヌ５３６５、イヌ６５２３、イヌ７１０４）の免疫及び採血スキームを実施例１３ａについて記載されるように実施した。

【0344】

［実施例１３ｆ］
ｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤の設計及び免疫試験
１００μｇのｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリ（配列番号６１）
２５μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
２５μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ

【0345】

二次免疫を３５日目に行い、血液試料も７７、８４、９１、９８、１０５、１１２、１１９、及び１２６日目に採取したことを除いて、実施例１３ａについて記載したように、３匹のネコ（ネコ３１３２、ネコ０４８７、ネコ５６７４）の免疫及び採血スキームを行った。

【0346】

［実施例１３ｇ］
更なるポリタンパク質／ＰＴＯ－ＯＤＮ／Ｐｏｌｙｇｅｎワクチン製剤及び免疫の設計
更なるポリタンパク質ワクチンは、以下を含有すると定義することができる。
２００μｇの配列番号６５又は配列番号２０２～３２９のいずれか１つ
５０μｇの１６６８－ＰＴＯ（配列番号５）
５０μｇの２００６－ＰＴＯ（配列番号６）
９００μｌのＰＢＳ中
＋１００μｌのＰｏｌｙｇｅｎ
免疫及び血液試料採取は、実施例１３ａについて記載したように行うことができる。

【0347】

［実施例１４ａ］
免疫イヌにおける抗ｃＩＬ－３１力価の測定
免疫イヌから得られたイヌ血清（実施例１３ａ参照）を、以下のＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－３１抗体の存在について試験した：
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４６４７１８）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．６）に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質（ｃＩＬ－３１：０、２９ｍｇ／ｍｌ、又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質：０、４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルごとに、１０μｌの体積のコーティング溶液を使用した。次いで、ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、蓋を閉めて４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、カタログ番号２００１２－０１９）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）による３回の洗浄を行った。続いて、非特異的結合部位のブロッキングを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（冷水魚の皮膚から、Ｈ_２Ｏ中４０～５０％、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７６５）を用いて行った。このブロッキング工程を室温で少なくとも１時間行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン中のイヌ血清の段階希釈液（非吸着レプリカプレートから）を添加した（ウェル当たり２０μｌ）。イヌ血清の段階希釈液とのインキュベーションを室温で少なくとも１時間行った。その後、イヌ血清の段階希釈液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）を行った。

【0348】

次に、ウサギＩｇＧ抗イヌＩｇＧ（Ｆｃ）－Ａｌｋの１：２，０００希釈ＰＢＳ中ＭｉｎＸ ｎｏｎｅ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、ＳＫＵ３０４－０５５－００８、又は同等品）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、３％（ｖ／ｖ）ゼラチン（２０μｌ／ウェル）を添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。この溶液を除去した後、再びＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（５０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。続いて、ウェルをＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６、ウェル当たり５０μｌ）で１回洗浄した。最後に、ＡＰ緩衝液（９０μｌ／ウェル）中５ｍＭ４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ｐＮＰＰ、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，ｖｉａＳｉｇｍａ，Ａ１４４２，００５０、又は同等品）を添加した。４０５ｎｍ／分（ｍＯＤ／分）での光学密度（ＯＤ）の増加をＥＬＩＳＡリーダーにおいてＲＴで記録し、曲線勾配を線形増加範囲から決定した。

【0349】

図１５ａ～図１５ｃ～図１７ａ～図１７ｃは、免疫されたイヌが免疫の１４日後に既に相当量の抗ｃＩＬ－３１抗体を産生したことを示すこれらのＥＬＩＳＡの結果を示す。高い抗ｃＩＬ－３１力価もまた、三匹全てのイヌにおいて一次免疫後１１２日目に均一に観察することができた。

【0350】

［実施例１４ｂ］
免疫イヌにおける抗ｃＩＬ－５力価の測定
免疫イヌから得られたイヌ血清（実施例１３ｂ参照）を、抗ｃＩＬ－３１抗体について実施例１４ａに記載したのと同じＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－５抗体の存在について試験した。３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液に溶解した１～５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－５でコーティングした。

【0351】

図４６（Ａ～Ｆ）は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示し、これは、２匹のｃＩＬ－５－ポリ免疫イヌが、免疫の２８日後に既に相当量の抗ｃＩＬ－５抗体を産生したことを示す（図４６Ａ及び図４６Ｅ）。２８日目の追加免疫は、これらの二匹のイヌにおいて更なる大量の抗ｃＩＬ－５抗体価上昇をもたらし、これは４２日目にピークに達した（図４６Ｂ及び図４６Ｆ）。力価は、最後の試料採取点である６３日目に高いままであり、おそらくそれを超えて広がる。一匹のイヌは、ｃＩＬ－５－ポリワクチン接種に対して全体的に不良な応答を示した（図４６Ｃ～Ｄ）が、２８日目の追加免疫の効果が明らかであった（図４６Ｄ）。

【0352】

［実施例１４ｃ］
免疫イヌにおける抗ｃＩＬ－１３力価の測定
免疫イヌから得られたイヌ血清（実施例１３ｃ参照）を、抗ｃＩＬ－３１抗体について実施例１４ａに記載したのと同じＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－１３抗体の存在について試験した。３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液に溶解した１～５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－１３（ストック溶液：ｃＩＬ－１３：０，１５ｍｇ／ｍＬ）でコーティングした。

【0353】

図５４は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃＩＬ－１３－ポリ免疫イヌは、２８日目までの一次免疫においてわずかな抗ｃＩＬ－１３抗体の発達しか示さなかった（図５４Ａ～Ｃ）。しかし、２８日目の追加免疫は、３匹全てのイヌにおいて大規模な抗ｃＩＬ－１３抗体価の増加をもたらし、これは３５日目４２日目付近にピークに達し、６３日目まで、おそらくそれを超えて続いた（図５４Ａ～Ｃ）。

【0354】

［実施例１４ｄ］
免疫イヌにおける抗ｃＩＬ－３３－ＣＳ力価の測定
免疫イヌから得られたイヌ血清（実施例１３ｄ参照）を、抗ｃＩＬ－３３抗体について実施例１４ｃに記載したのと同じＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－３３抗体の存在について試験した。３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液に溶解した１～５μｇ／ｍｌのｃＩＬ－３３－ＷＴ（Ｃ→Ｓ異常を排除するため）でコーティングした。

【0355】

図６７は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリ免疫イヌは、２８日目までの一次免疫において抗ｃＩＬ－３３－ＷＴ抗体の発生を示さなかった（図６７、白抜きの記号）。しかしながら、２８日目の追加免疫は、抗ｃＩＬ－３３－ＷＴ抗体力価の増加をもたらし、これは４２日目にピークに達し、６３日目まで持続し、経時的な減少はほとんどなかった（図６７、黒塗りの記号）。

【0356】

これらの結果は、設計されたｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリ抗原がｃＩＬ－３３－ＷＴに対する自己寛容の破壊をもたらすことを示している。

【0357】

［実施例１４ｅ］
免疫イヌにおける抗ｃＩＬ－４力価の測定
免疫イヌから得られたイヌ血清（実施例１３ｅ参照）を、抗ｃＩＬ－３１抗体について実施例１４ａに記載したのと同じＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－４抗体の存在について試験した。唯一の例外は、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートをコーティング緩衝液に溶解した１μｇ／ｍｌのｃＩＬ－４（ｅｘ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ｃＩＬ－４、０．８４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングしたことであった。

【0358】

図７２は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示す。ｃＩＬ－４－ポリ免疫イヌは、３５日目までの一次免疫においてわずかな抗ｃＩＬ－４抗体の発達しか示さなかった（図７２Ａ～Ｃ）。しかし、３５日目の追加免疫は、一匹のイヌ（イヌ５３６５；図７２Ａ）において大規模な抗ｃＩＬ－４抗体力価の増加をもたらし、これは４２日目頃にピークに達し、６３日目まで、おそらくはそれを超えて持続した。二匹のイヌ（イヌ６５２３、図７２Ｂ及びイヌ７１０４、図７２Ｃ）は、本質的に同じ写真を示したが、追加免疫後の力価はイヌ５３６５よりも弱かった。この実験は、選択された製剤中の設計されたｃＩＬ－４－ポリ抗原がｃＩＬ－４に対する自己寛容の破壊をもたらすことを示す。

【0359】

［実施例１４ｆ］
免疫ネコにおける抗ｆｅｌ－ＩＬ－３１力価の測定
免疫ネコから得られたネコ血清（実施例１３ｆ参照）を、イヌの抗ｃＩＬ－３１抗体について実施例１４ａに記載したのと同じＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて抗ｃＩＬ－３１抗体の存在について試験した。唯一の例外は、３８４ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液に溶解した１μｇ／ｍｌのｆｅｌ－ＩＬ－４（ｅｘ ＧｅｎｓｃｒｉｐｔＵ６３４４ＦＬ１６０－４、ｆｅｌ－ＩＬ－３１、０．５４ｍｇ／ｍｌ）でコーティングしたことであった。

【0360】

図７５及び図７６は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示す。三匹のｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリ免疫ネコのうちの二匹（ネコ３１３２及びネコ５６７４）は、２７日目までの一次免疫において、抗ｆｅｌ－ＩＬ－３１抗体のわずかな発達しか示さなかったか、又は抗ｆｅｌ－ＩＬ－３１抗体の発達を全く示さなかった（図７５Ａ～Ｃ）。しかしながら、２７日目の追加免疫は、３匹全てのネコにおいて、３５日目から６３日目まで高いままであった大規模な抗ｆｅｌ－ＩＬ－３１抗体価の増加をもたらした（図７５Ａ～Ｃ）。１２６日目までの血液試料の更なるＥＬＩＳＡ分析（図７６）は、特異的抗体力価が非常にゆっくりとしか低下せず、有意な力価が一次免疫後４ヶ月及び二次免疫後３ヶ月で依然として存在することを示した（図７６Ａ～Ｃ）。

【0361】

この実験は、設計されたｆｅｌ－ＩＬ－３１－ポリ抗原がネコにおいてｆｅｌ－ＩＬ－３１に対する自己寛容の破壊をもたらし、抗ｆｅｌ－ＩＬ－３１抗体力価が長く続くことを示す。

【0362】

［実施例１５］
イヌ血清中のｃＩＬ－３１中和抗体の存在を分析するための、ポリクローナルイヌ抗体とビオチン化ロキベトマブとの競合試験
ＥＬＩＳＡアッセイは、実施例１１に記載したように実施したが、ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌビオチン化ロキベトマブ中のイヌ血清の混合物を使用した。

【0363】

図１８～図２３は、免疫後４２日目のイヌ血清及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブを含む混合物の抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す。図１８、図２０及び図２２では、応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」であり、したがってレポーター応答からの直接読み出しであるが、図１９、図２１及び図２３は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された応答「ロキベトマブ結合％」の単位として使用している。

【0364】

図２４～図２９は、免疫後４２日目のイヌ血清及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブを含む混合物の抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す。図２４、図２６及び図２８では、応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」であり、したがってレポーター応答からの直接読み出しであるが、図２５、図２７及び図２９は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された応答「％ロキベトマブ結合」の単位として使用している。

【0365】

イヌの免疫前血清は、ｃＩＬ－３１に結合するロキベトマブに対していくらかの阻害活性を示したが、この効果は、免疫の４２日後に得られたイヌ血清の阻害活性と比較してはるかに弱く、１：２希釈で４０～７０％に制限された。これは、インターフェロンアルファ及びガンマ、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１ベータ及び１０等の様々なサイトカインについてヒトにおいて以前に記載されたように、イヌにおけるｃＩＬ－３１サイトカイン自己抗体の存在を反映していると思われる（Ｂｅｎｄｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｉｇｈ－ａｖｉｄｉｔｙ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ １９．５（１９９８）：２０９－２１１）。

【0366】

しかしながら、中和活性は、ｃＩＬ－３１ポリタンパク質による免疫によって大幅に増加した。実施例１３に記載のレジメンに従って免疫した３匹全てのイヌの４２日目の血清試料は、１：２に希釈した場合にｃＩＬ－３１へのロキベトマブの結合を９５％抑制する抗体を含有していた（図２１～図２６参照）。この阻害は、血清試料を更に希釈した場合（滴定）にはあまり顕著にならなかったが、１：１６希釈では、３匹全てのイヌにおいて部分的な効果が依然として見られた。

【0367】

ｃＩＬ－３１ポリをロキベトマブ結合剤として使用した場合にも同様の結果が得られた（図２４～図２９）。

【0368】

ロキベトマブはｃＩＬ－３１中和抗体であるので、記載されたｃＩＬ－３１ポリタンパク質免疫スキームによるロキベトマブ競合自己抗体の誘導の成功は、自己抗体がイヌにおいてｃＩＬ－３１機能を中和することができるという明らかな可能性を示す。

【0369】

ロキベトマブの治療作用は十分に確立されているので、本発明による宿主において誘導されたロキベトマブ競合自己抗体は同様の治療有効性を示すことが期待され得る。

【0370】

［実施例１６］
実施例１３のワクチン製剤を使用した第２の免疫試験
第２の免疫試験では、掻痒症に罹患しているイヌを、以下のように実施例１３によるワクチン製剤を用いた皮下注射によって免疫した：
－７日目：ｃＩＬ－３１によるチャレンジ（ベースライン評価のための１．７５μｇ／ｋｇ ｂｗ静脈内注射）
０日目：実施例１３で定義されているようなｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンによる一次皮下免疫。一次免疫の前に、免疫前の血液試料を全ての試験イヌから採取した。
６日目：血液試料の採取
１４日目：血液試料の採取
２１日目：血液試料の採取及びｃＩＬ－３１（１．７５μｇ／ｋｇ静脈内注射ｃＩＬ－３１）によるチャレンジ
２８日目：ｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンによる第１の皮下追加免疫及び血液試料の採取
３５日目：血液試料の採取
４２日目：ｃＩＬ－３１（１．７５μｇ／ｋｇ静脈内注射ｃＩＬ－３１）によるチャレンジ及び血液試料の採取
４９日目：血液試料の採取
５６日目：血液試料の採取
６３日目：ｃＩＬ－３１（０．８５μｇ／ｋｇ静脈内注射ｃＩＬ－３１）によるチャレンジ及び血液試料の採取
７０日目：血液試料の採取
７７日目：血液試料の採取
８４日目：ｃＩＬ－３１ポリタンパク質ワクチンによる２回目の皮下追加免疫及び血液試料の採取
９１日目：血液試料の採取
９８日目：ｃＩＬ－３１（０．８５μｇ／ｋｇ静脈内注射ｃＩＬ－３１）によるチャレンジ及び血液試料の採取
１０５日目：血液試料の採取
１１２日目：血液試料の採取
１１９日目：血液試料の採取
１２６日目：血液試料の採取

【0371】

２８及び８４日目の追加免疫の間に、試験したイヌに実施例１３によるワクチン製剤を再び投与した。

【0372】

血清試料を、ｃＩＬ－３１をコーティング抗原として使用して、実施例１４に記載のＥＬＩＳＡアッセイで分析した。１：２０～１：２０４８０のイヌ血清の段階希釈液を使用した。図３０ａ～図３０ｂ～図３７ａ～図３７ｂは、これらのＥＬＩＳＡの結果を示し、免疫イヌが相当量の抗ｃＩＬ－３１抗体を産生したことを示す。２８日目の追加免疫は、試験したイヌにおいて抗ｃＩＬ－３１抗体価の増加をもたらした。高い抗ｃＩＬ－３１抗体力価が、４２日目を超えて依然として観察された。試験したイヌでは、２回目の追加免疫までに抗ｃＩＬ－３１抗体力価の部分的喪失のみが起こった。まとめると、これらの結果は、試験したイヌにおけるｃＩＬ－３１に対する自己寛容の破壊の成功を示す。

【0373】

上記の免疫スキームに供されたイヌを、免疫スキームの異なる時点：免疫試験の開始前（－７日目）、最初の免疫の３週間後（２１日目）、最初の追加免疫の２週間後（４２日目）、最初の追加免疫の５週間後（６３日目）及び２回目の追加免疫の２週間後（９８日目）で、実施例４に記載のようないかなる掻痒行動の存在についても分析した。３匹の試験イヌの掻痒行動分析の例示的な結果を図３８に示す。図３８の結果は、適用された免疫スキームによって掻痒スコアを減少させることができ、したがって本発明によるワクチン組成物を使用した予防的／治療的ワクチン治療の成功の概念実証を提供することを実証している。

【0374】

［実施例１７］
本発明によるポリタンパク質をコードするｍＲＮＡを使用するワクチン製剤
近年、ｍＲＮＡワクチンの製造がかなり単純であるという事実のために、ｍＲＮＡによるワクチン接種がますます注目されている。そのようなワクチンの場合、ワクチン製造のコスト及び速度の点でしばしば障害となる、タンパク質抗原を発現及び精製する工程はもはや必要ではない（Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｍａｒｕｇｇｉ Ｇ，Ｓｈａｎ Ｈ，Ｌｉ Ｊ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９ Ｍａｒ ２７；１０：５９４．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．００５９４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１９．を参照されたい）。ｍＲＮＡワクチンは、導入されたｍＲＮＡに基づく宿主自身の細胞による抗原の産生に依存する。

【0375】

本発明のポリタンパク質をコードするｍＲＮＡを含有するワクチンを用いて、それ自体のＩＬ－３１に対するイヌのワクチン接種を達成することもできると考えられる。これは、以下のように達成することができる。

【0376】

実施例１に記載されるｃＩＬ－３１－ポリ構築物をインビトロ転写ベクターに移す。この目的のために、ｃＩＬ－３１－ポリをコードするインサートを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐｃＤＮＡ３．４からｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングする。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、ＥｃｏＲＩクローニング部位の上流にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する。このベクターからのキャップされたランオフＲＮＡ転写物の産生を可能にするために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＩＬ－３１－ポリベクターをインサートの３’に線状化する。次いで、転写特性を改変するために、キャップヌクレオチド、４つのカノニカルｄＮＴＰ及び／又は非カノニカルｄＮＴＰの存在下でＴ７－ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写を行う。次の工程では、得られたランオフ転写物を、Ｐｏｌｙ－Ａポリメラーゼを用いてポリアデニル化する。あるいは、終止コドンのｃＩＬ－３１－ポリ構築物３’中にポリ－ｄＴテールを含めることも可能である。

【0377】

次いで、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡをワクチン接種に使用することができる。イヌは、例えば、裸のｍＲＮＡを特許請求されるワクチン組成物の残りの成分と一緒に筋肉内、皮下若しくは皮内に、又は遺伝子銃を用いて注射することによって、１μｇ～１ｍｇ、より好ましくは１０μｇ～３００μｇのｍＲＮＡ量を投与される。ポリタンパク質をコードするｍＲＮＡを、特許請求されるワクチン組成物の残りの成分と一緒に、リポソーム製剤の形態で、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー若しくはカチオン性細胞透過性ペプチドとの複合体を含む製剤の形態で、又は導入されたｍＲＮＡの半減期、細胞取込み及び翻訳能を増強する他の形態で注射することも可能である。

【0378】

次いで、ｍＲＮＡ注射を２～６週間間隔で繰り返す。抗ｃＩＬ－３１抗体の存在は、実施例１４に記載されているように評価することができる。

【0379】

一般に、ｃＩＬ－３１－ポリ構築物を自己複製ｍＲＮＡによって、例えばアルファウイルス由来自己複製ｍＲＮＡによってコードすることも可能である。自己複製ｍＲＮＡの使用は、宿主への投与時にＲＮＡ構築物からより長いタンパク質産生が達成され、その結果、より高い抗ｃＩＬ－３１抗体力価も得られ得るという利点を有し得る。

【0380】

［実施例１８］
本発明によるポリタンパク質をコードするＤＮＡを使用するワクチン製剤
ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡ、通常はプラスミドＤＮＡを含有する。プラスミドＤＮＡは、注射又は遺伝子銃によって裸の形態で宿主に投与されることが多い。しかしながら、例えば、カチオン性脂質を有するリポプレックスとして、リポソーム製剤として、又はカチオン性ポリマーとの複合体として、プラスミドＤＮＡを宿主に送達することも可能である。時折、ＤＮＡはまた、ウイルスに似たタンパク質シェルに封入され、細胞による効率的な取り込みを確実にする。（総説：Ｇｈａｆｆａｒｉｆａｒ Ｆ．Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｗｈｅｒｅ ａｒｅ ｗｅ ｎｏｗ？Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）．２０１８ Ｍａｙ；５４（５）：３１５－３３３．ｄｏｉ：１０．１３５８／ｄｏｔ．２０１８．５４．５．２８０７８６４）。

【0381】

本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡを含有するワクチンを用いて、それ自体の自己タンパク質の１つ、例えばサイトカイン、特に好ましくはＩＬ－３１に由来するインターロイキンに対するイヌのワクチン接種を達成することもできると考えられる。

【0382】

一例として、本発明のポリタンパク質をコードするＤＮＡを含有するワクチンを用いて、それ自体のＩＬ－３１に対するイヌのワクチン接種を達成することもできると考えられる。これは、以下のように達成することができる。

【0383】

実施例１ａに記載のｃＩＬ－３１－ポリ構築物を哺乳動物発現ベクターに移入する。この目的のために、ｃＩＬ－３１－ポリをコードするインサートを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐｃＤＮＡ３．４からｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングする。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、宿主細胞におけるｃＩＬ－３１－ポリの発現に必要な全ての要素、すなわち、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーターの形態の強力な哺乳動物プロモーター及びウシ成長ホルモンＢＧＨ遺伝子の形態の強力なポリアデニル化／終結シグナルを有する。

【0384】

イヌは、例えば、裸のプラスミドＤＮＡを特許請求されるワクチン組成物の残りの成分と一緒に筋肉内、皮下若しくは皮間に、又は遺伝子銃で注射することによって、１０μｇ～３ｍｇ、より好ましくは５０μｇ～１０００μｇの量の高度に精製されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＩＬ－３１－ポリ（ＬＰＳ非含有）を受けることができた。ポリタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを、特許請求されるワクチン組成物の残りの成分と一緒に、リポソーム製剤の形態で、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー若しくはカチオン性細胞透過性ペプチドとの複合体を含む製剤の形態で、又は導入されたｍＲＮＡの半減期、細胞取込み及び翻訳能を増強する他の形態で注射することも可能である。

【0385】

次いで、プラスミドＤＮＡ注入を２～６週間間隔で繰り返す。抗ｃＩＬ－３１抗体の存在は、実施例１４ａに記載されているように評価することができる。

【0386】

他のインターロイキン、特に本明細書に例示されるインターロイキン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－３３－ＣＳ及びＴＮＦ－α）については、鎮痛プロトコルが想定される。

【0387】

［実施例１９ａ］
特定のウサギ抗ｃＩＬ－１３血清を用いたｃＩＬ－１３シグナル伝達の中和アッセイ
ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ１３（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｈｅｋ－ｉｌ４１３）を、ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，６１６９６５－０２６）、１０％ｉＦＣＳ中、３７℃、５％ＣＯ_２で成長させた。選択目的のために、培養培地に１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ａｎｔ－ｂｌ－５ｂ）及び１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ａｎｔ－ｚｎ－５）を補充した。

【0388】

ウサギ抗ｃＩＬ－１３血清（実施例６ａ）の希釈を、１０ｎｇ／ｍｌのｃＩＬ－１３を補充した３８４ウェル細胞培養プレート中の４０μｌの完全増殖培地で行い、１時間インキュベートした。ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ１３細胞を採取し、完全増殖培地中で２．２ｘ１０^５細胞／ｍＬに調整し、４０μｌの細胞懸濁液を各血清希釈液に添加した。細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２で９６時間インキュベートした。細胞培養上清試料を、３８４ウェルプレートについて９０μｌ／ウェルのＡＰ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．６）中５ｍＭリン酸パラ－ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）に添加することによって、アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の測定に使用した。線形領域（＝ｍＯＤ４０５ｎｍ／分）で曲線勾配を決定することによる速度論モード（ｍＯＤ／分）、又は固定時点での光学密度を決定することによる終点モード（ＯＤ）でのＥＬＩＳＡリーダーにおけるＲＴでの４０５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の測定。

【0389】

ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ１３細胞に対するウサギｃＩＬ－１３抗血清の中和効果のＥＬＩＳＡ結果を図５５に示す。ウサギｃＩＬ－１３抗血清は、既に１：３２０の希釈から開始して、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞のｃＩＬ－１３刺激を阻害した。１：２０の希釈で完全阻害が達成された。この実験は、ｃＩＬ－１３の生物学的効果の抗体中和アッセイを確立した。

【0390】

［実施例１９ｂ］
免疫前及び抗ｃＩＬ－１３イヌ血清を使用したｃＩＬ－１３シグナル伝達の中和アッセイ
実施例１９ａの同じ中和アッセイを、実施例１４ｃのｃＩＬ－１３－ポリワクチン接種試験の０日目（免疫前、ＳＤ－１）及び４２日目に採取した３匹のイヌ（イヌ０５２１、２５７９及び６０４８）からの血清に対して行った。ＥＬＩＳＡの結果を図５６Ａ～Ｃに示す。

【0391】

免疫前血清の希釈（「ＳＤ－１」）は、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞におけるｃＩＬ－１３シグナル強度の低下をもたらさなかったが、３匹全てのイヌからの４２日目のｃＩＬ－１３－ポリ抗血清は、それぞれ１：３２０、１：２０及び１：４０希釈でシグナルの完全な抑制をもたらし、これらの希釈後の阻害の滴定曲線をもたらした（図５６Ａ～Ｃを参照のこと）。

【0392】

［実施例１９ｃ］
免疫前及び抗ｃＩＬ－４イヌ血清を使用したｃＩＬ－４シグナル伝達の中和アッセイ
ＩＬ－４は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ又はＣＣＬ１７）の発現を誘導することが知られており、イヌでは、アトピー性皮膚炎におけるＴＡＲＣの上方制御が実証されている。したがって、ＴＡＲＣを、ＩＬ－４に対するイヌ血液曝露の陽性マーカー（強いｍＲＮＡアップレギュレーション）として使用した。

【0393】

以下のように、ｃＩＬ－４－ポリワクチン接種後に中和抗体の存在を調べるために、ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ上方制御の阻害を評価した：ＥＤＴＡ安定化血液試料を４９日目（イヌ５３６５、イヌ６５２３及びイヌ７１０４）にＩＬ－４－ポリ免疫動物から採取し（追加免疫に２週間）、対照動物から血液試料をプールした。５００μｌの血液に１ｎｇ／ｍｌのｃＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，７５４－ＣＬ－０２５／ＣＦ）を補充し、次いで、血液を３５℃、５％ＣＯ_２及び９６％相対湿度で６時間インキュベートした。ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｕｂｅｓ ５００μｌ（Ｑｉａｇｅｎ ７６５５４）及び室温で２時間のインキュベーションを用いて、血液溶解及びＲＮＡ安定化を行った。

【0394】

次いで、ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ７３２２４）を使用してＲＮＡを単離した。Ｉｍｐｌｅｎ ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標），ｔｙｐｅ ＮＰ８０を使用して、単離されたＲＮＡを分析及び定量した。定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、イヌＣＣＬ－１７（ＴＡＲＣ）用のプローブ及びプライマーを用いたＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｃｆ０２６２２１２８＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＱｕａｎｔｉＮｏｖａ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ２０８３５４）を用いて、プライマー、反応混合物及び製造業者によって概説された条件を用いて行った。家庭用イヌβ－アクチンＴａｑＭａｎプローブ及びＰＣＲプライマーをハウスキーピング遺伝子対照として使用した。典型的には、２５ｎｇの総ＲＮＡを鋳型として使用した。ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。

【0395】

実験の結果を図７３に示す。

【0396】

対照イヌのプール血液は、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ－１７ ｍＲＮＡ誘導に関して１ｎｇ／ｍｌ ｃＩＬ－４とのインキュベーションに対して高度に応答性であった（図７３ＡのΔΔＣｑ参照）。対照的に、ｃＩＬ－４－ポリをワクチン接種した３匹全てのイヌは、ｃＩＬ－４インキュベーションにおいて強く抑制されたＴＡＲＣ／ＣＣＬ－１７ ｍＲＮＡ誘導を有し、線形スケールグラフにおいて３匹全てのイヌについて阻害が明らかに完了した（図７３Ａ）。対数スケールのグラフにおいて、ｃＩＬ－４誘導性ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ産生の阻害は、イヌ５３６５及び７１０４では９９．９９％を超え、イヌ６５２３では９９％を超える（図７３Ｂ）。ｃＩＬ－４刺激の非存在下でのＴＡＲＣのいくらかの軽微なバックグラウンドｍＲＮＡ発現が全てのイヌにおいて検出された（図７３Ｂ、条件「ｗ／ｏ」）。

【0397】

まとめると、データは、ｃＩＬ－４に対する自己寛容が、ｃＩＬ－４－ポリワクチンで免疫された３匹全てのイヌにおいて破壊され、天然のｃＩＬ－４に対する抗体力価が存在したことを実証している。これらの抗体は、ｃＩＬ－４作用のための細胞培養アッセイ系において中和能を有し、免疫されたイヌのエクスビボ血液アッセイにおいて加えられるｃＩＬ－４に対して中和している。

【図面の簡単な説明】

【0398】

【図1】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を可能にするためのＥＲ導入のための人工シグナル配列から始まる。その後、成熟イヌＩＬ－３１の第１のコピーが続く（配列番号３）。成熟イヌＩＬ－３１のこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟イヌＩＬ－３１の第２のコピーが続く。成熟イヌＩＬ－３１のこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合し、続いて成熟イヌＩＬ－３１の第３のコピーが続く。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。これらの２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの後に、タンパク質精製のためのＨｉｓタグが続く。

【図2】図１によるｃＩＬ－３１ポリタンパク質をコードするベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ３１－ポリのプラスミドマップを示す図である。

【図3】ｃＩＬ－３１－ポリのクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図であり、これは実施例２で更に説明される。レーンＭ１は、タンパク質マーカーを除去する（ＴａＫａＲａ、カタログ番号。３４５２）。レーン１は還元条件下でのｃＩＬ－３１ポリタンパク質のサイズを示し、レーン２は非還元条件下でのサイズを示す。

【図4】実施例３で更に説明する、ｃＩＬ－３１のクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。レーンＭ１は、タンパク質マーカーを除去する（ＴａＫａＲａ、カタログ番号。３４５２）。レーン１は還元条件下でのｃＩＬ－３１タンパク質のサイズを示し、レーン２は非還元条件下でのサイズを示す。

【図5】ｃＩＬ－３１に対して惹起されたウサギ免疫前血清及び抗血清のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８で更に説明される。

【図6】ｃＩＬ－３１に対して産生されたニワトリ卵黄調製物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１又はｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８で更に説明される。

【図7】実施例９で更に説明する、ロキベトマブのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図8】ロキベトマブに対するＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１及びｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例９で更に説明される。

【図9】ビオチン化ロキベトマブのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１０で更に説明される。

【図10】ウサギ免疫前血清＋ビオチン化ロキベトマブの混合物又はウサギ免疫血清＋ビオチン化ロキベトマブの混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用して、ｃＩＬ－３１中和抗体としてのビオチン化ロキベトマブとＥＬＩＳＡプレートに固定化されたｃＩＬ－３１との間の相互作用をプローブするＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１１で更に説明される。

【図11】ウサギ免疫前血清＋ビオチン化ロキベトマブの混合物又はウサギ免疫血清＋ビオチン化ロキベトマブの混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して、ｃＩＬ－３１中和抗体としてのビオチン化ロキベトマブとＥＬＩＳＡプレートに固定化されたｃＩＬ－３１ポリタンパク質との間の相互作用をプローブするＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１１で更に説明される。

【図12】ニワトリ卵黄ＩｇＹ調製物＋ビオチン化ロキベトマブの混合物に対するＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用して、ｃＩＬ－３１中和抗体としてのロキベトマブとＥＬＩＳＡプレートに固定化されたｃＩＬ－３１との間の相互作用をプローブするＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１１で更に説明される。

【図13】構築物ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｂｓｄ－ＮＦｋＢ－ＳＥＡＰのプラスミドマップを示す図である。 －１８１ｂｐ－４４８ｂｐは５つのＮＦｋＢ結合部位をコードし、その後に最小ＥＬＡＭプロモーター（ＮＦｋＢ－５－ＥＬＡＭ）が続く －４５４ｂｐ－２０２２ｂｐは、ＮＦｋＢレポーター遺伝子としてＳＥＡＰ遺伝子をコードする －３２１４ｂｐ－３６１３ｂｐはブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｄ－Ｒ）をコードして真核細胞選択を可能にする －５９６１ｂｐ～５１００ｂｐは、Ｅ．コリ選択を可能にするためのアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ－Ｒ）をコードする。

【図14】クローン細胞株ＤＨ８２－ｂｓｄ－ＮＦＳＥＡＰをＰＴＯ－ＯＤＮで処理した場合のＮＦｋＢシグナル活性化の結果を示す図である。これらの結果は、実施例１２に更に記載されている。

【図15a】異なる試料採取時点での動物４３１５のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図15b】異なる試料採取時点での動物４３１５のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図15c】異なる試料採取時点での動物４３１５のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４で更に説明される。

【図16a】異なる試料採取時点での動物６９６２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図16b】異なる試料採取時点での動物６９６２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図16c】異なる試料採取時点での動物６９６２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４で更に説明される。

【図17a】異なる試料採取時点での動物８５２３のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図17b】異なる試料採取時点での動物８５２３のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図17c】異なる試料採取時点での動物８５２３のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４で更に説明される。

【図18】イヌ４３１５及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図19】イヌ４３１５及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図20】イヌ６９６２及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図21】イヌ６９６２及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図22】イヌ８５２３及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図23】イヌ８５２３及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図24】イヌ４３１５及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図25】イヌ４３１５及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図26】イヌ６９６２及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図27】イヌ６９６２及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図28】イヌ８５２３及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は「ｍＯＤ４０５／分」として示され、したがってレポーター応答からの直接読み出しである。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図29】イヌ８５２３及び１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ロキベトマブの免疫後４２日目からの血清を含む混合物のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。応答の単位は、０日目の免疫前血清についての「ｍＯＤ４０５／分」の最も高い読み出しに基づいて計算された「ロキベトマブ結合％」として示される。これらの結果は、実施例１５で更に説明される。

【図30a】異なる試料採取時点での動物１６７２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図30b】異なる試料採取時点での動物１６７２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図31a】異なる試料採取時点での動物５０９６のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図31b】異なる試料採取時点での動物５０９６のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図32a】異なる試料採取時点での動物５５８３のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図32b】異なる試料採取時点での動物５５８３のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図33a】異なる試料採取時点での動物７９１８のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図33b】異なる試料採取時点での動物７９１８のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図34a】異なる試料採取時点での動物９３５１のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図34b】異なる試料採取時点での動物９３５１のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図35a】異なる試料採取時点での動物８７７９のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図35b】異なる試料採取時点での動物８７７９のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図36a】異なる試料採取時点での動物１３６８のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図36b】異なる試料採取時点での動物１３６８のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図37a】異なる試料採取時点での動物３４３２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図37b】異なる試料採取時点での動物３４３２のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３１を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１６で更に説明される。

【図38】実施例１６に記載の免疫スキームに供した３匹の試験イヌの掻痒行動分析の例示的な結果を示す図である。結果は、実施例１６で更に説明される。

【図39】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を可能にするためのＥＲ導入のための人工シグナル配列から始まる。その後、成熟イヌＩＬ－５の第１のコピーが続く（配列番号４１）。成熟イヌＩＬ－５のこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟イヌＩＬ－５の第２のコピーが続く。成熟イヌＩＬ－５のこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合し、続いて成熟イヌＩＬ－５の第３のコピーが続く。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。これらの２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの後に、タンパク質精製のためのＨｉｓ_６タグが続く。

【図40】図３９によるｃＩＬ－５ポリタンパク質をコードするベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５－ポリのプラスミドマップを示す図である。

【図41】ｃＩＬ－５－ポリのクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図であり、これは実施例２ｂで更に説明される。レーン「Ｍ_２」は、タンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２１）を示す。レーン「Ｒ」は還元条件下でのｃＩＬ－５ポリタンパク質のサイズを示し、レーン「ＮＲ」は非還元条件下でのサイズを示す。レーン「Ｐ」は、陽性対照として多重タグタンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ０１０１）を示す。一次抗体はマウス抗Ｈｉｓ６ ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１８６）であった。

【図42】ｃＩＬ－５タンパク質をコードするベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－５のプラスミドマップを示す図である。

【図43】実施例３ｂで更に説明する、ｃＩＬ－５のクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は還元条件下でのｃＩＬ－５タンパク質のサイズを示し、レーン２は非還元条件下でのサイズを示す。

【図44】ウサギ免疫前血清及びｃＩＬ－５に対して産生された抗血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用したＥＬＩＳＡの力価決定結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｂで更に説明される。

【図45】ｃＩＬ－５に対して惹起されたウサギ免疫前血清及び抗血清のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５又はｃＩＬ－５ポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｂで更に説明される。

【図46A】動物「イヌ１」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図46B】動物「イヌ１」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図46C】動物「イヌ２」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図46D】動物「イヌ２」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図46E】動物「イヌ３」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図46F】動物「イヌ３」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－５を使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４ｂで更に説明される。

【図47】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を可能にするためのＥＲ導入のための人工シグナル配列から始まる。その後、成熟イヌＩＬ－１３の第１のコピーが続く（配列番号４６）。成熟イヌＩＬ－１３のこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟イヌＩＬ－１３の第２のコピーが続く。成熟イヌＩＬ－１３のこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合し、続いて成熟イヌＩＬ－１３の第３のコピーが続く。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。これらの２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの後に、タンパク質精製のためのＨｉｓ_６タグが続く。

【図48】ｃＩＬ－１３タンパク質をコードするベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－１３のプラスミドマップを示す図である。

【図49】ｃＩＬ－１３－ポリのクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図であり、これは実施例２ｂで更に説明される。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は還元条件下でのｃＩＬ－１３ポリタンパク質のサイズを示し、レーン２は非還元条件下でのサイズを示す。

【図50】ｃＩＬ－１３タンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－１３のプラスミドマップを示す図である。

【図51】実施例３ｃで更に説明する、ｃＩＬ－１３のクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、２μｇ）のサイズを示す。レーン２は、ｃＩＬ－１３タンパク質のサイズ（１．８６μｇ）を示す。

【図52】ＳＥＡＰレポーター遺伝子読み出しに基づく、ｃＩＬ－１３によるＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞刺激の結果を示す図である。これらの結果は、実施例１２ｂに更に記載されている。

【図53A】ｃＩＬ－１３に対して惹起されたウサギ免疫前血清（白抜きの記号）及び抗血清（黒塗りの記号）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－１３タンパク質（Ａ）又はｃＩＬ－１３ポリタンパク質（Ｂ）を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｃで更に説明される。

【図53B】ｃＩＬ－１３に対して惹起されたウサギ免疫前血清（白抜きの記号）及び抗血清（黒塗りの記号）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－１３タンパク質（Ａ）又はｃＩＬ－１３ポリタンパク質（Ｂ）を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｃで更に説明される。

【図54A】動物「イヌ０５２１」（Ａ）、動物「イヌ２５７９」（Ｂ）及び動物「イヌ６０４８」（Ｃ）のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－１３を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図54B】動物「イヌ０５２１」（Ａ）、動物「イヌ２５７９」（Ｂ）及び動物「イヌ６０４８」（Ｃ）のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－１３を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図54C】動物「イヌ０５２１」（Ａ）、動物「イヌ２５７９」（Ｂ）及び動物「イヌ６０４８」（Ｃ）のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－１３を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４ｃで更に説明される。

【図55】ウサギ抗ｃＩＬ－１３血清で処理したＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞のｃＩＬ－１３刺激の結果を示す図である。これらの結果は、実施例１９ａに更に記載されている。

【図56A】ｃＩＬ－１３－ポリによる免疫後の０日目（免疫前、白抜きの記号、「ＳＤ－１」）又は４２日目（黒塗りの記号、「ＳＤ４２」）のいずれかにおいて、イヌ０５２１から採取したイヌ血清で処理したＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞のｃＩＬ－１３刺激の結果を示す図である。

【図56B】ｃＩＬ－１３－ポリによる免疫後の０日目（免疫前、白抜きの記号、「ＳＤ－１」）又は４２日目（黒塗りの記号、「ＳＤ４２」）のいずれかにおいて、イヌ３５７９から採取したイヌ血清で処理したＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞のｃＩＬ－１３刺激の結果を示す図である。

【図56C】ｃＩＬ－１３－ポリによる免疫後の０日目（免疫前、白抜きの記号、「ＳＤ－１」）又は４２日目（黒塗りの記号、「ＳＤ４２」）のいずれかにおいて、イヌ６０４８から採取したイヌ血清で処理したＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞のｃＩＬ－１３刺激の結果を示す図である。これらの結果は、実施例１９ｂに更に記載されている。

【図57】ｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ（＋）－ｃａｎＩＬ３３－ＷＴのプラスミドマップを示す。

【図58】ｃＩＬ－３３－ＷＴのクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示し、これは実施例３ｄで更に説明される。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のサイズを示す。レーン２は、還元条件下でのｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質のサイズを示す。

【図59】ｃＩＬ－３３－ＷＴに対して惹起されたウサギ免疫前血清（白抜きの記号）及び抗血清（黒塗りの記号）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３３－ＷＴタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｄで更に説明される。

【図60】ｃＩＬ－３３－ＣＳタンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ－ｃａｎＩＬ３３－ＣＳのプラスミドマップを示す図である。

【図61】ｃＩＬ－３３－ＣＳのクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図であり、これは実施例３ｅで更に説明される。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のサイズを示す。レーン２は、還元条件下でのｃＩＬ－３３－ＣＳタンパク質のサイズを示す図である。

【図62】ＳＥＡＰレポーター遺伝子読み出しに基づく、異なる形態のｃＩＬ－３３によるＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞刺激の結果を示す図である。使用される異なる形態は、ＩＬ－３３－ＷＴ－ＮｏｖｏＰｒｏ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｏｖｏｐｒｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｐ／ｈｕｍａｎ－ｉｌ３３－ｃ９ｏｒｆ２６－ｉｌ１ｆ１１－ｎｆｈｅｖ－５１９１４６．ｈｔｍｌ；白抜きの丸）、ｃＩＬ－３３－ＷＴ Ｂａｔｃｈ１（黒塗りの三角）、ｃＩＬ－３３－ＷＴ Ｂａｔｃｈ２（黒塗りの四角）及びｃＩＬ－３３－ＣＳ（閉じた丸）である。これらの結果は、実施例１２ｃに更に記載されている。

【図63】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、Ｅ．コリ細胞における発現を可能にするための開始メチオニン及びＨｉｓ_６タグから始まる。その後、成熟イヌＩＬ－３３の第１のコピーが続く（ｃＩＬ－３３－ＣＳの意味；配列番号５１）。成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳのこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳの第２のコピーが続く。成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳのこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合し、続いて成熟イヌＩＬ－３３－ＣＳの第３のコピーが続く。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。

【図64】ｃＩＬ－３３－ＣＳタンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ３３－ポリのプラスミドマップを示す図である。

【図65】ｃＩＬ－３３－ＣＳ－ポリ（ここではｃＩＬ－３３－ポリとも呼ばれる）のクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す図であり、これは実施例２ｄで更に説明される。レーンＭ_１は、タンパク質マーカー（ＴａＫａＲａ、カタログ番号３４５２）を示す。レーン１は還元条件下でのｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質のサイズを示し、レーン２は非還元条件下でのサイズを示す。

【図66】ｃＩＬ－３３－ＷＴに対して惹起されたウサギ免疫前血清（白抜きの記号）及び抗血清（黒塗りの記号）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例８ｄで更に説明される。

【図67】ｃＩＬ－３３－ＣＳポリタンパク質を使用して免疫した動物「イヌ４０２」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－３３－ＷＴを使用した異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。時点は、免疫前血清（白抜きの丸）、免疫後２８日目（白抜きの丸）、免疫後３５日目（閉じた丸）、免疫後４２日目（黒塗りの四角）、免疫後４９日目（黒塗りの三角形）、免疫後５６日目（黒塗りの菱形）、免疫後６３日目（白抜きの三角）である。これらの結果は、実施例１４ｄで更に説明される。

【図68】本発明によるポリタンパク質（配列番号５７）の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を可能にするためのＥＲ導入のための人工シグナル配列から始まる。その後、成熟イヌＩＬ－４の第１のコピーが続く（配列番号５６）。成熟イヌＩＬ－４のこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟イヌＩＬ－４の第２のコピーが続く。成熟イヌＩＬ－４のこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合し、続いて成熟イヌＩＬ－４の第３のコピーが続く。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。これらの２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの後に、タンパク質精製のためのＨｉｓ_６タグが続く。

【図69】ｃＩＬ－４タンパク質をコードするベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｃＩＬ－４のプラスミドマップを示す図である。

【図70】ｃＩＬ－４タンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ－ｃＩＬ－４のプラスミドマップを示す図である。

【図71A】ｃＩＬ－４に対して惹起されたウサギ免疫前血清（丸）及び抗血清（三角）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－４タンパク質（Ａ）又はｃＩＬ－４ポリタンパク質（Ｂ）を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ｃＩＬ－１３に対して惹起したウサギ抗血清のコーティング抗原としてｃＩＬ－４－ポリタンパク質を用いた結果（四角）も示す。これらの結果は、実施例８ｅで更に説明される。

【図71B】ｃＩＬ－４に対して惹起されたウサギ免疫前血清（丸）及び抗血清（三角）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－４タンパク質（Ａ）又はｃＩＬ－４ポリタンパク質（Ｂ）を使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ｃＩＬ－１３に対して惹起したウサギ抗血清のコーティング抗原としてｃＩＬ－４－ポリタンパク質を用いた結果（四角）も示す。これらの結果は、実施例８ｅで更に説明される。

【図72A】動物「イヌ５３６５」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－４を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図72B】動物「イヌ６５２３」のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－４を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図72C】動物「イヌ７１０４」（Ｃ）のイヌ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｃＩＬ－４を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。これらの結果は、実施例１４ｅで更に説明される。

【図73A】４９日目に３匹のＩＬ－４ポリ免疫イヌ（図７２におけるようにイヌ５３６５、イヌ６５２３及びイヌ７１０４）から採取したＥＤＴＡ安定化血液、又はワクチン曝露なしの対照イヌからのプール血液試料（「プールされたナイーブ血液」）のｃＩＬ－４刺激（「＋ＩＬ４」）後のＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ結果を示す図である。ΔΔＣｑ値は、低値のより良好な視覚化のために線形（Ａ）又はｌｏｇ_１０スケール（Ｂ）で与えられる。「ｗ／ｏ」は、同じ方法でインキュベート及び処理されたが、ｃＩＬ－４を受けていない血液試料を示す。結果は、実施例１９ｃに更に記載される。

【図73B】４９日目に３匹のＩＬ－４ポリ免疫イヌ（図７２におけるようにイヌ５３６５、イヌ６５２３及びイヌ７１０４）から採取したＥＤＴＡ安定化血液、又はワクチン曝露なしの対照イヌからのプール血液試料（「プールされたナイーブ血液」）のｃＩＬ－４刺激（「＋ＩＬ４」）後のＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ結果を示す図である。ΔΔＣｑ値は、低値のより良好な視覚化のために線形（Ａ）又はｌｏｇ_１０スケール（Ｂ）で与えられる。「ｗ／ｏ」は、同じ方法でインキュベート及び処理されたが、ｃＩＬ－４を受けていない血液試料を示す。結果は、実施例１９ｃに更に記載される。

【図74】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を可能にするためのＥＲ導入のための人工シグナル配列から始まる。その後、成熟ネコＩＬ－３１の第１のコピーが続く（ｆｅｌ－ＩＬ－３１を意味する；配列番号６１）。成熟ネコＩＬ－３１のこの第１のコピー（配列番号６０）の後、破傷風毒素ｐ２Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）が含まれ、続いて成熟ネコＩＬ－３１の第２のコピーが含まれる。成熟ネコＩＬ－３１のこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）を結合させ、続いて成熟ネコＩＬ－３１の第３のコピーを結合させる。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。これらの２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープの後に、タンパク質精製のためのＨｉｓ_６タグが続く。

【図75A】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ３１３２」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図75B】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ０４８７」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図75C】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ５６７４」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。時点は、２日目の血清（白抜きの丸）、免疫後７日目（白抜きの菱形）、免疫後１４日目（白抜きの三角）、免疫後２１日目（「ｘ」）、免疫後２７日目（星印）、免疫後３５日目（黒塗りの丸）である。免疫後４２日目（黒塗りの菱形）、免疫後４９日目（黒塗りの三角）、免疫後５６日目（太字「ｘ」）、及び免疫後６３日目（黒塗りの四角）である。これらの結果は、実施例１４ｆで更に説明される。

【図76A】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ３１３２」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図76B】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ０４８７」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図76C】ｆｅｌ－ＩＬ－３１ポリタンパク質を使用して免疫した動物「ネコ５６７４」のネコ血清のＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてｆｅｌ－ＩＬ－３１を使用した、異なる試料採取時点でのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。時点は、免疫後６３、７０、７７、８４、９１、９８、１０５、１１２、１１９及び１２６日目の血清である（記号については凡例を参照）。これらの結果は、実施例１４ｆで更に説明される。

【図77】本発明によるポリタンパク質の実施形態を示す図である。ポリタンパク質のＮ末端は、Ｅ．コリ細胞における発現を可能にするための開始メチオニン及びＨｉｓ_６タグから始まる。これに続いて、成熟ウシＴＮＦ－αの第１のコピー（配列番号６４の意味）を行う。成熟ウシＴＮＦ－αのこの第１のコピーの後、破傷風毒素ｐ３０ Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸９４７～９６８、配列番号２）が含まれ、続いて成熟ウシＴＮＦ－αの第２のコピーが含まれる。成熟ウシＴＮＦ－αのこの第２のコピーの後、破傷風毒素ｐ２ Ｔ細胞エピトープ（破傷風毒素のアミノ酸１２７３～１２８４、配列番号１）を結合し、続いて成熟ウシＴＮＦ－αの第３のコピーを結合する。その後、２つの破傷風毒素Ｔ細胞エピトープ（ｐ３０及びｐ２）が含まれる。

【図78】ウシＴＮＦ－αポリタンパク質をコードするベクターｐＥＴ３０ａ－ｂｏｖ－ＴＮＦ－α－ポリのプラスミドマップを示す図である。

【図79】ウシＴＮＦ－αポリタンパク質に対して惹起されたウサギ免疫前血清（「ｘ」）及び抗血清（丸）のためのＥＬＩＳＡプレートコーティング抗原としてウシＴＮＦ－αを使用したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15a】

【図15b】

【図15c】

【図16a】

【図16b】

【図16c】

【図17a】

【図17b】

【図17c】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30a】

【図30b】

【図31a】

【図31b】

【図32a】

【図32b】

【図33a】

【図33b】

【図34a】

【図34b】

【図35a】

【図35b】

【図36a】

【図36b】

【図37a】

【図37b】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46A】

【図46B】

【図46C】

【図46D】

【図46E】

【図46F】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53A】

【図53B】

【図54A】

【図54B】

【図54C】

【図55】

【図56A】

【図56B】

【図56C】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71A】

【図71B】

【図72A】

【図72B】

【図72C】

【図73A】

【図73B】

【図74】

【図75A】

【図75B】

【図75C】

【図76A】

【図76B】

【図76C】

【図77】

【図78】

【図79】

【配列表】

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【国際調査報告】