特表2024-504198ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群及びその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-30
(54)【発明の名称】ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240123BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240123BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240123BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023545850
(86)(22)【出願日】2022-01-21
(85)【翻訳文提出日】2023-09-22
(86)【国際出願番号】 CN2022073168
(87)【国際公開番号】W WO2022161272
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】202110114500.8
(32)【優先日】2021-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518318761
【氏名又は名称】厦門艾徳生物医薬科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】宋 慶涛
(72)【発明者】
【氏名】李 有彩
(72)【発明者】
【氏名】楊 爽
(72)【発明者】
【氏名】張 嚇妹
(72)【発明者】
【氏名】洪 燕女
(72)【発明者】
【氏名】裴 艶瑞
(72)【発明者】
【氏名】阮 力
(72)【発明者】
【氏名】鄭 立謀
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ57
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
(57)【要約】
本発明は、ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群であって、第1マーカー～第22マーカーのうちの少なくとも2つを含むバイオマーカー群、及びその使用が提供される。該バイオマーカー群でヒト集団を検出するMslは、検出精度が高く、検出プラットフォームは汎用性が高く、検出コストが安価である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群であって、マーカーのホモポリマー反復配列またはその突然変異形態を検出し、12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第１のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第２のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第３のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第４のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第５のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12：58202496から始まる第６のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーとからなる群の少なくとも２種を含むことを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群。
【請求項2】
前記バイオマーカーの中の少なくとも３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーからなり、または前記全てのマーカーからなることを特徴とする請求項1に記載のバイオマーカー群。
【請求項3】
ヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法であって、12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第4のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのホモポリマー反復配列の塩基数を確認することを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法。
【請求項4】
前記バイオマーカーの中の少なくとも３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数及びその突然変異形態、または前記全てのマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数及びその突然変異形態を確認することを特徴とする請求項3記載の方法。
【請求項5】
前記ホモポリマー反復配列またはその突然変異形態の領域を増幅する工程をさらに含むことを特徴とする請求項3または4に記載の方法。
【請求項6】
前記検出のプロセスが完了した後に、融解曲線データを生成することを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記増幅工程は、分子ビーコンプローブを使用することを含むこと特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項8】
前記増幅は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列又はその突然変異形態の領域に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーをさらに含み、前記制限プライマーが前記分子ビーコンプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記分子ビーコンプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多いことを特徴とする請求項7に記載の方法。
【請求項9】
制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記増幅工程は、Light off/Light onプローブを使用することを含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項11】
前記増幅は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列又はその突然変異形態の領域に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーをさらに含み、前記制限プライマーが前記Light off/Light onプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記Light off/Light onプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多いことを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項12】
制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記増幅のサイクル数は40～70であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項14】
高忠実度DNAポリメラーゼを用いて前記増幅を行うことを特徴とする請求項5記載の方法。
【請求項15】
ヒトの生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキットであって、12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第4のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するTのホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのマーカーを増幅するためのプライマー対およびプローブを含むことを特徴とするヒトの生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキット。
【請求項16】
前記バイオマーカーの中の少なくとも３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数、または前記全てのマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数を増幅するためのプライマー対およびプローブを含むことを特徴とする請求項15に記載のキット。
【請求項17】
前記プローブが分子ビーコンプローブであることを特徴とする請求項15または16に記載のキット。
【請求項18】
前記プライマー対は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーからなり、前記制限プライマーが前記分子ビーコンプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記分子ビーコンプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多いことを特徴とする請求項17に記載のキット。
【請求項19】
制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
【請求項20】
前記プローブはLight off/Light onプローブ対であることを特徴とする請求項15又は16に記載のキット。
【請求項21】
前記プライマー対は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーからなり、前記制限プライマーが前記Light off/Light onプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記Light off/Light onプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多いことを特徴とする請求項20に記載のキット。
【請求項22】
前記制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3 ～ 1:20であることを特徴とする請求項21に記載のキット。
【請求項23】
前記プライマー対による増幅のサイクル数は40 ～ 70サイクルであることを特徴とする請求項15または16に記載のキット。
【請求項24】
前記プライマー対による増幅は、高忠実度DNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項15または16に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マイクロサテライト不安定性検出の技術分野に属し、具体的には、ヒトマイクロサテライト不安定性を検出するためのバイオマーカー群及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
マイクロサテライト(Microsatellite，MS)は、短鎖縦列反復配列(Short tandem repeat，STR)とも呼ばれ、ヒトゲノムにおいて数個のヌクレオチド(多くは1 ～ 6個)の単位で縦列に繰り返されるDNA配列であって、その反復長は5 ～ 50回であり、ヒトゲノムには約50万個の短鎖縦列反復配列が広く分布している。短い縦列反復配列が複製される場合、塩基高度反復による鎖滑り「Strand slippage」は、正常配列よりもはるかに高い確率で複製を誤る。健常なヒトでは、短い縦列反復配列によるミスマッチが、DNAミスマッチ修復(Mismatch repair，MMR)機構によって適時に修復され、短い縦列反復配列が、固定長を維持する。DNAミスマッチ修復機能に異常が生じた場合、短い縦列反復配列の複製エラーが訂正されずに累積され続けることにより、反復長または塩基組成が変化し、これはマイクロサテライト不安定性(Microsatellite instability，MSI)と呼ばれる。
【0003】
現在、MSI検出のゴールドスタンダードは、PCR-キャピラリー電気泳動法による5種類のマイクロサテライトマーカーの検出であり、検出の際に、一世代シークエンサーを用いて増幅産物の分析を行う必要があり、最も早く米国国立がん研究所（National cancer institute ，NCI)により提案されている。このパネルは、2つの単一ヌクレオチド反復マーカーと3つのジヌクレオチド反復マーカーを含み、2004年の改訂後、ジヌクレオチド反復マーカーを単一ヌクレオチド反復マーカーで置き換えて、検出感度と特異性を改善した。MSIを検出した結果を分析する場合、2つ以上のマーカーがミクロサテライト不安定を起こしている場合、高度ミクロサテライト不安定(Microsatellite instability-High，MSI-H )となり、マーカーの不安定が1つしか検出されなかった場合、低度ミクロサテライト不安定（Microsatellite instability-Low，MSI-L）となり、マイクロ衛星が安定していないことを示すマーカーがない場合、マイクロ衛星が安定している(Microsatellite stable，MSS)。ゴールドスタンダードの検出は、MSI検出の普及に困難をもたらす以下の明らかな欠点を有する。
1. 各サンプルを検出する際に、検出されるサンプルと対照サンプルを同時に検出する必要があり、検出コスト及び作業量が増加する。
2. 検出のプロセスが長く、PCR増幅、増幅産物処理、一世代シークエンサー断片分析検出、特殊化ソフトウェア分析などを必要とし、迅速なMSI検出の完了が困難である。
3. 機器の購入コストが高く、また、第一世代シークエンサーのキットに使用される試薬、消耗品等もMSI検出コストを増加させる。
4. アッセイプラットフォームは、汎用性が低く、従来のアッセイではキャピラリー電気泳動法に関連する製品が少なく、各研究室のキャピラリー電気泳動プラットフォームの専門性レベルが弱い。
5. 増幅産物の濃度が高いため、検出の際に増幅産物反応管を何度も開けなければならず、汚染等を招きやすい。
1. 各サンプルを検出する際に、検出されるサンプルと対照サンプルを同時に検出する必要があり、検出コスト及び作業量が増加する。
2. 検出のプロセスが長く、PCR増幅、増幅産物処理、一世代シークエンサー断片分析検出、特殊化ソフトウェア分析などを必要とし、迅速なMSI検出の完了が困難である。
3. 機器の購入コストが高く、また、第一世代シークエンサーのキットに使用される試薬、消耗品等もMSI検出コストを増加させる。
4. アッセイプラットフォームは、汎用性が低く、従来のアッセイではキャピラリー電気泳動法に関連する製品が少なく、各研究室のキャピラリー電気泳動プラットフォームの専門性レベルが弱い。
5. 増幅産物の濃度が高いため、検出の際に増幅産物反応管を何度も開けなければならず、汚染等を招きやすい。
【0004】
免疫組織化(IHC)はMMR関連タンパク質(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)の検出に使用可能であり、検出時に対応するタンパク質を蛍光標識し、顕微鏡検査装置によって個々の細胞における表現の有無を観察し、さらにMMR機能不全の発生の有無を分析する。4種のタンパク質が全ての細胞で検出可能である場合、MMR発現は正常であり(pMMR)、細胞中に1つまたは複数のタンパク質発現が欠失している場合、MMR発現は欠失(dMMR)である。免疫組織化は基礎検出として開発できるが、異なる検出キットの性能の差が大きく、検出感度がやや低く、肉眼で観察する場合に医師に高い要求があるなどの理由により、免疫組織化はMSI検出の標準的アプローチとしては難しい。
【0005】
NGSは、MSIマーカーの検出に使用することができ、検出時にサンプル中の多数のマーカーのライブラリー調製を行い、二世代シーケンサーを用いてライブラリーをシークエンシングし、センシトラートアルゴリズムと合わせて各マーカーの反復長が変化したか否かを分析し、さらにMSI状態を判断する。NGSプラットフォームによるMSIの検出は成熟しているが、配列決定試薬の忠実性が継続的に向上せず、検出コストが高く、検出周期が長く、異なる検出キットによる検出アルゴリズムが大きく異なるなどの欠点により、応用の見込みが制限されている。
【0006】
以上の3種類のMSI状態を検出する方法は、いずれも重大な欠陥を有するため、高い検出精度、検出プラットフォームの共通化、検出コストの低廉化、検出周期の短い検出方法がMSI状態の確認に急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服し、ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するバイオマーカー群を提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、上記のようなヒトマイクロサテライト不安定性検出用バイオマーカー群の応用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の技術的解決策は、以下の通りである。
ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群であって、以下のバイオマーカーの中の少なくとも二つのマーカーを含む。
ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群であって、以下のバイオマーカーの中の少なくとも二つのマーカーを含む。
【0010】
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第１のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第２のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第３のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第４のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第５のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12：58202496から始まる第６のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも２種を含むことを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群。
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第２のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第３のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第４のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第５のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12：58202496から始まる第６のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマーリピートを含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも２種を含むことを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群。
【0011】
本発明の好ましい実施形態において、バイオマーカー群は、前記バイオマーカーの中の少なくとも２個、又は３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーからなり、または前記全てのマーカーからなる。
【0012】
本発明の他の実施態様は、以下の通りである。
ヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法であって、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第4のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのホモポリマー反復配列の重複塩基数を確認することを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法。
ヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法であって、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第4のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのホモポリマー反復配列の重複塩基数を確認することを特徴とするヒトマイクロサテライトの不安定性を分析するための方法。
【0013】
本発明の好ましい実施態様において、前記バイオマーカーの中の少なくとも２個、又は３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数及びその突然変異形態、または前記全てのマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数及びその突然変異形態を決定する。
【0014】
本発明の好ましい態様においては、前記ホモポリマー反復配列またはその突然変異形態の領域を増幅する工程をさらに含む。
【0015】
さらに好ましくは、前記検出のプロセスが完了した後に、融解曲線データを生成する。
【0016】
さらに好ましくは、前記増幅工程は、分子ビーコンプローブを使用することを含む。
【0017】
さらに好ましくは、前記増幅は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列又はその突然変異形態の領域に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーをさらに含み、前記制限プライマーが前記分子ビーコンプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記分子ビーコンプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多い。
【0018】
さらに好ましくは、制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20である。
【0019】
さらに好ましくは、前記増幅工程は、Light off/Light onプローブを使用する。
【0020】
さらに好ましくは、前記増幅は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列又はその突然変異形態の領域に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーをさらに含み、前記制限プライマーが前記Light off/Light onプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記Light off/Light onプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多い。
【0021】
さらに好ましくは、制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20である。
【0022】
さらに好ましくは、前記増幅のサイクル数は40～70である。
【0023】
さらに好ましくは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて前記増幅を行う。
【0024】
本発明のさらに別の実施態様は、以下の通りである。
ヒトの生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキットであって、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第４のマーカーと
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するTのホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのマーカーを増幅するためのプライマー対およびプローブを含むことを特徴とするヒト生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキット。
ヒトの生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキットであって、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトEIF4E3遺伝子に局在し、chr3:71739332から始まる第1のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトUBAC2遺伝子に局在し、chr13:99890849から始まる第2のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトTAOK3遺伝子に局在し、chr12:118675984から始まる第3のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトIFT140遺伝子に局在し、chr16:1612145から始まる第４のマーカーと
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPRR5-ARHGAP8遺伝子に局在し、chr22:45205158から始まる第5のマーカーと、
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトAVIL遺伝子に局在し、chr12:58202496から始まる第6のマーカーと、
8個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACVR2A遺伝子に局在し、chr2:148683685から始まる第7のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPPP1CC遺伝子に局在し、chr12:111160513から始まる第8のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトRBM14-RBM4遺伝子に局在し、chr11:66410771から始まる第9のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSDHC遺伝子に局在し、chr1:161309335から始まる第10のマーカーと、
12の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPUM2遺伝子に局在し、chr2:20526998から始まる第11のマーカーと、
12個の連続するTのホモポリマー反復配列を含み、ヒトDEC1遺伝子に局在し、chr9:118164375から始まる第12のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトCOL11A1遺伝子に局在し、chr1:103468855から始まる第13のマーカーと、
11個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトYTHDF3遺伝子に局在し、chr8:64081981から始まる第14のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトACTL6A遺伝子に局在し、chr3:179291295から始まる第15のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMCM3AP遺伝子に局在し、chr21:47703455から始まる第16のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSPDL1遺伝子に局在し、chr5:169020337から始まる第17のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトSMARCA2遺伝子に局在し、chr9:2083325から始まる第18のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトPROSER1遺伝子に局在し、chr13:39608335から始まる第19のマーカーと、
12個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトMZB1遺伝子に局在し、chr5:138723143から始まる第20のマーカーと、
12個の連続するT塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトANKIB1遺伝子に局在し、chr7:92020452から始まる第21のマーカーと
10個の連続するA塩基のホモポリマー反復配列を含み、ヒトBRD4遺伝子に局在し、chr19:15366000から始まる第22のマーカーと、からなる群の少なくとも2つのマーカーを増幅するためのプライマー対およびプローブを含むことを特徴とするヒト生物学的サンプルのマイクロサテライト不安定性を分析するためのキット。
【0025】
本発明の好ましい態様において、前記キットは、前記バイオマーカーの中の少なくとも２個、又は３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個のバイオマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数、または前記全てのマーカーのホモポリマー反復配列の塩基数を増幅するためのプライマー対およびプローブを含む。
【0026】
本発明の好ましい実施形態において、前記プローブが分子ビーコンプローブである。
【0027】
さらに好ましくは、前記プライマー対は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーからなり、前記制限プライマーが前記分子ビーコンプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記分子ビーコンプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多い。
【0028】
さらに好ましくは、制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3～1:20である。
【0029】
本発明の好ましい実施形態において、前記プローブはLight off/Light onプローブ対である。
【0030】
さらに好ましくは、前記プライマー対は、それぞれの前記ホモポリマー反復配列に対応して、制限プライマー及び過剰プライマーからなり、前記制限プライマーが前記Light off/Light onプローブと同じ方向を有し、過剰プライマーから生成した一本鎖鋳型が、前記Light off/Light onプローブと相補的に対合し、且つ過剰プライマーの量が制限プライマーの量よりも多い。
【0031】
さらに好ましくは、前記制限プライマーと過剰プライマーとの比は1:3 ～ 1:20である。
【0032】
本発明の好ましい態様においては、前記プライマー対による増幅のサイクル数は40 ～ 70サイクルである。
【0033】
本発明の好ましい態様において、前記プライマー対による増幅は、高忠実度DNAポリメラーゼを用いる。
【発明の効果】
【0034】
本発明の有利な効果は以下のとおりである。
1、本発明によるヒトのMSIに対する検出は、検出精度が高く、検出プラットフォームの汎用性が高く、検出コストが安価である。
2、本発明により検出されるホモポリマー反復長は7 ～ 14bpの範囲に集中し、マーカーはヒトのMSI状態を検出することができる。
3、本発明は、蛍光PCRプラットフォームを用いて検出を行うことができ、機器価格は、第1世代遺伝子シーケンシングまたは第2世代遺伝子シーケンシングと比較して、百万から約15万に低減される。
4、本発明に係る検出プラットフォームは、機器と試薬との結合を低減し、試薬キット検出の汎用性を高め、検出の判定がソフトウェアアルゴリズムを必要とせず、融解ピークの「有/無」に基づいて直接的に判断し、肉眼による判定を迅速に行うことができる。
5、本発明のキットは、一台の蛍光PCR装置により、2時間程度で24 ～ 48個のサンプルの検出を完了することができ、スループットが適切で、検出時間が速い。
6、本発明は融解曲線を用いて検出を行い、検出時に蛍光標識されたプローブを用い、プローブと変異型配列が一致し、突然変異型配列はNGSにより検証されて決定され、突然変異型配列が1bpの反復塩基変化であるが、2bpの塩基変化も可能である。
1、本発明によるヒトのMSIに対する検出は、検出精度が高く、検出プラットフォームの汎用性が高く、検出コストが安価である。
2、本発明により検出されるホモポリマー反復長は7 ～ 14bpの範囲に集中し、マーカーはヒトのMSI状態を検出することができる。
3、本発明は、蛍光PCRプラットフォームを用いて検出を行うことができ、機器価格は、第1世代遺伝子シーケンシングまたは第2世代遺伝子シーケンシングと比較して、百万から約15万に低減される。
4、本発明に係る検出プラットフォームは、機器と試薬との結合を低減し、試薬キット検出の汎用性を高め、検出の判定がソフトウェアアルゴリズムを必要とせず、融解ピークの「有/無」に基づいて直接的に判断し、肉眼による判定を迅速に行うことができる。
5、本発明のキットは、一台の蛍光PCR装置により、2時間程度で24 ～ 48個のサンプルの検出を完了することができ、スループットが適切で、検出時間が速い。
6、本発明は融解曲線を用いて検出を行い、検出時に蛍光標識されたプローブを用い、プローブと変異型配列が一致し、突然変異型配列はNGSにより検証されて決定され、突然変異型配列が1bpの反復塩基変化であるが、2bpの塩基変化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】本発明の実施例1におけるMSI検出に関連するサイトの供給源およびスクリーニングプロセスである。
【図2】本発明の実施例1におけるMSS (negative)およびMSI (positive)サンプルのマーカーでの突然変異の分布である。
【図3】本発明の実施例2における分子ビーコンプローブ及びLight-off/Light-onプローブの異なるサンプル検出における線形図である。
【図4】本発明の実施例4におけるマーカー検出臨床サンプル融解曲線の線形図である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【0037】
＜実施例1＞
本発明のバイオマーカー群は、ヒトWGS、WES等のシークエンシングデータに由来し、図1の方案に従いMSマーカーの選択を行う。
本発明のバイオマーカー群は、ヒトWGS、WES等のシークエンシングデータに由来し、図1の方案に従いMSマーカーの選択を行う。
【0038】
MSI陰性と陽性サンプルのMSマーカーのタンデム反復配列の長さの差に基づいて、MSマーカーを分析する。参照配列としてNCBI、Ensembl、UCSC等のヒトゲノムデータベースにしたがって、NGSシークエンシングデータのMSマーカーの長さの変化を分析する。ヒト結腸直腸癌サンプルWGS、WESのNGSシークエンシングデータを収集し、個々のMSマーカーの検出長を決定し、MSマーカーにおける参照配列と検出配列の反復長の変化を比較することによって、結腸直腸癌患者における各組織サンプルの変化を決定する。そのうち、MSIサンプルのMSマーカーの長さが変化し、長さが減少または増加した突然変異の存在度がより高いはずである。MSSサンプルのMSマーカーは、参照配列の反復長と一致するはずである。
【0039】
トレーニングセットおよびテストセットを確立することによって、異なるグループ化されたサンプルにおける選択サイトの感度および特異性を検証し、SPASSソフトウェアを使用してMSマーカーの感度および特異性データに関して、各MSマーカーのAUCを計算する。AUCが1.0に近いほど、マーカーがMSIサンプルおよびMSSサンプルを区別する能力が高いことを示す。選択したマーカーを下記表1に示す：
表1：シークエンシングデータの分析後に選択したMSマーカー情報
表1：シークエンシングデータの分析後に選択したMSマーカー情報
【0040】
「ゴールドスタンダード」であるPCR-キャピラリー電気泳動法を用いて臨床サンプルを検出し、各サンプルのMSI状態をNGSサイトのスクリーニングの標準結果として決定する。シークエンシングデータの分析後に選択したマーカーについてoligoを設計し、ゴールドスタンダードによりMSI状態を決定する臨床サンプルをそれぞれライブラリー化し、NGSシークエンシングを行い、バイオアッセイにより各マーカーにおけるMSI及びMSSサンプルの半復長を決定し、NCBI、Ensembl、UCSCなどのヒトゲノムデータベースを標準参照配列として用いて、各マーカーのMSIサンプルにおける検出感度を分析し、各マーカーのMSSサンプルにおける検出特異性を分析する。マーカーの突然変異型配列の陰陽性を解析してプロットした結果を図2に示す。SPASS等のソフトウェアを用いて、各マーカーのMSIおよびMSSサンプルにおける検出結果を分析し、より多くのマーカーがMSIおよびMSSサンプルを効果的に区別することができる。各マーカーのMSSおよびMSIサンプルの検出のAUC情報を、以下の表2に示す。
表2： NGSでスクリーニングされたマーカーのMSIおよびMSSサンプルを区別するAUC情報
表2： NGSでスクリーニングされたマーカーのMSIおよびMSSサンプルを区別するAUC情報
【0041】
分析した結果、検証される22個のマーカーについてMSS及びMSIサンプルをそれぞれ検出する場合、優れた識別度を有し、AUC値がいずれも0.95より大きく、陰陽性サンプルを特異的に識別できる。
【0042】
＜実施例2＞
本実施例は、実施例1で得られた各MSマーカーを蛍光PCR融解曲線法により検出し、融解曲線検出の際に、蛍光プローブを用いて分析を行う。検出マーカーの配列を下線付き配列で示し、各マーカーの配列は以下の通りである。
1.EIF4E3(chr3：71739332，SEQ ID NO.01)：
2.UBAC2(chr13：99890849，SEQ ID NO.02)
3.TAOK3(chr12：118675984，SEQ ID NO.03)
4.IFT140(chr16：1612145，SEQ ID NO.04)
5.PRR5-ARHGAP8(chr22：45205158，SEQ ID NO.05)
6.AVIL(chr12：58202496，SEQ ID NO.06)
7.ACVR2A(chr2：148683685，SEQ ID NO.07)
8.PPP1CC(chr12：111160513，SEQ ID NO.08)
9.RBM14-RBM4(chr11：66410771，SEQ ID NO.09)
10.SDHC(chr1：161309335，SEQ ID NO.10)
11.PUM2(chr2：20526998，SEQ ID NO.11)
12.DEC1(chr9：118164375，SEQ ID NO.12)
13.COL11A1(chr11：103468855，SEQ ID NO.13)
14.YTHDF3(chr8：64081981，SEQ ID NO.14)
15.ACTL6A(chr3：179291295，SEQ ID NO.15)
16.MCM3AP(chr21：47703455，SEQ ID NO.16)
17.SPDL1(chr5：169020337，SEQ ID NO.17)
18.SMARCA2(chr9：2083325，SEQ ID NO.18)
19.PROSER1(chr13：39608335，SEQ ID NO.19)
20.MZB1(chr5：138723143，SEQ ID NO.20)
21.ANKIB1(chr7：92020452，SEQ ID NO.21)
22.BRD4(chr19：15366000，SEQ ID NO.22)
本実施例は、実施例1で得られた各MSマーカーを蛍光PCR融解曲線法により検出し、融解曲線検出の際に、蛍光プローブを用いて分析を行う。検出マーカーの配列を下線付き配列で示し、各マーカーの配列は以下の通りである。
1.EIF4E3(chr3：71739332，SEQ ID NO.01)：
【0043】
NGSによりスクリーニングされた上記のマーカーに対して、上下流プライマーを設計し、プライマーは目的のマーカー配列を増幅し、適切なアンプリコン長とすべきである。増幅の際に、一方のプライマーが充分に増幅された一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとハイブリダイゼーション対合させるように、上下流プライマーの量を調整する。そのうち、用量の少ない方のプライマーを「制限プライマー」とし、多い方のプライマーを「過剰プライマー」とし、プローブは制限プライマーと同じ方向になる。マーカープライマーの設計配列は以下の表3に示す。
表3：マーカープライマーの情報
表3：マーカープライマーの情報
【0044】
実施例1でNGSによりスクリーニングしたマーカーに対して、検出用プローブを設計し、プローブは上流下流プライマーの間に位置し、Tm値が30 ～ 55℃の範囲となるように変異型配列を設計する。プローブは、3'→5'によるプルーフリーディング活性の分解を避けるために、5'末端でチオ修飾を用いて保護することができ、また、プローブは、5'→3'重合活性での伸長を避けるために、3'においてクエンチ基又はブロッキング基を用いて修飾される必要がある。設計されたプローブは分子ビーコンプローブであっても、Light-off/Light-onプローブであってもよく、過剰量のプライマーが産生する一本鎖オリゴヌクレオチドはプローブと相補的に対合することができる。プローブは、FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、又はCY5等の修飾を含むフルオロフォア、BHQ1、BHQ2、及びBHQ3等の修飾を含む消光基、並びにアミノ基修飾、ジデオキシ基修飾、又はC3/C6Spacer等の修飾を含むブロッキング基により修飾される必要がある。マーカープローブの設計配列を以下の表4に示す：
表4：マーカープローブの情報
表4：マーカープローブの情報
【0045】
制限プライマー、過剰プライマーおよびプローブを用いて検出反応液を調製し、MSマーカーを増幅する。検出は蛍光PCR装置を用いて行い、プライマーTm値に基づきアニーリング温度を設計し、増幅サイクル数を60個とし、融解曲線の収集温度範囲を30 ～ 55℃の範囲に設定する。増幅終了後、プローブと一本鎖オリゴヌクレオチド鋳型の融解曲線を収集し、温度と蛍光値に対して負の導関数を求め、融解ピークプロファイルを得て結果を判読した。融解曲線の検出線は図3に示すとおりであり、分子ビーコンプローブのピークは上向きであり、サンプルが純粋な変異型鋳型である場合に、Tmの高い位置に融解ピークがあり、サンプルが純粋な野生型鋳型である場合に、Tm値の低い位置に融解ピークがあり、サンプルに変異型と野生型鋳型が同時に存在する場合に、Tm値の高い位置及び低い位置のいずれにも融解ピークがある。Light-off/Light-onプローブを用いる場合に、融解ピークは下向きであり、サンプルが純粋な変異型鋳型の場合にTmの高い位置に融解ピークがあり、サンプルが純粋な野生型鋳型の場合にTm値の低い位置に融解ピークがあり、サンプルに変異型と野生型鋳型が同時に存在する場合にTm値が高い位置と低い位置のいずれにも、融解ピークがある。
【0046】
＜実施例3＞
本発明に係るキットは、実施例2におけるバイオマーカーからなるMSI検出キットであり、マーカーの選択を行う前に、MSI陰性、陽性サンプルにおける各マーカーの感度と特異性を分析する必要がある。各MSマーカーは、分子ビーコンプローブまたはLight-off/Light-onプローブを用いてMSIおよびMSSサンプルを検出し、検出完了後、MSIサンプルにおける各マーカーの検出感度、及びMSSサンプルにおける検出特異性をまとめて統計し、個々のMSマーカーの検出感度、特異性を以下の表に示す：
表5：マーカーのMSI検出感度および特異性
本発明に係るキットは、実施例2におけるバイオマーカーからなるMSI検出キットであり、マーカーの選択を行う前に、MSI陰性、陽性サンプルにおける各マーカーの感度と特異性を分析する必要がある。各MSマーカーは、分子ビーコンプローブまたはLight-off/Light-onプローブを用いてMSIおよびMSSサンプルを検出し、検出完了後、MSIサンプルにおける各マーカーの検出感度、及びMSSサンプルにおける検出特異性をまとめて統計し、個々のMSマーカーの検出感度、特異性を以下の表に示す：
表5：マーカーのMSI検出感度および特異性
【0047】
検出結果から分かるように、実施例2の各マーカーがMSI及びMSSサンプルの両方を検出する場合に、高い検出性能を有するが、マーカーを組み合わせることにより、キットの検出性能を更に保証する必要がある。マーカーは、MSSサンプルを検出する場合、いずれも100%の特異性を保証し、非特異的に検出されたサンプルが発見されなかった。異なるマーカーにおいて、MSIサンプルの検出感度の差があり、感度が89.02 ～ 96.34%の範囲にあり、キットとして使用する場合に異なるマーカーを組み合わせる必要がある。
【0048】
＜実施例4＞
MSI検出キットを、実施例2の異なるマーカーの組み合わせにより形成する。キットを構成する際に、合理的なMSマーカーの量とすべきであり、キットが過剰にMSマーカーを使用すると、キットの製造コストが高くなりすぎ、検出時にサンプルDNAを無駄にし、検出の作業量が増加し、検出のスループットが低下する。キットに使用されるMSマーカーが少なすぎると、検出漏れ、偽陽性などのリスクがあり、キット検出性能が低下するおそれがある。各MSマーカーについて、検出結果の一致性分析を行い、異なるMSマーカーの検出結果に重複、検出漏れ等の表現があるか否かを確認する。
MSI検出キットを、実施例2の異なるマーカーの組み合わせにより形成する。キットを構成する際に、合理的なMSマーカーの量とすべきであり、キットが過剰にMSマーカーを使用すると、キットの製造コストが高くなりすぎ、検出時にサンプルDNAを無駄にし、検出の作業量が増加し、検出のスループットが低下する。キットに使用されるMSマーカーが少なすぎると、検出漏れ、偽陽性などのリスクがあり、キット検出性能が低下するおそれがある。各MSマーカーについて、検出結果の一致性分析を行い、異なるMSマーカーの検出結果に重複、検出漏れ等の表現があるか否かを確認する。
【0049】
マーカーを組み合わせることにより、それぞれ、４組みの２つのマーカーからなる組合せ、3組みの4つのマーカーからなる組合せ、2組みの8つのマーカーからなる組合せ、及び1組みの10つのマーカーからなる組合せを含む。マーカーのランダム選択により、2つのマーカーを組合せ、４組みの2つのマーカーからなる組合せが作製され、マーカーのランダム選択により、4つのマーカーを組み合わせ、３組みの４つのマーカーからなる組み合わせが作製され、マーカーのランダム選択により、8つのマーカーを組合せ、２組みの8つのマーカーからなる組合せが作製され、マーカーのランダム選択により、10つのマーカーを組み合わせ、１組みの10つのマーカーからなる組み合わせが作製され、具体的な組み合わせ情報は下表に示す。
表6：マーカーの組み合わせのMSI検出感度および特異性
表6：マーカーの組み合わせのMSI検出感度および特異性
【0050】
MSIマーカーを選択した後、マーカーの反応管を合併し、異なるマーカーを同一の反応管で検出する。単管反応液に内部制御遺伝子を加えることができ、内部制御遺伝子は、サンプル品質、検出試薬、および検出過程を制御し、キットの安定性、信頼性を向上させることができる。
【0051】
表6の10グループの組み合わせとゴールドスタンダードの「PCR-キャピラリー電気泳動」の一致性を比較する。臨床サンプルをブラインド処理し、表6の10グループの組み合わせと「PCR-キャピラリー電気泳動法」キットをそれぞれ用いて、同じ臨床サンプルを別々に検出し、検査結果を判読する際、アルゴリズム、図形解析ソフトウェア等の追加を必要とせず、人工で直接、迅速に判読を完了することができる。検出が完了した後、ゴールドスタンダードアッセイと比較し、2種類の試薬の検出一致性を分析し、臨床サンプルの検出線形の例を図4に示す。本発明のキット及びゴールドスタンダード試験キットの試験結果について一致性を分析し、感度、特異性、陽性予測子、陰性予測子、総適合率及びKappa値をまとめ、臨床サンプル試験の一致性を表7 ～ 16に示す。
表７： ゴールドスタンダードとグループ1の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表８：ゴールドスタンダードとグループ2の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 99.39%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 99.53%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表９：ゴールドスタンダードとグループ3の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表10：ゴールドスタンダードとグループ4の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表11：ゴールドスタンダードとグループ5の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表12：ゴールドスタンダードとグループ6の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキット特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表13：ゴールドスタンダードとグループ7の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表14：ゴールドスタンダードとグループ8の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表15：ゴールドスタンダードとグループ9の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキット特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表16：ゴールドスタンダードとグループ10の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの感度= 100%
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表７： ゴールドスタンダードとグループ1の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表８：ゴールドスタンダードとグループ2の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 99.53%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表９：ゴールドスタンダードとグループ3の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表10：ゴールドスタンダードとグループ4の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表11：ゴールドスタンダードとグループ5の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表12：ゴールドスタンダードとグループ6の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキット特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表13：ゴールドスタンダードとグループ7の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表14：ゴールドスタンダードとグループ8の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表15：ゴールドスタンダードとグループ9の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキット特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
表16：ゴールドスタンダードとグループ10の組み合わせとの一致性の比較
本発明のキットの特異度= 100%
陽性予測値= 100%
陰性予測値= 100%
総適合率= 100%
Kappa = 1.0
【0052】
検出の結果から分かるように、実施例2のバイオマーカーを取った場合、異なるランダムな組み合わせを行っても検出性能が優れ、ランダムな両組み合わせでも検出特異性100%を維持でき、かつ感度が99%より高く、検出性能が非常に優れている。
【0053】
以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、従って、本発明の実施範囲をこれらによって限定することはできず、即ち、本発明の特許請求の範囲及び明細書の内容に基づく等価な変更及び修飾は、いずれも本発明の包括的な範囲内に属する。
【産業上の利用可能性】
【0054】
本発明は、ヒトマイクロサテライトの不安定性を検出するためのバイオマーカー群及びその応用を開示するものであり、バイオマーカー群が第1～第22マーカーの少なくとも2つを含む。本発明によるヒトのMSIに対する検出は、精度が高く、検出プラットフォームの汎用性が高く、検出コストが安価であり、産業上の利用可能性を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】