特表 2024-504211 細胞培養物を評価するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-30

(54)【発明の名称】細胞培養物を評価するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20240123BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 21/01 20060101ALI20240123BHJP

   G01N 21/59 20060101ALI20240123BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B21/36

G01N21/01 D

G01N21/59 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565126

(86)(22)【出願日】2022-01-05

(85)【翻訳文提出日】2023-08-02

(86)【国際出願番号】 US2022011267

(87)【国際公開番号】W WO2022150351

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】63/205,757

(32)【優先日】2021-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509031062

【氏名又は名称】エマウス メディカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】オリバ ビラナ， ジョアン

(72)【発明者】

【氏名】落合 潤

【テーマコード（参考）】

2G059

2H052

【Ｆターム（参考）】

2G059AA03

2G059AA05

2G059BB12

2G059EE01

2G059FF04

2G059GG02

2G059HH02

2G059JJ11

2G059KK01

2G059MM01

2G059PP06

2H052AC33

2H052AD02

2H052AD16

2H052AD29

2H052AD33

2H052AD37

2H052AF02

2H052AF14

(57)【要約】

生物学的細胞培養物を評価するための装置が、本明細書において説明される。装置は、筐体と、データバスによって筐体に結合されたコントローラとを備えている。筐体は、光を発生させるための光源と、光源によって発生させられた光をコリメートするためのコリメータと、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿を直交方向に作動させるための線形ステージと、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通してコリメートされた光を受け取るための光検出器とを備えている。コントローラは、光源、線形ステージ、および光検出器を動作させるための命令をデータバスによって提供するように構成される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的細胞培養物を評価するための装置であって、前記装置は、
筐体であって、前記筐体は、
光を発生させるための光源であって、前記光源は、前記筐体の上部に配置されている、光源と、
光検出器であって、前記光検出器は、前記筐体上の基部に配置されている、光検出器と、
前記光をコリメートするためのコリメータであって、前記コリメータは、前記光源の下方に配置され、前記光検出器は、前記コリメートされた光を受け取るためである、コリメータと、
生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿を直交方向に作動させるための線形ステージと
を備え、
前記線形ステージは、前記光源と前記光検出器との間に配置され、前記細胞培養皿を固定するための表面を提供する、筐体と、
データバスによって前記筐体に結合されたコントローラと
を備え、
前記コントローラは、前記光源、前記線形ステージ、および前記光検出器を動作させるための命令を前記データバスによって提供するように構成されている、装置。

【請求項2】

前記筐体は、
前記筐体の前記基部から垂直に延びているロッドと、
前記ロッドに機械的に結合された第１のブリッジであって、前記第１のブリッジは、前記筐体の前記上部に配置され、前記光源を含む第１のブリッジと、
前記ロッドに機械的に結合された第２のブリッジと
をさらに備え、
前記第２のブリッジは、前記第１のブリッジと前記コリメータとの間に配置され、前記光源の見通し線に対して整列させられた開口を含む、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記コリメータは、少なくとも１つのレンズを備え、前記レンズは、アームおよびアーム関節部を経由して、ロッドに機械的に結合されている、請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記レンズは、２５．４ｍｍのレンズ直径および２５．４ｍｍの焦点距離を有する、請求項３に記載の装置。

【請求項5】

前記レンズは、前記アームに結合されたブラケット内に収容されている、請求項３に記載装置。

【請求項6】

前記線形ステージは、サンプルステージと、Ｘステージと、Ｙステージとを備え、前記サンプルステージは、前記細胞培養皿を固定するための前記表面を提供し、前記Ｘステージは、前記線形ステージを第１の方向に作動させ、前記Ｙステージは、前記線形ステージを前記第１の方向に直交する第２の方向に作動させる、請求項１に記載の装置。

【請求項7】

前記Ｘステージおよび前記Ｙステージは、前記Ｘステージおよび前記Ｙステージにそれらのそれぞれの方向に移動させるタイミングベルトに結合されたステッピングモータを含む、請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記サンプルステージ、前記Ｘステージ、前記Ｙステージの各々は、前記コリメートされた光が通過することを可能にする開口部を含む、請求項６に記載の装置。

【請求項9】

前記コントローラは、少なくとも２つのモータ駆動モジュールに結合されたコンピューティングユニットを備えている、請求項６に記載の装置。

【請求項10】

前記少なくとも２つのモータ駆動モジュールは、前記Ｘステージおよび前記Ｙステージの前記ステッピングモータを作動させるための信号を発生させる、請求項９に記載の装置。

【請求項11】

前記コンピューティングユニットは、前記データバスによって前記光検出器からアナログ信号を受信し、前記アナログ信号をデジタル化する、請求項９に記載の装置。

【請求項12】

前記コンピューティングユニットは、前記光検出器をオンまたはオフにするためのデジタル信号を発生させる、請求項９に記載の装置。

【請求項13】

前記光源によって発生させられる前記光は、４５０～４７５ｎｍにおける鋭いピークと、５６０～６０ｎｍにおける平坦なピークとを備えている、請求項１に記載の装置。

【請求項14】

前記データバスは、有線データ接続である、請求項１に記載の装置。

【請求項15】

前記有線データ接続は、イーサネット（登録商標）、シリアル、または汎用インターフェースバスベースのデータ接続のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の装置。

【請求項16】

前記データバスは、無線データ接続である、請求項１に記載の装置。

【請求項17】

前記無線データ接続は、セルラー、Ｗｉ－Ｆｉ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、または近距離無線通信ベースのデータ接続のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の装置。

【請求項18】

請求項１に記載の装置を動作させる方法であって、前記方法は、
前記コントローラによって、前記細胞培養皿の第１の所定の場所に対応する第１の場所まで、前記線形ステージを作動させることと、
前記コリメータを通した前記光源によって、前記第１の場所における前記細胞培養皿および前記生物学的細胞培養物を通過するためのコリメートされた光を発生させることと、
前記光検出器によって、前記細胞培養皿および前記生物学的細胞培養物を通過した前記コリメートされた光を受け取ることと、
前記コントローラによって、前記第１の場所における前記コリメートされた光の強度を決定することと
を含む、方法。

【請求項19】

前記方法は、
前記コントローラによって、前記細胞培養皿の第２の所定の場所に対応する第２の場所まで、前記線形ステージを作動させることと、
前記コリメータを通した前記光源によって、前記第２の場所における前記細胞培養皿および前記生物学的細胞培養物を通過するためのコリメートされた光を発生させることと、
前記光検出器によって、前記細胞培養皿および前記生物学的細胞培養物を通過した前記コリメートされた光を受け取ることと、
前記コントローラによって、前記第２の場所における前記コリメートされた光の強度を決定することと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第１の場所における前記コリメートされた光の前記強度および前記第２の場所における前記コリメートされた光の前記強度は、
前記生物学的細胞培養物の厚さと、
前記生物学的細胞培養物を採集するための前記生物学的細胞培養物の成熟度と、
前記生物学的細胞培養物の１枚以上の細胞シート内に存在する細胞の数と、
生物学的細胞培養物の透明度と
を決定するために使用される、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる２０２１年１月６日に出願された米国仮特許出願第６３／２０５，７５７号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）（米国特許法第１１９条（ｅ））下の優先権を主張する。

【0002】

（技術分野）
本発明は、概して、生物学的物質を評価することに関する。より具体的に、本発明は、生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞シート技術は、損傷した器官または組織を治癒するための再生医療において、関心を集めている。細胞シートは、単層または多層であることができる。再生医療では、実験室内増殖幹細胞のシートが、損傷した器官または組織の上に移植され得、それによって、移植された幹細胞は、下層の器官または組織の細胞として再生されることができる。そのような技法は、例えば、皮膚移植術において成功裏に使用されている。別の例として、角膜細胞等の透明な細胞培養物のシートが、増殖させられ、損傷した眼の上に移植されることができる。加えて、ドナーの角膜透過率が、移植前、精密に測定されることができる。そのような幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるための従来の方法のもと、羊膜、フィブリンゲル、ヒアルロン酸ヒドロゲル、コラーゲン等の種々の足場が、薄い幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるために使用される。幹細胞または角膜細胞シートは、次いで、採集され、他の幹細胞または角膜細胞シートの上に積み重ねられ、多層化された幹細胞または角膜細胞シートを形成し、それは、次いで、再生のために、損傷した器官または組織の上に移植されることができる。これらの従来の方法は、多くの欠点を有し得る。例えば、新しく増殖させられた幹細胞または角膜細胞シートは、機械的に取り除かれ、または細胞培養皿から分離され、次いで、別の幹細胞または角膜細胞シートの上に設置される必要がある。幹細胞または角膜細胞シートが、取り除かれる力に耐えるために、幹細胞または角膜細胞シートは、胞培養皿から持ち上げられたとき、幹細胞または角膜細胞シートがシート構造を保持するために十分に強い物理的完全性を保有するように、十分に長い間、増殖させられなければならない。幹細胞または角膜細胞シートが、早期に採集された場合、幹細胞または角膜細胞は、裂け得、交換用の幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるプロセスが、繰り返される必要がある。したがって、多層化された幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるプロセスは、面倒であり、時間を消費し、複雑であり、かつ費用がかかり得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、透明度、および細胞シート内の細胞の数を決定するための装置が、本明細書において説明される。装置は、筐体と、データバスによって筐体に結合されたコントローラとを備えていることができる。筐体は、光を発生させるための光源と、光源によって発生させられた光をコリメートするためのコリメータと、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿を直交方向に作動させるための線形ステージと、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通してコリメートされた光を受け取るための光検出器とを備えていることができる。光源は、筐体の上部に配置されることができる。コリメータは、光源の下方に配置されることができる。線形ステージは、コリメータの下方に配置されることができ、細胞培養皿を固定するための表面を提供することができる。光検出器は、線形ステージの下方に、かつ筐体上の基部に配置されることができる。コントローラは、光源、線形ステージ、および光検出器を動作させるための命令をデータバスによって提供するように構成されることができる。

【0005】

いくつかの実施形態において、筐体は、筐体の基部から垂直に延びているロッドと、ロッドに機械的に結合された第１のブリッジと、ロッドに機械的に結合された第２のブリッジとをさらに備えていることができる。第１のブリッジは、筐体の上部に配置されることができ、光源を含むことができる。第２のブリッジは、第１のブリッジとコリメータとの間に配置されることができ、光源の見通し線に対して整列させられた開口を含むことができる。

【0006】

いくつかの実施形態において、コリメータは、少なくとも１つのレンズを備えていることができる。レンズは、アームおよびアーム関節部を経由して、ロッドに機械的に結合されることができる。

【0007】

いくつかの実施形態において、レンズは、２５．４ｍｍのレンズ直径および２５．４ｍｍの焦点距離を有することができる。

【0008】

いくつかの実施形態において、レンズは、アームに結合されたブラケット内に収容されることができる。

【0009】

いくつかの実施形態において、線形ステージは、サンプルステージと、Ｘステージと、Ｙステージとを備えていることができる。サンプルステージは、細胞培養皿を固定するための表面を提供することができる。Ｘステージは、線形ステージを第１の方向に作動させることができる。Ｙステージは、線形ステージを第１の方向に直交する第２の方向に作動させることができる。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＸステージおよびＹステージは、ＸステージおよびＹステージをそれらのそれぞれの方向に移動させるタイミングベルトに結合されたステッピングモータを含むことができる。

【0011】

いくつかの実施形態において、サンプルステージ、Ｘステージ、Ｙステージの各々は、コリメートされた光が通過することを可能にする開口部を含むことができる。

【0012】

いくつかの実施形態において、コントローラは、少なくとも２つのモータ駆動モジュールに結合されたコンピューティングユニットを備えていることができる。

【0013】

いくつかの実施形態において、少なくとも２つのモータ駆動モジュールは、ＸステージおよびＹステージのステッピングモータを作動させるための信号を発生させることができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、コンピューティングユニットは、データバスによって光検出器からアナログ信号を受信し、アナログ信号をデジタル化することができる。

【0015】

いくつかの実施形態において、コンピューティングユニットは、光検出器をオンまたはオフにするためのデジタル信号を発生させることができる。

【0016】

いくつかの実施形態において、光源によって発生させられる光は、４５０～４７５ｎｍにおける鋭いピークと、５６０～６０ｎｍにおける平坦なピークとを備えていることができる。

【0017】

いくつかの実施形態において、データバスは、有線データ接続であることができる。

【0018】

いくつかの実施形態において、有線データ接続は、イーサネット（登録商標）、シリアル、または汎用インターフェースバスベースのデータ接続のうちの少なくとも１つであることができる。

【0019】

いくつかの実施形態において、データバスは、無線データ接続であることができる。

【0020】

いくつかの実施形態において、無線データ接続は、セルラー、Ｗｉ－Ｆｉ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、または近距離無線通信ベースのデータ接続のうちの少なくとも１つであることができる。

【0021】

装置を動作させる方法が、本明細書において説明される。コントローラは、細胞培養皿の第１の所定の場所に対応する第１の場所まで、線形ステージを作動させることができる。コリメータを通した光源は、第１の場所における細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過するためのコリメートされた光を発生させることができる。光検出器は、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過したコリメートされた光を受け取ることができる。コントローラは、第１の場所におけるコリメートされた光の強度を決定することができる。

【0022】

いくつかの実施形態において、コリメートされた光の強度は、少なくとも１０回の強度測定の平均であることができる。

【0023】

いくつかの実施形態において、コントローラは、細胞培養皿の第２の所定の場所に対応する第２の場所まで、線形ステージを作動させることができる。コリメータを通した光源は、第２の場所における細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過するためのコリメートされた光を発生させることができる。光検出器は、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過したコリメートされた光を受け取ることができる。コントローラは、第２の場所におけるコリメートされた光の強度を決定することができる。

【0024】

本明細書に開示される、装置、システム、方法、および非一過性コンピュータ読み取り可能な媒体のこれらの特徴および他の特徴、および動作の方法、および構造の関連する要素の機能、および部品の組み合わせ、および製造の経済性が、付随の図面を参照して、以下の説明および添付の請求項の検討に応じて、より明白になり、これらの全てが、本明細書の一部を形成し、同様の参照番号は、種々の図において、対応する部品を指定する。しかしながら、図面は、例証および説明のみの目的のためにあり、本発明の限界の定義として意図されないことが、明示的に理解されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【0025】

本技術の種々の実施形態のある特徴が、添付の請求項において、特定性を伴って記述される。本技術の特徴および利点のより深い理解が、本発明の原理が利用される例証的実施形態を記述する以下の詳細な説明を参照することによって取得され、付随の図面は、以下の通りである。

【0026】

【図1A】図１Ａ－１Ｄは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置を図示する。

【図1B】図１Ａ－１Ｄは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置を図示する。

【図1C】図１Ａ－１Ｄは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置を図示する。

【図1D】図１Ａ－１Ｄは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置を図示する。

【0027】

【図2】図２は、本開示の種々の実施形態によるコントローラの電気的概略図を図示する。

【0028】

【図3A】図３Ａは、本開示の種々の実施形態による光強度を測定するためにコントローラの上にロードされ得る構成設定の視覚的表現を図示する。

【0029】

【図3B】図３Ｂは、本開示の種々の実施形態による装置を動作させる方法を図示する。

【0030】

【図3C】図３Ｃは、本開示の種々の実施形態による装置を使用して、生物学的細胞培養物の透過率を決定する方法を図示する。

【0031】

【図4A】図４Ａは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の透過率（光強度）と厚さまたは採集時間（成熟度とも命名される）との関係を示す図を図示する。

【0032】

【図4B】図４Ｂ－４Ｃは、本開示の種々の実施形態による多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の透過率と、生物学的細胞培養物が実験室環境内で増殖させられた日数との間の関係を描写するグラフを図示する。

【図4C】図４Ｂ－４Ｃは、本開示の種々の実施形態による多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の透過率と、生物学的細胞培養物が実験室環境内で増殖させられた日数との間の関係を描写するグラフを図示する。

【0033】

【図4D】図４Ｄは、本開示の種々の実施形態による多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度を決定する方法を図示する。

【0034】

【図4E】図４Ｅは、本開示の種々の実施形態による細胞シート内の細胞の数を決定するために使用され得る基準グラフを図示する。

【発明を実施するための形態】

【0035】

図は、例証のみの目的のために、開示される技術の種々の実施形態を描写し、図は、同様の要素を識別するために、同様の参照番号を使用する。当業者は、以下の議論から、図に図示される構造および方法の代替実施形態が、本明細書に説明される開示される技術の原理から逸脱することなく、採用され得ることを容易に認識するであろう。

【0036】

再生医療では、実験室内増殖幹細胞のシートが、損傷した器官または組織の上に移植され得、それによって、移植された幹細胞は、下層の器官または組織の細胞として再生することができる。そのような技法は、例えば、皮膚移植術において成功裏に使用されている。別の例として、角膜細胞等の透明な細胞培養物のシートが、増殖させられ、損傷した眼の上に移植されることができる、またはドナーの角膜透過率が、移植前、精密に測定されることができる。そのような幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるための従来の方法のもと、羊膜、フィブリンゲル、ヒアルロン酸ヒドロゲル、コラーゲン等の種々の足場が、薄い幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるために使用される。幹細胞または角膜細胞シートは、次いで、採集され、他の幹細胞シートの上に積み重ねられ、多層化された幹細胞または角膜細胞シートを形成し、それは、次いで、再生のために、損傷した器官または組織の上に移植されることができる。これらの従来の方法は、多くの欠点を有し得る。例えば、新しく増殖させられた幹細胞または角膜細胞シートは、機械的に取り除かれ、または細胞培養皿から分離され、次いで、別の幹細胞または角膜細胞シートの上に設置される必要がある。幹細胞または角膜細胞シートが、取り除かれる力に耐えるために、幹細胞または角膜細胞シートは、細胞培養皿から持ち上げられたとき、幹細胞または角膜細胞シートがシート構造を保持するために十分に強い物理的完全性を保有するように、十分に長い間、増殖させられなければならない。幹細胞または角膜細胞シートが、早期に採集された場合、幹細胞または角膜細胞は、裂け得、交換用の幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるプロセスが、繰り返される必要がある。したがって、多層化された幹細胞または角膜細胞シートを増殖させるプロセスは、面倒であり、時間を消費し、複雑であり、かつ費用がかかり得る。より良好な解決策が、多層化された幹細胞または角膜細胞シートの増殖を監視するためのみならず、細胞シートの採集時間、および細胞シート薬量学の一部である細胞の数を決定するためにも必要とされる。

【0037】

上で説明される問題に対処する発明が、本明細書において説明される。上で説明される従来の方法と異なり、本明細書に説明される発明は、細胞培養皿上で、直接、多層化された幹細胞または角膜細胞シートの増殖を監視し、多層化された幹細胞または角膜細胞シートの採集時間を決定するために使用されることができ、多層化された幹細胞または角膜細胞シートは、損傷した器官または組織の上に、直接、移植されることができる。この方法は、薬量学のために使用されるであろう、非侵襲的アプローチを使用して、細胞シートあたりの細胞の数を決定することも可能にするであろう。このように、幹細胞または角膜細胞シートを１枚ずつ増殖し、幹細胞または角膜細胞シートを層状にする代わりに、多層化された幹細胞または角膜細胞シートが、直接、特定の厚さおよび／または成熟度まで増殖させられ、次いで、採集されることができる。種々の実施形態において、本発明は、多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置を含むことができる。装置は、光源と、コリメータと、線形ステージと、光検出器と、コントローラとを含む筐体を備えていることができる。光源は、１つ以上の周波数において、光を発生させる（または放出する）ように構成されることができる。例えば、いくつかの実施形態において、光源は、赤色、白色、または青色の光に対応する周波数において、光を発生させるように構成されることができる。コリメータは、光源から放出される光を収集し、線形ステージの開口部（例えば、開口）の上にその光を集束させられ得るコリメートされた光（すなわち、平行光線）に変換することができる。生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿は、コリメートされた光が開口部を通して生物学的細胞培養物を通過し得るように、線形ステージの上に固定されることができる。光検出器は、その強度を測定するために、生物学的細胞培養物を通過したコリメートされた光を受け取る（または、検出する）ように構成されることができる。コントローラは、種々の周波数において光を出力するように光源を制御するように構成されることができる。コントローラは、線形ステージを作動させるように構成されることができる。例えば、いくつかの実施形態において、コントローラは、線形ステージをｘおよびｙ方向に作動させるための信号を発生させ得る駆動回路を含むことができる。コントローラは、強度に基づいて、生物学的細胞培養物の透過率を決定するようにさらに構成されることができる。装置は、本明細書内でさらに詳細に議論されるであろう。

【0038】

種々の実施形態において、本発明はさらに、生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するために装置を使用する方法を含むことができる。生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿は、線形ステージ上に設置されることができる。光源から放出されるコリメートされた光は、コリメートされた光が所定の場所において細胞培養物および生物学的細胞培養物を通過し得るように、細胞培養皿のいくつかの所定の場所の上に照らされることができる。所定の場所におけるコリメートされた光の強度が、所定の場所における生物学的細胞培養物の透過率値を決定するために、測定されることができる。これらの透過率値に基づいて、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度が、決定されることができる。本発明のこれらの特徴および他の特徴が、本明細書内でさらに詳細に説明される。

【0039】

図１Ａ－１Ｄは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の厚さ、成熟度、および透明度を決定するための装置１００を図示する。図１Ａは、装置１００の等角図を描写する。図１Ｂは、装置１００の正面図を描写する。図１Ｃは、装置１００の側方図を描写する。図１Ｄは、装置１００の簡略化された正面図を描写する。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、いくつかの実施形態において、装置１００は、データバス１３０を経由してコントローラ１２０に結合された筐体１０２を備えていることができる。筐体１０２およびコントローラ１２０が、図１Ａおよび１Ｂでは、別個のエンティティとして示されるが、いくつかの実施形態において、コントローラ１２０は、筐体１０２の中に統合されるか、または、それの一部であることができる。いくつかの実施形態において、データバス１３０は、有線データ接続であることができる。例えば、データバス１３０は、イーサネット（登録商標）、シリアル、または汎用インターフェースバスベースのデータ接続であることができる。いくつかの実施形態において、データバス１３０は、無線データ接続であることができる。例えば、データバス１３０は、セルラー、Ｗｉ－Ｆｉ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、または近距離無線通信データ接続であることができる。

【0040】

筐体１０２は、光源１０４と、コリメータ１０６と、線形ステージ１０８と、光検出器１１０（図１Ｂおよび１Ｄに示される）とを含むことができる。いくつかの実施形態において、筐体１０２はさらに、筐体１０２を表面の上に据え付けるために使用され得る搭載基部１０２ａを含むことができる。例えば、筐体１０２は、実験室環境内で、搭載基部１０２ａの据え付け孔を通して、固定具またはテーブル上に取り付けられることができる。搭載基部１０２ａは、搭載基部１０２ａの上部から垂直に延びている、光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃを含むことができる。光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃの各々は、コリメータ１０６の１つ以上のレンズを据え付けるために使用され得るコリメータアーム（すなわち、１０２ｄおよび１０２ｅ）を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、コリメータ１０６は、光をコリメートされた光に変換する、少なくとも２つのレンズを備えている、光学系を備えていることができる。この例では、光学系の第１のレンズは、コリメータアーム１０２ｄを通して、筐体１０２に固定されることができ、光学系の第２のレンズは、コリメータアーム１０２ｅを通して、筐体１０２に固定されることができる。いくつかの実施形態において、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの各々は、コリメータアーム関節部（すなわち、１０２ｆおよび１０２ｇ）を含むことができ、コリメータアーム関節部１０２ｆおよび１０２ｇは、それぞれ、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅを光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃに機械的に結合するために使用され得る。コリメータアーム関節部１０２ｆ、１０２ｇの各々は、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの高さおよび長さを調節するために使用され得る少なくとも２つの開口部を含む。例えば、コリメータアーム関節部１０２ｆの第１の開口部は、光学系支持ロッド１０２ｂに沿ってコリメータアーム１０２ｄの高さを上昇または降下させるために使用されることができる。ある場合、第１の開口部は、コリメータアーム１０２ｄに取り付けられたレンズを光の見通し線の内外に回転移動させるために使用されることができる。コリメータアーム関節部１０２ｆの第２の開口部は、光学系支持ロッド１０２ｂに対して、コリメータアーム１０２ｄを長くまたは短くするために使用されることができる。コリメータアーム関節部１０２ｆが、正しい高さ、回転、および長さにあるように構成されると、コリメータアーム関節部１０２ｆは、第１の開口部および第２の開口部に関連付けられた固定ピンをしっかりと締めることによって、光学系支持ロッド１０２ｂに固定されることができる。コリメータアーム関節部１０２ｇは、同様に、コリメータアーム１０２ｅの高さを上昇または降下させるように、または光学系支持ロッド１０２ｃに対して、コリメータアーム１０２ｅを長くまたは短くするように構成されることができる。このように、コリメータ１０６の光学系は、多数の方法で調節されることができる。例えば、コリメータ１０６の焦点は、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの一方または両方を上昇または降下させることによって調節されることができる。別の例として、コリメータ１０６は、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの一方または両方を長くまたは短くすることによって、見通し線の内外に移動させられることができる。代替として、コリメータ１０６は、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの一方または両方を見通し線から離れるように回転させることによって、見通し線の内外に移動させられることができる。

【0041】

いくつかの実施形態において、筐体１０２は、搭載基部１０２ａに機械的に結合された少なくとも１つの搭載ブリッジ１０２ｈをさらに含むことができる。搭載ブリッジ１０２ｈは、搭載基部１０２ａ、したがって、筐体１０２に対して構造上の剛性を提供することができる。例えば、搭載ブリッジ１０２は、線形ステージ１０８の作動によって引き起こされる、搭載基部１０２ａに対する捩れまたは変形を最小化することができる。ある場合、搭載基部１０２と共に搭載ブリッジ１０２ｈは、線形ステージ１０８を固定するための搭載箇所を提供することができる。例えば、いくつかの実施形態において、搭載ブリッジ１０２ｈおよび搭載基部１０２ａは、線形ステージ１０８を筐体１０２に固定するための貫通孔を有することができる。

【0042】

いくつかの実施形態において、筐体１０２は、光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃに結合された光源搭載ブリッジ１０２ｉをさらに含むことができる。搭載ブリッジ１０２ｈと同様、光源搭載ブリッジ１０２ｉは、線形ステージ１０８が、作動させられているとき、筐体１０２に構造上の剛性を提供することができる。いくつかの実施形態において、光源搭載ブリッジ１０２ｉは、光源１０４を埋め込む（または統合する）ための孔を含むことができる。光源搭載ブリッジ１０２ｉの孔は、図１Ａ－１Ｃでは、中央に位置するように示されるが、いくつかの実施形態において、孔は、光源搭載ブリッジ１０２ｉの他の場所に配置されることができる。例えば、光源１０４は、中心から外れて、光源搭載ブリッジ１０２ｉの中に埋め込まれることができる。多くの変形例が、可能であり、想定される。

【0043】

いくつかの実施形態において、筐体１０２は、光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃに結合された開口ブリッジ１０２ｊ（図１Ｄに示される）をさらに含むことができる。搭載ブリッジ１０２ｈおよび光源搭載ブリッジ１０２ｉと同様、開口ブリッジ１０２ｊは、線形ステージ１０８が、作動させられているとき、筐体１０２に構造上の剛性を提供することができる。いくつかの実施形態において、開口ブリッジ１０２ｊは、光源１０４から放出される光が通過することを可能にし、見通し線を作成する開口（すなわち、開口部）をさらに含むことができる。一般に、開口ブリッジ１０２ｊおよび光源搭載ブリッジ１０２ｉは、開口ブリッジ１０２ｊの開口が、光源搭載ブリッジ１０２ｉの中に埋め込まれる光源１０４の真下にあるように、光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃに沿って配置される。このように、光源から放出される迷光は、コリメータ１０６に到達する前、最小化される。１つの特定の実施形態において、開口ブリッジ１０２ｊは、開口が、光源１０４から５ｍｍの距離にあるように、光学系支持カラム１０２ｂ、１０２ｃに沿って配置される。

【0044】

図１Ａ－１Ｄに示されるような筐体１０２は、開放構造を有するものとして描写されるが、いくつかの実施形態において、筐体１０２は、エンクロージャの中に完全に封入されることができる。そのような実施形態において、エンクロージャの内側は、周囲光が貫通し、光検出器１１０に干渉することができないように、無光沢黒色箔を用いて裏打ちされることができる。例えば、エンクロージャの中に進入する周囲光は、光検出器１１０によって確認される光強度を増加させ得る。内側を無光沢黒色箔を用いて裏打ちすることによって、エンクロージャに進入する周囲光が、減らされ、または完全に排除され、それによって、強度決定の正確度を増加させることができる。いくつかの実施形態において、筐体１０２は、１つ以上のカメラをさらに含むことができる。カメラは、光を制御し、それを線形ステージ１０８上の種々の場所の上に集束させるようにさらに構成されることができる。例えば、カメラは、線形ステージ１０８にフィードバックを提供することができ、それによって、線形ステージ１０８上の種々の場所の上への光の集束が、改良され得る。

【0045】

光源１０４は、１つ以上の周波数において、光を発生させるように構成されることができる。一般に、任意のタイプの光源が、光源１０４として実装されることができ、光源１０４は、交換可能であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ハロゲン光源、蛍光性光源、または白熱性光源が、光源１０４として実装されることができる。他の実施形態において、紫外線光源または赤外線光源が、光源１０４として実装されることができる。多くの変形例が、可能であり、想定される。１つの特定の実施形態において、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源が、光源１０４として実装されることができる。ＬＥＤを使用して光源１０４を実装することは、いくつかの利点を提供することができる。例えば、ＬＥＤ光源は、異なる周波数または波長において、光を発生させるように構成されること、または、プログラミングされることができる。例えば、ＬＥＤ光源は、コントローラ１２０からの制御信号を経由して、例えば、赤色、白色、または青色の光を（すなわち、異なる光の波長において）出力するように命令されることができる。さらに、ＬＥＤ光源は、それが光源搭載ブリッジ１０２ｉの中に容易に埋め込まれることができるように、小さな占有面積を有するように適応されることができる。いくつかの実施形態において、光源１０４は、蛍光体変換白色光を放出するように構成されることができる。蛍光体変換白色光は、青色に関して、４５０～４７５ｎｍにおける鋭いピークを伴い、黄色光に関して、５６０～６０ｎｍにおける平坦なピークを伴う広域スペクトルパワー分布を有することができる。そのような光の特性は、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通した照明を促進することができる。いくつかの実施形態において、光源１０４は、生物学的細胞培養物によって発現される、タンパク質のタイプに基づいて、特定の光の波長を生成するようにさらに適応されることができる。例えば、生物学的細胞培養物が緑色蛍光性タンパク質を発現（または生成）する場合、光源１０４は、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度を決定することに加えて、緑色蛍光性タンパク質の存在を検出し得る光を発生させるように適応されることができる。多くの変形例が、可能であり、想定される。

【0046】

コリメータ１０６は、光をコリメートされた光に変換するように構成されることができる。コリメートされた光（すなわち、平行光線）は、コリメートされた光線が、線形ステージ１０８の開口部を通して、かつ光検出器１１０まで通過することができるように、凝縮（または集束）させられることができる。図１Ａ－１Ｃに示されるように、いくつかの実施形態において、コリメータ１０６は、少なくとも２つのレンズ１０６ａ、１０６ｂを備えている光学系を備えていることができる。レンズ１０６ａ、１０６ｂは、それぞれ、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅに取り付けられることができる。例えば、レンズ１０６ａ、１０６ｂは、ブラケットの中に固定されることができる。ブラケットは、次いで、コリメータアーム１０２ｄ、１０２ｅの上にねじで留められることができる。いくつかの実施形態において、レンズ１０６ａ、１０６ｂは、光が、コリメータ１０６を通過するにつれて、迷光を減らすために、平凸レンズであることができる。一般に、レンズ１０６ａ、１０６ｂは、光をコリメートするために、任意のレンズ直径および焦点距離を有することができる。レンズ１０６ａ、１０６ｂに関する特定のレンズ直径の選択は、例えば、レンズ材料およびレンズの曲率等の種々の因子に依存し得る。１つの特定の実施形態において、レンズ１０６ａ、１０６ｂのうちの少なくとも１つは、２５．４ｍｍのレンズ直径および２５．４ｍｍの焦点距離を有することができる。他の実施形態において、レンズ１０６ａ、１０６ｂは両方とも、２５．４ｍｍのレンズ直径および２５．４ｍｍの焦点距離を有することができる。

【0047】

線形ステージ１０８は、サンプルステージ１０８ａを２つの直交方向に作動させるように構成されることができる。例えば、線形ステージ１０８は、コントローラ１２０によって発生させられる１つ以上の制御信号によって、例えば、サンプルステージ１０８ａをｘ－ｙ平面のｘ軸またはｙ軸に沿って移動させるように命令されることができる。いくつかの実施形態において、線形ステージ１０８は、Ｙステージ１０８ｃに結合されたＸステージ１０８ｂをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、サンプルステージ１０８ａは、細胞培養皿が、サンプルステージ１０８ａの上に精密に設置されることを可能にする構造上のガイドを伴う開口部を含むことができる。このように、異なる生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿は、サンプルステージ１０８ａへの細胞培養皿の整列に影響を及ぼすことなく、サンプルステージ１０８ａの上に設置されることができる。Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃの各々は、光が通過することを可能にする開口部を含むことができる。Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃの各々は、Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃが、線形方向に作動させられることを可能にする電動式ベルト駆動アクチュエータをさらに含むことができる。例えば、Ｘステージ１０８ｂのアクチュエータは、Ｘステージ１０８ｂをｘ軸に沿って移動させることができ、Ｙステージ１０８ｃのアクチュエータは、Ｙステージ１０８ｂをｙ軸に沿って移動させることができる。このように、サンプルステージ１０８ａ上に設置された生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿が、種々の場所まで移動させられ得、したがって、コリメータ１０６から出射するコリメートされた光が、それらの場所において、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通して照らす（または、光る）ことができる。いくつかの実施形態において、電動式ベルト駆動アクチュエータは、タイミングベルトと、ステッピングモータとを備えていることができる。そのような実施形態において、コントローラ１２０は、ステッピングモータを特定の回転位置まで回転させるステッピングモータに対するコマンド信号を発生させることができる。この回転は、タイミングベルトを通して特定の線形位置までステッピングモータが結合されたステージに作動させる。いくつかの実施形態において、Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃの各々は、送りねじ制御アクチュエータを含むことができる。電動式ベルト駆動アクチュエータと異なり、送りねじ制御アクチュエータは、正確度および再現性を改良している。いくつかの実施形態において、図１Ａ－１Ｃに示されるように、サンプルステージ１０８ａは、統合されるか、または、Ｘステージ１０８ｂの一部であることができる。他の実施形態において、サンプルステージ１０８ａは、Ｘステージ１０８ｂの上に搭載されることができる。

【0048】

光検出器１１０は、線形ステージ１０８の上に固定される細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過した光の強度を測定するように構成されることができる。いくつかの実施形態において、光検出器１１０は、モノリシックフォトダイオードであることができる。光検出器１１０は、光検出器１１０によって確認される光の強度をアナログ電圧信号に変換することができる。このアナログ電圧信号は、コントローラ１２０のアナログデジタル変換器によってデジタル化されることができる。一般に、アナログデジタル変換器は、任意の好適な分解能のものであることができる。例えば、いくつかの実施形態において、アナログデジタル変換器は、８ビットの分解能を有することができる。他の実施形態において、アナログデジタル変換器は、１０ビットの分解能を有することができる。多くの変形例が、可能である。いくつかの実施形態において、光検出器１１０は、光の強度を連続的に測定するように構成されることができる。例えば、いくつかの実施形態において、光検出器１１０は、１０Ｈｚにおいて、光の強度を測定するように構成されることができる（すなわち、１秒あたり１０回の強度測定）。別の例として、いくつかの実施形態において、光検出器１１０は、１００Ｈｚにおいて、光の強度を測定するように構成されることができる（すなわち、１秒あたり１００回の強度測定）。このように、統計的に意味のある強度値が、決定されることができる。

【0049】

コントローラ１２０は、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０を制御するように構成されることができる。例えば、コントローラ１２０は、データバス１３０を経由して、光源１０４に制御信号を伝送し、光源１０４に特定の周波数または波長において光を出力するように命令することができる。例えば、コントローラ１２０は、青色に関して、４５０～４７５ｎｍにおける鋭いピーク、および黄色光に関して、５６０～６０ｎｍにおける平坦なピークを有する白色光を出力するように光源１０４に命令することができる。別の例として、コントローラ１２０は、データバス１３０を経由して、線形ステージ１０８に制御信号を伝送し、ｘ－ｙ平面内の特定の位置に移動するように線形ステージ１０８に命令することができる。例えば、コントローラ１２０は、正のｘ方向に１０ｍｍ移動し、負のｙ方向に５ｍｍ移動するように線形ステージ１０８に命令することができる。また別の例として、コントローラ１２０は、データバス１３０を経由して、光検出器１１０に制御信号を伝送し、特定の率において光強度を測定するように光検出器１１０に命令することができる。例えば、コントローラ１２０は、５Ｈｚ、１０Ｈｚ等において、光強度を測定するように光検出器１１０に命令することができる。いくつかの実施形態において、コントローラ１２０は、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通した光強度の測定が自動化されるように、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０に関連付けられた動作を同期させることができる。例えば、１つの特定の実装では、コントローラ１２０は、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿の９つの所定の場所において、光強度を自動的に測定し、各場所において、１０Ｈｚ（すなわち、１０回）において、光強度を測定するように構成されることができる。この例では、コントローラ１２０は、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０の動作を同期させることができる。例えば、コントローラ１２０は、最初に、制御信号を線形ステージ１０８に伝送し、線形ステージ１０８を第１の所定の場所まで移動させる。移動が完了すると、コントローラ１２０は、白色光を出力するために、光源１０４に制御信号を伝送する。次いで、最終的に、コントローラ１２０は、制御信号を光検出器１１０に伝送し、光強度を１０回測定する。多くの変形例が、可能であり、想定される。いくつかの実施形態において、コントローラ１２０は、Ａｒｄｕｉｎｏコンピューティングユニット等のコンピューティングユニットを使用して実装されることができる。コントローラ１２０は、本明細書の図２を参照して、さらに詳細に議論されるであろう。

【0050】

図２は、本開示の種々の実施形態によるコントローラ１２０の電気的概略図２００を図示する。図２に示されるように、いくつかの実施形態において、コントローラ１２０は、コンピューティングユニット２０２を含むことができる。コンピューティングユニット２０２は、少なくとも１つのプロセッサと、少なくとも１つのメモリと、データバスによって互いに結合された少なくとも１つの入／出力インターフェースとを含むことができる。いくつかの実施形態において、コンピューティングユニット２０２は、入／出力インターフェースを通して、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０の動作をサポートするために、種々の信号を発生させる（および／または、読み取る）ための１つ以上の回路をさらに含むことができる。例えば、コンピューティングユニット２０２は、光源１０４をオンまたはオフにするデジタル出力信号２０４ａを発生させる回路を含むことができる。別の例として、コンピューティングユニット２０２は、光検出器１１０からアナログ入力信号２０４ｂを受信し、アナログ入力信号２０４ｂをデジタル化することができる回路をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、図２に示されるように、コンピューティングユニット２０２は、外部５Ｖ源２０６によって給電されることができる。この５Ｖ源２０６は、コンピューティングユニット２０２に関連付けられた種々の信号を発生させるために、および／または読み取るために、プロセッサ、メモリ、および１つ以上の回路に給電することができる。いくつかの実施形態において、コントローラ１２０は、少なくとも２つのモータドライバモジュール２０８ａ、２０８ｂをさらに含むことができる。そのような実施形態において、コントローラ１２０は、モータドライバモジュール２０８ａ、２０８ｂへの信号を発生させることができ、信号は、それぞれ、Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃのステッピングモータ２１０ａ、２１０ｂに対するパルス幅変調信号をモータドライバモジュール２０８ａ、２０８ｂに発生させる。パルス幅変調信号は、ステッピングモータ２１０ａ、２１０ｂを回転させ、それは、次に、Ｘステージ１０８ｂおよびＹステージ１０８ｃを線形に作動させることができる。いくつかの実施形態において、モータドライバモジュール２０８ａ、２０８ｂは、外部９Ｖ源２１２によって給電されることができる。他の実施形態において、モータドライバモジュール２０８ａ、２０８ｂは、コンピューティングユニット２０２に給電する５Ｖ源２０６によって給電されることができる。いくつかの実施形態において、コンピューティングユニット２０２は、Ａｒｄｕｉｎｏ Ｕｎｏ Ｒ３等のＡｒｄｕｉｎｏコンピューティングユニットを使用して実装されることができる。他の実施形態において、コンピューティングユニットは、他の好適な埋め込まれたコンピューティングシステムを使用して実装されることができる。

【0051】

いくつかの実施形態において、コンピューティングユニット２０２は、コンピューティングシステムに通信可能に結合されることができる。コンピューティングシステムは、ユーザ（例えば、プログラマ）が、自動化を実施するようにコンピューティングユニット２０２を構成することを可能にする統合型開発環境を起動するように構成されることができる。一般に、統合型開発環境は、自動化のための複数のプログラミング言語をサポートすることができる。例えば、１つの特定の実装では、ユーザは、ＰｙｔｈｏｎまたはＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃｓコードを使用して自動化を実施するように、コンピューティングユニット２０２をプログラミングすることができる。多くのプログラミング言語が、想定される。

【0052】

図３Ａは、本開示の種々の実施形態による光強度を測定するために、コントローラ１２０にロードされ得る構成設定の視覚的表現３００を図示する。上で議論されるように、種々の実施形態において、コントローラ１２０は、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿を通した光強度の測定を自動化するように構成されることができる。これは、例えば、コントローラ１２０に結合されたコンピューティングシステム上で起動する統合型開発環境を通して、コントローラ１２０に関する構成設定をプログラミングすることによって行われることができる。構成設定は、コントローラ１２０が、自動化のために、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０の動作を同期させることができるように、コントローラ１２０にロードされることができる。示されるように、図３Ａは、細胞培養皿３０２を描写する。細胞培養皿３０２は、実験室条件下で増殖させられた多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物を含むことができる。細胞培養皿３０２は、線形ステージ１０８の上に固定されることができる。構成設定は、コントローラ１２０が、ある特定の順序またはシーケンスで、光源１０４、線形ステージ１０８、および光検出器１１０に送信するための命令を含むことができる。例えば、非限定的な例として、構成設定は、コントローラ１２０が、線形ステージ１０８をある場所まで移動させるための命令の第１の組を含み、それによって、光源１０４から放出される光の見通し線が、細胞培養皿３０２、したがって、生物学的細胞培養物の第１の点３０４ａと交差することができる。線形ステージ１０８がその場所まで移動することを可能にするためのある程度の時間遅延の後、構成ファイルは、コントローラ１２０が光源１０４をオンにするための命令の第２の組を含むことができる。光源１０４がオンにされることを可能にするためのある程度のより多くの時間遅延の後、構成ファイルは、コントローラ１２０が光検出器に光強度を測定するように命令するための命令の第３の組を含むことができる。第１の点３０４ａに対応する場所における、光強度の測定の完了時、構成ファイルは、線形ステージ１０８を細胞培養皿３０２の第２の点３０４ｂに対応する場所まで移動させ、その場所において、光強度の測定を繰り返すためのさらなる命令を含むことができる。これらの命令は、光強度の測定が、細胞培養皿３０２の点３０４ａ－３０４ｎの全てにおいて測定されるまで、継続する。いくつかの実施形態において、構成設定は、図２に示される蛇行様ルート内で、細胞培養皿を移動させるための命令を含むことができる。

【0053】

図３Ｂは、本開示の種々の実施形態による装置１００を動作させる方法３３０を例証する。ステップ３３２において、線形ステージ１０８は、線形ステージ１０８の上に固定された生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿の第１の所定の場所に対応する場所まで作動させるように命令されることができる。ステップ３３４において、光源１０４は、第１の所定の場所に対応する場所において、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過するための光を発生させるように命令されることができる。ステップ３３６において、光検出器１１０は、細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過した光を受け取り、光の強度を測定することができる。このプロセスは、細胞培養皿の全ての所定の場所における強度が測定されるまで、繰り返される。

【0054】

本明細書に説明される技法は、例えば、コントローラ１２０によって実装される。いくつかの実施形態において、本明細書に説明される技法は、１つ以上の特殊目的コンピューティングデバイスによって実装されることができる。特殊目的コンピューティングデバイスは、本技法を実施するために、配線で接続され得るか、または、本技法を実施するように永続的にプログラミングされた回路網またはデジタル電子デバイス（１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等）を含み得るか、または、ファームウェア、メモリ、他の記憶装置、またはある組み合わせにおいてプログラム命令に従って本技法を実施するようにプログラミングされた１つ以上のハードウェアプロセッサを含み得る。

【0055】

図３Ｃは、本開示の種々の実施形態による装置１００を使用して、生物学的細胞培養物の透過率を決定するための方法３６０を図示する。ステップ３６２において、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿を通して照らすコリメートされた光が、光検出器１１０によって受け取られる。光検出器１１０は、コリメートされた光の強度を電圧に変換する。ステップ３６４において、コントローラ１２０のアナログ／デジタル変換器は、電圧を第１のデジタル値に変換する。第１のデジタル値は、０～９００の範囲であり得、０は、０％の透過率（すなわち、不透過性）と同等であり、９００は、１００％の透過率（すなわち、透過性）と同等である。ステップ３６６において、生物学的細胞培養物を増殖させるために使用された、２ｍＬの培養媒質（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、または未分化培養媒質）を含む、空の細胞培養皿を通して照らすコリメートされた光が、光検出器１１０によって受け取られる。ステップ３６６において、コントローラ１２０のアナログ／デジタル変換器は、空の細胞培養皿を通して照らすコリメートされた光の強度に対応する電圧を第２のデジタル値に変換する。ステップ３６８において、生物学的細胞培養物の透過率が、以下の式に基づいて計算される。
（細胞シート測定値／空の測定値）×１００＝％透過率
式中、細胞シート測定値は、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿の透過率であり、空の測定値は、培養媒質を含む空の細胞培養皿の透過率である。

【0056】

いくつかの実施形態において、装置１００は、移植の前、角膜または任意の他の生物学的細胞培養物の光学密度を測定するために使用されることができる。そのような実施形態において、細胞シート内の細胞の数は、装置１００を使用して測定される細胞シートの透過率と、測定された透過率を細胞の数とともに透過率をプロットしている基準グラフと比較することとに基づいて、推定されることができる。このように、細胞シートが、採集されるとき、細胞シートの品質管理および解放制御、および細胞シート療法の薬量学が、厳密に制御されることができる。これは、採集する前の細胞シートの成熟度のより少ない変動性を結果としてもたらす。細胞の数とともに透過率をプロットしている基準グラフは、本明細書の図４Ｅを参照して、さらなる詳細においてさらに議論される。

【0057】

図４Ａは、本開示の種々の実施形態による生物学的細胞培養物の透過率（光強度）と、厚さおよび／または成熟度との関係を示す図４００を図示する。一般に、物質または材料を通した光の透過率は、物質または材料から出射する光の強度に直接関係する。例えば、材料は、材料から出射する光が、高い光強度を有するとき、高い光の透過率を有すると言える。同様に、材料は、材料から出射する光が、低い光強度を有するとき、低い光の透過率を有すると言える。さらに、一般に、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度は、細胞シートの数に直接関係する。例えば、生物学的細胞培養物が、厚くなるほど、生物学的細胞培養物は、より多くの細胞シートを有する。図４Ａは、細胞培養皿が線形ステージ１０８上に固定された装置１００の簡略化された図を示す。さらに、図４Ａは、光強度を測定する３つのシナリオ４０２－４０６を示す。シナリオ４０２では、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿は、細胞培養皿内で、第１の日数にわたって増殖させられている。図４Ａに使用される透過率のパーセンテージは、細胞シートが細胞培養皿上で増殖させられるときの透過率の変化を説明するための例として使用される。細胞培養皿および生物学的細胞培養物を通過するために光源１０４から発生させられた光は、約１％の光強度を喪失する。このシナリオでは、細胞培養皿および生物学的細胞培養物は、９９％の透過率を有すると言える。この透過率は、第１の日数中に増殖させられた生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度に関係づけられることができる。シナリオ４０４では、生物学的細胞培養物は、第１の日数の後、第２の日数にわたって、細胞培養皿内でさらに増殖させられている。細胞培養皿および生物学的細胞培養物が、光強度を測定するために、再度、装置１００の中に設置されると、この時、細胞培養皿および生物学的細胞培養物から出射する光は、約３％の光強度を喪失し、細胞培養皿および生物学的細胞培養物は、９７％の透過率を有すると言える。シナリオ４０６では、生物学的細胞培養物は、第２の日数の後、第３の日数にわたって、細胞培養皿内でさらに増殖させられている。細胞培養皿および生物学的細胞培養物が、光強度を測定するために、再度、装置１００の中に設置されると、この時、細胞培養皿および生物学的細胞培養物から出射される光は、約１２％の光強度を喪失し、細胞培養皿および生物学的細胞培養物は、８８％の透過率を有すると言える。したがって、この方法を使用して、生物学的細胞培養物の透過率が、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度（すなわち、生物学的細胞培養物が有する細胞シートの数）に関係づけられることができる。さらに、ある場合、生物学的細胞培養物の透過率は、生物学的細胞培養物の成熟度に関係づけられることができる。例えば、生物学的細胞培養物が、より成熟するほど（すなわち、生物学的細胞培養物が、細胞培養皿内で、より長い間、増殖させられているほど）、生物学的細胞培養物は、より厚くなり、したがって、より良好に、細胞培養皿から取り除かれることに関連付けられた応力に耐えることを可能にする。本相関に基づいて、生物学的細胞培養物の透過率が、較正され、非侵襲的方法を用いて、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度、および生物学的細胞培養物を採集するための時間を決定することができる。例えば、生物学的細胞培養物を採集するための時間は、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度に基づいて決定されることができる。この例では、生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度は、生物学的細胞培養物の透過率を決定することによって決定されることができる。したがって、この例では、生物学的細胞培養物を採集するための時間は、生物学的細胞培養物の透過率に基づいて決定されることができる。このように、生物学的細胞培養物に関する採集時間が、非侵襲的な方法において、かつ生物学的細胞培養物を損傷させることなく決定されることができる。

【0058】

図４Ｂ－４Ｃは、本開示の種々の実施形態による多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の透過率と、生物学的細胞培養物が実験室環境内で増殖させられた日数との間の関係を描写するグラフ４２０および４４０を図示する。グラフ４２０は、ｘ－ｙグラフである。ｘ－ｙグラフのｘ軸は、生物学的細胞培養物が増殖した日数を表し、ｘ－ｙグラフのｙ軸は、特定の日数において測定された生物学的細胞培養物の透過率を表す。グラフ４２０では、特定の日数における生物学的細胞培養物の種々の点において測定された透過率値の分散が、棒４２２によって表される。最大および最小透過率値が、棒４２２の縁４２２ａ、４２２ｂによって示される。平均透過率値が、棒４２２の円４２２ｃによって表される。平均透過率値に基づいて、透過率と増殖の日数との間の数学的関係が、決定されることができる。したがって、単に、生物学的細胞培養物の透過率値を測定することによって、生物学的細胞培養物が増殖させられた日数、したがって、厚さおよび／または成熟度が、決定されることができる。グラフ４２０は、脂肪間質細胞シートの透過率、および脂肪間質細胞シートが細胞培養皿内で増殖させられた日数を示すｘ－ｙグラフである。

【0059】

図４Ｄは、本開示の種々の実施形態による多層化された幹細胞または角膜細胞シート等の生物学的細胞培養物の厚さおよび／または成熟度を決定する方法４６０を図示する。ステップ４６２では、コリメートされた光が、細胞培養皿の所定の数の場所において、生物学的細胞培養物を含む細胞培養皿の上に照らされる。コリメートされた光は、装置１００の光源１０４によって発生させられ、装置１００のコリメータ１０６を通してコリメートされる。細胞培養皿上の所定の数の場所は、装置１００のコントローラ１２０にロードされるべき構成設定に基づいて決定される。細胞培養皿は、装置１００の線形ステージ１０８を使用して、所定の数の場所まで作動させられる。

【0060】

ステップ４６４では、生物学的細胞培養物を通過したコリメートされた光の強度が、所定の数の場所において測定される。強度は、装置１００の光検出器１１０によって測定される。光検出器は、所定の数の場所の各々において、少なくとも１０個の強度値を測定する。

【0061】

ステップ４６６では、生物学的細胞培養物に関する透過率の範囲が、強度に基づいて決定される。透過率の範囲は、少なくとも生物学的細胞培養物に関する最大透過率値と、最小透過率値と、平均透過率値とを含む。特定の日数において測定された生物学的細胞培養物に関する透過率の範囲が、グラフ上にプロットされる。特定の日数において測定された平均透過率値に基づいて、相関曲線が、生物学的細胞培養物の透過率値と生物学的細胞培養物の厚さ／成熟度および細胞シートあたりの細胞の数との間で決定されることができる。

【0062】

図４Ｅは、本開示の種々の実施形態による細胞シート内の細胞の数を決定するために使用され得る基準グラフ４８０を図示する。上で議論されるように、細胞シート内の細胞の数が、装置１００を使用して測定された細胞シートの透過率と、測定された透過率を基準グラフ４８０と比較することとに基づいて推定されることができる。図４Ｅに示されるように、基準グラフ４８０は、ｘ－ｙ散布図であることができる。ｘ－ｙ散布図は、ｙ軸上に細胞シートのパーセント透過率と、ｘ軸上に細胞シート内の細胞の数とを含み、細胞の数とともに透過率をプロットすることができる。さらに、ｘ－ｙ散布図は、異なる培養媒質からのデータ点のクラスタを含むことができる。例えば、未分化培養媒質が、三角形のデータ点として表され、骨芽細胞が、正方形のデータ点として表され、軟骨細胞が、円形のデータ点として表される。したがって、細胞シートの透過率、および細胞シートを増殖させるために使用された培養媒質を把握することによって、細胞シート内の細胞の数が、基準グラフ４８０に基づいて決定されることができる。このように、細胞シートが、採集されるとき、細胞シートの品質管理および解放制御、および細胞シート療法の薬量学が、厳密に制御されることができる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【国際調査報告】