特表 2024-504240 安定した細胞株を用いた生物製剤製造のための厳密に制御された誘導性発現系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-31

(54)【発明の名称】安定した細胞株を用いた生物製剤製造のための厳密に制御された誘導性発現系

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240124BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240124BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240124BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240124BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240124BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240124BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240124BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240124BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240124BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240124BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240124BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240124BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240124BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240124BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20240124BHJP

   C07H 17/075 20060101ALN20240124BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 100Z

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A61K31/7048

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

A61K47/68

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/00 H

A61P43/00 111

A61P31/00

C07K14/00

C07H17/075

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534145

(86)(22)【出願日】2022-01-06

(85)【翻訳文提出日】2023-07-27

(86)【国際出願番号】 CA2022050010

(87)【国際公開番号】W WO2022147617

(87)【国際公開日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】63/134,816

(32)【優先日】2021-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】595006223

【氏名又は名称】ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ギルバート， レナルド

(72)【発明者】

【氏名】ブルソー， ソフィー

(72)【発明者】

【氏名】ギルボー， クレア

(72)【発明者】

【氏名】ルクレール， メラニー

(72)【発明者】

【氏名】リトヴィン， ヴィクトリア

(72)【発明者】

【氏名】シモノー， メラニー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C057

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4B065CA45

4C057BB02

4C057DD03

4C057KK09

4C076AA94

4C076CC29

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB32

4C084ZC41

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA14

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA11

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB32

4C086ZC41

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB32

4C087ZC41

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本開示は、組換えタンパク質、ワクチン又はウイルスベクター等の生物製剤の産生を含む、１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性産生に有用な、厳密に制御された誘導性発現系に関する。また、前記ＲＮＡ又はタンパク質の産生に有用な細胞株及びキット、並びに前記細胞株の作製方法及び前記ＲＮＡ又はタンパク質の産生を誘導する方法も提供する。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）構成的プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメートリプレッサータンパク質をコードする核酸分子を含む第１の発現カセット；
ｂ）クメート誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質をコードする核酸分子を含む第２の発現カセット；並びに
ｃ）
ｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位、及びポリアデニル化シグナルを含み、前記クローニング部位が、前記クメルマイシン誘導性プロモーター及び前記ポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された第１の目的のＲＮＡ若しくはタンパク質をコードする核酸分子を挿入するためのものである、核酸分子、又は
ｉｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された、第１の目的のＲＮＡ若しくはタンパク質をコードする核酸分子
を含む第３の発現カセット
を含む、誘導性発現系。

【請求項2】

前記構成的プロモーターが、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ヒトホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、β－アクチンプロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１に記載の発現系。

【請求項3】

前記クメートリプレッサータンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくはその機能性バリアントを含むか、又は配列番号１に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能性バリアントを含む核酸分子によってコードされる、請求項１又は請求項２に記載の発現系。

【請求項4】

前記クメート誘導性プロモーターが、配列番号５に記載のヌクレオチド配列又はその機能性バリアントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項5】

前記クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列若しくはその機能性バリアントを含むか、又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能性バリアントを有する核酸分子によってコードされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項6】

前記クメルマイシン誘導性プロモーターが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能性バリアントを含むか、又は配列番号１０に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能性バリアントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項7】

前記クメルマイシン誘導性プロモーターが、三分割リーダー（ＴＰＬ）及び／又は主要後期プロモーター（ＭＬＰ）エンハンサーをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項8】

前記クメルマイシン誘導性プロモーターが、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列又はその機能性バリアントを含む、請求項７に記載の発現系。

【請求項9】

前記クメルマイシン誘導性プロモーターがヒトβグロビンイントロンをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項10】

前記クメルマイシン誘導性プロモーターが、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列又はその機能性バリアントを含む、請求項９に記載の発現系。

【請求項11】

前記第３の発現カセットが、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、第１の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項12】

前記第３の発現カセットが組換えタンパク質をコードする、請求項１１に記載の発現系。

【請求項13】

プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、第２の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、第４の発現カセットをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項14】

プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、第３の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、第５の発現カセットをさらに含む、請求項１３に記載の発現系。

【請求項15】

前記第４及び／又は第５の発現カセットのプロモーターがクメルマイシン誘導性プロモーターである、請求項１３又は１４に記載の発現系。

【請求項16】

前記第４及び／又は第５発現カセットのプロモーターが構成的プロモーターである、請求項１５に記載の発現系。

【請求項17】

ウイルスベクターの１つ又は複数の構成要素をコードする、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項18】

前記第３の発現カセットがレンチウイルスＲＥＶタンパク質をコードし、前記第４の発現カセットのプロモーターがクメルマイシン誘導性プロモーターであり、前記第４の発現カセットがウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記第５の発現カセットがレンチウイルスＧａｇ／ｐｏｌをコードする、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項19】

前記第３の発現カセットがウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記第４の発現カセットのプロモーターがクメルマイシン誘導性プロモーターであり、前記第４の発現カセットがレンチウイルスＧａｇ／ｐｏｌをコードし、前記第５の発現カセットがレンチウイルスＲＥＶタンパク質をコードする、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項20】

前記ウイルスエンベロープタンパク質がＶＳＶｇであり、任意選択でＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌである、請求項１８又は１９に記載の発現系。

【請求項21】

前記第３の発現カセットがＲｅｐ４０又はＲｅｐ５２をコードし、前記第４の発現カセットがＲｅｐ６８又はＲｅｐ７８をコードし、前記第４の発現カセットがクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項22】

前記第３の発現カセットがＲｅｐ５２をコードし、前記第４の発現カセットがＲｅｐ６８をコードし、前記第５の発現カセットがＲｅｐ７８をコードし、前記第４及び第５の発現カセットがクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項23】

前記第３の発現カセットが抗体重鎖又はその一部をコードし、前記第４の発現カセットが抗体軽鎖又はその一部をコードする、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の発現系。

【請求項24】

目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞に、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の発現系及び選択可能マーカーを導入するステップ；並びに
ｂ）前記選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記発現系を保持する細胞を選択し、目的のウイルスベクター、ＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製するステップ
を含む、方法。

【請求項25】

ｃ）前記発現系を含む個々の細胞を単離するステップ；及び
ｄ）前記個々の細胞を培養して、前記発現系を含む細胞集団を作製するステップ
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセットと、第１の選択可能マーカーとを導入するステップ；
ｂ）第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記第１の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；
ｃ）前記第１の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；
ｄ）前記第１の個々の細胞を培養して、前記第１の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るステップ；
ｅ）前記第１の細胞集団の細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｆ）第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第２の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；
ｇ）前記第２の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；
ｈ）前記第２の個々の細胞を培養して、前記第２の発現カセットを含む第２の細胞集団を得るステップ；
ｉ）前記第２の細胞集団の細胞に、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第３の発現カセット及び第３の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｊ）第３の選択可能マーカーを保持する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記第３の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；
ｋ）前記第３の発現カセットを含む第３の個々の細胞を単離するステップ；
ｌ）前記第３の個々の細胞を培養して、前記第３の発現カセットを含む第３の細胞集団を得ることによって、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製するステップ
を含む、方法。

【請求項27】

請求項１３～２３のいずれか一項に記載の発現系の第４の発現カセット、及び任意選択で請求項１４～２３のいずれか一項に記載の発現系の第５の発現カセットが、ステップｉ）において、又はステップｌ）の後に細胞に導入される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセット、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセット、及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｂ）前記第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけるステップ；
ｃ）前記第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；
ｄ）前記第１の個々の細胞を培養して、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットを含む細胞の第１の集団を得るステップ；
ｅ）前記第１の細胞集団の細胞に、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第３の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｆ）前記第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけるステップ；
ｇ）前記第３の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；
ｈ）前記第２の個々の細胞を培養して、前記第３の発現カセットを含む第２の細胞集団を得ることによって、目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生のための哺乳動物を作製するステップ
を含む、方法。

【請求項29】

請求項１３～２３のいずれか一項に記載の発現系の第４の発現カセット、及び任意選択で請求項１４～２３のいずれか一項に記載の発現系の第５の発現カセットが、ステップｅ）において、又はステップｈ）の後に細胞に導入される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記発現系又は発現系の１つ若しくは複数の発現カセットが、トランスフェクション、形質導入、感染、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ヌクレオフェクション、又はマイクロインジェクションによって細胞に導入される、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞。

【請求項32】

請求項１１～２３のいずれか一項に記載の発現系を含む細胞。

【請求項33】

ヒト細胞であり、任意選択で、ＤＥヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－２９３細胞又はその誘導体である、請求項３１又は３２に記載の細胞。

【請求項34】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞若しくはその誘導体、ＶＥＲＯ細胞若しくはその誘導体、ＨｅＬａ細胞若しくはその誘導体、Ａ５４９細胞若しくはその誘導体、幹細胞若しくはその誘導体、又はニューロン若しくはその誘導体である、請求項３１又は３２に記載の細胞。

【請求項35】

目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生する方法であって、クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含み、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の細胞の発現系の第３の発現カセットが目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードし、目的のＲＮＡ又はタンパク質が産生される、方法。

【請求項36】

前記クメートエフェクター分子がクメートであり、任意選択で、クメートが約１～約２００μｇ／ｍｌ、約５０～約１５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記クメルマイシンエフェクター分子がクメルマイシンであり、任意選択で、クメルマイシンが約１～約３０ｎＭ、約５～約２０ｎＭ、又は約１０ｎＭの濃度で存在する、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞が、懸濁液中及び／又は血清非存在下で増殖される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

請求項１７～２２のいずれか一項に記載の発現系を含むウイルスパッケージング細胞。

【請求項40】

請求項１８～２０のいずれか一項に記載の発現系を含むレンチウイルスパッケージング細胞である、請求項３９に記載のウイルスパッケージング細胞。

【請求項41】

請求項２１又は２２に記載の発現系を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージング細胞である、請求項３９に記載のウイルスパッケージング細胞。

【請求項42】

目的の遺伝子を有するウイルス構築物をさらに含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のウイルスパッケージング細胞。

【請求項43】

ウイルスベクターを製造する方法であって、
ａ）請求項３９～４１のいずれか一項に記載のウイルスパッケージング細胞に、目的の遺伝子を保有するウイルス構築物を導入するか、又は請求項４２に記載のウイルスパッケージング細胞を得るステップ；並びに
ｂ）クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で前記細胞を培養することによりウイルスベクターを産生するステップ
を含む、方法。

【請求項44】

前記クメートエフェクター分子がクメートである、及び／又は前記クメルマイシンエフェクター分子がクメルマイシンである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ウイルスパッケージング細胞が、懸濁液中及び／又は血清非存在下で増殖される、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項46】

選択可能マーカーがウイルス構築物を有する細胞に導入され、前記方法が、前記選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために選択圧をかけるステップ、及び任意選択で、前記ウイルス構築物を含む個々の細胞を単離し、前記ウイルス構築物を含む前記個々の細胞を培養して、前記ウイルス構築物を含む細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞が請求項４０に記載のレンチウイルスパッケージング細胞であり、前記ウイルス構築物がレンチウイルス構築物である、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞が請求項４１に記載のＡＡＶパッケージング細胞であり、前記ウイルス構築物がＡＡＶ構築物である、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

発現可能な哺乳動物細胞株を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセット、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセット、及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｂ）第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記発現系の前記第１及び第２の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；
ｃ）個々の細胞を単離するステップ；並びに
ｄ）前記個々の細胞を培養して細胞株を作製することによって、発現可能な哺乳動物細胞株を作製するステップ
を含む、方法。

【請求項50】

発現可能な哺乳動物細胞株を作製する方法であって、
ａ）哺乳動物細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセット及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｂ）前記第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記第１の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；
ｃ）前記第１の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；
ｄ）前記第１の細胞を培養して、前記第１の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るステップ；
ｅ）前記第１の細胞集団の細胞に、請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；
ｆ）前記第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることによって、第２の発現カセットを有する細胞を選択するステップ；
ｇ）前記第２の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；並びに
ｈ）前記第２の個々の細胞を培養し、前記第２の発現カセットを含む細胞の第２の集団を得ることによって、発現可能な哺乳動物細胞株を作製するステップ
を含む、方法。

【請求項51】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセット及び請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセットを含む、哺乳動物細胞。

【請求項52】

ヒト細胞であり、任意選択で、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－２９３細胞又はその誘導体である、請求項５１に記載の哺乳動物細胞。

【請求項53】

目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生する方法であって、
ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセットと請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセットとを含む細胞に、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第３の発現カセットと選択可能マーカーとを導入するステップ；
ｂ）前記選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、前記発現系の第１、第２及び第３の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；並びに
ｃ）任意選択で、第１、第２及び第３の発現カセットを含む個々の細胞を単離し；前記個々の細胞を培養して、第１、第２及び第３の発現カセットを含む細胞集団を生成するステップ；
ｄ）クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で、第１、第２及び第３の発現カセットを含む細胞を培養し、ここで目的のＲＮＡ又はタンパク質が産生される、ステップ
を含む、方法。

【請求項54】

前記クメートエフェクター分子がクメートであり、及び／又は前記クメルマイシンエフェクター分子がクメルマイシンである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記細胞が、懸濁液中及び／又は血清非存在下で増殖される、請求項５３又は５４に記載の方法。

【請求項56】

ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第１の発現カセットを含む第１のプラスミド；
ｂ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第２の発現カセットを含む第２のプラスミド；及び
ｃ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第３の発現カセットを含む第３のプラスミド
を含む、キット。

【請求項57】

請求項５１又は５２に記載の細胞、及び請求項１～２３のいずれか一項に記載の発現系の第３の発現カセットを含むプラスミドを含む、キット。

【請求項58】

前記第３の発現カセットが、クメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位、及びポリアデニル化シグナルを含み、前記クローニング部位が、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された第１の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を挿入するためのものである、請求項５６又は５７に記載のキット。

【請求項59】

前記第３の発現カセットが、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された、第１の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項５６又は５７に記載のキット。

【請求項60】

請求項３９～４１のいずれか一項に記載の細胞、及びウイルス構築物を含むキット。

【請求項61】

前記クメートエフェクター分子、任意選択でクメート、及び／又はクメルマイシンエフェクター分子、任意選択でクメルマイシンをさらに含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項62】

請求項３１～３４及び３９～４２のいずれか一項に記載の細胞、並びにクメートエフェクター分子、任意選択でクメート、及び／又はクメルマイシンエフェクター分子、任意選択でクメルマイシンを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0003]本開示は、哺乳動物細胞における１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性発現のための遺伝子発現系に関する。また、哺乳動物細胞における組換えタンパク質、ワクチン、又はウイルスベクターのような生物製剤の誘導性の産生のための細胞株及び方法も開示する。

【背景技術】

【0002】

[0004]組換えタンパク質、ワクチン、ウイルスベクター等の様々な生物学的産物は、培養哺乳動物細胞を用いて臨床応用のために産生されることが多い。トランスフェクション又は感染を必要とすることなく、このような生物学的産物を効率的に産生する能力を有する細胞株が利用可能であることによって、製造プロセスを非常に容易にする。しかしながら、これらの生物学的製剤を構成する構成要素の中には細胞毒性を持つものがあるため、そのような細胞株を作製することは困難であることがしばしばである。その結果、これらの構成要素が構成的に合成されることで、細胞の適切な増殖が妨げられる。このような細胞は不安定であるか、又は生成物の産生量が少ない。したがって製造には適さない。

【0003】

[0005]安定な細胞株を用いて細胞毒性を有する生物学的製剤を産生するためには、テトラサイクリン遺伝子スイッチ（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ、１９９２）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）遺伝子スイッチ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）又はクメルマイシン遺伝子スイッチ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、２００３）等の誘導性発現系を用いて、その遺伝子の転写を制御する必要がある。このような誘導性発現系では、細胞の単離と増殖の間、生物学的生成物をコードする遺伝子の転写は不活性である（発現系はオフになっている）。生物学的産物の合成が必要になると、インデューサー（例えばドキシサイクリン又はクメート）を添加することにより転写が活性化される（発現系がオンになる）。誘導性発現系を使用するためには、細胞は遺伝子スイッチの調節エレメントをコードする遺伝子（複数可）、例えばトランスアクチベーター又はリプレッサーを染色体に組み込まなければならない。

【0004】

[0006]いくつかの誘導性発現系が開発されている（例えば、クメート、テトラサイクリン及びクメルマイシン遺伝子スイッチ）。いくつかの誘導性発現系の主な欠点は、その漏出性（目的の遺伝子が誘導なしでも低レベルで転写される）、及び／又は有効性が軽度であること（誘導された場合、発現系が弱い遺伝子発現しか与えない）である。

【発明の概要】

【0005】

[0007]本開示は、クメルマイシン遺伝子スイッチ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）とクメート遺伝子スイッチ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）とを組み合わせて、標的遺伝子発現の二重調節及び漏出性の低減を提供することにより、１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性発現のための発現系を提供する。本発明者らは、構成的プロモーターによって制御されるＣｙｍＲ遺伝子、及びクメート誘導性プロモーターの制御下にあるλＲ－ＧｙｒＢ遺伝子を用いて、この二重スイッチ発現系を実証した。したがって、λＲ－ＧｙｒＢの転写はクメート遺伝子スイッチによって制御された。クメート非存在下では、ＣｙｍＲリプレッサーはクメート誘導性プロモーターＣＭＶ５ＣｕＯに結合し、λＲ－ＧｙｒＢの転写を阻害した。λＲ－ＧｙｒＢ遺伝子の転写（したがってλＲ－ＧｙｒＢトランスアクチベーターの産生）は、クメートの添加によって誘導され、ＣｙｍＲはＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターから放出された。この遺伝子発現系では、産生される生物学的産物（複数可）をコードする遺伝子（複数可）の転写は、クメルマイシン誘導性プロモーター１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ（又は１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ、或いはこれらのプロモーターの変異体）によって制御された。このプロモーターはλＲ－ＧｙｒＢの二量体の結合によって活性化された。λＲ－ＧｙｒＢはクメルマイシンの存在下で二量体を形成した。クメルマイシンの非存在下では、λＲ－ＧｙｒＢは単量体のままで、１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎに結合せず、その結果１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎからの転写を活性化しなかった。まとめると、クメート／クメルマイシン二重遺伝子スイッチでは、誘導は２つのインデューサー：クメート（ＣｙｍＲによる阻害を解除し、λＲ－ＧｙｒＢの合成を可能にする）、及びλＲ－ＧｙｒＢの二量体化及び１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎからの転写を可能にするクメルマイシンを添加することによって達成された。

【0006】

[0008]本開示の一態様は、以下を含む誘導性発現系を含む：構成的プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメートリプレッサータンパク質をコードする核酸分子を含む第１の発現カセット；クメート誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質をコードする核酸分子を含む第２の発現カセット；並びに（ｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位、及びポリアデニル化シグナルを含み、クローニング部位が、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された目的の第１のＲＮＡ若しくはタンパク質をコードする核酸分子を挿入するためのものである、核酸分子、又は（ｉｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された、目的の第１のＲＮＡ若しくはタンパク質をコードする核酸分子、を含む第３の発現カセット。

【0007】

[0009]一実施形態において、構成的プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ヒトホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、β－アクチンプロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。

【0008】

[0010]一実施形態において、クメートリプレッサータンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、又は配列番号１に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能的バリアントを含む核酸分子によってコードされる。

【0009】

[0011]一実施形態において、クメート誘導性プロモーターは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列又はその機能的バリアントを含む。

【0010】

[0012]一実施形態において、クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能的バリアントを含む核酸分子によってコードされる。

【0011】

[0013]一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能的バリアントを含むか、又は配列番号１０に記載のヌクレオチド配列若しくはその機能的バリアントを含む。

【0012】

[0014]一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、三分割リーダー（ＴＰＬ）及び／又は主要後期プロモーター（ＭＬＰ）エンハンサーをさらに含む。一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列又はその機能的バリアントを含む。

【0013】

[0015]一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、ヒトβグロビンイントロンをさらに含む。一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列又はその機能的バリアントを含む。

【0014】

[0016]一実施形態において、第３の発現カセットは、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、目的の第１のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む。一実施形態において、第３の発現カセットは組換えタンパク質をコードする。

【0015】

[0017]一実施形態において、発現系は、プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、第２の目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、第４の発現カセットをさらに含む。

【0016】

[0018]一実施形態において、発現系は、プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された、第３のＲＮＡ又は目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む、第５の発現カセットをさらに含む。

【0017】

[0019]一実施形態において、第４及び／又は第５の発現カセットのプロモーターは、クメルマイシン誘導性プロモーターである。

【0018】

[0020]一実施形態において、第４及び／又は第５発現カセットのプロモーターは、構成的プロモーターである。

【0019】

[0021]一実施形態において、発現系は、ウイルスベクターの１つ又は複数の構成要素をコードする。

【0020】

[0022]一実施形態において、第３の発現カセットはレンチウイルスＲＥＶタンパク質をコードし、第４の発現カセットのプロモーターはクメルマイシン誘導性プロモーターであり、第４の発現カセットはウイルスエンベロープタンパク質をコードし、第５の発現カセットはレンチウイルスＧａｇ／ｐｏｌをコードする。一実施形態において、ウイルスエンベロープタンパク質はＶＳＶｇであり、任意選択でＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌである。

【0021】

[0023]一実施形態において、第３の発現カセットはウイルスエンベロープタンパク質をコードし、第４の発現カセットのプロモーターはクメルマイシン誘導性プロモーターであり、第４の発現カセットはレンチウイルスＧａｇ／ｐｏｌをコードし、第５の発現カセットはレンチウイルスＲＥＶタンパク質をコードする。一実施形態において、ウイルスエンベロープタンパク質はＶＳＶｇであり、任意選択でＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌである。

【0022】

[0024]一実施形態において、第３の発現カセットはＲｅｐ４０又はＲｅｐ５２をコードし、第４の発現カセットはＲｅｐ６８又はＲｅｐ７８をコードし、第４の発現カセットはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。

【0023】

[0025]一実施形態において、第３の発現カセットはＲｅｐ５２をコードし、第４の発現カセットはＲｅｐ６８をコードし、第５の発現カセットはＲｅｐ７８をコードし、第４及び第５の発現カセットはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。

【0024】

[0026]一実施形態において、第３の発現カセットは抗体重鎖又はその一部をコードし、第４の発現カセットは抗体軽鎖又はその一部をコードする。

【0025】

[0027]本開示の別の態様は、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法を含む。一実施形態において、本方法は、哺乳動物細胞に本明細書に記載の発現系及び選択可能マーカーを導入するステップ、選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、発現系を保有する細胞を選択し、目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生のための哺乳動物細胞を作製するステップを含む。

【0026】

[0028]一実施形態において、本方法は、選択可能マーカー及び発現系を保有する個々の細胞を単離するステップ；並びに個々の細胞を培養して、選択可能マーカー及び発現系を有する細胞集団を作成するステップをさらに含む。

【0027】

[0029]一実施形態において、本方法は以下を含む：ａ）哺乳動物細胞に、本明細書に記載の発現系の第１の発現カセット及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；ｂ）第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第１の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；ｃ）第１の発現カセットを含む第１の個々の集団を単離するステップ；ｄ）第１の細胞を培養して第１の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るステップ；ｅ）第１の細胞集団の細胞に、本明細書に記載の発現系の第２の発現カセットと第２の選択可能マーカーを導入するステップ；ｆ）第２の選択可能マーカーを保持する細胞を選択するために、細胞に選択圧をかけ、それによって第２の発現カセットを保持する細胞を選択するステップ；ｇ）第２の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；ｈ）第２の個体細胞を培養して、第２の発現カセットを含む第２の細胞集団を得るステップ；ｉ）第２の細胞集団の細胞に、本明細書に記載の発現系の第３の発現カセット及び第３の選択可能マーカーを導入するステップ；ｊ）第３の選択可能マーカーを有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第３の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；ｋ）第３の発現カセットを含む第３の個々の細胞を単離するステップ；ｌ）第３の個体細胞を培養して、第３の発現カセットを含む細胞の第３の集団を得ることによって、目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生のための哺乳動物細胞を生成するステップ。

【0028】

[0030]一実施形態において、本明細書に記載の発現系の第４の発現カセット、及び任意選択で第５の発現カセットを、ステップｉ）又はステップｌ）の後に細胞に導入する。

【0029】

[0031]一実施形態において、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法は、以下を含む：ａ）哺乳動物細胞に、本明細書に記載の発現系の第１の発現カセット、本明細書に記載の発現系の第２の発現カセット、及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；ｂ）第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけ、それにより第１及び第２の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；ｃ）第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；ｄ）第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るために個々の細胞を培養すること；ｅ）第１の細胞集団の細胞に、本明細書に記載の発現系の第３の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；ｆ）第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧を加えて、それにより第３の発現カセットを有する細胞を選択するステップ；ｇ）第３の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；ｈ）第２の個々の細胞を培養して、第３の発現カセットを含む第２の細胞集団を得ることによって、目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生のための哺乳動物細胞を作製するステップ。

【0030】

[0032]一実施形態において、本明細書に記載の発現系の第４の発現カセット、及び任意選択で本明細書に記載の発現系の第５の発現カセットを、ステップｅ）又はステップｈ）の後に細胞に導入する。

【0031】

[0033]一実施形態において、本明細書に記載の発現系又は発現系の１つ若しくは複数の発現カセットは、トランスフェクション、形質導入、感染、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ヌクレオフェクション、又はマイクロインジェクションによって細胞に導入される。

【0032】

[0034]他の態様は、本明細書に記載の発現系を含む細胞、又は本明細書に記載の方法によって作製された細胞を含む。

【0033】

[0035]一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、任意選択でヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－２９３細胞若しくはその誘導体、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞若しくはその誘導体、ＶＥＲＯ細胞若しくはその誘導体、ＨｅＬａ細胞若しくはその誘導体、Ａ５４９細胞若しくはその誘導体、幹細胞若しくはその誘導体、又はニューロン若しくはその誘導体である。

【0034】

[0036]他の態様は、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生する方法を含む。一実施形態において、本方法は、クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で、本明細書に記載の発現系を含む細胞を培養するステップを含み、ここで、細胞の発現系の第３の発現カセットが目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードし、目的のＲＮＡ又はタンパク質が産生される。

【0035】

[0037]一実施形態において、クメートエフェクター分子はクメートであり、任意選択でクメートは約１～約２００μｇ／ｍｌ、約５０～約１５０μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0036】

[0038]一実施形態において、クメルマイシンエフェクター分子はクメルマイシンであり、任意選択で、クメルマイシンは約１～約３０ｎＭ、約５～約２０ｎＭ、又は約１０ｎｍの濃度で存在する。

【0037】

[0039]一実施形態において、細胞は懸濁液中及び／又は血清非存在下で増殖する。

【0038】

[0040]一態様は、本明細書に記載の発現系を含むウイルスパッケージング細胞を含む。一実施形態では、ウイルスパッケージング細胞はレンチウイルスパッケージング細胞である。他の実施形態では、ウイルスパッケージング細胞はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージング細胞である。

【0039】

[0041]一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、目的の遺伝子を保有するウイルス構築物をさらに含む。

【0040】

[0042]他の態様は、ウイルスベクターを産生する方法を含み、本方法は、本明細書に記載のウイルスパッケージング細胞に、目的の遺伝子を有するウイルス構築物を導入するステップ；並びにクメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で細胞を培養することによりウイルスベクターを産生するステップを含む。

【0041】

[0043]一実施形態において、クメートエフェクター分子はクメートであり、及び／又はクメルマイシンエフェクター分子はクメルマイシンである。

【0042】

[0044]一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、懸濁液中及び／又は血清の非存在下で増殖する。

【0043】

[0045]一実施形態において、選択可能マーカーは、ウイルス構築物と共にウイルスパッケージング細胞に導入され、本方法は、選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために選択圧をかけ、それによってウイルス構築物を保有する細胞を選択するステップ、及び任意選択で、ウイルス構築物を含む個々の細胞を単離し、ウイルス構築物を含む個々の細胞を培養して、ウイルス構築物を含む細胞集団を得るステップをさらに含む。

【0044】

[0046]一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞はレンチウイルスパッケージング細胞であり、ウイルス構築物はレンチウイルス構築物である。

【0045】

[0047]一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞はＡＡＶパッケージング細胞であり、ウイルス構築物はＡＡＶ構築物である。

【0046】

[0048]さらなる態様は、発現可能な哺乳動物細胞株を作製する方法を含む。一実施形態において、本方法は以下を含む：哺乳動物細胞に、本明細書に記載の発現系の第１の発現カセット、本明細書に記載の発現系の第２の発現カセット、及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；第１の選択可能マーカーを担持する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第１及び第２の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；第１及び第２の発現カセットを含む個々の細胞を単離するステップ；並びに個々の細胞を培養して第１及び第２の発現カセットを含む細胞株を作製することによって発現可能な哺乳動物細胞株を作製するステップ。

【0047】

[0049]一実施形態において、発現可能な哺乳動物細胞株を作製する方法は、以下を含む：哺乳動物細胞に、本明細書に記載の発現系の第１の発現カセット及び第１の選択可能マーカーを導入するステップ；第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第１の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；第１の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；第１の個々の細胞を培養して、第１の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るステップ；第１の細胞集団の細胞に、本明細書に記載の発現系の第２の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；細胞に選択圧をかけて、第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するステップ；第２の発現カセットを含む第２の個々の細胞を単離するステップ；並びに第２の個々の細胞を培養して、第２の発現カセットを含む第２の細胞集団を得ることによって、発現可能な哺乳動物細胞株を得ること。

【0048】

[0050]他の態様は、本明細書に記載の発現系の第１の発現カセット及び本明細書に記載の発現系の第２の発現カセットを含む哺乳動物細胞を含む。

【0049】

[0051]一実施形態において、細胞はヒト細胞、任意選択でヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－２９３細胞又はその誘導体である。

【0050】

[0052]さらなる態様は、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生する方法を含み、本方法は以下を含む：本明細書に記載される発現系の第１の発現カセットと本明細書に記載される発現系の第２の発現カセットと含む細胞に、本明細書に記載される発現系の第３の発現カセットと選択可能マーカーとを導入するステップ；選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、発現系の第１、第２及び第３の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；任意選択で、第１、第２及び第３の発現カセットを含む個々の細胞を単離し、個々の細胞を培養して、第１、第２及び第３の発現カセットを含む細胞集団を作製するステップ；並びに、クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子の存在下で、第１、第２及び第３の発現カセットを含む細胞を培養し、ここで目的のＲＮＡ又はタンパク質が産生されること。一実施形態において、クメートエフェクター分子はクメートであり、及び／又はクメルマイシンエフェクター分子はクメルマイシンである。一実施形態において、細胞は、懸濁液中及び／又は血清非存在下で増殖する。

【0051】

[0053]本開示のさらに他の態様は、本明細書に記載される発現系を含むキットを含む。一実施形態において、キットは：本明細書に記載される発現系の第１の発現カセットを含む第１のプラスミド；本明細書に記載される発現系の第２の発現カセットを含む第２のプラスミド；及び本明細書に記載される発現系の第３の発現カセットを含む第３のプラスミドを含む。一実施形態において、キットは、本明細書に記載される発現系の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む細胞、並びに本明細書に記載される発現系の第３の発現カセットを含むプラスミドを含む。

【0052】

[0054]一実施形態において、第３の発現カセットは、クメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位、及びポリアデニル化シグナルを含み、ここで、クローニング部位は、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結されて目的の第１のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を挿入するためのものである。一実施形態において、第３の発現カセットは、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された、目的の第１のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む。

【0053】

[0055]一実施形態において、本明細書に記載される発現系の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含む細胞は、本明細書に記載される発現系の第３、第４及び／又は第５の発現カセットをさらに含み、ここで、第３、第４及び／又は第５の発現カセットは、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする。

【0054】

[0056]一実施形態において、キットは、本明細書に記載される発現系を含むウイルスパッケージング細胞、及びウイルス構築物を含む。

【0055】

[0057]一実施形態において、キットは、クメートエフェクター分子、任意選択でクメート、及び／又はクメルマイシンエフェクター分子、任意選択でクメルマイシンをさらに含む。

【0056】

[0058]前のセクションは、例示としてのみ提供され、本開示及び添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の組成物及び方法に関連する追加の目的及び利点は、本特許請求の範囲、説明、及び実施例に照らして、当業者によって理解される。例えば、本開示の様々な態様及び実施形態は、多数の組合せで利用され得、その全ては、本明細書によって明示的に企図される。これらの追加の利点対象及び実施形態は、本開示の範囲内に明示的に含まれる。本開示の背景を明らかにするために、また、特定の場合には、実施に関する追加の詳細を提供するために、本明細書で使用される刊行物及び他の資料は、参照により組み込まれ、便宜上、添付の参考文献のセクションに列挙される。

【図面の簡単な説明】

【0057】

[0059]本開示のさらなる目的、特徴及び利点は、本開示の例示的な実施形態を示す添付の図と併せてとられる以下の詳細な説明から明らかになる：

【図1】図１は、クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの実施形態の遺伝子調節機構の概略図である。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞を、クメート遺伝子スイッチのリプレッサー（ＣｙｍＲ）を構成的に産生するように操作した。この細胞はまた、ＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターの制御下のクメルマイシンキメラトランスアクチベーターの遺伝子（λＲ－ＧｙｒＢ）を含む。クメート非存在下では、ＣｙｍＲはＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターに結合し、λＲ－ＧｙｒＢの転写を阻害する。クメートを添加することによってＣｙｍＲがプロモーターから遊離し、λＲ－ＧｙｒＢが転写される。Ｂ）クメルマイシン存在下では、λＲ－ＧｙｒＢは二量体を形成し、１２ｘｌａｍｂｄａオペレーター（１２ｘλＯｐ）に結合し、目的の導入遺伝子の転写を活性化する。ノボビオシンを細胞に添加して、λＲ－ＧｙｒＢ二量体を解離させることにより、転写を防ぐことができる。

【図2】図２は、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ細胞の作製に使用した構築物の図を示す。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ細胞の作製に用いたＣｙｍＲ構築物。ＣｙｍＲリプレッサーのコード配列は強力な構成的プロモーター（ＣＭＶ５）によって制御されている。Ｂ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞の作製に用いたλＲ－ＧｙｒＢ構築物。λＲ－ＧｙｒＢのコード配列はＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターによって制御されている。Ｃ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ細胞の作製に使用されるｒｃＴＡ構築物。ｐＡ：ポリアデニル化シグナル。

【図3】図３は、本研究で使用したＬＶをコードする移入ベクターの図を示す。Ａ）ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰの移入ベクター。Ｂ）ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ用の移入ベクター。Ｃ）ＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰ用の移入ベクター。Ｄ）ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ用の移入ベクター。注：Ａ）、Ｂ）及びＣ）に示す移入ベクターは、条件付き自己不活性化レンチウイルス（ｃＳＩＮ）を産生する。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ：それぞれレンチウイルスの５’又は３’末端に位置するロングターミナルリピート；ＣＭＶ：ＣＭＶプロモーター；Ｒ：ＬＴＲのＲ領域；Ｕ５：ＬＴＲのＵ５領域：Ｔｅｔ：テトラサイクリンプロモーター；ψ：キャプシド形成シグナル；ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答配列；ｃＰＰＴ：中央ポリプリントラック；ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質；ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；ＳＤ及びＳＡ：それぞれスプライスドナー及びアクセプター；ＣＭＶ５ＣｕＯ及びＣＲ５クメート制御プロモーター；１２ｘλ－ＴＰＬ：１２ｘＬａｍｂｄａ－ＴＰＬクメルマイシミン制御プロモーター

【図4】図４は、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ細胞における遺伝子調節の機構の概略図を示す。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ細胞は、クメート遺伝子スイッチのリプレッサー（ＣｙｍＲ）を構成的に産生するように操作された。細胞はまた、ＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターの制御下にある逆トランスアクチベーター（ｒｃＴＡ）の遺伝子も含む。クメート非存在下では、ＣｙｍＲはＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターに結合し、ｒｃＴＡ遺伝子の転写を阻害する。クメートの添加によりＣｙｍＲはプロモーターから放出され、ｒｃＴＡの転写が可能になる。Ｂ）クメートの存在下では、ｒｃＴＡはＣＲ５プロモーターに結合し、目的の導入遺伝子（レポーター）の転写を活性化する。

【図5A】図５は、二重クメルマイシン／クメート遺伝子スイッチが、クメート遺伝子スイッチと比較して、より良好な誘導レベルを提供することを示す。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲのクローン（１９８－２、１９８－１０、１６９－４、１６９－Ｃ１、ＣＡ７）、Ｂ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡのクローン（Ｇ３及びＧ１１）及びＣ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢのクローン（７－２、７－３、７－１０）に、それぞれＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰ及びＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰで形質導入した。形質導入後、ＧＦＰ発現レベルをフローサイトメトリーによって解析した。誘導剤非存在下（Ｏｆｆ）及び存在下（Ｏｎ）の細胞集団の蛍光指数を比較した。各クローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、バーの上の数字（Ｂ，Ｃ）として、又は線（Ａ）によって示されている。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ、及び２９ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、それぞれ１５～３０、６０～１００、２６２１～３８７７の間で変動した。２９３ＳＦは、ＬＶを形質導入した２９３ＳＦ細胞（スイッチなし）であり；Ｔ０及びＴ２は、それぞれ培養で１週間及び８週間維持された細胞である。

【図5B】図５は、二重クメルマイシン／クメート遺伝子スイッチが、クメート遺伝子スイッチと比較して、より良好な誘導レベルを提供することを示す。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲのクローン（１９８－２、１９８－１０、１６９－４、１６９－Ｃ１、ＣＡ７）、Ｂ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡのクローン（Ｇ３及びＧ１１）及びＣ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢのクローン（７－２、７－３、７－１０）に、それぞれＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰ及びＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰで形質導入した。形質導入後、ＧＦＰ発現レベルをフローサイトメトリーによって解析した。誘導剤非存在下（Ｏｆｆ）及び存在下（Ｏｎ）の細胞集団の蛍光指数を比較した。各クローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、バーの上の数字（Ｂ，Ｃ）として、又は線（Ａ）によって示されている。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ、及び２９ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、それぞれ１５～３０、６０～１００、２６２１～３８７７の間で変動した。２９３ＳＦは、ＬＶを形質導入した２９３ＳＦ細胞（スイッチなし）であり；Ｔ０及びＴ２は、それぞれ培養で１週間及び８週間維持された細胞である。

【図5C】図５は、二重クメルマイシン／クメート遺伝子スイッチが、クメート遺伝子スイッチと比較して、より良好な誘導レベルを提供することを示す。Ａ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲのクローン（１９８－２、１９８－１０、１６９－４、１６９－Ｃ１、ＣＡ７）、Ｂ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡのクローン（Ｇ３及びＧ１１）及びＣ）２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢのクローン（７－２、７－３、７－１０）に、それぞれＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰ及びＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰで形質導入した。形質導入後、ＧＦＰ発現レベルをフローサイトメトリーによって解析した。誘導剤非存在下（Ｏｆｆ）及び存在下（Ｏｎ）の細胞集団の蛍光指数を比較した。各クローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、バーの上の数字（Ｂ，Ｃ）として、又は線（Ａ）によって示されている。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ、及び２９ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンのＯｎ／Ｏｆｆ比は、それぞれ１５～３０、６０～１００、２６２１～３８７７の間で変動した。２９３ＳＦは、ＬＶを形質導入した２９３ＳＦ細胞（スイッチなし）であり；Ｔ０及びＴ２は、それぞれ培養で１週間及び８週間維持された細胞である。

【図6】図６は、ＬＶのパッケージング細胞株を構築するのに使用される発現カセットの図を示す。ＬＶのパッケージング細胞株を構築するために、以下の構成要素を２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢの染色体に組み込んだ：ｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬの制御下にあるＨＩＶ Ｒｅｖ遺伝子；ｉｉ）構成的ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）又は１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎプロモーターによって制御されるＨＩＶ Ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子；及びｉｉｉ）１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬによって制御される水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子（ＶＳＶｇ）。クメート及びクメルマイシンの添加は、Ｒｅｖ、ＶＳＶｇ及びＧａｇ／ｐｏｌ（１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｇｂｍｉｎで制御されている場合）の転写を誘導する。注：Ｒｅｖの存在は、未処理のＧａｇ／ｐｏｌ ＲＮＡの核外輸送に必要である。したがって、Ｇａｇ／ｐｏｌポリペプチドの効率的な合成はＲｅｖの発現に依存する。

【図7A】図７は、パッケージング細胞のトランスフェクション後のレンチウイルスの産生を示す。無血清培地を用いて懸濁培養で増殖させたパッケージング細胞のクローンを、ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ用の移入ベクター（プラスミド）でトランスフェクションした（図３Ｄ）。細胞をクメート及びクメルマイシンで誘導し、トランスフェクション後３日目に培養培地を採取した。ＨＥＫ２９３細胞への形質導入後、培養培地中のＬＶをフローサイトメトリーによって定量化した。バーは培養培地中の感染力価（１ｍＬ当たりの形質導入単位［ＴＵ］）である。トランスフェクション効率（ＧＦＰ陽性細胞の％）は、薄白色の四角形でＡ）に示す。Ａ）１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ－Ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミドを用いて作製したパッケージング細胞のクローン。Ｂ）ＣＡＧ－Ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミドを用いて作製したパッケージング細胞のクローン。注：パッケージング細胞株（Ａ及びＢ）はいずれも、１．０×１０^７ ＴＵ／ｍｌ以上の力価でＬＶを産生できるクローンを生じた。

【図7B】図７は、パッケージング細胞のトランスフェクション後のレンチウイルスの産生を示す。無血清培地を用いて懸濁培養で増殖させたパッケージング細胞のクローンを、ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ用の移入ベクター（プラスミド）でトランスフェクションした（図３Ｄ）。細胞をクメート及びクメルマイシンで誘導し、トランスフェクション後３日目に培養培地を採取した。ＨＥＫ２９３細胞への形質導入後、培養培地中のＬＶをフローサイトメトリーによって定量化した。バーは培養培地中の感染力価（１ｍＬ当たりの形質導入単位［ＴＵ］）である。トランスフェクション効率（ＧＦＰ陽性細胞の％）は、薄白色の四角形でＡ）に示す。Ａ）１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ－Ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミドを用いて作製したパッケージング細胞のクローン。Ｂ）ＣＡＧ－Ｇａｇ／ｐｏｌをコードするプラスミドを用いて作製したパッケージング細胞のクローン。注：パッケージング細胞株（Ａ及びＢ）はいずれも、１．０×１０^７ ＴＵ／ｍｌ以上の力価でＬＶを産生できるクローンを生じた。

【図8】図８は、パッケージング細胞株由来の産生クローンによるレンチウイルス産生を示す。ＬＶ産生クローンは、パッケージング細胞（クローン３Ｄ４、図７Ｂ）に、ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰをコードする移入ベクター（プラスミド）をトランスフェクションすることにより作製した（図３Ｄ）。得られたＬＶ（ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ）は、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する。プラスミドを安定に組み込んだクローンを単離し、無血清培地を用いて懸濁培養で増殖させた。ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの産生は、培養培地へのクメート及びクメルマイシンの添加により誘導された。培養培地中のＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの力価は、ＨＥＫ２９３細胞への導入後３日目に測定し、フローサイトメトリーでＧＦＰ陽性細胞を定量化した。力価は非濃縮培養培地１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ）として表した。注：いくつかのクローン（１Ｅ９、３Ｅ９、２Ｇ１１、１Ｆ３、２Ｃ８及び１Ｅ８）は、１．０Ｘ１０^８ＴＵ／培養培地１ｍｌ以上の力価でＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰを産生する。

【図9】図９は、パッケージング細胞におけるＬＶ遺伝子発現の調節を示す。クメート及びクメルマイシンによる誘導後のパッケージング細胞（クローン３Ｄ４、図７）によるＶＳＶｇ（Ａ）、Ｒｅｖ（Ｂ）及びＧａｇ（Ｃ）の発現についてのウェスタンブロット解析。各サンプルについて同量の細胞溶解液を用いた。細胞は誘導前（０）、誘導の２４、４８、７２時間後に酪酸ナトリウム（誘導後１８時間後に添加）の非存在下又は存在下で採取した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞を陰性対照（ＣＴ）として用いた。ＶＳＶｇ、Ｒｅｖ、Ｇａｇポリタンパク質（ＧＡＧ ＰＰ）、及びｐ２４の位置を矢印で示す。ＭＷ：ｋＤａ単位の分子量マーカー。ＶＳＶｇ抗体を使用した場合、陰性対照に非特異的なバンド（＊）が存在することに注意されたい。

【図10】図１０は、ＡＡＶを産生するために使用される構成要素の概略図を示す。Ａ）２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞の作製に使用したＲｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、及びＲｅｐ７８を発現する構築物。各Ｒｅｐ遺伝子は１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬプロモーター（１３ｘλ－ＴＰＬ）によって制御されている。Ｂ）２９３ＳＦ－Ｒｅｐの一過性トランスフェクションによりＡＡＶを産生するために使用されたプラスミド。ｐＣＭＶ－ＣＡＰはＣＭＶプロモーターにより制御されるＡＡＶのＣＡＰ遺伝子をコードする。ｐＡＡＶ－ＧＦＰはＣＭＶにより制御されるＧＦＰを産生する発現ベクターである。ｐＨｅｌｐｅｒはアデノウイルスのヘルパー遺伝子を保有する。

【図11】図１１は、２９３ＳＦ－ＲｅｐクローンによるＲＥＰタンパク質発現のウェスタンブロットを示す。安定的にトランスフェクションされた２９３ＳＦ－Ｒｅｐクローン（クローン１３、１８、３５及び３６）の細胞溶解液を、ＲＥＰに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって解析した。異なる濃度のクメート及びクメルマイシンを用いて発現を誘導した。誘導されていない細胞は陰性対照とした。Ｒｅｐ７８、６８、及び５２の位置を矢印で示す。注：誘導なしではＲＥＰの有意な発現は観察されない。ＭＷ：分子量マーカー。

【図12】図１２は、２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞（クローン１３）の一過性トランスフェクション後のＡＡＶ産生の最適化を示す。無血清培地中において懸濁培養で増殖させた２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を、異なる量（μｇ／ｍｌで表す）のｐＣＭＶ－ＣＡＰ（ｐＶＲ４６－ＣＡＰ）、ｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶ－ＧＦＰでトランスフェクションした（図１０参照）。トランスフェクション後、細胞をクメート及びクメルマイシンで３日間誘導した。産生されたＡＡＶを含む細胞溶解液をＨＥＫ２９３細胞の形質導入に用い、その後フローサイトメトリーによって解析した。データは細胞培養物１ｍｌ当たりの感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ）として表した。最良の条件は、＃５及び＃１６であり、これらにより２．５×１０^７ＩＶＰ／ｍｌの力価が得られた。

【図13】図１３は、プロモーター１２ｘＬａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ（配列番号９）の配列（上鎖）及び相補配列（下鎖）を示す。１２コピーのラムダオペレーター（１２ｘｌａｍｂｄａＯＰ）及びＣＭＶ最小プロモーターの位置は、１２ｘＬａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎのヌクレオチド配列に示される。

【図14】図１４は、プロモーター１３ｘＬａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ（配列番号１０）の配列（上鎖）及び相補配列（下鎖）を示す。１３コピーのラムダオペレーター（１３ｘｌａｍｂｄａＯＰ）及びＣＭＶ最小プロモーターの位置は、１３ｘＬａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎのヌクレオチド配列に示される。

【図15】図１５は、プロモーター１３ｘＬａｍｂｄａ－ＴＰＬ（配列番号１１）の配列（上鎖）及び相補配列（下鎖）を示す。１３コピーのラムダオペレーター（１３ｘｌａｍｂｄａＯＰ）、ＣＭＶ最小プロモーター、アデノウイルス三分割リーダー（ＴＰＬ）及びアデノウイルス主要後期プロモーターのエンハンサー（ＭＬＰエンハンサー）の小イントロン内の位置を示す。

【図16-1】図１６は、プロモーター１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ（配列番号１２）の配列（上鎖）及び相補配列（下鎖）を示す。１１コピーのラムダオペレーター（１１ｘｌａｍｂｄａＯＰ）、ＣＭＶ最小プロモーター、アデノウイルス三分割リーダー（ＴＰＬ）、アデノウイルス主要後期プロモーターのエンハンサー（ＭＬＰエンハンサー）、ヒトβ－グロビンイントロン（ｈＢｇｌｏｂｉｎ－デルタイントロン）、及びキメライントロンのスプライス部位ドナー及びアクセプターの位置を示す。

【図16-2】図１６は、プロモーター１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ（配列番号１２）の配列（上鎖）及び相補配列（下鎖）を示す。１１コピーのラムダオペレーター（１１ｘｌａｍｂｄａＯＰ）、ＣＭＶ最小プロモーター、アデノウイルス三分割リーダー（ＴＰＬ）、アデノウイルス主要後期プロモーターのエンハンサー（ＭＬＰエンハンサー）、ヒトβ－グロビンイントロン（ｈＢｇｌｏｂｉｎ－デルタイントロン）、及びキメライントロンのスプライス部位ドナー及びアクセプターの位置を示す。

【発明を実施するための形態】

【0058】

［種々の実施形態の説明］
[0076]以下は、本開示を実施する際に当技術分野の当業者を助けるために提供される詳細な説明である。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、本開示を限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、図及び他の参考文献は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

【0059】

Ｉ．定義
[0077]本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに付与される意味を有し得る。しかしながら、当技術分野の当業者に公知の又は理解されている他の意味も可能であり、本開示の範囲内であることは理解されるべきである。矛盾が生じた場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

【0060】

[0078]値の範囲が提供される場合、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の他の記載された値又は介在値は、本明細書内に包含されると理解される。任意の下限値から任意の上限値までの範囲が想定される。

【0061】

[0079]本明細書で使用される「約」という用語は、実験誤差及び当技術分野の当業者によって予想される変動を考慮するために使用される。例えば、「約」は、参照される指示値のプラスマイナス１０％、又はプラスマイナス５％を意味し得る。

【0062】

[0080]本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数形の参照を含む。

【0063】

[0081]本明細書で使用される「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素の「いずれか、又は両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素、すなわち、そのように結合された要素の「１つ又は複数」も同様に解釈されるべきである。他の要素は、「及び／又は」句によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択で存在し得る。

【0064】

[0082]本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、一覧中の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であること、すなわち、多数又は一覧の要素のうちの少なくとも１つを含むが、１つを超えて含むこと、及び任意選択で、さらに列挙されていない項目を含むことと解釈されるものとする。反対を明確に示す、単一的な用語、例えば「のうちの１つのみ」、「のうちの厳密に１つ」、又は、特許請求の範囲において使用される場合、「からなる」は、多数又は一覧の要素のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般的に、本明細書で使用される用語「又は」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの厳密に１つ」等の排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、「一方又は他方であって両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。

【0065】

[0083]本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等の全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定されないが含むことを意味すると理解される。「からなる」及び「から本質的になる」という移行句のみが、それぞれ、クローズ又は半クローズな移行句であるものとする。

【0066】

[0084]本明細書で使用される場合、１つ又は複数の要素の一覧に関して「少なくとも１つ」という句は、要素の一覧内の任意の１つ又は複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素の一覧内に具体的に列挙された各要素及び全ての要素のうちの少なくとも１つを含む必要はなく、要素の一覧内の要素のいずれの組合せも除外するものではない。また、この定義は、「少なくとも１つ」という句が指す要素の一覧内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択で存在し得ることを許容するものである。

【0067】

[0085]また、１つを超えるステップ又は行為を含む本明細書に記載される特定の方法において、別段の指示がない限り、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が記載される順序に必ずしも限定されないことは理解されるべきである。

【0068】

ＩＩ．発現系
[0086]二重クメルマイシン／クメート遺伝子スイッチの使用は、クメートスイッチ単独の使用と比較して、目的のタンパク質の厳密な制御された発現（より高いＯｎ／Ｏｆｆ比）を提供することが見出された。したがって、本明細書において提供されるのは、目的のＲＮＡ又はタンパク質の緊密に制御された誘導性の発現に有用な、二重クメルマイシン／クメート遺伝子スイッチを含む発現系である。したがって、本明細書において提供されるのは、ａ）構成的プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメートリプレッサータンパク質をコードする核酸分子を含む第１の発現カセット；ｂ）クメート誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたクメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質をコードする核酸分子を含む第２の発現カセット；並びにｃ）（ｉ）クローニング部位が、クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された目的の第１のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を挿入するためのものである、クメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位及びポリアデニル化シグナル、又は（ｉｉ）クメルマイシン誘導性プロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結された、目的の少なくとも１つのＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子を含む、第３の発現カセットを含む発現系である。

【0069】

[0087]「発現カセット」という用語は、プロモーター及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ分子を指し、発現カセットの特定の部分は、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ、ロングノンコーディングＲＮＡ、又はレンチウイルス等のウイルスのゲノム等）及び／又は細胞機構によって続いてタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとして転写されることが可能であるようになっている。「発現カセット」という用語は、プロモーターと、ポリアデニル化シグナルと、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする核酸分子をプロモーター及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結されて挿入するためのクローニング部位とを含む核酸分子を指すのにも使用される。

【0070】

[0088]本明細書で使用する「核酸分子」及びその誘導体という用語は、未修飾のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡを含むことを意図している。例えば、本開示の核酸分子又はポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成され得る。本開示の核酸分子はまた、安定性又は他の理由のために修飾された、１つ又は複数の修飾塩基又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ骨格を含み得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチウム化塩基、及びイノシン等の珍しい塩基が挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡには様々な修飾が可能であり、したがって「核酸分子」は化学的、酵素的、代謝的に修飾された形態を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、対応する意味を有するものとする。

【0071】

[0089]本明細書で使用される、「クローニング部位」という用語は、組換えＤＮＡ技術（クローニング）を使用して、目的の核酸分子が挿入され得るか、又は目的の核酸分子が結合され得る核酸分子の部分を指す。発現カセットの場合、クローニング部位は、プロモーターとポリアデニル化シグナルの間に位置し、目的の核酸分子がプロモーターとポリアデニル化部位と作動可能に連結されて発現カセットにクローニングされ得るようになっていてもよい。いくつかのクローニング技術が当業者に公知であり、クローニング部位は、クローニング部位における目的の核酸分子の挿入を可能にするために必要な特性（制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）、リコンビナーゼ認識部位（複数可）、又は平滑若しくは突出末端（複数可）等）を含む。クローニング部位は、例えば、目的の核酸分子の挿入が可能になるために、複数の特有の制限酵素認識部位を含むマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）又はポリリンカー領域であってもよい。それに代えて又はそれに加えて、クローニング部位は、ＤＮＡ挿入を触媒するためにインテグラーゼ又はＣｒｅリコンビナーゼ等の部位特異的リコンビナーゼ（複数可）を用いる組換えクローニングによるＤＮＡ挿入を可能にするために、１つ又は複数のリコンビナーゼ認識部位を含むことができる。組換えクローニング系の例としては、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）（インテグラーゼ）、クリエーター（Ｃｒｅａｔｏｒ）（商標）（Ｃｒｅリコンビナーゼ）、及びエコークローニング（Ｅｃｈｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（商標）（Ｃｒｅリコンビナーゼ）が挙げられる。いくつかのクローニング戦略では、発現カセット又はベクターは線状分子として提供され、目的の核酸分子の平滑又は突出末端を、例えばライゲーション又はポリメラーゼ活性によって発現カセット又はベクターの平滑又は突出末端に結合させ、環状分子を形成させることができる。この場合、発現カセット又はベクターの平滑又は突出末端を合わせてクローニング部位と考えることができる。このようなアプローチはＰＣＲ産物のクローニングに一般的に使用される。

【0072】

[0090]本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つの構成要素が意図された方法で機能することを可能にする２つの構成要素間の関係を指す。例えば、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡがプロモーターに作動可能に連結されている場合、プロモーターはコードされるＲＮＡの発現を作動させる。

【0073】

[0091]「プロモーター」又は「プロモーター配列」という用語は、一般に、ＲＮＡを生成するために下流（すなわち３’）配列の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼによって結合されることができる調節ＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターは、任意の生物に由来してもよく、任意のＲＮＡポリメラーゼによって結合又は認識されてもよい。適切なプロモーターは当業者に公知である。いくつかの発現カセットでは、プロモーターは構成的プロモーターである。構成的プロモーターの例としては、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）、ヒトホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、β－アクチン、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター（ＣＭＶ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、又はそれらの機能性バリアントが挙げられる。いくつかの発現カセットにおいて、プロモーターは誘導性プロモーターである、及び／又はそれぞれ転写を活性化若しくは阻害するトランスアクチベーター若しくはリプレッサーのための結合配列を含む。誘導性プロモーターの例としては、クメート誘導性プロモーター及びクメルマイシン誘導性プロモーターが挙げられる。

【0074】

[0092]「クメート誘導性プロモーター」という用語は、クメートエフェクター分子の非存在下で、クメートリプレッサータンパク質によって結合され得るプロモーター、例えばＣｙｍＲ（配列番号１及び２）又はその機能性バリアントを指す。クメートエフェクター分子の結合は、ＣｙｍＲ等のクメートリプレッサータンパク質による転写抑制を緩和する。クメート誘導性プロモーターは、例えば米国特許第７，７４５，５９２号に記載されており、例えばＣＭＶ、ＶＩＰ、ｔｋ、ＨＳＰ、ＭＬＰ及びＭＭＴＶプロモーターから選択される哺乳動物プロモーターからの最小プロモーター配列（例えばＴＡＴＡボックス及び隣接配列）、並びに少なくとも１つのＣｙｍＲオペレーター配列（ＣｕＯ）を含む。ＣｕＯ配列は、例えば、米国特許第７７４５５９２号に記載されるようなＣｕＯ Ｐ１（配列番号４）又はＣｕＯ Ｐ２を含む。いくつかの実施形態では、ＣｕＯ Ｐ２（配列番号３）等のパリンドローム特徴を有するＣｕＯが使用される。本開示のいくつかの実施形態では、ＣＭＶ５－ＣｕＯ（配列番号５）又はその機能的バリアントを使用し得る。

【0075】

[0093]本明細書で使用される場合、「クメートエフェクター分子」という用語は、クメートリプレッサータンパク質による転写抑制を緩和する分子を指す。クメートエフェクター分子としては、クメート、ｐ－エチル安息香酸、ｐ－プロピル安息香酸、クミン酸、ｐ－イソブチル安息香酸、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチル安息香酸、ｐ－Ｎ－ジメチルアミノ安息香酸、及びｐ－Ｎ－エチルアミノ安息香酸が挙げられる。一実施形態において、クメートエフェクター分子はクメートである。

【0076】

[0094]本明細書中で使用される「クメルマイシン誘導性プロモーター」という用語は、クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質によって結合され得るプロモーターを指す。クメルマイシン誘導性プロモーターは、例えば、米国特許第８，３７７，９００号に記載されており、例えば、ＣＭＶ、ＶＩＰ、ＳＶ４０、ｔｋ、ＨＳＰ、ＰＧＫ、ＭＬＰ、ＥＦ１ａ及びＭＭＴＶプロモーター並びにそれらの機能性バリアントから選択される構成的哺乳動物プロモーターからの最小プロモーター配列（例えば、ＴＡＴＡボックス及び隣接配列）、並びに少なくとも１つのラムダオペレーター（λＯＰ）配列（配列番号６）を含む。クメルマイシン誘導性プロモーターは、例えば１～１３コピーのｌａｍｂｄａＯｐ、任意選択で１１、１２（配列番号７）又は１３（配列番号８）コピー又はそれ以上のｌａｍｂｄａＯｐを含み得る。一実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、最小ＣＭＶプロモーター及び数コピー、例えば１１、１２又は１３コピーのｌａｍｂｄａＯＰ、例えばそれぞれ配列番号９及び１０並びに図１３及び１４に記載されるような１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ若しくは１３ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ、又はそれらの機能性バリアントを含み得る。他の実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、最小ＣＭＶプロモーター並びにアデノウイルスの三分割リーダー（ＴＰＬ）及び主要後期プロモーター（ＭＬＰ）エンハンサーと共に複数のコピーのｌａｍｂｄａＯＰを含んでいてもよく、例えば、配列番号１１及び図１５に記載されるようなプロモーター１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ、又はその機能性バリアントを含み得る。他の実施形態において、クメルマイシン誘導性プロモーターは、例えば、配列番号１２及び図１６に記載されるように、１１コピーのｌａｍｂｄａＯＰ、最小ＣＭＶプロモーター、アデノウイルスＴＰＬ及びＭＬＰエンハンサー、並びにヒトβ－グロビンイントロンの一部を含むプロモーター１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎのように、他の下流配列と関連するいくつかのコピーのｌａｍｂｄａＯｐ、又はその機能性バリアントを含み得る。

【0077】

[0095]本明細書で使用される「クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質」という用語は、クメルマイシンエフェクター分子の存在下でクメルマイシン誘導性プロモーターに結合することができるタンパク質を指す。クメルマイシンエフェクター分子の結合は、λＲ－ＧｙｒＢ等のキメラトランスアクチベータータンパク質の二量体化、及びクメルマイシン誘導性プロモーターからの転写活性化をもたらす。クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質は、例えば米国特許第８，３７７，９００号に記載されており、λリプレッサー（λＲ）のＮ末端ドメインとＤＮＡジャイレースＢサブ単位（ＧｙｒＢ）を融合させ、その後にトランスアクティベーションドメインとも呼ばれる転写活性化ドメインを融合させることによって構築することができる。λＲのＮ末端ドメインは二量体としてｌａｍｂｄａＯＰに結合する。ＧｙｒＢドメインはクメルマイシンと結合した後に二量体を形成するため、λＲのＮ末端ドメインの二量体化を促進し、その後ｌａｍｂｄａＯＰに結合し、活性化ドメインを介して転写を活性化することができる。簡潔性のために、クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質を本明細書では単に「λＲ－ＧｙｒＢ」と称することがある。適切な転写活性化ドメインとしては、転写因子ＮＦκＢ ｐ６５、ＶＰ１６、Ｂ４２及びＧａ１４由来のものが挙げられる。一実施形態において、トランス活性化ドメインは、配列番号１５に記載されるようなＮＦｋＢ ｐ６５由来のものである。一実施形態において、クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質は、配列番号１３若しくは１４に記載されるような配列、又はその機能性バリアントを有する。適切なクメルマイシンエフェクター分子としては、クメルマイシンが挙げられる。タンパク質発現のさらなる抑制を提供するか、又は漏出発現を防止するために、クメルマイシンキメラトランスアクチベータータンパク質の二量体化及び活性化は、ノボビオシン等の阻害剤の添加によって阻害され得る。

【0078】

[0096]本明細書で使用する「ポリアデニル化シグナル」又は「ｐＡ」という用語は、一般的にポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を指し、これは転写されたＲＮＡが切断され、ポリアデニル化テールが付加される部位であり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等のＲＮＡの転写を終結させる効果を有する。適切なｐＡは、任意の生物由来であってもよく、当業者には公知である。ｐＡシグナルの例としては、ウサギβグロビンｐＡ（配列番号１６）、強力ウシ成長ホルモンｐＡ（ＢＧＨｐＡ；配列番号１７）及びＳＶ４０ポリＡシグナル（配列番号１８）が挙げられる。

【0079】

[0097]本明細書で使用する「機能性バリアント」という用語は、本明細書で開示する核酸分子又はポリペプチドと実質的に同じ機能を実質的に同じ方法で果たす、本明細書で開示する核酸配列又はタンパク質の修飾又は化学的均等物を含む。例えば、本明細書に開示されるポリペプチドの機能性バリアントには、限定されないが、保存的アミノ酸置換が含まれる。

【0080】

[0098]本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、同様の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性及びサイズ）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。ポリペプチドのバリアントには、本明細書で開示されるポリペプチド配列に対する付加及び欠失も含まれる。さらに、バリアントヌクレオチド配列には、そのアナログ及び誘導体が含まれる。

【0081】

[0099]一実施形態において、本開示は、本明細書中に開示される核酸配列に対する機能性バリアントを含む。機能性バリアンとは、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件下で、上記の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0082】

[00100]「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件」とは、溶液中で２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイズを促進する条件が選択されることを意味する。「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件及び中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件を包含する。ハイブリダイズは、核酸配列分子の全部又は一部に対して起こり得る。ハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０又は５０）ヌクレオチドの長さである。当技術分野の当業者であれば、核酸二重鎖又はハイブリッドの安定性がＴｍによって決定され、Ｔｍはナトリウム含有緩衝液中ではナトリウムイオン濃度と温度の関数である（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）、又は類似の式）ことを認識する。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータは、ナトリウムイオン濃度及び温度である。公知の核酸分子と類似しているが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチはＴｍが約１℃低下すると仮定することができ、例えば、９５％超の同一性を有する核酸分子を求める場合、最終洗浄温度は約５℃低下する。これらの考察に基づいて、当技術分野の当業者は適切なハイブリダイズ条件を容易に選択できる。いくつかの実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイズ条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリダイズを達成するために以下の条件を使用することができる：５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５ｘデンハルト溶液／１．０％ ＳＤＳで上記の式に基づきＴｍ－５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで６０℃で洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイズ条件は、４２℃の３ｘＳＳＣでの洗浄ステップを含む。しかしながら、同等のストリンジェンシーは別の緩衝剤、塩、温度を使用しても達成できることは理解される。ハイブリダイズの条件に関する追加ガイダンスは：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１に見ることができる。

【0083】

[00101]他の実施形態において、機能性バリアント核酸配列は、縮退コドン置換又はコドン最適化核酸配列を含む。本明細書で使用する「縮退コドン置換」という用語は、コドンの第２及び／又は第３の塩基が、そこにコードされるアミノ酸配列に変化をもたらさない異なる塩基で置換されたバリアント核酸配列を指す。本明細書で使用する「コドン最適化」という用語は、特定の生物のコドン使用バイアスを反映する１つ又は複数の縮退コドン置換を含むバリアント核酸分子を指す。

【0084】

[00102]他の実施形態において、機能性バリアント核酸又はタンパク質配列は、本明細書に開示される配列に対して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0085】

[00103]本明細書で使用する「配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列間の同一性パーセントを決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列にギャップが導入され得る）。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝重複する同一位置の数／位置の総数Ｘ１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを使用しても達成し得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの１つの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８の、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７で修正されているアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２に設定されたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、例えばｓｃｏｒｅ－５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３に設定されたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータで実行し得る。比較目的のためのギャップ整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。或いは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照のこと）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用することができる。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してもしなくても、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。

【0086】

[00104]本明細書に記載の発現系は、任意の目的のＲＮＡ又はタンパク質を発現するために使用することができる。したがって、一実施形態において、発現系は、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする。目的のＲＮＡ又はタンパク質は、細胞毒性を有しても、又は細胞増殖及び／若しくは生存能の低下をもたらしてもよい。一実施形態において、目的のタンパク質は組換えタンパク質である。

【0087】

[00105]本明細書に記載の発現系は、例えば抗体又はウイルスベクター等の複雑な生物学的製剤の発現のために、２つ以上の目的のＲＮＡ又はタンパク質を発現させるために使用することができる。したがって、一実施形態では、発現系は、さらなる目的のＲＮＡ又はタンパク質の発現を可能にするために、１つ又は複数のさらなる発現カセットを含む。さらなる目的のＲＮＡ又はタンパク質は、同じ制御エレメント又は異なる制御エレメントの制御下にあり得る。さらなる発現カセット（複数可）は、同一若しくは異なるプロモーター及び／又は同一若しくは異なるｐＡシグナルを含んでいてもよい。

【0088】

[00106]いくつかの実施形態において、本開示の発現系は、ウイルスベクターの産生に関与する１つ又は複数の核酸又はタンパク質をコードする。本明細書で使用される「ウイルスベクター」という用語は、標的細胞を形質導入することができるウイルス粒子又はウイルス様粒子を含むことが意図される。一般的なウイルスベクターとしては、ＨＩＶ由来のレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。他のウイルスベクターは、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）等）、又はヘルペスウイルス（ＣＭＶ及びＨＳＶ－１等）由来であってもよい。したがって、一実施形態において、発現系は、ウイルスベクターの構成要素をコードする。代表的な構成要素は、ベクターのキャプシド及びエンベロープを形成するタンパク質等のベクターの構造構成要素である。他の構成要素は、ベクターＲＮＡ又はＤＮＡの複製に関与する酵素である。このような酵素はウイルスＲＮＡの合成、成熟、及び輸送にも関与する。これらの酵素はまた、ウイルス構成要素のプロセシング及び成熟、並びにウイルスのゲノムの細胞染色体への組込みにも関与し得る。ウイルスベクターの構成要素である酵素は、ウイルスゲノムＲＮＡのＤＮＡへの逆転写にも関与し得る。ベクターの他の構成要素は、ウイルスベクターの遺伝子又は遺伝子産物の複製、転写、輸送又は翻訳を調節するタンパク質又はペプチドであり得る。このような因子はまた、細胞遺伝子の発現を活性化又は低下させることができ、ウイルスに対する細胞の防御機構を調節することができる。アデノウイルス及びレンチウイルスのプロテアーゼ（レンチウイルスのｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子によってコードされる）、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質、ＶＳＶのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶｇ）等、いくつかのウイルスベクターの構成要素は細胞に対して毒性を示すことがよく知られている。この一覧は網羅的ではなく、ウイルスベクター又はウイルスの他の構成要素は、構成的に産生される場合、又は過度の高濃度で産生される場合、毒性を示す可能性がある。

【0089】

[00107]一実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。ＲＥＶ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ及びＶＳＶｇ等のエンベロープタンパク質の発現は、レンチウイルスベクターの産生に関与する。したがって、いくつかの実施形態では、発現系は、プロモーターに作動可能に連結された、ＲＥＶ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びＶＳＶｇ等のエンベロープタンパク質の各々をコードするさらなる発現カセットを含み、少なくとも１つのウイルス構成要素は、クメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。任意選択で、全てのウイルス構成要素はクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、Ｇａｇ／Ｐｏｌは構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｇａｇ／Ｐｏｌはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。

【0090】

[00108]一実施形態では、ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。Ｒｅｐタンパク質の発現はＡＡＶの生産に関与する。したがって、いくつかの実施形態において、誘導可能発現系は、クメルマイシン誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８又はＲｅｐ７８をコードする核酸分子を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、発現系は、プロモーターに作動可能に連結されたＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８又はＲｅｐ７８をコードする１つ又は複数のさらなる発現カセットを含み、ここで、少なくとも１つはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、発現系は、Ｒｅｐ４０又はＲｅｐ５２のうちの少なくとも１つをコードする発現カセット、及びＲｅｐ６８又はＲｅｐ７８のうちの少なくとも１つをコードする発現カセットを含み、ここで、少なくとも１つはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。例えば、発現系は、Ｒｅｐ４０とＲｅｐ６８、Ｒｅｐ４０とＲｅｐ７８、Ｒｅｐ５２とＲｅｐ６８、又はＲｅｐ５２とＲｅｐ７８を含み得る。任意選択で、全てのウイルス構成要素はクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。

【0091】

[00109]いくつかの実施形態では、遺伝子発現系は抗体フラグメント、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖をコードする。抗体フラグメント、抗体重鎖及び／又は抗体軽鎖は、別々の発現カセットにコードされていてもよく、そのうちの少なくとも１つはクメルマイシン誘導性プロモーターの制御下にある。

【0092】

[00110]本明細書で使用する「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含むことを意図している。抗体は、組換え体由来であっても、及び／又はトランスジェニック動物で産生されていてもよい。本明細書で使用する「抗体フラグメント」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、それらの二量体、ミニボディ、ダイアボディ及び多量体、多特異的抗体フラグメント、並びにドメイン抗体を含むことが意図されるが、これらに限定されない。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント及び他のフラグメントは、組換えタンパク質として発現させることができる。

【0093】

[00111]基本的な抗体構造単位は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成される四量体を含むことが知られており、各対は１つの軽鎖（「Ｌ」）（約２５ｋＤａ）と１つの重鎖（「Ｈ」）（約５０～７０ｋＤａ）を有する。軽鎖のアミノ末端部分は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を形成し、重鎖のアミノ末端部分は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を形成する。ＶＨドメインとＶＬドメインは一緒になって抗体可変領域（Ｆｖ）を形成し、これは主に抗原認識／結合を担う。重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端部分は一緒になって、主にエフェクター機能を担う定常性領域を形成する。

【0094】

ＩＩＩ．方法
[00112]目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする本明細書に記載の発現系は、その中にコードされる１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性の産生のために哺乳動物細胞に導入し得る。したがって、本開示の一態様は、１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性の産生のための哺乳動物細胞を作製する方法であって、本方法は、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする本明細書に記載される発現系を哺乳動物細胞に導入するステップ、選択可能マーカーを細胞に導入するステップ、及び選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧を加えることにより、発現系を保有する細胞を選択することを含む。

【0095】

[00113]目的の１つ又は複数のＲＮＡ又はタンパク質の産生には、種々の哺乳動物細胞を使用することができる。適切な細胞は当該技術分野において周知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、幹細胞、及びニューロンを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞であり、任意選択で、米国特許第６，２１０，９２２号に記載されているような２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は懸濁液中で増殖される、及び／又は血清非存在下で増殖され得る。

【0096】

[00114]発現系は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって細胞に導入することができる。好適な方法としては、トランスフェクション、形質導入、感染、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ヌクレオフェクション、及びマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸構築物はトランスフェクションによって細胞に導入される。適切なトランスフェクション試薬は、当技術分野において周知であり、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオン性ポリマー、リポフェクタミン及び関連試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等のカチオン性脂質、並びにＦｕｇｅｎｅ及び関連試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の非リポソーム試薬又はリン酸カルシウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、発現系は、レンチウイルス、レトロウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルス等の適切なウイルスベクターを用いる形質導入によって細胞に導入し得る。

【0097】

[00115]発現系又はその構成要素が導入された細胞の選択を可能にするために、選択可能マーカーを、発現系と共に又は発現系の１つ若しくは複数の発現カセットと共に、細胞内に導入してもよい。本明細書で使用する「選択可能マーカー」という用語は、核酸構築物を保有する細胞に選択的な利点を与える核酸構築物中のエレメントを指す。例えば、選択可能マーカーは、発現され、特定の薬剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードし得る。或いは、選択可能マーカーは、発現され、特定の増殖条件下で細胞の生存能に必須なタンパク質をコードし得る。適切な選択マーカーは当業者には公知である。適切な薬剤選択可能マーカーの例には、ブラストサイジン耐性、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はピューロマイシン耐性が含まれる。

【0098】

[00116]選択可能マーカーは、発現カセットと同じ核酸分子上にあっても、又は異なる核酸分子上にあってもよい。選択可能マーカーが別の核酸分子上にある場合、選択可能マーカーを有する核酸分子は、他の核酸分子（複数可）よりも低い比又はパーセンテージ、例えば、１：４モル比、１：５モル比、若しくは１：１０モル比、又は例えば、全核酸の２５％、２０％、若しくは１０％で提供される。選択可能マーカーを取り込む細胞は、マーカーと共に導入される他の核酸、例えば発現系又はその構成要素を取り込んでいる可能性が高く、それによって発現系又はその構成要素を有する細胞の選択が可能になる。

【0099】

[00117]発現系の１つ又は複数の発現カセットを含む安定な細胞株は、１つ又は複数の発現カセットを含む個々の細胞を単離し、その細胞を培養して１つ又は複数の発現カセットを含む細胞集団を作製することによって作製することができる。したがって、一実施形態において、本方法は、個々の細胞を単離し、個々の細胞を培養して細胞集団を作製するステップをさらに含む。

【0100】

[00118]発現系の１つ又は複数の発現カセットを、同時に及び／又は逐次的に細胞に導入することができる。一例として、３つの発現カセットの全てを、単一のステップ（例えば、単一のトランスフェクション又は単一の形質導入）で細胞内に導入してもよい。或いは、第１及び第２の発現カセットを単一ステップで細胞に導入し、第３の発現カセット並びに任意選択で第４及び／又は第５の発現カセットをその後の１つ又は複数のステップで細胞に導入してもよい。或いは、各発現カセットを順次的に細胞に導入することもできる。したがって、一実施形態において、目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するための哺乳動物細胞を作製する方法は、発現系の第１の発現カセット及び第１の選択可能マーカーを哺乳動物細胞に導入するステップ；第１の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第１の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；第１の発現カセットを含む第１の個々の細胞を単離するステップ；第１の個々の細胞を培養して、第１の発現カセットを含む第１の細胞集団を得るステップ；第１の細胞集団の細胞に、発現系の第２の発現カセット及び第２の選択可能マーカーを導入するステップ；第２の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第２の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；第２の発現カセットを有する第２の個々の細胞を単離するステップ；第２の個々の細胞を培養して、第２の発現カセットを含む第２の細胞集団を得るステップ；発現系の第３の発現カセット及び第３の選択可能マーカーを第２の細胞集団の細胞に導入するステップ；第３の選択可能マーカーを保有する細胞を選択するために細胞に選択圧をかけることにより、第３の発現カセットを保有する細胞を選択するステップ；第３の発現カセットを保有する第３の個々の細胞を単離するステップ；並びに第３の個々の細胞を培養して、第３の発現カセットを保有する第３の細胞集団を得るステップを含む。

【0101】

[00119]本明細書に記載される発現系を含む哺乳動物細胞は、抗体又はウイルスベクター等の複雑な生物学的製剤の誘導性産生に使用することができる。したがって、一実施形態において、本方法は、さらなる構成要素をコードする１つ又は複数のさらなる発現カセットを細胞に導入するステップをさらに含む。さらなる発現カセットは、さらなる選択可能マーカー、及び／又は任意の他の発現カセット、及び／又は任意の他のさらなる構成要素と共に、細胞に導入することができる。例えば、発現系がウイルスベクターの誘導性産生のために使用される場合、さらなる構成要素は、目的の遺伝子（ＲＮＡ又はタンパク質をコードする）を有するウイルス構築物を含み得る。

【0102】

[00120]本明細書に記載される発現系は、そこにコードされる１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性産生のために使用され得る。したがって、本開示の一態様は、１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生を誘導する方法であって：ａ）目的のＲＮＡタンパク質をコードする本開示の発現系を含む哺乳動物細胞を得るステップ；ｂ）誘導性プロモーターからの発現を誘導するために、誘導剤を細胞の増殖培地に添加するステップ；及びｃ）目的のＲＮＡ又はタンパク質の産生のための条件下で細胞を培養し、それにより目的のＲＮＡ又はタンパク質を産生するステップ、を含む方法である。

【0103】

[00121]発現系は、クメート誘導性プロモーター及びクメルマイシン誘導性プロモーターを含む。したがって、適切な誘導剤としては、クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子が挙げられる。一実施形態において、クメートエフェクター分子はクメートである。任意の適切な濃度のクメートを使用してよく、例えば、約１～２００μｇ／ｍｌ、約５０～１５０μｇ／ｍｌ、又は任意選択で約１００μｇ／ｍｌである。一実施形態において、クメルマイシンエフェクター分子はクメルマイシンである。任意の適切な濃度のクメルマイシンを使用してよく、例えば、約１～３０ｎＭ、約５～２０ｎＭ、又は任意選択で約１０ｎＭである。クメートエフェクター分子及びクメルマイシンエフェクター分子は、ほぼ同時に、又は逐次的に、増殖培地に添加し得る。

【0104】

ＩＶ．組成物
[00122]本開示の発現系は、各々が核酸分子を含む３つ以上の発現カセットを含む。本明細書に記載の発現カセットは、１つ又は複数の核酸分子又は構築物として提供され得る。核酸分子又は構築物は、細胞の遺伝物質に組み込まれても、又はプラスミドに組み込まれてもよいことは理解される。したがって、一態様において、本明細書に記載の発現系の１つ又は複数の発現カセットは、発現系の発現カセット（複数可）を含む１つ若しくは複数のプラスミドの形態で、及び／又は発現系の１つ若しくは複数の発現カセットを含む細胞の形態で提供され得る。一実施形態において、１つ又は複数の発現カセットは、１つ又は複数のプラスミド上に提供される。一実施形態において、１つ又は複数の発現カセットは、細胞の遺伝物質に組み込まれ得る。

【0105】

[00123]本開示の別の態様は、目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性発現に有用な哺乳動物細胞を含む。したがって、一実施形態において、本開示は、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする本明細書に記載の発現系を含む哺乳動物細胞を提供する。本明細書で使用される場合、「発現カセットを含む細胞」、「発現系を含む細胞」、又は同様の句は、示される発現カセット又は発現系の核酸分子（複数可）が導入された細胞を意味する。核酸分子を細胞に導入する適切な方法は、当技術分野で周知である。

【0106】

[0124]一実施形態において、哺乳動物細胞は、ウイルスベクターの誘導性産生に有用である。したがって、一実施形態において、哺乳動物細胞は、ウイルスベクターの１つ又は複数の構成要素をコードするさらなる発現カセットを含む。一実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

【0107】

[00125]一実施形態において、哺乳動物細胞は、ウイルスベクターの構成要素をコードする発現カセットを含むウイルスパッケージング細胞である。一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、例えばレンチウイルスＲＥＶ、Ｇａｇ／ｐｏｌ、及び／又はＶＳＶｇ、任意選択でＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌ等のウイルスエンベロープタンパク質をコードする発現カセットを含むレンチウイルスパッケージング細胞である。一実施形態では、ウイルスパッケージング細胞は、例えばＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ７８、又はＲｅｐ４０若しくはＲｅｐ５２のうちの少なくとも１つと、Ｒｅｐ６８若しくはＲｅｐ７８のうちの少なくとも１つとの組合せをコードする発現カセットを含むＡＡＶパッケージング細胞である。例えば、発現系は、Ｒｅｐ４０とＲｅｐ６８、Ｒｅｐ４０とＲｅｐ７８、Ｒｅｐ５２とＲｅｐ６８、又はＲｅｐ５２とＲｅｐ７８を含み得る。

【0108】

[00126]ウイルス構築物はＤＮＡ又はＲＮＡから作製され、それらが由来するウイルス（レンチウイルス、レトロウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルス等）の遺伝物質の一部を含む。ウイルス構築物は、目的の組換えタンパク質又はＲＮＡを産生する目的の遺伝子を保有し、送達するように改変されており、例えば、細胞治療及び遺伝子治療による病気の治療並びにワクチン接種に用いることができる。ウイルス構築物は、細胞培養物において組換えタンパク質やＲＮＡを産生する目的の遺伝子を導入するためにも使用できる。適切なウイルス構築物は当技術分野で周知であり、使用されるウイルスベクターやウイルスの種類によって異なる。したがって、一実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、目的の遺伝子を保有するウイルス構築物をさらに含む。ウイルス構築物の種類は、使用されるウイルスパッケージング細胞（又はウイルスベクター）に依存する。例えば、ウイルスパッケージング細胞がレンチウイルスパッケージング細胞である場合、ウイルス構築物はレンチウイルス構築物である。ウイルスパッケージング細胞がＡＡＶパッケージング細胞である場合、ウイルス構築物はＡＡＶ構築物である。

【0109】

[0127]一実施形態において、哺乳動物細胞は抗体の誘導性産生に有用である。したがって、一実施形態において、哺乳動物細胞は、抗体の１つ又は複数のさらなる構成要素をコードする発現カセットを含む。

【0110】

[00128]１つ又は複数の目的のＲＮＡ又はタンパク質のカスタマイズ可能な発現のための可撓性ツールを提供するために、哺乳動物細胞は、本明細書に記載の発現系の一部のみを含んでいてもよい。例えば、哺乳動物細胞は、本明細書に記載の発現系の第１及び第２の発現カセットを含む「発現準備」細胞であってもよい。第３の発現カセットは、例えば、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードするようにユーザーによってカスタマイズされ得るプラスミドに組み込まれ、目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性産生用の細胞を作製するために発現準備細胞に導入され得る。

【0111】

Ｖ．キット
[00129]本明細書に記載の発現系は、目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性発現のためのキットとして提供され得る。したがって、一態様には、目的のＲＮＡ又はタンパク質の誘導性発現のためのキットが含まれる。一実施形態において、キットは、本開示の発現系をコードするプラスミドを含む。別の実施形態において、キットは、本開示の発現系及び１つ又は複数の誘導剤を含む細胞を含む。さらなる実施形態において、キットは、発現系の第１及び第２の発現カセットを含む「発現準備」細胞、並びにクメルマイシン誘導性プロモーター、クローニング部位及びポリアデニル化シグナルを含むプラスミド並びに／又は第３の発現カセットを含むプラスミドを含む。

【0112】

[00130]発現系がウイルスベクターを産生する場合、キットは、ウイルスベクターの構成要素をコードする本開示の発現系を含むウイルスパッケージング細胞、及び適切なウイルス構築物を含み得る。

【実施例】

【0113】

[00131]以下の非限定的な例は、本開示を例示するものである：
ＶＩ．実施例
[00132]本開示において、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）由来の細胞株等の細胞株を、クメート遺伝子スイッチのリプレッサー（ＣｙｍＲとして知られている）及びクメルマイシンキメラトランスアクチベーター（λＲ－ＧｙｒＢ）を産生するように操作した。ＨＥＫ２９３由来の２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞を本明細書では使用したが、これは、スケールアップを容易にすること及び規制遵守のために、無血清培地中において懸濁培養で増殖するためである。得られた細胞株は、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢと呼ばれる（図１）。

【0114】

[0133]誘導前（Ｏｆｆ）と誘導後（Ｏｎ）の遺伝子発現のＯｎ／Ｏｆｆ比を比較することによって決定されるように、クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチによってもたらされる誘導レベルは、リプレッサー構成のクメート遺伝子スイッチと比較して１３０倍高く、逆トランスアクチベーター構成のクメート遺伝子スイッチと比較して３０倍高かった（図５）。

【0115】

[00134]本明細書では、レンチウイルス（ＬＶ）由来のウイルスベクターのパッケージング細胞及び産生細胞の作製に用いることにより、複雑な生物学的製剤を製造するための新規クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの有用性を示す。ＬＶは遺伝子治療及び細胞治療の応用において非常に重要なベクターである（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，２０１１；Ｅｓｃｏｒｓ ａｎｄ Ｂｒｅｃｋｐｏｔ，２０１０；Ｍａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．）。本明細書で記載するＬＶのパッケージング細胞及び産生細胞は、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞に由来し、懸濁培養及び無血清培地での増殖が可能である。ＬＶを産生するためには、細胞は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のエンベロープ糖タンパク質及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ／ｐｏｌ遺伝子によってコードされるプロテアーゼ等の細胞毒性タンパク質を産生する必要がある。これらの遺伝子エレメントを含む細胞は、非常に厳密に制御された誘導性遺伝子発現系を用いることによってのみ構築することができる。

【0116】

[0135]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のパッケージング細胞の作製も本明細書で記載する。ＡＡＶは、遺伝子治療及び細胞治療の用途のためのもう１つの重要なウイルスベクターである（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ａｎｄ Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ，２０１４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，２０１４；Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｗｅｉｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｎ，２０１１）。より具体的には、ＡＡＶの高細胞毒性Ｒｅｐタンパク質を発現する細胞株（２９３ＳＦ－Ｒｅｐ）を構築するためのクメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの使用が、本明細書で実証される。Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶの複製及び組立てに必須である。本明細書で示すように、２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞は、クメート及びクメルマイシンで誘導した後、ＡＡＶを産生することができた。

【0117】

実施例１．２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢの構築
[00136]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞株を作製するための最初のステップは、クメート遺伝子スイッチのリプレッサーを発現する安定な細胞株（２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ）を構築することであった。

【0118】

２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ細胞株（クローン１９８－２）の構築
[00137]無血清懸濁培養に適応したＨＥＫ２９３細胞のクローン（クローン２９３ＳＦ－３Ｆ６（Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８））を、ＣｙｍＲ遺伝子のレシピエントとして使用した。簡単に述べると、この細胞をＣＭＶ５プロモーターによって制御されるＣｙｍＲ遺伝子をコードするプラスミド（図２Ａ）（本明細書で開示する第１の発現カセットの一例）及びピューロマイシン耐性をコードするプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を９６ウェルプレートでピューロマイシンの存在下で希釈した。耐性コロニーを摘出し、増幅した。ＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターで調節されたＧＦＰを発現するＬＶ（ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、図３Ａ）でクローンに形質導入することにより、クローン中のＣｙｍＲの存在を試験した。ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰを形質導入し、クメートで誘導した後のＧＦＰ発現レベルは、蛍光顕微鏡で可視化するか、又はフローサイトメトリーで誘導細胞と非誘導細胞を比較することによって定量化した（Ｏｎ／Ｏｆｆ比）。Ｏｎ／Ｏｆｆ比が最も良好なクローンを増殖させ、バンク化した（誘導もＬＶ処理もしていない細胞集団のサブセットを、細胞増殖及び細胞バンク化に使用した）。次に、Ｏｎ／Ｏｆｆ比の最も良いクローン（＃１６９と＃１９８）を、半固形培地中で低細胞密度でプレーティングしてサブクローニングした。その後、よく分離されたコロニーを、前述（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）のように、ロボット型セルピッカー（ＡＬＳ セルコレクター（ＣｅｌｌＣｅｌｌｅｃｔｏｒ）（商標））を用いて摘出した。サブクローンを増幅し、ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰで細胞を形質導入することにより、ＣｙｍＲの遺伝子発現調節能を試験した。最良のサブクローンの１つをクローン１９８－２と呼ぶ。

【0119】

２９３－ＣｙｍＲ細胞へのλＲ－ＧｙｒＢの挿入
[00138]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ細胞（クローン１９８－２）に、ＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターによって制御されるλＲ－ＧｙｒＢトランスアクチベーターをコードするプラスミド（図２Ｂ）（本明細書で開示される第２の発現カセットの一例）及びブラストサイジン耐性をコードするプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を９６ウェルプレートにブラストサイジンの存在下でプレーティングした。耐性コロニーを摘出し、増幅し、１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬプロモーターで制御されたＧＦＰを発現するＬＶ（ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ、図３Ｂ）を形質導入することにより、λＲ－ＧｙｒＢの存在について検査した。クメートとクメルマイシンで誘導した後、フローサイトメトリーでＧＦＰ発現を測定し、最高のＯｎ／Ｏｆｆ比に基づいて最良のクローンを選択した。最良のクローンを増幅し、上記のようにバンク化した。９６ウェルプレートで限界希釈してサブクローニングした。コロニーを摘出、増殖させ、ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰを形質導入して、誘導後にフローサイトメトリーで分析することにより、上記のようにλＲ－ＧｙｒＢの存在について試験した。
クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチはクメート遺伝子スイッチよりも良好な誘導レベルを提供する

【0120】

[00139]ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰで形質導入した後の２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢの最良のクローンのうちの３つのＯｎ／Ｏｆｆ比を試験することにより、クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの有効性を評価した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲの最良クローン（上述）と２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡの最良クローンで得られたＯｎ／Ｏｆｆ比も比較のために試験した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡのクローンは、２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞にＣＭＶで制御されるＣｙｍＲをコードするプラスミドとＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターで制御される逆トランスアクチベーターｒｃＴＡをコードするプラスミドをトランスフェクションし（図２Ｃ）、上記のように両遺伝子を染色体に安定に組み込んだクローンを単離することにより作製した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡの場合、クメートの添加はｒｃＴＡ遺伝子の転写を活性化する（ＣｙｍＲによる阻害を解除することによる）。合成後、ｒｃＴＡはＣＲ５プロモーターに結合し、転写を活性化する（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）（図４）。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡクローンを構築するために使用されたステップの詳細な説明は、材料及び方法と題されたセクションに示す。

【0121】

[00140]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡクローンのＯｎ／Ｏｆｆ比を、それぞれＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ及びＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰを細胞に形質導入し、誘導後にフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現レベルを測定することにより試験した。ＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰはＣＲ５プロモーターによって制御されるＧＦＰ遺伝子を保有する（図３Ｃ）。観察されたＯｎ／Ｏｆｆ比は、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ、及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンでそれぞれ約３０、１００、及び４０００であった（図５）。ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢを発現している細胞では、ＣｙｍＲのみを発現している細胞、又はＣｙｍＲ／ｒｃＴＡの組合せを発現している細胞と比較して、Ｏｎ／Ｏｆｆ比が１３０倍（４０００／３０）及び４０倍（４０００／１００）高いという事実は、クメート／クメルマイシンスイッチがはるかに優れた誘導レベルを提供することを示す。

【0122】

実施例２．ＬＶ産生のためのパッケージング細胞の構築
[00141]複雑な生物学的産物を産生するためのクメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの有用性を示す一つの例として、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンの一つを用いて、ＬＶを産生するための誘導性パッケージング細胞株を構築した。ＬＶは、がん又は遺伝性疾患を治療するために患者に送達される細胞を遺伝子改変するために使用されるため、細胞治療にとって極めて重要である（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，２０１１；Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，２０１８）。細胞治療の分野における課題の１つは、臨床応用に必要な量の良質なＬＶを合理的なコストで適時に産生することである。

【0123】

[00142]ＬＶの産生を容易にするための１つの解決策は、ＬＶの組立てに必要な遺伝的エレメントを全て含むパッケージング細胞を構築することである。第３世代ＬＶの場合、ＬＶを産生するために３つの遺伝子が必要である：Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ及びエンベロープタンパク質（Ｃｏｃｋｒｅｌｌ ａｎｄ Ｋａｆｒｉ，２００７；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，２０１１；Ｐｌｕｔａ ａｎｄ Ｋａｃｐｒｚａｋ，２００９）。最も一般的に使用されるエンベロープタンパク質はＶＳＶｇである。パッケージング細胞株が利用できるようになったこのｔにより、科学者はトランスフェクションを行う必要なく、ＬＶを産生できる安定した産生クローンを作成することができる。一過性のトランスフェクションに比べ、産生クローンの利点は、再現性及び簡便性（トランスフェクション及びプラスミドの調製が不要）である。懸濁培養に適応したパッケージング細胞の利用は、ＬＶ産生のスケールアップを大幅に促進する。加えて、無血清培地を使用することで、より安全でより特性決定された生成物が得られ、これによりｃＧＭＰ製造が容易になる。

【0124】

[00143]ＬＶを産生するのに必要な遺伝子（Ｇａｇ／ｐｏｌとＶＳＶｇ）の一部は細胞毒性があるため、宿主細胞を殺すことを回避するように、細胞増殖と細胞バンク化中は厳密にｏｆｆにしなければならない。このため、ＬＶのパッケージング細胞の構築の成功は、効率的な誘導性発現系を用いることによってのみ可能であった（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｆａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋａｆｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐａｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓａｎｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｐａｒａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0125】

[00144]パッケージング細胞を作製するための第１のステップは、Ｒｅｖ、Ｇａｇ／ｐｏｌ及びＶＳＶｇ遺伝子を保有するプラスミドを構築することであった。まず、ＲｅｖとＶＳＶｇの転写が１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬプロモーターによって制御されるプラスミドを構築した（図６及び１５）。Ｇａｇ／Ｐｏｌの発現については、２つの異なるプロモーター：１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ及びＣＡＧプロモーターを試験した（図６及び１６）。ＣＡＧはアクチンプロモーターにＣＭＶエンハンサーを融合した強力な構成的ハイブリッドプロモーターである（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。後者の場合、Ｇａｇ／ｐｏｌが強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって制御されているにもかかわらず、Ｒｅｖタンパク質の非存在下では、そのｍＲＮＡは細胞質に輸送されず、ポリタンパク質に翻訳されない。このため、Ｇａｇ／ｐｏｌポリペプチドの産生にはＲｅｖの存在が必要である。したがって、Ｒｅｖ遺伝子の転写は間接的にＧａｇ／ｐｏｌポリペプチドの合成を制御している。

【0126】

[00145]パッケージング細胞を産生するために２つの戦略が採用された。最初の戦略では、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞を、１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇ－Ｇａｇ／Ｐｏｌ、１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｖ、１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ（本明細書で開示する第３、第４及び第５発現のカセットの例）のプラスミド、及びネオマイシンに対する耐性をコードする第４のプラスミド（本明細書で開示する選択可能マーカーの一例）でトランスフェクションした。第２の戦略では、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞を、ＣＡＧ－Ｇａｇ／Ｐｏｌ、１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｖ、１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ、及びハイグロマイシンに対する耐性をコードするプラスミド（本明細書で開示する選択可能マーカーの他の例）でトランスフェクションした。

【0127】

[00146]トランスフェクション後、選択剤を細胞培養培地に添加した。耐性細胞のプールをナノウェルに希釈してクローニングした。単一細胞に由来する耐性コロニー（プレーティング時に写真撮影して記録した）を、ロボット型セルピッカー（セルコレクター（商標））を用いて単離し、３８４ウェルプレートに移した。その後、細胞を増殖させ、ＬＶの産生について試験した。

【0128】

[00147]パッケージング細胞のクローンを、ＣＭＶによって制御されるＧＦＰを発現するＬＶをコードするプラスミド（ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ）（図３Ｄ）（本明細書に開示されるレンチウイルス構築物の一例）でトランスフェクションすることによって、ＬＶの産生についてスクリーニングした。トランスフェクションされなかった細胞のサブ集団は、最良のクローンの増幅及び細胞バンク化のために保持した。一過性トランスフェクション後に産生されたＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの力価は、ＨＥＫ２９３細胞への形質導入後、フローサイトメトリーで測定した。ＣＡＧ－Ｇａｇ／Ｐｏｌプラスミド又は１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ－Ｇａｇ／Ｐｏｌプラスミドを用いたいずれの戦略も、培養培地１ｍｌ当たり１．０Ｘ１０^６形質導入単位（ＴＵ）を上回る力価を有するパッケージング細胞を作製することができた。いくつかのクローンは、１．０Ｘ１０^７ ＴＵ／ｍｌを超える力価も産生した。（図７）。クメートスイッチのみで構築したパッケージング細胞を用いてＬＶを産生するクローンを単離する以前の試みは失敗に終わった（図示せず）。
実施例３．ＬＶの安定産生体の構築
[00148]パッケージング細胞（クローン３Ｄ４（図７Ｂ））を用いて、一過性トランスフェクションを必要とせずにＬＶを産生する能力を有する産生クローンを作製した。簡単に述べると、パッケージング細胞３Ｄ４を、ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰをコードするプラスミド（図３Ｄ）とネオマイシン耐性をコードするプラスミドで共トランスフェクションした。トランスフェクション後、選択剤（ネオマイシン）を細胞に添加し、ネオマイシン耐性コロニーをナノウェルプレートに希釈してクローニングした。ロボット型セルピッカー（セルコレクター（商標））を用いてコロニーを単離し、３８４ウェルプレートに移した。クローンを増殖させ、誘導剤（クメート及びクメルマイシン）を添加してＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの産生を試験した。ＨＥＫ２９３細胞への形質導入後、フローサイトメトリーでＬＶを滴定した。いくつかのクローンは、培養培地中で１．０Ｘ１０^８ ＴＵ／ｍｌの範囲でＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰを産生することができた（図８）。

【0129】

パッケージング細胞における遺伝子発現の調節
[00149]ＬＶのパッケージング細胞におけるクメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの有効性を確認するために、ＬＶの産生に必要な遺伝的エレメント（Ｒｅｖ、Ｇａｇ及びＶＳＶｇ）の発現を、誘導の前後でウェスタンブロットにより解析した。予想通り、Ｒｅｖ、Ｇａｇ及びＶＳＶｇの発現は、クメート及びクメルマイシンの添加後に強く誘導され（図９）、誘導前には検出された発現は非常に弱いか、又は全く発現していなかった。

【0130】

実施例４．ＡＡＶ産生のためのパッケージング細胞の構築
[00150]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のウイルスベクターを産生するための１つの一般的な方法は、機能的ＡＡＶ粒子を組み立てるのに必要なエレメントを保有する３つのプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによるものである（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ａｎｄ Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ，２０１４；Ｇｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２０１２；Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｗｒｉｇｈｔ，２００９）。プラスミドは：ｉ）ＡＡＶによって送達される遺伝子（ウイルス構築物）を保有する発現プラスミド、ｉｉ）アデノウイルス由来の必須ヘルパー遺伝子をコードするヘルパープラスミド、及びｉｉｉ）ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子を含むＲｅｐ－Ｃａｐプラスミドである。ＲｅｐはＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングに関与する４つのタンパク質（Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、及びＲｅｐ７８）を産生する。ＣａｐはＡＡＶのキャプシドを構成する構造タンパク質をコードしている。ＡＡＶの産生を容易にする１つの可能性のあるアプローチは、ＬＶの場合のように、ＡＡＶの産生に必要なエレメントを含むパッケージング細胞を使用することであり得る。しかし、Ｒｅｐは細胞毒性タンパク質をコードしているため、ＡＡＶのパッケージング細胞を作製することは難しい。クメート／クメルマイシン遺伝子スイッチの有用性及び有効性をさらに証明するものとして、この遺伝子スイッチの制御下でＲｅｐタンパク質を産生するＡＡＶ用パッケージング細胞（２９３ＳＦ－Ｒｅｐ）が構築された。２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を用いたＡＡＶの産生も実証された。

【0131】

[00151]２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を構築するために、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ細胞に、１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬプロモーター（図１０Ａ）によって各々調節されるＲｅｐ５２をコードするプラスミド、Ｒｅｐ６８をコードするプラスミド及びＲｅｐ７８をコードするプラスミド（本明細書で開示する第３、第４及び第５の発現カセットの例）、並びにハイグロマイシン耐性をコードするプラスミド（本明細書で開示する選択可能マーカーの例）をトランスフェクションした。本実験では、Ｒｅｐ４０のプラスミドは含まれなかったが、これはＲｅｐ４０はＲｅｐ５２の存在下でＡＡＶを産生するのに必須ではないためである（Ｃｈａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。トランスフェクション後、培養培地にハイグロマイシンを添加し、ハイグロマイシン耐性プールを作製し、９６ウェルプレートで限界希釈してクローニングした。ハイグロマイシン耐性コロニーを単離して増殖させ、３つのプラスミド：Ｃａｐ用（ｐＣＭＶ－ＣＡＰ）、アデノウイルスヘルパー遺伝子用（ｐＨｅｌｐｅｒ）、及びＣＭＶプロモーターで調節されるＧＦＰを有する発現プラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で一過性トランスフェクションすることによってＡＡＶの産生を試験した（図１０ｂ）。産生されたＡＡＶの量は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にＡＡＶを形質導入し、蛍光顕微鏡を用いて半定量的に、又はフローサイトメトリーで定量的に、ＧＦＰ陽性細胞の割合をスコア化することで測定した。ＡＡＶを産生する能力を有するクローンを増幅し、バンク化した（トランスフェクションも誘導もしていない細胞のサブ集団をこの目的に使用した）。クメート及びクメルマイシンによる誘導後、Ｒｅｐタンパク質の産生が、これらのクローンのいくつかについてウェスタンブロットで証明された（図１１）。クローン１３からのＡＡＶ産生を、プラスミドの比率を変えて検討した（図１２）。いくつかの条件下で、クローン１３は一過性トランスフェクションにより、１ｍｌ当たり２．５Ｘ１０^７個のＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ）を産生することができた。誘導がない場合、産生されたＡＡＶの量はこの方法の感度を下回った。

【0132】

材料及び方法
プラスミド構築
[00152]プラスミドは分子生物学の標準的方法を用いて構築し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で増幅した後、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてクロマトグラフィーにより精製した。精製後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０ｎｍでプラスミド濃度を測定した。プラスミドの完全性は制限酵素による消化で確認した。このプロジェクトに必要なプラスミドは、以下に記載するように作製した。

【0133】

[00153]ｐＢｌａｓｔ：ｐＵＣ５７にクローニングされたブラストサイジン耐性遺伝子の発現カセットの配列は、遺伝子合成会社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に注文した。

【0134】

[00154]ｐＨｙｇｒｏ：ｐＵＣ５７にクローニングされたハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットの配列は、遺伝子合成会社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に注文した。

【0135】

[00155]ｐｋＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｍｃｓ；このプラスミドは、ｐｋＣＭＶ５－ＣｕＯ－Ｒｅｖ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）から制限酵素で消化することによりＲｅｖ遺伝子を除去して作製した。

【0136】

[00156]ｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡ－Ｈｙｇｒｏ：ｐＡｄｅｎｏｖａｔｏｒＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡからＢｌｐＩ及びＳｗａＩ消化によりｒｃＴＡ配列（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）を除去し、ＫｐｎＩ（平滑化）及びＢｌｐＩ消化によりｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－Ｒｅｖ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）のＲｅｖ配列の置換に使用し、これによってｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡプラスミドを作製した。ハイグロマイシン発現カセットを、ＮｒｕＩ及びＢｓｓＨＩＩでの消化によりｐＭＰＧ－ＣＭＶ５－ＣｙｍＲｏｐｔ－Ｈｙｇｒｏ（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）から除去し、末端を埋めて、事前にＡｆｌＩＩで消化して埋めておいたｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡプラスミドにライゲーションした。

【0137】

[00157]ｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－λＲ－ＧｙｒＢ：λＲ－ＧｙｒＢ配列を、ＮｄｅＩ及びＤｒａＩ消化によってｐＧｙｒｂ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）から除去し、末端を埋めた。λＲ－ＧｙｒＢ配列を含むＤＮＡフラグメントを用いてｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－Ｒｅｖ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）のＲｅｖ配列を置換した。

【0138】

[00158]ｐＬＶＲ２－ＣＲ５－ＧＦＰ：ｐＲＲＬ．ｃｐｐｔ．ＣＲ５－ＧＦＰ．ＷＰＲＥ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）からのＬＶベクター配列（ＲＳＶからＧＦＰ）を、ＳｐｈＩ及びＳａｌＩでの消化によりＬＶＲ２－ＧＦＰプラスミド（Ｖｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２）に移した。

【0139】

[00159]９＿ＳＧ＿ｐＭＡ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－Ｐｒｏｔｅａｓｅ：このプラスミドはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に注文した。これは１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎプロモーターの制御下にあるアデノウイルスプロテアーゼ配列を含む。

【0140】

[00160]ｐＭＥ＿００５（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－ＶＳＶｇ－Ｑ９６－Ｉ５７Ｌ）：ｐＮＮ０２のＣＭＶ５プロモーターを、ｐＶＲ１０（下記参照）から増幅した１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎフラグメントで置換した。配列決定により、得られたプラスミドは１２コピーの代わりに１３コピーのｌａｍｂｄａＯＰを有することが明らかになった。

【0141】

[00161]ｐＭＰＧ－ＣＭＶ５－ＣｙｍＲ：ハイグロマイシン発現カセットをＮｒｕＩ／ＡｓｃＩ（埋込み）消化によりｐＭＰＧ－ＣＭＶ５－ＣｙｍＲｏｐｔ－Ｈｙｇｒｏ（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）から除去し、プラスミドをライゲーションして再環状化した。

【0142】

[00162]ｐＭＰＧ－Ｐｕｒｏ：プラスミドｐＴＴ５４（Ｐｏｕｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）からピューロマイシン発現カセットを単離し、インサートを含まないｐＭＰＧ（Ｇｅｒｖａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）由来のプラスミドに挿入した。

【0143】

[00163]ｐＮＮ０２（ｐＶＶ－ＣＭＶ５－ＶＳＶｇ－Ｑ９６－Ｉ５７Ｌ）：このプラスミドを構築するために、最初にｐＴＴ５ベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）からＤＳ及びＦＲ配列を含むＢｇｌＩＩ／ＢｂｓＩ断片を除去し、末端を埋め、プラスミドを再環状化することによりｐＶＶ－ＣＭＶ５を作製した。次に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文したＶＳＶｇ遺伝子（配列番号１９に示すＶＳＶｇ－Ｑ９６－１５７Ｌ、配列番号２０に示すアミノ酸遺伝子バンクのアクセッション番号ＡＢＤ７３１２３．１に基づいてコドン最適化されている）をｐＶＶ－ＣＭＶ５のＰｍｅＩ部位にクローニングした。

【0144】

[00164]ｐＮＲＣ－ＬＶ１（ｐＮＣ１０９）：レンチウイルスベクター（図３参照、発現カセット［ＣＭＶ－ＧＦＰ］なし）の完全な骨格を含む３つのＤＮＡフラグメントを、遺伝子合成会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注文し、次いでギブソンアセンブリーによって、ｐＭＫ（ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）由来のクローニングベクターに結合した。得られたプラスミドをｐＢＶ３と呼ぶ。より高い力価を得るために、フラグメント（ＣＭＶ５’ＵＴＲ－ＨＩＶ－１Ψ－ＲＲＥ－ｃＰＰＴ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＲ８２２２０１．１）を遺伝子合成会社（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に注文し、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化によりｐＢＶ３の相同領域を置換するために使用した。

【0145】

[00165]ｐＮＲＣ－ＬＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰｑ（ｐＮＣ１１１）：ＣＭＶ－ＧＦＰをｐＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ＧＦＰｑ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）からＰＣＲにより増幅し、ゴールデンゲートアセンブリによりＥｓｐ３Ｉ部位を有するｐＮＲＣ－ＬＶ１に導入した。

【0146】

[00166]ｐＳＢ１７８（ｐＫＣＲ５－ＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌ）及びｐＳＢ１７４（ｐＫＣＲ５－Ｒｅｖ）は共に、ＣＭＶ－Ｂ４３カセットをクメートスイッチ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）からのＣＲ５プロモーターに置換するように改変されたｐＫＣＭＶ－Ｂ４３ベクター（Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に由来する。 ＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌ（配列番号１９、これは配列番号２０に示すようにアミノ酸遺伝子バンクのアクセッション番号ＡＢＤ７３１２３．１に基づいてコドン最適化されている）及びＲｅｖ（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３８１９．３）の配列を遺伝子合成会社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に注文し、ＣＲ５プロモーターの下流にクローニングしてそれぞれｐＳＢ１７８及びｐＳＢ１７４を作製した。

【0147】

[00167]ｐＳＢ１８９（ｐｋＣＭＶ５－ｈｂｇｄｅｌｔａ－Ｇａｇ／ｐｏｌ２）：Ｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子（ＨＩＶ－１完全ゲノムＧｅｎｅ ｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３８１９．３）及びヒトβグロビンのイントロンの一部（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋアクセッションＭＫ４７６５０３．１）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文した。両フラグメントを、ＣＭＶ－Ｂ４３カセットをＣＭＶ５プロモーター（Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ）に置き換えることによって改変したｐＫＣＭＶ－Ｂ４３（Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）由来のプラスミドにクローニングした。クローニングの間、ＣＭＶ５のイントロンの一部をヒトβグロビンのイントロン配列で置換した。

【0148】

[00168]ｐＳＢ２０１（ｐＭＰＧ／ＴＫ＊／Ｎｅｏ）：このプラスミドは、ｐＭＰＧ／ＴＫ＊ｎｅｏ／ＣｙｍＲ－ｎｌｓ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）からＡｓｃＩ消化によりＣｙｍＲ－ｎｌｓカセットを除去することにより作製した。

【0149】

[00169]ｐＳＢ２１１（ｐＣＡＧ－Ｇａｇ／ｐｏｌＩＩＩｂ）：Ｇａｇ／Ｐｏｌｌｌｂ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５４１６１７．１）を遺伝子合成会社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に注文し、ＣＭＶ－Ｂ４３カセットをＣＡＧプロモーター（Ｂｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に置換することにより改変されたｐＫＣＭＶ－Ｂ４３（Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）由来のプラスミドにクローニングした。

【0150】

[00170]ｐＳＢ２１３（ｐ１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ－Ｇａｇ／ｐｏｌＩＩＩｂ）：１２ｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎプロモーターとイントロンをＢａｍＨＩ（埋込み）で消化することによりｐＶＲ２８から抽出し、ＸｈｏＩ（埋込み）及びＥｃｏＲＩ（埋込み）で消化することによりｐＳＢ２１１（ｐＣＡＧ－Ｇａｇ／ｐｏｌＩＩＩｂ）のＣＡＧプロモーターを置換するために使用した。プロモーターの塩基配列を決定した結果、クローニング中に１つのｌａｍｂｄａＯｐリピートが失われ、プロモーターには（１２ではなく）１１のｌａｍｂｄａＯｐ反復が残っていると考えられた。得られたプロモーター（１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ）の概略図を図１６に示す。

【0151】

[00171]ｐＴｅｔ０７－ＣＭＶ５－ＣｕＯ－ＧＦＰ：ＣＭＶ５－ＣｕＯ配列を、最初にｐＲＲＬ．ｃｔｐｔ．ＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）から抽出し、ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、末端を埋め、事前にＸｂａＩで消化し、平滑化させたｐＮＥＢ１９３ｍｃｓ（ＮＥＢ）にライゲーションすることによってｐＮＥＢ－ＣＭＶ５－ＣｕＯを作製した。次に、ｐＮＥＢ－ＣＭＶ５－ＣｕＯからのＣＭＶ５－ＣｕＯ配列を、両方のＤＮＡをＰａｃＩ及びＢｌｐＩで消化した後、ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－５－ＧＦＰ（以下に記載）にライゲーションした。

【0152】

[00172]ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ｍｃｓ：プラスミドＬＶＲ２－ＧＦＰ（Ｖｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２）を、ＸｈｏＩ部位にＢｓｐＥＩリンカー（ＴＣＧＡＴＣＣＧＣＡ）を挿入することによって最初に改変した。次いで、Ｔｅｔ０７オペレーターを含む３’ＬＴＲを、ＢｓｐＥＩ及びＰｍｅＩで消化することによりこの構築物から除去し、ＢｓｐＥＩ及びＢｓｍＩで予め消化した（事前に平滑化した）ｐＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ｍｃｓ（Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）にライゲーションした。

【0153】

[00173]ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ｍｃｓ：ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－５－ｍｃｓのＣＲ５プロモーターをＰａｃＩ及びＡｇｅＩで消化して除去し、空のＬＶ骨格を作製した。

【0154】

[00174]ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－５－ｍｃｓ及びｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－５－ＧＦＰ：Ｔｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ｍｃｓ及びＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）からのＣＭＶプロモーターをＣＲ５プロモーターに置換し、将来の構築物においてプロモーターを容易に変更するために、ＰａｃＩ部位をプロモーターの５’末端に挿入した。簡単に説明すると、まずｐＣＳＩＩ－ＣＭＶ ｍｃｓ （Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）由来のプラスミドを鋳型として用いて、第１のＣＭＶプロモーターのＳｎａｂＩ部位（５’ＬＴＲの５’末端）からｃｐｐｔ配列までの部分をカバーするＰＣＲ断片を増幅した。２回目のＰＣＲは、ｐＲＲＬ．ｃｐｐｔ．ＣＲ５－ＧＦＰ．ＷＰＲＥ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）からＣＲ５プロモーターを増幅するために行った。第１のフラグメントの３’末端と第２のフラグメントの５’末端にＰａｃＩ部位を挿入した。ＰＣＲ産物をアニールし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、５’ＬＴＲの５’にあるＣＭＶからｍｃｓまでの部分を一緒にカバーする１つのフラグメントを生成した。このフラグメントをＳｎａｂＩ及びＡｇｅＩで消化し、Ｔｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ｍｃｓ及びＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドに挿入した。配列決定により、ＣＲ５プロモーターの６つのＣｕＯコピーのうち５つがクローニング中に欠失したことが明らかになった。

【0155】

[00175]ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑ：ｐＶＲ９からの１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑ配列を、ＢａｍＨＩで消化することにより最初にｐＵＣ１９に挿入し、これによりｐＵＣ１９－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑを作製した。次に、１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑ配列を、ＥｃｏＲＩで消化した後、Ｔｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ｍｃｓにライゲーションした。

【0156】

[00176]ｐＶＲ１（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯ－ＴＰＬ－ＭＣｓ）：１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯプロモーターをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ１に注文し、ｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－ＭＳＣのＣＭＶ－ＣｕＯプロモーター領域をＫｐｎＩ／ＡｇｅＩで消化することにより置換した。

【0157】

[00177]ｐＶＲ２：（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯ－ｍｓｃ－ＰｏｌｙＡ）は、ＣＭＶ５－ＣｕＯプロモーターの代わりに、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成された１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＡＴＡ－ＣｕＯをｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｍｃｓのＡｃｃ６５Ｉ／ＢｇｌＩＩ部位に導入することにより作製した。

【0158】

[00178]ｐＶＲ５（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑ）：ｐＡｄ－ＣＭＶ５－ＧＦＰｑ（Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ）をＢａｍＨＩで消化して得たＧＦＰ遺伝子を、ＢｇｌＩＩで消化したｐＶＲ１にライゲーションした。

【0159】

[00179]ｐＶＲ６（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯ－ＧＦＰｑ）：ＢａｍＨＩで消化したｐＡｄＣＭＶ５－ＧＦＰｑ（Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ）からのＧＦＰｑを、ＢｇｌＩＩで消化したｐＶＲ２にサブクローニングすることにより得られた。

【0160】

[00180]ｐＶＲ９（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰｑ）：９＿ＳＧ＿ｐＭＡ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－Ｐｒｏｔｅａｓｅの１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎプロモーターをＰＣＲで増幅し、予めＡｇｅＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＶＲ５に挿入し、ｐＶＲ５の１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯフラグメントを置換した。

【0161】

[00181]ｐＶＲ１０（ｐＫＣ＿１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－ＧＦＰ）：ｐＶＲ６のＫｐｎＩ－ＡｇｅＩフラグメント（１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣｕＯを含む）を、９＿ＳＧ＿ｐＭＡ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－Ｐｒｏｔｅａｓｅを鋳型として事前にＰＣＲで増幅した、同様に消化した１２ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎフラグメントと置換することにより作製した。

【0162】

[00182]ｐＶＲ１７（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－ＭＣＳ）：ｐＭＥ＿００５からＣＭＶｍｉｎ－ＶＳＶｇフラグメントをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより除去し、プラスミドｐＶＲ１０を鋳型として用いることによってＰＣＲにより得られたＣＭＶｍｉｎプロモーターを含むＤＮＡフラグメントで置換することにより得た。

【0163】

[00183]ｐＶＲ１９（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ＿Ｉ５７Ｌ）：ｐＳＢ１７８からのＶＳＶｇ（ＴＰＬ－ＶＳＶｇ）のｃＤＮＡを含むＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを同様に消化したｐＶＲ１７（ｐＶＶ－１３ｌａｍｂｄａ－ＣＭＶｍｉｎ－ｍｃｓ）にサブクローニングすることにより得た。

【0164】

[00184]ｐＶＲ２１（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｖ）：ｐＳＢ１７４からのＲｅｖ配列（ＴＰＬ－Ｒｅｖ）を、ＳｔｕＩ／ＮｈｅＩ制限部位を用いてｐＶＲ１７にサブクローニングすることにより得た。

【0165】

[00185]ｐＶＲ２８（ｐＫ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ＿ｅｘ＿Ｇａｇ－Ｐｏｌ）：ＣＭＶプロモーター／エンハンサー及びＴＰＬをコードするｐＳＢ１８９のＡｆｌＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＶＲ９からの１２ｘｌａｍｂｄａプロモーター及びＴＰＬを含むＡｆｌＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントで置換した。

【0166】

[00186]ｐＶＲ４１、ｐＶＲ４２、ｐＶＲ４３及びｐＶＲ４４：１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬプロモーターの制御下に置かれた、それぞれＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ２遺伝子を含むプラスミド。プラスミドは以下のように作製した：Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするヒト最適化ＡＡＶ２遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔで合成し、それぞれをｐＵＣ５７のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし、１８＿ＳＧ、１９＿ＳＧ、２０＿ＳＧ及び２１＿ＳＧを作製した。Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８配列内の内部Ｐ１９プロモーターのＴＡＴＡボックスは、ＴＡＴＴＴＡＡＧＣ配列をＴＡＣＣＴＣＴＣＡ配列に変更することにより、その活性を低下させるように改変した。ｐＵＣ５７－ＲｅｐクローンをＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、Ｒｅｐ遺伝子をコードするフラグメントをＶＳＶｇの代わりに同様に消化したｐＶＲ１９（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ）にサブクローニングし、ｐＶＲ４１（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｐ７８）、ｐＶＲ４２（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｐ６８）、ｐＶＲ４３（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｐ５２）及びｐＶＲ４４（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｐ４０）を得た。

【0167】

[00187]ｐＶＲ４６－Ｃａｐ：ＣＭＶ５プロモーターによって調整されるＡＡＶ２のＣＡＰ遺伝子をコードする。このプラスミドを構築するために、ＡＡＶ２のＣＡＰ遺伝子とその上流の非翻訳領域をｐＴＴ３のＣＭＶ５プロモーター（Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ，１９９８ａ）の後にクローニングすることによってｐＴＴ３ＣＡＰ１を生成した。ＣＭＶ５プロモーターのスプライスアクセプター部位とＣａｐ遺伝子のスプライスドナー部位をＡｌｅＩ／ＳｗａＩで消化し、末端をライゲーションすることにより除去した。

【0168】

細胞培養
[00188]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡを、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＳＦＭ４－Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。半固形培地でのサブクローニングは、クローナセル（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ）（商標）ＦＬＥＸ ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２ｘ ＳＦＭ４－Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、６ｍＭ Ｌ－グルタミン、２．５％クローナセル（商標）ＡＣＦ ＣＨＯ補充物質（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の混合物で行った。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢは、６ｍＭ Ｌ－グルタミンと１０ｍｇ／ｍｌ ｒＴｒａｎｓｆｅｒｉｎ（Ｂｉｏｇｅｍｓ）を添加したＬｏｗ－Ｃａｌｃｉｕｍ－ＳＦＭ培地（ＬＣ－ＳＦＭ）（Ｇｉｂｃｏ）で展開し、ＳＦＭ４－Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３で懸濁増殖させた。細胞株２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＢ－Ｌ及び２９３ＳＦ－ＬＶＰＩＩＩＢ－ＧＦＰは、６ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１０ｍｇ／ｍｌ ｒＴｒａｎｓｆｅｒｉｎを補充した５０％ ＬＣ－ＳＦＭと、４ｍＭ Ｌ－グルタミン及び０．１％コリフォア（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ）（登録商標）を補充した５０％ハイセル（Ｈｙｃｅｌｌ）（商標）ＴｒａｎｓＦｘ－Ｈ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）の混合物で展開し、１００％ハイセル（商標）ＴｒａｎｓＦｘ－Ｈ中で懸濁維持した。懸濁培養の場合、細胞はシェイクフラスコで１１０ｒｐｍで培養した。２９３Ａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、２９３ｒｔＴＡ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）及び２９３ｒｃＴＡ（Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）は、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。全ての細胞株は、３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気で維持した。

【0169】

レンチウイルスの産生及び滴定
[00189]ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ及びＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰを、２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶ＃２９－６を用いて、以前に記載されたように（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ）、ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－ＣＭＶ５－ＣｕＯ－ＧＦＰ、ｐＴｅｔ０７－ＣＳＩＩ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ及びｐＬＶＲ２－ＣＲ５－ＧＦＰをそれぞれ用いて、ＬＣ－ＳＭＦ＋１％ＦＢＳ中、静置条件でトランスフェクションし、ドキシサイクリン１μｇ／ｍＬ及びクメート５０μｇ／ｍＬを添加することにより産生した。産生されたＬＶをスクロースクッション上で超遠心して濃縮し（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）、懸濁液を用いて新鮮な２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶ ＃２９－６を形質導入し、各ＬＶについて産生細胞株のプールを作製した。このプールをＬＣ－ＳＦＭ＋１％ＦＢＳ中で懸濁増幅し、ドキシサイクリン１μｇ／ｍＬ及びクメート５０μｇ／ｍＬを添加してＬＶ産生を誘導した。産生されたＬＶは４８時間後及び７２時間後に採取し、スクロースクッション上で超遠心して濃縮し、－８０℃で凍結した。ＬＶのＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ、１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ、及びＣＲ５－ＧＦＰを、それぞれ２９３Ａ、２９３ｒｔＴＡ、２９３ｒｃＴＡ細胞に形質導入して滴定し、ＧＦＰ発現細胞の割合を以前に記載されているようにフローサイトメトリーで解析した（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0170】

細胞株の作製
２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ
[00190]ＳＦＭ４－ＴｒａｎｓＦｘ－２９３で増殖させた２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞株（Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を、リポフェクタミン（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＭＰＧ－ＣＭＶ５－ＣｙｍＲ－ｏｐｔ及びｐＭＰＧ－Ｐｕｒｏを９：１のＤＮＡ比を用いてトランスフェクションションした。両ＤＮＡは事前にＭｆｅＩで消化した。４８時間後、細胞を０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＳＦＭ４－Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３培地で５，０００細胞／ウェル及び１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに希釈した。選択された細胞クローンは、１０００細胞／ｍｌと３０００細胞／ｍｌで半固形培地にプレーティングしてサブクローニングした。ロボット型セルピッカーセルコレクター（商標）（ＡＬＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてコロニーを単離し、９６ウェルプレートに移した。ＣｙｍＲの存在についてクローンをスクリーニングするため、各クローンを２つの集団に分けた。一方の集団はＧＦＰ発現の解析に使用し、他方の集団はクローン増殖及びバンク化のためにそのまま残した。ＣＭＶ５ＣｕＯプロモーターで調節されたＧＦＰを発現するＬＶ（ＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ）を形質導入した後、クローンのＧＦＰ発現を解析した。形質導入は最初に９６ウェルプレートで行い、クメート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μｇ／ｍｌで細胞に誘導した。クローンをＧＦＰ強度について選択し、次にＯｎ／Ｏｆｆ条件下（誘導剤あり、及びなし）でのＧＦＰ発現について２回目のスクリーニングを行った。

【0171】

２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ－ｒｃＴＡ
[00191]２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞を、リポフェクタミン（商標）２０００ ＣＤを用いて、ｐＭＰＧ－ＣＭＶ５－ＣｙｍＲ－ｏｐｔプラスミド及びｐＭＰＧ－Ｐｕｒｏプラスミド（比９：１）でトランスフェクションした。両ＤＮＡは事前にＭｆｅＩで消化した。２日後、０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下、細胞を９６ウェルプレートでウェル当たり５０００細胞と１００００細胞に希釈した。ピューロマイシン耐性のコロニーを４８ウェル又は２４ウェルプレートに移した。細胞が５０～８０％のコンフルエントに達した時点で、２５ｃｍ^２のフラスコにまとめて５つの異なるプール（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）を形成した。この時点から、ピューロマイシンは培地に添加しなかった。プールを混合してプールＣＤＥＦＧを形成した。

【0172】

[00192]プールＣＤＥＦＧを、ＰＥＩプロ（ＰＥＩｐｒｏ）（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて、直鎖化（ＸｍｎＩ）ｐｋＣＭＶ５－ＣｕＯ－ｒｃＴＡ－Ｈｙｇｒｏプラスミドの１：１複合体でトランスフェクションした。２４時間培養後、細胞を２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含む培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に９６ウェルプレートで１ウェル当たり１５００細胞ずつ移した。コロニーをプールし、遠心分離し、２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む新鮮培地に再懸濁し、異なるミニプール（ＡからＨの文字）を形成した。

【0173】

[00193]プールＣ、Ｆ、Ｇ及びＨを完全に分散した細胞として半固形培地にプレーティングした。半固形培地中のコロニーを、自動化ＴｉＳＳＭ法（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｅｍｉ－Ｓｏｌｉｄ Ｍｅｄｉｕｍ）によりｒｃＴＡの存在及びレベルについてスクリーニングし、陽性のコロニーをセルセレクター（商標）により９６ウェルプレート中で単離した。簡単に言えば、コロニーはセルセレクター（商標）を用いたスキャンによって同定された。ＰＥＩ ＭＡＸ（登録商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＣＲ５プロモーター制御下でＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質をコードするレポータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の３：１複合体（ｐｋＣＲ５．ＤｓＲｅｄ）をセルセレクター（商標）ロボットアームで各コロニーに沈着させた。トランスフェクション後２４時間で、コロニーからの基本的なＤｓＲｅｄ蛍光を検出するためのスキャンを行った（ＯＦＦレベル）。その後、クメート誘導剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ．２６８４０２、Ｌｏｔ Ｎｏ．１３６１３ＨＢ）を最終濃度１００μｇ／ｍＬで含む液体ＳＦＭ４培地オーバーレイを半固体培地層上に塗布し、一晩拡散させた。トランスフェクション後４８時間（誘導後２４時間）に、ＤｓＲｅｄ蛍光（ＯＮレベル）を測定するために２回目のスキャンを行った。その後、ＯＦＦとＯＮの画像を比較し、高誘導特性を持つコロニーを同定し、これらのコロニーをセルセレクター（商標）で摘出し、個々のウェル（９６ウェルプレート）に沈着させた。ＴｉＳＳＭから単離されたクローンは、徐々に２４ウェルプレート及び２５ｃｍ^２フラスコに移した後、バンク化した。

【0174】

２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢ
[00194]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ（クローン１９８－２）を、ＰＥＩプロ（登録商標）によりプラスミドｐＫＣＭＶ５－ＣｕＯ－λＲ－ＧｙｒＢ及びｐＢｌａｓｔを９：１のＤＮＡ比でトランスフェクションした。ＤＮＡは予めそれぞれＸｍｎＩとＸｂａＩで消化した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を７μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｅｎｚｏ）を含むＬＣ－ＳＦＭ培地で希釈し、１０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに移した。１週間後、ブラストサイジンの濃度を１０μｇ／ｍｌに高めた。選択したクローンは、ＬＣ－ＳＦＭ培地で０．３細胞／ウェル及び１．０細胞／ウェルに９６ウェルで限界希釈し、選択せずにサブクローニングした。遺伝子発現を調節する能力についてクローンをスクリーニングするため、各クローンを２つの集団に分けた。一方の集団はＧＦＰ発現の解析に用い、他方の集団はクローン増殖及びバンク化のために未改変のままとした。クローンは、１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬで調節されたＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰ）で導入した後、ＧＦＰ発現を解析した。形質導入は最初に９６ウェルプレートで行い、１００μｇ／ｍｌのクメート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１０ｎＭのクメルマイシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞を誘導した。クローンをＧＦＰ強度について選択し、次にＯｎ／Ｏｆｆ条件下（誘導剤あり、及びなし）でのＧＦＰ発現について２回目のスクリーニングを行った。

【0175】

[00195]クメートスイッチ及びクメート／クメルマイシンスイッチの誘導能の比較
[00196]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｒｙＢのクローンを、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下、レンチウイルスベクターで形質導入した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ及び２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／ｒｃＴＡを、それぞれ２０ＴＵのＭＯＩでＬＶ－ＣＭＶ５ＣｕＯ－ＧＦＰ及びＬＶ－ＣＲ５－ＧＦＰで形質導入し、翌日１００μｇ／ｍｌのクメートの添加により細胞を誘導した。２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローンには、ＬＶ－１２ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＧＦＰを５ＴＵのＭＯＩで導入し、翌日１００μｇ／ｍｌのクメート及び１０ｎＭのクメルマイシンを添加して細胞を誘導した。細胞は固定し、形質導入７２時間後のフローサイトメトリー解析のために処理した。

【0176】

レンチウイルスベクター（２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＡ）用のパッケージング細胞
[00197]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローン７－２を、ＰＥＩプロ（登録商標）を用いて懸濁液中でｐＳＢ２１３（ｐ１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ－Ｇａｇ／ｐｏｌＩＩＩｂ）、ｐＶＲ１９（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌ）、ｐＶＲ２１（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｖ）及びｐＨｙｇｒｏをそれぞれ４０％、２５％、２５％及び１０％のＤＮＡ比でトランスフェクションした。プラスミドはそれぞれＢｓｐＨＩ、ＺｒａＩ、ＸｍｎＩ、及びＸｍｎＩで消化した。トランスフェクション３６時間後で、細胞を６５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む培地で０．３５ｘ１０^６細胞／ｍｌに希釈した。４日及び８日後、細胞をナノウェル（ＡＬＳ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４．７細胞／ナノウェル、ハイグロマイシン濃度５０μｇ／ｍｌでプレーティングした。懸濁液中での選択を並行して続けた。２０５個（懸濁液中で４日間選択）及び１７１個（懸濁液中で８日間選択）の耐性コロニーをプールし、２つの異なるミニプールを形成した。このミニプールと懸濁液で得られたプールを、細胞密度０．６細胞／ナノウェルでナノウェルプレートに希釈してクローニングした。ナノウェル中の単離された細胞は、セルセレクター（商標）（ロボットセルピッカー）のカメラシステムを用いて、０日目に記録された。合計３６６個のコロニーがセルセレクター（商標）を用いて単離され、３８４ウェルプレートに移された。

【0177】

レンチウイルスベクター（２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＢ）用のパッケージング細胞
[00198]２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢクローン７－２を、ｐＳＢ２１１（ｐＣＡＧ－Ｇａｇ／ｐｏｌＩＩＩｂ）、ｐＶＲ１９（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－ＶＳＶｇ－Ｑ９６Ｈ－Ｉ５７Ｌ）、ｐＶＲ２１（ｐＶＶ－１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ－Ｒｅｖ）及びｐＨｙｇｒｏをそれぞれ４０％、２５％、２５％及び１０％のＤＮＡ比で用いて、ＰＥＩプロ（登録商標）で懸濁液中にトランスフェクションした。プラスミドはそれぞれＢｓｐＨＩ、ＺｒａＩ、ＸｍｎＩ、及びＸｍｎＩで消化した。トランスフェクション３６時間後で、細胞を８０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む培地で０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌに希釈した。８日後、細胞をナノウェルプレートに１．４細胞／ナノウェル、ハイグロマイシン濃度５０又は２５μｇ／ｍｌでプレーティングした。１７３の耐性コロニーをプールしてミニプールを形成した。このミニプールは６日後、２０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加した培地で、細胞密度０．６細胞／ナノウェルでＮａｎｏｗｅｌｌプレートに希釈してクローニングした。ナノウェル中の単一細胞の存在を示す写真は、セルセレクター（商標）（ロボットセルピッカー）のカメラシステムを用いて０日目に得た。セルセレクター（商標）を用いて３４８個のコロニーを単離し、３８４ウェルプレートに移した。

【0178】

レンチウイルスベクター（２９３ＳＦ－ＬＶＰＩＩＩＢ－ＧＦＰ）の産生細胞
[00199]パッケージング細胞２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＢ、クローン３Ｄ４を、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）を用いて、プラスミドｐＮＣ１１１（ｐＮＲＣ－ＬＶ１－ＣＭＶＧＦＰ）及びｐＳＢ２０１（ｐＭＰＧ／ＴＫｎｅｏ）をＤＮＡ比４：１で懸濁液中でトランスフェクションした。プラスミドは事前にそれぞれＦｓｐＩ及びＸｂａＩで消化した。トランスフェクション３６時間後で、細胞を４００μｇ／ｍＬのｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地で０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌに希釈した。選択培養１８日後、細胞を０．６細胞／ナノウェル（Ｇ４１８なし）の細胞密度でナノウェルにクローニングするために希釈した。セルセレクター（商標）のカメラシステムを用いて、ナノウェル中の単一細胞の存在を示す写真を０日目に得た。セルセレクター（商標）を用いて３８０個のコロニーを単離し、３８４ウェルプレートに移した。

【0179】

パッケージング細胞（２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＡ、２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＢ）及び産生細胞（２９３ＳＦ－ＬＶＰＩＩＩＢ－ＧＦＰ）からのクローンのスクリーニング
[00200]ＧＦＰを発現するレンチウイルス（ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ）の産生についてクローンを分析した。最初に９６ウェルプレートで、次に２４ウェルプレートで、最後に６ウェルプレート懸濁液で試験した。パッケージング細胞からのクローンをｐＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）でトランスフェクションし、クメート／クメルマイシン及び酪酸ナトリウムを添加して誘導した。産生クローン（２９３ＳＦ－ＬＶＰＩＩＩＢ－ＧＦＰ）はトランスフェクションせず、クメート／クメルマイシン及び酪酸ナトリウムで誘導した。産生されたＬＶ（ＬＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ）は、２９３Ａ細胞の形質導入により滴定し、ＧＦＰレベルは、９６ウェルプレート及び２４ウェルプレートで産生されたＬＶについては蛍光顕微鏡観察により評価し、６ウェルプレートで産生されたＬＶについてはフローサイトメトリーにより滴定した（Ｂｒｏｕｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0180】

Ｇａｇ／ｐｏｌ、ＶＳＶｇ及びＲＥＶのウェスタンブロッティング
[00201]２９３ＳＦ－ＰａｃＬＶＩＩＩＢ、クローン３Ｄ４からの細胞を、ｐ２４、ＶＳＶｇ及びＲＥＶタンパク質の発現についてウェスタンブロットで試験した。誘導の当日、２５００万個の細胞を遠心分離し、１２５ｍｌの振盪フラスコ中で最終濃度１．０ｘ１０^６細胞／ｍＬになるように２５ｍｌのハイセル（商標）培地に再懸濁した。誘導は１時間後に８０μｇ／ｍｌのクメート及び１０ｎＭのクメルマイシンを用いて行った。陰性対照として、５００万個の２９３ＳＦＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙＲＢ細胞を遠心分離し、－８０℃に移した。誘導１８時間後に８ｍＭの酪酸ナトリウムを添加した群と添加しなかった２つの細胞群を調製した。誘導の０、２４、４８、７２時間後に細胞培養物５ｍｌを採取した。遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを－８０℃に移した。ウェスタンブロット解析のために、細胞を解凍し、ＲＩＰＡ緩衝剤（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ－４０、０．２５％デオキシコール酸Ｎａ）で溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、サンプルを超音波処理し、ライセートを遠心分離で清澄化した。タンパク質濃度はＢＩＯ－ＲＡＤ ＤＣ（商標）ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。同量の総タンパク質をＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、抗ＨＩＶ１ ＲＥＶマウスモノクローナル抗体（ａｂ８５５２９、ａｂｃａｍ）、ウサギポリクローナルＨＩＶ ｐ２４ Ａｂ（ＰｒｏＳｃｉカタログ＃７３１３）、ウサギポリクローナル抗ＶＳＶｇタグ抗体（ａｂ８３１９６、ａｂｃａｍ）、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ抗体又は西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いてウェスタンブロッティングで解析した。シグナルは、ＥＣＬ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ）を用いて化学発光により明らかにし、デジタルイメージングシステム（イメージカント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）（商標）ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析した。

【0181】

２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞の作製
[00202]４ｍＭのグルタミンと０．１％のコリフォア（登録商標）を添加したハイセル（商標）培地中で、ＰＥＩプロ（登録商標）を用いて、２９３ＳＦ－ＣｙｍＲ／λＲ－ＧｙｒＢにｐＶＲ４３、ｐＶＲ４２、ｐＶＲ４１及びｐＵＣ５７－ＴＫ－Ｈｙｇｒｏをそれぞれ５５％、３０％、１５％、及び１０％の割合でトランスフェクションすることにより、Ｒｅｐ５２、６８、７８を発現する細胞のプールを作製した。トランスフェクションの前に、ＲｅｐをコードするプラスミドはＳｐｅＩで直鎖化し、ｐＵＣ５７－ＴＫ－ＨｙｇｒｏはＸｍｎＩで直鎖化した。トランスフェクション４８時間後に、細胞を遠心分離し、ハイグロマイシン（４０又は５０μｇ／ｍｌ）を含む培地に再懸濁し、最終濃度を０．５ ｘ １０^６細胞／ｍｌとした。生存率及び細胞増殖は定期的にモニターした。約３週間培養したプールの細胞から、少量の凍結バイアルバンクを作製した。

【0182】

[00203]細胞バンクの１バイアルを、４ｍＭのグルタミン及び０．１％のコリフォア（登録商標）を添加しハイセル（商標）培地で、選択なしに解凍した。解凍の２日後に４０μｇ／ｍＬの選択ハイグロマイシンを添加した。９６ウェルプレートでサブクローニングを行う前に、細胞を選択培地で３倍に希釈した。サブクローニングは選択なしの２種類の培地：４ｍＭのグルタミンと０．１％のコリフォア（登録商標）を添加したハイセル（商標）と、６ｍＭのグルタミン及び１０ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを添加したＨＳＦＭで行った。

【0183】

[00204]９６ウェルのコロニーを２４ウェルプレートに移した。ウェルがコンフルエントになった時点で、細胞集団の３分の１を別の２４ウェルプレートに移し、一過性トランスフェクションによるＡＡＶの産生を試験した。トランスフェクションでは、培養液を新しい培地に交換し、１μｇ／ｍｌのプラスミドと２μｇ／ｍｌのＰＥＩプロ（登録商標）を用いて細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションは、ｐｔｔ３ＣＡＰ１、ｐＨｅｌｐｅｒ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂ）、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂ）の混合物を用いて行った。誘導はトランスフェクションの４時間後に５０μｇ／ｍｌのクメートと１０ｎＭのクメルマイシンで行った。採取はトランスフェクションの７２時間後に行い、バランＣＤ、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）培地を用いて２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞でＡＡＶの標準遺伝子移入アッセイ（以下に記載）を用いて滴定を行った。ＡＡＶを産生できるクローンを増幅し、凍結細胞のバイアルを調製した。

【0184】

Ｒｅｐ発現のウェスタンブロット解析
[00205]２９３ＳＦ－Ｒｅｐクローン（＃１３、１８、３５及び３６）の細胞を４０μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンを添加したハイセル（商標）培地で培養した。クローンを、誘導なし、又は異なる濃度のクメート及びクメルマイシンで誘導した後、ＲＥＰタンパク質の存在についてウェスタンブロットで試験した。２５０万個の細胞を遠心分離し、６ウェルプレートに１．０ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２．５ｍｌの新しいハイセル（商標）培地に再懸濁した。細胞を次の濃度のクメート（μｇ／ｍｌ）とクメルマイシン（ｎＭ）で誘導した：０．５μｇ／ｍｌ／１ｎＭ；５μｇ／ｍｌ／１ｎＭ；又は５０μｇ／ｍｌ／１０ｎＭ。細胞培養物は、誘導７２時間後に遠心分離によって回収し、細胞ペレットを－８０℃に移した。細胞ペレットを解凍し、３００μｌのＲＩＰＡ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＳＤＳ，１％ ＮＰ－４０，０．２５％デオキシコール酸 Ｎａ）を用いて溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、サンプルを超音波処理し、溶解液を遠心分離で清澄化した。タンパク質濃度は、ＢＩＯ－ＲＡＤ ＤＣ（商標）ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。同量の総タンパク質（３０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動し、マウスモノクローナルＩｇＧ１抗－ＲＥＰ ＡＡＶ（ＡＲＰ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号０３－６１０６９）、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いたウェスタンブロッティングで解析した。シグナルはＥＣＬ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ）を用いて化学発光で明らかにし、デジタル画像システム（イメージカント（商標）ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析した。

【0185】

２９ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を用いたＡＡＶの産生及び遺伝子移入アッセイ
[00206]２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞（クローン１３）を遠心分離（３００×ｇ、５分間）してハイグロマイシン（クローンの選択を維持するために使用）を除去し、トランスフェクションの２時間前にハイセル（商標）ＴｒａｎｓＦｘ－Ｈ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に再懸濁し、６ウェルプレートで最終密度が１．０×１０^６細胞／ｍＬになるようにした。細胞懸濁液を、１μｇ／ｍＬのＤＮＡ（Ｃｅｌｌ ＢｉｏｌａｂｓのｐＡＡＶ－ＧＦＰとｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＶＲ４６－Ｃａｐを異なる比率で使用）及び２μｇ／ｍＬのＰＥＩプロ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いてトランスフェクションし（図１２）、４時間インキュベートした後誘導剤を添加した。両誘導剤とのプラスミド混合物を調製し、最終濃度がクメルマイシン１０ｎＭ及びクメート５０μｇ／ｍＬになるようにトランスフェクションした細胞に添加した。誘導された細胞は、３日間インキュベートした後、最終濃度２ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１％のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５ Ｕ／ｍＬのベンゾネーゼ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の溶解溶液で溶解した。溶解２時間後、ウイルス粒子を安定化させるためにＭｇＳＯ４を最終濃度３７．５ｍＭで添加した。溶解した細胞を１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を採取して凍結した。バランＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の細胞を用いて、産生されたＡＡＶの力価を測定した。２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を１２ウェルプレートに０．５ ｘ １０^６細胞／ｍＬでプレーティングし、ルシフェラーゼ（ＨＤ－ＬＵＣ、ΔＥ１、ΔＥ３）をコードする組換えアデノウイルスベクター（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．２００１）にＭＯＩ５で感染させた。ＡＡＶを含む細胞溶解液を１：１０から１：３００に希釈し、感染細胞に添加した。２４時間インキュベートした後、全細胞密度と生存率を記録し、２９３ＳＦ－Ｒｅｐ細胞を２％ホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）で固定し、フローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）））で解析した。単一細胞のＧＦＰ％（１０，０００イベント）を用いて、希釈倍率を考慮した感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ）／ｍＬの力価を算出した。

【0186】

[00207]本出願は実施例を参照して説明してきたが、特許請求の範囲は実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではなく、全体として本明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることを理解されたい。

【0187】

[00151]全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願における用語が、参照により本明細書に組み込まれる文書において異なるように定義されていることが判明した場合、本明細書において提供される定義が、その用語の定義として機能する。

【0188】

配列表
ＣｙｍＲ遺伝子（配列番号１）シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）
ATGAGCCCCAAGAGGAGAACCCAGGCCGAGAGAGCCATGGAGACCCAGGGCAAGCTGATCGCCGCTGCCCTGGGCGTGCTGAGAGAGAAGGGCTACGCCGGCTTCAGAATCGCCGACGTGCCTGGAGCCGCCGGAGTGAGCAGAGGCGCCCAGAGCCACCACTTCCCTACCAAGCTGGAGCTGCTGCTGGCCACCTTCGAGTGGCTGTACGAGCAGATCACCGAGAGGAGCAGAGCCAGACTGGCCAAGCTGAAGCCCGAGGACGATGTGATCCAGCAGATGCTGGATGATGCCGCCGAGTTCTTCCTGGACGACGACTTCAGCATCAGCCTGGACCTGATCGTGGCCGCCGACAGAGACCCCGCCCTGAGAGAGGGCATCCAGAGGACCGTGGAGCGGAACAGATTCGTGGTGGAGGACATGTGGCTGGGAGTGCTGGTGTCCAGAGGCCTGAGCAGAGATGACGCCGAGGACATCCTGTGGCTGATCTTCAACTCTGTGAGGGGCCTGGCTGTGAGAAGCCTGTGGCAGAAGGACAAGGAGAGATTCGAGAGAGTGCGGAACAGCACCCTGGAGATCGCCAGAGAGCGCTACGCCAAGTTTAAACGGTGA

【0189】

ＣｙｍＲタンパク質（配列番号２）シュードモナス・プチダ
MSPKRRTQAERAMETQGKLIAAALGVLREKGYAGFRIADVPGAAGVSRGAQSHHFPTKLELLLATFEWLYEQITERSRARLAKLKPEDDVIQQMLDDAAEFFLDDDFSISLDLIVAADRDPALREGIQRTVERNRFVVEDMWLGVLVSRGLSRDDAEDILWLIFNSVRGLAVRSLWQKDKERFERVRNSTLEIARERYAKFKR*

【0190】

ＣＭＶ５－ＣｕＯ（配列番号３）由来のＣｕＯ（Ｐ２）シュードモナス・プチダ
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTA

【0191】

ＣｕＯ（Ｐ１）（配列番号４）シュードモナス・プチダ
AGAAACAAACCAACCTGTCTGTATTA

【0192】

ＣＭＶ５－ＣｕＯ（配列番号５）合成
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCAAGCTTGCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAACCGGTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTACCGGTGTTTAGTGAACCGGGCGCGCCTCATATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCCAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCC

【0193】

１ｘｌａｍｂｄａＯＰ（配列番号６）バクテリオファージ
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAG

【0194】

１２ｘｌａｍｂｄａＯＰ（配列番号７）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAG

【0195】

１３ｘｌａｍｂｄａＯＰ（配列番号８）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAG

【0196】

１２ｘｌａｍｂｄａＣＭＶｍｉｎ（配列番号９）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGACTCTAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCT

【0197】

１３ｘｌａｍｂｄａＣＭＶｍｉｎ（配列番号１０）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGACTCTAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCT

【0198】

１３ｘｌａｍｂｄａ－ＴＰＬ（配列番号１１）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGACTCTAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCC

【0199】

１１ｘｌａｍｂｄａ－ｈｂｇｍｉｎ（配列番号１２）合成
TCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGAGTTTACCTCTGGCGGTGATAGTCGACTCTAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCAACCTAAGCTTCCAACCGGTGTTTAGTGAACCGGGCGCGCCTCATATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTAACGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTC

【0200】

λＲ－ＧｙｒＢ遺伝子（配列番号１３）合成
ATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAAGCAATTTATGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGGGCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTATAACGCCGCATTGCTTGCAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAAATCTACGAGATGTATGAAGCGGTTGGGATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTGAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGGGTAGATATCTCGAATTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCCCGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGCGGCCCATGGATGGGCCCTAAAAAGAAGCGTAAAGTCGCCATCGATCAGCTCACCATGGTGTTTCCTTCTGGGCAGATCTCAAACCAGGCCCTGGCCTTAGCACCGTCCTCTGCCCCAGTCCTTGCCCAGACCATGGTCCCTTCCTCAGCCATGGTACCTCTGGCTCAGCCCCCAGCTCCTGCCCCAGTTCTAACCCCGGGTCCTCCCCAGTCCCTGTCTGCACCTGTTCCAAAGAGCACCCAGGCTGGGGAAGGCACGCTGTCGGAAGCCCTGCTGCACCTGCAGTTTGATGCTGATGAAGACTTGGGGGCCTTGCTTGGCAACAGCACAGACCCAGGAGTGTTCACAGACCTGGCATCTGTGGACAACTCAGAGTTTCAGCAGCTCCTGAACCAGGGTGTGTCCATGTCTCACTCCACAGCTGAGCCCATGCTGATGGAGTACCCTGAAGCTATAACTCGCCTGGTGACAGGGTCCCAGAGGCCCCCTGACCCAGCTCCCACACCCCTGGGGACCTCGGGGCTTCCCAATGGTCTCTCCGGAGATGAAGACTTCTCCTCCATTGCGGACATGGACTTCTCTGCTCTGCTGAGTCAGATCAGCTCCAGCGGCCAATAA

【0201】

λＲ－ＧｙｒＢタンパク質（配列番号１４）合成
MSTKKKPLTQEQLEDARRLKAIYEKKKNELGLSQESVADKMGMGQSGVGALFNGINALNAYNAALLAKILKVSVEEFSPSIAREIYEMYEAVGMQPSLRSEYEYPVFSHVQAGMFSPELRTFTKGDAERWVDISNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGGPWMGPKKKRKVAIDQLTMVFPSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQ

【0202】

マウスＮＦ－κＢのｐ６５サブ単位のＣ末端部分（配列番号１５）
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS

【0203】

ウサギβ－グロビンポリＡ（配列番号１６）
AATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCA

【0204】

ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリＡ（配列番号１７）
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG

【0205】

ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル（配列番号１８）シミアンウイルス４０
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA

【0206】

コドン最適化ＶＳＶｇ－Ｑ９６－１５７Ｌ（配列番号１９）合成
ATGAAATGTCTGCTGTACCTGGCATTCCTGTTTATCGGAGTCAACTGCAAGTTTACTATCGTCTTCCCCCACAATCAGAAAGGCAATTGGAAGAACGTGCCAAGCAATTACCACTATTGCCCCAGCTCCTCTGACCTGAACTGGCATAATGATCTGATCGGCACCGCCCTGCAGGTCAAGATGCCCAAATCCCACAAGGCCATCCAGGCTGACGGGTGGATGTGCCATGCTTCTAAATGGGTGACCACATGTGACTTCCGGTGGTACGGACCAAAGTATATCACTCATAGCATTCGCTCCTTCACCCCCTCCGTGGAGCAGTGCAAAGAGTCTATTGAACAGACCAAGCAGGGGACATGGCTGAACCCTGGATTTCCCCCTCAGTCCTGTGGGTACGCCACAGTCACTGACGCTGAGGCAGTGATCGTCCAGGTGACACCACACCATGTCCTGGTGGACGAGTATACTGGGGAATGGGTGGATTCACAGTTCATTAACGGAAAATGCAGCAATTACATCTGTCCTACAGTCCACAACTCTACTACCTGGCATAGTGATTATAAGGTGAAAGGCCTGTGCGATAGCAATCTGATCTCCATGGACATTACTTTCTTTAGTGAGGATGGCGAACTGAGTTCACTGGGGAAGGAGGGAACCGGCTTTCGGAGCAATTACTTCGCATATGAAACAGGCGGGAAAGCCTGCAAGATGCAGTACTGTAAACACTGGGGAGTCCGCCTGCCATCTGGCGTGTGGTTCGAGATGGCAGACAAGGATCTGTTTGCCGCTGCACGATTCCCAGAGTGCCCCGAAGGCAGCTCCATCTCTGCCCCCAGTCAGACTTCAGTGGACGTGAGCCTGATTCAGGATGTGGAGAGAATCCTGGACTACAGTCTGTGCCAGGAAACCTGGTCAAAAATTAGGGCTGGCCTGCCTATCTCACCAGTGGACCTGAGCTATCTGGCTCCCAAAAACCCTGGGACTGGACCCGCCTTCACCATCATTAATGGGACACTGAAGTACTTCGAGACCCGGTATATCAGAGTGGACATTGCCGCTCCTATCCTGAGCCGAATGGTGGGCATGATCTCCGGGACAACTACCGAGCGGGAACTGTGGGACGATTGGGCTCCTTACGAGGATGTCGAAATTGGACCAAACGGCGTGCTGAGGACATCTAGTGGCTACAAATTTCCTCTGTATATGATCGGCCACGGGATGCTGGACTCTGATCTGCATCTGTCAAGCAAGGCACAGGTGTTCGAGCACCCCCATATCCAGGACGCAGCCTCTCAGCTGCCTGACGATGAAAGTCTGTTCTTTGGGGATACCGGACTGAGCAAAAATCCAATTGAGCTGGTGGAAGGATGGTTTTCCTCTTGGAAGAGTTCAATCGCCTCCTTCTTTTTCATCATTGGACTGATCATTGGCCTGTTCCTGGTCCTGCGGGTGGGCATTCACCTGTGCATCAAGCTGAAACATACCAAGAAAAGACAGATTTACACCGACATTGAGATGAACAGACTGGGCAAGTGA

【0207】

ＶＳＶｇ－Ｑ９６－１５７Ｌアミノ酸（配列番号２０）水疱性口内炎ウイルス
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK*

【0208】

参考文献
Balakrishnan, B., and G.R. Jayandharan.2014. Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.Curr. Gene Ther. 14:86-100.
Blain, M., Y. Zeng, M. Bendjelloul, P.L.Hallauer, A. Kumar, K.E. Hastings, G. Karpati, B. Massie, and R. Gilbert. 2010.Strong muscle-specific regulatory cassettes based on multiple copies of thehuman slow troponin I gene upstream enhancer. Hum. Gene Ther. 21:127-134.
Broussau, S., N. Jabbour, G. Lachapelle, Y.Durocher, R. Tom, J. Transfiguracion, R. Gilbert, and B. Massie. 2008.Inducible Packaging Cells for Large-scale Production of Lentiviral Vectors inSerum-free Suspension Culture. Mol. Ther. 16:500-507.
Caron, A.W., C. Nicolas, B. Gaillet, I. Ba,M. Pinard, A. Garnier, B. Massie, and R. Gilbert. 2009. Fluorescent labeling insemi-solid medium for selection of mammalian cells secreting high-levels ofrecombinant proteins. BMC. Biotechnol. 9:42.
Chahal, P., S.M. Elahi, P. O'Neal, M.H.Venne, N. Nazemi-Moghaddam, and R. Gilbert. 2018. Key Rep-proteins necessaryfor the adeno-associated virus production by transient trasfection in HEK293cells in suspension and serum-free medium. In 21th Annual Meeting, AmericanSociety of Gene and Cell Therapy, May 16-19, 2018, Chicago, IL.
Cockrell, A.S., and T. Kafri. 2007. Genedelivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36:184-204.
Cote, J., A. Garnier, B. Massie, and A.Kamen. 1998. Serum-free production of recombinant proteins and adenoviralvectors by 293SF-3F6 cells. Biotechnol. Bioeng. 59:567-575.
Dropulic, B. 2011. Lentiviral vectors:their molecular design, safety, and use in laboratory and preclinical research.Hum. Gene Ther. 22:649-657.
Durocher, Y., S. Perret, and A. Kamen.2002. High-level and high-throughput recombinant protein production bytransient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. NucleicAcids Res. 30:E9.
Escors, D., and K. Breckpot. 2010. Lentiviralvectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch.Immunol. Ther. Exp. (Warsz. ). 58:107-119.
Farson, D., R. Witt, R. McGuinness, T.Dull, M. Kelly, J. Song, R. Radeke, A. Bukovsky, A. Consiglio, and L. Naldini.2001. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviralvectors. Hum. Gene Ther. 12:981-997.
Gervais, C., D. Paquette, A. Burns-Tardis,L. Martin, and B. Massie. 1998. Development of high output expression vectorsfor antibody production in mammalian cells. In Animal Cell Technology: Basic& Applied Aspects. K. Nagai and M. Wachi, editors. Kluwer AcademicPublishers, Netherlands. 349-354.
Gilbert, R., S. Broussau, and B. Massie.2007. Protein production using lentiviral vectors. In Methods Express:expression systems. M.R. Dyson and Y. Durocher, editors. Scion Publishing Ltd,Oxfordshire. 241-258.
Gilbert, R., C. Guilbault, D. Gagnon, A.Bernier, L. Bourget, S.M. Elahi, A. Kamen, and B. Massie. 2014. Establishmentand validation of new complementing cells for production of E1-deletedadenovirus vectors in serum-free suspension culture. J. Virol. Methods.208:177-188.
Gossen, M., and H. Bujard. 1992. Tightcontrol of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsivepromoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:5547-5551.
Grieger, J.C., and R.J. Samulski. 2012.Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications.Methods Enzymol. 507:229-254.
Kafri, T., P.H. van, L. Ouyang, F.H. Gage,and I.M. Verma. 1999. A packaging cell line for lentivirus vectors. J. Virol.73:576-584.
Kotterman, M.A., and D.V. Schaffer. 2014.Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy. Nat. Rev. Genet. 15:445-451.
Massie, B., F. Couture, L. Lamoureux, D.D.Mosser, C. Guilbault, P. Jolicoeur, F. Belanger, and Y. Langelier. 1998a. Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirusvector with a tetracycline-regulatable expression cassette. J. Virol. 72:2289-2296.
Massie, B., D.D. Mosser, M. Koutroumanis,I. Vitte-Mony, L. Lamoureux, F. Couture, L. Paquet, C. Guilbault, J. Dionne, D.Chahla, P. Jolicoeur, and Y. Langelier. 1998b. Newadenovirus vectors for protein production and gene transfer. Cytotechnology.28:53-64.
Matrai, J., M.K. Chuah, and T.VandenDriessche. 2010. Recent advances in lentiviral vector development andapplications. Mol. Ther. 18:477-490.
Mercille, S., P. Jolicoeur, C. Gervais, D.Paquette, D.D. Mosser, and B. Massie. 1999.Dose-dependent reduction of apoptosis in nutrient-limited cultures of NS/0 myelomacells transfected with the E1B-19K adenoviral gene. Biotechnol. Bioeng.63:516-528.
Milone, M.C., and U. O'Doherty. 2018.Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32:1529-1541.
Miyazaki, J., S. Takaki, K. Araki, F.Tashiro, A. Tominaga, K. Takatsu, and K. Yamamura. 1989. Expression vectorsystem based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production ofinterleukin-5. Gene. 79:269-277.
Miyoshi, H., U. Blomer, M. Takahashi, F.H.Gage, and I.M. Verma. 1998. Development of a self-inactivating lentivirusvector. J. Virol. 72:8150-8157.
Mullick, A., Y. Xu, R. Warren, M.Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L.Lamoureux, R. Lo, A.W. Caron, A. Pilotte, and B. Massie. 2006. The cumategene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMCBiotechnol. 6:43.
Ni, Y., S. Sun, I. Oparaocha, L. Humeau, B.Davis, R. Cohen, G. Binder, Y.N. Chang, V. Slepushkin, and B. Dropulic. 2005.Generation of a packaging cell line for prolonged large-scale production ofhigh-titer HIV-1-based lentiviral vector. J. Gene Med. 7:818-834.
Pacchia, A.L., M.E. Adelson, M. Kaul, Y.Ron, and J.P. Dougherty. 2001. An inducible packaging cell system for safe,efficient lentiviral vector production in the absence of HIV-1 accessoryproteins. Virology. 282:77-86.
Pluta, K., and M.M. Kacprzak. 2009. Use ofHIV as a gene transfer vector. Acta Biochim. Pol.56:531-595.
Poulain, A., S. Perret, F. Malenfant, A.Mullick, B. Massie, and Y. Durocher. 2017. Rapidprotein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and thecumate gene-switch. J Biotechnol. 255:16-27.
Robert, M.A., P.S. Chahal, A. Audy, A.Kamen, R. Gilbert, and B. Gaillet. 2017. Manufacturing of recombinantadeno-associated viruses using mammalian expression platforms. Biotechnol. J.12.
Sanber, K.S., S.B. Knight, S.L. Stephen, R.Bailey, D. Escors, J. Minshull, G. Santilli, A.J. Thrasher, M.K. Collins, andY. Takeuchi. 2015. Construction of stable packaging cell lines for clinicallentiviral vector production. Sci Rep. 5:9021.
Sparacio, S., T. Pfeiffer, H. Schaal, andV. Bosch. 2001. Generation of a flexible cell line with regulatable, high-levelexpression of HIV Gag/Pol particles capable of packaging HIV-derived vectors.Mol. Ther. 3:602-612.
Umana, P., C.A. Gerdes, D. Stone, J.R.Davis, D. Ward, M.G. Castro, and P.R. Lowenstein. 2001. Efficient FLPerecombinase enables scalable production of helper- dependent adenoviral vectorswith negligible helper-virus contamination. Nat.Biotechnol. 19:582-585.
Vigna, E., S. Cavalieri, L. Ailles, M.Geuna, R. Loew, H. Bujard, and L. Naldini. 2002. Robustand efficient regulation of transgene expression in vivo by improvedtetracycline-dependent lentiviral vectors. Mol. Ther. 5:252-261.
Weitzman, M.D., and R.M. Linden. 2011.Adeno-associated virus biology. Methods Mol. Biol. 807:1-23.
Wright, J.F. 2009. Transient transfectionmethods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum. Gene Ther.20:698-706.
Zhao, H.F., J. Boyd, N. Jolicoeur, and S.H.Shen. 2003. A coumermycin/novobiocin-regulated gene expression system. Hum.Gene Ther. 14:1619-1629.

【0209】

［関連出願との相互参照］
[0001]本出願は、２０２１年１月７日に出願された米国仮出願第６３／１３４，８１６号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0210】

［配列表の組込み］
[0002]２０２２年１月５日に作成されたシーケンスリスト「Ｐ６１１０２ＰＣ００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」（２６，８９４バイト）のコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A)】

【図2B)】

【図2C)】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【配列表】

2024504240000001.app

【国際調査報告】