▶ ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-31
(54)【発明の名称】リガーゼ融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240124BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20240124BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240124BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N9/00 ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023537961
(86)(22)【出願日】2021-01-28
(85)【翻訳文提出日】2023-07-07
(86)【国際出願番号】 CN2021074082
(87)【国際公開番号】W WO2022160156
(87)【国際公開日】2022-08-04
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516310910
【氏名又は名称】ジーンクアンタム ヘルスケア （スーチョウ） シーオー．， エルティーディー．
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＱＵＡＮＴＵＭ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ （ＳＵＺＨＯＵ）ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ギャン・チン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ・エルヴイ
(72)【発明者】
【氏名】ヨアヒム・ヴァルター
(72)【発明者】
【氏名】ロルフ・ヴェルナー
(72)【発明者】
【氏名】ユンポン・ジョン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA50
4H045BA53
4H045BA57
4H045BA60
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明はバイオテクノロジーに関する。具体的には、リガーゼ融合タンパク質及びそれを含む固定化リガーゼを提供する。本発明は、前記リガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼのコンジュゲート調製における用途をも提供する。本発明は、リガーゼ又はリガーゼユニットを用いてコンジュゲートを調製する方法をさらに提供する。
【選択図】 図１５
【選択図】 図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リガーゼ及びＨａｌｏタグを含む、リガーゼ融合タンパク質。
【請求項2】
前記リガーゼはトランスペプチダーゼ、好ましくはソルターゼ、より好ましくはソルターゼＡである、請求項１に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項3】
前記ソルターゼＡは、配列番号１～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項4】
前記ソルターゼＡは、部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含み、好ましくは、前記ソルターゼＡは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項5】
前記Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項6】
前記リガーゼは約７．５～約１０．０の等電点（ｐＩ）を有し、前記Ｈａｌｏタグは約４．５～約５．０の等電点を有し、前記リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、前記リガーゼのｐＩよりも約２．０～約４．５ｐＨ単位低い、請求項１から５のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項7】
前記リガーゼはトランスペプチダーゼ、好ましくはソルターゼ、より好ましくはソルターゼＡである、請求項６に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項8】
前記ソルターゼＡは、配列番号１～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項9】
前記ソルターゼＡは、部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含み、好ましくは、前記ソルターゼＡは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項10】
前記Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６から９のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【請求項11】
支持体に固定化される請求項１から１０のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質を含む、固定化リガーゼ。
【請求項12】
前記支持体は、ハロアルキルリンカー、好ましくはクロロアルキルリンカーを含むことで、前記リガーゼ融合タンパク質がハロアルキルリンカーとＨａｌｏタグとの間の共有結合相互作用によって前記支持体に固定化される、請求項１１に記載の固定化リガーゼ。
【請求項13】
クロロアルキルリンカーは、式（Ｉ－１）の構造を有するクロロアルキル基質から生成され、【化1】
【請求項14】
前記支持体は、式（ＩＩ）の構造を有し、【化2】
【化3】
【請求項15】
第１部分及び第２部分を含むコンジュゲートを調製するための方法であって、（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記リガーゼユニットはリガーゼを含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む、前記方法。
【請求項16】
ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、１つ又は複数の不純物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記リガーゼユニットは、遊離リガーゼ、好ましくはトランスペプチダーゼ、より好ましくはソルターゼ、より特に好ましくはソルターゼＡを含み、最も好ましくは、前記リガーゼユニットは、請求項１から１０のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質を含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記リガーゼユニットは支持体に固定化されたリガーゼを含み、好ましくは、前記リガーゼは支持体に共有結合で固定化され、前記リガーゼは、好ましくはトランスペプチダーゼ、より好ましくはソルターゼ、より特に好ましくはソルターゼＡであり、最も好ましくは、前記リガーゼユニットは、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の固定化リガーゼを含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含む、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから独立して選択され、前記イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択され、好ましくは、前記クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは、抗体又は抗体フラグメントを含み、ステップ（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、好ましくは、前記抗体又は抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメントを含み、前記アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記第１部分又は第２部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｄ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｄ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｄ－３）疎水性相互作用クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（ｂ）の後、ステップ（３）の前にＵＦ／ＤＦを行い、ステップ（３）は、
（３ｅ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｅ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（ｂ）の後、ステップ（３）の前にＵＦ／ＤＦを行い、ステップ（３）は、陽イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項24】
前記アフィニティークロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行され、及び／又は、前記イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モード又はフロースルーモードで実行され、
好ましくは、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実行され、及び／又は、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行される、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
ステップ（ｂ）はバッチモード、半連続モード又は連続モードで実行される、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）のうちの少なくとも１つは半連続モード又は連続モードで実行され、好ましくは、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）は連続モードで実行される、請求項２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の構造を有し、前記第１部分はＴを含み、
前記第２部分は式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体を含み、
【化4】
Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように場合により修飾される生体分子を含み、
Ｌは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの他方を含むリンカーを含み、
Ｐはペイロードを含み、
ｚは１～２０の整数であり、
ｔは１～２０の整数である、請求項１５から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
Ｔは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、及び核酸もしくは類似体を含み、及び／又は、Ｐは、水素、小分子化合物、好ましくは毒素、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、核酸もしくは類似体、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体フラグメント、又はタンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記リガーゼは、ソルターゼ、好ましくはソルターゼＡであり、及び／又は、前記リガーゼ供与体基質認識モチーフは、ＬＰＸＴＧＪ、好ましくはＬＰＸＴＧ又はＬＰＥＴＧＧであり、及び／又は、
前記リガーゼ受容体基質認識モチーフは、Ｇｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎは３～１０の整数であり、
Ｘは、任意の天然又は非天然アミノ酸であり、
Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸であり、好ましくは、Ｊは存在しないか又はＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である、請求項１５から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記コンジュゲートは、下記の式（３）、（３’）、（５）及び（５’）から選択される構造を有し、【化5-1】
【化5-2】
ｘはＯＨ、ＮＨ２又はＧｌｙであり、
Ｔｏｘｉｎは細胞毒素を表し、
好ましくは、前記細胞毒素は、タキサン類、メイタンシノイド類、アウリスタチン類、エポチロン類、コンブレタスタチンＡ－４ホスフェート、コンブレタスタチンＡ－４及びその誘導体、インドール－スルホンアミド類、ビンブラスチン等のビンブラスチン類、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、ビングリシネート、無水ビンブラスチン、ドラスタチン１０及び類似体、ハリコンドリンＢ、エリブリン、インドール－３－オキソアセタミド、ポドフィロトキシン類、７－ジエチルアミノ－３（２’－ベンゾオキサゾリル）－クマリン（ＤＢＣ）、ディスコデルモリド、ラウリマライド、カンプトテシン類及びその誘導体、ミトキサントロン、ミトグアゾン、窒素マスタード類、ニトロソ尿素類、アジリジン類、ベンゾドーパ、カルボコン、メトレデパ、ウレデパ、ダイネマイシン、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、ブレオマイシン類、アクチノマイシンＣ、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、デトルビシン、アドリアマイシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、鉄アドリアマイシン、ロドルビシン、ルフォクロモマイシン、ストレプトゾシン、ジノスタチン、ゾルビシン、トリコテセン、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、バシロクポリンＡ、アンギジン、ウベニメックス、アザセリン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ジメチル葉酸、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、エダトレキサート、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、ゲムシタビン、エノシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、フロクスウリジン、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸リュープロレリン、プロテインキナーゼ阻害剤、及びプロテアソーム阻害剤からなる群から選択され、及び／又は前記細胞毒素は、アウリスタチン類、特にＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ又はＭＭＡＤから選択され、
ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｌ１とＬ３は、それぞれ独立して、
－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－、及びＣ１－４アルキレン基と－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－のうちの１つの基との組合せからなる群から選択され、
Ｌ２は存在しないか又はＣ７－３４アルキレン基であり、前記アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は－Ｏ－によって場合により置き換えられ、
Ｌ１、Ｌ２とＬ３は、それぞれ場合により且つ独立して、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって置換され、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、－Ｃ１－６アルキル基、－（ＣＯ）－Ｃ１－６アルキル基、及び－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｃ１－６アルキル基からなる群から選択され、
Ｙは存在しないか、又は切断可能な配列、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
前記切断可能な配列は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列を含み、前記切断可能な配列は１～１０個のアミノ酸を含み、
Ｓｐ１は、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ及びそれらの組合せからなる群から選択され、Ｔとｚは、それぞれ請求項２７に定義されている通りである、請求項１５から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
Ｙは存在せず、前記コンジュゲートは、下記の式（４）、（４’）、（６）及び（６’）から選択される構造を有する、請求項３０に記載の方法。【化6-1】
【化6-2】
【請求項32】
リガーゼユニットをリンカー－ペイロード中間体及びＴと接触させ、Ｔとリンカー－ペイロード中間体との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得ることを含む、コンジュゲートを調製するための方法であって、【化7】
前記コンジュゲートは、式（５）又は（５’）の構造を有し、
式（ＩＶ－１－５）、（ＩＶ－１－５’）、（５）及び（５’）は以下に示す通りであり、
【化8-1】
【化8-2】
ｎは３～１０の整数であり、
Ｔｏｘｉｎは、請求項３０に定義されている通りである、前記方法。
【請求項33】
式（ＩＶ－１－５）のリンカー－ペイロード中間体は、式（ＩＶ－１－６）の構造を有し、式（ＩＶ－１－５’）のリンカー－ペイロード中間体は、式（ＩＶ－１－６’）の構造を有し、
式（５）のコンジュゲートは、式（６）の構造を有し、
式（５’）のコンジュゲートは、式（６’）の構造を有し、
式（ＩＶ－１－６）、（ＩＶ－１－６’）、（６）及び（６’）は以下に示す通りである、請求項３２に記載の方法。
【化9-1】
【化9-2】
【請求項34】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のリガーゼ融合タンパク質、又は請求項１１～１４のいずれか１項に記載の固定化リガーゼのコンジュゲート調製における使用であって、好ましくは、前記コンジュゲートは、請求項１５から３３のいずれか１項に定義されている通りである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年１月２８日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７４０８２号の優先権を主張し、その全ての内容が参照によって本出願に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月２８日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７４０８２号の優先権を主張し、その全ての内容が参照によって本出願に組み込まれる。
【0002】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的にはリガーゼ融合タンパク質及びそれを含む固定化リガーゼに関する。本発明は、前記リガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼのコンジュゲート調製における用途をも提供する。本発明は、リガーゼ又はリガーゼユニットを用いてコンジュゲートを調製する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【0003】
高品質のコンジュゲートに対する需要、特に生物科学研究、診断又は治療等の目的のためのバイオコンジュゲートに対する需要が急速に高まっているが、バイオコンジュゲートのハイスループット生産は満足のいくものには程遠いのが現状である。一部の原因は、生体分子が複雑なため、バイオコンジュゲートの高い品質基準に達することが難しいということである。
【0004】
従来のコンジュゲーション方法は化学的なものである。例えば、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の典型的な生産方法では、薬物はリンカーを介して抗体中のリジン又はシステイン残基と化学的にコンジュゲートされる。コンジュゲーションプロセスに移る前に、抗体は上流及び下流の精製プロセスによって調製される。コンジュゲーションステップの後、ＡＤＣ中の凝集体、溶媒、副生成物及び不純物を除去するために、別の下流精製プロセスが必要である。抗体調製からＡＤＣ生産までの方法において複数の下流ステップがあるため、コストと時間が大幅に増加するほかに、収率も低下する。また、安全性の観点から、コンジュゲーション反応は化学アイソレータ内で行う必要があるため、該方法のスケールアップが困難である。要するに、複数の上流及び下流精製ステップを含む従来の方法は、時間がかかり、経済的でなく、柔軟性がなく、スケーラビリティに欠ける。
【0005】
ソルターゼ酵素等のリガーゼは、穏やかな条件下で基質特異性が高く且つ効率的な方法でコンジュゲーションを触媒するためのものであり（例えば、ＷＯ２０１５／１６５４１３Ａ１、ＷＯ２０１４／１７７０４２、及びＷＯ２０１４／１４０３１７）、時間の節約、コストの削減及び浪費の低減が可能である。リガーゼは、多くの利点があるが、数々の課題により、コンジュゲーション反応における工業的応用が依然として制約されている。
【0006】
酵素の低い操作安定性及び低い再利用性等の課題は酵素の固定化によって解決できる。コンジュゲーションに応用されているものとして、臭化シアン活性化アガロースゲル上の固定化ソルターゼＡ（例えば、Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｏｒｔａｓｅ ｉｎ ｂａｔｃｈ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ－ｆｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，（２０１５），１０（３）：５０８－５１６を参照）、又はニッケル修飾磁性粒子に固定されたＨｉｓ６タグ付きソルターゼＡ（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｏｒｔａｓｅ Ａ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌａｂｌｅ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，（２０１７），７：６５６１を参照）がある。
【0007】
しかしながら、上流の触媒反応からの残留酵素汚染物質を除去することは、ほとんどの酵素触媒コンジュゲート、特にバイオコンジュゲートにとって依然として主な懸念事項であり、これは、残留酵素汚染物質（固定化酵素の場合、支持体に非特異的に吸着された遊離酵素が、まだ脱落する可能性がある）の除去が困難であることがあるためである。したがって、費用対効果が高く、安定で、制御可能で、コンジュゲート生成物から容易に除去できるリガーゼが求められている。
【発明の概要】
【0008】
一概括的な態様では、本発明は、リガーゼ及びＨａｌｏタグを含む、リガーゼ融合タンパク質を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼはソルターゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼはソルターゼＡである。いくつかの好ましい実施形態において、ソルターゼＡは、配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの他の好ましい実施形態において、ソルターゼＡは、部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含み、好ましくは、ソルターゼＡは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0010】
一実施形態において、Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル基質からハロゲンを除去して残りのアルキル基と共有結合を形成する突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼ又はその変異体である。いくつかの実施形態において、Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0011】
好ましい一態様において、本発明は、由来するリガーゼと比較して等電点（ｐＩ）が変化したリガーゼ融合タンパク質を提供し、前記リガーゼは塩基性ｐＩを有し、前記Ｈａｌｏタグは酸性ｐＩを有する。いくつかの実施形態において、前記リガーゼは約７．５～約１０．０の等電点（ｐＩ）を有し、前記Ｈａｌｏタグは約４．５～約５．０の等電点を有し、前記リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、前記リガーゼのｐＩよりも約２．０～約４．５ｐＨ単位低い。
【0012】
別の概括的な態様において、本発明は、支持体に固定化される本発明のリガーゼ融合タンパク質を含む、固定化リガーゼを提供する。
【0013】
本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼのコンジュゲート調製における用途をさらに提供する。
【0014】
さらに別の概括的な態様において、本発明は、第１部分及び第２部分を含むコンジュゲートを調製する方法であって、
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記リガーゼユニットはリガーゼを含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む、前記方法を提供する。
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記リガーゼユニットはリガーゼを含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む、前記方法を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記リガーゼユニットは、遊離リガーゼ、好ましくはトランスペプチダーゼ、特に好ましくはソルターゼ、より特に好ましくはソルターゼＡを含み、最も好ましくは、前記リガーゼユニットは本発明のリガーゼ融合タンパク質を含む。
他のいくつかの実施形態において、前記リガーゼユニットは支持体に固定化されたリガーゼを含み、好ましくは、前記リガーゼは支持体に共有結合で固定化され、前記リガーゼは、好ましくはトランスペプチダーゼ、特に好ましくはソルターゼ、より特に好ましくはソルターゼＡであり、最も好ましくは、前記リガーゼユニットは本発明の固定化リガーゼを含む。
他のいくつかの実施形態において、前記リガーゼユニットは支持体に固定化されたリガーゼを含み、好ましくは、前記リガーゼは支持体に共有結合で固定化され、前記リガーゼは、好ましくはトランスペプチダーゼ、特に好ましくはソルターゼ、より特に好ましくはソルターゼＡであり、最も好ましくは、前記リガーゼユニットは本発明の固定化リガーゼを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、１つ又は複数の不純物を含む。他のいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）である。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記方法は、
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含む。
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含む。
【0018】
クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びそれらの組合せからなる群から独立して選択することができる。好ましくは、クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択される。
【0019】
いくつかの実施形態において、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは、抗体又は抗体フラグメントを含み、ステップ（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、好ましくは、抗体又は抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメントを含み、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーである。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】スタフィロコッカスワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）由来の例示的なＳｒｔＡ（配列番号３）及びそのＳＮＡＴ変異体のソルターゼ活性を示す。
【図2】精製された（Ａ）Ｈａｌｏ－ソルターゼ、（Ｂ）Ｈｉｓ６－ソルターゼ及び（Ｃ）ＧＢ１－ソルターゼの活性を示す。
【図3】様々なクロロ樹脂の酵素負荷量を示す。
【図4】様々なクロロ樹脂から調製された固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの触媒活性（ＤＡＲとして表される）を示す。
【図5】低温下でＧＢ１－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼで触媒して生成させるＡＤＣ生成物の溶解性を示す。
【図6】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ媒体を使用したＡＥＸにおける（Ａ）ＡＤＣ、（Ｂ）Ｈａｌｏ－ソルターゼ及び（Ｃ）ＡＤＣ＋Ｈａｌｏ－ソルターゼのクロマトグラフィープロファイルを示す。［００３６］
【図7】ＣａｐｔｏＳＩｍｐＡｃｔ媒体を使用したＣＥＸにおける（Ａ）ＡＤＣ及び（Ｂ）Ｈａｌｏ－ソルターゼのクロマトグラフィープロファイルを示す。
【図8】ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析によるプロセス２の粗コンジュゲート混合物に含まれるコンジュゲートのＤＡＲ組成を示す。
【図9】プロセス２における各クロマトグラフィーステップの後の、標的ＡＤＣを含むサンプル中の残留不純物の量を示す（図中、タンパク質Ａとは、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物であり、ＡＥＸとはＡＥＸのＡＤＣフロースルー液であり、ＣＥＸとはＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）。
【図10】ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析によるプロセス１の粗コンジュゲート混合物に含まれるコンジュゲートのＤＡＲ組成を示す。
【図11】プロセス１における各クロマトグラフィーステップの後の、標的ＡＤＣを含むサンプル中の残留不純物の量を示す（図中、タンパク質Ａとは、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物であり、ＡＥＸとはＡＥＸのＡＤＣフロースルー液であり、ＣＥＸとはＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）。
【図12】プロセス３における各クロマトグラフィーステップの後の、標的ＡＤＣを含むサンプル中の残留不純物の量を示す（図中、第１タンパク質Ａとはタンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーでのｍＡｂ溶出物であり、第２タンパク質Ａとはタンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物であり、ＡＥＸとはＡＥＸのＡＤＣフロースルー液であり、ＣＥＸとはＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）。
【図13】標的ＡＤＣを含むサンプル中の残留Ｈａｌｏ－ソルターゼの量を示す（図中、コンジュゲーションとはＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液から収集される粗コンジュゲート混合物であり、タンパク質Ａとはタンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物であり、ＡＥＸとはＡＥＸのＡＤＣフロースルー液であり、ＣＥＸとはＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）。
【図14】リンカー－毒素（リンカー－ペイロード中間体）除去の最適化されたクロマトグラフィープロファイルを示し、（Ａ）はＢｉｏｍａｘのタンパク質Ａ媒体によるものであり、（Ｂ）はＧＥのタンパク質Ａ媒体によるものであり、（Ｃ）はＧＥのＣＥＸ媒体によるものである。
【図15】従来の方法（従来のＡＤＣプロセス）及び本発明の方法（ＡＤＣプロセス１、ＡＤＣプロセス２、ＡＤＣプロセス３及びＡＤＣプロセス４）を使用したＡＤＣ調製のステップフローチャートを示す（図中、タンパク質Ａとはタンパク質Ａクロマトグラフィーであり、低ｐＨとは低ｐＨ処理であり、ＵＦ／ＤＦとは限外濾過／ダイアフィルトレーションであり、ＡＥＸとは陰イオン交換クロマトグラフィーであり、ＣＥＸとは陽イオン交換クロマトグラフィーであり、ＨＩＣとは疎水性相互作用クロマトグラフィーであり、ＭａｂＤＳとはモノクローナル抗体の下流プロセスである）。
【発明を実施するための形態】
【0021】
一般的な定義
別段に定義しない限り、本発明で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。また、タンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学並びに免疫学に関する用語及び実験方法は、当技術分野で広く用いられている用語及び一般的な方法である。本明細書に商品名が記載されている場合、それに対応する商品又はその有効成分を指すことを意図する。本明細書に引用した全ての特許、公開特許出願及び出版物は全て参照によって本出願に組み込まれる。また、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義と説明を以下に示す。
別段に定義しない限り、本発明で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。また、タンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学並びに免疫学に関する用語及び実験方法は、当技術分野で広く用いられている用語及び一般的な方法である。本明細書に商品名が記載されている場合、それに対応する商品又はその有効成分を指すことを意図する。本明細書に引用した全ての特許、公開特許出願及び出版物は全て参照によって本出願に組み込まれる。また、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義と説明を以下に示す。
【0022】
本明細書で使用されるように、「少なくとも１つ」又は「１つ又は複数」という表現は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又はそれ以上、等を意味する。本明細書で使用されるように、反対のことが明示されない限り、「１」及び「１つ」は、「少なくとも１つ」と理解されるべきである。
【0023】
特定の量、濃度、又はその他の値もしくはパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値、又は好ましい下限値として示されていることは、任意の上限値又は好ましい値と任意の下限値又は好ましい値とを組み合わせた全ての範囲が、明記されているかどうかに関わらず、具体的に開示されていることと同等であると理解すべきである。特に明記しない限り、本明細書で列挙される数値の範囲は、範囲の端点及び該範囲内の全ての整数及び分数（小数）を含むことを意図する。例えば、「ｉは２から２０の整数である」という表現は、ｉが２から２０のいずれかの整数であると理解すべきであり、例えば、ｉは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり得る。他の類似表現も同様に理解すべきである。
【0024】
用語「約」及び「およそ」は、濃度、等電点（ｐＩ）、ｐＨ、温度、又は特定の範囲等の数値変数と組み合わせて使用する場合、一般に、変数の値及び変数の全ての値が、実験誤差の範囲内（例えば、平均値の９５％信頼区間内）又は具体値±１０％以内、又はより広い範囲内であることを意味する。
【0025】
用語「任意の」又は「任意に」とは、その後に説明される事象が発生する可能性があるが、必ずしも発生するわけではないことを意味し、該表現は、前記事象又は状況が発生する場合又は発生しない場合を含むことを意味する。
【0026】
表現「含む」又は類似の表現「備える」、「含有」及び「有する」等はオープンエンドなものであり、追加の列挙されていない要素、ステップ又は成分を排除しない。表現「…からなる」は、明確に示していない要素、ステップ又は成分をいずれも除外する。表現「実質的に…からなる」は、範囲を、指定の要素、ステップ又は成分、及び保護を請求する主題の重要な特徴及び新規な特徴に実質的な影響を及ぼさない任意に存在する元素、ステップ又は成分に限定することを意味する。表現「含む」は表現「実質的に…からなる」と「…からなる」を包含すると理解すべきである。
【0027】
本明細書で使用されるように、「生体分子」の定義は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、小さなヌクレオチド、アミノ酸及びその誘導体を包含する。
【0028】
本明細書で使用されるように、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも２つのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体がホスボジエステル結合で連結したポリマーを指し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
【0029】
本明細書で使用されるように、「ベクター」とは、外来性核酸を宿主細胞に導入するための媒体であり、外来性核酸は宿主細胞内で増幅又は発現する。本明細書で使用されるように、「ベクター」の定義は、プラスミド（例えば、線形化プラスミド）、ウイルスベクター、コスミド、ファージベクター、ファージミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体及び哺乳動物人工染色体）等を包含する。本明細書で使用されるように、ベクターが宿主細胞内で発現及び／又は複製できることは、ベクターが宿主細胞内でＲＮＡポリヌクレオチド又はポリペプチドを発現できること、及び／又は、ベクターの複数のコピーを生成できることを意味する。「発現可能」又は「複製可能」のために、ベクターは、プロモーターに動作可能に連結された核酸配列又は要素を含んでもよい。本明細書で使用されるように、核酸配列又は要素に関する「動作可能な連結」とは、これらの核酸配列が機能的に相互に関連していることを意味する。例えば、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に連結して、核酸の転写を調節又は媒介することができる。当業者は、特定の目的に応じて適切なベクターを選択して使用することができる。
【0030】
本明細書で使用されるように、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは共有結合した２つ又は複数のアミノ酸を意味する。特に明記しない限り、これらの用語は互換的に使用できる。
【0031】
本明細書で使用されるように、「配列同一性」は本分野で一般的に認識されている意味を有し、２つのポリペプチド間の配列同一性の百分率は、例えば、基本的なローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）、及び高速適応縮小／閾値処理アルゴリズム（ＦＡＳＴＡ）（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４を参照）のような、公的に利用できるアルゴリズムを使用して２つの配列を比較することによって算出することができる。２つのポリペプチド間の同一性を測定する方法は様々であるが、用語「同一性」は、当業者によく知られたものである（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
【0032】
本明細書で使用されるように、用語「変異体」とは、参照タンパク質に比べて、１つ又は複数の残基の置換、欠失、挿入があるタンパク質を意味する。参照タンパク質は、天然資源から分離可能な天然に存在するタンパク質（即ち、野生型タンパク質）、又は操作されたタンパク質であってもよい。本明細書で使用されるように、例えばソルターゼＡ変異体又はＨａｌｏタグ変異体等の変異体の機能又は活性は、それぞれ参照ソルターゼＡ又はＨａｌｏタグの機能又は活性と実質的に類似又は同等又はそれ以上である。
【0033】
本明細書の具体的な文脈において、タンパク質中のアミノ酸の位置は次のように定義される。（ｉ）Ｎ－末端から開始し、及び（ｉｉ）Ｎ末端の１番目のアミノ酸位置を１として指定する。所定位置（例えば部位３４）のアミノ酸（例えばＳｅｒ）は、Ｓｅｒ３４と表すことができる。所定のアミノ酸位置（例えば部位２７２）のアミノ酸（例えばＨｉｓ）が他のアミノ酸（例えばＰｈｅ）に置換されたものは、Ｈｉｓ２７２Ｐｈｅと表すことができる。
【0034】
本明細書で使用されるように、「リガーゼ」とは、２つ又は複数の分子の共有結合を触媒することができる酵素のことである。リガーゼは、リガーゼ供与体基質認識モチーフを含む第１部分とリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む第２部分との間のコンジュゲーションを特異的に触媒して、標的コンジュゲートを生成することができる。
【0035】
本明細書で使用されるように、用語「ペプチド転移反応」とは、１つ又は複数のアミノ酸（例えばペプチド）が１つの分子から別の分子に転移する化学反応を指す。トランスペプチダーゼは、供与体基質と受容体基質との間のペプチド転移反応を触媒できる酵素である。在ソルターゼによって触媒される簡略化したペプチド転移反応では、まずソルターゼがリガーゼ供与体基質の認識モチーフ（供与体認識モチーフとも呼ばれ、例えばＳｒｔＡが使用される場合のＬＰＸＴＧ）を切断し、チオエステル結合を形成することによって基質－酵素中間体を生成する。次に、リガーゼの受容体基質認識モチーフ（受容体認識モチーフとも呼ばれ、例えばＧＧＧ）がチオエステル結合を求核攻撃して酵素を放出し、２つの基質の間に新しいペプチド結合を形成する。ペプチド転移反応では通常、両方がコンジュゲートしてコンジュゲートを形成する。
【0036】
本明細書で使用されるように、用語「コンジュゲーション」は、少なくとも２つの部分（例えば、少なくとも２つの分子又は同一分子の少なくとも２つの末端）の共有結合を意味する。
【0037】
本明細書で使用されるように、「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、少なくとも２つの部分（例えば、少なくとも２つの分子又は同一分子の少なくとも２つの末端／側鎖）の共有結合により調製することができる。
【0038】
本明細書で使用されるように、「バイオコンジュゲート」とは、結合された部分の少なくとも１つが生体分子であるコンジュゲートを意味する。バイオコンジュゲートの例としては、ポリマー、脂質、抗体、ペプチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）又は小分子リガンドに結合された治療用分子、例えば、ｓｉＲＮＡコンジュゲート、ペプチドホルモンコンジュゲート、ペプチド－ペプチドコンジュゲート、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート及び多重特異性抗体等を含む。
【0039】
用語「標的化分子」とは、特定の標的（例えば受容体、細胞表面タンパク質、サイトカイン等）に対して親和性を有する分子を意味する。標的化分子は、標的送達によりペイロードを生体内の特異部位に送達することができる。標的化分子は、１つ又は複数のターゲットを認識することができる。特異的な標的部位は、標的化分子が認識したターゲットによって定義される。例えば、受容体を標的とする標的化分子は、大量の前記受容体を含む部位に細胞毒素を送達することができる。標的化分子の例としては、抗体、抗体フラグメント、所定抗原の結合タンパク質、抗体模倣体、所定ターゲットに対して親和性を有する足場タンパク質、リガンド等を含むが、これらに限定されない。
【0040】
本明細書で使用されるように、用語「抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」とは、ペイロードに共有結合された抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートを意味する。
本明細書で使用されるように、リガーゼ（例えばソルターゼ）の「活性」、「酵素活性」及び「触媒活性」という用語は、コンジュゲーション反応を触媒するリガーゼの能力を指し、且つ互換的に使用することができる。本明細書で使用されるように、コンジュゲーション反応、例えば、抗体とペイロードとの間のコンジュゲーション反応におけるソルターゼの触媒活性は、コンジュゲーション効率（コンジュゲーション効率＝（コンジュゲート抗体のモル数：全抗体のモル数）×１００％）又はＤＡＲ（薬物抗体比、即ち、所定抗体の薬物コンジュゲート製剤の平均薬物抗体比）分布として表すことができる。
本明細書で使用されるように、リガーゼ（例えばソルターゼ）の「活性」、「酵素活性」及び「触媒活性」という用語は、コンジュゲーション反応を触媒するリガーゼの能力を指し、且つ互換的に使用することができる。本明細書で使用されるように、コンジュゲーション反応、例えば、抗体とペイロードとの間のコンジュゲーション反応におけるソルターゼの触媒活性は、コンジュゲーション効率（コンジュゲーション効率＝（コンジュゲート抗体のモル数：全抗体のモル数）×１００％）又はＤＡＲ（薬物抗体比、即ち、所定抗体の薬物コンジュゲート製剤の平均薬物抗体比）分布として表すことができる。
【0041】
本明細書で使用されるように、用語「抗体（Ａｂ）」とは、少なくとも１つの抗原結合部位を介して抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその誘導体を意味する。「従来」又は「完全長」の抗体は、一般に、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）の４つのポリペプチドからなる。本明細書で使用されるように、「抗体」の定義は、従来の抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノ抗体（即ち単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン）及び抗イディオタイプ抗体を含む。「抗体」はまた、任意の免疫グロブリンタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）もしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のメンバー、又はそれらの任意の誘導体を含む。
【0042】
本明細書で使用されるように、抗体の「抗体フラグメント」とは、完全長抗体よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体の任意の部分を指し、例えば、抗体の可変構造ドメインの少なくとも一部（例えば１つ又は複数のＣＤＲ）を含み且つ完全長抗体の同起源抗原に特異的に結合する抗原結合フラグメント、又は、抗体の重鎖定常領域を含み且つ細胞表面のＦｃ受容体に結合するＦｃフラグメントである。抗体フラグメントは、化学的又は酵素的処理、化学合成又は組換えＤＮＡ技術等、様々な方法によって取得することができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ（可変領域フラグメント）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖフラグメント）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド結合によって安定化させた可変フラグメント）、ｓｃｄｓＦｖ（単鎖ジスルフィド結合によって安定化させた可変フラグメント）、ダイアボディ、Ｆｄフラグメント（ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ）、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）、ｓｃＦａｂ（単鎖Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ（結晶化可能フラグメント）及びそれらの任意の誘導体を含むが、これらに限定されない。
【0043】
本明細書で使用されるように、用語「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」は、例えば、リンカーを介して連結された、コンジュゲートに含まれる機能部分を指す。ペイロードの例としては、小分子化合物（小分子薬物とも呼ばれ、例えば、阻害剤及び毒素（細胞毒素等））、放射性核種（例えば、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｇａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１９１ｍＯｓ、１９５ｍＰｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１１９Ｓｂ、１５３Ｓｍ、９９ｍＴｃ、２２７Ｔｈ及び９０Ｙ）、グリカン、ＰＥＧ部分、核酸及び類似体（例えば、干渉ＲＮＡ）、トレーサー分子（例えば、フルオロフォア及び蛍光分子）、ポリペプチド（例えば、タンパク質タグ、生物活性ペプチド、酵素、抗体及び抗体フラグメント、並びにタンパク質毒素）、及びペプチド模倣体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用されるように、リンカー（例えば、リガーゼ基質認識モチーフを含むリンカー）を含むペイロード及び上述したペイロードは本発明に含まれる。
【0044】
本明細書で使用されるように、用語「天然アミノ酸」は、タンパク質の構成アミノ酸であるアミノ酸を指し、一般的な２０種類のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）と、あまり一般的ではないセレノシステイン及びピロリジンを含む。
【0045】
本明細書で使用されるように、用語「非天然アミノ酸」は、タンパク質の構成アミノ酸ではないアミノ酸を指す。具体的には、該用語は、上記で定義した天然アミノ酸でないアミノ酸を指す。
【0046】
本明細書で使用されるように、用語「ペプチド模倣体」とは、特定のペプチドのコンフォメーション及び所望の特徴を模倣する化合物を指す。
【0047】
本明細書で使用されるように、「受容体」は、細胞内又は表面に存在し、特定の物質に結合して細胞内で特定の作用をもたらす構造を指す。受容体は、本明細書に記載のＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、及びシグナル分子、細胞成長因子とサイトカインの受容体を含み得る。
【0048】
本明細書で使用されるように、「シグナル伝達因子」とは、細胞を横断又は通るシグナル伝達事象において役割を果たす任意の物質を指す。シグナル伝達因子は、シグナル分子（例えば、ステロイドホルモン、レチノイン酸、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ３、ペプチドホルモン、神経ペプチド、エイコサノイド、神経伝達物質及びサイトカイン）及びそれらの受容体を含み得るが、これらに限定されない。
【0049】
本明細書で使用されるように、用語「免疫調節剤」は、免疫系の機能に影響を与えることができる生物学的活性物質を指す。免疫調節剤は、免疫抑制性のもの（例えば免疫抑制剤／免疫抑制性の薬物）又は免疫刺激性のもの（例えば免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）／免疫賦活剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ））であってもよい。免疫調節剤の例としては、サイトカイン、胸腺ホルモン（例えば、チムリン、チモシン及びチモポエチン）、レンチナン、β－グルカン、イヌリン、レバミゾール、イソプリノシン、ＩＭＰＤＨ阻害剤（例えば、アザチオプリン、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ミコフェノール酸、ミゾリビン（ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）及びチアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ））、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ））、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ））、Ｐ３８阻害剤、ＮＦ－κＢ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ））、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、及びプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ））、ヤヌスキナーゼ阻害剤（例えば、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）、バリシチニブ（ｂａｒｉｃｉｔｉｎｉｂ））、抗サイトカイン抗体、及びＴ細胞受容体に対する抗体を含み得るが、これらに限定されない。
【0050】
本明細書で使用されるように、用語「細胞成長因子」は、細胞の成長、癒合、増殖、生存及び分化を刺激できる任意の物質を指す。成長因子の例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、奇形癌由来成長因子（ＴＤＧＦ））、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含み得るが、これらに限定されない。
【0051】
本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞から放出され、他の細胞に影響を与える任意の物質を指す。サイトカインの例としては、ケモカイン、リンホカイン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）、血管新生因子、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、及び他の細胞にシグナルを伝達できるその他の分泌分子と細胞表面分子を含むが、これらに限定されない。サイトカインは、ＩＮＦα、ＩＮＦβ、ＩＮＦγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０、ｅｏｔａｘｉｎ／ＣＣＬ１１、ＭＣＰ－１／ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１α／ＣＣＬ４、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、及び成長因子を含むが、これらに限定されない。
【0052】
小分子化合物とは、医療で一般的に使用される有機分子と同程度の大きさの分子のことである。該用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を包含しないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等の低分子量のペプチド又はその誘導体を含む。一般に、小分子化合物の分子量は、例えば、約１００～約２０００Ｄａ、約２００～約１０００Ｄａ、約２００～約９００Ｄａ、約２００～約８００Ｄａ、約２００～約７００Ｄａ、約２００～約６００Ｄａ、約２００～約５００Ｄａであり得る。本明細書で使用されるように、小分子化合物は、薬物と称することもできる。
【0053】
細胞毒素とは、細胞の発現活性、細胞機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊を引き起こす物質である。場合によっては、現在ＡＤＣに使用されている細胞毒素は、一般に使われている化学療法薬よりも毒性が強いことがある。細胞毒素の例としては、微小管細胞骨格、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キネシン媒介のタンパク質輸送、アポトーシス調節のようなターゲットを標的とする薬物を含むが、これらに限定されない。微小管細胞骨格を標的とする薬物は、例えば、微小管安定化剤又は微小管タンパク質重合阻害剤であり得る。微小管安定化剤の例としては、タキサン類を含むが、これに限定されない。微小管タンパク質重合阻害剤の例としては、メイタンシノイド類（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、アウリスタチン類（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、ビンブラスチン類、コルヒチン類、及びドラスタチン類を含むが、これらに限定されない。ＤＮＡ標的薬物は、例えば、ＤＮＡ構造を直接破壊する薬物、又はトポイソメラーゼ阻害剤であり得る。ＤＮＡ構造を直接破壊する薬物の例としては、ＤＮＡ二本鎖切断剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を含むが、これらに限定されない。ＤＮＡ二本鎖切断剤は、例えば、エンジイン系抗生物質であり得、ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ｕｎｃｉａｌａｍｙｃｉｎ等を含むが、これらに限定されない。ＤＮＡアルキル化剤は、例えば、ＤＮＡビスアルキル化剤（ｂｉｓ－ａｌｋｙｌａｔｏｒ）（即ちＤＮＡ架橋剤）又はＤＮＡモノアルキル化剤であり得る。ＤＮＡアルキル化剤の例としては、ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、１－（クロロメチル）－２，３－ジヒドロゲン－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体、ＣＢＩ－ＰＢＤヘテロ二量体、ジヒドロインドロベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）二量体、デュオカルマイシン様（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ－ｌｉｋｅ）化合物等を含むが、これらに限定されない。トポイソメラーゼ阻害剤の例としては、カンプトテシン類（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、アントラサイクリン類（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）を含むが、これらに限定されない。ＲＮＡを標的とする薬物は、例えば、スプライシングを阻害する薬物であり得、その例としては、プラジエノリド（ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ）を含むが、これに限定されない。キネシン媒介のタンパク質輸送を標的とする薬物は、例えば、有糸分裂キネシン阻害剤であり得、キネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）阻害剤を含むが、これに限定されない。
【0054】
スペーサーは、異なる構造モジュールの間に位置し、構造モジュールを空間的に分離できる構造である。スペーサーの定義は、特定の機能を有するかどうか、又は生体内で切断又は分解され得るかどうかによって限定されない。スペーサーの例としては、アミノ酸及び非アミノ酸構造を含むが、これらに限定されない。そのうち、非アミノ酸構造は、アミノ酸誘導体又は類似体であり得るが、これらに限定されない。「スペーサー配列」とは、スペーサーとなるアミノ酸配列を指し、その例としては、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ等の単一のアミノ酸、複数のアミノ酸を含む配列、例えばＧＡ等の２つのアミノ酸を含む配列、又は例えばＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ等を含むが、これらに限定されない。スペーサーの他の例としては、例えば、ＰＡＢ（ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ，パラアミノベンジル）等の自壊的スペーサーを含む。
【0055】
用語「アルキル基」とは、炭素原子と水素原子からなる直鎖又は分枝飽和脂肪族炭化水素基を意味し、該飽和脂肪族炭化水素基は単結合によって分子の残りの部分に連結されている。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を含み得、即ちＣ１－Ｃ２０アルキルであり得、例えば、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ２アルキル基、Ｃ３アルキル基、Ｃ４アルキル基、Ｃ３－Ｃ６アルキル基である。アルキルの非限定的な例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、１－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、ネオペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、２－エチルブチル基、１－エチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、又は１，２－ジメチルブチル基、又はそれらの異性体を含むが、これらに限定されない。二価ラジカルとは、対応する一価ラジカルの自由価電子を持つ炭素原子から水素原子を１つ除去することによって得られた基を意味する。二価ラジカルは、分子の残りの部分に連結されている２つの連結部位を有する。例えば、「アルキレン基」又は「アルキリデン基」とは、直鎖又は分枝鎖の飽和二価炭化水素基を指す。アルキレン基の例としては、メチレン基（－ＣＨ２－）、エチレン基（－Ｃ２Ｈ４－）、プロピレン基（－Ｃ３Ｈ６－）、ブチレン基（－Ｃ４Ｈ８－）、ペンチレン基（－Ｃ５Ｈ１０－）、ヘキシレン基（－Ｃ６Ｈ１２－）、１－メチルエチレン基（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－）、２－メチルエチレン基（－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、メチルプロピレン基、エチルプロピレン基等を含むが、これらに限定されない。
【0056】
本明細書で使用されるように、１つの基が他の基と組み合わされる場合、化学的に安定な構造が形成されるのであれば、基の連結は直鎖状でも分枝状でもよい。このような組合せによって形成される構造は、該構造内の任意の適切な原子によって、好ましくは指定の化学結合によって分子の他の部分に連結することができる。例えば、Ｃ１－４アルキレン基と、－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－を含む基の１つとを組み合わせると記述する場合、Ｃ１－４アルキレン基は上記基と直鎖状連結を形成することができ、例えば、Ｃ１－４アルキレン－ＣＨ２－、Ｃ１－４アルキレン－ＮＨ－、Ｃ１－４アルキレン－（ＣＯ）－、Ｃ１－４アルキレン－ＮＨ（ＣＯ）－、Ｃ１－４アルキレン－（ＣＯ）ＮＨ－、－ＣＨ２－Ｃ１－４アルキレン、－ＮＨ－Ｃ１－４アルキレン、－（ＣＯ）－Ｃ１－４アルキレン、－ＮＨ（ＣＯ）－Ｃ１－４アルキレン、－（ＣＯ）ＮＨ－Ｃ１－４アルキレンを形成することができる。得られた二価構造は、分子の他の部分にさらに連結することができる。
【0057】
本明細書で使用されるように、用語「等電点（ｐＩ）」は、正味表面電荷を持たない分子（例えばタンパク質）の水溶液のｐＨ（水素濃度指数）値であり、ｐＨ単位として表される。タンパク質のｐＩは、例えば、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）及びキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）等、当分野でよく知られている方法を用いて実験的に測定することができる。異なるｐＩを持つ異なる生体分子（タンパク質、核酸、多糖類等）は所定のｐＨ値で異なる電荷を持ち得、これにより、イオン交換クロマトグラフィー又は等電点電気泳動等の方法によって分離可能となる。
【0058】
本明細書で使用されるように、「塩基性ｐＩ」を持つ分子は、ｐＩが７．０よりも高い分子を指す。本明細書で使用されるように、「酸性ｐＩ」を持つ分子は、ｐＩが７．０よりも低い分子を指す。
【0059】
本明細書で使用されるように、「タンパク質タグ」は、目的とする分子の検出、分離、固定化又は捕獲を促進するために、又は目的とする分子の１つ又は複数の特性（例えば発現レベル、溶解性、及び安定性）を改善するために目的とする分子に導入可能なポリペプチドを指す。
【0060】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、生体分子の正味表面電荷の差、及びイオン交換体（媒体、樹脂又は固定相とも呼ばれる）に対する親和力の差に基づいて生体分子を分離する、生体分子の精製によく使われている技術である。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、ｐＩが緩衝液のｐＨよりも低いタンパク質は、負の正味表面電荷を持ち、且つ正に帯電した陰イオン交換体に結合する。一方、ｐＩが緩衝液のｐＨよりも高い別のタンパク質は、正の正味表面電荷を持ち、且つ正に帯電した陰イオン交換体に結合しないため、緩衝液とともに媒体を通る。
【0061】
本明細書で使用されるように、用語「支持体」は、反応混合物から固体形態又は半固体形態で分離可能な水不溶性物質を指し、例えば、サーフェス、ゲル、ポリマー、マトリックス、粒子、樹脂、ビーズ又は膜である。
【0062】
用語「清澄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、目的とする生体分子を含む系から不溶性不純物を除去することを意味する。「清澄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」プロセスは、比濁分析によって監視することができ、例えば、比濁分析濁度単位（ＮＴＵ）で測定することができる。
【0063】
用語「仕上げ精製ステップ」とは、混合物中に存在する微量の汚染物質及び凝集体をさらに除去するステップをいう。一般に、ＡＤＣ又は抗体調製のプロセスでは、１つ又は複数の仕上げ精製ステップを用いることができ、仕上げ精製ステップは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択することができる。
【0064】
本明細書で使用されるように、用語「不純物」及び「汚染物質」とは、標的分子混合物中の望ましくない物質を指し、例えば、細胞、細胞片、宿主細胞タンパク質及びその他のタンパク質、エンドトキシン、媒体成分、脂質、過剰な反応物質（例えば未反応のリンカー－ペイロード中間体（ｌｉｎｋｅｒ－ｐａｙｌｏａｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ））、核酸、及びウイルスである。
【0065】
本明細書で使用されるように、用語「ｐｐｍ（百万分の一）」とは、総重量１００万単位あたりの標的分子（例えば標的コンジュゲート）に含まれる汚染物質（例えばＨＣＰ又はタンパク質Ａ）の量の単位である。該用語は、標的分子の純度を示す尺度として使用される。
【0066】
用語「限外濾過」又は「ＵＦ」は、制御可能な細孔、半透膜を用いて溶解した分子を濃縮又は分級する膜濾過技術を指す。細孔よりもはるかに大きな分子は供給溶液に保持され、膜を通過する液体の体積に正比例して濃縮される。限外濾過膜の孔径は、一般に１～１００ｎｍである。
【0067】
用語「ダイアフィルトレーション」又は「ＤＦ」とは、限外濾過膜を用いてタンパク質、ペプチド、核酸及びその他の生体分子を含む溶液から、塩又は溶媒を完全に除去、置換又はその濃度を下げる技術を指す。該方法は、分子サイズに基づいて透過性（多孔質）膜フィルターを選択的に使用して、溶液及び懸濁液の成分を分離する。限外濾過とダイアフィルトレーションは組み合わせて使用することができ、ＵＦ／ＤＦと呼ばれる。
【0068】
ウイルス不活性化は、安全性を確保するために、多くのバイオ医薬品の精製プロセスで使用されている。温度、ｐＨ、放射線、及び特定の化学試薬への暴露を含む種々のウイルス不活化技術が当技術分野で知られている。一般に、ウイルス不活性化は、低ｐＨ処理によって行うことができる。Ｆｃフラグメントを含む分子の場合、ウイルス不活性化は、例えばクロマトグラフィー方法ステップ（例えばタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー）の後に行うことができる。この場合、標的分子を含むプール（ｐｏｏｌ）はウイルス不活性化に必要なｐＨに調整され、一定時間維持され（ウイルス不活性化酸性化（ＶＩＡ）ステップ）、ｐＨと時間の組合せがウイルスの不活性化を引き起こすことは証明されている。ＶＩＡプールは、さななる下流プロセスで使用するために、中性に近いｐＨ値に調整される（ウイルス不活性化中和（ＶＩＮ）ステップ）。
【0069】
ウイルス濾過（ウイルス保持濾過とも呼ばれる）は、多くのバイオ医薬品精製プロセスにおいて一般的なステップである。ウイルス濾過は、ＵＦ又はナノ濾過によって行うことができる。低ｐＨ又は熱処理等の他の専用のウイルス除去ユニット操作に比べて、ほとんどの場合、ウイルス濾過はより穏やかであるため、製品の品質への潜在的な悪影響が小さくなる。除去するウイルスの大きさに応じて、市販のウイルス濾過製品を使用することができる。
【0070】
本明細書において互換的に使用できる用語「方法ステップ」又は「ユニット操作」とは、精製プロセスにおいて特定の結果を達成するために１つ又は複数の方法又は装置を使用することを意味する。
【0071】
本明細書で使用されるように、用語「連続プロセス」とは、２つ又は複数の方法ステップ（又はユニット操作）を含む標的分子を精製するための方法を指し、１つの方法ステップからの送出液は、中断することなく及び／又は次の方法ステップを実行する前に前の方法ステップからの全ての送出液を収集することなく、直接次の方法ステップに進むようにする。本明細書で説明したように、連続プロセスには、任意の個々の方法ステップにおける流体物質の送入又は送出が不連続又は断続的である方法も含まれる。このようなプロセスは、「半連続」プロセスと呼ばれることがある。
【0072】
リガーゼ融合タンパク質
一態様では、本発明は、リガーゼ及びＨａｌｏタグを含む、リガーゼ融合タンパク質を提供する。
一態様では、本発明は、リガーゼ及びＨａｌｏタグを含む、リガーゼ融合タンパク質を提供する。
【0073】
リガーゼ
本発明のリガーゼは、任意の標的リガーゼであり得、特に、リガーゼ供与体基質認識モチーフを含む第１部分とリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む第２部分との間のコンジュゲーションを特異的に触媒して、目的とするコンジュゲートを生成することができる。
本発明のリガーゼは、任意の標的リガーゼであり得、特に、リガーゼ供与体基質認識モチーフを含む第１部分とリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む第２部分との間のコンジュゲーションを特異的に触媒して、目的とするコンジュゲートを生成することができる。
【0074】
いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。トランスペプチダーゼは、天然に存在するものであっても、操作されたものであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、リガーゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、ソルターゼＣ（ＳｒｔＣ）、ソルターゼＤ（ＳｒｔＤ）、ソルターゼＥ（ＳｒｔＥ）又はソルターゼＦ（ＳｒｔＦ）等のソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）であるが、これらに限定されない。本明細書における「ソルターゼ」又は「ソルターゼ酵素」とは、ペプチド転移反応を触媒するソルターゼ活性を有する酵素を指し、例えば、ソルターゼ酵素スーパーファミリーのクラスＡ、クラスＢ、クラスＣ、クラスＤ、クラスＥ及びクラスＦのソルターゼを含むが（例えば、Ｄｒａｍｓｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｏｒｔａｓｅｓ：ａ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｏｒｔａｓｅｓ ｏｆ Ｇｒａｍ－ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００５），１５６：２８９-２９７；Ｂｒａｄｓｈａｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｒｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆａｍｉｌｙ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，（２０１５），２８２：２０９７-２１１４；Ｍａｌｉｋ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｒｔａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２０１９），５７（６）：４３１－４４３；及びＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）、これらに限定されない。このような酵素は、ＳｒｔＡ、ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣ、ＳｒｔＤ、ＳｒｔＥ又はＳｒｔＦと呼ぶことができるが、これらに限定されない。ソルターゼは、天然に存在するものであっても、操作されたものであってもよい。天然に存在するソルターゼは、様々なグラム陽性菌に見られ、例えば、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・アルジェンテウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｅｕｓ）と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、及びリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））等の任意の菌株、種又は亜種に見られるが、これらに限定されない。１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有するソルターゼ変異体のような操作されたソルターゼは、タンパク質工学及び化学合成等の当分野で知られている方法によって、その天然の対応物から得ることができる。また、野生型ソルターゼと同一又は類似の機能を有するものであれば、当分野で知られている任意の野生型ソルターゼの他の変異体（例えば１つ又は複数の活性基又はラベルを有するもの）も考慮される。当業者であれば、ソルターゼを容易に同定し、その配列及び他の特徴に基づいて特定のクラスに分類することができる。しかしながら、ソルターゼの定義は、いかなる分類方法又は命名システムにも限定されない。
【0075】
いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼは、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）である。ＳｒｔＡは、天然に存在するものであっても、操作されたものであってもよい。ＳｒｔＡの例としては、例えば米国特許第７，２３８，４８９号及び上述のＭａｌｉｋ ａｎｄ Ｋｉｍ，２０１９に記載したものを含み、例えば、連鎖球菌属（例えば、肺炎連鎖球菌と化膿連鎖球菌）、ブドウ球菌属（例えば、スタフィロコッカス・アルジェンテウスと黄色ブドウ球菌）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ））、バチルス属（例えば、炭疽菌）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ））、及びリステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）等の任意の菌株、種又は亜種を含むが、これらに限定されない。様々なＳｒｔＡのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第７，２３８，４８９号又は公開配列データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉｐｒｏｔ）において見出すことができ、その関連する内容が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の実施例に用いられ得る天然に存在するＳｒｔＡアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ２ＦＶ９９、Ａ０Ａ３Ｓ０ＪＲＪ４、Ａ０Ａ２Ｔ４Ｑ４３０、Ａ０Ａ５０７ＳＭＺ３、Ａ０Ａ１Ｆ２ＪＥＸ６、Ａ０Ａ３６４ＵＮＲ７、Ａ０Ａ１Ｊ３ＺＵ７５、Ａ０Ａ０Ｍ２ＮＳＵ２、Ａ０Ａ４３２Ａ５Ｖ１、Ａ０Ａ１Ｊ４ＨＢ５７、Ａ０Ａ４Ｑ８ＭＸＶ４、Ｗ１Ｗ５Ｚ３、Ａ０Ａ２Ｔ４ＫＤＫ７、Ａ０Ａ２Ｋ４ＤＱＸ６、Ａ０Ａ２Ｔ４ＫＨＷ３、Ａ０Ａ３８０ＦＹＢ６、Ａ０Ａ２Ｋ４Ｃ０Ｙ９、Ａ０Ａ４Ｑ９ＷＱＢ８、Ａ０Ａ１２１ＡＦＵ６、Ａ０Ａ１Ｑ８ＤＨ５９、Ａ０Ａ５Ｂ２ＹＴＨ７、Ａ０Ａ５３３ＩＹＩ６、Ｑ４Ｌ９２３、Ａ０Ａ１Ｆ１Ｍ８Ｚ４、Ａ０Ａ２Ａ１ＫＣ８４、及びＡ０Ａ１３３Ｑ６７１のタンパク質であり得るが、これらに限定されない。操作されたＳｒｔＡは、例えばＷＯ２０１６／０１４５０１等の様々な文献で報告されており、その関連する内容が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、ＷＯ２０１６／０１４５０１に記載されているように、Ｑ２ＦＶ９９と比較して１つ又は複数の置換（例えばＰｒｏ９４Ａｒｇ、Ａｓｐｌ６０Ａｓｎ、Ａｓｐｌ６５Ａｌａ、Ｌｙｓｌ９０Ｇｌｕ、Ｌｙｓｌ９６Ｔｈｒ、Ｇｌｕｌ０５Ｌｙｓ及びＧｌｕｌ０８Ｇｌｎ）を有する操作されたＳｒｔＡ、又はＱ２ＦＶ９９と比較してＮ－末端の５９個のアミノ酸が欠失した短縮されたＳｒｔＡを考慮に入れることができる。ＳｒｔＡ変異体のアミノ酸配列は、上記の任意の他のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有することができる。また、野生型ＳｒｔＡと同一又は類似の機能を有するものであれば、当分野で知られている任意の野生型ＳｒｔＡの変異体（例えば１つ又は複数の活性基又はラベルを有するもの）も考慮される。
【0076】
いくつかの実施形態において、ＳｒｔＡは、配列番号１～２６（ＷＴ）から選択されるアミノ酸配列を含む。他のいくつかの実施形態において、ＳｒｔＡは、配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ部位３４、１００、１０５及び１３６にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基は、それぞれＳｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（即ち［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）によって置換される。いくつかの具体的な実施形態において、ソルターゼＡは、配列番号１のＳＮＡＴ対応物である配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【0077】
いくつかの実施形態において、ソルターゼＡは、配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0078】
いくつかの実施形態において、ソルターゼＡは、配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含む。
【0079】
別の態様において、本発明は、ＳｒｔＡを提供し、該ＳｒｔＡは、配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を含み且つ部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含み、又は前記アミノ酸突然変異体と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、本発明は、配列番号２７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＳｒｔＡを提供する。
【0080】
Ｈａｌｏタグ
Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル基質（例えば、ハロアルキル部分－（ＣＨ２）２－３０－Ｘを含む試薬であり、ここでＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、特にＣｌ又はＢｒのようなハロゲンである）からハロゲンを除去し、基質の残りの部分と共有結合を形成する突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼ又はその変異体である。突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼは、例えば、ＷＯ２００６／０９３５２９及びＷＯ２００８／０５４８２１に記載されており、その関連する内容が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明に用いられ得る突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼは、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）デハロゲナーゼ（例えばキサントバクターオートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）デハロゲナーゼ（ＤｈＩＡ））、又はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）デハロゲナーゼ（例えばロドコッカスロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）デハロゲナーゼ（ＤｈａＡ））の突然変異体を含み得るが、これらに限定されず、その例としては、ＷＯ２００８／０５４８２１に記載されているように、触媒トライアド残基にＰｈｅ／Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｇｌｎ／ＡｓｎによるＨｉｓ２７２の置換又はＣｙｓによるＡｓｐ１０６の置換又はその他の置換等、１つ又は複数の置換を含むものが挙げられる。突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼがハロアルキル基質と共有結合を形成できればよい。
Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル基質（例えば、ハロアルキル部分－（ＣＨ２）２－３０－Ｘを含む試薬であり、ここでＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、特にＣｌ又はＢｒのようなハロゲンである）からハロゲンを除去し、基質の残りの部分と共有結合を形成する突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼ又はその変異体である。突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼは、例えば、ＷＯ２００６／０９３５２９及びＷＯ２００８／０５４８２１に記載されており、その関連する内容が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明に用いられ得る突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼは、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）デハロゲナーゼ（例えばキサントバクターオートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）デハロゲナーゼ（ＤｈＩＡ））、又はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）デハロゲナーゼ（例えばロドコッカスロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）デハロゲナーゼ（ＤｈａＡ））の突然変異体を含み得るが、これらに限定されず、その例としては、ＷＯ２００８／０５４８２１に記載されているように、触媒トライアド残基にＰｈｅ／Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｇｌｎ／ＡｓｎによるＨｉｓ２７２の置換又はＣｙｓによるＡｓｐ１０６の置換又はその他の置換等、１つ又は複数の置換を含むものが挙げられる。突然変異のハロアルカンデハロゲナーゼがハロアルキル基質と共有結合を形成できればよい。
【0081】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｈａｌｏタグは、配列番号２８と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0082】
追加の要素及び／又は修飾をさらに含む実施形態
任意に、リガーゼ融合タンパク質は、追加のポリペプチド又はタグ等の１つ又は複数の追加の要素をさらに含んでもよい。好ましくは、リガーゼ融合タンパク質は、実質的に所望の特性を保持する。当業者であれば、融合タンパク質の所望の機能又は特性に応じて適切な要素を選択することができる。このような要素を導入する方法は当分野で知られている。
任意に、リガーゼ融合タンパク質は、追加のポリペプチド又はタグ等の１つ又は複数の追加の要素をさらに含んでもよい。好ましくは、リガーゼ融合タンパク質は、実質的に所望の特性を保持する。当業者であれば、融合タンパク質の所望の機能又は特性に応じて適切な要素を選択することができる。このような要素を導入する方法は当分野で知られている。
【0083】
追加のポリペプチドは、所望の特性を有するタンパク質タグであり得る。タンパク質タグの例としては、レポータータンパク質、結合タグ及び溶解性強化タグを含むが、これらに限定されない。レポータータンパク質の例としては、蛍光タンパク（例えば、緑色蛍光タンパク及びその変異体）、ＡＰ（塩基性ホスファターゼ）、及びＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を含むが、これらに限定されない。結合タグは、共有結合又は非共有結合の方式で対応する結合パートナーに効果的に結合することができる。結合タグの例としては、ポリヒスチジンタグ（即ちＨｉｓタグであり、例えば、Ｈｉｓ６又はＨｉｓ８タグである）、Ｆｃタグ（免疫グロブリン重鎖定常領域（構造ドメイン３及び４））、カルモジュリンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｓタグ（リボ核酸酵素Ｓタンパク質と相互作用する）、アビジン／ストレプトアビジン／ニュートラアビジンに結合するペプチド（例えば、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びＳｔｒｅｐタグＩＩ）、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰタグ、及びＣＬＩＰタグ（ＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの操作された突然変異体）及びその変異体を含むが、これらに限定されない。溶解性強化タグは、組換えタンパク質の一部として発現される場合、一般的に組換えタンパク質の発現レベル及び溶解性を強化することができる。溶解性強化タグの例としては、ＧＢ１タグ（連鎖球菌タンパク質ＧのＢ１構造ドメイン）、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺ構造ドメイン、ＳＵＭＯ（小型ユビキチン関連修飾因子）、チオレドキシン、ＧＳＴ、及びＭＢＰを含むが、これらに限定されない。なお、タンパク質タグの特性は実施形態に対するいかなる制限も構成せず、タンパク質タグは１つ又は複数の特性を有し得ることを理解すべきであり、例えば、レポータータンパク質又は結合タグは溶解性強化タグにもなり得る。
【0084】
追加のポリペプチドは、リンカー、スペーサー又は酵素切断可能な配列（例えばＴＥＶプロテアーゼ認識モチーフ又はトロンビン認識モチーフ）として働くことができる短いペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、当分野で知られている方法でリガーゼとＨａｌｏタグとの間に剛性又は柔軟性のリンカーペプチド（例えばポリグリシンストレッチ、（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここでＧはグリシンで、Ｓはセリンであり、ｎは１～６の整数であり、好ましくは、ｎは２～５の整数である）を挿入して、融合タンパク質の正常な機能を確保する。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは（Ｇ４Ｓ）２である。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【0085】
いくつかの実施形態において、タグは、フルオロフォア、放射性核種、蛍光分子、蛍光量子ドット又はナノ金粒子等のトレーサー分子である。いくつかの実施形態において、タグは、ビオチン等の親和性タグである。このようなタグは、融合タンパク質によって触媒される反応を監視し又は融合タンパク質を追跡又は固定化するために用いられ得る。
【0086】
いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は１つ又は複数の修飾を含み、ここでリガーゼ、Ｈａｌｏタグ及び追加のポリペプチド（該当する場合）は、例えば、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入によって、又は１つ又は複数の適切な残基における部分もしくは活性基の導入によって独立して修飾され、修飾された融合タンパク質の所望の生物学的活性又は機能が、対応する融合タンパク質の生物学的活性又は機能と実質的に類似すればよい。
【0087】
塩基性ｐＩを有するリガーゼの具体的な実施形態
好ましい一態様において、本発明は、由来するリガーゼと比較してｐＩが変化したリガーゼ融合タンパク質を提供し、前記リガーゼは塩基性ｐＩを有し、前記Ｈａｌｏタグは酸性ｐＩを有する。塩基性ｐＩを有するリガーゼと酸性ｐＩを有するＨａｌｏタグとを融合することによって、ｐＩが変化したリガーゼ融合タンパク質が得られ、特定の状況下で特定の有益な効果が生じる。例えば、前記リガーゼ融合タンパク質は、特定の条件下（例えば、所定ｐＨ値における特定の緩衝システム中又はインビボ環境中）のリガーゼと比較して、変化した電荷特性を有し得、それによって、例えば、リガーゼと比較して変化した溶解性、安定性、又は静電相互作用パターン（即ち、荷電物質との静電相互作用を形成する能力）が得られる。
好ましい一態様において、本発明は、由来するリガーゼと比較してｐＩが変化したリガーゼ融合タンパク質を提供し、前記リガーゼは塩基性ｐＩを有し、前記Ｈａｌｏタグは酸性ｐＩを有する。塩基性ｐＩを有するリガーゼと酸性ｐＩを有するＨａｌｏタグとを融合することによって、ｐＩが変化したリガーゼ融合タンパク質が得られ、特定の状況下で特定の有益な効果が生じる。例えば、前記リガーゼ融合タンパク質は、特定の条件下（例えば、所定ｐＨ値における特定の緩衝システム中又はインビボ環境中）のリガーゼと比較して、変化した電荷特性を有し得、それによって、例えば、リガーゼと比較して変化した溶解性、安定性、又は静電相互作用パターン（即ち、荷電物質との静電相互作用を形成する能力）が得られる。
【0088】
いくつかの実施形態において、前記リガーゼは約７．５～約１０．０の等電点（ｐＩ）を有し、前記Ｈａｌｏタグは約４．５～約５．０のｐＩを有し、前記リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約２．０～約４．５ｐＨ単位低い。１つ又は複数の追加の要素（例えば、上記で定義された追加のポリペプチド又はラベル又はそれらの組合せ）及び／又は修飾（例えばアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、又は部分もしくは活性基）を含む実施形態において、好ましくはリガーゼ融合タンパク質とリガーゼとの間の所望のｐＩ差が達成される。いくつかの実施形態において、追加のポリペプチド（該当する場合）は、リガーゼ融合タンパク質の所望のｐＩの達成に役立つ特定のｐＩを有し得る。
【0089】
いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約２．０～約２．５ｐＨ単位低く、例えば、リガーゼのｐＩよりも約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４又は２．５ｐＨ単位低い。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約２．６～約３．０ｐＨ単位低く、例えば、リガーゼのｐＩよりも約２．６、２．７、２．８、２．９又は３．０ｐＨ単位低い。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約３．１～約３．５ｐＨ単位低く、例えば、リガーゼのｐＩよりも約３．１、３．２、３．３、３．４又は３．５ｐＨ単位低い。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約３．６～約４．０ｐＨ単位低く、例えば、リガーゼのｐＩよりも約３．６、３．７、３．８、３．９又は４．０ｐＨ単位低い。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは、リガーゼのｐＩよりも約４．１～約４．５ｐＨ単位低く、例えば、リガーゼのｐＩよりも約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５ｐＨ単位低い。
【0090】
いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは約４．５～約６．５であり、例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４又は６．５である。いくつかの好ましい実施形態において、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは約５．０～約６．０である。
【0091】
いくつかの実施形態において、リガーゼのｐＩは約７．５～約８．５であり、例えば、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４又は８．５である。いくつかの実施形態において、リガーゼのｐＩは約８．６～約９．５、例えば、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４又は９．５である。いくつかの実施形態において、リガーゼのｐＩは約９．６～約１０．０であり、例えば、約９．６、９．７、９．８、９．９又は１０．０である。
【0092】
いくつかの具体的な実施形態において、融合タンパク質のｐＩは約５．０～約６．０であり、且つリガーゼのｐＩは約７．６～約９．７である。
【0093】
いくつかの実施形態において、リガーゼはソルターゼである。前記ソルターゼは、ＳｒｔＡ、ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣ、ＳｒｔＤ、ＳｒｔＥ及びＳｒｔＦからなる群から選択することができる。
【0094】
いくつかの好ましい実施形態において、前記ＳｒｔＡは、配列番号１～１２（ＷＴ）から選択されるアミノ酸配列を含む。他のいくつかの実施形態において、前記ＳｒｔＡは、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ部位３４、１００、１０５及び１３６にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基は、それぞれＳｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（ＶＮＮＳ）によって置換される。これらのＳｒｔＡのｐＩは表１に示される。
【0095】
【表1】
【0096】
いくつかの実施形態において、前記ソルターゼＡは、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、前記ソルターゼＡは、配列番号１～１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、部位３４、１００、１０５及び１３６にＳＮＡＴ、ＹＮＡＴ、ＷＮＤＴ又はＶＮＮＳのアミノ酸置換を含む。
【0098】
具体的な一実施形態において、前記ソルターゼＡは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。該配列番号２７のアミノ酸配列は、配列番号１のＳＮＡＴ対応物であり、且つ８．５０８のｐＩを有する。
【0099】
いくつかの実施形態において、当分野で知られている方法でリガーゼとＨａｌｏタグとの間に剛性又は柔軟性のリンカーペプチド（例えばポリグリシンストレッチ、（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここでＧはグリシンで、Ｓはセリンであり、ｎは１～６の整数であり、好ましくは、ｎは２～５の整数である）を挿入して、融合タンパク質の正常な機能を確保する。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは（Ｇ４Ｓ）２である。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【0100】
リガーゼ融合タンパク質を得る方法
リガーゼ、Ｈａｌｏタグ及び追加のポリペプチド（該当する場合）は、任意の方式で融合することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼはＨａｌｏタグのＮ－末端に位置する。いくつかの実施形態において、ＨａｌｏタグはリガーゼのＮ－末端に位置する。いくつかの実施形態において、当分野で知られている方法でリガーゼとＨａｌｏタグとの間に剛性又は柔軟性のリンカーペプチド（例えばポリグリシンストレッチ、（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここでＧはグリシンで、Ｓはセリンであり、ｎは１～６の整数であり、好ましくは、ｎは２～５の整数である）を挿入して、融合タンパク質の適切な機能を確保してもよい。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは（Ｇ４Ｓ）２である。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
リガーゼ、Ｈａｌｏタグ及び追加のポリペプチド（該当する場合）は、任意の方式で融合することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼはＨａｌｏタグのＮ－末端に位置する。いくつかの実施形態において、ＨａｌｏタグはリガーゼのＮ－末端に位置する。いくつかの実施形態において、当分野で知られている方法でリガーゼとＨａｌｏタグとの間に剛性又は柔軟性のリンカーペプチド（例えばポリグリシンストレッチ、（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここでＧはグリシンで、Ｓはセリンであり、ｎは１～６の整数であり、好ましくは、ｎは２～５の整数である）を挿入して、融合タンパク質の適切な機能を確保してもよい。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは（Ｇ４Ｓ）２である。いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【0101】
リガーゼ融合タンパク質は、例えば、組換えＤＮＡ技術による核酸からの発現、化学合成、酵素触媒カップリング方法又は化学的カップリング方法等、当分野で知られている様々な技術によって得ることができる。いくつかの好ましい実施形態において、リガーゼ融合タンパク質は、核酸によってコードされる組換えタンパク質であり、前記核酸は、リガーゼ及びＨａｌｏタグをコードする核酸配列を含む。組換えタンパク質は、例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、又は昆虫細胞等、好ましくは大腸菌等の細菌のような、適切な宿主細胞において発現及び精製することができる。
【0102】
核酸とベクター
本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質をコードする核酸をさらに提供し、それは本発明のリガーゼをコードする第１ポリヌクレオチドと、Ｈａｌｏタグをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、追加のポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のポリペプチドはリガーゼ及びＨａｌｏタグに操作可能に連結される。追加のポリペプチドの例は、上記の通りである。
本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質をコードする核酸をさらに提供し、それは本発明のリガーゼをコードする第１ポリヌクレオチドと、Ｈａｌｏタグをコードする第２ポリヌクレオチドとを含み、ここで前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、追加のポリペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のポリペプチドはリガーゼ及びＨａｌｏタグに操作可能に連結される。追加のポリペプチドの例は、上記の通りである。
【0103】
いくつかの実施形態において、第１ポリヌクレオチドはソルターゼＡをコードし、第２ポリヌクレオチドはＨａｌｏタグをコードする。いくつかの実施形態において、第１ポリヌクレオチドはソルターゼＡをコードし、前記ソルターゼＡは配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を有し、且つ第２ポリヌクレオチドはＨａｌｏタグをコードし、前記Ｈａｌｏタグは配列番号２８のアミノ酸配列を有する。具体的な一実施形態において、第１ポリヌクレオチドはＳｒｔＡをコードし、前記ＳｒｔＡは配列番号２７のアミノ酸配列を有し、且つ第２ポリヌクレオチドはＨａｌｏタグをコードし、前記Ｈａｌｏタグは配列番号２８のアミノ酸配列を有する。別の具体的な実施形態において、前記核酸はリガーゼ融合タンパク質をコードし、前記リガーゼ融合タンパク質は配列番号２９のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、核酸中の１つ又は複数のヌクレオチドが、本発明の精神に反することなく最適化され得ることが理解される。
【0104】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸は組換え核酸として調製され、該組換え核酸は、例えば調節要素、及びタンパク質タグをコードするポリヌクレオチド等、１つ又は複数の追加のポリヌクレオチドをさらに含み得る。このような調節要素は、本発明の融合タンパク質の発現を調節することができ、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むが、これらに限定されない。本発明の核酸を含む組換え核酸は、当分野で知られている分子クローニング技術、例えば、化学合成、部位特異的突然変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。
【0105】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸をベクター、好ましくは、宿主細胞（例えば、細菌、哺乳動物、酵母又は昆虫細胞）において発現可能な発現ベクターにクローニングする。当業者であれば、リガーゼ融合タンパク質の性質及び使用される宿主細胞に応じて適切な発現ベクターを選択することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌（例えば大腸菌）において発現する細菌発現ベクターである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子をさらに含み得る。発現後、使用されるタンパク質タグに応じて、当分野で知られている方法で融合タンパク質を精製することができる。当業者であれば、使用する宿主細胞の種類及び精製戦略に応じて、適切な発現ベクター、プロモーター、調節要素及びタンパク質タグを選択することができる。
【0106】
固定化リガーゼ
別の態様において、本発明は、支持体に固定化される本発明のリガーゼ融合タンパク質を含む固定化リガーゼを提供する。
別の態様において、本発明は、支持体に固定化される本発明のリガーゼ融合タンパク質を含む固定化リガーゼを提供する。
【0107】
支持体は、任意の材料で作られた固体形態又は半固体形態のものであり得る。支持体の非限定的な例としては、樹脂（例えば、アガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂、エポキシ樹脂又はセルロース樹脂）、ゲル（例えば、アルギン酸ヒドロゲル）、ビーズ／マイクロスフェア／粒子（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性粒子）、プレート、ウェル、チューブ、薄膜、膜、マトリックス、及びガラス（例えば、ガラススライド）を含み得るが、これらに限定されない。
【0108】
いくつかの好ましい実施形態において、支持体は樹脂である。いくつかのより好ましい実施形態において、支持体は、アガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂及びセルロース樹脂からなる群から選択される。具体的な一実施形態において、支持体は、高度に架橋されたアガロース樹脂である。
【0109】
吸着、共有結合又は非共有結合、包埋、カプセル化、及び架橋等の酵素固定化の方法は当分野で知られている。固定化後にリガーゼの最大酵素活性を保持でき、且つコンジュゲーション反応後のコンジュゲート生成物中に遊離リガーゼが最小量で存在することが望まれる。好ましくは、支持体の表面は、リガーゼ融合タンパク質が支持体に共有結合で固定化できるよう、１つ又は複数の官能基を含むように修飾される。
【0110】
好ましくは、支持体は、リガーゼ融合タンパク質の反応基（例えば、アミン、チオール基及びカルボキシレート）又はハロアルキル基質中の反応基と共有結合を形成可能な１つ又は複数の化学活性官能基を含むか、又は支持体は、リガーゼ融合タンパク質に含まれる対応する結合タグ／親和性ラベルの１つ又は複数の結合パートナーを含む。化学活性官能基と反応基との間の対応関係、又は結合タグ／親和性ラベルと結合パートナーとの間の対応関係は当分野で知られている。
【0111】
いくつかの実施形態において、支持体は、リガーゼ融合タンパク質上の反応基（例えば、アミン、チオール基及びカルボキシレート）又はハロアルキル基質中の反応基と共有結合を形成可能な化学活性官能基を含む。いくつかの具体的な実施形態において、支持体に含まれる官能基は、シアネートエステル、イソチオシアナート、イソシアネート、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、アミン、カーボネート、エポキシド、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、クロロギ酸エチル、及び脂肪族アルデヒドからなる群から選択される。
【0112】
いくつかの実施形態において、支持体は、エポキシ活性化樹脂、ＣＮＢｒ（臭化シアン）－活性化樹脂、又はＮＨＳ－活性化樹脂であり、好ましくはエポキシ活性化樹脂である。いくつかの具体的な実施形態において、支持体は、エポキシ活性化されたアガロース樹脂、好ましくはエポキシ活性化された高度架橋アガロース樹脂である。いくつかの好ましい実施形態において、ハロアルキル基質と反応する前に、エポキシ活性化樹脂を前処理してアミノ基を導入する。いくつかの好ましい実施形態において、エポキシ活性化樹脂の前処理は、アンモニアを使用して実施される。いくつかの好ましい実施形態において、エポキシ活性化樹脂の前処理によりオキシラン環上にアミノ基が導入され、且つオキシラン環の開環によりヒドロキシ基が提供される。このようなヒドロキシ基は、後続の支持体調製工程において任意にエンドキャップされる。具体的な一実施形態において、エポキシ活性化樹脂の前処理によりオキシラン環上にアミノ基が導入され、且つオキシラン環の開環によりヒドロキシ基が提供され、該ヒドロキシ基は、後続の支持体調製工程においてエステル化試薬（例えば、Ａｃ２Ｏ等のアセチル化試薬）によって任意にエステル化される。このように前処理されたエポキシ活性化樹脂は、上記で定義した「エポキシ活性化樹脂」の範囲内である。いくつかの好ましい実施形態において、前記樹脂は、アガロース樹脂（例えば高度架橋アガロース樹脂）又はポリメチルメタクリレート樹脂である。
【0113】
他のいくつかの実施形態において、支持体は、例えば付加のタグ又は親和性ラベルのような、リガーゼ融合タンパク質に含まれる対応する結合タグ／親和性ラベルの１つ又は複数の結合パートナーを含む。反応基間又は結合タグ／親和性ラベルと結合パートナーとの間の対応関係は当分野で知られている。結合タグ／親和性ラベルと対応する結合パートナーの例としては、ＨｉｓタグとＮｉ２＋、ビオチン／ＳＰＢタグ／Ｓｔｒｅｐタグ／ＳｔｒｅｐタグＩＩとストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジン、ＧＳＴタグとグルタチオン、Ｆｃタグとタンパク質Ａ、カルモジュリンタグとＣａ２＋、ＭＢＰとアミロース、Ｓタグとリボ核酸酵素Ｓ－タンパク質、ＳＮＡＰタグとベンジルグアニン（ＢＧ）誘導体、及びＣＬＩＰタグとベンジルシトシン（ＢＣ）誘導体を含み得るが、これらに限定されない。
【0114】
いくつかの好ましい実施形態において、支持体は、ハロアルキルリンカーを含むことによって、Ｈａｌｏタグとの共有結合相互作用を形成するように官能化される。ハロアルキルリンカーは、支持体に含まれる１つ又は複数の官能基とハロアルキル基質中の１つ又は複数の反応基との共有結合によって支持体に導入されてもよく、このように得られた支持体は、ハロアルキルリンカー修飾支持体とも呼ばれる。ハロアルキルリンカー修飾支持体は、上記で定義した「支持体」の範囲内である。ハロアルキル基質の例としては、例えばＵＳ２００６００２４８０８Ａ１及びＷＯ２００６０９３５２９に記載したものを含むが、これらに限定されない。ハロアルキル基質及びそのような支持体の調製方法は、例えば、米国特許第７，４２９，４７２号、第７，８８８，０８６号及び第８，２０２，７００号、日本特許第４７４８６８５号に記載されており、その関連する内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0115】
ハロアルキル基質は、第１級又は第２級ハロ基、好ましくは第１級ハロ基を含むハロアルキル部分を含み得る。ハロアルキル部分中のハロ基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから、好ましくはＣｌ及びＢｒから選択される。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基質は、下記式（Ｉ）の構造を有する。
（Ｆ１ａ－Ｈ１ｂ）ｒ－Ｌｈ－（Ｆ２ｂ－Ｈ２ａ）ｓ（Ｉ）
式中、
Ｆ１とＦ２は独立して、支持体に含まれる化学活性官能基と共有結合を形成可能な反応基を含む部分であり、
Ｈ１とＨ２は、ハロＣ２－３０アルキルから独立して選択され、
Ｌｈは、化学結合であるか又はＣ３－２００アルキレン基であり、ここで前記アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は、－Ｏ－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－によって任意に置き換えられ、
Ｌｈは、－Ｏ－Ｃ１－１０アルキル基、－ＮＨ－Ｃ１－１０アルキル基、－（ＣＯ）－Ｃ１－１０アルキル基、－ＮＨ（ＣＯ）－Ｃ１－１０アルキル基、及び－（ＣＯ）ＮＨ－Ｃ１－１０アルキル基から選択される１、２又は３個の置換基によって任意に置換され、
ａとｂが異なることを条件として、ａは０又は１であり、ｂは０又は１であり、
ｒは１～１００の整数であり、
ｓは１～１００の整数である。
（Ｆ１ａ－Ｈ１ｂ）ｒ－Ｌｈ－（Ｆ２ｂ－Ｈ２ａ）ｓ（Ｉ）
式中、
Ｆ１とＦ２は独立して、支持体に含まれる化学活性官能基と共有結合を形成可能な反応基を含む部分であり、
Ｈ１とＨ２は、ハロＣ２－３０アルキルから独立して選択され、
Ｌｈは、化学結合であるか又はＣ３－２００アルキレン基であり、ここで前記アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は、－Ｏ－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、及び－（ＣＯ）ＮＨ－によって任意に置き換えられ、
Ｌｈは、－Ｏ－Ｃ１－１０アルキル基、－ＮＨ－Ｃ１－１０アルキル基、－（ＣＯ）－Ｃ１－１０アルキル基、－ＮＨ（ＣＯ）－Ｃ１－１０アルキル基、及び－（ＣＯ）ＮＨ－Ｃ１－１０アルキル基から選択される１、２又は３個の置換基によって任意に置換され、
ａとｂが異なることを条件として、ａは０又は１であり、ｂは０又は１であり、
ｒは１～１００の整数であり、
ｓは１～１００の整数である。
【0116】
いくつかの実施形態において、ｒは、１～１０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。いくつかの実施形態において、ｓは、１～１０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。いくつかの実施形態において、Ｆ１又はＦ２中の反応基は、アミノ基、アミン、チオール基及び活性エステルから選択される。いくつかの実施形態において、活性エステルは、１つ又は複数のカルボン酸ラジカル（例えば、４－ニトロフェノールのような電子欠乏フェノール等の適切なアルコール又はフェノールの炭酸モノエステル中、又は、例えば、ＮＨＳエステル又はスルホ－ＮＨＳエステル中）、又は、１つ又は複数のスルホン酸ラジカル（例えば、ＭｓＯ－等のメタンスルホン酸活性エステル中）を含む。具体的な一実施形態において、Ｆ１又はＦ２は
である。
【化1】
【0117】
いくつかの実施形態において、Ｈ１とＨ２は、ハロＣ２－２０アルキル基、好ましくはハロＣ２－１０アルキル基、特にハロＣ６アルキルから独立して選択される。いくつかの具体的な実施形態において、Ｈ１又はＨ２中のアルキル基は、直鎖アルキルである。具体的な一実施形態において、Ｈ１又はＨ２は（ＣＨ２）２－３０－Ｘ、好ましくは（ＣＨ２）２－２０－Ｘ、より好ましくは（ＣＨ２）２－１０－Ｘ、特に（ＣＨ２）６－Ｘであり、ここでＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲンである。
【0118】
いくつかの好ましい実施形態において、支持体は、ＨａｌｏＬｉｎｋＴＭ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。
【0119】
いくつかのより好ましい実施形態において、支持体は、ハロアルキルリンカーを含み得る樹脂であり、前記ハロアルキルリンカーは、－（ＣＨ２）２－３０－Ｘの構造を含み、ここでＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲンである。具体的な一実施形態において、支持体は、ハロアリルリンカー修飾樹脂、好ましくはアガロース樹脂又はポリメチルメタクリレート樹脂、より好ましくは高度架橋アガロース樹脂である。
【0120】
いくつかの具体的な実施形態において、ａは１、ｂは０、ｒは１、ｓは１、Ｆ１は
Ｌｈは
Ｈ２は（ＣＨ２）２－２０－Ｃｌであり、前記ハロアルキル基質は、式（Ｉ－１）の構造を有するクロロアルキル基質である。
【化2】
【化3】
【0121】
【化4】
具体的な一実施形態において、ｕは３、ｖは２、ｗは５であり、前記クロロアルキル基質は、下記式（Ｉ－１－１）の構造を有する。
【化5】
【0122】
いくつかの実施形態において、支持体は、クロロアルキルリンカー修飾支持体であり、且つ式（ＩＩ）の構造を有する。
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数であり、
は支持体を表し、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスであり、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度架橋アガロース樹脂である。なお、明確にするために、支持体に連結される単一のクロロアルキル－リンカー部分のみについて説明するが、支持体に連結されるこのようなクロロアルキル－リンカー部分が多数存在することを理解すべきである。
【化6】
【化7】
【0123】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）に示されるクロロアルキルリンカー修飾支持体は、
で表される樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスと、式（Ｉ－１）のクロロアルキル基質とを使用して調製される。
【化8】
【0124】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）に示されるクロロアルキルリンカー修飾支持体は、前処理されたエポキシ活性化樹脂から調製され、前記エポキシ活性化樹脂は、エポキシ活性化樹脂のオキシラン環上にアミノ基を導入することによって調製され、前処理過程におけるオキシラン環の開環によってヒドロキシ基が提供され、該ヒドロキシ基が後続の支持体調製工程においてＡｃ２Ｏで任意にエステル化され、式（ＩＩ）に示される支持体は、式（ＩＩ－１）の構造を有する。
式中、
サブ構造
は、前処理されたエポキシ活性化樹脂を表し、ここで
部分はオキシラン環を表し、それはアミノ基と反応して開環し、ヒドロキシ基が得られ、その後ヒドロキシ基がエステル化されてＡｃＯ－を形成し、
部分は、前処理されたエポキシ活性化樹脂の他の部分を表す。
【化9】
サブ構造
【化10】
【化11】
【化12】
【0125】
いくつかの実施形態において、固定化リガーゼは下記構造を有する。
【0126】
Ｓｕｐｐｏｒｔ－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ
ここで、
Ｓｕｐｐｏｒｔは、支持体（例えば固体支持体）であり、例えば、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスから選択され、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度架橋アガロース樹脂であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、支持体に共有結合されるリンカー部分であり、例えば、１０～６０個の炭素原子の鎖を含み、１つ又は複数のエーテル、エステル、カルバメート及び／又はアミド結合を任意に含み、例えば、式（ＩＩ－１’）又は（ＩＩ’）のリンカー部分であり、
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数であり、
ＨａｌｏＴａｇは、Ｈａｌｏタグ（ハロアルカンデハロゲナーゼポリペプチド）であり、リンカーに共有結合され、
Ｌｉｇａｓｅはリガーゼであり、
ここで１つ又は複数の「－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ」部分は同じ支持体に結合される。
ここで、
Ｓｕｐｐｏｒｔは、支持体（例えば固体支持体）であり、例えば、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスから選択され、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度架橋アガロース樹脂であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、支持体に共有結合されるリンカー部分であり、例えば、１０～６０個の炭素原子の鎖を含み、１つ又は複数のエーテル、エステル、カルバメート及び／又はアミド結合を任意に含み、例えば、式（ＩＩ－１’）又は（ＩＩ’）のリンカー部分であり、
【化13】
ＨａｌｏＴａｇは、Ｈａｌｏタグ（ハロアルカンデハロゲナーゼポリペプチド）であり、リンカーに共有結合され、
Ｌｉｇａｓｅはリガーゼであり、
ここで１つ又は複数の「－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ」部分は同じ支持体に結合される。
【0127】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ－１’）のリンカー部分を含む固定化リガーゼは、以下の１）と２）の反応によって得られる。１）１つ又は複数のクロロアルキル基質が支持体と反応して、クロロアルキルリンカー修飾支持体を形成する。２）その後、クロロアルキルリンカー修飾支持体がＨａｌｏＴａｇ（例えば、リガーゼ融合タンパク質に含まれるＨａｌｏタグ）と反応して、前記固定化リガーゼを得る。
【0128】
リガーゼ融合タンパク質と固定化リガーゼの用途
本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼのコンジュゲート調製における用途をさらに提供する。コンジュゲートの種類は限定されない。コンジュゲートは、リガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼを第１部分及び第２部分と接触させて、コンジュゲートさせることによって得ることができ、ここで第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフを含み、他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む。
本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼのコンジュゲート調製における用途をさらに提供する。コンジュゲートの種類は限定されない。コンジュゲートは、リガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼを第１部分及び第２部分と接触させて、コンジュゲートさせることによって得ることができ、ここで第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフを含み、他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む。
【0129】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートはバイオコンジュゲートである。バイオコンジュゲートの例としては、ｓｉＲＮＡコンジュゲート、ペプチド－ホルモンコンジュゲート、ペプチド－ペプチドコンジュゲート、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、及び多重特異性抗体を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、受容体、抗体又は抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートである。
【0130】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｐＩは、リガーゼ融合タンパク質のｐＩよりも約１．０～約４．０ｐＨ単位高く、例えば、リガーゼ融合タンパク質のｐＩよりも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０ｐＨ単位高い。いくつかの好ましい実施形態において、コンジュゲートのｐＩは、リガーゼ融合タンパク質のｐＩよりも約２．０～約４．０ｐＨ単位高い。
【0131】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｐＩは約５．５～約１０．５であり、例えば、約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９又は１０．０である。いくつかの好ましい実施形態において、コンジュゲートのｐＩは約７．５～約１０．０である。いくつかの具体的な実施形態において、コンジュゲートのｐＩは約８．０～約９．０である。
【0132】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｐＩは約５．５～約１０．５であり、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは約４．５～約６．５である。いくつかの具体的な実施形態において、コンジュゲートのｐＩは約８．０～約９．０であり、リガーゼ融合タンパク質のｐＩは約５．０～約６．０である。
【0133】
いくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質とコンジュゲートは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を使用して互いに分離することができる。前記ＩＥＸは、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又はそれらの組合せであり得る。他のいくつかの実施形態において、リガーゼ融合タンパク質とコンジュゲートは、ｉＣＩＥＦ又はＣＩＥＦ等の等電点電気泳動を用いて互いに分離することができる。
【0134】
いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼは、ソルターゼ、好ましくはソルターゼＡであり、コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートである。
【0135】
本発明の方法
別の態様において、本発明は、第１部分及び第２部分を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記リガーゼユニットはリガーゼを含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む。
別の態様において、本発明は、第１部分及び第２部分を含むコンジュゲートを調製するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、前記コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記リガーゼユニットはリガーゼを含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、第１部分と第２部分は、リガーゼ供与体基質認識モチーフとリガーゼ受容体基質認識モチーフとのカップリングによって互いに連結される。
【0137】
いくつかの実施形態において、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つはリンカーを含み、好ましくは、前記第１部分又は第２部分に含まれるリガーゼ認識モチーフ（即ち、リガーゼ供与体基質認識モチーフ又はリガーゼ受容体基質認識モチーフ）はリンカーの一部である。いくつかの実施形態において、前記第１部分又は第２部分は、ペイロード及びリンカーを含み、前記リンカーは、リガーゼ認識モチーフと、ペイロードに連結される１つ又は複数の構造部分とを含み得る。他の実施形態において、前記第１部分又は第２部分は、生体分子及びリンカーを含み、リンカーは、リガーゼ認識モチーフと、生体分子に連結される１つ又は複数の構造部分とを含み得る。さらなる実施形態において、生体分子及び／又はペイロードは、活性基、スペーサー及びラベル等の１つ又は複数の付加の部分を含むように独立して修飾される。
【0138】
コンジュゲートの「第１部分」及び「第２部分」という用語は、本明細書においてコンジュゲートの各部分を指すために使用される。例えば、バイオコンジュゲートの場合、第１部分は、コンジュゲートの生体分子部分であり得、第２部分は、別の機能部分又はコンジュゲートの残りの部分であり得る。「第１」及び「第２」は、単に明確にする目的で異なる部分を指定するために使用され、いかなる制限も構成しないことを理解すべきである。
【0139】
「システム１」及び「システム２」という用語は、単にコンジュゲートすべき部分を含む異なる部分を指定するために使用され、いかなる制限も構成しない。システム１とシステム２は、それぞれ独立して、水性形態、固体形態又は半固体形態等の任意の形態であり得る。好ましくは、システム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、（水）溶液又は流体等の水性形態である。システム１とシステム２は、それぞれ独立して、培養物（例えば、組織培養物、哺乳動物細胞培養物、酵母細胞培養物、細菌細胞培養物及びファージ培養物）、収穫された細胞培養液、抗体を含む溶液、リンカー－ペイロード中間体を含む溶液等から選択することができる。「システム１」と「システム２」は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは異なっている。
【0140】
リガーゼユニット
リガーゼユニット（ｌｉｇａｓｅ ｕｎｉｔ）は、制限なしに任意のリガーゼを含むことができる。具体的には、２つの部分上の認識モチーフを認識し、２つの部分間のコンジュゲーションを触媒することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼはソルターゼである。ソルターゼは、ＳｒｔＡ、ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣ、ＳｒｔＤ、ＳｒｔＥ、ＳｒｔＦ及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼは、上述したＳｒｔＡである。いくつかの実施形態において、リガーゼは、上述したタンパク質タグ又はラベル等の１つ又は複数の追加の要素を含むか、又は１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含むことによって、さらに修飾される。
リガーゼユニット（ｌｉｇａｓｅ ｕｎｉｔ）は、制限なしに任意のリガーゼを含むことができる。具体的には、２つの部分上の認識モチーフを認識し、２つの部分間のコンジュゲーションを触媒することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼはソルターゼである。ソルターゼは、ＳｒｔＡ、ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣ、ＳｒｔＤ、ＳｒｔＥ、ＳｒｔＦ及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、リガーゼは、上述したＳｒｔＡである。いくつかの実施形態において、リガーゼは、上述したタンパク質タグ又はラベル等の１つ又は複数の追加の要素を含むか、又は１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含むことによって、さらに修飾される。
【0141】
リガーゼは、遊離リガーゼであってもよいし、又は支持体に固定化されていてもよい。好ましくは、リガーゼは支持体に固定化され、これにより、より高い操作安定性と再利用性、より低い酵素汚染、より少ない占有面積及び連続生産を実現することができる。支持体は、任意の材料で作られた固体形態又は半固体形態であり得る。支持体の非限定的な例としては、樹脂（例えば、アガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂、エポキシ樹脂又はセルロース樹脂）、ゲル（例えばアルギン酸ヒドロゲル）、ビーズ／マイクロスフェア／粒子（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性粒子）、プレート、ウェル、チューブ、薄膜（ｆｉｌｍ）、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）、マトリックス、及びガラス（例えば、ガラススライド）を含み得るが、これらに限定されない。
【0142】
吸着、共有結合又は非共有結合、包埋、カプセル化、及び架橋等の酵素固定化方法は当分野で知られている。固定化後にリガーゼの最大酵素活性を保持でき、且つコンジュゲーション反応後のコンジュゲート生成物中に遊離リガーゼが最小量で存在することが望まれる。
【0143】
より好ましくは、支持体から脱落する遊離リガーゼの量を減少させるために、リガーゼは支持体に共有結合で固定化される。タンパク質の非特異的共有結合固定化の方法は当分野で知られている。いくつかの実施形態において、支持体は、リガーゼ上の反応基（例えば、アミン、チオール基及びカルボキシレート）と共有結合を形成可能な化学活性官能基を含む。このような官能基は、イソチオシアナート、イソシアネート、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カーボネート、エポキシド、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、クロロギ酸エチル及び脂肪族アルデヒドからなる群から選択することができる。
【0144】
最も好ましくは、リガーゼは、最大の酵素活性が保持されるように、自己標識タンパク質タグによって支持体に共有結合で固定化される。自己標識タンパク質タグは、その基質と共有結合相互作用を形成することができる。このようなタンパク質タグは、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、Ｈａｌｏタグ及びその変異体を含み得るが、これらに限定されない。それに応じて、支持体は、タンパク質タグの対応基質を含み得る。
【0145】
いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼユニットは本発明のリガーゼ融合タンパク質を含む。いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼユニットは本発明の固定化リガーゼを含む。
【0146】
コンジュゲート
前記方法は、様々なコンジュゲートの調製に使用できる。いくつかの実施形態において、前記コンジュゲートは、上述したバイオコンジュゲートである。
前記方法は、様々なコンジュゲートの調製に使用できる。いくつかの実施形態において、前記コンジュゲートは、上述したバイオコンジュゲートである。
【0147】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の構造を有し、第１部分はＴを含み、第２部分は式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体を含み、
式中、
Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される生体分子を含み、
Ｌは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの他方を含むリンカーを含み、
Ｐはペイロードを含み、
ｚは１～２０の整数であり、
ｔは１～２０の整数である。
【化14】
Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される生体分子を含み、
Ｌは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの他方を含むリンカーを含み、
Ｐはペイロードを含み、
ｚは１～２０の整数であり、
ｔは１～２０の整数である。
【0148】
ｔは、式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体を形成するために単一のリンカーにカップリングされるペイロードの数を表す。Ｚは、単一のＴにカップリングされて式（ＩＩＩ）の化合物を形成する式（ＩＶ）の化合物の数を表す。
【0149】
一実施形態において、ｚは、１～１０、１～８、１～６又は１～４の整数から選択される。別の実施形態において、ｚは１又は２である。具体的な一実施形態において、ｚは２である。
【0150】
生体分子
本発明において、生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、及び核酸と類似体からなる群から選択することができる。一実施形態において、Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を任意に含むか、又はこのようなモチーフのうちの１つを有するように任意に修飾される。
本発明において、生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、及び核酸と類似体からなる群から選択することができる。一実施形態において、Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を任意に含むか、又はこのようなモチーフのうちの１つを有するように任意に修飾される。
【0151】
いくつかの実施形態において、Ｔは、受容体、抗体又は抗体フラグメントを含む分子であり、該分子はリガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される。別のいくつかの実施形態において、Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される受容体、抗体又は抗体フラグメントである。好ましい一実施形態において、Ｔは、Ｆｃフラグメント及び抗体の抗原結合フラグメントを含む分子であり、該分子はリガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される。別のいくつかの実施形態において、Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される可溶性受容体である。
【0152】
いくつかの実施形態において、Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される標的化分子である。標的化分子（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）によって認識されるターゲットは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１１７／ＫＩＴ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１７４、ＣＤ２２７／ＭＵＣ１、ＣＤ３５２、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＣＮ３３、ＧＰＮＭＢ、ＥＮＰＰ３、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＳＬＣ４４Ａ４／ＡＧＳ－５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ１、ＬＹ６Ｅ、ＬＩＶ１、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＳＬＩＴＲＫ６、ＨＧＦＲ／ｃＭｅｔ、ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、ＡＸＬ、ＮａＰｉ２Ｂ、ＧＣＣ、ＳＴＥＡＰ１、ＭＵＣ１６、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＥＴＢＲ、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、ＦＯＬＲ１、ＬＡＭＰ１、Ｃａｄｈｅｒｉｎ６、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＣＡ６、ＣａｎＡｇ、インテグリンαＶ、ＴＤＧＦ１、エフリン（Ｅｐｈｒｉｎ）Ａ４、Ｔｒｏｐ２、ＰＴＫ７、ＮＯＴＣＨ３、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３を含むが、これらに限定されない。
【0153】
いくつかの実施形態において、標的化分子は、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される抗ヒトＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗ヒトＨＥＲ２抗体の例としては、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）及びトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を含むが、これらに限定されない。
【0154】
一実施形態において、標的化分子は、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される抗ヒトＴＲＯＰ２抗体又はその抗原結合フラグメントから選択される１つ又は複数である。具体的な一実施形態において、抗ヒトＴＲＯＰ２抗体は、ｈｒＳ７（ＵＳ２０１４０１２００３５）に基づく操作された抗ＴＲＯＰ２抗体から選択される１つ又は複数である。別の具体的な実施形態において、抗ヒトＴＲＯＰ２抗体は、ＭＡＡＡ１１８１ａ（ＵＳ２０１６０２９７８９０）に基づく操作された抗ＴＲＯＰ２抗体から選択される１つ又は複数である。
【0155】
好ましい一実施形態において、抗ヒトＨＥＲ２又はＴＲＯＰ２抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、及び抗体模倣体からなる群から選択される組換え抗体である。いくつかの実施形態において、抗体模倣体は、ｓｃＦｖ、ミニ抗体、二重抗体、ナノ抗体からなる群から選択される。後述するように、式（ＩＶ）の化合物にカップリングするために、本発明の標的化分子は、式（Ｖ）の化合物中のＤ１又はＤ２に連結する修飾部分、即ちリンカー中のリガーゼ受容体又は供与体基質認識モチーフを含む部分を、含んでもよい。このような修飾部分の導入位置は限定されず、例えば、標的化分子が抗体である場合、その導入位置は、抗体重鎖又は軽鎖のＣ－末端又はＮ－末端であってもよいが、これらに限定されない。
【0156】
別のいくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物中のＤｌ又はＤ２にカップリングするための修飾部分は、抗体重鎖又は軽鎖の非末端位置に導入してもよく、その導入は、例えば、化学修飾方法を使用することができる。
【0157】
いくつかの実施形態において、本発明の標的化分子は、末端修飾を含み得る抗体又はその抗原結合フラグメントである。末端修飾とは、抗体重鎖又は軽鎖のＣ－末端又はＮ－末端における修飾を指し、該修飾は、例えばリガーゼ認識モチーフを含む。別のいくつかの実施形態において、末端修飾は、２～１００個のアミノ酸のスペーサーＳｐ２をさらに含んでもよく、ここで抗体、Ｓｐ２及びリガーゼ認識モチーフは順に連結される。好ましい一実施形態において、Ｓｐ２は、２～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列である。いくつかの具体的な実施形態において、Ｓｐ２スペーサー配列は、ＧＡ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群、特にＧＡから選択される。
【0158】
好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖は、野生型（ＬＣ）と、リガーゼ認識モチーフＬＰＸＴＧを直接導入することによって修飾されるＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧを導入することによって修飾されるＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴＬ）との３つの種類を含む。抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、野生型（ＨＣ）と、リガーゼ認識モチーフＬＰＸＴＧを直接導入することによって修飾されるＣ－末端修飾重鎖（ＨＣＣＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ供与体基質認識モチーフＬＰＸＴＧを導入することによって修飾されるＣ－末端修飾重鎖（ＨＣＣＴＬ）との３つの種類を含む。Ｘは、任意の天然又は非天然の単一アミノ酸であり得る。式（ＩＶ）の化合物中のｚが１又は２である場合、上記重鎖と軽鎖の組合せは、アミノ酸配列表に示すように、８つの好ましい抗体分子を形成することができる。
【0159】
いくつかの好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖は、野生型（ＬＣ）と、リガーゼ認識モチーフＧＧＧを直接導入することによって修飾されるＮ－末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴ）と、導入短いペプチドスペーサー及びリガーゼ受容体基質認識モチーフＧＧＧを導入することによって修飾されるＮ－末端修飾軽鎖（ＬＣＮＴＬ）との３つの種類を含む。抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、野生型（ＨＣ）と、リガーゼ認識モチーフＧＧＧを直接導入することによって修飾されるＮ－末端修飾重鎖（ＨＣＮＴ）と、短いペプチドスペーサー及びリガーゼ受容体基質認識モチーフＧＧＧを導入することによって修飾されるＮ－末端修飾重鎖（ＨＣＮＴＬ）との３つの種類を含む。
【0160】
本発明のコンジュゲートは、ペイロードをさらに含んでもよい。前記ペイロードは本発明で説明した通りである。
【0161】
リンカー
いくつかの実施形態において、前記リンカー、即ち式（ＩＩＩ）及び式（Ｖ）中のＬは、式（Ｖ）の化合物であり、
（Ａ１ｐ－Ｄ１ｑ－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２ｑ－Ｄ２ｐ）ｔ（Ｖ）
式中、
Ｄ１とＤ２は独立して、リガーゼ受容体又は供与体基質認識モチーフを含む部分であり、
Ａ１とＡ２は独立して、ペイロードに連結する結合、又はペイロードにカップリング可能な反応基を含む部分を表し、
Ｌｋは化学結合、Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３又はＬ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４又はＬ４－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３又はＬ４であり、
Ｌ１とＬ３は、それぞれ独立して、
－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－、及びＣ１－４アルキレン基と－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－のうちの１つの基との組合せからなる群から選択され、
Ｌ２は存在しないか又はＣ７－３４アルキレン基であり、ここで前記アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は－Ｏ－によって任意に置き換えられ、
Ｌ１、Ｌ２とＬ３は、それぞれ任意に且つ独立して、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって置換され、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、－Ｃ１－６アルキル基、－（ＣＯ）－Ｃ１－６アルキル基、及び－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｃ１－６アルキル基からなる群から選択され、
Ｌ４は、ペプチド配列（アミド結合は、α－アミノ基とカルボキシル基の縮合反応によって形成される）であり、ここで前記ペプチド配列は、任意に誘導体化されたＬｙｓ（リジン）（数が１～１００）を含むか、又は任意に誘導体化されたＣｙｓ（システイン）（数が１～１００）を含み、
ＹとＷはそれぞれ独立して、存在しないか、又は切断可能な配列、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
切断可能な配列は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列を含み、切断可能な配列は１～１０個のアミノ酸を含み、
Ｓｐ１は、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｐとｑが異なることを条件として、ｐは０又は１であり、ｑは０又は１であり、
ｔは、式（ＩＩＩ）に定義されている通りである。
いくつかの実施形態において、前記リンカー、即ち式（ＩＩＩ）及び式（Ｖ）中のＬは、式（Ｖ）の化合物であり、
（Ａ１ｐ－Ｄ１ｑ－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２ｑ－Ｄ２ｐ）ｔ（Ｖ）
式中、
Ｄ１とＤ２は独立して、リガーゼ受容体又は供与体基質認識モチーフを含む部分であり、
Ａ１とＡ２は独立して、ペイロードに連結する結合、又はペイロードにカップリング可能な反応基を含む部分を表し、
Ｌｋは化学結合、Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３又はＬ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４又はＬ４－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３又はＬ４であり、
Ｌ１とＬ３は、それぞれ独立して、
－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－、及びＣ１－４アルキレン基と－ＣＨ２－、－ＮＨ－、－（ＣＯ）－、－ＮＨ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）ＮＨ－のうちの１つの基との組合せからなる群から選択され、
Ｌ２は存在しないか又はＣ７－３４アルキレン基であり、ここで前記アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は－Ｏ－によって任意に置き換えられ、
Ｌ１、Ｌ２とＬ３は、それぞれ任意に且つ独立して、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって置換され、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素、－Ｃ１－６アルキル基、－（ＣＯ）－Ｃ１－６アルキル基、及び－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｃ１－６アルキル基からなる群から選択され、
Ｌ４は、ペプチド配列（アミド結合は、α－アミノ基とカルボキシル基の縮合反応によって形成される）であり、ここで前記ペプチド配列は、任意に誘導体化されたＬｙｓ（リジン）（数が１～１００）を含むか、又は任意に誘導体化されたＣｙｓ（システイン）（数が１～１００）を含み、
ＹとＷはそれぞれ独立して、存在しないか、又は切断可能な配列、スペーサーＳｐ１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
切断可能な配列は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列を含み、切断可能な配列は１～１０個のアミノ酸を含み、
Ｓｐ１は、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列、ＰＡＢ及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｐとｑが異なることを条件として、ｐは０又は１であり、ｑは０又は１であり、
ｔは、式（ＩＩＩ）に定義されている通りである。
【0162】
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）のリンカーは、Ａ１又はＡ２によってペイロードに連結され、Ｄ１又はＤ２と生体分子Ｔに含まれるリガーゼ受容体基質認識モチーフ又はリガーゼ供与体基質認識モチーフとのカップリングによって生体分子Ｔに連結される。任意に、生体分子Ｔ中のリガーゼ認識モチーフは、例えば組換え方法又は化学修飾方法によって生体分子中に導入される修飾部分の形態で存在する。
【0163】
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）は、システム１の第１部分に含まれるか、又はシステム２の第２部分に含まれる。
【0164】
いくつかの実施形態において、Ｌ１、Ｌ２とＬ３は独立して、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって置換される。置換は、例えば、（－ＣＨ３）、（－ＣＨ２－）又は
構造上に発生し、特に（－ＣＨ２－）上に発生する。
【化15】
【0165】
いくつかの実施形態において、Ｌ２はＣ７－３４アルキレン基であり、ここでアルキレン基は直鎖又は分枝鎖アルキレン基であり、アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は－Ｏ－によって任意に置き換えられ得、アルキレン基は、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって任意に置換される。さらなる実施形態において、Ｌ２は、－ＯＲ１及び－ＮＲ１Ｒ２から選択される１、２又は３個の置換基によって任意に置換される基から選択され、ここで前記基は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、１－メチルエチレン基、２－メチルエチレン基、２－メチルプロピレン基、及び２－エチルプロピレン基である。
【0166】
別のいくつかの実施形態において、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ１－４アルキレン基であり、ｉは２～１０の整数である。「－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－」は、ＰＥＧユニットが重合して形成した構造を表し、ここｉはＰＥＧユニットの数を表す。別のいくつかの実施形態において、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ１－２アルキレン基である。いくつかの具体的な実施形態において、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－である。別のいくつかの実施形態において、Ｌ２はＣ１－４アルキレン基－（Ｏ－Ｃ２Ｈ４）ｉである。別のいくつかの実施形態において、Ｌ２はＣ１－２アルキレン基－（Ｏ－Ｃ２Ｈ４）ｉである。いくつかの具体的な実施形態において、Ｌ２は－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－Ｃ２Ｈ４）ｉ－である。いくつかの実施形態において、ｉは、２～１０、２～８、２～６、２～４又は４～６から選択される。具体的な一実施形態において、ｉは４である。
【0167】
Ｌ４の別の実施形態において、リジンのε－アミノ基は、所望のカップリング数に応じて、適切な二官能性架橋剤によってＡ１又はＡ２部分にマレイミド官能基を導入するために用いられ得、又は別のリジンのα－カルボキシル基とアミノ結合を形成して分枝鎖を形成するために用いられ得、その後、分枝鎖中のリジンのα－及びε－アミノ基は、適切な二官能性架橋剤によってマレイミド基を導入することができる。このように、主鎖及び／又は分枝鎖側鎖中のリジンの数を増やすことにより、このようなＬ４部分によって導入されるＡ１又はＡ２部分の数は１～１０００に達することができる。
【0168】
Ｌ４の別の実施形態において、各システインのメルカプト基は、所望のカップリング数に応じて、Ａ１又はＡ２中のマレイミド官能基と反応するために用いられ得る。Ａ１又はＡ２はそれによってＬｋに連結することができる。Ａ１とＡ２はそれぞれ、ペイロードにカップリング可能な反応基をさらに含む。Ｌ４中、例えばＬ４の主鎖及び／又は分枝鎖側鎖中のシステインの数を増やすことにより、このようなＬ４部分によって導入されるＡ１又はＡ２部分の数は１～１０００に達することができる。
【0169】
いくつかの実施形態において、Ｌ４は、任意に誘導体化されたリジンである。
【0170】
好ましい一実施形態において、リジンの誘導体化は、次の１）と２）からなる群から選択される。１）カルボキシル基をアミド化し、得られたアミドＮＨ２は、Ｃ１－６アルキル基によって任意に置換される。２）カルボキシル基及び／又はアミノ基を、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント又は１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントに連結させ、ここで前記アミノ酸フラグメントは、好ましくはＧｌｙである。
【0171】
いくつかの実施形態において、ＹとＷはそれぞれ独立して、存在しないか、又は切断可能な配列、スペーサーＳｐｌ及びそれらの組合せからなる群から選択される。具体的な一実施形態において、Ｙは存在しない。別の具体的な実施形態において、Ｗは存在しない。さらなる具体的な実施形態において、ＹとＷは両方とも存在しない。いくつかの実施形態において、切断可能な配列は、酵素基質として認識でき、且つ酵素によって切断できるアミノ酸配列を含む。いくつかの具体的な実施形態において、切断可能な配列は、細胞のリソソームにおいて酵素的に切断可能である。別のいくつかの具体的な実施形態において、切断可能な配列はプロテアーゼ、特にカテプシンによって切断することができる。さらなる具体的な実施形態において、切断可能な配列はグルタミナーゼによって切断することができる。いくつかの実施形態において、切断可能な配列は、カテプシン制限部位、グルタミナーゼ制限部位及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、切断可能な配列は、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ及びそれらの組合せから選択される。
【0172】
一実施形態において、ＹとＷはそれぞれ独立して、存在しないか、又はスペーサーＳｐｌから選択される。別の実施形態において、Ｓｐ１は、１～１０個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個のアミノ酸を含むスペーサー配列である。具体的な一実施形態において、Ｓｐ１はＬｅｕである。別の具体的な実施形態において、Ｓｐ１はＧｌｎである。一実施形態において、Ｓｐ１はＰＡＢである。さらなる実施形態において、ＹとＷは、それぞれ独立して、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ及びＶａｌ－Ｌｙｓ－ＰＡＢからなる群から選択される。
【0173】
いくつかの実施形態において、Ｙ及び／又はＷに含まれるアミノ酸は、天然又は非天然であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、Ｙは存在しないか、又はアミノ酸フラグメント１である。アミノ酸フラグメント１は、それぞれ独立して同一又は異なる１～３０個の天然又は非天然アミノ酸を含む。アミノ酸フラグメント１は、１～１０個のアミノ酸を含む切断可能な配列、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列及びそれらの組合せからなる群から選択される。別の具体的な実施形態において、Ｗは存在しないか、又はアミノ酸フラグメント２である。アミノ酸フラグメント２は、それぞれ独立して同一又は異なる１～３０個の天然又は非天然アミノ酸を含む。アミノ酸フラグメント２は、１～１０個のアミノ酸を含む切断可能な配列、１～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【0174】
いくつかの実施形態において、ｐ＝０で、ｑ＝１で、式（Ｖ）の化合物の構造は下記式（Ｖ－１）に示される通りである。
【0175】
Ｄ１－Ｙ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２）ｔ（Ｖ－１）
式中、Ａ２、Ｄ１、Ｙ、Ｌｋ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
式中、Ａ２、Ｄ１、Ｙ、Ｌｋ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【0176】
別のいくつかの実施形態において、ｐ＝１で、ｑ＝０で、式（ＩＩＩ）の化合物の構造は下記式（Ｖ－２）に示される通りである。
【0177】
（Ａ１－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－Ｗ－Ｄ２（Ｖ－２）
式中、Ａ１、Ｄ２、Ｙ、Ｌｋ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
式中、Ａ１、Ｄ２、Ｙ、Ｌｋ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【0178】
一実施形態において、適切なリンカーは、ＷＯ２０１４１７７０４２Ａの図１３～１６から選択されるいずれかのリンカーであり得る。さらなる実施形態において、適切なリンカーは、ＷＯ２０１５１６５４１３Ａの図７～１０から選択されるいずれかのリンカーであり得る。
【0179】
一実施形態において、適切なリンカーは、ＷＯ２０１４１７７０４２Ａの図１～１２から選択されるいずれかのリンカーであり得る。さらなる実施形態において、適切なリンカーは、ＷＯ２０１５１６５４１３Ａの図３～６から選択されるいずれかのリンカーであり得る。
【0180】
リガーゼ受容体又は供与体基質認識モチーフを含む部分
いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼは、天然トランスペプチダーゼ、非天然トランスペプチダーゼ、上記両者の変異体、及びそれらの組合せからなる群から選択される。非天然トランスペプチダーゼは、天然トランスペプチダーゼを操作することによって得られたものであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、リガーゼはトランスペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼは、天然トランスペプチダーゼ、非天然トランスペプチダーゼ、上記両者の変異体、及びそれらの組合せからなる群から選択される。非天然トランスペプチダーゼは、天然トランスペプチダーゼを操作することによって得られたものであり得るが、これらに限定されない。
【0181】
いくつかの好ましい実施形態において、リガーゼは、天然ソルターゼ、非天然ソルターゼ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。天然ソルターゼの種類は、ＳｒｔＡ、ＳｒｔＢ、ＳｒｔＣ、ＳｒｔＤ、ＳｒｔＥ、ＳｒｔＦ等（例えば、ＵＳ２０１１０３２１１８３Ａ１とＥＰ３６４７４１９Ａ１を参照）を含む。異なる分子又は構造フラグメント間の特異的なカップリングを実現するために、リガーゼの種類はリガーゼ認識モチーフに対応する。
【0182】
いくつかの実施形態において、リガーゼ受容体基質認識モチーフは、オリゴマーグリシン、オリゴマーアラニン、及び重合度３～１０のオリゴマーグリシン／アラニン混合物からなる群から選択される。いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼ受容体基質認識モチーフはＧｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）であり、ｎは３～１０の整数である。
【0183】
いくつかの実施形態において、リガーゼはＳｒｔＡであり、且つ供与体認識モチーフはＬＰＸＴＧであり得、ここでＸは任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、リガーゼはＳｒｔＢであり、且つ供与体認識モチーフはＮＰＸＴＧであり得、ここでＸは任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、リガーゼはＳｒｔＣであり、且つ供与体認識モチーフはＬＰＸＴＧであり得、ここでＸは任意の天然又は非天然アミノ酸である。他のいくつかの実施形態において、リガーゼはＳｒｔＤであり、且つ供与体認識モチーフはＬＰＸＴＡであり得、ここでＸは任意の天然又は非天然アミノ酸である。いくつかのさらなる実施形態において、リガーゼはＳｒｔＥであり、且つ供与体認識モチーフはＬＡＸＴＧであり得、ここでＸは任意の天然又は非天然アミノ酸である。他のいくつかの実施形態において、リガーゼはＳｒｔＦであり、且つ供与体認識モチーフはＬＰＸＴＧであり得、ここでＸは、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｉ、Ｌ及びＫからなる群から選択される。
【0184】
別の具体的な実施形態において、リガーゼは、黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＡである。それに応じて、リガーゼ認識モチーフは、該酵素の典型的な認識モチーフＬＰＸＴＧであり得る。さらなる具体的な実施形態において、リガーゼ供与体基質認識モチーフはＬＰＸＴＧＪであり、且つリガーゼ受容体基質認識モチーフはＧｎであり、ここでＸは、天然又は非天然の任意の単一アミノ酸であり得、Ｊは存在しないか、又は任意に標識される１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントである。一実施形態において、Ｊは存在しない。さらなる実施形態において、Ｊは１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸である。別のいくつかの実施形態において、ＪはＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である。さらなる具体的な実施形態において、リガーゼ供与体基質認識モチーフはＬＰＥＴＧである。別の具体的な実施形態において、リガーゼ供与体基質認識モチーフはＬＰＥＴＧＧである。一実施形態において、リガーゼは、黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＢであり、且つ対応する供与体基質認識モチーフはＮＰＱＴＮであり得る。別の実施形態において、リガーゼは、炭疽菌由来のＳｒｔＢであり、且つ対応する供与体基質認識モチーフはＮＰＫＴＧであり得る。さらなる実施形態において、リガーゼは、化膿連鎖球菌由来のＳｒｔＡであり、且つ対応する供与体基質認識モチーフはＬＰＸＴＧＪであり得、ここでＪは上記で定義した通りである。別の実施形態において、リガーゼは、ストレプトミセス・セリカラー由来のＳｒｔＥであり、且つ対応する供与体基質認識モチーフはＬＡＸＴＧであり得る。さらなる実施形態において、リガーゼは、ラクトバチルス・プランタラム由来のＳｒｔＡであり、且つ対応する供与体基質認識モチーフはＬＰＱＴＳＥＱであり得る。リガーゼ認識モチーフは、手動スクリーニングによって最適化されたトランスペプチダーゼの他の斬新な認識配列であってもよい。
【0185】
ＬＰＸＴＧＪをＧｎにカップリングすると、ＬＰＸＴＧＪ配列中のグリシンの上流のペプチド結合がソルターゼＡによって切断され、生じた中間体がＧｎの遊離Ｎ端に連結して、新しいペプチド結合を生成する。得られたアミノ酸配列はＬＰＸＴＧｎである。配列ＧｎとＬＰＸＴＧＪは上記で定義した通りである。
【0186】
いくつかの具体的な実施形態において、リガーゼは、黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＡ、供与体認識モチーフはＬＰＥＴＧＧ、受容体認識モチーフはＧＧＧである。
【0187】
反応基を含む部分
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）中のＡ１とＡ２は、それぞれ独立して、アミノ化合物、マレイミド及びその誘導体、チオール化合物、ピリジルジチオール化合物（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）、ハロ酢酸（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）からなる群から選択される。別のいくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２中の反応基は、それぞれ独立して、アミノ基、マレイミド基、チオール基、ピリジルジチオ基（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、及びイソシアネート基（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）中のＡ１とＡ２は、それぞれ独立して、アミノ化合物、マレイミド及びその誘導体、チオール化合物、ピリジルジチオール化合物（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）、ハロ酢酸（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）からなる群から選択される。別のいくつかの実施形態において、Ａ１及びＡ２中の反応基は、それぞれ独立して、アミノ基、マレイミド基、チオール基、ピリジルジチオ基（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、及びイソシアネート基（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）からなる群から選択される。
【0188】
いくつかの実施形態において、Ａ１とＡ２は、その中の反応基の構造に応じて、それぞれ独立して、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又はウレタン結合を介して、マイケル受容体（マイケル付加の受容体分子）に共有結合することができる。具体的な一実施形態において、Ａ１とＡ２は、それぞれ独立して、任意に誘導体化されたシステインから選択される。
【0189】
別のいくつかの具体的な実施形態において、Ａ１とＡ２は、それぞれ独立して、任意に誘導体化されたシステインから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、システインの誘導体化は、次の１）、２）及び３）からなる群から選択される。１）カルボキシル基をアミド化し、得られたアミドＮＨ２は、Ｃ１－６アルキル基によって任意に置換される。２）アミノ基のアシル化。３）カルボキシル基及び／又はアミノ基を、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント又は１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントに連結させ、ここで前記アミノ酸フラグメントは、好ましくはＧｌｙである。具体的な一実施形態において、システインの誘導体化とは、システインのカルボキシル基のアミド化又はグリシンとの連結を指す。
【0190】
いくつかの実施形態において、Ａ２は
であり、ここでｘは、水素、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ａ１は
であり、ここでｘは、水素、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ基のアシル化とは、システインのアミノ基がＣ１－６アルキルカルボニル基によって置換されることを指す。
【化16】
【化17】
【0191】
いくつかの実施形態において、（Ｖ－１）の連結ユニット中のｔは１で、Ｄ１はＧｎで、Ａ２は
であり、式（Ｖ－１）の化合物の構造は下記式（Ｖ－１－１）に示される通りである。
ｘは、水素、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群から選択され、
Ｌｋは、Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、ｔ、ＹとＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、ｘは、ＯＨ、ＮＨ２及びＧｌｙから選択される。
【化18】
【化19】
Ｌｋは、Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、ｔ、ＹとＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、ｘは、ＯＨ、ＮＨ２及びＧｌｙから選択される。
【0192】
いくつかの具体的な実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、ＹとＷは両方とも存在せず、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－で、ｉ＝４であり、式（Ｖ－１－１）の化合物の構造は下記式（Ｖ－１－１－１）に示される通りである。
【化20】
【0193】
いくつかの具体的な実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、Ｗは存在せず、ＹはＬで、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）で、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－で、ｉ＝４であり、連結ユニットの構造は下記式（Ｖ－１－１－２）に示される通りである。
【化21】
【0194】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、Ｗは存在せず、ＹはＱで、Ｑはグルタミン（Ｇｌｎ）で、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－で、ｉ＝４であり、連結ユニットの構造は下記式（Ｖ－１－１－３）に示される通りである。
【化22】
【0195】
いくつかの具体的な実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、ＹとＷは両方とも存在せず、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－Ｃ５Ｈ１０－であり、連結ユニットの構造は下記式（Ｖ－１－１－４）に示される通りである。
【化23】
【0196】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、式（Ｖ－１－１）中、ＹとＷは両方とも存在せず、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は１つの－ＮＲ１Ｒ２基によって置換された－Ｃ５Ｈ１０－基で、Ｒ１は水素で、Ｒ２は－（ＣＯ）ＣＨ３であり、連結ユニットの構造は下記式（Ｖ－１－１－５）に示される通りである。
【化24】
【0197】
式（Ｖ－２）の連結ユニットのいくつかの実施形態において、ｔが１で、Ｄ２がＬＰＸＴＧで且つＡ１が
である場合、式（Ｖ－２）の化合物の構造は下記式（Ｖ－２－１）に示される通りである。
式中、ｘは、水素、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントから選択され、
ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｙ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【化25】
【化26】
ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｙ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【0198】
一実施形態において、ｘは水素である。
【0199】
いくつかの実施形態において、Ａ１とＡ２はそれぞれ独立して、マレイミド官能基である。マレイミド官能基は、適切な二官能性架橋剤によって式（Ｖ）の分子に導入される。
【0200】
いくつかの好ましい実施形態において、マレイミド官能基を導入するための二官能性架橋剤は、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ，ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体Ｎ－［α－マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル（Ｎ－［ａｌｐｈａ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔｏｘｙ］ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ，ＡＭＡＳ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（Ｎ－ｇａｍｍａ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌ－ ｏｘｙｓ ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ，ＧＭＢＳ）、３－マレイミド安息香酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（３－ＭａｌｅｉＭｉｄｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉＭｉｄｅ ｅｓｔｅｒ，ＭＢＳ）、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ，ＥＭＣＳ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（４－マレイミドフェニル）ブチレート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（４－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ） ｂｕｔｙｒａｔｅ，ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６－［（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６－ ［（ｂｅｔａ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ，ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙ－（６－ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ），ＬＣ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル１１－（マレイミド）ウンデカノエート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ １１－（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ，ＫＭＵＳ）、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド－（ポリエチレングリコールアルコール）ｎ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ａｌｃｏｈｏｌ）ｎ，ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ）を含む二官能性架橋剤を含むが、これらに限定されず、ここでｎは、２、４、６、８、１２又は２４個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットがあることを表す。二官能性架橋剤と反応した直後にＡ１又はＡ２に導入されるマレイミド官能基の例は次の表に列挙される。
【0201】
【表2】
【0202】
いくつかの実施形態において、Ａ１とＡ２は、それぞれ独立して、ｍｃ及びｍｃｃから選択される。
【0203】
式（Ｖ－１）のリンカーのいくつかの実施形態において、ｔは１で、Ｄ１はＧｎで、Ｇはグリシンで、Ａ２はｍｃｃで、Ｗは存在せず、ＬｋはＬ４で、Ｌ４は任意に誘導体化されたリジンであり、式（Ｖ－１）の化合物の構造は下記式（Ｖ－１－２）に示される通りである。
式中、ｎは３～１０の整数であり、
ｘは、水素、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群から選択され、
Ｙは、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【化27】
ｘは、水素、ＯＨ、ＮＨ２、１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメント、及び１～１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチドフラグメントからなる群から選択され、
Ｙは、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【0204】
具体的な一実施形態において、式（Ｖ－１－２）中、Ｙは存在せず、ｎ＝３で、ｘはＯＨであり、リンカーの構造は下記（リンカーＬＵ１０４）に示される通りである。
【化28】
【0205】
ペイロード
本発明において、ペイロードは、水素、小分子化合物（例えば、阻害剤及び毒素（例えば細胞毒素））、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、核酸及び類似体（例えば、干渉ＲＮＡ）、トレーサー分子（例えば、フルオロフォア及び蛍光分子）、ポリペプチド（例えば、タンパク質タグ、生物活性ペプチド、タンパク質毒素及び酵素）、ペプチド模倣体、抗体及び抗体フラグメントからなる群から選択することができる。
本発明において、ペイロードは、水素、小分子化合物（例えば、阻害剤及び毒素（例えば細胞毒素））、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、核酸及び類似体（例えば、干渉ＲＮＡ）、トレーサー分子（例えば、フルオロフォア及び蛍光分子）、ポリペプチド（例えば、タンパク質タグ、生物活性ペプチド、タンパク質毒素及び酵素）、ペプチド模倣体、抗体及び抗体フラグメントからなる群から選択することができる。
【0206】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、小分子化合物、免疫調節剤、核酸及び類似体、トレーサー分子、放射性核種、ペプチド模倣体、グリカン、及びＰＥＧ部分からなる群から選択される。
【0207】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、生物活性ペプチド、サイトカイン、抗体、抗体フラグメント、及びタンパク質受容体からなる群から選択される。
【0208】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、小分子化合物、核酸分子、及びトレーサー分子からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、ペイロードは、小分子化合物から選択される。より好ましい実施形態において、ペイロードは、細胞毒素及びそのフラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ペイロードは、１つ又は複数の放射性核種である。別のいくつかの実施形態において、ペイロードは、１つ又は複数のサイトカインである。いくつかの実施形態において、ペイロードは、１つ又は複数の免疫調節剤である。
【0209】
いくつかの実施形態において、細胞毒素は、微小管細胞骨格を標的とする薬物からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、タキサン類、メイタンシノイド類、アウリスタチン類、エポチロン類（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、コンブレタスタチンＡ－４ホスフェート（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ－４ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コンブレタスタチンＡ－４及びその誘導体、インドール－スルホンアミド類、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）等のビンブラスチン類、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、無水ビンブラスチン（ａｎｈｙ－ｄｒｏｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０及び類似体、ハリコンドリン（ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉｎ）Ｂ及びエリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、インドール－３－オキサミド類、ポドフィロトキシン、７－ジエチルアミノ－３（２’－ベンゾオキサゾリル）－クマリン（ＤＢＣ）、ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）、ラウリマライド（ｌａｕｌｉｍａｌｉｄｅ）からなる群から選択される。別のいくつかの実施形態において、細胞毒素は、例えば、カンプトテシン類及びその誘導体、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）等のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌｍｕｓｔａｒｄ）等の窒素マスタード類からなる群から選択される。別のいくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、例えば、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、フルベンズロン、ホルモテロール（ｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）等のニトロソウレア類（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａｓ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、アジリジン類（ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ）からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メトレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）、及びウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、抗腫瘍抗生物質類からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、エンジイン抗生物質類からなる群から選択される。いくつかのより好ましい実施形態において、細胞毒素は、ダイネマイシン、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン、及びアクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）からなる群から選択される。別のいくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アントラマイシン（ａｎｔｒａｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン類（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、アクチノマイシンＣ、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）及びカルジノフィリン（ｃａｒｄｉｎｏｐｈｙｌｌｉｎ）、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、鉄アドリアマイシン（ｆｅｒｒｉｃ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ルフォクロモマイシン（ｒｕｆｏｃｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態において、細胞毒素は、トリコテセン類（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）からなる群から選択される。いくつかのより好ましい実施形態において、細胞毒素は、Ｔ－２毒素、ベルカリン（ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）Ａ、バシロクポリン（ｂａｃｉｌｌｏｃｐｏｒｉｎ）Ａ、及びアンギジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、抗腫瘍アミノ酸誘導体である。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、ウベニメックス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン（６－ｄｉａｚｏ－５－ｏｘｏ－Ｌ－ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）からなる群から選択される。別のいくつかの実施形態において、細胞毒素は、葉酸類似体からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、ジメチル葉酸、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、及びエダトレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、プリン類似体からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンからなる群から選択される。さらなる実施形態において、細胞毒素は、ピリミジン類似体から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、及びフロクスウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、アンドロゲン類から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンからなる群から選択される。別のいくつかの実施形態において、細胞毒素は、抗副腎薬からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、及びトリロスタン（ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞毒素は、抗アンドロゲン類から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞毒素は、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸リュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ ａｃｅｔａｔｅ）、及びゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）からなる群から選択される。さらなる実施形態において、細胞毒素は、プロテインキナーゼ阻害剤及びプロテアソーム阻害剤からなる群から選択される。いくつかの具体的な実施形態において、細胞毒素は、ビンブラスチン類、コルヒチン類、タキサン類、アウリスタチン類、及びメイタンシノイド類からなる群から選択される。いくつかの具体的な実施形態において、細胞毒素は、例えば、ＭＭＡＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ，モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ，モノメチルアウリスタチンＦ）、ＭＭＡＤ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｄ，モノメチルアウリスタチンＤ）等のアウリスタチン類である。モノメチルアウリスタチン化合物の合成及び構造は、ＵＳ２００６０２２９２５３に記載されている通りであり、その開示内容の全てが参照によって本明細書に組み込まれる。
【0210】
ペイロードは、式（Ｖ）の化合物中の反応基と反応できる反応基を含み、それによってペイロードは式（Ｖ）の化合物に共有結合する。反応基を含まない化合物は、ペイロードを得るために適切に誘導体化する必要がある。いくつかの実施形態において、ペイロード中の反応基はマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）であり、又は、マレイミドを含まない化合物は、マレイミド誘導体を得るために、適切な反応に供することができる。例えば、ＭＭＡＦはｍｃ－ＭＭＡＦ（ｍｃはマレイミドカプロイルである）を得るように誘導体化される。ＭＭＡＥはｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを得るように誘導体化される。上記構造中のｍｃは、ｍｃｃ（４－（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｎｙｌ，４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）又はマレイミド－Ｒ構造によって置き換えられ得、ここでＲはＣ１－２０アルキレン基であり、任意に、アルキレン基中の１つ又は複数の（－ＣＨ２－）構造は－Ｏ－によって置き換えられ得る。
【0211】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、式（Ｖ）のリンカーをペイロードと反応させることによってシステム２を得ることを含む。好ましくは、式（Ｖ）の化合物は、Ａ１又はＡ２部分に含まれる反応基を介して、ペイロードに含まれる別の反応基にそれぞれ独立して共有結合され、式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体を形成する。
【0212】
Ａ１又はＡ２部分に含まれる反応基は、上記の通りである。
【0213】
いくつかの具体的な実施形態において、式（Ｖ）の化合物とペイロードとの間に形成される共有結合は、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ペプチド結合、ヒドラゾン結合、エステル結合、エーテル結合、及びウレタン結合からなる群から選択される１つ又は複数である。
【0214】
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物のＡ１又はＡ２中の反応基は、マレイミド又はマレイミド誘導体であり、ペイロード中の別の反応基は、マイケル受容体である。ペイロードと反応した後、マレイミド又はマレイミド誘導体は、スクシンイミド又はスクシンイミド誘導体に変換する。
【0215】
いくつかの実施形態において、ｐ＝０で、ｑ＝１であり、式（ＩＶ）の中間体は下記式（ＩＶ－１）に示される通りである。
Ｄ１－Ｙ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２－Ｐ）ｔ（ＩＶ－１）。
Ｄ１－Ｙ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２－Ｐ）ｔ（ＩＶ－１）。
【0216】
別のいくつかの実施形態において、ｐ＝１で、ｑ＝０であり、式（ＩＶ）の化合物の構造は下記式（ＩＶ－２）に示される通りである。
（Ｐ－Ａ１－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－Ｗ－Ｄ２（ＩＶ－２）。
（Ｐ－Ａ１－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－Ｗ－Ｄ２（ＩＶ－２）。
【0217】
いくつかの実施形態において、スクシンイミド又はスクシンイミド誘導体を含む式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体は、「開環」中間体を得るように開環反応に供されてもよい。開環反応は、ＷＯ２０１５１６５４１３Ａに記載の方法と同様の方法で行うことができる。開環中間体も式（ＩＶ）の範囲内に含まれる。
【0218】
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体中のスクシンイミドの開環反応は、下記式（ＩＶ－１－２）に示されるような開環中間体を形成する。式（ＩＶ－１－２）は式（ＩＶ－１）の範囲に含まれる。
Ｄ１－Ｙ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２ｏｐｅｎ－Ｐ）ｔ（ＩＶ－１－２）。
Ｄ１－Ｙ－Ｌｋ－（Ｗ－Ａ２ｏｐｅｎ－Ｐ）ｔ（ＩＶ－１－２）。
【0219】
別のいくつかの実施形態において、スクシンイミド環の開環反応は、式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体において下記式（ＩＶ－２－２）に示される開環中間体を形成する。式（ＩＶ－２－２）は式（ＩＶ－２）の範囲に含まれる。
（Ｐ－Ａ１ｏｐｅｎ－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－Ｗ－Ｄ２（ＩＶ－２－２）
式中、「－Ａ１ｏｐｅｎ－」及び「－Ａ２ｏｐｅｎ－」の構造は、
から選択される。
（Ｐ－Ａ１ｏｐｅｎ－Ｙ）ｔ－Ｌｋ－Ｗ－Ｄ２（ＩＶ－２－２）
式中、「－Ａ１ｏｐｅｎ－」及び「－Ａ２ｏｐｅｎ－」の構造は、
【化29】
【0220】
リンカー－ペイロード中間体の具体的な実施形態
いくつかの実施形態において、Ａ１とＡ２は、それぞれ独立して、ｍｃ及びｍｃｃから選択され、その中に含まれるマレイミド官能基は、ペイロード（Ｐ）中のチオール基に連結され、それによって、リンカーとペイロードは、チオスクシンイミド構造（チオスクシンイミド連結，ｔｈｉｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を介して互いに連結される。チオスクシンイミド連結におけるスクシンイミド環は、下記開環したチオスクシンイミド構造を得るように上記開環反応に供されてもよい。
いくつかの実施形態において、Ａ１とＡ２は、それぞれ独立して、ｍｃ及びｍｃｃから選択され、その中に含まれるマレイミド官能基は、ペイロード（Ｐ）中のチオール基に連結され、それによって、リンカーとペイロードは、チオスクシンイミド構造（チオスクシンイミド連結，ｔｈｉｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を介して互いに連結される。チオスクシンイミド連結におけるスクシンイミド環は、下記開環したチオスクシンイミド構造を得るように上記開環反応に供されてもよい。
【化30】
【0221】
いくつかの実施形態において、Ｌの構造は、式（Ｖ－１－１）で定義した通りであり、式（ＩＶ－１）のリンカー－ペイロード中間体は、式（ＩＶ－１－１）の構造を有する。式（ＩＶ－１－１）のリンカー－ペイロード中間体は、式（Ｖ－１－１）の対応するリンカーとペイロード（Ｐ）との反応によって調製してもよい。
【0222】
いくつかの具体的な実施形態において、式（ＩＶ－１）において、Ｄ１はＧｎで、Ｇはグリシンで、Ａ２は
である。いくつかの実施形態において、ＬｋはＬ４であり、Ｌ４は、任意に誘導体化されたリジンである。いくつかの実施形態において、式（ＩＶ－２）中のＤ２はＧｎで、Ｇはグリシンである。いくつかの実施形態において、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－１）に示す構造を有する。
【化31】
【化32】
【0223】
いくつかの好ましい実施形態において、式（ＩＶ－１－１）中、ＹとＷは両方とも存在せず、ペイロードはｍｃ（開環）－Ｔｏｘｉｎであり、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－２－１）又は式（ＩＶ－１－２’－１）に示す構造を有する。
【0224】
【化33】
【0225】
いくつかのより好ましい実施形態において、式（ＩＶ－１－２－１）及び式（ＩＶ－１－２’－１）において、細胞毒素はＭＭＡＦであり、即ち、ペイロードはｍｃ（開環）－ＭＭＡＦであり、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－３）又は式（ＩＶ－１－３’）に示す構造を有する。
【0226】
【化34】
Ｔ、ｎ、Ｌｋ及びｘはそれぞれ、式（ＩＶ－１－１）に定義されている通りである。
【0227】
別のいくつかの具体的な実施形態において、式（ＩＶ－１－３）及び（ＩＶ－１－３’）中、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３で、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－で、ｉ＝４であり、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－４）と（ＩＶ－１－４’）に示す構造を有する。
【0228】
【化35】
ｎとｘはそれぞれ、式（ＩＶ－１－１）に定義されている通りである。
【0229】
いくつかの具体的な実施形態において、式（ＩＶ－１）中、Ｗは存在せず、ｔは１で、ペイロードはＴｏｘｉｎで、Ａ２はｍｃｃで、ＬｋはＬ４で、Ｌ４は任意に誘導体化されたリジンであり、Ｄ１はＧｎで、Ｇはグリシンであり、連結体－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－５－１）に示す構造を有する。
式中、Ｔｏｘｉｎ、ｎ、Ｙ及びｘは上記で定義した通りである。
【化36】
【0230】
いくつかの実施形態において、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－５）又は（ＩＶ－１－５’）に示す構造を有する。
【0231】
【化37】
【0232】
式（ＩＶ－１－５）及び（ＩＶ－１－５’）のリンカー－ペイロード中間体は、式（ＩＶ－１－５－１）の開環反応によって調製してもよい。
【0233】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｔｏｘｉｎは、メイタンシノイド、好ましくはＤＭ１である。
【0234】
いくつかの具体的な実施形態において、式（ＩＶ－１－５）及び（ＩＶ－１－５’）中、細胞毒素はＤＭ１であり、Ｙは存在せず、リンカー－ペイロード中間体は、下記式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）に示す構造を有する。式（ＩＶ－１－６）は式（ＩＶ－１－５）の範囲に含まれ、式（ＩＶ－１－６’）は式（ＩＶ－１－５’）の範囲に含まれる。
【0235】
【化38】
【0236】
コンジュゲートの具体的な実施形態
いくつかの実施形態において、ｔは１であり、コンジュゲートは、下記式（１）、（２）、（２’）、（３）、（３’）、（４）、（４’）、（５）、（５’）、（６）、及び（６’）から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ｔは１であり、コンジュゲートは、下記式（１）、（２）、（２’）、（３）、（３’）、（４）、（４’）、（５）、（５’）、（６）、及び（６’）から選択される構造を有する。
【0237】
いくつかの実施形態において、Ｌ－Ｐの構造は式（Ｖ－１－１）で定義した通りであり、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（１）の構造を有する。式（１）のコンジュゲートは、式（Ｖ－１－１）の対応するリンカー－ペイロード中間体と生体分子（Ｔ）とのコンジュゲーション反応によって調製してもよい。
式中、ｎは３～１０の整数であり、
ｘはＯＨ、ＮＨ２又はＧｌｙであり、
ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｔ、Ｐａｙｌｏａｄ及びｚはそれぞれ、式（ＩＩＩ）で定義した通りであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｙ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【化39】
ｘはＯＨ、ＮＨ２又はＧｌｙであり、
ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、
Ｔ、Ｐａｙｌｏａｄ及びｚはそれぞれ、式（ＩＩＩ）で定義した通りであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｙ及びＷはそれぞれ、式（Ｖ）に定義されている通りである。
【0238】
いくつかの実施形態において、Ｌ－Ｐの構造は式（ＩＶ－１－２－１）又は（ＩＶ－１－２’－１）で定義した通りであり、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、下記式（２）及び（２’）から選択される構造を有する。いくつかの具体的な実施形態において、Ｌ－Ｐの構造は式（ＩＶ－１－３）又は（ＩＶ－１－３’）で定義した通りであり、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、下記式（３）及び（３’）から選択される構造を有する。いくつかのより具体的な実施形態において、Ｌ－Ｐの構造は式（ＩＶ－１－４）又は（ＩＶ－１－４’）で定義した通りであり、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、下記式（４）及び（４’）から選択される構造を有する。式（４）は式（３）の範囲に含まれ、式（３）は式（２）の範囲に含まれ、式（２）は式（１）の範囲に含まれる。式（４’）は式（３’）の範囲に含まれ、式（３’）は式（２’）の範囲に含まれ、式（２’）は式（１）の範囲に含まれる。
【0239】
いくつかの好ましい実施形態において、ＹとＷは両方とも存在せず、式（１）中のペイロードはｍｃ（開環）－毒素であり、コンジュゲートの構造は下記式（２）又は式（２’）に示される通りである。
【0240】
【化40】
【0241】
いくつかのより好ましい実施形態において、式（２）及び式（２’）中の細胞毒素はＭＭＡＦであり、即ち、ペイロードはｍｃ（開環）－ＭＭＡＦであり、コンジュゲートの構造は、下記式（３）又は式（３’）に示される通りである。
【0242】
【化41】
Ｔ、ｎ、Ｌｋ、ｘ及びｚはそれぞれ、式（１）に定義されている通りである。
【0243】
別のいくつかの具体的な実施形態において、ＬｋはＬ１－Ｌ２－Ｌ３であり、Ｌ１は－ＮＨ－で、Ｌ３は－（ＣＯ）－で、Ｌ２は－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｉ－Ｃ２Ｈ４－で、ｉ＝４である。コンジュゲートの構造は下記式（４）及び（４’）に示される通りである。
【0244】
【化42】
Ｔ、ｎ、ｘ及びｚはそれぞれ、式（１）に定義されている通りである。
【0245】
いくつかの具体的な実施形態において、標的化分子は、抗体ペルツズマブ、ｈｒＳ７又はＭＡＡＡ１１８１ａである。
【0246】
いくつかの実施形態において、ｔは１で、Ｌ－Ｐの構造は式（ＩＶ－１－５）又は（ＩＶ－１－５’）で定義した通りであり、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、下記式（５）及び（５’）から選択される構造を有する。（５）又は（５’）のコンジュゲートは、式（ＩＶ－１－５）又は（ＩＶ－１－５’）の対応するリンカー－ペイロード中間体と生体分子（Ｔ）とのコンジュゲーション反応によって調製してもよい。いくつかの具体的な実施形態において、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、下記式（６）及び（６’）から選択される構造を有する。（６）又は（６’）のコンジュゲートは、式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）の対応するリンカー－ペイロード中間体と生体分子（Ｔ）とのコンジュゲーション反応によって調製してもよい。式（６）は式（５）の範囲に含まれ、式（６’）は式（５’）の範囲に含まれる。
【0247】
【化43】
【0248】
いくつかの具体的な実施形態において、Ｙは存在しない。コンジュゲートの構造は下記式（６）及び（６’）に示される通りである。
【0249】
【化44】
【0250】
本発明の方法の具体的な実施形態
本発明の方法は、コンジュゲーションステップでリガーゼによって部位特異的に触媒し、リガーゼがコンジュゲートすべき部分上の認識モチーフを特異的に認識するという点で、本分野の従来の化学的カップリング方法と異なる。一方、従来の化学的カップリング反応では、非特異的なカップリングによる望ましくない副生成物を避けるために、カップリング反応の前にコンジュゲートすべき部分を精製することが望まれる。
本発明の方法は、コンジュゲーションステップでリガーゼによって部位特異的に触媒し、リガーゼがコンジュゲートすべき部分上の認識モチーフを特異的に認識するという点で、本分野の従来の化学的カップリング方法と異なる。一方、従来の化学的カップリング反応では、非特異的なカップリングによる望ましくない副生成物を避けるために、カップリング反応の前にコンジュゲートすべき部分を精製することが望まれる。
【0251】
したがって、一態様では、本発明の方法は、コンジュゲーションステップの前にコンジュゲートすべき部分を精製する必要がなく、全体的な操作時間及びステップを減少させるとともに、最終収率を増加させる。それに応じて、いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）のシステム１及び／又はシステム２は、１つ又は複数の不純物をさらに含む。
【0252】
別の態様において、前記方法は、生体分子（例えばタンパク質）等の化学的に不安定な分子を含むコンジュゲートに特に有利である。いくつかの具体的な態様において、前記方法はバイオコンジュゲートの調製に適し、その中の第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは生体分子を含む。
【0253】
一般に、生体分子の生産方法は、例えば、哺乳動物又は細菌宿主細胞系を用いて、抗体又は抗体フラグメント等の標的タンパク質を生産する細胞培養の方法を伴う。ほとんどの場合、得られた収集物は、細胞及び細胞片を除去するために清澄化され、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、培地成分及び核酸等の不純物を含む収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）が得られる。一般的な化学的カップリングに基づく方法において、ＨＣＣＦは、下流のコンジュゲーション反応に使用する高純度の生体分子を得るように、さらに一連の精製ステップに供される。場合によっては、収穫された収集物は、抽出、清澄化、濃縮を経て標的タンパク質が沈殿し、その後、沈殿物が再溶解してから精製される。本発明の方法におけるリガーゼは、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーションを特異的に触媒することができるので、システム１及び／又はシステム２中の不純物は、ステップ（ｂ）のコンジュゲーション効率及び／又は特異性にほとんど影響せず、システム１及びシステム２の高純度は、ステップ（ｂ）の前提条件ではなくなる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２のうちの少なくとも１つは、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）である。ＨＣＣＦは、組織培養物、哺乳動物細胞培養物、酵母細胞培養物、細菌細胞培養物、ファージ培養物等から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＨＣＣＦ以外の他のサンプルを使用することもできる。
【0254】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、生体分子の生産プロセスと柔軟に統合して、該生体分子を含むバイオコンジュゲートを得ることができる。例えば、前記方法は、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの生産プロセスと容易に統合して、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを含むバイオコンジュゲートを生産することができる。バイオコンジュゲートは、同じ製造施設で製造することができ、含まれる生体分子と同じ製品サイクル及び類似の全収率を有するとともに、既存の生産施設及びパイプラインは大きく変わらないままであり得る。
【0255】
別のいくつかの実施形態において、前記方法は、
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含む。
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含む。
【0256】
クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びそれらの組合せからなる群から独立して選択することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。いくつかの好ましい実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの組合せである。いくつかの実施形態において、ステップ（３）におけるクロマトグラフィーステップは、精製ステップとも呼ばれる。精製ステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含み得る。
【0257】
いくつかの実施形態において、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは、抗体又は抗体フラグメントを含み、ステップ（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。抗体は、従来の抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、完全ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、又はナノ抗体であり得る。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）、又はそれらの任意の活性誘導体であり得る。抗体フラグメントは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、ｓｃｄｓＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント又はダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）であり得る。抗体又は抗体フラグメントの性質に応じて、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィー（例えばＣａｐｔｏＴＭＬアフィニティークロマトグラフィー）、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー、ＬａｍｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィー、又はＭａｂｓｅｌｅｃｔＴＭアフィニティークロマトグラフィーであり得る。いくつかの実施形態において、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つはＦｃフラグメントを含み、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、第１部分はＦｃフラグメントを含む。好ましくは、Ｆｃフラグメントは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ型抗体のＦｃフラグメントである。いくつかの具体的な実施形態において、Ｔは抗体であり、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーである。当業者であれば、コンジュゲートすべき部分の性質に基づいて適切なアフィニティークロマトグラフィー方法を選択することができる。
【0258】
いくつかの好ましい実施形態において、ステップ（１）、（２）及び（３）におけるクロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択される。
【0259】
いくつかの実施形態において、ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーの組合せ（プロセス１）である。別のいくつかの実施形態において、ステップ（１）及びステップ（２）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、イオン交換クロマトグラフィー（プロセス２）を含む。いくつかのさらなる実施形態において、ステップ（１）及びステップ（２）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーの組合せ（プロセス３）を含む。いくつかのさらなる実施形態において、ステップ（１）及びステップ（２）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、アフィニティークロマトグラフィーと、疎水性相互作用クロマトグラフィーと、イオン交換クロマトグラフィーとの組合せ（プロセス４）を含む。
【0260】
いくつかの具体的な実施形態において、ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0261】
別のいくつかの具体的な実施形態において、ステップ（１）及び（２）のうちの少なくとも１つは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0262】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、ステップ（１）及び（２）のうちの少なくとも１つは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0263】
いくつかの具体的な実施形態において、第１部分及び／又は第２部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、を任意の順序で含む。
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、を任意の順序で含む。
【0264】
別のいくつかの具体的な実施形態において、第１部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（１）はタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0265】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、第１部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（１）はタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0266】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、第２部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0267】
いくつかのさらなる具体的な実施形態において、第２部分はＦｃフラグメントを含み、ステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0268】
いくつかのさらなる具体的な実施例において、ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｄ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｄ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｄ－３）疎水性相互作用クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｄ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｄ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｄ－３）疎水性相互作用クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0269】
いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、結合－溶出モードで実行される。別のいくつかの実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、結合－溶出（ｂｉｎｄ－ａｎｄ－ｅｌｕｔｅ）モード又はフロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）モードで実行される。
【0270】
いくつかの好ましい実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フロースルーモードで実行される。いくつかの実施形態において、フロースルー精製方法ステップで得られたサンプルは、次の方法ステップに連続的に流れる。別のいくつかの好ましい実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、結合－溶出モードで実行される。いくつかの実施形態において、結合－溶出精製方法ステップで得られたサンプルは、次の方法ステップに連続的に流れる。
【0271】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）はバッチモード、半連続モード又は連続モードで実行される。別のいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、半連続モード又は連続モードで実行され、好ましくは、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）は連続モードで実行される。
【0272】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明の方法は連続モードで実行され、前記方法は、
（ａ’）流体中のシステム１を用意し、流体中のシステム２を用意するステップと、
（ｂ’）システム１及び／又はシステム２を独立してクロマトグラフィーステップに供して、システム１の溶出物及び／又はシステム２の溶出物を得て、システム１の溶出物及び／又はシステム２の溶出物が低下した不純物レベルを有するステップと、
（ｃ’）ステップ（ａ’）又は（ｂ’）におけるシステム１とシステム２を混合して反応流体を形成し、リガーゼユニットを前記反応流体に適用してＴと式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体とのコンジュゲーション反応を触媒し、粗コンジュゲート混合物を得て、前記粗コンジュゲート混合物が標的コンジュゲート及び１つ又は複数の不純物を含むステップと、
（ｄ’）ステップ（ｃ’）の粗コンジュゲート混合物をクロマトグラフィーステップに供して不純物を除去し、所望の純度を有する標的コンジュゲートを得るステップと、を含み、
ここで、
ステップ（ａ’）～（ｄ’）を接続することで、サンプルが１つの方法ステップから次の方法ステップへと連続的に流れることができるように流体の相互連通を維持する。
（ａ’）流体中のシステム１を用意し、流体中のシステム２を用意するステップと、
（ｂ’）システム１及び／又はシステム２を独立してクロマトグラフィーステップに供して、システム１の溶出物及び／又はシステム２の溶出物を得て、システム１の溶出物及び／又はシステム２の溶出物が低下した不純物レベルを有するステップと、
（ｃ’）ステップ（ａ’）又は（ｂ’）におけるシステム１とシステム２を混合して反応流体を形成し、リガーゼユニットを前記反応流体に適用してＴと式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体とのコンジュゲーション反応を触媒し、粗コンジュゲート混合物を得て、前記粗コンジュゲート混合物が標的コンジュゲート及び１つ又は複数の不純物を含むステップと、
（ｄ’）ステップ（ｃ’）の粗コンジュゲート混合物をクロマトグラフィーステップに供して不純物を除去し、所望の純度を有する標的コンジュゲートを得るステップと、を含み、
ここで、
ステップ（ａ’）～（ｄ’）を接続することで、サンプルが１つの方法ステップから次の方法ステップへと連続的に流れることができるように流体の相互連通を維持する。
【0273】
本発明の方法は、例えば、発酵、清澄化、クロマトグラフィー、ｐＨ調節、ウイルス不活性化、ウイルス濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、無菌濾過、製剤及びそれらの組合せからなる群から選択される追加のステップをさらに含むことによって、特定のコンジュゲートの調製に適合することができる。当業者であれば、前記追加のステップと本発明の方法を組み合わせ、そして特定のコンジュゲートを調製するためのステップ順序を手配することができる。
【0274】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ウイルス不活性化、ウイルス濾過、ＵＦ／ＤＦ及び／又は製剤のステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化は、例えば、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの後に、低ｐＨ処理によって完了する。ウイルス濾過は、コンジュゲーションステップ、即ちステップ（ｂ）の後又は前に行うことができる。好ましくは、ウイルス濾過は、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップの後に行われる。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過は、コンジュゲーションステップの後、例えば、精製ステップの後に行われる（例えば、ＡＤＣプロセス１～３）。他のいくつかの実施形態において、ウイルス濾過は、コンジュゲーションステップの前に行われ、例えば、イオン交換クロマトグラフィーの後に行われる（例えば、ＡＤＣプロセス４）。いくつかの実施形態において、コンジュゲーションステップの後、ステップ（３）の前にＵＦ／ＤＦを行う（例えば、ＡＤＣプロセス３～４）。
【0275】
いくつかの具体的な実施形態において、ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、コンジュゲーションステップの後、ステップ（３）の前にＵＦ／ＤＦを行い、ここでステップ（３）は、
（３ｅ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｅ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
（３ｅ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｅ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含む。
【0276】
別のいくつかの具体的な実施形態において、ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、コンジュゲーションステップの後、ステップ（３）の前にＵＦ／ＤＦを行い、ここでステップ（３）は、陽イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。
【0277】
いくつかの具体的な実施形態において、コンジュゲートはＡＤＣであり、前記方法は、図１５に示すように、ＡＤＣプロセス１、ＡＤＣプロセス２、ＡＤＣプロセス３及びＡＤＣプロセス４を含む。従来のＡＤＣプロセスと比較して、本発明の方法はステップがより少ないため、前記方法に必要な操作時間、材料及びスペースが削減される。また、従来のＡＤＣプロセスにおいて、コンジュゲーションは通常、ウイルス濾過の後に行われるのに対して、本発明の方法において、コンジュゲーションは、ウイルス濾過の前（プロセス１～３）又は後（プロセス４）にを行うことができ、より柔軟な生産が可能となる。
【0278】
いくつかの実施形態において、本発明は、リガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質（本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質）を提供する。例えば、本発明は、下記１．１～１．１０のリガーゼ融合タンパク質を提供する。
【0279】
１．１．前記リガーゼがトランスペプチダーゼ、好ましくはソルターゼである、本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【0280】
１．２．前記リガーゼがソルターゼＡである、本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質。
【0281】
１．３．前記リガーゼは、ソルターゼ、好ましくはソルターゼＡであり、及び／又は、リガーゼ供与体基質認識モチーフは、ＬＰＸＴＧＪ、好ましくはＬＰＸＴＧ又はＬＰＥＴＧＧであり、及び／又は、リガーゼ受容体基質認識モチーフは、Ｇｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎは３～１０の整数であり、Ｘは、任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸であり、好ましくは、Ｊは存在しないか又はＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0282】
１．４．前記リガーゼは、リガーゼ供与体基質認識モチーフを含む（例えば、末端配列ＬＰＸＴＧ又はＬＰＸＴＧＧを含み、ここでＸは任意の天然アミノ酸である）第１部分とリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む（例えば、ＧＧＧ等の末端ポリグリシン配列を含む）第２部分との間のコンジュゲーションを触媒して、第１部分と第２部分とのコンジュゲートを生成することができる、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0283】
１．５．前記リガーゼは下記ａ．～ｃ．から選択されるアミノ酸配列を含む、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
ａ．配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。
ｂ．部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基が任意にそれぞれ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（即ち［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）によって置換される、配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。例えば、前記リガーゼは配列番号２７のアミノ酸配列（即ち配列番号１のＳＮＡＴ対応物）を含む。
ｃ．ソルターゼ活性を有し、且つ（ａ）又は（ｂ）のいずれか１項と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
ａ．配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。
ｂ．部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基が任意にそれぞれ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（即ち［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）によって置換される、配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。例えば、前記リガーゼは配列番号２７のアミノ酸配列（即ち配列番号１のＳＮＡＴ対応物）を含む。
ｃ．ソルターゼ活性を有し、且つ（ａ）又は（ｂ）のいずれか１項と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【0284】
１．６．前記Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル部分からのハロゲンの脱離を触媒し、脱ハロゲン化アルキル部分と共有結合を形成するポリペプチドである、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0285】
１．７．前記Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル部分からのハロゲンの脱離を触媒し、脱ハロゲン化アルキル部分と共有結合を形成し、そして形成された共有結合の加水分解を防ぐために突然変異する細菌ハロアルカンデハロゲナーゼから由来し、例えば、キサントバクターオートトロフィカス又はロドコッカスロドクロウスのハロアルカンデハロゲナーゼから由来し、該ハロアルカンデハロゲナーゼは加水分解に関与する残基が突然変異し、例えば、ロドコッカスロドクロウスデハロゲナーゼのアミノ酸残基２７２部位に対応するヒスチジン残基が突然変異する、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0286】
１．８．前記Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列、又は、デハロゲナーゼ活性を有し且つ配列番号２８と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0287】
１．９．前記リガーゼは約７．５～約１０．０の等電点（ｐＩ）を有し、前記Ｈａｌｏタグは約４．５～約５．０の等電点を有し、前記リガーゼ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、前記リガーゼの等電点（ｐＩ）よりも約２．０～約４．５ｐＨ単位低い、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0288】
１．１０．配列番号２９の配列、又はデハロゲナーゼ活性、ソルターゼ活性を有し且つ配列番号２９と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0289】
別のいくつかの実施形態において、本発明は、Ｈａｌｏタグを介して支持体に連結されるリガーゼを含む、固定化リガーゼ（本発明に記載の固定化リガーゼ）を提供する。例えば、前記固定化リガーゼは、リガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質（例えば、任意の本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質）と、表面にハロアルキルリンカー（好ましくはクロロアルキルリンカー）を含む支持体との反応によって固定化され、これにより、前記リガーゼ融合タンパク質がハロアルキルリンカーとＨａｌｏタグとの共有結合相互作用によって支持体に固定化される。該固定化リガーゼは、例えば、下記１．１～１．１３のものである。
【0290】
１．１．リガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質とハロアルキルリンカーを含む支持体との反応によって固定化され、前記リガーゼ融合タンパク質は任意の本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質である、本発明に記載の固定化リガーゼ。
【0291】
１．２．リガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質とハロアルキルリンカーを含む支持体との反応によって固定化され、前記ハロアルキルリンカーは、式（Ｉ－１－１）又は（Ｉ－１）の構造を有するハロアルキル基質から生成され、
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数である、任意の前記固定化リガーゼ。
【化45】
【0292】
１．３．リガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質とハロアルキルリンカーを含む支持体との反応によって固定化され、例えば、前記支持体は、式（ＩＩ－１）又は（ＩＩ）の構造を有し、
式中、
は支持体であり、例えば、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスから選択され、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度に架橋されたアガロース樹脂であり、
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数である、任意の前記固定化リガーゼ。
【化46】
【化47】
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数である、任意の前記固定化リガーゼ。
【0293】
［なお、明確にするために、単に支持体に連結される単一のクロロアルキル－リンカー部分について説明するが、支持体に連結されるこのようなクロロアルキル－リンカー部分が多数存在することを理解すべきである。］
【0294】
１．４．下記構造を有し、
Ｓｕｐｐｏｒｔ－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ
ここで、
Ｓｕｐｐｏｒｔは、支持体（例えば固体支持体）であり、例えば、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスから選択され、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度に架橋されたアガロース樹脂であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、支持体に共有結合されるリンカー部分であり、例えば、１０～６０個の炭素原子の鎖を含み、１つ又は複数のエーテル、エステル、カルバメート及び／又はアミド結合を任意に含み、例えば、式（ＩＩ－１’）又は（ＩＩ’）のリンカー部分であり、
式中、ｕは１～２０の整数、ｖは０～２０の整数、ｗは１～１９の整数であり、
ＨａｌｏＴａｇは、Ｈａｌｏタグ（ハロアルカンデハロゲナーゼポリペプチド）であり、リンカーに共有結合され、
Ｌｉｇａｓｅはリガーゼポリペプチドであり、
ここで１つ又は複数の「－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ」部分は同じ支持体に結合される、任意の前記固定化リガーゼ。
Ｓｕｐｐｏｒｔ－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ
ここで、
Ｓｕｐｐｏｒｔは、支持体（例えば固体支持体）であり、例えば、樹脂、ビーズ、膜、ゲル、マトリックス、薄膜、プレート、ウェル、チューブ、ガラススライド又はサーフェスから選択され、好ましくは樹脂であり、より好ましくはアガロース樹脂、有機シリコーン樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂又はセルロース樹脂であり、最も好ましくは高度に架橋されたアガロース樹脂であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、支持体に共有結合されるリンカー部分であり、例えば、１０～６０個の炭素原子の鎖を含み、１つ又は複数のエーテル、エステル、カルバメート及び／又はアミド結合を任意に含み、例えば、式（ＩＩ－１’）又は（ＩＩ’）のリンカー部分であり、
【化48】
ＨａｌｏＴａｇは、Ｈａｌｏタグ（ハロアルカンデハロゲナーゼポリペプチド）であり、リンカーに共有結合され、
Ｌｉｇａｓｅはリガーゼポリペプチドであり、
ここで１つ又は複数の「－－－－Ｌｉｎｋｅｒ－－－－ＨａｌｏＴａｇ－－－－Ｌｉｇａｓｅ」部分は同じ支持体に結合される、任意の前記固定化リガーゼ。
【0295】
１．５．ソルターゼ、好ましくはソルターゼＡであり、及び／又は、リガーゼ供与体基質認識モチーフが、ＬＰＸＴＧＪ、好ましくはＬＰＸＴＧ又はＬＰＥＴＧＧであり、及び／又は、リガーゼ受容体基質認識モチーフが、Ｇｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎは３～１０の整数であり、Ｘは、任意の天然又は非天然アミノ酸であり、Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸であり、好ましくは、Ｊは存在しないか又はＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である、任意の前記固定化リガーゼ。
【0296】
１．６．リガーゼ供与体基質認識モチーフを含む（例えば、末端配列ＬＰＸＴＧ又はＬＰＸＴＧＧを含み、ここでＸは任意の天然アミノ酸である）第１部分とリガーゼ受容体基質認識モチーフを含む（例えば、ＧＧＧ等の末端ポリグリシン配列を含む）の第２部分との間のコンジュゲーションを触媒し、前記第１部分と第２部分とのコンジュゲートを生成することができる、任意の前記固定化リガーゼ。
【0297】
１．７．下記ａ．～ｃ．から選択されるアミノ酸配列を含む、任意の前記固定化リガーゼ。
ａ．配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。
ｂ．部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基が任意にそれぞれ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（即ち［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）によって置換される、配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。例えば、リガーゼは配列番号２７のアミノ酸配列（即ち配列番号１のＳＮＡＴ対応物）を含む。
ｃ．ソルターゼ活性を有し、且つ（ａ）又は（ｂ）のいずれか１項と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
ａ．配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。
ｂ．部位３４、１００、１０５及び１３６のアミノ酸残基が任意にそれぞれ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ）、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｓｐ及びＴｈｒ（即ち［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ）、又はＶａｌ、Ａｓｎ、Ａｓｎ及びＳｅｒ（即ち［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）によって置換される、配列番号１～２６のいずれかのアミノ酸配列。例えば、リガーゼは配列番号２７のアミノ酸配列（即ち配列番号１のＳＮＡＴ対応物）を含む。
ｃ．ソルターゼ活性を有し、且つ（ａ）又は（ｂ）のいずれか１項と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【0298】
１．８．前記Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル部分からのハロゲンの脱離を触媒し、脱ハロゲン化アルキル部分と共有結合を形成するポリペプチドである、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0299】
１．９．前記Ｈａｌｏタグは、ハロアルキル部分からのハロゲンの脱離を触媒し、脱ハロゲン化アルキル部分と共有結合を形成し、そして形成された共有結合の加水分解を防ぐために突然変異する細菌ハロアルカンデハロゲナーゼから由来し、例えば、キサントバクターオートトロフィカス又はロドコッカスロドクロウスのハロアルカンデハロゲナーゼから由来し、該ハロアルカンデハロゲナーゼは加水分解に関与する残基が突然変異し、例えば、ロドコッカスロドクロウスデハロゲナーゼのアミノ酸残基２７２部位に対応するヒスチジン残基が突然変異する、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0300】
１．１０．前記Ｈａｌｏタグは、配列番号２８のアミノ酸配列、又は、デハロゲナーゼ活性を有し且つ配列番号２８と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0301】
１．１１．約７．５～約１０．０の等電点（ｐＩ）を有し、前記Ｈａｌｏタグは約４．５～約５．０の等電点を有し、前記リガーゼ融合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、前記リガーゼの等電点（ｐＩ）よりも約２．０～約４．５ｐＨ単位低い、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0302】
１．１２．配列番号２９の配列、又はデハロゲナーゼ活性、ソルターゼ活性を有し且つ配列番号２９と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、任意の前記リガーゼ融合タンパク質。
【0303】
１．１３．配列番号２９の配列、又はデハロゲナーゼ活性、ソルターゼ活性を有し且つ配列番号２９と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、リンカーを介して支持体に結合される、任意の前記固定化リガーゼ。
【0304】
別のいくつかの実施形態において、本発明は、第１部分及び第２部分を含むコンジュゲート（例えば、薬物－抗体コンジュゲート）を調製するための方法（本発明に記載の方法）を提供し、ここで前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフを含み、前記第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含み、前記方法は、リガーゼユニットの存在下で第１部分と第２部分を接触させることを含み、ここで前記リガーゼユニットは、固定化リガーゼ、又はリガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質である。前記方法は、例えば、下記１．１～１．１１のものである。
【0305】
１．１．前記リガーゼユニットは、Ｈａｌｏタグを介して支持体に連結されるリガーゼを含む固定化リガーゼであり、例えば、前記固定化リガーゼは、任意の本発明に記載の固定化リガーゼである、本発明に記載の方法。
【0306】
１．２．前記リガーゼユニットは、任意の本発明に記載のリガーゼ融合タンパク質である、本発明に記載の方法。
【0307】
１．３．
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、前記第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含み、これにより、前記リガーゼユニットは、リガーゼ供与体基質認識モチーフとリガーゼ受容体基質認識モチーフとの間のコンジュゲーションを触媒し、
例えば、ステップ（ｂ）はバッチモード、半連続モード又は連続モードで実行される、任意の前記方法。
（ａ）第１部分を含むシステム１を用意し、及び第２部分を含むシステム２を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のシステム１及びシステム２をリガーゼユニットに接触させ、第１部分と第２部分との間のコンジュゲーション反応を触媒して、コンジュゲートを得るステップと、を含み、
前記第１部分及び第２部分は、それぞれ独立して、生体分子、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、核酸もしくは核酸類似体、小分子化合物、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣体を含み、
前記第１部分及び第２部分のうちの一方はリガーゼ供与体基質認識モチーフをさらに含み、前記第１部分及び第２部分のうちの他方はリガーゼ受容体基質認識モチーフを含み、これにより、前記リガーゼユニットは、リガーゼ供与体基質認識モチーフとリガーゼ受容体基質認識モチーフとの間のコンジュゲーションを触媒し、
例えば、ステップ（ｂ）はバッチモード、半連続モード又は連続モードで実行される、任意の前記方法。
【0308】
１．４．
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含み、
例えば、クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから独立して選択され、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択され、
好ましくは、前記クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択され、
例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）のうちの少なくとも１つは半連続モード又は連続モードで実行され、例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）は連続モードで実行され、
例えば、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは、抗体又は抗体フラグメントを含み、ステップ（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、例えば、ここで抗体又は抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメントを含み、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーであり、
例えば、第１部分又は第２部分はＦｃフラグメントを含み、
ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｄ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｄ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｄ－３）疎水性相互作用クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
例えば、アフィニティークロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行され、及び／又は、イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モード又はフロースルーモードで実行され、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実行され、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行される、前記方法。
（１）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム１に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（２）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）のシステム２に対して１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、及び／又は、
（３）ステップ（ｂ）で得られたコンジュゲートに対して、
１つ又は複数のクロマトグラフィーステップ処理を行って、１つ又は複数の不純物を除去するステップ、をさらに含み、
例えば、クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから独立して選択され、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択され、
好ましくは、前記クロマトグラフィーステップは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組合せから選択され、
例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）のうちの少なくとも１つは半連続モード又は連続モードで実行され、例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（１）～（３）は連続モードで実行され、
例えば、第１部分及び第２部分のうちの少なくとも１つは、抗体又は抗体フラグメントを含み、ステップ（１）～（３）のうちの少なくとも１つは、アフィニティークロマトグラフィーを含み、例えば、ここで抗体又は抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメントを含み、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーであり、
例えば、第１部分又は第２部分はＦｃフラグメントを含み、
ステップ（１）及び（２）は存在せず、ステップ（３）は、
（３ａ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ａ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ａ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｂ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｃ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｃ－２）陰イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｃ－３）陽イオン交換クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
又は
ステップ（１）又はステップ（２）は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含み、ステップ（３）は、
（３ｄ－１）タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーと、
（３ｄ－２）陽イオン交換クロマトグラフィーと、
（３ｄ－３）疎水性相互作用クロマトグラフィーと、のステップを任意の順序で含み、
例えば、アフィニティークロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行され、及び／又は、イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モード又はフロースルーモードで実行され、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実行され、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーは結合－溶出モードで実行される、前記方法。
【0309】
１．５．前記第１部分と第２部分との間の反応に１つ又は複数の不純物が存在する、任意の前記方法。
【0310】
１．６．前記第１部分又は第２部分が、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）に含まれる、任意の前記方法。
【0311】
１．７．前記リガーゼユニットがリガーゼ及びＨａｌｏタグを含むリガーゼ融合タンパク質であり、リガーゼユニットとハロアルキルリンカーを含む支持体とを反応させるステップと、第１部分と第２部分との間の反応が実質的に完了した後、形成された固定化リガーゼ、例えば、本発明に記載の任意の固定化リガーゼを除去するステップと、をさらに含む、任意の前記方法。
【0312】
１．８．前記リガーゼユニットが固定化リガーゼ、例えば、任意の本発明に記載の固定化リガーゼであり、第１部分と第２部分との間の反応が実質的に完了した後、固定化リガーゼを除去するステップをさらに含む、任意の前記方法。
【0313】
１．９．前記コンジュゲートは式（ＩＩＩ）の構造を有し、前記第１部分はＴを含み、前記第２部分は式（ＩＶ）のリンカー－ペイロード中間体を含み、
式中、
Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される生体分子を含み、
Ｌは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの他方を含むリンカーを含み、
Ｐはペイロードを含み、
ｚは１～２０の整数であり、
ｔは１～２０の整数である、任意の前記方法。
【化49】
Ｔは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの一方を有するように任意に修飾される生体分子を含み、
Ｌは、リガーゼ供与体基質認識モチーフ及びリガーゼ受容体基質認識モチーフのうちの他方を含むリンカーを含み、
Ｐはペイロードを含み、
ｚは１～２０の整数であり、
ｔは１～２０の整数である、任意の前記方法。
【0314】
１．１０．
Ｔは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、及び核酸もしくは類似体を含み、及び／又は、
Ｐは、水素、小分子化合物（好ましくは毒素）、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、核酸もしくは類似体、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体フラグメント、又はタンパク質を含む、前記方法。
Ｔは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、シグナル伝達因子、細胞成長因子、及び核酸もしくは類似体を含み、及び／又は、
Ｐは、水素、小分子化合物（好ましくは毒素）、グリカン、ＰＥＧ部分、放射性核種、サイトカイン、免疫調節剤、核酸もしくは類似体、トレーサー分子、フルオロフォア、蛍光分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体フラグメント、又はタンパク質を含む、前記方法。
【0315】
１．１１．前記リガーゼは、ソルターゼ、好ましくはソルターゼＡであり、及び／又は、リガーゼ供与体基質認識モチーフは、ＬＰＸＴＧＪ、好ましくはＬＰＸＴＧ又はＬＰＥＴＧＧであり、及び／又は、リガーゼ受容体基質認識モチーフはＧｎであり、ここでＧはグリシン（Ｇｌｙ）で、ｎは３～１０の整数であり、
Ｘは、任意の天然又は非天然アミノ酸であり、
Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸であり、好ましくは、Ｊは存在しないか又はＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である、任意の前記方法。
Ｘは、任意の天然又は非天然アミノ酸であり、
Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントであり、ここで各アミノ酸は独立して任意の天然又は非天然アミノ酸であり、好ましくは、Ｊは存在しないか又はＧｍであり、ここでｍは１～１０の整数である、任意の前記方法。
【0316】
有益な効果
一態様では、本発明は、リガーゼ融合タンパク質を提供し、該ガーゼ融合タンパク質は、下記（１）～（３）の有利な特徴のうちの少なくとも１つを有する。
（１）前記リガーゼ融合タンパク質は発現性及び溶解性が高いため、酵素精製のコストが削減される。
（２）前記リガーゼ融合タンパク質は、大量精製が容易で、純度と活性が高く、特に工業的応用に適している。
（３）前記リガーゼ融合タンパク質は、生理学的条件下で固定化しやすく、リガーゼの保管と輸送に役立つだけでなく、最大の酵素活性の維持と生産スケーラビリティの向上にも役たつ。
一態様では、本発明は、リガーゼ融合タンパク質を提供し、該ガーゼ融合タンパク質は、下記（１）～（３）の有利な特徴のうちの少なくとも１つを有する。
（１）前記リガーゼ融合タンパク質は発現性及び溶解性が高いため、酵素精製のコストが削減される。
（２）前記リガーゼ融合タンパク質は、大量精製が容易で、純度と活性が高く、特に工業的応用に適している。
（３）前記リガーゼ融合タンパク質は、生理学的条件下で固定化しやすく、リガーゼの保管と輸送に役立つだけでなく、最大の酵素活性の維持と生産スケーラビリティの向上にも役たつ。
【0317】
別の態様において、本発明は、前記リガーゼ融合タンパク質を含む固定化リガーゼを提供する。前記固定化リガーゼは、下記（１）～（４）有利な特徴のうちの少なくとも１つを有する。
（１）安定性が高い。
（２）再利用性が高く、反応完了後、固定化リガーゼは、反応系から容易に回収及び分離することができるとともに、酵素活性がほとんど損なわれない。
（３）耐塩基性に優れるため、固定化リガーゼのアルカリ洗浄が可能になる。
（４）酵素負荷量と酵素活性が高く、したがって、遊離リガーゼと比較して、前記固定化リガーゼは、密閉スペース内で高濃度の酵素活性を有するコンジュゲーション反応を触媒することができ、これにより作業スペースと保管スペース、及び試薬コストが削減される。
（１）安定性が高い。
（２）再利用性が高く、反応完了後、固定化リガーゼは、反応系から容易に回収及び分離することができるとともに、酵素活性がほとんど損なわれない。
（３）耐塩基性に優れるため、固定化リガーゼのアルカリ洗浄が可能になる。
（４）酵素負荷量と酵素活性が高く、したがって、遊離リガーゼと比較して、前記固定化リガーゼは、密閉スペース内で高濃度の酵素活性を有するコンジュゲーション反応を触媒することができ、これにより作業スペースと保管スペース、及び試薬コストが削減される。
【0318】
したがって、本発明の固定化リガーゼは、制御可能であり、再利用可能であり、費用対効果が高く、スケールアップしやすく、よって、工業的応用に特に有利である。
【0319】
いくつかの具体的な態様において、前記リガーゼ融合タンパク質は、リガーゼ融合タンパク質が由来するリガーゼと比較して、等電点が変化し、これにより、最終的なコンジュゲート生成物から残留酵素汚染物質を効果的に除去することが可能になる。この特徴は、親和性部分を含まないコンジュゲートの効率的な親和性精製にとって特に重要である。例えば、ｐＩが約８～約９のコンジュゲートについては、ｐＩが約５～約６のリガーゼ融合タンパク質を使用することができ、そしてコンジュゲートとリガーゼ融合タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離することができ、ここでリガーゼ融合タンパク質はクロマトグラフィー媒体に結合するが、コンジュゲートはフロースルーされる。あるいは、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分離し、ここでコンジュゲートはクロマトグラフィー媒体に結合するが、リガーゼ融合タンパク質はフロースルーされる。より重要なことは、リガーゼ融合タンパク質のｐＩが変化したため、存在する可能性のある微量の遊離酵素（例えば、支持体に非特異的に吸着された酵素は触媒過程で脱落することがある）は容易に除去できる。
【0320】
別の態様において、本発明は、本発明のリガーゼ融合タンパク質又は固定化リガーゼを用いてコンジュゲートを調製する方法を提供する。
【0321】
タンパク質部分を含むコンジュゲートを調製するための従来の方法は、コンジュゲーションステップ前のタンパク質の上流及び下流精製と、コンジュゲーションステップ後のコンジュゲーション生成物の下流精製との少なくとも２組の精製プロセスを含み、各組は複数のクロマトグラフィーステップを含む。ＡＤＣ（抗体－薬物コンジュゲート）の調製について、現在主流のコンジュゲーション技術は化学に基づくものであり、薬物は、リンカーを介して抗体中のリジン又はシステイン残基と化学的にコンジュゲートされる。コンジュゲーションステップの前に、上流及び下流プロセスによって高純度の抗体を調製し、それは純度の低い抗体は予測できない結果をもたらすことがあるからである。例えば、抗体フィードに不純物が含まれる場合、ペイロードとリジン／システインとのコンジュゲーション反応により副生成物が生じることがある。抗体フィード中の不純物は、コンジュゲーションステップの収率を低下させるため、プロセスの生産性に圧力がかかり、投入の追加が必要となり、さらにプロセス全体の複雑さが増大する。コンジュゲーションステップの後に、ＡＤＣ中の凝集体、溶媒、副生成物及び不純物を除去するために別の下流精製プロセスが必要である。従来の方法における２つの下流ステップは、コストと時間を大幅に増加させるほかに、収率を低下させる。また、安全性の観点から、コンジュゲーション反応は化学アイソレータ内で行う必要があるため、該方法のスケールアップが困難である。要するに、複数の上流及び下流精製ステップを含む従来の方法は、時間がかかり、経済的でなく、柔軟性がなく、スケーラビリティに欠ける。
【0322】
本発明の方法は、以下の技術效果のうちの少なくとも１つを実現する。
【0323】
（１）リガーゼの基質特異性により、前記方法は、原材料からコンジュゲートすべき部分を事前に精製する工程なく行うことができ、これにより全体的な操作時間及びステップが減少し、コスト（例えば、純水又は注射用水、様々な緩衝液試薬、クロマトグラフィー媒体等）が削減され、収率が高まる。
（２）前記方法は、コンジュゲートすべき抗体等の生体分子部分のコンジュゲーション工程と柔軟に統合することができ、つまり、標的コンジュゲートは、含まれる生体分子部分と同じ生産施設で、同じ製品サイクルで生産することができ、全収率が類似し、そして既存の生産施設及びパイプラインは大きく変わらないままであり得る。
（３）前記方法は、特に固定化リガーゼを使用する場合に、工業的ニーズを満たすために容易にスケールアップできる。
（４）製品品質のインプロセス分析の簡素化が達成される。
（５）余剰反応物及び残留酵素汚染物質等、上流の触媒反応での不純物の効果的な除去が実現される。
（６）時間的・空間的経済性の向上等が実現される。
（２）前記方法は、コンジュゲートすべき抗体等の生体分子部分のコンジュゲーション工程と柔軟に統合することができ、つまり、標的コンジュゲートは、含まれる生体分子部分と同じ生産施設で、同じ製品サイクルで生産することができ、全収率が類似し、そして既存の生産施設及びパイプラインは大きく変わらないままであり得る。
（３）前記方法は、特に固定化リガーゼを使用する場合に、工業的ニーズを満たすために容易にスケールアップできる。
（４）製品品質のインプロセス分析の簡素化が達成される。
（５）余剰反応物及び残留酵素汚染物質等、上流の触媒反応での不純物の効果的な除去が実現される。
（６）時間的・空間的経済性の向上等が実現される。
【0324】
上記利点に加えて、本発明の方法は、バイオコンジュゲート調製において従来の方法に対して少なくとも下記（１）～（２）の特別な利点を有する。
（１）凝集体（例えば抗体及びＡＤＣ凝集体）の形成が最小限に抑えられるため、最終収率が向上するとともに、凝集体除去の作業量が減少する。
（２）バイオコンジュゲートにおけるＤＡＲ比及びコンジュゲーション部位は容易に制御できるため、より高い同質性と明確な物理化学的特性を備えるバイオコンジュゲートが生じる。
（１）凝集体（例えば抗体及びＡＤＣ凝集体）の形成が最小限に抑えられるため、最終収率が向上するとともに、凝集体除去の作業量が減少する。
（２）バイオコンジュゲートにおけるＤＡＲ比及びコンジュゲーション部位は容易に制御できるため、より高い同質性と明確な物理化学的特性を備えるバイオコンジュゲートが生じる。
【0325】
実施例
本発明の目的と技術的解決手段をより明確に説明するために、以下において、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。以下の実施例で説明されていない具体的な実験方法は、いずれも従来の実験方法に従って実施される。
本発明の目的と技術的解決手段をより明確に説明するために、以下において、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。以下の実施例で説明されていない具体的な実験方法は、いずれも従来の実験方法に従って実施される。
【0326】
器具、材料及び試薬
特に明記しない限り、前記器具及び試薬は、市販されているものであってもよいし、又は本分野の従来の方法に従って調製してもよい。
特に明記しない限り、前記器具及び試薬は、市販されているものであってもよいし、又は本分野の従来の方法に従って調製してもよい。
【0327】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡは、ＧＥから入手し、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ／Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔは、ＧＥから入手する。抗体発現のためのＣＨＯ細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手する。ｐｃＤＮＡ３．３は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手する。
【0328】
ＨＩＣ－ＨＰＬＣは、Ｂｕｔｙｌ－ＨＩＣである。移動相Ａは、２５ｍＭ ＰＢ、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ７．０である。移動相Ｂは、２５ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．０である。流量は、０．８ｍｌ／ｍｉｎである。収集時間は、２５分間である。試料注入量は、２０μｇである。カラム温度は、２５℃である。検出波長は、２８０ｎｍである。サンプル室温度は、８℃である。
【0329】
一般的な方法
抗体生産の一般的な方法
抗体調製の方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、抗ヒトＨＥＲ２抗体トラスツズマブをコードするプラスミド構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、抗体軽鎖のＣ末端は、供与体認識モチーフＬＰＥＴＧＧを含むことによって修飾されることで、Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣが得られる。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞から、トラスツズマブの培養方法を参照して５～１０Ｌの反応器内で培養される高発現の細胞群をスクリーニングする。細胞培養物を遠心分離して、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得る。
抗体生産の一般的な方法
抗体調製の方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、抗ヒトＨＥＲ２抗体トラスツズマブをコードするプラスミド構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、抗体軽鎖のＣ末端は、供与体認識モチーフＬＰＥＴＧＧを含むことによって修飾されることで、Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣが得られる。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞から、トラスツズマブの培養方法を参照して５～１０Ｌの反応器内で培養される高発現の細胞群をスクリーニングする。細胞培養物を遠心分離して、収穫された清澄化細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得る。
【0330】
ＨＣＣＦは、コンジュゲーション反応に使用する抗体フィードとして使用するか（プロセス１）、又はさらに下流処理を経てコンジュゲーション反応に使用する精製抗体を提供することができる（プロセス２と３）。
【0331】
抗体精製の一般的な方法
抗体精製の方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣの精製は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ）とＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーの組合せを使用する標準方法で行われ、精製された生成物は、元のトラスツズマブ薬物緩衝液（５ｍＭヒスチジン－ＨＣｌ、２％トレハロース、０．００９％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０）に溶解される。
抗体精製の方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣの精製は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡ）とＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーの組合せを使用する標準方法で行われ、精製された生成物は、元のトラスツズマブ薬物緩衝液（５ｍＭヒスチジン－ＨＣｌ、２％トレハロース、０．００９％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０）に溶解される。
【0332】
リンカー－ペイロード中間体調製の一般的な方法
リンカー－ペイロード中間体の生産方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、該方法は次の通りである。
リンカー－ペイロード中間体の生産方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すれば、該方法は次の通りである。
【0333】
式（Ｖ－１－２）の構造を有するリンカー溶液をペイロード溶液とともにインキュベートして、式（ＩＶ－１－５－１）の構造を有するリンカー－ペイロード中間体を形成し、それをさらに開環反応させて式（ＩＶ－１－５）又は（ＩＶ－１－５’）の構造を有する開環リンカー－ペイロード中間体を得る。実施例において、ペイロードはＤＭ１であり、リンカー－ペイロード中間体は、式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）の構造を有する。開環リンカー－ペイロード中間体は、ＨＰＬＣで精製及び分析される。
【0334】
コンジュゲーション反応の一般的な方法
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから精製された抗体を使用してＡＤＣを生産する方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、該方法は次の通りである。
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから精製された抗体を使用してＡＤＣを生産する方法は、例えばＵＳ２０１７０１１２９４４Ａ１を参照することができ、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、該方法は次の通りである。
【0335】
上述したように、式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）の構造を有するリンカー－ペイロード中間体（０．１～５０ｍｇ／ｍｌ）と抗体Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ（１～１００ｍｇ／ｍｌ）を含む緩衝液をそれぞれ調製する。
【0336】
固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼを容器に所望の量で充填する。固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１～３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０～１０．０）、０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨで処理する。固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼを空気浴又は水浴で１０～４０℃にて約３０分間又はそれ以上予熱する。抗体溶液とリンカー－ペイロード中間体溶液を所定の比率（抗体：リンカー－ペイロード中間体＝１：１～１：１００）で混合し、混合物を得て、その後、混合物を処理された固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼを含む容器（プルダウン（ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ）モード）又はＨａｌｏ－ソルターゼカラム（フロースルーモード）に加える。コンジュゲーション反応を開始し、反応時間は５分間から２４時間である。
【0337】
コンジュゲーション反応完了後、反応溶液又は固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液を収集し、式（６）又は（６’）の構造を有する標的コンジュゲートを含む粗コンジュゲート混合物を得る。粗コンジュゲート混合物をＨＩＣ－ＨＰＬＣでＡＤＣのＤＡＲを分析して、反応のコンジュゲーション効率を測定する。
【0338】
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの一般的な方法
カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５にて平衡化して、粗コンジュゲート混合物を入れる。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５にて洗い流す。任意に、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０にて不純物を洗浄により除去する（洗浄ステップ）。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．３～３．７にて所望のＡＤＣを溶出する。所望のＡＤＣを含む溶出物を収集する。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０にて溶出物のｐＨをｐＨ５．０～６．０に調節する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等をＥＬＩＳＡ又はｑＰＣＲで分析する。
カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５にて平衡化して、粗コンジュゲート混合物を入れる。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５にて洗い流す。任意に、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０にて不純物を洗浄により除去する（洗浄ステップ）。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．３～３．７にて所望のＡＤＣを溶出する。所望のＡＤＣを含む溶出物を収集する。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０にて溶出物のｐＨをｐＨ５．０～６．０に調節する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等をＥＬＩＳＡ又はｑＰＣＲで分析する。
【0339】
陰イオン交換クロマトグラフィーの一般的な方法
クロマトグラフィーカラムをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ媒体で充填する。２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５～８．０にてカラムを平衡化し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから収集された複合溶出物を入れる。標的ＡＤＣを含むフロースルー液を収集する。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５～８．０にて洗い流す。２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．５～８．０にてクロマトグラフィーカラムを再生する。１Ｍ ＮａＯＨで３０分間定置洗浄（ＣＩＰ）する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等を分析する。
クロマトグラフィーカラムをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ媒体で充填する。２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５～８．０にてカラムを平衡化し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから収集された複合溶出物を入れる。標的ＡＤＣを含むフロースルー液を収集する。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５～８．０にて洗い流す。２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．５～８．０にてクロマトグラフィーカラムを再生する。１Ｍ ＮａＯＨで３０分間定置洗浄（ＣＩＰ）する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等を分析する。
【0340】
陽イオン交換クロマトグラフィーの一般的な方法
カラムをＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ媒体で充填する。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０～６．０にてカラムを平衡化し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの溶出物を入れる。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いてクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０～６．０にて洗い流す。クエン酸塩－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０～６．０にて標的ＡＤＣを溶出する。標的ＡＤＣを含む溶出物を収集する。クエン酸塩－クエン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０にてクロマトグラフィーカラムを再生する。１Ｍ ＮａＯＨで３０分間定置洗浄（ＣＩＰ）する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等を分析する。
カラムをＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ媒体で充填する。クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０～６．０にてカラムを平衡化し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの溶出物を入れる。所望のオフセット（ベースライン）に達するまで、引き続いてクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０～６．０にて洗い流す。クエン酸塩－クエン酸ナトリウム緩衝液、１００～５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０～６．０にて標的ＡＤＣを溶出する。標的ＡＤＣを含む溶出物を収集する。クエン酸塩－クエン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０にてクロマトグラフィーカラムを再生する。１Ｍ ＮａＯＨで３０分間定置洗浄（ＣＩＰ）する。溶出物中の残留不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａ等を分析する。
【0341】
実施例１ リガーゼ融合タンパク質の調製
１．１ ＳｒｔＡｓのクローニングと精製
ＳｒｔＡ（配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を有するＳｒｔＡ及びその変異体（［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ。［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ。［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ。［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）をコードする核酸は、遺伝子合成標準方法及びＧｉｂｓｏｎアセンブリ技術によってｐＥＴ－２１ａ（＋）発現ベクター中のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにサブクローニングされる。Ｈｉｓ６タグをＳｒｔＡオープンリーディングフレームのＮ末端に挿入する。
１．１ ＳｒｔＡｓのクローニングと精製
ＳｒｔＡ（配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を有するＳｒｔＡ及びその変異体（［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ。［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ。［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ。［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）をコードする核酸は、遺伝子合成標準方法及びＧｉｂｓｏｎアセンブリ技術によってｐＥＴ－２１ａ（＋）発現ベクター中のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにサブクローニングされる。Ｈｉｓ６タグをＳｒｔＡオープンリーディングフレームのＮ末端に挿入する。
【0342】
ＳｒｔＡ発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。ＬＢに５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えて３７℃でＯＤ６００＝０．５～０．８になるまで培養し、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２５℃でソルターゼ発現を１２時間誘導する。標的細胞を遠心分離によって収集してリーシス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、その後、超音波処理によってリーシスし、製造元の指示に従ってＮｉ－ＮＴＡアガロース上で上清を精製する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってソルターゼの純度が＞９０％であると判断される。ＳｒｔＡの濃度は、吸光係数法で測定されたＡ２８０から算出される。
【0343】
１．２ ソルターゼ活性の評価
実施例１．１で調製された組換えＳｒｔＡのソルターゼ活性を蛍光分光光度法で測定する。３７℃で、０．６２５μＭの精製されたＳｒｔＡ（又は変異体）を加えることによって、９６ウェルプレートにおける反応（全体積１００μＬ、０．０８５ｍＭ Ａｂｚ－ＬＰＥＴＧＫ－Ｄｎｐ、１８ｍＭトリグリシンの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５））を開始する。Ａｂｚ－ＬＰＥＴＧＫ－Ｄｎｐは、２－アミノベンズイミダゾール（Ａｂｚ）をフルオロフォアとし、２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をクエンチャーとする内部クエンチしたペプチドである。ソルターゼがペプチドＬＰＥＴＧＫを切断して、ＤｎｐとＡｂｚが分離され、ソルターゼの活性を示すためのＡｂｚの蛍光シグナルは検出することができる。１時間後に蛍光シグナルの増加を連続的に収集する（λｅｘｃ／λｅｍ＝３２０ｎｍ／４２０ｎｍ、ゲイン＝８５、Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダー）。
実施例１．１で調製された組換えＳｒｔＡのソルターゼ活性を蛍光分光光度法で測定する。３７℃で、０．６２５μＭの精製されたＳｒｔＡ（又は変異体）を加えることによって、９６ウェルプレートにおける反応（全体積１００μＬ、０．０８５ｍＭ Ａｂｚ－ＬＰＥＴＧＫ－Ｄｎｐ、１８ｍＭトリグリシンの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５））を開始する。Ａｂｚ－ＬＰＥＴＧＫ－Ｄｎｐは、２－アミノベンズイミダゾール（Ａｂｚ）をフルオロフォアとし、２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をクエンチャーとする内部クエンチしたペプチドである。ソルターゼがペプチドＬＰＥＴＧＫを切断して、ＤｎｐとＡｂｚが分離され、ソルターゼの活性を示すためのＡｂｚの蛍光シグナルは検出することができる。１時間後に蛍光シグナルの増加を連続的に収集する（λｅｘｃ／λｅｍ＝３２０ｎｍ／４２０ｎｍ、ゲイン＝８５、Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダー）。
【0344】
例示的な例として、スタフィロコッカスワーネリ（配列番号３）由来のＳｒｔＡ及びその変異体（［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ）の活性を棒グラフで示す（図１）。結果によると、ＳＮＡＴ変異体ＳｒｔＡは、その野生型ＳｒｔＡ（配列番号３）よりも活性が約１倍高く、両者ともソルターゼ活性を有する。
【0345】
１．３ 本発明のリガーゼ融合タンパク質（Ｈａｌｏ－ソルターゼ）のクローニング
本発明のリガーゼ融合タンパク質（Ｈａｌｏ－ソルターゼ）をコードする核酸を細菌発現ベクターｐＥＴ２１ａ又はｐＥＴ２４ｄにクローニングし、リガーゼ融合タンパク質のそれぞれは、ＳｒｔＡ（配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を有するＳｒｔＡ及びその変異体（［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ。［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ。［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ。［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）と、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＨａｌｏタグと、を含む。
本発明のリガーゼ融合タンパク質（Ｈａｌｏ－ソルターゼ）をコードする核酸を細菌発現ベクターｐＥＴ２１ａ又はｐＥＴ２４ｄにクローニングし、リガーゼ融合タンパク質のそれぞれは、ＳｒｔＡ（配列番号１～２６から選択されるアミノ酸配列を有するＳｒｔＡ及びその変異体（［Ｓｅｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＳＮＡＴ。［Ｔｙｒ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｌａ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＹＮＡＴ。［Ｔｒｐ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｐ１０５］［Ｔｈｒ１３６］，ＷＮＤＴ。［Ｖａｌ３４］［Ａｓｎ１００］［Ａｓｎ１０５］［Ｓｅｒ１３６］，ＶＮＮＳ）と、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＨａｌｏタグと、を含む。
【0346】
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＨａｌｏ－ソルターゼは、以下の実施例に使用され、該Ｈａｌｏ－ソルターゼは、黄色ブドウ球菌由来のＳｒｔＡ変異体（配列番号２７）及びＨａｌｏタグ（配列番号２８）を含む。
【0347】
１．４ Ｈａｌｏ－ソルターゼの精製
Ｈａｌｏ－ソルターゼは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現され、精製され、－８０℃、５％～１０％のグリセロールに保存される。Ｈｉｓ６タグを有するＨｉｓ－ソルターゼ及びＧＢ１タグを有するＧＢ１－ソルターゼは、比較のために同様の方法で調製される。
Ｈａｌｏ－ソルターゼは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現され、精製され、－８０℃、５％～１０％のグリセロールに保存される。Ｈｉｓ６タグを有するＨｉｓ－ソルターゼ及びＧＢ１タグを有するＧＢ１－ソルターゼは、比較のために同様の方法で調製される。
【0348】
１．５ Ｈａｌｏ－ソルターゼの活性
方法は次の（１）～（４）の通りである。
（１）精製された抗体Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣと式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）の構造を有するリンカー－ペイロード中間体とを、コンジュゲーション緩衝液中に最適なモル比（Ａｂ：リンカー－ペイロード中間体＝１：１～１：１００）で混合する。
（２）実施例１．４で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ソルターゼ又はＧＢ１－ソルターゼをそれぞれ、ステップ（１）の混合物と４～４０℃で０．５～２０時間インキュベートする。
（３）ステップ（２）で得られた生成物を４℃又は－８０℃で保存する。
（４）生成物に対して１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行って、コンジュゲーション効率を測定する。
方法は次の（１）～（４）の通りである。
（１）精製された抗体Ｔ－ＬＣＣＴＬ－ＨＣと式（ＩＶ－１－６）又は（ＩＶ－１－６’）の構造を有するリンカー－ペイロード中間体とを、コンジュゲーション緩衝液中に最適なモル比（Ａｂ：リンカー－ペイロード中間体＝１：１～１：１００）で混合する。
（２）実施例１．４で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ソルターゼ又はＧＢ１－ソルターゼをそれぞれ、ステップ（１）の混合物と４～４０℃で０．５～２０時間インキュベートする。
（３）ステップ（２）で得られた生成物を４℃又は－８０℃で保存する。
（４）生成物に対して１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行って、コンジュゲーション効率を測定する。
【0349】
結果は図２に示すように、Ｈａｌｏ－ソルターゼ、ＧＢ１－ソルターゼ及びＨｉｓ－ソルターゼのコンジュゲーション効率は９０％を上回る。
【0350】
実施例２ 固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの調製
２．１ クロロアルキル－リンカー修飾樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ Ｒｅｓｉｎ）の調製
クロロ樹脂の調製方法は、例えば、米国特許第７，４２９，４７２号、第７，８８８，０８６号及び第８，２０２，７００号を参照し、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。クロロ樹脂の調製に使用する樹脂を表２に示す。
２．１ クロロアルキル－リンカー修飾樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ Ｒｅｓｉｎ）の調製
クロロ樹脂の調製方法は、例えば、米国特許第７，４２９，４７２号、第７，８８８，０８６号及び第８，２０２，７００号を参照し、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。クロロ樹脂の調製に使用する樹脂を表２に示す。
【0351】
【表3】
【0352】
方法は次の（１）～（３）の通りである。
（１）前処理
ＮＨＳ活性化樹脂（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）及びＣＮＢｒ活性化樹脂（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）について、
イソプロピルアルコールで樹脂を濾過し、濾過ケーキをＤＭＦで１回洗浄し、その後、吸引して乾燥させる。ＤＭＦを使用して濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、混合物にエチレンジアミンを加え、１０～１５時間撹拌する。濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄する。その後、液体を切る。
エポキシ活性化樹脂について、
イソプロピルアルコールで樹脂を濾過し、濾過ケーキをＨ２Ｏで１回洗浄し、その後、吸引して乾燥させる。濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、混合物に２５％～２８％の濃アンモニア水を加え、体系を４０～５０℃まで徐々に加熱し、４０～５０℃で撹拌しながら反応させる。体系の温度を２０～３０℃に下げ、混合物を濾過する。濾液のｐＨが約７～８に達するまで、Ｈ２Ｏで濾過ケーキを洗浄する。続いて、ＤＭＦで濾過ケーキを洗浄して液体を切る。
（２）ステップ（１）の濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、上記式（Ｉ－１－１）の構造を含むクロロアルキル基質のＤＭＦとトリエチルアミンを体系に順に加える。撹拌しながら反応させる。続いて、体系を濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄し、最後に液体を切る。
（３）ステップ（２）の濾過ケーキをフラスコに移し、撹拌する。続いて、混合物に順にＡｃ２Ｏとトリエチルアミンを加える。撹拌しながら反応させる。その後、混合物を濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄する。その後、Ｈ２Ｏで濾過ケーキを洗浄して液体を切る。最後に、２０％エタノールを使用して混合物を容器に移して保存する。
（１）前処理
ＮＨＳ活性化樹脂（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）及びＣＮＢｒ活性化樹脂（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）について、
イソプロピルアルコールで樹脂を濾過し、濾過ケーキをＤＭＦで１回洗浄し、その後、吸引して乾燥させる。ＤＭＦを使用して濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、混合物にエチレンジアミンを加え、１０～１５時間撹拌する。濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄する。その後、液体を切る。
エポキシ活性化樹脂について、
イソプロピルアルコールで樹脂を濾過し、濾過ケーキをＨ２Ｏで１回洗浄し、その後、吸引して乾燥させる。濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、混合物に２５％～２８％の濃アンモニア水を加え、体系を４０～５０℃まで徐々に加熱し、４０～５０℃で撹拌しながら反応させる。体系の温度を２０～３０℃に下げ、混合物を濾過する。濾液のｐＨが約７～８に達するまで、Ｈ２Ｏで濾過ケーキを洗浄する。続いて、ＤＭＦで濾過ケーキを洗浄して液体を切る。
（２）ステップ（１）の濾過ケーキをフラスコに移して撹拌する。続いて、上記式（Ｉ－１－１）の構造を含むクロロアルキル基質のＤＭＦとトリエチルアミンを体系に順に加える。撹拌しながら反応させる。続いて、体系を濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄し、最後に液体を切る。
（３）ステップ（２）の濾過ケーキをフラスコに移し、撹拌する。続いて、混合物に順にＡｃ２Ｏとトリエチルアミンを加える。撹拌しながら反応させる。その後、混合物を濾過してＤＭＦで濾過ケーキを洗浄する。その後、Ｈ２Ｏで濾過ケーキを洗浄して液体を切る。最後に、２０％エタノールを使用して混合物を容器に移して保存する。
【0353】
結果として、式（ＩＩ－１）の構造を有するクロロ樹脂を得る。
式中、
は、高度に架橋されたアガロース樹脂又はポリメチルメタクリレート樹脂である。
【化50】
【化51】
【0354】
２．２ クロロ樹脂へのＨａｌｏ－ソルターゼの固定化
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）実施例１．４で調製された精製Ｈａｌｏ－ソルターゼと実施例２．１で調製されたクロロ樹脂を室温で１０分間～２４時間インキュベートする。
（２）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０～１０．０）を用いて樹脂を３回洗浄する。
（３）固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの酵素活性を測定する。
（４）任意に、固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼでカラムを充填し、Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムを得る。
（５）ステップ（３）の固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼ又はステップ（４）のＨａｌｏ－ソルターゼカラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１～３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０～１０．０）、０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨで洗浄して４℃で保存する。
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）実施例１．４で調製された精製Ｈａｌｏ－ソルターゼと実施例２．１で調製されたクロロ樹脂を室温で１０分間～２４時間インキュベートする。
（２）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０～１０．０）を用いて樹脂を３回洗浄する。
（３）固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの酵素活性を測定する。
（４）任意に、固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼでカラムを充填し、Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムを得る。
（５）ステップ（３）の固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼ又はステップ（４）のＨａｌｏ－ソルターゼカラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１～３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０～１０．０）、０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨで洗浄して４℃で保存する。
【0355】
実施例３ クロロ樹脂の特徴付け
方法は次の（１）～（３）の通りである。
（１）試験すべき各クロロ樹脂をそれぞれ２５０μｌ取り、過剰量のＨａｌｏ－ソルターゼを加え、チューブをローターに置き、室温で２時間インキュベートする。
（２）固定化反応の異なる時点（それぞれ１５分間、３０分間、１時間及び２時間）で、チューブを室温で３０００ｇにて３分間遠心分離して、各クロロ樹脂の上清を１滴採取し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して上清中のＨａｌｏ－ソルターゼの濃度を測定する。
（３）各時点でのＨａｌｏ－ソルターゼの濃度を算出し、Ｈａｌｏ－ソルターゼの初期濃度からそれを差し引き、各時点での固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの量を得、クロロ樹脂に固定化されたＨａｌｏ－ソルターゼの量をコンジュゲーション時間の関数として、曲線を描く。
方法は次の（１）～（３）の通りである。
（１）試験すべき各クロロ樹脂をそれぞれ２５０μｌ取り、過剰量のＨａｌｏ－ソルターゼを加え、チューブをローターに置き、室温で２時間インキュベートする。
（２）固定化反応の異なる時点（それぞれ１５分間、３０分間、１時間及び２時間）で、チューブを室温で３０００ｇにて３分間遠心分離して、各クロロ樹脂の上清を１滴採取し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して上清中のＨａｌｏ－ソルターゼの濃度を測定する。
（３）各時点でのＨａｌｏ－ソルターゼの濃度を算出し、Ｈａｌｏ－ソルターゼの初期濃度からそれを差し引き、各時点での固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの量を得、クロロ樹脂に固定化されたＨａｌｏ－ソルターゼの量をコンジュゲーション時間の関数として、曲線を描く。
【0356】
結果を図３に示し、クロロ樹脂に固定化されたＨａｌｏ－ソルターゼの量は２時間の時点でプラトーに達し、各クロロ樹脂の最大負荷量が示される。
【0357】
実施例４ 固定化Ｈａｌｏ－ソルターゼの特徴付け
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）実施例２．２に記載したように、一定量のＨａｌｏ－ソルターゼをクロロ樹脂に固定化する。
（２）樹脂体積の５～１０倍の１×保存緩衝液で固定化酵素を３回洗浄し、毎回３０００ｇで室温にて３分間遠心分離し、固定化酵素樹脂を沈殿させ、コンジュゲーション緩衝液で固定化酵素を再懸濁する。
（３）各固定化酵素樹脂をそれぞれ２５μｌ取り、供与体認識モチーフＬＰＥＴＧＧを含む２００μｌのＧＦＰタンパク質及びリンカー－ペイロード中間体を含む（小分子化合物にカップリングした受容体認識モチーフＧＧＧを含む）小分子反応緩衝液を加え、コンジュゲーション反応を開始する。
（４）コンジュゲーション反応の異なる時点（それぞれ１５分間、３０分間、１時間及び２時間）で、上清サンプルを採取してＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を行う。
（５）ＨＩＣ－ＨＰＬＣによってコンジュゲーション効率を測定する。結果を図４に示す（コンジュゲーション活性は、経時的なＤＡＲとして表される）。
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）実施例２．２に記載したように、一定量のＨａｌｏ－ソルターゼをクロロ樹脂に固定化する。
（２）樹脂体積の５～１０倍の１×保存緩衝液で固定化酵素を３回洗浄し、毎回３０００ｇで室温にて３分間遠心分離し、固定化酵素樹脂を沈殿させ、コンジュゲーション緩衝液で固定化酵素を再懸濁する。
（３）各固定化酵素樹脂をそれぞれ２５μｌ取り、供与体認識モチーフＬＰＥＴＧＧを含む２００μｌのＧＦＰタンパク質及びリンカー－ペイロード中間体を含む（小分子化合物にカップリングした受容体認識モチーフＧＧＧを含む）小分子反応緩衝液を加え、コンジュゲーション反応を開始する。
（４）コンジュゲーション反応の異なる時点（それぞれ１５分間、３０分間、１時間及び２時間）で、上清サンプルを採取してＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を行う。
（５）ＨＩＣ－ＨＰＬＣによってコンジュゲーション効率を測定する。結果を図４に示す（コンジュゲーション活性は、経時的なＤＡＲとして表される）。
【0358】
実施例５ 低温でＨａｌｏ－ソルターゼにより触媒されたＡＤＣ生成物の溶解性
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）組換えソルターゼタンパク質ＧＢ１－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼを使用して、「一般的な方法」に記載の方法でＡＤＣサンプルを調製する。
（２）ＡＤＣサンプルを氷上に１０分間静置する。
（３）ＡＤＣサンプルを１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。
（４）ステップ（３）の沈殿に２０μｌの１×ＳＤＳローディング緩衝液を加えて沈殿を溶解し、サンプルのローディング用に５μｌ採取する。
（５）全てのサンプルを９５℃で１０ｍｉｎ煮て、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにサンプルをロードして分析する。
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）組換えソルターゼタンパク質ＧＢ１－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼを使用して、「一般的な方法」に記載の方法でＡＤＣサンプルを調製する。
（２）ＡＤＣサンプルを氷上に１０分間静置する。
（３）ＡＤＣサンプルを１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。
（４）ステップ（３）の沈殿に２０μｌの１×ＳＤＳローディング緩衝液を加えて沈殿を溶解し、サンプルのローディング用に５μｌ採取する。
（５）全てのサンプルを９５℃で１０ｍｉｎ煮て、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにサンプルをロードして分析する。
【0359】
結果を図５に示し、氷上に置かれる時、ほとんどのＧＢ１－ソルターゼにより触媒されたＡＤＣは沈殿するが、Ｈａｌｏ－ソルターゼ又はＨｉｓ－ソルターゼにより触媒されたＡＤＣは沈殿していない。結果として、Ｈａｌｏ－ソルターゼ又はＨｉｓ－ソルターゼにより触媒されたＡＤＣは、ＧＢ１－ソルターゼにより触媒されたＡＤＣと比較して、寒冷条件下でより安定し、比較的長い保持時間を有するコンジュゲーションプロセス（バイオコンジュゲートの生産では一般的である）において生存する可能性があることが示される。したがって、Ｈｉｓ－ソルターゼとＨａｌｏ－ソルターゼは、生成物の溶解性に関してＧＢ１－ソルターゼよりも優れている。
【0360】
実施例６ Ｈａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣの分離
６．１ 陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によるＨａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣの分離
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ媒体でカラムを充填する。
（２）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化し、サンプル（それぞれＡのＡＤＣ、ＢのＨａｌｏ－ソルターゼ、及びＣのＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物である（ＡＤＣ：Ｈａｌｏ－ソルターゼの質量比はそれぞれ約１００：１である））をロードする。
（３）ベースライン、溶出液ｐＨ及び導電率が安定するまで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗い流す。
（４）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを再生する。
（５）１Ｍ ＮａＯＨで定置洗浄（ＣＩＰ）する。
６．１ 陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によるＨａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣの分離
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ媒体でカラムを充填する。
（２）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化し、サンプル（それぞれＡのＡＤＣ、ＢのＨａｌｏ－ソルターゼ、及びＣのＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物である（ＡＤＣ：Ｈａｌｏ－ソルターゼの質量比はそれぞれ約１００：１である））をロードする。
（３）ベースライン、溶出液ｐＨ及び導電率が安定するまで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗い流す。
（４）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを再生する。
（５）１Ｍ ＮａＯＨで定置洗浄（ＣＩＰ）する。
【0361】
結果を図６に示し、ｐＨ７．５の時、ＡＤＣはＱＦＦクロマトグラフィーカラムを通過し（フロースルー［ＦＴ］モード）、これは従来のＡＤＣ＆Ａｂ精製方法と一致する。Ｈａｌｏ－ソルターゼはＱＦＦクロマトグラフィーカラムに結合し（結合／溶出［Ｂ／Ｅ］モード）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５にて溶出される。ＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物について、ＡＤＣはＱＦＦカラムを通過するが、Ｈａｌｏ－ソルターゼはＱＦＦカラムに結合し、両者が良好に分離される。
【0362】
６．２ 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によるＨａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣの分離
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ媒体でカラムを充填する。
（２）２０ｍＭ クエン酸－クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）でカラムを平衡化し、サンプルをロードする（それぞれＡのＡＤＣ、ＢのＨａｌｏ－ソルターゼ、ＣのＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物である）。
（３）ベースライン、溶出液ｐＨ及び導電率が安定するまで、２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）でカラムを平衡化する。
（４）２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム、１６０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２にてサンプルを溶出する。
（５）２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２にてカラムを再生し、１Ｍ ＮａＯＨで定置洗浄（ＣＩＰ）する。
方法は次の（１）～（５）の通りである。
（１）Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ媒体でカラムを充填する。
（２）２０ｍＭ クエン酸－クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）でカラムを平衡化し、サンプルをロードする（それぞれＡのＡＤＣ、ＢのＨａｌｏ－ソルターゼ、ＣのＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物である）。
（３）ベースライン、溶出液ｐＨ及び導電率が安定するまで、２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）でカラムを平衡化する。
（４）２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム、１６０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２にてサンプルを溶出する。
（５）２０ｍＭ クエン酸／クエン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２にてカラムを再生し、１Ｍ ＮａＯＨで定置洗浄（ＣＩＰ）する。
【0363】
結果を図７に示し、ｐＨ６．２の時、ＡＤＣはＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔカラムに結合し（結合／溶出［Ｂ／Ｅ］モード）、ｐＨ７．５の時、Ｈａｌｏ－ソルターゼはＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔクロマトグラフィーカラムを通過し（フロースルー［ＦＴ］モード）、ＡＤＣとＨａｌｏ－ソルターゼの混合物について、ＡＤＣはＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔカラムに結合するが、Ｈａｌｏ－ソルターゼは通過し、両者は良好に分離される。
【0364】
６．３ 反応生成物からのＨｉｓ６－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼの除去の比較
Ｈｉｓ６－ソルターゼとＨａｌｏ－ソルターゼの等電点、及びＨｉｓ６－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼと反応生成物ＡＤＣを分離するためのクロマトグラフィーモード（ＡＥＸとＣＥＸ）を表３に示す。Ｈｉｓ６－ソルターゼは８．９２の等電点を有し、ＡＤＣの等電点（８～９）に近い。Ｈｉｓ６－ソルターゼとＡＤＣは両方ともＣＥＸにおける陽イオン交換体に結合し、且つ両方ともＡＥＸにおける陰イオン交換体を通過するため、両者を分離することは困難である。Ｈａｌｏ－ソルターゼの等電点は５．７であり、Ｈａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣはＡＥＸ又はＣＥＸによって簡単に分離できる。
Ｈｉｓ６－ソルターゼとＨａｌｏ－ソルターゼの等電点、及びＨｉｓ６－ソルターゼ又はＨａｌｏ－ソルターゼと反応生成物ＡＤＣを分離するためのクロマトグラフィーモード（ＡＥＸとＣＥＸ）を表３に示す。Ｈｉｓ６－ソルターゼは８．９２の等電点を有し、ＡＤＣの等電点（８～９）に近い。Ｈｉｓ６－ソルターゼとＡＤＣは両方ともＣＥＸにおける陽イオン交換体に結合し、且つ両方ともＡＥＸにおける陰イオン交換体を通過するため、両者を分離することは困難である。Ｈａｌｏ－ソルターゼの等電点は５．７であり、Ｈａｌｏ－ソルターゼとＡＤＣはＡＥＸ又はＣＥＸによって簡単に分離できる。
【0365】
【表4】
【0366】
実施例７ タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製された抗体を用いるＡＤＣ調製（プロセス２）
７．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、ＨＣＣＦのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（即ち、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物）を使用して標的ＡＤＣを調製する。抗体フィード中のＨＣＰの含有量は１０００～２０００ｐｐｍである。コンジュゲーション反応に使用する容器は、実施例２．２で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼカラムである。粗コンジュゲート混合物はＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として収集される。ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析（図１０を参照）によると、調製されたＡＤＣのＤＡＲは１．８３である。コンジュゲーション効率は９１．６％である（表４）。
７．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、ＨＣＣＦのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（即ち、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物）を使用して標的ＡＤＣを調製する。抗体フィード中のＨＣＰの含有量は１０００～２０００ｐｐｍである。コンジュゲーション反応に使用する容器は、実施例２．２で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼカラムである。粗コンジュゲート混合物はＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として収集される。ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析（図１０を参照）によると、調製されたＡＤＣのＤＡＲは１．８３である。コンジュゲーション効率は９１．６％である（表４）。
【0367】
【表5】
【0368】
７．２ 不純物の除去
７．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して順にＡＥＸとＣＥＸを行い、各ステップの標的ＡＤＣを含むサンプル（それぞれＡＥＸのＡＤＣフロースルー液及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）を収集する。タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析し、残留不純物の量を測定する。
７．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して順にＡＥＸとＣＥＸを行い、各ステップの標的ＡＤＣを含むサンプル（それぞれＡＥＸのＡＤＣフロースルー液及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物である）を収集する。タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析し、残留不純物の量を測定する。
【0369】
ＡＥＸクロマトグラフィー後、ＨＣＰ含有量が約１対数（９０％）減少したことが観察された。一連のクロマトグラフィー精製を経た後、ＨＣＰ、ＤＮＡ及びタンパク質Ａのレベルは全て１ｐｐｍ以下に下がる（図９を参照）。
【0370】
実施例８ ＨＣＣＦから得られた抗体を用いるＡＤＣ調製（プロセス１）
８．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、抗体フィードとしてＨＣＣＦを使用して標的ＡＤＣを調製する。抗体フィード中のＣＨＯ ＨＣＰの含有量は１０００００～１００００００ｐｐｍである。
８．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、抗体フィードとしてＨＣＣＦを使用して標的ＡＤＣを調製する。抗体フィード中のＣＨＯ ＨＣＰの含有量は１０００００～１００００００ｐｐｍである。
【0371】
コンジュゲーション反応に使用する容器は、実施例２．２で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼカラムである。粗コンジュゲート混合物はＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として収集される。ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析（図１１を参照）によると、調製されたＡＤＣのＤＡＲは１．８１で、コンジュゲーション効率は９０．５％である（表５を参照）。
【0372】
【表6】
【0373】
８．２ 不純物の検出及び除去
８．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行い、各ステップのＡＤＣを含む溶液（それぞれタンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物）を収集し、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析して残留不純物の量を測定する。
８．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行い、各ステップのＡＤＣを含む溶液（それぞれタンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物）を収集し、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析して残留不純物の量を測定する。
【0374】
ＡＥＸクロマトグラフィー後、ＨＣＰ含有量が８０％減少し、ＤＮＡ含有量が約３対数（９９．９％）減少したことが観察された。ＣＥＸクロマトグラフィー後、ＨＣＰ含有量が約９３％減少したことが観察された。一連のクロマトグラフィー精製を経た後、ＤＮＡ及びタンパク質Ａの含有量レベルは５ｐｐｍ以下に下がり、ＨＣＰのレベルは４０ｐｐｍ以下に下がる（図１１を参照）。
【0375】
本発明のプロセスは、ＡＤＣの高速調製、特に小規模、例えば実験室での調製、又は生物活性の研究等の目的でのＡＤＣのハイスループット調製に適している。
【0376】
実施例９ タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製された抗体を用いるＡＤＣ調製（プロセス３）
９．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、ＨＣＣＦのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから得られたモノクローナル抗体（即ち、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物）を使用して標的ＡＤＣを調製する。コンジュゲーション反応に使用する容器は、実施例２．２で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼカラムである。粗コンジュゲート混合物はＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として収集される。
９．１ コンジュゲーション反応
「一般的な方法」に記載の方法に従って、ＨＣＣＦのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから得られたモノクローナル抗体（即ち、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物）を使用して標的ＡＤＣを調製する。コンジュゲーション反応に使用する容器は、実施例２．２で調製されたＨａｌｏ－ソルターゼカラムである。粗コンジュゲート混合物はＨａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として収集される。
【0377】
９．２ 不純物の除去
８．２と同様の方法で、９．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析し、残留不純物の量を測定する。結果として、一連のクロマトグラフィー精製を経た後、ＨＣＰ及びタンパク質Ａのレベルは２ｐｐｍ以下に下がることが示される（図１２を参照）。したがって、２つのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーステップを用いても、タンパク質Ａが浸出する可能性に関して生成物の品質が影響されない。２番目のタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーステップの溶出物中の不純物の含有量が低いことは、この方法ではより高濃度／より複雑なローディングサンプルに耐えられることを示す。したがって、本実施例は、実施例７及び実施例８に記載した方法よりも複雑な精製プロセスの概念的検証として理解してもよい。
８．２と同様の方法で、９．１で収集された粗コンジュゲート混合物に対して、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのｍＡｂ溶出物、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物をＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで分析し、残留不純物の量を測定する。結果として、一連のクロマトグラフィー精製を経た後、ＨＣＰ及びタンパク質Ａのレベルは２ｐｐｍ以下に下がることが示される（図１２を参照）。したがって、２つのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーステップを用いても、タンパク質Ａが浸出する可能性に関して生成物の品質が影響されない。２番目のタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーステップの溶出物中の不純物の含有量が低いことは、この方法ではより高濃度／より複雑なローディングサンプルに耐えられることを示す。したがって、本実施例は、実施例７及び実施例８に記載した方法よりも複雑な精製プロセスの概念的検証として理解してもよい。
【0378】
９．３ 残留酵素汚染物質（即ちコンジュゲーション後にＨａｌｏ－ソルターゼカラムから脱落する酵素）の除去
実施例９．１に記載したように、Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。粗コンジュゲート混合物、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物に対して、ＥＬＩＳＡ分析を行って残留酵素汚染物質の量を測定する。
実施例９．１に記載したように、Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。粗コンジュゲート混合物、タンパク質ＡアフィニティークロマトグラフィーのＡＤＣ溶出物、ＡＥＸのＡＤＣフロースルー液、及びＣＥＸのＡＤＣ溶出物に対して、ＥＬＩＳＡ分析を行って残留酵素汚染物質の量を測定する。
【0379】
図１３に示すように、一連のクロマトグラフィー精製の後、残留酵素汚染物質は３対数（９９．９％）減少した。特に、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーのみを使用するワンステップ精製に比べて、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーは、最終生成物中の残留酵素の量がさらに約７８％減少した。
【0380】
実施例１０ リンカー－ペイロード中間体とＡＤＣの分離
標的ＡＤＣを含む粗コンジュゲート混合物からリンカー－ペイロード中間体を除去する従来の方法は、通常、限外濾過（ＵＦ）を含む。しかしながら、限外濾過中に生じるせん断力により、タンパク質分子凝集のリスクが高まる。コンジュゲートしていないタンパク質分子と比較して、ＡＤＣの限外濾過時間が長く且つ疎水性が強化されることから、これは、製品ＡＤＣから小分子（例えば、リンカー－ペイロード中間体）を除去する場合に特に懸念される。
標的ＡＤＣを含む粗コンジュゲート混合物からリンカー－ペイロード中間体を除去する従来の方法は、通常、限外濾過（ＵＦ）を含む。しかしながら、限外濾過中に生じるせん断力により、タンパク質分子凝集のリスクが高まる。コンジュゲートしていないタンパク質分子と比較して、ＡＤＣの限外濾過時間が長く且つ疎水性が強化されることから、これは、製品ＡＤＣから小分子（例えば、リンカー－ペイロード中間体）を除去する場合に特に懸念される。
【0381】
本発明は、リンカー－ペイロード中間体を除去するためのユニット操作（方法ステップ）のいくつかの選択肢を提供する。以下において、クロマトグラフィーステップの実施例を提供する。これらの実施例において、ＡＤＣサンプルは、ＨＣＣＦのタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーから得られた抗体を使用し、又は抗体フィードとしてＨＣＣＦを使用して、「一般的な方法」に記載の方法に従って調製される。クロマトグラフィーステップは、「一般的な方法」に記載の方法に従って行われる。
【0382】
１０．１ タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー
９．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、異なる供給業者（ＢｉｏｍａｘとＧＥ）から提供されるタンパク質Ａクロマトグラフィー媒体を使用してタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを行う。ＧＥのタンパク質Ａを使用した方法は洗浄ステップを含むが、Ｂｉｏｍａｘのタンパク質Ａを使用した方法は洗浄ステップを含まない。結果を図１４に示す。
９．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、異なる供給業者（ＢｉｏｍａｘとＧＥ）から提供されるタンパク質Ａクロマトグラフィー媒体を使用してタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを行う。ＧＥのタンパク質Ａを使用した方法は洗浄ステップを含むが、Ｂｉｏｍａｘのタンパク質Ａを使用した方法は洗浄ステップを含まない。結果を図１４に示す。
【0383】
１０．２ ＣＥＸ
９．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、ＧＥにより提供されるＣＥＸ媒体を使用してＣＥＸクロマトグラフィーを行う。
９．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、ＧＥにより提供されるＣＥＸ媒体を使用してＣＥＸクロマトグラフィーを行う。
【0384】
結果を図１４に示す。
【0385】
１０．３ タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸ
７．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。各ステップの標的ＡＤＣを含むサンプルはＲＰ－ＨＰＬＣによって分析し、残留リンカー－ペイロード中間体（Ｌｉｎｋｅｒ－Ｔｏｘｉｎ）を測定する。
７．１と同様の方法で標的ＡＤＣを調製する。Ｈａｌｏ－ソルターゼカラムのフロースルー液として粗コンジュゲート混合物を収集し、その後、順にタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ及びＣＥＸを行う。各ステップの標的ＡＤＣを含むサンプルはＲＰ－ＨＰＬＣによって分析し、残留リンカー－ペイロード中間体（Ｌｉｎｋｅｒ－Ｔｏｘｉｎ）を測定する。
【0386】
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後、リンカー－ペイロード中間体の含有量が４対数超（９９．９９％超）減少したことが観察された。
【0387】
本発明は、例えばタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ＡＥＸ、ＣＥＸ及びそれらの組合せような、リンカー－ペイロード中間体を除去するための複数の方法を提供する。精製ステップの後、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション等の追加のステップによってさらなる精製を実現することもできる。したがって、リンカー－ペイロード中間体を完全に除去することができる。
【0388】
配列表
【0389】
【化52-1】
【化52-2】
【化52-3】
【化52-4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】