(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-31
(54)【発明の名称】敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/351 20060101AFI20240124BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20240124BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240124BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240124BHJP
A61K 31/34 20060101ALI20240124BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20240124BHJP
【ＦＩ】
A61K31/351
A61K31/7048
A61P43/00 121
A61P31/04
A61K31/34
A61K31/192
A61P43/00 111
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538107
(86)(22)【出願日】2021-03-23
(85)【翻訳文提出日】2023-07-28
(86)【国際出願番号】 CN2021082244
(87)【国際公開番号】W WO2022183539
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】202110225428.6
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519178593
【氏名又は名称】天津紅日薬業股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＡＮＪＩＮ ＣＨＡＳＥ ＳＵＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２０， ＱＵＡＮＦＡ ＲＯＡＤ， ＴＩＡＮＪＩＮ ＷＵＱＩＮＧ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＡＲＥＡ， ＴＩＡＮＪＩＮ， ３０１７００ ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110000523
【氏名又は名称】アクシス国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】于洋
(72)【発明者】
【氏名】王建立
(72)【発明者】
【氏名】蒋春亮
(72)【発明者】
【氏名】王向成
(72)【発明者】
【氏名】李玉坤
(72)【発明者】
【氏名】李宝斎
(72)【発明者】
【氏名】張桂萍
(72)【発明者】
【氏名】董凱
(72)【発明者】
【氏名】姚小青
【テーマコード（参考）】
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA06
4C086BA07
4C086EA11
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB35
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA22
4C206MA03
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB35
4C206ZC42
4C206ZC75
(57)【要約】
【要約】
本発明は敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用を提供し、化学薬品の技術分野に属する。本発明は、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンを含む３成分薬物組成物を提供し、更にヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸を含む７成分薬物組成物を提供し、本発明は、２グループの薬物組成物が、細胞レベル及び動物レベルで効果的に敗血症を治療する効果を有することを検証し、同時に薬物毒性実験は、当該薬物が比較的高い安全性を有することを示した。本発明によって提供される薬物組成物は、Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ注射剤の有効成分であるため、敗血症の臨床治療に使用できる。
本発明は敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用を提供し、化学薬品の技術分野に属する。本発明は、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンを含む３成分薬物組成物を提供し、更にヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸を含む７成分薬物組成物を提供し、本発明は、２グループの薬物組成物が、細胞レベル及び動物レベルで効果的に敗血症を治療する効果を有することを検証し、同時に薬物毒性実験は、当該薬物が比較的高い安全性を有することを示した。本発明によって提供される薬物組成物は、Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ注射剤の有効成分であるため、敗血症の臨床治療に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式が式Ｉに示されるヒドロキシサフロールイエローＡ、構造式が式ＩＩに示されるペオニフロリン及び構造式が式ＩＩＩに示されるアルビフロリンを含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０であることを特徴とする敗血症を治療するための薬物組成物。
【化1】
【請求項2】
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は、１～１００：１～１００：１～１０であることを特徴とする請求項１に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項3】
更に、構造式が式ＩＶに示される酸化ペオニフロリン、構造式が式Ｖに示されるセンキュノリドＩ、構造式が式ＶＩに示されるダンシェンスナトリウム、及び構造式が式ＶＩＩに示されるフェルラ酸を含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比が１～１００：１～１００：１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１であることを特徴とする請求項１又は２に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【化2】
【請求項4】
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：１～１０：１～１０：１～１０：１～１０：０．１～１であることを特徴とする請求項３に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の薬物組成物の敗血症を治療するための薬物の調製における使用。
【請求項6】
前記薬物組成物の敗血症におけるＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を阻害する薬物の調製における使用を特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記薬物組成物の敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害する薬物の調製における使用を特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項8】
前記薬物組成物の敗血症における敗血症制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進する薬物の調製における使用を特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項9】
前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの３つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項５～８に記載の使用。
【請求項10】
前記薬物組成物が、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸を含む７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡ薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１１～１４に記載の使用。
【請求項11】
請求項１～４の何れか一項に記載の薬物組成物から調製された薬物を服用することを特徴とする敗血症を治療する方法。
【請求項12】
前記薬物組成物がＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４および／またはＨＭＧＢ１の発現を阻害することによって敗血症の治療を実現することを特徴とする請求項１１に記載の敗血症を治療する方法。
【請求項13】
前記薬物組成物が敗血症のＴＦおよび／またはＴＭの放出を阻害することによって敗血症の治療を実現することを特徴とする請求項１１に記載の敗血症を治療する方法。
【請求項14】
前記薬物組成物が敗血症の制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進することによって敗血症の治療を実現することを特徴とする請求項１１に記載の敗血症を治療する方法。
【請求項15】
前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリンおよびアルビフロリンの３つの活性化合物から構成される場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１１～１４の何れか一項に記載の敗血症を治療する方法。
【請求項16】
前記薬物組成物が、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウムおよびフェルラ酸を含む７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１１～１４の何れか一項に記載の敗血症を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は２０２１年３月１日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２１１０２２５４２８．６であり、発明の名称が「敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張し、そのすべての内容は、引用により本出願に組み込まれる。
【0002】
本発明は化学薬品の技術分野に属し、詳しくは敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
敗血症は、感染に対する宿主の反応異常によって引き起こされる致死的な臓器機能障害であり、その悪質性と高致死率は、重症患者の死因の主な原因である。長年、従来の敗血症治療には抗生物質、抗ウイルス薬、血管拡張薬などが使用されてきたが、敗血症の発病メカニズムに十分な特異的な薬剤はまだ、臨床に投入されることはない。敗血症の発症・進展において、全身炎症反応、凝固機能障害、免疫機能障害をいかに速やかに修正し、早期に生体炎症促進-抗炎症動態バランスを回復し、患者の予後を効果的に改善するかは、敗血症の治療薬の研究開発における解決すべき重要課題になっている。
Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ（血必浄）注射液は、「３つの症候と３つの方法」の弁証原則に基づいて、「細菌、毒、炎症の組み合わせ治療」の理論の指導の下で、清王朝の王清任の著書『ＹｉｌｉｎＧａｉｃｕｏ』に収録された「血府逐オ湯」をもとに、開発された静脈内注射液であり、紅花、赤芍、川キュウ、丹参、当帰の５つの生薬から、抽出、精製、乾燥、配合の現代のプロセスによって調製され、敗血症や感染によって誘発される全身性炎症反応症候群に適し、多臓器不全症候群の臓器不全期の治療と併用することもできる。しかし、Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ（血必浄）注射液は漢方薬から調製されており、敗血症の主な有効成分がまだ不明であるため、敗血症治療用の薬物組成物を調製するには、さまざまな漢方薬を抽出及び精製する必要がある。
Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ（血必浄）注射液は、「３つの症候と３つの方法」の弁証原則に基づいて、「細菌、毒、炎症の組み合わせ治療」の理論の指導の下で、清王朝の王清任の著書『ＹｉｌｉｎＧａｉｃｕｏ』に収録された「血府逐オ湯」をもとに、開発された静脈内注射液であり、紅花、赤芍、川キュウ、丹参、当帰の５つの生薬から、抽出、精製、乾燥、配合の現代のプロセスによって調製され、敗血症や感染によって誘発される全身性炎症反応症候群に適し、多臓器不全症候群の臓器不全期の治療と併用することもできる。しかし、Ｘｕｅｂｉｊｉｎｇ（血必浄）注射液は漢方薬から調製されており、敗血症の主な有効成分がまだ不明であるため、敗血症治療用の薬物組成物を調製するには、さまざまな漢方薬を抽出及び精製する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
これを鑑みて、本発明は、敗血症を治療するための新規薬物組成物及びその使用を提供することを目的とし、当該薬物組成物は、敗血症の活性化合物を直接配合しているため、生薬の抽出という面倒な工程を省き、薬物組成物の構成をより簡潔化にすることができ、製品の薬効を向上できる。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、構造式が式Ｉに示されるヒドロキシサフロールイエローＡ、構造式が式ＩＩに示されるペオニフロリン及び構造式が式ＩＩＩに示されるアルビフロリンを含み、
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０である敗血症を治療するための薬物組成物を提供する。
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０である敗血症を治療するための薬物組成物を提供する。
【0006】
【化1】
【0007】
好ましくは、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は、１～１００：１～１００：１～１０である。
【0008】
好ましくは、前記薬物組成物はさらに、構造式が式ＩＶに示される酸化ペオニフロリン、構造式が式Ｖに示されるセンキュノリドＩ（ｓｅｎｋｙｎｏｌｉｄｅＩ）、構造式が式ＶＩに示されるダンシェンスナトリウム、及び構造式が式ＶＩＩに示されるフェルラ酸を含み、
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ（ｓｅｎｋｙｎｏｌｉｄｅＩ）、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１である。
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ（ｓｅｎｋｙｎｏｌｉｄｅＩ）、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１である。
【0009】
【化2】
【0010】
好ましくは、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ）、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：１～１０：１～１０：１～１０：１～１０：０．１～１である。
【0011】
本発明は、前記薬物組成物の敗血症治療薬の調製における使用を提供する。
【0012】
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害するための薬物の調製に使用される。
【0013】
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進するための薬剤の調製に使用される。
【0014】
好ましくは、前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの３つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇである。
【0015】
好ましくは、前記薬物組成物が、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸を含む７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇである。
【0016】
本発明はさらに、薬物組成物から調製された薬物を服用することによる敗血症の治療方法を提供する。
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を阻害することによって敗血症を治療することができる。
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を阻害することによって敗血症を治療することができる。
【0017】
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害することによって敗血症を治療することができる。
【0018】
好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進することによって敗血症の治療を実現する。
【0019】
好ましくは、前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの３つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇである。
【0020】
好ましくは、前記薬物組成物が、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸を含む７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇである。
【発明の効果】
【0021】
本発明によって提供される敗血症を治療するための薬物組成物は、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリンを含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０である。本発明は、前記薬物組成物が、敗血症におけるマクロファージＩＬ－６、ＨＭＧＢ１、ＣＴＬＡ－４及びＦｏｘｐ３の発現を抑制する作用を有し、敗血症におけるＴＦ及びＴＭの放出を有効に抑制し、同時に制御性Ｔリンパ球のアポトーシスに対する促進作用を有することを細胞レベル及び動物レベルで証明し、本発明により提供される薬物組成物が、敗血症に対して明らかに細胞又は体細胞の免疫抑制状態を修正する作用を有し、敗血症を治療する目的を達成することを示している。
【0022】
同時に、本発明の前記薬物組成物の静脈内投与による急性毒性試験の結果、投与後の動物に明らかな異常が認められず、動物の体重及び体重増加率は対照グループと有意な差はなく、肉眼解剖学的構造に明らかな異常は認められず、本発明により提供される薬物組成物が薬剤安全性を有することを示している。
【0023】
さらに、本発明によって提供される薬物組成物は、さらに式ＩＶに示される構造式を有する酸化ペオニフロリン、式Ｖに示される構造式を有するセンキュノリドＩ、式ＶＩに示される構造式を有するダンシェンスナトリウム、及び式ＶＩＩに示される構造式を有するフェルラ酸を含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１である。本発明は、ヒドロキシサフロールイエローＡが敗血症治療用の紅花の有効成分として、ペオニフロリン、アルビフロリン及び酸化ペオニフロリンが敗血症治療用の赤芍と白芍の有効成分として、センキュノリドＩが敗血症治療用の川キュウ及び当帰の有効成分として、フェルラ酸が敗血症治療用の当帰の有効成分として、ダンシェンスが敗血症治療用の丹参の活性成分として、フェルラ酸は敗血症治療用の当帰の活性成分として、３つの化合物からなる薬物組成物と比較して、７つの有効成分を厳密な用量と比率で配合した薬物組成物は、敗血症におけるマクロファージのＩＬ－６、ＨＭＧＢ１、ＣＴＬＡ－４、Ｆｏｘｐ３の発現により強力な抑制作用があり、敗血症におけるＴＦ及びＴＭの放出に対してより強力な阻害作用があり、同時に制御性Ｔリンパ球のアポトーシスに対してより強力な促進作用があることを明らかにし、本発明の実験により、前記薬物組成物が敗血症の治療においてより強力な薬効を有し、より優れた治療効果を達成することが示される。
【0024】
同時に、本発明はまた、７つの有効成分からなる薬物組成物に対して静脈内急性毒性試験を実施し、その結果、投与後の動物に明らかな異常は認められず、動物の体重及び体重増加率は対照グループと有意な差はなく、肉眼解剖学的構造に明らかな異常は認められず、薬物組成物が本発明により提供される薬剤安全性を有する。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、敗血症を治療するための薬物組成物を提供し、構造式が式Ｉに示されるヒドロキシサフロールイエローＡ、構造式が式ＩＩに示されるペオニフロリン及び構造式が式ＩＩＩに示されるアルビフロリンを含み、
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０である。
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０である。
【0026】
【化3】
【0027】
本発明において、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は、好ましくは１～１００：１～１００：１～１０であり、１～１００：１：１、１～１００：１０：１、１～１００：１００：１、１～１００：１：０．０１、１～１００：１：１０、１～１００：１０：１０、１～１００：１０：１、１～１００：１０：０．０１を含み、具体的には、１：１０：１０、１：１００：１、１０：１：１０、１０：１０：１、１０：１００：０．１、１００：１：１、１００：１０：０．１及び１０：１０：１であり、最も好ましくは１０：１０：１である。ヒドロキシサフロールイエローＡは、分子式がＣ27Ｈ3Ｏ16、分子量が６１２．５３である常用漢方薬紅花の有効成分であり、ヒドロキシサフロールイエローＡは、モノカルコン配糖体化合物であり、紅花の薬理作用の最も有効な水溶性部分であり、血小板活性化因子による血小板の凝集と放出を阻害でき、血小板受容体への血小板活性化因子の結合を競合的に阻害でき、抗血小板及び抗心筋虚血作用があり、サフロールイエローの血行促進やむくみ解消の有効成分であり、同時に、抗炎症作用、細胞保護作用、抗腫瘍作用も有する。ペオニフロリン（Ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ）は、分子式がＣ23Ｈ28Ｏ11、分子量が４８０．４６である常用漢方薬赤芍と白芍の有効成分であり、ペオニフロリンは、モノテルペン配糖体化合物であり、薬理作用が多様であり、抗フリーラジカル損傷、細胞内カルシウム過負荷の抑制、抗神経毒性などの活性を有し、生体内実験では、血液粘度の低下、血管の拡張、微小循環の改善、抗酸化、抗けいれんなどのさまざまな生物学的作用があり、有害反応が少ないことが証明された。アルビフロリンは、分子式がＣ23Ｈ28Ｏ11、分子量が４８０．４６である。アルビフロリンはペオニフロリンと化学構造が類似しており、ペオニフロリンの異性体であり、含有量はペオニフロリンより低く、アルビフロリンは、免疫系の脾臓、胸腺、血液系の造血サイトカインに作用し、血液を豊かにする明確な作用があると同時に、神経系のＨＰＡ軸と脳内のモノアミンの神経伝達にも作用し、明らかな抗うつ作用がある。前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、アルビフロリン及びペオニフロリンの形態には、それらのモノマー化合物だけでなく、好ましくは、それらの薬学的に許容できる塩、溶媒和物、多結晶体、エナンチオマー又はラセミ混合物等を更に含む。
【0028】
本発明では、前記薬物組成物は、好ましくはさらに、構造式が式ＩＶに示される酸化ペオニフロリン、構造式が式Ｖに示されるセンキュノリドＩ、構造式が式ＶＩに示されるダンシェンスナトリウム、及び構造式が式ＶＩＩに示されるフェルラ酸を含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１である。
【0029】
【化4】
【0030】
本発明において、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比は、好ましくは１～１００：１～１００：１～１０：１～１０：１～１０：１～１０：０．１～１であり、具体的に好ましくは１：１０：１：１：１：１：０．１、１：１００：１０：１０：１０：１０：１、１０：１：０．１：１：１：１０：１、１０：１０：１：１０：１０：０．１：０．０１、１０：１００：１０：０．１：０．１：１：０．１、１００：０．１：１：０．１：１０：１：１、１００：１０：０．１：１０：１：０．１：１０：０．０１、１００：１００：０．１：１０：１：０．１：１、１：１：１０：１０：１：１：０．０１、１：１０：０．１：０．１：１０：１０：１、１：１００：１：１：０．１：０．１：１、１０：１：１：０．１：１：０．１：０．１、１０：１０：１０：１０：０．１：０．１：１、１０：１００：０．１：１：１０：１：０．０１、１００：１：１０：１：１０：０．１：１、１００：１０：０．１：１０：０．１：１：１、１００：１００：１：０．１：１：１０：０．０１であり、最も好ましくは１００：１００：１：０．１：１：１０：０．０１である。酸化ペオニフロリンの含有量は、赤芍と白芍薬の中では比較的少なく、その薬理作用については、ほとんど報告がない。ペオニフロリンは、鎮痛、抗感染、抗酸化、抗がんなど作用があり、非常に高い応用価値を有するため、臨床推進に値する。センキュノリドＩは川キュウや当帰などの漢方薬の抽出物の中から分離されたフタリド化合物であり、優れた脂溶性と水溶性を有し、多種な薬理作用があり、センキュノリドＩはＮＦ－κＢ経路を阻害することにより、抗炎症作用を発揮でき、Ｉｎ ｖｉｖｏの実験では、虚血再灌流障害に対する保護作用が確認され、同時に、赤血球の変形指数と指向係数を低下させ、赤血球の凝集を低下させ、抗凝固及び抗血小板凝集の活性の作用を有する。タンシノール（Ｔａｎｓｈｉｎｏｌ）は丹参の水溶性成分の主な有効成分であり、フェノール系の芳香族酸化合物の一種であり、安定性を高めるために、ダンシェンスと同じ効果を持つダンシェンスナトリウムに調製し、研究では、ダンシェンスが心筋梗塞の範囲と病気の経過を減らし、心筋虚血再灌流障害を減らし、心筋を保護する作用を有し、ダンシェンスは、血小板の凝集をさらに著しく阻害し、全血の粘度を低下させ、その抗凝固作用により、全身のさまざまな臓器（心臓、肝臓、肺など）の微小循環障害を改善し、体の組織の回復に寄与し、同時に、ダンシェンスには一定の抗菌効果と抗炎症効果があり、体の免疫力を高める作用があることが示される。フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ）は当帰の有効成分の一つであり、フェノール酸化合物に属し、抗血小板凝集、血小板５－ヒドロキシトリプタミン放出の阻害、血小板トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）産生の阻害、プロスタグランジン活性の増強、鎮痛、血管痙攣の緩和等の作用を有する。実験により、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸がＸｕｅｂｉｊｉｎｇ注射液の中の有効成分であり、敗血症の治療における役割には、重要な実用的意義と応用価値があることが証明された。本発明において、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の形態には、それらのモノマー化合物のみならず、好ましくは、それらの薬学的に許容できる塩、溶媒和物、多結晶体、エナンチオマー又はラセミ混合物等を更に含む。
【0031】
本発明において、前記薬物組成物の調製方法は、以下の工程を含むことが好ましい。
ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリンを上記質量比で混合して薬物組成物を得る。
ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリンを上記質量比で混合して薬物組成物を得る。
【0032】
薬物組成物が７種を含む場合、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸を上記質量比に従って混合することにより得られる。
【0033】
本発明は、前記薬物組成物の敗血症治療薬の調製における使用を提供する。前記薬物組成物の敗血症の治療における使用を提供する。
【0034】
本発明において、好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を抑制するための薬物の調製に使用される。実験結果は、対照グループが細胞レベル及び動物レベルで少量のＩＬ－６及びＨＭＧＢ１を含むことを示し、モデルグループのＩＬ－６、ＨＭＧＢ１、Ｆｏｘｐ３、及びＣＴＬＡ－４の含有量は有意に増加し、前記薬物組成物投与グループ（８時間、２４時間及び４８時間）のＩＬ－６、ＨＭＧＢ１、Ｆｏｘｐ３及びＣＴＬＡ－４の血漿中含有量は、いずれもモデルグループより有意に低く、各用量グループの３成分の薬剤グループは、ＣＬＰ敗血症におけるＩＬ－６、ＨＭＧＢ１、Ｆｏｘｐ３、及びＣＴＬＡ－４の発現を大幅に減少させることができ、敗血症ラットモデルの初期炎症反応に対して明らかな抑制効果があることが示唆されている。前記薬学的組成物は、ＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を阻害することにより、敗血症の初期炎症反応を治療する効果を達成する。
【0035】
本発明において、好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害するための薬物の調製に使用される。実験は、細胞レベル及び動物レベルで、対照グループで単球のＴＭ及びＴＦが一定の発現されることを示し、モデルグループでＴＭとＴＦ（手術後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間）の発現は対照グループより有意に高く（ｐ＜０．０５）、且つ手術後時間の延長とともに徐々に増加し、薬物組成物投与グループのＴＭ及びＴＦ（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）の発現は、モデルグループよりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。前記薬物組成物が、敗血症ラットモデルに対して、明らかに凝固因子の放出を阻害し、凝固亢進状態を改善する作用があることを示している。前記薬物組成物は、敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害することによって、敗血症凝固疾患の治療効果を達成する。
【0036】
本発明において、好ましくは、前記薬物組成物は、敗血症制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｄ）のアポトーシスを促進するための薬剤の調製に使用される。実験は、モデルグループＴｒｅｇ細胞のアポトーシス細胞の比率は対照グループよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、漢方薬組成物投与グループがモデルグループよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループは、いずれも敗血症Ｔｒｅｇのアポトーシスを促進し、Ｔリンパ球の増殖と分泌機能に対する抑制効果をダウンレギュレートさせることができる。前記薬物組成物は、Ｔｒｅｇアポトーシスを促進することにより、Ｔリンパ球の増殖及び分泌機能を調節できることを示す。
【0037】
本発明において、前記薬物組成物は細胞レベル及び動物レベルで、別々の薬物実験を行い、動物投与量に基づいて、徐叔云主編の『薬理実験方法学』におけるヒトと動物の間の体表面積換算法に従い、式Ａに従ってヒトに投与される用量を算出する。
ヒトの用量＝ラットの用量／０．０１８ 式Ａ
ここで、成人の体重７０ｋｇ、ラットの体重０．２ｋｇを基準とし。
ヒトの用量＝ラットの用量／０．０１８ 式Ａ
ここで、成人の体重７０ｋｇ、ラットの体重０．２ｋｇを基準とし。
【0038】
好ましくは、前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの３つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸の７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇである。
【0039】
本発明は、調製された薬剤の剤形に特別な限定はなく、例えば錠剤、カプセル剤、経口液剤、顆粒剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤、軟膏剤、エリキシル剤、懸濁液剤、粉末剤、溶液剤、注射剤、坐剤、スプレー剤、ドロップ剤など、当技術分野で周知の医薬剤形を使用すればよい。本発明は、前記薬物の各剤形の調製方法に特別な制限はなく、当技術分野で周知の医薬剤形の調製方法を使用すればよい。
【0040】
本発明によって提供される敗血症を治療するための薬学的組成物及びその使用は、実施例を参照して以下に詳細に記載されるが、それらは本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されることはできない。
実施例１
実施例１
【0041】
１．実験材料
クリーングレードＳＤラット（雄雌各半分）１８０～２２０ｇ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、ダンシェンスナトリウムは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｏｎｇｔｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩとフェルラ酸はＤｉｎｇｒｕｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液）。
クリーングレードＳＤラット（雄雌各半分）１８０～２２０ｇ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、ダンシェンスナトリウムは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｏｎｇｔｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩとフェルラ酸はＤｉｎｇｒｕｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液）。
【0042】
２．実験方法
適応期間の動物の体重増加、食事及び活動などに基づいて、８０匹の動物（半分は雄、半分は雌）をスクリーニングして本試験に参加させ、ラットを体重グループ群分け法により４つのグループに分け、各グループ２０匹ずつ、雌雄は各半分であった。
適応期間の動物の体重増加、食事及び活動などに基づいて、８０匹の動物（半分は雄、半分は雌）をスクリーニングして本試験に参加させ、ラットを体重グループ群分け法により４つのグループに分け、各グループ２０匹ずつ、雌雄は各半分であった。
【0043】
３成分薬物の各成分の濃度は、ヒドロキシサフロールイエローＡ３０ｍｇ／ｍｌ、ペオニフロリン４０ｍｇ／ｍｌ、アルビフロリン４ｍｇ／ｍｌであった。薬液の調製方法は、ヒドロキシサフラワーイエローＡ３．０ｇ、ペオニフロリン４．０ｇ、アルビフロリン０．４ｇをそれぞれ電子天秤（１／１００００ｇ）で量り、適量の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１００ｍＬにしてろ過滅菌して３成分薬物に調製した。
【0044】
７成分薬物の各成分の濃度は、ヒドロキシサフロールイエローＡ３０ｍｇ／ｍｌ、ペオニフロリン４０ｍｇ／ｍｌ、アルビフロリン４ｍｇ／ｍｌ、酸化ペオニフロリン４ｍｇ／ｍｌ、センキュノリドＩ４ｍｇ／ｍｌ、ダンシェンスナトリウム４ｍｇ／ｍｌ、フェルラ酸０．５ｍｇ／ｍｌであった。薬液の調製方法は、ヒドロキシサフラワーイエローＡ３．０ｇ、ペオニフロリン４．０ｇ、アルビフロリン０．４ｇ、酸化ペオニフロリン０．４ｇ、センキュノリドＩ０．４ｇ、ダンシェンスナトリウム０．４ｇ、フェルラ酸０．０５ｇを量り、適量の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、１００ｍＬにしてろ過滅菌して７成分薬物に調製した。
【0045】
ラットの静脈内注射の限界量は６ｍＬ／ｋｇであり、要約すると、３成分薬物の投与量は、ヒドロキシサフラワーイエローＡ１８０ｍｇ／ｋｇ、ペオニフロリン２４０ｍｇ／ｋｇ、アルビフロリン２４ｍｇ／ｋｇであった。
【0046】
７成分薬物の投与量はヒドロキシサフロールイエローＡ１８０ｍｇ／ｋｇ、ペオニフロリン２４０ｍｇ／ｋｇ、アルビフロリン２４ｍｇ／ｋｇ、酸化ペオニフロリン２４ｍｇ／ｋｇ、センキュノリドＩ２４ｍｇ／ｋｇ、ダンシェンスナトリウム２４ｍｇ／ｋｇ、フェルラ酸３ｍｇ／ｋｇであった。
【0047】
実験グループには単回投与において、６ｍＬ／ｋｇの上記の３成分薬と７成分薬をゆっくりと静脈内注射し、対照グループには同じ用量の生理食塩水を投与した。
【0048】
投与後、２時間以上連続して観察し、投与後１日目の午前と午後に各１回観察及び記録し、その後は１日１回、計１４日間観察及び記録した。観察期間中、動物の毒性反応状況及び各グループの動物の死亡状況を観察及び記録し、死亡又は瀕死の動物をタイムリーに剖検した。投与後１４日目に全生存動物を剖検し、肉眼で主要臓器の明らかな異常変化を観察し、臓器の体積、色、質感などが変化する場合、すべてを記録し、組織病理学的検査を実施する必要がある。
【0049】
３．実験結果
ラットに３成分の薬物をゆっくりと静脈内注射した結果により、（１）動物への投与後、異常症状がなかった、（２）投与グループと対照グループの動物の体重及び体重増加率に有意差はなかった、（３）肉眼的剖検では明らかな異常は見られなかったことが示される。
ラットに３成分の薬物をゆっくりと静脈内注射した結果により、（１）動物への投与後、異常症状がなかった、（２）投与グループと対照グループの動物の体重及び体重増加率に有意差はなかった、（３）肉眼的剖検では明らかな異常は見られなかったことが示される。
【0050】
ラットに７成分の薬物をゆっくりと静脈内注射した結果により、（１）動物への投与後、異常症状がなかった、（２）投与グループと対照グループの動物の体重及び体重増加率に有意差はなかった、（３）肉眼的剖検では明らかな異常は見られなかったことが示される。
実施例２
実施例２
【0051】
ＬＰＳによって刺激されたラット腹腔マクロファージからのＩＬ－６の放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0052】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＲＰＭＩ－１６４０培地、２４ウェルプレート、ＩＬ－６ＥＬＩＳＡキット。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＲＰＭＩ－１６４０培地、２４ウェルプレート、ＩＬ－６ＥＬＩＳＡキット。
【0053】
２．実験方法
雄ＳＤラットの腹腔マクロファージを分離し、具体的な方法は、雄ＳＤラットを手術前に１２時間絶食させ、麻酔後に腹腔を開き、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液を腹腔に注入し、腹壁を指で軽く押して液体を腹腔内で流動させる。腹腔内の液体を吸引して、無菌チューブに注入し、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液でもう１回洗浄し、操作は上記と同じである。収集した洗浄液２５０ｇを、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨てる。赤血球ライセート２ｍＬを加えて赤血球を溶解し、1回５秒ずつ、２回軽く振り、５分間静置してから、Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液４ｍＬを加えて反応を終了させた。上記方法に従って再度遠心し、上清を捨てた。沈殿物を培地で洗浄した後、細胞を再懸濁して２×１０6／ｍＬの細胞懸濁液を作成した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーターで培養した。各グループは６つの平行ウェルであった。別々で１２時間及び２４時間培養した後、上清を回収し、イライザ法（ELISA、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）によってサイトカインの含有量を測定した。
雄ＳＤラットの腹腔マクロファージを分離し、具体的な方法は、雄ＳＤラットを手術前に１２時間絶食させ、麻酔後に腹腔を開き、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液を腹腔に注入し、腹壁を指で軽く押して液体を腹腔内で流動させる。腹腔内の液体を吸引して、無菌チューブに注入し、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液でもう１回洗浄し、操作は上記と同じである。収集した洗浄液２５０ｇを、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨てる。赤血球ライセート２ｍＬを加えて赤血球を溶解し、1回５秒ずつ、２回軽く振り、５分間静置してから、Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液４ｍＬを加えて反応を終了させた。上記方法に従って再度遠心し、上清を捨てた。沈殿物を培地で洗浄した後、細胞を再懸濁して２×１０6／ｍＬの細胞懸濁液を作成した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーターで培養した。各グループは６つの平行ウェルであった。別々で１２時間及び２４時間培養した後、上清を回収し、イライザ法（ELISA、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）によってサイトカインの含有量を測定した。
【0054】
実験は、対照グループ、モデルグループ、及び投与グループに分けられ、各グループの処理方法は、各グループの細胞を３７℃、５％ＣＯ2の細胞インキュベーターで一晩培養した後、対照グループとモデルグループには対応する量の培養液を添加し、投与グループには対応する濃度の薬液を等量添加し、インキュベーター内で１時間培養後、対照グループにはＬＰＳを添加せず、モデルグループと投与グループはＬＰＳ（７５ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、各グループは１２時間、２４時間後、０．５ｍＬの細胞培養上清を収集し、－２０℃の冷蔵庫に保存し、集中して対応するサイトカインを検出した方法であった。ここで、投与グループは直交実験法を採用し、直交実験グループ分け法を表１、表２に示した。
【0055】
【表1】
【0056】
表１において、ヒドロキシサフロールイエローＡの３つの濃度は、低２μＭ、中２０μＭ、高２００μＭであり、ペオニフロリンの３つの濃度は、低４μＭ、中４０μＭ、高４００μＭであり、アルビフロリンの３つの濃度は、低２μＭ、中２０μＭ、高２００μＭであり、酸化ペオニフロリンの３つの濃度は、低２μＭ、中２０μＭ、高２００μＭであり、センキュノリドＩの３つの濃度は、低４μＭ、中４０μＭ、高４００μＭであり、ダンシェンスナトリウムの３つの濃度は、低２μＭ、中２０μＭ、高２００μＭであり、フェルラ酸の３つの濃度は、低４μＭ、中４０μＭ、高４００μＭであった。
【0057】
【表2】
【0058】
薬液の調製方法は、表１の各グループの対応する濃度に従って、適切な重量のヒドロキシサフラワーイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン電子天秤（１／１００００ｇ）で量り、異なる濃度の組み合わせに従って異なるメスフラスコに組み合わせ、それぞれ適切な量の培地（１０％ウシ胎児血清を含む）に溶解し、対応する濃度の９グループの３成分薬物を作成し、
表２の対応する各グループの濃度に従って、ヒドロキシサフラワーイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリド、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の適切な重量を電子天秤（１／１００００ｇ）で秤量し、異なる濃度の組み合わせに従って異なるメスフラスコに組み合わせ、それぞれ適切な培地（１０％ウシ胎児血清を含む）に溶解して、対応する濃度の１８グループの７成分薬物を作成した。
表２の対応する各グループの濃度に従って、ヒドロキシサフラワーイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリド、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の適切な重量を電子天秤（１／１００００ｇ）で秤量し、異なる濃度の組み合わせに従って異なるメスフラスコに組み合わせ、それぞれ適切な培地（１０％ウシ胎児血清を含む）に溶解して、対応する濃度の１８グループの７成分薬物を作成した。
【0059】
３．実験結果
実験結果（表３）は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも１２時間及び２４時間でラット腹腔マクロファージのＩＬ－６の放出レベルを大幅に低下できることを示し、これは３成分の薬物グループと７成分の薬物グループは、敗血症細胞モデルの初期炎症因子に対して良好な抑制効果があったことを示す。
実験結果（表３）は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも１２時間及び２４時間でラット腹腔マクロファージのＩＬ－６の放出レベルを大幅に低下できることを示し、これは３成分の薬物グループと７成分の薬物グループは、敗血症細胞モデルの初期炎症因子に対して良好な抑制効果があったことを示す。
【0060】
【表3】
【0061】
ＬＰＳによって刺激されたラット腹腔マクロファージからのＨＭＧＢ１の放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0062】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＲＰＭＩ－１６４０培地、２４ウェルプレート、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキット。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＲＰＭＩ－１６４０培地、２４ウェルプレート、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキット。
【0063】
２．実験方法
雄ＳＤラットの腹腔マクロファージを分離し、具体的な方法は、雄ＳＤラットを手術前に１２時間絶食させ、麻酔後に腹腔を開き、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液を腹腔に注入し、腹壁を指で軽く押して液体を腹腔内で流動させた。腹腔内の液体を吸引して、無菌チューブに注入し、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液でもう１回洗浄し、操作は上記と同じである。収集した洗浄液２５０ｇを、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。赤血球ライセート２ｍＬを加えて赤血球を溶解し、一回５秒ずつ、２回軽く振り、５分間静置してから、Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液４ｍＬを加えて反応を終了させた。上記方法に従って再度遠心し、上清を捨てた。沈殿物を培地で洗浄した後、細胞を再懸濁して２×１０6／ｍＬの細胞懸濁液を作成した。前記細胞懸濁液を２４ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーターで培養した。各グループは６つの平行ウェルであった。別々で４８時間及び７２時間培養した後、上清を回収し、イライザ法法（ＥＬＩＳＡ）によってサイトカインの含有量を測定した。
雄ＳＤラットの腹腔マクロファージを分離し、具体的な方法は、雄ＳＤラットを手術前に１２時間絶食させ、麻酔後に腹腔を開き、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液を腹腔に注入し、腹壁を指で軽く押して液体を腹腔内で流動させた。腹腔内の液体を吸引して、無菌チューブに注入し、１０ｍＬの予冷したＰＢＳ溶液でもう１回洗浄し、操作は上記と同じである。収集した洗浄液２５０ｇを、４℃で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。赤血球ライセート２ｍＬを加えて赤血球を溶解し、一回５秒ずつ、２回軽く振り、５分間静置してから、Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液４ｍＬを加えて反応を終了させた。上記方法に従って再度遠心し、上清を捨てた。沈殿物を培地で洗浄した後、細胞を再懸濁して２×１０6／ｍＬの細胞懸濁液を作成した。前記細胞懸濁液を２４ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2の細胞培養インキュベーターで培養した。各グループは６つの平行ウェルであった。別々で４８時間及び７２時間培養した後、上清を回収し、イライザ法法（ＥＬＩＳＡ）によってサイトカインの含有量を測定した。
【0064】
実験は、対照グループ、モデルグループ、及び投与グループに分けられ、各グループの処理方法は、
各グループの細胞を３７℃、５％ＣＯ2の細胞インキュベーターで一晩培養した後、対照グループとモデルグループには対応する量の培養液を添加し、投与グループには対応する濃度の薬液を等量添加し、インキュベーター内で１時間培養後、対照グループにはＬＰＳを添加せず、モデルグループと投与グループはＬＰＳ（７５ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、各グループは４８時間、７２時間後、０．５ｍＬの細胞培養上清を収集し、－２０℃の冷蔵庫に保存し、集中して対応するサイトカインを検出した方法であった。実験のグループ分け及び薬液調製方法は、実施例２と同じである。
各グループの細胞を３７℃、５％ＣＯ2の細胞インキュベーターで一晩培養した後、対照グループとモデルグループには対応する量の培養液を添加し、投与グループには対応する濃度の薬液を等量添加し、インキュベーター内で１時間培養後、対照グループにはＬＰＳを添加せず、モデルグループと投与グループはＬＰＳ（７５ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、各グループは４８時間、７２時間後、０．５ｍＬの細胞培養上清を収集し、－２０℃の冷蔵庫に保存し、集中して対応するサイトカインを検出した方法であった。実験のグループ分け及び薬液調製方法は、実施例２と同じである。
【0065】
３．実験結果
実験結果（表４）は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも４８時間及び７２時間でラット腹腔マクロファージのＨＭＧＢ１の放出レベルを大幅に低下できることを示し、これは３成分の薬物グループと７成分の薬物グループは、敗血症細胞モデルの後期炎症因子に対して良好な抑制効果があったことを示す。
実験結果（表４）は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも４８時間及び７２時間でラット腹腔マクロファージのＨＭＧＢ１の放出レベルを大幅に低下できることを示し、これは３成分の薬物グループと７成分の薬物グループは、敗血症細胞モデルの後期炎症因子に対して良好な抑制効果があったことを示す。
【0066】
【表4】
【0067】
ＬＰＳによって刺激されたラット腹部大動脈内皮細胞ＴＭの放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0068】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＥＣＭ培地、２４ウェルプレート、組織因子（ＴＭ）ＥＬＩＳＡキット。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＥＣＭ培地、２４ウェルプレート、組織因子（ＴＭ）ＥＬＩＳＡキット。
【0069】
２．実験方法
ラットを頸椎脱臼により殺した後、７５％のエタノールに５分間浸し、胸腔及び腹腔を一層ずつ開き、胸部と腹部の大動脈を完全に露出させ、その周囲の組織を分離し、大動脈を近位端から総腸骨動脈の枝まで分離し、ＰＢＳを含む培養皿の中に入れ、無菌的に血管外膜の脂肪組織と線維組織を剥がし、血管内腔をＰＢＳで洗浄した。大動脈を約１．５ｍｍ×１．５ｍｍの小片に切断し、６ｍＬの０．２５％ＩＶ型コラゲナーゼの中に入れ、３７℃で１５分間消化し、５分ごとに振とうし、注意しながら消化液を吸い取り、組織塊を保持し、次に１．０％中性プロテアーゼ６ｍＬを加え、３７℃で１５分間消化し、５分ごとに振動させ、消化液を吸い取り、１０ｍＬのＥＣＭを補充し、ブローを繰り返し、１０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、培地と消化液を廃棄し、断片を保持し、組織片を１０ｃｍ培養皿の底に広げ、３７℃のオーブンに逆さにして２時間入れ、組織塊を強固に接着させ、適切な量のＥＣＭを加え、組織片を沈めることが好ましく、３７℃の体積分率が５％であるＣＯ2飽和湿度インキュベーター内に入れて培養し、培地は３日ごとに交換した。約７日で、内皮細胞が組織片の端から這い出し、徐々に外側に伸び、平らで短い紡錘形又は多角形を呈すことが見られ、組織塊を取り除き、その時点で０．２５％のトリプシンで消化し、２５ｃｍ2の培養フラスコに１：３の割合で継代し、３～４回目の継代細胞を使用して実験を行った。
ラットを頸椎脱臼により殺した後、７５％のエタノールに５分間浸し、胸腔及び腹腔を一層ずつ開き、胸部と腹部の大動脈を完全に露出させ、その周囲の組織を分離し、大動脈を近位端から総腸骨動脈の枝まで分離し、ＰＢＳを含む培養皿の中に入れ、無菌的に血管外膜の脂肪組織と線維組織を剥がし、血管内腔をＰＢＳで洗浄した。大動脈を約１．５ｍｍ×１．５ｍｍの小片に切断し、６ｍＬの０．２５％ＩＶ型コラゲナーゼの中に入れ、３７℃で１５分間消化し、５分ごとに振とうし、注意しながら消化液を吸い取り、組織塊を保持し、次に１．０％中性プロテアーゼ６ｍＬを加え、３７℃で１５分間消化し、５分ごとに振動させ、消化液を吸い取り、１０ｍＬのＥＣＭを補充し、ブローを繰り返し、１０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、培地と消化液を廃棄し、断片を保持し、組織片を１０ｃｍ培養皿の底に広げ、３７℃のオーブンに逆さにして２時間入れ、組織塊を強固に接着させ、適切な量のＥＣＭを加え、組織片を沈めることが好ましく、３７℃の体積分率が５％であるＣＯ2飽和湿度インキュベーター内に入れて培養し、培地は３日ごとに交換した。約７日で、内皮細胞が組織片の端から這い出し、徐々に外側に伸び、平らで短い紡錘形又は多角形を呈すことが見られ、組織塊を取り除き、その時点で０．２５％のトリプシンで消化し、２５ｃｍ2の培養フラスコに１：３の割合で継代し、３～４回目の継代細胞を使用して実験を行った。
【0070】
上記におけるラットの腹部大動脈内皮細胞の培養方法に従って細胞を培養し、細胞懸濁液を調製し、１．２×１０5／ｍＬで細胞を接種し、細胞懸濁液を２４ウェルプレートに接種し、３７℃で培養し、約１２時間後にモデルグループと投与グループをＬＰＳで刺激を与え、１時間後異なる溶液をそれぞれ与えて介入させ、刺激後２４時間、４８時間、７２時間にそれぞれ上清を回収した。
【0071】
実験は、対照グループ、モデルグループ、及び投与グループに分けられ、各グループの処理方法は、各グループの細胞を３７℃、５％ＣＯ2の細胞インキュベーターで一晩培養した後、対照グループとモデルグループに対応する量の培養液を添加し、投与グループに対応する濃度の薬液を等量添加し、インキュベーター内で１時間培養後、対照グループにＬＰＳを添加せず、モデルグループと投与グループにＬＰＳ（７５ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、各グループは２４時間、４８時間、７２時間後、０．５ｍＬの細胞培養上清を収集し、－２０℃の冷蔵庫に保存し、集中して対応するサイトカインを検出した。実験のグループ分け及び薬液調製方法は、実施例２と同じであった。
【0072】
３．実験結果
ＴＭは、ラット腹部大動脈内皮細胞の表面に一般的に存在し、トロンビンに結合することで、プロテインＣシステムを活性化して抗凝固作用を発揮し、敗血症の状態で、ＴＭが周囲の血液に大量に放出されて、抗凝固効果を弱くさせた。薬物介入下でのＴＭの減少は、抗凝固因子／凝固促進因子のバランスに寄与し、細胞／生体の血液凝固機能の正常な状態への回復を促進するのに有益である。
ＴＭは、ラット腹部大動脈内皮細胞の表面に一般的に存在し、トロンビンに結合することで、プロテインＣシステムを活性化して抗凝固作用を発揮し、敗血症の状態で、ＴＭが周囲の血液に大量に放出されて、抗凝固効果を弱くさせた。薬物介入下でのＴＭの減少は、抗凝固因子／凝固促進因子のバランスに寄与し、細胞／生体の血液凝固機能の正常な状態への回復を促進するのに有益である。
【0073】
実験結果（表５）により、モデルグループと比較して、各濃度グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも２４時間、４８時間、７２時間でラット腹部大動脈内皮細胞のＴＭの放出を低下でき、３成分の薬物グループと７成分の薬物グループでは、敗血症細胞モデルに対して血液凝固機能を正常に戻す効果があることが示される。
【0074】
【表5】
【0075】
ＬＰＳによって刺激されたラットの腹部大動脈内皮細胞ＴＦの放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0076】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＥＣＭ培地、２４ウェルプレート、組織因子（ＴＦ）ＥＬＩＳＡキット。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＥＣＭ培地、２４ウェルプレート、組織因子（ＴＦ）ＥＬＩＳＡキット。
【0077】
２．実験方法
実験方法及びグループ分け処理方法は実施例４と同じである。
実験方法及びグループ分け処理方法は実施例４と同じである。
【0078】
実験グループ分け及び薬液の調製方式は、実施例２と同じである。
【0079】
３．実験結果
ＴＦは、ラットの腹部大動脈内皮細胞の重要な凝固促進因子であり、敗血症の状態で、凝固亢進状態はＴＦの大量放出として表現される。薬物介入下でのＴＦの減少は、抗凝固因子／凝固促進因子のバランスに寄与し、細胞／生体の血液凝固機能の正常な状態への回復を促進するのに有益である。
ＴＦは、ラットの腹部大動脈内皮細胞の重要な凝固促進因子であり、敗血症の状態で、凝固亢進状態はＴＦの大量放出として表現される。薬物介入下でのＴＦの減少は、抗凝固因子／凝固促進因子のバランスに寄与し、細胞／生体の血液凝固機能の正常な状態への回復を促進するのに有益である。
【0080】
実験結果（表６）により、モデルグループと比較して、各濃度グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループはいずれも２４時間、４８時間、７２時間でラット腹部大動脈内皮細胞凝固促進因子のＴＦの放出を低下でき、３成分の薬物グループと７成分の薬物グループでは、敗血症細胞モデルに対して血液凝固機能を正常に戻す効果があったことが示される。
【0081】
【表6】
【0082】
ＬＰＳによって刺激されたラット脾臓の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のアポトーシスに対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0083】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）－抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識アネキシンＶアポトーシスキット、ラットＣＤ２５－ＡＰＣ抗体キット、ＡＰＣ磁気ビーズ、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム（ＬＳ）、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）－抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識アネキシンＶアポトーシスキット、ラットＣＤ２５－ＡＰＣ抗体キット、ＡＰＣ磁気ビーズ、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム（ＬＳ）、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
【0084】
２．実験方法
雄のＳＤラットを頸部脱臼により殺し、脾臓を収集し、脾臓を無菌シリンジプランジャーで粉砕し、ピペットで懸濁液を遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＬ／各脾臓）を加えて再懸濁し、チューブの壁に沿ってリンパ球分離溶液（１：１）の上層に加え、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、中間層をピペットで吸引し、別の遠心管に入れ、洗浄液を加えて１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁して準備しておいた。
雄のＳＤラットを頸部脱臼により殺し、脾臓を収集し、脾臓を無菌シリンジプランジャーで粉砕し、ピペットで懸濁液を遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＬ／各脾臓）を加えて再懸濁し、チューブの壁に沿ってリンパ球分離溶液（１：１）の上層に加え、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、中間層をピペットで吸引し、別の遠心管に入れ、洗浄液を加えて１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁して準備しておいた。
【0085】
１×１０7個の単球あたり１μＬの抗ＣＤ２５－ＡＰＣ抗体を加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄した。１×１０7細胞あたり２０μＬの抗ＡＰＣ磁気ビーズと８０μＬのＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、ＬＳカラムで磁気選別してＣＤ２５+細胞を得た。
【0086】
ＣＤ２５+細胞をカウントした後、１×１０7細胞あたり２０μＬの解離剤を加え、４℃で１分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、１×１０7細胞あたり２０μＬの抗ＣＤ４磁気ビーズと３０μＬのターミネーターを加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、適量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、ＬＳカラムで磁気選別してＣＤ４+ＣＤ２５+細胞を得た。
【0087】
Ｔｒｅｇ細胞を適量の培地で再懸濁し、細胞数を２．５×１０6／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの細胞を播種し、モデルグループと実験グループは、ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３は０．５μｇ／１０6、ＣＤ２８は１μｇ／１０6）＋ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で刺激し、実験は、対照グループ、モデルグループ、及び投与グループに分け、１時間後、モデルグループと投与グループに異なる薬液をそれぞれ与えて介入し、３７℃のＣＯ2インキュベーターで７２時間培養した。
【0088】
細胞を回収し、予冷したＰＢＳで細胞を洗浄し、１ｍｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒで再度洗浄し、遠心分離後、上清を除去して１００μｌ残し、次に５μｌのＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎ Ｖと５μｌのＰＩを加え、室温（２５℃）の暗所で１５分間インキュベートし、次に２００μｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒを加えて均一に混合し、１時間以内にフローサイトメトリーで検出した。
【0089】
グループ分け処理方法は次のとおりである。モデルグループ：細胞を細胞インキュベーターで一晩培養した後、ＬＰＳ（７５ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激する。投与グループ：対応する濃度の薬液を加えて１時間培養し、ＬＰＳ刺激を行い、濃度の異なる実験グループで７２時間介入後、細胞培養液の上清０．５ｍＬを収集し、－２０℃の冷蔵庫に保存し、集中して対応するサイトカインを検出した。
実験のグループ分け及び薬液調製方法は、実施例２と同じである。
実験のグループ分け及び薬液調製方法は、実施例２と同じである。
【0090】
３．実験結果
Ｔｒｅｇ細胞の機能が増強された後、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－βなど免疫抑制因子を産生することで通常のＴ細胞を阻害し、また、グランザイムＢとパーフォリン－１で標的細胞を死滅させることにより、免疫抑制効果を発揮する。また、ＤＣ樹状細胞がインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを生成するように誘導して、トリプトファンのキヌレンへの分解を触媒し、周囲の細胞の死を引き起こし、また、ＤＣ細胞に他のアミノ酸関連酵素の分泌を誘導して、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮できる。したがって、薬物は一定の時期にＴｒｅｇ細胞のアポトーシスを促進し、生体免疫調節方面に非常に重要な作用を発揮する。モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループは、いずれもラット制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のアポトーシスを促進できる（表７）。
Ｔｒｅｇ細胞の機能が増強された後、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－βなど免疫抑制因子を産生することで通常のＴ細胞を阻害し、また、グランザイムＢとパーフォリン－１で標的細胞を死滅させることにより、免疫抑制効果を発揮する。また、ＤＣ樹状細胞がインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを生成するように誘導して、トリプトファンのキヌレンへの分解を触媒し、周囲の細胞の死を引き起こし、また、ＤＣ細胞に他のアミノ酸関連酵素の分泌を誘導して、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮できる。したがって、薬物は一定の時期にＴｒｅｇ細胞のアポトーシスを促進し、生体免疫調節方面に非常に重要な作用を発揮する。モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループと７成分薬物グループは、いずれもラット制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のアポトーシスを促進できる（表７）。
【0091】
【表7】
【0092】
ＬＰＳによって刺激されたラット脾臓の制御性Ｔ細胞のＣＴＬＡ－４及びＦｏｘｐ３発現に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0093】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、ラット抗ＰＥキット、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム、ＰＥ標識Ｆｏｘｐ３キット、ＰＥ標識ＣＴＬＡ－４キット、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ＬＰＳ、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、ラット抗ＰＥキット、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム、ＰＥ標識Ｆｏｘｐ３キット、ＰＥ標識ＣＴＬＡ－４キット、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
【0094】
２．実験方法
実験方法及びグループ分け処理方法は実施例６と同じである。
実験方法及びグループ分け処理方法は実施例６と同じである。
【0095】
実験グループ分け及び薬液の調製方式は、実施例２と同じである。
【0096】
３．実験結果
Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－βなど免疫抑制因子を産生することで通常のＴ細胞を阻害し、グランザイムＢとパーフォリン－１で標的細胞を死滅させることにより、免疫抑制効果を発揮する。ＣＴＬＡ－４は、ＤＣ樹状細胞がインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを生成するように誘導して、トリプトファンのキヌレンへの分解を触媒し、周囲の細胞の死を引き起こし、ＤＣ細胞に他のアミノ酸関連酵素の分泌をさらに誘導して、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮できる。したがって、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３とＣＴＬＡ－４を介して生体免疫調節方面に非常に重要な作用を発揮し、Ｆｏｘｐ３の発現は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能と密接に関連する。
Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－βなど免疫抑制因子を産生することで通常のＴ細胞を阻害し、グランザイムＢとパーフォリン－１で標的細胞を死滅させることにより、免疫抑制効果を発揮する。ＣＴＬＡ－４は、ＤＣ樹状細胞がインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを生成するように誘導して、トリプトファンのキヌレンへの分解を触媒し、周囲の細胞の死を引き起こし、ＤＣ細胞に他のアミノ酸関連酵素の分泌をさらに誘導して、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮できる。したがって、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３とＣＴＬＡ－４を介して生体免疫調節方面に非常に重要な作用を発揮し、Ｆｏｘｐ３の発現は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能と密接に関連する。
【0097】
モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループは、いずれも７２時間でラット制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のＣＴＬＡ－４及びＦｏｘｐ３の発現レベルを低下させることができ、３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが敗血症ラットの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対して７２時間のＣＴＬＡ－４とＦｏｘｐ３の発現レベルを低下させる効果があることが示される（表８及び表９）。
【0098】
【表8】
【0099】
【表9】
【0100】
ＣＬＰ誘発敗血症ラットにおけるＩＬ－６発現に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0101】
１．実験材料
１週間適応的に飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＩＬ－６ＥＬＩＳＡ検出キット。
１週間適応的に飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＩＬ－６ＥＬＩＳＡ検出キット。
【0102】
２．実験方法
２．１グループ分けと介入
２９０匹のラットをランダムに対照グループ、モデルグループ及び投与グループの合計２９グループに分け、各グループ１０匹ずつであり、ここで投与グループは直交実験法を採用し、直交実験のグループ分けの方法は表１０、１１に示すとおりである。
２．１グループ分けと介入
２９０匹のラットをランダムに対照グループ、モデルグループ及び投与グループの合計２９グループに分け、各グループ１０匹ずつであり、ここで投与グループは直交実験法を採用し、直交実験のグループ分けの方法は表１０、１１に示すとおりである。
【0103】
【表10】
【0104】
表１０では、ヒドロキシサフロールイエローＡの３つの濃度は、それぞれが低０．９ｍｇ／ｋｇ、中９ｍｇ／ｋｇ、高９０ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの３つの濃度は、低０．９ｍｇ／ｋｇ、中９ｍｇ／ｋｇ、高９０ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの３つの濃度は、低０．０９ｍｇ／ｋｇ、中０．９ｍｇ／ｋｇ、高９ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの３つの濃度は、低０．０９ｍｇ／ｋｇ、中０．９ｍｇ／ｋｇ、高９ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの３つの濃度は、低０．０９ｍｇ／ｋｇ、中０．９ｍｇ／ｋｇ、高９ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの３つの濃度は、低０．０９ｍｇ／ｋｇ、中０．９ｍｇ／ｋｇ、高９ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の３つの濃度は、低０．００９ｍｇ／ｋｇ、中０．０９ｍｇ／ｋｇ、及び高０．９ｍｇ／ｋｇであった。
【0105】
【表11】
【0106】
溶液の調製方法と実験の注射量は次のとおりである。各ラットは２００ｇとして計算され、実験の注射量は何れも１．０ｍＬ／回／匹である。表１０の各グループに対応する濃度に従って、ヒドロキシサフラワーイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの適切な重量を電子天秤（１／１００００ｇ）で量り、異なる濃度の組み合わせに従って異なるメスフラスコにそれらを配合し、適切な量の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解して、対応する濃度の９グループの３成分薬物を作成し、表１１の各グループの対応する濃度に従って、ヒドロキシサフラワーイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸の適切な重量を電子天秤（１／１００００ｇ）で秤量し、異なる濃度の組み合わせに従ってメスフラスコに配合して、それぞれ適切な量の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解して、対応する濃度の７成分医薬品の１８グループを作成した。実験前に１２時間絶食させ、体重を測定し、乱数表法に従ってグループに分けた。対照グループでは盲腸のみを開腹して露出させ、皮膚を縫合し、１０ｍＬの生理食塩水を皮下注射して蘇生し、モデルグループと投与グループは盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデリングを行った後、生理食塩水１０ｍＬを皮下注射して蘇生した。ＣＬＰモデリングプロセスは次のとおりである。ケタミン注射＋スミアンキシンＩＩ注射によって２：１の体積比で調製された混合物を筋肉内注射してラットを麻酔し、敗血症動物モデルをＣＬＰによって調製した。盲腸と回腸の接合部を結紮し、１８ゲージの針を使用して盲腸を２回貫通させて腸瘻を形成し、２つのドレナージストリップ（０．５ｃｍ×２．０ｃｍ）を所定の位置に残して、針の穴が治癒するのを防ぎ、その後皮膚を層ごとに縫合し、手術直後に１０ｍＬの生理食塩水を皮下注射しして蘇生した。ラットのＣＬＰ手術後、投与グループに、手術後２時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、及び６０時間後に、尾静脈から上記の異なる薬液を注射し、モデルグループと対照グループに、対応する時間に尾静脈から生理食塩水を注射した。ｎ＝１０まで当該実験を繰り返した。
【0107】
２．２採血と検査
ＣＬＰ後の８時間、２４時間、及び４８時間に、麻酔後に各グループの動物に腹部大動脈から３ｍＬの無菌血液を採取し、血漿中のＩＬ－６含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した。
ＣＬＰ後の８時間、２４時間、及び４８時間に、麻酔後に各グループの動物に腹部大動脈から３ｍＬの無菌血液を採取し、血漿中のＩＬ－６含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した。
【0108】
３．実験結果
実験結果（表１２）は、対照グループの血漿が少量のＩＬ－６を含み、ＣＬＰ手術後早期に、モデルグループのＩＬ－６含有量が大幅に増加し、ＩＬ－６のレベルは８時間でさらに増加し、２４時間で徐々に減少したが、手術後４８時間では対照グループよりも依然として高く、差は統計的に有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す。一方、投与グループのＩＬ－６血漿含有量は、投与グループの術後８時間、２４時間、及び４８時間に、モデルグループよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、対照グループのレベルに近い。
実験結果（表１２）は、対照グループの血漿が少量のＩＬ－６を含み、ＣＬＰ手術後早期に、モデルグループのＩＬ－６含有量が大幅に増加し、ＩＬ－６のレベルは８時間でさらに増加し、２４時間で徐々に減少したが、手術後４８時間では対照グループよりも依然として高く、差は統計的に有意である（ｐ＜０．０５）ことを示す。一方、投与グループのＩＬ－６血漿含有量は、投与グループの術後８時間、２４時間、及び４８時間に、モデルグループよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、対照グループのレベルに近い。
【0109】
上記の発見は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＩＬ－６の発現を有意に減少させることができ敗血症ラットモデルの初期炎症反応に対して明らかな抑制効果があることが示唆され、成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）である。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
【0110】
【表12】
【0111】
ＣＬＰ誘発敗血症ラットにおけるＨＭＧＢ１の発現に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0112】
１．実験材料
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＨＭＧＢ１ＥＬＩＳＡ検出キット。
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＨＭＧＢ１ＥＬＩＳＡ検出キット。
【0113】
２．実験方法
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
【0114】
２．２採血と検査
ＣＬＰ手術後の４８時間及び７２時間に、麻酔後の各グループの動物に腹部大動脈から３ｍＬの無菌血液を採取し、血漿ＨＭＧＢ１含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した。
ＣＬＰ手術後の４８時間及び７２時間に、麻酔後の各グループの動物に腹部大動脈から３ｍＬの無菌血液を採取し、血漿ＨＭＧＢ１含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した。
【0115】
３．実験結果
実験結果（表１３）では、対照グループの血漿が少量のＨＭＧＢ１を含み、ＣＬＰ手術後後期に、モデルグループのＨＭＧＢ１含有量が大幅に増加し、４８時間に徐々に増加し、手術後７２時間に依然として対照グループよりも高く、差は統計的に有意だった（ｐ＜０．０５）ことを示す。一方、手術後４８時間及び７２時間での投与グループのＨＭＧＢ１の血漿含有量はいずれもモデルグループより大幅に低く（ｐ＜０．０５）、対照グループのレベルに近い。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＨＭＧＢ１の発現を有意に減少させることでき、敗血症のラットモデルの後期炎症反応には明らかな抑制効果があることを示した。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）である。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
実験結果（表１３）では、対照グループの血漿が少量のＨＭＧＢ１を含み、ＣＬＰ手術後後期に、モデルグループのＨＭＧＢ１含有量が大幅に増加し、４８時間に徐々に増加し、手術後７２時間に依然として対照グループよりも高く、差は統計的に有意だった（ｐ＜０．０５）ことを示す。一方、手術後４８時間及び７２時間での投与グループのＨＭＧＢ１の血漿含有量はいずれもモデルグループより大幅に低く（ｐ＜０．０５）、対照グループのレベルに近い。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＨＭＧＢ１の発現を有意に減少させることでき、敗血症のラットモデルの後期炎症反応には明らかな抑制効果があることを示した。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）である。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
【0116】
【表13】
【0117】
ＣＬＰ誘発敗血症ラットにおけるＴＦ放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0118】
１．実験材料
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＴＦＥＬＩＳＡ検出キット。
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＴＦＥＬＩＳＡ検出キット。
【0119】
２．実験方法
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
【0120】
２．２ 採血と検査
ＣＬＰ手術後の１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間に、麻酔した各グループの動物に腹部大動脈から５ｍＬの無菌血液を採取した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でＴＦ含有量を検出した。
ＣＬＰ手術後の１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間に、麻酔した各グループの動物に腹部大動脈から５ｍＬの無菌血液を採取した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でＴＦ含有量を検出した。
【0121】
３．実験結果
実験結果（表１４）は、対照グループの単球において一定のＴＦ発現があり、モデルグループにおけるＴＦ（術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）の発現は、対照グループより有意に高く（ｐ＜０．０５）、術後時間の延長とともに徐々に増加したことを示す。投与グループにおけるＴＦの（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）発現は、モデルグループと比較して、有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＴＦの放出を有意に減少させることができ、敗血症のラットモデルに対して、３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが凝固因子の放出を阻害し、凝固亢進状態を改善する明らかな効果を有したことを示す。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）であった。
実験結果（表１４）は、対照グループの単球において一定のＴＦ発現があり、モデルグループにおけるＴＦ（術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）の発現は、対照グループより有意に高く（ｐ＜０．０５）、術後時間の延長とともに徐々に増加したことを示す。投与グループにおけるＴＦの（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）発現は、モデルグループと比較して、有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＴＦの放出を有意に減少させることができ、敗血症のラットモデルに対して、３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが凝固因子の放出を阻害し、凝固亢進状態を改善する明らかな効果を有したことを示す。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）であった。
【0122】
【表14】
【0123】
ＣＬＰにより誘発した敗血症ラットにおけるＴＭの放出に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0124】
１．実験材料
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＴＭＥＬＩＳＡ検出キット。
適応的に１週間飼育した雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）。ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、ＴＭＥＬＩＳＡ検出キット。
【0125】
２．実験方法
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
【0126】
２．２採血と検査
ＣＬＰ手術後の１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間に、麻酔した各グループの動物に腹部大動脈から５ｍＬの無菌血液を採取した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でＴＭ含有量を検出した。
ＣＬＰ手術後の１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間に、麻酔した各グループの動物に腹部大動脈から５ｍＬの無菌血液を採取した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でＴＭ含有量を検出した。
【0127】
３．実験結果
実験結果（表１５）は、対照グループの単球に一定のＴＦ発現があり、モデルグループにおけるＴＭ（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）の発現は、いずれも対照グループより有意に高く（ｐ＜０．０５）、手術後時間の延長とともに徐々に増加したことを示す。投与グループにおけるＴＭの（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）発現は、いずれもモデルグループと比較して、有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＴＭの放出を有意に減少させることができ、敗血症のラットモデルにおいて、３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが凝固因子の放出を阻害し、凝固亢進状態を改善する明らかな効果を有したことを示す。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）である。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
実験結果（表１５）は、対照グループの単球に一定のＴＦ発現があり、モデルグループにおけるＴＭ（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）の発現は、いずれも対照グループより有意に高く（ｐ＜０．０５）、手術後時間の延長とともに徐々に増加したことを示す。投与グループにおけるＴＭの（手術後１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間）発現は、いずれもモデルグループと比較して、有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。上記の調査結果は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが何れもＣＬＰ敗血症ラットのＴＭの放出を有意に減少させることができ、敗血症のラットモデルにおいて、３成分薬物グループ及び７成分薬物グループが凝固因子の放出を阻害し、凝固亢進状態を改善する明らかな効果を有したことを示す。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）である。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
【0128】
【表15】
【0129】
ＣＬＰにより誘発した敗血症制御性Ｔ細胞機能に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響の評価
【0130】
１．実験材料
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）－抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識アネキシンＶアポトーシスキット、ラット抗－ＰＥキット、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム、ＰＥ標識Ｆｏｘｐ３キット、ＰＥ標識ＣＴＬＡ－４キット、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
雄性クリーングレードＳＤラット（１８０～２２０ｇ）、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸、１６４０培地、２４ウェルプレート、フィコエリトリン（ＰＥ）－抗ラットＣＤ２５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ラットＣＤ４、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識アネキシンＶアポトーシスキット、ラット抗－ＰＥキット、ＣＤ４磁気ビーズ、ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離器及び分離カラム、ＰＥ標識Ｆｏｘｐ３キット、ＰＥ標識ＣＴＬＡ－４キット、抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体、抗ラットＣＤ２８モノクローナル抗体。
【0131】
２．実験方法
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
２．１ グループ分けと介入
実施例８を参照する。
【0132】
２．２細胞の分離と培養
ＣＬＰ手術後の７２時間後にラットを頸部脱臼により殺し、胸部と腹部をアルコール綿球で３回消毒した後、開腹し、完全な腹膜を保存した後、アルコール綿球を再度消毒し、別のピンセットで腹膜を開き、脾臓を取り出し、４℃の１５ｍｌＰＢＳに入れた。ピンセットを使用して脾臓被膜を引き裂き、フィルターに入れ、ＰＢＳを加えて湿らせ、脾臓を引き裂き、筋膜を取り除き、脾臓を無菌シリンジプランジャーで粉砕し、ピペットで懸濁液を遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＬ／各脾臓）を加えて再懸濁し、チューブの壁に沿ってリンパ球分離溶液（１：１）の上層に加え、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、中間層をピペットで吸引し、別の遠心管に入れ、洗浄液を加えて１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁して準備しておいた。
ＣＬＰ手術後の７２時間後にラットを頸部脱臼により殺し、胸部と腹部をアルコール綿球で３回消毒した後、開腹し、完全な腹膜を保存した後、アルコール綿球を再度消毒し、別のピンセットで腹膜を開き、脾臓を取り出し、４℃の１５ｍｌＰＢＳに入れた。ピンセットを使用して脾臓被膜を引き裂き、フィルターに入れ、ＰＢＳを加えて湿らせ、脾臓を引き裂き、筋膜を取り除き、脾臓を無菌シリンジプランジャーで粉砕し、ピペットで懸濁液を遠心チューブに移し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＬ／各脾臓）を加えて再懸濁し、チューブの壁に沿ってリンパ球分離溶液（１：１）の上層に加え、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、中間層をピペットで吸引し、別の遠心管に入れ、洗浄液を加えて１２００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、適量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁して準備しておいた。
【0133】
１×１０7単球あたり１μｌの抗ＣＤ２５－ＡＰＣ抗体を加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄した。１×１０7細胞あたり２０μｌの抗ＡＰＣ磁気ビーズと８０μｌのＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、ＬＳカラムで磁気選別してＣＤ２５+細胞を得た。
【0134】
ＣＤ２５+細胞を数えた後、細胞１×１０7個あたり解離剤２０μｌを加え、４℃で１０分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、細胞１×１０7個あたり抗ＣＤ４磁気ビーズ２０μｌとターミネーター３０μｌを加え、４℃で１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒで洗浄し、適切な量のＭＡＣＳＢｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、ＬＳカラムで磁気選別してＣＤ４+ＣＤ２５+細胞を得た。
【0135】
２．３検出と分析
Ｔｒｅｇアポトーシス率の検出：細胞を収集し、予冷したＰＢＳで細胞を洗浄し、１ｍｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒで再度洗浄し、遠心分離後に、上清を除去して１００μｌを残し、次に５μｌのＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎＶと５μｌのＰＩを加え、室温（２５℃）の暗所で１５分間インキュベートし、２００μｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒを加えて均一に混合し、１時間以内にフローサイトメトリーで検出した。
Ｔｒｅｇアポトーシス率の検出：細胞を収集し、予冷したＰＢＳで細胞を洗浄し、１ｍｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒで再度洗浄し、遠心分離後に、上清を除去して１００μｌを残し、次に５μｌのＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎＶと５μｌのＰＩを加え、室温（２５℃）の暗所で１５分間インキュベートし、２００μｌの１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒを加えて均一に混合し、１時間以内にフローサイトメトリーで検出した。
【0136】
Ｆｏｘｐ３とＣＴＬＡ－４発現の検出：細胞上清を収集後、細胞をＰＢＳで洗浄し、上清を除去し、ＣＴＬＡ－４－ＰＥ蛍光抗体を加え、４℃暗所で３０分間インキュベートし、膜破壊剤を添加して一晩した。翌日、膜透過バッファーを加えて洗浄し、上清を除去し、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ－Ｃｙ７蛍光抗体を添加し、室温で光を避けて３０分間インキュベートし、膜破壊バッファーを加えて洗浄し、上清を除去し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで検出した。
【0137】
３．実験結果
３．１ＣＬＰにより誘発した敗血症ラットにおける制御性Ｔ細胞機能に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響
３．１ＣＬＰにより誘発した敗血症ラットにおける制御性Ｔ細胞機能に対する３成分薬物及び７成分薬物の影響
【0138】
実験結果（表１６）は、モデルグループにおけるＴｒｅｇのアポトーシス率が対照グループより有意に低く（ｐ＜０．０５）、投与グループにおけるＴｒｅｇのアポトーシス率がモデルグループよりも有意に高いことを示す（ｐ＜０．０５）。モデルグループのＦｏｘｐ３とＣＴＬＡ－４の発現は対照グループよりも有意に高く（ｐ＜０．０５）、投与グループはいずれもモデルグループよりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。上記の発見は、モデルグループと比較して、各用量グループの３成分薬グループ及び７成分薬グループがいずれも敗血症Ｔｒｅｇのアポトーシスを促進し、Ｔリンパ球の増殖及び分泌機能に対する阻害効果をダウンレギュレートさせることができることを示唆する。敗血症のラットモデルに対して、各用量グループの三成分薬物グループ及び七成分薬物グループが生体細胞の免疫抑制状態を修正することに明らかな効果を有したことを示す。成人用量に換算すると、約３成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ）、７成分薬物グループ（ヒドロキシサフロールイエローＡ６ｍｇ～６００ｍｇ、ペオニフロリン６ｍｇ～６００ｍｇ、アルビフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、酸化ペオニフロリン０．６ｍｇ～６０ｍｇ、センキュノリドＩ０．６ｍｇ～６０ｍｇ、ダンシェンスナトリウム０．６ｍｇ～６０ｍｇ、フェルラ酸０．０６ｍｇ～６ｍｇ）であった。［徐淑雲編『薬理実験方法学』のヒトと動物の体表面積換算法に基づく計算によると、ヒト用量＝ラット用量／０．０１８（成体体重７０ｋｇ、ラット体重０．２ｋｇ計）］。
【0139】
【表16】
【0140】
以上、実施例の説明は、本発明の方法及びその核心アイデアを理解するのを助けることを意図しているに過ぎない。当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明のいくつかの改良及び修正を行うことができ、これらも本発明の請求項の保護範囲に含まれることに留意されたい。これらの実施例に対する様々な変更は、当業者にとって明らかであり、本明細書で定義された一般原理は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく他の実施例で実現できる。したがって、本発明は、本明細書に示されたこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示された原理及び新規な特徴と一致する最も広い範囲に及ぶものである。
【手続補正書】
【提出日】2023-07-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式が式Ｉに示されるヒドロキシサフロールイエローＡ、構造式が式ＩＩに示されるペオニフロリン及び構造式が式ＩＩＩに示されるアルビフロリンを含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は１～１００：１～１００：０．１～１０であることを特徴とする敗血症を治療するための薬物組成物。
【化1】
【請求項2】
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの質量比は、１～１００：１～１００：１～１０であることを特徴とする請求項１に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項3】
請求項１に記載の敗血症を治療するための薬物組成物と構造式が式ＩＶに示される酸化ペオニフロリン、構造式が式Ｖに示されるセンキュノリドＩ、構造式が式ＶＩに示されるダンシェンスナトリウム、及び構造式が式ＶＩＩに示されるフェルラ酸を含み、前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム、フェルラ酸の質量比が１～１００：１～１００：１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０：０．０１～１であることを特徴とする敗血症を治療するための薬物組成物。
【化2】
【請求項4】
前記ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸の質量比は１～１００：１～１００：１～１０：１～１０：１～１０：１～１０：０．１～１であることを特徴とする請求項３に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項5】
前記薬物組成物が敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害することによって敗血症の治療を実現することを特徴とする請求項１に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項6】
前記薬物組成物が敗血症制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進することによって敗血症の治療を実現することを特徴とする請求項１に記載の敗血症を治療するための薬物組成物。
【請求項7】
請求項１に記載の薬物組成物の敗血症を治療するための薬物の調製における使用。
【請求項8】
前記薬物組成物の敗血症におけるＩＬ－６、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及び／又はＨＭＧＢ１の発現を阻害する薬物の調製における使用を特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記薬物組成物の敗血症におけるＴＦ及び／又はＴＭの放出を阻害する薬物の調製における使用を特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項10】
前記薬物組成物の敗血症における敗血症制御性Ｔ細胞のアポトーシスを促進する薬物の調製における使用を特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項11】
前記薬物組成物がヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン及びアルビフロリンの３つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求７に記載の使用。
【請求項12】
前記薬物組成物が、ヒドロキシサフロールイエローＡ、ペオニフロリン、アルビフロリン、酸化ペオニフロリン、センキュノリドＩ、ダンシェンスナトリウム及びフェルラ酸を含む７つの活性化合物からなる場合、ヒドロキシサフロールイエローＡ薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、ペオニフロリンの薬用量は６～６００ｍｇ／ｋｇであり、アルビフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、酸化ペオニフロリンの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、センキュノリドＩの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、ダンシェンスナトリウムの薬用量は０．６～６０ｍｇ／ｋｇであり、フェルラ酸の薬用量は０．０６～６ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【国際調査報告】