▶ ユーシーエル ビジネス パブリック リミテッド カンパニーの特許一覧
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-31
(54)【発明の名称】リジン分解関連障害の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240124BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240124BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240124BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240124BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240124BHJP
A61P 13/00 20060101ALI20240124BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240124BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240124BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240124BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
C12N15/113 130Z
C12N15/113 ZNA
C12N15/09 110
A61P43/00 111
A61P25/08
A61P13/00
A61K31/713
A61K31/7105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023538768
(86)(22)【出願日】2021-12-22
(85)【翻訳文提出日】2023-08-21
(86)【国際出願番号】 GB2021053413
(87)【国際公開番号】W WO2022136873
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】2020549.8
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506417186
【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】ミルズ、フィリッパ
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ、ハイヤン
(72)【発明者】
【氏名】ギッセン、ポール
(72)【発明者】
【氏名】ヴーツクリ、レディ スリーカンス
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA06
4C084ZA81
4C084ZC20
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA06
4C086ZA81
4C086ZC20
4C086ZC41
(57)【要約】
本開示は、対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法、及び該方法において使用するための組成物に関する。本開示はまた、リジン分解のサッカロピン経路に関与する酵素の発現を低下させる核酸サイレンシング分子に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法であって、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項2】
対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法において使用するための組成物であって、前記組成物が、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含み、前記方法が、前記核酸サイレンシング分子を前記対象に投与することを含む組成物。
【請求項3】
前記障害が、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＤＨＴＫＤ１、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、又はＡＡＤＡＴの欠損を含む、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項4】
前記欠損が、それぞれＡＬＤＨ７Ａ１、ＤＨＴＫＤ１、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、又はＡＡＤＡＴにおける変異に起因する、請求項３に記載の方法又は使用のための組成物。
【請求項5】
前記変異が、それぞれＡＬＤＨ７Ａ１、ＤＨＴＫＤ１、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、又はＡＡＤＡＴにおける１つ以上の置換、１つ以上の挿入、及び／又は１つ以上の欠失を含む、請求項４に記載の方法又は使用のための組成物。
【請求項6】
（ａ）前記障害が、ＡＬＤＨ７Ａ１の欠損を含み、前記障害が、ピリドキシン依存性てんかんである；（ｂ）前記障害が、ＤＨＴＫＤ１の欠損を含み、前記障害が、２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症若しくはシャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型である；又は
（ｃ）前記障害が、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの欠損を含み、前記障害が、グルタル酸尿症Ｉ型である
請求項１及び請求項３～５のいずれか一項に記載の方法又は請求項２～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
前記方法が、前記対象に更なる治療組成物を投与する又は治療レジメンを施すことを含む、請求項１及び請求項３～６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
（ａ）前記障害がＡＬＤＨ７Ａ１の欠損を含み、前記更なる治療用組成物がビタミンＢ６及び／若しくはアルギニンを含む；又は（ｂ）前記障害がグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの欠損を含み、前記更なる治療用組成物がアルギニン及び／若しくはカルニチンを含む、請求項７に記載の方法又は使用のための組成物。
【請求項9】
前記治療レジメンが治療食を含み、任意で、前記治療食がリジン制限食及び／又はトリプトファン制限食を含む、請求項７に記載の方法又は使用のための組成物。
【請求項10】
α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子。
【請求項11】
前記核酸サイレンシング分子が、（ｉ）ＲＮＡ、（ｉｉ）ＤＮＡ、又は（ｉｉｉ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、請求項１及び３～９のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項12】
前記核酸サイレンシング分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含むか又はからなり；任意で、前記核酸サイレンシング分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むか又はからなる、請求項１、３～９、及び１１のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０若しくは１１に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項13】
前記核酸サイレンシング分子が、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含むか又は２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドからなる、請求項１、３～９、１１、及び１２のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９、１１、及び１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１２のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項14】
前記核酸サイレンシング分子が、１つ以上の２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含むか又は２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドからなる、請求項１、３～９、及び１１～１３のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１３のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項15】
前記核酸サイレンシング分子が、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドを含むか又はロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドからなる、請求項１、３～９、及び１１～１４のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１４のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項16】
前記核酸サイレンシング分子が、１つ以上のヌクレオシドホスホロチオエートを含むか又はヌクレオシドホスホロチオエートからなる、請求項１、３～９、及び１１～１５のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１５のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項17】
（ｉ）前記組成物が、請求項１６に記載の２つ以上の核酸サイレンシング分子を含み；（ｉｉ）前記２つ以上の核酸サイレンシング分子の各々が１つの立体異性体であり；かつ（ｉｉｉ）前記組成物中に更なる核酸サイレンシング分子が含まれない、請求項１６に記載の方法又は使用のための組成物。
【請求項18】
前記核酸サイレンシング分子が、（ａ）ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、任意で、前記核酸サイレンシング分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である、請求項１、３～９、及び１１～１７のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１６のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項19】
前記一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列が、（ｉ）エクソンに含まれるヌクレオチド配列、（ｉｉ）イントロンに含まれるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）３’非翻訳領域に含まれるヌクレオチド配列、及び（ｉｖ）５’非翻訳領域に含まれるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、請求項１８に記載の方法、使用のための組成物、又は核酸サイレンシング分子。
【請求項20】
前記核酸サイレンシング分子が、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、任意で、前記核酸サイレンシング分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１、３～９、及び１１～１７のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０から１６のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項21】
前記核酸サイレンシング分子が、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／若しくはエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、又は核酸サイレンシング分子。
【請求項22】
前記核酸サイレンシング分子に含まれるヌクレオチド配列が、約１０～約１５０００ヌクレオチド長、任意で約１０～約５０ヌクレオチド長、又は約２０～約３０ヌクレオチド長である、請求項１、３～９、及び１１～２１のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１０～１６及び１８～２１のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項23】
前記核酸サイレンシング分子が、（ａ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号２２若しくは配列番号３２又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号７又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｂ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号２３若しくは配列番号３３又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号８又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｃ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号３８若しくは配列番号４１又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号３５又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド；
（ｄ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号１９、配列番号２７、若しくは配列番号２８又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号４又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｅ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号２１、配列番号３０、若しくは配列番号３１又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号６又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｆ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号３７若しくは配列番号４１又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号３４又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｇ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号３９若しくは配列番号４２又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号３６又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｈ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号１６若しくは配列番号２４又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号１又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｉ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号１７若しくは配列番号２５又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号２又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｊ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号１８若しくは配列番号２６又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号３又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
（ｋ）任意で、前記核酸サイレンシング分子が、配列番号２０若しくは配列番号２９又はそれらに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、配列番号５又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
を含むか又はからなる、請求項１、３～９、及び１１～２２のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１１～１７及び１９～２２のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項24】
前記核酸サイレンシング分子が、１つ以上の非核酸部分にコンジュゲートされている、請求項１、３～９、及び１１～２３のいずれか一項に記載の方法；請求項２～９及び１１～２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物；又は請求項１１～１７及び１９～２３のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子。
【請求項25】
請求項１１～１６及び１８～２４のいずれか一項に記載の核酸サイレンシング分子と細胞を接触させることを含む、細胞におけるＡＡＳＳの発現を低下させるためのインビトロ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法、及び該方法において使用するための組成物に関する。本開示はまた、リジン分解のサッカロピン経路に関与する酵素の発現を低下させる核酸サイレンシング分子に関する。
【背景技術】
【0002】
幾つかの遺伝性代謝障害は、リジン分解のサッカロピン経路に影響を及ぼす。これら障害は、個体がこの経路に関与する酵素をコードしている遺伝子のうちの１つに変異を有する場合に生じる。変異の結果経路がブロックされ、影響を受けた酵素によって触媒される工程の上流に代謝物が蓄積する。多くの場合、その代謝物は、神経毒性があると考えられる。
【0003】
より詳細には、ＡＬＤＨ７Ａ１（アルデヒド脱水素酵素７ファミリーメンバーＡ１）における変異は、ピリドキシン依存性てんかんを引き起こし得る。このピリドキシン依存性てんかんの発症率は６４，０００人に１人であり、ビタミンＢ６の欠乏によって引き起こされる難治性の新生児発作を特徴とする。現在の治療には、ピリドキシン（ビタミンＢ６の一形態）の投与、リジンの食事制限、及び／又はアルギニンの補給がある。ピリドキシンの投与は発作を制御することができるが、末梢神経障害を引き起こす可能性もある。更に、食事制限は、患者及びその家族にとって負担となり、必須アミノ酸であるリジンの欠乏につながる可能性がある。更に、患者の７５％に発達遅延がみられるが、これはＡＬＤＨ７Ａ１の基質であるＡＡＳＡ及び他の代謝物の蓄積によって引き起こされると考えられる。現在の治療では、このような発達遅延を改善することはできない。
【0004】
ＤＨＴＫＤ１（デヒドロゲナーゼＥ１及びトランスケトラーゼドメイン含有１）における変異は、２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症（２－アミノアジピン酸及び２－ケトアジピン酸尿症、２－アミノアジピン酸２－オキソアジピン酸尿症、又は２－アミノアジピン酸及び２－オキソアジピン酸尿症としても知られている）を引き起こし得る。２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症は、発症率が６４，０００人に１人である常染色体劣性障害である。症状は、発作、免疫不全、発達遅延、軽度から重度の知的障害、運動失調、てんかん、及び行動障害を含み得るが、現在利用可能な治療ではうまく対処できない。ＤＨＴＫＤ１における変異は、シャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型を引き起こす場合もある。シャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型は、常染色体優性ナンセンス変異に起因する希少疾患である。患者は、通常、末梢神経障害を含む症状が発現した時点で１３歳～２５歳である。現在利用可能なのは支持療法だけである。ＤＨＴＫＤ１における変異は好酸球性食道炎と関連することも示されている。
【0005】
グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける変異は、グルタル酸尿症Ｉ型を引き起こし得る。グルタル酸尿症Ｉ型の発症率は、世界的には小児１０万人に１人であり、アーミッシュ派のコミュニティー及びカナダのオジブウェー族では、最大新生児３００人に１人が罹患する。グルタル酸尿症Ｉ型は、未治療のまま放置すると、不可逆的な線条体損傷及び運動障害を引き起こされ、罹患者の多くは成人するまで生存できない。現在の治療は、リジン及びトリプトファンの制限食、並びにアルギニン、カルニチン、及びリボフラビンの補給を含む。しかし、早期に治療を実行したとしても、罹患者は、腎臓疾患を発症する及び／又は白質変化を経験する場合がある。
【0006】
従って、リジン分解のサッカロピン経路の障害に対する改善された治療が必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、核酸サイレンシング分子を用いてα－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の遺伝子発現を低下させることが可能であることを実証した。ＡＡＳＳはリジン分解のサッカロピン経路における最初の酵素であるため、ＡＡＳＳの発現を低下させることで、この経路に影響を及ぼす代謝障害から生じる毒性代謝物の蓄積を減少させることができる。このようにして、障害の症状を緩和することができる。
【0008】
リジン分解のサッカロピン経路の障害を治療するためにＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を使用することは、幾つかの利点に関連する。第一に、ＡＡＳＳは経路の最初の酵素であり（図１参照）、ＡＡＳＳの発現を低下させることによって下流の全ての障害を治療することができる。例えば、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子は、ピリドキシン依存性てんかん等のＡＬＤＨ７Ａ１における１つ以上の変異に起因する障害を治療するために使用することができる。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子は、２－アミノアジピン２－ケトアジピン酸尿症又はシャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型等のＤＨＴＫＤ１における１つ以上の変異に起因する障害を治療するために使用することもできる。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子は、グルタル酸尿症Ｉ型等のグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける１つ以上の変異に起因する障害を治療するために使用することもできる。
【0009】
第二に、リジン分解のサッカロピン経路の障害は、通常、リジン制限食で治療される。このような食事は、患者及びその家族に負担をかける場合があり、社会的及び文化的な伝統と相容れない場合もある。また、必須アミノ酸であるリジンの欠乏につながる恐れもある。従って、リジン制限食は、通常、専門栄養士が頻繁にモニタリングすることを必要とする。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を用いて毒性代謝物の蓄積を減少させることにより、食事制限をすることなく、リジン分解のサッカロピン経路の障害を治療することができる。これにより、患者及びその家族の負担を最小限に抑え、確実にリジンをタンパク質合成に容易に利用できるようになる。
【0010】
第三に、ＡＡＳＳの発現低下に関連する副作用は軽度である可能性が高い。ＡＡＳＳにおける変異により生じ、高リジン血症（血漿リジン濃度が６００μｍｏｌ／Ｌ超に上昇することを特徴とする）を引き起こす障害も知られているが、これは良性障害であるというのが一般的な共通認識である。報告されている発端者の約５０％は無症状であり、偶発的に検出されたものである。神経学的表現型を有する個体も幾つか報告されているが、一貫した画像がないことから、高リジン血症は臨床的表現型とは無関係な逸話的生化学的所見であることが示唆されている。このことは、明らかな臨床的帰結がないことが報告されたＡＡＳＳのノックインマウスモデルから得られた最近のデータによって更に裏付けられている。
【0011】
まとめると、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子の使用により、リジン分解のサッカロピン経路の障害から生じる毒性代謝物の蓄積を予防することができる。従って、疾患の臨床徴候が緩和される。一般に副作用は最小限であり、患者は通常の食事をとることができる。
【0012】
従って、本開示は、対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法であって、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を該対象に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、
－ 対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法において使用するための組成物であって、該組成物が、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含み、該方法が、該核酸サイレンシング分子を該対象に投与することを含む組成物；
－ α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子；及び
－ 細胞におけるＡＡＳＳの発現を低下させるためのインビトロ方法であって、該細胞を本開示の核酸サイレンシング分子と接触させることを含む方法
を提供する。
－ 対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法において使用するための組成物であって、該組成物が、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含み、該方法が、該核酸サイレンシング分子を該対象に投与することを含む組成物；
－ α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子；及び
－ 細胞におけるＡＡＳＳの発現を低下させるためのインビトロ方法であって、該細胞を本開示の核酸サイレンシング分子と接触させることを含む方法
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】リジン分解のためのサッカロピン経路。ＡＡＳＳ：α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素、ＡＡＳＡ：α－アミノアジピン酸セミアルデヒド、ＡＡＡ：α－アミノアジピン酸、ＫＡＡ：α－ケトアジピン酸。
【図2】ａ、ｂ）ピリドキシン依存性てんかんの根底にある機序。ＡＬＤＨ７Ａ１における変異の結果、毒性代謝物が蓄積するが、そのうちの１つ（Ｐ６Ｃ）は、７０種を超える酵素の補酵素として作用することができるビタミンＢ６の唯一の形態であるピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）と相互作用する。ｃ）ピリドキシン依存性てんかんの治療法の時間軸。２００６年にＡＬＤＨ７Ａ１欠損症の遺伝的な根拠が同定され、発作を制御するためにビタミンＢ６が投与された。トリプル療法＝リジンの制限と並行してビタミンＢ６及びアルギニンを補給する。
【図3】ａ）α－アミノアジピン酸及びα－ケトアジピン酸尿症とシャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型との根底にある機序。ＤＨＴＫＤ１における変異の結果、毒性代謝物が蓄積する。ｂ）グルタル酸尿症１型の根底にある機序。グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける変異の結果、グルタル酸（ＧＡ）、３－ＯＨＧＡ、及びグルタリルカルニチン等の毒性代謝物が蓄積する。
【図4】ＡＬＤＨ７Ａ１欠損線維芽細胞におけるＡＡＳＳのｍＲＮＡ発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の効果。Ａ）ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＡＳＳを抑制し（ｐ＜０．０５）、ＡＯＮ４及びＡＯＮ６が最も劇的な効果を有していた（ｐ＝０．０００１）。（ｂ）ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４及びＡＯＮ６はＡＡＳＳを有意に減少させた（ｐ＝０．０００１）。
【図5】質量分析を用いて線維芽細胞内のＡＡＳＡを測定することによるＡＬＤＨ７Ａ１欠損症の機能アッセイ。
【図6】ａ）患者１（Ｐ１）及びｂ）患者３（Ｐ３）の線維芽細胞におけるＡＡＳＡレベルは、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４処理によって有意に低下した（それぞれｐ＝０．００８２及びｐ＝０．０００８）。同様に、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６もＰ３のＡＡＳＡレベルを低下させた（ｐ＝０．０００７）。
【図7】ＡＬＤＨ７Ａ１欠損患者の線維芽細胞におけるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現に対するＡＯＮ ＭＯＥ４、６、７、８、及び９の効果。定量ＰＣＲ（ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて解析を行った。１００ｎＭの濃度のＡＯＮを使用した。
【図8】ＧＣＤＨ欠損患者の線維芽細胞におけるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現に対するＡＯＮ ＭＯＥ４、６、７、８、及び９の効果。定量ＰＣＲ（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて解析を行った。１００ｎＭの濃度のＡＯＮを使用した。平均ＡＡＳＳ発現阻害率％を各バーの上に記載する。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
【図9】３Ｔ３ Ｊ２マウス線維芽細胞におけるＡａｓｓ ｍＲＮＡ発現に対するＡＯＮ ＭＯＥ６、ＭＯＥ６マウス、及びＭＯＥ８の初期スクリーニング。１００ｎＭの濃度のＡＯＮを使用した。定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）解析を用いて、Ａａｓｓ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
【図10】質量分析ベースのアッセイを用いたグルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）の測定。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）法を用いて５０μＭ濃度でＣ５ＤＣを測定した。使用したＭＲＭトランジション：２７６．２＞８４．９。
【図11】標準的なトランスフェクション法を用いてＡＯＮ ＭＯＥ６～９を細胞にトランスフェクションした後のＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＳＳの発現レベル。１００ｎＭの濃度のＡＯＮを使用した。定量ＰＣＲ（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）解析を用いて、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
【図12】逆トランスフェクション法を用いてＡＯＮを細胞に導入したときのＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＳＳ発現に対するＡＯＮ ＭＯＥ４、６、及び８の効果。１００ｎＭの濃度のＡＯＮを使用した。定量ＰＣＲ（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）解析を用いて、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。ｎ＝３。
【図13】逆トランスフェクション法を用いてＡＯＮを細胞に導入したときのＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＳＳ発現に対する様々な濃度（１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）のＡＯＮ ＭＯＥ４、６、及び８の効果。定量ＰＣＲ（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）解析を用いて、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。
【発明を実施するための形態】
【0014】
配列表の簡単な説明
配列番号１－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号２－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号４－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号５－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号６－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号７－本発明の核酸サイレンシング分子。配列番号７は、配列番号４の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号８－本発明の核酸サイレンシング分子。配列番号８は、配列番号６の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号９－ＡＡＳＳ遺伝子の核酸配列。
配列番号１０－ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの核酸配列。
配列番号１１－ＡＡＳＳタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１２－実施例で使用したＡＡＳＳフォワードプライマー。
配列番号１３－実施例で使用したＡＡＳＳリバースプライマー。
配列番号１４－実施例で使用したＧＡＰＤＨフォワードプライマー。
配列番号１５－実施例で使用したＧＡＰＤＨリバースプライマー。
配列番号１６－ＡＯＮ１の核酸配列、配列番号１に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１７－ＡＯＮ２の核酸配列、配列番号２に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１８－ＡＯＮ３の核酸配列、配列番号３に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１９－ＡＯＮ４の核酸配列、配列番号４に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２０－ＡＯＮ５の核酸配列、配列番号５に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２１－ＡＯＮ６の核酸配列、配列番号６に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２２－ＡＯＮ７の核酸配列、配列番号７に係る核酸サイレンシング分子配列。ＡＯＮ７は、ＡＯＮ４の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。
配列番号２３－ＡＯＮ８の核酸配列、配列番号８に係る核酸サイレンシング分子配列。ＡＯＮ８は、ＡＯＮ６の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。
配列番号２４－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ１の核酸配列。
配列番号２５－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ２の核酸配列。
配列番号２６－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ３の核酸配列。
配列番号２７－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ４の核酸配列。
配列番号２８－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４の核酸配列。
配列番号２９－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ５の核酸配列。
配列番号３０－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ６の核酸配列。
配列番号３１－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ６の核酸配列。
配列番号３２－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ７の核酸配列。
配列番号３３－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ８の核酸配列。
配列番号３４－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３５－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３６－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３７－ＭＯＥ７の核酸配列、配列番号３４に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号３８－ＭＯＥ８の核酸配列、配列番号３５に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号３９－ＭＯＥ９の核酸配列、配列番号３６に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号４０－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ７の核酸配列。
配列番号４１－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ８の核酸配列。
配列番号４２－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ９の核酸配列。
配列番号４３－実施例で使用したＡａｓｓマウスフォワードプライマー。
配列番号４４－実施例で使用したＡａｓｓマウスリバースプライマー。
配列番号４５－実施例で使用したＨｐｒｔ１マウスフォワードプライマー。
配列番号４６－実施例で使用したＨｐｒｔ１マウスリバースプライマー。
配列番号１－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号２－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号４－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号５－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号６－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号７－本発明の核酸サイレンシング分子。配列番号７は、配列番号４の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号８－本発明の核酸サイレンシング分子。配列番号８は、配列番号６の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号９－ＡＡＳＳ遺伝子の核酸配列。
配列番号１０－ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの核酸配列。
配列番号１１－ＡＡＳＳタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１２－実施例で使用したＡＡＳＳフォワードプライマー。
配列番号１３－実施例で使用したＡＡＳＳリバースプライマー。
配列番号１４－実施例で使用したＧＡＰＤＨフォワードプライマー。
配列番号１５－実施例で使用したＧＡＰＤＨリバースプライマー。
配列番号１６－ＡＯＮ１の核酸配列、配列番号１に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１７－ＡＯＮ２の核酸配列、配列番号２に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１８－ＡＯＮ３の核酸配列、配列番号３に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号１９－ＡＯＮ４の核酸配列、配列番号４に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２０－ＡＯＮ５の核酸配列、配列番号５に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２１－ＡＯＮ６の核酸配列、配列番号６に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号２２－ＡＯＮ７の核酸配列、配列番号７に係る核酸サイレンシング分子配列。ＡＯＮ７は、ＡＯＮ４の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。
配列番号２３－ＡＯＮ８の核酸配列、配列番号８に係る核酸サイレンシング分子配列。ＡＯＮ８は、ＡＯＮ６の拡張（２０ｍｅｒ）バージョンである。
配列番号２４－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ１の核酸配列。
配列番号２５－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ２の核酸配列。
配列番号２６－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ３の核酸配列。
配列番号２７－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ４の核酸配列。
配列番号２８－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４の核酸配列。
配列番号２９－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ５の核酸配列。
配列番号３０－ＬＮＡ修飾ＡＯＮ６の核酸配列。
配列番号３１－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ６の核酸配列。
配列番号３２－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ７の核酸配列。
配列番号３３－ＭＯＥ修飾ＡＯＮ８の核酸配列。
配列番号３４－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３５－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３６－本発明の核酸サイレンシング分子。各Ｎは、独立して、Ｔ及びＵから選択され得る。
配列番号３７－ＭＯＥ７の核酸配列、配列番号３４に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号３８－ＭＯＥ８の核酸配列、配列番号３５に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号３９－ＭＯＥ９の核酸配列、配列番号３６に係る核酸サイレンシング分子配列。
配列番号４０－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ７の核酸配列。
配列番号４１－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ８の核酸配列。
配列番号４２－ＭＯＥ修飾ＭＯＥ９の核酸配列。
配列番号４３－実施例で使用したＡａｓｓマウスフォワードプライマー。
配列番号４４－実施例で使用したＡａｓｓマウスリバースプライマー。
配列番号４５－実施例で使用したＨｐｒｔ１マウスフォワードプライマー。
配列番号４６－実施例で使用したＨｐｒｔ１マウスリバースプライマー。
【0015】
発明の詳細な説明
開示される方法及び生成物の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本開示の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
開示される方法及び生成物の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本開示の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【0016】
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0017】
一般的定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0018】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を含み、「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、等である。
【0019】
一般に、「含む」という用語は、含むがそれに限定されないことを意味することを意図する。例えば、「ＲＮＡを含む核酸サイレンシング分子」という表現は、核酸サイレンシング分子はＲＮＡを含有するが、核酸サイレンシング分子が更なる核酸を含有していてもよいことを意味すると解釈されるべきである。
【0020】
本開示の幾つかの態様では、「含む」という単語は、「からなる」という表現に置き換えられる。「からなる」という用語は、限定的であることを意図する。例えば、「ＲＮＡからなる核酸サイレンシング分子」という表現は、核酸サイレンシング分子がＲＮＡを含有し、更なる核酸を含有しないことを意味すると理解されるべきである。
【0021】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー鎖を指すことが意図される。
【0022】
本開示の目的のために、２つの配列（２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの配列等）の同一性パーセントを求めるために、最適な比較目的のために配列をアラインする（例えば、第２の配列と最適にアラインするために第１の配列にギャップを導入してもよい）。次いで、ヌクレオチド位置におけるヌクレオチド残基を比較する。第１の配列におけるある位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチド残基で占められている場合、ヌクレオチドはその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有されている同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／参照配列における位置の総数×１００）。
【0023】
通常、配列比較は、参照配列の全長に対して行われる。例えば、所与の（「試験」）配列が配列番号Ｘに対して特定の同一性％を有するかどうかをユーザが判定したい場合、配列番号Ｘが参照配列となる。例えば、配列が配列番号Ｘ（参照配列の一例）に対して少なくとも８０％同一であるかどうかを評価するために、当業者は配列番号Ｘの全長に対してアライメントを実施し、試験配列中の何箇所が配列番号Ｘと同一であるかを特定する。位置の少なくとも８０％が同一である場合、試験配列は配列番号Ｘに対して少なくとも８０％同一である。配列が配列番号Ｘよりも短い場合、ギャップ又は欠損している位置は非同一位置であるとみなすべきである。
【0024】
当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を求めるために利用可能な様々なコンピュータプログラムを認識している。例えば、配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【0025】
核酸サイレンシング分子
α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子が本明細書に開示される。
α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子が本明細書に開示される。
【0026】
このようなサイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を低下させるために治療的に用いることができる。ＡＡＳＳの発現を低下させることにより、リジン分解のサッカロピン経路をその初期工程においてブロック又は阻害することができるが、その理由は、ＡＡＳＳが該経路における最初の酵素であるためである。このように経路の先頭をブロック又は阻害することにより、下流の代謝物の形成を防止又は低減することができる。従って、神経毒性代謝物等の毒性代謝物の蓄積を防止又は低減することができる。毒性代謝物の蓄積を予防又は低減することにより、リジン分解のサッカロピン経路の障害を治療することができる。例えば、そのような障害の臨床徴候又は症状を軽減又は消失させることができる。臨床徴候又は症状の進行を止めることもできる。本明細書に開示される核酸サイレンシング分子を用いたリジン分解のサッカロピン経路の障害の治療は、上記のような食事性リジン制限等の他の治療法を超える利点を有し得る。
【0027】
本明細書に開示される核酸サイレンシング分子の他の使用も想定され得る。例えば、核酸サイレンシング分子を用いてインビボ又はインビトロでＡＡＳＳの発現を実験的に低下させることができる。言い換えれば、例えばリジン分解のサッカロピン経路について調べるための研究ツールとして核酸サイレンシング分子を使用することができる。
【0028】
ＡＡＳＳの発現低下
本明細書に開示される核酸サイレンシング分子は、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳタンパク質の発現を低下させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及びＡＡＳＳタンパク質の発現を低下させることができる。
本明細書に開示される核酸サイレンシング分子は、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳタンパク質の発現を低下させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及びＡＡＳＳタンパク質の発現を低下させることができる。
【0029】
核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳの発現を低下させることができる。細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。細胞は、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞であってよい。細胞におけるＡＡＳＳの発現低下は、例えば、細胞内に含まれるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量の減少を指し得る。従って、ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、例えば、減少した量のＡＡＳＳ ｍＲＮＡを含み得る。ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、例えば、減少した量のＡＡＳＳタンパク質を含み得る。ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、例えば、減少した量のＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及び減少した量のＡＡＳＳタンパク質を含み得る。
【0030】
核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳの発現を低下させることができる。核酸サイレンシング分子と接触させた細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。核酸サイレンシング分子と接触させた細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。好ましくは、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞及び核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、同じ種類の細胞（例えば、ヒト細胞又はヒト細胞株由来の細胞）である。好ましくは、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞及び核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、同じ条件下（例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロ）にある。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、代わりに、モック核酸サイレンシング分子等の対照分子と接触させてもよい。モック核酸サイレンシング分子（モックアンチセンスオリゴヌクレオチド等）並びにそれを設計及び作製する方法は、当技術分野において周知である。核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳの発現の低下は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて細胞内に含まれるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量が減少することを指し得る。従って、核酸サイレンシング分子と接触させ、ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、核酸サイレンシング分子と接触していない細胞と比べて、減少した量のＡＡＳＳ ｍＲＮＡを含み得る。核酸サイレンシング分子と接触させ、ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、核酸サイレンシング分子と接触していない細胞と比べて、減少した量のＡＡＳＳタンパク質を含み得る。核酸サイレンシング分子と接触させ、ＡＡＳＳの発現が低下した細胞は、核酸サイレンシング分子と接触していない細胞と比べて、減少した量のＡＡＳＳ ｍＲＮＡ量及び減少した量のＡＡＳＳタンパク質を含み得る。
【0031】
上記の態様のいずれかでは、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を少なくとも３０％低下させることができる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を少なくとも３０％減少させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳの発現を少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％低下させることができる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳの発現を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％低下させることができる。すなわち、核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％減少させることができる。
【0032】
好ましくは、核酸サイレンシング分子は、細胞内のＡＡＳＳの発現を少なくとも３０％低下させる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を少なくとも３０％減少させることができる。ＡＡＳＳ発現を評価するための細胞の種類及び条件は上記の通りである。核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳの発現を少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％低下させることができる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳの発現を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％低下させることができる。すなわち、核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％減少させることができる。
【0033】
より好ましくは、核酸サイレンシング分子は、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞におけるＡＡＳＳの発現を少なくとも３０％低下させる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を少なくとも３０％減少させることができる。ＡＡＳＳ発現を評価するための細胞の種類及び条件は上記の通りである。核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳの発現を少なくとも少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％低下させることができる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少させることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳの発現を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％低下させることができる。すなわち、核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳ ｍＲＮＡの量及び／又はＡＡＳＳタンパク質の量を３０％～９９％、例えば３５％～９５％、４０％～９０％、４５％～８５％、５０％～８０％、５５％～７５％、又は６０％～７０％減少させることができる。
【0034】
上記の態様のいずれかでは、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を１００％低下させることができる。言い換えれば、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を完全に排除することができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を完全に排除する（すなわち、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を１００％低下させる）ことができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳタンパク質の発現を完全に排除する（すなわち、ＡＡＳＳタンパク質の発現を１００％低下させる）ことができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及びＡＡＳＳタンパク質の発現を完全に排除する（すなわち、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及びＡＡＳＳタンパク質の発現を１００％低下させる）ことができる。
【0035】
核酸サイレンシング分子は、例えば、細胞内のＡＡＳＳの発現を完全に排除することができる。従って、細胞は、ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ及び／又はＡＡＳＳタンパク質を発現することができない。細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。細胞は、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞であってよい。
【0036】
核酸サイレンシング分子は、例えば、核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞と比べて、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞内のＡＡＳＳの発現を１００％低下させることができる。核酸サイレンシング分子と接触させた細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。核酸サイレンシング分子と接触させた細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、例えば、ヒト又はヒト細胞株由来であってよい。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであってよい。好ましくは、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞及び核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、同じ種類の細胞（例えば、ヒト細胞又はヒト細胞株由来の細胞）である。好ましくは、核酸サイレンシング分子と接触させた細胞及び核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、同じ条件下（例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロ）にある。核酸サイレンシング分子と接触させていない細胞は、代わりに、モック核酸サイレンシング分子等の対照分子と接触させてもよい。上記の通り、モック核酸サイレンシング分子（モックアンチセンスオリゴヌクレオチド等）並びにそれを設計及び作製する方法は、当技術分野において周知である。
【0037】
核酸サイレンシング分子
本開示の文脈において、サイレンシング分子は、標的遺伝子の発現を低下させるか又は排除する（すなわち、ノックダウンする）分子として定義することができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の量を減少させることができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物を排除することができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のタンパク質産物の量を減少させることができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のタンパク質産物を排除することができる。本開示では、標的遺伝子はＡＡＳＳである。
本開示の文脈において、サイレンシング分子は、標的遺伝子の発現を低下させるか又は排除する（すなわち、ノックダウンする）分子として定義することができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物の量を減少させることができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ産物を排除することができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のタンパク質産物の量を減少させることができる。サイレンシング分子は、例えば、標的遺伝子のタンパク質産物を排除することができる。本開示では、標的遺伝子はＡＡＳＳである。
【0038】
本開示の文脈において、核酸サイレンシング分子は、１つ以上の核酸を含むか又はからなるサイレンシング分子として定義することができる。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＲＮＡを含み得る。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＤＮＡを含み得る。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み得る。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＲＮＡからなり得る。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＤＮＡからなり得る。本開示の核酸サイレンシング分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなり得る。
【0039】
核酸サイレンシング分子は、当技術分野で公知の任意の機序により、ＡＡＳＳの発現を低下させるか又は排除する（すなわちノックダウン）ことができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ分子に結合して、そのタンパク質への翻訳をブロックすることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ分子に結合して、ｍＲＮＡの分解（酵素分解等）を誘導することができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳ遺伝子をコードしているＤＮＡに結合して、ＤＮＡ及び／又はその関連ヒストンのメチル化を誘導することができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳをコードしているＤＮＡに結合して、遺伝子編集によるＡＡＳＳ遺伝子の全部又は一部の除去を促進することができる。
【0040】
例えば、核酸サイレンシング分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含み得るか又はからなり得る。好ましくは、核酸サイレンシング分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。
【0041】
核酸サイレンシング分子は、約１０～約１５０００ヌクレオチド長であってよく、例えば、約１００～約１４０００ヌクレオチド長、約２００～約１３０００ヌクレオチド長、約３００～約１２０００ヌクレオチド長、約４００～約１１０００ヌクレオチド長、約４００～約１００００ヌクレオチド長、約５００～約９０００ヌクレオチド長、約６００～約８０００ヌクレオチド長、約７００～約７０００ヌクレオチド長、約８００～約６０００ヌクレオチド長、約９００～約５０００ヌクレオチド長、約１０００～約４０００ヌクレオチド長、又は約２０００～約３０００ヌクレオチド長であってよい。好ましくは、核酸サイレンシング分子は、１００ヌクレオチド長未満（例えば、９５ヌクレオチド長未満、９０ヌクレオチド長未満、８５ヌクレオチド長未満、８０ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、７０ヌクレオチド長未満、６５ヌクレオチド長未満、６０ヌクレオチド長未満、５５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、４５ヌクレオチド長未満、４０ヌクレオチド長未満、３５ヌクレオチド長未満、３０ヌクレオチド長未満、２５ヌクレオチド長未満、２０ヌクレオチド長未満、１５ヌクレオチド長未満、又は１０ヌクレオチド長未満）である。核酸サイレンシング分子は、例えば、約１０～約５０ヌクレオチド長であり得る。例えば、核酸サイレンシング分子は、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約２０ヌクレオチド長、約２０～約５０ヌクレオチド長、約２０～約４０ヌクレオチド長、約２０～約３０ヌクレオチド長、約３０～約５０ヌクレオチド長、又は約３０～約４０ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、核酸分子は約１０～約３０ヌクレオチド長（約１０～約２０ヌクレオチド長又は約２０～約３０ヌクレオチド長等）である。核酸サイレンシング分子は、例えば、約１０ヌクレオチド長、約１１ヌクレオチド長、約１２ヌクレオチド長、約１３ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド長、約１６ヌクレオチド長、約１７ヌクレオチド長、約１８ヌクレオチド長、約１９ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長、約２１ヌクレオチド長、約２２ヌクレオチド長、約２３ヌクレオチド長、約２４ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド長、約２６ヌクレオチド長、約２７ヌクレオチド長、約２８ヌクレオチド長、約２９ヌクレオチド長、又は約３０ヌクレオチド長であってよい。核酸分子は、好ましくは約１６核酸長又は約２０核酸長であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの典型的な長さは、当技術分野において周知である。
【0042】
核酸サイレンシング分子は、例えば、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又は２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、１つ以上の２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又は２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又はロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、１つ以上のヌクレオチドホスホロチオエートを含み得るか、又はヌクレオチドホスホロチオエートからなり得る。ＭＯＥ修飾ヌクレオチド、２ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ＬＮＡ修飾ヌクレオチド、及びヌクレオチドホスホロチオエートは、当技術分野において記載されている。
【0043】
核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ遺伝子又はＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているＲＮＡに結合することができる。核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ遺伝子の一部又はＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているＲＮＡの一部に結合することができる。結合は、例えば、ハイブリダイゼーションによって行われる。
【0044】
核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ遺伝子の核酸配列に対するものであってよい。例えば、核酸サイレンシング分子は、配列番号９のＤＮＡに対するものであってよい。核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているＲＮＡに対するものであってよい。例えば、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡに対するものであってよい。核酸サイレンシング分子は、配列番号９のＤＮＡによってコードされているＲＮＡに対するものであってよい。例えば、核酸サイレンシング分子は、配列番号９のＤＮＡによってコードされているｍＲＮＡに対するものであってよい。核酸サイレンシング分子は、配列番号１０のｍＲＮＡに対するものであってよい。核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳタンパク質をコードしている核酸配列に対するものであってよい。例えば、核酸サイレンシング分子は、配列番号１１のＡＡＳＳタンパク質をコードしている核酸配列に対するものであってよい。核酸サイレンシング分子は、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている核酸配列に対するものであってよい。例えば、核酸サイレンシング分子は、配列番号１１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている核酸配列に対するものであってよい。特定の核酸配列に「対する」核酸サイレンシング分子は、その核酸配列に結合する（例えば、ハイブリダイズする）ことができる。
【0045】
核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含み得るか又はからなり得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。一次転写産物とは、ＤＮＡの転写によって合成される一本鎖リボ核酸ＲＮＡ産物であり、プロセシングされてｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡ等の様々な成熟ＲＮＡ産物が生成される。一次転写産物は、例えば、プロセシングされてｍＲＮＡを形成する前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）であってよい。一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列は、（ｉ）エクソンに含まれるヌクレオチド配列、（ｉｉ）イントロンに含まれるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）３’非翻訳領域に含まれるヌクレオチド配列、及び（ｉｖ）５’非翻訳領域に含まれるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含み得る。一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列は、例えば、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）及び（ｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む。
【0046】
核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。
【0047】
核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳのエクソン８を標的とすることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳのエクソン９を標的とすることができる。核酸サイレンシング分子は、例えば、ＡＡＳＳのエクソン８及びエクソン９を標的とすることができる。従って、核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／若しくは９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸サイレンシング分子は、（ａ）ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得るか又はからなり得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／又はエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／又はエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／又はエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳから転写されたｍＲＮＡのエクソン８及び／又はエクソン９に含まれるヌクレオチド配列に対して８０％～１００％、８５％～９９％、９０％～９８％、又は９５％～９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。
【0048】
核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３４、配列番号３５、又は配列番号３６を含み得るか又はからなり得る。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、又は３６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。例えば、核酸サイレンシング分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、又は３６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。好ましくは、核酸サイレンシング分子は、（ａ）配列番号４、若しくは配列番号４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号６、若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号７、若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号８、若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；又は（ｅ）配列番号３５、若しくは配列番号３５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0049】
配列番号７は、配列番号４の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒである。配列番号８は、配列番号６の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒである。配列番号４及び配列番号７は、ＡＡＳＳのエクソン９を標的とする。配列番号６及び配列番号８は、ＡＡＳＳのエクソン８を標的とする。
【0050】
配列番号３４は、ＡＡＳＳのエクソン９を標的とする。配列番号３５は、ＡＡＳＳのエクソン８を標的とする。配列番号３６は、ＡＡＳＳのエクソン８を標的とする。
【0051】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、及び３６は、核酸「Ｎ」を含有する。いずれも場合も、Ｎは、独立して、Ｔ（チミン）及びＵ（ウラシル）から選択可能である。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、及び３６のそれぞれについて、任意の数の「Ｎ」が「Ｔ」であってよい。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、及び３６のそれぞれについて、任意の数の「Ｎ」が「Ｕ」であってよい。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、及び３６はそれぞれ、「Ｎ」と指定された位置に「Ｔ」及び「Ｕ」の任意の組み合わせを含有し得る。従って、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、及び３６はそれぞれ、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列であってよい。
【0052】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、又は３６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、又は３６に対して１つ以上のヌクレオチド置換を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１６ｍｅｒである配列番号１、２、３、４、５、又は６に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの置換を含み得る。ヌクレオチド配列は、１９ｍｅｒである配列番号３４に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの置換を含み得る。ヌクレオチド配列は、２０ｍｅｒである配列番号７、８、３５、又は３６に対して１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換を含み得る。
【0053】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５、又は３６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、３４、３５又は３６に対して１つ以上のヌクレオチド欠失を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１６ｍｅｒである配列番号１、２、３、４、５、又は６に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの欠失を含み得る。ヌクレオチド配列は、１９ｍｅｒである配列番号３４に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの欠失を含み得る。ヌクレオチド配列は、２０ｍｅｒである配列番号７、８、３５、又は３６に対して１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの欠失を含み得る。
【0054】
配列番号１又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１６（ＡＯＮ１）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２４（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ１）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号１６（ＡＯＮ１）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２４（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ１）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0055】
配列番号２又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１７（ＡＯＮ２）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２５（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ２）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号１７（ＡＯＮ２）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２５（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ２）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0056】
配列番号３又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１８（ＡＯＮ３）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２６（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ３）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号１８（ＡＯＮ３）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２６（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ３）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0057】
配列番号４又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１９（ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号２７（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２８（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号１９（ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号２７（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２８（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0058】
配列番号５又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２０（ＡＯＮ５）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２９（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ５）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号２０（ＡＯＮ５）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２９（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ５）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0059】
配列番号６又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２１（ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号３０（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３１（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号２１（ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号３０（ＬＮＡ修飾ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３１（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ６）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0060】
配列番号７又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２２（ＡＯＮ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３２（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号２２（ＡＯＮ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３２（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0061】
配列番号８又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２３（ＡＯＮ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３３（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号２３（ＡＯＮ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号３３（ＭＯＥ修飾ＡＯＮ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0062】
配列番号２２は、配列番号１９の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒである。配列番号２３は、配列番号２１の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒである。配列番号１９、２２、２７、２８、及び３２は、ＡＡＳＳのエクソン９を標的とする。配列番号２１、２３、３０、３１、及び３３は、ＡＡＳＳのエクソン８を標的とする。
【0063】
配列番号３４又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号３７（ＭＯＥ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４０（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号３７（ＭＯＥ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４０（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ７）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0064】
配列番号３５又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号３８（ＭＯＥ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４１（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号３８（ＭＯＥ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４１（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ８）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0065】
配列番号３６又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号３９（ＭＯＥ９）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４２（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ９）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。従って、核酸サイレンシング分子は、配列番号３９（ＭＯＥ９）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号４２（ＭＯＥ修飾ＭＯＥ９）若しくはそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。
【0066】
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２に対して１つ以上のヌクレオチド置換を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１６ｍｅｒである配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの置換を含み得る。ヌクレオチド配列は、１９ｍｅｒである配列番号３７又は４０に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの置換を含み得る。ヌクレオチド配列は、２０ｍｅｒである配列番号２２、２３、３２、３３、３８、３９、４１、又は４２に対して１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換を含み得る。
【0067】
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２に対して１つ以上のヌクレオチド欠失を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、１６ｍｅｒである配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの欠失を含み得る。ヌクレオチド配列は、１９ｍｅｒである配列番号３７又は４０に対して１つ、２つ、３つ、又は４つの欠失を含み得る。ヌクレオチド配列は、２０ｍｅｒである配列番号２２、２３、３２、３３、３８、３９、４１、又は４２に対して１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの欠失を含み得る。
【0068】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、又は１９個以上）の２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又は２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドからなり得る。２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９内の任意の位置（複数可）に存在し得る。
【0069】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、又は１９個以上）の２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又は２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドからなり得る。２’－Ｏ－メチル（２ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９内の任意の位置（複数可）に存在し得る。
【0070】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、又は１９個以上）のロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドを含み得るか、又はロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチドからなり得る。ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９内の任意の位置（複数可）に存在し得る。
【0071】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、又は１９個以上）のヌクレオチドホスホロチオエートを含み得るか、又はヌクレオチドホスホロチオエートからなり得る。ヌクレオチドホスホロチオエート（複数可）は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９内の任意の位置（複数可）に存在し得る。
【0072】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、（ｉ）１つ以上の２ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）１つ以上のＬＮＡ修飾ヌクレオチド、（ｉｉｉ）１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾ヌクレオチド、及び（ｉｖ）１つ以上のヌクレオチドホスホロチオエートの任意の組み合わせを含み得る。例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９のいずれかは、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）及び（ｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）；又は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含み得る。
【0073】
例示の目的のために、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１の例示的なＬＮＡ修飾を、それぞれ配列番号２４、２５、２６、２７、２９、及び３０に示す。配列番号１６、１７、１８、１９、２０、及び２１の例示的なヌクレオチドホスホロチオエート修飾も、それぞれ配列番号２４、２５、２６、２７、２９、及び３０に示す。配列番号１９、２１、２２、及び２３の例示的な２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾を、それぞれ配列番号２８、３１、３２及び３３に示す。配列番号１９、２１、２２、及び２３の例示的なヌクレオチドホスホロチオエート修飾も、それぞれ配列番号２８、３１、３２及び３３に示す。配列番号３７、３８、及び３９の例示的なヌクレオチドホスホロチオエート修飾を、それぞれ配列番号４０、４１、及び４２にも示す。配列番号３７、３８、及び３９の例示的な２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾も、それぞれ配列番号４０、４１、及び４２に示す。例示される修飾は限定的なものではない。任意の種類の化学修飾（例えば、２ＯＭｅ修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾、ヌクレオチドホスホロチオエート修飾）が、例示された位置のいずれか又は全てにおいてなされ得る。化学修飾（例えば、２ＯＭｅ修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース（ＭＯＥ）修飾、ヌクレオチドホスホロチオエート修飾）は、例示されていない位置でもなされ得る。
【0074】
好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号４又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。より好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号１９（ＡＯＮ４）又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号１９（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）の化学修飾バージョン、例えば、配列番号２３（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）又は（配列番号３３又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）を含み得るか又はからなり得る。
【0075】
別の好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号７又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。より好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号２２（ＡＯＮ７；配列番号１９（ＡＯＮ４）の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒ）又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２２（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）の化学修飾バージョン、例えば、配列番号３２（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）を含み得るか又はからなり得る。
【0076】
更に好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号６又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。より好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号２１（ＡＯＮ６）又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２１（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）の化学修飾バージョン、例えば、配列番号３０（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）又は（配列番号３１又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）を含み得るか又はからなり得る。
【0077】
別の好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号８又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。より好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号２３（ＡＯＮ８；配列番号２１（ＡＯＮ６）の１６ｍｅｒを含む２０ｍｅｒ）又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号２３（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）の化学修飾バージョン、例えば、配列番号３３（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）を含み得るか又はからなり得る。
【0078】
別の好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号３５又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。より好ましい態様では、核酸サイレンシング分子は、配列番号３８（ＭＯＥ８）又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる。核酸サイレンシング分子は、例えば、配列番号３８（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）の化学修飾バージョン、例えば、配列番号４１（又はそれに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）を含み得るか又はからなり得る。
【0079】
コンジュゲーション
核酸サイレンシング分子は、１つ以上の非核酸部分にコンジュゲートし得る。例えば、核酸サイレンシング分子は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の非核酸部分にコンジュゲートし得る。
核酸サイレンシング分子は、１つ以上の非核酸部分にコンジュゲートし得る。例えば、核酸サイレンシング分子は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の非核酸部分にコンジュゲートし得る。
【0080】
好ましくは、非核酸部分は、送達部分である。送達部分は、核酸サイレンシング分子のインビボ送達を支援する分子である。例えば、送達部分は、標的の器官、組織、又は細胞型への核酸サイレンシング分子の送達を促進し得る。以下に述べる非核酸部分はいずれも、送達部分として機能し得る。
【0081】
非核酸部分は、例えば、疎水性であってよい。非核酸部分は、例えば、脂質を含み得る。例えば、非核酸部分は、コレステロール、脂肪酸、トリグリセリド、又はリン脂質を含み得る。脂肪酸は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和脂肪酸は、多価不飽和であってよい。好ましくは、非核酸部分は、コレステロール又は多価不飽和脂肪酸を含む。
【0082】
非核酸部分は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。例えば、非核酸部分は、ペプチドリガンドを含み得る。ペプチド又はペプチドリガンドは、例えば、標的細胞、又は標的組織若しくは標的器官に含まれる細胞の表面上に存在する受容体に対する同族リガンドであり得る。非核酸部分は、例えば、抗体又は抗体断片を含み得る。抗体又は抗体断片は、例えば、標的細胞又は標的の組織若しくは器官に含まれる細胞の表面上に存在する抗原に結合することが可能であり得る。抗体断片は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖ２を含み得るか又はからなり得る。
【0083】
非核酸部分は、例えば、糖類、二糖類、又は多糖類を含み得る。非核酸部分は、例えば、アミノ糖を含み得る。好ましくは、非核酸部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。ＧａｌＮＡｃは、肝臓の肝細胞表面上で発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができる。このように、核酸サイレンシング分子をＧａｌＮＡｃにコンジュゲートすることにより、核酸サイレンシング分子を肝臓の肝細胞に特異的に送達することが可能となる。ＧａｌＮＡｃは非常に強力であり、肝細胞による核酸サイレンシング分子の取り込みを劇的に増加させ、その持続時間を延長することが実証されている。マウスにおける研究では、腎臓におけるＧａｌＮＡｃにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの体内分布の一部も示唆されている。リジンの異化は、主に肝臓、次いで腎臓で生じるので、核酸サイレンシング分子をＧａｌＮＡｃにコンジュゲートさせると有利である。
【0084】
非核酸部分は、例えば、ナノ粒子を含み得る。好適なナノ粒子は、当技術分野において公知である。このようなナノ粒子の製造方法も公知である。ナノ粒子は、例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、高分子ナノ粒子、無機ナノ粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、自己組織化タンパク質、リン酸カルシウムナノ粒子、シリコンナノ粒子、又は金ナノ粒子であってよい。好ましくは、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。核酸サイレンシング分子を脂質ナノ粒子にコンジュゲートさせると、肝臓及び腎臓における核酸サイレンシング分子の体内分布及び取り込みが増強され得る。
【0085】
治療方法及び医学的使用
対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法であって、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を該対象に投与することを含む方法が本明細書に開示される。
対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法であって、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を該対象に投与することを含む方法が本明細書に開示される。
【0086】
また、対象におけるリジン分解のサッカロピン経路の障害を治療する方法において使用するための組成物であって、該組成物が、α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素（ＡＡＳＳ）の発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含み、該方法が、該核酸サイレンシング分子を該対象に投与することを含む組成物も本明細書に開示される。
【0087】
リジン分解のサッカロピン経路の障害を有する対象に、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を投与すると、該経路を初期段階でブロック又は阻害することができる。このようにして、下流の代謝物の形成を防止又は低減することができる。従って、神経毒性代謝物等の毒性代謝物の蓄積を防止又は低減することができる。毒性代謝物の蓄積を防止又は低減することにより、リジン分解のサッカロピン経路の障害を治療することができる。例えば、そのような障害の臨床徴候又は症状を軽減又は消失させることができる。臨床徴候又は症状の進行を止めることもできる。本明細書に開示される治療方法及び医学的使用は、上記のような食事性リジン制限等のリジン分解のサッカロピン経路の障害に対する他の治療を超える利点を有し得る。
【0088】
核酸サイレンシング分子
本明細書に記載の治療方法及び医学的使用は、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を対象に投与することを含む。このような核酸サイレンシング分子については、上記で詳述した。本開示の核酸サイレンシング分子に関連して上述した態様はいずれも、本開示の治療方法又は本開示の医学的使用にも等しく適用され得る。
本明細書に記載の治療方法及び医学的使用は、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を対象に投与することを含む。このような核酸サイレンシング分子については、上記で詳述した。本開示の核酸サイレンシング分子に関連して上述した態様はいずれも、本開示の治療方法又は本開示の医学的使用にも等しく適用され得る。
【0089】
組成物は、ＡＡＳＳの発現を低下させる１つ以上の核酸サイレンシング分子を含み得る。例えば、組成物は、１用量あたりＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を２個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、５０００個以上、１００００個以上、２００００個以上、５００００個以上、１０００００個以上、２０００００個以上、５０００００個以上、１００００００個以上、２００００００個以上、５００００００個以上、１×１０７個以上、２×１０７個以上、５×１０７個以上、１×１０８個以上、２×１０８個以上、５×１０８個以上、１×１０９個以上、２×１０９個以上、又は５×１０９個以上含み得る。好ましくは、組成物の１用量に含まれるより多くの核酸サイレンシング分子は全て、同じヌクレオチド配列を含む。
【0090】
一態様では、核酸サイレンシング分子は、１つ以上のヌクレオチドホスホロチオエートを含み得るか又はヌクレオチドホスホロチオエートからなり得る。組成物が２つ以上のこのような核酸サイレンシング分子を含む場合、２つ以上の核酸サイレンシング分子の各々が１つの立体異性体であってもよい。好ましくは、組成物は、更なる核酸サイレンシング分子を含まない。これにより、組成物の立体純度が確保される。核酸サイレンシング分子の立体純度については、当技術分野、例えばＩｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：９，８４５－８５１において記載されている。
【0091】
ＡＡＳＳの発現低下
組成物に含まれる核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を低下させる。ＡＡＳＳの発現低下については、本開示の核酸サイレンシング分子に関連して上記で詳述した。本開示の核酸サイレンシング分子に関連して記載した態様はいずれも、本開示の治療方法又は本開示の医学的使用にも等しく適用され得る。
組成物に含まれる核酸サイレンシング分子は、ＡＡＳＳの発現を低下させる。ＡＡＳＳの発現低下については、本開示の核酸サイレンシング分子に関連して上記で詳述した。本開示の核酸サイレンシング分子に関連して記載した態様はいずれも、本開示の治療方法又は本開示の医学的使用にも等しく適用され得る。
【0092】
リジン分解のサッカロピン経路の障害
ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を投与すると、リジン分解のサッカロピン経路がその初期段階でブロック又は阻害されるが、その理由は、ＡＡＳＳが該経路における最初の酵素であるためである。このように経路上流の先頭をブロック又は阻害することにより、任意の下流の代謝物の形成を防止又は低減することができる。従って、リジン分解のサッカロピン経路のいかなる障害も、本開示の治療方法又は医学的使用に従って治療することができる。
ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を投与すると、リジン分解のサッカロピン経路がその初期段階でブロック又は阻害されるが、その理由は、ＡＡＳＳが該経路における最初の酵素であるためである。このように経路上流の先頭をブロック又は阻害することにより、任意の下流の代謝物の形成を防止又は低減することができる。従って、リジン分解のサッカロピン経路のいかなる障害も、本開示の治療方法又は医学的使用に従って治療することができる。
【0093】
好ましくは、障害は、リジン分解のサッカロピン経路の毒性代謝物の蓄積と関連している。毒性代謝物は、例えば、神経毒性代謝物である。好ましくは、障害は、リジン分解のサッカロピン経路に含まれる酵素のうちの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上）に欠損を含む。障害は、例えば、ＡＬＤＨ７Ａ１に欠損を含み得る。障害は、例えば、ＤＨＴＫＤ１に欠損を含み得る。障害は、例えば、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼに欠損を含み得る。障害は、例えば、ＡＡＤＡＴに欠損を含み得る。
【0094】
１つ以上の酵素における欠損は、酵素における変異に起因する場合がある。例えば、ＡＬＤＨ７Ａ１における欠損は、ＡＬＤＨ７Ａ１における変異に起因する場合がある。ＤＨＴＫＤ１における欠損は、ＤＨＴＫＤ１における変異に起因する場合がある。グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける欠損は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける変異に起因する場合がある。ＡＡＤＡＴにおける欠損は、ＡＡＤＡＴにおける変異に起因する場合がある。変異は、酵素における１つ以上の置換を含み得る。変異は、酵素への１つ以上の挿入を含み得る。変異は、酵素からの１つ以上の欠失を含み得る。
【0095】
障害は、例えば、ピリドキシン依存性てんかんであり得る。ピリドキシン依存性てんかんは、ＡＬＤＨ７Ａ１における欠損（例えば変異）に起因する。障害は、例えば、２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症であり得る。２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症（２－アミノアジピン酸及び２－ケトアジピン酸尿症としても知られている）は、ＤＨＴＫＤ１における欠損（例えば変異）に起因する。２－アミノアジピン酸２－ケトアジピン酸尿症は、２－アミノアジピン酸２－オキソアジピン酸尿症又は２－アミノアジピン酸及び２－オキソアジピン酸尿症としても知られている。障害は、例えば、シャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型であり得る。シャルコー・マリー・ツース病２Ｑ型は、ＤＨＴＫＤ１における欠損（例えば変異）に起因する。障害は、例えば、グルタル酸尿症Ｉ型であり得る。グルタル酸尿症Ｉ型は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼにおける欠損（例えば変異）に起因する。
【0096】
対象
対象は、例えば哺乳類であってよい。哺乳類は、例えば、ヒトであってもよく、イヌ、ネコ、ウマ、又は家畜等の非ヒト哺乳類であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
対象は、例えば哺乳類であってよい。哺乳類は、例えば、ヒトであってもよく、イヌ、ネコ、ウマ、又は家畜等の非ヒト哺乳類であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
【0097】
対象は、例えば、成体である。対象は、例えば、若年である。
【0098】
投与及び製剤
組成物は、任意の経路によって投与してよい。好適な経路としては、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、及び経口／頬側の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物は、任意の経路によって投与してよい。好適な経路としては、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、及び経口／頬側の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【0099】
組成物は、インビボでの核酸サイレンシング分子の送達を最適化する送達ビヒクルを含み得る。好適な送達ビヒクルは、当技術分野で公知であり、例えば、細胞標的化部分、細胞透過性部分、脂質、リポタンパク質、リポソーム、リポプレックス、ペプチド、ＧａｌＮＡｃ、抗体、アプタマー、ナノ粒子、エクソソーム、球状核酸、及びＤＮＡケージ等が挙げられる。
【0100】
組成物は、生理学的に許容し得る担体又は希釈剤と一緒に調製してもよい。典型的には、そのような組成物は、核酸サイレンシング分子及び／又は送達ビヒクルと連結した核酸サイレンシング分子の懸濁液として調製される。核酸サイレンシング分子及び／又は送達ビヒクルと連結した核酸サイレンシング分子は、薬学的に許容し得かつ活性成分と適合する賦形剤と混合され得る。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びこれらの組み合わせである。更に、必要に応じて、医薬組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤及び／又はｐＨ緩衝剤等の補助物質を微量含有していてもよい。
【0101】
核酸サイレンシング分子及び／又は送達ビヒクルと連結した核酸サイレンシング分子は、剤形に適合する方法で投与され、そのような量で治療的に有効になるであろう。投与される量は、治療される対象、治療される疾患、及び対象の免疫系の能力に依存する。投与が必要とされる核酸サイレンシング分子及び／又は送達ビヒクルと連結した核酸サイレンシング分子の正確な量は、医師の判断に依存し得、各対象に特有であり得る。
【0102】
上記のように、核酸サイレンシング分子は、一態様では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡであり得る。この場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ、又はＣａｓＸ等）を対象に投与してよい。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核酸サイレンシング分子を含む組成物中に含まれていてもよく、別個の組成物中に含まれていてもよい。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが別個の組成物に含まれている場合、核酸サイレンシング分子を含む組成物及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を対象に同時に投与してもよい。核酸サイレンシング分子を含む組成物及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物は、異なる時間に対象に投与してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物の前に核酸サイレンシング分子を含む組成物を対象に投与してもよい。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物の後に核酸サイレンシング分子を含む組成物を対象に投与してもよい。
【0103】
併用療法
組成物は、併用療法の一部として投与することができる。すなわち、治療方法又は医学的使用は、対象に更なる治療組成物又は治療レジメンを投与することを含み得る。例えば、核酸サイレンシング分子がＡＡＳＳ発現を排除するのではなく低下させる場合、更なる組成物を投与したり治療レジメンを施したりすることが望ましい場合もある。しかし、場合によっては、障害を治療するために、ＡＡＳＳの発現を（排除するのではなく）低下させることで十分な場合もある。
組成物は、併用療法の一部として投与することができる。すなわち、治療方法又は医学的使用は、対象に更なる治療組成物又は治療レジメンを投与することを含み得る。例えば、核酸サイレンシング分子がＡＡＳＳ発現を排除するのではなく低下させる場合、更なる組成物を投与したり治療レジメンを施したりすることが望ましい場合もある。しかし、場合によっては、障害を治療するために、ＡＡＳＳの発現を（排除するのではなく）低下させることで十分な場合もある。
【0104】
組成物は、特定の障害に対して利用可能な任意の治療用組成物又は治療レジメンと組み合わせて併用療法の一部として投与してもよい。例えば、リジン分解のサッカロピン経路の多くの障害は、リジン制限食で治療することができる。従って、治療レジメンは、リジン制限食を含んでいてよい。リジン分解のサッカロピン経路の幾つかの障害（グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼに欠損を含む障害、例えばグルタル酸尿症Ｉ型等）は、トリプトファン制限食で治療することができる。従って、治療レジメンは、トリプトファン制限食を含んでいてよい。ビタミンＢ６は、ピリドキシン依存性てんかんの治療薬として公知である。従って、障害がＡＬＤＨ７Ａ１に欠損を含む場合（例えば、ピリドキシン依存性てんかん）、更なる治療組成物はビタミンＢ６を含んでいてよい。ＡＬＤＨ７ＡＩに欠損を含む障害に対する別の公知の治療薬はアルギニンである。従って、障害がＡＬＤＨ７ＡＩに欠損を含む場合、更なる治療組成物はアルギニンを含んでいてよい。アルギニンは、グルタル酸尿症Ｉ型の治療薬としても公知である。従って、障害がグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼに欠損を含む（例えばグルタル酸尿症Ｉ型）場合、更なる治療組成物はアルギニンを含んでいてよい。カルニチンもグルタル酸尿症Ｉ型の治療薬として公知である。従って、障害がグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼに欠損を含む（例えばグルタル酸尿症Ｉ型）場合、更なる治療組成物はカルニチンを含んでいてよい。
【0105】
併用療法では、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物は、更なる治療組成物又は治療レジメンの投与と組み合わせて治療的に有効となるような量で投与される。更なる治療組成物は、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物と組み合わせて治療的に有効となるような量で投与される。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物及び更なる治療組成物は、一緒に、例えば同時に投与してもよい。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物及び更なる治療組成物は、別々に、例えば異なる時間に投与してもよい。例えば、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を更なる治療組成物の前に投与してもよい。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物を更なる治療組成物の後に投与してもよい。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物の投与を更なる治療組成物の投与と交互に行ってもよい。
【0106】
併用療法の別の態様では、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物は、追加の治療レジメンと組み合わせて治療的に有効となるような量で投与される。治療レジメンは、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物の投与と組み合わせて治療的に有効となる程度まで実施される。ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物は、治療レジメンの実施前、実施中、又は実施後に投与してよい。好ましくは、ＡＡＳＳの発現を低下させる核酸サイレンシング分子を含む組成物は、治療レジメンの実施中に投与される。
【0107】
インビトロ法
上記のように、本明細書に開示される核酸サイレンシング分子は、インビトロでＡＡＳＳの発現を低下させるために使用することができる。例えば、例えばリジン分解のサッカロピン経路について調べるための研究ツールとして、核酸サイレンシング分子を使用することができる。従って、本開示は、細胞内のＡＡＳＳの発現を低下させるためのインビトロ方法であって、該細胞を本開示の核酸サイレンシング分子と接触させることを含む方法を提供する。
上記のように、本明細書に開示される核酸サイレンシング分子は、インビトロでＡＡＳＳの発現を低下させるために使用することができる。例えば、例えばリジン分解のサッカロピン経路について調べるための研究ツールとして、核酸サイレンシング分子を使用することができる。従って、本開示は、細胞内のＡＡＳＳの発現を低下させるためのインビトロ方法であって、該細胞を本開示の核酸サイレンシング分子と接触させることを含む方法を提供する。
【0108】
細胞は、任意の種類の細胞であってよい。例えば、細胞は、任意の組織由来であってよい。細胞は、任意の種由来であってよい。好ましくは、細胞は、ヒトである。細胞は、健常細胞であっても、疾患細胞であってもよい。疾患細胞は、例えば、がん細胞であってよい。細胞は、天然に存在する細胞であってよい。細胞は、細胞株由来であってよい。
【0109】
核酸サイレンシング分子を細胞に接触させる機序は、当技術分野において周知である。接触は、例えば、マイクロウェルプレートのウェル内又は細胞培養フラスコ若しくは試験管等の別の種類の容器内で行ってよい。接触工程は、細胞の培養の前に行ってもよく、又は同時に行ってもよい。様々な細胞型の培養に必要な条件は、当技術分野において周知である。
【0110】
細胞は、核酸サイレンシング分子に加えて１つ以上の分子と接触させてもよい。追加の分子は、ＡＡＳＳを標的とする別の核酸サイレンシング分子であってもよい。追加の分子は、ＡＡＳＳ以外の遺伝子、例えばリジン分解のサッカロピン経路内の異なる遺伝子を標的とする核酸サイレンシング分子であってもよい。好ましくは、追加の分子は、核酸サイレンシング分子によるＡＡＳＳ発現の低下又は排除を促進し得る。例えば、核酸サイレンシング分子がＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである場合、追加の分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであってよい。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ、又はＣａｓＸであってよい。
【0111】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【0112】
実施例１
材料及び方法
患者
ＡＬＤＨ７Ａ１欠損症患者５名及び健常対照４名の線維芽細胞株を皮膚生検から樹立した。
材料及び方法
患者
ＡＬＤＨ７Ａ１欠損症患者５名及び健常対照４名の線維芽細胞株を皮膚生検から樹立した。
【0113】
ヒト線維芽細胞の培養
全ての患者及び対照の線維芽細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。
全ての患者及び対照の線維芽細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。
【0114】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の設計
ＡＡＳＳ（α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素）を標的とするロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）及び２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）ケミストリーを有するＡＯＮを設計し、商業的に合成した。ギャップマーの長さは、ＬＮＡケミストリーでは１６ｍｅｒ、ＭＯＥケミストリーでは２０ｍｅｒであった。中央のＤＮＡギャップはホスホロチオエート（ＰＳ）修飾ＤＮＡであり、一方、隣接するＲＮＡ領域はＭＯＥ又はＬＮＡで修飾された。
ＡＡＳＳ（α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素）を標的とするロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）及び２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）ケミストリーを有するＡＯＮを設計し、商業的に合成した。ギャップマーの長さは、ＬＮＡケミストリーでは１６ｍｅｒ、ＭＯＥケミストリーでは２０ｍｅｒであった。中央のＤＮＡギャップはホスホロチオエート（ＰＳ）修飾ＤＮＡであり、一方、隣接するＲＮＡ領域はＭＯＥ又はＬＮＡで修飾された。
【0115】
細胞のＡＯＮ処理
線維芽細胞成長培地（２ｍＬ）中２×１０５個の密度で６ウェルプレートに細胞を播種し、翌日、８５～９０％コンフルエントになったところで、ＡＯＮを含む５μＬのリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１０分間用いて、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした後、１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を２４時間にわたって添加した。各実験につき、リポフェクタミンのみで処理した細胞（モック）、ｍＲＮＡに結合しないスクランブル配列を有するＡＯＮで処理した細胞（スクランブル）、及び線維芽細胞成長培地のみで処理した細胞の３つの対照条件を使用した。
線維芽細胞成長培地（２ｍＬ）中２×１０５個の密度で６ウェルプレートに細胞を播種し、翌日、８５～９０％コンフルエントになったところで、ＡＯＮを含む５μＬのリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１０分間用いて、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした後、１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を２４時間にわたって添加した。各実験につき、リポフェクタミンのみで処理した細胞（モック）、ｍＲＮＡに結合しないスクランブル配列を有するＡＯＮで処理した細胞（スクランブル）、及び線維芽細胞成長培地のみで処理した細胞の３つの対照条件を使用した。
【0116】
質量分析によるＡＡＳＡ分析のための細胞の収集及び調製
ＡＯＮで２４時間処理した後、細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を４００ｍｇ／ＬのＬ－リジンを含有するＤＭＥＭ中で更に２４時間放置して成長させた。次いで、調整培地を回収し、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。２４００μＬの氷冷メタノールを細胞に添加し、続いて、２４００μＬのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ冷Ｈ２Ｏを加え、全ての工程を氷上で行った。セルスクレーパーを用いて細胞を収集し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、３０秒間超音波処理（４０％ ａｍｐ）した後に、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を新たな１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、直ちに質量分析によって分析するか又は分析前に－８０℃で保存した。
ＡＯＮで２４時間処理した後、細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を４００ｍｇ／ＬのＬ－リジンを含有するＤＭＥＭ中で更に２４時間放置して成長させた。次いで、調整培地を回収し、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。２４００μＬの氷冷メタノールを細胞に添加し、続いて、２４００μＬのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ冷Ｈ２Ｏを加え、全ての工程を氷上で行った。セルスクレーパーを用いて細胞を収集し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、３０秒間超音波処理（４０％ ａｍｐ）した後に、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を新たな１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、直ちに質量分析によって分析するか又は分析前に－８０℃で保存した。
【0117】
ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを用いたＡＡＳＡ代謝物の分析
ＦＭＯＣ－塩化物、ホウ酸、アセトン、酢酸アンモニウム、ギ酸、及びアセトニトリルはＨＰＬＣグレードのものであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。重水素化内部標準物質であるα－アミノアジピン酸－ｄ３（ＡＡＡ－ｄ３、純度９８％）は、ＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｌ－アリシンエチレンアセタールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
ＦＭＯＣ－塩化物、ホウ酸、アセトン、酢酸アンモニウム、ギ酸、及びアセトニトリルはＨＰＬＣグレードのものであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。重水素化内部標準物質であるα－アミノアジピン酸－ｄ３（ＡＡＡ－ｄ３、純度９８％）は、ＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｌ－アリシンエチレンアセタールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0118】
上清をガラスバイアルに移し、窒素流下で乾燥させた後、５０μＬの水、１０μＬの０．１ｍｍｏｌ ＡＡＡ－ｄ３、及び１２５μＬのホウ酸バッファ（ｐＨ１０．４）に再懸濁させた。次いで、１２５μＬのＦｍｏｃ－塩化物（アセトン中６ｍＭ）を添加し、十分に混合し、室温で１５分間反応させることにより、サンプルを誘導体化した。
【0119】
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ質量分析計に接続したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いた液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、α－ＡＡＳＡの定量を行った。調製したサンプル１０マイクロリットルをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－５ ＬＣカラム（５ｃｍ×２．１ｍｍ×５μＭ）に注入した。移動相は、Ａ（４ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．０及びＢ（１００％アセトニトリル）からなっており、以下の勾配を使用した：０～１．９分（９５％Ａ及び５％Ｂ；０．５ｍＬ／分）、２～１０分（８０％Ａ及び２０％Ｂ→２０％Ａ及び８０％Ｂ；０．２５ｍＬ／分）、１０～１２分（８０％Ａ及び２０％Ｂ→１００％Ｂ；０．２５～０．５ｍＬ／分）、１２～１６分（１００％Ｂ；０．５ｍＬ／分）。次いで、次のサンプルを注入する前にカラムを再平衡化した。全ての勾配工程は線形であった。α－ＡＡＳＡ及びｄ３－ＡＡＡはネガティブイオンモードで分析した。モニタリングした複数の反応トランジションは、α－ＡＡＳＡ－ＦＭＯＣについては３６６．１＞１４４．１ｍ／ｚ（コーン電圧＝４Ｖ、コリジョン電圧２０Ｖ）、ｄ３－ＡＡＡ－ＦＭＯＣについては３８５．０２＞１６３．０６ｍ／ｚ（コーン電圧＝１９Ｖ、コリジョン電圧＝１３Ｖ）であった。
【0120】
０．０３２～０．１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でα－ＡＡＳＡ標準曲線を作成した。α－ＡＡＳＡ標準物質は、Ｌ－アリシンエチレンアセタールから合成した。簡潔に説明すると、５ｍｇのＬ－アリシンエチレンアセタールを１ｍＬのｄＨ２Ｏに添加し、１５ｍｇのＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５樹脂と室温で１０分間混合することによりブロックを解除した。次いで、１ｍＬの溶液を新たなバイアルに移し、樹脂を０．５ｍＬの２５％水酸化アンモニウム及び２ｍＬのｄＨ２Ｏと混合した。更に３．１１ｍＬのｄＨ２Ｏを添加して、１ｍｍｏｌ／Ｌ α－ＡＡＳＡの溶液６．６１ｍＬを作製した。
【0121】
ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの調製
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って、細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、各サンプルのＲＮＡの収量及び品質を求めた。ランダムヘキサマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて２０μＬの反応混合物中で製造業者の指示に従って全ＲＮＡ（４００～５００ｎｇ）を逆転写した。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って、細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、各サンプルのＲＮＡの収量及び品質を求めた。ランダムヘキサマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて２０μＬの反応混合物中で製造業者の指示に従って全ＲＮＡ（４００～５００ｎｇ）を逆転写した。
【0122】
定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）解析
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量リアルタイムＰＣＲ解析を行った。ＡＡＳＳ及びＧＡＰＤＨの遺伝子に最適化されたプライマーについては以下に詳述する。以下の方法を用いた定量リアルタイムＰＣＲ及び解析のために、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した：９５℃で１０分間の保持段階、続いて、以下の融解曲線（工程１：９５℃で１５秒間、工程２：６０℃で１分間、及び工程３：９５℃で１５秒間（＋０．３℃）で９５℃で１５秒間の変性及び６０℃で１分間のアニーリングを４０サイクル。ΔΔＣｔ法を用いて相対定量を測定した。ＡＡＳＳの発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。各サンプルをトリプリケートで分析した。
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量リアルタイムＰＣＲ解析を行った。ＡＡＳＳ及びＧＡＰＤＨの遺伝子に最適化されたプライマーについては以下に詳述する。以下の方法を用いた定量リアルタイムＰＣＲ及び解析のために、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した：９５℃で１０分間の保持段階、続いて、以下の融解曲線（工程１：９５℃で１５秒間、工程２：６０℃で１分間、及び工程３：９５℃で１５秒間（＋０．３℃）で９５℃で１５秒間の変性及び６０℃で１分間のアニーリングを４０サイクル。ΔΔＣｔ法を用いて相対定量を測定した。ＡＡＳＳの発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。各サンプルをトリプリケートで分析した。
【0123】
【表A】
【0124】
定量及び統計解析
両側独立スチューデントのｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア）を用いてデータを分析した。複数の群を比較する場合、一元配置分散分析検定を行った。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。データは、平均±ＳＥＭとして提示する。
両側独立スチューデントのｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア）を用いてデータを分析した。複数の群を比較する場合、一元配置分散分析検定を行った。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。データは、平均±ＳＥＭとして提示する。
【0125】
結果
ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現
ＡＬＤＨ７Ａ１欠損線維芽細胞において、ＡＡＳＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理のＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現に対する効果を評価した。結果を図４に示す。ＬＮＡ修飾及びＭＯＥ修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれもＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を低下させた。具体的には、ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＡＳＳを抑制し（ｐ＜０．０５）、ＡＯＮ４及びＡＯＮ６が最も劇的な効果を有していた（ｐ＝０．０００１）（図４（ａ））。ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４及びＡＯＮ６（それぞれ２０ｍｅｒの形態、それぞれＡＯＮ７とＡＯＮ８に対応）もＡＡＳＳを有意に減少させた（ｐ＝０．０００１）（図４（ｂ））。
ＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現
ＡＬＤＨ７Ａ１欠損線維芽細胞において、ＡＡＳＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理のＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現に対する効果を評価した。結果を図４に示す。ＬＮＡ修飾及びＭＯＥ修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれもＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現を低下させた。具体的には、ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＡＳＳを抑制し（ｐ＜０．０５）、ＡＯＮ４及びＡＯＮ６が最も劇的な効果を有していた（ｐ＝０．０００１）（図４（ａ））。ＭＯＥ修飾ＡＯＮ４及びＡＯＮ６（それぞれ２０ｍｅｒの形態、それぞれＡＯＮ７とＡＯＮ８に対応）もＡＡＳＳを有意に減少させた（ｐ＝０．０００１）（図４（ｂ））。
【0126】
ＡＡＳＡ代謝物の定量
質量分析法を用いて線維芽細胞内のＡＡＳＡを測定することにより、ＡＬＤＨ７Ａ１の欠損を機能的にアッセイすることができる。ＡＡＳＡはＡＬＤＨ７Ａ１の代謝物であり、ＡＬＤＨ７Ａ１が欠損するとＡＡＳＡが蓄積し得る。このことは、ＡＬＤＨ７Ａ１患者及び健常対照由来の線維芽細胞で行った質量分析の結果を示す図５で確認される。健常対照由来の線維芽細胞ではＡＡＳＡは検出されなかったが、ＡＬＤＨ７Ａ１欠損患者由来の線維芽細胞ではＡＡＳＡの蓄積が実証された。
質量分析法を用いて線維芽細胞内のＡＡＳＡを測定することにより、ＡＬＤＨ７Ａ１の欠損を機能的にアッセイすることができる。ＡＡＳＡはＡＬＤＨ７Ａ１の代謝物であり、ＡＬＤＨ７Ａ１が欠損するとＡＡＳＡが蓄積し得る。このことは、ＡＬＤＨ７Ａ１患者及び健常対照由来の線維芽細胞で行った質量分析の結果を示す図５で確認される。健常対照由来の線維芽細胞ではＡＡＳＡは検出されなかったが、ＡＬＤＨ７Ａ１欠損患者由来の線維芽細胞ではＡＡＳＡの蓄積が実証された。
【0127】
ＡＡＳＳによって駆動されるＡＡＳＡの産生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の効果について調べるため、患者の線維芽細胞をＡＡＳＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド又は対照アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。図６に示す通り、ａ）患者１（Ｐ１）及びｂ）患者３（Ｐ３）由来の線維芽細胞におけるＡＡＳＡレベルは、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４による処理によって有意に低下した（それぞれｐ＝０．００８２及びｐ＝０．０００８）。同様に、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６もＰ３のＡＡＳＡレベルを低下させた（ｐ＝０．０００７）。上述のように、ＭＯＥケミストリーではギャップマーの長さは２０ｍｅｒであった（すなわち、ＡＯＮ７はＭＯＥケミストリーのＡＯＮ４として使用され、ＡＯＮ８はＭＯＥケミストリーのＡＯＮ６として使用された）。
【0128】
従って、リジン分解のサッカロピン経路における下流酵素の障害によって引き起こされる代謝物の蓄積を防止又は最小化するために、ＡＡＳＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【0129】
実施例２
ヒトＡＡＳＳ及びマウスＡａｓｓを標的とする更なるＡＯＮの設計
ＡＡＳＳ遺伝子の特定の領域、すなわちエクソン８／エクソン９に対して、３つの新たなＭＯＥ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＯＥ７、ＭＯＥ８、及びＭＯＥ９）を設計した。ＡＡＳＳ遺伝子の発現が最も大きく阻害されるのは、この領域を標的とした場合である。遺伝子のこの領域のヒト及びマウスのＤＮＡ配列は類似している。ＭＯＥ７、ＭＯＥ８、及びＭＯＥ９は、表１に示す通りである。
ヒトＡＡＳＳ及びマウスＡａｓｓを標的とする更なるＡＯＮの設計
ＡＡＳＳ遺伝子の特定の領域、すなわちエクソン８／エクソン９に対して、３つの新たなＭＯＥ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＯＥ７、ＭＯＥ８、及びＭＯＥ９）を設計した。ＡＡＳＳ遺伝子の発現が最も大きく阻害されるのは、この領域を標的とした場合である。遺伝子のこの領域のヒト及びマウスのＤＮＡ配列は類似している。ＭＯＥ７、ＭＯＥ８、及びＭＯＥ９は、表１に示す通りである。
【0130】
【表1】
【0131】
ヒトＡＬＤＨ７Ａ１欠損線維芽細胞におけるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現のノックダウンに対するＡＯＮの有効性
５つのＡＬＤＨ７Ａ１欠損患者線維芽細胞株において、以下のＡＯＮの効力を調べた：
－ ＭＯＥ４（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ７である）；
－ ＭＯＥ６（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ８である）；
－ ＭＯＥ７
－ ＭＯＥ８
－ ＭＯＥ９。
５つのＡＬＤＨ７Ａ１欠損患者線維芽細胞株において、以下のＡＯＮの効力を調べた：
－ ＭＯＥ４（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ７である）；
－ ＭＯＥ６（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ８である）；
－ ＭＯＥ７
－ ＭＯＥ８
－ ＭＯＥ９。
【0132】
リポフェクタミン２０００を用いたトランスフェクションの２４時間後にｑ－ＲＴ－ＰＣＲによってＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、効力を調べた。試験したＡＯＮは全て、図７に示すように発現レベルを有意に低下させ、最大９８％の抑制が達成された。
【0133】
ヒトＧＣＤＨ欠損線維芽細胞（グルタル酸尿症）におけるＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現のノックダウンに対するＡＯＮの有効性
リポフェクタミン２０００を用いたトランスフェクションの２４時間後にｑ－ＲＴ－ＰＣＲによってＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、市販されている２つの患者ＧＣＤＨ欠損線維芽細胞株でも、ＭＯＥ４、６、７、８、及び９の効果を分析した。ＭＯＥ４、６、７、８、及び９は、発現を最大９０％と有意に阻害することが示された（図８）。
リポフェクタミン２０００を用いたトランスフェクションの２４時間後にｑ－ＲＴ－ＰＣＲによってＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、市販されている２つの患者ＧＣＤＨ欠損線維芽細胞株でも、ＭＯＥ４、６、７、８、及び９の効果を分析した。ＭＯＥ４、６、７、８、及び９は、発現を最大９０％と有意に阻害することが示された（図８）。
【0134】
マウス細胞株におけるＡａｓｓ遺伝子発現のノックダウンに対するＡＯＮの有効性
Ａａｓｓの発現を６つのマウス細胞株で分析した（表２）。これら株のうち５株では、Ａａｓｓの発現が低すぎて、ＡＯＮ処理後のＡａｓｓノックダウンについて信頼できる結果が得られなかった。しかし、Ａａｓｓがはるかに高いレベルで発現しているマウス線維芽細胞上皮細胞株３Ｔ３－Ｊ２では、ＡＯＮの効果を調べることが可能であった。リポフェクタミン３０００を用いたトランスフェクションの２４時間後にｑ－ＲＴ－ＰＣＲ法によってＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、Ａａｓｓの発現を最も大きく阻害したのはＭＯＥ８であることが明白であり、約８５％のノックダウンが達成された（図９）。
Ａａｓｓの発現を６つのマウス細胞株で分析した（表２）。これら株のうち５株では、Ａａｓｓの発現が低すぎて、ＡＯＮ処理後のＡａｓｓノックダウンについて信頼できる結果が得られなかった。しかし、Ａａｓｓがはるかに高いレベルで発現しているマウス線維芽細胞上皮細胞株３Ｔ３－Ｊ２では、ＡＯＮの効果を調べることが可能であった。リポフェクタミン３０００を用いたトランスフェクションの２４時間後にｑ－ＲＴ－ＰＣＲ法によってＡＡＳＳ ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、Ａａｓｓの発現を最も大きく阻害したのはＭＯＥ８であることが明白であり、約８５％のノックダウンが達成された（図９）。
【0135】
【表2】
【0136】
＊Ｃｔ値が低いほど、標的核酸の量が多い。Ｃｔ値≧２９は核酸が豊富に存在することを示し、一方、３０～３４のＣｔ値は、標的核酸の量が少ないか又は中程度である弱い陽性反応であるとみなされる。
【0137】
ＧＡ１欠損患者線維芽細胞におけるＡＯＮの効果を測定するための機能的アッセイの開発
グルタル酸尿症１型（ＧＡ１）は、リジン及びヒドロキシリジンの代謝に関与する酵素であるグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＣＤＨ）の欠損によって引き起こされる。ＧＣＤＨにおける変異の結果、グルタル酸（ＧＡ）、３－ＯＨ－グルタル酸（３－ＯＨ－ＧＡ）、グルタコン酸、及びグルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）が蓄積する。Ｃ５ＤＣを測定するための質量分析法が確立されている（図１０）。これを用いて、ＧＡ１欠損患者線維芽細胞に対するＡＯＮの効果を機能的に評価する。
グルタル酸尿症１型（ＧＡ１）は、リジン及びヒドロキシリジンの代謝に関与する酵素であるグルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＣＤＨ）の欠損によって引き起こされる。ＧＣＤＨにおける変異の結果、グルタル酸（ＧＡ）、３－ＯＨ－グルタル酸（３－ＯＨ－ＧＡ）、グルタコン酸、及びグルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）が蓄積する。Ｃ５ＤＣを測定するための質量分析法が確立されている（図１０）。これを用いて、ＧＡ１欠損患者線維芽細胞に対するＡＯＮの効果を機能的に評価する。
【0138】
ＨＥＰＧ２ヒト肝細胞におけるＡＡＳＳの発現レベル
ＡＯＮをＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とコンジュゲートさせ、その後アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）に選択的に取り込ませることにより、肝臓細胞（肝細胞）へのＡＯＮの標的送達が達成される。取り込みに対するＧａｌＮＡｃコンジュゲーションの効果を調べる前に、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株におけるＡＡＳＳの発現レベルを評価するための試験を行った。継代回数が発現レベルに影響するかどうかを調べるため、ほんの数回しか継代していない細胞株（ｐ＝１４）及びかなり多い回数継代した細胞株（ｐ＝７８）を調べた。継代回数は、ＡＡＳＳの発現レベルには影響を及ぼさなかった（表３）。
ＡＯＮをＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とコンジュゲートさせ、その後アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）に選択的に取り込ませることにより、肝臓細胞（肝細胞）へのＡＯＮの標的送達が達成される。取り込みに対するＧａｌＮＡｃコンジュゲーションの効果を調べる前に、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株におけるＡＡＳＳの発現レベルを評価するための試験を行った。継代回数が発現レベルに影響するかどうかを調べるため、ほんの数回しか継代していない細胞株（ｐ＝１４）及びかなり多い回数継代した細胞株（ｐ＝７８）を調べた。継代回数は、ＡＡＳＳの発現レベルには影響を及ぼさなかった（表３）。
【0139】
【表3】
【0140】
ＡＯＮによるＨＥＰＧ２細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬を用いたことを除いて先のヒト線維芽細胞の研究で用いたのと同じ方法を用いてＨＥＰＧ２細胞をトランスフェクションした後、非コンジュゲートＡＯＮであるＭＯＥ４、６、及び８の効力を評価した。ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現の有意な低下が達成されたが（図１１）、このアプローチを用いても、患者線維芽細胞でみられたほどの大きな低下を達成することはできなかった。これは、単層で成長する線維芽細胞とは異なりＨｅｐＧ２細胞はクラスター状に又は互いに重なり合って成長することによりトランスフェクション効率が低下したためである可能性が高い。トランスフェクションを改善するため、逆トランスフェクション法を採用したが、それは、細胞がプレートに接着する前にトランスフェクションを行うことができるためである。
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬を用いたことを除いて先のヒト線維芽細胞の研究で用いたのと同じ方法を用いてＨＥＰＧ２細胞をトランスフェクションした後、非コンジュゲートＡＯＮであるＭＯＥ４、６、及び８の効力を評価した。ＡＡＳＳ ｍＲＮＡ発現の有意な低下が達成されたが（図１１）、このアプローチを用いても、患者線維芽細胞でみられたほどの大きな低下を達成することはできなかった。これは、単層で成長する線維芽細胞とは異なりＨｅｐＧ２細胞はクラスター状に又は互いに重なり合って成長することによりトランスフェクション効率が低下したためである可能性が高い。トランスフェクションを改善するため、逆トランスフェクション法を採用したが、それは、細胞がプレートに接着する前にトランスフェクションを行うことができるためである。
【0141】
ＨｅｐＧ２細胞の逆トランスフェクションの条件を最適化し、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲを用いて非コンジュゲートＡＯＮ４、６、及び８の有効性を分析した（図１２；ｎ＝３）。
【0142】
濃度範囲（１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）に対する用量応答を行った。結果を図１３に示す。対応する対照（モック処理）に対するＭＯＥ４、６、及び８の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ１．４２ｎＭ、４．３０８ｎＭ、及び８．８６ｎＭであった（図１４）。
【0143】
方法
患者細胞株
実施例１と同様に皮膚生検から線維芽細胞株及び健常対照株を樹立した。２つのＧＣＤＨ欠損線維芽細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した（カタログＩＤ：ＧＭ１６３９３及びＧＭ１６３９４）。
患者細胞株
実施例１と同様に皮膚生検から線維芽細胞株及び健常対照株を樹立した。２つのＧＣＤＨ欠損線維芽細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した（カタログＩＤ：ＧＭ１６３９３及びＧＭ１６３９４）。
【0144】
細胞培養
全てのヒト患者及び対照の線維芽細胞、マウス上皮線維芽細胞（３Ｔ３ Ｊ２）及びＨｅｐＧ２細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ－１０５０００６４）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－１５１４０１２２）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－４１９６５０３９）中において、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。約７５～８０％のコンフルエントに達した時点で細胞を分割した。
全てのヒト患者及び対照の線維芽細胞、マウス上皮線維芽細胞（３Ｔ３ Ｊ２）及びＨｅｐＧ２細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ－１０５０００６４）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－１５１４０１２２）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－４１９６５０３９）中において、３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。約７５～８０％のコンフルエントに達した時点で細胞を分割した。
【0145】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の設計
ＡＡＳＳ（α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素）を標的とするＡＯＮ ２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）ケミストリーを有するＡＯＮを設計し、商業的に合成した。ＡＯＮは、
－ ＭＯＥ４（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ７である－配列番号３２）；
－ ＭＯＥ６（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ８である－配列番号３３）；
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ７（配列番号４０）
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ８（配列番号４１）
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ９（配列番号４２）
を含む。
ＡＡＳＳ（α－アミノアジピン酸セミアルデヒド合成酵素）を標的とするＡＯＮ ２’－Ｏ－メトキシ－エチル（ＭＯＥ）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）ケミストリーを有するＡＯＮを設計し、商業的に合成した。ＡＯＮは、
－ ＭＯＥ４（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ４であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ７である－配列番号３２）；
－ ＭＯＥ６（ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ６であり、２０ｍｅｒの形態である、すなわち、ＭＯＥケミストリーにおけるＡＯＮ８である－配列番号３３）；
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ７（配列番号４０）
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ８（配列番号４１）
－ ＭＯＥケミストリーにおけるＭＯＥ９（配列番号４２）
を含む。
【0146】
線維芽細胞株へのＡＯＮ処理
実施例１と同様にＡＯＮ処理を行った。
実施例１と同様にＡＯＮ処理を行った。
【0147】
ＨｅｐＧ２及び３Ｔ３ Ｊ２細胞株の逆トランスフェクション
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地と共にトランスフェクション試薬としてリポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ｌ３０００００１）を用いた。細胞をカウントし、６ウェルプレート当たり５×１０５個の密度で線維芽細胞成長培地（１．６ｍＬ）中に回収した。２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中６μＬのリポフェクタミン、及び２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中所望の濃度のＡＯＮを調製し、リポフェクタミン及びＡＯＮの両方を混合し、１５分間インキュベートした。次の工程では、細胞及びＡＯＮを混合し、製造業者の指示に従って２４時間トランスフェクションを行った。各実験につき、リポフェクタミンのみで処理した細胞株、すなわちモック対照、いかなるｍＲＮＡにも結合しないスクランブル配列を有するＡＯＮで処理した患者細胞株、及び線維芽細胞成長培地のみで処理した細胞株、すなわちブランク対照の３つの対照を使用した。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地と共にトランスフェクション試薬としてリポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ｌ３０００００１）を用いた。細胞をカウントし、６ウェルプレート当たり５×１０５個の密度で線維芽細胞成長培地（１．６ｍＬ）中に回収した。２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中６μＬのリポフェクタミン、及び２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中所望の濃度のＡＯＮを調製し、リポフェクタミン及びＡＯＮの両方を混合し、１５分間インキュベートした。次の工程では、細胞及びＡＯＮを混合し、製造業者の指示に従って２４時間トランスフェクションを行った。各実験につき、リポフェクタミンのみで処理した細胞株、すなわちモック対照、いかなるｍＲＮＡにも結合しないスクランブル配列を有するＡＯＮで処理した患者細胞株、及び線維芽細胞成長培地のみで処理した細胞株、すなわちブランク対照の３つの対照を使用した。
【0148】
ＲＮＡの抽出
Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ－ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ－７４１３４）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡの完全性を評価し、ＲＮＡ品質管理のためのＲＩＮ（ＲＮＡ完全性番号）スコアを決定した。ＲＮＡの純度が良好なサンプルのみを研究に含めた。
Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ－ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ－７４１３４）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡの完全性を評価し、ＲＮＡ品質管理のためのＲＩＮ（ＲＮＡ完全性番号）スコアを決定した。ＲＮＡの純度が良好なサンプルのみを研究に含めた。
【0149】
ＲＴ－ＰＣＲのためのｃＤＮＡ合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－１１７５６０５０）を用いて、製造業者の指示に従って、５００ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－１１７５６０５０）を用いて、製造業者の指示に従って、５００ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。
【0150】
定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－４３６８５７７）を用いて定量リアルタイムＰＣＲ解析を行った。
ヒトＡＡＳＳ及びＧＡＰＤＨ並びにマウスＡａｓｓ及びＨｐｒｔ１遺伝子に最適化したプライマーを以下に列挙する。実施例１に記載の通り定量リアルタイムＰＣＲを行うために、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＡＡＳＳ／Ａａｓｓ発現レベルを正規化するために、内因性対照又は参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ／Ｈｐｒｔ１を用いてΔΔＣｔ法によって相対定量を測定した。各サンプルを少なくとも３回試験した。
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－４３６８５７７）を用いて定量リアルタイムＰＣＲ解析を行った。
ヒトＡＡＳＳ及びＧＡＰＤＨ並びにマウスＡａｓｓ及びＨｐｒｔ１遺伝子に最適化したプライマーを以下に列挙する。実施例１に記載の通り定量リアルタイムＰＣＲを行うために、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＡＡＳＳ／Ａａｓｓ発現レベルを正規化するために、内因性対照又は参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ／Ｈｐｒｔ１を用いてΔΔＣｔ法によって相対定量を測定した。各サンプルを少なくとも３回試験した。
【0151】
【表4】
【0152】
質量分析による代謝物分析のための細胞の収集及び調製
接着細胞を収集し、実施例１に記載の通り代謝物分析用に調製した。
接着細胞を収集し、実施例１に記載の通り代謝物分析用に調製した。
【0153】
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるＡＡＳＡの分析
実施例１に記載の通り、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってＡＡＳＡを分析した。
実施例１に記載の通り、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってＡＡＳＡを分析した。
【0154】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いたグルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）の分析
酢酸アンモニウム、ギ酸、及びアセトニトリルは、ＨＰＬＣグレードのものであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。非標識内部標準物質であるＣ５ＤＣ（純度９８％）は、ＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。
酢酸アンモニウム、ギ酸、及びアセトニトリルは、ＨＰＬＣグレードのものであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。非標識内部標準物質であるＣ５ＤＣ（純度９８％）は、ＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。
【0155】
グルタリルカルニチンのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ質量分析計に接続したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）－質量分析計（ＭＳ）を用いることによって、グルタリルカルニチンの定量を行った。１０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％ギ酸の移動相Ａ及び９０％アセトニトリルの移動相Ｂを用い、流速５００ｕＬ／分でＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム１．７μｍにおいて５０μＭの未標識Ｃ５ＤＣ ５μＬを分析した。以下のパラメーターを用いて、ポジティブイオンモードで多重反応モニタリングによりＣ５ＤＣを検出した：Ｃ５ＤＣｍ／ｚ ２７６．２＞８４．９（コーン電圧＝３０Ｖ、コリジョン電圧２０Ｖ）。
Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ質量分析計に接続したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）－質量分析計（ＭＳ）を用いることによって、グルタリルカルニチンの定量を行った。１０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％ギ酸の移動相Ａ及び９０％アセトニトリルの移動相Ｂを用い、流速５００ｕＬ／分でＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム１．７μｍにおいて５０μＭの未標識Ｃ５ＤＣ ５μＬを分析した。以下のパラメーターを用いて、ポジティブイオンモードで多重反応モニタリングによりＣ５ＤＣを検出した：Ｃ５ＤＣｍ／ｚ ２７６．２＞８４．９（コーン電圧＝３０Ｖ、コリジョン電圧２０Ｖ）。
【図1】
【図2(a)】
【図2(b)】
【図2(c)】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図4(a)】
【図4(b)】
【図5】
【図6(a)】
【図6(b)】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】