特表 2024-504388 抗４－１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-31

(54)【発明の名称】抗４－１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20240124BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240124BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240124BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22 ZNA

C07K16/46

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023544437

(86)(22)【出願日】2022-01-21

(85)【翻訳文提出日】2023-09-15

(86)【国際出願番号】 KR2022001083

(87)【国際公開番号】W WO2022158889

(87)【国際公開日】2022-07-28

(31)【優先権主張番号】10-2021-0010077

(32)【優先日】2021-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500309919

【氏名又は名称】ユーハン・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】パク，ジュヨン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ソンヒョン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ユンヒ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウォンテ

【テーマコード（参考）】

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CE12

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA41

4H045DA76

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、特定の無機塩を含む酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いてアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法を提供する。本発明の精製方法は、インタクト型の抗体の溶出を増加させることによって、インタクト型の抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を、高純度かつ高収率で提供することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法であって、
（ａ）抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株の培養上清を濾過して粗抗体を含有する濾液を得る工程；
（ｂ）前記濾液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードする工程；および
（ｃ）ＣａＣｌ_２を含有する酢酸ナトリウム緩衝液を用いて工程（ｂ）のカラムから抗体を溶出する工程を含み、
前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖が、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の重鎖と、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域と；配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域とを含む抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ
とを含み、
前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖を含む、方法。

【請求項2】

前記抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖が、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度が、３０～５００ｍＭである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度が、７５～１２５ｍＭである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度が、２０～１００ｍＭである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨが、ｐＨ３．５～ｐＨ４．０である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度が、７５～１２５ｍＭであり、前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度が、２０～１００ｍＭである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨが、ｐＨ３．５～ｐＨ４．０である、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法に関する。より具体的には、本発明は、特定の無機塩を含む酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いてアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

４-１ＢＢタンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞と獲得免疫細胞の両方の免疫細胞の活性化後に発現される共刺激分子である。４-１ＢＢは、様々な免疫細胞の活性の調節に重要な役割を果たしている。４-１ＢＢアゴニストは、免疫細胞の増殖と生存、サイトカインの分泌、およびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞溶解活性を増強する。したがって、４-１ＢＢは、がん免疫学の標的分子として有望である可能性がある。抗４-１ＢＢ抗体は、抗腫瘍効果を有するものの、臨床応用において重度の肝毒性を引き起こすことが認められた。

【0003】

ＨＥＲ２は、細胞表面に存在する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、がん細胞の増殖と浸潤、血管新生などを誘導する。

【0004】

２種以上の抗原を標的とする多重特異性抗体は、モノクローナル抗体に比べて、優れた治療効果を有する新薬として期待されている。がん細胞上に存在する抗原と免疫細胞上に存在する抗原の２種の抗原を認識できる多重特異性抗体は、より強力ながん特異的免疫応答を誘導することができる。本出願人は、４-１ＢＢとＨＥＲ２の両方に特異的に結合する様々な抗体、すなわち、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を開発した（国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００９８７１号）。これらの抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体は、ＨＥＲ２発現細胞の存在下でのみ４-１ＢＢシグナル伝達を活性化し、強力な免疫細胞を増強する。したがって、これらの抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を介して特異的な免疫応答を誘導することから、これらの抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を使用することにより、４-１ＢＢモノクローナル抗体と比較して、肝毒性をはるかに低くく抑えられることが期待される。国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００９８７１号は、参照により本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００９８７１号の開示に従って、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞を培養し、この抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体産生細胞から抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を単離しようとする際に、得られる抗体の大部分が凝集体の形態で存在するという問題に気付いた。本発明者らは、インタクト型の抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の純度を高めることができる精製方法を開発するために、種々の研究を行った。その結果、特定の無機塩を含む酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、インタクト型の抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を、高純度かつ高収率に得ることができることを見出した。

【0006】

したがって、本発明の目的は、特定の無機塩を含む酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いてアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様によれば、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法であって、（ａ）抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株の培養上清を濾過して粗抗体を含有する濾液を得る工程；（ｂ）前記濾液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードする工程；および（ｃ）ＣａＣｌ_２を含有する酢酸ナトリウム緩衝液を用いて工程（ｂ）のカラムから抗体を溶出する工程を含む、方法が提供される。

【0008】

本発明の精製方法において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の重鎖と、（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域と；配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域とを含む抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖとを含み、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖を含む。

【0009】

一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸配列からなっていてもよく；前記抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列からなっていてもよい。別の一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含んでいてもよい。さらに別の一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含んでいてもよい。さらに別の一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列からなっていてもよい。

【0010】

本発明の精製方法において、前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度は、３０～５００ｍＭであってもよく、好ましくは７５～１２５ｍＭであってもよい。また、前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、２０～１００ｍＭであってもよい。さらに、前記酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．５～ｐＨ４．０であってもよい。

【発明の効果】

【0011】

本発明に従って、特定の無機塩、すなわちＣａＣｌ_２を含む酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、インタクト型の抗体の溶出を顕著に増加させることができ、これによって、インタクト型の抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を、高純度かつ高収率で提供することができる。したがって、本発明の精製方法は、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を高純度かつ高収率で提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製方法であって、（ａ）抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株の培養上清を濾過して粗抗体を含有する濾液を得る工程；（ｂ）前記濾液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードする工程；および（ｃ）ＣａＣｌ_２を含有する酢酸ナトリウム緩衝液を用いて工程（ｂ）のカラムから抗体を溶出する工程を含む、方法を提供する。

【0013】

本発明の精製方法において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体は重鎖と軽鎖からなり、国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００９８７１号の開示に従って製造することができる。具体的には、本発明の精製方法において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の重鎖と、（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域と；配列番号５のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域とを含む抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）とを含み、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列からなる抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖を含む。

【0014】

一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸配列からなっていてもよく；前記抗４-１ＢＢ抗体の重鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列からなっていてもよい。別の一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含んでいてもよい。例えば、前記抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖは、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸が順に（すなわち、Ｎ’→Ｃ’に）連結されているポリペプチドであってもよい。

【0015】

一実施形態において、前記抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるリンカーをさらに含んでいてもよい。例えば、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖は、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸が順に（すなわち、Ｎ’→Ｃ’に）連結されているポリペプチド、すなわち、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。

【0016】

本発明の精製方法は、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株の培養上清を濾過して粗抗体を含有する濾液を得る工程［工程（ａ）］を含む。抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株は、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドと、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドとがそれぞれ組み込まれたプラスミドでトランスフェクションされた細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であってもよい。このトランスフェクションされた細胞は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００９８７１号の開示に従って得ることができる。このトランスフェクションされた細胞は、生物工学分野で通常用いられる培地を用いて常法に従って培養してもよい。培養上清は、例えば、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株の培養物を遠心分離することにより得ることができる。濾過は、通常の無菌濾過、例えば、０．２μｍのメンブレンフィルターを用いた無菌濾過により行ってもよい。上記のようにして得られる粗抗体含有濾液には、抗体凝集体が約４０～４５％含まれている。

【0017】

本発明の精製方法は、工程（ａ）で得られた濾液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードする工程［工程（ｂ）］を含む。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、様々なアガロース系樹脂の使用を含む。樹脂としては、公知のアガロース系樹脂、例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ^ＴＭ ＬＸ（Ｃｙｔｉｖａ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ社）、Ｐｒａｅｓｔｏ^ＴＭ ｊｅｔｔｅｄ Ａ５０（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等、好ましくはＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ社）のアフィニティークロマトグラフィー樹脂を用いてもよい。例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ＰｒｉｓｍＡ（Ｃｙｔｉｖａ社）樹脂を充填したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムへの、工程（ａ）で得られた濾液のロードは、常法に従って行ってもよい。例えば、濾液は、樹脂１ｍｌ当たり２０～４０ｍｇの割合でロードしてもよいが、これに限定されない。

【0018】

本発明の精製方法は、ＣａＣｌ_２を含有する酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いて、工程（ｂ）のカラムから抗体（すなわち、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体）を溶出する工程［工程（ｃ）］を含む。前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度は、好ましくは３０～５００ｍＭであってもよく、より好ましくは５０～５００ｍＭであってもよく、さらに好ましくは７５～１２５ｍＭであってもよく、特に好ましくは約１００ｍＭであってもよい。前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、好ましくは２０～１００ｍＭであってもよい。本発明の一実施形態において、前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度は、７５～１２５ｍＭであってもよく、前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、２０～１００ｍＭであってもよい。

【0019】

前記酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ３．５～ｐＨ４．０であってもよく、より好ましくは約ｐＨ３．７であってもよい。本発明の一実施形態において、前記酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度は、７５～１２５ｍＭであってもよく、前記酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、２０～１００ｍＭであってもよく、前記酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．５～ｐＨ４．０であってもよい。

【0020】

本発明による精製方法の一実施形態において、前記酢酸ナトリウム緩衝液は、約１００ｍＭのＣａＣｌ_２を含有し、約ｐＨ３．７のｐＨを有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液であってもよい。

【0021】

本発明による精製方法の別の一実施形態では、前記酢酸ナトリウム緩衝液は、約１００ｍＭのＣａＣｌ_２を含有し、約ｐＨ３．７のｐＨを有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液であってもよい。

【0022】

本発明の精製方法により得られる抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体は、通常の方法によるウイルス不活化処理および中和処理を行うことによって、工程（ｃ）の溶出液から抗体含有溶液の形態で単離してもよい。ウイルス不活化処理は、例えば、ｐＨを３．４～３．６に調整することによって行ってもよく、中和は、例えば、１Ｍトロメタミン溶液を使用することによって行ってもよいが、これらに限定されない。必要に応じて、工程（ｃ）の工程を行った後、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上のクロマトグラフィーをさらに実施してもよい。

【0023】

以下、製造例および実施例を参照することにより本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの製造例および実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0024】

製造例：抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の製造
国際特許出願第ＰＣＴ/ＫＲ２０２０/００９８７１号に開示された方法に従って、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を以下のように製造した。
（１）抗４-１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体
イムノチューブを用いた４-１ＢＢに対するファージライブラリーパニングによって、スクリーニングを実施した。標的分子に対するファージライブラリー（ＫＢｉｏ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ＣＵＲＥＢＩＯから入手）のパニングでは、ヒト４-１ＢＢ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００１５５２．２）でコーティングされたイムノチューブを使用して、合計４回のパニングを実施した。

【0025】

３回のパニングによって得られた細菌コロニーを、９６ディープウェルプレートに入れたＳＢ-カルベニシリン（Ｂｉｏｍａｔｉｋ、カタログＮｏ．Ａ２３１１、５ｇ）中で、混濁するまで増殖させた後、１０^１１ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｋ－Ｂｉｏ Ｈｅａｌｔｈ）を各ウェルに添加した。穏やかに振盪（８０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間かけて感染させた後、７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、細胞を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。

【0026】

翌日、プレートを遠心分離し、ファージを含む上清を、３％（ｖ/ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）溶液でブロックした４-１ＢＢ抗原コーティングＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログＮｏ．１１９７３－ＭＭ０５）を添加した。プレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して結合活性を測定した。

【0027】

プラスミドのＤＮＡ配列決定のため、４-１ＢＢ特異的バインダーを増幅させた。軽鎖可変領域および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）の配列を分析して、固有の配列を同定し、配列多様性を調べた。アゴニスト活性の比較には、ＢＭＵＲ（ＢＭＳ社製Ｕｒｅｌｕｍａｂ、米国特許第７，２８８，６３８号）という名称で示される抗４-１ＢＢ抗体を使用した。その結果として得られた４-１ＢＢに対する全長ヒトモノクローナル抗体の配列を以下に示す。

【0028】

【表1】

【0029】

配列番号１３の（ＧＧＧＧＳ）_４をリンカーとして用いて、下記表２に示す（Ｎ’）－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－（Ｃ’）の構造を有する抗４-１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体を作製した。ジスルフィド架橋を形成することによってｓｃＦｖを安定化させるため、軽鎖可変領域の１０３位のアミノ酸残基「Ｇ」を「Ｃ」に置換し（配列番号４）、重鎖可変領域の４４位のアミノ酸残基「Ｇ」を「Ｃ」に置換した（配列番号８）。具体的には、配列番号４の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと、配列番号１３のリンカーをコードするＤＮＡと、配列番号８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡとが連結されたポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７）に挿入した。得られたベクターを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１３３）を用いて３７℃でＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２７）にトランスフェクションし、８日間培養した。培養上清を０．２μｍフィルターでろ過し、（Ｎ’）-ＶＬ－リンカー－ＶＨ－（Ｃ’）の構造を有する抗４-１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体を得た。

【0030】

【表2】

【0031】

（２）抗ＨＥＲ２抗体
抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体のＨＥＲ２標的部分として、トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；以下、「ＨＥＲ２（ＷＴ）」と呼ぶ；ＤｒｕｇＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＤＢ０００７２；ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体）の重鎖および軽鎖を使用した。ＨＥＲ２（ＷＴ）の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を以下の表３に示す。

【0032】

【表3】

【0033】

（３）抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株
上記（１）および（２）で得られた、抗４-１ＢＢ ｓｃＦｖ抗体とＨＥＲ２（ＷＴ）の重鎖および軽鎖を用いて、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合抗体（ｓｃＦｖ抗体断片をＩｇＧのＣ末端に融合させたもの）、すなわち、下記の表４に示す、配列番号１０からなる重鎖部分と配列番号１１からなる軽鎖部分を有する抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を製造した。

【0034】

具体的には、配列番号１２のＧＳリンカーをコードするＤＮＡセグメント２を、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖をコードするＤＮＡセグメント１（配列番号９）の末端に融合した後、抗４-１ＢＢ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡセグメント３を融合して、抗ＨＥＲ２／抗４-１ＢＢ二重特異性抗体の重鎖をコードするＤＮＡセグメント（配列番号１０）を作製し、このＤＮＡセグメントをプラスミド１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７）に挿入した。さらに、抗ＨＥＲ２／抗４-１ＢＢ二重特異性抗体の軽鎖をコードするＤＮＡセグメント４（配列番号１１）をプラスミド２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７）に挿入した。

【0035】

得られたプラスミド１とプラスミド２を、ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１３３）を使用してＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２７）にトランスフェクションした。具体的には、得られたプラスミド１（２５０μｇ）とプラスミド２（２５０μｇ）を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬（Ａ２９１２９）を含むＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭ ＳＦＭ（１２３０９－０５０）（８００μＬ）と混合し（最終量２０ｍＬ）、３分間静置した。トランスフェクションを行うため、得られた混合溶液と６×１０^６個のＥｘｐｉＣＨＯ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ａ２９１００－０１）に加えて、８％ＣＯ_２加湿振盪インキュベーター内において３７℃で培養した。１８時間培養後、１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １とＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ Ｆｅｅｄを加え、３７℃で４日間培養した。温度を３２℃に調整した後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ Ｆｅｅｄを添加し、８日間培養を継続した。

【0036】

【表4】

【0037】

（４）抗体発現のための流加培養
（３）で得られた抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を産生する細胞株を、グルタミンを含まないＡｃｔｉｐｒｏ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３１０３７．０２）で３日間培養した後、流加培養（作業量：７００ｍｌ/２０００ｍｌフラスコ、３７℃、５％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍ）を１４日間実施し、その際に、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ７ａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３１０２６．０１）/７ｂサプリメント（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３１０２７．０１ＫＲ）を１日おきに添加した。培養物を約３０００ｒｐｍで遠心分離して得られた培養上清を、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過して、粗抗体を含有する濾液を得た。

【0038】

実施例１：プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製
直径１．６ｃｍ、樹脂層高２０ｃｍのカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で平衡化した。製造例（４）で得られた粗抗体を含有する濾液を、樹脂１ｍＬ当たり３０ｍｇの割合でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードした。カラムを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、添加剤（ＣａＣｌ_２）を含む酢酸ナトリウム緩衝液または添加剤を含まない酢酸ナトリウム緩衝液を溶出緩衝液として用いて抗体を溶出した。溶出緩衝液中の添加剤の濃度および酢酸ナトリウムの濃度と、溶出緩衝液のｐＨを下記の表５に示す。

【0039】

以下の各溶出緩衝液を使用して得られたプールを、２８０ｎｍのＵＶで吸光度を測定することによって、抗体（すなわち、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体）の収率を分析し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を用いて高分子量凝集体の含有量（％）を測定することによって、抗体（すなわち、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体）の純度を分析した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる分析は、東ソー社製カラム（型番：ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷ_ＸＬ）を用いて行った。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を１ｍｌ／分の流速でカラムに流して平衡化した後、各溶出画分（１００μｇ）を注入して純度分析を行った。純度は、インタクト型の純度（％）を示し、以下の式により算出した。
純度（％）＝１００－高分子量凝集体の含有量（％）

【0040】

上述のように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製を行うことによって得られた結果を以下の表５に示す。

【0041】

【表5】

【0042】

上記表５の結果から分かるように、添加剤としてＣａＣｌ_２を含む酢酸ナトリウム緩衝液を使用すると、比較的に高い収率で、抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の純度を顕著に高めることができる。また、表５の結果から、酢酸ナトリウム緩衝液中のＣａＣｌ_２の濃度は、３０～５００ｍＭの範囲が好ましく、５０～５００ｍＭの範囲がより好ましく、７５～１２５ｍＭの範囲がさらに好ましく、約１００ｍＭが特に好ましいことが分かる。また、酢酸ナトリウム緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、２０～１００ｍＭの範囲であることが好ましいことが分かる。

【0043】

比較例１：添加剤としてＮａＣｌを使用した抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製
添加剤としてのＮａＣｌを１０００ｍＭの濃度で含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）を用いて、実施例１と同様の方法でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。実施例１と同様の方法で、溶出プールの純度および収率を分析した。その結果、添加剤を含まない１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．７）を用いた精製に比べて、純度は相対的に上昇したが、収率は２９．３％に大幅に低下した。

【0044】

上記の結果を踏まえて、酢酸ナトリウムと添加剤（ＮａＣｌ）の濃度を下げることにより純度および収率を評価した。すなわち、添加剤としてのＮａＣｌを１００ｍＭの濃度で含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）を用いて、実施例１と同様の方法でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。実施例１と同様の方法で、溶出プールの純度および収率を分析した。その結果、純度が７４．２％に大幅に低下した。

【0045】

したがって、ＮａＣｌを含む酢酸ナトリウム緩衝液の使用は、純度および収率の点で、改善された精製効果を示さなかった。

【0046】

比較例２：添加剤としてＭｇＣｌ _２ を使用した抗４-１ＢＢ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の精製
添加剤としてのＭｇＣｌ_２を１０００ｍＭの濃度で含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）を用いて、実施例１と同様の方法でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。実施例１と同様の方法で、溶出プールの純度および収率を分析した。その結果、添加剤を含まない１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．７）を用いた精製に比べて、純度は相対的に上昇したが、収率は４３．９％に大幅に低下した。

【0047】

上記の結果を踏まえて、酢酸ナトリウムと添加剤（ＭｇＣｌ_２）の濃度を下げることにより純度および収率を評価した。すなわち、添加剤としてのＭｇＣｌ_２を１００ｍＭの濃度で含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）を用いて、実施例１と同様の方法でプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。実施例１と同様の方法で、溶出プールの純度および収率を分析した。その結果、高濃度の酢酸ナトリウム／添加剤を用いた精製に比べて、純度は相対的に上昇したが、収率はわずか６６．７％であった。

【0048】

したがって、ＭｇＣｌ_２を含む酢酸ナトリウム緩衝液の使用は、収率の点で、改善された精製効果を示さなかった。

【配列表】

2024504388000001.app

【国際調査報告】