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特表2024-504408光増感剤ユニットを含むバイオコンジュゲート、その調製方法、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-31
(54)【発明の名称】光増感剤ユニットを含むバイオコンジュゲート、その調製方法、及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 41/00 20200101AFI20240124BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240124BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240124BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240124BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20240124BHJP
A61K 31/555 20060101ALI20240124BHJP
C07D 487/22 20060101ALI20240124BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240124BHJP
【ＦＩ】
A61K41/00
A61P17/00
A61P27/02
A61K9/08
A61K47/62
A61K31/555
C07D487/22
C07K14/435 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023544663
(86)(22)【出願日】2022-01-28
(85)【翻訳文提出日】2023-07-24
(86)【国際出願番号】 EP2022052075
(87)【国際公開番号】W WO2022162160
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】21305116.2
(32)【優先日】2021-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514058706
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ボルドー
(71)【出願人】
【識別番号】513277212
【氏名又は名称】アンスティチュ ポリテクニーク ドゥ ボルドー
(71)【出願人】
【識別番号】519208029
【氏名又は名称】セントレ ナシオナル ドゥ ラ レシェルシェ サイエンティフィク
(71)【出願人】
【識別番号】523279970
【氏名又は名称】ユニヴェルシダッド・オウトノマ・デ・マドリッド
(74)【代理人】
【識別番号】100098394
【弁理士】
【氏名又は名称】山川 茂樹
(72)【発明者】
【氏名】ルコマンドー，セバスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ガランジェ，エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】イブラヒモワ，ヴサラ
(72)【発明者】
【氏名】トーレス－セバダ，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス－デルガード，ホセ・アントニオ
【テーマコード（参考）】
4C050
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C050PA12
4C076AA11
4C076BB11
4C076BB24
4C076CC10
4C076CC18
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF11
4C076FF34
4C084AA11
4C084MA05
4C084MA16
4C084MA58
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZA89
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA39
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA16
4C086MA58
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZA89
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は光増感剤単位、特にフタロシアニン単位、及びそれと共役したエラスチン様ポリペプチドを含むバイオコンジュゲートに関する。前記エラスチン様ポリペプチドでは、式Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇを有する単量体単位が少なくとも１つ発生し、式中のＰはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また、Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表すこと、又はＸａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表すことのいずれかである。このバイオコンジュゲートは、光線力学療法により疾患を治療するために特に有用であることが判明している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
光増感剤単位及び光増感剤単位と共役したエラスチン様ポリペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、前記エラスチン様ポリペプチドでは、下記式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ発生し：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ （Ａ）
式中、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、前記Ｒ’は上記で定義した通りであること
のいずれかである、
バイオコンジュゲート。
【請求項2】
前記Ｒ’はＣ１‐Ｃ３アルキル基を表す、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項3】
式（Ａ）中、‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３はメチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１はメチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表すこと
のいずれかである、
請求項１又は請求項２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項4】
前記光増感剤は、フタロシアニン、ポルフィリン、ボディピー系光増感剤、及びメチレンブルーから成る群より選択される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項5】
前記光増感剤単位はリンカーにより前記エラスチン様ポリペプチドに共有結合している、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項6】
前記エラスチン様ポリペプチドはそのＮ末端で前記光増感剤単位と共役している、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項7】
前記エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｂ）を有し：Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、ｘは１から２００の整数であり、
Ｚは１から２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、
Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、
Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、
Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、式中のｚ及びＲ’は請求項１又は２で定義した通りであり、Ｘａａ３では、‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比は０／１から１０／１となっている、
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項8】
式（Ｂ）において、Ｚはアミノ酸配列ＭＷを有するペプチドフラグメントを表す、請求項７に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項9】
前記エラスチン様ポリペプチドは以下の配列：ＭＧＴＥＬＡＡＡＳＥＦＴＨＭＷ［ＶＰＧＭＧ］２０（配列番号９）、ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］５（配列番号１０）、ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号１１）、ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１５（配列番号１２）、及びＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］２０（配列番号１３）から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項10】
前記光増感剤単位は、下記一般式（Ｖ’）を有するフタロシアニン単位であり：Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、その各々は：水素原子、‐ＣＯＯＨ、‐Ｃ≡Ｃ‐ＣＯＯＨ、‐ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ７、‐ＳＲ７、又は‐ＮＲ７Ｒ８を表し、式中のＲ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、又は１つ以上のＲ９基により任意に置換したフェニル基を表し、Ｒ９基はそれぞれ独立して、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ１０、‐ＳＲ１０、及びＮＲ１１Ｒ１２から成る群より選択され、式中のＲ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、又は炭素原子数が１から１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
あるいは、Ｒ３とＲ４の対及びＲ５とＲ６の対の一方又は両方は、隣接する炭素原子に結合し、それらが結合している環と共に芳香族縮合環系を形成し、
Ｒ１は、前記フタロシアニン単位と前記エラスチン様ポリペプチドとの結合に関与する共有結合を表す、
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項11】
前記増感剤単位はベルテポルフィンである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項12】
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲートを調製する方法であって、以下の工程：‐ 上記式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中のＰ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は請求項１から請求項３のいずれか１項で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾し、末端アルキン基を誘導する工程、
‐ 光増感剤分子を官能化し、アジド基を誘導する工程、及び
‐ このように修飾したエラスチン様ポリペプチドとこのように官能化した光増感剤との間で、ヒュスゲン銅（Ｉ）で触媒したアルキン‐アジド環化付加反応を行う工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項13】
光線力学療法による疾患の治療、特に皮膚疾患又は眼疾患の治療に使用するための請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項14】
請求項１３に記載の使用のためのバイオコンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートを、治療対象の被験体の身体の標的部位に注射により投与する、バイオコンジュゲート。
【請求項15】
薬学的に許容可能な賦形剤中に請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項16】
被験体への非経口投与に適している形態である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療法、特に光線力学療法の分野にある。より詳細には、本発明は、光増感剤及び生体高分子担体含むバイオコンジュゲートに関する。バイオコンジュゲートは光線力学療法、特に皮膚疾患、眼疾患、又は光線力学療法が適用され得る治療を必要とする任意の疾患に、光増感成分として特に有用であることが分かっている。本発明はまた、このようなバイオコンジュゲートを調製する方法、並びに光線力学療法治療により疾患を治療するためのその使用に関する。本発明は、薬学的に許容可能な賦形剤中にそのようなバイオコンジュゲートを含む医薬組成物を別の目的とする。
【背景技術】
【0002】
光線力学療法（ＰＤＴ）は、選択性の高い魅力的な非侵襲的疾患治療の代替法である。中でも、光線力学療法は、外科手術、化学療法、及び放射線療法のような従来の方法と比較して副作用が少ないことから、癌の治療に使用することが可能である。
光線力学療法には３種の相互作用成分：光増感剤と呼ばれる光活性化合物、適切な波長の光、及び酸素が必要である。これらの成分は、個々には無毒であるが、組み合わせて使用すると、一重項酸素（１Ｏ２）のような毒性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）が発生する：腫瘍部位に蓄積した光増感剤が、適切な波長、通常６００～８００ｎｍの光により選択的に活性化された結果、活性化した光増感剤の励起三重項状態から近傍の分子状酸素にエネルギー又は電子が移動する。発生した活性酸素種は、周囲の微小環境に多くの酸化的損傷を与える。これは癌療法という特定のケースにおいて、二重の効果をもたらす。悪性細胞の代謝機能が損なわれると、これらの細胞はアポトーシス及び／又はネクローシスを起こす。光線力学療法による抗癌治療後に起こる小規模な炎症は、悪性細胞に対する天然免疫系を活性化し、腫瘍を完全に破壊し、腫瘍の回復リスクを抑制することも分かっている。
光線力学療法には３種の相互作用成分：光増感剤と呼ばれる光活性化合物、適切な波長の光、及び酸素が必要である。これらの成分は、個々には無毒であるが、組み合わせて使用すると、一重項酸素（１Ｏ２）のような毒性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）が発生する：腫瘍部位に蓄積した光増感剤が、適切な波長、通常６００～８００ｎｍの光により選択的に活性化された結果、活性化した光増感剤の励起三重項状態から近傍の分子状酸素にエネルギー又は電子が移動する。発生した活性酸素種は、周囲の微小環境に多くの酸化的損傷を与える。これは癌療法という特定のケースにおいて、二重の効果をもたらす。悪性細胞の代謝機能が損なわれると、これらの細胞はアポトーシス及び／又はネクローシスを起こす。光線力学療法による抗癌治療後に起こる小規模な炎症は、悪性細胞に対する天然免疫系を活性化し、腫瘍を完全に破壊し、腫瘍の回復リスクを抑制することも分かっている。
【0003】
光線力学療法の成功は主に、低暗所毒性と共に、使用の光増感剤の光物理学的特性、特にその消光係数（ε）、一重項酸素（１Ｏ２）発生量子収率（ΦΔ）等、及び標的部位におけるその効果的な蓄積に依存する。
先行技術、特にＭｕｋｅｒｊｉ Ｒａｔｕｌらの論文、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、２０１５年、第７９号：ｐ．７９‐８７では、腫瘍部位に、放射性ペイロードを有し、特異的光増感剤であるクロリン‐ｅ６とＮ末端で共役した周期的システイン残基を有する組換えエラスチン様ポリペプチド（ｃＥＬＰ）を含むバイオポリマーから安定なハイドロゲルデポを形成することが提案されている。この論文の目的は、放射性ペイロードを有するｃＥＬＰの腫瘍部位での保持を促進し、放射性核種療法を実施することである。これは、バイオポリマーを体内に注入し、光増感剤の光線力学的刺激を行うことにより達成され、そうすることでｃＥＬＰのシステイン残基のチオール基のジスルフィド架橋をその場で誘導し、この架橋によりバイオポリマーは安定なハイドロゲル中で安定化する。このような方法は、その後の放射性核種療法の効率を向上させる。しかし、この方法は、形成されたハイドロゲル中に光増感剤が固定化されることから、光線力学療法による疾患治療には最適ではない。
先行技術、特にＭｕｋｅｒｊｉ Ｒａｔｕｌらの論文、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、２０１５年、第７９号：ｐ．７９‐８７では、腫瘍部位に、放射性ペイロードを有し、特異的光増感剤であるクロリン‐ｅ６とＮ末端で共役した周期的システイン残基を有する組換えエラスチン様ポリペプチド（ｃＥＬＰ）を含むバイオポリマーから安定なハイドロゲルデポを形成することが提案されている。この論文の目的は、放射性ペイロードを有するｃＥＬＰの腫瘍部位での保持を促進し、放射性核種療法を実施することである。これは、バイオポリマーを体内に注入し、光増感剤の光線力学的刺激を行うことにより達成され、そうすることでｃＥＬＰのシステイン残基のチオール基のジスルフィド架橋をその場で誘導し、この架橋によりバイオポリマーは安定なハイドロゲル中で安定化する。このような方法は、その後の放射性核種療法の効率を向上させる。しかし、この方法は、形成されたハイドロゲル中に光増感剤が固定化されることから、光線力学療法による疾患治療には最適ではない。
【0004】
先行技術により提案された光増感剤の中で、第二世代の光増感剤グループであるフタロシアニンは非常に強力であると考えられている。フタロシアニンはポルフィリンの合成誘導体であり、４つのピロールサブユニットから成り、その各々は追加のベンゾ環と融合し、窒素原子を介して連結している。その４つのピロールサブユニットは、光線力学療法に理想的な化合物としての光物理学的特性をいくつかもたらす。特に、その４つのピロールサブユニットは６７０～７７０ｎｍに強い吸収を示す堅固で非常に万能な分子であり、一重項酸素を大量に生成する。Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ、Ｐｈｏｔｏｃｙａｎｉｎｅ、Ｐｃ４、及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどの、いくつかのフタロシアニン系光増感剤は臨床使用が承認されているか、又は臨床試験段階が進行中である。
【0005】
これらの光線治療剤の更なる開発は、分子レベルでもナノサイズの製剤としても、現在強い関心を集めている。
フタロシアニン分子は、その内因的な疎水性により、生理的媒体中で凝集する傾向が強い。この種の光増感剤の全身投与を可能にするため、先行技術では、親水性フタロシアニンの誘導体を開発することが提案されている。しかし、フタロシアニン骨格の制御不能な凝集傾向、並びにその低いモル質量により、この種の光増感剤の生体内分布が制御されず、癌の治療に光線力学療法を適用する特定の場合において腫瘍部位での光増感剤の蓄積が少なくなる。
フタロシアニン分子は、その内因的な疎水性により、生理的媒体中で凝集する傾向が強い。この種の光増感剤の全身投与を可能にするため、先行技術では、親水性フタロシアニンの誘導体を開発することが提案されている。しかし、フタロシアニン骨格の制御不能な凝集傾向、並びにその低いモル質量により、この種の光増感剤の生体内分布が制御されず、癌の治療に光線力学療法を適用する特定の場合において腫瘍部位での光増感剤の蓄積が少なくなる。
【0006】
複数の研究、特にｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｌら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２０１９年、第１４号（１１）、ｐ．１００７‐１０１７、又はＩｂｒａｈｉｍｏｖａら、「Ｎａｎｏｓｃａｌｅ」、２０１７年、第９号（３１）、ｐ．１１１８０‐１１１８６では更に、光増感剤の高分子複合体又はナノ担体は、生理的液体中での溶解度及び血漿半減期を増加させ、速い腎クリアランスを回避することにより、それらの生体分布、生物学的利用能、及び治療成績が向上することが示されている。しかしながら、これまでに提案されている光増感剤送達システムの効率は、特に光増感剤がフタロシアニンである場合には、まだ十分に満足できるものではない。本発明は、先行技術により提案されたフタロシアニン、より一般的には光増感剤の送達システムの欠点、特に上述の欠点を克服することを目的とする。これらの欠点は、光線力学療法治療、特にフタロシアニンに基づく治療の臨床効果の改善を強化するような方法で光増感剤を標的部位に効率的に送達するための新たな技術を提案することで克服する。
【0007】
本発明者らは、光増感剤と、特定のポリペプチド、より正確には少なくとも１つの特定の硫黄含有アミノ酸残基（より正確には、側鎖がチオエーテル基を有するアミノ酸残基）を提供し、より低い臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）相転移挙動を示す組換えエラスチン様ポリペプチドとを共有結合させることにより、この目的及びそれ以上の目的を達成できることを発見した。得られた低ＬＣＳＴの疎水性バイオコンジュゲートは、生理的体温で自発的に自己凝集し、粒子になる。しかし、そのバイオコンジュゲートは、光線力学療法プロセスの光照射工程で光増感剤が活性化される際に光増感剤により生成された活性酸素種と全く同じ活性酸素種により酸化されると、有利にも、生理的体温で可溶性／不安定な親水性化合物に変化する。その後、硫黄含有アミノ酸残基のチオエーテル基のスルホキシドへの特異的酸化により、ＬＣＳＴを示すバイオコンジュゲートの親水性が生理的体温付近からはるかに高い値まで上昇し、それにより、生理的体温で粒子の分解が誘発される。このように分解したバイオコンジュゲートは、遊離解離形態で、より容易に高密な組織中に拡散することが可能になる。それにより有利にも、効率的な第２の光照射工程を実施することが可能になる。その後、光増感剤のこのような再活性化は、深部で疾患組織をかなり損傷させ、治療の療法的利益を最大化する可能性がある。
【発明の概要】
【0008】
第１態様によれば、本発明は、光増感剤ユニット及びそれと共役したエラスチン様ポリペプチドに関する。前記エラスチン様ポリペプチドでは、下記式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ発生する：
Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ （Ａ）
式中、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は上記で定義した通りであること
のいずれかである。
Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ （Ａ）
式中、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を表し、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は上記で定義した通りであること
のいずれかである。
【0009】
本発明の特定の実施形態では、光増感剤は、ポルフィリン、フタロシアニン、ボディピー系光増感剤、及びメチレンブルーから成る群より選択される。
光増感剤はベルテポルフィンとすることが可能である。
本発明の特定の実施形態では、光増感剤ユニットはリンカーによりエラスチン様ポリペプチドに共有結合する。
エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｂ）を有してもよい：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、ｘは１～２００の整数であり、Ｚは１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｘａａ３では、‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比が０／１～１０／１となっている。
光増感剤はベルテポルフィンとすることが可能である。
本発明の特定の実施形態では、光増感剤ユニットはリンカーによりエラスチン様ポリペプチドに共有結合する。
エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｂ）を有してもよい：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、ｘは１～２００の整数であり、Ｚは１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｘａａ３では、‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比が０／１～１０／１となっている。
【0010】
本発明の別の態様は、本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製する方法に関する。この方法は以下の工程を含む：
‐ 上記式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中のＰ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は上記で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾し、末端アルキン基を誘導する工程、
‐ 光増感剤分子を官能化し、アジド基を誘導する工程、
‐ このように修飾したエラスチン様ポリペプチドとこのように官能化した光増感剤との間で、ヒュスゲン銅（Ｉ）で触媒したアルキン‐アジド環化付加反応を行う工程。
‐ 上記式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中のＰ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は上記で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾し、末端アルキン基を誘導する工程、
‐ 光増感剤分子を官能化し、アジド基を誘導する工程、
‐ このように修飾したエラスチン様ポリペプチドとこのように官能化した光増感剤との間で、ヒュスゲン銅（Ｉ）で触媒したアルキン‐アジド環化付加反応を行う工程。
【0011】
本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製する代替法は、光増感剤分子を官能化し、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル基を誘導する工程、及び前記活性化した基を式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中のＰ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は上記で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端アミン基に直接カップリングする工程を含む。本発明の別の態様は、光線力学療法による疾患の治療、特に皮膚疾患、眼疾患、又は光線力学療法が有用であることが証明され得る治療を必要とする任意の疾患の治療ための、本発明に従ったバイオコンジュゲートの使用である。本発明のバイオコンジュゲートは特に癌治療に用いてもよい。
本発明の第４態様は、薬学的に許容される賦形剤中に本発明に従ったバイオコンジュゲートを含む医薬組成物である。
本発明の第４態様は、薬学的に許容される賦形剤中に本発明に従ったバイオコンジュゲートを含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明に従ったバイオコンジュゲートを実施する光線力学療法により癌を治療する方法における異なる工程を示す概略図である。
【図2】本発明に従ったバイオコンジュゲート（ＴＴ１‐ＥＬＰ）、及びメチオニル残基の硫黄原子を化学酸化した後のその誘導体（対照化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ））の特性分析の結果を示す図である。Ａ）ＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）との重ね合わせたマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトル。比較のためにＥＬＰのスペクトルも示している。Ｂ）ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）分析。Ｃ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＴＴ１‐ＥＬＰのサイズ排除クロマトグラム（屈折率（ＲＩ）検出、及び６０７ｎｍでのＵＶ検出）。Ｄ）ＤＭＳＯ中のＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）のサイズ排除クロマトグラム（ＲＩ検出及び６０７ｎｍでのＵＶ検出）。Ｅ）リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中、２５℃でのＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）との重なった吸収スペクトル。
【図3】赤色光の光照射後の、本発明に従ったバイオコンジュゲート（ＴＴ１‐ＥＬＰ）の特性分析結果を示す図である。Ａ）５分、１０分、１５分、２０分、及び３０分間の光照射後の、積み重ねたＴＴ１‐ＥＬＰの１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ジュウテリウム（Ｄ２Ｏ）、室温、２００ＭＨｚ）。Ｂ）光照射前後のＴＴ１‐ＥＬＰ（ＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘ）のＤＭＳＯ中におけるサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）（ＲＩ検出）。Ｃ）光照射前（ＴＴ１‐ＥＬＰ）と光照射後（ＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘ）におけるバイオコンジュゲートのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析（クマシーブルー染色）。
【図4】動的光散乱により測定した、本発明に従ったバイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰのサイズ分布（強度）を表すグラフである。Ａ）２０℃及び３７℃での光照射前。Ｂ）３７℃での光照射後。
【図5】本発明に従ったバイオコンジュゲート（ＴＴ１‐ＥＬＰ）についての、Ａ）Ｃｏｒｄｏｕａｎ（１６５°６５７ｎｍ、周囲温度）により得た動的光散乱；Ｂ）ＰＢＳ中、１５℃の高配向熱分解黒鉛（ＨＯＰＧ）基板上の温度制御高速原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（液体）画像の結果を示す図である。
【図6】本発明に従ったバイオコンジュゲート（ＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］及びＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］）の特性分析結果を示す図である。Ａ）２０℃、Ｄ２Ｏ中の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。Ｂ）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。
【図7】ａ／本発明に従ったバイオコンジュゲート（ＶＰ‐ＥＬＰ）及びｂ／メチオニル残基の硫黄原子を化学酸化した後のその誘導体（対照化合物ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ））のマトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトルを示す図である。
【図8】ＤＭＳＯ中の本発明に従ったバイオコンジュゲートＶＰ‐ＥＬＰのサイズ排除クロマトグラム（屈折率（ＲＩ）検出及び６０７ｎｍでのＵＶ検出）を示す図である。
【図9】ａ／Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中３μＭのベルテポルフィン（ＶＰ）の吸収スペクトル、及びｂ／エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）と、４℃のＰＢＳ緩衝液中３ｍｇ／ｍｌの、このエラスチン様ポリペプチド（ＶＰ‐ＥＬＰ）及びメチオニル残基の硫黄原子を化学酸化した後のその誘導体（対照化合物ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ））を含む本発明に従ったバイオコンジュゲートとの重なった吸収スペクトルを示す図である。
【図10】ａ／勾配冷却及び勾配加熱中での、本発明に従ったバイオコンジュゲートＶＰ‐ＥＬＰの２ｍｇ／ｍｌ溶液の７５０ｎｍにおける吸光度、ｂ／勾配冷却及び勾配加熱中での、メチオニル残基の硫黄原子の化学酸化後のその誘導体（対照化合物ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ））の２ｍｇ／ｍｌ溶液の７５０ｎｍにおける吸光度、及びｃ／このバイオコンジュゲート及びその誘導体の質量濃度に対する曇点温度（ＴＣＰ）、を示す図である。
【図11】ａ／異なる時点（光照射前、光照射から５分、１０分、及び１５分後）での、ＰＢＳ ｐＨ７．４中、１５℃における、本発明に従ったバイオコンジュゲートＶＰ‐ＥＬＰ存在下での一重項酸素センサーグリーン（ＳＯＳＧ）（１Ｏ２センサー）蛍光スペクトル；ｂ／異なる時点（光照射前、光照射から１０分及び１５分後）での、ＰＢＳ ｐＨ７．４中、１５℃における、エラスチン様ポリペプチドＥＬＰ存在下でのＳＯＳＧ蛍光スペクトル；ｃ／ＥＬＰ及びＶＰ‐ＥＬＰのレーザー光照射の異なる時点におけるＳＯＳＧ蛍光強度、を示す図である。
【図12】光照射前（「照射なし」）、１０分の照射（「１０分照射」）、３０分の照射（「３０分照射」）後、勾配加熱での、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中、１ｍｇ／ｍｌの本発明に従ったバイオコンジュゲートＶＰ‐ＥＬＰについて、及びメチオニル残基の硫黄原子を化学酸化した後のその誘導体（対照化合物ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ））（「対照」）について、温度の関数としてのＺ平均を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明に従ったバイオコンジュゲートは、直接に、又はリンカーを介して互いに共役した、即ち安定な共有結合により互いに結合した以下のものから成る：
‐ 光増感剤ユニット、及び
‐ 下記式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ、好ましくは数個、特に１～２００個発生するエラスチン様ポリペプチド：
Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ （Ａ）
式中、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は硫黄含有アミノ酸残基を表し、前記硫黄含有アミノ酸残基は、任意に式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有するように修飾した天然又は非天然アミノ酸残基であってもよく、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は、飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は硫黄含有アミノ酸残基を表し、前記硫黄含有アミノ酸残基は任意に式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有するように修飾した天然又は非天然アミノ酸残基であってもよく、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は、飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと
のいずれかである。
‐ 光増感剤ユニット、及び
‐ 下記式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ、好ましくは数個、特に１～２００個発生するエラスチン様ポリペプチド：
Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ （Ａ）
式中、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、また：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は硫黄含有アミノ酸残基を表し、前記硫黄含有アミノ酸残基は、任意に式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有するように修飾した天然又は非天然アミノ酸残基であってもよく、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は、飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１は硫黄含有アミノ酸残基を表し、前記硫黄含有アミノ酸残基は任意に式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有するように修飾した天然又は非天然アミノ酸残基であってもよく、式中のｚは１又は２であり、Ｒ’は、飽和及び／又は不飽和の、芳香族又は非芳香族の、任意に、１つ以上のヘテロ原子、及び／又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の基又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む基で置換、任意に中断される直鎖状、分岐状、及び／又は環状のＣ１‐Ｃ２２炭化水素ラジカルを表すこと
のいずれかである。
【0014】
組換えエラスチン様ポリペプチドは、エラスチンの可溶性前駆体であるトロポエラスチンの疎水性ドメインから誘導する人工タンパク質ポリマーである。組換えエラスチン様ポリペプチドは、アミノ酸配列‐Ｘａａ４‐Ｐｒｏ‐Ｘａａ５‐Ｘａａ６‐Ｇｌｙ‐（配列番号１）を有する反復ペンタペプチドフラグメントを含み、式中、Ｘａａ５はグリシル残基又はアラニル残基を示し、Ｘａａ４及びＸａａ６はそれぞれ、プロリル残基又はその誘導体を除く任意の天然又は非天然アミノ酸残基であってよい可変アミノ酸残基を示し、Ｘａａ４及びＸａａ６の少なくとも一方はバリル残基である。
【0015】
自然から着想を得たこれらの遺伝子操作型組換えエラスチン様ポリペプチドは、その制御された分子量、生体適合性、生分解性、非免疫原性、及び刺激応答特性により、生物医学的用途、特に薬物送達用途のための注目すべき高性能ポリペプチドである。また、エラスチン様ポリペプチドは、その分子組成を正確に制御することにより、コスト効果のある方法で大量生産できる。
本発明のエラスチン様ポリペプチドは、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する少なくとも１つの硫黄含有アミノ酸残基を含む。前記エラスチン様ポリペプチドは、好ましくはポリペプチド骨格に沿って規則的に分布しているそのような残基を好ましくは数個、特にそのような残基を２～２００個含む。
本明細書において、慣例により、語句「硫黄含有アミノ酸残基」は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を指定するために使用する。式中のｚ及びＲ’は本明細書において定義した通りである。
本発明のエラスチン様ポリペプチドは、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する少なくとも１つの硫黄含有アミノ酸残基を含む。前記エラスチン様ポリペプチドは、好ましくはポリペプチド骨格に沿って規則的に分布しているそのような残基を好ましくは数個、特にそのような残基を２～２００個含む。
本明細書において、慣例により、語句「硫黄含有アミノ酸残基」は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を指定するために使用する。式中のｚ及びＲ’は本明細書において定義した通りである。
【0016】
用語「光増感剤」は、本明細書では、従来の方法で、光照射により促進する電子励起の際に獲得されるエネルギーを、一重項酸素発生及び他の活性酸素種（ＲＯＳ）をもたらす周囲の酸素分子に伝達する能力を有する化合物を指定するために使用する。
好ましくは、光増感剤は、フタロシアニン、ポルフィリン、ボディピー系光増感剤、及びメチレンブルーから成る群より選択される。本発明の特定の実施形態では、光増感剤はベンゾポルフィリン、又はその誘導体、例えばベルテポルフィンである。
本発明の好ましい実施形態では、Ｘａａ１の側鎖又はＸａａ３の側鎖において、Ｒ’は直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３アルキル基、例えばメチル基を表す。
好ましくは、光増感剤は、フタロシアニン、ポルフィリン、ボディピー系光増感剤、及びメチレンブルーから成る群より選択される。本発明の特定の実施形態では、光増感剤はベンゾポルフィリン、又はその誘導体、例えばベルテポルフィンである。
本発明の好ましい実施形態では、Ｘａａ１の側鎖又はＸａａ３の側鎖において、Ｒ’は直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３アルキル基、例えばメチル基を表す。
【0017】
式（Ａ）中、Ｘａａ１及びＸａａ３は以下のようであってもよい：
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は、メチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表し、前記アルキルは、好ましくは直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３直鎖又は分枝アルキル基、例えばメチル基であり、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１はメチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表し、前記アルキルは、好ましくは直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３直鎖状又は分枝アルキル基、例えばメチル基である。
‐ Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ３は、メチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表し、前記アルキルは、好ましくは直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３直鎖又は分枝アルキル基、例えばメチル基であり、又は
‐ Ｘａａ３はバリル残基を表し、Ｘａａ１はメチオニル残基、Ｓ‐アルキル‐ホモシステイニル残基、及びＳ‐アルキル‐システイニル残基から成る群より選択されるアミノ酸残基を表し、前記アルキルは、好ましくは直鎖又は分枝アルキル基、特にＣ１‐Ｃ３直鎖状又は分枝アルキル基、例えばメチル基である。
【0018】
本発明の特定の実施形態では、式（Ａ）中、Ｘａａ１はバリル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基を表し、Ｘａａ３はメチオニル残基を表す。次に、本発明のエラスチン様ポリペプチドは、下記化学式（Ｉ）に対応するアミノ酸配列ＶＰＧＭＧ（配列番号２）を有する単量体単位が少なくとも１つ、好ましくは数個、特に１～２００個発生する：
【0019】
【0020】
より一般的には、本発明に従ったエラスチン様ポリペプチドは好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する単位の１～２００個の繰り返しから成るペプチドフラグメントを含む：
ＶＰＸａａ２ＸａａＧ（配列番号３）
式中、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を示し、Ｘａａはプロリル残基を除く任意のアミノ酸残基であってよい可変アミノ酸残基を示し、但し、少なくとも１つのＸａａ残基は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基であり、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、特にメチオニル残基である。
エラスチン様ポリペプチド骨格中に少なくとも１つ、好ましくは数個の、好ましくは周期的に間隔を置いたこのような硫黄含有アミノ酸残基（単数又は複数）が存在するため、本発明のバイオコンジュゲートは非常に有利にも、温度応答性及び一重項酸素応答性の両方を有し、このことは光線力学療法治療を行う医療用途に特に有用である。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは、非置換システイン残基、即ち、チオール‐ＳＨ基を有するシステイン残基を含まない。
ＶＰＸａａ２ＸａａＧ（配列番号３）
式中、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を示し、Ｘａａはプロリル残基を除く任意のアミノ酸残基であってよい可変アミノ酸残基を示し、但し、少なくとも１つのＸａａ残基は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基であり、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、特にメチオニル残基である。
エラスチン様ポリペプチド骨格中に少なくとも１つ、好ましくは数個の、好ましくは周期的に間隔を置いたこのような硫黄含有アミノ酸残基（単数又は複数）が存在するため、本発明のバイオコンジュゲートは非常に有利にも、温度応答性及び一重項酸素応答性の両方を有し、このことは光線力学療法治療を行う医療用途に特に有用である。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは、非置換システイン残基、即ち、チオール‐ＳＨ基を有するシステイン残基を含まない。
【0021】
本発明のバイオコンジュゲートを光線力学療法プロセスにおいて使用する場合、エラスチン様ポリペプチドは、標的部位、特に腫瘍部位にバイオコンジュゲートの光増感剤ユニットを運ぶための担体として作用する。
本発明のバイオコンジュゲートは生理的体温では切断されず、エラスチン様ポリペプチドは、特に標的部位に到達する前に光増感剤の無秩序な蓄積及び漏出を防止することにより、標的部位での光増感剤濃度を確実に定量的に制御する。
本発明のバイオコンジュゲートは、治療被験体の体内で自己凝集して粒子になる。光増感単位の光照射を行うと、バイオコンジュゲートは体内で生成した一重項酸素により酸化する。より正確には、バイオコンジュゲートの１つ又は数個の硫黄含有アミノ酸残基（単数又は複数）、特にメチオニル残基（単数又は複数）の疎水性チオエーテル基（単数又は複数）は酸化しやすく、従って活性酸素種に対して感受性が高く、酸化して親水性スルホキシド基（単数又は複数）になり、この酸化反応はバイオコンジュゲートの光増感剤ユニット自体により触媒される。
本発明のバイオコンジュゲートは生理的体温では切断されず、エラスチン様ポリペプチドは、特に標的部位に到達する前に光増感剤の無秩序な蓄積及び漏出を防止することにより、標的部位での光増感剤濃度を確実に定量的に制御する。
本発明のバイオコンジュゲートは、治療被験体の体内で自己凝集して粒子になる。光増感単位の光照射を行うと、バイオコンジュゲートは体内で生成した一重項酸素により酸化する。より正確には、バイオコンジュゲートの１つ又は数個の硫黄含有アミノ酸残基（単数又は複数）、特にメチオニル残基（単数又は複数）の疎水性チオエーテル基（単数又は複数）は酸化しやすく、従って活性酸素種に対して感受性が高く、酸化して親水性スルホキシド基（単数又は複数）になり、この酸化反応はバイオコンジュゲートの光増感剤ユニット自体により触媒される。
【0022】
本発明は、本発明に従った特定のエラスチン様ポリペプチドの逆相転移挙動を利用する。実際、これらのポリペプチドは、低い臨界溶液温度挙動：所与の濃度の臨界凝集温度（曇点、一般にＴｔ又はＴＣＰと表記する）より低い：を示す。これらのポリペプチドの鎖は可溶性であり、大部分が内因的に無秩序であるが、Ｔｔより高い温度では疎水的に崩壊する。酸化に感受性があるため、硫黄含有アミノ酸残基のチオエーテル基は容易にスルホキシドへと酸化され、疎水性硫黄含有アミノ酸を含むＴｔの低いポリペプチドはＴｔの高い親水性スルホキシド誘導体になる。
従って、光照射後、有利にも、バイオコンジュゲートの転移温度が生理的体温付近からはるかに高い値まで上昇することが観察される。この上昇は、治療した被験体の体内に形成されたバイオコンジュゲート粒子の分解を誘発する。粒子の分解により放出された個々のバイオコンジュゲート分子はその後、組織、特に腫瘍内に深く拡散することができ、それにより標的部位への２回目の光照射工程の効率が向上するという仮説を立てることが可能となる。
従って、光照射後、有利にも、バイオコンジュゲートの転移温度が生理的体温付近からはるかに高い値まで上昇することが観察される。この上昇は、治療した被験体の体内に形成されたバイオコンジュゲート粒子の分解を誘発する。粒子の分解により放出された個々のバイオコンジュゲート分子はその後、組織、特に腫瘍内に深く拡散することができ、それにより標的部位への２回目の光照射工程の効率が向上するという仮説を立てることが可能となる。
【0023】
更に、バイオコンジュゲート粒子の分解は局所的な低体温によっても誘発できる。
本発明のバイオコンジュゲートは光線療法期間が長くても安定なままであることも本発明者らは観察している。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｂ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、Ｚは１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｘａａ３では、［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比は０／１～１０／１であり、式中のｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、好ましくは３０～６０、より好ましくは３５～４５、例えば約４０の整数となっている。
本発明のバイオコンジュゲートは光線療法期間が長くても安定なままであることも本発明者らは観察している。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｂ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、Ｚは１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、式中のｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｘａａ３では、［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比は０／１～１０／１であり、式中のｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、好ましくは３０～６０、より好ましくは３５～４５、例えば約４０の整数となっている。
【0024】
［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中の、Ｘａａ３位におけるバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比は、１／１～５／１の間、より詳細には２／１～４／１の間であってよい。モル比は例えば３／１である。
特に、式（Ｂ）では、Ｘａａ３はメチオニル残基及びバリル残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表してもよく、Ｘａａ３では、［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／メチオニル残基のモル比は０／１～１０／１、特に１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明の特定の実施形態では、式（Ｂ）において、Ｚは、アミノ酸配列ＭＷを含むペプチドフラグメントを示す。そして、このアミノ酸配列はＺのＣ末端に位置することが好ましい。
Ｚは、アミノ酸配列ＭＷを有するペプチドフラグメントから構成してもよい。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｃ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］ｙ （Ｃ）
式中、Ｚ、Ｖ、Ｐ、Ｇは上記で定義した通りであり、
Ｘａａ３は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を示し、ｚ及びＲ’は、上記で定義した通りであり、特にメチオニル残基であり、
ｙは２～２０、特に５～１５の整数である。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは、下記一般化学式（Ｉａ）を有する：
特に、式（Ｂ）では、Ｘａａ３はメチオニル残基及びバリル残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表してもよく、Ｘａａ３では、［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／メチオニル残基のモル比は０／１～１０／１、特に１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明の特定の実施形態では、式（Ｂ）において、Ｚは、アミノ酸配列ＭＷを含むペプチドフラグメントを示す。そして、このアミノ酸配列はＺのＣ末端に位置することが好ましい。
Ｚは、アミノ酸配列ＭＷを有するペプチドフラグメントから構成してもよい。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは下記式（Ｃ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］ｙ （Ｃ）
式中、Ｚ、Ｖ、Ｐ、Ｇは上記で定義した通りであり、
Ｘａａ３は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を示し、ｚ及びＲ’は、上記で定義した通りであり、特にメチオニル残基であり、
ｙは２～２０、特に５～１５の整数である。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは、下記一般化学式（Ｉａ）を有する：
【0025】
【0026】
式中、ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、Ｒは‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を表し、Ｒでは、式（Ｉａ）のエラスチン様ポリペプチド中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’モル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明の特定の実施形態では、式（Ｉａ）において、Ｒは、‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及びＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を表し、Ｒでは、式（Ｉａ）のエラスチン様ポリペプチド中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明の特定の実施形態では、式（Ｉａ）において、Ｒは、‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及びＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を表し、Ｒでは、式（Ｉａ）のエラスチン様ポリペプチド中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
【0027】
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドは以下の配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する：
‐ ＭＧＴＥＬＡＡＡＳＥＦＴＨＭＷ［ＶＰＧＸａａ３Ｇ］２０（配列番号４）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］５（配列番号５）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号６）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］１５（配列番号７）、及び
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］２０（配列番号８）
配列中、Ｘａａ３は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を示し、ｚ及びＲ’は、上記で定義した通りである。
本発明のエラスチン様ポリペプチドは例えば、以下の配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を有してもよい：
‐ ＭＧＴＥＬＡＡＡＳＥＦＴＨＭＷ［ＶＰＧＭＧ］２０（配列番号９）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］５（配列番号１０）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号１１）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１５（配列番号１２）、及び
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］２０（配列番号１３）
‐ ＭＧＴＥＬＡＡＡＳＥＦＴＨＭＷ［ＶＰＧＸａａ３Ｇ］２０（配列番号４）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］５（配列番号５）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号６）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］１５（配列番号７）、及び
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＸａａ３Ｇ（ＶＰＧＶＧ）２］２０（配列番号８）
配列中、Ｘａａ３は、式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基を示し、ｚ及びＲ’は、上記で定義した通りである。
本発明のエラスチン様ポリペプチドは例えば、以下の配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を有してもよい：
‐ ＭＧＴＥＬＡＡＡＳＥＦＴＨＭＷ［ＶＰＧＭＧ］２０（配列番号９）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］５（配列番号１０）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号１１）、
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１５（配列番号１２）、及び
‐ ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］２０（配列番号１３）
【0028】
これらのポリペプチドのいくつかは、特に国際公開第２０１７／０２１３３４号又は欧州特許第３ ７５９ １５３号明細書に記載されている。
特に有利なエラスチン様ポリペプチドは、下記化学式（Ｉｂ）を有する上記配列番号１１のアミノ酸配列のポリペプチドである：
特に有利なエラスチン様ポリペプチドは、下記化学式（Ｉｂ）を有する上記配列番号１１のアミノ酸配列のポリペプチドである：
【0029】
【0030】
前記ポリペプチドは、そのＮ末端又はＣ末端で光増感剤ユニットと共役している。
別の特に有利なエラスチン様ポリペプチドは、下記化学式（Ｉｃ）を有する、上記配列番号１３のアミノ酸配列のポリペプチドである：
別の特に有利なエラスチン様ポリペプチドは、下記化学式（Ｉｃ）を有する、上記配列番号１３のアミノ酸配列のポリペプチドである：
【0031】
【0032】
前記ポリペプチドは、そのＮ末端又はＣ末端で光増感剤ユニットと共役している。
本発明の特定の実施形態では、光増感剤ユニットはリンカーによりエラスチン様ポリペプチドに共有結合している。
リンカーは本明細書では、本発明のバイオコンジュゲートの光増感剤ユニットとエラスチン様ポリペプチドとを共有結合させることが可能な化学構造体と定義している。
リンカーは、一方では光増感剤ユニット、特にその芳香環に共有結合し、他方ではエラスチン様ポリペプチドのＮ末端アミン基に共有結合したカルボニル基であってもよい。
リンカーは他に一般式（ＩＩ）を有してもよい：
本発明の特定の実施形態では、光増感剤ユニットはリンカーによりエラスチン様ポリペプチドに共有結合している。
リンカーは本明細書では、本発明のバイオコンジュゲートの光増感剤ユニットとエラスチン様ポリペプチドとを共有結合させることが可能な化学構造体と定義している。
リンカーは、一方では光増感剤ユニット、特にその芳香環に共有結合し、他方ではエラスチン様ポリペプチドのＮ末端アミン基に共有結合したカルボニル基であってもよい。
リンカーは他に一般式（ＩＩ）を有してもよい：
【0033】
【0034】
ｎは１～６、好ましくは２の整数である。
エラスチン様ポリペプチドは、そのＣ末端で光増感剤ユニットと共役してもよい。
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドはそのＮ末端で光増感剤ユニットと共役している。
本発明に従った光増感剤はメチレンブルーであってもよい。
そうでなければ、ホウ素‐ジピロメテン（ボディピー）系の光増感剤であってもよい。
【0035】
下記式（ＩＩＩ）の核を有するこのような化合物は当業者に周知である：
【0036】
【0037】
そうでなければ、本発明に従った光増感剤はポルフィリン、例えば式（ＩＶ）のポルフィリン、又はその任意の誘導体であってもよい：
【0038】
【0039】
好ましくは、光増感剤はベンゾポルフィリン又はその誘導体である。
本発明の特定の実施形態では、光増感剤はベルテポルフィンである。本明細書中で使用している用語ベルテポルフィンは、下記式（Ｘａ）及び（Ｘｂ）の各ベルテポルフィン異性体、並びにこれらの異性体の任意の混合物を包含する：
本発明の特定の実施形態では、光増感剤はベルテポルフィンである。本明細書中で使用している用語ベルテポルフィンは、下記式（Ｘａ）及び（Ｘｂ）の各ベルテポルフィン異性体、並びにこれらの異性体の任意の混合物を包含する：
【0040】
【0041】
ベルテポルフィンは、癌の治療に好適かつ重要な光物理学的特性を有する光増感剤である。
本発明に従ったバイオコンジュゲートのベルテポルフィン単位は、亜鉛原子などの金属原子、又はメタロイド原子と錯形成することが可能である。本明細書においてメタロイドとは、金属ではないが、１つ以上の関連する点において金属に匹敵する特性を有する化学元素を意味する。メタロイドの例としては、とりわけケイ素及びゲルマニウムが挙げられる。
本発明の他の特定の実施形態では、光増感剤はフタロシアニンである。フタロシアニン類は、下記式（Ｖ）の構造を共有する一群の化学化合物である：
本発明に従ったバイオコンジュゲートのベルテポルフィン単位は、亜鉛原子などの金属原子、又はメタロイド原子と錯形成することが可能である。本明細書においてメタロイドとは、金属ではないが、１つ以上の関連する点において金属に匹敵する特性を有する化学元素を意味する。メタロイドの例としては、とりわけケイ素及びゲルマニウムが挙げられる。
本発明の他の特定の実施形態では、光増感剤はフタロシアニンである。フタロシアニン類は、下記式（Ｖ）の構造を共有する一群の化学化合物である：
【0042】
【0043】
本発明に従ったバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は好ましくは、周辺置換フタロシアニン単位である。「周辺置換」とは、本明細書では、フタロシアニン構造の６員環のうち少なくとも１つが水素原子以外の置換基で置換されることを意味する。好ましくは、フタロシアニン構造の６員環のうち２つ、３つ、又は４つ全てが水素原子以外の少なくとも１つの置換基を有する。
周辺置換したフタロシアニンは、特に、多くの溶媒において未置換フタロシアニンより溶解度が高いという利点を有しており、このことは、特に、本発明のバイオコンジュゲートの調製の容易さに関して有用であることを証明している。
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は軸方向に置換できても置換できなくてもよい。「軸方向に置換した」フタロシアニン単位は本明細書において、フタロシアニンにより錯形成した金属又はメタロイド上のフタロシアニン構造体の平面に対して軸方向に位置する置換基（単数又は複数）を有するフタロシアニン単位と定義する。
周辺置換したフタロシアニンは、特に、多くの溶媒において未置換フタロシアニンより溶解度が高いという利点を有しており、このことは、特に、本発明のバイオコンジュゲートの調製の容易さに関して有用であることを証明している。
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は軸方向に置換できても置換できなくてもよい。「軸方向に置換した」フタロシアニン単位は本明細書において、フタロシアニンにより錯形成した金属又はメタロイド上のフタロシアニン構造体の平面に対して軸方向に位置する置換基（単数又は複数）を有するフタロシアニン単位と定義する。
【0044】
本発明の特定の実施形態では、フタロシアニン単位は亜鉛‐フタロシアニン単位である。
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は、下記一般式（Ｖ’）を有してもよい：
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は、下記一般式（Ｖ’）を有してもよい：
【0045】
【0046】
式中、Ｍは金属原子又はメタロイド原子を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、その各々は：水素原子、‐ＣＯＯＨ、‐Ｃ≡Ｃ‐ＣＯＯＨ、‐ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ７、‐ＳＲ７、又は‐ＮＲ７Ｒ８を表し、式中のＲ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、又は１つ以上のＲ９基により任意に置換したフェニル基を表し、Ｒ９基はそれぞれ独立して、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ１０、‐ＳＲ１０、及びＮＲ１１Ｒ１２から成る群より選択され、式中のＲ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、又は炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
あるいは、Ｒ３とＲ４の対及びＲ５とＲ６の対の一方又は両方は、隣接する炭素原子に結合し、それらが結合している環と共に芳香族縮合環系を形成し、
Ｒ１は、前記フタロシアニン単位と前記エラスチン様ポリペプチドとの、直接又はリンカーを介した結合に関与する共有結合を表す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、その各々は：水素原子、‐ＣＯＯＨ、‐Ｃ≡Ｃ‐ＣＯＯＨ、‐ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ７、‐ＳＲ７、又は‐ＮＲ７Ｒ８を表し、式中のＲ７及びＲ８は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、又は１つ以上のＲ９基により任意に置換したフェニル基を表し、Ｒ９基はそれぞれ独立して、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ１０、‐ＳＲ１０、及びＮＲ１１Ｒ１２から成る群より選択され、式中のＲ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は同一であっても異なっていてもよく、その各々は水素原子、又は炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基を表し、
あるいは、Ｒ３とＲ４の対及びＲ５とＲ６の対の一方又は両方は、隣接する炭素原子に結合し、それらが結合している環と共に芳香族縮合環系を形成し、
Ｒ１は、前記フタロシアニン単位と前記エラスチン様ポリペプチドとの、直接又はリンカーを介した結合に関与する共有結合を表す。
【0047】
上記の一般式（Ｖ’）、並びに本明細書に記載のフタロシアニンを表す他の全ての一般式は、その分子の全ての可能な位置異性体、又はその混合物を包含する。用語「位置異性体」とは、異なる位置に同じ官能基又は置換基を有する位置異性体を指す。
本明細書におけるメタロイドとは、金属ではないが、１つ以上の関連する点において金属に匹敵する特性を有する化学元素を意味する。メタロイドの例としては、とりわけケイ素及びゲルマニウムが挙げられる。
本発明の他の実施形態では、フタロシアニン単位は、下記式（Ｖ”）の遊離塩基形態を有してもよい：
本明細書におけるメタロイドとは、金属ではないが、１つ以上の関連する点において金属に匹敵する特性を有する化学元素を意味する。メタロイドの例としては、とりわけケイ素及びゲルマニウムが挙げられる。
本発明の他の実施形態では、フタロシアニン単位は、下記式（Ｖ”）の遊離塩基形態を有してもよい：
【0048】
【0049】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は上記で定義した通りである。
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は特に、下記一般式（Ｖ’ａ）を有してもよい：
本発明のバイオコンジュゲートのフタロシアニン単位は特に、下記一般式（Ｖ’ａ）を有してもよい：
【0050】
【0051】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は上記で定義した通りである。
式（Ｖ’）、（Ｖ”）及び（Ｖ’ａ）のフタロシアニン単位では、基Ｒ１及びＲ２は対応する６員環のうちの４つの位置のいずれかにおいて独立して位置していてもよい。同様に、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、フタロシアニン単位の対応する６員環の各環の４つの位置いずれかにおいて独立して位置していてもよい。
本発明の特に好ましい実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６基の少なくとも１つの基、好ましくは少なくとも２つの基は、直鎖又は分枝Ｃ１‐Ｃ１２アルキル基、好ましくはＣ４アルキル基、より好ましくはｔｅｒｔ‐ブチル基である。
特定の実施形態では、対応する６員環の各環の４つの位置いずれかにおいて独立して位置するＲ３及びＲ５基はｔｅｒｔ‐ブチル基であり、Ｒ４及びＲ６基は独立して、水素原子、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ７、‐ＳＲ７、又は‐ＮＲ７Ｒ８であり、式中のＲ７及びＲ８は上記で定義した通りである。
最も好ましくは、フタロシアニン単位は下記一般式（Ｖ’ｂ）を有する：
式（Ｖ’）、（Ｖ”）及び（Ｖ’ａ）のフタロシアニン単位では、基Ｒ１及びＲ２は対応する６員環のうちの４つの位置のいずれかにおいて独立して位置していてもよい。同様に、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、フタロシアニン単位の対応する６員環の各環の４つの位置いずれかにおいて独立して位置していてもよい。
本発明の特に好ましい実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６基の少なくとも１つの基、好ましくは少なくとも２つの基は、直鎖又は分枝Ｃ１‐Ｃ１２アルキル基、好ましくはＣ４アルキル基、より好ましくはｔｅｒｔ‐ブチル基である。
特定の実施形態では、対応する６員環の各環の４つの位置いずれかにおいて独立して位置するＲ３及びＲ５基はｔｅｒｔ‐ブチル基であり、Ｒ４及びＲ６基は独立して、水素原子、炭素原子数が１～１２個の直鎖もしくは分枝アルキル基、‐ＯＲ７、‐ＳＲ７、又は‐ＮＲ７Ｒ８であり、式中のＲ７及びＲ８は上記で定義した通りである。
最も好ましくは、フタロシアニン単位は下記一般式（Ｖ’ｂ）を有する：
【0052】
【0053】
式中、Ｒ１は上記で定義した通りである。
本発明の特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは下記一般式（ＶＩ）を有する：
本発明の特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは下記一般式（ＶＩ）を有する：
【0054】
【0055】
式中、「リンカー」はリンカー基を示し、
ＰＳは光増感剤ユニットを示し、
ｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’及びＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、ｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
ＰＳは光増感剤ユニットを示し、
ｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’及びＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、ｚ及びＲ’は上記で定義した通りであり、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
【0056】
本発明の好ましい実施形態では、式（ＶＩ）中、Ｒは、‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明に従ったバイオコンジュゲートは下記式（ＶＩ’）を有してもよい：
本発明に従ったバイオコンジュゲートは下記式（ＶＩ’）を有してもよい：
【0057】
Ｌｉｎｋｅｒ：リンカー
【0058】
式中、リンカー、Ｍ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は上記で定義した通りであり、
ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐ＣＨ３及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明のバイオコンジュゲートは特に下記一般式（ＶＩ”）を有してもよい：
ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐ＣＨ３及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
本発明のバイオコンジュゲートは特に下記一般式（ＶＩ”）を有してもよい：
【0059】
【0060】
式中、Ｍ、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｍ、及びｎは上記で定義した通りであり、ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数である。
本発明に従った特に有利なバイオコンジュゲートは下記一般式（ＶＩ”ａ）を有する：
本発明に従った特に有利なバイオコンジュゲートは下記一般式（ＶＩ”ａ）を有する：
【0061】
【0062】
式中、Ｒは上記で定義した通りであり、ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数である。
本発明のバイオコンジュゲートは他に下記式（ＶＩ’ｂ）を有してもよい：
本発明のバイオコンジュゲートは他に下記式（ＶＩ’ｂ）を有してもよい：
【0063】
【0064】
式中、Ｒは上記で定義した通りであり、ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数である。
式（ＶＩ”ａ）及び（ＶＩ’ｂ）のバイオコンジュゲートはいずれも、制御した方法で、かつ工業的規模で調製することが容易であるという利点がある。
本発明に従った他のバイオコンジュゲートはそれぞれ下記式（ＸＩａ）及び（ＸＩｂ）を有する：
式（ＶＩ”ａ）及び（ＶＩ’ｂ）のバイオコンジュゲートはいずれも、制御した方法で、かつ工業的規模で調製することが容易であるという利点がある。
本発明に従った他のバイオコンジュゲートはそれぞれ下記式（ＸＩａ）及び（ＸＩｂ）を有する：
【0065】
Ｌｉｎｋｅｒ：リンカー
【0066】
式中、「リンカー」は、光増感剤ユニットとエラスチン様ポリペプチドとの共有結合、又は光増感剤ユニットとエラスチン様ポリペプチドと共有結合している化学構造を示し、
ｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比が０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
特に、式（ＸＩａ）及び（ＸＩｂ）のこのようなバイオコンジュゲートの混合物は本発明の分野に該当する。
本発明のバイオコンジュゲートは特に、下記一般式（ＸＩ’）を有してもよい：
ｘは、１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数であり、
Ｒは‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及び‐ＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、バイオコンジュゲート中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比が０／１～１０／１、詳細には１／１～５／１、より詳細には２／１～４／１、例えば３／１となっている。
特に、式（ＸＩａ）及び（ＸＩｂ）のこのようなバイオコンジュゲートの混合物は本発明の分野に該当する。
本発明のバイオコンジュゲートは特に、下記一般式（ＸＩ’）を有してもよい：
【0067】
【0068】
式中、Ｒは上記で定義した通りであり、ｘは１～２００、詳細には１０～２００、より詳細には１５～８０、例えば４０、６０、又は８０の整数である。
特に、式（ＸＩ’ａ）と（ＸＩ’ｂ）とのこのようなバイオコンジュゲートの混合物は本発明の分野に該当する。
式（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、特に式（ＸＩ’ａ）、（ＸＩ’ｂ）のバイオコンジュゲートは特に調製が容易である。
より一般的には、本発明のバイオコンジュゲートは非免疫原性、生体適合性、及び生分解性である。
これらのバイオコンジュゲートは有利にも、再現可能な方法により、狭いモル質量分布で容易に生成できる。
本発明のバイオコンジュゲートは当業者に公知の任意の方法で調製してもよい。
好ましくは、光増感剤ユニット、例えば、ベルテポルフィン単位又はフタロシアニン単位は、直接に、又はリンカーを介して、１つ又は数個のアミド結合を介して、エラスチン様ポリペプチドに結合する。
特に、式（ＸＩ’ａ）と（ＸＩ’ｂ）とのこのようなバイオコンジュゲートの混合物は本発明の分野に該当する。
式（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、特に式（ＸＩ’ａ）、（ＸＩ’ｂ）のバイオコンジュゲートは特に調製が容易である。
より一般的には、本発明のバイオコンジュゲートは非免疫原性、生体適合性、及び生分解性である。
これらのバイオコンジュゲートは有利にも、再現可能な方法により、狭いモル質量分布で容易に生成できる。
本発明のバイオコンジュゲートは当業者に公知の任意の方法で調製してもよい。
好ましくは、光増感剤ユニット、例えば、ベルテポルフィン単位又はフタロシアニン単位は、直接に、又はリンカーを介して、１つ又は数個のアミド結合を介して、エラスチン様ポリペプチドに結合する。
【0069】
本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製するための第１の方法は以下の工程を含む：
‐ 式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中、Ｐ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は本明細書において上記で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾し、末端アルキン基を誘導する工程、
‐ 光増感剤分子、特にフタロシアニン、好ましくは周辺置換フタロシアニン、更に好ましくは亜鉛‐フタロシアニンを官能化し、アジド基を誘導する工程、
‐ このように修飾したエラスチン様ポリペプチドとこのように官能化した光増感剤との間で、ヒュスゲン銅（Ｉ）で触媒したアルキン‐アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を行う工程。
本発明に従った方法は更に、個々に、又は技術的に動作する各組み合わせにおいて提供する以下に記載の特徴の１つ以上に対応してもよい。
‐ 式（Ａ）：Ｘａａ１ＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ（Ａ）、式中、Ｐ、Ｇ、Ｘａａ１、Ｘａａ２、及びＸａａ３は本明細書において上記で定義した通りである：を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾し、末端アルキン基を誘導する工程、
‐ 光増感剤分子、特にフタロシアニン、好ましくは周辺置換フタロシアニン、更に好ましくは亜鉛‐フタロシアニンを官能化し、アジド基を誘導する工程、
‐ このように修飾したエラスチン様ポリペプチドとこのように官能化した光増感剤との間で、ヒュスゲン銅（Ｉ）で触媒したアルキン‐アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を行う工程。
本発明に従った方法は更に、個々に、又は技術的に動作する各組み合わせにおいて提供する以下に記載の特徴の１つ以上に対応してもよい。
【0070】
式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ、特にアミノ酸配列ＶＰＧＭＧ（配列番号２）が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチド、及びエラスチン様ポリペプチドを調製及び精製する方法は当業者に公知である。エラスチン様ポリペプチドは特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてエラスチン様ポリペプチドを組換え生成するための方法と共に、国際公開第２０１７／０２１３３４号に記載されている。
本発明の方法において提供するエラスチン様ポリペプチドは、前記バイオコンジュゲートのエラスチン様ポリペプチド部分に関し、本発明のバイオコンジュゲートについて上述した任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。
本発明の方法において使用するための特に好ましいエラスチン様ポリペプチドは、下記式（Ｂ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、ｘは１～２００の整数であり、
Ｚは、１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、
Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、
Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、
Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、
Ｘａａ３では、‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比が０／１～１０／１となっている。
エラスチン様ポリペプチドは特に、アミノ酸配列ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号１１）を有してもよい。
本発明の方法において提供するエラスチン様ポリペプチドは、前記バイオコンジュゲートのエラスチン様ポリペプチド部分に関し、本発明のバイオコンジュゲートについて上述した任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。
本発明の方法において使用するための特に好ましいエラスチン様ポリペプチドは、下記式（Ｂ）を有する：
Ｚ‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘ‐ＯＨ （Ｂ）
式中、ｘは１～２００の整数であり、
Ｚは、１～２０個のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントを表し、
Ｖはバリル残基を表し、Ｐはプロリル残基を表し、Ｇはグリシル残基を表し、
Ｘａａ２はグリシル残基又はアラニル残基を表し、
Ｘａａ３はバリル残基、及び式‐（ＣＨ２）ｚ‐Ｓ‐Ｒ’の側鎖を有する硫黄含有アミノ酸残基から成る群より選択される可変アミノ酸残基を表し、
Ｘａａ３では、‐［ＶＰＸａａ２Ｘａａ３Ｇ］ｘペプチドフラグメント中のバリル残基／硫黄含有アミノ酸残基のモル比が０／１～１０／１となっている。
エラスチン様ポリペプチドは特に、アミノ酸配列ＭＷ［ＶＰＧＶＧＶＰＧＭＧ（ＶＰＧＶＧ）２］１０（配列番号１１）を有してもよい。
【0071】
本発明の特定の実施形態では、エラスチン様ポリペプチドのＮ末端を修飾する工程は、前記エラスチン様ポリペプチドと下記一般式（ＶＩＩ）の化合物とを反応させることにより行う：
【0072】
【0073】
式中、エラスチン様ポリペプチドの末端窒素原子及び一般式（Ｖ）の化合物のカルボニル基の炭素原子が関与するアミド結合を形成するような条件下では、ｎは１～６、好ましくは２の整数である。
本発明の方法において特に有用な一般式（ＶＩＩ）の化合物は、下記式（ＶＩＩａ）の４‐ペンチン酸スクシンイミジルエステルである：
本発明の方法において特に有用な一般式（ＶＩＩ）の化合物は、下記式（ＶＩＩａ）の４‐ペンチン酸スクシンイミジルエステルである：
【0074】
【0075】
アミド化反応は、当業者に公知の任意の方法で実施してもよい。
例えば前記方法は、以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 第３級アミン、例えばＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 周囲温度；
‐ 数時間、例えば２～４８時間、好ましくは６～２４時間。
このようにして得られた修飾アルキン‐（エラスチン様ポリペプチド）は、任意の手段、例えば透析により反応媒体から回収してもよい。
本発明の方法において実施する光増感剤分子は、バイオコンジュゲートの光増感剤ユニットに関し、本発明のバイオコンジュゲートについて上述した任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。その分子は例えば、フタロシアニン、又はベルテポルフィンである。
例えば前記方法は、以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 第３級アミン、例えばＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 周囲温度；
‐ 数時間、例えば２～４８時間、好ましくは６～２４時間。
このようにして得られた修飾アルキン‐（エラスチン様ポリペプチド）は、任意の手段、例えば透析により反応媒体から回収してもよい。
本発明の方法において実施する光増感剤分子は、バイオコンジュゲートの光増感剤ユニットに関し、本発明のバイオコンジュゲートについて上述した任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。その分子は例えば、フタロシアニン、又はベルテポルフィンである。
【0076】
前記光増感剤分子、特に前記フタロシアニンを官能化してアジド基を誘導する工程は、当業者に公知の任意の方法で実施してもよい。
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の方法において出発物質として使用する光増感剤は、カルボキシ‐フタロシアニンである。「カルボキシ‐フタロシアニン」とは、その６員環の１つがカルボキシル基を有するようなフタロシアニンを意味する。
本発明の方法において使用するための特に好ましいカルボキシ‐フタロシアニンは好ましくは下記一般式（ＶＩＩＩ）を有する周辺置換カルボキシ‐Ｚｎ（ＩＩ）‐フタロシアニンである：
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の方法において出発物質として使用する光増感剤は、カルボキシ‐フタロシアニンである。「カルボキシ‐フタロシアニン」とは、その６員環の１つがカルボキシル基を有するようなフタロシアニンを意味する。
本発明の方法において使用するための特に好ましいカルボキシ‐フタロシアニンは好ましくは下記一般式（ＶＩＩＩ）を有する周辺置換カルボキシ‐Ｚｎ（ＩＩ）‐フタロシアニンである：
【0077】
【0078】
式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は上記で定義した通りである。
フタロシアニンは例えば、下記式（ＶＩＩＩａ）を有してもよい：
フタロシアニンは例えば、下記式（ＶＩＩＩａ）を有してもよい：
【0079】
【0080】
式（ＶＩＩＩ）及び（ＶＩＩＩａ）は、前記分子の全ての位置異性体、及びこのような位置異性体の全ての混合物を包含する。
式（ＶＩＩＩａ）（９（１０），１６（１７），２３（２４）‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラ‐ベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｅｉｃｏｓｉｎａｔｏ）‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ））のフタロシアニンは例えば、Ｃｉｄら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載されているように調製してもよい。
このフタロシアニンは特に際立った光物理特性を有する。特に、このフタロシアニンは紫外線（ＵＶ）～可視光スペクトルにおいて、６８０ｎｍ付近に優れた吸光係数を持つバンド（Ｑバンド、εは約１０５Ｍ－１／ｃｍ－１）を示し、これはいわゆる治療光学ウィンドウの範囲内である。ジメチルスルホキシド中で測定したこのフタロシアニンの一重項酸素量子収量は最大ΦΔ＝０．７２である。ｔｅｒｔ‐ブチル基が存在することにより、分子凝集体の形成を最小限に抑えるだけでなく、有機溶媒中への化合物の溶解性を高める。
このフタロシアニンはまた、反応性カルボキシル官能基が構造中に存在することを利用して、容易に官能化できるという利点もある。
式（ＶＩＩＩａ）（９（１０），１６（１７），２３（２４）‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラ‐ベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｅｉｃｏｓｉｎａｔｏ）‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ））のフタロシアニンは例えば、Ｃｉｄら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載されているように調製してもよい。
このフタロシアニンは特に際立った光物理特性を有する。特に、このフタロシアニンは紫外線（ＵＶ）～可視光スペクトルにおいて、６８０ｎｍ付近に優れた吸光係数を持つバンド（Ｑバンド、εは約１０５Ｍ－１／ｃｍ－１）を示し、これはいわゆる治療光学ウィンドウの範囲内である。ジメチルスルホキシド中で測定したこのフタロシアニンの一重項酸素量子収量は最大ΦΔ＝０．７２である。ｔｅｒｔ‐ブチル基が存在することにより、分子凝集体の形成を最小限に抑えるだけでなく、有機溶媒中への化合物の溶解性を高める。
このフタロシアニンはまた、反応性カルボキシル官能基が構造中に存在することを利用して、容易に官能化できるという利点もある。
【0081】
式（ＶＩＩＩａ）のフタロシアニンは８つの位置異性体の形態であってもよい。
特定の実施形態では、本発明の方法において出発物質として使用するフタロシアニンは、これらの８つの形態、又はこれらの混合物のいずれか、即ち、以下の間で選択する：
‐ ９，１６，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１６，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１７，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１７，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１６，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１６，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１７，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１７，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ 及びこれらの任意の混合物。
特定の実施形態では、本発明の方法において出発物質として使用するフタロシアニンは、これらの８つの形態、又はこれらの混合物のいずれか、即ち、以下の間で選択する：
‐ ９，１６，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１６，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１７，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ ９，１７，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１６，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１６，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１７，２３‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ １０，１７，２４‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロ‐テトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２－）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）；
‐ 及びこれらの任意の混合物。
【0082】
本発明の特定の実施形態では、前記フタロシアニンを官能化する工程は、カルボキシ‐フタロシアニンと下記一般式（ＩＸ）の化合物とを反応させることにより実施する：
【0083】
【0084】
式中、ｍは１～５、好ましくは３の整数であり、
この工程は、一般式（ＩＸ）の化合物の第一級アミンの窒素原子及びフタロシアニンのカルボキシル基の炭素原子が関与するアミド結合を形成するような条件下で行う。
本発明の方法において特に有用な式（ＩＸ）の化合物は下記式（ＩＸａ）の３‐アジドプロピルアミンである：
この工程は、一般式（ＩＸ）の化合物の第一級アミンの窒素原子及びフタロシアニンのカルボキシル基の炭素原子が関与するアミド結合を形成するような条件下で行う。
本発明の方法において特に有用な式（ＩＸ）の化合物は下記式（ＩＸａ）の３‐アジドプロピルアミンである：
【0085】
【0086】
アミド化反応は、当業者に公知の任意の方法で実施してもよい。
本発明の特定の実施形態では、フタロシアニンは、以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って一般式（ＩＸ）の化合物と反応させる：
‐ ｛［‐（Ｚ）‐（１‐シアノ‐２‐エトキシ‐２‐オキソエチリデン）アミノ］オキシ｝‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル（モルホリン‐４‐イル）メタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）などのカップリング剤の存在下；
‐ 第三級アミン、例えばＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ ジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 周囲温度；
‐ 数時間、例えば１６～２８時間。
本発明の特定の実施形態では、フタロシアニンは、以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って一般式（ＩＸ）の化合物と反応させる：
‐ ｛［‐（Ｚ）‐（１‐シアノ‐２‐エトキシ‐２‐オキソエチリデン）アミノ］オキシ｝‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル（モルホリン‐４‐イル）メタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）などのカップリング剤の存在下；
‐ 第三級アミン、例えばＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ ジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 周囲温度；
‐ 数時間、例えば１６～２８時間。
【0087】
このようにして得られた官能化アジド‐フタロシアニンは、任意の手段、例えば適切な溶媒を使用した抽出により反応媒体から回収し、任意にフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製してもよい。
このようにして得た修飾エラスチン様ポリペプチドと官能化光増感剤とのヒュスゲン銅（Ｉ）触媒アルキン‐アジド環化付加反応の反応条件は、それら自体の古典的条件となっている。
反応は、例えば以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 硫酸銅五水和物とアスコルビン酸ナトリウムとの混合物などの銅触媒系の存在下；
‐ 数時間、例えば２～７２時間。
このようにして得たバイオコンジュゲートは、自体の従来法により反応媒体から回収し、任意に精製してもよい。
このようにして得た修飾エラスチン様ポリペプチドと官能化光増感剤とのヒュスゲン銅（Ｉ）触媒アルキン‐アジド環化付加反応の反応条件は、それら自体の古典的条件となっている。
反応は、例えば以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ 硫酸銅五水和物とアスコルビン酸ナトリウムとの混合物などの銅触媒系の存在下；
‐ 数時間、例えば２～７２時間。
このようにして得たバイオコンジュゲートは、自体の従来法により反応媒体から回収し、任意に精製してもよい。
【0088】
本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製する第２の方法は、光増感剤分子、特に好ましくは遊離カルボン酸基を含有するフタロシアニン又はベルテポルフィンを官能化し、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル基を誘導する工程、及び前記活性化基を、上記で定義した式（Ａ）を有する単量体単位が少なくとも１つ発生するエラスチン様ポリペプチドのＮ末端アミン基に直接カップリングさせる工程を含む。
この第２の方法において出発物質として使用する光増感剤、特にフタロシアニン又はベルテポルフィン、及びエラスチン様ポリペプチドは、本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製するための第１の方法を参照して上述した任意の特徴又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。
この第２の方法において出発物質として使用する光増感剤、特にフタロシアニン又はベルテポルフィン、及びエラスチン様ポリペプチドは、本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製するための第１の方法を参照して上述した任意の特徴又は特徴の任意の組み合わせを有してもよい。
【0089】
Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル基を誘導するための光増感剤、特にフタロシアニン又はベルテポルフィンの官能化は、当業者に公知の任意の手段により実施できる。前記官能化は好ましくは、標準的な条件下、溶媒としてジクロロメタンを用い、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）の存在下で、式（ＶＩＩＩａ）のフタロシアニン又はベルテポルフィンとＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを反応させることにより実施する。
このように活性化した光増感剤、特に活性化したフタロシアニン又はベルテポルフィンをエラスチン様ポリペプチドへカップリングすることは、アミド結合を形成するためにＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルを第一級アミンと反応させるための任意の自体の従来法により実施してもよい。
このように活性化した光増感剤、特に活性化したフタロシアニン又はベルテポルフィンをエラスチン様ポリペプチドへカップリングすることは、アミド結合を形成するためにＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルを第一級アミンと反応させるための任意の自体の従来法により実施してもよい。
【0090】
反応は、例えば、以下の特徴のいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 数時間、例えば２～４８時間；
‐ 不活性雰囲気下、例えば窒素Ｎ２雰囲気下。
このように得たバイオコンジュゲートは、自体の従来手段により反応媒体から回収し、任意に精製してもよい。
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 数時間、例えば２～４８時間；
‐ 不活性雰囲気下、例えば窒素Ｎ２雰囲気下。
このように得たバイオコンジュゲートは、自体の従来手段により反応媒体から回収し、任意に精製してもよい。
【0091】
ベルテポルフィンのように光増感剤がカルボキシル基を含む実施形態に適した本発明のバイオコンジュゲートを調製する別の方法には、適切なカップリング試薬の存在下で光増感剤のカルボキシル基とエラスチン様ポリペプチドのＮ末端アミン基とを反応させることによりアミドを形成する工程が含まれる。このようなカップリング試薬としては、Ｏ‐（１Ｈ‐６‐クロロベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＣＴＵ）又はＨＴＢＵなどの、ペプチド合成において通常使用される試薬が特に好ましい。
反応は連続的２工程で実施することが好ましく、この工程は、光増感剤、例えばベルテポルフィンとカップリング試薬とを反応させる第１工程、及び第１工程の反応生成物とエラスチン様ポリペプチドとを反応させる第２工程を含む。
反応は連続的２工程で実施することが好ましく、この工程は、光増感剤、例えばベルテポルフィンとカップリング試薬とを反応させる第１工程、及び第１工程の反応生成物とエラスチン様ポリペプチドとを反応させる第２工程を含む。
【0092】
第１工程は、ジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒中で実施できる。第１工程は好ましくは、室温で、及び／又は３０～１２０分、例えば約１時間行う。
第２工程は例えば、以下の特徴の１つ又はいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 数時間、例えば１２～６０時間、好ましくは３０～５０時間；
‐ 不活性雰囲気下、例えばアルゴン雰囲気下。
第２工程は例えば、以下の特徴の１つ又はいくつか、好ましくは全てに従って実施してもよい：
‐ 周囲温度；
‐ ジメチルスルホキシドなどの極性非プロトン性溶媒中；
‐ Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の存在下；
‐ 数時間、例えば１２～６０時間、好ましくは３０～５０時間；
‐ 不活性雰囲気下、例えばアルゴン雰囲気下。
【0093】
本発明のバイオコンジュゲートは、多くの用途、特に医療用途、より詳細には光線力学療法治療用の光増感剤として有用であることが証明されている。
本発明のバイオコンジュゲートは特に、それを必要とする被験体、特に哺乳動物、より詳細にはヒト被験体での光線力学療法による疾患治療に使用できる。特に、皮膚疾患、眼疾患、又は光線力学療法が適用できると判明した治療を必要とする任意の他の疾患の光線力学療法による治療に使用することが可能である。例えば、光線力学療法による癌の治療に使用可能である。
本発明のバイオコンジュゲートは、自体の古典的な任意の投与経路により被験体に投与してもよい。例えば、経口、非経口、局所、経鼻、直腸、又は肺を通る経路により、それを必要とする被験体に投与してもよい。
本発明のバイオコンジュゲートは特に、それを必要とする被験体、特に哺乳動物、より詳細にはヒト被験体での光線力学療法による疾患治療に使用できる。特に、皮膚疾患、眼疾患、又は光線力学療法が適用できると判明した治療を必要とする任意の他の疾患の光線力学療法による治療に使用することが可能である。例えば、光線力学療法による癌の治療に使用可能である。
本発明のバイオコンジュゲートは、自体の古典的な任意の投与経路により被験体に投与してもよい。例えば、経口、非経口、局所、経鼻、直腸、又は肺を通る経路により、それを必要とする被験体に投与してもよい。
【0094】
非経口投与経路としては、皮下、硬膜下、静脈内、筋肉内、髄腔内、腹腔内、脳内、動脈内、及び病巣内の投与経路が挙げられ、光線力学療法による疾患治療、特に癌治療に関して特に好ましい。
特に好ましい実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、治療対象の被験体に、被験体の身体の標的部位、例えば腫瘍部位に注射することにより投与する。
例として、卵巣癌の治療に本発明のバイオコンジュゲートを使用するため、治療対象の被験体に、腹腔内への直接注射によりバイオコンジュゲートを投与することが好ましい。
癌治療、例えば乳癌又は脳腫瘍治療の分野において、本発明のバイオコンジュゲートをその他の方法で腫瘍手術後に局所投与してもよい。
特に好ましい実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、治療対象の被験体に、被験体の身体の標的部位、例えば腫瘍部位に注射することにより投与する。
例として、卵巣癌の治療に本発明のバイオコンジュゲートを使用するため、治療対象の被験体に、腹腔内への直接注射によりバイオコンジュゲートを投与することが好ましい。
癌治療、例えば乳癌又は脳腫瘍治療の分野において、本発明のバイオコンジュゲートをその他の方法で腫瘍手術後に局所投与してもよい。
【0095】
光線力学療法により、それを必要とする被験体において疾患、特に皮膚疾患もしくは眼疾患、又は癌を治療する方法の観点からも本発明を述べることも可能であり、前記方法は以下の工程を含む：
‐ 治療有効量の本発明のバイオコンジュゲートを、特に標的部位、例えば腫瘍部位に直接注射することにより、前記被験体に投与する工程；
‐ 次いで、光増感剤ユニットを活性化するための適切な波長、特に赤色光で前記標的部位に光照射する工程。
本明細書において「治療有効量」とは、疾患を治療するために被験体に投与する際にそのような疾患治療を行うに十分なバイオコンジュゲート量を意味する。本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量は、疾患及びその重症度、治療対象の被験体の年齢、体重等、使用する特定のバイオコンジュゲート、投与経路及び投与形態等の、いくつかの因子に依存する。本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量は、個々の症例各々で施術者が決定する。
‐ 治療有効量の本発明のバイオコンジュゲートを、特に標的部位、例えば腫瘍部位に直接注射することにより、前記被験体に投与する工程；
‐ 次いで、光増感剤ユニットを活性化するための適切な波長、特に赤色光で前記標的部位に光照射する工程。
本明細書において「治療有効量」とは、疾患を治療するために被験体に投与する際にそのような疾患治療を行うに十分なバイオコンジュゲート量を意味する。本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量は、疾患及びその重症度、治療対象の被験体の年齢、体重等、使用する特定のバイオコンジュゲート、投与経路及び投与形態等の、いくつかの因子に依存する。本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量は、個々の症例各々で施術者が決定する。
【0096】
本発明の特に好ましい実施形態では、疾患を処置する方法は２つの連続的な光照射工程を含み、これらの工程は数分又は数時間離して実施する。
光線力学療法のこの文脈において、本発明のバイオコンジュゲートは、単独の、又は異なるナノ担体と共役した形態のフタロシアニンなどの光増感剤と比較して、治療の臨床効果を有利に向上させる。
疾患を治療するための本発明の方法の異なる工程を、治療する疾患として癌を例にして図１に示す。
光線力学療法のこの文脈において、本発明のバイオコンジュゲートは、単独の、又は異なるナノ担体と共役した形態のフタロシアニンなどの光増感剤と比較して、治療の臨床効果を有利に向上させる。
疾患を治療するための本発明の方法の異なる工程を、治療する疾患として癌を例にして図１に示す。
【0097】
本発明のバイオコンジュゲートの分子１０は、被験体に投与されると、生理的体温、ヒト被験体では約３７℃で自発的に自己凝集して粒子１１になる。腫瘍部位に蓄積したこれらの粒子の分解は、赤色光１２を用いた局所的な光照射により遠隔で誘発することが可能であり、その後、バイオコンジュゲートの光増感剤ユニットにより生成した一重項酸素１３により硫黄含有アミノ酸残基が酸化する。その結果、バイオコンジュゲートの転移温度が上昇する。光増感剤ユニットにより放出された活性酸素種は、腫瘍内の細胞をほぼ死滅させる。同時に、粒子から個々に放出された可溶性バイオコンジュゲート分子１０は、腫瘍部位に深く拡散し、赤色光１２を用いた２回目の光照射工程の有効性を向上させる。バイオコンジュゲートの光増感剤ユニットの再活性化は一重項酸素１３などの酸素活性種の新たな生成工程になり、腫瘍塊にかなりの損傷を与え、治療利益を最大にする可能性がある。
【0098】
本発明の別の態様は、本発明に従ったバイオコンジュゲートを薬学的に許容可能な賦形剤中に含む医薬組成物である。
本明細書において「薬学的に許容可能」とは、ヒトを含む哺乳動物に投与する際に賦形剤が有害作用、アレルギー作用、又は他の望ましからざる作用を示さないことを意味する。
本発明の組成物は経口、非経口、経鼻、舌下、直腸、経皮、吸入、又は吹送投与に適した任意の形態であってもよい。組成物は、被験体、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒト被験体への非経口投与、好ましくは、腫瘍などの組織の病変部への直接投与に適した形態であることが好ましい。
本発明の特徴及び利点は以下の実施例の観点から、より明瞭に理解されるであろうが、但し、例示のみを目的とし、本発明を何ら限定するものではない。
本明細書において「薬学的に許容可能」とは、ヒトを含む哺乳動物に投与する際に賦形剤が有害作用、アレルギー作用、又は他の望ましからざる作用を示さないことを意味する。
本発明の組成物は経口、非経口、経鼻、舌下、直腸、経皮、吸入、又は吹送投与に適した任意の形態であってもよい。組成物は、被験体、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒト被験体への非経口投与、好ましくは、腫瘍などの組織の病変部への直接投与に適した形態であることが好ましい。
本発明の特徴及び利点は以下の実施例の観点から、より明瞭に理解されるであろうが、但し、例示のみを目的とし、本発明を何ら限定するものではない。
【0099】
Ａ／光増感剤としてのフタロシアニン
材料
以下の試薬を使用する：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、ＶＷＲ社製、１００％）、酢酸アンモニウム（Ｃ２Ｈ３Ｏ２ＮＨ４、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＢｉｏＸｔｒａ９８％）、氷酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、Ｃｈｅｍ‐Ｌａｂｓ社製）、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９％）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ｃｕ２ＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製、９８％）、（＋）‐Ｌ‐アスコルビン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ７ＮａＯ６、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９８％）、３‐アジドプロピルアミン（Ｃ３Ｈ８Ｎ４、ＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅ社製、＞９５．０％）、ＣＯＭＵ（登録商標）（Ｃ１２Ｈ１９Ｆ６Ｎ４Ｏ４Ｐ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９７％）。
更に精製することなく以下の溶媒を使用する：エタノール（ＥｔＯＨ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、分析グレード、１００％）、ジクロロメタン（ＤＣＭ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、分析グレード、９９．９％）、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｌｕｋａ、９９．８％）、アセトニトリル（ＡＣＮ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）グレード、９９．９％）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、９７％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９，９％）、１，４‐ジオキサン（ＨＰＬＣグレード ‐ ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）で安定化、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社製）、ｎ‐ヘキサン（分析用９９％、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社製）。
材料
以下の試薬を使用する：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、ＶＷＲ社製、１００％）、酢酸アンモニウム（Ｃ２Ｈ３Ｏ２ＮＨ４、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＢｉｏＸｔｒａ９８％）、氷酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、Ｃｈｅｍ‐Ｌａｂｓ社製）、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９％）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ｃｕ２ＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製、９８％）、（＋）‐Ｌ‐アスコルビン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ７ＮａＯ６、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９８％）、３‐アジドプロピルアミン（Ｃ３Ｈ８Ｎ４、ＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅ社製、＞９５．０％）、ＣＯＭＵ（登録商標）（Ｃ１２Ｈ１９Ｆ６Ｎ４Ｏ４Ｐ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９７％）。
更に精製することなく以下の溶媒を使用する：エタノール（ＥｔＯＨ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、分析グレード、１００％）、ジクロロメタン（ＤＣＭ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、分析グレード、９９．９％）、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｌｕｋａ、９９．８％）、アセトニトリル（ＡＣＮ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）グレード、９９．９％）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ、ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、９７％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９，９％）、１，４‐ジオキサン（ＨＰＬＣグレード ‐ ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）で安定化、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社製）、ｎ‐ヘキサン（分析用９９％、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社製）。
【0100】
光増感剤はフタロシアニンであり、本明細書ではＴＴ１，９（１０），１６（１７），２３（２４）‐トリ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐カルボキシ‐５，２８：１４，１９‐ジイミノ‐７，１２：２１，２６‐ジニトリロテトラベンゾ［ｃ，ｈ，ｍ，ｒ］［１，６，１１，１６］テトラアザシクロエイコシナート‐（２）‐Ｎ２９，Ｎ３０，Ｎ３１，Ｎ３２亜鉛（ＩＩ）（位置異性体の混合物）と称する。
これは本明細書で上記した式（ＶＩＩＩａ）を有する。
本明細書においてＥＬＰと呼ばれるエラスチン様ポリペプチドは下記化学式を有し：
これは本明細書で上記した式（ＶＩＩＩａ）を有する。
本明細書においてＥＬＰと呼ばれるエラスチン様ポリペプチドは下記化学式を有し：
【0101】
【0102】
式中、Ｒは、‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３及びＣＨ（ＣＨ３）２から選択される可変基を示し、Ｒでは、角括弧内において各単位中の‐ＣＨ（ＣＨ３）２／‐（ＣＨ２）２‐Ｓ‐ＣＨ３のモル比は３／１となっており、
更にアミノ酸配列の配列番号１１を有する。
更にアミノ酸配列の配列番号１１を有する。
【0103】
分析方法
核磁気共鳴（ＮＭＲ）：Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ（登録商標）ＩＩＩ ＨＤ（５ｍｍＰｒｏｄｉｇｙ凍結プローブを用いた液体状態４００ＭＨｚ ＮＭＲ）、及びＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ（登録商標）Ｉ（５ｍｍＢＢＦＯプローブを用いた液体状態４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計）により１Ｈ ＮＭＲ ４００ＭＨｚスペクトルを得る。重水素クロロホルム（ＣＤＣｌ３、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）、重水素ジメチルスルホキシド（ｄ‐ＤＭＳＯ、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）、及び重水素水（Ｄ２Ｏ、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）を溶媒及びロックの参照として使用する。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）：Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ（登録商標）ＩＩＩ ＨＤ（５ｍｍＰｒｏｄｉｇｙ凍結プローブを用いた液体状態４００ＭＨｚ ＮＭＲ）、及びＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ（登録商標）Ｉ（５ｍｍＢＢＦＯプローブを用いた液体状態４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計）により１Ｈ ＮＭＲ ４００ＭＨｚスペクトルを得る。重水素クロロホルム（ＣＤＣｌ３、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）、重水素ジメチルスルホキシド（ｄ‐ＤＭＳＯ、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）、及び重水素水（Ｄ２Ｏ、Ｅｕｒｉｓｏ‐ｔｏｐ社製、９９．８％）を溶媒及びロックの参照として使用する。
【0104】
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）：ダイオードアレイ検出器ＤＡＤを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）社製ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００システム上でＤＭＳＯ中の測定を行う。このシステムには、Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製多角度光散乱検出器ＭＡＬＳ及び示差屈折率検出器ｄＲＩも備えられている。東ソーＴＳＫ社製Ｇ３０００ＨＨＲ及びＧ２０００ＨＨＲ（７．８ｍｍ内径×３００ｍｍ）カラム（排除限界：２００～６０，０００Ｄａ）上、流速０．５ｍＬ／分でポリマーを分離する。カラム温度を８０℃に保つ。標準物質としてＰＳＳ社製デキストランを使用する。溶離液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ＋臭化リチウムＬｉＢｒを１ｇ／Ｌ）を使用する。
【0105】
ドデシル硫酸ナトリウム ‐ ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）分析：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（サイズマーカー）１５μＬ及び各試料２０μＬをゲルトレイ（ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製、４～２０％Ｍｉｎｉ‐ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ‐Ｆｒｅｅ（登録商標）ゲル）に装填する。ローディング試料バッファとしてＴｒｉｓ‐Ｇｌｙｃｉｎｅ‐ＳＤＳ緩衝液（ＴＧＳ、１倍）を使用する。
【0106】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）：３５５ｎｍで発光する周波数３倍のネオジウム（Ｎｄ）：イットリウム・アルミニウム・ガーネット（ＹＡＧ）レーザーを備えたＡｕｔｏｆｌｅｘ ｍａＸ ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）上で、ＣＥＳＡＭＯ（フランス、ボルドー）によりＭＡＬＤＩ‐ＭＳスペクトルを測定する。加速電圧１９ｋＶのリニア陽イオンモードでスペクトルを記録する。試料を４ｍｇ／ｍｌで水に溶解する。シナピン酸（ＳＡ）マトリクス溶液は、１０ｍｇを１ｍｌのアセトニトリル／０．１％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０／５０に溶解して調製する。これらの溶液を、マトリクスと試料との体積比が１０：１０になるように合わせる。得られた溶液の１～２マイクロリットルを目的試料に付着させ、真空乾燥させる。
【0107】
ＵＶ‐可視光（Ｖｉｓ）分光測定：遷移温度（Ｔｔ）は、多重セル熱電温度制御装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｒｙ１００ＵＶ‐Ｖｉｓ分光光度計で、温度に対する６００ｎｍ又は５００ｎｍの吸光度における濁度を追跡することにより測定する。濁度は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の３種類の濃度（１０、２０、及び３０μＭ）のフタロシアニンにおいて、共役反応の前後に１℃・ｍｉｎ－１の走査速度で１０～６０℃の温度範囲で測定する。
【0108】
動的光散乱：ＴＴ１‐ＥＬＰ（２０℃及び３７℃）及びＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘ（３７℃）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、ＮａｎｏＺＳ９０装置（ヘリウム・ネオン（ＨｅＮｅ）レーザー６３２．８ｎｍ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を用い、キュベット内の一定位置において９０°の角度で行う（１倍ＰＢＳ ｐＨ７．４中、濃度３０μＭでの一定散乱体積）。ＣＯＮＴＩＮのようなアルゴリズムを用い、２次キュムラントフィットからＺ平均流体力学直径（ＤＨ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）の値を求める。
【0109】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＡＦＭシステムＤｉｍｅｎｓｉｏｎ ＦａｓｔＳｃａｎ（登録商標）を用い、温度制御液体原子間力顕微鏡測定を行う。先端半径が典型的に５ｎｍであるシリコン製カンチレバー（ＳｃａｎＡｓｙｓｔ‐Ｆｌｕｉｄ＋、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用い、ピークフォースタッピングモードでバイオコンジュゲートのトポグラフィ画像を得る。カンチレバー共振周波数は１５０ｋＨｚ、バネ定数は０．７Ｎ／ｍである。５０μＭのバイオコンジュゲート溶液を、劈開したばかりの雲母又はＡｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＨＯＰＧの表面にドロップキャスティングすることにより試料を調製し、これを画像処理に直接適用する。ＡＦＭ画像処理プロセスは、特定の温度の液体環境で行う。基板表面で目標温度にするために、外部加熱台（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を使用する。
【0110】
実施例１ ‐ フタロシアニンＴＴ１の官能化
ＴＴ１を、Ｃｉｄら、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載の方法により得る。
アジド基を誘導するＴＴ１の官能化は、下記合成反応スキームに従って行う：
ＴＴ１を、Ｃｉｄら、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載の方法により得る。
アジド基を誘導するＴＴ１の官能化は、下記合成反応スキームに従って行う：
【0111】
【0112】
アルゴン雰囲気下、室温で、ＴＴ１（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）と、蒸留したばかりのＤＩＰＥＡ（５．３μＬ）を含む乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）との混合物にＣＯＭＵ（１６．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、３‐アジドプロピルアミン（４．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を２４時間攪拌する。混合物をＤＣＭ（２ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ（５ｍＬ×２回）、１ＮのＮａＨＣＯ３（５ｍＬ×２回）、及び飽和ＮａＣｌ（５ｍＬ×２回）で抽出する。その後、ＤＣＭをＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィ（ジオキサン／ｎ‐ヘキサン＝５０：５０）で直接精製し、１６．４ｍｇの「１」（収率：７５％）を暗青色の固体として得る。
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ９．９１（ｍ，１Ｈ），９．５５‐９．３０（ｍ，８Ｈ），８．７１（ｍ，１Ｈ），８．３７（ｍ，３Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），２．０７‐２．０２（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｓ，２７Ｈ），１．２４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．
高分解能質量分析（ＨＲ‐ＭＳ）（マトリクス支援レーザー脱離イオン化方式飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）、ｔｒａｎｓ‐２‐［３‐（４‐ｔｅｒｔ‐ブチルフェニル）‐２‐メチル‐２‐プロペニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ））：Ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ４６Ｎ１２ＯＺｎ：［Ｍ］＋：質量／電荷数比（ｍ／ｚ）：８７０．３２０９，ｆｏｕｎｄ ８７０．３２０４．
ＵＶ／Ｖｉｓ：（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））：λｍａｘ（ｎｍ）（ε）＝６７３（４．７０）；６０７（４．６８），３４８（４．０８）．
１Ｈ‐ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ９．９１（ｍ，１Ｈ），９．５５‐９．３０（ｍ，８Ｈ），８．７１（ｍ，１Ｈ），８．３７（ｍ，３Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），２．０７‐２．０２（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｓ，２７Ｈ），１．２４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．
高分解能質量分析（ＨＲ‐ＭＳ）（マトリクス支援レーザー脱離イオン化方式飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）、ｔｒａｎｓ‐２‐［３‐（４‐ｔｅｒｔ‐ブチルフェニル）‐２‐メチル‐２‐プロペニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ））：Ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ４６Ｎ１２ＯＺｎ：［Ｍ］＋：質量／電荷数比（ｍ／ｚ）：８７０．３２０９，ｆｏｕｎｄ ８７０．３２０４．
ＵＶ／Ｖｉｓ：（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））：λｍａｘ（ｎｍ）（ε）＝６７３（４．７０）；６０７（４．６８），３４８（４．０８）．
【0113】
実施例２ ‐ ＥＬＰのＮ末端修飾
ＥＬＰは、Ｐｅｔｉｔｄｅｍａｎｇｅら、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２０１７年、第１８号（２）、ｐ．５４４‐５５０に記載されているように入手し、精製する。
ＥＬＰのＮ末端にアルキン基を誘導するＥＬＰの修飾は、下記合成反応スキームに従って行う：
ＥＬＰは、Ｐｅｔｉｔｄｅｍａｎｇｅら、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２０１７年、第１８号（２）、ｐ．５４４‐５５０に記載されているように入手し、精製する。
ＥＬＰのＮ末端にアルキン基を誘導するＥＬＰの修飾は、下記合成反応スキームに従って行う：
【0114】
【0115】
ＥＬＰ（２０ｍｇ、１．１７μｍｏｌ）を含む無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）の溶液に、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（１ｍｇ、１．１７μｍｏｌ）を添加し、その溶液を窒素起泡により脱気する。４‐ペンチン酸スクシンイミジルエステル（４ｍｇ、２３．４８μｍｏｌ）を反応混合物に添加し、窒素雰囲気下、室温で７２時間撹拌する。その後、溶液を１５ｍＬのＨ２Ｏで希釈し、透析バッグ（分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）：３．５ｋＤａ）中でＭｉｌｌｉ‐Ｑ水に対して７２時間透析する。溶液を凍結乾燥し、白色生成物アルキン‐ＥＬＰ（１９ｍｇ、９５％）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．４７‐４．４４（ｍ，１１Ｈ αＣＨ Ｍｅ），４．３７‐４．３２（ｍ，８０Ｈ αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．０９‐４．０７（ｄ，３０Ｈ αＣＨ Ｖａｌｘａａ），３．９４‐３．８２（ｂｒ ｍ，αＣＨ２ Ｇｌｙ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），３．６４‐３．６２（ｍ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），２．５４‐２．３６（ｂｒ ｍ，γＣＨ２ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），２．２３‐２．２１（ｍ，βＣＨ２ Ｐｒｏ），２．０５‐１．８３（ｍ，βＣＨ２ Ｍｅｔ，βＣＨ２ Ｐｒｏ，γＣＨ２ Ｐｒｏ，βＣＨ２ Ｖａｌ，εＣＨ３ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），０．９０‐０．８４（ｍ，４２０Ｈ，γＣＨ３ Ｖａｌ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．４７‐４．４４（ｍ，１１Ｈ αＣＨ Ｍｅ），４．３７‐４．３２（ｍ，８０Ｈ αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．０９‐４．０７（ｄ，３０Ｈ αＣＨ Ｖａｌｘａａ），３．９４‐３．８２（ｂｒ ｍ，αＣＨ２ Ｇｌｙ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），３．６４‐３．６２（ｍ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），２．５４‐２．３６（ｂｒ ｍ，γＣＨ２ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），２．２３‐２．２１（ｍ，βＣＨ２ Ｐｒｏ），２．０５‐１．８３（ｍ，βＣＨ２ Ｍｅｔ，βＣＨ２ Ｐｒｏ，γＣＨ２ Ｐｒｏ，βＣＨ２ Ｖａｌ，εＣＨ３ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），０．９０‐０．８４（ｍ，４２０Ｈ，γＣＨ３ Ｖａｌ）
【0116】
実施例３ ‐ ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートの合成及び精製
本カップリング反応は下記合成スキームに従って行う：
本カップリング反応は下記合成スキームに従って行う：
【0117】
Ｓｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｅ：アスコルビン酸ナトリウム
７２ｈ、ｒｔ：７２時間、室温
【0118】
アルキン‐ＥＬＰ（１当量）及び「１」（２当量）を乾燥ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＣｕＳＯ４，５Ｈ２Ｏ（１当量）及びアスコルビン酸ナトリウム（２当量）を添加し、溶液を凍結‐融解‐凍結サイクルにより脱気する。この溶液を窒素雰囲気下、室温で７２時間撹拌しながら放置する。余分な銅をキュプリソーブビーズ処理及びその後の濾過により除去する。反応液をＭｉｌｌｉ‐Ｑ水に対して４８時間透析し（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）、凍結乾燥する。最終生成物を逆転移サイクル（ＩＴＣ）により精製し、その後凍結乾燥する。
ＩＴＣ精製は以下のように行う。
ＩＴＣ精製は以下のように行う。
【0119】
青色の生成物を５ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、熱浴（４０℃）に入れる。変動したバイオコンジュゲートを３８℃で１０分間遠心分離する（回転数３８００ｒｐｍ）。上清を廃棄し、濃青色のペレットを３ｍＬの冷水に溶解する。この溶液を４℃で３０分間遠心分離し（回転数３８００ｒｐｍ）、ペレットを廃棄する。上清に１Ｍ ＮａＣｌ溶液を数滴添加し、熱浴に入れる。凝集したバイオコンジュゲートを３８℃で１０分間遠心する（回転数３８００ｒｐｍ）。最後に、上清を廃棄し、ペレットを冷Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水に溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）中でＭｉｌｌｉ‐Ｑ水に対して２４時間透析し、余分な塩を除去する。この溶液を凍結乾燥し、純粋な青色バイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰを得る。
純粋バイオコンジュゲートの収量：１６ｍｇ、８０％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，５℃）：δ４．３８（ｂｒ ｍ，１１Ｈ αＣＨ Ｍｅ），４．２８‐４．２５（ｍ，８０Ｈ αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．００‐３．９９（ｄ，３０Ｈ αＣＨ Ｖａｌｘａａ），３．８０‐３．７７（ｂｒ ｍ，２００Ｈ αＣＨ２ Ｇｌｙ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），３．５４（ｂｒ，４０Ｈ δＣＨ２ Ｐｒｏ），２．４７‐２．３５（ｂｒ ｍ，２２Ｈ γＣＨ２ Ｍｅｔ），２．１６（ｂｒ ｍ，４０Ｈ βＣＨ２ Ｐｒｏ），１．９３‐１．８０（ｂｒ ｍ，２４０Ｈ βＣＨ２ Ｍｅｔ，βＣＨ２ Ｐｒｏ，γＣＨ２ Ｐｒｏ，βＣＨ２ Ｖａｌ，εＣＨ３ Ｍｅｔ），０．８３‐０．７０（ｍ，４２０Ｈ，γＣＨ３ Ｖａｌ）．
ＳＥＣ（ＤＭＳＯ，ＬｉＢｒ １ｇ／Ｌ，標準物質：デキストラン）Ｍｎ＝２０１２０Ｄａ，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１２９．
ＭＡＬＤＩ ＭＳ：理論ＭＷ＝１８０３２．９６Ｄａ，実験［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８０３３．５２１Ｄａ
水中でのＵＶ吸収 λｍａｘ＝３３７．６３３ｎｍ、蛍光なし。
純粋バイオコンジュゲートの収量：１６ｍｇ、８０％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，５℃）：δ４．３８（ｂｒ ｍ，１１Ｈ αＣＨ Ｍｅ），４．２８‐４．２５（ｍ，８０Ｈ αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．００‐３．９９（ｄ，３０Ｈ αＣＨ Ｖａｌｘａａ），３．８０‐３．７７（ｂｒ ｍ，２００Ｈ αＣＨ２ Ｇｌｙ，δＣＨ２ Ｐｒｏ），３．５４（ｂｒ，４０Ｈ δＣＨ２ Ｐｒｏ），２．４７‐２．３５（ｂｒ ｍ，２２Ｈ γＣＨ２ Ｍｅｔ），２．１６（ｂｒ ｍ，４０Ｈ βＣＨ２ Ｐｒｏ），１．９３‐１．８０（ｂｒ ｍ，２４０Ｈ βＣＨ２ Ｍｅｔ，βＣＨ２ Ｐｒｏ，γＣＨ２ Ｐｒｏ，βＣＨ２ Ｖａｌ，εＣＨ３ Ｍｅｔ），０．８３‐０．７０（ｍ，４２０Ｈ，γＣＨ３ Ｖａｌ）．
ＳＥＣ（ＤＭＳＯ，ＬｉＢｒ １ｇ／Ｌ，標準物質：デキストラン）Ｍｎ＝２０１２０Ｄａ，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１２９．
ＭＡＬＤＩ ＭＳ：理論ＭＷ＝１８０３２．９６Ｄａ，実験［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８０３３．５２１Ｄａ
水中でのＵＶ吸収 λｍａｘ＝３３７．６３３ｎｍ、蛍光なし。
【0120】
図２に示すように、ＥＬＰ鎖末端の定量的修飾、及び反応に使用した過剰ＴＴ１の完全除去は、ＭＡＬＤＩ ＭＳ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、及びＳＥＣ分析により確認する。
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析から、ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰとの単荷電種［Ｍ＋Ｈ］＋の間で９９３．３Ｄａのシフトがあることが示され、これは理論値（９９７．５Ｄａ）と妥当に一致している（図２‐Ａ））。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析から、反応に使用した過剰なＴＴ１が良好に除去されていることが分かる（図２‐Ｂ））。ＴＴ１‐ＥＬＰのＳＥＣクロマトグラム（ＲＩ検出）から単峰性ピーク分布が見られる（図２‐Ｃ））。短い保持時間に小さいショルダーが見られるのは、ＴＴ１平面骨格のπ‐πスタッキングによるＴＴ１‐ＥＬＰの凝集体に起因する。また、６０７ｎｍでの吸収は、ＥＬＰ鎖末端へのＴＴ１の結合が良好であることも示している（図２－Ｃ））。
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析から、ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰとの単荷電種［Ｍ＋Ｈ］＋の間で９９３．３Ｄａのシフトがあることが示され、これは理論値（９９７．５Ｄａ）と妥当に一致している（図２‐Ａ））。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析から、反応に使用した過剰なＴＴ１が良好に除去されていることが分かる（図２‐Ｂ））。ＴＴ１‐ＥＬＰのＳＥＣクロマトグラム（ＲＩ検出）から単峰性ピーク分布が見られる（図２‐Ｃ））。短い保持時間に小さいショルダーが見られるのは、ＴＴ１平面骨格のπ‐πスタッキングによるＴＴ１‐ＥＬＰの凝集体に起因する。また、６０７ｎｍでの吸収は、ＥＬＰ鎖末端へのＴＴ１の結合が良好であることも示している（図２－Ｃ））。
【0121】
実施例４ ‐ 比較化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）
メチオニル残基の酸化後の本発明のバイオコンジュゲートの特性を調べるために、比較化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）は、１１個のメチオニル残基の全ての硫黄原子をスルホキシド形態へと酸化させる以外はＴＴ１‐ＥＬＰと同じ構造を有している。
この目的のために、ＥＬＰをまず、Ｐｅｔｉｔｄｅｍａｎｇｅら、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２０１７年、第１８号（２）、ｐ．５４４‐５５０に記載されているように過酸化水素と反応させ、メチオニル残基の全ての硫黄原子がスルホキシド形態であるＥＬＰ（Ｏ）を得る。
次いで、実施例１に記載した方法と同じ方法により、下記反応スキームに従ってＥＬＰ（Ｏ）を、そのＮ末端で修飾する：
メチオニル残基の酸化後の本発明のバイオコンジュゲートの特性を調べるために、比較化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）は、１１個のメチオニル残基の全ての硫黄原子をスルホキシド形態へと酸化させる以外はＴＴ１‐ＥＬＰと同じ構造を有している。
この目的のために、ＥＬＰをまず、Ｐｅｔｉｔｄｅｍａｎｇｅら、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２０１７年、第１８号（２）、ｐ．５４４‐５５０に記載されているように過酸化水素と反応させ、メチオニル残基の全ての硫黄原子がスルホキシド形態であるＥＬＰ（Ｏ）を得る。
次いで、実施例１に記載した方法と同じ方法により、下記反応スキームに従ってＥＬＰ（Ｏ）を、そのＮ末端で修飾する：
【0122】
【0123】
ＥＬＰ（Ｏ）（４０ｍｇ、２．３２μｍｏｌ）を含む無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）の溶液に、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍｇ、２．３２μｍｏｌ）を添加し、続いて４‐ペンチン酸スクシンイミジルエステル（９ｍｇ、４６．４８μｍｏｌ）を添加する。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で７２時間撹拌する。その後、溶液を１５ｍＬのＨ２Ｏで希釈し、透析バッグ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）中でＭｉｌｌｉ‐Ｑ水に対して７２時間透析する。溶液を凍結乾燥し、白色生成物アルキン‐ＥＬＰ（Ｏ）（３０ｍｇ、７５％）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）：δ４．２９‐４．２３（ｍ，８０Ｈ，αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．０９‐３．９９（ｄ，３０Ｈ，αＣＨ ＶＰＧＶＧ），２．８５‐２．７３（ｍ，２２Ｈ，ＣＨ２Ｓ Ｍｅｔ），２．３８‐２．２９（ｂｒ ｍ，γＣＨ２ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），２．５６（ｓ，３３Ｈ，ＳＣＨ３ Ｍｅｔ），０．８２‐０．７５（ｂｒ ｍ，４２０Ｈ，ＣＨ３ Ｖａｌ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，２５℃）：δ４．２９‐４．２３（ｍ，８０Ｈ，αＣＨ Ｖａｌ，Ｐｒｏ），４．０９‐３．９９（ｄ，３０Ｈ，αＣＨ ＶＰＧＶＧ），２．８５‐２．７３（ｍ，２２Ｈ，ＣＨ２Ｓ Ｍｅｔ），２．３８‐２．２９（ｂｒ ｍ，γＣＨ２ Ｍｅｔ，ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ），２．５６（ｓ，３３Ｈ，ＳＣＨ３ Ｍｅｔ），０．８２‐０．７５（ｂｒ ｍ，４２０Ｈ，ＣＨ３ Ｖａｌ）．
【0124】
１Ｈ ＮＭＲ分析から、ＥＬＰが定量的に酸化され、Ｎ末端鎖が完全に官能化されたことが確認される。
アルキン‐ＥＬＰ（Ｏ）とのＴＴ１‐アジドの共役を、実施例３に記載の通りに実施し、図２に示すように、ＭＡＬＤＩ ＭＳ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、ＳＥＣ、ＮＭＲ、及びＵＶ‐Ｖｉｓ分光測定分析により確認する。
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析から、ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）との単荷電種［Ｍ＋Ｈ］＋の間で１，１７４Ｄａのシフトがあることが示され、これは理論値（１，１７７Ｄａ）と非常に一致している（図２‐Ａ））。ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）のＳＥＣクロマトグラム（ＲＩ検出）から、６０７ｎｍのＵＶ検出器シグナルと重なる狭い単峰性のピーク分布が示され、ＴＴ１の共役が良好であることが分かる（図２‐Ｄ））。
周囲温度でのＴＴ１‐ＥＬＰ及びＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）バイオコンジュゲートの光学的特性は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、λａｂｓ＝３３７及び６３３ｎｍ）での最大吸収に差はない（図２‐Ｅ））。ポリペプチドとの共役、イオン強度の高い水性環境、及びＴＴ１鎖末端のスタッキングにより、バイオコンジュゲートの吸収ピークはより広域になり、６７３ｎｍ（ＴＨＦ中のＴＴ１）から６３３ｎｍ（ＰＢＳ中のコンジュゲート）へ青方偏移している。
アルキン‐ＥＬＰ（Ｏ）とのＴＴ１‐アジドの共役を、実施例３に記載の通りに実施し、図２に示すように、ＭＡＬＤＩ ＭＳ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、ＳＥＣ、ＮＭＲ、及びＵＶ‐Ｖｉｓ分光測定分析により確認する。
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析から、ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）との単荷電種［Ｍ＋Ｈ］＋の間で１，１７４Ｄａのシフトがあることが示され、これは理論値（１，１７７Ｄａ）と非常に一致している（図２‐Ａ））。ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）のＳＥＣクロマトグラム（ＲＩ検出）から、６０７ｎｍのＵＶ検出器シグナルと重なる狭い単峰性のピーク分布が示され、ＴＴ１の共役が良好であることが分かる（図２‐Ｄ））。
周囲温度でのＴＴ１‐ＥＬＰ及びＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）バイオコンジュゲートの光学的特性は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、λａｂｓ＝３３７及び６３３ｎｍ）での最大吸収に差はない（図２‐Ｅ））。ポリペプチドとの共役、イオン強度の高い水性環境、及びＴＴ１鎖末端のスタッキングにより、バイオコンジュゲートの吸収ピークはより広域になり、６７３ｎｍ（ＴＨＦ中のＴＴ１）から６３３ｎｍ（ＰＢＳ中のコンジュゲート）へ青方偏移している。
【0125】
実施例５ ‐ ＴＴ１‐ＥＬＰの光照射
本発明に従ったバイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰを含むＤ２Ｏ溶液を、赤色発光ダイオードによる照射に供する。１Ｈ ＮＭＲ分光測定により、メチオニル残基の選択的酸化を追跡する。
３ｍｇのＴＴ１‐ＥＬＰを０．５ｍＬのＤ２Ｏに溶解し、ＮＭＲチューブに移す。ＬＥＤ（Ｌｕｚｃｈｅｍ社製ＬＥＤｉ、赤色領域６３０～６４０ｎｍ、照射量＞２１００Ｗ／ｍ２）照射の５分前、５分後、及び照射の３０分の間、１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し、２００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲで周囲温度でのメチオニル残基の光酸化を監視する。得られたバイオコンジュゲートを本明細書ではＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘと称する。
５分、１０分、１５分、２０分、及び３０分に渡る赤色発光ＬＥＤ照射中のスルホキシド形成は、チオエーテル形態（‐ＳＣＨ３）の硫黄に隣接するメチル基のプロトンに帰属する２．１ｐｐｍの共鳴ピークが、スルホキシド形態（‐Ｓ（Ｏ）ＣＨ３）の２．６ｐｐｍにシフトすることにより確認される。図３Ａ）参照。
５分後に約５０％の酸化が観察され、３０分間の照射でＥＬＰの１１個のメチオニル残基が完全に酸化された。
ＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘとのＳＥＣクロマトグラムを重ね合わせると、狭い単峰性ピーク分布が見られ、骨格中の架橋又は分解の痕跡が全くない酸化プロセスの選択性が確認される（図３‐Ｂ））。ＳＥＣで示され、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルでも観察された二量体集団の増加（図３‐Ｃ））は恐らくＴＴ１鎖末端間の強い疎水性相互作用によるものであろう。
本発明に従ったバイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰを含むＤ２Ｏ溶液を、赤色発光ダイオードによる照射に供する。１Ｈ ＮＭＲ分光測定により、メチオニル残基の選択的酸化を追跡する。
３ｍｇのＴＴ１‐ＥＬＰを０．５ｍＬのＤ２Ｏに溶解し、ＮＭＲチューブに移す。ＬＥＤ（Ｌｕｚｃｈｅｍ社製ＬＥＤｉ、赤色領域６３０～６４０ｎｍ、照射量＞２１００Ｗ／ｍ２）照射の５分前、５分後、及び照射の３０分の間、１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定し、２００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲで周囲温度でのメチオニル残基の光酸化を監視する。得られたバイオコンジュゲートを本明細書ではＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘと称する。
５分、１０分、１５分、２０分、及び３０分に渡る赤色発光ＬＥＤ照射中のスルホキシド形成は、チオエーテル形態（‐ＳＣＨ３）の硫黄に隣接するメチル基のプロトンに帰属する２．１ｐｐｍの共鳴ピークが、スルホキシド形態（‐Ｓ（Ｏ）ＣＨ３）の２．６ｐｐｍにシフトすることにより確認される。図３Ａ）参照。
５分後に約５０％の酸化が観察され、３０分間の照射でＥＬＰの１１個のメチオニル残基が完全に酸化された。
ＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘとのＳＥＣクロマトグラムを重ね合わせると、狭い単峰性ピーク分布が見られ、骨格中の架橋又は分解の痕跡が全くない酸化プロセスの選択性が確認される（図３‐Ｂ））。ＳＥＣで示され、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルでも観察された二量体集団の増加（図３‐Ｃ））は恐らくＴＴ１鎖末端間の強い疎水性相互作用によるものであろう。
【0126】
実施例６‐開始転移温度
ＴＴ１共役前後のＥＬＰの熱応答特性は、１０～６０℃の温度範囲に渡って、それぞれ６００ｎｍ及び５００ｎｍの吸光度を追跡するリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の濁度アッセイにより測定する。測定は、ＴＴ１‐ＥＬＰが１０℃で完全に溶解する３種類の濃度（１０、２０、３０μＭ）で行う。
ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）（メチオニル基の化学酸化により得られる）及びＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘ（メチオニル基の光照射で誘発する酸化により得られる）についても同様の分析を行う。
結果を表１に示す。
ＴＴ１共役前後のＥＬＰの熱応答特性は、１０～６０℃の温度範囲に渡って、それぞれ６００ｎｍ及び５００ｎｍの吸光度を追跡するリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の濁度アッセイにより測定する。測定は、ＴＴ１‐ＥＬＰが１０℃で完全に溶解する３種類の濃度（１０、２０、３０μＭ）で行う。
ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）（メチオニル基の化学酸化により得られる）及びＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘ（メチオニル基の光照射で誘発する酸化により得られる）についても同様の分析を行う。
結果を表１に示す。
【0127】
【0128】
調査した濃度では、ＥＬＰの転移温度（Ｔｔ）は３５～３８℃の範囲にあり、生理的体温に近い。ＴＴ１の共役後、Ｔｔは約１０℃下がることが見出され、ＴＴ１‐ＥＬＰのＴｔの範囲は１０μＭで２９℃～３０μＭで２７℃の範囲である。これは、ＴＴ１の強い疎水特性が原因であると推察した。
動的光散乱は、ＴＴ１‐ＥＬＰのＴｔを超えた温度で１．５μｍの安定した粒子が形成されたことを証明し、このことは、ＴＴ１‐ＥＬＰは生体内で使用されると自己凝集することを示唆している。
臨床応用では、この高性能な自己凝集粒子は、光線力学的治療を行う前にＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートを腫瘍塊の深部まで拡散させるために、腫瘍の局所的凍結サーミア（ｃｒｙｏｔｈｅｒｍｉａ）により分解することが可能である。
動的光散乱は、ＴＴ１‐ＥＬＰのＴｔを超えた温度で１．５μｍの安定した粒子が形成されたことを証明し、このことは、ＴＴ１‐ＥＬＰは生体内で使用されると自己凝集することを示唆している。
臨床応用では、この高性能な自己凝集粒子は、光線力学的治療を行う前にＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートを腫瘍塊の深部まで拡散させるために、腫瘍の局所的凍結サーミア（ｃｒｙｏｔｈｅｒｍｉａ）により分解することが可能である。
【0129】
興味深いことに、ＴＴ１‐ＥＬＰ粒子の分解は、近赤外光によるＴＴ１活性化の際に生成した１Ｏ２によるメチオニル残基の酸化によっても誘発できた。実際、化学酸化した複合体ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）の熱応答性挙動は、ＴＴ１‐ＥＬＰと同様の条件で測定したところ、酸化されていないバイオコンジュゲートと比較して、Ｔｔが大幅に（約１７℃）上昇している。従って、体温をはるかに上回る約４５℃のＴｔでは、酸化バイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）は３７℃で可溶性である。
光酸化したバイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘの熱応答特性を、出発物質ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲート及び化学的酸化した参照化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）の熱応答特性と比較する。ＰＢＳ中の３０μＭでのＴｔは、ＴＴ１‐ＥＬＰの３５℃から４４℃にシフトし、これは、化学合成したスルホキシド形態ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）１で得られる値と完全に一致している。スルホキシド形成によりＥＬＰ骨格の物理化学的特性が劇的に変化し、複合体の相転移温度がシフトすることで、粒子が不安定になり、分解する。
光酸化したバイオコンジュゲートＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘの熱応答特性を、出発物質ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲート及び化学的酸化した参照化合物ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）の熱応答特性と比較する。ＰＢＳ中の３０μＭでのＴｔは、ＴＴ１‐ＥＬＰの３５℃から４４℃にシフトし、これは、化学合成したスルホキシド形態ＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）１で得られる値と完全に一致している。スルホキシド形成によりＥＬＰ骨格の物理化学的特性が劇的に変化し、複合体の相転移温度がシフトすることで、粒子が不安定になり、分解する。
【0130】
実施例７ ‐ 粒度分布分析
ＴＴ１‐ＥＬＰの自己凝集プロファイル及び光酸化誘発分解プロファイルを模倣するために、ＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘについて、生理的条件下（ＰＢＳ ｐＨ７．４、３７℃）で動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行う。結果を図４に示す。
溶液温度を３７℃まで上昇させると、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で大きい粒子（流体力学的直径１．５μｍ）が形成され、一方、温度を２０℃まで低下させると、図４‐Ａ）に示すように、これらの凝集体が分解する。
対照的に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃におけるＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘのＤＬＳ分析から、図４‐Ｂ）に示すように、単鎖又は小型二量体／多量体が存在し、１．５μｍ付近の凝集体は検出されないことが証明されている。
周囲温度でＰＢＳ中にＴＴ１‐ＥＬＰを直接溶解する際のＴＴ１のスタッキング傾向により、６５７ｎｍレーザーを用いて１６５°の角度で行ったＤＬＳ測定では、狭い粒度分布（ＰＤＩ：０．２）の６０ｎｍのミセルが観察される（図５‐Ａ））。温度制御した高速ＡＦＭ画像処理でも、図５‐Ｂ）に示すように、１５℃でもミセルの存在が確認される。
ＴＴ１‐ＥＬＰの自己凝集プロファイル及び光酸化誘発分解プロファイルを模倣するために、ＴＴ１‐ＥＬＰとＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘについて、生理的条件下（ＰＢＳ ｐＨ７．４、３７℃）で動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行う。結果を図４に示す。
溶液温度を３７℃まで上昇させると、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で大きい粒子（流体力学的直径１．５μｍ）が形成され、一方、温度を２０℃まで低下させると、図４‐Ａ）に示すように、これらの凝集体が分解する。
対照的に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃におけるＴＴ１‐ＥＬＰＰｈＯｘのＤＬＳ分析から、図４‐Ｂ）に示すように、単鎖又は小型二量体／多量体が存在し、１．５μｍ付近の凝集体は検出されないことが証明されている。
周囲温度でＰＢＳ中にＴＴ１‐ＥＬＰを直接溶解する際のＴＴ１のスタッキング傾向により、６５７ｎｍレーザーを用いて１６５°の角度で行ったＤＬＳ測定では、狭い粒度分布（ＰＤＩ：０．２）の６０ｎｍのミセルが観察される（図５‐Ａ））。温度制御した高速ＡＦＭ画像処理でも、図５‐Ｂ）に示すように、１５℃でもミセルの存在が確認される。
【0131】
上記の結果から、ＴＴ１に特定の光照射を行うと、ＥＬＰが酸化されてそのスルホキシド誘導体ＥＬＰ（Ｏ）になり、生理的体温で粒子へと自己凝集した本発明の疎水性ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートが、親水性で可溶性のＴＴ１‐ＥＬＰ（Ｏ）誘導体に変化することが分かる。
本発明のバイオコンジュゲートの多応答性挙動に関するこの実験的実証から、臨床応用の点で非常に興味深いものであることが証明されている。実際、光線力学療法に関し、腫瘍部位に蓄積したＴＴ１‐ＥＬＰの自己凝集粒子は、メチオニル残基酸化及びＴｔ増加により、局所光照射すると分解する。その後、可溶性の光酸化したバイオコンジュゲート分子は、密度の高い腫瘍を含む腫瘍組織内に、より容易により深く拡散し、２回目の光照射工程を実施可能にする。次いで、ＴＴ１の再活性化は腫瘍塊をかなり損傷する可能性がある。
本発明のバイオコンジュゲートの多応答性挙動に関するこの実験的実証から、臨床応用の点で非常に興味深いものであることが証明されている。実際、光線力学療法に関し、腫瘍部位に蓄積したＴＴ１‐ＥＬＰの自己凝集粒子は、メチオニル残基酸化及びＴｔ増加により、局所光照射すると分解する。その後、可溶性の光酸化したバイオコンジュゲート分子は、密度の高い腫瘍を含む腫瘍組織内に、より容易により深く拡散し、２回目の光照射工程を実施可能にする。次いで、ＴＴ１の再活性化は腫瘍塊をかなり損傷する可能性がある。
【0132】
実施例８ ‐ 本発明に従ったバイオコンジュゲートを調製する代替方法
工程１：フタロシアニンＴＴ１の活性化
ＴＴ１を、Ｃｉｄら、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」、２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載の方法により得る。
Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルを誘導するＴＴ１の官能化は、下記合成反応スキームに従って行う：
工程１：フタロシアニンＴＴ１の活性化
ＴＴ１を、Ｃｉｄら、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」、２００７年、第４６号（４４）、ｐ．８３５８‐８３６２に記載の方法により得る。
Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルを誘導するＴＴ１の官能化は、下記合成反応スキームに従って行う：
【0133】
【0134】
この活性化反応のために、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）の存在下、ジクロロメタンを溶媒として用い、室温の不活性雰囲気下、標準条件で、ＴＴ１とＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを反応させる。その溶液をジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏで洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。得られた粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（ジオキサン：ヘキサン比１：１）で精製し、ＴＴ１‐ＮＨＳ（８０％）と称する官能化ＴＴ１を暗緑色の固体として得る。
【0135】
工程２：ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートの合成及び精製
本実験では２種のＥＬＰを使用する：
ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］は下記式を有する：
本実験では２種のＥＬＰを使用する：
ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］は下記式を有する：
【0136】
【0137】
ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］は下記式を有する：
【0138】
【0139】
このカップリング反応は下記合成スキームに従って実施する：
【0140】
【0141】
ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］／ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］（１００ｍｇ、１当量）及びＴＴ１‐ＮＨＳ（１．２当量）を含む無水ＤＭＳＯ（２５ｍｇ／ｍＬ－１濃度）の溶液に、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（１当量）を添加し、アルゴンを５分間起泡することにより溶液を脱気する。室温、Ｎ２雰囲気下で反応混合物を４８時間撹拌する。その後、溶液をジエチルエーテル中で沈殿させる。沈殿物を３ｍＬの水に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）１００Ｇカラムで精製する。回収した試料を凍結乾燥し、更に逆遷移サイクル（ＩＴＣ）で精製する。ＴＴ１‐ＥＬＰバイオコンジュゲートのペレットを２０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、透析バッグ（分子量カットオフ値：１５ｋＤａ）中、超純水に対して４８時間透析し、凍結乾燥する。
ＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］：１０１ｍｇ、３．８５μｍｏｌ、９８％
ＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］：９６ｍｇ、２．８４μｍｏｌ、９４％
これらのバイオコンジュゲートの特性評価結果を図６に示す（２０℃、Ｄ２Ｏ中の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図６‐Ａ）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を図２‐Ｂ）に示す）。これらの結果は、本発明に従ったバイオコンジュゲートが良好に合成されたことを証明している。
ＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐６０］：１０１ｍｇ、３．８５μｍｏｌ、９８％
ＴＴ１‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］：９６ｍｇ、２．８４μｍｏｌ、９４％
これらのバイオコンジュゲートの特性評価結果を図６に示す（２０℃、Ｄ２Ｏ中の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図６‐Ａ）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を図２‐Ｂ）に示す）。これらの結果は、本発明に従ったバイオコンジュゲートが良好に合成されたことを証明している。
【0142】
Ｂ／光増感剤としてのベルテポルフィン
材料
以下の試薬を入手した状態のまま使用する：Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９％）、Ｏ‐（１Ｈ‐６‐クロロベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＣＴＵ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＞９８％）、一重項酸素センサーグリーン試薬（ＳＯＳＧ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。
以下の溶媒を、精製を追加せずに使用する：Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｌｕｋａ、９９．８％）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ、ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、９７％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９．９％）、メタノール（ＭｅＯＨ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９．９％）。
光増感剤は、式（Ｘａ）及び（Ｘｂ）の２つの異性体の混合物として使用するベルテポルフィンであり、本明細書ではＶＰ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製、９９．９８％）（３‐［（２３Ｓ，２４Ｒ）‐１４‐エテニル‐５‐（３‐メトキシ‐３‐オキソプロピル）‐２２，２３‐ビス（メトキシカルボニル）‐４，１０，１５，２４‐テトラメチル‐２５，２６，２７，２８‐テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ‐１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１‐ドデカエン‐９‐イル］プロパン酸）と称する。
エラスチン様ポリペプチドは下記式を有するＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］である：
材料
以下の試薬を入手した状態のまま使用する：Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９％）、Ｏ‐（１Ｈ‐６‐クロロベンゾトリアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＣＴＵ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＞９８％）、一重項酸素センサーグリーン試薬（ＳＯＳＧ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。
以下の溶媒を、精製を追加せずに使用する：Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｆｌｕｋａ、９９．８％）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ、ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、９７％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９．９％）、メタノール（ＭｅＯＨ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９９．９％）。
光増感剤は、式（Ｘａ）及び（Ｘｂ）の２つの異性体の混合物として使用するベルテポルフィンであり、本明細書ではＶＰ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製、９９．９８％）（３‐［（２３Ｓ，２４Ｒ）‐１４‐エテニル‐５‐（３‐メトキシ‐３‐オキソプロピル）‐２２，２３‐ビス（メトキシカルボニル）‐４，１０，１５，２４‐テトラメチル‐２５，２６，２７，２８‐テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ‐１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１‐ドデカエン‐９‐イル］プロパン酸）と称する。
エラスチン様ポリペプチドは下記式を有するＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］である：
【0143】
【0144】
これは、例えば文献、国際公開第２０１７／０２１３３４号に記載されているような、以前に報告された手順に従って、大腸菌において組換え操作で生成する。
【0145】
分析方法
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）：ＤＭＳＯ中のＳＥＣ分析は、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）社製Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）３０００システムで行う。このシステムには、Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）及び示差屈折率検出器（ｄＲＩ）も備えられている。東ソー社製ＴＳＫ Ｇ３０００ＨＨＲ及びＧ２０００ＨＨＲ（７．８ｍｍ内径×３００ｍｍ）カラム（排除限界：２００～６０，０００Ｄａ）上、流速０．５ｍＬ・ｍｉｎ－１で複合体を分離する。カラム温度を８０℃に保つ。標準物質としてＰＳＳ社製デキストランを使用する。溶離液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）＋臭化リチウムＬｉＢｒを１ｇ・Ｌ－１使用する。
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）：ＤＭＳＯ中のＳＥＣ分析は、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）社製Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）３０００システムで行う。このシステムには、Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）及び示差屈折率検出器（ｄＲＩ）も備えられている。東ソー社製ＴＳＫ Ｇ３０００ＨＨＲ及びＧ２０００ＨＨＲ（７．８ｍｍ内径×３００ｍｍ）カラム（排除限界：２００～６０，０００Ｄａ）上、流速０．５ｍＬ・ｍｉｎ－１で複合体を分離する。カラム温度を８０℃に保つ。標準物質としてＰＳＳ社製デキストランを使用する。溶離液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）＋臭化リチウムＬｉＢｒを１ｇ・Ｌ－１使用する。
【0146】
マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）：ＳＭＡＲＴ‐ｂｅａｎ ＩＩレーザー（Ｎｄ：ＹＡＧ、３５５ｎｍ）を備えたＡｕｔｏｆｌｅｘ ｍａＸ ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社、ドイツ）上で、ＣＥＳＡＭＯ（フランス、ボルドー）にてＭＡＬＤＩ‐ＭＳスペクトルを測定する。加速電圧１９ｋＶのリニア陽イオンモードでスペクトルを記録する。試料を１０ｍｇ／ｍｌで水に溶解する。ＳＡマトリクス（シナピン酸）溶液は、１０ｍｇのシナピン酸を１ｍＬのアセトニトリル／０．１％水性ＴＦＡ５０／５０ｖ／ｖに溶解して調製する。これらの溶液を、マトリクスと試料との体積比が９０：１０になるように合わせる。得られた溶液の１．５μｌをＭＡＬＤＩプレートに付着させ、風乾する。
【0147】
ＵＶ‐Ｖｉｓ分光測定：異なる複合体の曇点温度（ＴＣＰ）は、多重セル熱電温度制御装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｒｙ１００ＵＶ‐ｖｉｓ分光光度計で、温度に対する７５０ｎｍの吸光度を追跡することにより測定する。濁度は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の３種類の濃度（０．５、１、及び２ｍｇ／ｍＬ、それぞれ１４．５、２９、及び５８μＭに相当）の複合体において、２℃・ｍｉｎ－１の走査速度で１０～５０℃の温度範囲で測定する。ＴＣＰは、吸光度が上昇し始める開始温度とする。
【0148】
ＵＶ‐分光測定によるＶＰ検量線：６９０ｎｍにおけるＤＭＦ中の数種のＶＰ溶液（１３．９μＭ、６．９μＭ、３．５μＭ、１．７μＭ、０．９μＭ）の吸光度を測定することによりＤＭＦ中のＶＰのモル消光係数を計算する。得られた式はｙ＝３５９３４ｘ＋０．０１３６であり、決定係数（Ｒ2）は０．９９８である。従って、定義したεＶＰ‐６９０ｎｍは３５，３９４Ｍ－１・ｃｍ－１である。次に、１ｍｇ／ｍＬのＶＰ‐ＥＬＰバイオコンジュゲートをＤＭＦに溶解する。変換率が１００％であれば、得られた１ｍｇ／ｍＬ溶液の濃度は２９μＭであることが好ましい。ＶＰ‐ＥＬＰの吸光度を測定し、対応する濃度を計算して変換率を求める。
【0149】
動的光散乱（ＤＬＳ）：ＶＰ‐ＥＬＰ、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）、又は光照射したＶＰ‐ＥＬＰのＤＬＳ分析は、ＮａｎｏＺＳ装置（ＨｅＮｅレーザー６３２．８ｎｍ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社、英国）を用い、キュベット内の一定位置において１７３°の角度で行う（ＰＢＳ ｐＨ７．４中、２ｍｇ／ｍＬでの一定散乱体積）。ＣＯＮＴＩＮのようなアルゴリズムを用い、２次キュムラントフィットからＺ平均流体力学直径（ＤＨ）の値を求める。ＤＬＳ温度勾配（１０～５０℃）で測定したＴＣＰを、粒度及びＤＣＲが増加し始める開始温度と定義する。
【0150】
光照射実験：ＶＰ‐ＥＬＰ又はＥＬＰをＰＢＳ ｐＨ７．４に溶解して０．１２５ｍｇ／ｍＬ溶液とし、最終体積２ｍＬで石英キュベットに移す。ＳＯＳＧ（ＭｅＯＨ中３ｍＭ）を、最終ＳＯＳＧ濃度が０．４μＭになるようにＶＰ‐ＥＬＰ又はＥＬＰ溶液に添加する。吸収現象を避けるために条件を最適化する。そのため、濃度は他の分析に比べて低い。照射は攪拌下、６９０ｎｍレーザー（３５ｍＷ、９０ｍＡ）で行う。
【0151】
蛍光測定：一重項酸素センサーグリーン（ＳＯＳＧ）（ブランク）の添加前、ＳＯＳＧ添加直後ではあるが光照射前（Ｔ０）、及び３０分間の異なる光照射時間後（照射の５分、１０分、１５分、２０分、３０分後）に、１５℃で溶液の蛍光スペクトルを測定する。ＳＯＳＧの励起波長は５０４ｎｍである。スペクトル蛍光の記録条件は、走査速度１００ｎｍ／分、応答０．２秒、発光及び励起帯域幅２．５ｎｍ、及びデータ間隔０．５ｎｍである。
【0152】
実施例９ ‐ ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］バイオコンジュゲートの合成及び精製
本カップリング反応は、下記合成スキームに従って実施する：
本カップリング反応は、下記合成スキームに従って実施する：
【0153】
ｒｔ，４０ｈ：室温、４０時間
【0154】
ＶＰ（４２．６ｍｇ、５９．３μｍｏｌ、１０当量）及びＨＣＴＵ（２４．５ｍｇ、５９．３μｍｏｌ、１０当量）を１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、室温で１時間撹拌する。ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］（２００ｍｇ、５．９３μｍｏｌ、１当量）を、ＤＩＰＥＡ（１．５μＬ、１．５当量）を含む３０ｍＬの無水ＤＭＦに１５分間掛けて溶解させ、その後、ＤＭＦ中の活性化ＶＰの溶液を添加する。その溶液をアルゴン雰囲気下、室温で約４０時間撹拌しながら放置する。次いで、溶液をジエチルエーテルで沈殿させ、沈殿物を減圧下で乾燥させる。固体を冷水に溶解し、透析チューブ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）を用いて超純水に対して２日間透析する。溶液を凍結乾燥し、ＶＰ‐ＥＬＰ複合体であるＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］を緑色粉末として得る（１７０ｍｇ、８５％の全収率、９０％の変換率）。
【0155】
実施例１０ ‐ 比較化合物ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］
メチオニル残基の酸化後に本発明のバイオコンジュゲートの特性を調べるために、ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］と同じ構造を有する比較化合物ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］を使用する。但し、ＥＬＰの１１個のメチオニル残基の全ての硫黄原子はスルホキシド形態へと酸化している。ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］は、実施例４に記載の方法に従って、ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］から得る。ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）バイオコンジュゲートであるＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］を合成及び精製するために、実施例９に記載した方法と同じ方法を実施する。
メチオニル残基の酸化後に本発明のバイオコンジュゲートの特性を調べるために、ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］と同じ構造を有する比較化合物ＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］を使用する。但し、ＥＬＰの１１個のメチオニル残基の全ての硫黄原子はスルホキシド形態へと酸化している。ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］は、実施例４に記載の方法に従って、ＥＬＰ［Ｍ１Ｖ３‐８０］から得る。ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）バイオコンジュゲートであるＶＰ‐ＥＬＰ［Ｍ（Ｏ）１Ｖ３‐８０］を合成及び精製するために、実施例９に記載した方法と同じ方法を実施する。
【0156】
実施例１１ ‐ 特徴付け／特性
実施例９のＶＰ‐ＥＬＰバイオコンジュゲート及び実施例１０のＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）バイオコンジュゲートは以下のように特徴付ける。
図７はＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示し、ＶＰ‐ＥＬＰについてはａ／に、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）についてはｂ／に示す。ＶＰ‐ＥＬＰのＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルから、ＶＰ‐ＥＬＰに対応する３４，６０２において大きいピークが見られ、未反応のＥＬＰに対応する３３，８９５において第２の小さいピークが見られる。これら２つのピークの質量差は、ＶＰの理論モル質量（７１８．８ｇ／ｍｏｌ）と一致する。大きいピークが３４，７８７に見られ、第２の小さいピークが３４，０７４に見られるＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）複合体についても同様の結果が得られている。
図８に示すように、ＤＭＳＯ中のＶＰ‐ＥＬＰのＳＥＣ分析は単峰性のピークを示している。
実施例９のＶＰ‐ＥＬＰバイオコンジュゲート及び実施例１０のＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）バイオコンジュゲートは以下のように特徴付ける。
図７はＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の結果を示し、ＶＰ‐ＥＬＰについてはａ／に、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）についてはｂ／に示す。ＶＰ‐ＥＬＰのＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルから、ＶＰ‐ＥＬＰに対応する３４，６０２において大きいピークが見られ、未反応のＥＬＰに対応する３３，８９５において第２の小さいピークが見られる。これら２つのピークの質量差は、ＶＰの理論モル質量（７１８．８ｇ／ｍｏｌ）と一致する。大きいピークが３４，７８７に見られ、第２の小さいピークが３４，０７４に見られるＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）複合体についても同様の結果が得られている。
図８に示すように、ＤＭＳＯ中のＶＰ‐ＥＬＰのＳＥＣ分析は単峰性のピークを示している。
【0157】
ＶＰ単独及びその複合体の吸収スペクトルを図９のそれぞれａ／及びｂ／に示す。ＶＰは６９０ｎｍ付近に優れた吸収係数を示すＱバンドを有しながらも、そのＵＶ‐Ｖｉｓ吸収スペクトルは治療光学ウィンドウが広く、吸収ピークが数点ある。これらの特性は光線力学療法に関連している。ｂ／に示したスペクトルの吸収帯域の比較から、ＶＰがＥＬＰ及び酸化ＥＬＰに良好に結合していることが示されている。
ＶＰ共役後のＥＬＰ及びＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）の熱応答特性は、１０～５０℃の温度範囲で７５０ｎｍの吸光度を追跡するリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の濁度アッセイにより測定する。測定は、ＶＰ‐ＥＬＰ及びＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）が１０℃で完全に溶解する３種類の濃度（０．５、１、及び２ｍｇ／ｍＬ）で行う。結果を図１０に示し、ａ／ではＶＰ‐ＥＬＰについて、ｂ／ではＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）について示している。濃度の関数としての両バイオコンジュゲートのＴＣＰをｃ／に示す。ＶＰの共役後、ＶＰ‐ＥＬＰのＴＣＰは約２２℃である。ＥＬＰが酸化すると、ＴＣＰは約１４℃上昇し、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）のＴＣＰは約３６℃であることが分かる。生理的体温では、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）は容易に分解する不安定領域にある。
ＶＰ共役後のＥＬＰ及びＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）の熱応答特性は、１０～５０℃の温度範囲で７５０ｎｍの吸光度を追跡するリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の濁度アッセイにより測定する。測定は、ＶＰ‐ＥＬＰ及びＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）が１０℃で完全に溶解する３種類の濃度（０．５、１、及び２ｍｇ／ｍＬ）で行う。結果を図１０に示し、ａ／ではＶＰ‐ＥＬＰについて、ｂ／ではＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）について示している。濃度の関数としての両バイオコンジュゲートのＴＣＰをｃ／に示す。ＶＰの共役後、ＶＰ‐ＥＬＰのＴＣＰは約２２℃である。ＥＬＰが酸化すると、ＴＣＰは約１４℃上昇し、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）のＴＣＰは約３６℃であることが分かる。生理的体温では、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）は容易に分解する不安定領域にある。
【0158】
光線力学療法／放射線力学療法（ＰＤＴ／ＲＤＴ）を実現するために必要な特性である、一重項酸素（１Ｏ２）を生成するバイオコンジュゲートの能力を検定する。そのために、一重項酸素センサーグリーン（ＳＯＳＧ）を媒体中に添加する。実際、このセンサーは１Ｏ２と反応し、５２５ｎｍで蛍光を発する。光照射中に蛍光発生を追跡する。測定した蛍光強度を波長発光の関数として表したグラフを図１１に示し、ａ／ではＶＰ‐ＥＬＰについて、ｂ／ではＥＬＰ単独について示している。ＥＬＰをＶＰと共役させた場合、照射時間が長いほど蛍光強度は高い（ａ／）。一方、ＥＬＰ単独では照射下でも蛍光強度は安定している（ｂ／）。この所見から、本発明のＶＰ‐ＥＬＰバイオコンジュゲートにより１Ｏ２が良好に生成されたことが示唆され、これは、ＶＰ‐ＥＬＰ及びＥＬＰについて、測定した蛍光強度を時間の関数として表した図１１におけるｃ／のグラフでも示されている。
【0159】
ＶＰ‐ＥＬＰの光照射の第２の結果をＤＬＳ測定により強調し、その結果を図１２に示す。対象のＺ平均は、異なる照射時点（照射前、照射の１０分後、照射の３０分後）の後に勾配温度（１０～５０℃）で測定する。照射前（「非照射」）では、ＶＰ‐ＥＬＰは低温でクラスターを形成し、温度が上昇するにつれ大きい凝集体を形成する。こうして測定したＴＣＰは２８℃前後である。照射中、ＶＰ‐ＥＬＰのＴＣＰは上昇する。照射から３０分後、ＶＰ‐ＥＬＰのＺ平均曲線（「３０分照射」）は、ＶＰ‐ＥＬＰ‐Ｍ（Ｏ）（「対照」）のものと類似しており、ＴＣＰは３５℃前後である。ＶＰ‐ＥＬＰは小さく不安定なオリゴマー（生理的体温で自発的に分解する）を形成する。従ってＶＰによる１Ｏ２の生成は、光増感剤ＴＴ１での知見と同様に、ＥＬＰ骨格に存在するメチオニン残基の酸化を誘導する。
【0160】
これらの結果から、ＶＰ‐ＥＬＰは生理的体温で自発的に粒子へと自己凝集すること、また、光線力学療法プロセスの光照射工程後に、ＶＰ‐ＥＬＰは、生理的体温付近の値でＬＣＳＴを有し、これが生理的体温での粒子の分解を誘発することが明らかになっている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】