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▶ ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-31
(54)【発明の名称】機能性核酸分子および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240124BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20240124BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240124BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240124BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/19
C12N15/13
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023544676
(86)(22)【出願日】2022-01-26
(85)【翻訳文提出日】2023-09-25
(86)【国際出願番号】 GB2022050206
(87)【国際公開番号】W WO2022162361
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】21153875.6
(32)【優先日】2021-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500219618
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】ポラード、 スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】ケーベル、 ウテ
(72)【発明者】
【氏名】マテュサイティス、 マンタス
(57)【要約】
本発明は、1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーに関する。特に、本開示は、標的細胞に発現する1つ以上の転写因子によって活性化され、転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化時に、有害ペイロードなどの導入遺伝子を発現するために使用される合成スーパーエンハンサーに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサーであって、前記スーパーエンハンサーが異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は前記転写因子の結合部位を含む、スーパーエンハンサー。
【請求項2】
前記スーパーエンハンサー内の2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが300ヌクレオチド長未満であり、特に約160ヌクレオチド長であり、前記スーパーエンハンサーが1200ヌクレオチド長未満であり、特に700ヌクレオチド長未満である、請求項1に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項3】
前記スーパーエンハンサーは、4つのエンハンサー配列を含む、請求項1または請求項2に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項4】
前記スーパーエンハンサーは、少なくとも1つのSOX二量体モチーフおよび/または少なくとも1つのSOXモチーフを含む、請求項1～3のいずれか1項に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項5】
前記SOX二量体モチーフは、配列番号1を含む、請求項4に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項6】
前記SOXモチーフは、配列番号3を含む、請求項4に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項7】
前記スーパーエンハンサーは、表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む、請求項1～6のいずれか1項に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項8】
前記スーパーエンハンサーは、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1～7のいずれか1項に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項9】
各エンハンサー配列は、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20～400ヌクレオチドをさらに含む、請求項1～7のいずれか1項に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項10】
導入遺伝子に作動可能に連結された、請求項1～9のいずれか1項に記載のスーパーエンハンサーを含む、機能性核酸分子。
【請求項11】
前記導入遺伝子が、細胞、治療ペイロードまたはリプログラミング因子における発現のための遺伝子をコードする、請求項10に記載の機能性核酸。
【請求項12】
標的異常細胞で発現される1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサーおよび有害ペイロードを含み、前記ペイロードは、前記転写因子によるスーパーエンハンサーの活性化によって発現される、機能性核酸分子。
【請求項13】
前記転写因子は、前記標的異常細胞において差次的に発現され、任意に、前記転写因子は、発生または幹細胞関連転写因子である、請求項12に記載の機能性核酸分子。
【請求項14】
前記有害ペイロードは、細胞傷害性免疫細胞の動員につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、請求項12または請求項13に記載の機能性核酸分子。
【請求項15】
前記有害ペイロードは、不活性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である、請求項12または請求項13に記載の機能性核酸分子。
【請求項16】
膠芽腫のようながんの治療に使用するための、請求項11から15のいずれか一項に記載の機能性核酸分子を含む組成物。
【請求項17】
SOXファミリーの1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサーであって、前記スーパーエンハンサーが、2つ以上のエンハンサー配列および少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフを含む、スーパーエンハンサー。
【請求項18】
前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が異なる配列を有する、請求項17に記載のスーパーエンハンサー。
【請求項19】
前記スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が300ヌクレオチド長未満であり、特に約160ヌクレオチド長である、請求項17または請求項18に記載のスーパーエンハンサー。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーに関する。特に、本開示は、標的細胞に発現する転写因子によって活性化され、活性化時に標的細胞を殺すために有害ペイロードに結合される合成スーパーエンハンサーに関する。本開示はまた、SOXファミリーの1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療に導入可能な細胞型特異的エンハンサーおよびプロモーターの同定に大きな関心が寄せられており、特に治療蛋白質カーゴが最大用量および標的外効果の低減を確実にするために高度に細胞選択的に発現する必要がある場合に注目されている。しかしながら、現在の戦略の成功は限られており、サイズ、選択性または強度においてしばしば妥協しなければならない。
【0003】
細胞型特異的エンハンサーを同定するために、2つの異なる、しかし相補的な戦略を用いることができる。第1に、関心のある細胞型のための強力で選択的な天然エンハンサーは、関心のある細胞型または系統のための調節ネットワークの系統的な機能的遺伝的解剖から出現するかもしれない。第二に、既知のキー転写因子(TF)の人工的に合成されたDNA結合モチーフに基づいて、完全合成エンハンサーを構築することができる。このようなモチーフのデータベース-通常は約5～10塩基対の長さ-は、JASPAR(Jolmaら2013)のような最強結合の生化学的アッセイに基づいて定義されている。これらの転写因子結合モチーフは合成され、プールされたライブラリー(Jolmaら2013)を用いて全体を通してハイスループットでスクリーニングされ得る。しかしながら、各アプローチには欠点がある。個々の天然エンハンサーは、典型的には表現型アッセイに有用なほど強くないか、サイズの制約または不適切な選択性によって制限される。転写因子結合モチーフのコンカテマー上に構築された人工プロモーターは、発現を誘導することができるが、天然エンハンサー配列に存在し、協働するTFおよび補因子(Farleyら2015)のリクルートに必要な適切な「文法」、すなわち間隔、順序および適切な親和性を持たない。したがって、これらは選択性およびロバスト性を欠いている。
【0004】
プロモーター配列、エンハンサー配列およびそのような配列を同定する方法は、当該技術分野に記載されているが、これらは上述した欠点に苦しんでいる。WO2014066848およびUS2014/0296218は、細胞型特異的遺伝子の発現を調節するために有用であると主張されている天然スーパーエンハンサーおよびそのスーパーエンハンサーを同定するための方法を記載している。WO2017155973は、組換えパルボウイルスに使用するための合成エンハンサー、特に大きな遺伝的ペイロードの送達を可能にするためにサイズを縮小したエンハンサーを記載している。WO2012101191は、転写因子結合部位モチーフ予測を用いて遺伝子の選択的発現のためのプロモーターを設計し、これらのモチーフに基づいて最小化されたプロモーターを作成することを記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、遺伝子治療のような治療法で使用される適切な選択性と活性を有するエンハンサーを提供することが、この分野では依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
第1の態様によれば、1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサーが提供され、スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含む。別の教示では、1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーが提供され、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含み、かつ、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20～400ヌクレオチドを含む。
【0007】
用語「合成」は、通常異なるゲノム遺伝子座に位置する2つ以上のエンハンサー配列が単離され、新しい構築物内で結合されるスーパーエンハンサー構築物を包含することができる。したがって、合成スーパーエンハンサーは自然界に存在せず、人工的または「製造された」と表現されることがある。したがって、本明細書に開示されるのは、1つ以上の転写因子によって活性化される構築物であり、ここで、構築物は、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含む。便宜上、用語「合成スーパーエンハンサー」は、本明細書に記載されるスーパーエンハンサー/構築物のいずれかを包含するために使用される。
【0008】
さらなる態様によれば、本明細書に記載される合成スーパーエンハンサーを含み、導入遺伝子に作動可能に連結された機能性核酸分子が提供される。1つの教示では、機能性核酸分子は、本明細書に記載のスーパーエンハンサー構築物を含み、導入遺伝子に作動可能に連結される
【0009】
更なる態様によれば、標的異常細胞に発現される1つ以上の転写因子により活性化される合成スーパーエンハンサーと有害ペイロードとを含む機能性核酸分子が提供され、前記ペイロードは、転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化により発現される。更なる教示において、標的異常細胞に発現される1つ以上の転写因子により活性化されるスーパーエンハンサー構築物と有害ペイロードとを含む機能性核酸分子が提供され、前記ペイロードは、転写因子によるスーパーエンハンサー構築物の活性化により発現される。
【0010】
更なる態様によれば、SOXファミリーの1つ以上の転写因子により活性化される合成スーパーエンハンサーが提供され、合成スーパーエンハンサーは、2つ以上のエンハンサー配列と、少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフとを含む。1つの教示において、SOXファミリーの1つ以上の転写因子により活性化されるスーパーエンハンサー構築物が提供され、スーパーエンハンサー構築物は、2つ以上のエンハンサー配列と、少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフとを含む。
【0011】
さらなる態様によれば、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々は、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、SOX2により活性化される合成スーパーエンハンサーが提供される。1つの教示において、スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々は、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、SOX2により活性化されるスーパーエンハンサー構築物が提供される。
【0012】
さらなる態様によれば、合成スーパーエンハンサー、スーパーエンハンサー構築物または本明細書に記載される機能性核酸分子を含むベクターが提供される。
【0013】
さらなる態様によれば、本明細書に記載される合成スーパーエンハンサー、スーパーエンハンサー構築物、機能性核酸分子またはベクター、および許容される担体を含む組成物が提供される。
【0014】
さらなる態様によれば、治療に使用するための、本明細書に記載される機能性核酸分子を含む組成物が提供される。
【0015】
さらなる態様によれば、がんの治療に使用するための、本明細書に記載の機能性核酸分子を含む組成物が提供される。
【0016】
さらなる態様によれば、本明細書に記載の有害ペイロードを含む機能性核酸分子を含むキットが提供され、ここで、有害ペイロードは、不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子であり、キットは、機能性核酸分子、ベクターまたは組成物と共に投与するための前記不活性プロドラッグをさらに含む。
【0017】
さらなる態様によれば、本明細書に記載の機能性核酸分子または組成物を患者に投与することを含むがんを治療する方法が提供される。
【0018】
さらなる態様によれば、機能性核酸分子および不活性プロドラッグを患者に投与することを含む神経膠芽腫を治療する方法が提供され、
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による前記合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される。
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による前記合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される。
【0019】
1つの教示において、機能性核酸分子および不活性プロドラッグを患者に投与することを含む、膠芽腫を治療する方法が提供され、
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサー構築物および前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
ここで、前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による前記スーパーエンハンサー構築物の活性化によって発現される。
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサー構築物および前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
ここで、前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による前記スーパーエンハンサー構築物の活性化によって発現される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】SOX2 ChIP-Seqピークから同定された候補全長エンハンサーは相乗的に作用し得、選択的に活性である。(A) 候補エンハンサー270によって示される、mCMVおよび候補エンハンサーによって駆動される構築物の概略図。mCMVの上流におけるGSC7 (B) またはG328 (C) における14候補エンハンサーの活性。完全長CMVプロモーターが陽性対照として提供される。(D) HEK293細胞におけるエンハンサー候補の活性。(E) エンハンサー270クラスタリングの模式図。(F) エンハンサー活性は4×270エンハンサーを一緒にクラスタリングするときに最も高くなる。(G) HEK293細胞におけるクラスタ化エンハンサー構築物の活性。(H) GSCの分化における選択性の概要 (I) SSE‐T4 (パネルKでは「4×Top4」)の活性のフローサイトメトリー。(J)パネル(I)でスコア化した細胞におけるSSE‐T4 (ここではSSE‐4ともいう)の活性の生細胞画像。(K)複数のエンハンサーを組み合わせてテストするための構成設計の概略図。(L) GSC7のルシフェラーゼアッセイにおけるパネルKからの構築物の相対活性 (スケールしない 。対二元配置分散分析、*=p値≦0.05,**=p値≦0.01。すべてのドットは生物学的複製を表す。
【図2】プレートベースのルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたアレイ化プラスミドライブラリ (～4000プラスミド) の機能エンハンサースクリーニング。(A) エンハンサースクリーニングの実験概要。(B) エンハンサースクリーンの結果 (C) Nanoluc DLRアッセイにおける初期スクリーンの135ヒットの検証 (D) ヒットのほとんど (mCMVより10以上) はイントロン領域にある。(E) GSC7, (F) GSC328, (G) HEK293, (H) huFb710におけるトップ17ヒットに対するmNGreen+細胞の%。(I)GSC7, (J)GSC328, (K)HEK293および(L)huFb170におけるmNGreen+細胞のMFI。
【図3】制限酵素アダプタークローニング部位を除去した合成スーパーエンハンサーの比較。(A) 第二世代合成スーパーエンハンサーの設計の概要‐C1は世代2a (974 bp) を表し、Gb1は世代2b (640 bp) を表す。A=20bpアダプター、隣接する白い箱=90bpスペーサー。n=3生物学的複製物。注:サイズの見かけの不一致は、単純化のためにスキームで説明されていない6×4 bpのクローニング部位によるものである。(B) 世代2aおよび世代2b合成スーパーエンハンサー(クローニング部位/アダプターを除去した場合と除去しなかった場合)を比較するためのナノグロDLRアッセイ。(C) 世代2aおよび世代2b合成スーパーエンハンサーのmNGreen+細胞の割合。(D) 世代2aおよび世代2b合成スーパーエンハンサーのmNGreen+細胞のMFI。(E) 世代2aおよび世代2b合成スーパーエンハンサーの代表的な生細胞画像。倍率20倍、スケールバー=50μm。
【0021】
【図4】SSE‐7はGSCおよび前脳神経幹細胞 (NSC) に対して選択性を有する。(A) SSE (SSE-1からSSE-7まで。左の数)を構成する4つの部品の組み合わせの設計の概略図。(B) フローサイトメトリーは、これらすべてがCMVと同様のレベルで活性を有することを確認する。 (C) HEK293細胞では、すべてのSSEは不活性である。(D) ヒト線維芽細胞 (huFb170) では、すべてのSSEは不活性である。(E) 5% FCS を用いた、星状細胞分化中のSSE-7および対照の生細胞画像。 (F) 5% FCS中のSSE-7および対照のmNGreen+細胞の% (G) mNGreen+細胞の 0日目にCMV発現に対して正規化したSSE-7のMFI。(H) ゼブラフィッシュ胚および幼虫におけるSSE-7の評価のための実験概要。(J) 注入対照 (I) 本実験に用いた構築物の概略図。(K) 世代2aプラスミドC1, C3, C5およびC7 (注:これらは、それぞれSSE-1、3、5、および7の後者の派生物に対応し、アダプタシーケンスを含む。)の受精後24および48時間での活性(hpf)。
【図5】複数のタンパク質の発現を駆動するSSE-7に関するフローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの結果 (a) ポリシストロン転写物 (P2A自己切断ペプチド配列を含む) におけるSSE-7からのmCherryおよびHSV-TKv5発現の両方を示す発現カセットの概略図。(b) ウイルス送達 (AAV) によるこの核酸の送達後のmCherry発現レベルを示すフローサイトメトリーデータ。(c) 陽性mCherry発現細胞の%をスコア化するフローサイトメトリーの結果の定量。(d、e、f)はゲート戦略を示す。(g) HSV‐TK蛋白質発現を確認するウェスタンブロット (検出に融合v5 C末端エピトープタグを用いる) 。(h) (g)におけるウェスタンブロット結果の定量。
【図6】細胞毒性は、MTTアッセイおよびインキュサイトのライブイメージングから生じる。(a) 200μM GCV、0.2% DMSO (ビークル対照) または20% DMSO (陽性対照) の存在下で、CMVまたはSSE-7駆動TKv5-P2A-mCherryにより形質導入または非形質導入されたヒトGSC7細胞の経時的コンフルエンス変化。(b) 記載された条件におけるGSC7細胞のMTTアッセイデータの要約。各ドットは生物学的複製を表す。MTT値をビークル対照に正規化した。エラーバーはSD (N=3) を表す。(c) GSC7細胞の3日目と8日目のライブ画像は、200μM GCVの存在下で構築物を形質導入した細胞の細胞数と形態学的変化を示している。 (d) 200μM GCVの存在下で構築物を形質導入した細胞の細胞数と形態学的変化を示すhuFB170細胞の17日目のライブ画像。 (e) 記載された条件におけるhuFB170細胞のMTTアッセイデータの要約。各ドットは生物学的複製を表す。MTT値はビークル対照 (N=1) に正規化した。
【図7】一連のGSCにおけるSSE-7の活性。(A) 発現カセットの模式図。(B) 実験概要 (C) 試験した種々の細胞株にわたる個々の細胞に対する%mCherry発現の結果。GSC7が試験した陽性対照細胞株であった (そこから断片を最初にスクリーニングした) 。E17, E28 (以前はG328と呼ばれていた)、 E21, E31, E34は追加の5つの患者由来膠芽腫細胞株を指す。
【図8】SOX二量体モチーフは活性に大きく寄与し、SOX2とSOX9の両方に結合している。(A) 我々のデータセットのMEMEにより同定されたSOX二量体モチーフは、上位32の活性断片に濃縮されている。(B) TRANSFACデータベース(Huangら2015)からのダイマーSOXEモチーフ。(C) HOMERによる既知モチーフで発見された最強モチーフ。 (D) 転写活性を欠く推定エンハンサーのデータセットで発見されたSOX二量体モチーフのマッピング。(E) (A) からのSOX二量体モチーフの第1世代スクリーンのTop51陽性ヒットへのマッピングは、このモチーフがより高い頻度で発見されることを確認する。断片の活性を左側に示す。(F) DNAをビオチン化プライマーでPCR増幅し、核抽出物とインキュベートした。プルダウン溶出物を質量分析により分析し、結合蛋白質を同定した。(G) ID1101 (すべてのヒト転写因子を表す上の円) によりプルダウンされた蛋白質の要約。SOX2はID1101と相互作用する2つの細胞株間の共有標的である。GSC7とGSC328の間で共有された11のヒットの中には、関心のある3つのタンパク質(ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体の構成要素であるNOC2LおよびDMAP1および基底転写機構の重要な構成要素であるTFIID)がある。いくつかのSOXファミリーメンバータンパク質も単離された。SOX2は (H) GSC7および(I) GSC328においてID1101と選択的に相互作用する。(J) 活性の研究に用いた野生型 (WT) 配列のSOX二量体モチーフ変異体 (S9D1～10) 。野生型配列は配列番号83として含まれ、S9D1～S9D2は配列番号84～85として含まれ、S9D6～S9D9は配列番号86～89として含まれる。(K) GSC7および (L) GSC328におけるSOX二量体モチーフ変異体の活性。(M) SOX9はID1101およびID2904と選択的に相互作用する。配列599はランダムDNA陰性対照である。
【0022】
【図9】脳または神経膠腫関連発現を有する推定標的遺伝子を有するSOX二量体モチーフに濃縮されるエンハンサーの第二世代スクリーニングを実施した。(A) 第二世代のスクリーニングのための候補エンハンサーの選択。(B) SOX二量体モチーフ。(C) SOX二量体モチーフおよび候補標的遺伝子に基づく活性エンハンサーを同定するための第1および (D) 第2スクリーニング。(E) 第2世代SSEの集合の図式およびレポーター遺伝子アッセイを用いたその後の測定。(F) (F) GSC7および (G) huFb170における209の第2世代SSEのスクリーニング。
【図10】二重ペイロードを有する例示的なSSE-7で観察された有意な生存および腫瘍クリアランス。細胞毒性および免疫調節ペイロードのGBM幹細胞選択的発現は、 in vivoでの腫瘍細胞の選択的クリアランスの概念実証を示す。(A) SSE‐7が免疫刺激性サイトカインIL‐12と共に細胞毒性酵素/プロドラッグペイロード (HSV‐TK) の二重発現を駆動するAAVデザインの概略図。これらはSSE‐7により制御される (P2Aを介して) 単一シトロン上で生成され、複合発現を保証する。(B) Kaplan‐Meier生存曲線は、 SSE‐7を用いた遺伝子治療の有意な生存の利点、および治療マウスの長期生存性と毒性の欠如を示す。(CおよびD) 生きたマウスの生物発光イメージングは腫瘍増殖の追跡を可能にする。(C) GBMの免疫応答性マウスモデルでは、腫瘍は急速に増殖し、 3～4週間以内にマウスを殺す。(D) 腫瘍を、SSE駆動ペイロードを有するAAVの直接注射により処理すると、腫瘍は完全に数週間であり、 (C) に示すすべての対照未処理マウスが大きな腫瘍塊を伴って死亡した後5週間以上経過しても腫瘍細胞は検出されない。
【0023】
【図11】mCMVプロモーターはSSE活性には必要ない。(A) SSEに結合したmCMVプロモーターの要求を探索するために用いたmCMV がランダムな配列で置換されているベクター設計の概略図。(B) mCMVの有無によるSSEのフローサイトメトリー分析は、 SSEが機能性を維持し、高度に活性であることを確認する。(C) 転写開始部位から上流にSSEを配置するスペーサーとして機能する、ランダムDNA配列の要求を探索するために使用されるベクター設計の概略図。(D) 活性のフローサイトメトリー分析は、 SSEが配置のための追加のランダム配列なしでも機能するが、活性レベルが低下することを確認する。
【0024】
【図12】患者GSC間のSSE‐7活性の変動性は、 NEUROG2などの神経分化マーカーのレベルと相関する。ここに開示されたSSE構築物は、未成熟GBM幹細胞様細胞に高度に特異的である。細胞がNEUROG2駆動ニューロン分化またはSOX10駆動オリゴデンドロサイト分化のような別の分化経路に入り始めると、 SSEの活性は低下する。(A) SSE‐7‐mCherryレポーター高細胞および低細胞のRNA‐seqプロファイリングにより同定された差次的に発現した遺伝子を示す火山プロット。低発現細胞は幹細胞状態から分化への出口を示す重要な転写因子の豊富な発現を示した。対照的に高発現細胞はSOX2と最も密接に関連するSOX1のレベルを増加させた。(B) (A) からの差次的に発現した上位50遺伝子に対するRNA‐seq遺伝子発現パターンのヒートマップ。矢頭はNEUROG2に言及している。
【0025】
【図13】一連の第二世代SSEはすべてマウスGSCにおける活性を示す。SOXモチーフおよびSOX二量体モチーフに対して濃縮されたエンハンサー断片を含むSSEの活性を評価するためのフローサイトメトリーは、これらすべてがGSCにおいて完全長CMVに匹敵する高レベルの発現を促進することを確認する。
【0026】
【図14】例示的なSSE-7は、レンチウイルスとともに配置された場合にも良好な活性を示す。SSE-7-mCherryレポーターを保有するレンチウイルスで形質導入されたGSCにおけるmCherryレポーターレベルのフローサイトメトリー定量。SSE-7を有するレンチウイルスでは高レベルの発現が達成され、導入遺伝子は (A) と (B) でそれぞれ2つの異なるGSC患者株、 E31とE55を用いて広範囲のウイルスベクターを用いて送達されることが示された。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本開示は、新規 (合成) スーパーエンハンサー (S) SE) に関するものであり、治療および有害ペイロードのような導入遺伝子を送達する革新的な方法を提供する。細胞型特異的遺伝子調節に関する知識の進歩に基づいて、本発明者らは、全長エンハンサー内のコア機能エレメントおよび転写因子モチーフを保持するエンハンサーを人工的に (または合成的に) 組み立てることによってSSEを作成することが可能であると推論した。これには、これらのエンハンサー内の直接転写因子モチーフを囲む自然で機能的な隣接配列を利用することが含まれる。この戦略は、重要な細胞特異的転写因子 (TF) に対する天然の局所的なTF結合コンテキスト (適切な間隔と低親和性) を保持するが、高濃度のTF結合を促進して強い転写を誘発すること、すなわち、細胞型特異的エンハンサー内のTFモチーフの適切な文法(共結合タンパク質の間隔、親和性および配向)を捕捉し、マルチパートアレイとして組み合わせることによって転写活性を高めることを可能にすることを目的としている。本明細書に記載されているように、機能予測されたエンハンサーのコンビナトリアルアセンブリを用いたSSEの構築は、多くの、特に遺伝子治療において多くの応用を有する、強く、しかし高度に細胞型選択的な調節エレメントをもたらすことが見出された。
【0028】
合成スーパーエンハンサー
【0029】
第1の態様によれば、1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサーが提供され、前記スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含む。別の教示において、1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーが提供され、前記合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含み、かつ、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20～400ヌクレオチドを含む。別の教示において、1つ以上の転写因子によって活性化されるスーパーエンハンサー構築物が提供され、スーパーエンハンサー構築物は、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位を含む。
【0030】
本明細書で使用されるように、 「エンハンサー」 は、遺伝子の転写を増強するためにタンパク質(例えば、転写因子)によって結合されるDNA配列 (例えば、 「エンハンサー配列」 ) を指す。用語 「エンハンサー」 は、例えば、転写因子によって結合されるDNAの特定の短い領域 (通常50‐1500 bp) を包含することができる。それにもかかわらず、エンハンサー配列は、直接転写因子モチーフに隣接するまたはこれを囲む配列の一部をさらに含むことができる。エンハンサーは典型的にシス調節エレメントとして作用するが、トランスでも作用することがあり、複数の標的遺伝子を活性化することがある。DNAの折り畳みおよび立体配座により、または多分子コンパートメント(転写ハブまたは凝縮体と呼ばれ、相分離によって形成されることがある)の促進により、エンハンサーは調節される遺伝子の転写開始部位 (TSS) から遠位に位置することがある。対照的に、プロモーターは転写開始部位の近位にある同じDNA配列上のTSSの上流にある。プロモーターは転写を開始するためにRNAポリメラーゼIIに結合する。
【0031】
H3K27Acはエンハンサーによく見られるヒストン修飾であり、エンハンサー活性の領域を予測するために使用できる。配列が遺伝子転写を増強するかどうか (従って 「エンハンサー」 と呼ばれ得る) の決定は、最も典型的にはプラスミドベースのレポーターアッセイを用いて、当該技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
【0032】
スーパーエンハンサーはまた、転写の活性化または調節に関与する。自然界では、用語 「スーパーエンハンサー」 は、通常5～15kbの領域にまたがる複数のエンハンサーのクラスタを含む配列を指す。これらの 「スーパーエンハンサー」 は、平均的なエンハンサーと比較して、メディエーター複合体のような転写コアクチベーターによって高度に占有されている。これらは、平均的なエンハンサーよりも大きな活性を示し、細胞同一性または疾患状態の維持に関与する細胞型特異的遺伝子の発現の駆動にしばしば関与している(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているUS2014/0296218およびUS2014/0287932を参照のこと。)。本明細書における 「スーパーエンハンサー」、 「合成スーパーエンハンサー」 (または 「SSE」 ) またはスーパーエンハンサー構築物という用語は、自然界には存在しないスーパーエンハンサー、すなわち、本明細書に記載された目的のために設計された人工的に構築されたスーパーエンハンサーを意味し、天然スーパーエンハンサーに関連する特徴を示し得ることが理解されるであろう。特に、 SSEは、 2つ以上のエンハンサー配列(異なるゲノム遺伝子座に由来し得る) を含む人工構築物である。ここでも、疑いを避けるために、用語 「SSE」 は、本明細書に記載されるスーパーエンハンサー、合成スーパーエンハンサーおよび/またはスーパーエンハンサー構築物のいずれかを包含するために使用される。SSEは、転写活性化を刺激する転写因子モチーフに対して高度に濃縮され得る。これは、SSEへの高濃度の転写因子結合が転写活性を促進するため、SSE配列が天然のスーパーエンハンサーよりも短いことを可能にする。
【0033】
一実施形態において、本開示は、標的細胞に発現する転写因子、または転写因子のユニークな組み合わせによって活性化されるSSEに結合することにより、導入遺伝子を送達する革新的な方法を提供する。したがって、標的細胞における転写因子 (s) の内因性発現は、非常に選択的な方法で外因性導入遺伝子の発現を開始するために使用される。好ましくは、転写因子は、細胞型または系統特異的な発現パターンを有し、したがって、標的細胞以外の細胞において最小限に発現される、すなわち、遍在的に発現されない。これは、SSEの細胞型または細胞状態選択的活性化、および導入遺伝子の発現を可能にし、それによって標的外毒性を最小限に抑える。一実施形態では、転写因子は標的細胞において、すなわち他の細胞型と比較して、異なって発現される。SSEの使用はまた、導入遺伝子の高発現を提供し、好ましくは、全長サイトメガロウイルス(CMV) プロモーターのような強力なプロモーターを使用する場合の導入遺伝子の発現に近づくか、または同等である。SSEは高度に選択的で、強く、サイズが小さくてもよい (好ましくは500塩基対未満) 。これらは、関連するオープンリーディングフレーム/導入遺伝子の遺伝子発現において、細胞型の同一性または状態に応じて、最小限の発現から非常に強い発現への 「スイッチ」 を提供する。
【0034】
エンハンサーおよびスーパーエンハンサー機能は、最小プロモーター(例えば、最小CMV)のようなプロモーターの存在を含む可能性があり、これは転写機構の動員を促進する重要な領域を含み、典型的にはTSSを含む。別の実施形態では、本開示のSSEは、プロモーターおよび/または最小CMVプロモーターを含まないこともあり得る。
【0035】
本明細書で使用される用語 「転写因子」 は、標的遺伝子の調節エレメンに結合して、標的遺伝子の発現を調節する、例えば、増加または減少するタンパク質を意味する。転写因子 (TF) は、TFに存在するDNA結合ドメインのタイプに基づいて分類されることが多い。真核生物で最も一般的なDNA結合ドメインは、ジンクフィンガー、ホメオドメイン、塩基性ロイシンジッパー、塩基性ヘリックスループヘリックスドメインである。同じDNA結合ドメインを持つTFパラログは、しばしば類似のDNA配列を認識する。本明細書に記載された合成スーパーエンハンサーは、1つ以上の転写因子に結合される、すなわち、1つ以上の転写因子がSSEに結合し、活性化をもたらす。活性化はRNAポリメラーゼIIの動員を介して起こり、それによって関連遺伝子(すなわち導入遺伝子)の発現を活性化し、プロモーター単独による発現レベル以上に転写を増強する。SSEへの転写因子の結合は、それに伴う転写およびクロマチン調節マシーナリーを含み得る。
【0036】
一実施形態では、転写因子は、発生または幹細胞関連転写因子である。これらのタイプの転写因子は、幹細胞または細胞の発生中における高レベルの活性化と関連している。
【0037】
一実施形態では、転写因子はSOXファミリーの転写因子である。転写因子のSOX (SRY関連HMGボックス) 遺伝子ファミリーは、ヒトおよびマウスゲノムにおいて20のメンバーを含み、すべてが high-mobility-group (HMG) ボックスドメインを共有する。高い相同性を持つSOXファミリーメンバーは、グループ(SoxA、SoxB1、SoxB2、SoxC、SoxD、SoxE、SoxF、SoxG、SoxH)に分類される。一実施形態では、転写因子はSoxB1 (SOX1、SOX2、SOX3)またはSoxE (SOX8、SOX9、SOX10)転写因子である。
【0038】
SOX2はがん幹細胞(Bulstrodeら2017、Gangemiら2009、Guerra-Rebolloら2019、Lujan ら2012、D.K.Singhら2017、S.K.Singhら2004、およびBoumahdiら2014)の重要な調節因子として出現している。膠芽腫幹細胞 (GSC) とそれらの分化した子孫のためのChIP‐seqデータセットは、ヒストンH3エンハンサーマーク (H3K27ac) マークとGSCに特有のSOX2結合をカタログ化したSuvaら2014によって報告されている。特に、本発明者らは、多様な患者由来系統にまたがってGSCで作動するSOX2調節エンハンサー候補のセットを同定した。したがって、一実施形態では、転写因子はSOX2である。
【0039】
転写因子は、標的エンハンサー中の特定のモチーフ(すなわち転写因子結合部位)に結合する転写因子のDNA結合ドメインにより結合する。典型的には、転写因子結合部位配列は5～15 bpの長さである。
【0040】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサー (SSE) は、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む。このようなモチーフは、標的細胞におけるSSEの機能にとって重要である可能性があり、例えば、本明細書に記載されたエンハンサー配列の多くは、膠芽腫幹細胞において活性を保持するために必要なSOXダイマーサイトを含むことが示されている。エンハンサーエレメントは、SOX転写因子がホモまたはヘテロ二量体化する可能性のあるSOX結合サイト (ときに回文性配列) を含むことができる。典型的には、個々のモノマー結合モチーフ間の間隔は約8～12bpであろう。
【0041】
一実施形態では、SOX二量体モチーフは、配列番号1:
ACAAAGRGSVBYTKK
を含む。
ここで、
RはAまたはGを表す。SはCまたはGを表す。VはA、CまたはGを表す。BはC、GまたはTを表す。YはCまたはTを表す。KはGまたはTを表す。
ACAAAGRGSVBYTKK
を含む。
ここで、
RはAまたはGを表す。SはCまたはGを表す。VはA、CまたはGを表す。BはC、GまたはTを表す。YはCまたはTを表す。KはGまたはTを表す。
【0042】
さらなる実施形態では、SOX二量体モチーフは、配列番号2:
RRRASARAGRRRBBHDDBWH
を含む。
ここで、
RはAまたはGを表す。SはCまたはGを表す。BはC、GまたはTを表す。HはA、CまたはTを表す。DはA、GまたはTを表す。WはAまたはTを表す。
RRRASARAGRRRBBHDDBWH
を含む。
ここで、
RはAまたはGを表す。SはCまたはGを表す。BはC、GまたはTを表す。HはA、CまたはTを表す。DはA、GまたはTを表す。WはAまたはTを表す。
【0043】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、少なくとも1つのSOXモチーフを含む。更なる実施形態では、SOXモチーフは、SOX2モチーフである。
【0044】
一実施形態では、SOX2モチーフは、配列番号3:
WSARAGRSMYMHTBB
を含む。
ここで、
WはAまたはTを表す。SはCまたはGを表す。RはAまたはGを表す。MはAまたはCを表す。YはCまたはTを表す。HはA、CまたはTを表す。BはC、GまたはTを表す。
WSARAGRSMYMHTBB
を含む。
ここで、
WはAまたはTを表す。SはCまたはGを表す。RはAまたはGを表す。MはAまたはCを表す。YはCまたはTを表す。HはA、CまたはTを表す。BはC、GまたはTを表す。
【0045】
一実施形態において、合成スーパーエンハンサーは、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む。
【0046】
本明細書で説明されるように、スーパーエンハンサーはエンハンサー配列のクラスタを指す。したがって、一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、2つ以上のエンハンサー配列を含む。さらなる実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、2～8のエンハンサー配列を含む。さらに別の実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、4つのエンハンサー配列を含む。
【0047】
エンハンサーエレメントは、当該技術分野で公知の技術を用いて同定することができる。例えば、本明細書に記載された方法は、特定の細胞型のChIP-seqデータセットを用いて、関心のある転写因子に結合したエンハンサーを同定するか、またはクロマチンアクセシビリティアッセイ(例:ATAC-seqまたはMNaseプロファイリング)を使用する。ENCODEまたはThe Cancer Genome Atlas (TCGA) データセットのような、様々な生物および細胞型における活性エンハンサーのゲノムワイド同定を支援するために、公的に利用可能な資源が利用可能である。
【0048】
SSEに存在するエンハンサー配列は、すべてが同じ配列ではない(すなわち、SSEは同一のエンハンサーエレメントのコンカテマーではない)ことが好ましい。したがって、一実施形態では、SSEは、少なくとも2つの異なるエンハンサー配列を含む。一実施形態では、エンハンサー配列の各々は、異なる配列を有する。一実施形態では、エンハンサー配列の各々は、同一の転写因子によって活性化される。
【0049】
ここに提示されたデータは、驚くべきことに異なるゲノム遺伝子座に由来するエンハンサーの4パート配列 (～640 bp) への集合が、選択性を損なうことなく、それらの活性の桁違いの増加をもたらしたことを示している。したがって、SSEで使用されるエンハンサー配列はそれぞれ異なる遺伝子に由来し得る。さらなる実施形態では、エンハンサー配列はそれぞれ異なるゲノム遺伝子座に由来する。これらのエンハンサー配列はそれでもすべて、共通の転写因子または一連の細胞型関連転写因子によって活性化されることが好ましい。一実施形態では、エンハンサー配列のそれぞれは、転写因子によって活性化され、異なるゲノム遺伝子座に由来する。一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上、例えば4つのエンハンサー配列を含む。
【0050】
一実施形態では、エンハンサー配列の各々は、転写因子の結合部位と、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20ヌクレオチドから400ヌクレオチドを含む。これにより、転写因子結合部位を囲む(すなわち、直接上流および/または下流の)文脈がエンハンサー配列に含まれ、したがってエンハンサー機能を保持することができる。間隔、順序、配向および/または親和性を保持する天然エンハンサー配列に典型的に存在する上流および/または下流配列は、協働する転写因子および補因子のリクルートに有用である。加えて、転写因子結合モチーフを囲む配列コンテキストは、結合を促進し、転写効率を高めるために協力的に作用する可能性がある。当業者は、一般に利用可能なゲノムデータベースから、関心のある結合部位の上流および/または下流の20ヌクレオチドから400ヌクレオチドの間の配列を同定/取得することができる。その同じ当業者は、本明細書に記載されているレポーターアッセイまたは当技術分野で広く採用されている他の方法のような機能解析を介して転写因子活性を決定することができる。一実施形態では、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位と、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20ヌクレオチドから400ヌクレオチドを含み、上流および/または下流の配列は、エンハンサーがその機能を維持することを保証するのに十分である。さらなる実施形態では、エンハンサー配列は、転写因子の結合部位の上流および/または下流の20から400ヌクレオチド、例えば、転写因子の結合部位の上流および/または下流の20から300ヌクレオチド、または好ましくは、転写因子の結合部位の上流および/または下流の20から200ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、エンハンサー配列は、転写因子の結合部位の上流および/または下流の50から400ヌクレオチド、例えば、転写因子の結合部位の上流および/または下流の50から300ヌクレオチド、または好ましくは、転写因子の結合部位の上流および/または下流の50から200ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、エンハンサー配列は、転写因子の結合部位の上流および/または下流の80から400ヌクレオチド、例えば、転写因子の結合部位の上流および/または下流の80から300ヌクレオチド、または好ましくは、転写因子の結合部位の上流および/または下流の80から200ヌクレオチドを含む。
【0051】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサー内のエンハンサー配列の各々は、500ヌクレオチド長未満、例えば、450,400,350,300,250または200ヌクレオチド長未満である。更なる実施形態では、SSE内のエンハンサー配列の各々は、300ヌクレオチド長未満である。一実施形態では、合成スーパーエンハンサー内のエンハンサー配列の各々は、20から500ヌクレオチド長であり、例えば、50～250ヌクレオチド長または100から200ヌクレオチド長である。
【0052】
これらの実施形態を組み合わせてもよいことが理解されるであろう。したがって、さらなる実施形態では、エンハンサー配列は転写因子の結合部位の上流および/または下流の20から400ヌクレオチドを含み、エンハンサー配列は500ヌクレオチド長未満である。さらに別の実施形態では、エンハンサー配列は転写因子の結合部位の上流および/または下流の20から200ヌクレオチドを含み、エンハンサー配列は300ヌクレオチド長未満である。
【0053】
さらなる実施形態では、SSE内のエンハンサー配列の各々は、約160ヌクレオチド長である。特に、ヌクレオソーム結合に十分なサイズを提供し、機能エンハンサー内の文法の進化における重要な属性であると考えられるため、160塩基対 (bp) が選択された。さらに、160 bpは、アレイ状プラスミドライブラリのその後の構築のために20 bp末端を組み込んだプールされたオリゴヌクレオチドライブラリの合成に便利なサイズである。
【0054】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは2000ヌクレオチド長未満である。更なる実施形態では、合成スーパーエンハンサーは1500ヌクレオチド長未満であり、例えば、1400、1300、1200、1100、1000,950、900,850、800,750または700ヌクレオチド長未満である。一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは1200ヌクレオチド長未満である。更なる実施形態では、合成スーパーエンハンサーは700ヌクレオチド長未満である。好ましくは、合成スーパーエンハンサーは、640ヌクレオチド長などの650ヌクレオチド長未満である。
【0055】
本明細書に記載されるモチーフは、SSE のエンハンサーの一つ以上に存在してもよい(たとえば、図8E参照)。したがって、一実施形態では、エンハンサーの一つ以上は、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む。
【0056】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサー内のエンハンサー配列の各々は、SOX2モチーフのようなSOXモチーフを含む。一実施形態では、合成スーパーエンハンサー内のエンハンサー配列の各々は、SOX二量体モチーフを含む。
【0057】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、SOX2によって活性化され、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々は、少なくとも1つのSOX二量体モチーフおよび/または少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む。一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、SOX2によって活性化され、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々は、少なくとも1つのSOX2モチーフを含む。一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、SOX2によって活性化され、合成スーパーエンハンサーは、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々は、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む。
【0058】
一実施形態では、1つ以上のエンハンサー配列は、配列番号4-63 (表1) からなる群から選択された配列に対して、少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、1つ以上のエンハンサー配列は、配列番号4-13および56-63からなる群から選択された配列に対して、少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。さらに別の実施形態では、1つ以上のエンハンサー配列は、配列番号4-63 (例えば、配列番号4-13および56-63)からなる群から選択された配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、99%の配列同一性を有するか、または100%同一である。本明細書に記載されるエンハンサー配列(すなわち表1)は、少なくとも1つの(20未満、10未満、5未満など)ヌクレオチド置換、欠失または付加によって修飾され得るが、ここで、変異エンハンサー配列は、実質的に配列の機能特性を保持する。本明細書に提供されるエンハンサー配列の変異体は、依然として、記載されたエンハンサー配列の機能的活性を保持することを意図していることが理解されるであろう。例えば、実施例4は、記載されたエンハンサー配列が、Nanoglo DLRアッセイを用いて試験されたとき、mCMVよりも10倍以上増加したことを示す。したがって、この範囲内に含まれる変異エンハンサー配列は、開始配列の活性の75%未満の活性を有するべきではない。
【0059】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む。したがって、SSEは、配列番号4-63からなる群から選択される1つ以上のエンハンサー配列を含むことができる。マルチパートアレイにおけるこれらのエンハンサー配列の配列は、細胞特異性を損なうことなく、転写活性を増加させることができることを示すデータをここに提示する。さらなる実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、表1に提示された配列から選択された1から8、2から6、または3から5のエンハンサー配列を含む。さらに別の実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、表1に提示された配列から選択された4つのエンハンサー配列を含む。
【0060】
1つの実施形態では、SSEは、配列番号4～36からなる群から選択された1つ以上のエンハンサー配列を含む。別の実施形態では、SSEは、配列番号37～63、より好ましくは配列番号54～63からなる群から選択された1つ以上のエンハンサー配列を含む。
【0061】
1つの実施形態では、SSEは、配列番号4～13および54～63からなる群から選択された1つ以上のエンハンサー配列を含む。
【0062】
さらなる実施形態では、SSEは、配列番号4～36、例えば4～13、特に4～8からなる群から選択される4つのエンハンサー配列を含む。別の実施形態では、SSEは、配列番号37～63からなる群から選択される4つのエンハンサー配列、好ましくは配列番号54～63からなる群から選択される4つのエンハンサー配列、より好ましくは配列番号56～63からなる群から選択される4つのエンハンサー配列を含む。
【0063】
SSEは、表2に記載される配列を含むことができる。一実施形態では、合成スーパーエンハンサーは、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む。更なる実施形態では、配列は、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、99%の配列同一性を有するか、または100%同一である。更なる実施形態では、SSEは、配列番号70を含む。本明細書に提供される配列の変異体は、依然として、記載されたSSEの機能的活性、すなわち、転写因子によるSSEの活性化時の導入遺伝子発現を保持することを意図している。
【0064】
2つの密接に関連するポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列との間の 「%配列同一性」 は、ヌクレオチド配列 の標準設定 (BLASTN) を用いて、NCBI BLAST v2.0を用いて計算することができる。2つの密接に関連するポリペプチド配列を比較する目的で、第1のポリペプチド配列と第2のポリペプチド配列との間の 「%配列同一性」 は、ポリペプチド配列 の標準設定 (BLASTP) を用いて、NCBI BLAST v2.0を用いて計算することができる。
【0065】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、その全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合、他のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列と同じまたは 「同一」 であると言われる。配列中の残基は左から右に、すなわち、ポリペプチドの場合はN-末端からC-末端に、ポリヌクレオチドの場合は5’から3’末端に番号が振られている。
【0066】
配列間の 「違い」 とは、第1の配列と比較して、第2の配列のある位置における単一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの挿入、欠失または置換を指す。2つのポリヌクレオチド配列は、1つまたは2つ以上のそのようなヌクレオチドの違いを含むことができる。2つのポリペプチド配列は、1つまたは2つ以上のそのようなアミノ酸の違いを含むことができる。そうでなければ第1の配列と同一 (100%配列同一性) である第2の配列における挿入、欠失または置換は、%配列同一性を減少させる。
【0067】
あるいは、第1の参照配列を第2の比較配列と比較する目的で、第2の配列を生成するために第1の配列に対して行われた追加、置換および/または欠失の数を確認することができる。「追加」 とは、第1の配列への1つのアミノ酸残基/ヌクレオチドの追加である (第1の配列のいずれかの末端での追加を含む) 。「置換」 とは、第1の配列の1つのアミノ酸残基/ヌクレオチドが1つの異なるアミノ酸残基/ヌクレオチドで置換されることである。ポリペプチド配列に関しては、置換は保存的または非保存的である。ポリヌクレオチド配列に関しては、置換は同義または非同義である。「欠失」 とは、第1配列からの1つのアミノ酸残基/ヌクレオチドの欠失である (第1配列のいずれかの末端における欠失を含む) 。
【0068】
一実施形態では、合成スーパーエンハンサーはさらに転写調節因子、すなわち遺伝子発現を制御する配列 (またはタンパク質をコードする配列) を含む。
【0069】
別の態様によれば、合成スーパーエンハンサーは、2つ以上のエンハンサー配列および少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフを含む、SOXファミリーの1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーが提供される。機能性核酸分子の合成スーパーエンハンサーに適用される本明細書に記載の実施形態は、この態様にも適用されることが理解される。
【0070】
さらなる態様によれば、合成スーパーエンハンサーが、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、エンハンサー配列の各々が、少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフを含む、SOX2によって活性化される合成スーパーエンハンサーが提供される。
【0071】
機能性核酸分子
【0072】
SSEは、機能性核酸分子を形成する付加的なエレメントを含む構築物中に存在することができる。したがって、さらなる態様によれば、本明細書に記載の合成スーパーエンハンサーを含み、導入遺伝子に作動可能に連結された機能性核酸分子が提供される。
【0073】
さらに別の態様によれば、標的異常細胞に発現される1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーと有害ペイロードとを含み、前記ペイロードは、転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される機能性核酸分子が提供される。
【0074】
機能性核酸分子は、SSEおよび導入遺伝子に対する追加の成分を含み得る。例えば、合成スーパーエンハンサーは、プロモーターに作動可能に連結され得る。適切なプロモーターは、当技術分野において公知である。一実施形態では、プロモーターは、最小CMVプロモーターである。一教示では、SSEは、プロモーターに動作可能に連結されていないかもしれない。別の実施形態では、スーパーエンハンサーに動作可能に連結されたプロモーターは、最小CMVプロモーターではない。
【0075】
導入遺伝子
【0076】
本明細書に記載されるように、SSEsは導入遺伝子の発現を増強するために使用され得る。一実施形態では、導入遺伝子は細胞における発現のための外因性配列であり得る。一教示では、導入遺伝子は、生物学および医学において有用な産物をコードする配列であり、例えば、予防的または治療的導入遺伝子、例えば、タンパク質または非タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドである。したがって、導入遺伝子は、治療的ペイロードをコードし得る。例えば、治療的ペイロードは、抗原、抗体、サイトカイン(例えば、免疫原性反応を誘導する)、腫瘍抑制タンパク質(例えば、天然/未変異p53)、分化因子(すなわち、細胞の運命または同一性を調節または再プログラムする)、または核酸編集または遺伝子活性調節機能を有するタンパク質(例えば、DNAまたはRNAの編集、または転写調節)、または他の方法で細胞表現型(例えば、運動性、ECM産生、細胞老化または静止)を変更するタンパク質などの治療タンパク質を含み得る。別の実施形態では、導入遺伝子は、RNA (mRNA以外) 、例えばmiRNA、siRNA、shRNAまたはIncRNAなどのオリゴヌクレオチドをコードする非タンパク質をコードする。非コードRNAをコードする導入遺伝子は、遺伝子サイレンシングの方法において使用され得ることが理解されるであろう。
【0077】
一実施形態において、機能性核酸分子は、1つ以上の導入遺伝子を含む。したがって、当業者には、導入遺伝子の異なる組合せが含まれ得ることが理解されるであろう。
【0078】
更なる態様によれば、標的細胞において導入遺伝子を発現する方法が提供され、それは、本明細書に記載の合成スーパーエンハンサーに作用的に連結された導入遺伝子を発現することを含み、前記転写因子の1つ以上が標的細胞において発現される。
【0079】
有害ペイロード
【0080】
本明細書に記載されるように、SSEに作動可能に連結された導入遺伝子は、有害ペイロードをコードし得る。本明細書で使用される用語 「有害ペイロード」 は、標的細胞に悪影響を及ぼすペイロードを意味する。悪影響は、例えば、細胞の健康または生存性および/または細胞の分裂能力に対する悪影響であり得る。悪影響は、直接的に(例えば、導入遺伝子は、アポトーシス促進遺伝子または自殺遺伝子のような細胞に有害な物質をコードする)または間接的に(例えば、導入遺伝子は、細胞に有害な影響をもたらす外部因子をリクルートする物質をコードする)達成され得る。
【0081】
有害ペイロードは、標的細胞に悪影響を及ぼす免疫応答を刺激するために使用され得る。このような反応は、例えば、局所免疫微小環境を変化させる。一実施形態では、有害ペイロードは、細胞毒性免疫細胞の活性化につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする。一実施形態では、有害ペイロードは、ケモカイン、サイトカイン、抗体または他の免疫調節タンパク質から選択される。さらなる実施形態では、有害ペイロードは、炎症誘発性サイトカインであり、例えば、IL-12、IL-10、IL-2、IFN-αおよびGM-CSFから選択されるサイトカインである。例えば、有害ペイロードは、抗がん活性を有することが示されているIL-12のようなサイトカインであり得る。IL-12は、休止および活性化CD 4+T細胞、CD 8+T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞によるIFN-γ産生の誘導を引き起こすだけでなく、活性化T細胞およびNK細胞の増殖を増強し、NK/リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を増加させ、特異的細胞傷害性Tリンパ球 (CTL) 応答を促進する。しかし、IL-12は過剰な毒性のため全身治療として投与することはできず、したがって、標的細胞内でのみ発現する標的療法は、このペイロードの送達を可能にする。
【0082】
「免疫応答」 とは、免疫系(細胞性応答、体液性応答、サイトカイン応答、ケモカイン応答を含むがこれらに限定されない)の少なくとも1つの細胞、1つの細胞型、1つの内分泌経路、または1つの外分泌経路における測定可能な変化である。
【0083】
「免疫細胞」 とは、CD34+細胞、B細胞、CD45+ (リンパ球共通抗原) 細胞、アルファ－ベータT細胞、細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、形質細胞、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、食細胞、顆粒球、自然リンパ球、ナチュラルキラー (NK) 細胞およびガンマデルタT細胞を含むが、これらに限定されない免疫系の細胞として定義される。典型的には、免疫細胞をサブ集団に分化させるために、免疫細胞を同定またはグループ化またはクラスタ化するために、コンビナトリアル細胞表面分子分析(例えば、フローサイトメトリーによる)を用いて免疫細胞は分類される。ペイロードが有害なペイロードである本開示の分子および方法では、刺激された免疫応答は標的細胞に悪影響を及ぼすことを意図している。「細胞傷害性免疫細胞」 という用語は、細胞死をもたらす免疫細胞、特に細胞傷害性T細胞 (キラーT細胞としても知られる) を指す。
【0084】
一実施形態では、有害ペイロードは細胞傷害性物質(すなわち、細胞毒性ペイロード)をコードする。
【0085】
一実施形態では、有害ペイロードは自殺遺伝子である。自殺遺伝子は、細胞死を引き起こすタンパク質を発現する遺伝子である。あるいは、自殺遺伝子が機能するためには、外部から供給される補因子または補薬(例えばプロドラッグ)が必要な場合もある。その後、補因子または補薬は、自殺遺伝子の産物によって細胞毒性物質に変換される。一実施形態では、自殺遺伝子は、不活性なプロドラッグを細胞毒性物質に変換することができるタンパク質をコードする。不活性なプロドラッグは、機能性核酸分子と同時にまたは順次に投与することができる。
【0086】
一実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ (HSV-TK) である。特に、HSV-TK遺伝子は、プロドラッグ、ガンシクロビル (GCV) またはその類似体、例えばアシクロビルおよびバラシクロビルと組み合わせて使用される。別の実施形態では、自殺遺伝子はシトシンデアミナーゼ (CD) である。特に、CD遺伝子は、プロドラッグ5-フルオロシトシン (5FC) と組み合わせて使用される。
【0087】
標的細胞
【0088】
本明細書に記載される機能性核酸分子は、様々な細胞型を標的とするために使用することができる。特に、細胞は、ヒト細胞のような哺乳類細胞である。本開示は、有害なペイロードの存在を含み得るので、異常細胞(すなわち、健康でない細胞のような異常な細胞)を標的とするのに適している。
【0089】
異常細胞は、過増殖細胞、すなわち、過剰で異常な増殖を有する細胞であり得る。一実施形態では、異常細胞は、がん細胞または腫瘍細胞である。この実施形態では、有害ペイロードは、抗がんペイロードであり得る。
【0090】
SOX2は、がん遺伝子として同定されているため、他の異常細胞、特にがん細胞においても増幅され得る。本開示の方法を用いて標的とすることができる他の異常細胞の例には、肺および食道の扁平上皮がん、ならびに他の多くが含まれる。
【0091】
一実施形態において、異常細胞は、以下から選択されるがん細胞である:膠芽腫幹細胞、神経膠腫細胞、肺がん細胞 (特に扁平上皮がん細胞) 、食道がん細胞、卵巣がん細胞、乳がん細胞、口腔がん細胞(例、口腔、舌、咽頭)、胃がん細胞、小腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、直腸がん細胞、肝臓がん細胞、胆管がん細胞、胆嚢がん細胞、膵臓がん細胞、骨がん細胞(例えば骨肉腫)、皮膚がん細胞、子宮がん細胞、前立腺がん細胞、精巣がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、網膜がん細胞、甲状腺がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞または白血病細胞。
【0092】
特定の実施形態では、異常細胞は膠芽腫幹細胞である。膠芽腫は、マスター調節神経幹細胞関連転写因子のレベル/活性の上昇によって駆動される神経膠腫の侵攻性の形態である。膠芽腫幹細胞 (GSC) は、しばしば、神経幹細胞アイデンティティに必要な重要なマスター調節因子および再プログラミング因子であるSOX2を含む、重要な神経発達転写因子の発現または活性の上昇を有する(Bulstrodeら2017、Gangemiら2009、Guerra-Rebolloら2019、Lopez-Bertoniら2015、MacLeodら2019)。GSCにおけるSOX2のノックダウンは、それらの腫瘍形成性を低下させるが(Gangemi他2009)、POU3F2、OLIG2およびSALL2とともにその異所性発現は、GSC状態を強制する(Suvaら2014)。ここに提示された例は、GSC選択的SSEがアデノ随伴ウイルス(AAV) において活性を保持し、GSCの標的化殺傷のための細胞毒性ペイロードの発現を駆動するために使用されることを示す。さらに、SSEの活性はGSCの分化中に消失し、HEKまたは線維芽細胞には存在しなかった。したがって、プロモーターの強度が大幅に増加したにもかかわらず、GSCの選択的発現は維持された。
【0093】
ベクター
【0094】
さらなる態様によれば、本明細書に記載の合成スーパーエンハンサーまたは機能性核酸分子を含むベクターが提供される。
【0095】
本明細書で使用される用語 「ベクター」 は、機能性核酸分子を輸送することができる分子を意味する。ベクターの1つのタイプは 「プラスミド」 であり、これは、追加のDNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを意味する。ベクターのもう1つのタイプはウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的な複製を行うことができる(例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター、および哺乳類および酵母のエピソームベクター)。他のベクター(例えば非エピソード哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作的に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書では 「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術における有用性の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。
【0096】
例示的な発現ベクターは、当該技術分野において公知であり、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンウイルスベクター)、ファージベクター、コスミドベクター等を含むことができる。発現ベクターの選択は、使用される宿主細胞のタイプおよび使用目的に依存してもよい。
【0097】
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクター、特に遺伝子治療アプリケーションで使用されるものは、当該技術分野でよく知られている。そのようなウイルスは、一本鎖 (ss) または二本鎖 (ds) のいずれかのゲノムを有するRNAおよびDNAウイルスであり得る。例えば、ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス (AAV) 、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス (HSV) 、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス (NDV) 、ポックスウイルスおよびピコルナウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。インサート容量および指向性は変化し得るため、ウイルスベクターは、意図された用途に基づいて選択され得る。
【0098】
AAVベクターは、安全性が向上しているため、最適な遺伝子治療ウイルスベクターとしてますます好まれている。しかし、その制限は、貨物サイズが小さいことである。ここに記載されているSSE 4パートアセンブリは、AAVに理想的に適している。したがって、一実施形態では、ベクターはAAVである。異なるAAV血清型は、その指向性が異なるため、使用されるAAVベクターのタイプは、標的とする組織のタイプに応じて選択することができる。AAVベクターは、当該技術分野で公知の多数の血清型、例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10またはAAV11のいずれかから選択されてもよく、または非天然変異体であってもよい。一実施形態では、AAVは、AAV1、AAV2またはAAV5から選択される。
【0099】
さらなる態様によれば、本明細書に記載の合成スーパーエンハンサーおよび導入遺伝子(すなわち、治療用ペイロードのようなペイロード)を含むベクターが提供される。本明細書に記載のように、合成スーパーエンハンサーは、プロモーターなどの他の発現エレメントに作動可能に連結され得る。
【0100】
組成物およびキット
【0101】
本開示はまた、本明細書に記載される機能性核酸分子またはベクターを含む組成物に関する。組成物は、ウイルスベクター(AAV、レンチウイルス等)および非ウイルスベクター(ナノ粒子、脂質粒子等)による前記機能性核酸分子の送達を可能にする成分を含むことができる。
【0102】
さらなる態様によれば、合成スーパーエンハンサー、本明細書に記載の機能性核酸分子またはベクター、および許容可能な担体を含む組成物が提供される。適切な担体は、当技術分野において公知である。特定の態様において、担体は、1つ以上の機能性核酸分子による標的細胞のトランスフェクションを促進する能力に基づいて選択される。
【0103】
さらなる態様によれば、治療に使用するための、本明細書に記載の機能性核酸分子またはベクターを含む組成物が提供される。
【0104】
さらなる態様によれば、がんの治療に使用するための、本明細書に記載の機能性核酸分子またはベクターを含む組成物が提供される。
【0105】
さらなる態様によれば、特にがんの治療のための、医薬の製造のための、本明細書に記載の機能性核酸分子 (またはベクターまたは組成物) の使用が提供される。
【0106】
さらなる態様によれば、本明細書に記載の機能性核酸分子を含むキットが提供され、ここで、有害ペイロードは、不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である。したがって、この態様において、キットは、不活性プロドラッグ(すなわち、機能性核酸分子と投与するための)をさらに含む。
【0107】
治療方法
【0108】
さらに別の態様によれば、本明細書に記載の機能性核酸分子、ベクターまたは組成物を患者に投与することを含む疾患の治療方法が提供される。
【0109】
「被験者」、「患者」または「個人」という用語は、治療される対象、特に哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象には、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜(牛など)、スポーツ動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどのペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象はマウスのような非ヒト哺乳動物である。
【0110】
本明細書で使用されるように、疾患または障害を「治療する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度および/または重症度を減少させることを意味する。
【0111】
一実施形態では、疾患はがんである。本明細書で使用される「がん」は、細胞の異常な増殖または分裂を意味する。一般に、がん細胞の増殖および/または寿命は、その周囲の正常な細胞および組織の増殖および/または寿命を超え、それらと協調しない。がんには、良性、前悪性、悪性がある。がんには、原発がんと二次がんがある。原発がんは、がんが発生した最初の臓器または組織であるが、二次がんは、原発がんが体内の別の部位に広がった(または転移した)結果である。
【0112】
がんは、口腔(例、口腔、舌、咽頭)、消化器系(例、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肝臓、胆管、胆嚢、膵臓)、呼吸器系(例、喉頭、肺、気管支)、骨、関節、皮膚(例、基底細胞、扁平上皮、髄膜腫)、乳房、生殖器系(例、子宮、卵巣、前立腺、精巣)、泌尿器系(例、膀胱、腎臓、尿管)、眼、神経系(例えば脳)、内分泌系(例えば甲状腺)、造血系(例えば、リンパ腫、骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病)など、様々な細胞および組織に発生する。
【0113】
別の実施形態では、がんは、中枢神経系に位置する原発性または二次性がんなど、脳または脊髄(すなわち中枢神経系)に位置するがんである。本開示は、膠芽腫の治療における特別な使用を見出す。
【0114】
機能性核酸分子(またはベクターまたは組成物)は、静脈内、動脈内、心臓内、皮膚内、皮下、腹腔内、筋肉内または経口のような、意図された治療のための任意の適切な送達様式によって投与され得る。一実施形態では、機能性核酸分子、ベクターまたは組成物は、全身的に投与される。投与は疾患部位へ直接的にすることもある。したがって、一実施形態では、機能性核酸分子、ベクターまたは組成物は、局所的に、例えば腫瘍内など臓器または組織に直接投与される。
【0115】
さらなる態様によれば、神経膠芽腫を治療する方法であって、機能性核酸分子および不活性プロドラッグを患者に投与することを含み、
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される、
神経膠芽腫を治療する方法が提供される。
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび前記不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞における前記SOX転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される、
神経膠芽腫を治療する方法が提供される。
【0116】
一実施形態では、不活性プロドラッグは、機能性核酸分子と同時にまたは順次に投与される。
【0117】
治療方法は、治療的に有効な量の投与を含むことが理解されるであろう。用語「治療的に有効な量」は、疾患または障害の症状を改善または治療するために有効な量である。治療的に有効な量は、予防が治療とみなされることがあるので、「予防的に有効な量」であり得る。
【0118】
本明細書に記載された実施形態は、開示のすべての側面に適用することができることが理解されるであろう。すなわち、使用のために記載された実施形態は、クレームされた方法などに同様に適用することができる。
【0119】
項
【0120】
開示とその好ましい側面を定義する一連の項は以下のとおりである。
項1. 1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサーが、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位と、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20～400ヌクレオチドとを含む合成スーパーエンハンサー。
項2. 前記合成スーパーエンハンサー内の2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが300ヌクレオチド長未満、特に160ヌクレオチド長である、項1記載の合成スーパーエンハンサー。
項3. 前記合成スーパーエンハンサーが、1200ヌクレオチド長未満、特に700ヌクレオチド長未満である、項1または項2記載の合成スーパーエンハンサー。
項4. 前記合成スーパーエンハンサーが、4つのエンハンサー配列を含む、項1から項3のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項5. 前記転写因子がSOXファミリーの転写因子である、項1～4のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項6. 前記合成スーパーエンハンサーが、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、項1～5のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項7. 前記SOX二量体モチーフが、配列番号1を含む、項6に記載の合成スーパーエンハンサー。
項8. 前記合成スーパーエンハンサーが、少なくとも1つのSOXモチーフを含む、項1から項5のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項9. 前記SOXモチーフが、SOX2モチーフである、項8に記載の合成スーパーエンハンサー。
項10. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項8または項9に記載の合成スーパーエンハンサー。
項11. 前記合成スーパーエンハンサーが表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む、項1から項10のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項12. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項1から項11のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項13. 前記合成スーパーエンハンサーが、さらに転写調節因子を含む、項1から項12のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項14. 導入遺伝子に作動可能に連結された、項1から項13のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーを含む、機能性核酸分子。
項15. 前記導入遺伝子が治療ペイロードをコードする、項14記載の機能性核酸分子。
項16. 前記導入遺伝子が有害ペイロードをコードする、項14記載の機能性核酸分子。
項17. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性免疫細胞の動員につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、項16記載の機能性核酸分子。
項18. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性物質をコードする、項16記載の機能性核酸分子。
項19. 前記有害ペイロードが、不活性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である、項1から項18のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
項20. 前記合成スーパーエンハンサーがプロモーターに作用可能に連結されている、項14から項19のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項21.標的異常細胞に発現する1つ以上の転写因子により活性化される合成スーパーエンハンサーと有害ペイロードとを含み、前記ペイロードは、転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化により発現される、機能性核酸分子。
項22. 前記転写因子が標的異常細胞において差次的に発現される、項21記載の機能性核酸分子。
項23. 前記転写因子が発生または幹細胞関連転写因子である、項21または項22記載の機能性核酸分子。
項24. 前記転写因子がSOXファミリーの転写因子である、項21から項23のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
項25. SOX2によって活性化される項21から項24のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項26. 前記合成スーパーエンハンサーが少なくとも一つのSOX二量体モチーフを含む、項21から項25のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項27. 前記SOX二量体モチーフが配列番号1を含む、項26に記載の機能性核酸分子。
項28. 前記合成スーパーエンハンサーが少なくとも1つのSOXモチーフを含む、項21から項25のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項29. 前記SOXモチーフがSOX2モチーフである、項28に記載の機能性核酸分子。
項30. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項28または項29に記載の機能性核酸分子。
項31. 前記合成スーパーエンハンサーが2つ以上のエンハンサー配列を含む、項21から項30のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項32. 前記合成スーパーエンハンサーが4つのエンハンサー配列を含む、項21から項31のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項33. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なる配列を有する、項31または項32に記載の機能性核酸分子。
項34. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なるゲノム遺伝子座に由来する、項31から項33のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項35. 前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が300ヌクレオチド長未満、特に約160ヌクレオチド長である、項31から項34のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項36. 前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む、項31から項35のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項37. 前記合成スーパーエンハンサーが、表1に示される一つ以上のエンハンサー配列を含む、項21から項36のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項38. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項21から項37のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項39. 前記合成スーパーエンハンサーが、プロモーターに作動可能に連結されている、項21から項38のいずれか一項に記載の機能性核酸。
項40. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性免疫細胞の動員につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、項21から項39のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項41. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性物質をコードする、項21から項39のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項42. 前記有害ペイロードが、不活性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である、項1から項41のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項43. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ (HSV-TK) 遺伝子であり、プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビルまたはバラシクロビルである、項42に記載の機能性核酸分子。
項44. 前記異常細胞ががん細胞または腫瘍細胞であり、前記有害ペイロードが抗がんペイロードである、項21から項43のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項45. 前記異常細胞が膠芽腫幹細胞である、項21～44のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項46. 前記合成スーパーエンハンサーが、2つ以上のエンハンサー配列および少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフを含む、SOXファミリーの1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項47. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なる配列を有する、項46に記載の合成スーパーエンハンサー。
項48. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なるゲノム遺伝子座に由来する、項46または項47に記載の合成スーパーエンハンサー。
項49. 前記合成スーパーエンハンサーが4つのエンハンサー配列を含む、項46から項48のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項50. 項46から項49のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が300ヌクレオチド長未満、特に160ヌクレオチド長である合成スーパーエンハンサー。
項51. 項46から項50のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む合成スーパーエンハンサー。
項52. 項46から項51のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、SOX2によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項53. 前記SOX二量体モチーフが配列番号1を含む、項52に記載の合成スーパーエンハンサー。
項54. 前記SOXモチーフがSOX2モチーフである、項46から項51のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項55. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項54記載の合成スーパーエンハンサー。
項56. 前記合成スーパーエンハンサーが表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む、項46から項55のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項57. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項46から項56のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項58. 前記合成スーパーエンハンサーが、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列が少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、SOX2によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項59. 項1から項13または項46から項58のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー、または項14から項45のいずれか1項に記載の機能性核酸分子を含むベクター。
項60. ベクターがウイルスベクターである、項59に記載のベクター。
項61. ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV) である、項59または項60に記載のベクター。
項62. 項1から項13または項46から項58のいずれかに記載の合成スーパーエンハンサー、項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子、または項59から項61のいずれかに記載のベクター、および許容可能な担体を含む組成物。
項63. 治療に使用するための項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子を含む組成物。
項64. がんの治療に使用するための項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子を含む組成物。
項65. 項21から項45のいずれか一項に記載の機能性核酸分子を含むキットであって、前記有害ペイロードは、不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子であり、キットは、さらに、機能性核酸分子と共に投与される前記不活性プロドラッグを含むキット。
項66. 項14から項45のいずれか一項に記載の機能性核酸分子または項63または項64に記載の組成物を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
項67. がんが膠芽腫のような脳腫瘍である、項66に記載の方法。
項68. 前記機能性核酸分子または組成物が全身的に投与される、項66または項67に記載の方法。
項69. 前記機能性核酸分子または組成物が局所的に投与される、項66または項67に記載の方法。
項70. 前記機能性核酸分子および不活性プロドラッグを患者に投与することを含む神経膠芽腫の治療方法、
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞におけるSOX転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される。
項71. 前記不活性プロドラッグが機能性核酸分子に同時または連続的に投与される、項70に記載の方法。
項1. 1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサーが、異なるゲノム遺伝子座に由来する2つ以上のエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列は、転写因子の結合部位と、そのゲノム遺伝子座に存在する転写因子の結合部位の上流および/または下流の20～400ヌクレオチドとを含む合成スーパーエンハンサー。
項2. 前記合成スーパーエンハンサー内の2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが300ヌクレオチド長未満、特に160ヌクレオチド長である、項1記載の合成スーパーエンハンサー。
項3. 前記合成スーパーエンハンサーが、1200ヌクレオチド長未満、特に700ヌクレオチド長未満である、項1または項2記載の合成スーパーエンハンサー。
項4. 前記合成スーパーエンハンサーが、4つのエンハンサー配列を含む、項1から項3のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項5. 前記転写因子がSOXファミリーの転写因子である、項1～4のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項6. 前記合成スーパーエンハンサーが、少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、項1～5のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項7. 前記SOX二量体モチーフが、配列番号1を含む、項6に記載の合成スーパーエンハンサー。
項8. 前記合成スーパーエンハンサーが、少なくとも1つのSOXモチーフを含む、項1から項5のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項9. 前記SOXモチーフが、SOX2モチーフである、項8に記載の合成スーパーエンハンサー。
項10. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項8または項9に記載の合成スーパーエンハンサー。
項11. 前記合成スーパーエンハンサーが表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む、項1から項10のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項12. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項1から項11のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項13. 前記合成スーパーエンハンサーが、さらに転写調節因子を含む、項1から項12のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項14. 導入遺伝子に作動可能に連結された、項1から項13のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーを含む、機能性核酸分子。
項15. 前記導入遺伝子が治療ペイロードをコードする、項14記載の機能性核酸分子。
項16. 前記導入遺伝子が有害ペイロードをコードする、項14記載の機能性核酸分子。
項17. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性免疫細胞の動員につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、項16記載の機能性核酸分子。
項18. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性物質をコードする、項16記載の機能性核酸分子。
項19. 前記有害ペイロードが、不活性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である、項1から項18のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
項20. 前記合成スーパーエンハンサーがプロモーターに作用可能に連結されている、項14から項19のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項21.標的異常細胞に発現する1つ以上の転写因子により活性化される合成スーパーエンハンサーと有害ペイロードとを含み、前記ペイロードは、転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化により発現される、機能性核酸分子。
項22. 前記転写因子が標的異常細胞において差次的に発現される、項21記載の機能性核酸分子。
項23. 前記転写因子が発生または幹細胞関連転写因子である、項21または項22記載の機能性核酸分子。
項24. 前記転写因子がSOXファミリーの転写因子である、項21から項23のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
項25. SOX2によって活性化される項21から項24のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項26. 前記合成スーパーエンハンサーが少なくとも一つのSOX二量体モチーフを含む、項21から項25のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項27. 前記SOX二量体モチーフが配列番号1を含む、項26に記載の機能性核酸分子。
項28. 前記合成スーパーエンハンサーが少なくとも1つのSOXモチーフを含む、項21から項25のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項29. 前記SOXモチーフがSOX2モチーフである、項28に記載の機能性核酸分子。
項30. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項28または項29に記載の機能性核酸分子。
項31. 前記合成スーパーエンハンサーが2つ以上のエンハンサー配列を含む、項21から項30のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項32. 前記合成スーパーエンハンサーが4つのエンハンサー配列を含む、項21から項31のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項33. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なる配列を有する、項31または項32に記載の機能性核酸分子。
項34. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なるゲノム遺伝子座に由来する、項31から項33のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項35. 前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が300ヌクレオチド長未満、特に約160ヌクレオチド長である、項31から項34のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項36. 前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む、項31から項35のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項37. 前記合成スーパーエンハンサーが、表1に示される一つ以上のエンハンサー配列を含む、項21から項36のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項38. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項21から項37のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項39. 前記合成スーパーエンハンサーが、プロモーターに作動可能に連結されている、項21から項38のいずれか一項に記載の機能性核酸。
項40. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性免疫細胞の動員につながる免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、項21から項39のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項41. 前記有害ペイロードが、細胞傷害性物質をコードする、項21から項39のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項42. 前記有害ペイロードが、不活性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子である、項1から項41のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項43. 前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ (HSV-TK) 遺伝子であり、プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビルまたはバラシクロビルである、項42に記載の機能性核酸分子。
項44. 前記異常細胞ががん細胞または腫瘍細胞であり、前記有害ペイロードが抗がんペイロードである、項21から項43のいずれか1項に記載の機能性核酸分子。
項45. 前記異常細胞が膠芽腫幹細胞である、項21～44のいずれか一項に記載の機能性核酸分子。
項46. 前記合成スーパーエンハンサーが、2つ以上のエンハンサー配列および少なくとも1つのSOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフを含む、SOXファミリーの1つ以上の転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項47. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なる配列を有する、項46に記載の合成スーパーエンハンサー。
項48. 前記2つ以上のエンハンサー配列のそれぞれが異なるゲノム遺伝子座に由来する、項46または項47に記載の合成スーパーエンハンサー。
項49. 前記合成スーパーエンハンサーが4つのエンハンサー配列を含む、項46から項48のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項50. 項46から項49のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が300ヌクレオチド長未満、特に160ヌクレオチド長である合成スーパーエンハンサー。
項51. 項46から項50のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、前記合成スーパーエンハンサー内の前記２つ以上のエンハンサー配列の各々が、SOXモチーフおよび/またはSOX二量体モチーフから選択される配列を含む合成スーパーエンハンサー。
項52. 項46から項51のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサーであって、SOX2によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項53. 前記SOX二量体モチーフが配列番号1を含む、項52に記載の合成スーパーエンハンサー。
項54. 前記SOXモチーフがSOX2モチーフである、項46から項51のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー。
項55. 前記SOX2モチーフが配列番号3を含む、項54記載の合成スーパーエンハンサー。
項56. 前記合成スーパーエンハンサーが表1に示す1つ以上のエンハンサー配列を含む、項46から項55のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項57. 前記合成スーパーエンハンサーが、配列番号64～80からなる群から選択される一つの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、項46から項56のいずれか1項記載の合成スーパーエンハンサー。
項58. 前記合成スーパーエンハンサーが、異なるゲノム遺伝子座に由来する4つのエンハンサー配列を含み、各エンハンサー配列が少なくとも1つのSOX二量体モチーフを含む、SOX2によって活性化される合成スーパーエンハンサー。
項59. 項1から項13または項46から項58のいずれか1項に記載の合成スーパーエンハンサー、または項14から項45のいずれか1項に記載の機能性核酸分子を含むベクター。
項60. ベクターがウイルスベクターである、項59に記載のベクター。
項61. ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV) である、項59または項60に記載のベクター。
項62. 項1から項13または項46から項58のいずれかに記載の合成スーパーエンハンサー、項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子、または項59から項61のいずれかに記載のベクター、および許容可能な担体を含む組成物。
項63. 治療に使用するための項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子を含む組成物。
項64. がんの治療に使用するための項14から項45のいずれかに記載の機能性核酸分子を含む組成物。
項65. 項21から項45のいずれか一項に記載の機能性核酸分子を含むキットであって、前記有害ペイロードは、不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子であり、キットは、さらに、機能性核酸分子と共に投与される前記不活性プロドラッグを含むキット。
項66. 項14から項45のいずれか一項に記載の機能性核酸分子または項63または項64に記載の組成物を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
項67. がんが膠芽腫のような脳腫瘍である、項66に記載の方法。
項68. 前記機能性核酸分子または組成物が全身的に投与される、項66または項67に記載の方法。
項69. 前記機能性核酸分子または組成物が局所的に投与される、項66または項67に記載の方法。
項70. 前記機能性核酸分子および不活性プロドラッグを患者に投与することを含む神経膠芽腫の治療方法、
前記機能性核酸は、SOX転写因子によって活性化される合成スーパーエンハンサーおよび不活性プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする自殺遺伝子を含み、
前記自殺遺伝子は、膠芽腫細胞におけるSOX転写因子による合成スーパーエンハンサーの活性化によって発現される。
項71. 前記不活性プロドラッグが機能性核酸分子に同時または連続的に投与される、項70に記載の方法。
【実施例】
【0121】
以下の非限定例を参照して、本開示を説明する。
【0122】
実施例
【0123】
材料及び方法
【0124】
デスティネーションベクタークローニング
【0125】
エンハンサークローニングとスーパーエンハンサーアセンブリの両方に対して高いクローニング効率を確保するために、効率的なゴールデンゲートクローニングを可能にする新しいカスタムデスティネーションベクターを構築した。これはまた反応セットアップ時間/コストを低減した。このデスティネーションベクター設計は、レポーター遺伝子カセットNanoluc‐Ires‐mNGreen‐pAと最小CMVプロモーター(mCMV)を包含した。細菌自殺ccdBカセットを、選択と効率的クローニングのために使用した。CDV2はそれらの位置にまたがるccdBカセットを含み、最大4つのエンハンサーとスペーサーの組み立てを可能にした。CDV1とは対照的に、CDV2はカセット全体に隣接するPiggyBacトランスポザーゼ認識部位も含む。Gibsonアセンブリを用いて、瘢痕のないカスタムデスティネーションベクターを生成した(Gibbsonら2009)。
【0126】
SOX2エンハンサーオリゴヌクレオチドプールの設計へのバイオインフォマティクス
【0127】
Suvaらは、GSCにおけるSOX2結合(神経前駆サブタイプのMGG8細胞株におけるSOX2r1およびSOX2r2）、および3つの細胞株MGG4（神経前駆サブタイプ)、MGG6（古典的サブタイプ）、およびMGG8 (Suvaら2014)におけるH3K27ac 1について、一つの細胞についての技術的複製を発表した。
【0128】
彼らはまた、分化したMGG8細胞 (ここでは分化神経膠腫細胞 (DGC) と呼ぶ) のデータも含めている。明確にするために、それらの腫瘍形成特性により、GSC系統は、DGC (星状細胞分化を刺激する血清の添加によりGSCからここで誘導される) とは対照的に、腫瘍増殖細胞とも呼ばれる。
【0129】
GSC特異的SOX2ピークを決定するために、GSC SOX2r1およびSOX2r2をDGC SOX2_H3K27ac (SOX2過剰発現DGCにおけるH3K27ac Chip-Seq) と重ね合わせた。さらに、推定エンハンサー配列を定義するために、共有H3K27acピークもGSC細胞株間で同定した。これらの共有ピークは、GSC特異的SOX2r1およびGSC特異的SOX2r2と個別に重複していた。これにより、潜在的に重要な領域の損失からの保護がされた。次に、得られた共有ピークを一つのファイルに結合し、100塩基対 (bp) より近いピークを結合することで、重複も除去した。ピークの長さは15 -5300 bpの範囲で、平均長は411 bpであった。次に、繰り返し配列およびセントロメアなどの非エンハンサー配列を除去するために、プールを手動でキュレーションした。これにより、15－3366 bpの範囲で平均長402 bpの1721のピークを含むキュレーション予備プールが得られた。
【0130】
小さな断片に対するPCRバイアスを回避するために、100 bpより小さい領域もすべて破棄し、115－3366 bpの範囲で平均長404 bp の1710のピークが得られた。これらのピークは160 bp断片に分割された。100 bpより小さい断片はPCRバイアスを避けるために再び除去された。20 bpアダプターが両側に取り付けられた。
【0131】
細胞株
【0132】
GSCは、Pollardらが以前に報告したNSC培養条件を用いて誘導した。簡単に言えば、細胞はN2およびB27サプリメントを含む神経基底培地中で血清およびフィーダーのない条件で拡張した。細胞は培養培地にラミニン‐1を補充することによって接着的に増殖した。GSC7はStrikerらによって特徴づけられており、 HEK293細胞はATCC細胞バンクから得られた。他のすべてのGSC株とhuFb170はPollard研究室で得られ(未発表)、Glioma Cellular Genetics Resource (www.gcgr.org.uk) の一部として特徴づけられている。
【0133】
エンハンサーの配列プラスミドライブラリの構築
【0134】
我々は、160 bpエンハンサー断片を個別に別々のプラスミドにクローニングし、96ウェルプレートにアレイにしたアレイライブラリー形式を選択した。これら160 bpをオリゴの単一プールとして合成し、次いでプラスミドにランダムにクローニングして単離した。プールのPCR増幅には20bp×2が必要であるため、 200 bp断片のライブラリーを合成した (Twist Biosciences) 。我々のオリゴ合成戦略を満たすために、 GSCによって発現したChIP‐seqピークを単一オリゴにマージした。このオリゴヌクレオチドプールをPCR増幅し(バイアスと、増幅しやすい生成物がオリゴヌクレオチドプールを追い越すことを意味する「ジャックポット」生成物を低減するために限定サイクルを使用し)、効率的なゴールデンゲート反応によって発現ベクターにクローン化した。4579個の個々のプラスミドを無作為に選択し、単離し、アレイプラスミドDNAライブラリーとして96ウェルプレート (x48) にプレートした。細菌コロニーピッキングとプラスミドミニプレップの生産は、Edinburgh Genome Foundry (S. Rosser)によって支援された。このライブラリーは、最適化Nanoglo DLRアッセイ(Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay、プロメガ)を用いて384ウェル形式でスクリーニングした。各プレートをPGK‐FFLUcと共に1:10比でGSC7細胞に一過性にトランスフェクトした。2日後にNanoglo DLRアッセイを行い、プレートリーダーでアッセイした。
【0135】
ライブラリー生産のためのPCR増幅とクリーンアップ
【0136】
ゴールデンゲートクローニングと空ベクターに対する選択を用いて、不適切な生成物、空配列およびライブラリーの冗長性を回避するために、非常に高い効率のライブラリー増幅とプラスミドクローニングを開発した。PCR条件を、限定的／無バックグラウンドおよび増幅バイアスなしでオリゴヌクレオチドプールを増幅するように最適化した。
【0137】
68°Cアニーリング温度および72°Cでの5s伸長時間で、GC緩衝液(ロシュKK2501)と共にKAPA HiFiホットスタートポリメラーゼを用いた。PCRバイアスを低減するために、オリゴヌクレオチドプールを最初に0.25μl (2.5 ng入力)で10サイクル増幅し、この反応の0.5μlを次の15サイクル増幅に用いた。
【0138】
ゴールデンゲートクローニングの前に、損失を最小化し、DNAをクリーンアップするために磁気ビーズベース固相可逆固定化(SPRI)精製を用いた。すべてのインサートのサンガー配列決定は、それらが多様であることを確認し、すべての配列はプールの断片にマップすることができ、アダプターを含んでいた。
【0139】
384ウェルプレートのスクリーニングプラットフォーム
【0140】
細胞を、マルチドロップを用いて384ウェルプレートに播種し、翌日CyBio Felixを用いてトランスフェクトした。2日後、実験をNanoglo DLRアッセイで終了し、 10以上のmCMVに対する倍率変化を有する全てのヒットをSanger配列決定し、ゲノムにマップした。
【0141】
検証されたエンハンサーのゲノム特徴
【0142】
オンラインツールであるGREATは、各遺伝子の基本調節ドメインを転写開始部位(TSS)の下流1 kbと上流5 kbと定義しており、近い遺伝子が同じ調節ドメインの一部であることを意味する。遠位調節事象を説明するために、基本遺伝子調節ドメインは1000kb以内の最も近い上流および下流の基底調節ドメインに向かって拡張される。その後、GREATは、標的遺伝子を予測するために、遺伝子オントロジーの濃縮をテストする二項検定と共に、遺伝子アノーテーションのオントロジーとクエリー配列を使用する(Mcleanら2010)。我々は、予測された標的遺伝子のヒト成人組織における発現パターン(https://gtexportal.org/home/)を検討した。
【0143】
オリゴヌクレオチドプルダウンおよび質量分析
【0144】
オリゴを、ビオチン化プライマーを用いてPCR増幅した。次いでPCR産物をSPRI精製してビオチン化プライマーダイマーを除去した。これらのdsDNA断片をGSC7およびGSC328からの核抽出物とインキュベートした。次いで、それらをストレプトアビジン磁気ビーズに結合し、3回洗浄し、凍結ビーズを質量分析分析のために送った。
【0145】
細胞培養手順
【0146】
細胞株を5% CO2中37°Cで培養した。細胞はコーティングされていない細胞培養プラスチック皿上で増殖させた。膠芽腫幹細胞株は以前に報告された条件を用いて無血清条件下で増殖させた(Pollardら2009)。継代細胞株はPBSで洗浄し、GSCにはアキュターゼを、huFb170とHEK293には0.5%トリプシン/EDTAを用いてそれぞれ剥離した。細胞を洗浄培地に取り込み、300 xgで3分間スピンダウンした。それらをそれぞれの増殖培地に懸濁し、再播種した。凍結保存のために細胞を10% DMSOを添加した増殖培地に懸濁し、短期保存のために-80°Cで保存した。長期保存のためには、バイアルを液体窒素容器に移した。
【0147】
GSC, huFb170およびHEK293細胞のトランスフェクション
【0148】
細胞を必要な密度で播種した。翌日、トランスフェクションを実施した。このために、Plus reagentおよびLipofectamine LTX (ライフ・テクノロジー社、15338030)をそれぞれ、OptiMEM I Reduced-Serum培地(ライフ・テクノロジー社、31985062)の体積の半分に希釈した。このステップに続いて、Plus reagent/OptimemプレミックスをすべてのDNAサンプルに添加し、続いてリポフェクタミンLTX/Optimemプレミックスを添加した。トランスフェクションミックスを室温で5分間インキュベートし、次いで慎重に細胞に滴下した。一般的に、培地交換は行わなかった。細胞はトランスフェクションの2日後に分析された。
【0149】
HEK293細胞をそれぞれのプレートフォーマットで指定した密度で播種した。翌日GMEM, DNAおよびPEI (自家製) を混合し、複合体形成を可能にするため室温で15分間インキュベートした。続いてトランスフェクションミックスを細胞に滴下し、2日後に分析を行った。
【0150】
Nano-Glo Dual Luciferase Reporter Assay System (プロメガ)
【0151】
この分析は2段階から成る。トランスフェクションは、目的のプラスミドと1/10の比率でトランスフェクションされた正規化プラスミドPGK-Firefly-Luciferase (プロメガE5011)を用いて実施された。最初に、トランスフェクション効率への正規化を可能にするFirefly-Luciferase活性が測定される。第二段階では、目的のプラスミドの読み出しであるNanolucの活性が決定される。細胞をPBSで3回洗浄し、最終洗浄後に20μlを96ウェルプレートに残した (384ウェルに25μl) 。Oneglo緩衝液を加え、プレートを480 rpmで5分間振り、細胞溶解を可能にした。次いで、96ウェル形式の20μl細胞溶解物または384ウェル形式の25μl細胞溶解物を対応する不透明白色プレートに移し、発光を、Ensightマルチモードプレートリーダーを用いてウェル当たり0.1秒間測定した。次の96ウェル形式のNanoluc反応のために、2μl細胞溶解物を40μl PBSを含む不透明白色プレートに移し、基質を添加した20μl Stopglo緩衝液を各ウェルに加えた。384ウェル形式で、基質を含む20μl Stopglo緩衝液を未希釈細胞溶解物の上に加えた。ホタルルシフェラーゼ反応を急冷し、良好な混合を確保するために、プレートを480 rpmで5分間再び振盪した。Nanoluc活性を、Ensightマルチモードプレートリーダーを用いてウェル当たり0.1秒間測定した。
【0152】
Nanoluc反応で得られたデータは、トランスフェクション効率がウェル間で変動することを考慮して、ホタル反応に正規化した。正規化したデータを用いて、空のベクター対照mCMVに対する倍率変化を計算した。
【0153】
免疫細胞化学
【0154】
細胞をPBSで二度洗浄し、4% PFAで10分間固定した。細胞をPBS中の0.1% Triton‐100 (以後PBSTと呼ぶ) で透過させた。細胞をブロッキング溶液(PBST中の1% BSAと3%ヤギ血清)でブロックし、一次抗体と共に4°Cで一晩インキュベートした (表3) 。翌日、細胞をPBST中で3回洗浄し、それぞれの二次抗体をブロッキング溶液中に適用し、室温で45～60分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、最終濃度1μg/mlのDAPI核対抗染色で5分間インキュベートした。画像はNikon TiE顕微鏡およびNIS elementソフトウェア (Nikon) を用いて取得した。
【0155】
【表3】
【0156】
フローサイトメトリー
【0157】
フローサイトメトリーのために、細胞を分離し、ペレット化し、適当な容量のフローサイトメトリー緩衝液(PBSの1% BSA、v/v)に再懸濁させた。細胞を生/死染色としてDraq7 (アブカム、ab109202, f.c.0.1μM)で染色し、BD LSRFortessa細胞分析器(4レーザー、BDバイオサイエンス)を用いて分析した。フローサイトメトリーデータの分析をFlowJo Analysisソフトウェア(FlowJo version 10.6.2)で行った。
【0158】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qRT‐PCR)
【0159】
qRT‐PCRのために、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)とTaqMan遺伝子発現アッセイ (Life Technologies) をQuant Studio7 FlexリアルタイムqPCRマシンで使用した。DNA汚染を評価するために逆転写を受けないRNAサンプルと水対照をすべてのプレートで使用した。さらに、 qRT‐PCRを技術的複製で実施した。データ分析は、100%のPCR効率を仮定し、TaqManアッセイで保証されるddCt法を用いて実施した。簡単に言えば、平均を技術的複製のために計算し、ddCt値を生じるハウスキーピング遺伝子GAPDHに正規化した。これらの値をさらに、ddCtを算出するためにキャリブレーター試料(GSC7)に正規化した。
【0160】
Extensible Modularほ乳類アセンブリ(EMMA)ツールキットを用いたエントリーおよび最終ベクターの生産
【0161】
ベクターはMartellaら2017に従って設計および製造された。簡単に言えば、新しい部品の国産化のために、 BsaIおよびBsmBIサイトは除去された。新しい部品は、融合サイトおよびBsaIサイトのためのオーバーハングを生成するプライマーを用いてPCR増幅された。これにより、部品エントリーベクターへの簡単で効率的なクローニングが保証された。すべての部品エントリーベクターは赤色蛍光蛋白質 (RFP) を含み、これはクローニングされる部品と組換えられ、したがって、白色コロニーのみが部品を含むことができるので、クローニング効率が増加した。発現ベクターを組み立てるために、すべての部品は等モル比でアクセプターベクターと混合される。クローニング効率を高めるために、アクセプターベクターは、発現ベクターの一部と組換えられる細菌自殺カセットccdBを含む。したがって、未修飾アクセプターを取り込む細菌はコロニーを作ることができない。
【0162】
ウェスタンブロット法
【0163】
細胞をPBS中でスクレイピングし、全液体を除去するために0.3 gで二回スピンダウンした。細胞ペレットを70μlのRIPA緩衝液 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5%デオキシコール酸、 0.1% SDSおよびプロテアーゼ阻害剤(Complete、Roche、11697498001)中に再懸濁し、氷上で5分間インキュベートした。溶解物を4°C (遠心分離機5415D、Eppendorf)で10分間13000 rpmで遠心分離した。そして、上清を新しいチューブに集めた。蛋白質抽出物は、製造業者の指示に従い、 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific、Cat: 23225)を用いて定量した。
【0164】
50 mM DTTを含む4×ドデシル硫酸リチウム (LDS) 緩衝液の全容量の5%を細胞抽出物に添加し、試料を95°Cで10分間変性させた。試料は、Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific、Cat: 26634)またはBioRad Precision Plus Protein Dual Color Standards (Cat: 1610377)と共にCarla Blin博士が調製した4～12%ポリアクリルアミドゲルに充填した。Immobilon PVDF膜(Millipore, IPVH00010)への蛋白質バンド転写は、製造業者の指示に従いBiorad Trans-blot turbo systemを用いて湿式エレクトロブロットまたはセミドライブロットにより行った。TBS‐T中の5%ミルク (TBS+0.1% Tween‐20) を室温で1時間膜ブロッキングに使用し、続いてTBS‐T中の5%乳中で一次抗体を一晩振盪しながらインキュベートした (表4)。翌朝、TBS‐T中の室温で5分間洗浄した膜を3回洗浄し、TBS‐T中の5%乳中のワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした (表4) 。再び、膜をTBS‐T中で5分間3回洗浄し、自家製増強化学ルミネセンス (ECL) 溶液またはClarity ECL Western Blotting基質(Bio-Rad, Cat:170-5061)を用いて現像し、X線フィルムまたはBio‐Rad ChemiDocTM Imagerを用いて画像化した。
【0165】
【表4】
【0166】
核抽出物
【0167】
全ての緩衝液を前日に調製し、 22μmフィルター (透析緩衝液を除く) を通過させ、4°Cで一晩放置した。DTTとプロテアーゼ阻害剤を使用直前に添加した。細胞を培地上で擦過し、 50 mlのfalconで採取し、4°Cで1350 rcf 5分回転させた。ペレットを50 mlの氷冷PBS中に懸濁し、細胞計数のためにアリコートを採取し、 4°Cで1350 rcf 5分回転させた。次いで、ペレットを4000万細胞当たり5 mlの氷冷緩衝液A (10 mM HEPES pH 7.9, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT,プロテアーゼ阻害剤(Complete、Roche、11697498001))中に懸濁し、氷上で10分間インキュベートした。細胞懸濁液をガラスDounceホモジナイザーに移し、氷上で40回dounceした。細胞懸濁液をfalconに移し、1350 rcfで4°Cで10分間遠心分離した。上清を廃棄し(細胞質抽出物)、ペレットを氷冷緩衝液B (20 mM HEPES pH 7.9, 5%グリセロール、 1M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA pH 8.0, 0.5 mM DTT,プロテアーゼ阻害剤(Complete、Roche、11697498001))中の1000万細胞当たり100μlに懸濁した。懸濁液を4°Cで30分間回転し、透析膜(SnakeSkin、Thermo Scientific、Cat 68100)に移した。透析は500 mlの透析緩衝液(20 mM HEPES pH 7.9, 5%グリセロール、100 mM KCl, 0.83 mM EDTA pH 8.0, 1.66 mM DTT,プロテアーゼ阻害剤(Complete、Roche、11697498001))中で4°Cで2時間回転させて行った。透析緩衝液 (500 ml) を交換し、透析を4°Cで一晩続けた。抽出物を1.5 mlチューブに集め、 4°Cで15分間最高速度で回転させた (遠心分離器5415D Eppendorf) 。上清を新しい1.5 mlチューブに集め、定量した(Pierce BCA蛋白質定量キット、Thermo Scientific Cat23225)。100μgのアリコートを液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで保存した。
【0168】
ビオチン化プライマーによるPCR増幅および精製
【0169】
エンハンサーは、製造業者の指示に従ってPrimeStar Max (Takara) を用いて5’ビオチン化プライマー (表5) で増幅した。
【0170】
【表5】
【0171】
Agencourt AMPure XP磁気ビーズ (Beckman Coulter) を用いたPCR精製を製造業者の指示に従って行った。Tapestationおよび試薬を用いたPCR産物定量を製造業者の指示に従って行った。
【0172】
相互作用タンパク質の沈殿
【0173】
製造業者の指示に従ってストレプトアビジン磁気ビーズ(NEB、S1420S)を使用した。簡単に言うと、10μlのビーズをLoBindチューブに分注し、磁気スタンド上の結合緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 M NaCl、1 mM EDTA)で三回洗浄した。20μlのビオチン化DNA (～20 pmol)を200μlの結合緩衝液と混合し、ビーズに加えた。懸濁液を室温で2時間回転させた。ビーズを結合緩衝液で3回再洗浄し、50μgの核抽出物を加えた (全容量50μl) 。ビーズ、DNAおよび核抽出物に150μlの透析緩衝液(20mM HEPES pH 7.9, 5%グリセロール、 100 mM KCl, 0.83 mM EDTA pH 8.0, 1.66 mM DTT,プロテアーゼ阻害剤(Complete、Roche、11697498001))を加え、4°Cで一晩回転させた。翌朝、ビーズを洗浄緩衝液(20mM HEPES pH 7.9, 5%グリセロール、 250 mM NaCl, 0.83 mM EDTA pH 8.0, 1.66 mM DTT)で3回洗浄した。ウェスタンブロット法のために、タンパク質を20μlのローディング緩衝液 (50 mM DTTを含むドデシル硫酸リチウム (LDS) 緩衝液) 中で溶出し、タンパク質を変性させるために5分間煮沸した。質量分析のために、ビーズを乾燥した状態で施設に送った。
【0174】
ゼブラフィッシュ実験
【0175】
すべての胚は自然産卵によって得られ、0.00001%メチレンブルーで調整した水槽水に集められた。胚は、色素沈着を阻害するために、受精後6時間(hpf)から実験期間中、200μMのN-phenylthiourea (PTU)(Sigma)で処理された(Karlsson、Von Hofsten、およびOlsson 2001)。
【0176】
接合子は、発生の１細胞期で注入された。卵は、マイクロインジェクションのために、Nusslein‐VolhardおよびDahm 2002によって記述された1.5% Agarose (Sigma) 型に保存された。マイクロインジェクション針は、P‐97 Flaming/Brown Micropipette Puller (Sutter Instruments 米国)を用いてガラス毛細管(Harvard Apparatus 米国)から引かれた。ニードルプルパラメータは次の通りである。Heat: 550; Pull:200; Velocity:55; Time:150。マイクロインジェクションはPV820 Pneumatic PicoPump (World Precision Instruments [WPI] 米国)システムで実施した。DNA構築物はTol2Kitシステム(Kawakami 2007, Kwanら2007)を用いて作成した。注入量の可視化を容易にするために0.2% w/vフェノールレッド(Sigma)を添加したTol2 capped mRNA (20 ng/μL)を含む約2 nLのプラスミドDNA (30 ng/μL) を注入した。胚をトリカインによる麻酔後に生きたまま広範囲蛍光顕微鏡で24～48 hpfで画像化した。
【0177】
アデノ随伴ウイルス (AAV) 形質導入アッセイ
【0178】
HEK293細胞をトランスフェクション前日に6つのウェルプレートに播種し、トランスフェクション当日のコンフルエンスが60～70%になるようにした。培地を2日間ウイルスで調整するため、HEK293細胞をPEIでトランスフェクションする前に、培地交換を行う。翌日、 HEK293またはGSC7細胞を低密度(10～20%) で、同じまたはより小さなプレートフォーマット(6または12ウェルプレート) で播種する。AAV調整培地を1300 rpmで4分間スピンダウンして汚染細胞を除去し、上清を低密度で播種したHEK293細胞に移す。細胞を顕微鏡またはフローサイトメトリーで分析する。
【0179】
殺細胞アッセイのための細胞播種および形質導入
【0180】
細胞播種の日に、上記の方法を用いて細胞を分離した。細胞を、血球計算機を用いて計数し、96ウェル (1,000細胞/ウェル、50μL) 、24ウェル (3万細胞/ウェル、500μL) または6ウェル (6万細胞/ウェル、2mL) コーニングプレートに播種し、37°C/5% CO2で培養器に入れた。翌日、AAVウイルス株を室温で解凍し、適切な量のウイルス株を必要量の培地に添加して、5×105の最終的な感染多重度 (MOI) を達成した。ウイルス粒子を含む培地を、既存の培地を置換することなく細胞に添加した。細胞を37°C/5% CO2に戻した。
【0181】
薬物治療
【0182】
凍結乾燥GCVをDMSO中で希釈し、100mMのストック濃度を得た。GCVストックをアリクォートし、1か月以上-20°Cで保存した。作業ストック濃度を作るために、GCVを適当な培地で1:100に希釈し、次いで、そのような作業ストックの20μLを、すでに80μLの培地を含むウェルに加えた (さらに1:5の希釈を達成した) 。細胞上のGCVの最終濃度は200μMであった。
【0183】
陰性対照として、DMSOを適切な培地で1:100に希釈し、作業ストックを得た。20μLの作業在庫を、すでに80μLの培地を含むウェルに加えた。陽性対照として、20μLのDMSOを80μLの培地を含むウェルに加え、 20%のDMSOの最終濃度を達成した。
【0184】
インキュサイト生細胞イメージング
【0185】
治療中の細胞増殖と形態変化を追跡するために、細胞をインキュサイト生細胞イメージングシステムを用いてモニターした。4時間毎のCorning 96ウェルプレートの全ウェルイメージング。基本的な合流スコア解析ソフトウェア (Incucyte) を用いて合流を推定した。特定の時点での画像を抽出し、細胞合流と形態を検証した。
【0186】
MTTアッセイ
【0187】
アッセイ日に培地を0.3mg/mLのMTT溶液 (細胞株に適した培地で希釈) に置き換えた。細胞を37°C/5% CO2で3時間培養器に入れた。培養後、培地を除去し、DMSO 70μLを各ウェルに添加した。各プレートを37°Cで20分間暗所に保ち、時々浸透した。プレートを読み取る前に、各ウェルを目視検査し、すべての(ホルマザン)結晶が溶解していることを確認した。プレートをプレートリーダーで、560nm吸光度で読み取った。
【0188】
データ分析
【0189】
ほとんどのデータ分析は、Microsoft Excel Version 16.23 for MacおよびGraphPad Prism 7を使用して行われた。エラーバーは平均値の標準偏差として示される。いくつかのデータ分析は、RStudioバージョン1.1.456 (RStudio Team 2015)を使用して行われた。イラストの生成には、biorender.comとAdobe Illustrator 22.0.1が使用された。さらに、bedtools (Quinlan およびHall 2010) 、GREAT (Mcleanら2010)、fastasplitter (Stothard 2000) 、およびMEME (Baileyら2009)などのオープンソースプログラムが様々な分析に使用された。
【0190】
実施例1 機能性SOX2エンハンサーの同定
【0191】
個々に活性なエンハンサーをクラスタ化マルチパートアレイに結合したときに相乗的な活性が達成できるかどうかの概念実証を最初に確立するために、我々は最初に候補エンハンサーの小さなセットを同定した。これらは、NSC対初代ヒト線維芽細胞の利用可能な差次発現データも用いて、神経幹細胞 (NSC) 自己再生における既知の役割を有する近位遺伝子(POU3F2、POU3F3、CHD7、ASCL1、SOX6、ETV1)に基づいて選択された。5つのSOX2候補自己調節エンハンサーも含めた。これらのエンハンサー(典型的には～500～800bp)をmNeonGreenとルシフェラーゼレポータカセットを持つプラスミド発現ベクターにクローニングし、2つの独立した患者由来膠芽腫幹細胞 (GSC) 細胞株 (G7とG328) を用いて個々のエンハンサー活性を試験した(図1)。これらのエンハンサーのうち6つは機能的であり、 NanoLucの発現はmCMVよりも10倍以上増加した(254,270,282,292,312および316;10～300倍の範囲)。これらのいずれもHEK293細胞では活性がなかった (陰性対照) 。
【0192】
【表6】
【0193】
実施例2 4つの異なるエンハンサーの集合は、転写活性の相乗的増加をもたらす
【0194】
複数のエンハンサーを組み合わせることが活性を増加させることができるかどうかを調査するために、まず、2つのエンハンサー (2x) 、4つのエンハンサー (4x) 、または8つのエンハンサー(8x) のいずれかのバージョンのコンカテマー(すなわち、同一のエンハンサーの複数のコピー)を構築した。可変強度を有する3つの異なる個別エンハンサー:270 (約100倍) 、254 (約20倍) 、および312 (約10倍)、を選択した。270については、2パートおよび4パートエンハンサーの両方において、個別エンハンサー活性と比較してわずかな相乗効果しか認められなかった。4パートエンハンサーは、個別エンハンサーの約100倍と比較して、約500倍の活性をもたらした(図1F)。驚くべきことに、コピーを8パートコンカテマーに増加させても追加利得は観察されなかった。同様の傾向が独立した患者系統、 GSC328で観察された。mCMV陰性対照に匹敵するルシフェラーゼ活性化のバックグラウンドレベルのみが、全ての構築物についてHEK293細胞で見られた。
【0195】
次に、異なる遺伝子の異なるエンハンサーを一緒に混合することが相乗効果の改善をもたらすかどうかを試験した(図1K)。したがって、G7で同定された上位4つの個々のエンハンサー(270,282,292および316)を新しい合成エンハンサー (T4と呼ばれる)に結合した。実際、Nanolucレポーターアッセイ(Nano-Glo Luciferase AssayおよびNano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay (いずれもプロメガ))を用いて、mCMVと比較してT4の発現が5000倍以上増加する顕著な増加を認めた(図1L)。このことは、フローサイトメトリーを用いてG7細胞のmNGreenをスコア化することでさらに検証され(図1I)、T4レベルはG7細胞の全長CMVで観察されたレベルの約50～60%であることが示された。したがって、異なる遺伝子のエンハンサーを組み合わせると、GSCにおける相乗効果とエンハンサー活性の大幅な増加が生じるが、HEK293細胞におけるバックグラウンド発現の増加はない。エンハンサーのこれらの細胞型特異的合成クラスタは、今後「合成スーパーエンハンサー」(SSE)と呼ばれる。
【0196】
実施例3 GSCにおけるT4合成スーパーエンハンサーの活性は、星状細胞分化後に低下する
【0197】
次に、SSE‐T4合成スーパーエンハンサーがGSC状態に特異的であり、SOX2がダウンレギュレートされる星状細胞への分化時に消失するかどうかを調べた。G7細胞は、10～15日間にわたって子牛の胎児血清(FCS)に曝露した後、星状細胞様細胞に効率的に分化できる。したがって、GSC(G7)はSSE‐T4発現カセット(PiggyBacトランスポザーゼシステムを使用)とmNGreen+細胞を蛍光活性化細胞選別(FACs)を使用して選別して安定にトランスフェクトした。これらを翌日5% FCS中にプレートし、mNGreen発現を15日間の時間経過でフローサイトメトリーを用いて5日毎に測定した(図1H‐J)。mNGreen発現は生細胞蛍光イメージングに基づいて5日目までに有意に減少した。これはフローサイトメトリーによって確認され、5日目までに細胞の約50%、15日目までに約80%がmNGreenを失ったことが示された。これらのデータは、SSE‐T4がGSCにおいて高い活性を有するが、分化した星状細胞様子孫細胞においてはそうではなく、SSEが細胞型特異的であることを示す。
【0198】
実施例4 SOX 2エンハンサーのアレイ化プラスミドライブラリの系統的スクリーニング
【0199】
上記データは、エンハンサーを4パートアレイに組み合わせることで、非GSC細胞におけるバックグラウンド発現を妥協することなく、転写活性を増加させることができるという原理の証明を提供した。我々はエンハンサー断片 (160bp) の機能的スクリーニングは、SSEで使用される場合に最適な性能とより小さなサイズを有する機能的エンハンサーを系統的に同定するために、ハイスループット384ウェルプレートに基づくルシフェラーゼアッセイにおいて、候補ゲノムワイドSOX2エンハンサーのフルセットを使用して実施できると考えた。このようなスクリーニングを患者由来GSCで行うことにより、適切な同一性と関連エンハンサーを持たない既存の血清成長がん細胞株の限界を克服することができる。
【0200】
160 bpを選択したのは、これがヌクレオソーム結合に十分なサイズを提供し、機能エンハンサー内の文法の進化における重要な属性である可能性が高いためである(Soufiら2015)。さらに、160 bpは、アレイ状プラスミドライブラリのその後の構築のために20 bp末端を組み込んだプールされたオリゴヌクレオチドライブラリの合成に便利なサイズである。著者らは、 STARR‐seq (Muerdterら2018、Arnoldら2013)のような他のプールされたライブラリスクリーニング戦略よりも、合成オリゴヌクレオチドから構築されたアレイ状プラスミドライブラリを支持したが、これは、ノイズに対する改善されたシグナルとヒットの直接的な検証を保証するためである。
【0201】
したがって、著者らは、プールとして合成できるオリゴヌクレオチドのセットを設計した。著者らは、Suvaら2014からのデータセットを再分析し、 H3K27acと重複するGSC特異的SOX2結合ピークのセットを決定することによって、1710の異なるエンハンサーを同定した。これらのエンハンサーは平均約400 bp (範囲:115～3366 bp)であった。これらの配列をin silicoで100 bp重複する160 bpエレメントに分割した。9523の異なるオリゴヌクレオチド配列をプールとして合成し、 PCR増幅し、 48×96ウェルプレート (全部で4579個の個々のプラスミド) のアレイ状プラスミドライブラリにクローン化した。得られたプラスミドのサブセットのサンガー配列決定は、これらのプラスミドの大部分 (～70%) が適切なエンハンサーを含むことを確認した。
【0202】
最適化ルシフェラーゼアッセイを用いて、 SOX2エンハンサーライブラリを384ウェル形式でスクリーニングした。135のプラスミドは、 mCMVより10倍以上増加して機能的であると同定された。これらの135の初期ヒットのうち52は、独立したNanoglo DLRアッセイを用いて三重に検証した(図2)。これら52のうち16は、一度以上検出された。ヒットはサンガー配列決定され、エンハンサーを含むことが確認され、最初に設計されたセットから予想される断片を用いてヒトゲノムにマッピングされた。
【0203】
次に、複数の細胞株にわたる独立したフローサイトメトリー分析を用いて、上位17断片(mCMVの30倍以上の増加)を検証した(図2)。これらは独立した患者由来GSC株 (GSC328)では活性であったが、試験した非神経細胞では不活性であった(HEK293細胞およびヒト初代線維芽細胞、huFb170)。上位ヒットの大部分は脊椎動物全体で進化的に保存された配列であることを見出した。上位5つのエンハンサーはそれぞれNanoLucに基づいて、mCMV (範囲:100～260倍)と比較して100倍以上であった。これらはフローサイトメトリーにより検証した。
【0204】
ID1101はPRCPのイントロンに位置する;ID2904はMYO18遺伝子のイントロン領域に位置し、SEZ6Lに近接する;ID0109はTPK1とCNTNAP2の間の遺伝子豊富な領域に位置する;ID4328はジンクフィンガー転写因子ZNF438のイントロン領域に位置する。ID0876はNWD2のイントロン領域に位置する。
【0205】
【表7】
【0206】
このように、著者らの機能的スクリーニングは、サイズが4から5倍小さいにもかかわらず、全長エンハンサー(上述)と比較して有意に活性を改善した多くの160 bpエンハンサー断片を同定した。
【0207】
実施例5 新たに同定されたSOX2エンハンサーを用いた強力で選択的な合成スーパーエンハンサーの作成
【0208】
細胞型選択性を保持しながらそれらの強度が相乗的に増加するかどうかを同定するために、スクリーンからの個々に最も活性な断片を4パート配列にクラスタリングすることにより合成スーパーエンハンサーを構築した。
【0209】
可能な限り最強の合成スーパーエンハンサーを作成するために、 Top17エンハンサーからの配列を用いて4つの新しい4パート配列のセットを設計した。これらはmCMVの上流に組み立てた。断片はmCMVに対するそれらの中央折畳み変化に従ってランク付けした。4つの最も活性なエンハンサー(ID1101、ID2904、ID0109、ID4328。「1」で表される)を合成スーパーエンハンサーへの4パートアレイにクラスタ化した。第2群(「2」で示される)を含むエンハンサーを合成スーパーエンハンサーにクラスタ化した。我々は、4つの最も強力なエンハンサーが最高レベルの発現を示し、次の群が2番目に高いなどの仮説を立てた。さらに、異なる細胞型(GSC7、GSC328、HEK293およびhuFb170)で合成スーパーエンハンサーを試験することにより、それらの細胞型選択性も調べた。
【0210】
試験したすべての4つの構築物(C1、C3、C5およびC7)は、GSC7とGSC328で有意かつ選択的な発現を誘導し、HEK293ではバックグラウンド発現のみを誘導した。huFb170では発現は検出されなかった。これらの合成スーパーエンハンサー(C1、C3、C5およびC7)の各々は、GSC7とGSC328において、エンハンサー候補を用いる最も活性な合成スーパーエンハンサーであるSSE‐T4 (上述の第1世代SSE) よりも高い蛍光強度と高い割合のmNGreen+細胞を示した。注目すべきことに、 C1とC7は、それ自体が最強のウイルスプロモーターの一つである陽性対照CMVよりも高い発現レベルを誘導した。したがって、我々は、4パートエンハンサーの構築アレイの明確な相乗効果を観察し、非常に強力で細胞型選択的な合成スーパーエンハンサーをもたらした。
【0211】
我々は、アダプターとスペーサーの除去により、合成スーパーエンハンサーのサイズをさらに縮小した(例えばC1では974 bpから640 bp)。これらの合成スーパーエンハンサーは、 7つの構築物であり、その設計はC1, C3, C5, C7と同じ理論に従うことから、 SSE 1～7と呼ばれた。すべての構築物は、同様のレベルの活性を示した。これは完全なCMVのレベルに匹敵し、いくつかの症例ではCMVよりも高かった (Nanoglo DLRアッセイによるSSE1, 2, 3, 5およびGSC7におけるフローサイトメトリーによるSSE1, 2, 3, 5, 7。SSE 1, 2, 5および7もGSC7におけるCMVより高い強度を示した。フローサイトメトリーによるmNGreen発現の分析もGSC328, HEK293およびhuFb170に対して行った。この傾向はGSC328でも同様である。平均蛍光強度 (MFI) はCMV周辺であり、SSE‐6はCMVより明らかに強度が低かった。HEK293細胞では、全ての合成スーパーエンハンサーはmCMVのような同様のレベルに転写を誘導した。mCMVは非トランスフェクト細胞と比較して32.5% mNGreen+細胞を示した。SSEはmCMVと比較してHEK293における発現のわずかな増加を示した。huFb170におけるSSE1‐7の活性は検出できなかった (1%以上) 。両レポーター遺伝子アッセイ (Nanoglo DLRアッセイおよびフローサイトメトリー) において、より小さな合成スーパーエンハンサーにより高い活性を示す傾向が、各構築物C1対SSE‐1;C3対SSE‐3などで観察された(図3B、C、D)。これは生細胞画像によって確認された (図3E) 。試験した合成スーパーエンハンサーSSE‐1, 3, 5および7はいずれもCMVと同様の活性を示した。
【0212】
実施例6 合成スーパーエンハンサーは分化したGSCでは活性が低い
【0213】
分化条件下でのSSE‐2‐SSE‐7の活性を調べるために、GSC7細胞を、Piggybacトランスポザーゼ系を用いて安定にトランスフェクトし、mNGreen+細胞を選別した。同様の数の生細胞をmCMVと非トランスフェクト対照で選別した。細胞を、増殖因子を含まず5% FCSを含む培地に入れ、星状細胞分化を誘導した。
【0214】
mNGreen発現は、分化中の0、1、5、10および15日目に測定された (図4EおよびG) 。時間経過とともにシグナルの低下が観察され、合成スーパーエンハンサーはGSCで最も高度に発現し、活性は分化時に低下することが示唆された。
【0215】
実施例7 ゼブラフィッシュ胚は前脳において高度に選択的で領域特異的な発現を示す
【0216】
ゼブラフィッシュはエンハンサーの組織特異性を探索する実験モデルとして適している。我々は、腹側脊髄発現、耳側プラコード、中脳/後脳および前脳のようなすべての構築物の間で共有される組織を同定した。いくつかの断片は、前/後腸のような付加的活性を有した。我々は一般的に24 hpfで低い発現を観察し、48 hpfでの最新の測定時点まで増加し続けた。対照では、同じアッセイを用いてCMV対照でEGFPの広範で非特異的な発現を観察し、mCMVでは発現を観察しなかった(図4)。mCMV対照は緑色蛍光の眼を示したが、これはおそらくCrystal eyeプロモーターからの偽転写によるものである(図4K)。
【0217】
実施例8 SSEはGSCの選択的殺傷を誘導するためにアデノ随伴ウイルスに使用できる
【0218】
SSEが細胞毒性ペイロードを駆動し、GSCを選択的に殺すのに適しているかどうかを試験するため、単純ヘルペスウイルス(HSV)由来の自殺遺伝子チミジンキナーゼ(TK)をp2Aで結合したレポーター遺伝子mCherryを有するポリシストロンmRNAの形で有するアデノ随伴ウイルス2(AAV2)をGSC7およびhuFB170細胞株に形質導入した。カセットは、陽性対照として構成的に活性なCMVプロモーター (CMV_HSV-TK-v5_P2A_mCherry)または関心プロモーターであるSSE-7 (SSE-7-HSV-TK-v5-P2A-mCherry)によって駆動された。HSV-TKは、非細胞毒性プロドラッグであるガンシクロビル(GCV)をリン酸化によって細胞毒性産物に代謝する、確立されたプロドラッグである。リン酸化GCVは、ポリメラーゼの基質としてdGTPと競合し、それによってDNA合成の妨害をもたらし、早期終結と細胞毒性を引き起こす。
【0219】
フローサイトメトリーとウェスタンブロット法は、SSE‐7が、線維芽細胞(huFb170)ではなく、GSC7でmCherryとHSV‐TKv5の両方の発現を駆動することを確認した(図5)。細胞コンフルエンスは、細胞毒性実験を通して記録した。細胞増殖とコンフルエンスの減少は、CMVまたはSSE‐7駆動TKv5‐P2A‐mCherryで形質導入し、200μM GCVを受けた細胞で特異的に観察された(図6A)。ウイルスまたはガンシクロビルのみを受けた細胞では、細胞コンフルエンスに対する有意な負の影響は観察されなかった。MTTアッセイのデータは、 CMVまたはSSE‐7駆動TKv5‐P2A‐mCherryおよびGCVで処理したGSC7細胞における細胞生存性のおおよその読出しとして役立つ代謝活性の損失 (または欠如)を示す(図6B)。CMVとSSE‐7の間には統計的差異はなかった (13%対12%生存率) (p値=0.7792)。GSC7細胞生存性に対するガンシクロビル単独の影響は小さかった(89%生存率)。生細胞イメージングは、治療後の細胞のストレス、損傷または死(丸い細胞)に関連した細胞密度の低下および形態学的変化を示すこれらの所見を確認した(図6C)。要約すると、CMVとSSE-7の両方が、HSV-TK-v5-P2A-mCherry構築物の発現をGSC7細胞で十分なレベルに誘導し、ガンシクロビルの存在下で細胞死を誘導することができる。
【0220】
実験終了時 (17日目) の生細胞画像データに基づいて、SSE-7ではなくCMVで誘導されたウイルスを形質導入したhuFB170細胞の大部分が死滅した (図6D) 。これはMTTデータで確認され、CMVで誘導されるウイルスを形質導入した細胞の生存率は6.3%であったのに対し、SSE-7で誘導されるTKv5-P2A-mCherry (図6E、n=1)を形質導入した細胞の生存率は完全であった。
【0221】
実施例9 SSEはGSCの範囲で活性を示す
【0222】
提案された遺伝子治療におけるSSEは、多様な患者由来の膠芽腫細胞株にわたって高度に発現することが望ましいが、他の細胞型では不活性である。実施例8に記載された実験を、 5つの患者由来の膠芽腫細胞株(E17、E21、E28、E31、E34)で繰り返した。これらの株は、遺伝的および転写GBMサブタイプのスペクトルをカバーし、マウス脳において腫瘍誘発性であることが示されているため、この実験のために選択された。全体として、SSE7はすべての細胞株で活性であるが、程度が異なる:陽性対照細胞株GSC7では、SSE7は高度に発現し、完全長CMVに匹敵する (図7C);そしてE17およびE28 (図7C) は、どちらも古典的サブタイプに属するが、 E21, E31およびE34では発現頻度が低い (図7C) 。
【0223】
実施例10 de novoモチーフの分析は、トップ32ヒットで濃縮されたSOX二量体モチーフを同定する
【0224】
我々は新規モチーフを同定できるMEMEツールを用いた(Baileyら2009)。上位32ヒットを入力として用いた。予想に反して、有意なモチーフとして出現したのは部分回文的SOXモチーフであった (図8A) 。SOX2は他のSOX因子とホモまたはヘテロ二量体を形成しない;しかし、 SOXE群のメンバーは二量体化することがよく知られている(SOX8、SOX9、SOX10)。興味深いことに、SOX9はNSCとGSCのよく知られた調節因子であるが、 SOX2ほど深く研究されていない(Bulstrodeら2017、Huangら2015、Mateoら2015、D.K.Singhら2017)。このモチーフは、 SOX2とSOX9が共有エンハンサーで作動している可能性を即座に示唆した (図8C) 。
【0225】
次に、この二量体モチーフが配列のオリゴヌクレオチドプールの一般的な特徴であるかどうかを調査し、検証の未確認のヒットと初期オリゴヌクレオチドプールの10のランダムな配列と比較して、トップ52ヒット (mCMVの10倍の変化を有するすべての配列) にマッピングした。モチーフは、トップ32ヒットでは高頻度で存在し、残りのトップ33‐トップ52では低頻度で存在した。
【0226】
実施例11 SOX二量体モチーフは、GSCにおけるID2904の活性に必須であり、主要なGSC機能エンハンサーにおけるSOX2とSOX9の協調を示唆する。
【0227】
次に、SOX二量体がエンハンサー機能に必須であるかどうかを検討した。ID2904のモチーフの一連の変種を生成した。合成した変種は、 1) ハーフサイト間の間隔の減少 (-2n) 2) モチーフハーフサイト間の間隔の増加;3) 及び4) ハーフサイトの削除;5) ランダム配列による隣接配列の置換;6) モチーフの逆位;7) コアヌクレオチドの変異;8) Jolmaら2013が報告した高親和性モチーフによる置換;9) 負の対照としてのランダム配列;と10) モチーフの四回のコンカテマー化を示した。これらの異なる変異により、二量体モチーフ内のキー配列を機能的に分析することができた (図8) 。
【0228】
ID2904ではSOX二量体モチーフのほぼすべての変異で活性がほぼ完全に失われていることが観察され、エンハンサーの機能にとってこの二量体モチーフが重要であることが確認された。例外は2つのハーフサイト間の距離が変化したことで、活性が増加したことである。これは興味深いことで、間隔が「部分最適化」され、2bpの減少がSOX9二量体のより強い結合を促進する可能性があるという考えと一致する(Farleyら2015)。SOX二量体モチーフはID2904のエンハンサー活性に必須であると結論する。間隔の減少は、SOXE因子モチーフのための最適間隔を定義したHuangら2015に従った。
【0229】
次に、実際にSOX2とSOX9がエンハンサーとSOX二量体モチーフに結合することを確認することを目的とした。この目的のために、ID1101 (スクリーンのトップヒット) とID2901をビオチン化し、核抽出物とインキュベートするプルダウンアッセイを実施した。ウェスタンブロット法と質量分析を行い、断片と相互作用する主要な転写因子を同定した (図8) 。データ分析のために、ID1101を(各細胞株における)ランダム配列599の平均値に正規化した。カットオフを両細胞株において599の二倍濃縮に設定した。転写因子をフィルターするために、全ての転写因子のリストをUniProtから得て、両細胞株において検出された蛋白質と重ね合わせた。
【0230】
共免疫沈降実験では、 SOX2はGSC7とGSC328で、ID1101で特異的にプルダウンし、エンハンサーへのSOX2結合を示した (図8) 。これは質量分析で確認され、 SOX2はGSC328で23倍、 G7で4.4倍濃縮され、この転写因子の結合を確認した。
【0231】
さらに、野生型 (WT) 配列の上下20bpの置換は活性の完全な喪失をもたらしたので、上で説明し、図8Jに示したデータは、モチーフを取り巻く配列文脈 (文法) が機能的に重要であることを示す。
【0232】
実施例12 SOX二量体モチーフは、活性エンハンサーをin silicoでフィルターするのに役立つ
【0233】
我々は、モチーフの存在は、どのエンハンサーが活性であるかについての予測力を増加させる能力を有するかもしれないと仮定した。この仮説をテストするために、オリジナルのSOX2 ChIP‐seqデータセットのすべての全長エンハンサーにモチーフをマッピングした。同じ予測された標的遺伝子の調節を意味する、GBMまたは神経幹細胞において既知の機能を有する予測された標的遺伝子およびゲノム内のクラスタ化に基づいて初期スクリーニングのために70領域を選択した。それらをNanoglo DLRアッセイで試験した。これらは「クラスタ化SOX二量体モチーフエンハンサー」(CSE)と呼ばれた。したがって、 SOX二量体モチーフ頻度と合理的設計を用いて、元のスクリーン(52/2610)での～2%から、合理的選択 (16/70) での～22.8%へ、約11倍正エンハンサー同定の成功を増加させた。陽性ヒットは、 GSC7, GSC328, HEK293およびhuFb170のフローサイトメトリーによってさらに検証された (図9) 。
【0234】
さらなる活性エンハンサーを同定するために、 209のエンハンサーによる追加スクリーニングが実施された。エンハンサーは、それらの予測モチーフ (minCSEと呼ばれる－表1参照)に基づいて160 bpに縮小した。160 bpエンハンサー断片は、スクリーニングのためにさらなるSSEを生成するために、human protein atlas (https://www.proteinatlas.org/)のデータに基づいて、増殖、幹細胞性または脳濃縮/脳特異的または神経膠腫濃縮/神経膠腫特異的な予測標的遺伝子のような経路をカバーするために、異なる標的遺伝子から混合された。
【0235】
【表8】
【0236】
結論
【0237】
転写因子結合部位のマッピング、クロマチンアクセシビリティまたはエンハンサー関連ヒストンマークは、重要な転写因子(TF)および関連エンハンサーの探索に広く用いられている。しかしながら、主要な制限は、TFがかなり乱雑に結合することであり、機能的エンハンサーはわずかなサブセットを表すだけである。我々はここで、機能的エンハンサー配列のアレイを組み合わせることが合成スーパーエンハンサーの形成につながることを示す。内因性機能的エンハンサー配列の自然な「文法」を利用するが、これらを最適サイズおよびクラスタで組み合わせることにより、細胞型選択性を犠牲にすることなく、転写活性化の相乗的増加を伴うSSEsを得ることができた。したがって、我々のデータは、個々のエンハンサーを組み合わせて、選択性を保持するが、転写を駆動する際に非常に強い合成スーパーエンハンサーを作り出すことができることを支持する。
【0238】
参考文献
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Suva et al. 2014 “Reconstructing and Reprogramming the Tumor-Propagating Potential of Glioblastoma Stem-like Cells.” Cell 157(3): 580－94.
【0239】
【表1】
【0240】
【表2】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】