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特表2024-504592遺伝子転写フレームワーク、ベクターシステム、ゲノム配列編集方法および応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-01
(54)【発明の名称】遺伝子転写フレームワーク、ベクターシステム、ゲノム配列編集方法および応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240125BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240125BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240125BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240125BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240125BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240125BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240125BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240125BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/11 Z
A61P25/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P25/28
A61P25/16
A61K31/711
A61K48/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023541700
(86)(22)【出願日】2021-12-01
(85)【翻訳文提出日】2023-07-07
(86)【国際出願番号】 CN2021134710
(87)【国際公開番号】W WO2022156378
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】202110089068.1
(32)【優先日】2021-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523259569
【氏名又は名称】彭双紅
(74)【代理人】
【識別番号】100084375
【弁理士】
【氏名又は名称】板谷 康夫
(74)【代理人】
【識別番号】100142077
【弁理士】
【氏名又は名称】板谷 真之
(72)【発明者】
【氏名】彭双紅
(72)【発明者】
【氏名】隋云鵬
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
本発明は、遺伝子転写フレームワーク、ベクターシステム、ゲノム配列編集方法およびその応用を提供する。遺伝子転写フレームワークは、真核生物における逆転位メカニズムに基づいています。DNA、RNAまたはRNP経路によって媒介することができ、1つ以上の標的部位の上流配列、挿入される配列および標的部位の下流配列、1つ以上のSINE(エレメント)、1つ以上のLINE(エレメント)、1つ以上のORF1pコード配列および/または1つ以上のORF2pコード配列を含む転写産生配列を含む。遺伝子編集法によれば、外来系や物質を極力導入せず、DNA二本鎖切断を起こさないことを前提に、DNA、RNAまたはRNP経路を介して遺伝子編集系を細胞核または細胞質に移転する(RNAまたはRNPはORF1pおよび/またはORF2p媒介を介して細胞質から細胞核へ移入する)、 ゲノム内の指定部位に標的断片を挿入したり、ゲノム中の指定断片を欠失または置換したりすることで、高いターゲティング精度を実現します。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子転写フレームワークであって、前記遺伝子転写フレームワークが、５′→３′方向に沿って、標的サイト上流配列、挿入される配列、標的サイト下流配列を含み、前記遺伝子転写フレームワークが、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され得るＤＮＡ配列であり、前記遺伝子転写フレームワークの転写産物またはその転写産物の形質転換産物における標的サイト上流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの上流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、標的サイト下流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの下流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、前記標的サイト上流配列と前記標的サイト下流配列がゲノムの対応するの標的遺伝子配列において直接的に接続し、ゲノム上の標的遺伝子配列における標的サイト上流配列と標的サイト下流配列との間のサイトが、挿入される配列の標的サイトである、ことを特徴とする、遺伝子転写フレームワーク。
【請求項2】
請求項１記載の遺伝子転写フレームワークであって、前記細胞が真核細胞である、ことを特徴とする、遺伝子転写フレームワーク。
【請求項3】
ベクターシステムであって、前記ベクターシステムが、一種類または複数種のベクターを含み、前記一種類または複数種のベクターが、一つまたは複数の１）請求項１記載の遺伝子転写フレームワークと、
一つまたは複数の２）短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、
および／または、一つまたは複数の３）長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と、
を含み、
その中、前記成分１）、２）および／または３）が、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
前記ベクターが、一つまたは複数のプロモーターを備え、前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、かつ、前記成分１）、２）および／または３）の上流に位置し、
前記ベクターシステムが、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介される、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項4】
請求項３記載のベクターシステムであって、成分１）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、成分２）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、成分３）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置する、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項5】
請求項３記載のベクターシステムであって、前記ベクターが、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、ウィルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体、ファージベクター、コスミドベクターである、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項6】
請求項３記載のベクターシステムであって、前記ベクターが、発現ベクター、クローニングベクター、シーケンスベクター、形質転換ベクター、シャトルベクターまたは多機能ベクターである、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項7】
請求項３記載のベクターシステムであって、１）および２）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークと前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項8】
請求項３記載のベクターシステムであって、１）および３）が同じベクターに位置する場合、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列が、前記遺伝子転写フレームワークの上流および／または下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項9】
請求項３記載のベクターシステムであって、１）、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流および／または前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの上流に位置し、および／または、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項10】
請求項３記載のベクターシステムであって、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の上流および／または下流に位置し、かつ、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
【請求項11】
ゲノム配列編集方法であって、１）ゲノムから編集対象標的遺伝子の挿入されるサイトを選択し、挿入されるサイトの両側の標的遺伝子の挿入されるサイトの上流配列および下流配列を決定する工程と、
２）請求項３から１０のいずれか記載のベクターシステムを製造する工程と、
３）ベクターシステムを細胞、組織、または生体に形質転換またはトランスフェクションし、転写する工程と、
を含む、ことを特徴とする、ゲノム配列編集方法。
【請求項12】
ゲノムの任意の領域におけるＤＮＡ配列の挿入、削除、置換における、請求項３から１０のいずれか記載のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介可能なベクターシステムの使用。
【請求項13】
請求項１２記載の使用であって、前記ＤＮＡ配列が、一つまたは複数のＣＮＶ配列、ＣＮＶ末端配列、短い散在要素配列、部分短い散在要素配列、類似短い散在要素配列、長い散在要素配列、部分長い散在要素配列、ＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列である、ことを特徴とする、使用。
【請求項14】
癌、遺伝子関連の遺伝疾患、神経変性疾病の予防および／または治療のための医薬としての、請求項３から１０のいずれか記載のベクターシステムの使用。
【請求項15】
請求項１４記載の使用であって、前記癌が、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、大腸癌、十二指腸癌、白血病、前立腺癌、子宮体癌、甲状腺癌、リンパ腫、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、皮膚癌、下垂体腫瘍、胚細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜癌、膠芽腫、各種星状細胞腫、各種乏突起膠腫、星状乏突起細胞腫、各種上衣腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、脊索腫、神経芽腫、各種神経節細胞腫、嗅神経芽細胞腫、交感神経系神経芽細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、髄芽腫、三叉神経鞘腫、聴神経腫、頸静脈腫、頸静脈球型腫瘍、血管網状腫、頭蓋咽頭腫、顆粒細胞腫および/または顆粒膜細胞腫である、ことを特徴とする、使用。
【請求項16】
請求項１４記載の使用であって、前記遺伝子関連の遺伝疾患が、ハンチントン病、脆弱X症候群、フェニルケトン尿症、偽肥大性進行性筋ジストロフィー、ミトコンドリア脳筋症、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン重畳症候群、パーキンソン症候群、パーキンソン病、白皮症、赤緑色盲、赤緑色覚異常、軟骨無形成症、アルカプトン尿症、先天性難聴、サラセミア、鎌状赤血球貧血、血友病、遺伝的変化に関連するてんかん、ミオクローヌス、ジストニア、脳卒中および統合失調症、ビタミンD抵抗性くる病、家族性結腸ポリープ症、遺伝性腎炎である、ことを特徴とする、使用。
【請求項17】
請求項１４記載の使用であって、前記神経変性疾病が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症、多系統萎縮症、原発性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺である、ことを特徴とする、使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術分野に関し、遺伝子編集技術に関する。特に、DNA、RNAまたはRNP経路によって媒介される遺伝子編集技術およびその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、生物技術分野において、遺伝子編集技術として、主に、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＴａｒｇｅｔｒｏｎ技術がある。その中で、ZFN技術は歴史上最初に開発されました。しかし、そのDNA結合ドメインは長さ9bpの配列しか認識できないため、実際のアプリケーションにおけるターゲティング精度は大きく制限されています。さらに、この手法の実際の設計は面倒であり、未知のアップストリームおよびダウンストリームシーケンスを持つシーケンスをノックアウトすることはできません。さらに、その細胞毒性およびオフターゲット率は高い。ZFNと比較して、TALEN法は設計が単純で、より高い特異性で17～18bp配列を認識することができます。しかし、コア技術は個々の営利企業によって管理されているため、ほとんどの研究所は単独でそれを完成させることができず、その普及と応用がある程度制限されます。同時に、その建設プロセスはまだ比較的複雑です。CRISPR/Cas9 手法は、3 つの中で最も単純で最も操作可能です。古細菌や細菌で初めて発見され、約20bpの配列を特異的に認識し、Cas9エンドヌクレアーゼの作用で特定の部位に二本鎖切断を引き起こし、システム自身のDNA修復機能を介して修復し、遺伝子編集操作を行うことができます。
しかし、3つの手法はすべていわゆるオフターゲット問題を抱えており、認識長が最も高いCRISPR/Cas9手法も例外ではありません。研究によると、標的部位に対するCRISPR/Cas9認識の特異性は、主にgRNA PAM部位近くの10～12塩基の対合に依存し、非特異的切断を引き起こす傾向があることが示されています。また、これら3つの手法によるDNA二本鎖切断の生成後、相同組換えではなく非相同末端結合によってDNA二本鎖切断が修復され、ランダムな配列が生成される可能性が高く、その不確実性は、特に人体および臨床応用における実用化を大きく損ないます。同時に、これらの3つの技術は、人間などの受容システムの一部ではない遺伝物質やタンパク質を持ち込み、これも予期しない影響を与える可能性があります。
一方、更新されたTargetron技術は、グループIIイントロンを使用してゲノムの特定の部位に配列を挿入し、対応する遺伝子を変異させます。しかし、この技術は必然的にゲノム二本鎖切断を引き起こし、外因性のグループIIイントロンをゲノムに導入して「瘢痕」を生成します。また、この技術は原核生物に由来するため、逆転写のために自ら作製したRNAは膜貫通輸送機能を持たず、その機能を果たすためのRNAの応用が限られています。さらに、そして最も重要なことに、この技術は細菌の遺伝子編集の分野ではうまく機能しましたが、高等生物ではうまく機能しませんでした。4つの遺伝子編集技術はすべて、受容系に属さないタンパク質や核酸を導入する必要があり、効果の不確実性が高まり、臨床応用が大きく妨げられます。
しかし、3つの手法はすべていわゆるオフターゲット問題を抱えており、認識長が最も高いCRISPR/Cas9手法も例外ではありません。研究によると、標的部位に対するCRISPR/Cas9認識の特異性は、主にgRNA PAM部位近くの10～12塩基の対合に依存し、非特異的切断を引き起こす傾向があることが示されています。また、これら3つの手法によるDNA二本鎖切断の生成後、相同組換えではなく非相同末端結合によってDNA二本鎖切断が修復され、ランダムな配列が生成される可能性が高く、その不確実性は、特に人体および臨床応用における実用化を大きく損ないます。同時に、これらの3つの技術は、人間などの受容システムの一部ではない遺伝物質やタンパク質を持ち込み、これも予期しない影響を与える可能性があります。
一方、更新されたTargetron技術は、グループIIイントロンを使用してゲノムの特定の部位に配列を挿入し、対応する遺伝子を変異させます。しかし、この技術は必然的にゲノム二本鎖切断を引き起こし、外因性のグループIIイントロンをゲノムに導入して「瘢痕」を生成します。また、この技術は原核生物に由来するため、逆転写のために自ら作製したRNAは膜貫通輸送機能を持たず、その機能を果たすためのRNAの応用が限られています。さらに、そして最も重要なことに、この技術は細菌の遺伝子編集の分野ではうまく機能しましたが、高等生物ではうまく機能しませんでした。4つの遺伝子編集技術はすべて、受容系に属さないタンパク質や核酸を導入する必要があり、効果の不確実性が高まり、臨床応用が大きく妨げられます。
【発明の概要】
【0003】
上記課題を解決するために、本発明の目的は、遺伝子転写フレームワークであって、前記遺伝子転写フレームワークが転写後、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介して細胞核または細胞質に転送先し、目標フラグメントをゲノムにおける特定のサイトに挿入する、または、ゲノムにおける特定のフラグメントを削除または置換することができ、同時により高い標的正確性を有する、遺伝子転写フレームワークを提供することにある。
本発明の別の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介可能なベクターシステムを提供することにある。
本発明の第３の目的は、遺伝子編集方法であって、前記遺伝子編集方法が、できるだけ外来システムや物質を導入しない、および、二本鎖切断を起こさない前提に、ＤＮＡ、ＲＮＰまたはＲＮＡ（体外製造可能）および関連タンパク質を媒介として、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＰ経路により細胞核または細胞質に転送先し、目標フラグメントをゲノムにおける特定のサイトに挿入する、または、ゲノムにおける特定のフラグメントを削除または置換し、同時により高い標的正確性を有する、遺伝子編集方法を提供することにある。
上記目的を実現するために、本発明は、遺伝子転写フレームワークであって、前記遺伝子転写フレームワークが、５′→３′方向に沿って、標的サイト上流配列、挿入される配列、標的サイト下流配列を含み、
前記遺伝子転写フレームワークが、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され得るＤＮＡ配列であり、前記遺伝子転写フレームワークの転写産物またはその転写産物の形質転換産物における標的サイト上流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの上流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、標的サイト下流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの下流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、前記標的サイト上流配列と前記標的サイト下流配列がゲノムの対応するの標的遺伝子配列において直接的に接続し、ゲノム上の標的遺伝子配列における標的サイト上流配列と標的サイト下流配列との間のサイトが、挿入される配列の標的サイトである、ことを特徴とする、遺伝子転写フレームワーク。
上記遺伝子転写フレームワークが、挿入される配列をゲノム標的サイトに挿入するために使用される、遺伝子転写フレームワークを提供する。
好ましくは、前記細胞が、真核細胞である。
本発明は、さらに、ベクターシステムであって、前記ベクターシステムが一種類または複数種のベクターを含み、前記一種類または複数種のベクターが、
一つまたは複数の１）請求項１記載の遺伝子転写フレームワークと、
一つまたは複数の２）短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、
および／または、一つまたは複数の３）長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と、
を含み、
その中、前記成分１）、２）および／または３）が、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分１）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分２）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分３）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
前記ベクターが、一つまたは複数のプロモーターを備え、前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、かつ、前記成分１）、２）および／または３）の上流に位置し、
前記ベクターシステムが、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介される、ベクターシステムを提供する。
さらに、前記ベクターが、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、ウィルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体、ファージベクター、コスミドベクターである。
さらに、前記ベクターが、発現ベクター、クローニングベクター、シーケンスベクター、形質転換ベクター、シャトルベクターまたは多機能ベクターである。
さらに、１）および２）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークと前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、１）および３）が同じベクターに位置する場合、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列が、前記遺伝子転写フレームワークの上流および／または下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、１）、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流および／または前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの上流に位置し、および／または、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の上流および／または下流に位置し、かつ、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
転写効率を向上させるために、ベクターシステムにおける遺伝子転写フレームワーク、短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の数を増加する。異なる種にも天然的に短い散在要素配列、長い散在要素配列が存在するが、天然のネイティブプロモーターの活性が低いため、追加のプロモーターによる転写および/または短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、および/または長い散在要素配列および/またはＯＲＦ１ｐコード配列および/またはＯＲＦ2ｐコード配列の追加の転写は、発現および遺伝子編集効率を高めるために適用されます。
本発明は、さらに、ゲノム配列編集方法であって、
１）ゲノムから編集対象標的遺伝子の挿入されるサイト（標的サイト）を選択し、挿入されるサイトの両側の標的遺伝子の挿入されるサイトの上流配列（標的サイト上流配列、標的サイトの上流配列）および下流配列（標的サイト下流配列、標的サイトの下流配列）を決定する工程と、
２）上記のベクターシステムを製造する工程と
３）ベクターシステムを細胞、組織、臓器、胚または生体に形質転換またはトランスフェクションし、遺伝子編集を実現する工程と、
を含む、ゲノム配列編集方法を提供する。
本発明は、さらに、ゲノムの任意の領域におけるＤＮＡ配列の挿入、削除、置換における、上記ベクターシステムの使用を提供する。
好ましくは、前記ＤＮＡ配列が、一つまたは複数のＣＮＶ配列、ＣＮＶ末端配列、短い散在要素配列、部分短い散在要素配列、類似短い散在要素配列、長い散在要素配列、部分長い散在要素配列、ＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列である。
ＤＮＡ配列がＣＮＶ配列、ＣＮＶ末端(ＣＮＶの末端、ＣＮＶ端部)配列である場合、ＣＮＶ末端（即ち、ＣＮＶ末端における遺伝子部分と部分ＳＩＮＥ(部分ＳＩＮＥ部分、部分ＳＩＮＥ配列)との間）を編集し、ゲノムまたは局在ゲノムと相同でない配列を挿入してその遺伝子のコピー数変化および発現変化をブロックする、またはＣＮＶ末端の遺伝子部分配列を削除して対応する細胞発現を変化することができる。CNV末端は、遺伝子部分および部分SINEを含む。
本発明は、さらに、癌、遺伝子関連の遺伝疾患、神経変性疾病の予防および／または治療のための医薬としての、上記ベクターシステムの使用を提供する。
好ましくは、前記癌が、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、大腸癌、十二指腸癌、白血病、前立腺癌、子宮体癌、甲状腺癌、リンパ腫、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、皮膚癌、下垂体腫瘍、胚細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜癌、膠芽腫、各種星状細胞腫、各種乏突起膠腫、星状乏突起細胞腫、各種上衣腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、脊索腫、神経芽腫、各種神経節細胞腫、嗅神経芽細胞腫、交感神経系神経芽細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、髄芽腫、三叉神経鞘腫、聴神経腫、頸静脈腫、頸静脈球型腫瘍、血管網状腫、頭蓋咽頭腫、顆粒細胞腫および/または顆粒膜細胞腫である。
好ましくは、前記遺伝子関連の遺伝疾患が、ハンチントン病、脆弱X症候群、フェニルケトン尿症、偽肥大性進行性筋ジストロフィー、ミトコンドリア脳筋症、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン重畳症候群、パーキンソン症候群、パーキンソン病、白皮症、赤緑色盲、赤緑色覚異常、軟骨無形成症、アルカプトン尿症、先天性難聴、サラセミア、鎌状赤血球貧血、血友病、遺伝的変化に関連するてんかん、ミオクローヌス、ジストニア、脳卒中および統合失調症、ビタミンD抵抗性くる病、家族性結腸ポリープ症、遺伝性腎炎である。
好ましくは、前記神経変性疾病が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症、多系統萎縮症、原発性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺である。
本発明は、上記の癌およびそれらの転移癌の発生を予防し、それらの増殖を阻害し、それらの上昇および進行を防止し、またはそれらの性質を逆転させてそれらを治癒することができる。インスリン、レボドパ、さまざまな腫瘍化学療法薬および標的薬に対する薬剤耐性を予防、遅延または改善し、細胞、組織、臓器、胚または生物の遺伝子変化および状態変化、組織および臓器再生および生物学的再生を遅らせまたは停止する。
本発明の関連技術を適用することにより、各遺伝子におけるコピー数多型(CNV)およびその末端部分(CNV末端)を編集して、末端位置を変更したり、末端を安定化させたりすることができる。各遺伝子およびその末端部分(CNV末端)のコピー数変動が遺伝子発現を決定するので、末端位置の変化または末端の安定化は、細胞、組織、胚、器官および生物の各状態を安定化または変化させることができ、細胞、組織、臓器、胚、生物の遺伝子や状態を改変・変化させる技術分野で活用できます。機能を改善するためにヒトなどの生物のゲノムを改変すること、ハンチントン病や脆弱X症候群などの遺伝子に関連するさまざまな遺伝病を治療するためにヒトなどの生物のゲノムを改変すること、細胞、組織、臓器、胚および生物(老化など)の遺伝子および状態変化を遅らせたり停止させたりすること、細胞、組織、臓器、胚、生物の遺伝子や状態を変えることができます。胚、組織または臓器の再建および生物学的再生、体細胞を生殖細胞に変換する転写因子を導入することにより生殖を支援すること、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、原発性側索硬化症、脊髄小脳失調症、ピック病、前頭側頭型認知症、ルイス小体型認知症、進行性核上性麻痺などの神経変性疾患を予防または遅延させ、腫瘍細胞の代謝活性と増殖速度と産生を阻害し、進行を遅らせ、悪性度を改善します。 糖尿病などの遺伝的およびCNVの変化に関連する他のすべての疾患の研究と治療、およびその他の生理学的、病理学的、病態生理学的研究。
本発明において、遺伝子転写フレームワークに挿入される配列は、外因性配列または内因性配列とすることができ、ワンタイム挿入配列の長さは1bp～2000bpである。ゲノムへの任意の長さのDNA配列の挿入は、複数の挿入が行われるときに達成され得る。標的サイト上流配列(標的部位の上流配列)のヌクレオチド配列長は、10bp～2000bpの間であってもよく、標的サイト下流配列(標的部位の下流配列)のヌクレオチド配列長は、10bp～2000bpの間であってもよい。
本発明の特徴：
本発明は、ゲノムの特定のサイト(部位)に挿入する必要がある挿入される配列をベクター上の挿入される配列の両側の標的サイトの上下流配列を依頼し、ゲノム上の挿入されるサイトに位置づけることができる。短い散在要素、長い散在要素およびその発現タンパク質の助けを借りて、ゲノムの選択された部位に挿入される配列を挿入する。さらに、細胞内またはベクターによって発現されたORF2pは、ベクター上の標的サイト上流配列またはその相補配列が細胞ゲノムの標的サイト上流配列またはその相補配列と完全に一致する条件でのみ、核酸ベクターの3'末端からゲノム上の一本鎖切断部位までスムーズにスライドすることができます。これにより、ターゲティング精度が大幅に向上し、予期せぬ切断の発生が回避され、既存の遺伝子編集技術よりも理論的に高いターゲティング精度が得られます。
さらに、必要なRNAおよびORF1pおよびORF2pなどの対応する内因性タンパク質をin vitroで生成することができ、ゲノム上の標的配列および遺伝子をRNAまたはRNP経路によって編集し、DNA断片を導入することなく、不必要に直接核にトランスフェクトすることができる。RNAまたはRNP媒介経路は、受容系への影響を最小限に抑え、非特異的効果を低減しながらターゲティング精度を向上させることができる。ORF1pとORF2pの核局在機能とORF1pの核酸に対する保護効果により、細胞にトランスフェクトされたRNAやタンパク質を核に誘導することができ、ベクターの核への輸送が困難なため操作が困難な細胞の遺伝子編集に役立ちます。
本発明は、より優れたターゲティングを有し、二本鎖切断を生成しないことを前提として、より正確な標的配列同定および切断を行うことができ、相同組換えを通じて所望の配列を方向的に挿入することができ、対応する断片を欠失および置換することができる。しかし、CRISPRなどの既存の遺伝子編集技術は、二本鎖切断や予測不可能なランダム変異を生じさせ、極めて非効率な相同組換えによる標的配列導入の可能性は低い。本発明は、二本鎖切断を発生せず、DNA二本鎖切断および予期しないランダム配列の導入の危険性を懸念しない。
本発明は、前の挿入後に生成された新しい部位に従ってさらなる挿入のためのベクターを絶えず設計することによって、長い配列をゲノムに漸進的に導入することができ、これも、現在知られている遺伝子編集技術では達成が困難です。同様に、ゲノム上の標的化された正確な配列欠失および配列置換は、従来技術によって達成することは困難であるが、本発明によっても達成することができる。また、CNVまたはその末端を編集または安定化して、細胞または生物の遺伝子発現および/または状態を変化または安定化させるなどの操作は、既存の遺伝子編集技術では実現できないが、本発明により実現することができる。
本発明の有益な効果は、以下である。
本発明は、真核生物レトロトランスポジション機構に基づく、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＰ経路により媒介可能な遺伝子編集方法を提供する。真核生物の固有のメカニズムを通じて、外因性のシステムまたは物質の導入を最小限に抑え、二本鎖切断を生成しないという前提の下で、この方法はDNA、RNPまたはRNA(インビトロで調製および産生することができる)および関連タンパク質(インビトロで調製および産生することができる)によって媒介される。DNA、RNA、またはRNP経路を介して核または細胞質に導入すること、目的の断片(挿入される配列)をゲノム内の選択された遺伝子座に挿入すること、またはゲノム内の選択された断片を削除または置換すること、同時に、ターゲティング精度も高いです。 原核生物由来のタンパク質などの外来系を導入しず、二本鎖切断を生じないため、本発明は既存の遺伝子編集技術よりも臨床への適用が容易である。
本発明の別の目的は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介可能なベクターシステムを提供することにある。
本発明の第３の目的は、遺伝子編集方法であって、前記遺伝子編集方法が、できるだけ外来システムや物質を導入しない、および、二本鎖切断を起こさない前提に、ＤＮＡ、ＲＮＰまたはＲＮＡ（体外製造可能）および関連タンパク質を媒介として、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＰ経路により細胞核または細胞質に転送先し、目標フラグメントをゲノムにおける特定のサイトに挿入する、または、ゲノムにおける特定のフラグメントを削除または置換し、同時により高い標的正確性を有する、遺伝子編集方法を提供することにある。
上記目的を実現するために、本発明は、遺伝子転写フレームワークであって、前記遺伝子転写フレームワークが、５′→３′方向に沿って、標的サイト上流配列、挿入される配列、標的サイト下流配列を含み、
前記遺伝子転写フレームワークが、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写され得るＤＮＡ配列であり、前記遺伝子転写フレームワークの転写産物またはその転写産物の形質転換産物における標的サイト上流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの上流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、標的サイト下流配列またはその相補配列が、細胞ゲノムの対応する標的サイトの下流配列またはその相補配列とハイブリダイズ可能であり、前記標的サイト上流配列と前記標的サイト下流配列がゲノムの対応するの標的遺伝子配列において直接的に接続し、ゲノム上の標的遺伝子配列における標的サイト上流配列と標的サイト下流配列との間のサイトが、挿入される配列の標的サイトである、ことを特徴とする、遺伝子転写フレームワーク。
上記遺伝子転写フレームワークが、挿入される配列をゲノム標的サイトに挿入するために使用される、遺伝子転写フレームワークを提供する。
好ましくは、前記細胞が、真核細胞である。
本発明は、さらに、ベクターシステムであって、前記ベクターシステムが一種類または複数種のベクターを含み、前記一種類または複数種のベクターが、
一つまたは複数の１）請求項１記載の遺伝子転写フレームワークと、
一つまたは複数の２）短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、
および／または、一つまたは複数の３）長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と、
を含み、
その中、前記成分１）、２）および／または３）が、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分１）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分２）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
成分３）が複数ある場合、前記ベクターシステムの同じまたは異なるベクターに位置し、
前記ベクターが、一つまたは複数のプロモーターを備え、前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、かつ、前記成分１）、２）および／または３）の上流に位置し、
前記ベクターシステムが、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＰ経路により媒介される、ベクターシステムを提供する。
さらに、前記ベクターが、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、ウィルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体、ファージベクター、コスミドベクターである。
さらに、前記ベクターが、発現ベクター、クローニングベクター、シーケンスベクター、形質転換ベクター、シャトルベクターまたは多機能ベクターである。
さらに、１）および２）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークと前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記短い散在要素配列、および／または部分短い散在要素配列、および／または類似短い散在要素配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、１）および３）が同じベクターに位置する場合、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列が、前記遺伝子転写フレームワークの上流および／または下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワークが、前記一つまたは複数の長い散在要素配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ１ｐコード配列、および／または一つまたは複数のＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、１）、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記遺伝子転写フレームワークの下流および／または前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの上流に位置し、および／または、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の下流に位置し、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の下流に位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記遺伝子転写フレームワークの下流に位置し、かつ、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記遺伝子転写フレームワーク、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
さらに、２）および３）が同じベクターに位置する場合、前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列が前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列の上流および／または下流に位置し、かつ、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と直接的に接続しまたは間接的に接続し、直接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有し、間接的に接続する場合、前記短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列が前記長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列と一つのプロモーターを共有するまたは一つのプロモーターを共有しない、ことを特徴とする、ベクターシステム。
転写効率を向上させるために、ベクターシステムにおける遺伝子転写フレームワーク、短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、長い散在要素配列および／またはＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列の数を増加する。異なる種にも天然的に短い散在要素配列、長い散在要素配列が存在するが、天然のネイティブプロモーターの活性が低いため、追加のプロモーターによる転写および/または短い散在要素配列および／または部分短い散在要素配列および／または類似短い散在要素配列、および/または長い散在要素配列および/またはＯＲＦ１ｐコード配列および/またはＯＲＦ2ｐコード配列の追加の転写は、発現および遺伝子編集効率を高めるために適用されます。
本発明は、さらに、ゲノム配列編集方法であって、
１）ゲノムから編集対象標的遺伝子の挿入されるサイト（標的サイト）を選択し、挿入されるサイトの両側の標的遺伝子の挿入されるサイトの上流配列（標的サイト上流配列、標的サイトの上流配列）および下流配列（標的サイト下流配列、標的サイトの下流配列）を決定する工程と、
２）上記のベクターシステムを製造する工程と
３）ベクターシステムを細胞、組織、臓器、胚または生体に形質転換またはトランスフェクションし、遺伝子編集を実現する工程と、
を含む、ゲノム配列編集方法を提供する。
本発明は、さらに、ゲノムの任意の領域におけるＤＮＡ配列の挿入、削除、置換における、上記ベクターシステムの使用を提供する。
好ましくは、前記ＤＮＡ配列が、一つまたは複数のＣＮＶ配列、ＣＮＶ末端配列、短い散在要素配列、部分短い散在要素配列、類似短い散在要素配列、長い散在要素配列、部分長い散在要素配列、ＯＲＦ１ｐコード配列および／またはＯＲＦ２ｐコード配列である。
ＤＮＡ配列がＣＮＶ配列、ＣＮＶ末端(ＣＮＶの末端、ＣＮＶ端部)配列である場合、ＣＮＶ末端（即ち、ＣＮＶ末端における遺伝子部分と部分ＳＩＮＥ(部分ＳＩＮＥ部分、部分ＳＩＮＥ配列)との間）を編集し、ゲノムまたは局在ゲノムと相同でない配列を挿入してその遺伝子のコピー数変化および発現変化をブロックする、またはＣＮＶ末端の遺伝子部分配列を削除して対応する細胞発現を変化することができる。CNV末端は、遺伝子部分および部分SINEを含む。
本発明は、さらに、癌、遺伝子関連の遺伝疾患、神経変性疾病の予防および／または治療のための医薬としての、上記ベクターシステムの使用を提供する。
好ましくは、前記癌が、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、大腸癌、十二指腸癌、白血病、前立腺癌、子宮体癌、甲状腺癌、リンパ腫、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、皮膚癌、下垂体腫瘍、胚細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜癌、膠芽腫、各種星状細胞腫、各種乏突起膠腫、星状乏突起細胞腫、各種上衣腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、脊索腫、神経芽腫、各種神経節細胞腫、嗅神経芽細胞腫、交感神経系神経芽細胞腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、髄芽腫、三叉神経鞘腫、聴神経腫、頸静脈腫、頸静脈球型腫瘍、血管網状腫、頭蓋咽頭腫、顆粒細胞腫および/または顆粒膜細胞腫である。
好ましくは、前記遺伝子関連の遺伝疾患が、ハンチントン病、脆弱X症候群、フェニルケトン尿症、偽肥大性進行性筋ジストロフィー、ミトコンドリア脳筋症、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン重畳症候群、パーキンソン症候群、パーキンソン病、白皮症、赤緑色盲、赤緑色覚異常、軟骨無形成症、アルカプトン尿症、先天性難聴、サラセミア、鎌状赤血球貧血、血友病、遺伝的変化に関連するてんかん、ミオクローヌス、ジストニア、脳卒中および統合失調症、ビタミンD抵抗性くる病、家族性結腸ポリープ症、遺伝性腎炎である。
好ましくは、前記神経変性疾病が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症、多系統萎縮症、原発性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺である。
本発明は、上記の癌およびそれらの転移癌の発生を予防し、それらの増殖を阻害し、それらの上昇および進行を防止し、またはそれらの性質を逆転させてそれらを治癒することができる。インスリン、レボドパ、さまざまな腫瘍化学療法薬および標的薬に対する薬剤耐性を予防、遅延または改善し、細胞、組織、臓器、胚または生物の遺伝子変化および状態変化、組織および臓器再生および生物学的再生を遅らせまたは停止する。
本発明の関連技術を適用することにより、各遺伝子におけるコピー数多型(CNV)およびその末端部分(CNV末端)を編集して、末端位置を変更したり、末端を安定化させたりすることができる。各遺伝子およびその末端部分(CNV末端)のコピー数変動が遺伝子発現を決定するので、末端位置の変化または末端の安定化は、細胞、組織、胚、器官および生物の各状態を安定化または変化させることができ、細胞、組織、臓器、胚、生物の遺伝子や状態を改変・変化させる技術分野で活用できます。機能を改善するためにヒトなどの生物のゲノムを改変すること、ハンチントン病や脆弱X症候群などの遺伝子に関連するさまざまな遺伝病を治療するためにヒトなどの生物のゲノムを改変すること、細胞、組織、臓器、胚および生物(老化など)の遺伝子および状態変化を遅らせたり停止させたりすること、細胞、組織、臓器、胚、生物の遺伝子や状態を変えることができます。胚、組織または臓器の再建および生物学的再生、体細胞を生殖細胞に変換する転写因子を導入することにより生殖を支援すること、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、原発性側索硬化症、脊髄小脳失調症、ピック病、前頭側頭型認知症、ルイス小体型認知症、進行性核上性麻痺などの神経変性疾患を予防または遅延させ、腫瘍細胞の代謝活性と増殖速度と産生を阻害し、進行を遅らせ、悪性度を改善します。 糖尿病などの遺伝的およびCNVの変化に関連する他のすべての疾患の研究と治療、およびその他の生理学的、病理学的、病態生理学的研究。
本発明において、遺伝子転写フレームワークに挿入される配列は、外因性配列または内因性配列とすることができ、ワンタイム挿入配列の長さは1bp～2000bpである。ゲノムへの任意の長さのDNA配列の挿入は、複数の挿入が行われるときに達成され得る。標的サイト上流配列(標的部位の上流配列)のヌクレオチド配列長は、10bp～2000bpの間であってもよく、標的サイト下流配列(標的部位の下流配列)のヌクレオチド配列長は、10bp～2000bpの間であってもよい。
本発明の特徴：
本発明は、ゲノムの特定のサイト(部位)に挿入する必要がある挿入される配列をベクター上の挿入される配列の両側の標的サイトの上下流配列を依頼し、ゲノム上の挿入されるサイトに位置づけることができる。短い散在要素、長い散在要素およびその発現タンパク質の助けを借りて、ゲノムの選択された部位に挿入される配列を挿入する。さらに、細胞内またはベクターによって発現されたORF2pは、ベクター上の標的サイト上流配列またはその相補配列が細胞ゲノムの標的サイト上流配列またはその相補配列と完全に一致する条件でのみ、核酸ベクターの3'末端からゲノム上の一本鎖切断部位までスムーズにスライドすることができます。これにより、ターゲティング精度が大幅に向上し、予期せぬ切断の発生が回避され、既存の遺伝子編集技術よりも理論的に高いターゲティング精度が得られます。
さらに、必要なRNAおよびORF1pおよびORF2pなどの対応する内因性タンパク質をin vitroで生成することができ、ゲノム上の標的配列および遺伝子をRNAまたはRNP経路によって編集し、DNA断片を導入することなく、不必要に直接核にトランスフェクトすることができる。RNAまたはRNP媒介経路は、受容系への影響を最小限に抑え、非特異的効果を低減しながらターゲティング精度を向上させることができる。ORF1pとORF2pの核局在機能とORF1pの核酸に対する保護効果により、細胞にトランスフェクトされたRNAやタンパク質を核に誘導することができ、ベクターの核への輸送が困難なため操作が困難な細胞の遺伝子編集に役立ちます。
本発明は、より優れたターゲティングを有し、二本鎖切断を生成しないことを前提として、より正確な標的配列同定および切断を行うことができ、相同組換えを通じて所望の配列を方向的に挿入することができ、対応する断片を欠失および置換することができる。しかし、CRISPRなどの既存の遺伝子編集技術は、二本鎖切断や予測不可能なランダム変異を生じさせ、極めて非効率な相同組換えによる標的配列導入の可能性は低い。本発明は、二本鎖切断を発生せず、DNA二本鎖切断および予期しないランダム配列の導入の危険性を懸念しない。
本発明は、前の挿入後に生成された新しい部位に従ってさらなる挿入のためのベクターを絶えず設計することによって、長い配列をゲノムに漸進的に導入することができ、これも、現在知られている遺伝子編集技術では達成が困難です。同様に、ゲノム上の標的化された正確な配列欠失および配列置換は、従来技術によって達成することは困難であるが、本発明によっても達成することができる。また、CNVまたはその末端を編集または安定化して、細胞または生物の遺伝子発現および/または状態を変化または安定化させるなどの操作は、既存の遺伝子編集技術では実現できないが、本発明により実現することができる。
本発明の有益な効果は、以下である。
本発明は、真核生物レトロトランスポジション機構に基づく、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＰ経路により媒介可能な遺伝子編集方法を提供する。真核生物の固有のメカニズムを通じて、外因性のシステムまたは物質の導入を最小限に抑え、二本鎖切断を生成しないという前提の下で、この方法はDNA、RNPまたはRNA(インビトロで調製および産生することができる)および関連タンパク質(インビトロで調製および産生することができる)によって媒介される。DNA、RNA、またはRNP経路を介して核または細胞質に導入すること、目的の断片(挿入される配列)をゲノム内の選択された遺伝子座に挿入すること、またはゲノム内の選択された断片を削除または置換すること、同時に、ターゲティング精度も高いです。 原核生物由来のタンパク質などの外来系を導入しず、二本鎖切断を生じないため、本発明は既存の遺伝子編集技術よりも臨床への適用が容易である。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】真核生物自体が有するレトロトランスポジション機構に基づく遺伝子編集の基本模式図である。
【図2】DNAを介したゲノム挿入または欠失の概略図を示しである。
【図3】RNAおよびRNPを介したゲノム挿入および欠失の概略図を示しである。
【図4】CNV末端に非相同配列を挿入することによりCNV末端で変化を止めるの概略図を示しである。
【図5】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造の模式図である。
【図6】本発明が提供する遺伝子転写フレームワーク連結プロモーターの構造の模式図である。
【図7】プロモーターと短い散在要素、部分短い散在要素または類似短い散在要素を連結する本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造の模式図である。
【図8】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの上流連結プロモーター、本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの下流連結長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の構造模式図である。
【図9】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、遺伝子転写フレームワークは、上流に長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列で連結され、長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流にプロモーターが連結される。
【図10】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、前記プロモーターが遺伝子転写フレームワークの上流に連結され、短い散在要素または部分短い散在要素または類似短い散在要素が遺伝子転写フレームワークの下流に連結され、そして、長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が、短い散在要素または部分短い散在要素または類似短い散在要素の下流に接続される。
【図11】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、前記遺伝子転写フレームワークは、下流に短い散在要素、部分短い散在要素または類似短い散在要素と接続され、前記遺伝子転写フレームワークは、上流において長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列と連結され、そして、長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流がプロモーターで連結されている。
【図12】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、遺伝子転写フレームワーク、および短い散在要素、部分短い散在要素または類似短い散在要素はプロモーターを共有しない。
【図13】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、遺伝子転写フレームワーク、および長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列はプロモーターを共有しない。
【図14】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、遺伝子転写フレームワーク、および短い散在要素、部分短い散在要素または類似短い散在要素、および長い散在要素、ORF1pコード配列またはORF2pコード配列はプロモーターを共有しない、一方、短い散在要素、部分的な短い散在要素または短い散在様要素、および長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列はプロモーターを共有する。
【図15】本発明が提供する遺伝子転写フレームワークの構造模式図であり、遺伝子転写フレームワーク、および短い散在要素、部分短い散在要素または類似短い散在要素、および長い散在要素、ORF1pコード配列またはORF2pコード配列はプロモーターを共有しない、一方、短い散在要素、部分的な短い散在要素または短い散在様要素、および長い散在要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列はプロモーターを共有する。
【図16】実施例1で構築したプラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1のプラスミドマップであり、実施例1のベクターに遺伝子転写フレームワークVEGFA1が挿入されたものである。
【図17】実施例6で構築したプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1のプラスミドマップであり、実施例6で遺伝子転写フレームワークIT15-1がベクターに挿入されたものである。
【発現を実施するための形態】
【0005】
本発明は、ゲノム上の遺伝子コピー数やリピート配列を改変するトランスポゾンによる真核生物に遍在するゲノム再構成機構に基づくものである。 このメカニズムは、ハンチントン病や脆弱X症候群などのいくつかの中枢神経系変性疾患において病原性三塩基反復の欠失または付加をもたらす可能性があり、配列の高い相同性などの相同組換えと一致し、メチル化によって阻害することができ、発現レベルに関連しています。図1に示すように。図1において、本発明は、短い散在要素（短鎖散在反復配列、短い散在核要素、short interspersed element、short interspersed nuclear element, SINE）、長い散在要素（長鎖散在反復配列、長い散在核要素、長く散在する元素、長く散在する核元素long interspersed element, long interspersed nuclear element, LINE）およびその関連タンパク質、例えばオープンリーディングフレーム1タンパク質（open reading frame 1 protein、ORF1p）、オープンリーディングフレーム2タンパク質（open reading frame 2 protein、ORF2p）および他の種類のオープンリーディングフレームタンパク質（open reading frame protein、ORFp）に関する。短点散在要素(SINE)には、主に霊長類のAlu要素とSVA要素、MIRやMIR3などのさまざまな哺乳類全体の散在リピート要素（mammalian-wide interspersed repeat elements、MIRs）、モノトレノスのMon-1、げっ歯類のB1およびB2要素、ゼブラフィッシュのHE1ファミリー、爬虫類のAnolis SINE2とSauria SINE、イカなどの無脊椎動物のIdioSINE1、IdioSINE2などが含まれます。セピアシネ、セピオス-SINE1、セピオス-SINE2A、セピオス-SINE2Bおよびエゴプシネ、ならびにイネなどの植物におけるp-SINE1。長く散在する元素には、主にさまざまなLINE-1(L1)、さまざまなLINE-2(L2)およびさまざまなLINE-3(L3)、R2、RandI、L1、RTE、I、およびジョッキーのさまざまな種の生物のTa元素およびその他のLINE種が含まれます。これらの構造はさまざまな動植物に広く見られ、ゲノム全体に散在しており、それぞれがその相補機能に対応する独自の特定のSINEとLINEを持っています。 SINEの主な特徴は、ゲノム上に分布する比較的短いトランスポゾンであり、内部RNAポリメラーゼIIIプロモーターを含み、AまたはTリッチテールまたは短い単純な反復で終わり、LINEの助けを借りて逆転写され、それらの転写物の右半分には逆転できる機能構造が含まれています。 一方、LINEは、逆転写酵素コード配列を含むゲノム中に広く分布しているトランスポゾンによって特徴付けられる。 SINEとそれに対応するそれぞれの種のLINEは、どちらも同様のメカニズムでゲノムを継続的に再構築します。
このメカニズムの基本原理は、プレmRNA処理によって体内で生成された投げ縄構造と、せん断によってSINEの残留逆転写構造の右半分を接続することです(中間部位で切断された完全なSINE転写産物によって生成される逆転写構造を持つSINEの右半分は部分SINE配列と呼ばれ、せん断部位はSINEの種によって異なります)。 SINEの自然せん断部位は一般に全長の中央に位置し、一般的な全長が約100～400ntのSINEの場合、その自然せん断部位は通常100～250ntに位置し、例えば、全長約300bpのAlu要素の場合、そのせん断部位は118番目のntに位置する。 全長約260ntの様々なタイプのMIRについて、せん断部位は100～150ntの範囲で観察され得る。
実際、部位がどこにあるかに関係なく、それがせん断されている限り、残りの右側部分は完全な逆転写機能構造を含む(その二次構造は特別な構造を形成し、通常はΩ形; その一次構造は、中間スペーサー配列を含まないゲノム上の相補配列を結合し、2つの配列を直接接続することができる、2つのセグメント間の中間スペーサー配列によって分離された2つのセグメントを含む配列によって特徴付けられる。 LINEによってコードされるORF2pは、転写産物中の2つの配列のうち3'の配列に結合し、2つの配列の間の対応するゲノム遺伝子座でゲノム一本鎖を切断し、逆転写を開始する)、すなわち部分SINE配列である。
Alu要素によって生成される部分SINEなどの特定のSINEについては、部分Alu、具体的にはその中間アデニル酸リピートとして記録されるか、または上流に2～3塩基、およびAlu右モノマーと3'ポリAリピートが右モノマーの後に繰り返されます。 また、逆転写機能構造を含み、逆転写を開始できるが、従来のSINEとは配列が異なる配列を類似の短い散在要素(類似SINE)と呼びます。 )、対応する種類のLINE(Aluエレメントの機能に対応するLINE-1や各種MIRエレメントに対応するLINE-2など)で発現するタンパク質（例としては、ORF1p および ORF2p などがあります）を介して、RNAを二本鎖DNAに変換し、ゲノム上でそれに相補的な配列に結合させる(転写形成されたRNAを逆転写して一本鎖DNAを生成し、ゲノム配列をプライマーとする一本鎖DNAによって生成された二本鎖DNAは“転写産物の形質転換産物”である)。 特異的なΩ構造を形成することにより、相同組換え機構によって外因性配列がゲノムに挿入される。
さらに、LINEは、その下流配列を転写し(すなわち、3’形質導入)、ゲノム上の相補配列と結合してΩ構造を形成することにより、上記の同様のRNAの二本鎖DNAへの変換およびゲノム挿入を達成することもできます。Aluエレメントとその機能を補助する対応するLINE-1を例にとると、遺伝子発現後に生成されたプレmRNAを切断して、プレmRNAの任意の領域で発生する可能性のある配列が重複する投げ縄(lariat)を生成することができます。違いは、これらの投げ縄(lariat)を生成するカットの強さにあります。エクソンの上流および下流の投げ縄(lariat)の切断強度(配列の違いに基づく)は、他の周囲の投げ縄(lariat)の切断強度よりも高いため、プレmRNAの過程でエクソンを簡単かつ完全に切断することができ、他の投げ縄(lariat)の産生が阻害されます。
同時に、LINE-1によって生成されたORF1pは、それに結合した核酸を保護することができ、LINE(LINE-1)によって生成されたORF2pとともに、結合した核酸を核に配置し、それを核内に輸送することができる。さらに、ORF2pは、Aluエレメント転写産物の特別なΩ二次構造に結合し、その後のゲノム一本鎖切断、逆転写、およびゲノムへの組み込みを媒介することができます。Aluエレメントの転写産物は、特定の部位(複数の置換遺伝子座が産生する小さな細胞プラストエレメントRNA)(すなわち、一般的にAlu転写産物の中間ポリA配列の前に位置する以下のscAlu切断部位または天然切断部位、実際の状態に応じて変化してもよい)で切断することができ、小さな細胞質Alu(scAlu)RNAおよび右モノマーを含む残りの部分(逆転写機能的ORF2p)が生成される。右モノマーを含む残りの部分を部分Alu RNAと称し、部分Alu RNAが転写されるDNA配列を部分Alu 配列(partial Alu)と呼ぶ。
その後、得られた投げ縄(lariat)構造を、その3'末端から逆転写機能構造を含む切断されたAlu配列転写産物の残りまで連結することができ、ORF2pは、A(アデニル酸)に富む配列を介してリクルートされ、「部分Alu RNA二次構造によって形成されるΩ構造バイポッド」の3'脚と結合することができる。 Ωバイポッド上の配列と一致するゲノム上の配列を特定します(主に部分的なAlu RNA上のUU / AAAA、UとAの間の不連続性、つまりギャップが位置する場所)。Ωギャップの反対側のゲノム部位の一本鎖を切断し、Ωバイポッドの配列に相補的なゲノム配列を逆転写のプライマーとして溶融させる。このようなプロセスは、ターゲットプライミング逆転写(target-primed reverse transcription, TPRT)と呼ばれます。次いで、ORF2pは逆転写により生成された一本鎖DNAの3'末端に移動し、生成された一本鎖DNA配列をゲノム上の相補配列と結合させ、ゲノム上の挿入される対応する部位(標的部位、標的サイト)においてΩ二次構造を形成することができる(ゲノム上の挿入される対応する部位(標的部位)には挿入される配列が存在しないため、 一方、一本鎖DNAに挿入される配列の両側の配列は、ゲノム上の挿入される部位(標的部位、標的サイト)の両側に存在する)。
ORF2pは、相補配列に沿って3'から5'の方向にΩ構造にスライドし、Ω構造の下部2脚に相補的な6ヌクレオチド(主に3'の4つのヌクレオチドと5'の2つのヌクレオチド)を持つゲノム配列を特定し、上記の同様のプロセスを通じて二本鎖DNAを生成します。ORF2pを切断部位(すなわち、生成されたDNA上のΩ構造のギャップに対応するゲノム上の部位)にスライドさせることができるのは、完全に一致した配列のみであり、そのターゲティング精度を保証することに留意されたい。最終的に作製された二本鎖DNAは、対応する挿入部位(標的部位)の両側と再びΩ状(Ω構造)に結合する。6ヌクレオチド(主にORF2pによって認識される3'の4ヌクレオチドと5'の2ヌクレオチドの間)がギャップで不連続である場合(二本鎖DNAの構造Ωギャップで)、ORF2pのエンドヌクレアーゼ作用により、ギャップに対応する遺伝子(ゲノム)と生成された二本鎖DNAの他方の鎖に2つの一本鎖DNA切開を作り出すことができ、そして、Ω構造の中央の円形部分は、相同組換えメカニズムによってゲノムに挿入されます。
挿入された配列(挿入される配列)を変更することにより、相同組換えによってゲノムに対する欠失または置換などの他の効果を達成することができる。上記のプロセスにおいて、LINEによってコードされるORF1pのアニーリングおよび脱構築機能は、記載されたゲノム再構成プロセスにおける核酸によって生成された二次構造および「ゲノムへのその結合」を安定化し、その結合および作用後のゲノムからの核酸の分離を促進する上で補助的な役割を果たすことができる。また、ORF1pは高いRNA親和性と核局在機能を有する。ORF2pはゲノム二本鎖の片鎖しか切断できず、二本鎖切断を生じないため、安全性が高い。同様のメカニズムは、他のSINEとLINEの組み合わせにも適用されます。胚発生や腫瘍形成などの生理学的および病理学的プロセスにおける局所コピー数変動の変化、および欠失のあるHIV-1ゲノムは、ヒトゲノムに挿入されたSINE配列を好みますは、自然界におけるこのメカニズムの現れです。
転写されたmRNA配列は、ORF1pおよびORF2pの助けを借りてゲノムに組み込まれる可能性があることが報告されています。しかし、転写テンプレートは純粋に外因性の非相同配列であったため、ゲノム内の特定の部位にターゲティングすることができず、逆転写機能構造を持つ断片が結合しておらず、非効率的で制御が困難なランダムプロセスが発生しました。本発明によれば、転写配列が再設計され、様々な能動的または受動的手段によって様々なタイプのSINEまたは部分SINEなどの逆転写機能構造を含む配列と連結され、より正確で効率的な遺伝子編集効果が達成される。
生理学的条件下では、コピー数多型(CNV)は、無傷の遺伝子元のコピーに類似している。上記のメカニズムにより、無傷の遺伝子元のコピーとして連続的に伸長することができるCNVは、細胞、組織、生物のタンパク質発現および様々な状態を絶えず変化させることができる。CNV末端は、上流の遺伝子部分と下流の部分SINE配列部分からなり、投げ縄(lariat)に含まれる短い配列断片は、部分SINE配列と連結した投げ縄(lariat)の配列を介してCNV末端の2つの部分の間に連続的に挿入され、CNVを伸長させる。初期の胚発生では、LINEの転写は有意に増加し、ゲノムSINE(Alu要素配列など)は有意な脱メチル化を示します。LINEを介した3'形質導入(対応する(関連する)遺伝子のプロモーターの上流のSINEの右モノマー欠失および下流の完全なSINE構造に基づく)は、関連遺伝子のコピー数多型(CNV)の伸長を開始したが、脱メチル化されたSINE配列の相同組換えは、以前に伸長されたCNVのほとんどを欠失する(初期化)。その後、完全に初期化された胚細胞は高メチル化状態を取り戻し、CNV末端の部分SINE配列がCNV末端の漸進的な伸長を媒介し、それによって各細胞の発現状態および状態を変化させる。次に、各細胞の遺伝子発現状態は、投げ縄(lariat)を介したCNVの変化に影響を与え、したがって、ゲノムの変化と段階的な分化誘導につながります。これは、胚におけるCNVの一般的な変化および様々な組織におけるCNVの違いと一致している。
異なる遺伝子のCNV(癌遺伝子のCNVなど)の延長は、あらゆる種類の腫瘍細胞に一般的に存在し、臨床グレードと正の相関があります。同時に、癌原遺伝子と癌抑制遺伝子の発現レベルもCNVの長さに正比例するため、腫瘍の形成と進行は、癌原遺伝子または癌抑制遺伝子のCNVの障害に関連しているはずです。さらに、糖尿病などの外部刺激に関連するいくつかの不可逆的な疾患もCNVの異常に関連しています。薬剤耐性の大部分は、長期の外部刺激による対応するタンパク質の発現の変化と関連しているので、それらの対応する遺伝子のCNV変化が関与することができ、この技術によって薬剤耐性を改善または妨げることができる。
I.DNA媒介ゲノム配列挿入編集技術(遺伝子編集がDNAによって媒介される場合、1～40個のTTAAAAまたはTTTTAA配列をプラスミドに追加して、RNAのDNAへの変換を補助することができる)(図2に示すように)
1. 投げ縄構造を介したアプローチ:挿入する部位(すなわち標的部位)の上流および下流の配列(2000bp以内)を選択し、挿入される配列(2000bp以内)を上流および下流配列の中間挿入部位に付加する。設計された配列は合成され、ベクターに組み込まれ、RNAポリメラーゼIIによって転写され始めます。ベクターの他の領域は、「SINE配列」(0～20、受信システムへの影響を軽減するために、受信システムの種に応じて対応する種にSINEにすることができる)で挿入することができる。SINE配列としては、霊長類におけるAlu配列、単孔類におけるMon-1配列等とすることができ、その数は一定範囲内であれば効率に比例する。
また、非天然型、非種SINEを用いることも可能であり、その後、使用するSINEの機能に対応するLINEまたはそのタンパク質コード配列を導入しなければならない。下記参照)およびRNAポリメラーゼIIまたはIIIによって開始される。前記SINE配列の後に、対応するRNAポリメラーゼの終結シグナルが選択的に連結され(対応するLINE配列または該LINE配列によってコードされるタンパク質配列は、SINE中のAluエレメントに対応するLINE-1配列、または該LINE-1配列によってコードされるORF1pおよびORF2p配列など、該SINE配列の後の終結シグナルの前に選択的に挿入され得る。 MIRエレメントに対応するLINE-2配列、またはLINE-2配列によってコードされるORF1pおよびORF2p配列など、遺伝子編集に必要なタンパク質を発現させて、遺伝子編集を実現したり、編集効率を高めたりすること)(RNAポリメラーゼIIによって転写が開始される場合、対応する終結シグナルはpolyA配列であり、ORF2pのリクルートを増加させるためにその長さを適切に延長(200bp以内)することができる。それ以外の場合は、終結シグナルの前のORF1pおよびORF2p配列の後に適切な長さのpolyA配列を追加し(200bp以内)、SINE配列の末尾のpolyA配列を適切に伸長(200bp以内)することができます。)
その後、ベクトル (ベクターに含まれるSINE配列に対応するLINE配列またはLINE配列によってコードされるタンパク質配列、例えばAlu配列に対応するLINE-1またはORF2pおよび/またはORF1p配列を発現する他のベクターは、遺伝子編集効率を高めるために、受信システムに同時にトランスフェクトすることができる。受容系が対応するLINEのORF1PやORF2pなどの上記のタンパク質を発現しない場合には、タンパク質のさらなる発現が必要となる。加えて、SINEを発現するベクターは、同時に受容系にトランスフェクトすることもでき、遺伝子編集効率を向上させるように)は、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること(期待した効率が達成されない場合は、挿入される部位(標的部位)の上流および下流配列と挿入される中間配列からなる投げ縄構造の形成効率が高くないことに起因する可能性があり、 上流および下流の配列または挿入される配列の長さは、投げ縄構造の形成を促進するために増減することができる。あるいは、挿入される部位(標的部位)を含む投げ縄構造を以下の検出方法に従って検出し、該投げ縄構造の配列又は部分配列を標的部位の上流配列及び下流配列とし、標的部位の上流配列及び下流配列をゲノム配列に従って適切に伸長させ、 挿入される配列を標的部位の上流配列と下流配列の中間挿入部位(標的部位)に配置して遺伝子転写フレームワークを形成し、これをベクターに構築することができ、このベクターのトランスフェクションにより遺伝子編集効率を向上させることもできる。)(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)。挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
2. SINE（配列）直接接続アプローチ:
このアプローチでは、生成された投げ縄を切断されたSINE転写物と接続する必要はありません。ベクター構築時に、挿入する部位(標的部位)の上流および下流の配列とそれらの間に挿入される配列をSINE関連配列と直接接続するため、真核生物のpre-mRNAスプライシング機構がなければ投げ縄構造を生成できない細菌などの原核生物に適した方法であり、 また、プレmRNAスプライシング機構を有する真核生物にも適しています。これは、以下のLINEを介したアプローチにも当てはまります。具体的な手順は次のとおりです。挿入部位(標的部位)の上流配列と下流配列(2000bp以内)と、上流配列と下流配列の間に挿入される配列(2000bp以内)が遺伝子転写フレームワークを形成し、RNAポリメラーゼIIまたはIIIのプロモーターによって開始され、続いてSINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列を接続の配列が合成される (場合により、遺伝子編集効率を高めるために、SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列の後に、対応するSINE機能を補助することができるLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加し、受容系がLINEまたはそのコードタンパク質自体を発現しない場合、コードタンパク質を受容系に付加するか、または受容系において追加的に発現させなければならない)。
その後、SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列の後に、対応する種類のRNAポリメラーゼの終止シグナルを選択的に付加し(終止シグナルがpolyA配列の場合、終止シグナルを適切に伸長(200bp以内)してORF2pのリクルートを増加させることができる。
または、ORF2pのリクルートを増加させるために、SINE配列、部分SINE配列、類似SINE配列、LINE配列、ORF1p配列および/またはORF2p配列の後および終止シグナルの前に、適切な長さ(200bp以内)のpolyA配列を付加し、配列をベクターに構築することができる。
ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
LINE 媒介アプローチ:
RNA ポリメラーゼ II が LINE またはその中のタンパク質 ORF2p および/または ORF1p コード配列の発現を開始し、続いてSINE 配列直接接続アプローチと同じ方法で設計された配列が続きます(遺伝子編集受信システムへの影響を最小限に抑えるため、受信システムのSINEタイプとLINEタイプを選択できます。効率を向上させるために、その中の SINE シーケンスは、前の LINE に機能的に対応するように選択できます)、そして、使用したRNAポリメラーゼIIの終結シグナルを選択的に末端に連結することができます。ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
下流結合ORF2p結合配列アプローチ：
ベクター上の遺伝子転写フレームワークの標的部位上流配列、標的部位下流配列、中間挿入される配列がゲノムと結合することで形成されるΩ構造を利用して、SINEの逆転写機能構造を置換し、逆転写を開始します。遺伝子転写フレームワークにおける標的部位の下流配列の下流には、ＯＲＦ２ｐに結合可能なＯＲＦ２ｐ結合配列（例えば、ポリＡ配列）が接続される。LINE 配列、ORF1p および/または ORF2p コード配列は、効率を向上させるために、遺伝子転写フレームワークと同じベクターまたは別のベクターに選択的に追加できます。ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
II. DNA媒介ゲノム配列削除(欠失)技術、図2に示すように
1. ゲノム上の任意の領域の削除:上記の挿入手法で設計したベクター中の挿入される配列を、挿入点(標的部位)（100000bp以内）の上流または下流の特定の配列（2000bp以内）に変更し、本発明に記載のＤＮＡ、ＲＮＰ、またはＲＮＡ媒介挿入アプローチにより、２つの同一配列間の配列は、配列挿入後の相同組換えにより一定の効率で除去することができる(選択できる:組換え部位 (GCAGA[A/T]C、CCCA[C/G]GAC または/および CCAGC) を含む配列を挿入用に選択して、その後の相同組換えの効率を向上させることができます)。
2. CNV 末端の削除：細胞または組織内の CNV 末端は、シークエンシングおよびアラインメント（遺伝子配列と部分SINE 配列の接合部のアラインメント）によって検出されます。処理されるCNV末端の遺伝子部分（2000 bp以内）と完全な遺伝子の中でこのCNV末端下流範囲（2000 bp以内）の一部が形成できる投げ縄の3'部分配列（下流で形成され得る投げ縄を以下の方法により予測または検出することができる）（または投げ縄の3'部分配列を完全遺伝子中のCNV末端の20000 bpの範囲内の下流配列の切断配列で置換することができる）をそれぞれ選択し、その後、CNV末端の削除される配列の上流（100000 bp以内）に隣接するシーケンス(配列)(すぐ隣の上流配列)をそれぞれ接続する。その後、完全なSINE配列、部分SINE配列、または類似SINE配列（上記の異なる挿入技術による）を接続し（その後、任意にORF1pコード配列およびORF2pコード配列を接続することができる）。次に、上記の配列を合成してベクトルを構築します。そして、上述の遺伝子挿入技術の1つを通じて、DNA、RNAまたはRNP経路を通じて、CNV末端の削除される配列のすぐ隣の上流配列を実際のCNV末端の遺伝子部分とSINE配列部分との間に挿入する（担体上で使用されるSINE配列は挿入部位の周囲のSINE配列と同じか近い、効率を高めるため）。次に、削除される配列を同じ配列間の相同再編成によって削除します(選択できる:組換え部位 (GCAGA[A/T]C、CCCA[C/G]GAC または/および CCAGC) を含む配列を挿入用に選択して、その後の相同組換えの効率を向上させることができます)。
III、DNA媒介のゲノム配列置換技術:挿入技術で設計されたベクターに挿入される配列は、置換配列とゲノム上で置換される配列の周辺配列に変更される（すなわち、挿入される置換される配列とゲノム対応配列との間の相同組換えにより削除される配列である。ベクターを構築する際、挿入部位がゲノム上の置換される配列の上流または下流であるかに応じて、置換される配列の3'または5'に位置するかどうか）（置換される配列はゲノム上で置換される配列と相同でなければならない）。置換される配列及ゲノム上の置換される配列の周辺配列は、遺伝子編集挿入技術によりゲノム上の置換される配列の上流又は下流に挿入される。挿入された置換配列とゲノム上で置換される配列が相同組換えを起こすと、ゲノム上で置換される配列は、その相同挿入される置換される配列に置換される。同時に、相同組換えにより削除の置換される配列の周辺配列は、配列挿入中に置換される配列とともにゲノムに再挿入される。
RNA媒介ゲノム配列編集技術（DNAへのRNAの変換が不要であり、追加のTTAAAAサイトまたはTTAAAAサイトを追加する必要がないため）、図3に示すように。
1.リボ核タンパク質（RNP）媒介経路：前記合成したベクターを増幅してLINEにコードされるタンパク質を高発現する工学用細胞系（合成ベクターに含まれるSINE配列の機能に対応するLINEを選択して効率を高めることができ、例えば合成ベクターにAlu配列または部分Alu配列が含まれる場合、それはLINE-1とそのコードタンパク質ORF 1 pおよびORF 2 pに対応する）（関連タンパク質を発現するベクターのトランスフェクションまたはトランスフェクション後スクリーニングにより、関連タンパク質を永久に過発現する工学細胞を得る;後のステップで使用されるリボヌクレオチドがORF 1 pおよびORF 2 pなどの相関タンパク質によってインキュベートされる場合、転入される工学細胞は相関タンパク質を発現しなくてもよい）にトランスフェクションし、しばらく後に細胞核及び細胞質を抽出し、配列特異性などの原理及び相応の通常方法を用いて単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）、或いは単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）を含む生物活性を有するリボ核タンパク質（RNP）複合体を抽出する(得られたORF 1 p及び/又はORF 2 pを含む細胞質中又はORF 1 p及び/又はORF 2 pを含む生理学的液体中でのインキュベーション(適温、常温又は37℃でもよく、48 h以内のインキュベーション)の後に再度抽出精製することを選択することができ。in vitro生理学的液体又は細胞質中にRNA酵素阻害剤を添加する必要があり、この前に転入した細胞が関連タンパク質を発現しない場合はORF 1 p及び/又はORF 2 pとインキュベーションしなければならない)。その後、リポソームやウイルストランスフェクションなどの通常のトランスフェクション手段によってRNP複合体を体外培養された細胞や組織に移し（細胞質に移すことによって、直接細胞核に入る必要はない）、あるいは血液、リンパ、脳脊髄液、局所組織などの経路によって生体に与えて、遺伝子編集を完了する。指向性輸送が必要な場合は、ベクターの外側のラップを修飾することができます。プロセス全体がRNA分解を避けることに注意してください。
また、LINE媒介方式で合成されたベクターのRNP形式での適用は、抽出された単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）を含む生物活性を有するリボ核タンパク質（RNP）複合体から、先端LINE-1配列またはORF 1 pおよびORF 2 pコード配列を含まない生成物をスクリーニングする必要がある（配列特異性による）（インビトロヌクレオチダーゼなどを追加添加してせん断を促進することができる）、先端配列が遺伝子編集の標的を乱すのを防ぐために行われる。
2.単純RNA媒介経路：
前述の通り、挿入点（すなわち標的部位）を含む上下流配列（それぞれ2000 bp以内）および中間位置に位置し挿入点に対応する箇所にある挿入される配列（2000 bp以内）を合成し、その後SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列を接続し、その後使用するSINE機能に対応するLINE配列またはそこに含まれるタンパク質コード配列の配列を接続する（例えば、部分Alu配列を使用する場合、LINE-1及びその中のORF1 p及びORF2 pコード配列に対応し、部分MIR配列を使用する場合、LINE-2及びその中の対応するタンパク質コード配列に対応する）、そしてこの配列をベクターに構築してRNAポリメラーゼII/IIIプロモーターによって起動させる(あるいは、上述の各種DNA媒介法で得られた担体をそのまま用いて工学細胞に転入することができ、その後、遺伝子編集に使用できるRNA生成物を、配列特異性などに基づいて通常の手段により抽出する)。発現したmRNAを単離精製した後、リポソームなどの脂溶性物質やウイルスなどの通常のトランスフェクション手段を用いてRNAを包み、インビトロ培養した細胞、組織をトランスフェクションし、あるいは血液、リンパ液、脳脊髄液などの通路や局所組織投与などの方法で生体に転入し（細胞質に転入すればよく、核に入る必要はない）、挿入される配列をゲノム上の対応する挿入される部位に挿入する目的を達成することができる。挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる（持続的にRNAを細胞にトランスフェクションさせる必要がある可能性がある）。
転座子によるゲノム変化を阻害し、ゲノム及びその上のCNVsを安定させる(すなわち、この遺伝子編集技術によってCNV末端の遺伝子部分と部分SINE配列の間または他の領域にゲノムまたはCNV末端の遺伝子部分およびその部分の完全な遺伝子中の上下流配列と非同源的な配列を挿入し、CNVのさらなる伸長を阻害する。CNV末端は遺伝子配列（部分）が部分SINE配列に直接接続する領域として定義され、そこでは遺伝子を延長することができ、各特定のCNV末端の遺伝子配列（部分）と部分SINE配列の具体的な配列は遺伝子配列決定や遺伝子チップなどの分子生物学的手段によって取得することができる)(脂質溶性物質や細胞トランスフェクション能を有する物質、例えばリポソームやウイルスなどの通常のトランスフェクション手段を用いて対応するベクターを包んだ後にインビトロ培養細胞、組織をトランスフェクションし、あるいは血液、リンパ液、脳脊髄液などの通路や局所組織投与などを経て生体に転入する)(図4に示すように)
1.特定のCNVに介入する（挿入作用を達成するために用いられる標的部位の上流配列が特定の遺伝子のCNV末端である遺伝子部分）：操作が必要なCNVを選定し、その遺伝子部分の3’端と部分SINE配列の境界を挿入点（標的部位）とし、CNV終端遺伝子部分の3’端（2000 bp以内）を上記挿入方法における挿入点（標的部位）上流配列とし、標的部位下流配列は部分SINE配列である（したがって、上記方法における標的部位下流配列の後に接続されるSINE配列、部分SINE配列、または類似SINE配列のようなものは省略可能である）、挿入される配列は、ゲノム又はCNV末端における遺伝子部分及び完全な遺伝子中における遺伝子部分の上下流配列と非同源的な任意の配列（2000 bp以内）である。ベクター構築が完了した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、非相同配列を対応するCNV末端に挿入した。非相同配列は完全遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子配列（部分）の下流に存在しないため、完全な遺伝子配列に基づいてCNV末端をさらに延長することができず、それによってCNV末端のさらなる変化を阻害する。
2.ゲノム上の広範なCNVへの介入（挿入作用を実現するために使用される標的部位の上流配列は、存在する可能性のあるすべてのCNV末端の遺伝子部分を含む必要がある）：
（1）ゲノム破砕配列法：操作が必要な生体、組織又は細胞系中の細胞を体外培養し、又は直接ゲノムを抽出し、超音波破砕後ランダムプライマー及びPCRにより増幅する、短ランダム配列（20 bp以内）を設計合成し、下流で部分SINE配列を接続する。増幅して得られたゲノム断片と合成された短ランダム配列接続部分SINE配列断片をPCRにより接続と増幅し、異なるゲノム断片配列がランダム配列を接続した後の接続部分SINE配列の配列を得て、得られたフラグメントをベクターに構築した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ゲノム断片配列を介してゲノム上のすべてのCNV末端を標的化し、非相同配列（すなわち、短いランダム配列または部分的に短いランダム配列であり、それは遺伝子断片と同源な部分ではなく、対応する遺伝子断片の局所的な遺伝子配列にとって非同源的である）をCNV末端の遺伝子部分と部分SINE配列の間に挿入する、非相同配列は完全な遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子部分配列の下流に存在しないため、CNV末端のさらなる変化を阻害する。
（2）ランダム配列法：適切な長さ（100 bp以内）を発現するランダム配列（すべての可能な配列組み合わせを含み、SINE配列と近似する部分を排除することができる）、その後、任意のゲノム非同源の配列（2000 bp以内）を接続した後、部分SINE配列を接続するのプラスミドを構築し、あるいはランダム配列（100 bp以内）、その後SINEの中間自然せん断部位（例えば、Alu要素の転写生成物の場合、この部位は転写生成物の中間に位置し、scAluと部分Aluを生成するせん断部位をせん断することができる）に任意のゲノム非相同配列（2000 bp以内）を追加するの部分SINE配列を接続するのプラスミドを構築し、RNAポリメラーゼIIによって転写されたランダム配列後に任意のゲノム非相同配列（その後、投げ縄として発現）を連結するベクター（このベクターにはSINE配列を含むか、またはSINE配列を含む他のベクターに追加的に転入する必要があり、SINE配列の下流にはSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を接続または追加的に発現することができる）も構築することができる。そして、上述のDNA、RNPまたはRNA経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ランダム配列を通じてゲノム上のすべてのCNV末端を標的にし、非相同配列を対応するCNV末端に挿入させ、非相同配列は完全な遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子配列（部分）の下流に存在しないため、CNV末端のさらなる変化を阻害する。
（3）投げ縄終端配列法による：すべての投げ縄の種類(ゲノムと相同でない小片のランダム配列（100 bp以内）をSINE配列に挿入し、その後もSINE配列を部分SINE配列に正常に切り取ることができる（すなわち、この非相同系列の挿入位置はSINE自然せん断部位の下流であり、せん断部位には位置しない）、そして、この改造SINE配列を発現できるプラスミドを構築し、対応する操作対象生物から取り出して増幅する細胞または対応する種の細胞系に転入する（対応する測定対象種のゲノムをとり、全ゲノムを比較的長く（200 bp以上）かつある程度重なり合う（10 bp以上重なる）断片に切断し、ベクターに構築することもできる、このフラグメントは、対応する種のinvitro細胞におけるRNAポリメラーゼIIによる過剰発現）、一定時間後にSINE配列に挿入された非相同配列の配列特異性により対応する核酸を抽出し、シーケンシング検査を行い、非相同配列を含む部分SINE配列に接続された各種生成投げ縄の配列情報を取得する。）を検出する、または／同時に、pre-mRNAによる投げ縄を形成する配列規則に基づいて投げ縄配列を予測し（例えば、AGで終わることが多い）、その種または個体のすべての投げ縄配列情報を得る。すべての投げ縄の3’配列（2000 bp以内）をとり、ゲノムと非相同な任意の配列（2000 bp以内）をそれぞれ接続した後、上記SINE配列（上記によれば、効率を高めるために、「SINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列」をその後ろに接続することができる）を発現するベクター（SINEは別のベクターでも発現可能）に統合し、投げ縄として発現し、そしてSINE転写産物の細胞中でのせん断によって生成された部分SINE配列に接続し、あるいは、得られたすべての投げ縄の3’配列をそれぞれ任意のゲノム非相同配列（2000 bp以内）に接続した後、接続部分SINE配列（上述のようにSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列をその後ろに接続して効率を高めることができる）（SINE配列は、それに接続された投げ縄の3’配列が存在する遺伝子のSINE配列と同じか類似していることが好ましい）、ベクターを構築して発現する。上述のDNA、RNPまたはRNA経路を介して対応する細胞、組織または生体に転入し、全ゲノム範囲内のCNV末端を編集する。
（4）SINE配列改造法：すなわち、改造されたSINE配列の発現を追加投与することにより、びゲノム又は該CNV末端中の遺伝子部分及完全な遺伝子におけるこの部分の上下流配列と非相同な配列を各CNV末端に挿入し、CNV末端の延長を阻害する。SINE自然せん断部位の前に短い配列（通常の場合に生成されるソケットの3’シーケンスと一致せず、SINE自然せん断部位にまたがる小段のシーケンス（100 bp以内）を追加すればよい）を追加し、SINEの転写産物をこの新規領域でも自然せん断できるようにする完全なSINE配列を含むベクターを構築する（その後ろに対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加して効率を高めることができる）、あるいはSINE転写産物の自然せん断部位の後に任意のゲノム非相同配列（200 bp以内）を追加する完全なSINE配列（その後ろに対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加して効率を高めることができる）を構築する、そして、対応する細胞、生体組織、または生体を投与する。使用されるSINE配列は、全ゲノム上のすべてのCNV末端を正確に修正するために、できるだけその種または個体のすべてのSINE配列（シーケンシングまたはアレイチップなどの方法で得ることができる）をカバーする。
全ゲノムを互いにある程度重なる長い断片（1つの投げ縄構造の長さ以上の重畳長さ）に切断することもでき、ベクターに組み込まれた後、対応する種のinvitro細胞系で過発現し、投げ縄構造を産生し、その後、上記で作製した発現改造SINE配列（下流に対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を添加した後、RNA経路を介して媒介することができる）のベクターを転入し、投げ縄に接続された部分SINE（改造SINE配列から発生）の生物活性を有する単鎖RNAリボ核タンパク質（RNP）複合体またはRNAを配列特異性などの性質および通常の手段により単離精製し、その後、対応するRNAまたはRNP経路を介して機能する。
3.ゲノム上のSINEとLINEを改造する：ゲノム上のSINEのプロモーター、転写産物の自然せん断部位またはSINE上のその他の配列または/およびLINEのプロモーター、タンパク質コード配列またはその他の配列を本遺伝子編集技術を通じて任意の配列（500 bp以内）を挿入し、ゲノム上のSINE配列を転写できない、または転写後にせん断できない、または/およびゲノム上のLINE配列を転写できない、または正常な機能を持つタンパク質を産生できない。まず操作を行う個体の全ゲノムのSINE配列またはLINE配列に対してシーケンシングを行い、その上のプロモーター、転写産物の自然せん断部位、蛋白コード配列またはその他の配列を挿入点（標的部位）として選択し、本遺伝子編集技術における上下流配列はSINE配列またはLINE配列上の挿入される部位（標的部位）に対する上下流配列であり、挿入される配列は任意の配列である。上記の挿入方法により、ゲノム上のSINEまたはLINE上の対応する部位に任意の配列を挿入する。また、ゲノム上のSINE配列またはLINE配列を上記遺伝子編集方法により置換または削除して不活化してもよい。
4.CNV末端を削除しながら固定する：操作が必要なCNV末端を選択し、その遺伝子部分の3’端と部分SINE配列の境界を挿入される部位とし、前記挿入方法における標的部位の上流配列はCNV末端の遺伝子部分の3’端配列（2000 bp以内）、下流配列は部分SINE配列である（したがって、上記遺伝子編集方法における標的部位下流配列の後に接続される部分SINE配列は省略可能である）、挿入される配列は、ゲノム上の削除される配列（100000 bp以内）の上流に隣接する配列（2000 bp以内）である後、ゲノム配列と非相同な任意の配列（2000 bp以内）を接続する。ベクター構築が完了した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ゲノム上の削除される配列の上流に隣接する配列、およびその後の非相同配列を対応するCNV末端に挿入し、2つの同じ（相同）配列に相同組換えが発生して中間配列が削除された後、非相同配列は同時にCNVのさらなる延長を阻害する。
5.抑制固有機構法：細胞や生体固有のCNV伸長機構を直接抑制することもでき、例えば：RNA干渉などの方式によってSINEやLINEなどの転写やそのRNA及び符号化された蛋白質、例えばORF 1 pとORF 2 pの産生を抑制し、特異的蛋白質を通じてこのCNV伸長機構に関連する蛋白質、例えばORF 1 p、ORF 2 pまたは剪断体などのあるいは複合体の機能構造と結合してその機能を阻害し、上述の遺伝子編集技術などを通じて、ゲノム上のSINE、例えばAluと各種MIRなど、各種LINE及びその中の相応するタンパク質コード配列などを改造して活性を失活させたり低下させたり、相同組換え或いはDNAミスマッチ修復上の関連タンパク質機能を抑制したり、改造されたヌクレオシド類物質を投与して逆転写の進行を阻害したり、したがって、内在的なCNV伸長機構を抑制することにより、ゲノムの変化を阻害し、CNVsを安定させる作用を実現する。
SINE、LINE及びその発現するタンパク質は真核生物中に広く存在するため、この技術を通じて広範な真核生物に対して遺伝子編集操作を行うことができる。また、遺伝子改変を有する疾患の治療及び遺伝子改変に関連する細胞又は生体状態の改変又は安定化等にも応用できる。
本技術では、ある決定配列（挿入される配列など）が5′→3′方向にあることを定義し、上流が決定配列の5’端の前で、下流が決定配列の3’端の後で、上流配列は決定配列の5’端より前の配列であり、下流配列は決定配列の3’端より後の配列である。
本技術が提供する遺伝子転写フレームワークは、図5に示すように、5’→3’方向に沿って標的部位上流配列、挿入される配列(挿入すべき配列)、標的部位下流配列を含む。遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、長い散在核要素、プロモーターとの位置関係をより理解できるようにするために、理解のためにいくつかの異なる接続形態を挙げた。図6に示すように、遺伝子転写フレームワークの前にプロモーターが連結された構造の概略図である。プロモーターは、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーターであってもよい。プロモーターはベクター上に位置することができ、ベクター酵素切断部位を通じて遺伝子転写フレームワーク、短い散在核要素、長い散在核要素などをプロモーター下流に挿入し、細胞にトランスフェクションして後進発現する。直接合成の方法でプロモーターを遺伝子転写フレームワーク、短い散在核要素、長い散在核要素などと直接合成し、ベクターに挿入することもできる。図7は遺伝子転写フレームワークの上流にプロモーターを接続し、下流に短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を接続する構造である。図8は遺伝子転写フレームワークの上流にプロモーターを接続し、下流に長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続する構造模式図である。図9は、遺伝子転写フレームワークの上流で長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続し、長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流でプロモーターを接続する構造模式図である。図10は遺伝子転写フレームワークが上流でプロモーターを連結し、下流で短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を連結した後、下流で長い散在核要素またはORF 1 pコード配列またはORF2pコード配列を連結する構造模式図である。図11は遺伝子転写フレームワークの下流に短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を接続し、遺伝子転写フレームワークの上流に長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続し、長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流にプロモーターを接続する構造模式図である。図12は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が1つのプロモーターを共用しない構造模式図である。図13は遺伝子転写フレームワークと長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターを共用しない構造模式図である。図14は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターの構造を共有しておらず、短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の下流に位置し、両者は1つのプロモーターを共有している。図15は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターを共用しない構造であり、短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流に位置し、両者は1つのプロモーターを共用している。これらはすべて遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が同一ベクター上にある形式であり。同一ベクター上にいなくてもよい、共同で細胞にトランスフェクションし、異なるプロモーターによって発現してもよい。
以下の実施例では、使用される材料はヒト由来細胞であるため、したがって使用されるSINEは霊長類特有の短い散在核要素Alu要素である。Alu要素の完全な配列はSeq ID No.1に示され、部分Alu配列はSeq ID No.2に示されている。使用される材料が他の種である場合、発現を容易にするために、短い散在核要素を対応する種の短い散在核要素に交換することができる。
材料
１．ｐＳＩＬ－ｅＧＦＰプラスミドベクターが、Ａｄｄｇｅｎｅから購入されたＰｌａｓｍｉｄ ５２６７５であり、ｐＢＳ－Ｌ１ＰＡ１－ＣＨ－ｍｎｅｏプラスミドベクターが、Ａｄｄｇｅｎｅから購入されたＰｌａｓｍｉｄ ５１２８８であった。
2. 10×酵素切断緩衝液（NheI酵素切断に必要）：330 mM Tris-acetate、100 mM酢酸マグネシウム、660 mM酢酸カリウム、1 mg/mL BSA、10×酵素切断緩衝液（Sali酵素切断に必要）：500 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、1000 mM NaCl、1 mg/mL BSA。
3.制限酵素NheI、SaliはThermoFisherから購入した。
4.T4 DNAリガーゼ及びその応用に必要な10×接続緩衝液はPromegaから購入した。5.Entranster-H 4000トランスフェクション試薬は「北京英格恩生物科技有限公司」から購入した。
6.血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：DP 304。
7.SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）は「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：FP205。
8.磁気ビーズ法組織/細胞/血液総(トータル)RNA抽出キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：DP 761。
9.FastKing cDNA第一鎖合成キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：KR 116。
10.TIANSeq mRNA捕捉キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：NR 105。
11.LipofectamineTM MessengerMAXTM mRNAトランスフェクション試薬はThermoFisherから購入した。
12.トリプシンはSigma-Aldrichから購入し、製品カタログ番号：T 1426。
13.Dnase Iは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：RT411。
14.プライマー、配列の化学合成は「ポォー尚生物技術（上海）有限公司」によって完成された。
実施例1 ゲノム指定部位に挿入する外因性配列のDNA媒介挿入
血管内皮増殖因子(VEGFA)は、PDGF / VEGF成長因子ファミリーのメンバーです。ジスルフィド結合ホモ二量体として存在するヘパリン結合タンパク質をコードしています。この成長因子は、血管新生、内皮細胞の増殖、内皮細胞の増殖の誘導、細胞遊走の促進、アポトーシスの阻害、血管透過性の誘導など、生理学的血管新生と病理学的血管新生の両方に必要な役割を果たします。
本実施例では、そのVEGFA遺伝子に外因性配列を挿入し、本発明のDNA媒介ゲノム配列挿入技術を確認した。
ヒトゲノム中の遺伝子VEGFAの459-bp配列を選択し、その配列を配列番号3に示す:
ATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCAC*AATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAA、式中*は選択された挿入部位(標的部位)であった。VEGFA遺伝子における挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)は挿入部位の前であり、VEGFA遺伝子における挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)は挿入部位の後であった。遺伝子転写フレームワークを形成するために挿入される配列として、ランダムに設計された非相同配列を挿入部位に添加し、遺伝子転写フレームワークの両末端に制限エンドヌクレアーゼNheI酵素切断部位と保護塩基(overhangs)を添加して、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにした。完全な配列は配列番号4に示されています:
CTAGCTAGCTAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAACTAGCTAGCTAG、式中、下線部分は無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)であり、長さは38bpであり、配列の両末端はNheI酵素切断部位および保護塩基であった(太字斜体)。配列は化学合成によって得られ、VEGFA1と命名された。挿入される外因性配列は、VEGFA遺伝子のその配列と非相同な配列として設計され、ゲノム上の標的部位への挿入が後の実験で特異的に検出される可能性がある。
同時に、ベクター上の挿入部位の前後にVEGFA遺伝子の挿入部位の上流配列と下流配列の短い配列を追加し、長さの異なる標的部位の上流配列と標的部位の下流配列が挿入効果に及ぼす影響を検証した。
VEGFA配列の挿入部位の10bp前および10bp後を選択し、非相同配列、NheI酵素切断部位および保護塩基を有する配列を、配列番号5に示すように短い配列に設計した:
CTAGCTAGCTAGAAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTACTAGCTAGCTAG、このうち、下線部は無作為に設計された長さ38bpの外因性非相同配列(挿入される配列)を表し、配列の両端にNheI酵素切断部位と保護塩基(太字斜体)があり、化学合成により得られた配列をVEGFA2と命名した。
制限酵素切断部位の選択は、プラスミド構築の便宜のためのみであり、異なるベクターに応じて変更することができた。
pSIL-eGFPにVEGFA1とVEGFA2を挿入し、プラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1とpSIL-eGFP-VEGFA2を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
VEGFA1、VEGFA2とpSIL-eGFPを別々に消化し、反応系を表1に示す:
表1 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したVEGFA1とVEGFA2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表2に示した:
表2 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1とpSIL-eGFP-VEGFA2を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
pSIL-eGFPプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
Alu発現配列を設計し、Alu配列、非相同配列(18bp)、TTTTT、およびTTTTAA*n(式中nが6)を連結し、その配列の両末端にSalI酵素切断部位および対応する保護塩基を付加することにより、配列番号6に示す配列を得る:
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAAGGGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCCGGCTAAAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTATCAGGCGAGCCCGTATTTTTTTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAAACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA、ここで、両端の斜体は太字のSalI消化部位および対応する保護塩基であり、上流のSalI消化部位と対応する保護塩基の後にAlu配列が続き、下線はAluに添加した後の非相同配列(18bp)であり、Aluを標識して、その転写産物と遺伝子転写フレームワーク(挿入される配列を含む)の転写によって生成された投げ縄との結合の検出を容易にするために使用されます実験の作用機序を検証するための後の実験では、波線は転写のターミネーターであり、二重下線はRNAをゲノムで一般的な繰り返し配列であるDNAに変換するために使用される6TTTTAAの繰り返しです、複数形を追加または追加しないことを選択してもよく、この実施形態では6を追加することを選択する。 配列は化学合成によって得られ、Alu1と命名された。
Alu1、プラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1およびプラスミドpSIL-eGFP-VEGFA2をそれぞれSalIで消化した。消化反応系を表3に示した:
表3 消化反応システム
反応条件は、37°Cで3時間インキュベートし、その後80°Cに温度を10分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したAlu1をプラスミドベクターpSIL-eGFP-VEGFA1とpSIL-eGFP-VEGFA2とライゲーションし、反応系を表4に示した:
表4 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1 (図16に示すように)とpSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
pSIL-eGFPプラスミド自体は、RNAポリメラーゼIIIに依存するプロモーターであるU6プロモーターを持っているため、U6プロモーターの後にAlu配列を挿入すると、RNAポリメラーゼIIIによってAlu配列(Alu要素、Aluエレメント)の転写が開始される可能性があります。
pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1またはpSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1をHela細胞にトランスフェクトして、ランダムに設計された外因性配列の挿入効率をテストしました。挿入効率を向上させるために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドであるpBS-L1PA1-CH-mneoをHela細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計しました。実験群と対照群との共トランスフェクトプラスミドを表5に示す。
表 5 グループ化
グループ化から示すように、対照群1では、元のpSIL-eGFPとpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトし、遺伝子転写フレームワーク配列とAlu1配列を含まない。実験群1では、VEGFA遺伝子の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワーク、Alu1配列およびpBS-L1PA1-CH-mneoを含むpSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1およびpBS-L1PA1-CH-mneoを同時トランスフェクトした。実験群2では、pSIL-eGFP-VEGFA1とpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトし、VEGFA遺伝子上の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワークとpBS-L1PA1-CH-mneoを含みましたが、Alu1配列は含まれていませんでした。実験群3では、VEGFA遺伝子の標的部位の上流および下流の短い配列を含む遺伝子転写フレームワーク、Alu1配列およびpBS-L1PA1-CH-mneoを含むpSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1およびpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトした。実験群4では、pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1はトランスフェクトされたが、pBS-L1PA1-CH-mneoはトランスフェクトされず、VEGFA遺伝子上の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワークおよびAlu1配列が含まれていたが、pBS-L1PA1-CH-mneoは含まれていなかった。各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 細胞の各プレートのトランスフェクションの場合、48μgまたは96μg(実験グループによると、1つのプラスミドのみがトランスフェクションされた場合は48μg;2つのプラスミドを同時トランスフェクトした場合、各プラスミドの48μg、および合計96μgの2つのプラスミドを用いた)構築したプラスミドを300μL無血清DMEMで希釈し、十分に混合した。同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子を検出するための上流プライマー配列は、配列番号7に以下のように示されている:5'-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3'。下流プライマー配列を配列番号8:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'に示す。
プライマーペア1およびプライマーペア2を設計し、プライマーペア1の上流プライマー配列を配列番号9として示す:5'-CCCAGGGTTGTCCCATCT-3';下流プライマー配列を配列番号10:5'-CCTCCTCTTATTCCGTAGC-3'に示す。プライマーペア1の上流プライマー配列は、完全なVEGFA遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流配列の上流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノムのみにおいて、プライマーペア1の下流プライマー配列は、挿入されるランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)の5'末端の19bp配列に位置する。プライマーペア2の上流配列を配列番号11に示す:5'-CACAACAGTCGTGGGTCG-3';下流プライマー配列を配列番号12に示す:5'-GAGGGAGAAGTGCTAAAGTCAG-3'。プライマーペア2の上流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)の3'末端の18bp配列に位置し、下流プライマー配列は完全なVEGFA遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の下流配列の下流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノム内のみに位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表6に示す。
表6 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群1、および実験群1-4からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア1:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
プライマーペア2:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、54°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表7と表8に示した、表7はプライマーペア1の結果を示し、表8はプライマーペア2の結果を示す。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表7 プライマーペア1の結果（n=3, x￣±s）
他の群(N/Aは40.00に従って計算)と比較して、実験群1の相対コピー数は他の群よりも有意に高く、統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)のより長い上流または下流配列とAluエレメント(SINE)および/またはORF1pおよび/またはORF2p(LINE)の適切な発現により、遺伝子編集が最も効率的であることが示唆された。実験群2、3、4のコピー数の相対量は対照群1よりも高く(N/Aは40.00に従って計算された)、すべての結果は統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子編集は依然として効果的であるが効率が低いことを示唆している。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の上流または下流配列が短く、細胞自体のAluエレメント(SINE)の発現が低いかまったくないか、ORF1pおよびORF2p(LINE)の発現が低いかまったくないという条件下で。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の両側に十分な長さの配列は、効率的な挿入を確実にするために投げ縄(lariat)の形成を容易にするために必要とされる。標的部位の上流および/または下流配列を長くするか、ORF1p、ORF2p(LINE)および/またはAluエレメント(SINE)を付加的に発現させることで、編集効率を向上させることができます。
表8 プライマーペア2の結果（n=3, x￣±s）
他の群(N/Aは40.00に従って計算)と比較して、実験群1の相対コピー数は他の群よりも有意に高く、統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)のより長い上流または下流配列とAluエレメント(SINE)および/またはORF1pおよび/またはORF2p(LINE)の適切な発現により、遺伝子編集が最も効率的であることが示唆された。実験群2、3、4のコピー数の相対量は対照群1よりも高く(N/Aは40.00に従って計算された)、すべての結果は統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子編集は依然として効果的であるが効率が低いことを示唆している。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の上流または下流配列が短く、細胞自体のAluエレメント(SINE)の発現が低いかまったくないか、ORF1pおよびORF2p(LINE)の発現が低いかまったくないという条件下で。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の両側に十分な長さの配列は、効率的な挿入を確実にするために投げ縄(lariat)の形成を容易にするために必要とされる。標的部位の上流および/または下流配列を長くするか、ORF1p、ORF2p(LINE)および/またはAluエレメント(SINE)を付加的に発現させることで、編集効率を向上させることができます。
表7及び表8の結果によれば、挿入される配列の両端がゲノム上の挿入される部位(標的部位)に挿入されたこと、すなわち挿入される配列が挿入される部位(標的部位)に完全に挿入されたことを意味する。実験グループ1、2、3、4は、非相同配列をゲノムに完全に挿入することができ、実験グループ1が最も効率が高くなります。
実施例2 遺伝子転写フレームワークによって形成される投げ縄構造(挿入される外因性配列を含む)とSINE部分配列(例えば、Aluエレメント)を含むRNA断片との間の接続を検出する(自然せん断部位で切断されたAluエレメントの転写)
実施例1の実験群1および対照群1のトランスフェクト細胞からの全RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
cDNAテンプレートの逆転写合成:
cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対3は、挿入される外因性配列を含む転写投げ縄構造と、Alu要素の転写産物によって産生される部分Alu配列を含むRNA断片との間の結合を検出するように設計した。上流プライマー配列は配列番号11:5’-CACAACAGTCGTGGGTCG-3’に示され、上流プライマーは挿入される外因性配列上に位置し、下流プライマー配列を配列番号13に示す:5’-TACGGGCTCGCCTGATAG-3’。下流プライマーは、プラスミドに構築されたAlu配列の後の非相同配列(18bp)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表9に示す。
表9 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、54°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および 挿入される配列を含む投げ縄(lariat)構造と部分Aluを含むRNA断片との間の結合 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表10に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表10 プライマーペア3の結果（n=3, x￣±s）
対照群1(N/Aは40.00に従って計算)と比較して、実験群1の相対コピー数は有意に高く、統計的有意性(P < 0.05)であり、挿入される外因性配列を含む投げ縄(lariat)構造が実際にAlu配列の転写物(すなわち、部分Aluを含むRNA断片)と実際に連結されていたことが分かる。
表10から、Alu配列(すなわち部分Aluを含むRNA断片)の転写物が、挿入される配列を含む転写産物と実際に連結されていたことが分かる。
実施例3.DNAを介したゲノム指定部位への挿入される外因性配列の挿入
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)遺伝子ファミリーのメンバーであるMMP2遺伝子は、細胞外マトリックスの成分およびシグナル伝達に関与する分子を切断することができる亜鉛依存性酵素である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、コラゲナーゼA、IV型コラゲナーゼであり、触媒部位に3つのフィブロネクチンII型リピートを含み、変性したIV型およびV型コラーゲンとエラスチンが結合することを可能にする。ほとんどのMMPファミリーメンバーとは異なり、このタンパク質の活性化は細胞膜上で起こり得る。この酵素は、プロトドメインを除去するためのタンパク質分解を必要とせずに、プロテアーゼによって細胞外に、またはS-グルタチオンを介して細胞内で活性化することができる。このタンパク質は、神経系、子宮内膜月経破裂、血管新生調節、転移など、さまざまな経路に関与していると考えられています。この遺伝子の変異は、ウィンチェスター症候群および結節性関節症骨溶解症(NAO)症候群に関連しています。選択的スプライシングは、異なるサブタイプの複数の転写変異体のコード化をもたらす。
本実施例では、そのMMP2遺伝子に外因性配列を挿入し、本発明のDNA媒介ゲノム配列挿入技術を確認した。
ヒトゲノム中の遺伝子MMP2の479-bp配列を選択し、その配列を配列番号14に示す:
AGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAG*GTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAG、式中*は選択された挿入部位(標的部位)であった。MMP2遺伝子における挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)は挿入部位の前であり、MMP2遺伝子における挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)は挿入部位の後であった。遺伝子転写フレームワークを形成するために挿入される配列として、ランダムに設計された非相同配列を挿入部位に添加し、遺伝子転写フレームワークの両末端に制限エンドヌクレアーゼNheI酵素切断部位と保護塩基(overhangs)を添加して、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにした。完全な配列は配列番号15に示されています:
CTAGCTAGCTAGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAGCTAGCTAGCTAG、式中、下線部分は無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)であり、長さは103bpであり、配列の両末端はNheI酵素切断部位および保護塩基であった(太字斜体)。配列は化学合成によって得られ、MMP2-1と命名された。挿入される外因性配列は、MMP2遺伝子のその配列と非相同な配列として設計され、ゲノム上の標的部位への挿入が後の実験で特異的に検出される可能性がある。
同時に、ベクター上の挿入部位の前後にMMP2遺伝子の挿入部位の上流配列と下流配列の短い配列を追加し、長さの異なる標的部位の上流配列と標的部位の下流配列が挿入効果に及ぼす影響を検証した。
MMP2配列の挿入部位の10bp前および10bp後を選択し、非相同配列、NheI酵素切断部位および保護塩基を有する配列を、配列番号16に示すように短い配列に設計した:
CTAGCTAGCTAGGACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGCTAGCTAGCTAG、このうち、下線部は無作為に設計された長さ103bpの外因性非相同配列(挿入される配列)を表し、配列の両端にNheI酵素切断部位と保護塩基(太字斜体)があり、化学合成により得られた配列をMMP2-2と命名した。
制限酵素切断部位の選択は、プラスミド構築の便宜のためのみであり、異なるベ
pSIL-eGFPにMMP2-1とMMP2-2を挿入し、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1とpSIL-eGFP-MMP2-2を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
pSIL-eGFP、MMP2-1とMMP2-2を別々に消化し、反応系を表11に示す:
表11 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したMMP2-1とMMP2-2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表12に示した:
表12 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1とpSIL-eGFP-MMP2-2を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
pSIL-eGFPプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
Alu発現配列を設計し、Alu配列、非相同配列(18bp)、TTTTT、およびTTTTAA*n(式中nが
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAAGGGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCCGGCTAAAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCAAGAGCGAGCCAACAGATTTTTTTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAAACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA、ここで、両端の斜体は太字のSalI消化部位および対応する保護塩基であり、上流のSalI消化部位と対応する保護塩基の後にAlu配列が続き、下線はAluに添加した後の非相同配列(18bp)であり、Aluを標識して、その転写産物と遺伝子転写フレームワーク(挿入される配列を含む)の転写によって生成された投げ縄との結合の検出を容易にするために使用されます実験の作用機序を検証するための後の実験では、波線は転写のターミネーターであり、二重下線はRNAをゲノムで一般的な繰り返し配列であるDNAに変換するために使用される6TTTTAAの繰り返しです、複数形を追加または追加しないことを選択してもよく、この実施形態では6を追加することを選択する。 配列は化学合成によって得られ、Alu2と命名された。
Alu2、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1およびプラスミドpSIL-eGFP-MMP2-2をそれぞれSalIで消化した。消化反応系を表13に示した:
表13 消化反応システム
反応条件は、37°Cで3時間インキュベートし、その後80°Cに温度を10分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したAlu2をプラスミドベクターpSIL-eGFP-MMP2-1とpSIL-eGFP-MMP2-2とライゲーションし、反応系を表14に示した:
表14 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2とpSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
pSIL-eGFPプラスミド自体は、RNAポリメラーゼIIIに依存するプロモーターであるU6プロモーターを持っているため、U6プロモーターの後にAlu配列を挿入すると、RNAポリメラーゼIIIによってAlu配列(Aluエレメント)の転写が開始される可能性があります。
pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2またはpSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2をU251(ヒト神経膠腫)細胞にトランスフェクトして、ランダムに設計された外因性配列の挿入効率をテストしました。挿入効率を向上させるために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドであるpBS-L1PA1-CH-mneoをU251細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計しました。実験群と対照群との共トランスフェクトプラスミドを表15に示す。
表 15 グループ化
グループ化から示すように、対照群1では、元のpSIL-eGFPとpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトし、遺伝子転写フレームワーク配列とAlu2配列を含まない。実験群5では、MMP2遺伝子の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワーク、Alu2配列およびpBS-L1PA1-CH-mneoを含むpSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2およびpBS-L1PA1-CH-mneoを同時トランスフェクトした。実験群6では、pSIL-eGFP-MMP2-1とpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトし、MMP2遺伝子上の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワークとpBS-L1PA1-CH-mneoを含みましたが、Alu2配列は含まれていませんでした。実験群7では、MMP2遺伝子の標的部位の上流および下流の短い配列を含む遺伝子転写フレームワーク、Alu2配列およびpBS-L1PA1-CH-mneoを含むpSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2およびpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトした。実験群8では、pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2はトランスフェクトされたが、pBS-L1PA1-CH-mneoはトランスフェクトされず、MMP2遺伝子上の標的部位の上流および下流に長い配列を含む遺伝子転写フレームワークおよびAlu2配列が含まれていたが、pBS-L1PA1-CH-mneoは含まれていなかった。各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがU251細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、U251細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 細胞の各プレートのトランスフェクションの場合、48μgまたは96μg(実験グループによると、1つのプラスミドのみがトランスフェクションされた場合は48μg;2つのプラスミドを同時トランスフェクトした場合、各プラスミドの48μg、および合計96μgの2つのプラスミドを用いた)構築したプラスミドを300μL無血清DMEMで希釈し、十分に混合した。同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子を検出するための上流プライマー配列は、配列番号7に以下のように示されている:5’-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3’。下流プライマー配列を配列番号8:5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’に示す。
プライマーペア4を設計し、プライマーペア4の上流プライマー配列を配列番号18として示す:5’-TTTCAGGGTCTAGGTGGC-3’;下流プライマー配列を配列番号19:5’-AAATGCTTTCTCCGCTCT-3’に示す。プライマーペア4の上流プライマー配列は、完全なMMP2遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流配列の上流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノムのみにおいて、プライマーペア4の下流プライマー配列は、挿入されるランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表16に示す。
表16 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群1、および実験群5-8からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア4: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表17に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表17 プライマーペア4の結果（n=3, x￣±s）
他の群(N/Aは40.00に従って計算)と比較して、実験群5の相対コピー数は他の群よりも有意に高く、統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)のより長い上流または下流配列とAluエレメント(SINE)および/またはORF1pおよび/またはORF2p(LINE)の適切な発現により、遺伝子編集が最も効率的であることが示唆された。実験群6、7、8のコピー数の相対量は対照群1よりも高く(N/Aは40.00に従って計算された)、すべての結果は統計的有意性(P < 0.05)であり、遺伝子編集は依然として効果的であるが効率が低いことを示唆している。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の上流または下流配列が短く、細胞自体のAluエレメント(SINE)の発現が低いかまったくないか、ORF1pおよびORF2p(LINE)の発現が低いかまったくないという条件下で。遺伝子転写フレームワークにおける挿入部位(標的部位)の両側に十分な長さの配列は、効率的な挿入を確実にするために投げ縄(lariat)の形成を容易にするために必要とされる。標的部位の上流および/または下流配列を長くするか、ORF1p、ORF2p(LINE)および/またはAluエレメント(SINE)を付加的に発現させることで、編集効率を向上させることができます。
実施例4 遺伝子転写フレームワークによって形成される投げ縄(lariat)構造(挿入される外因性配列を含む)とSINE部分配列(例えば、Aluエレメント)を含むRNA断片との間の接続を検出する(自然せん断部位で切断されたAluエレメントの転写)
実施例3の実験群5および対照群1のトランスフェクト細胞からの全RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
cDNAテンプレートの逆転写合成:cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対（ペア）5は、挿入される外因性配列を含む転写投げ縄(lariat)構造と、Alu要素の転写産物によって産生される部分Alu配列を含むRNA断片との間の結合を検出するように設計した。上流プライマー配列は配列番号20:5'-GGCATAATGATGTGGCTGTT-3'に示され、上流プライマーは挿入される外因性配列上に位置し、下流プライマー配列を配列番号21に示す:5'-TCTGTTGGCTCGCTCTTG-3'。下流プライマーは、プラスミドに構築されたAlu配列の後の非相同配列(18bp)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表18に示す。
表18 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、52°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および 挿入される配列を含む投げ縄(lariat)構造と部分Aluを含むRNA断片との間の結合 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表19に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表19 プライマーペア5の結果（n=3, x￣±s）
対照群1(N/Aは40.00に従って計算)と比較して、実験群5の相対コピー数は有意に高く、統計的有意性(P < 0.05)であり、挿入される外因性配列を含む投げ縄(lariat)構造が実際にAlu配列の転写物(すなわち、部分Aluを含むRNA断片)と実際に連結されていたことが分かる。表19から、Alu配列(すなわち部分Aluを含むRNA断片)の転写物が、挿入される配列を含む転写産物と実際に連結されていたことが分かる。
実施例5は、本発明における遺伝子編集技術のターゲティング精度を試験する
配列番号15に示す配列におけるランダムに設計された非相同配列(すなわち挿入される配列)の上流の5bp～10bp(合計6bp配列)を「CGATGA」に置き換えて、配列番号22に示す配列を得る:
CTAGCTAGCTAGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGCGATGAAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAGCTAGCTAGCTAG、この配列では、波状部分は元々GACCAGであり、CGATGAに置き換えられ、残りの配列はSeq ID No.15と同じでした。配列は化学合成によって得られ、MMP2-3と命名された。
実施例3の方法を用いてMMP2-3を調製し、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2を得た。
プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2をU251細胞(ヒトグリオーマ)にトランスフェクトし、ORF1pおよびORF2pを発現するプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo(LINE)も実験群としてU251細胞に同時トランスフェクトし、pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2およびpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトした前述の細胞を対照群とした。具体的なグルーピングを表20に示す。
表 20 グループ化
各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがU251細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。トランスフェクションの方法及びトランスフェクション後の細胞DNAの抽出は実施例3と同様とした。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア4を用いたPCR検出、および実施例3のqPCR反応系および反応サイクルを用いたqPCR検出。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表21に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表21 プライマーペア4の結果（n=3, x￣±s）
表21から分かるように、実験群の相対コピー数は対照群よりも有意に低く(N/Aは40.00に従って計算)、統計的に有意(P<0.05)であり、ベクター上の挿入部位(標的部位)の上流配列がゲノム上の挿入部位(標的部位)の上流配列と一致しない場合、 ゲノム上の標的部位に配列を挿入することは困難であった。したがって、本発明によって実施される遺伝子編集は、高いターゲティング精度を有する。
実施例6 挿入される外因性配列を挿入するためのSINE配列(例としてAlu配列)直接連結法の適用
IT15遺伝子はハンチントン病の原因遺伝子であり、本実施例ではIT15遺伝子に外来性配列を挿入し、ゲノム配列挿入技術「DNAを介したSINE配列の直接ライゲーション法(Alu配列を例に)」を確認する。
ヒトゲノム中の遺伝子IT15の160bp配列を配列番号23に示すように選択した:
ATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAG*AAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCA、ここで、*は選択された挿入部位(標的部位)、挿入部位の前のIT15遺伝子の挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)、および挿入部位の後のIT15遺伝子の挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)である。
挿入される配列として挿入部位にランダムに設計された非相同配列を付加し、標的部位の下流に部分Alu配列を連結して遺伝子転写フレームワークとし、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにするために、制限酵素NheI消化部位と保護塩基を両端に付加し、完全な配列を配列番号24に示します。
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAGGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、このうち、アンダースコアは、無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)を示し、長さは60 bp、配列の両端にNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)、およびIT15遺伝子挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)と3′NheI消化部位および保護塩基配列との間の部分Alu配列(斜線部分)を示す。 配列は化学合成によって得られ、IT15-1と命名された。
部分Alu配列を標的部位の下流の配列の下流に接続するという選択は、生物における特定の構造によって形成される特定の状態を模倣するように選択される。 この状態は、SINEの転写産物(Aluエレメント)が細胞内作用(SINE転写産物の自然せん断部位での切断)によって生成される逆転写機能を保持する構造と、プレmRNA(pre-mRNA)せん断によって生成される投げ縄構造とがつながった状態です。
図17に示すようにプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoにIT15-1を挿入し、プラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
IT15-1とpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表22に示す:
表22 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したIT15-1をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表23に示した:
表23 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
実験群:トランスフェクトされたpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1プラスミドの群を実験群10とした; 非改変pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドをトランスフェクトした群を対照3とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対6:その上流プライマー配列を配列番号25に示す:5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号26:5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'に示されている。 プライマーペア6の上流プライマー配列は、そのままのIT15遺伝子に位置し、さらにプラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流の配列の上流は、プラスミド中ではなく、ゲノムのみに位置し、プライマーペア6の下流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表24に示す。
表24 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群3、および実験群10からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア6: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表25に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表25 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
表25から、実験群10の相対コピー数は対照群3の相対コピー数よりも有意に高く(N/Aは40.00に従って算出)、統計的に有意(P<0.05)であり、挿入される配列がゲノム上の標的部位に効率的に挿入されていることを示していることがわかります。
実施例7は、本発明における遺伝子編集技術のターゲティング精度を試験する
配列番号24に示す配列におけるランダムに設計された非相同配列(すなわち挿入される配列)の上流の10bp～15bp(合計6bp配列)を「GGACAT」に置き換えて、配列番号27に示す配列を得る:
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACAGGACATCAGTTACAGGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、このシーケンス(配列)では、波状部分は元々TGTGTGであり、GGACATに置き換えられ、残りの配列はSeq ID No.24と同じでした。配列は化学合成によって得られ、IT15-2と命名された。
プラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoにIT15-2を挿入し、プラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2を構築し、実施例6を参照した。
pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2プラスミドを導入したHela細胞群を実験群11とした;pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1プラスミドを導入したHela細胞群を対照群4とした。各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
実施例6の方法は、qPCR検出のためのトランスフェクションおよびトランスフェクト細胞DNAの抽出に使用した。
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
qPCRにプライマーペア6を用い、反応系および反応サイクルは実施例6と一致した。GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表26に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表26 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
実験群の相対コピー数は対照群よりも有意に低く(N/Aは40.00に従って計算)、統計的に有意(P<0.05)であり、ベクター上の挿入部位(標的部位)の上流配列がゲノム上の挿入部位(標的部位)の上流配列と一致しない場合、 ゲノム上の標的部位に配列を挿入することは困難であった。
結論:本発明により実施されるゲノム配列挿入は、高いターゲティング精度を有する。
実施例1から実施例6まで、DNAを介した外因性配列をゲノム指定部位に挿入する方法は、真核細胞(細胞株や初代細胞など)の効果的な遺伝子編集が可能であり、挿入される配列を高効率かつ高精度に標的部位に標的化することがわかる。異なる組織細胞を編集することの実現可能性から、この方法は様々な細胞、組織および生物(生物)に適用できることがわかる。
実施例8 DNAを介したゲノムの配列(削除される配列)の欠失(削除)
ヒトゲノム中の遺伝子MINK1の配列は、配列番号28に示すようにランダムに選択される:
AGAGAATGAGGGGCCCCTTTTTCTCTCTGGTGGCTCAGGCCCAACTCCCTTCCTACTGGGGAGGCTCACTCCCTCCCCTTTCCCCTCTCCCCCTGGAATGCCCTGCCTCCTGCTGAAAATCCCTCAGGAAGCTCTTCACCTGTCACCTGTTACGGGCCAGGTGCTCTGCAGGTTGCTCTGGGGAGATGGGATCTGATGGCCCTCCTGCCTGGGATGCTGTCCGTGATCCTTTTACCTGGGTTTTTCTCTAAGATGCTGGAAGATGGAATCGGGTTCTTCAGGATGGTGGTGGGGTAAAGGAGGGTGCTGGGGTGTCTGGGTCGGGCCAGGACCACAGCTGGCTCAGGCAAGTCCTGTGTGTGCACGCAGGGATGTGAGGCAAGGGAGCAGAGGTGACTCCCCACACTGACCCCTCCCTCTGTGTCTTCACAGTGGATTTTGGGGTGAGTGCTCAGCTGGACCGCACCGTGGGCAGACGGAACACTTTCATTGGGACTCCCTACTGGATGGCTCCAGAGGTCATCGCCTGTGATGAGAACCCTGATGCCACCTATGATTACAGGGTATGGAGTGGAAAGTTGGGAGCATGGGGGCTGCCAAGGGCGGGAAGCAATATGGGGACCACGGGGCCTGAGCAGGCTGGGGAACAGAGGAAGGTCAGATGATGTTAGCAGTGAGGGGCTGGGGAACATCTTACGGCAAGGCAAGTGTGGGTGGGAAGATGGGATGGGTTGGAAGGCACTGCTGCAGGAATGGGTGTGGCCCAGGAAGGCTCCTGAGAGGCCAGGATGGTGGGTGAAGAGAGGTTGCAGGGCAGAGTTGTCAGGAATATTCACTTGTTCCTTCTTTCCCGTCTATAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTG、ここで、下線部は、ゲノム上で削除される配列であり、削除される配列の前のゲノム上で削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、削除される配列の後のゲノム上で削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列であり、 影のある部分は、ゲノム上で削除される配列の3'配列です。
配列は、削除される配列の3'配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列の順に構築され、NheI消化部位および対応する保護塩基が両端に付加され、配列は配列番号29に示されています:
CTAGCTAGCTAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCAGAGAATGAGGGGCCCCTTTTTCTCTCTGGTGGCTCAGGCCCAACTCCCTTCCTACTGGGGAGGCTCACTCCCTCCCCTTTCCCCTCTCCCCCTGGAATGCCCTGCCTCCTGCTGAAAATCCCTCAGGAAGCTCTTCACCTGTCACCTGTTACGGGCCAGGTGCTCTGCAGGTTGCTCTGGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTGCTAGCTAGCTAG、両端の斜体と太字の部分は、NheI消化部位と対応する保護塩基です。 配列は化学合成によって得られ、MINK1-1と命名された。
同時に、配列番号29において削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列をMINK1遺伝子と相同ではない配列を用いて置換し、配列番号30に示すような配列を得る:
CTAGCTAGCTAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTGCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはMINK1遺伝子と相同ではない置換配列である。 配列は化学合成によって得られ、MINK1-2と命名された。
MINK1-1およびMINK1-2をそれぞれプラスミドベクターpSIL-eGFPに挿入し、以下のようにプラスミドpSIL-eGFP-MINK1-1およびpSIL-eGFP-MINK1-2を構築した。
MINK1-1、MINK1-2、およびプラスミドpSIL-eGFPを別々に消化し、反応系を表27に示した:
表27 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したMINK1-1またはMINK1-2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表28に示した:
表28 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpSIL-eGFP-MINK1-1 および pSIL-eGFP-MINK1-2を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
実施例1で調製したAlu1、プラスミドpSIL-eGFP-MINK1-1およびプラスミドpSIL-eGFP-MINK1-2をSalIで消化し、連結させた後、反応系および条件を実施例1と同様にして、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1およびpSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1を得た。
削除される配列を削除する効果は、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1またはpSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1をHela細胞にトランスフェクションすることによってテストされました。 欠失効率を改善するために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoをHela細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計した。 このうち、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneoを導入した群を実験群12とし、pSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneoを導入した群を対照群5とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
実施例1の方法に従って、プラスミドトランスフェクションを行い、トランスフェクションされた細胞DNAを抽出する。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対(ペア)7:その上流プライマー配列を配列番号31に示す:5'-ACAGGGTATGGAGTGGAAAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号32:5'-ATAGACGGGAAAGAAGGAAC-3'に示されている。 プライマーペア7の上流プライマーは、ゲノム上のMINK1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在せず、下流プライマーはゲノム上のMINK1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在しない。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表29に示す。
表29 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群5、および実験群12からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア7:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表30に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表30 プライマーペア7の結果（n=3, x￣±s）
実験群12の相対コピー数(40.00で計算されたN/A)は対照群5よりも有意に少なく、実験結果は統計的に有意(P<0.05)であり、ゲノム上で削除される配列が削除したことを示しています。
実施例9 SINE配列(Alu配列を例にとる)直接接続方式により配列を削除する
FMR1遺伝子は遺伝性精神遅滞 - 脆弱X症候群に関連しており、配列番号33に示すように、配列の1つが選択されました:
ACTTGCTGAGTACCCAAGGAAAGTGTGCTTGTATTTATGGGCGTCTATTTTCAGAGCACTAATTATTGCTGAATTAGAACAGAAATATAGGAAAACTGATTTTTACAAGGAGCTTCAAAGCAATCTCAGGTAGTTTCTGATTATGTATCTCTGCCTACCTCGGGGTACATAGACAGGGTTACAATTTGGTTGAGGATATATGACATGTGGTTTTTAAAGACACCTAGGGGCATTTTAAGAAAATTTCCTCGATATCTGAAAATCTGTAGATTTCAAAATTATGTTAATCATGAAATATTCTGTGTTGTAATTTTTGTGTAGGTGTATTCCAGAGCAAATGAAAAAGAGCCTTGCTGTTGGTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGATAAAGGGTGAGGTAGGAAAATGCCTATTTAAATTTTTTTCTTATATTGTTTCCTTTTTTTAAACCCAGGTTGTACATTCCCGTGTGGATTTCTATTTTGAAGTAATATCTAATTTTGAGTAATTTAATTAAAATGTTTTCACTATGTGTTCAGTATGTTTCTGTTGGTCATAAATTTTTTCACATAGATTATTTATTTTAAAATAACTGAATAGGGAGAACTTCTTATTCTTACTTTAAAAATTGTGATTAGAAGTGACTTTTATTTATTTCTCAGTTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAA、ここで、下線部は、ゲノム上で削除される配列であり、削除される配列の前のゲノム上で削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、削除される配列の後のゲノム上で削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列であり、 影のある部分は、ゲノム上で削除される配列の3'配列です。
配列は、削除される配列の3'配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列+部分Alu配列の順に構築され、NheI消化部位および対応する保護塩基が両端に付加され、 配列は配列番号34に示されています:
CTAGCTAGCTAGTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGACTTGCTGAGTACCCAAGGAAAGTGTGCTTGTATTTATGGGCGTCTATTTTCAGAGCACTAATTATTGCTGAATTAGAACAGAAATATAGGAAAACTGATATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、両端の斜体と太字の部分は、NheI消化部位と対応する保護塩基です。影付きの部分は部分Alu配列です。 配列は化学合成によって得られ、FMR1-1と命名された。
同時に、配列番号34において削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列をFMR1遺伝子と相同ではない配列を用いて置換し、配列番号35に示すような配列を得る:
CTAGCTAGCTAGTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはFMR1遺伝子と相同ではない置換配列である。 配列は化学合成によって得られ、FMR1-2と命名された。
FMR1-1およびFMR1-2をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1およびpBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2を構築した。
FMR1-1、FMR1-2、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表31に示した:
表31 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したFMR1-1またはFMR1-2をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表32に示した:
表32 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1 および pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1を導入した群を実験群13とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2を導入した群を対照群6とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア8:その上流プライマー配列を配列番号36に示す:5'-ACAGGGTTACAATTTGGT-3'; 下流プライマー配列は、配列番号37:5'-CATTTGCTCTGGAATACAC-3'に示されている。 プライマーペア8の上流プライマーは、ゲノム上のFMR1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在せず、下流プライマーはゲノム上のFMR1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在しない。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表33に示す。
表33 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群6、および実験群13からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア8:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、45°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表34に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表34 プライマーペア8の結果（n=3, x￣±s）
実験群13の相対コピー数(40.00で計算されたN/A)は対照群6よりも有意に少なく、実験結果は統計的に有意(P<0.05)であり、ゲノム上で削除される配列が削除したことを示しています。
上記実施形態から、本発明を用いてゲノムの任意の領域における任意の配列の削除が実現可能であることがわかる。 同時に、シーケンシングが各遺伝子のCNVs末端を取得する場合(すなわち、対応する遺伝子配列がSINE配列の一部を接続する場合)、CNVs末端を編集することもできる:挿入または削除してCNVsを編集し(CNVs末端)、それらによってもたらされる発現変化によって細胞、組織または生物の状態を変更する。
実施例10 RNAを介したゲノムに挿入される外来性配列の挿入
ヒトゲノム中の遺伝子IT15の配列を選択し、対応する配列を次の順序で設計した:配列番号38に示すように、NheI消化認識部位および保護塩基+挿入部位(標的部位)の上流配列+挿入される配列+挿入部位(標的部位)下流配列+部分Alu配列+NheI消化認識部位および保護塩基:
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAACATGTGTGCAGTTACAGAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアは、挿入されるランダムに設計された(IT15遺伝子に相同ではない)配列を示し、長さは60 bp、配列の両端にNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)、およびIT15遺伝子挿入部位(標的部位)の下流配列と3'NheI消化部位および保護塩基配列との間の部分Alu配列(斜線部分)を示す。 配列は化学合成によって得られ、IT15-3と命名された。
IT15-3をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3を構築した。
IT15-3、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表35に示した:
表35 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したIT15-3をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表36に示した:
表36 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
次に、pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3およびpBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドをそれぞれHela細胞にトランスフェクトしました。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液総(トータル)RNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
全RNAからのmRNAの抽出:
先に抽出した総RNA濃度をUV分光光度計で検出し、1000 ngの総RNAをヌクレアーゼフリーddH2Oで50 μLに希釈し、TIANSeq mRNAキャプチャキットの指示に従ってmRNAを抽出し、サンプルの一部を採取してmRNA含有量を検出しました(上記の実験手順を数回繰り返して、トランスフェクションに十分なmRNAを取得します)。
実験群:「pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3プラスミドを導入したHela細胞」から抽出したmRNAを与えられた群を実験群14とした; 「pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドを導入したHela細胞」から抽出したmRNAを与えられた群を対照7とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
得られたmRNAをLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬を用いて細胞に移し、実験群14および対照群7で6ウェルプレートで培養したHela細胞。 最初のトランスフェクションは、細胞が40%のコンフルエントまで成長したときに行われます。 トランスフェクトした細胞の各ウェルについて、7.5 μLのLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬を125 μLの無血清DMEM溶液で希釈し、室温で10分間インキュベートします。 調製したmRNA5 μgを無血清DMEM溶液125 μLと混合した後、予め希釈した125 μLのLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬と混合し、室温で5分間インキュベートします。 得られた混合液を培養細胞の各ウェルの培養液に加え、穏やかに混合する。 細胞が70%コンフルエントになったら、上記の操作を繰り返す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア6:その上流プライマー配列を配列番号25に示す:5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号26:5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'に示されている。 プライマーペア6の上流プライマー配列は、そのままのIT15遺伝子に位置し、さらにプラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流の配列の上流は、プラスミド中ではなく、ゲノムのみに位置し、プライマーペア6の下流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表37に示す。
表37 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群7、および実験群14からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア6: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表38に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表38 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
表38から、実験群14の相対コピー数は対照群7の相対コピー数よりも有意に高く(N/Aは40.00に従って算出)、統計的に有意(P<0.05)であり、挿入される配列がゲノム上の標的部位に効率的に挿入されていることを示していることがわかります, 本発明のRNA経路による遺伝子編集が有効であることを示す。
完全なRNA媒介の実現可能性により、ORF2pおよび/またはORF1pのコード配列が、編集されるシステムにインポートされる配列に追加されていない場合、挿入部位(標的部位)上流配列+挿入される配列+挿入部位(標的部位)下流配列+SINE配列(Alu配列など)、部分SINE配列または類似SINE配列を含むRNA産物は、インビトロでORF2pに結合するか、ORF1pとORF2pに同時に結合し、RNP媒介経路によって細胞(細胞質)に転写することができる。
実施例11 CNV末端は本発明によって固定および編集される
生物に広く存在するCNV伸長の現象に基づいて、各遺伝子のCNVは末端を有するべきであると推測することができる。具体的には、対応する遺伝子における配列のセグメントを下流に連結した部分SINE(Alu)配列と、異なるなげなわで連結された部分SINE(Alu)配列(二本鎖DNA)は、CNVの末端の部分SINE配列の前に遺伝子配列を連続的に挿入し、CNVを徐々に伸長させる。 エクソンはpre-mRNAから切り離す必要があるため、イントロンの末端はなげなわを形成する必要があり、それと重なるエクソンを含むなげなわを生成する確率は低いため、発現が比較的低い遺伝子の場合、比較的長い期間が必要であり、CNV末端は遺伝子のイントロンの末端に位置し、部分SINE(Alu)配列に結合している。
本実施例では、BRCA1遺伝子におけるイントロンの3'配列を無作為に選択し、次例において欠失する配列として選択した。 BRCA1遺伝子イントロンの3'配列を配列番号39に示す:
CCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAGAAGGATATTTTGGAAAACTCCTTACATACCTAAATTCTTTGTTTATCAAATACTTGGACTTAGCACACTCTTCTTTGAAATGGACCAATAAACAACAGGAGCCCATAAGCAAAAAGAACTCATTATTTTAAAAACAGTAACTATCCTTACAGGCTTTCTCAGGGCTCTTTCTGTTGGATCCTTCCCTCTCACAGGTCCTTGCTAATGATCTCTAGGTGGACACATTCTAGATGAGATGTCCCTGTCTAGAATGGCAGCACCATGAGGGCTATATCCTCAGTACTAGGACAGCGCCTGGTGCTTAATAGATAGTAAATAGTTGTCTAATTAACTGAGCAAACAGATAGATTCATGAATTAGCTTTTTGCTTTTTCTGTTAGAAACTAAAGGTTCAGGTCAGGCACAATGGCGCATGTCTCTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCTGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATAGTAAAACCCTGTTTCTACAAAAATTACCAAAATTAGCCGGGCGTCTTGGCAAGCACCTGTAATGCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGTGGGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGAAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATGGTGCCAACCTGGGTGACAGAGGGAGACTTAAAAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAAACTAAAGGTTCAAAGAATCCCAGAAAAGGAAGAGTCCTCACAAGCCAGTAATCTAGGCAGGATTACTGATAGTATTTTTATATTTGTTGTATTTTTATAAAATGCCATAGATAGAGGGCTTTTTTCAACATTACATCAGTCTAAAAATCACACATTTTTATATGAACTAACCTAAATGTCTGATGAATCTCACAACACCAAGTCTTTGAAATGTGCCCATATAAATAAAATGTTAACAGATTCATGCTAATTTTAAATATCGATAGTGTTTAAATGCCTTAATTATTTTTTCACTCCCTAGCTTTAAAAGAAAATAACCAACTTCAAAAGGACATCACAATAACATCAAGTCTATTTGGGGGAATTTGAGGATTTTTTCCCTCACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAG、ここで、下線部は、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、下線の後の配列は、削除される配列(具体的には、BRCA1遺伝子のイントロンの3'配列)、波線は、削除される配列の3'末端配列である(欠失は、次の実施形態において行われるので、名前)。
配列は、欠失する配列の3'末端配列+BRCA1遺伝子と相同でないランダムに設計された配列+部分Alu配列の順に構築され、配列の両端にNheI消化部位と保護塩基が付加されて配列が構築される。
Aluエレメント転写産物が部分Alu配列のみを含むRNAを産生させる天然せん断部位は、異なる文献で一貫して報告されていないため、CNV末端の部分Alu配列とのミスマッチによる挿入不能を防ぐために、3つの可能な部分Alu配列を合成して導入し(違いはそれらの5'末端配列が異なることです)、関連する配列は配列番号40、配列番号41、配列番号42に示すように構築されています。
配列配列番号40は：
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu3(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu3と命名された。
配列配列番号41は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu4(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu4と命名された。
配列配列番号42は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu5(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu5と命名された。
配列番号43、配列番号44および配列番号45に示すように、非相同配列(BRCA1遺伝子と相同でない配列)を含まない配列も設計される。
配列番号43の配列は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号43は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu3である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu3と命名された。
配列番号44は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGCTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号44は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu4である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu4と命名された。
配列番号45は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号45は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu5である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu5と命名された。
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5を構築した。
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表39に示した:
表39 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したBRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表40に示した:
表40 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5を導入した群を実験群15とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5を導入した群を対照群8とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、96 μg(各プラスミドにつき32 μg)を取り、構築したプラスミドを300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合します。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア9:その上流プライマー配列を配列番号46に示す:5'-CCCCTTTATCTCCTTCTG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号47:5'-ATTTCTCCCATTCCACTT-3'に示されている。プライマー対9の上流プライマー配列は、プラスミド上ではなくゲノム上にのみ存在し、インタクトBRCA1遺伝子において削除される配列の3'末端配列の下流に位置し、プライマー対9の下流プライマー配列は、プラスミド中ではなく、ゲノム上のみにおいて、インタクトBRCA1遺伝子において欠失される配列の3'末端配列の下流に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表41に示す。
表41 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群8、および実験群15からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア9: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、46°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の3'末端配列の下流配列挿入を検出の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表42に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表42 プライマーペア9の結果（n=3, x￣±s）
実験群15の相対コピー数(40.00で計算されたN/A)は対照群8よりも有意に少なく、実験結果は統計的に有意(P<0.05)であり、これは、実験群15のCNV末端の遺伝子部分が対応するインタクト遺伝子の下流配列におけるコピー数が少ないことを意味し、CNV末端への非相同配列の挿入がCNV末端の下流の遺伝子部分の伸長を妨げることを示している。
結論:CNV末端への非相同配列の挿入は、対応するCNVの伸長を妨げることがわかる。
実施例12 CNV末端(端部)の切断(短縮)
BRCA1遺伝子のイントロンの1つの3'配列(実施例11の配列番号39に位置する)を選択し、削除される配列の3'末端配列+非相同配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+部分Alu配列の順に配列を合成し、両末端にNheI消化部位及び保護塩基を付加し、配列を配列番号48、配列番号49及び配列番号50に示した。
配列番号48の配列は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分Alu配列-Alu3です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu3と命名された。
配列番号49は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分Alu配列-Alu4です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu4と命名された。
配列番号50は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分的なAluシーケンス-Alu5です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu5と命名された。
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4、BRCA1-3-Alu5をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5を構築した。
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4、BRCA1-3-Alu5、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表43に示した:
表43 消化反応システム
反応条件は、37°Cで1時間インキュベートし、その後65°Cに温度を20分間インキュベートしてエンドヌクレアーゼ酵素を不活性化し、電気泳動、酵素消化産物を回収した。
消化したBRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4およびBRCA1-3-Alu5をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表44に示した:
表44 リンケージ反応系
反応条件は、16°Cで16時間インキュベートした後、70°Cで10分間インキュベートしてリガーゼを不活性化し、電気泳動および精製してプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5を得た。 プラスミドが正しいことを確認するために配列決定した。
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5を導入した群を実験群16とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5を導入した群を対照群9とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、96 μg(各プラスミドにつき32 μg)を取り、構築したプラスミドを300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合します。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア10:その上流プライマー配列を配列番号51に示す:5'-GCTTTCTCAGGGCTCTTT-3'; 下流プライマー配列は、配列番号52:5'-GCACCATCTCGGCTCACT-3'に示されている。プライマー対10の上流プライマー配列は削除される配列上に位置し、プラスミド中には存在せず、ゲノム上にのみ存在し、プライマー対10の下流プライマー配列は削除される配列上に位置し、プラスミド中には存在せず、ゲノム上にのみ存在する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表45に示す。
表45 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、トランスフェクション後の前述の対照群9、および実験群16からDNA抽出した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア10: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、49°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表46に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表46 プライマーペア10の結果（n=3, x￣±s）
実験群16の相対コピー数(40.00で計算されたN/A)は対照群9よりも有意に少なく、実験結果は統計的に有意(P<0.05)であり、実験群16では、削除される配列が削除し、CNV末端の遺伝子部分配列が減少していることが示された。
実施例11から、CNV末端が伸長し続けるのを妨げるために、CNV末端に非相同配列が挿入され得ることが分かる。 しかし、実施例12は、実験群におけるCNV末端の遺伝子部分の配列が対照群の配列よりも有意に小さいことを示しており、CNVが短くなっている間にCNV末端がクリップされていることを示しており、CNV末端が本発明における関連する方法によって改変され得ることを証明している。 したがって、本発明の遺伝子編集方法において、ゲノム上の複数または全てのCNVsを、挿入点の上流のガイド配列(すなわち、標的部位上流配列)を変更することによって改変することもできる(CNV末端において遺伝子編集を行う場合、ここで標的部位上流配列とCNV末端の遺伝子部分配列は同一である)。
実施例13 CNV末端クリッピング後の対応する遺伝子発現変化
実施例12の実験群16および対照群9の細胞から全RNAを抽出する:
トランスフェクトされた細胞RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
全RNAからのmRNAの抽出:
先に抽出した総RNA濃度をUV分光光度計で検出し、1000 ngの総RNAをヌクレアーゼフリーddH2Oで50 μLに希釈し、TIANSeq mRNAキャプチャキットの指示に従ってmRNAを抽出し、サンプルの一部を採取してmRNA含有量を検出しました(上記の実験手順を数回繰り返して、トランスフェクションに十分なmRNAを取得します)。
cDNAテンプレートの逆転写合成:
cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の発現は様々な組織において比較的安定しているため、GAPDH遺伝子が内部参照遺伝子として用いられる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア11:その上流プライマー配列を配列番号53に示す:5'-CAGAGGACAATGGCTTCCATG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号54:5'-CTACACTGTCCAACACCCACTCTC-3'に示されている。プライマーペア11の上流プライマー配列はBRCA1遺伝子上に位置しプラスミド中には存在せずゲノム上にのみ存在し、プライマーペア11の下流プライマー配列はBRCA1遺伝子上に位置しプラスミド中には存在せずゲノム上にのみ存在する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表47に示す。
表47 qPCR反応系
細胞DNAテンプレートを、共トランスフェクション後の対照9群および実験16群から抽出したmRNAからcDNAを合成した。
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア11: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、55°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および BRCA1 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表48に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表48 プライマーペア11の結果（n=3, x￣±s）
実験群16のBRCA1遺伝子の相対発現は対照群9の相対発現よりも低く、統計的に有意であり(P<0.05)、BRCA1遺伝子のCNV末端クリッピングがその発現の減少につながったことを示しています。
結論:BRCA1遺伝子の発現が減少していることがわかり、CNVの編集が対応する遺伝子の転写に影響を与え、タンパク質の発現や細胞、組織、生物の状態に影響を与える可能性があることが示されました。
実施例11～13から分かるように、本発明に基づくと、CNV末端を固定、伸長およびクリップし、かつ細胞の遺伝子転写およびタンパク質発現に同時に影響を与えることができる。 さらに、CNVは、胚や個体発生の発生、腫瘍形成などの生理学的プロセスによっても変化し、細胞、組織、個体によって異なるため、CNVを編集すると、対応する細胞、組織、生物の状態も変化する可能性があります。上記実施形態から分かるように、本発明は、真核生物に広く存在するレトロトランスポゾン及びそれらの逆転写機能を用いてゲノムを編集し、関与するSINE、LINE配列及び関連タンパク質が正常生物に広く存在し、二本鎖切断、より正確な標的配列認識および切断を生成することなく、標的断片はゲノムに組み込まれ、対応する断片は欠失および置換され得る。二本鎖切断がないため、ゲノム二本鎖DNA切断の危険性や予期しないランダム配列の導入を心配する必要はありません。SINEにおけるAluエレメント配列と、LINEにおけるLINE-1に対応するその機能を例にとると、AluエレメントとLINE-1は霊長類のゲノム中に広く分布しており、具体的な態様としては、前記挿入される配列は、挿入される配列の両側(標的部位の上流配列と標的部位の下流配列)上の配列に依存してゲノム上の挿入部位(標的部位)に導かれ、
さらに、ORF2pは、標的部位の上流配列が完全に一致している条件下でのみ、キャリア核酸の3'末端からゲノム上の一本鎖切断のためのせん断部位までスムーズにスライドすることができるため、ターゲティング精度が大幅に向上し、予期しない切断の発生を回避し、そのターゲティング精度は理論的には、現在存在する他の遺伝子編集技術よりも高い。
さらに、目的の配列、遺伝子およびゲノムは、必要なRNAおよびORF1pおよびORF2pなどの対応するタンパク質をin vitroで生成することにより、DNA断片を導入したり、トランスフェクション中に核に入ったりすることなく、RNAまたはRNP経路を介して改変することができる。ORF1p(およびORF2p)の核局在機能により、細胞にトランスフェクトされたRNAやタンパク質を核内に誘導することができ、ベクターの核への侵入が難しいために操作が困難な細胞の編集に有益です。同時に、本発明は、ゲノム上のCNVを編集することもできるので、CNVsは、本発明を通じて増加、減少または安定化(変化し続けることができない)、CNVsはタンパク質発現等に直接影響し得るので、CNVsの操作は、対応する細胞、組織、器官または生体（個体）の発現および状態を変化または安定化させることができる。様々なMIRおよびLINE-2のような、Alu要素およびLINE-1と相同で機能的に類似した様々なタイプのSINEおよびLINEが真核生物に広く分布しているので、本発明は他の真核生物系にも適用することができる。
他の遺伝子編集技術とは異なり、本発明で使用される関連機構は、正常な生物に存在し、外来機構およびシステムを導入することなく、遺伝子編集のための受容系への影響を低減する。原核生物由来のタンパク質などの外来系を導入しず、二本鎖切断を生じないため、本発明は他の既存の遺伝子編集技術よりも臨床現場への適用が容易である。
このメカニズムの基本原理は、プレmRNA処理によって体内で生成された投げ縄構造と、せん断によってSINEの残留逆転写構造の右半分を接続することです(中間部位で切断された完全なSINE転写産物によって生成される逆転写構造を持つSINEの右半分は部分SINE配列と呼ばれ、せん断部位はSINEの種によって異なります)。 SINEの自然せん断部位は一般に全長の中央に位置し、一般的な全長が約100～400ntのSINEの場合、その自然せん断部位は通常100～250ntに位置し、例えば、全長約300bpのAlu要素の場合、そのせん断部位は118番目のntに位置する。 全長約260ntの様々なタイプのMIRについて、せん断部位は100～150ntの範囲で観察され得る。
実際、部位がどこにあるかに関係なく、それがせん断されている限り、残りの右側部分は完全な逆転写機能構造を含む(その二次構造は特別な構造を形成し、通常はΩ形; その一次構造は、中間スペーサー配列を含まないゲノム上の相補配列を結合し、2つの配列を直接接続することができる、2つのセグメント間の中間スペーサー配列によって分離された2つのセグメントを含む配列によって特徴付けられる。 LINEによってコードされるORF2pは、転写産物中の2つの配列のうち3'の配列に結合し、2つの配列の間の対応するゲノム遺伝子座でゲノム一本鎖を切断し、逆転写を開始する)、すなわち部分SINE配列である。
Alu要素によって生成される部分SINEなどの特定のSINEについては、部分Alu、具体的にはその中間アデニル酸リピートとして記録されるか、または上流に2～3塩基、およびAlu右モノマーと3'ポリAリピートが右モノマーの後に繰り返されます。 また、逆転写機能構造を含み、逆転写を開始できるが、従来のSINEとは配列が異なる配列を類似の短い散在要素(類似SINE)と呼びます。 )、対応する種類のLINE(Aluエレメントの機能に対応するLINE-1や各種MIRエレメントに対応するLINE-2など)で発現するタンパク質（例としては、ORF1p および ORF2p などがあります）を介して、RNAを二本鎖DNAに変換し、ゲノム上でそれに相補的な配列に結合させる(転写形成されたRNAを逆転写して一本鎖DNAを生成し、ゲノム配列をプライマーとする一本鎖DNAによって生成された二本鎖DNAは“転写産物の形質転換産物”である)。 特異的なΩ構造を形成することにより、相同組換え機構によって外因性配列がゲノムに挿入される。
さらに、LINEは、その下流配列を転写し(すなわち、3’形質導入)、ゲノム上の相補配列と結合してΩ構造を形成することにより、上記の同様のRNAの二本鎖DNAへの変換およびゲノム挿入を達成することもできます。Aluエレメントとその機能を補助する対応するLINE-1を例にとると、遺伝子発現後に生成されたプレmRNAを切断して、プレmRNAの任意の領域で発生する可能性のある配列が重複する投げ縄(lariat)を生成することができます。違いは、これらの投げ縄(lariat)を生成するカットの強さにあります。エクソンの上流および下流の投げ縄(lariat)の切断強度(配列の違いに基づく)は、他の周囲の投げ縄(lariat)の切断強度よりも高いため、プレmRNAの過程でエクソンを簡単かつ完全に切断することができ、他の投げ縄(lariat)の産生が阻害されます。
同時に、LINE-1によって生成されたORF1pは、それに結合した核酸を保護することができ、LINE(LINE-1)によって生成されたORF2pとともに、結合した核酸を核に配置し、それを核内に輸送することができる。さらに、ORF2pは、Aluエレメント転写産物の特別なΩ二次構造に結合し、その後のゲノム一本鎖切断、逆転写、およびゲノムへの組み込みを媒介することができます。Aluエレメントの転写産物は、特定の部位(複数の置換遺伝子座が産生する小さな細胞プラストエレメントRNA)(すなわち、一般的にAlu転写産物の中間ポリA配列の前に位置する以下のscAlu切断部位または天然切断部位、実際の状態に応じて変化してもよい)で切断することができ、小さな細胞質Alu(scAlu)RNAおよび右モノマーを含む残りの部分(逆転写機能的ORF2p)が生成される。右モノマーを含む残りの部分を部分Alu RNAと称し、部分Alu RNAが転写されるDNA配列を部分Alu 配列(partial Alu)と呼ぶ。
その後、得られた投げ縄(lariat)構造を、その3'末端から逆転写機能構造を含む切断されたAlu配列転写産物の残りまで連結することができ、ORF2pは、A(アデニル酸)に富む配列を介してリクルートされ、「部分Alu RNA二次構造によって形成されるΩ構造バイポッド」の3'脚と結合することができる。 Ωバイポッド上の配列と一致するゲノム上の配列を特定します(主に部分的なAlu RNA上のUU / AAAA、UとAの間の不連続性、つまりギャップが位置する場所)。Ωギャップの反対側のゲノム部位の一本鎖を切断し、Ωバイポッドの配列に相補的なゲノム配列を逆転写のプライマーとして溶融させる。このようなプロセスは、ターゲットプライミング逆転写(target-primed reverse transcription, TPRT)と呼ばれます。次いで、ORF2pは逆転写により生成された一本鎖DNAの3'末端に移動し、生成された一本鎖DNA配列をゲノム上の相補配列と結合させ、ゲノム上の挿入される対応する部位(標的部位、標的サイト)においてΩ二次構造を形成することができる(ゲノム上の挿入される対応する部位(標的部位)には挿入される配列が存在しないため、 一方、一本鎖DNAに挿入される配列の両側の配列は、ゲノム上の挿入される部位(標的部位、標的サイト)の両側に存在する)。
ORF2pは、相補配列に沿って3'から5'の方向にΩ構造にスライドし、Ω構造の下部2脚に相補的な6ヌクレオチド(主に3'の4つのヌクレオチドと5'の2つのヌクレオチド)を持つゲノム配列を特定し、上記の同様のプロセスを通じて二本鎖DNAを生成します。ORF2pを切断部位(すなわち、生成されたDNA上のΩ構造のギャップに対応するゲノム上の部位)にスライドさせることができるのは、完全に一致した配列のみであり、そのターゲティング精度を保証することに留意されたい。最終的に作製された二本鎖DNAは、対応する挿入部位(標的部位)の両側と再びΩ状(Ω構造)に結合する。6ヌクレオチド(主にORF2pによって認識される3'の4ヌクレオチドと5'の2ヌクレオチドの間)がギャップで不連続である場合(二本鎖DNAの構造Ωギャップで)、ORF2pのエンドヌクレアーゼ作用により、ギャップに対応する遺伝子(ゲノム)と生成された二本鎖DNAの他方の鎖に2つの一本鎖DNA切開を作り出すことができ、そして、Ω構造の中央の円形部分は、相同組換えメカニズムによってゲノムに挿入されます。
挿入された配列(挿入される配列)を変更することにより、相同組換えによってゲノムに対する欠失または置換などの他の効果を達成することができる。上記のプロセスにおいて、LINEによってコードされるORF1pのアニーリングおよび脱構築機能は、記載されたゲノム再構成プロセスにおける核酸によって生成された二次構造および「ゲノムへのその結合」を安定化し、その結合および作用後のゲノムからの核酸の分離を促進する上で補助的な役割を果たすことができる。また、ORF1pは高いRNA親和性と核局在機能を有する。ORF2pはゲノム二本鎖の片鎖しか切断できず、二本鎖切断を生じないため、安全性が高い。同様のメカニズムは、他のSINEとLINEの組み合わせにも適用されます。胚発生や腫瘍形成などの生理学的および病理学的プロセスにおける局所コピー数変動の変化、および欠失のあるHIV-1ゲノムは、ヒトゲノムに挿入されたSINE配列を好みますは、自然界におけるこのメカニズムの現れです。
転写されたmRNA配列は、ORF1pおよびORF2pの助けを借りてゲノムに組み込まれる可能性があることが報告されています。しかし、転写テンプレートは純粋に外因性の非相同配列であったため、ゲノム内の特定の部位にターゲティングすることができず、逆転写機能構造を持つ断片が結合しておらず、非効率的で制御が困難なランダムプロセスが発生しました。本発明によれば、転写配列が再設計され、様々な能動的または受動的手段によって様々なタイプのSINEまたは部分SINEなどの逆転写機能構造を含む配列と連結され、より正確で効率的な遺伝子編集効果が達成される。
生理学的条件下では、コピー数多型(CNV)は、無傷の遺伝子元のコピーに類似している。上記のメカニズムにより、無傷の遺伝子元のコピーとして連続的に伸長することができるCNVは、細胞、組織、生物のタンパク質発現および様々な状態を絶えず変化させることができる。CNV末端は、上流の遺伝子部分と下流の部分SINE配列部分からなり、投げ縄(lariat)に含まれる短い配列断片は、部分SINE配列と連結した投げ縄(lariat)の配列を介してCNV末端の2つの部分の間に連続的に挿入され、CNVを伸長させる。初期の胚発生では、LINEの転写は有意に増加し、ゲノムSINE(Alu要素配列など)は有意な脱メチル化を示します。LINEを介した3'形質導入(対応する(関連する)遺伝子のプロモーターの上流のSINEの右モノマー欠失および下流の完全なSINE構造に基づく)は、関連遺伝子のコピー数多型(CNV)の伸長を開始したが、脱メチル化されたSINE配列の相同組換えは、以前に伸長されたCNVのほとんどを欠失する(初期化)。その後、完全に初期化された胚細胞は高メチル化状態を取り戻し、CNV末端の部分SINE配列がCNV末端の漸進的な伸長を媒介し、それによって各細胞の発現状態および状態を変化させる。次に、各細胞の遺伝子発現状態は、投げ縄(lariat)を介したCNVの変化に影響を与え、したがって、ゲノムの変化と段階的な分化誘導につながります。これは、胚におけるCNVの一般的な変化および様々な組織におけるCNVの違いと一致している。
異なる遺伝子のCNV(癌遺伝子のCNVなど)の延長は、あらゆる種類の腫瘍細胞に一般的に存在し、臨床グレードと正の相関があります。同時に、癌原遺伝子と癌抑制遺伝子の発現レベルもCNVの長さに正比例するため、腫瘍の形成と進行は、癌原遺伝子または癌抑制遺伝子のCNVの障害に関連しているはずです。さらに、糖尿病などの外部刺激に関連するいくつかの不可逆的な疾患もCNVの異常に関連しています。薬剤耐性の大部分は、長期の外部刺激による対応するタンパク質の発現の変化と関連しているので、それらの対応する遺伝子のCNV変化が関与することができ、この技術によって薬剤耐性を改善または妨げることができる。
I.DNA媒介ゲノム配列挿入編集技術(遺伝子編集がDNAによって媒介される場合、1～40個のTTAAAAまたはTTTTAA配列をプラスミドに追加して、RNAのDNAへの変換を補助することができる)(図2に示すように)
1. 投げ縄構造を介したアプローチ:挿入する部位(すなわち標的部位)の上流および下流の配列(2000bp以内)を選択し、挿入される配列(2000bp以内)を上流および下流配列の中間挿入部位に付加する。設計された配列は合成され、ベクターに組み込まれ、RNAポリメラーゼIIによって転写され始めます。ベクターの他の領域は、「SINE配列」(0～20、受信システムへの影響を軽減するために、受信システムの種に応じて対応する種にSINEにすることができる)で挿入することができる。SINE配列としては、霊長類におけるAlu配列、単孔類におけるMon-1配列等とすることができ、その数は一定範囲内であれば効率に比例する。
また、非天然型、非種SINEを用いることも可能であり、その後、使用するSINEの機能に対応するLINEまたはそのタンパク質コード配列を導入しなければならない。下記参照)およびRNAポリメラーゼIIまたはIIIによって開始される。前記SINE配列の後に、対応するRNAポリメラーゼの終結シグナルが選択的に連結され(対応するLINE配列または該LINE配列によってコードされるタンパク質配列は、SINE中のAluエレメントに対応するLINE-1配列、または該LINE-1配列によってコードされるORF1pおよびORF2p配列など、該SINE配列の後の終結シグナルの前に選択的に挿入され得る。 MIRエレメントに対応するLINE-2配列、またはLINE-2配列によってコードされるORF1pおよびORF2p配列など、遺伝子編集に必要なタンパク質を発現させて、遺伝子編集を実現したり、編集効率を高めたりすること)(RNAポリメラーゼIIによって転写が開始される場合、対応する終結シグナルはpolyA配列であり、ORF2pのリクルートを増加させるためにその長さを適切に延長(200bp以内)することができる。それ以外の場合は、終結シグナルの前のORF1pおよびORF2p配列の後に適切な長さのpolyA配列を追加し(200bp以内)、SINE配列の末尾のpolyA配列を適切に伸長(200bp以内)することができます。)
その後、ベクトル (ベクターに含まれるSINE配列に対応するLINE配列またはLINE配列によってコードされるタンパク質配列、例えばAlu配列に対応するLINE-1またはORF2pおよび/またはORF1p配列を発現する他のベクターは、遺伝子編集効率を高めるために、受信システムに同時にトランスフェクトすることができる。受容系が対応するLINEのORF1PやORF2pなどの上記のタンパク質を発現しない場合には、タンパク質のさらなる発現が必要となる。加えて、SINEを発現するベクターは、同時に受容系にトランスフェクトすることもでき、遺伝子編集効率を向上させるように)は、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること(期待した効率が達成されない場合は、挿入される部位(標的部位)の上流および下流配列と挿入される中間配列からなる投げ縄構造の形成効率が高くないことに起因する可能性があり、 上流および下流の配列または挿入される配列の長さは、投げ縄構造の形成を促進するために増減することができる。あるいは、挿入される部位(標的部位)を含む投げ縄構造を以下の検出方法に従って検出し、該投げ縄構造の配列又は部分配列を標的部位の上流配列及び下流配列とし、標的部位の上流配列及び下流配列をゲノム配列に従って適切に伸長させ、 挿入される配列を標的部位の上流配列と下流配列の中間挿入部位(標的部位)に配置して遺伝子転写フレームワークを形成し、これをベクターに構築することができ、このベクターのトランスフェクションにより遺伝子編集効率を向上させることもできる。)(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)。挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
2. SINE（配列）直接接続アプローチ:
このアプローチでは、生成された投げ縄を切断されたSINE転写物と接続する必要はありません。ベクター構築時に、挿入する部位(標的部位)の上流および下流の配列とそれらの間に挿入される配列をSINE関連配列と直接接続するため、真核生物のpre-mRNAスプライシング機構がなければ投げ縄構造を生成できない細菌などの原核生物に適した方法であり、 また、プレmRNAスプライシング機構を有する真核生物にも適しています。これは、以下のLINEを介したアプローチにも当てはまります。具体的な手順は次のとおりです。挿入部位(標的部位)の上流配列と下流配列(2000bp以内)と、上流配列と下流配列の間に挿入される配列(2000bp以内)が遺伝子転写フレームワークを形成し、RNAポリメラーゼIIまたはIIIのプロモーターによって開始され、続いてSINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列を接続の配列が合成される (場合により、遺伝子編集効率を高めるために、SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列の後に、対応するSINE機能を補助することができるLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加し、受容系がLINEまたはそのコードタンパク質自体を発現しない場合、コードタンパク質を受容系に付加するか、または受容系において追加的に発現させなければならない)。
その後、SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列の後に、対応する種類のRNAポリメラーゼの終止シグナルを選択的に付加し(終止シグナルがpolyA配列の場合、終止シグナルを適切に伸長(200bp以内)してORF2pのリクルートを増加させることができる。
または、ORF2pのリクルートを増加させるために、SINE配列、部分SINE配列、類似SINE配列、LINE配列、ORF1p配列および/またはORF2p配列の後および終止シグナルの前に、適切な長さ(200bp以内)のpolyA配列を付加し、配列をベクターに構築することができる。
ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
LINE 媒介アプローチ:
RNA ポリメラーゼ II が LINE またはその中のタンパク質 ORF2p および/または ORF1p コード配列の発現を開始し、続いてSINE 配列直接接続アプローチと同じ方法で設計された配列が続きます(遺伝子編集受信システムへの影響を最小限に抑えるため、受信システムのSINEタイプとLINEタイプを選択できます。効率を向上させるために、その中の SINE シーケンスは、前の LINE に機能的に対応するように選択できます)、そして、使用したRNAポリメラーゼIIの終結シグナルを選択的に末端に連結することができます。ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
下流結合ORF2p結合配列アプローチ：
ベクター上の遺伝子転写フレームワークの標的部位上流配列、標的部位下流配列、中間挿入される配列がゲノムと結合することで形成されるΩ構造を利用して、SINEの逆転写機能構造を置換し、逆転写を開始します。遺伝子転写フレームワークにおける標的部位の下流配列の下流には、ＯＲＦ２ｐに結合可能なＯＲＦ２ｐ結合配列（例えば、ポリＡ配列）が接続される。LINE 配列、ORF1p および/または ORF2p コード配列は、効率を向上させるために、遺伝子転写フレームワークと同じベクターまたは別のベクターに選択的に追加できます。ベクターは、リポソームまたはウイルストランスフェクション等の通常の手段を介してインビトロで培養された細胞および組織に移転されるか、または血液、リンパ液、脳脊髄液等または局所組織などの経路を介して生物に投与され(構築したベクターは、ORF1pおよび/またはORF2pを含む生理的液体中で短時間(適切な温度、常温または37°C、および48時間以内)インキュベートして、ベクターの核局在および輸入効率を向上させることができます)、 構築されたベクターが発現のために核に入り、ゲノム上の挿入される対応する部位に挿入する対応する配列を挿入する目的を完了すること.
挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる。
II. DNA媒介ゲノム配列削除(欠失)技術、図2に示すように
1. ゲノム上の任意の領域の削除:上記の挿入手法で設計したベクター中の挿入される配列を、挿入点(標的部位)（100000bp以内）の上流または下流の特定の配列（2000bp以内）に変更し、本発明に記載のＤＮＡ、ＲＮＰ、またはＲＮＡ媒介挿入アプローチにより、２つの同一配列間の配列は、配列挿入後の相同組換えにより一定の効率で除去することができる(選択できる:組換え部位 (GCAGA[A/T]C、CCCA[C/G]GAC または/および CCAGC) を含む配列を挿入用に選択して、その後の相同組換えの効率を向上させることができます)。
2. CNV 末端の削除：細胞または組織内の CNV 末端は、シークエンシングおよびアラインメント（遺伝子配列と部分SINE 配列の接合部のアラインメント）によって検出されます。処理されるCNV末端の遺伝子部分（2000 bp以内）と完全な遺伝子の中でこのCNV末端下流範囲（2000 bp以内）の一部が形成できる投げ縄の3'部分配列（下流で形成され得る投げ縄を以下の方法により予測または検出することができる）（または投げ縄の3'部分配列を完全遺伝子中のCNV末端の20000 bpの範囲内の下流配列の切断配列で置換することができる）をそれぞれ選択し、その後、CNV末端の削除される配列の上流（100000 bp以内）に隣接するシーケンス(配列)(すぐ隣の上流配列)をそれぞれ接続する。その後、完全なSINE配列、部分SINE配列、または類似SINE配列（上記の異なる挿入技術による）を接続し（その後、任意にORF1pコード配列およびORF2pコード配列を接続することができる）。次に、上記の配列を合成してベクトルを構築します。そして、上述の遺伝子挿入技術の1つを通じて、DNA、RNAまたはRNP経路を通じて、CNV末端の削除される配列のすぐ隣の上流配列を実際のCNV末端の遺伝子部分とSINE配列部分との間に挿入する（担体上で使用されるSINE配列は挿入部位の周囲のSINE配列と同じか近い、効率を高めるため）。次に、削除される配列を同じ配列間の相同再編成によって削除します(選択できる:組換え部位 (GCAGA[A/T]C、CCCA[C/G]GAC または/および CCAGC) を含む配列を挿入用に選択して、その後の相同組換えの効率を向上させることができます)。
III、DNA媒介のゲノム配列置換技術:挿入技術で設計されたベクターに挿入される配列は、置換配列とゲノム上で置換される配列の周辺配列に変更される（すなわち、挿入される置換される配列とゲノム対応配列との間の相同組換えにより削除される配列である。ベクターを構築する際、挿入部位がゲノム上の置換される配列の上流または下流であるかに応じて、置換される配列の3'または5'に位置するかどうか）（置換される配列はゲノム上で置換される配列と相同でなければならない）。置換される配列及ゲノム上の置換される配列の周辺配列は、遺伝子編集挿入技術によりゲノム上の置換される配列の上流又は下流に挿入される。挿入された置換配列とゲノム上で置換される配列が相同組換えを起こすと、ゲノム上で置換される配列は、その相同挿入される置換される配列に置換される。同時に、相同組換えにより削除の置換される配列の周辺配列は、配列挿入中に置換される配列とともにゲノムに再挿入される。
RNA媒介ゲノム配列編集技術（DNAへのRNAの変換が不要であり、追加のTTAAAAサイトまたはTTAAAAサイトを追加する必要がないため）、図3に示すように。
1.リボ核タンパク質（RNP）媒介経路：前記合成したベクターを増幅してLINEにコードされるタンパク質を高発現する工学用細胞系（合成ベクターに含まれるSINE配列の機能に対応するLINEを選択して効率を高めることができ、例えば合成ベクターにAlu配列または部分Alu配列が含まれる場合、それはLINE-1とそのコードタンパク質ORF 1 pおよびORF 2 pに対応する）（関連タンパク質を発現するベクターのトランスフェクションまたはトランスフェクション後スクリーニングにより、関連タンパク質を永久に過発現する工学細胞を得る;後のステップで使用されるリボヌクレオチドがORF 1 pおよびORF 2 pなどの相関タンパク質によってインキュベートされる場合、転入される工学細胞は相関タンパク質を発現しなくてもよい）にトランスフェクションし、しばらく後に細胞核及び細胞質を抽出し、配列特異性などの原理及び相応の通常方法を用いて単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）、或いは単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）を含む生物活性を有するリボ核タンパク質（RNP）複合体を抽出する(得られたORF 1 p及び/又はORF 2 pを含む細胞質中又はORF 1 p及び/又はORF 2 pを含む生理学的液体中でのインキュベーション(適温、常温又は37℃でもよく、48 h以内のインキュベーション)の後に再度抽出精製することを選択することができ。in vitro生理学的液体又は細胞質中にRNA酵素阻害剤を添加する必要があり、この前に転入した細胞が関連タンパク質を発現しない場合はORF 1 p及び/又はORF 2 pとインキュベーションしなければならない)。その後、リポソームやウイルストランスフェクションなどの通常のトランスフェクション手段によってRNP複合体を体外培養された細胞や組織に移し（細胞質に移すことによって、直接細胞核に入る必要はない）、あるいは血液、リンパ、脳脊髄液、局所組織などの経路によって生体に与えて、遺伝子編集を完了する。指向性輸送が必要な場合は、ベクターの外側のラップを修飾することができます。プロセス全体がRNA分解を避けることに注意してください。
また、LINE媒介方式で合成されたベクターのRNP形式での適用は、抽出された単鎖プラスミド生成物（単鎖RNA）を含む生物活性を有するリボ核タンパク質（RNP）複合体から、先端LINE-1配列またはORF 1 pおよびORF 2 pコード配列を含まない生成物をスクリーニングする必要がある（配列特異性による）（インビトロヌクレオチダーゼなどを追加添加してせん断を促進することができる）、先端配列が遺伝子編集の標的を乱すのを防ぐために行われる。
2.単純RNA媒介経路：
前述の通り、挿入点（すなわち標的部位）を含む上下流配列（それぞれ2000 bp以内）および中間位置に位置し挿入点に対応する箇所にある挿入される配列（2000 bp以内）を合成し、その後SINE配列、部分SINE配列または類似SINE配列を接続し、その後使用するSINE機能に対応するLINE配列またはそこに含まれるタンパク質コード配列の配列を接続する（例えば、部分Alu配列を使用する場合、LINE-1及びその中のORF1 p及びORF2 pコード配列に対応し、部分MIR配列を使用する場合、LINE-2及びその中の対応するタンパク質コード配列に対応する）、そしてこの配列をベクターに構築してRNAポリメラーゼII/IIIプロモーターによって起動させる(あるいは、上述の各種DNA媒介法で得られた担体をそのまま用いて工学細胞に転入することができ、その後、遺伝子編集に使用できるRNA生成物を、配列特異性などに基づいて通常の手段により抽出する)。発現したmRNAを単離精製した後、リポソームなどの脂溶性物質やウイルスなどの通常のトランスフェクション手段を用いてRNAを包み、インビトロ培養した細胞、組織をトランスフェクションし、あるいは血液、リンパ液、脳脊髄液などの通路や局所組織投与などの方法で生体に転入し（細胞質に転入すればよく、核に入る必要はない）、挿入される配列をゲノム上の対応する挿入される部位に挿入する目的を達成することができる。挿入後に生成された新たな部位に基づいて、上記の方法に従ってゲノム挿入を継続すると、配列挿入を連続的に行うことができ、ゲノムへの有意な長さ制限のない長い断片挿入を達成することができる（持続的にRNAを細胞にトランスフェクションさせる必要がある可能性がある）。
転座子によるゲノム変化を阻害し、ゲノム及びその上のCNVsを安定させる(すなわち、この遺伝子編集技術によってCNV末端の遺伝子部分と部分SINE配列の間または他の領域にゲノムまたはCNV末端の遺伝子部分およびその部分の完全な遺伝子中の上下流配列と非同源的な配列を挿入し、CNVのさらなる伸長を阻害する。CNV末端は遺伝子配列（部分）が部分SINE配列に直接接続する領域として定義され、そこでは遺伝子を延長することができ、各特定のCNV末端の遺伝子配列（部分）と部分SINE配列の具体的な配列は遺伝子配列決定や遺伝子チップなどの分子生物学的手段によって取得することができる)(脂質溶性物質や細胞トランスフェクション能を有する物質、例えばリポソームやウイルスなどの通常のトランスフェクション手段を用いて対応するベクターを包んだ後にインビトロ培養細胞、組織をトランスフェクションし、あるいは血液、リンパ液、脳脊髄液などの通路や局所組織投与などを経て生体に転入する)(図4に示すように)
1.特定のCNVに介入する（挿入作用を達成するために用いられる標的部位の上流配列が特定の遺伝子のCNV末端である遺伝子部分）：操作が必要なCNVを選定し、その遺伝子部分の3’端と部分SINE配列の境界を挿入点（標的部位）とし、CNV終端遺伝子部分の3’端（2000 bp以内）を上記挿入方法における挿入点（標的部位）上流配列とし、標的部位下流配列は部分SINE配列である（したがって、上記方法における標的部位下流配列の後に接続されるSINE配列、部分SINE配列、または類似SINE配列のようなものは省略可能である）、挿入される配列は、ゲノム又はCNV末端における遺伝子部分及び完全な遺伝子中における遺伝子部分の上下流配列と非同源的な任意の配列（2000 bp以内）である。ベクター構築が完了した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、非相同配列を対応するCNV末端に挿入した。非相同配列は完全遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子配列（部分）の下流に存在しないため、完全な遺伝子配列に基づいてCNV末端をさらに延長することができず、それによってCNV末端のさらなる変化を阻害する。
2.ゲノム上の広範なCNVへの介入（挿入作用を実現するために使用される標的部位の上流配列は、存在する可能性のあるすべてのCNV末端の遺伝子部分を含む必要がある）：
（1）ゲノム破砕配列法：操作が必要な生体、組織又は細胞系中の細胞を体外培養し、又は直接ゲノムを抽出し、超音波破砕後ランダムプライマー及びPCRにより増幅する、短ランダム配列（20 bp以内）を設計合成し、下流で部分SINE配列を接続する。増幅して得られたゲノム断片と合成された短ランダム配列接続部分SINE配列断片をPCRにより接続と増幅し、異なるゲノム断片配列がランダム配列を接続した後の接続部分SINE配列の配列を得て、得られたフラグメントをベクターに構築した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ゲノム断片配列を介してゲノム上のすべてのCNV末端を標的化し、非相同配列（すなわち、短いランダム配列または部分的に短いランダム配列であり、それは遺伝子断片と同源な部分ではなく、対応する遺伝子断片の局所的な遺伝子配列にとって非同源的である）をCNV末端の遺伝子部分と部分SINE配列の間に挿入する、非相同配列は完全な遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子部分配列の下流に存在しないため、CNV末端のさらなる変化を阻害する。
（2）ランダム配列法：適切な長さ（100 bp以内）を発現するランダム配列（すべての可能な配列組み合わせを含み、SINE配列と近似する部分を排除することができる）、その後、任意のゲノム非同源の配列（2000 bp以内）を接続した後、部分SINE配列を接続するのプラスミドを構築し、あるいはランダム配列（100 bp以内）、その後SINEの中間自然せん断部位（例えば、Alu要素の転写生成物の場合、この部位は転写生成物の中間に位置し、scAluと部分Aluを生成するせん断部位をせん断することができる）に任意のゲノム非相同配列（2000 bp以内）を追加するの部分SINE配列を接続するのプラスミドを構築し、RNAポリメラーゼIIによって転写されたランダム配列後に任意のゲノム非相同配列（その後、投げ縄として発現）を連結するベクター（このベクターにはSINE配列を含むか、またはSINE配列を含む他のベクターに追加的に転入する必要があり、SINE配列の下流にはSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を接続または追加的に発現することができる）も構築することができる。そして、上述のDNA、RNPまたはRNA経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ランダム配列を通じてゲノム上のすべてのCNV末端を標的にし、非相同配列を対応するCNV末端に挿入させ、非相同配列は完全な遺伝子中の対応するCNV末端遺伝子配列（部分）の下流に存在しないため、CNV末端のさらなる変化を阻害する。
（3）投げ縄終端配列法による：すべての投げ縄の種類(ゲノムと相同でない小片のランダム配列（100 bp以内）をSINE配列に挿入し、その後もSINE配列を部分SINE配列に正常に切り取ることができる（すなわち、この非相同系列の挿入位置はSINE自然せん断部位の下流であり、せん断部位には位置しない）、そして、この改造SINE配列を発現できるプラスミドを構築し、対応する操作対象生物から取り出して増幅する細胞または対応する種の細胞系に転入する（対応する測定対象種のゲノムをとり、全ゲノムを比較的長く（200 bp以上）かつある程度重なり合う（10 bp以上重なる）断片に切断し、ベクターに構築することもできる、このフラグメントは、対応する種のinvitro細胞におけるRNAポリメラーゼIIによる過剰発現）、一定時間後にSINE配列に挿入された非相同配列の配列特異性により対応する核酸を抽出し、シーケンシング検査を行い、非相同配列を含む部分SINE配列に接続された各種生成投げ縄の配列情報を取得する。）を検出する、または／同時に、pre-mRNAによる投げ縄を形成する配列規則に基づいて投げ縄配列を予測し（例えば、AGで終わることが多い）、その種または個体のすべての投げ縄配列情報を得る。すべての投げ縄の3’配列（2000 bp以内）をとり、ゲノムと非相同な任意の配列（2000 bp以内）をそれぞれ接続した後、上記SINE配列（上記によれば、効率を高めるために、「SINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列」をその後ろに接続することができる）を発現するベクター（SINEは別のベクターでも発現可能）に統合し、投げ縄として発現し、そしてSINE転写産物の細胞中でのせん断によって生成された部分SINE配列に接続し、あるいは、得られたすべての投げ縄の3’配列をそれぞれ任意のゲノム非相同配列（2000 bp以内）に接続した後、接続部分SINE配列（上述のようにSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列をその後ろに接続して効率を高めることができる）（SINE配列は、それに接続された投げ縄の3’配列が存在する遺伝子のSINE配列と同じか類似していることが好ましい）、ベクターを構築して発現する。上述のDNA、RNPまたはRNA経路を介して対応する細胞、組織または生体に転入し、全ゲノム範囲内のCNV末端を編集する。
（4）SINE配列改造法：すなわち、改造されたSINE配列の発現を追加投与することにより、びゲノム又は該CNV末端中の遺伝子部分及完全な遺伝子におけるこの部分の上下流配列と非相同な配列を各CNV末端に挿入し、CNV末端の延長を阻害する。SINE自然せん断部位の前に短い配列（通常の場合に生成されるソケットの3’シーケンスと一致せず、SINE自然せん断部位にまたがる小段のシーケンス（100 bp以内）を追加すればよい）を追加し、SINEの転写産物をこの新規領域でも自然せん断できるようにする完全なSINE配列を含むベクターを構築する（その後ろに対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加して効率を高めることができる）、あるいはSINE転写産物の自然せん断部位の後に任意のゲノム非相同配列（200 bp以内）を追加する完全なSINE配列（その後ろに対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を追加して効率を高めることができる）を構築する、そして、対応する細胞、生体組織、または生体を投与する。使用されるSINE配列は、全ゲノム上のすべてのCNV末端を正確に修正するために、できるだけその種または個体のすべてのSINE配列（シーケンシングまたはアレイチップなどの方法で得ることができる）をカバーする。
全ゲノムを互いにある程度重なる長い断片（1つの投げ縄構造の長さ以上の重畳長さ）に切断することもでき、ベクターに組み込まれた後、対応する種のinvitro細胞系で過発現し、投げ縄構造を産生し、その後、上記で作製した発現改造SINE配列（下流に対応する種類のSINE機能に対応するLINE配列またはそのタンパク質コード配列を添加した後、RNA経路を介して媒介することができる）のベクターを転入し、投げ縄に接続された部分SINE（改造SINE配列から発生）の生物活性を有する単鎖RNAリボ核タンパク質（RNP）複合体またはRNAを配列特異性などの性質および通常の手段により単離精製し、その後、対応するRNAまたはRNP経路を介して機能する。
3.ゲノム上のSINEとLINEを改造する：ゲノム上のSINEのプロモーター、転写産物の自然せん断部位またはSINE上のその他の配列または/およびLINEのプロモーター、タンパク質コード配列またはその他の配列を本遺伝子編集技術を通じて任意の配列（500 bp以内）を挿入し、ゲノム上のSINE配列を転写できない、または転写後にせん断できない、または/およびゲノム上のLINE配列を転写できない、または正常な機能を持つタンパク質を産生できない。まず操作を行う個体の全ゲノムのSINE配列またはLINE配列に対してシーケンシングを行い、その上のプロモーター、転写産物の自然せん断部位、蛋白コード配列またはその他の配列を挿入点（標的部位）として選択し、本遺伝子編集技術における上下流配列はSINE配列またはLINE配列上の挿入される部位（標的部位）に対する上下流配列であり、挿入される配列は任意の配列である。上記の挿入方法により、ゲノム上のSINEまたはLINE上の対応する部位に任意の配列を挿入する。また、ゲノム上のSINE配列またはLINE配列を上記遺伝子編集方法により置換または削除して不活化してもよい。
4.CNV末端を削除しながら固定する：操作が必要なCNV末端を選択し、その遺伝子部分の3’端と部分SINE配列の境界を挿入される部位とし、前記挿入方法における標的部位の上流配列はCNV末端の遺伝子部分の3’端配列（2000 bp以内）、下流配列は部分SINE配列である（したがって、上記遺伝子編集方法における標的部位下流配列の後に接続される部分SINE配列は省略可能である）、挿入される配列は、ゲノム上の削除される配列（100000 bp以内）の上流に隣接する配列（2000 bp以内）である後、ゲノム配列と非相同な任意の配列（2000 bp以内）を接続する。ベクター構築が完了した後、上述のDNA、RNAまたはRNP経路を通じて対応する細胞、生体組織または生体に転入し、ゲノム上の削除される配列の上流に隣接する配列、およびその後の非相同配列を対応するCNV末端に挿入し、2つの同じ（相同）配列に相同組換えが発生して中間配列が削除された後、非相同配列は同時にCNVのさらなる延長を阻害する。
5.抑制固有機構法：細胞や生体固有のCNV伸長機構を直接抑制することもでき、例えば：RNA干渉などの方式によってSINEやLINEなどの転写やそのRNA及び符号化された蛋白質、例えばORF 1 pとORF 2 pの産生を抑制し、特異的蛋白質を通じてこのCNV伸長機構に関連する蛋白質、例えばORF 1 p、ORF 2 pまたは剪断体などのあるいは複合体の機能構造と結合してその機能を阻害し、上述の遺伝子編集技術などを通じて、ゲノム上のSINE、例えばAluと各種MIRなど、各種LINE及びその中の相応するタンパク質コード配列などを改造して活性を失活させたり低下させたり、相同組換え或いはDNAミスマッチ修復上の関連タンパク質機能を抑制したり、改造されたヌクレオシド類物質を投与して逆転写の進行を阻害したり、したがって、内在的なCNV伸長機構を抑制することにより、ゲノムの変化を阻害し、CNVsを安定させる作用を実現する。
SINE、LINE及びその発現するタンパク質は真核生物中に広く存在するため、この技術を通じて広範な真核生物に対して遺伝子編集操作を行うことができる。また、遺伝子改変を有する疾患の治療及び遺伝子改変に関連する細胞又は生体状態の改変又は安定化等にも応用できる。
本技術では、ある決定配列（挿入される配列など）が5′→3′方向にあることを定義し、上流が決定配列の5’端の前で、下流が決定配列の3’端の後で、上流配列は決定配列の5’端より前の配列であり、下流配列は決定配列の3’端より後の配列である。
本技術が提供する遺伝子転写フレームワークは、図5に示すように、5’→3’方向に沿って標的部位上流配列、挿入される配列(挿入すべき配列)、標的部位下流配列を含む。遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、長い散在核要素、プロモーターとの位置関係をより理解できるようにするために、理解のためにいくつかの異なる接続形態を挙げた。図6に示すように、遺伝子転写フレームワークの前にプロモーターが連結された構造の概略図である。プロモーターは、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーターであってもよい。プロモーターはベクター上に位置することができ、ベクター酵素切断部位を通じて遺伝子転写フレームワーク、短い散在核要素、長い散在核要素などをプロモーター下流に挿入し、細胞にトランスフェクションして後進発現する。直接合成の方法でプロモーターを遺伝子転写フレームワーク、短い散在核要素、長い散在核要素などと直接合成し、ベクターに挿入することもできる。図7は遺伝子転写フレームワークの上流にプロモーターを接続し、下流に短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を接続する構造である。図8は遺伝子転写フレームワークの上流にプロモーターを接続し、下流に長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続する構造模式図である。図9は、遺伝子転写フレームワークの上流で長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続し、長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流でプロモーターを接続する構造模式図である。図10は遺伝子転写フレームワークが上流でプロモーターを連結し、下流で短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を連結した後、下流で長い散在核要素またはORF 1 pコード配列またはORF2pコード配列を連結する構造模式図である。図11は遺伝子転写フレームワークの下流に短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素を接続し、遺伝子転写フレームワークの上流に長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列を接続し、長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流にプロモーターを接続する構造模式図である。図12は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が1つのプロモーターを共用しない構造模式図である。図13は遺伝子転写フレームワークと長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターを共用しない構造模式図である。図14は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターの構造を共有しておらず、短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の下流に位置し、両者は1つのプロモーターを共有している。図15は遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が1つのプロモーターを共用しない構造であり、短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素が長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列の上流に位置し、両者は1つのプロモーターを共用している。これらはすべて遺伝子転写フレームワークと短い散在核要素、部分短い散在核要素または類似の短い散在要素および長い散在核要素またはORF1pコード配列またはORF2pコード配列が同一ベクター上にある形式であり。同一ベクター上にいなくてもよい、共同で細胞にトランスフェクションし、異なるプロモーターによって発現してもよい。
以下の実施例では、使用される材料はヒト由来細胞であるため、したがって使用されるSINEは霊長類特有の短い散在核要素Alu要素である。Alu要素の完全な配列はSeq ID No.1に示され、部分Alu配列はSeq ID No.2に示されている。使用される材料が他の種である場合、発現を容易にするために、短い散在核要素を対応する種の短い散在核要素に交換することができる。
材料
１．ｐＳＩＬ－ｅＧＦＰプラスミドベクターが、Ａｄｄｇｅｎｅから購入されたＰｌａｓｍｉｄ ５２６７５であり、ｐＢＳ－Ｌ１ＰＡ１－ＣＨ－ｍｎｅｏプラスミドベクターが、Ａｄｄｇｅｎｅから購入されたＰｌａｓｍｉｄ ５１２８８であった。
2. 10×酵素切断緩衝液（NheI酵素切断に必要）：330 mM Tris-acetate、100 mM酢酸マグネシウム、660 mM酢酸カリウム、1 mg/mL BSA、10×酵素切断緩衝液（Sali酵素切断に必要）：500 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、1000 mM NaCl、1 mg/mL BSA。
3.制限酵素NheI、SaliはThermoFisherから購入した。
4.T4 DNAリガーゼ及びその応用に必要な10×接続緩衝液はPromegaから購入した。5.Entranster-H 4000トランスフェクション試薬は「北京英格恩生物科技有限公司」から購入した。
6.血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：DP 304。
7.SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）は「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：FP205。
8.磁気ビーズ法組織/細胞/血液総(トータル)RNA抽出キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：DP 761。
9.FastKing cDNA第一鎖合成キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：KR 116。
10.TIANSeq mRNA捕捉キットは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：NR 105。
11.LipofectamineTM MessengerMAXTM mRNAトランスフェクション試薬はThermoFisherから購入した。
12.トリプシンはSigma-Aldrichから購入し、製品カタログ番号：T 1426。
13.Dnase Iは「天根生化科技（北京）有限公司」から購入し、製品カタログ番号：RT411。
14.プライマー、配列の化学合成は「ポォー尚生物技術（上海）有限公司」によって完成された。
実施例1 ゲノム指定部位に挿入する外因性配列のDNA媒介挿入
血管内皮増殖因子(VEGFA)は、PDGF / VEGF成長因子ファミリーのメンバーです。ジスルフィド結合ホモ二量体として存在するヘパリン結合タンパク質をコードしています。この成長因子は、血管新生、内皮細胞の増殖、内皮細胞の増殖の誘導、細胞遊走の促進、アポトーシスの阻害、血管透過性の誘導など、生理学的血管新生と病理学的血管新生の両方に必要な役割を果たします。
本実施例では、そのVEGFA遺伝子に外因性配列を挿入し、本発明のDNA媒介ゲノム配列挿入技術を確認した。
ヒトゲノム中の遺伝子VEGFAの459-bp配列を選択し、その配列を配列番号3に示す:
ATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCAC*AATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAA、式中*は選択された挿入部位(標的部位)であった。VEGFA遺伝子における挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)は挿入部位の前であり、VEGFA遺伝子における挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)は挿入部位の後であった。遺伝子転写フレームワークを形成するために挿入される配列として、ランダムに設計された非相同配列を挿入部位に添加し、遺伝子転写フレームワークの両末端に制限エンドヌクレアーゼNheI酵素切断部位と保護塩基(overhangs)を添加して、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにした。完全な配列は配列番号4に示されています:
CTAGCTAGCTAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGGTGAGGATGTAGTCACGGATTCATTATCAGCAAGTGGCTGCAGGGTGCCTGATCTGTGCCAGGGTTAAGCATGCTGTACTTTTTGGCCCCCGTCCAGCTTCCCGCTATGTGACCTTTGGCATTTTACTTCAATGTGCCTCAGTTTCTACATCTGTAAAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTATACTTCATAGCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAACTAGCTAGCTAG、式中、下線部分は無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)であり、長さは38bpであり、配列の両末端はNheI酵素切断部位および保護塩基であった(太字斜体)。配列は化学合成によって得られ、VEGFA1と命名された。挿入される外因性配列は、VEGFA遺伝子のその配列と非相同な配列として設計され、ゲノム上の標的部位への挿入が後の実験で特異的に検出される可能性がある。
同時に、ベクター上の挿入部位の前後にVEGFA遺伝子の挿入部位の上流配列と下流配列の短い配列を追加し、長さの異なる標的部位の上流配列と標的部位の下流配列が挿入効果に及ぼす影響を検証した。
VEGFA配列の挿入部位の10bp前および10bp後を選択し、非相同配列、NheI酵素切断部位および保護塩基を有する配列を、配列番号5に示すように短い配列に設計した:
CTAGCTAGCTAGAAATGGGCACGCTACGGAATAAGAGGAGGCCACAACAGTCGTGGGTCGAATAGTAGTACTAGCTAGCTAG、このうち、下線部は無作為に設計された長さ38bpの外因性非相同配列(挿入される配列)を表し、配列の両端にNheI酵素切断部位と保護塩基(太字斜体)があり、化学合成により得られた配列をVEGFA2と命名した。
制限酵素切断部位の選択は、プラスミド構築の便宜のためのみであり、異なるベクターに応じて変更することができた。
pSIL-eGFPにVEGFA1とVEGFA2を挿入し、プラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1とpSIL-eGFP-VEGFA2を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
VEGFA1、VEGFA2とpSIL-eGFPを別々に消化し、反応系を表1に示す:
表1 消化反応システム
消化したVEGFA1とVEGFA2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表2に示した:
表2 リンケージ反応系
pSIL-eGFPプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
Alu発現配列を設計し、Alu配列、非相同配列(18bp)、TTTTT、およびTTTTAA*n(式中nが6)を連結し、その配列の両末端にSalI酵素切断部位および対応する保護塩基を付加することにより、配列番号6に示す配列を得る:
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAAGGGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCCGGCTAAAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTATCAGGCGAGCCCGTATTTTTTTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAAACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA、ここで、両端の斜体は太字のSalI消化部位および対応する保護塩基であり、上流のSalI消化部位と対応する保護塩基の後にAlu配列が続き、下線はAluに添加した後の非相同配列(18bp)であり、Aluを標識して、その転写産物と遺伝子転写フレームワーク(挿入される配列を含む)の転写によって生成された投げ縄との結合の検出を容易にするために使用されます実験の作用機序を検証するための後の実験では、波線は転写のターミネーターであり、二重下線はRNAをゲノムで一般的な繰り返し配列であるDNAに変換するために使用される6TTTTAAの繰り返しです、複数形を追加または追加しないことを選択してもよく、この実施形態では6を追加することを選択する。 配列は化学合成によって得られ、Alu1と命名された。
Alu1、プラスミドpSIL-eGFP-VEGFA1およびプラスミドpSIL-eGFP-VEGFA2をそれぞれSalIで消化した。消化反応系を表3に示した:
表3 消化反応システム
消化したAlu1をプラスミドベクターpSIL-eGFP-VEGFA1とpSIL-eGFP-VEGFA2とライゲーションし、反応系を表4に示した:
表4 リンケージ反応系
pSIL-eGFPプラスミド自体は、RNAポリメラーゼIIIに依存するプロモーターであるU6プロモーターを持っているため、U6プロモーターの後にAlu配列を挿入すると、RNAポリメラーゼIIIによってAlu配列(Alu要素、Aluエレメント)の転写が開始される可能性があります。
pSIL-eGFP-VEGFA1-Alu1またはpSIL-eGFP-VEGFA2-Alu1をHela細胞にトランスフェクトして、ランダムに設計された外因性配列の挿入効率をテストしました。挿入効率を向上させるために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドであるpBS-L1PA1-CH-mneoをHela細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計しました。実験群と対照群との共トランスフェクトプラスミドを表5に示す。
表 5 グループ化
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 細胞の各プレートのトランスフェクションの場合、48μgまたは96μg(実験グループによると、1つのプラスミドのみがトランスフェクションされた場合は48μg;2つのプラスミドを同時トランスフェクトした場合、各プラスミドの48μg、および合計96μgの2つのプラスミドを用いた)構築したプラスミドを300μL無血清DMEMで希釈し、十分に混合した。同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子を検出するための上流プライマー配列は、配列番号7に以下のように示されている:5'-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3'。下流プライマー配列を配列番号8:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'に示す。
プライマーペア1およびプライマーペア2を設計し、プライマーペア1の上流プライマー配列を配列番号9として示す:5'-CCCAGGGTTGTCCCATCT-3';下流プライマー配列を配列番号10:5'-CCTCCTCTTATTCCGTAGC-3'に示す。プライマーペア1の上流プライマー配列は、完全なVEGFA遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流配列の上流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノムのみにおいて、プライマーペア1の下流プライマー配列は、挿入されるランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)の5'末端の19bp配列に位置する。プライマーペア2の上流配列を配列番号11に示す:5'-CACAACAGTCGTGGGTCG-3';下流プライマー配列を配列番号12に示す:5'-GAGGGAGAAGTGCTAAAGTCAG-3'。プライマーペア2の上流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)の3'末端の18bp配列に位置し、下流プライマー配列は完全なVEGFA遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の下流配列の下流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノム内のみに位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表6に示す。
表6 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア1:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
プライマーペア2:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、54°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表7と表8に示した、表7はプライマーペア1の結果を示し、表8はプライマーペア2の結果を示す。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表7 プライマーペア1の結果（n=3, x￣±s）
表8 プライマーペア2の結果（n=3, x￣±s）
表7及び表8の結果によれば、挿入される配列の両端がゲノム上の挿入される部位(標的部位)に挿入されたこと、すなわち挿入される配列が挿入される部位(標的部位)に完全に挿入されたことを意味する。実験グループ1、2、3、4は、非相同配列をゲノムに完全に挿入することができ、実験グループ1が最も効率が高くなります。
実施例2 遺伝子転写フレームワークによって形成される投げ縄構造(挿入される外因性配列を含む)とSINE部分配列(例えば、Aluエレメント)を含むRNA断片との間の接続を検出する(自然せん断部位で切断されたAluエレメントの転写)
実施例1の実験群1および対照群1のトランスフェクト細胞からの全RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
cDNAテンプレートの逆転写合成:
cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対3は、挿入される外因性配列を含む転写投げ縄構造と、Alu要素の転写産物によって産生される部分Alu配列を含むRNA断片との間の結合を検出するように設計した。上流プライマー配列は配列番号11:5’-CACAACAGTCGTGGGTCG-3’に示され、上流プライマーは挿入される外因性配列上に位置し、下流プライマー配列を配列番号13に示す:5’-TACGGGCTCGCCTGATAG-3’。下流プライマーは、プラスミドに構築されたAlu配列の後の非相同配列(18bp)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表9に示す。
表9 qPCR反応系
qPCR反応サイクル:
95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、54°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および 挿入される配列を含む投げ縄(lariat)構造と部分Aluを含むRNA断片との間の結合 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表10に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表10 プライマーペア3の結果（n=3, x￣±s）
表10から、Alu配列(すなわち部分Aluを含むRNA断片)の転写物が、挿入される配列を含む転写産物と実際に連結されていたことが分かる。
実施例3.DNAを介したゲノム指定部位への挿入される外因性配列の挿入
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)遺伝子ファミリーのメンバーであるMMP2遺伝子は、細胞外マトリックスの成分およびシグナル伝達に関与する分子を切断することができる亜鉛依存性酵素である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、コラゲナーゼA、IV型コラゲナーゼであり、触媒部位に3つのフィブロネクチンII型リピートを含み、変性したIV型およびV型コラーゲンとエラスチンが結合することを可能にする。ほとんどのMMPファミリーメンバーとは異なり、このタンパク質の活性化は細胞膜上で起こり得る。この酵素は、プロトドメインを除去するためのタンパク質分解を必要とせずに、プロテアーゼによって細胞外に、またはS-グルタチオンを介して細胞内で活性化することができる。このタンパク質は、神経系、子宮内膜月経破裂、血管新生調節、転移など、さまざまな経路に関与していると考えられています。この遺伝子の変異は、ウィンチェスター症候群および結節性関節症骨溶解症(NAO)症候群に関連しています。選択的スプライシングは、異なるサブタイプの複数の転写変異体のコード化をもたらす。
本実施例では、そのMMP2遺伝子に外因性配列を挿入し、本発明のDNA媒介ゲノム配列挿入技術を確認した。
ヒトゲノム中の遺伝子MMP2の479-bp配列を選択し、その配列を配列番号14に示す:
AGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAG*GTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAG、式中*は選択された挿入部位(標的部位)であった。MMP2遺伝子における挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)は挿入部位の前であり、MMP2遺伝子における挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)は挿入部位の後であった。遺伝子転写フレームワークを形成するために挿入される配列として、ランダムに設計された非相同配列を挿入部位に添加し、遺伝子転写フレームワークの両末端に制限エンドヌクレアーゼNheI酵素切断部位と保護塩基(overhangs)を添加して、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにした。完全な配列は配列番号15に示されています:
CTAGCTAGCTAGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGGACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAGCTAGCTAGCTAG、式中、下線部分は無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)であり、長さは103bpであり、配列の両末端はNheI酵素切断部位および保護塩基であった(太字斜体)。配列は化学合成によって得られ、MMP2-1と命名された。挿入される外因性配列は、MMP2遺伝子のその配列と非相同な配列として設計され、ゲノム上の標的部位への挿入が後の実験で特異的に検出される可能性がある。
同時に、ベクター上の挿入部位の前後にMMP2遺伝子の挿入部位の上流配列と下流配列の短い配列を追加し、長さの異なる標的部位の上流配列と標的部位の下流配列が挿入効果に及ぼす影響を検証した。
MMP2配列の挿入部位の10bp前および10bp後を選択し、非相同配列、NheI酵素切断部位および保護塩基を有する配列を、配列番号16に示すように短い配列に設計した:
CTAGCTAGCTAGGACCAGAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGCTAGCTAGCTAG、このうち、下線部は無作為に設計された長さ103bpの外因性非相同配列(挿入される配列)を表し、配列の両端にNheI酵素切断部位と保護塩基(太字斜体)があり、化学合成により得られた配列をMMP2-2と命名した。
制限酵素切断部位の選択は、プラスミド構築の便宜のためのみであり、異なるベ
pSIL-eGFPにMMP2-1とMMP2-2を挿入し、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1とpSIL-eGFP-MMP2-2を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
pSIL-eGFP、MMP2-1とMMP2-2を別々に消化し、反応系を表11に示す:
表11 消化反応システム
消化したMMP2-1とMMP2-2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表12に示した:
表12 リンケージ反応系
pSIL-eGFPプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
Alu発現配列を設計し、Alu配列、非相同配列(18bp)、TTTTT、およびTTTTAA*n(式中nが
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAAGGGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCCGGCTAAAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCAAGAGCGAGCCAACAGATTTTTTTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAATTTTAAACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA、ここで、両端の斜体は太字のSalI消化部位および対応する保護塩基であり、上流のSalI消化部位と対応する保護塩基の後にAlu配列が続き、下線はAluに添加した後の非相同配列(18bp)であり、Aluを標識して、その転写産物と遺伝子転写フレームワーク(挿入される配列を含む)の転写によって生成された投げ縄との結合の検出を容易にするために使用されます実験の作用機序を検証するための後の実験では、波線は転写のターミネーターであり、二重下線はRNAをゲノムで一般的な繰り返し配列であるDNAに変換するために使用される6TTTTAAの繰り返しです、複数形を追加または追加しないことを選択してもよく、この実施形態では6を追加することを選択する。 配列は化学合成によって得られ、Alu2と命名された。
Alu2、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-1およびプラスミドpSIL-eGFP-MMP2-2をそれぞれSalIで消化した。消化反応系を表13に示した:
表13 消化反応システム
消化したAlu2をプラスミドベクターpSIL-eGFP-MMP2-1とpSIL-eGFP-MMP2-2とライゲーションし、反応系を表14に示した:
表14 リンケージ反応系
pSIL-eGFPプラスミド自体は、RNAポリメラーゼIIIに依存するプロモーターであるU6プロモーターを持っているため、U6プロモーターの後にAlu配列を挿入すると、RNAポリメラーゼIIIによってAlu配列(Aluエレメント)の転写が開始される可能性があります。
pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2またはpSIL-eGFP-MMP2-2-Alu2をU251(ヒト神経膠腫)細胞にトランスフェクトして、ランダムに設計された外因性配列の挿入効率をテストしました。挿入効率を向上させるために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドであるpBS-L1PA1-CH-mneoをU251細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計しました。実験群と対照群との共トランスフェクトプラスミドを表15に示す。
表 15 グループ化
トランスフェクション手順では、U251細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 細胞の各プレートのトランスフェクションの場合、48μgまたは96μg(実験グループによると、1つのプラスミドのみがトランスフェクションされた場合は48μg;2つのプラスミドを同時トランスフェクトした場合、各プラスミドの48μg、および合計96μgの2つのプラスミドを用いた)構築したプラスミドを300μL無血清DMEMで希釈し、十分に混合した。同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子を検出するための上流プライマー配列は、配列番号7に以下のように示されている:5’-CACTGCCACCCAGAAGACTG-3’。下流プライマー配列を配列番号8:5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’に示す。
プライマーペア4を設計し、プライマーペア4の上流プライマー配列を配列番号18として示す:5’-TTTCAGGGTCTAGGTGGC-3’;下流プライマー配列を配列番号19:5’-AAATGCTTTCTCCGCTCT-3’に示す。プライマーペア4の上流プライマー配列は、完全なMMP2遺伝子に位置し、プラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流配列の上流配列は、プラスミド内ではなく、ゲノムのみにおいて、プライマーペア4の下流プライマー配列は、挿入されるランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表16に示す。
表16 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア4: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表17に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表17 プライマーペア4の結果（n=3, x￣±s）
実施例4 遺伝子転写フレームワークによって形成される投げ縄(lariat)構造(挿入される外因性配列を含む)とSINE部分配列(例えば、Aluエレメント)を含むRNA断片との間の接続を検出する(自然せん断部位で切断されたAluエレメントの転写)
実施例3の実験群5および対照群1のトランスフェクト細胞からの全RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
cDNAテンプレートの逆転写合成:cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対（ペア）5は、挿入される外因性配列を含む転写投げ縄(lariat)構造と、Alu要素の転写産物によって産生される部分Alu配列を含むRNA断片との間の結合を検出するように設計した。上流プライマー配列は配列番号20:5'-GGCATAATGATGTGGCTGTT-3'に示され、上流プライマーは挿入される外因性配列上に位置し、下流プライマー配列を配列番号21に示す:5'-TCTGTTGGCTCGCTCTTG-3'。下流プライマーは、プラスミドに構築されたAlu配列の後の非相同配列(18bp)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表18に示す。
表18 qPCR反応系
qPCR反応サイクル:
95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、52°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および 挿入される配列を含む投げ縄(lariat)構造と部分Aluを含むRNA断片との間の結合 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表19に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表19 プライマーペア5の結果（n=3, x￣±s）
実施例5は、本発明における遺伝子編集技術のターゲティング精度を試験する
配列番号15に示す配列におけるランダムに設計された非相同配列(すなわち挿入される配列)の上流の5bp～10bp(合計6bp配列)を「CGATGA」に置き換えて、配列番号22に示す配列を得る:
CTAGCTAGCTAGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGACGGACTCCTGGCTCATGCCTTCGCCCCAGGCACTGGTGTTGGGGGAGACTCCCATTTTGATGACGATGAGCTATGGACCTTGGGAGAAGGCCAAGGTGAGAAAGGGGCCCTCTGCATGCCCCAGACCTTCTCTCCTGTCCTCTCTCCACTCCATTTGCTTGCGATGAAGAGCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATGGCATAATGATGTGGCTGTTTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACGTGGGAGGGGAGGAAAGTCACACATCTGGGTGAGTCAGAATCTTGGTCTCCAAAGAAGGCCTGGAGAAGTCCAACCTCCCCCTTCCATGTCACTCTTTAGTGGTCCGTGTGAAGTATGGGAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCCGCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAAGCTAGCTAGCTAG、この配列では、波状部分は元々GACCAGであり、CGATGAに置き換えられ、残りの配列はSeq ID No.15と同じでした。配列は化学合成によって得られ、MMP2-3と命名された。
実施例3の方法を用いてMMP2-3を調製し、プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2を得た。
プラスミドpSIL-eGFP-MMP2-3-Alu2をU251細胞(ヒトグリオーマ)にトランスフェクトし、ORF1pおよびORF2pを発現するプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo(LINE)も実験群としてU251細胞に同時トランスフェクトし、pSIL-eGFP-MMP2-1-Alu2およびpBS-L1PA1-CH-mneoを共トランスフェクトした前述の細胞を対照群とした。具体的なグルーピングを表20に示す。
表 20 グループ化
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア4を用いたPCR検出、および実施例3のqPCR反応系および反応サイクルを用いたqPCR検出。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表21に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表21 プライマーペア4の結果（n=3, x￣±s）
実施例6 挿入される外因性配列を挿入するためのSINE配列(例としてAlu配列)直接連結法の適用
IT15遺伝子はハンチントン病の原因遺伝子であり、本実施例ではIT15遺伝子に外来性配列を挿入し、ゲノム配列挿入技術「DNAを介したSINE配列の直接ライゲーション法(Alu配列を例に)」を確認する。
ヒトゲノム中の遺伝子IT15の160bp配列を配列番号23に示すように選択した:
ATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAG*AAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCA、ここで、*は選択された挿入部位(標的部位)、挿入部位の前のIT15遺伝子の挿入部位の上流配列(標的部位の上流配列)、および挿入部位の後のIT15遺伝子の挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)である。
挿入される配列として挿入部位にランダムに設計された非相同配列を付加し、標的部位の下流に部分Alu配列を連結して遺伝子転写フレームワークとし、遺伝子転写フレームワークを発現ベクターに挿入できるようにするために、制限酵素NheI消化部位と保護塩基を両端に付加し、完全な配列を配列番号24に示します。
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAGGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、このうち、アンダースコアは、無作為に設計された外因性の非相同配列(すなわち、挿入される配列)を示し、長さは60 bp、配列の両端にNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)、およびIT15遺伝子挿入部位の下流配列(標的部位の下流配列)と3′NheI消化部位および保護塩基配列との間の部分Alu配列(斜線部分)を示す。 配列は化学合成によって得られ、IT15-1と命名された。
部分Alu配列を標的部位の下流の配列の下流に接続するという選択は、生物における特定の構造によって形成される特定の状態を模倣するように選択される。 この状態は、SINEの転写産物(Aluエレメント)が細胞内作用(SINE転写産物の自然せん断部位での切断)によって生成される逆転写機能を保持する構造と、プレmRNA(pre-mRNA)せん断によって生成される投げ縄構造とがつながった状態です。
図17に示すようにプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoにIT15-1を挿入し、プラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1を構築すると、具体的なプロセスは次のとおりです。
IT15-1とpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表22に示す:
表22 消化反応システム
消化したIT15-1をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表23に示した:
表23 リンケージ反応系
pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドは独自のCMVプロモーターを持っているため、発現フレームワークがCMVプロモーターに挿入されている限り、RNAポリメラーゼIIによって転写を開始できます。
実験群:トランスフェクトされたpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1プラスミドの群を実験群10とした; 非改変pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドをトランスフェクトした群を対照3とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対6:その上流プライマー配列を配列番号25に示す:5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号26:5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'に示されている。 プライマーペア6の上流プライマー配列は、そのままのIT15遺伝子に位置し、さらにプラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流の配列の上流は、プラスミド中ではなく、ゲノムのみに位置し、プライマーペア6の下流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表24に示す。
表24 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア6: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表25に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表25 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
実施例7は、本発明における遺伝子編集技術のターゲティング精度を試験する
配列番号24に示す配列におけるランダムに設計された非相同配列(すなわち挿入される配列)の上流の10bp～15bp(合計6bp配列)を「GGACAT」に置き換えて、配列番号27に示す配列を得る:
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACAGGACATCAGTTACAGGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、このシーケンス(配列)では、波状部分は元々TGTGTGであり、GGACATに置き換えられ、残りの配列はSeq ID No.24と同じでした。配列は化学合成によって得られ、IT15-2と命名された。
プラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoにIT15-2を挿入し、プラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2を構築し、実施例6を参照した。
pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-2プラスミドを導入したHela細胞群を実験群11とした;pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-1プラスミドを導入したHela細胞群を対照群4とした。各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
実施例6の方法は、qPCR検出のためのトランスフェクションおよびトランスフェクト細胞DNAの抽出に使用した。
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
qPCRにプライマーペア6を用い、反応系および反応サイクルは実施例6と一致した。GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表26に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表26 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
結論:本発明により実施されるゲノム配列挿入は、高いターゲティング精度を有する。
実施例1から実施例6まで、DNAを介した外因性配列をゲノム指定部位に挿入する方法は、真核細胞(細胞株や初代細胞など)の効果的な遺伝子編集が可能であり、挿入される配列を高効率かつ高精度に標的部位に標的化することがわかる。異なる組織細胞を編集することの実現可能性から、この方法は様々な細胞、組織および生物(生物)に適用できることがわかる。
実施例8 DNAを介したゲノムの配列(削除される配列)の欠失(削除)
ヒトゲノム中の遺伝子MINK1の配列は、配列番号28に示すようにランダムに選択される:
AGAGAATGAGGGGCCCCTTTTTCTCTCTGGTGGCTCAGGCCCAACTCCCTTCCTACTGGGGAGGCTCACTCCCTCCCCTTTCCCCTCTCCCCCTGGAATGCCCTGCCTCCTGCTGAAAATCCCTCAGGAAGCTCTTCACCTGTCACCTGTTACGGGCCAGGTGCTCTGCAGGTTGCTCTGGGGAGATGGGATCTGATGGCCCTCCTGCCTGGGATGCTGTCCGTGATCCTTTTACCTGGGTTTTTCTCTAAGATGCTGGAAGATGGAATCGGGTTCTTCAGGATGGTGGTGGGGTAAAGGAGGGTGCTGGGGTGTCTGGGTCGGGCCAGGACCACAGCTGGCTCAGGCAAGTCCTGTGTGTGCACGCAGGGATGTGAGGCAAGGGAGCAGAGGTGACTCCCCACACTGACCCCTCCCTCTGTGTCTTCACAGTGGATTTTGGGGTGAGTGCTCAGCTGGACCGCACCGTGGGCAGACGGAACACTTTCATTGGGACTCCCTACTGGATGGCTCCAGAGGTCATCGCCTGTGATGAGAACCCTGATGCCACCTATGATTACAGGGTATGGAGTGGAAAGTTGGGAGCATGGGGGCTGCCAAGGGCGGGAAGCAATATGGGGACCACGGGGCCTGAGCAGGCTGGGGAACAGAGGAAGGTCAGATGATGTTAGCAGTGAGGGGCTGGGGAACATCTTACGGCAAGGCAAGTGTGGGTGGGAAGATGGGATGGGTTGGAAGGCACTGCTGCAGGAATGGGTGTGGCCCAGGAAGGCTCCTGAGAGGCCAGGATGGTGGGTGAAGAGAGGTTGCAGGGCAGAGTTGTCAGGAATATTCACTTGTTCCTTCTTTCCCGTCTATAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTG、ここで、下線部は、ゲノム上で削除される配列であり、削除される配列の前のゲノム上で削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、削除される配列の後のゲノム上で削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列であり、 影のある部分は、ゲノム上で削除される配列の3'配列です。
配列は、削除される配列の3'配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列の順に構築され、NheI消化部位および対応する保護塩基が両端に付加され、配列は配列番号29に示されています:
CTAGCTAGCTAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCAGAGAATGAGGGGCCCCTTTTTCTCTCTGGTGGCTCAGGCCCAACTCCCTTCCTACTGGGGAGGCTCACTCCCTCCCCTTTCCCCTCTCCCCCTGGAATGCCCTGCCTCCTGCTGAAAATCCCTCAGGAAGCTCTTCACCTGTCACCTGTTACGGGCCAGGTGCTCTGCAGGTTGCTCTGGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTGCTAGCTAGCTAG、両端の斜体と太字の部分は、NheI消化部位と対応する保護塩基です。 配列は化学合成によって得られ、MINK1-1と命名された。
同時に、配列番号29において削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列をMINK1遺伝子と相同ではない配列を用いて置換し、配列番号30に示すような配列を得る:
CTAGCTAGCTAGAGTGATATTTGGTCTCTAGGAATCACAGCCATCGAGATGGCAGAGGGAGCCCCCCGTAAGTTCTGAGTCTGCCCATTGTTATAATGATTAAACAAGTTATATATGAAAAGATTAAAACAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTCTCTCTCCCTACCCATTGCAGACCAAAGAAAGATAGGGAGTGGGAGGGGAGGGAAAGGAAGGGCCCAGAGAGTGGCTGTAGGGAGGAGGTGGGTCCTGGGACCCTGCCGAGGAAGGGTCCTGTAGCTCCCAGTGCAGTGAAAGGGACTGAGGGTGTCTCCTCTGTGTCCAGCTCTGTGTGACATGCACCCCATGCGAGCCCTCTTCCTCATTCCTCGGAACCCTCCGCCCAGGCTCAAGTCCAAGAAGTGCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはMINK1遺伝子と相同ではない置換配列である。 配列は化学合成によって得られ、MINK1-2と命名された。
MINK1-1およびMINK1-2をそれぞれプラスミドベクターpSIL-eGFPに挿入し、以下のようにプラスミドpSIL-eGFP-MINK1-1およびpSIL-eGFP-MINK1-2を構築した。
MINK1-1、MINK1-2、およびプラスミドpSIL-eGFPを別々に消化し、反応系を表27に示した:
表27 消化反応システム
消化したMINK1-1またはMINK1-2をプラスミドベクターpSIL-eGFPとライゲーションし、反応系を表28に示した:
表28 リンケージ反応系
実施例1で調製したAlu1、プラスミドpSIL-eGFP-MINK1-1およびプラスミドpSIL-eGFP-MINK1-2をSalIで消化し、連結させた後、反応系および条件を実施例1と同様にして、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1およびpSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1を得た。
削除される配列を削除する効果は、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1またはpSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1をHela細胞にトランスフェクションすることによってテストされました。 欠失効率を改善するために、ORF1pおよびORF2p(LINE)を発現するプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoをHela細胞に同時トランスフェクトし、対応する対照群を設計した。 このうち、pSIL-eGFP-MINK1-1-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneoを導入した群を実験群12とし、pSIL-eGFP-MINK1-2-Alu1+pBS-L1PA1-CH-mneoを導入した群を対照群5とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
実施例1の方法に従って、プラスミドトランスフェクションを行い、トランスフェクションされた細胞DNAを抽出する。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマー対(ペア)7:その上流プライマー配列を配列番号31に示す:5'-ACAGGGTATGGAGTGGAAAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号32:5'-ATAGACGGGAAAGAAGGAAC-3'に示されている。 プライマーペア7の上流プライマーは、ゲノム上のMINK1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在せず、下流プライマーはゲノム上のMINK1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在しない。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表29に示す。
表29 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア7:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表30に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表30 プライマーペア7の結果（n=3, x￣±s）
実施例9 SINE配列(Alu配列を例にとる)直接接続方式により配列を削除する
FMR1遺伝子は遺伝性精神遅滞 - 脆弱X症候群に関連しており、配列番号33に示すように、配列の1つが選択されました:
ACTTGCTGAGTACCCAAGGAAAGTGTGCTTGTATTTATGGGCGTCTATTTTCAGAGCACTAATTATTGCTGAATTAGAACAGAAATATAGGAAAACTGATTTTTACAAGGAGCTTCAAAGCAATCTCAGGTAGTTTCTGATTATGTATCTCTGCCTACCTCGGGGTACATAGACAGGGTTACAATTTGGTTGAGGATATATGACATGTGGTTTTTAAAGACACCTAGGGGCATTTTAAGAAAATTTCCTCGATATCTGAAAATCTGTAGATTTCAAAATTATGTTAATCATGAAATATTCTGTGTTGTAATTTTTGTGTAGGTGTATTCCAGAGCAAATGAAAAAGAGCCTTGCTGTTGGTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGATAAAGGGTGAGGTAGGAAAATGCCTATTTAAATTTTTTTCTTATATTGTTTCCTTTTTTTAAACCCAGGTTGTACATTCCCGTGTGGATTTCTATTTTGAAGTAATATCTAATTTTGAGTAATTTAATTAAAATGTTTTCACTATGTGTTCAGTATGTTTCTGTTGGTCATAAATTTTTTCACATAGATTATTTATTTTAAAATAACTGAATAGGGAGAACTTCTTATTCTTACTTTAAAAATTGTGATTAGAAGTGACTTTTATTTATTTCTCAGTTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAA、ここで、下線部は、ゲノム上で削除される配列であり、削除される配列の前のゲノム上で削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、削除される配列の後のゲノム上で削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列であり、 影のある部分は、ゲノム上で削除される配列の3'配列です。
配列は、削除される配列の3'配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+削除される配列の3'末端のすぐ隣の下流配列+部分Alu配列の順に構築され、NheI消化部位および対応する保護塩基が両端に付加され、 配列は配列番号34に示されています:
CTAGCTAGCTAGTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGACTTGCTGAGTACCCAAGGAAAGTGTGCTTGTATTTATGGGCGTCTATTTTCAGAGCACTAATTATTGCTGAATTAGAACAGAAATATAGGAAAACTGATATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、両端の斜体と太字の部分は、NheI消化部位と対応する保護塩基です。影付きの部分は部分Alu配列です。 配列は化学合成によって得られ、FMR1-1と命名された。
同時に、配列番号34において削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列をFMR1遺伝子と相同ではない配列を用いて置換し、配列番号35に示すような配列を得る:
CTAGCTAGCTAGTTTATGTGATAGAATATGCAGCATGTGATGCAACTTACAATGAAATTGTCACAATTGAACGTCTAAGATCTGTTAATCCCAACAAACCTGCCACAAAAGAGTGTTGCTCCATAATAAATGCTGTTTTTACTGTGATTATTATTGTTGTTATCCCTATCATTATCATCACCATCTTAACCCTTCCCTGTTTTGCTCTTTTATACTTTCCATAAGATCAAGCTGGATGTGCCAGAAGACTTACGGCAAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはFMR1遺伝子と相同ではない置換配列である。 配列は化学合成によって得られ、FMR1-2と命名された。
FMR1-1およびFMR1-2をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1およびpBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2を構築した。
FMR1-1、FMR1-2、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表31に示した:
表31 消化反応システム
消化したFMR1-1またはFMR1-2をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表32に示した:
表32 リンケージ反応系
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-1を導入した群を実験群13とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-FMR1-2を導入した群を対照群6とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア8:その上流プライマー配列を配列番号36に示す:5'-ACAGGGTTACAATTTGGT-3'; 下流プライマー配列は、配列番号37:5'-CATTTGCTCTGGAATACAC-3'に示されている。 プライマーペア8の上流プライマーは、ゲノム上のFMR1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在せず、下流プライマーはゲノム上のFMR1遺伝子のまもなく削除される配列上に位置し、プラスミドには存在しない。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表33に示す。
表33 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア8:95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、45°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表34に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表34 プライマーペア8の結果（n=3, x￣±s）
上記実施形態から、本発明を用いてゲノムの任意の領域における任意の配列の削除が実現可能であることがわかる。 同時に、シーケンシングが各遺伝子のCNVs末端を取得する場合(すなわち、対応する遺伝子配列がSINE配列の一部を接続する場合)、CNVs末端を編集することもできる:挿入または削除してCNVsを編集し(CNVs末端)、それらによってもたらされる発現変化によって細胞、組織または生物の状態を変更する。
実施例10 RNAを介したゲノムに挿入される外来性配列の挿入
ヒトゲノム中の遺伝子IT15の配列を選択し、対応する配列を次の順序で設計した:配列番号38に示すように、NheI消化認識部位および保護塩基+挿入部位(標的部位)の上流配列+挿入される配列+挿入部位(標的部位)下流配列+部分Alu配列+NheI消化認識部位および保護塩基:
CTAGCTAGCTAGATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATAACATGTGTGCAGTTACAGAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGCTGCACTCCACCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTAATAACTGCTGGAGATCCTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアは、挿入されるランダムに設計された(IT15遺伝子に相同ではない)配列を示し、長さは60 bp、配列の両端にNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)、およびIT15遺伝子挿入部位(標的部位)の下流配列と3'NheI消化部位および保護塩基配列との間の部分Alu配列(斜線部分)を示す。 配列は化学合成によって得られ、IT15-3と命名された。
IT15-3をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3を構築した。
IT15-3、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表35に示した:
表35 消化反応システム
消化したIT15-3をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表36に示した:
表36 リンケージ反応系
次に、pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3およびpBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドをそれぞれHela細胞にトランスフェクトしました。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、構築したプラスミド48 μgを300 μLの無血清DMEMで希釈し、完全に混合しました。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液総(トータル)RNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
全RNAからのmRNAの抽出:
先に抽出した総RNA濃度をUV分光光度計で検出し、1000 ngの総RNAをヌクレアーゼフリーddH2Oで50 μLに希釈し、TIANSeq mRNAキャプチャキットの指示に従ってmRNAを抽出し、サンプルの一部を採取してmRNA含有量を検出しました(上記の実験手順を数回繰り返して、トランスフェクションに十分なmRNAを取得します)。
実験群:「pBS-L1PA1-CH-mneo-IT15-3プラスミドを導入したHela細胞」から抽出したmRNAを与えられた群を実験群14とした; 「pBS-L1PA1-CH-mneoプラスミドを導入したHela細胞」から抽出したmRNAを与えられた群を対照7とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
得られたmRNAをLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬を用いて細胞に移し、実験群14および対照群7で6ウェルプレートで培養したHela細胞。 最初のトランスフェクションは、細胞が40%のコンフルエントまで成長したときに行われます。 トランスフェクトした細胞の各ウェルについて、7.5 μLのLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬を125 μLの無血清DMEM溶液で希釈し、室温で10分間インキュベートします。 調製したmRNA5 μgを無血清DMEM溶液125 μLと混合した後、予め希釈した125 μLのLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬と混合し、室温で5分間インキュベートします。 得られた混合液を培養細胞の各ウェルの培養液に加え、穏やかに混合する。 細胞が70%コンフルエントになったら、上記の操作を繰り返す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア6:その上流プライマー配列を配列番号25に示す:5'-GAAATTGGTTTGAGCAGGAG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号26:5'-CGATTGGATGGCAGTAGC-3'に示されている。 プライマーペア6の上流プライマー配列は、そのままのIT15遺伝子に位置し、さらにプラスミド上で用いられる挿入部位(標的部位)の上流の配列の上流は、プラスミド中ではなく、ゲノムのみに位置し、プライマーペア6の下流プライマー配列は、ランダムに設計された非相同配列(挿入される配列)に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表37に示す。
表37 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア6: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、50°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと挿入される配列の挿入の検出の増幅曲線において指数関数的な増殖期が観察され、ほぼ平行であることを確認し、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表38に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表38 プライマーペア6の結果（n=3, x￣±s）
完全なRNA媒介の実現可能性により、ORF2pおよび/またはORF1pのコード配列が、編集されるシステムにインポートされる配列に追加されていない場合、挿入部位(標的部位)上流配列+挿入される配列+挿入部位(標的部位)下流配列+SINE配列(Alu配列など)、部分SINE配列または類似SINE配列を含むRNA産物は、インビトロでORF2pに結合するか、ORF1pとORF2pに同時に結合し、RNP媒介経路によって細胞(細胞質)に転写することができる。
実施例11 CNV末端は本発明によって固定および編集される
生物に広く存在するCNV伸長の現象に基づいて、各遺伝子のCNVは末端を有するべきであると推測することができる。具体的には、対応する遺伝子における配列のセグメントを下流に連結した部分SINE(Alu)配列と、異なるなげなわで連結された部分SINE(Alu)配列(二本鎖DNA)は、CNVの末端の部分SINE配列の前に遺伝子配列を連続的に挿入し、CNVを徐々に伸長させる。 エクソンはpre-mRNAから切り離す必要があるため、イントロンの末端はなげなわを形成する必要があり、それと重なるエクソンを含むなげなわを生成する確率は低いため、発現が比較的低い遺伝子の場合、比較的長い期間が必要であり、CNV末端は遺伝子のイントロンの末端に位置し、部分SINE(Alu)配列に結合している。
本実施例では、BRCA1遺伝子におけるイントロンの3'配列を無作為に選択し、次例において欠失する配列として選択した。 BRCA1遺伝子イントロンの3'配列を配列番号39に示す:
CCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAGAAGGATATTTTGGAAAACTCCTTACATACCTAAATTCTTTGTTTATCAAATACTTGGACTTAGCACACTCTTCTTTGAAATGGACCAATAAACAACAGGAGCCCATAAGCAAAAAGAACTCATTATTTTAAAAACAGTAACTATCCTTACAGGCTTTCTCAGGGCTCTTTCTGTTGGATCCTTCCCTCTCACAGGTCCTTGCTAATGATCTCTAGGTGGACACATTCTAGATGAGATGTCCCTGTCTAGAATGGCAGCACCATGAGGGCTATATCCTCAGTACTAGGACAGCGCCTGGTGCTTAATAGATAGTAAATAGTTGTCTAATTAACTGAGCAAACAGATAGATTCATGAATTAGCTTTTTGCTTTTTCTGTTAGAAACTAAAGGTTCAGGTCAGGCACAATGGCGCATGTCTCTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCTGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATAGTAAAACCCTGTTTCTACAAAAATTACCAAAATTAGCCGGGCGTCTTGGCAAGCACCTGTAATGCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGTGGGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGAAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATGGTGCCAACCTGGGTGACAGAGGGAGACTTAAAAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAAACTAAAGGTTCAAAGAATCCCAGAAAAGGAAGAGTCCTCACAAGCCAGTAATCTAGGCAGGATTACTGATAGTATTTTTATATTTGTTGTATTTTTATAAAATGCCATAGATAGAGGGCTTTTTTCAACATTACATCAGTCTAAAAATCACACATTTTTATATGAACTAACCTAAATGTCTGATGAATCTCACAACACCAAGTCTTTGAAATGTGCCCATATAAATAAAATGTTAACAGATTCATGCTAATTTTAAATATCGATAGTGTTTAAATGCCTTAATTATTTTTTCACTCCCTAGCTTTAAAAGAAAATAACCAACTTCAAAAGGACATCACAATAACATCAAGTCTATTTGGGGGAATTTGAGGATTTTTTCCCTCACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAG、ここで、下線部は、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列であり、下線の後の配列は、削除される配列(具体的には、BRCA1遺伝子のイントロンの3'配列)、波線は、削除される配列の3'末端配列である(欠失は、次の実施形態において行われるので、名前)。
配列は、欠失する配列の3'末端配列+BRCA1遺伝子と相同でないランダムに設計された配列+部分Alu配列の順に構築され、配列の両端にNheI消化部位と保護塩基が付加されて配列が構築される。
Aluエレメント転写産物が部分Alu配列のみを含むRNAを産生させる天然せん断部位は、異なる文献で一貫して報告されていないため、CNV末端の部分Alu配列とのミスマッチによる挿入不能を防ぐために、3つの可能な部分Alu配列を合成して導入し(違いはそれらの5'末端配列が異なることです)、関連する配列は配列番号40、配列番号41、配列番号42に示すように構築されています。
配列配列番号40は：
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu3(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu3と命名された。
配列配列番号41は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu4(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu4と命名された。
配列配列番号42は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、アンダースコアはランダムに設計された非相同配列(BRCA1遺伝子と相同ではない配列)を示し、配列の両端にNheI切断部位と保護塩基(斜体の太字)、および非相同配列と3'末端NheI切断部位と保護塩基配列の間に部分的なAlu配列-Alu5(影付きの部分)を示します。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-1-Alu5と命名された。
配列番号43、配列番号44および配列番号45に示すように、非相同配列(BRCA1遺伝子と相同でない配列)を含まない配列も設計される。
配列番号43の配列は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号43は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu3である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu3と命名された。
配列番号44は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGCTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号44は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu4である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu4と命名された。
配列番号45は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、配列番号45は非相同配列を有さないBRCA1-1-Alu5である。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-2-Alu5と命名された。
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5を構築した。
BRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表39に示した:
表39 消化反応システム
消化したBRCA1-1-Alu3、BRCA1-1-Alu4、BRCA1-1-Alu5、BRCA1-2-Alu3、BRCA1-2-Alu4、BRCA1-2-Alu5をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表40に示した:
表40 リンケージ反応系
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5を導入した群を実験群15とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-2-Alu5を導入した群を対照群8とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、96 μg(各プラスミドにつき32 μg)を取り、構築したプラスミドを300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合します。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア9:その上流プライマー配列を配列番号46に示す:5'-CCCCTTTATCTCCTTCTG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号47:5'-ATTTCTCCCATTCCACTT-3'に示されている。プライマー対9の上流プライマー配列は、プラスミド上ではなくゲノム上にのみ存在し、インタクトBRCA1遺伝子において削除される配列の3'末端配列の下流に位置し、プライマー対9の下流プライマー配列は、プラスミド中ではなく、ゲノム上のみにおいて、インタクトBRCA1遺伝子において欠失される配列の3'末端配列の下流に位置する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表41に示す。
表41 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア9: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、46°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の3'末端配列の下流配列挿入を検出の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表42に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表42 プライマーペア9の結果（n=3, x￣±s）
結論:CNV末端への非相同配列の挿入は、対応するCNVの伸長を妨げることがわかる。
実施例12 CNV末端(端部)の切断(短縮)
BRCA1遺伝子のイントロンの1つの3'配列(実施例11の配列番号39に位置する)を選択し、削除される配列の3'末端配列+非相同配列+削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列+部分Alu配列の順に配列を合成し、両末端にNheI消化部位及び保護塩基を付加し、配列を配列番号48、配列番号49及び配列番号50に示した。
配列番号48の配列は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分Alu配列-Alu3です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu3と命名された。
配列番号49は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分Alu配列-Alu4です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu4と命名された。
配列番号50は:
CTAGCTAGCTAGACTAACATCATTTGGAAATAATTTCATGGGCATTAATTGCATGAATGTGGTTAGATTAAAAGGTGTTCAGCTAGAACTTGTAGTTCCATACTAGGTGATTTCAATTCCTGTGCTAAAATTAATTTGTATGATATATTTTCATTTAATGGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCATTTTCTTGGTGCCATTTATCGTTTTTGAAGGGGGGGCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGGAGAATTGCTTGAACCAGGTAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGGCAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAAAAATAAATAAATAAAATAAATTCTTAAACTAAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGATGGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACACGGGAGGCTGAGACAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCACTGCACTGCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAACTAGCTAGCTAG、ここで、下線は無作為に設計された非相同配列を示し、配列全体の両端にはNheI消化部位および保護塩基(斜体太字)があり、非相同配列とシャドウ配列との間には、削除される配列の5'末端のすぐ隣の上流配列がある。シャドウシーケンスは部分的なAluシーケンス-Alu5です。 配列は化学合成によって得られ、BRCA1-3-Alu5と命名された。
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4、BRCA1-3-Alu5をそれぞれプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoに挿入し、以下のようにプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5を構築した。
BRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4、BRCA1-3-Alu5、およびプラスミドpBS-L1PA1-CH-mneoを別々に消化し、反応系を表43に示した:
表43 消化反応システム
消化したBRCA1-3-Alu3、BRCA1-3-Alu4およびBRCA1-3-Alu5をプラスミドベクターpBS-L1PA1-CH-mneoとライゲーションし、反応系を表44に示した:
表44 リンケージ反応系
このうち、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-3-Alu5を導入した群を実験群16とし、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu3、pBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu4およびpBS-L1PA1-CH-mneo-BRCA1-1-Alu5を導入した群を対照群9とした。 各群には3つのパラレルが含まれており、それぞれがHela細胞で培養された6ウェルプレートで構成されています。
トランスフェクション手順では、Hela細胞を継代し、6ウェルプレートに広げます。 翌日、Entranster-H4000トランスフェクション試薬をトランスフェクションに使用しました。 各6ウェルプレートの細胞トランスフェクションでは、96 μg(各プラスミドにつき32 μg)を取り、構築したプラスミドを300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合します。 同時に、120 μLのEntranster-H4000試薬を300 μLの無血清DMEMで希釈し、よく混合し、室温で5分間静置しました。 その後、調製した2つの液体を混合してよく混合し、室温で15分間静置してトランスフェクション複合体を作成しました。 トランスフェクション複合体を、1ウェルあたり10%ウシ胎児血清を含むDMEM培養液2 mlを含む6ウェルプレートに添加して、トランスフェクションを行います。 細胞が約90%融合したら、継代後に上記の操作を繰り返し、細胞を約90%融合させた後、その後の操作に取り出す。
トランスフェクトされた細胞DNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。 その後、血液/細胞/組織ゲノムDNA抽出キットの製品説明書に従って細胞DNAを抽出し、紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子はAlu配列を含まず、コピー数が安定であるため、GAPDH遺伝子を内部参照遺伝子として用いる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア10:その上流プライマー配列を配列番号51に示す:5'-GCTTTCTCAGGGCTCTTT-3'; 下流プライマー配列は、配列番号52:5'-GCACCATCTCGGCTCACT-3'に示されている。プライマー対10の上流プライマー配列は削除される配列上に位置し、プラスミド中には存在せず、ゲノム上にのみ存在し、プライマー対10の下流プライマー配列は削除される配列上に位置し、プラスミド中には存在せず、ゲノム上にのみ存在する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表45に示す。
表45 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア10: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、49°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDHと削除される配列の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表46に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表46 プライマーペア10の結果（n=3, x￣±s）
実施例11から、CNV末端が伸長し続けるのを妨げるために、CNV末端に非相同配列が挿入され得ることが分かる。 しかし、実施例12は、実験群におけるCNV末端の遺伝子部分の配列が対照群の配列よりも有意に小さいことを示しており、CNVが短くなっている間にCNV末端がクリップされていることを示しており、CNV末端が本発明における関連する方法によって改変され得ることを証明している。 したがって、本発明の遺伝子編集方法において、ゲノム上の複数または全てのCNVsを、挿入点の上流のガイド配列(すなわち、標的部位上流配列)を変更することによって改変することもできる(CNV末端において遺伝子編集を行う場合、ここで標的部位上流配列とCNV末端の遺伝子部分配列は同一である)。
実施例13 CNV末端クリッピング後の対応する遺伝子発現変化
実施例12の実験群16および対照群9の細胞から全RNAを抽出する:
トランスフェクトされた細胞RNAの抽出:細胞培養培地を吸引した後、細胞をPBSで2回すすぎ、消化のために適量の0.25%トリプシンを加え、37°Cで合計20分間消化し、5分ごとに15回のピペッティング(吸引とブロー)を行います。 細胞が懸濁状態にあるとき、血清を含む完全培地を添加して反応を終了する。細胞を含む溶液をRNaseフリーの遠沈管に移し、300gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、全ての上清を吸引する。 磁気ビーズ法組織/細胞/血液トータルRNA抽出キットの指示に従って、トータルRNA抽出を実行します。
全RNAからのmRNAの抽出:
先に抽出した総RNA濃度をUV分光光度計で検出し、1000 ngの総RNAをヌクレアーゼフリーddH2Oで50 μLに希釈し、TIANSeq mRNAキャプチャキットの指示に従ってmRNAを抽出し、サンプルの一部を採取してmRNA含有量を検出しました(上記の実験手順を数回繰り返して、トランスフェクションに十分なmRNAを取得します)。
cDNAテンプレートの逆転写合成:
cDNAは、FastKing cDNA第一鎖合成キットの指示に従って合成され、合成されたcDNAの濃度は、その後のテストのためにUV分光光度計によって決定されます。
qPCR検査:
GAPDH遺伝子の発現は様々な組織において比較的安定しているため、GAPDH遺伝子が内部参照遺伝子として用いられる。
GAPDH遺伝子の上流プライマー配列を配列番号7に示し、下流プライマー配列を配列番号8に示す。
プライマーペア11:その上流プライマー配列を配列番号53に示す:5'-CAGAGGACAATGGCTTCCATG-3'; 下流プライマー配列は、配列番号54:5'-CTACACTGTCCAACACCCACTCTC-3'に示されている。プライマーペア11の上流プライマー配列はBRCA1遺伝子上に位置しプラスミド中には存在せずゲノム上にのみ存在し、プライマーペア11の下流プライマー配列はBRCA1遺伝子上に位置しプラスミド中には存在せずゲノム上にのみ存在する。
上記のプライマーは化学合成により得られる。
qPCR反応系を表47に示す。
表47 qPCR反応系
反応系を氷上で調製し、調製後に反応管の蓋をし、穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分が管の底にあることを確認した。各6ウェルプレート細胞サンプルは、同時に3回繰り返した。
qPCR反応サイクル:
プライマーペア11: 95°Cで15分間の予備変性;(95°Cで10秒間の変性、55°Cで20秒間のアニーリング、72°Cで20秒間の伸長)40サイクル。GAPDHプライマーを同条件で反応させた。
GAPDH および BRCA1 発現の増幅曲線における指数関数的な成長周期を観察し、ほぼ平行であることを確認した後、得られたデータを2-ΔΔCt法で解析し、結果を表48に示した。PCR産物は、シーケンシングによって正しいことが確認されました。
表48 プライマーペア11の結果（n=3, x￣±s）
結論:BRCA1遺伝子の発現が減少していることがわかり、CNVの編集が対応する遺伝子の転写に影響を与え、タンパク質の発現や細胞、組織、生物の状態に影響を与える可能性があることが示されました。
実施例11～13から分かるように、本発明に基づくと、CNV末端を固定、伸長およびクリップし、かつ細胞の遺伝子転写およびタンパク質発現に同時に影響を与えることができる。 さらに、CNVは、胚や個体発生の発生、腫瘍形成などの生理学的プロセスによっても変化し、細胞、組織、個体によって異なるため、CNVを編集すると、対応する細胞、組織、生物の状態も変化する可能性があります。上記実施形態から分かるように、本発明は、真核生物に広く存在するレトロトランスポゾン及びそれらの逆転写機能を用いてゲノムを編集し、関与するSINE、LINE配列及び関連タンパク質が正常生物に広く存在し、二本鎖切断、より正確な標的配列認識および切断を生成することなく、標的断片はゲノムに組み込まれ、対応する断片は欠失および置換され得る。二本鎖切断がないため、ゲノム二本鎖DNA切断の危険性や予期しないランダム配列の導入を心配する必要はありません。SINEにおけるAluエレメント配列と、LINEにおけるLINE-1に対応するその機能を例にとると、AluエレメントとLINE-1は霊長類のゲノム中に広く分布しており、具体的な態様としては、前記挿入される配列は、挿入される配列の両側(標的部位の上流配列と標的部位の下流配列)上の配列に依存してゲノム上の挿入部位(標的部位)に導かれ、
さらに、ORF2pは、標的部位の上流配列が完全に一致している条件下でのみ、キャリア核酸の3'末端からゲノム上の一本鎖切断のためのせん断部位までスムーズにスライドすることができるため、ターゲティング精度が大幅に向上し、予期しない切断の発生を回避し、そのターゲティング精度は理論的には、現在存在する他の遺伝子編集技術よりも高い。
さらに、目的の配列、遺伝子およびゲノムは、必要なRNAおよびORF1pおよびORF2pなどの対応するタンパク質をin vitroで生成することにより、DNA断片を導入したり、トランスフェクション中に核に入ったりすることなく、RNAまたはRNP経路を介して改変することができる。ORF1p(およびORF2p)の核局在機能により、細胞にトランスフェクトされたRNAやタンパク質を核内に誘導することができ、ベクターの核への侵入が難しいために操作が困難な細胞の編集に有益です。同時に、本発明は、ゲノム上のCNVを編集することもできるので、CNVsは、本発明を通じて増加、減少または安定化(変化し続けることができない)、CNVsはタンパク質発現等に直接影響し得るので、CNVsの操作は、対応する細胞、組織、器官または生体（個体）の発現および状態を変化または安定化させることができる。様々なMIRおよびLINE-2のような、Alu要素およびLINE-1と相同で機能的に類似した様々なタイプのSINEおよびLINEが真核生物に広く分布しているので、本発明は他の真核生物系にも適用することができる。
他の遺伝子編集技術とは異なり、本発明で使用される関連機構は、正常な生物に存在し、外来機構およびシステムを導入することなく、遺伝子編集のための受容系への影響を低減する。原核生物由来のタンパク質などの外来系を導入しず、二本鎖切断を生じないため、本発明は他の既存の遺伝子編集技術よりも臨床現場への適用が容易である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】