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特表2024-504622脊髄性筋萎縮症のサイレントキャリアを検出するための方法、組成物、およびシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-01
(54)【発明の名称】脊髄性筋萎縮症のサイレントキャリアを検出するための方法、組成物、およびシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20240125BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240125BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240125BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12N15/11 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542695
(86)(22)【出願日】2022-01-14
(85)【翻訳文提出日】2023-08-30
(86)【国際出願番号】 US2022012470
(87)【国際公開番号】W WO2022155442
(87)【国際公開日】2022-07-21
(31)【優先権主張番号】63/137,889
(32)【優先日】2021-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511172461
【氏名又は名称】ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】オカモト， パトリシア
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ジェンシー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA17
4B063QQ03
4B063QQ12
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ58
4B063QR08
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアを検出するための方法、組成物およびシステムに関する。方法は、Ｔ＞Ｇ変異の存在を検出するためにＳＭＮ１遺伝子増幅産物におけるｒｓ１４３８３８１３９を分析することによって、標的遺伝子増幅産物（例えば、ＳＭＮ１（２＋０）遺伝子型）の有無を検出するための核酸サンプルを分析する工程を含む。分析方法は、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲであり得る。本明細書に開示される方法の実施形態を実施するまたは組成物を使用するためのシステムおよびキットも開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法であって、（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記核酸サンプルを分析する工程がリアルタイムＰＣＲアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー、または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸サンプルを分析する工程が、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用するＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９の標的化分析を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記プローブが配列番号３を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記プローブが配列番号４を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記２種のプローブが異なるフルオロフォアで標識されている、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
データが収集された後に各蛍光色素チャネルについてＣｔが決定される、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記対象がヒトである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムであって、以下の工程：（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのキットであって、以下の工程：（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
【請求項18】
ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、該対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物。
【請求項19】
ＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項22】
前記プローブが、検出可能な部分で標識されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本出願は、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３７，８８９号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６３／１３７，８８９号は、本明細書においてその全体が参照によって援用される。
本出願は、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３７，８８９号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６３／１３７，８８９号は、本明細書においてその全体が参照によって援用される。
【0002】
（発明の分野）
本出願は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアを検出するための方法、組成物、およびシステムに関する。
本出願は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアを検出するための方法、組成物、およびシステムに関する。
【背景技術】
【0003】
（背景）
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、染色体５ｑ１３．２上の運動神経細胞生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）１（ＳＭＮ１）遺伝子のホモ接合型欠失によって主に引き起こされる一般的な常染色体劣性疾患である。現在のＳＭＡキャリアスクリーニング方法は、ＳＭＮ１コピー数の減少を探す。しかし、場合によっては、特定の個体が一方の５番染色体上における２コピー（またはそれより多い）のＳＭＮ１遺伝子と、もう一方の５番染色体上における０個のＳＭＮ１コピーとを有し得る（２＋０と示される）ような、ＳＭＮ１遺伝子の重複が存在する。現在の方法は、個々の染色体上に存在するＳＭＮ１コピーの数を決定することができず、したがって、一方の染色体上における２個のＳＭＮ１コピーと、もう一方における０コピーとを有する個体（２＋０、サイレントキャリア）を、両方の染色体上における１個のＳＭＮ１遺伝子を有する個体（１＋１）と区別しない。したがって、サイレントキャリアは、伝統的なスクリーニング方法によってはキャリアとして同定されず、偽陰性の試験結果を受ける。これらのＳＭＡサイレントキャリアを同定する能力を有する試験方法は、高価で、時間がかかり、正確度が疑わしい。したがって、ＳＭＡのサイレントキャリアを検出するための効率的で正確なアッセイについて、当該分野において必要性が存在する。
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、染色体５ｑ１３．２上の運動神経細胞生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）１（ＳＭＮ１）遺伝子のホモ接合型欠失によって主に引き起こされる一般的な常染色体劣性疾患である。現在のＳＭＡキャリアスクリーニング方法は、ＳＭＮ１コピー数の減少を探す。しかし、場合によっては、特定の個体が一方の５番染色体上における２コピー（またはそれより多い）のＳＭＮ１遺伝子と、もう一方の５番染色体上における０個のＳＭＮ１コピーとを有し得る（２＋０と示される）ような、ＳＭＮ１遺伝子の重複が存在する。現在の方法は、個々の染色体上に存在するＳＭＮ１コピーの数を決定することができず、したがって、一方の染色体上における２個のＳＭＮ１コピーと、もう一方における０コピーとを有する個体（２＋０、サイレントキャリア）を、両方の染色体上における１個のＳＭＮ１遺伝子を有する個体（１＋１）と区別しない。したがって、サイレントキャリアは、伝統的なスクリーニング方法によってはキャリアとして同定されず、偽陰性の試験結果を受ける。これらのＳＭＡサイレントキャリアを同定する能力を有する試験方法は、高価で、時間がかかり、正確度が疑わしい。したがって、ＳＭＡのサイレントキャリアを検出するための効率的で正確なアッセイについて、当該分野において必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
（概要）
本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアを検出するための方法およびシステムに関する。
本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアを検出するための方法およびシステムに関する。
【0005】
一部の実施形態では、本発明は、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するための方法を含む。方法は、核酸サンプルを対象から得る工程を含み得る。方法は、標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、核酸サンプルを分析する工程をさらに含み得る。方法は、標的遺伝子増幅産物が存在する場合に対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程をさらに含み得る。一部の実施形態では、核酸サンプルを分析する方法は、リアルタイムＰＣＲアッセイを含み得る。一部の実施形態では、核酸サンプルを分析する方法は、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含み得る。一部の実施形態では、核酸サンプルを分析する方法は、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含み得る。方法の一部の実施形態では、変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物は、変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される。方法の一部の実施形態では、プローブは、フルオロフォアで標識されている。方法の一部の実施形態では、データが収集された後に蛍光色素チャネルのＣｔが決定され、曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される。
【0006】
他の実施形態において、本発明は、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するためのシステムを含む。一部の実施形態において、そのシステムは、本明細書において開示される発明の方法を実施するためのコンポーネントを含む。
【0007】
なお他の実施形態において、本発明は、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するための組成物またはキットを含む。一部の実施形態において、そのキットは、本明細書において開示される発明の方法を実施するための組成物および／または他の構成成分を含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
（詳細な説明）
以下の説明は、本発明の方法、組成物、ならびにシステムの種々の局面および実施形態を記載する。本発明のどの特定の実施形態も、それらの方法およびシステムの範囲を定義することは意図されない。むしろ、それらの実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる、種々の方法およびシステムの非限定的例を提供するに過ぎない。この説明は、当業者の観点から読まれるべきである。したがって、当業者にとって周知である情報は、必ずしも含まれていない。
以下の説明は、本発明の方法、組成物、ならびにシステムの種々の局面および実施形態を記載する。本発明のどの特定の実施形態も、それらの方法およびシステムの範囲を定義することは意図されない。むしろ、それらの実施形態は、本発明の範囲内に少なくとも含まれる、種々の方法およびシステムの非限定的例を提供するに過ぎない。この説明は、当業者の観点から読まれるべきである。したがって、当業者にとって周知である情報は、必ずしも含まれていない。
【0013】
（定義）
本発明はこれから、以下においてより完全に記載される。本発明は、多くの異なる形式で具体化され得、本発明は、本明細書において示される局面に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの局面は、適用される法的要件をこの開示が満たすように提供される。別途定義されない限りは、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において参照されるすべての特許、出願、公開された出願および他の公開物は、それらの全体が参照によって援用される。この節において示される定義が、参照によって本明細書において援用される特許、出願、公開された出願および他の公開物において示される定義に反するかまたは他の様式で一致しない場合は、この節において示される定義が、参照によって本明細書において援用される定義に勝る。
本発明はこれから、以下においてより完全に記載される。本発明は、多くの異なる形式で具体化され得、本発明は、本明細書において示される局面に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの局面は、適用される法的要件をこの開示が満たすように提供される。別途定義されない限りは、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において参照されるすべての特許、出願、公開された出願および他の公開物は、それらの全体が参照によって援用される。この節において示される定義が、参照によって本明細書において援用される特許、出願、公開された出願および他の公開物において示される定義に反するかまたは他の様式で一致しない場合は、この節において示される定義が、参照によって本明細書において援用される定義に勝る。
【0014】
本発明またはその実施形態の構成要件を紹介する場合、冠詞「ある（１つの）（ａ）」、「ある（１つの）（ａｎ）」、「前記（該）（その）（ｔｈｅ）」および「前記（該）（その）（ｓａｉｄ）」は、それらの構成要件のうちの１つ以上が存在することを意味することが、意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であること、および列挙された構成要件以外に追加の構成要件が存在し得ることを意味することが、意図される。本明細書において記載される発明の局面および実施形態は、局面ならびに実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことが、理解される。
【0015】
用語「および／または」とは、２つ以上の項目の列挙において使用される場合には、その列挙された項目のうちのいずれか１つが、単独で、またはその列挙された項目のうちのいずれか１つもしくは複数と組み合わせて、使用され得ることを意味する。例えば、表現「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢのうちのいずれかまたは両方、すなわち、Ａ単独、Ｂ単独、またはＡとＢとの組合せを意味することが、意図される。表現「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢとの組合せ、ＡとＣとの組合せ、ＢとＣとの組合、またはＡとＢとＣとの組合せを意味することが、意図される。
【0016】
本開示の種々の局面は、範囲形式で提示される。範囲形式の記載は、単に簡便性および簡潔性のために過ぎず、本開示の範囲に対する一定不変の限定として解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内にある可能なすべての部分範囲および個々の数値を具体的に開示していると解釈されるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのその範囲内にある部分範囲ならびに個々の数値（例えば、１、２、３、４、５、および６）を具体的に開示していると解釈されるべきである。このことは、その範囲の幅とは無関係に適用される。
【0017】
「サンプル」または「組織サンプル」または「患者サンプル」または「患者細胞サンプルもしくは患者組織サンプル」または「検体」とは、各々、対象または患者の組織から得られた類似の細胞の収集物を指す。組織サンプル源は、新鮮な組織、凍結および／もしくは保存された器官または組織または生検材料または吸引物に由来する、固形組織；血液またはなんらかの血液成分（例えば、血漿もしくは血清）、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、体液（例えば、脳脊髄液、羊水、腹水もしくは間質液）または対象の妊娠もしくは発生における任意の時点に由来する細胞であり得る。組織サンプルは、天然にあるその組織と天然では混合されない化合物（例えば、保存料、抗凝固薬、緩衝液、固定液、栄養分、抗菌薬など）を含み得る。細胞は、従来の様式で、例えば、ＦＦＰＥ様式で、固定され得る。また、サンプルは、後の移動および／または分析のために乾燥され得る（例えば、乾燥血液または乾燥血漿）。
【0018】
本明細書において使用される場合、用語「個体」、「対象」および「患者」は、交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、用語「対象」および「対象（複数）」とは、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウスまたはヒツジ）ならびに霊長類（例えば、カニクイザル、ゴリラ、チンパンジーなどのサル、またはヒト）を含む哺乳動物を指す。
【0019】
本明細書において使用される場合、用語「検出可能な部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」とは、定量アッセイにおいて測定され得る分子を指す。例えば、検出可能な部分は、測定され得る生成物（例えば、目に見える生成物）へと基質を変換するために使用され得る酵素を含み得る。または、検出可能な部分は、定量され得る放射性同位体であり得る。または、検出可能な部分は、フルオロフォアであり得る。または、検出可能な部分は、発光分子であり得る。または、他の検出可能な分子が、使用され得る。
【0020】
用語「標識された」および「検出可能な作用物質もしくは検出可能な部分で標識された」とは、例えば、別の実体（例えば、核酸、ポリペプチドなど）への結合後のその標識の検出（例えば、放射能の視覚化された検出など）によって測定され得る実体（例えば、核酸プローブ、抗体など）を特定するために本明細書において交換可能に使用される。検出可能な作用物質もしくは検出可能な部分は、測定され得、またその強度が、結合された実体の量に関連（例えば、比例）するシグナルをそれが生じるように、選択され得る。核酸を標識および／または検出するための広範な種類のシステムが、当該分野において公知である。標識された核酸は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段もしくは他の手段によって検出可能である標識の組込みまたはその標識への結合体化によって、調製され得る。標識または標識部分は、直接的に検出可能であり得（すなわち、それは、検出可能であるためにいかなるさらなる反応も操作も必要とせず、例えば、フルオロフォアは直接的に検出可能である）、またはそれは間接的に検出可能であり得る（すなわち、それは、検出可能な別の実体との反応もしくは結合を通じて検出可能にされ、例えば、ハプテンは、レポーター（例えば、フルオロフォア）を含む適切な抗体との反応後の免疫染色によって検出可能である）。適切な検出可能な作用物質としては、放射性ヌクレオチド、フルオロフォア、化学発光剤、マイクロ粒子、酵素、比色標識、磁気標識、ハプテン、分子ビーコン、アプタマービーコンなどが挙げられるが、それらに限定はされない。
【0021】
（方法）
一部の実施形態において、本発明は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法を含む。その方法は、種々の様式で具体化され得る。
一部の実施形態において、本発明は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法を含む。その方法は、種々の様式で具体化され得る。
【0022】
ＳＭＡは、民族性に依存して約３５人中１人～１１７人中１人の範囲にあるキャリア頻度である常染色体劣性疾患である。この疾患は、脊髄中の前角細胞の進行性変性および損失によって引き起こされる、両側の筋力低下、最終的には萎縮をもたらす。ＳＭＡの最も一般的な原因は、図１において示されるとおり、染色体５ｑ１３．２上の運動神経細胞生存１（ＳＭＮ１）遺伝子のホモ接合型欠失であり、ＳＭＡ患者のうちの９８％までにおいて、ＳＭＮ１の両方のコピーが、欠失されているかまたは非機能性にされているかのいずれかである。ＳＭＡを引き起こすほとんどの変異はＳＭＮ１コピー数の減少を含むので、キャリアスクリーニングは、一般的には、個体が有するＳＭＮ１コピーの数を決定することを含む。図２において示されるとおり、各染色体上に少なくとも１個のＳＭＮ１コピーを有する人々（１＋１）は、ＳＭＡキャリアではない。現在のスクリーニング方法は、一方の染色体上における１個のＳＭＮ１コピーと、もう一方における０個のＳＭＮ１コピーとを有するＳＭＡキャリア（１＋０）を容易に同定し得る。しかし、現在のスクリーニング方法は、一方の染色体上における２（またはそれより多い）コピーのＳＭＮ１と、もう一方の染色体上における０コピーのＳＭＮ１とを有する個体（２＋０）について、偽陰性の結果を提供する。本開示において、用語「サイレントキャリア」とは、一方の染色体上における２コピーまたはそれより多いコピーのＳＭＮ１と、もう一方の染色体上における０コピーのＳＭＮ１とを有する個体を指す。これらのサイレントキャリアは、そのヌルアレルを自身の子孫へと５０％の確率で渡す。
【0023】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するための方法を含む。本発明のある実施形態は、図３において示されるとおり、核酸サンプルを対象から得る工程；その核酸サンプルを分析する工程であって、その分析する工程は、標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、工程；およびその標的遺伝子増幅産物が存在する場合にその対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程を含む。
【0024】
一部の実施形態において、その方法は、核酸サンプルを対象から得る工程を含み得る。核酸は、特定の実施形態において、その核酸を含むサンプルの処理を伴わずに、本明細書において記載される方法を実施するために得られ得る。一部の実施形態において、核酸は、その核酸を含むサンプルの処理後に、本明細書において記載される方法を実施するために得られる。例えば、核酸は、そのサンプルから抽出、単離、精製、部分精製または増幅され得る。本明細書において使用される用語「単離された」とは、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然環境、または外因的に発現される場合は宿主細胞）から取り出された核酸を指し、したがって、ヒトの介入によって（例えば、「人の手によって」）その元の環境から変更されている。本明細書において使用される用語「単離された核酸」とは、対象（例えば、ヒト対象）から取り出された核酸を指し得る。単離された核酸は、供給源サンプル中に存在する構成成分の量よりも少ない非核酸構成成分（例えば、タンパク質、脂質）しか伴わずに単離され得る。単離された核酸を含む組成物は、非核酸構成成分を約５０％～９９％を超えて含まない可能性がある。単離された核酸を含む組成物は、非核酸構成成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて含まない可能性がある。本明細書において使用される用語「精製された」とは、精製手順に核酸を供する前に存在する非核酸構成成分の量よりも少ない非核酸構成成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を含む核酸が提供されることを指し得る。精製された核酸を含む組成物は、他の非核酸構成成分を約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて含まない可能性がある。本明細書において使用される用語「精製された」とは、核酸が由来するサンプル供給源中にあるよりも少ない核酸種を含む核酸が得られることを指し得る。精製された核酸を含む組成物は、他の核酸種を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超えて含まない可能性がある。
【0025】
その方法は、核酸サンプルを分析する工程をさらに含み得、その核酸サンプルを分析する工程は、標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む。本明細書において使用される用語「増幅産物」とは、サンプル中の標的核酸を、その標的核酸またはそのセグメントと同じヌクレオチド配列または実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的または指数関数的に生じるプロセスに供することの産物を指す。本明細書において使用される用語「増幅産物」とは、標的核酸（例えば、他の核酸を含むサンプル中にある）を、その標的核酸またはそのセグメントと同じヌクレオチド配列または実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を選択的かつ、直線的または指数関数的に生じるプロセスに供することの産物を指し得る。本明細書において使用される用語「増幅産物」とは、核酸集団を、増幅前にサンプル中に存在した核酸またはそのセグメントと同じヌクレオチド配列または実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を非選択的かつ、直線的または指数関数的に生じるプロセスに供することの産物を指し得る。その方法は、その標的遺伝子増幅産物が存在する場合にその対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程をさらに含み得る。
【0026】
一部の実施形態において、用語「増幅産物」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法の産物を指す。一部の実施形態において、核酸サンプルを分析する方法は、リアルタイムＰＣＲアッセイを含み得る。
【0027】
一部の実施形態において、核酸サンプルを分析する方法は、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含み得る。一部の実施形態において、その核酸サンプルを分析する方法は、そのＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析して、サイレントキャリア中に存在するＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含み得る。一部の実施形態において、配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される。
【表2】
【0028】
一部の実施形態において、その方法は、ＳＭＮ１のエクソン８またはその部分を分析して、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定することを含み得る。一部の実施形態において、核酸サンプルを分析する方法は、ＳＭＮ１エクソン８に位置する挿入／欠失バリアントｒｓ２００８００２１４（ｄｅｌＡＴ ＭＡＦ：ｇｎｏｍＡＤにおいて８．６％、１０００Ｇにおいて９．６％）を分析することを含み得る。
【0029】
その方法の一部の実施形態において、変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、その変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される。一部の実施形態において、その変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブは、配列番号３を含む。その方法の一部の実施形態において、野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、その野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される。一部の実施形態において、その野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブは、配列番号４を含む。
【表3】
【0030】
その方法の一部の実施形態において、そのプローブは、検出可能な部分で標識され得る。一部の実施形態において、その検出可能な部分はフルオロフォアである。一部の実施形態において、そのフルオロフォアは６－カルボキシフルオレセインであり得る。一部の実施形態において、そのフルオロフォアはＶＩＣであり得る。一部の実施形態において、各プローブは、異なるフルオロフォアで標識され得る。または、他の検出可能な部分（例えば、本明細書において開示される検出可能な部分）が、使用され得る。
【0031】
その方法の一部の実施形態において、多型の存在が、プローブの蛍光シグナルが最小閾値を横切るサイクル数（Ｃｔ）によって検出され得る。その方法の一部の実施形態において、Ｃｔは、そのデータが収集された後にその蛍光色素チャネルにおいて決定され、その曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される。
【0032】
一部の実施形態において、その対象はヒトである。
【0033】
一部の実施形態において、そのサンプルは生体サンプルである。一部の実施形態において、そのサンプルは、血液サンプルまたは血液サンプルの部分（例えば、血清もしくは血漿）である。
【0034】
（組成物）
本開示の他の実施形態は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物を含む。その組成物は、種々の様式で具体化され得る。
本開示の他の実施形態は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物を含む。その組成物は、種々の様式で具体化され得る。
【0035】
特定の実施形態において、ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、その対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物が、開示される。ある実施形態において、その組成物は、そのＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む。
【0036】
特定の実施形態において、その組成物は、配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む。さらに、および／または代替的に、その組成物は、配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む。特定の実施形態において、そのプライマーおよび／またはプローブは、検出可能な部分で標識され得る。一部の実施形態において、その検出可能な部分はフルオロフォアである。一部の実施形態において、そのフルオロフォアは６－カルボキシフルオレセインであり得る。一部の実施形態において、そのフルオロフォアはＶＩＣであり得る。一部の実施形態において、各プローブは、異なるフルオロフォアで標識され得る。または、他の検出可能な部分（例えば、本明細書において開示される検出可能な部分）が、使用され得る。
【0037】
広範な種類の検出可能な作用物質のいずれもが、本開示の実施において使用され得る。適切な検出可能な作用物質としては、種々のリガンド、放射性ヌクレオチド；蛍光色素；化学発光剤（例えば、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｕｍ）エステル、安定化されたジオキセタンなど）；生物発光剤；具体的には、スペクトル的に分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）；マイクロ粒子；金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など．）；ナノクラスター；常磁性金属イオン；酵素；比色標識（例えば、色素、コロイド金など）；ビオチン；ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）；ハプテン；ならびに抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質が挙げられるが、それらに限定はされない。
【0038】
以下に、使用され得る一部の検出可能な部分の一部の非限定的例が記載される。
【0039】
（蛍光色素）
特定の実施形態において、検出可能な部分は蛍光色素である。広範な種類の化学構造および物理的特徴の多数の公知の蛍光色素が、本開示の実施における使用のために適切である。蛍光性の検出可能な部分は、検出器によって捕捉される放出光を有するレーザーによって刺激され得る。その検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または共焦点顕微鏡であり得、それらはその強度を記録する。
特定の実施形態において、検出可能な部分は蛍光色素である。広範な種類の化学構造および物理的特徴の多数の公知の蛍光色素が、本開示の実施における使用のために適切である。蛍光性の検出可能な部分は、検出器によって捕捉される放出光を有するレーザーによって刺激され得る。その検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または共焦点顕微鏡であり得、それらはその強度を記録する。
【0040】
適切な蛍光色素としては、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｉｎｅ）またはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、ヘキサクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、Ｑ－ＤＯＴＳ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ色素（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４など）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＲＥＤ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ、シアニン色素（例えば、ＣＹ－３、ＣＹ－５、ＣＹ－３．５、ＣＹ－５．５など）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５３２、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５９４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６６０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ ７００、ＩＲＤ ８００など）などが挙げられるが、それらに限定はされない。蛍光色素を他の化学実体（例えば、タンパク質およびペプチド）に結合するために適切な蛍光色素および方法に関するより多くの例について、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲを参照のこと。蛍光標識剤の好ましい特性としては、高いモル吸収係数、高い蛍光量子収率、および光安定性が挙げられる。一部の実施形態において、標識フルオロフォアは、スペクトルの紫外線範囲（すなわち、４００ｎｍより低い）においてではなく可視光範囲（すなわち、４００ｎｍと７５０ｎｍとの間）で吸収波長および放出波長を示す。
【0041】
検出可能な部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）など、１つよりも多い化学実体を含み得る。共鳴移動は、その放出強度の全体的増強をもたらす。例えば、Ｊｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４３４７（その内容全体が参照によって本明細書において援用される）を参照のこと。共鳴エネルギー移動を達成するために、第１の蛍光分子（「ドナー」蛍光（ｆｌｕｏｒ））が光を吸収し、励起した電子の共鳴を通じてその光を第２の蛍光分子（「アクセプター」蛍光（ｆｌｕｏｒ））へと移動させる。ある１つのアプローチにおいて、ドナー色素およびアクセプター色素の両方が、一緒に連結されてオリゴプライマーに結合され得る。ドナー色素およびアクセプター色素を核酸に連結するための方法は、例えば、Ｌｅｅらに対する米国特許第５，９４５，５２６号（その内容全体が参照によって本明細書において援用される）において記載されている。使用され得る色素のドナー／アクセプター対としては、例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ）、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、およびフルオレセイン／ＱＳＹ ７色素が挙げられる。例えば、Ｌｅｅらに対する米国特許第５，９４５，５２６号を参照のこと。これらの色素の多くはまた、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）から、市販されている。適切なドナーフルオロフォアとしては、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’－クロロ－７’－フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）などが挙げられる。
【0042】
（酵素）
特定の実施形態において、検出可能な部分は酵素である。適切な酵素の例としては、ＥＬＩＳＡにおいて使用される酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、それらに限定はされない。他の例としては、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。酵素は、リンカー基（例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなど）を使用して分子に結合体化され得る。
特定の実施形態において、検出可能な部分は酵素である。適切な酵素の例としては、ＥＬＩＳＡにおいて使用される酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、それらに限定はされない。他の例としては、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。酵素は、リンカー基（例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなど）を使用して分子に結合体化され得る。
【0043】
（放射性同位体）
特定の実施形態において、検出可能な部分は放射性同位体である。例えば、分子は、同位体で標識され得る（すなわち、天然で通常見出される原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量もしくは質量数を有する原子によって置換された、１個もしくは複数の原子を含み得る）か、または同位体がその分子に結合され得る。分子に組み込まれ得る同位体の非限定的例としては、水素同位体、炭素同位体、フッ素同位体、リン同位体、銅同位体、ガリウム同位体、イットリウム同位体、テクネチウム同位体、インジウム同位体、ヨウ素同位体、レニウム同位体、タリウム同位体、ビスマス同位体、アスタチン同位体、サマリウム同位体、およびルテチウム同位体（すなわち、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、１３５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８７Ｒｅ、２０１Ｔ１、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１ｌＡｔ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ）が挙げられる。
特定の実施形態において、検出可能な部分は放射性同位体である。例えば、分子は、同位体で標識され得る（すなわち、天然で通常見出される原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量もしくは質量数を有する原子によって置換された、１個もしくは複数の原子を含み得る）か、または同位体がその分子に結合され得る。分子に組み込まれ得る同位体の非限定的例としては、水素同位体、炭素同位体、フッ素同位体、リン同位体、銅同位体、ガリウム同位体、イットリウム同位体、テクネチウム同位体、インジウム同位体、ヨウ素同位体、レニウム同位体、タリウム同位体、ビスマス同位体、アスタチン同位体、サマリウム同位体、およびルテチウム同位体（すなわち、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、１３５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８７Ｒｅ、２０１Ｔ１、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１ｌＡｔ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ）が挙げられる。
【0044】
（デンドリマー）
一部の実施形態において、シグナル増幅は、標識されたデンドリマーを検出可能な部分として使用して、達成される（例えば、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：９３～９９、２０００）（その内容全体がその全体として参照によって本明細書において援用される）を参照のこと）。蛍光標識されたデンドリマーは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（Ｍｏｎｔｖａｌｅ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。これらは、当該分野において公知である方法によって、オリゴヌクレオチドプライマーに化学的に結合体化され得る。
一部の実施形態において、シグナル増幅は、標識されたデンドリマーを検出可能な部分として使用して、達成される（例えば、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：９３～９９、２０００）（その内容全体がその全体として参照によって本明細書において援用される）を参照のこと）。蛍光標識されたデンドリマーは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（Ｍｏｎｔｖａｌｅ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。これらは、当該分野において公知である方法によって、オリゴヌクレオチドプライマーに化学的に結合体化され得る。
【0045】
（システムおよびキット）
本開示の他の実施形態は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムおよびキットを含む。そのシステムは、種々の様式で具体化され得る。
本開示の他の実施形態は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムおよびキットを含む。そのシステムは、種々の様式で具体化され得る。
【0046】
ある特定の実施形態では、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するためのシステムは、（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、核酸サンプルを分析する工程；および（ｃ）標的遺伝子増幅産物が存在する場合に対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネント（例えば、組成物）を含む。
【0047】
ある特定の実施形態では、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するためのキットは、（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、核酸サンプルを分析する工程；および（ｃ）標的遺伝子増幅産物が存在する場合に対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つの構成成分（例えば、組成物）を含む。ある特定の実施形態では、キットにおいて使用される組成物は、配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含み得る。追加で、および／もしくは代替的に、組成物は、配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む。特定の実施形態において、プライマーおよび／またはプローブは、検出可能な部分で標識され得る。一部の実施形態において、その検出可能な部分はフルオロフォアである。一部の実施形態において、そのフルオロフォアは６－カルボキシフルオレセインであり得る。一部の実施形態において、そのフルオロフォアはＶＩＣであり得る。一部の実施形態において、各プローブは、異なるフルオロフォアで標識され得る。または、他の検出可能な部分（例えば、本明細書において開示される検出可能な部分）が、使用され得る。特定の実施形態において、キットは、使用のための指示を含む。
【0048】
一部の実施形態において、本開示は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムを提供する。したがって、ある実施形態において、本発明は、本明細書において記載される方法のためのプログラミングコードがコードされている、コンピュータ可読媒体を含む。また、ある実施形態において、本発明は、コンピュータ可読媒体と通信するプロセッサを含むシステムを含み得、そのプロセッサは、本明細書において記載される方法を実施するように構成されている。本発明の種々の実施形態のために適切なプロセッサおよびコンピュータ可読媒体が、以下により詳細に記載され、図４において示されている。
【0049】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムを含み、そのシステムは、コンピュータ可読媒体、およびそのコンピュータ可読媒体と通信するプロセッサを含み、そのプロセッサは、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するように構成されている。
【0050】
他の実施形態において、本発明は、対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして予測するためのプログラムコードがコードされているコンピュータ可読媒体を含み、そのプログラムコードは、少なくとも１種の遺伝子における個々の変異の効果を推定するためのモデルを適用するためのコードを含む。
【0051】
本発明のシステムおよびコンピュータ可読媒体の一部の実施形態は、種々の遺伝子に適用され得る。特定の実施形態において、その少なくとも１種の遺伝子は、ＳＭＮ１遺伝子を含む。
【0052】
本主題の局面にしたがう実施形態は、デジタル電子回路においてか、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアにおいてか、またはそれらの組合せにおいて、実装され得る。１つの実施形態において、コンピュータは、プロセッサまたはプロセッサ（複数）を含み得る。そのプロセッサは、コンピュータ可読媒体（例えば、そのプロセッサに連結されたランダムアクセスメモリ）を含み得るか、またはそのコンピュータ可読媒体へのアクセスを有し得る。そのプロセッサは、メモリに保存されたコンピュータ実行可能なプログラム命令を実行し得る（例えば、本明細書において詳細に記載される分析を生じるための出力を生成するための、サンプリングルーチンおよび適切なプログラミングを含む、１つ以上のコンピュータプログラムを実行する）。
【0053】
そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、およびステートマシーンを含み得る。そのようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス、例えば、ＰＬＣ、プログラマブル割り込みコントローラ（ＰＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電気的にプログラム可能なリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の同様のデバイスをさらに含み得る。
【0054】
そのようなプロセッサは、そのプロッサによって実行された場合に、プロセッサによって実行されるかもしくは支援されると本明細書において記載される工程をそのプロセッサに実施させ得る命令を保存し得る媒体（例えば、有形のコンピュータ可読媒体）を含み得るか、またはその媒体と通信状態にあり得る。コンピュータ可読媒体の実施形態は、プロセッサ（例えば、ウェブサーバ中にあるプロセッサ）にコンピュータ可読命令を提供可能なすべての電子的記憶装置、光学的記憶装置、磁気的記憶装置、または他の記憶装置を含み得るが、それらに限定はされない。媒体の他の例は、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、すべての光学媒体、すべての磁気テープもしくは他の磁気媒体、またはコンピュータプロセッサが読み取り可能である他のあらゆる媒体を含むが、それらに限定はされない。また、種々の他のデバイスが、コンピュータ可読媒体、例えば、ルーター、私的ネットワークもしくは公的ネットワーク、または他の伝達装置を含み得る。そのプロセッサおよびその処理は、１つまたは複数の構造中にあり得、１つまたは複数の構造を通じて分散され得る。そのプロセッサは、本明細書において記載される方法（もしくは方法の部分）のうちの１つまたは複数を実行するためのコードを含み得る。
【0055】
そのシステムは、データ編集システム、ならびに分析が進行する際にユーザがそのシステムとインタラクトするための手段を含み得る。したがって、ある実施形態において、本発明は、複数のアッセイ測定値および／もしくは配列決定データからのデータを収集ならびに／または編集して、そのデータをコンピュータに伝達するためのシステム、ならびにその分析の結果をユーザに伝達するためのシステムを含み得る。そのシステムは、ＤＮＡ配列決定データおよび／またはアミノ酸配列決定データの高スループット分析用に設計され得る。したがって、ある実施形態において、複数の測定されたシグナルは、少なくとも１種の細胞型から単離された複数の既知のＤＮＡ配列を含む。
【0056】
図４は、本発明のソフトウェアを含むシステムにおける情報フローの実施形態を示す。上記で議論されるとおり、コンピュータプロセッサまたはＣＰＵは、例えば、入力を処理し、アルゴリズムを実行し、必要な場合には接触感知式入力装置から受け取った入力に反応して出力を生成することが可能である、デジタルロジックプロセッサを含み得る。本明細書において詳述されるとおり、そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、例えば、ＡＳＩＣ、およびステートマシーン、ならびに／または他のコンポーネントを含み得る。そのようなプロセッサは、そのプロセッサによって実行された場合に、本明細書において記載される工程をそのプロセッサに実施させる命令を保存する媒体（例えば、コンピュータ可読媒体）を含むか、またはその媒体と通信状態にあり得る。
【0057】
したがって、ある実施形態において、その出発点はデータ（１００）を含み得る。いったん、そのデータが収集される（１１０）と、適切な統計分析および／または標準的なスプレッドシートソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、ＦｏｘＰｒｏ、Ｌｏｔｕｓなど）を使用して、その分析の前にかまたはその分析の一部として、そのデータは編集（１２０）および／または（必要な場合には）変換され得る。ある実施形態において、そのデータは、各実験のためのシステムに入力される。あるいは、以前の実行に由来するデータは、コンピュータメモリ（１５０）に保存され、必要に応じて使用される。
【0058】
分析の各時点で、ユーザは、キーボード（１８０）、フロッピー（登録商標）ディスク、リモートアクセス（例えば、インターネットを介する）（１９０）、または他のアクセス手段を介して、命令を入力し得る。ユーザは、実行のためのオプション、レポートをどのように印刷すべきかなどを含む、命令を入力し得る。また、分析の各時点で、そのデータは、当該分野において一般的な記憶装置（例えば、ディスク、ドライブ、またはメモリ（１５０））を使用して、コンピュータに保存され得る。当該分野において理解されるとおり、プロセッサ（１６０）およびＩ／Ｏコントローラ（１７０）は、コンピュータ機能の複数の局面のために必要とされる。また、ある実施形態において、１つよりも多いプロセッサが存在し得る。
【0059】
そのデータはまた、ノイズを除去する（１３０）ために処理され得る。一部の場合では、ユーザは、キーボード（１８０）、フロッピー（登録商標）ディスク、またはリモートアクセス（１９０）を介して、その分析についての変数または制約、例えば、ノイズを決定するための閾値を入力することを望み得る。その後、その分析の結果は、編集され得、ユーザによるレビューのための形式で提供され得る（１４０）。
【実施例】
【0060】
（実施例）
（実施例１－ＳＭＡサイレントキャリアを検出するための方法）
ＳＭＮ１サイレントキャリアアッセイは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ技術を使用して、ＳＭＮ１およびＮＭ＿０００３４４：ｃ．＊３＋８０Ｔ＞Ｇ ＳＮＰを特異的に標的とする。簡単に述べると、ＦＡＭフルオロフォアまたはＶＩＣフルオロフォアのいずれかで標識された２種のＴａｑＭａｎプローブを使用して、それぞれ多型性Ｇバリアントまたは野生型Ｔ塩基の存在を検出する。上流ｑＰＣＲプライマーは、最も３’側にある塩基にてＳＭＮ１に対する特異性を提供し、これは、５番染色体：７０２４７７７３（ｈｇ１９）におけるＳＭＮ１特異的Ｃ塩基と相補的である。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェア（ｖ１．２、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＱＳ７サーマルサイクリング機器（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせて使用して、データの収集および分析を実施する。その多型の存在を、その蛍光シグナルが最小閾値を横切るサイクル数（Ｃｔ）によって検出する。その多型について何のシグナルも検出されない場合、ＷＴプローブからの蛍光シグナルを、サンプル特異的アッセイ対照として使用する。
（実施例１－ＳＭＡサイレントキャリアを検出するための方法）
ＳＭＮ１サイレントキャリアアッセイは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ技術を使用して、ＳＭＮ１およびＮＭ＿０００３４４：ｃ．＊３＋８０Ｔ＞Ｇ ＳＮＰを特異的に標的とする。簡単に述べると、ＦＡＭフルオロフォアまたはＶＩＣフルオロフォアのいずれかで標識された２種のＴａｑＭａｎプローブを使用して、それぞれ多型性Ｇバリアントまたは野生型Ｔ塩基の存在を検出する。上流ｑＰＣＲプライマーは、最も３’側にある塩基にてＳＭＮ１に対する特異性を提供し、これは、５番染色体：７０２４７７７３（ｈｇ１９）におけるＳＭＮ１特異的Ｃ塩基と相補的である。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェア（ｖ１．２、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＱＳ７サーマルサイクリング機器（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせて使用して、データの収集および分析を実施する。その多型の存在を、その蛍光シグナルが最小閾値を横切るサイクル数（Ｃｔ）によって検出する。その多型について何のシグナルも検出されない場合、ＷＴプローブからの蛍光シグナルを、サンプル特異的アッセイ対照として使用する。
【0061】
このＳＭＮ１サイレントキャリアアッセイにおいて、ＳＭＮ１標的配列について、５番染色体：７０２４７７７３（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ビルド）にあるＣ塩基を標的とすることによって、ＳＭＮ１遺伝子に特異的であるように上流ＰＣＲプライマーを設計し、これを使用して、ＳＭＮ１をその偽遺伝子であるＳＭＮ２と区別する。そのリバースＰＣＲプライマーもまた、ＳＭＮ１遺伝子に特異的である。そのＳＭＮ１アンプリコンの大きさは、１３９ｂｐである。プライマー配列およびプローブ配列が、表１に列挙されている。
【表1】
【0062】
いったん、そのＴａｑＭａｎデータを収集すると、両方の蛍光色素チャネルについてそのＣｔを決定し、そのデータの質を評価する。その曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによって、そのアレルの有無を決定し、指数関数的増幅期における線形曲線（ｌｉｎｅａｒ ｃｕｒｖｅ）の勾配によって、その曲線の質を測定する。この勾配は、等式：
によって決定され、この等式において、Ｃｔ＋１は、Ｃｔ後の最初の完全サイクル数である。
【数1】
【0063】
（実施例２－特定の実施形態の例）
本技術の特定の実施形態の非限定的な例が、本明細書の以下に列挙される。
本技術の特定の実施形態の非限定的な例が、本明細書の以下に列挙される。
【0064】
Ａ１． 対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法であって、
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
を含む、方法。
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
を含む、方法。
【0065】
Ａ２． 前記核酸サンプルを分析する工程がリアルタイムＰＣＲアッセイを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【0066】
Ａ３． 前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含む、実施形態Ａ１～Ａ２のいずれか一項に記載の方法。
【0067】
Ａ４． 配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか一項に記載の方法。
【0068】
Ａ５． 前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含む、実施形態Ａ１～Ａ４のいずれか一項に記載の方法。
【0069】
Ａ６． 前記核酸サンプルを分析する工程が、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用するＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９の標的化分析を含む、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか一項に記載の方法。
【0070】
Ａ７． 野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、実施形態Ａ６に記載の方法。
【0071】
Ａ８． 前記プローブが配列番号３を含む、実施形態Ａ７に記載の方法。
【0072】
Ａ９． 変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、実施形態Ａ６に記載の方法。
【0073】
Ａ１０． 前記プローブが配列番号４を含む、実施形態Ａ９に記載の方法。
【0074】
Ａ１１． 前記２種のプローブが異なるフルオロフォアで標識されている、実施形態Ａ６～Ａ１０のいずれか一項に記載の方法。
【0075】
Ａ１２． データが収集された後に各蛍光色素チャネルについてＣｔが決定される、実施形態Ａ６～Ａ１１のいずれか一項に記載の方法。
【0076】
Ａ１３． 前記曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される、実施形態Ａ１２に記載の方法。
【0077】
Ａ１４． 前記対象がヒトである、実施形態Ａ１～Ａ１３のいずれか一項に記載の方法。
【0078】
Ａ１５． 前記サンプルが血液サンプルである、実施形態Ａ１～Ａ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0079】
Ｂ１． 前述の実施形態のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステム。
【0080】
Ｂ２． 対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するためのシステムであって、以下の工程：
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
【0081】
Ｃ１． 前述の実施形態のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症のサイレントキャリアとして同定するためのキット。
【0082】
Ｃ２． Ｃ１に記載のキットであって、以下の工程：
（ａ）核酸を対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
（ａ）核酸を対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
【0083】
Ｃ３． 配列番号１の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーをさらに含む、Ｃ１に記載のキット。
【0084】
Ｃ４． 配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーをさらに含む、Ｃ１に記載のキット。
【0085】
Ｃ５． 配列番号３の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブをさらに含む、Ｃ１に記載のキット。
【0086】
Ｃ６． 配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブをさらに含む、Ｃ１に記載のキット。
【0087】
Ｃ７． 前記プライマーおよび／またはプローブが、検出可能な部分で標識されていてもよい、実施形態Ｃ２～Ｃ６のいずれか一項に記載のキット。
【0088】
Ｃ８． 前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、実施形態Ｃ７に記載のキット。
【0089】
Ｄ１． ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、該対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物。
【0090】
Ｄ２． ＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む、実施形態Ｄ１に記載の組成物。
【0091】
Ｄ３． 配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む、実施形態Ｄ１および／もしくはＤ２に記載の組成物。
【0092】
Ｄ４． 配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む、実施形態Ｄ１および／もしくはＤ２に記載の組成物。
【0093】
Ｄ５． 前記プライマーおよび／またはプローブの少なくとも１つが、検出可能な部分で標識されている、、実施形態Ｄ３および／もしくはＤ４に記載の組成物。
【0094】
Ｄ６． 前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、実施形態Ｄ５に記載の組成物。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための指標として標的遺伝子増幅産物を得る方法であって、該標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該対象から得られた核酸サンプルを分析する工程
を含み、該標的遺伝子増幅産物の存在は、該対象がＳＭＡのサイレントキャリアであることを示す、方法。
【請求項2】
前記核酸サンプルを分析する工程がリアルタイムＰＣＲアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー、または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸サンプルを分析する工程が、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用するＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９の標的化分析を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記プローブが配列番号３を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記プローブが配列番号４を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記２種のプローブが異なるフルオロフォアで標識されている、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
データが収集された後に各蛍光色素チャネルについてＣｔが決定される、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記対象がヒトである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムであって、以下の工程：（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのキットであって、以下の工程：（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
【請求項18】
ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、該対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物。
【請求項19】
ＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項22】
前記プローブが、検出可能な部分で標識されている、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の組成物。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0007】
なお他の実施形態において、本発明は、対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして同定するための組成物またはキットを含む。一部の実施形態において、そのキットは、本明細書において開示される発明の方法を実施するための組成物および／または他の構成成分を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法であって、
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
を含む、方法。
（項目２）
前記核酸サンプルを分析する工程がリアルタイムＰＣＲアッセイを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含む、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー、または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記核酸サンプルを分析する工程が、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用するＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９の標的化分析を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記プローブが配列番号３を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記プローブが配列番号４を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記２種のプローブが異なるフルオロフォアで標識されている、項目６～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
データが収集された後に各蛍光色素チャネルについてＣｔが決定される、項目２～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記対象がヒトである、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記サンプルが血液サンプルである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
項目１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムであって、以下の工程：
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
（項目１７）
項目１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのキットであって、以下の工程：
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
（項目１８）
ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、該対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物。
（項目１９）
ＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２１）
配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２２）
前記プローブが、検出可能な部分で標識されている、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、項目２２に記載の組成物。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための方法であって、
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
を含む、方法。
（項目２）
前記核酸サンプルを分析する工程がリアルタイムＰＣＲアッセイを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析することを含む、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマー、または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーが、ＳＭＮ１のエクソン７またはその部分を分析するために使用される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記核酸サンプルを分析する工程が、ＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出することを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記核酸サンプルを分析する工程が、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用するＳＭＮ１遺伝子増幅産物中のｒｓ１４３８３８１３９の標的化分析を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該野生型ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記プローブが配列番号３を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物が、該変異体ＳＭＮ１遺伝子増幅産物に特異的な標識された核酸プローブで検出される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記プローブが配列番号４を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記２種のプローブが異なるフルオロフォアで標識されている、項目６～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
データが収集された後に各蛍光色素チャネルについてＣｔが決定される、項目２～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記曲線Ｃｔが所定の閾値よりも低いか否かによってアレルの有無が決定される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記対象がヒトである、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記サンプルが血液サンプルである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
項目１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのシステムであって、以下の工程：
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含む、システム。
（項目１７）
項目１～１５のいずれか一項に記載の方法を使用して対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するためのキットであって、以下の工程：
（ａ）核酸サンプルを対象から得る工程；
（ｂ）標的遺伝子増幅産物の有無を検出することを含む、該核酸サンプルを分析する工程；および
（ｃ）該標的遺伝子増幅産物が存在する場合に該対象をＳＭＡのサイレントキャリアとして特徴付ける工程
のうちの少なくとも１つを実施するための構成成分を含む、キット。
（項目１８）
ＳＭＮ１遺伝子コピー中に存在するアレルを対象において同定することによって、該対象を脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のサイレントキャリアとして同定するための組成物。
（項目１９）
ＳＭＮ１遺伝子中のｒｓ１４３８３８１３９を分析してＴ＞Ｇ変異の存在を検出するための構成成分を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
配列番号１の核酸配列を含むプライマーおよび／もしくは配列番号２の核酸配列を含むプライマー、または配列番号１の核酸配列および／もしくは配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプライマーを含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２１）
配列番号３の核酸配列を含むプローブおよび／もしくは配列番号４の核酸配列を含むプローブ、または配列番号３の核酸配列および／もしくは配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％、もしくは９８％、もしくは９７％、もしくは９６％、もしくは９５％、もしくは９０％、もしくは８５％、もしくは８０％同一である核酸配列を含むプローブを含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２２）
前記プローブが、検出可能な部分で標識されている、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記検出可能な部分が、フルオロフォアであり、必要に応じて、６－カルボキシフルオレセインまたはＶＩＣのうちの少なくとも１つである、項目２２に記載の組成物。
【国際調査報告】