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特表2024-504629前立腺癌誘発性骨転移の核医学診断および治療のための標識前駆体および放射性トレーサー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-01
(54)【発明の名称】前立腺癌誘発性骨転移の核医学診断および治療のための標識前駆体および放射性トレーサー
(51)【国際特許分類】
A61K 51/04 20060101AFI20240125BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
A61K51/04 200
A61K51/04 100
A61P35/04
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023542823
(86)(22)【出願日】2022-01-20
(85)【翻訳文提出日】2023-07-13
(86)【国際出願番号】 EP2022051289
(87)【国際公開番号】W WO2022157277
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】102021101216.3
(32)【優先日】2021-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521177348
【氏名又は名称】エスツェーファオ－シュペツィアールヒェミカーリェンフェアトリープ、ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】ＳＣＶ－ＳＰＥＺＩＡＬＣＨＥＭＩＫＡＬＩＥＮＶＥＲＴＲＩＥＢ ＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】フランク、レッシュ
(72)【発明者】
【氏名】ティルマン、グルス
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C084AA12
4C084NA14
4C084ZB26
4C085HH03
4C085KA09
4C085KB02
4C085KB07
4C085KB09
4C085KB10
4C085KB12
4C085KB15
4C085KB17
4C085KB56
4C085LL18
(57)【要約】
核医学診断およびセラノスティクスのための標識前駆体は、下記構造（式）を有し、ここで、第１のＰＳＭＡ特異的ターゲティングベクターＴＶ１、第２のターゲティングベクターＴＶ２は骨親和性を有し、キレート剤Ｃｈｅｌは、放射性同位体と、２つまたは３つのリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３とを錯化するためのものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
放射性同位体と錯化するための、構造：【化1】
－第１のターゲティングベクターＴＶ１は、
【化2】
－第２のターゲティングベクターＴＶ２は、
【化3】
－第１のリンカーＬ１は、
【化4】
式中、
Ｇは、
【化5】
Ｏ１、Ｏ２およびＯ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から独立して選択され；
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第２のリンカーＬ２は、
【化6】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、フラン基、アゾール基、オキサゾール基、チオフェン基、チアゾール基、アジン基、チアジン基、ナフタレン基、キノリン基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基、テトラゾール基、チアジアゾール基、オキサジアゾール基、ピリジン基、ピリミジン基、トリアジン基、テトラジン基、チアジン基、オキサジン基、ナフタレン基、クロメン基またはチオクロメン基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）からなる群から選択され；
ｓ１、ｓ２およびｓ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第３のリンカーＬ３は、
【化7】
式中、
Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｖＮＨ－（式中、ｖ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から選択され；
ｕ１、ｕ２およびｕ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－ＱＳは、スクエア酸基：
【化8】
および
－キレート剤Ｃｈｅｌは、Ｈ４ｐｙｐａ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）、ＥＤＴＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタアセテート）およびその誘導体、ＤＯＴＡ（ドデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＤＯＴＡＧＡ（２－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－４，７，１０）ペンタン二酸）および他のＤＯＴＡ誘導体、ＴＲＩＴＡ（トリデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＴＥＴＡ（テトラデカ－１，４，８，１１－テトラアミンテトラアセテート）およびその誘導体、ＮＯＴＡ（ノナ－１，４，７－トリアミントリアセテート）およびその誘導体、例えばＮＯＴＡＧＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸，４，７－アセテート）、ＴＲＡＰ（トリアザシクロノナンホスフィン酸）、ＮＯＰＯ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－ビス［メチレン（ヒドロキシメチル）ホスフィン酸］－７－［メチレン（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＰＥＰＡ（ペンタデカ－１，４，７，１０，１３－ペンタアミンペンタアセテート）、ＨＥＨＡ（ヘキサデカ－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアミンヘキサアセテート）およびその誘導体、ＨＢＥＤ（ヒドロキシベンジルエチレンジアミン）およびその誘導体、ＤＥＤＰＡおよびその誘導体、例えばＨ２ＤＥＤＰＡ（１，２－［［６－（カルボキシレート）ピリジン－２－イル］メチルアミン］エタン）など、ＤＦＯ（デフェロキサミン）およびその誘導体、トリスヒドロキシピリジノン（ＴＨＰ）およびその誘導体、例えばＹＭ１０３など、ＴＥＡＰ（テトラアザシクロデカンホスフィン酸）およびその誘導体、ＡＡＺＴＡ（６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピンＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラアセテート）およびその誘導体、例えばＤＡＴＡ（（６－ペンタン酸）－６－（アミノ）メチル－１，４－ジアゼピントリアセテート）など；ＳａｒＡｒ（１－Ｎ－（４－アミノベンジル）－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン－１，８－ジアミン）およびその塩、（ＮＨ２）２ＳＡＲ（１，８－ジアミノ－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン）ならびにその塩および誘導体、アミノチオールおよびその誘導体を含む群から選択される）
を有する、標識前駆体。
【請求項2】
前記キレート剤Ｃｈｅｌが、ＤＯＴＡ、Ｈ４ｐｙｐａ、ＤＡＴＡまたはＤＯＴＡＧＡであることを特徴とする、請求項１に記載の標識前駆体。
【請求項3】
前記第２のリンカーＬ２が、【化9】
【請求項4】
前記第２のリンカーＬ２が、少なくとも１つのスクエア酸基：【化10】
【請求項5】
前記第２のリンカーＬ２が、【化11】
【請求項6】
前記第２のリンカーＬ２が、少なくとも１つのイミダゾール基：【化12】
【請求項7】
前記リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の２つまたは３つが同一であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の標識前駆体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の標識前駆体と、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｎｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３５Ｓｍ、１４０Ｐｒ、１５９Ｇｄ、１４９Ｔｂ、１６０Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１６５Ｅｒ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび２３２Ｔｈを含む群から選択される放射性同位体とを含んでなる、放射性トレーサー。
【請求項9】
前記放射性同位体が、６８Ｇａ、１７７Ｌｕまたは２２５Ａｃであることを特徴とする、請求項８に記載の放射性トレーサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キレート剤Ｃｈｅｌと、そのキレート剤Ｃｈｅｌにコンジュゲートされた、ＰＳＭＡおよび骨転移のための２つのターゲティングベクターとを含む、放射性同位体を錯化するための標識前駆体に関する。
【0002】
本発明の化合物は、前立腺癌によって誘発される骨転移の画像核医学診断および治療（セラノスティクス）を意図している。
【背景技術】
【0003】
ラジオセラノスティックス
診療において、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像診断法は、およそ１５年間にわたり、使用範囲が拡大してきた。近年、セラノスティック方法もまた、ますます重要になってきた。
診療において、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像診断法は、およそ１５年間にわたり、使用範囲が拡大してきた。近年、セラノスティック方法もまた、ますます重要になってきた。
【0004】
核医学診断法および治療法において、腫瘍細胞および転移は、放射性同位体、例えばガリウム－６８（６８Ｇａ）またはルテチウム－１７７（１７７Ｌｕ）によって標識される。標識前駆体のなかで、この場合、各放射性同位体（６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ）に配位結合し、放射性トレーサーを形成するものが使用される。標識前駆体は、必須の化学的コンポーネントとして、放射性同位体の効果的かつ安定な錯化のためのキレート剤と、機能性コンポーネントとして、腫瘍組織中の限定された標的構造に結合する生物学的ターゲティングベクターとを含む。一般に、生物学的ターゲティングベクターは、腫瘍細胞の膜貫通受容体、タンパク質、酵素、または他の構造に対して高い親和性を有する。
【0005】
血流中に静脈内注入した後、放射性同位体標識したセラノスティック薬剤または放射性トレーサーは、原発性腫瘍および転移性組織の細胞上または細胞内に集積する。目的は、組織が死ぬような放射線の線量を腫瘍内に蓄積させることである。同時に、健常組織が受ける放射線量は、そこに与える障害が許容可能であるように、十分に低いままであるべきである。
【0006】
キレート剤は、ターゲティングベクターのコンフィギュレーションおよび化学的特性を改変し、また、一般に腫瘍細胞に対するターゲティングベクターの親和性に強く影響を及ぼす。したがって、キレート剤とターゲティングベクターの間のカップリングは、複雑な試行錯誤実験、または生化学的スクリーニングと呼ばれる実験において、目的に合わせて作られる。これには、キレート剤とターゲティングベクターを含む多数の標識前駆体を合成すること、および、特に腫瘍細胞に対する親和性を定量することが含まれる。キレート剤、およびターゲティングベクターに対する化学的カップリングは、それぞれのラジオセラノスティックスの生物学的および核医学的能力にとって極めて重要である。
【0007】
高い親和性に加えて、標識前駆体は、さらなる要求、例えば、
－それぞれの放射性同位体の迅速かつ効果的なキレート化；
－健常組織と比較して、腫瘍細胞および転移（特に骨転移）に対する、最終的なラジオセラノスティックスの高い選択性；
－ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、すなわち、生理的条件下の血清中における最終的なラジオセラノスティックスの生化学的安定性
を満たさなければならない。
－それぞれの放射性同位体の迅速かつ効果的なキレート化；
－健常組織と比較して、腫瘍細胞および転移（特に骨転移）に対する、最終的なラジオセラノスティックスの高い選択性；
－ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、すなわち、生理的条件下の血清中における最終的なラジオセラノスティックスの生化学的安定性
を満たさなければならない。
【0008】
前立腺癌
先進国の男性について、前立腺癌は、最も一般的な種類の癌であり、また、癌による死の第三位の原因である。この疾患において、腫瘍増殖はゆっくりと進む。早いステージに診断された場合、５年生存率は１００％に近い。腫瘍が転移した後で初めて診断された場合、生存率は劇的に低下する。他方で、腫瘍の治療が早すぎる、および積極的すぎる場合、患者のクオリティ・オブ・ライフを無駄に損ない得る。例えば、前立腺の外科的切除は、失禁およびインポテンツを引き起こし得る。この疾患のステージについての信頼できる診断および情報が、患者のクオリティ・オブ・ライフが高い、成功した治療のために不可欠である。幅広く用いられている診断ツールは、医師による前立腺の触診に加えて、患者の血液中の腫瘍マーカーの定量である。前立腺癌の最も有名なマーカーは、血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度である。しかしながら、わずかに数値が上昇した患者が前立腺癌を有していないことがしばしばあり、逆に、前立腺癌患者の１５％は血中ＰＳＡ濃度の上昇を示さないので、ＰＳＡ濃度の重要性には議論がある。
先進国の男性について、前立腺癌は、最も一般的な種類の癌であり、また、癌による死の第三位の原因である。この疾患において、腫瘍増殖はゆっくりと進む。早いステージに診断された場合、５年生存率は１００％に近い。腫瘍が転移した後で初めて診断された場合、生存率は劇的に低下する。他方で、腫瘍の治療が早すぎる、および積極的すぎる場合、患者のクオリティ・オブ・ライフを無駄に損ない得る。例えば、前立腺の外科的切除は、失禁およびインポテンツを引き起こし得る。この疾患のステージについての信頼できる診断および情報が、患者のクオリティ・オブ・ライフが高い、成功した治療のために不可欠である。幅広く用いられている診断ツールは、医師による前立腺の触診に加えて、患者の血液中の腫瘍マーカーの定量である。前立腺癌の最も有名なマーカーは、血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度である。しかしながら、わずかに数値が上昇した患者が前立腺癌を有していないことがしばしばあり、逆に、前立腺癌患者の１５％は血中ＰＳＡ濃度の上昇を示さないので、ＰＳＡ濃度の重要性には議論がある。
【0009】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
前立腺腫瘍の診断のための標的構造の一つは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＡとは異なり、ＰＳＭＡは、血中には検出されない。ＰＳＭＡは、酵素活性を有する膜結合型糖タンパク質である。その機能は、Ｎ－アセチル－アスパルチル－グルタメート（ＮＡＡＧ）および葉酸－（ポリ）－γ－グルタメートからＣ末端グルタメートを切断することである。ＰＳＭＡは、正常組織にはほとんど生じないが、前立腺癌細胞によって高度に過剰発現され、その発現は、腫瘍疾患のステージと密接に関連している。前立腺癌のリンパ節転移および骨転移の約４０％もまた、ＰＳＭＡを発現する。
前立腺腫瘍の診断のための標的構造の一つは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＡとは異なり、ＰＳＭＡは、血中には検出されない。ＰＳＭＡは、酵素活性を有する膜結合型糖タンパク質である。その機能は、Ｎ－アセチル－アスパルチル－グルタメート（ＮＡＡＧ）および葉酸－（ポリ）－γ－グルタメートからＣ末端グルタメートを切断することである。ＰＳＭＡは、正常組織にはほとんど生じないが、前立腺癌細胞によって高度に過剰発現され、その発現は、腫瘍疾患のステージと密接に関連している。前立腺癌のリンパ節転移および骨転移の約４０％もまた、ＰＳＭＡを発現する。
【0010】
ＰＳＭＡの分子ターゲティングのための１つの戦略は、ＰＳＭＡのタンパク質構造に抗体を結合させることである。別なアプローチは、ＰＳＭＡの酵素活性を利用することであり、これはよく理解されている。ＰＳＭＡの酵素結合ポケット中に、グルタメートに結合する２つのＺｎ２＋イオンが存在する。２つのＺｎ２＋イオンの中心の前方に、芳香族結合ポケットがある。このタンパク質は、プテロイン酸基が芳香族結合ポケットに結合すると共に、ＮＡＡＧに加えて葉酸も結合できるように、伸長して結合相手に適合（誘導適合）することができる。ＰＳＭＡの酵素親和性を利用することによって、基質の酵素的切断とは独立して、細胞内への基質の取り込み（エンドサイトーシス）が可能になる。
【0011】
したがって、特にＰＳＭＡ阻害剤は、画像診断およびセラノスティックな放射性医薬品または放射性トレーサーのためのターゲティングベクターとして、高い適性を有している。放射標識された阻害剤は、酵素の活性部位に結合するが、そこで変換されることはない。よって、この阻害剤と放射性標識の間の結合は切断されない。エンドサイトーシスによって、放射性標識を有する阻害剤は、細胞内に取り込まれ、腫瘍細胞内に集積する。
【0012】
ＰＳＭＡに対する親和性が高い阻害剤（スキーム１）は、一般にグルタメートモチーフ、および酵素的に切断されない構造を含む。非常に効果的なＰＳＭＡ阻害剤は、２－ホスホノメチルグルタル酸または２－ホスホノメチルペンタン二酸（２－ＰＭＰＡ）であり、ここで、グルタメートモチーフは、ＰＳＭＡによって切断されないホスホネート基に結合されている。尿素ベースの阻害剤は、臨床的に適切な放射性医薬品ＰＳＭＡ－１１（スキーム２）およびＰＳＭＡ－６１７（スキーム３）において使用される、ＰＳＭＡ阻害剤の別のグループを形成する。
【0013】
グルタメートモチーフのための結合ポケットに加えて、ＰＳＭＡの芳香族結合ポケットを標的化することが有利であることが見出されている。例えば、非常に強力な放射性医薬品ＰＳＭＡ－１１において、結合モチーフＬ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）は、ヘキシル（ヘキシルリンカー）を介して、芳香族ＨＢＥＤキレート剤（Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシ－５－（エチレン－ベータ－カルボキシ）ベンジル）エチレンジアミンＮ，Ｎ’－ジアセテート）に結合される。
【0014】
これに対して、Ｌ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）が非芳香族キレート剤ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラアセテート）に結合される場合、親和性および腫瘍組織への蓄積が低下することが観察される。しかしながら、治療用放射性同位体（例えば１７７Ｌｕまたは２２５Ａｃなど）を含む、ＰＳＭＡ親和性を有する放射性医薬品のためにＤＯＴＡキレート剤を使用することを可能にするために、リンカーを適合させなければならない。非常に効果的な放射性医薬品ＰＳＭＡ－６１７（現在のゴールドスタンダードである）は、種々の芳香族構造によるヘキシルの特異的な置換によって見出された。
【0015】
【化1】
【0016】
【化2】
【0017】
【化3】
【0018】
放射性同位体を用いた、癌の診断およびセラノスティクスのための多数の標識前駆体が、先行技術に開示されている。ＷＯ２０１５０５５３１８Ａ１は、スキーム３の化合物ＰＳＭＡ－６１７を含む、前立腺癌または上皮癌の診断およびセラノスティクスのための放射性トレーサーを開示している。
【0019】
骨転移およびビスホスホネート
ビスホスホネート（ＢＰ）は、診療において、骨代謝異常およびカルシウム代謝異常の治療ために使用される。これには、ページェット病、骨粗鬆症および骨腫瘍の従来の全身療法が含まれる。ビスホスホネートは、ミネラルであるリン酸カルシウムの蓄積における顕著な選択性によって特徴付けられる。これは、ビスホスホネートとカルシウム（ＩＩ）イオンの二座キレート錯体の形成に基づく。ビスホスホネートは、急速に骨再構築している領域において優先的に吸収される。骨転移においては、健常組織と比較して、集中的な再構築が起こる。したがって、ビスホスホネートは、骨転移においてより高い程度まで集積し、そこで、種々のプロセスを開始させる。
ビスホスホネート（ＢＰ）は、診療において、骨代謝異常およびカルシウム代謝異常の治療ために使用される。これには、ページェット病、骨粗鬆症および骨腫瘍の従来の全身療法が含まれる。ビスホスホネートは、ミネラルであるリン酸カルシウムの蓄積における顕著な選択性によって特徴付けられる。これは、ビスホスホネートとカルシウム（ＩＩ）イオンの二座キレート錯体の形成に基づく。ビスホスホネートは、急速に骨再構築している領域において優先的に吸収される。骨転移においては、健常組織と比較して、集中的な再構築が起こる。したがって、ビスホスホネートは、骨転移においてより高い程度まで集積し、そこで、種々のプロセスを開始させる。
【0020】
他方で、ビスホスホネートは、骨質のミネラル化および骨吸収を阻害する。この効果は、なかでも、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素（メバロネート）経路の酵素であるファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）の阻害に基づく。この酵素の阻害によって、シグナリングタンパク質を細胞膜にアンカリングするための重要な分子（ＦＰＰＳ）であるファルネシルの産生が止まり、また、細胞のアポトーシスが引き起こされる。よって、ビスホスホネート誘導体は、そのようなものとして、細胞レベルで既に治療的な役割を果たしている。
【0021】
骨表面へのビスホスホネートの選択的蓄積によって、骨原性細胞、特に破骨細胞（これは、骨基質が脱灰した場合に、より高い程度までビスホスホネートを取り込む）のアポトーシスが促進する。破骨細胞のアポトーシスが増加したことによって、次に、骨吸収抑制効果が生じる。
【0022】
臨床的に適切なビスホスホネートは、クロドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートである。
【0023】
骨転移のセラノスティクスのための特に効果的な放射性トレーサーは、芳香族複素環Ｎユニットを有するヒドロキシビスホスホネートであるゾレドロネート（ＺＯＬ）であることが見出されている。キレート剤ＮＯＤＡＧＡおよびＤＯＴＡとコンジュゲートしたゾレドロネート（スキーム４）は、骨転移のための現在最も強力な放射性セラノスティクスの代表である。
【0024】
【化4】
【0025】
進行期における前立腺癌および転移の治療において、上記のＰＳＭＡターゲティングベクターＫｕＥを含む単量体放射性トレーサーは、現在好んで用いられている。ＰＳＭＡは、また、健常細胞の表面にも発現される。したがって、ＰＳＭＡターゲティングベクターを含む単量体放射性トレーサー放射性トレーサーは、また、健常組織内にも少なからぬ程度まで集積する。それに伴う放射線量は、種々の有毒な副作用を引き起こす。これらの副作用は、２２５Ａｃ（225アクチニウム）で標識された放射性トレーサーのケースにおいて特に顕著であり、唾液腺を完全かつ不可逆的に損傷させる。したがって、２２５Ａｃ放射性同位体を含む治療形態は、もはや用いられていない。
【0026】
診断方法の改善の結果として、転移性前立腺癌の患者数が近年減少しているにもかかわらず、前立腺癌転移を有する患者数は依然として高く、転移の約８０％が骨組織を侵している。転移性前立腺癌のケースにおいては、生存率が著しく低下する。これは、骨転移に特にあてはまる。加えて、骨転移は、激痛を引き起こし、また、クオリティ・オブ・ライフを著しく損なう。一般に、残された唯一の臨床的な代替手段は、緩和療法である（Ｇａｎｄａｇｌｉａ，Ｇ．ら，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｏｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ，２０１５，６８（２），３２５－３３４）。
【発明の開示】
【0027】
本発明の目的は、転移性前立腺癌の穏やかで効果的な治療のための標識前駆体および放射性トレーサーを提供することである。
【0028】
この目的は、放射性同位体と錯化するための、構造：
（式中、
－第１のターゲティングベクターＴＶ１は、
を含むＰＳＭＡ阻害剤の群から選択され；
－第２のターゲティングベクターＴＶ２は、
を含むビスホスホネートの群から選択され；
－第１のリンカーＬ１は、
から選択される構造を有し、
式中、
Ｇは、
であり；
Ｏ１、Ｏ２およびＯ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から独立して選択され；
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第２のリンカーＬ２は、
から選択される構造を有し、
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、フラン基、アゾール基、オキサゾール基、チオフェン基、チアゾール基、アジン基、チアジン基、ナフタレン基、キノリン基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基、テトラゾール基、チアジアゾール基、オキサジアゾール基、ピリジン基、ピリミジン基、トリアジン基、テトラジン基、チアジン基、オキサジン基、ナフタレン基、クロメン基またはチオクロメン基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）からなる群から選択され；
ｓ１、ｓ２およびｓ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第３のリンカーＬ３は、
から選択される構造を有し、
式中、
Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｖＮＨ－（式中、ｖ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から選択され；
ｕ１、ｕ２およびｕ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－ＱＳは、スクエア酸基：
であり；
および
－キレート剤Ｃｈｅｌは、Ｈ４ｐｙｐａ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）、ＥＤＴＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタアセテート）およびその誘導体、ＤＯＴＡ（ドデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＤＯＴＡＧＡ（２－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－４，７，１０）ペンタン二酸）および他のＤＯＴＡ誘導体、ＴＲＩＴＡ（トリデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＴＥＴＡ（テトラデカ－１，４，８，１１－テトラアミンテトラアセテート）およびその誘導体、ＮＯＴＡ（ノナ－１，４，７－トリアミントリアセテート）およびその誘導体、例えばＮＯＴＡＧＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸，４，７－アセテート）、ＴＲＡＰ（トリアザシクロノナンホスフィン酸）、ＮＯＰＯ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－ビス［メチレン（ヒドロキシメチル）ホスフィン酸］－７－［メチレン（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＰＥＰＡ（ペンタデカ－１，４，７，１０，１３－ペンタアミンペンタアセテート）、ＨＥＨＡ（ヘキサデカ－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアミンヘキサアセテート）およびその誘導体、ＨＢＥＤ（ヒドロキシベンジルエチレンジアミン）およびその誘導体、ＤＥＤＰＡおよびその誘導体、例えばＨ２ＤＥＤＰＡ（１，２－［［６－（カルボキシレート）ピリジン－２－イル］メチルアミン］エタン）など、ＤＦＯ（デフェロキサミン）およびその誘導体、トリスヒドロキシピリジノン（ＴＨＰ）およびその誘導体、例えばＹＭ１０３など、ＴＥＡＰ（テトラアザシクロデカンホスフィン酸）およびその誘導体、ＡＡＺＴＡ（６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピンＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラアセテート）およびその誘導体、例えばＤＡＴＡ（（６－ペンタン酸）－６－（アミノ）メチル－１，４－ジアゼピントリアセテート）など；ＳａｒＡｒ（１－Ｎ－（４－アミノベンジル）－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン－１，８－ジアミン）およびその塩、（ＮＨ２）２ＳＡＲ（１，８－ジアミノ－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン）ならびにその塩および誘導体、アミノチオールおよびその誘導体を含む群から選択される）
を有する標識前駆体によって実現される。
【化5】
－第１のターゲティングベクターＴＶ１は、
【化6】
－第２のターゲティングベクターＴＶ２は、
【化7】
－第１のリンカーＬ１は、
【化8】
式中、
Ｇは、
【化9】
Ｏ１、Ｏ２およびＯ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から独立して選択され；
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第２のリンカーＬ２は、
【化10】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、フラン基、アゾール基、オキサゾール基、チオフェン基、チアゾール基、アジン基、チアジン基、ナフタレン基、キノリン基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基、テトラゾール基、チアジアゾール基、オキサジアゾール基、ピリジン基、ピリミジン基、トリアジン基、テトラジン基、チアジン基、オキサジン基、ナフタレン基、クロメン基またはチオクロメン基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｑＮＨ－（式中、ｑ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）からなる群から選択され；
ｓ１、ｓ２およびｓ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－第３のリンカーＬ３は、
【化11】
式中、
Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、アミド基、カルボキサミド基、ホスフィネート基、アルキル基、トリアゾール基、チオ尿素基、エチレン基、マレイミド基、－（ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－および－（ＣＨ２）ｖＮＨ－（式中、ｖ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）を含む群から選択され；
ｕ１、ｕ２およびｕ３は、｛０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０｝のセットから独立して選択され；
－ＱＳは、スクエア酸基：
【化12】
および
－キレート剤Ｃｈｅｌは、Ｈ４ｐｙｐａ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）、ＥＤＴＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタアセテート）およびその誘導体、ＤＯＴＡ（ドデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＤＯＴＡＧＡ（２－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－４，７，１０）ペンタン二酸）および他のＤＯＴＡ誘導体、ＴＲＩＴＡ（トリデカ－１，４，７，１０－テトラアミンテトラアセテート）、ＴＥＴＡ（テトラデカ－１，４，８，１１－テトラアミンテトラアセテート）およびその誘導体、ＮＯＴＡ（ノナ－１，４，７－トリアミントリアセテート）およびその誘導体、例えばＮＯＴＡＧＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸，４，７－アセテート）、ＴＲＡＰ（トリアザシクロノナンホスフィン酸）、ＮＯＰＯ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－ビス［メチレン（ヒドロキシメチル）ホスフィン酸］－７－［メチレン（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＰＥＰＡ（ペンタデカ－１，４，７，１０，１３－ペンタアミンペンタアセテート）、ＨＥＨＡ（ヘキサデカ－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアミンヘキサアセテート）およびその誘導体、ＨＢＥＤ（ヒドロキシベンジルエチレンジアミン）およびその誘導体、ＤＥＤＰＡおよびその誘導体、例えばＨ２ＤＥＤＰＡ（１，２－［［６－（カルボキシレート）ピリジン－２－イル］メチルアミン］エタン）など、ＤＦＯ（デフェロキサミン）およびその誘導体、トリスヒドロキシピリジノン（ＴＨＰ）およびその誘導体、例えばＹＭ１０３など、ＴＥＡＰ（テトラアザシクロデカンホスフィン酸）およびその誘導体、ＡＡＺＴＡ（６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピンＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラアセテート）およびその誘導体、例えばＤＡＴＡ（（６－ペンタン酸）－６－（アミノ）メチル－１，４－ジアゼピントリアセテート）など；ＳａｒＡｒ（１－Ｎ－（４－アミノベンジル）－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン－１，８－ジアミン）およびその塩、（ＮＨ２）２ＳＡＲ（１，８－ジアミノ－３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン）ならびにその塩および誘導体、アミノチオールおよびその誘導体を含む群から選択される）
を有する標識前駆体によって実現される。
【0029】
本発明の標識前駆体の適切な実施形態は、特徴が相互排他的でない限り、下記の特徴：
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＯＴＡであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、Ｈ４ｐｙｐａであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＡＴＡであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＯＴＡＧＡであり；
－前記第２のリンカーＬ２は、
から選択される基の少なくとも１つを含み；
－前記第２のリンカーＬ２は、少なくとも１つのスクエア酸基
を含み；
－前記第２のリンカーＬ２は、
から選択される少なくとも１つの基を含み；
－前記リンカーＬ１およびＬ２は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２）；
－前記リンカーＬ１およびＬ３は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２）；
－前記リンカーＬ２およびＬ３は、同一であり（Ｌ２＝Ｌ３）；
－前記リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２＝Ｌ３）；
－前記第２のリンカーＬ２は、
および上記の基の誘導体
の基を含む群から選択される基を含み；
－前記第２のリンカーＬ２は、少なくとも１つのイミダゾール基：
を含み；
－Ｇは、
であり；
－前記標識前駆体は、構造：
を有する；
の任意の組合せによって特徴付けられる。
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＯＴＡであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、Ｈ４ｐｙｐａであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＡＴＡであり；
－前記キレート剤Ｃｈｅｌは、ＤＯＴＡＧＡであり；
－前記第２のリンカーＬ２は、
【化13】
－前記第２のリンカーＬ２は、少なくとも１つのスクエア酸基
【化14】
－前記第２のリンカーＬ２は、
【化15】
－前記リンカーＬ１およびＬ２は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２）；
－前記リンカーＬ１およびＬ３は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２）；
－前記リンカーＬ２およびＬ３は、同一であり（Ｌ２＝Ｌ３）；
－前記リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、同一であり（Ｌ１＝Ｌ２＝Ｌ３）；
－前記第２のリンカーＬ２は、
【化16】
の基を含む群から選択される基を含み；
－前記第２のリンカーＬ２は、少なくとも１つのイミダゾール基：
【化17】
－Ｇは、
【化18】
－前記標識前駆体は、構造：
【化19】
の任意の組合せによって特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
以下、図面および実施例を参照して本発明を詳細に説明する。図面は、以下のことを示す。
【発明の具体的説明】
【0031】
アミドカップリングの具体例
本発明において、キレート剤Ｃｈｅｌ、ターゲティングベクターＴＶ１、ＴＶ２およびリンカーＬ１、Ｌ２は、好ましくは、アミドカップリング反応によってコンジュゲートされる。アミドカップリング（これは、タンパク質のバックボーンを形成する）は、医薬品化学において、最も一般的に使用される反応である。アミドカップリングの一般的な例をスキーム５に示す。
本発明において、キレート剤Ｃｈｅｌ、ターゲティングベクターＴＶ１、ＴＶ２およびリンカーＬ１、Ｌ２は、好ましくは、アミドカップリング反応によってコンジュゲートされる。アミドカップリング（これは、タンパク質のバックボーンを形成する）は、医薬品化学において、最も一般的に使用される反応である。アミドカップリングの一般的な例をスキーム５に示す。
【0032】
【化20】
【0033】
容易に利用可能なカルボン酸誘導体およびアミン誘導体のセットには実質的に限りがないため、アミドカップリング戦略は、新規化合物を合成するための簡便な経路をもたらす。アミドカップリングのための非常に多くの試薬およびプロトコルが当業者に知られている。最も一般的なアミドカップリング戦略は、カルボン酸とアミンの縮合に基づく。カルボン酸は、この目的のために、一般的に活性化される。残りの官能基は、活性化の前に保護される。反応は、２つのステップで行われ、１つの反応媒体（ワンポット）で活性化カルボン酸を直接的に変換するか、または２つのステップで、活性化された「トラップされた」カルボン酸を単離して、アミンと反応させるか、のいずれかである。
【0034】
カルボキシレートは、ここで、カップリング剤と反応し、反応中間体を形成する（反応中間体は、単離してもよく、またはアミンと直接的に反応させてもよい）。非常に多くの試薬（例えば、酸ハロゲン化物（塩化物、フッ化物）、アジ化物、無水物、またはカルボジイミドなど）が、カルボン酸の活性化のために利用可能である。加えて、ペンタフルオロフェニルまたはヒドロキシコハク酸イミドエステルなどのエステルが、反応中間体として形成され得る。アシル塩化物またはアジ化物由来の中間体は、反応性が高い。しかしながら、過酷な反応条件および高い反応性が、繊細な基質またはアミノ酸に対する使用の妨げになることが多い。対照的に、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）などのカルボジイミドを使用するアミドカップリング戦略は、幅広い範囲に適用される。一般に、特に固相合成において、反応効率を改善するために添加材が用いられる。アミニウム塩は、反応時間が短く、かつラセミ化が最小限である、高効率なペプチドカップリング試薬である。いくつかの添加剤、例えばＨＯＢｔによって、ラセミ化は完全に回避することさえ可能である。アミニウム試薬は、ペプチドの遊離アミンとの過剰な反応を防ぐために、カルボン酸に対して等モル量で使用される。ホスホニウム塩は、カルボキシレートと反応し、これは、一般に２等量の塩基、例えばＤＩＥＡを必要とする。イミニウム試薬を上回るホスホニウム塩の主要な利点は、ホスホニウムは、アミン化合物の遊離アミノ基と反応しないことである。これが、酸とアミンの当モル比でのカップリングを可能にし、また、直鎖ペプチドの分子内環化および高価なアミン化合物の過剰な使用を避けるために役立つ。
【0035】
アミドカップリングのための反応戦略および試薬の包括的な概要は、以下の総説論文中に見出すことができる：
－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｗｈｅｒｅ Ｈａｖｅ Ａｌｌ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｇｏｎｅ？；Ｄ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｂｏｓｔｒｏｍ；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９（１０），４４４３－４４５８；
－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａ Ｌｅｔｔｅｒ Ｓｏｕｐ；Ａ．Ｅｌ－Ｆａｈａｍ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１，１１１（１１），６５５７－６６０２；
－Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｖ．Ｒ．Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂｏｄｅ；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４８０（２０１１）４７１－４７９；
－Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｍｙｔｈ ｏｆ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ｅ．Ｖａｌｅｕｒ，Ｍ．Ｂｒａｄｌｅｙ；Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００９，３８，６０６－６３１。
－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｗｈｅｒｅ Ｈａｖｅ Ａｌｌ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｇｏｎｅ？；Ｄ．Ｇ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｂｏｓｔｒｏｍ；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９（１０），４４４３－４４５８；
－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａ Ｌｅｔｔｅｒ Ｓｏｕｐ；Ａ．Ｅｌ－Ｆａｈａｍ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１，１１１（１１），６５５７－６６０２；
－Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｖ．Ｒ．Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂｏｄｅ；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４８０（２０１１）４７１－４７９；
－Ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｍｙｔｈ ｏｆ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ｅ．Ｖａｌｅｕｒ，Ｍ．Ｂｒａｄｌｅｙ；Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００９，３８，６０６－６３１。
【0036】
本発明に従って使用されるキレート剤の多く（特にＤＯＴＡなど）は、１つまたはそれを超えるカルボキシ基またはアミド基を有する。したがって、これらのキレート剤は、当該技術分野で知られているいずれかのアミドカップリング戦略を使用して、リンカーＬ１、Ｌ２に容易にコンジュゲートされ得る。スキーム６および７は、リンカーターゲティングベクターユニットＬ１－ＴＶ１とキレート剤Ｃｈｅｌのカップリングの例を示し；スキーム８～１０は、Ｌ２－ＴＶ２とキレート剤Ｃｈｅｌのカップリングの例を示す。
【0037】
【化21】
【0038】
【化22】
【0039】
【化23】
【0040】
【化24】
【0041】
【化25】
【0042】
放射性同位体標識のためのキレート剤Ｃｈｅｌ
キレート剤Ｃｈｅｌは、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｎｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３５Ｓｍ、１４０Ｐｒ、１５９Ｇｄ、１４９Ｔｂ、１６０Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１６５Ｅｒ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび２３２Ｔｈからなる群から選択される放射性同位体によって、本発明の標識前駆体を標識するためのものである。上記の放射性同位体を錯化するための多様なキレート剤が、当該技術分野において知られている。スキーム１１は、本発明に従って使用されるキレート剤の例を示す。
キレート剤Ｃｈｅｌは、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｎｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３５Ｓｍ、１４０Ｐｒ、１５９Ｇｄ、１４９Ｔｂ、１６０Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１６５Ｅｒ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび２３２Ｔｈからなる群から選択される放射性同位体によって、本発明の標識前駆体を標識するためのものである。上記の放射性同位体を錯化するための多様なキレート剤が、当該技術分野において知られている。スキーム１１は、本発明に従って使用されるキレート剤の例を示す。
【0043】
【化26】
【0044】
６８Ｇａの錯化のために、また１７７Ｌｕの錯化のためにも適性が良好なＤＯＴＡキレート剤は、本発明に従って好ましい。１７７Ｌｕの錯化のために、特に、Ｈ２ｐｙｐａキレート剤もまた使用され得る。Ｈ４ｐｙｐａの合成をスキーム１２に示す。
【0045】
【化27】
【0046】
放射性同位体
核医学セラノスティクス（診断および治療）のために、特に、放射性同位体６８Ｇａまたは１７７Ｌｕが使用される。本発明は、また、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｎｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３５Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１４９Ｔｂ、１６０Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１６５Ｅｒ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび２３２Ｔｈからなる群から選択される放射性同位体の使用も提供する。
核医学セラノスティクス（診断および治療）のために、特に、放射性同位体６８Ｇａまたは１７７Ｌｕが使用される。本発明は、また、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｎｂ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１３５Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１４９Ｔｂ、１６０Ｔｂ、１６１Ｔｂ、１６５Ｅｒ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃおよび２３２Ｔｈからなる群から選択される放射性同位体の使用も提供する。
【0047】
本発明の標識前駆体の構造式の例を、以下に列挙する。
【化28】
【0048】
【化29】
【0049】
【化30】
【0050】
【化31】
【0051】
【化32】
【0052】
【化33】
【0053】
【化34】
【0054】
【化35】
【0055】
【化36】
【0056】
【化37】
【実施例】
【0057】
実施例１：ビスホスホネートのための親和性プロモーターとしてのスクエア酸
発明者らは、意外にも、ビスホスホネートターゲティングベクターのリンカーのコンポーネントとしてのスクエア酸は、骨組織において、ヒドロキシアパタイトに対する親和性を増大させることを見出した。この有利な効果は、キレート剤ＮＯＤＡＧＡとスクエア酸パミドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍ）のコンジュゲート、およびＮＯＤＡＧＡとゾレドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＺＯＬ）のコンジュゲートの吸着熱（adsorption therms）によって示される。この目的のために、吸着熱（adsorption therms）は、ＬａｎｇｍｕｉｒとＦｒｅｕｎｄｌｉｃｈの方法によって決定される。
発明者らは、意外にも、ビスホスホネートターゲティングベクターのリンカーのコンポーネントとしてのスクエア酸は、骨組織において、ヒドロキシアパタイトに対する親和性を増大させることを見出した。この有利な効果は、キレート剤ＮＯＤＡＧＡとスクエア酸パミドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍ）のコンジュゲート、およびＮＯＤＡＧＡとゾレドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＺＯＬ）のコンジュゲートの吸着熱（adsorption therms）によって示される。この目的のために、吸着熱（adsorption therms）は、ＬａｎｇｍｕｉｒとＦｒｅｕｎｄｌｉｃｈの方法によって決定される。
【0058】
比較のために、スキーム２３および２４に、キレート剤ＮＯＤＡＧＡとスクエア酸パミドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍ）のコンジュゲート、およびＮＯＤＡＧＡとゾレドロネート（ＮＯＤＡＧＡ．ＺＯＬ）のコンジュゲートを示し、さらにＬａｎｇｍｕｉｒとＦｒｅｕｎｄｌｉｃｈの方法によって測定された、それぞれの吸着係数ＫＬＦも示す。
【0059】
【化38】
【0060】
【化39】
【0061】
コンジュゲートＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍの吸着係数ＫＬＦは、ＮＯＤＡＧＡ．ＺＯＬ（これは、スクエア酸基の代わりにイミダゾール基を含む）の吸着係数ＫＬＦよりも大きく、約３倍である。このことから、スクエア酸は、骨組織に対するビスホスホネート基の親和性を著しく増大させることが直ちに明らかである。
【0062】
さらに、若齢の健常ウィスターラットに対する、放射性トレーサー［６８Ｇａ］Ｇａ－ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍを使用したｉｎ ｖｉｖｏ ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）研究（図２参照）によって、骨端（これは、若齢動物において、骨転移と同様に、骨組織の急速な更新および再構築によって特徴付けられる）における高い蓄積が示される。
【0063】
ＰＥＴ放射標識［６８Ｇａ］Ｇａ－ＤＯＴＡ．ＺＯＬについての公開されているＳＵＶ（標準取込値、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＳＵＶ＿（Ｎｕｋｌｅａｒｍｅｄｉｚｉｎ））であるＳＵＶ骨端＝１７．４と比較して、［６８Ｇａ］ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍによって、著しく上昇した値であるＳＵＶ骨端＝２２．９（図３参照）を実現することが可能である。
【0064】
加えて、［６８Ｇａ］ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍの腎排出（％ＩＤ腎＝４０±４、６０分ｐ．ｉ．）は、［６８Ｇａ］Ｇａ－ＤＯＴＡ．ＺＯＬについての腎排出（％ＩＤ腎＝３３±１７、６０分ｐ．ｉ．）よりも速い。［６８Ｇａ］Ｇａ－ＮＯＤＡＧＡ．ＱＳ．Ｐａｍについて、図３に示すように、このことが、［６８Ｇａ］Ｇａ－ＤＯＴＡ．ＺＯＬについての３０．３と比較してより高い２９９．１という骨端対血液比、また、これに対応してより良好なＰＥＴ画像コントラスト（またはシグナル・ノイズ比）をもたらす。
【0065】
実施例２：ＫｕＥユニットの合成
ＰＳＭＡのためのターゲティングベクターとして、例えば、ＰＳＭＡ阻害剤Ｌ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）を、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによる既知の方法（Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，５９（５），１７６１－１７７５）を使用して合成した（スキーム２５参照）。固相に、特にポリマー樹脂に結合し、かつｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ－ブチル）で保護されたリジンを、ここで、二重にｔｅｒｔ－ブチルで保護されたグルタミン酸と反応させる。保護されたグルタミン酸を、トリホスゲンで活性化し、固相に結合したリジンにカップリングした後、Ｌ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）を、ＴＦＡを使用して除去し、同時に完全に脱保護する。次いで、セミ分取ＨＰＬＣによって、産物を遊離リジンから７１％の収率で単離することができる。
ＰＳＭＡのためのターゲティングベクターとして、例えば、ＰＳＭＡ阻害剤Ｌ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）を、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによる既知の方法（Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，５９（５），１７６１－１７７５）を使用して合成した（スキーム２５参照）。固相に、特にポリマー樹脂に結合し、かつｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔｅｒｔ－ブチル）で保護されたリジンを、ここで、二重にｔｅｒｔ－ブチルで保護されたグルタミン酸と反応させる。保護されたグルタミン酸を、トリホスゲンで活性化し、固相に結合したリジンにカップリングした後、Ｌ－リジン－尿素－Ｌ－グルタメート（ＫｕＥ）を、ＴＦＡを使用して除去し、同時に完全に脱保護する。次いで、セミ分取ＨＰＬＣによって、産物を遊離リジンから７１％の収率で単離することができる。
【0066】
【化40】
【0067】
次いで、ＰＳＭＡ阻害剤ＫｕＥ（１）を、カップリング試薬としてジエチルスクエアレートを使用して、標識前駆体とカップリングすることができる。ＫｕＥ（１）とスクエアジエステルのカップリングは、ｐＨ７の０．５Ｍリン酸緩衝液中で行われる。リン酸緩衝液の緩衝能が不十分なので、両方の試薬を添加した後、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）によってｐＨを再調整しなければならない。ｐＨ７において、酸の単純なアミド化（スキーム２６）が、室温で、短い反応時間で急速に進行する。ＨＰＬＣ精製を行った後、ＫｕＥ－ＱＳ（２）が全収率１６％で得られる。
【0068】
【化41】
【0069】
このようにして得たＫｕＥスクエア酸モノエステルは、貯蔵可能であり、また、さらなる合成のための基礎的要素として使用することができる。
【0070】
実施例３：ＫｕＥユニットおよびＰＳＭＡ－６１７リンカーの固相ベースの合成
グルタメート－尿素－リジン結合モチーフＫｕＥを、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって開発された方法によって、芳香族リンカーユニットとコンジュゲートする（Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，５９（５），１７６１－１７７５)。Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって報告された合成方法を、わずかに改変した（スキーム２７参照）。
グルタメート－尿素－リジン結合モチーフＫｕＥを、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって開発された方法によって、芳香族リンカーユニットとコンジュゲートする（Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，５９（５），１７６１－１７７５)。Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって報告された合成方法を、わずかに改変した（スキーム２７参照）。
【0071】
【化42】
【0072】
【化43】
【0073】
【化44】
【0074】
【化45】
【0075】
実施例４：標識前駆体Ｐａｍ．ＱＳ．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７の合成
まず、ＤＯＴＡＧＡ部分構造を合成する。これは、収率７４％であった。
まず、ＤＯＴＡＧＡ部分構造を合成する。これは、収率７４％であった。
【化46】
【0076】
合成は、二級アミンをＢｏｃ保護アミノ基で官能化した、商業的に入手可能なＤＯ２Ａ（ｔＢｕ）－ＧＡＢｚから出発した。
【0077】
ＤＯＴＡＧＡ（ＣＯＯｔＢｕ）３（ＮＨＢｏｃ）－ＧＡＢｚ（４）のグルタル酸側鎖のベンジル保護基を還元的に除去し、ターゲティングベクターとカップリングさせた。
【0078】
次いで、ＰＳＭＡ－６１７リンカーを、アミドカップリングによって、キレート剤（５）とカップリングする。
【化47】
【0079】
キレート剤（５）とＫｕＥ－結合リンカーのカップリングをスキーム２９に示す。アミドカップリングによって得た、保護されたＰＳＭＡ－６１７誘導体（６）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して脱保護し、固相から脱離させる。２段階合成の全収率は、ＨＰＬＣ精製後で６％であった。
【0080】
最後のステップにおいて、パミドロネート－スクエア酸ユニットを合成し、化合物（７）とカップリングする（スキーム３０）。β－アラニンから出発し、パミドロネート（８）をまず調製し、ｐＨ７のリン酸緩衝水溶液中でスクエアジエステルとカップリングさせる。パミドロネート－スクエア酸基（９）とＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７（７）のカップリングは、ｐＨ９のリン酸緩衝水溶液中で行われる（スキーム３０参照）。ＨＰＬＣ精製を行った後、本発明の標識前駆体Ｐａｍ．ＱＳ．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７（１０）が収率４９％で得られる。
【0081】
【化48】
【0082】
実施例５：標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の合成
スキーム１７に示す標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の合成をスキーム３１に示す。まず、固相に結合した第１のターゲティングベクターＫｕＥと、それにコンジュゲートされた芳香族リンカー（スキーム３１における構造（１１））を、スキーム２７に示したものと同様のやり方で合成する。次いで、直交的に保護されたリジンを、架橋ユニットＸとしてリンカーにコンジュゲートする。Ｆｍｏｃ脱保護（構造（１２））に続き、ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）とカップリングし（各反応において、アミド形成のための試薬としてＨＡＴＵを使用する）、構造式（１３）に示す化合物を得る。その後、化合物（１３）をＴＦＡ／ＤＣＭ中で完全に脱保護し、固相から脱離させて化合物（１４）を得る。最後に、パミドロネートとスクエア酸からなる第２のターゲティングベクター（９）を、化合物（１４）とコンジュゲートさせる。第２のターゲティングベクターは、スキーム３０に示したものと同様のやり方で、前もって合成する。
スキーム１７に示す標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の合成をスキーム３１に示す。まず、固相に結合した第１のターゲティングベクターＫｕＥと、それにコンジュゲートされた芳香族リンカー（スキーム３１における構造（１１））を、スキーム２７に示したものと同様のやり方で合成する。次いで、直交的に保護されたリジンを、架橋ユニットＸとしてリンカーにコンジュゲートする。Ｆｍｏｃ脱保護（構造（１２））に続き、ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）とカップリングし（各反応において、アミド形成のための試薬としてＨＡＴＵを使用する）、構造式（１３）に示す化合物を得る。その後、化合物（１３）をＴＦＡ／ＤＣＭ中で完全に脱保護し、固相から脱離させて化合物（１４）を得る。最後に、パミドロネートとスクエア酸からなる第２のターゲティングベクター（９）を、化合物（１４）とコンジュゲートさせる。第２のターゲティングベクターは、スキーム３０に示したものと同様のやり方で、前もって合成する。
【0083】
【化49】
【0084】
実施例６：化合物ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７、ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＱＳ．ＫｕＥおよびＰａｍ．ＳＡ．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
細胞アッセイを使用して、ＫｕＥターゲティングベクターと、親油性リンカーとの親和性（ＰＳＭＡ－６１７と類似する）、およびスクエア酸リンカーとの親和性を、化合物ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７およびＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＱＳ．ＫｕＥ（スキーム３２における構造式（８）および（１０））を使用して検討した。
細胞アッセイを使用して、ＫｕＥターゲティングベクターと、親油性リンカーとの親和性（ＰＳＭＡ－６１７と類似する）、およびスクエア酸リンカーとの親和性を、化合物ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７およびＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＱＳ．ＫｕＥ（スキーム３２における構造式（８）および（１０））を使用して検討した。
【0085】
【化50】
【0086】
アッセイのために、ＬＮＣａＰ細胞を、マルチウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標））の中にピペットで分注した。次第に濃度を上げた分析対象の化合物に、それぞれ、規定量または濃度の、Ｋｄ値が既知である参照化合物化合物６８Ｇａ［Ｇａ］ＰＳＭＡ－１０を添加し、混合物を、ウェル中で、ＬＮＣａＰ細胞と４５分間インキュベートした。数回洗浄した後、細胞結合活性を決定した。得られた阻害曲線を、表１に示すＩＣ５０値およびＫｉ値を計算するために使用した。
【0087】
【表1】
【0088】
非特異的な結合を決定するために、全ての化合物に過剰量のＰＳＭＡ阻害剤２－ＰＭＰＡ（２－（ホスホノメチル）ペンタン酸）を追加して添加し、それらを上記と同じＬＮＣａＰアッセイにかけた。
【0089】
スクエア酸含有化合物ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＱＳ．ＫｕＥ（１６）およびＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７（７）の親和性は実質的に同じであり、確立された化合物ＰＳＭＡ－６１７およびＰＳＭＡ－１１の親和性とおおむね一致する。
【0090】
図４は、ＱＳ．ＫｕＥ基と、ＰＳＭＡの結合ポケットの相互作用を示す。
【0091】
スクエア酸含有化合物ＮＨ２．ＤＯＴＡＧＡ．ＱＳ．ＫｕＥ（１０）の合成に関する複雑さは、他の化合物と比較して、非常に低い。ターゲティングベクターとキレート剤の間のリンカーとしてスクエア酸を使用することによって、２つの異なるターゲティングベクター（このケースでは、ＫｕＥとビスホスホネート）を用いて、より複雑な標識前駆体を定量的に合成する手段がもたらされる。
【0092】
さらに、最終の標識前駆体Ｐａｍ．ＳＡ．ＤＯＴＡＧＡ．ＫｕＥ－６１７（１０）のＰＳＭＡ親和性を決定した。ＩＣ５０は、４９．８±１０ｎＭである。
【0093】
実施例７：［
１１７
Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の放射化学的分析
温度９５℃で、標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７（スキーム１７、およびスキーム３１の構造式（１５）を参照のこと）を、１ｍｌの酢酸アンモニウム緩衝水溶液（１Ｍ、ｐＨ５．５）中で、１７７Ｌｕによって標識する。酢酸アンモニウム緩衝溶液中に存在する標識前駆体の量（５、１０および３０ｎｍｏｌ）の関数としての放射化学的収率（ＲＣＹ）を図５に示す。≧１０ｎｍｏｌの量の標識前駆体で、５分後に、放射化学的収率（ＲＣＹ）は≧９０％に達する。対照的に、５ｎｍｏｌの量の標識前駆体では、５分後の収率はわずか７５％であり、その後、８５％の定常値に達する。放射化学的収率および純度は、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）およびラジオ高圧液体クロマトグラフィー（ラジオＨＰＬＣ）によって決定する。ラジオ薄層クロマトグラフィーによって、放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について、０．０というＲｆが得られる。対照的に、移動相としてのクエン酸緩衝液中の非結合［１７７Ｌｕ］Ｌｕ３＋について、０．８～１．０というＲｆが得られる。分析ラジオ高圧液体クロマトグラフィーにおいて、この放射性トレーサーについて、９．８分という保持時間ｔＲが測定される。
温度９５℃で、標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７（スキーム１７、およびスキーム３１の構造式（１５）を参照のこと）を、１ｍｌの酢酸アンモニウム緩衝水溶液（１Ｍ、ｐＨ５．５）中で、１７７Ｌｕによって標識する。酢酸アンモニウム緩衝溶液中に存在する標識前駆体の量（５、１０および３０ｎｍｏｌ）の関数としての放射化学的収率（ＲＣＹ）を図５に示す。≧１０ｎｍｏｌの量の標識前駆体で、５分後に、放射化学的収率（ＲＣＹ）は≧９０％に達する。対照的に、５ｎｍｏｌの量の標識前駆体では、５分後の収率はわずか７５％であり、その後、８５％の定常値に達する。放射化学的収率および純度は、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ラジオＴＬＣ）およびラジオ高圧液体クロマトグラフィー（ラジオＨＰＬＣ）によって決定する。ラジオ薄層クロマトグラフィーによって、放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について、０．０というＲｆが得られる。対照的に、移動相としてのクエン酸緩衝液中の非結合［１７７Ｌｕ］Ｌｕ３＋について、０．８～１．０というＲｆが得られる。分析ラジオ高圧液体クロマトグラフィーにおいて、この放射性トレーサーについて、９．８分という保持時間ｔＲが測定される。
【0094】
図６は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、等張生理食塩水（ＮａＣｌ）およびヒト血清（ＨＳ）における放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の安定性の測定値を示す。ＰＢＳおよび等張生理食塩水（ＮａＣｌ）において、１４日後においても、≧９８％の放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７が、変化せずに、錯体形態で存在する。ヒト血清（ＨＳ）において、９日後の安定性はわずかに低く９３％であり、１４日後も安定性は９３％のままである。
【0095】
［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の親油性は、ｎ－オクタノールとＰＢＳの混合液における、この化合物の分配平衡を決定することによって決定する。［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７および［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７のｌｏｇＤ７．４係数についての測定値を表２に示す。この結果は、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７が、ＰＳＭＡ－６１７と実質的に同じ親油性を有することを示す。
【0096】
【表2】
【0097】
実施例８：ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）についての親和性
カルシウムを含有する結晶であるヒドロキシアパタイトは、哺乳動物の骨に必須の構成成分であり、また、健常な骨組織および骨転移におけるビスホスホネート蓄積のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のためのモデル基材として適している。図７は、通常のＨＡＰ、およびパミドロネートで前処理またはブロッキングしたＨＡＰに対する、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７および［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋の蓄積についての測定値を示し、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋は、ＨＡＰに対して高い親和性を有することが知られており、参照の役割を果たす。ＨＡＰに結合した放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の割合は９８．２％であり、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋の９９．９％という測定値よりもわずかに低い。対照的に、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７は、ＨＡＰ富化フラクションがわずか１．２％であることがわかった。選択性を決定するために、前もって過剰量のパミドロネートで処理したＨＡＰに対する蓄積をさらに測定した。これによって、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について７．３％、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３について４．９％という値が得られ、これは、ＨＡＰについての高い選択性を示している。
カルシウムを含有する結晶であるヒドロキシアパタイトは、哺乳動物の骨に必須の構成成分であり、また、健常な骨組織および骨転移におけるビスホスホネート蓄積のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のためのモデル基材として適している。図７は、通常のＨＡＰ、およびパミドロネートで前処理またはブロッキングしたＨＡＰに対する、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７および［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋の蓄積についての測定値を示し、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋は、ＨＡＰに対して高い親和性を有することが知られており、参照の役割を果たす。ＨＡＰに結合した放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の割合は９８．２％であり、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３＋の９９．９％という測定値よりもわずかに低い。対照的に、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７は、ＨＡＰ富化フラクションがわずか１．２％であることがわかった。選択性を決定するために、前もって過剰量のパミドロネートで処理したＨＡＰに対する蓄積をさらに測定した。これによって、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について７．３％、遊離［１１７Ｌｕ］Ｌｕ３について４．９％という値が得られ、これは、ＨＡＰについての高い選択性を示している。
【0098】
実施例９：ＰＳＭＡについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性
放射リガンド比較アッセイによって、ＰＳＭＡについて、放射性トレーサーまたは標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７、および参照構造に対する結合親和性を決定する。阻害定数Ｋｉについての対応する測定値を表３に示す。［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７についてのＫｉ値は、標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７についての値と概ね一致する。このことから、ルテチウムによる錯化は、ＰＳＭＡについての結合親和性に悪影響を及ぼさないことが理解できる。ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ．ＫｕＥ－６１７（スキーム３１の構造式（１４）に相当する）と比較して、［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７のＫｉは、約２倍の大きさである。このことから、スクエア酸－パミドロネート基は、ＰＳＭＡに対する親和性を低下させることが理解できる。
放射リガンド比較アッセイによって、ＰＳＭＡについて、放射性トレーサーまたは標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７、および参照構造に対する結合親和性を決定する。阻害定数Ｋｉについての対応する測定値を表３に示す。［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７についてのＫｉ値は、標識前駆体ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７についての値と概ね一致する。このことから、ルテチウムによる錯化は、ＰＳＭＡについての結合親和性に悪影響を及ぼさないことが理解できる。ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ．ＫｕＥ－６１７（スキーム３１の構造式（１４）に相当する）と比較して、［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７のＫｉは、約２倍の大きさである。このことから、スクエア酸－パミドロネート基は、ＰＳＭＡに対する親和性を低下させることが理解できる。
【0099】
【表3】
【0100】
実施例１０：ｅｘ ｖｉｖｏ研究
放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について、器官蓄積を、誘発させたＬＮＣａＰ腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスで検討した。結果を図８に示す。腫瘍と大腿骨における放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の富化は同等であり、それぞれの値は、４．２±０．７％ＩＤ／ｇと３．４±０．４％ＩＤ／ｇであった。腫瘍とは対照的に、骨への蓄積は、ＰＳＭＡ阻害剤ＰＭＰＡ（２－ホスホノメチルペンタン二酸）の投与によってブロックすることはできない。このことから、骨への取り込みは、ＰＳＭＡは発現されていないため、ＰＳＭＡによるものではないことが理解できる。腎臓は、１７±２％ＩＤ／ｇという値であり、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の高い蓄積を示し、これは、同様にＰＭＰＡの投与によって大幅に減少し得る。対照的に、肝臓および脾臓への蓄積は、ＰＳＭＡ特異的ではない。腫瘍と血液への蓄積率は高く、それぞれ２１０と１７０という値であり、これは血液学的な軽度の副作用を示唆する。
放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７について、器官蓄積を、誘発させたＬＮＣａＰ腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスで検討した。結果を図８に示す。腫瘍と大腿骨における放射性トレーサー［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の富化は同等であり、それぞれの値は、４．２±０．７％ＩＤ／ｇと３．４±０．４％ＩＤ／ｇであった。腫瘍とは対照的に、骨への蓄積は、ＰＳＭＡ阻害剤ＰＭＰＡ（２－ホスホノメチルペンタン二酸）の投与によってブロックすることはできない。このことから、骨への取り込みは、ＰＳＭＡは発現されていないため、ＰＳＭＡによるものではないことが理解できる。腎臓は、１７±２％ＩＤ／ｇという値であり、［１１７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ．Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）ＫｕＥ－６１７の高い蓄積を示し、これは、同様にＰＭＰＡの投与によって大幅に減少し得る。対照的に、肝臓および脾臓への蓄積は、ＰＳＭＡ特異的ではない。腫瘍と血液への蓄積率は高く、それぞれ２１０と１７０という値であり、これは血液学的な軽度の副作用を示唆する。
【0101】
方法および材料
全般
全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋ、Ｆｌｕｋａ、ＡｌｆａＡｅｓａｒ、ＶＷＲ、ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ、ＴＣＩ、Ｉｒｉｓ ＢｉｏｔｅｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、さらなる精製を行わずに使用した。乾燥溶媒は、ＭｅｒｃｋおよびＶＷＲから、ＮＭＲスペクトルのための重水素化された溶媒は、Ｄｅｕｔｅｒｏから入手した。ＰＳＭＡ－６１７は、Ｈｙｃｕｌｔｅｃから購入した。薄層クロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ２５４コーティングアルミニウムプレートを使用して行った。評価は、λ＝２５４ｎｍの蛍光吸収、および過マンガン酸カリウムによる染色によって行った。ラジオＴＬＣは、Ｒａｙｔｅｓｔ ＣＲ－３５ Ｂｉｏ Ｔｅｓｔイメージング装置およびＡＩＤＡソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用して評価した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ３００分光装置（３００ＭＨｚ、５ｍｍ ＢＢＦＯプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＢＡＣＳ６０サンプルチェンジャーを使用）、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００分光装置（４００ＭＨｚ、５ｍｍ ＢＢＦＯプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＳａｍｐｌｅＸＰｒｅｓｓ６０サンプルチェンジャーを使用）、およびＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００分光装置（６００ＭＨｚ、５ｍｍ ＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＳａｍｐｌｅＸＰｒｅｓｓ Ｌｉｔｅ１６サンプルチェンジャーを使用）で行った。ＬＣ／ＭＳ測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６１３０Ｂ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳシステムに接続した、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２２０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムで行った。セミ分取ＨＰＬＣ精製は、Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍシリーズ７０００で、各ケースに記載されている条件およびカラムを使用して行った。放射性標識実験のために、ＩＴＭ Ｇａｒｃｈｉｎｇから提供を受けた、０．０４Ｍ ＨＣｌ中の［１７７Ｌｕ］ＬｕＣｌ３を使用した。
全般
全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋ、Ｆｌｕｋａ、ＡｌｆａＡｅｓａｒ、ＶＷＲ、ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ、ＴＣＩ、Ｉｒｉｓ ＢｉｏｔｅｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、さらなる精製を行わずに使用した。乾燥溶媒は、ＭｅｒｃｋおよびＶＷＲから、ＮＭＲスペクトルのための重水素化された溶媒は、Ｄｅｕｔｅｒｏから入手した。ＰＳＭＡ－６１７は、Ｈｙｃｕｌｔｅｃから購入した。薄層クロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ２５４コーティングアルミニウムプレートを使用して行った。評価は、λ＝２５４ｎｍの蛍光吸収、および過マンガン酸カリウムによる染色によって行った。ラジオＴＬＣは、Ｒａｙｔｅｓｔ ＣＲ－３５ Ｂｉｏ Ｔｅｓｔイメージング装置およびＡＩＤＡソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用して評価した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ３００分光装置（３００ＭＨｚ、５ｍｍ ＢＢＦＯプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＢＡＣＳ６０サンプルチェンジャーを使用）、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００分光装置（４００ＭＨｚ、５ｍｍ ＢＢＦＯプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＳａｍｐｌｅＸＰｒｅｓｓ６０サンプルチェンジャーを使用）、およびＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００分光装置（６００ＭＨｚ、５ｍｍ ＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅプローブ、ｚグラジエント、ＡＴＭ、およびＳａｍｐｌｅＸＰｒｅｓｓ Ｌｉｔｅ１６サンプルチェンジャーを使用）で行った。ＬＣ／ＭＳ測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６１３０Ｂ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳシステムに接続した、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２２０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムで行った。セミ分取ＨＰＬＣ精製は、Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍシリーズ７０００で、各ケースに記載されている条件およびカラムを使用して行った。放射性標識実験のために、ＩＴＭ Ｇａｒｃｈｉｎｇから提供を受けた、０．０４Ｍ ＨＣｌ中の［１７７Ｌｕ］ＬｕＣｌ３を使用した。
【0102】
有機合成
ＰＳＭＡリガンドの固相合成（ポリスチレン樹脂上、ＫｕＥ－６１７）
グルタメート－尿素－リジン結合モチーフＫｕＥとＫｕＥ－６１７リガンドのリンカーの合成は、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって提案された方法（Ｂｅｎｅｓｏｖａ，Ｍ．；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｍ．；Ｂａｕｄｅｒ－Ｗｕｓｔ，Ｕ．；Ａｆｓｈａｒ－Ｏｒｏｍｉｅｈ，Ａ．；Ｋｒａｔｏｃｈｗｉｌ，Ｃ．；Ｍｉｅｒ，Ｗ．；Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．；Ｋｏｐｋａ，Ｋ．；Ｅｄｅｒ，Ｍ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔａｉｌｏｒ－Ｍａｄｅ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｄｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１５，５６（６），９１４－９２０； Ｂｅｎｅｓｏｖａ，Ｍ．；Ｂａｕｄｅｒ－Ｗｕｓｔ，Ｕ．；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｍ．；Ｋｌｉｋａ，Ｋ．Ｄ．；Ｍｉｅｒ，Ｗ．；Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．；Ｋｏｐｋａ，Ｋ．；Ｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９（５），１７６１－１７７５）、およびわずかに適合させた方法によって、確立された固相ペプチド化学に従う。ビス（ｔｅｒｔ－ブチル）－Ｌ－グルタメート塩酸塩（４．５ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．９８ｇ、１０．５ｍｌ、６１．７４ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却する。ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のトリホスゲン（１．５６ｇ、５．２６ｍｍｏｌ）を、４．５時間にわたり、滴下して添加する。添加が完了した後、溶液をさらに１時間撹拌する。Ｆｍｏｃ－Ｌ－リジン（Ａｌｌｏｃ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（１．６５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）のＦｍｏｃ保護基をピペリジン／ＤＭＦ溶液（１：１）中で１５分間撹拌することによって除去し、その後、ジクロロメタンによる洗浄ステップを行う。脱保護したＬ－リジン(Ａｌｌｏｃ)－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎを、予め調製した溶液に添加し、室温で終夜撹拌する。樹脂をジクロロメタン（１５ｍｌ）で洗浄し、さらなる精製を行わずに使用する。
ＰＳＭＡリガンドの固相合成（ポリスチレン樹脂上、ＫｕＥ－６１７）
グルタメート－尿素－リジン結合モチーフＫｕＥとＫｕＥ－６１７リガンドのリンカーの合成は、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって提案された方法（Ｂｅｎｅｓｏｖａ，Ｍ．；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｍ．；Ｂａｕｄｅｒ－Ｗｕｓｔ，Ｕ．；Ａｆｓｈａｒ－Ｏｒｏｍｉｅｈ，Ａ．；Ｋｒａｔｏｃｈｗｉｌ，Ｃ．；Ｍｉｅｒ，Ｗ．；Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．；Ｋｏｐｋａ，Ｋ．；Ｅｄｅｒ，Ｍ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔａｉｌｏｒ－Ｍａｄｅ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｄｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１５，５６（６），９１４－９２０； Ｂｅｎｅｓｏｖａ，Ｍ．；Ｂａｕｄｅｒ－Ｗｕｓｔ，Ｕ．；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｍ．；Ｋｌｉｋａ，Ｋ．Ｄ．；Ｍｉｅｒ，Ｗ．；Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．；Ｋｏｐｋａ，Ｋ．；Ｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９（５），１７６１－１７７５）、およびわずかに適合させた方法によって、確立された固相ペプチド化学に従う。ビス（ｔｅｒｔ－ブチル）－Ｌ－グルタメート塩酸塩（４．５ｇ、１５．２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．９８ｇ、１０．５ｍｌ、６１．７４ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却する。ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のトリホスゲン（１．５６ｇ、５．２６ｍｍｏｌ）を、４．５時間にわたり、滴下して添加する。添加が完了した後、溶液をさらに１時間撹拌する。Ｆｍｏｃ－Ｌ－リジン（Ａｌｌｏｃ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（１．６５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）のＦｍｏｃ保護基をピペリジン／ＤＭＦ溶液（１：１）中で１５分間撹拌することによって除去し、その後、ジクロロメタンによる洗浄ステップを行う。脱保護したＬ－リジン(Ａｌｌｏｃ)－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎを、予め調製した溶液に添加し、室温で終夜撹拌する。樹脂をジクロロメタン（１５ｍｌ）で洗浄し、さらなる精製を行わずに使用する。
【0103】
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５１６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）およびモルホリン（３．９２ｇ、３．９２ｍｌ、４５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１２ｍｌ）に溶解して添加する。溶液を暗所で２４時間撹拌する。次いで、それをジクロロメタン（１５ｍｌ）、ＤＭＦ中の１％ＤＩＰＥＡ溶液（３×１３ｍｌ）、ＤＭＦ中のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物溶液（１５ｍｇ／ｍｌ）（９×１０．５ｍｌ×５分）で洗浄し、樹脂に結合し、かつＡｌｌｏｃで保護されたグルタメート－尿素－リジンコンジュゲートを得る。Ｆｍｏｃ－３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン（１．７５ｇ、４．００ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．５２ｇ、４．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５４０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７８０ｍｇ、１．０２ｍｌ、６．０３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解して樹脂に添加する。この溶液を終夜撹拌し、次いでＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄する。Ｆｍｏｃ基を除去するために、ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１：１、３×１１ｍｌ）中で、１回あたり１０分間ずつ撹拌し、ＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ－４－Ａｍｃ－ＯＨ（１．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５４０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（７８０ｍｇ、１．０２ｍｌ、６．０３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中で樹脂に添加する。この溶液を２日間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄する。Ｆｍｏｃ基を除去するために、反応溶液をピペリジン／ＤＭＦ溶液（１：１、１１ｍｌ）中で、１回あたり１０分間ずつ撹拌し、ＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄して、樹脂に結合したＫｕＥ－６１７リガンドを得る。
【0104】
パミドロネートの合成
β－アラニン（１．５ｇ、０．０１７ｍｏｌ）およびリン酸（２．７６ｇ、０．０３４ｍｏｌ）をスルホラン（５．５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却する。三塩化リン（４．６２ｇ、２．９５ｍｌ、０．０３４ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。この溶液を７５℃で３時間撹拌する。水（１５ｍｌ）を添加し、混合物を１００℃で１２時間撹拌する。最後に、エタノール（１５ｍｌ）を添加し、０℃で３日間結晶化させることによって、パミドロネート産物（１．４８ｇ、０．００６ｍｏｌ、３７％）を黄色固体として得る。
1H NMR (300 MHz, D2O): δ [ppm] = 3.34 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.31 (tt, J = 13,7, 7.1 Hz, 2H).
13C NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 72.58; 36.14; 30.54.
31P NMR (121.5 MHz, D2O): δ [ppm] = 17.58 (s, 2P).
MS (ESI): 236.0 [M+H]+, C3H11NO7P2についての計算値: 235.07 [M]+.
β－アラニン（１．５ｇ、０．０１７ｍｏｌ）およびリン酸（２．７６ｇ、０．０３４ｍｏｌ）をスルホラン（５．５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却する。三塩化リン（４．６２ｇ、２．９５ｍｌ、０．０３４ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。この溶液を７５℃で３時間撹拌する。水（１５ｍｌ）を添加し、混合物を１００℃で１２時間撹拌する。最後に、エタノール（１５ｍｌ）を添加し、０℃で３日間結晶化させることによって、パミドロネート産物（１．４８ｇ、０．００６ｍｏｌ、３７％）を黄色固体として得る。
1H NMR (300 MHz, D2O): δ [ppm] = 3.34 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.31 (tt, J = 13,7, 7.1 Hz, 2H).
13C NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 72.58; 36.14; 30.54.
31P NMR (121.5 MHz, D2O): δ [ppm] = 17.58 (s, 2P).
MS (ESI): 236.0 [M+H]+, C3H11NO7P2についての計算値: 235.07 [M]+.
【0105】
パミドロネート－エチルスクエアレートの合成
パミドロネート（５００ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７、５ｍｌ）に溶解する。３，４－ジエトキシシクロブト－３－エン－１，２－ジオン（ジエチルスクエアレート、ＳＡＤＥ、５４２ｍｇ、４６８μｌ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２日間撹拌する。結晶化のためにエタノール（３ｍｌ）を添加する。この混合物をフリーザー内に３日間放置し、結晶化を完了させる。白色の沈殿を冷エタノールで洗浄し、パミドロネート－エチルスクエアレート産物（０．５８ｇ、１．６２ｍｏｌ、７６％）を白色固体として得る。
1H NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 4.79-4.62 (m, 2H), 3.31 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.32-2.15 (m, 2H), 1.42 (dt, J = 11.7, 7.2 Hz, 3H).
31P NMR (162 MHz, D2O): δ [ppm] = 17.92 (s), 2.26 (s).
MS (ESI): 360.0 [M+H]+, 720.0 2[M+H]+, 763.0 2[M+Na]+, C9H15NO10P2についての計算値: 359.16 [M]+.
パミドロネート（５００ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７、５ｍｌ）に溶解する。３，４－ジエトキシシクロブト－３－エン－１，２－ジオン（ジエチルスクエアレート、ＳＡＤＥ、５４２ｍｇ、４６８μｌ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２日間撹拌する。結晶化のためにエタノール（３ｍｌ）を添加する。この混合物をフリーザー内に３日間放置し、結晶化を完了させる。白色の沈殿を冷エタノールで洗浄し、パミドロネート－エチルスクエアレート産物（０．５８ｇ、１．６２ｍｏｌ、７６％）を白色固体として得る。
1H NMR (400 MHz, D2O): δ [ppm] = 4.79-4.62 (m, 2H), 3.31 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.32-2.15 (m, 2H), 1.42 (dt, J = 11.7, 7.2 Hz, 3H).
31P NMR (162 MHz, D2O): δ [ppm] = 17.92 (s), 2.26 (s).
MS (ESI): 360.0 [M+H]+, 720.0 2[M+H]+, 763.0 2[M+Na]+, C9H15NO10P2についての計算値: 359.16 [M]+.
【0106】
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（５０６ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４１５ｍｇ、０．００１１ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１４６ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２７７μｌ、２１１ｍｇ、０．００１６２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）に溶解し、３０分間撹拌する。ＫｕＥ－６１７樹脂（３００ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ、０．０９ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を室温で１日間撹拌する。樹脂をアセトニトリル（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）と混合し、後続の合成ステップのために用意しておく。
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（５０６ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４１５ｍｇ、０．００１１ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１４６ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２７７μｌ、２１１ｍｇ、０．００１６２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）に溶解し、３０分間撹拌する。ＫｕＥ－６１７樹脂（３００ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ、０．０９ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を室温で１日間撹拌する。樹脂をアセトニトリル（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）と混合し、後続の合成ステップのために用意しておく。
【0107】
Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂を、ＤＭＦとピペリジン（１：１、６ｍｌ）の混合物中で１時間撹拌する。Ｆｍｏｃ脱保護した樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄し、次のステップにおいて、さらなる精製を行わずに使用する。
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂を、ＤＭＦとピペリジン（１：１、６ｍｌ）の混合物中で１時間撹拌する。Ｆｍｏｃ脱保護した樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄し、次のステップにおいて、さらなる精製を行わずに使用する。
【0108】
ＤＯＴＡ（ｔＢｕ）３－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂
ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）（３１０ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０８ｍｇ、０．０００８１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１０ｍｇ、０．０００８１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１８４μｌ、１４０ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）に溶解し、３０分間撹拌する。Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂（４６１ｍｇ、０．０００２７ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を室温で１日間撹拌する。樹脂をアセトニトリル（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄し、次のステップにおいて、さらなる精製を行わずに使用する。
ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）（３１０ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０８ｍｇ、０．０００８１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１０ｍｇ、０．０００８１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１８４μｌ、１４０ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）に溶解し、３０分間撹拌する。Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂（４６１ｍｇ、０．０００２７ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を室温で１日間撹拌する。樹脂をアセトニトリル（１０ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）で洗浄し、次のステップにおいて、さらなる精製を行わずに使用する。
【0109】
ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＫｕＥ－６１７
ＤＯＴＡ（ｔＢｕ）３－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂（５３６ｍｇ、０．０００２７ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＴＦＡおよびジクロロメタンの溶液（１：１、４ｍｌ）中で撹拌する。ＴＦＡ／ジクロロメタン溶液を減圧下で濃縮し、セミ分取ＨＰＬＣ精製（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ１８ ＥＣ（２５０×１０ｍｍ）５ｍ、流速：５ｍｌ／分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５％ＭｅＣＮ均一濃度、ｔＲ＝１０．３分）を行って、産物（１０．６ｍｇ、０．００９１ｍｍｏｌ、４％）を無色粉末として得る。
MS (ESI): 1172.5 [M+2H]+, 585.9 1/2[M+2H]+, 391.0 1/3[M+2H]+, C55H83N11O17についての計算値: 1170.33 [M]+.
ＤＯＴＡ（ｔＢｕ）３－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＫｕＥ－６１７樹脂（５３６ｍｇ、０．０００２７ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＴＦＡおよびジクロロメタンの溶液（１：１、４ｍｌ）中で撹拌する。ＴＦＡ／ジクロロメタン溶液を減圧下で濃縮し、セミ分取ＨＰＬＣ精製（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ１８ ＥＣ（２５０×１０ｍｍ）５ｍ、流速：５ｍｌ／分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２５％ＭｅＣＮ均一濃度、ｔＲ＝１０．３分）を行って、産物（１０．６ｍｇ、０．００９１ｍｍｏｌ、４％）を無色粉末として得る。
MS (ESI): 1172.5 [M+2H]+, 585.9 1/2[M+2H]+, 391.0 1/3[M+2H]+, C55H83N11O17についての計算値: 1170.33 [M]+.
【0110】
ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７
スキーム３１（１０ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ）からの化合物（１４）およびパミドロネート－エチルスクエアレート（１６ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を、リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ９、１ｍｌ）に溶解し、２日間撹拌する。セミ分取ＨＰＬＣ精製（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ１８ ＥＣ（２５０×１０ｍｍ）５ｍ、流速：５ｍｌ／分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２０分間で２３％～２８％ＭｅＣＮ、ｔＲ＝８．２分）を行って、ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７産物（１０．５６ｍｇ、０．００７１ｍｍｏｌ、８４％）を無色粉末として得る。
MS (ESI): 511.3 1/3[M+H+2Na]+, 520.0 [1/3M+2K]+, 781.0 1/2[M+2K]+, C62H92N12O26P2についての計算値: 1483.42 [M]+.
スキーム３１（１０ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ）からの化合物（１４）およびパミドロネート－エチルスクエアレート（１６ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を、リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ９、１ｍｌ）に溶解し、２日間撹拌する。セミ分取ＨＰＬＣ精製（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ１８ ＥＣ（２５０×１０ｍｍ）５ｍ、流速：５ｍｌ／分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、２０分間で２３％～２８％ＭｅＣＮ、ｔＲ＝８．２分）を行って、ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７産物（１０．５６ｍｇ、０．００７１ｍｍｏｌ、８４％）を無色粉末として得る。
MS (ESI): 511.3 1/3[M+H+2Na]+, 520.0 [1/3M+2K]+, 781.0 1/2[M+2K]+, C62H92N12O26P2についての計算値: 1483.42 [M]+.
【0111】
ルテチウム－１７７によるＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７の放射性標識
放射性標識のために、０．０４Ｍ ＨＣｌ（ＩＴＧ，Ｇａｒｃｈｉｎｇ，ドイツ）中の［１７７Ｌｕ］ＬｕＣｌ３を使用する。放射標識は、１ｍｌの１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で、ｐＨ５．５で行う。反応は、異なる量の前駆体（５、１０および３０ｎｍｏｌ）を使用して、９５℃で、４０～５０ＭＢｑ ｎ．ｃ．ａ．のルテチウム－１７７で行う。反応は、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ シリカゲル６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋから入手）および移動相としてクエン酸緩衝液（ｐＨ４）移動相を使用して、およびＨＰＬＣ ７０００ Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍ分析装置（カラム：Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）ＲＰ－１８ｅ、１０分間で５～９５％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）／９５～５％水（０．１％ＴＦＡ））を使用した高圧液体クロマトグラフィーを使用してモニターした。ラジオ薄層クロマトグラフィーサンプルは、Ｅｌｙｓｉａ－Ｒａｙｔｅｓｔ（Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ、ドイツ）から入手したＴＬＣ Ｉｍａｇｅｒ ＣＲ－３５ Ｂｉｏ Ｔｅｓｔイメージング装置を使用して、ＡＩＤＡソフトウェアで測定および評価する。
放射性標識のために、０．０４Ｍ ＨＣｌ（ＩＴＧ，Ｇａｒｃｈｉｎｇ，ドイツ）中の［１７７Ｌｕ］ＬｕＣｌ３を使用する。放射標識は、１ｍｌの１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で、ｐＨ５．５で行う。反応は、異なる量の前駆体（５、１０および３０ｎｍｏｌ）を使用して、９５℃で、４０～５０ＭＢｑ ｎ．ｃ．ａ．のルテチウム－１７７で行う。反応は、ラジオ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ シリカゲル６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋから入手）および移動相としてクエン酸緩衝液（ｐＨ４）移動相を使用して、およびＨＰＬＣ ７０００ Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍ分析装置（カラム：Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）ＲＰ－１８ｅ、１０分間で５～９５％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）／９５～５％水（０．１％ＴＦＡ））を使用した高圧液体クロマトグラフィーを使用してモニターした。ラジオ薄層クロマトグラフィーサンプルは、Ｅｌｙｓｉａ－Ｒａｙｔｅｓｔ（Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ、ドイツ）から入手したＴＬＣ Ｉｍａｇｅｒ ＣＲ－３５ Ｂｉｏ Ｔｅｓｔイメージング装置を使用して、ＡＩＤＡソフトウェアで測定および評価する。
【0112】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性研究
１７７Ｌｕ標識化合物の安定性研究は、ヒト血清（ＨＳ、ＡＢヒト男性血漿、ＵＳＡ起源、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で行う。５ＭＢｑの放射活性化合物を０．５ｍｌの媒体中で１４日間インキュベートする。異なる時間（１時間、２時間、５時間、１日、２日、５日、７日、９日および１４日）に試料の一部を取り、放射化学的安定性を決定する。各測定は、３回同じ方法で行う。
１７７Ｌｕ標識化合物の安定性研究は、ヒト血清（ＨＳ、ＡＢヒト男性血漿、ＵＳＡ起源、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で行う。５ＭＢｑの放射活性化合物を０．５ｍｌの媒体中で１４日間インキュベートする。異なる時間（１時間、２時間、５時間、１日、２日、５日、７日、９日および１４日）に試料の一部を取り、放射化学的安定性を決定する。各測定は、３回同じ方法で行う。
【0113】
親油性の決定
各化合物のＬｏｇＤ７．４を、ｎ－オクタノールとＰＢＳにおける分配係数によって決定する。標識溶液をｐＨ７．４に調節し、５ＭＢｑを７００μｌのｎ－オクタノールおよび７００μｌのＰＢＳで希釈する。これを１５００ｒｐｍで２分間振盪し、次いで遠心する。４００μｌのｎ－オクタノール相および４００μｌのＰＢＳ相を、それぞれ新しいエッペンドルフチューブに移した。次いで、３～６μｌをＴＬＣプレートにピペットで乗せ、蛍光イメージング装置を使用して分析する。ｌｏｇＤ７．４を、２つの相の活性の比率に基づいて計算する。各相の測定は、３つのｌｏｇＤ７．４値を得ることができ、平均値が計算できるように、より高い活性のサンプルを使用して、さらに２回繰り返す。
各化合物のＬｏｇＤ７．４を、ｎ－オクタノールとＰＢＳにおける分配係数によって決定する。標識溶液をｐＨ７．４に調節し、５ＭＢｑを７００μｌのｎ－オクタノールおよび７００μｌのＰＢＳで希釈する。これを１５００ｒｐｍで２分間振盪し、次いで遠心する。４００μｌのｎ－オクタノール相および４００μｌのＰＢＳ相を、それぞれ新しいエッペンドルフチューブに移した。次いで、３～６μｌをＴＬＣプレートにピペットで乗せ、蛍光イメージング装置を使用して分析する。ｌｏｇＤ７．４を、２つの相の活性の比率に基づいて計算する。各相の測定は、３つのｌｏｇＤ７．４値を得ることができ、平均値が計算できるように、より高い活性のサンプルを使用して、さらに２回繰り返す。
【0114】
１７７
Ｌｕ標識化合物のヒドロキシアパタイト親和性の測定
ヒドロキシアパタイト（２０ｍｇ）を、生理食塩水（１ｍｌ）中で２４時間インキュベートする。５０μｌの放射性トレーサー［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７（５ＭＢｑ）または［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７（５ＭＢｑ）を添加する。各懸濁液をボルテックスミキサーで２０秒間ボルテックスし、室温で１時間インキュベートする。各懸濁液をフィルター（ＣＨＲＯＭＡＦＩＬ（登録商標）Ｘｔｒａ ＰＴＦＥ－４５／１３）に通し、上清を水（５００μｌ）で洗浄する。液体、および得られたＨＡＰ含有上清の放射活性を、各ケースにおいて、キュリーメーター（Ｉｓｏｍｅｄ２０１０ ａｃｔｉｖｉｍｅｔｅｒ、ＭＥＤ Ｎｕｃｌｅａｒ－Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ Ｄｒｅｓｄｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して測定する。［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７および［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７の結合を、ＨＡＰに吸着された活性の割合（パーセント）として決定する。参照として、遊離Ｌｕ－１７７のＨＡＰ結合を、同様のやり方で測定する。比較測定を、ブロッキングされたヒドロキシアパタイトで、同様のやり方で行う。この目的のために、生理食塩水溶液（１ｍｌ）中のＨＡＰ（２０ｍｇ）を、パミドロネート（１００ｍｇ）とインキュベートし、［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７および遊離Ｌｕ－１７７の活性をそれぞれ決定する。
ヒドロキシアパタイト（２０ｍｇ）を、生理食塩水（１ｍｌ）中で２４時間インキュベートする。５０μｌの放射性トレーサー［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７（５ＭＢｑ）または［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７（５ＭＢｑ）を添加する。各懸濁液をボルテックスミキサーで２０秒間ボルテックスし、室温で１時間インキュベートする。各懸濁液をフィルター（ＣＨＲＯＭＡＦＩＬ（登録商標）Ｘｔｒａ ＰＴＦＥ－４５／１３）に通し、上清を水（５００μｌ）で洗浄する。液体、および得られたＨＡＰ含有上清の放射活性を、各ケースにおいて、キュリーメーター（Ｉｓｏｍｅｄ２０１０ ａｃｔｉｖｉｍｅｔｅｒ、ＭＥＤ Ｎｕｃｌｅａｒ－Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ Ｄｒｅｓｄｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して測定する。［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７および［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＰＳＭＡ－６１７の結合を、ＨＡＰに吸着された活性の割合（パーセント）として決定する。参照として、遊離Ｌｕ－１７７のＨＡＰ結合を、同様のやり方で測定する。比較測定を、ブロッキングされたヒドロキシアパタイトで、同様のやり方で行う。この目的のために、生理食塩水溶液（１ｍｌ）中のＨＡＰ（２０ｍｇ）を、パミドロネート（１００ｍｇ）とインキュベートし、［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７および遊離Ｌｕ－１７７の活性をそれぞれ決定する。
【0115】
ＰＳＭＡ結合親和性のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
非放射性（コールド）の［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ複合体を、標識前駆体ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７（３７１μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２５０ｎｍｏｌ）を含有する溶液とＬｕＣｌ３（１２９μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、３７５ｎｍｏｌ、金属と標識前駆体の比１．５：１）を、１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で、９５℃で２時間振盪することによって調製する。複合体の形成を、ＥＳＩ－ＬＣ／ＭＳによってモニターする。
非放射性（コールド）の［ｎａｔＬｕ］Ｌｕ複合体を、標識前駆体ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７（３７１μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２５０ｎｍｏｌ）を含有する溶液とＬｕＣｌ３（１２９μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、３７５ｎｍｏｌ、金属と標識前駆体の比１．５：１）を、１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で、９５℃で２時間振盪することによって調製する。複合体の形成を、ＥＳＩ－ＬＣ／ＭＳによってモニターする。
【0116】
ＰＳＭＡ結合親和性を、Ｂｅｎｅｓｏｖａらによって記述されている競合放射性リガンドアッセイ（Ｂｅｎｅｓｏｖａ，Ｍ．；Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｍ．；Ｂａｕｄｅｒ－Ｗｕｓｔ，Ｕ．；Ａｆｓｈａｒ－Ｏｒｏｍｉｅｈ，Ａ．；Ｋｒａｔｏｃｈｗｉｌ，Ｃ．；Ｍｉｅｒ，Ｗ．；Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ，Ｕ．；Ｋｏｐｋａ，Ｋ．；Ｅｄｅｒ，Ｍ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔａｉｌｏｒ－Ｍａｄｅ ＤＯＴＡ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＳＭＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｏｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｄｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１５，５６（６），９１４－９２０．）によって決定する。この目的のために、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手したＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、５％ＣＯ２中、３７℃で培養する。ＬＮＣａＰ細胞を、次第に濃度を高めた標識前駆体を含有する溶液と、０．７５ｎＭ［６８Ｇａ］Ｇａ－ＰＳＭＡ－１０存在下で、４５分間インキュベートする。遊離放射活性を、氷冷ＰＢＳで数回洗浄することによって除去する。得られたサンプルを、ガンマカウンター（（２４８０ＷＩＺＡＲＤ２自動ガンマカウンター、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）内で測定する。測定データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９で、非線形回帰を用いて評価する。
【0117】
ｅｘ ｖｉｖｏ研究
全ての動物実験は、Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ－Ｐａｌａｔｉｎａｔｅ州の倫理委員会（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚ［動物保護法］のセクション８、第１パラグラフに従う、Ｌａｎｄｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｍｔ［Ｓｔａｔｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅ］）によって承認を受け、関連する連邦法および施設ガイドラインに従って行った（承認番号２３ １７７－０７／Ｇ ２１－１－０２２）。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＲｊ雄性マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）に、２００μｌの１：１（ｖ／ｖ）マトリゲル／ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）中の５×１０6個のＬＮＣａＰ細胞を皮下接種した。測定は、腫瘍の体積が約１００ｃｍ３に達した後に行った。ＬＮＣａＰ腫瘍担持マウスを２％イソフルランで麻酔した後、０．５ｎｍｏｌの［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７を静脈内注射した。比放射能は、約３ＭＢｑ／ｎｍｏｌであった。ＰＳＭＡ選択性は、マウス１匹あたり１．５ｍｍｏｌのＰＭＰＡを同時注射することによって調べた。動物は、注射の２４時間後に屠殺した。器官を回収し、秤量した。放射活性を測定し、組織質量１グラムあたりの、注射した線量の減衰補正した割合（パーセント）（％ＩＤ／ｇ）として計算した。
全ての動物実験は、Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ－Ｐａｌａｔｉｎａｔｅ州の倫理委員会（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚ［動物保護法］のセクション８、第１パラグラフに従う、Ｌａｎｄｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｍｔ［Ｓｔａｔｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅ］）によって承認を受け、関連する連邦法および施設ガイドラインに従って行った（承認番号２３ １７７－０７／Ｇ ２１－１－０２２）。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＲｊ雄性マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）に、２００μｌの１：１（ｖ／ｖ）マトリゲル／ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）中の５×１０6個のＬＮＣａＰ細胞を皮下接種した。測定は、腫瘍の体積が約１００ｃｍ３に達した後に行った。ＬＮＣａＰ腫瘍担持マウスを２％イソフルランで麻酔した後、０．５ｎｍｏｌの［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＤＯＴＡ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＳＡ．Ｐａｍ）－ＫｕＥ－６１７を静脈内注射した。比放射能は、約３ＭＢｑ／ｎｍｏｌであった。ＰＳＭＡ選択性は、マウス１匹あたり１．５ｍｍｏｌのＰＭＰＡを同時注射することによって調べた。動物は、注射の２４時間後に屠殺した。器官を回収し、秤量した。放射活性を測定し、組織質量１グラムあたりの、注射した線量の減衰補正した割合（パーセント）（％ＩＤ／ｇ）として計算した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】