特表 2024-504645 放射線誘発性疾患を予防、改善、又は軽減するプテロスチルベン及びシリビニン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-01

(54)【発明の名称】放射線誘発性疾患を予防、改善、又は軽減するプテロスチルベン及びシリビニン

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/357 20060101AFI20240125BHJP

   A61P 39/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20240125BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20240125BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240125BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 31/085 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 8/34 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20240125BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20240125BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20240125BHJP

   A61Q 19/06 20060101ALN20240125BHJP

   A61K 47/54 20170101ALN20240125BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20240125BHJP

【ＦＩ】

A61K31/357

A61P39/00

A61Q17/04

A61Q19/08

A61Q19/00

A61P43/00 111

A61P25/28

A61P9/00

A61P11/00

A61P3/00

A61P43/00 105

A61P25/16

A61P25/14

A61P25/00

A61P21/00

A61P13/12

A61P9/10

A61P9/12

A61P25/02

A61P3/10

A61P17/00

A61P17/16

A61P17/10

A61P17/06

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/08

A61K31/706

A61K31/085

A61K8/34

A61K8/49

A23L33/10

A23L33/18

A61Q19/06

A61K47/54

C07K7/06 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023542925

(86)(22)【出願日】2022-01-18

(85)【翻訳文提出日】2023-09-08

(86)【国際出願番号】 EP2022051038

(87)【国際公開番号】W WO2022152943

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】21382036.8

(32)【優先日】2021-01-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519098394

【氏名又は名称】ウニベルシタ デ バレンシア

(71)【出願人】

【識別番号】520075188

【氏名又は名称】インスティテュート デ インベスティガシオン サニタリア ラ フェ－フンダシオン パラ ラ インベスティガシオン デル ホスピタル ウニベルシタリオ イ ポリテクニコ ラ フェ デ ラ コミュニダ バレンシアナ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】エストレラ アリギュエル ホセ マリア

(72)【発明者】

【氏名】オブラドール プラ マリア エレナ

(72)【発明者】

【氏名】サルヴァドール パーマー マリア ロサリオ

(72)【発明者】

【氏名】モントーロ パストル アレグリア

【テーマコード（参考）】

4B018

4C076

4C083

4C084

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B018LB01

4B018LB02

4B018LB03

4B018LB04

4B018LB07

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4C206ZC41

4C206ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA15

(57)【要約】

本発明は、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩との組合せを含む組成物、及び被験体における電離放射線によって誘発される疾患の処置、予防、改善、又は軽減におけるそれらの使用に関する。上記組成物及び上記使用は、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物、好ましくはＮＡＤ^＋ブースター及び／又はＦＳＬ－１を更に含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを含む組成物。

【請求項2】

前記組成物は、好ましくは、
ａ．ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、
ｂ．線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又は、
それらのあらゆる塩、
から選択される少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物を更に含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物を更に含み、ここで、前記少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又はそれらのあらゆる塩である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又は前記シリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物は、医薬組成物、栄養補強食品組成物、美容組成物、又は食品組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減において使用される、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩と組み合わされたプテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩であって、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に投与され、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを前記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩。

【請求項8】

プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、単独の医薬組成物又は別個の医薬組成物において投与される、請求項７に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項9】

プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩の投与は、局所、経口、又は非経口である、請求項７又は８に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項10】

プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、放射線照射前及び／又は放射線照射後、又はその両方で、同時に又は逐次的に数回投与される、請求項７～９のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項11】

前記組合せは、放射線防護効果を提供することができる投与量で存在する、請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項12】

前記使用は、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩、及びｃ）少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩の前記被験体への同時の又は逐次的な投与として理解される、請求項７～１１のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項13】

前記少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である、請求項１２に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項14】

前記使用は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここで、前記少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である、請求項１３に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項15】

前記ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項16】

電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連する、請求項７～１５のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項17】

電離放射線によって誘発される疾患は、急性放射線症候群及び／又は慢性放射線症候群である、請求項７～１６のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項18】

前記電離放射線は、ガンマ線又はＸ線である、請求項７～１７のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項19】

前記プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又は前記シリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、請求項７～１８のいずれか一項に記載の使用されるプテロスチルベン。

【請求項20】

プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せの非治療的な美容的使用であって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを前記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、非治療的な美容的使用。

【請求項21】

前記使用は、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大といったヒトの皮膚及び口唇に対する日光の有害効果を防護、改善、及び／又は軽減することである、請求項２０に記載の非治療的な美容的使用。

【請求項22】

増加を必要とする患者におけるサーチュインの細胞内レベルを増加させるのに使用される、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、前記増加は、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せでの処置前の同じ患者におけるサーチュインの細胞内レベルと比較したものである、組合せ。

【請求項23】

前記増加を必要とする患者は、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、又は加齢関連障害を患っている患者である、請求項２２に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項24】

前記障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項25】

栄養補強食品組成物として使用される、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、組合せ。

【請求項26】

栄養補強食品組成物としての使用は、電離放射線によって誘発される疾患の処置若しくは予防のため、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、若しくは加齢関連障害の処置若しくは予防のため、及び／又はヒトの皮膚若しくは口唇に対する日光の有害効果の防護若しくは修復のためのものである、請求項２５に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項27】

電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連する、請求項２６に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項28】

前記神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、又は加齢関連障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項29】

ヒトの皮膚又は口唇に対する日光の有害効果は、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大、セルライト形成、ニキビ形成、酒さ、乾癬、及び湿疹からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せ。

【請求項30】

少なくともプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩と、任意に少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物とを含む少なくとも２つの受容器を含むパーツのキット。

【請求項31】

任意の少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、
ａ．ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、
ｂ．線維芽細胞刺激性リポペプチド、又は、
それらのあらゆる薬学的に許容可能な塩、
の群から選択される、請求項３０に記載のパーツのキット。

【請求項32】

前記ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、請求項３１に記載のパーツのキット。

【請求項33】

前記プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又は前記シリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、請求項２７又は２８に記載のパーツのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医療の分野に関する。特に、本発明は、放射線誘発性疾患を予防、改善、又は軽減する組成物及び方法の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、電離放射線は様々な医療目的に使用されている。Ｘ線及びγ線は、主にＤＮＡ及びその他の細胞標的の直接的な電離と、活性酸素種（ＲＯＳ）を介した間接的な効果とによって細胞に損傷を与える。γ線とＸ線との間の違いはこれらの生成の仕方である。ガンマ線は、放射性核種の励起核が放射性崩壊を経た後の沈静化過程に由来するのに対して、Ｘ線は、電子がターゲットに衝突する際、又は電子が原子内で再配列する際に生成される。Ｘ線及びγ線はどちらも高エネルギー（高周波）電磁放射線の一種である。これらは電荷も質量も有しないエネルギーの塊（光子）である。Ｘ線及びγ線はどちらも同じ特性及び健康への影響を有する。

【0003】

Ｘ線及びγ線を含む電磁放射線は、ＤＮＡ及びその他の分子の電離によって直接的に、また活性酸素種の生成によって間接的に細胞に損傷を与える。放射線曝露に対する応答は、細胞型及び放射線線量、固有の組織感受性及び組織修復、並びに細胞周期状態、Ｏ_２圧、並びにチオール及びその他の抗酸化物質のレベルを含む細胞内因子の調節によって異なる。しかしながら、放射線防護及び放射線緩和の方略は不足しており、非効率的である。毎年、何百万人もの癌患者がその処置の過程の間に放射線療法を受けており、近年、一部の放射線事象又は原子力事象が人々に脅威をもたらしているため、放射線防護又は放射線緩和の方略が必要とされる。

【0004】

有害な放射線への曝露に対する防護剤の開発は、数十年にもわたる精力的な調査対象となっている。効果的で安全な放射線防護剤は存在していない。現在まで、造血器及び消化管の急性放射線症候群（ＡＲＳ）を引き起こす電離放射線等の高レベルの電離放射線曝露を処置する薬物は開発されていない。

【0005】

放射線防護剤は、放射線によって引き起こされる直接的な損傷を軽減することができる化合物である。放射線緩和剤は、放射線が照射された後でも毒性を最小限に抑えることができる化合物である。概して、理想的な放射線防護剤又は放射線緩和剤は、安定であるべきであり、容易に投与することができ、関連毒性を有さず、急性毒性若しくは遅発性毒性が線量制限的であるか、又は生活の質の大幅な低下の要因（例えば、粘膜炎、肺炎、脊髄症、口腔乾燥症、直腸炎、線維症、又は白質脳症の原因）となるような感受性があるとみなされる正常組織を防護するべきである。

【0006】

幅広い植物性化学物質（一般に植物の生長を助ける、又は競争者、捕食者、若しくは病原体を阻止するのに植物によって生成される化合物）は抗酸化物質であり、したがって潜在的に放射線防護性である。しかしながら、それらの放射線防護特性又は放射線緩和剤特性が通常有効であるのは短期間であり、通常は放射線発生後最大１ヶ月に限定される。したがって、継続的な期間にわたって被験体における放射線の有害効果を処置、軽減、予防、又は改善することができる新しい化合物及び組成物が望まれる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、放射線曝露によって引き起こされる疾患の長期防護及び緩和のための組成物及びその使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】Ａ）全身γ線照射を受けたスイスアルビノマウスにおける３０日間生存試験についての放射線線量－応答を示す図である。Ｂ）γ線（ＬＤ５０／３０）及び様々な用量のプテロスチルベン（ＰＴ）で処置されたマウスの６０日間生存率を示す図である。アミフォスチンをコントロールの承認放射線防護剤として使用した。Ｃ）γ線（ＬＤ５０／３０）及び様々な用量のレスベラトロール（Ｒｅｓｖ）で処置されたマウスの６０日間生存率を示す図である。化合物を経口投与した。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図2】Ａ）照射６日後、Ｂ）照射３０日後、及びＣ）照射６０日後にγ放射線（ＬＤ５０／３０）によって誘発される致死性を予防するプテロスチルベン（ＰＴ）及び他のポリフェノールの組合せを示す図である。公表された最大非毒性用量から各植物性化学物質についての用量を選択した。化合物を経口投与した。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図3】Ａ）全身γ線照射（ＬＤ５０／３０）を受けたマウスの長期生存に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の組合せの効果を示す図である。Ｂ）ＰＴ及びＳＩＬの組合せによって引き出される放射線防護：γ線照射の前又は後のポリフェノールの投与間の比較を示す図である。化合物をＩＰ投与した。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図4】Ａ）γ線照射（ＬＤ５０／３０）されたマウスの生存に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の効果、並びに体重に対する効果を示す図である。Ｂ）マウスにおける神経運動機能の全身γ放射線誘発性の変化に対するＰＴ及びＳＩＬの投与の効果を示す図である。化合物をＩＰ経由で投与した。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図5】分離された細胞における様々な抗酸化防御関連酵素活性のγ放射線誘発性の酸化的損傷発現（ＲＴ－ＰＣＲ）に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の防護効果を示す図である。ＧＣＬ、γ－グルタミル－システインリガーゼ；ＧＰＸ、グルタチオンペルオキシダーゼ；ＣＡＴ、カタラーゼ；ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ；ＥＩＣ、腸上皮細胞。コントロール（未処置）細胞（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）の発現率に対する倍率変化。

【図6】様々な分子マーカーにおけるγ放射線誘発性の酸化的損傷に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の防護効果を示す図である。Ａ）８－ＯＨｄＧ、Ｂ）８－イソプロスタン、及びＣ）タンパク質カルボニル（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）。

【図7】Ａ）γ－グルタミル－システインリガーゼ、Ｂ）グルタチオンにおけるグルタチオン関連抗酸化防御におけるγ放射線誘発性の酸化的損傷に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の防護効果（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）を示す図である。

【図8】様々な抗酸化防御関連酵素活性：Ａ）カタラーゼ、Ｂ）グルタチオンペルオキシダーゼ、並びにＣ）及びＤ）スーパーオキシドジスムターゼ１及びスーパーオキシドジスムターゼ２におけるγ放射線誘発性の酸化的損傷に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の防護効果（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）を示す図である。

【図9】γ線照射（ＬＤ５０／３０）誘発性の死亡率に対するニコチンアミドリボシド（ＮＲ）及び線維芽細胞刺激性リポペプチド（ＦＳＬ－１）の効果を示す図である。ＮＲを、照射のすぐ後（６０分）から開始して１日１回の単回用量（経口）で３０日間毎日投与した。ＦＳＬ－１を、照射２４時間後に１回だけＩＰ投与した。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図10】処置されたマウス及び照射されたマウス（全ての場合において１群当たり６匹のマウス）の循環血液中のＡ）プテロスチルベン（ＰＴ）、Ｂ）シリビニン（ＳＩＬ）、及びＣ）ＮＡＤ^＋のレベルを示す図である。

【図11】プテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の放射線防護性の組合せへの、潜在的な放射線緩和剤（ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）及び線維芽細胞刺激性リポペプチド－１（ＦＳＬ－１））の添加を示す図である。Ａ）投与スキーム、Ｂ）日数での照射後の時間に対する生存。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを使用した。

【図12】γ線照射されたマウスにおける死因（ＬＤ５０／３０）、並びに放射線防護剤及び放射線緩和剤（ＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１）の組合せ投与の効果を示す図である。全ての場合において、１群当たり２０匹のマウスを研究した。

【図13】Ａ）成長中のヒトＡ５４９（肺腺癌）及びＢ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳癌）異種移植片への放射線防護性／放射線緩和性の組合せＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＳＬ－１（ＰＳＮＦ）及びＸ線の組合せ投与を示す図である。全ての場合において、１群当たり５匹のマウスを使用した。

【図14】γ線照射されたマウスにおける細胞ＮＡＤ^＋含有量、ＤＮＡ損傷、及び造血回復に対する放射線防護剤及び放射線緩和剤の効果を示す図である。Ａ）γ線照射されたマウスから分離された細胞のＮＡＤ^＋含有量に対するＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の特異的非競合的阻害剤ＦＫ８６６の効果（群、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）。ＦＫ８６６をｉｎ ｖｉｖｏで投与した（１５ｍｇ／ｋｇ、照射の３日前から開始して腹腔内注射により１日２回を６日間、図１１ａを参照のこと）。ＦＫ８６６は細胞培養物中にも存在した（１００ｎＭ）。照射の７２時間後に細胞を分離した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋γ線で処置されたマウス又はＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＫ８６６＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している）。Ｂ）細胞ＮＡＭＰＴ活性に対するＦＫ８６６の効果（Ｐ＜０．０１；^＊ＦＫ８６６で処置されたマウスをコントロールに対して比較している、ｎ＝５）。上記（ａ）のようにマウスを阻害剤で６日間処置した。Ｃ）γ線照射されたマウスから分離された細胞におけるＤＮＡ損傷に対するＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＫ８６６の効果（群、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をγ線照射されたコントロールに対して比較している；^＋γ線照射され、ＦＫ８６６が存在する群をそれらの各コントロールに対して比較している）。上記（ａ）のようにマウスを処置し、細胞を分離した。Ｄ）γ線照射されたマウスにおける造血回復に対するＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１の効果。造血コロニー形成細胞ＣＦＵ－ＧＭ（コロニー形成単位－顆粒球、マクロファージ）及びＣＦＵ－ＧＥＭＭ（コロニー形成単位－顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）を、コントロール及び処置されたマウスから摘出された大腿骨において定量化した（群及び処置ごとにｎ＝５）。マウスを図１１ａのように処置し、照射の７日後に骨髄細胞を分離した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋様々な処置＋γ線照射をγ線照射単独に対して比較している）。

【図15】Ｎｒｆ２依存性機構、ＮＦ－κＢ依存性機構、ＰＡＲＰ１依存性機構、及びＰＧＣ１α依存性機構に対するプテロスチルベン及びシリビニンによる処置の効果を示す図である。照射のすぐ前に、図１１ａに示されるプロトコルを受けたマウスから腸上皮細胞を分離した。Ａ）核抽出物中のｐ６５ＮＦ－κＢ、Ｎｒｆ２、ＰＡＲＰ１、及びＳｉｒｔ１、ミトコンドリア抽出物中のＳｉｒｔ３、並びに全抽出物中のリン酸化ＰＧＣ－１αを検出するためのウェスタンブロット。デンシトメトリー分析（ウェスタンブロット）は、分子及び実験条件ごとに５匹又は６匹の異なるマウスについての平均値±ＳＤを表す（Ｐ＜０．０１；^＊ＰＴ、ＳＩＬ、又はＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスを生理的食塩水、ＰＳで処置されたマウスに対して比較している、^＋ＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスをＰＴで処置されたマウスに対して比較している、^＃ＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスをＳＩＬで処置されたマウスに対して比較している）。Ｂ）潜在的な分子相互作用及び異なるシグナル伝達機構間の相互関係。Ｕｂ、ユビキチン；ＩｋＢ、Ｂ細胞阻害剤におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子；Ｋｅａｐ１、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１；ＲＥ、応答要素；ＡＲＥ、抗酸化剤応答要素；ＭＡＦ、筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログ；Ａｃ、アセチル化；ＩＭＦ、炎症媒介因子。Ｃ）特定のシグナル伝達関連分子の遺伝子サイレンシング。この図は、ｎ＝５又は６の異なる実験及び実験条件についての代表的な実験を示している。ＰＳ、生理的食塩水。Ｄ）分離されたＩＥＣを特定のｓｉＲＮＡの存在下又は不存在下で２４時間培養し、その後、γ線（ｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用したのと同じ線量）を照射した。細胞死を、「方法」で記載されるように、分離され培養されたＩＥＣ細胞において、γ線照射の１２時間後に分析した。ＰＴ（２０μＭ）及びＳＩＬ（１５μＭ）は、ＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスから分離されたＩＥＣを含む培養物中に存在した。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ処置によって誘導される効果をｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で保持することができた。データは、分子及び実験条件ごとに４回又は５回の異なる実験についての平均値±ＳＤである（ｐ＜０．０１；^＊ＰＳ下で又はＰＴ＋ＳＩＬ下で、特定のｓｉＲＮＡによる処置をコントロール（ビヒクルでの処置）に対して比較している；ｐ＜０．０１；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ下でのデータをＰＳ下でのそれらの同等のデータに対して比較している）。

【発明を実施するための形態】

【0009】

発明の簡単な説明
１つの態様において、本発明は、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、好ましくは、ａ）ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、ｂ）線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又は、それらのあらゆる塩から選択される少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物を更に含む。

【0010】

好ましくは、組成物は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物を更に含み、ここで、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又はそれらのあらゆる塩である。

【0011】

好ましくは、プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である。好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである。

【0012】

好ましくは、組成物は、医薬組成物、栄養補強食品組成物、美容組成物、又は食品組成物である。

【0013】

更なる態様において、本発明は、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減において使用される、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩と組み合わされたプテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩であって、投与は、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に行われ、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩に関する。

【0014】

好ましくは、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、単独の医薬組成物又は別個の医薬組成物において投与される。好ましくは、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩の投与は、局所、経口、又は非経口である。

【0015】

好ましくは、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、放射線照射前及び／又は放射線照射後、又はその両方で、同時に又は逐次的に数回投与される。好ましくは、組合せは、放射線防護効果を提供することができる投与量で存在する。

【0016】

好ましくは、使用は、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩、及びｃ）少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩の上記被験体への同時の又は逐次的な投与として理解される。

【0017】

好ましくは、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である。

【0018】

好ましくは、使用は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここで、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である。好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである。

【0019】

好ましくは、電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連するものであり、より好ましくは、急性放射線症候群及び／又は慢性放射線症候群である。

【0020】

好ましくは、電離放射線は、ガンマ線又はＸ線である。

【0021】

好ましくは、プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である。

【0022】

更なる態様において、本発明は、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せの非治療的な美容的使用であって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、非治療的な美容的使用に関する。好ましくは、使用は、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大等のヒトの皮膚及び口唇に対する日光の有害効果を防護、改善、及び／又は軽減するためのものである。

【0023】

更なる態様において、本発明は、増加を必要とする患者におけるサーチュインの細胞内レベルを増加させるのに使用される、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、上記増加は、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せでの処置前の同じ患者におけるサーチュインの細胞内レベルと比較したものである、組合せに関する。好ましくは、増加を必要とする患者は、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、又は加齢関連障害を患っている患者である。好ましくは、障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される。

【0024】

更なる態様において、本発明は、栄養補強食品組成物として使用される、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、組合せに関する。好ましくは、栄養補強食品組成物としての使用は、電離放射線によって誘発される疾患の処置若しくは予防のため、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝性障害、若しくは加齢関連障害の処置若しくは予防のため、及び／又はヒトの皮膚若しくは口唇に対する日光の有害効果の防護若しくは修復のためのものである。好ましくは、電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連するものである。好ましくは、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、又は加齢関連障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される。好ましくは、ヒトの皮膚又は口唇に対する日光の有害効果は、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大、セルライト形成、ニキビ形成、酒さ、乾癬、及び湿疹からなる群から選択される。

【0025】

更なる態様において、本発明は、少なくともプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩と、任意に少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物とを含む少なくとも２つの受容器を含むパーツのキットに関する。好ましくは、任意の少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ａ）ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、ｂ）線維芽細胞刺激性リポペプチド、又は、それらのあらゆる薬学的に許容可能な塩の群から選択される。好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである。好ましくは、プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である。

【0026】

発明の説明
一般的な定義
本明細書において使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、文脈上特段の明示がない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。さらに、特段の指示がない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、一連の中の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、日常の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、又は把握することができるであろう。そのような均等物は、本発明により包含されることが意図される。

【0027】

「約」という用語は、所与の量又は数量に適用される場合、プラス又はマイナス５パーセントの偏差を含むことが意図される。

【0028】

本明細書において使用される場合、多数の列挙された要素間の接続語「及び／又は」は、個別の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」により接続されている場合、１つ目の選択肢は１つ目の要素を２つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。２つ目の選択肢は２つ目の要素を１つ目の要素を除いて適用可能であることを指す。３つ目の選択肢は１つ目の要素と２つ目の要素とを一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つがその意味の範囲内に含まれ、したがって本明細書において使用される「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。２つ以上の選択肢を同時に適用可能であることもその意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。

【0029】

本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特段の必要がない限り、「～を含む（comprise）」という語、並びに「～を含む（comprises）」及び「～を含む（comprising）」等の別形は、指定された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、あらゆる他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群も除外しないことを意味するものと理解されるであろう。本明細書において使用される場合、「～を含む（comprising）」という用語を、「～を含有する（containing）」若しくは「～を含む（including）」という用語で置き換えることができ、又は本明細書において使用される場合、時には「～を有する（having）」という用語で置き換えることができる。上述の用語（～を含む（comprising）、～を含有する（containing）、～を含む（including）、～を有する（having））のいずれも、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書で使用されるときはいつでも、「～からなる（consisting of）」という用語で置き換えることができるが、これはあまり好ましくない。

【0030】

本明細書において使用される場合、「～からなる（consisting of）」は、クレームの要素に特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。本明細書において使用される場合、「本質的に～からなる（consisting essentially of）」は、クレームの基本的な特徴及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。

【0031】

本明細書において使用される「疾患」という用語は、「病理」、「障害」、及び「病態」（病状等）という用語と、これら全てが正常な機能を損ない、典型的には、特徴的な兆候及び症状によって現れる身体又はその部分の１つの異常な状態を反映するという点でほぼ同義であることが意図され、これらと区別なく使用される。

【0032】

本明細書において言及される「治療的有効量」は、被験体に投与された場合に、条件付きの状態のそのような処置を行うのに十分な化合物の量として定義される。「治療的有効量」は、化合物、及び処置される病態、被験体の年齢及び相対的健康、投与経路及び投与形態、当業者の判断、並びにその他の要因に応じて変動し得る。

【0033】

本明細書において使用される「処置」という用語は、疾患又は傷害に対して患者に与えられる医療ケアを指す。この用語は、疾患の治癒だけでなく、上記疾患の症状を改善、緩和、又は軽減することも含む。したがって、本明細書において使用される「治療的処置」又は「処置」という用語は、身体を病理学的状態又は疾患からその正常な健康状態に戻すことを指す。本明細書において使用される「治療的処置」又は「処置」という用語はまた、被験体における放射線の有害効果の緩和、改善、若しくは軽減、又はそのような効果に関連する症状を何らかの方法で軽減することを指す。本明細書において使用される「予防的処置」という用語は、病理学的状態を予防することを指す。

【0034】

「予防」とは、疾患の発生を防ぐことを意味する。「改善」とは、患者の疾患を良くすること、又は上記疾患を矯正する若しくは少なくともより許容可能にする努力をする行動を意味する。「軽減」又は「緩和」とは、疾患の重症度、重篤度、又は痛みを減らすことを意味する。

【0035】

本明細書において使用される「被験体」という用語は、哺乳動物被験体を指す。好ましくは、被験体は、ヒト、伴侶動物、非家畜、又は動物園の動物から選択される。例えば、被験体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、クマ等から選択され得る。好ましい実施形態において、上記哺乳動物被験体は、ヒト被験体である。

【0036】

「電離放射線」とは、通り抜ける媒体中で電離を引き起こすのに十分なエネルギーを有する粒子、Ｘ線、又はガンマ線からなる放射線を意味する。「γ線」又は「γ放射線」とは、原子核の放射性崩壊から生ずる透過型の電磁放射線を意味する。これは最も短い波長の電磁波からなるため、最も高い光子エネルギーを与える。「Ｘ線」又はＸ放射線とは、透過型の高エネルギー電磁放射線を意味する。殆どのＸ線は１０ピコメートル～１０ナノメートルの範囲の波長を有し、これは３０ペタヘルツ～３０エクサヘルツの範囲の周波数、及び１２４ｅＶ～１２４ｋｅＶの範囲のエネルギーに相当する。

【0037】

「プテロスチルベン」又はＰＴとは、３，５－ジメトキシ－４’－ヒドロキシスチルベン、又はその塩、溶媒和物、異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）、水和物、又はあらゆる既知の誘導体、合成変種、及び許容可能な製剤（医薬品、化粧品、栄養補強食品等）を意味する。プテロスチルベン（ＰＴ）は天然の抗酸化物質であり、レスベラトロールの天然類似体であるが、同様の抗発癌特性を示すほぼ６０倍～１００倍強力な抗真菌剤である。プテロスチルベンは、主にブルーベリー及び赤ブドウに存在するが、定量的研究によれば、１０部ごとのｔ－レスベラトロールにつき、１部～２部のｔ－プテロスチルベンしか存在しないことが明らかになっている。プテロスチルベンは、式：

【化1】

に対応する。

【0038】

「シリビニン」又はＳＩＬは、シリビン又はシリマリンとしても知られており（どちらもシリバム（Silybum）（オオアザミ）由来）、キク科における２種のアザミ属から得られるフラボノイドである。シリビニンには、その塩、溶媒和物、異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）、水和物、又はあらゆる既知の誘導体、合成変種、及び許容可能な製剤（医薬品、化粧品、栄養補強食品等）のいずれも含まれる。この植物は、欧州の地中海地域、北アフリカ、及び中東を原産とする。シリビニン（ＳＩＬ）は、オオアザミ種子の標準化抽出物である、シリビニン、イソシリビニン、シリクリスチン、シリジアニン等からなるフラボノリグナンの混合物を含むシリマリンの主要な活性成分である。シリビニン自体は、２つのジアステレオマーであるシリビンＡ及びシリビンＢのほぼ等モル比での混合物である。ＳＩＬは、３，５，７－トリヒドロキシ－２－［３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－２－（ヒドロキシメチル）－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル］－２，３－ジヒドロクロメン－４－オンとしても知られ、これは、以下の式：

【化2】

を有する。

【0039】

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドブースター、ＮＡＤ^＋前駆体、又はＮＡＤ^＋ブースターとは、Rajman et al., Cell Metab. 2018 March 06; 27(3): 529-547. doi:10.1016/j.cmet.2018.02.011による文献に明確に開示されたＮＡＤ前駆体、ＮＡＤ合成の活性化剤、又はＮＡＤ^＋分解の阻害剤等のあらゆる化合物を意味する。ニコチンアミドには、その塩、溶媒和物、異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）、水和物、又はあらゆる既知の誘導体、合成変種、及び許容可能な製剤（医薬品、化粧品、栄養補強食品等）のいずれも含まれる。

【0040】

「線維芽細胞刺激性リポペプチド」又はＦＳＬ－１とは、トール様受容体２／６アゴニスト、又はその塩、溶媒和物、異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）、水和物、又はあらゆる既知の誘導体、合成変種、及び許容可能な製剤（医薬品、化粧品、栄養補強食品等）を意味し、式：

【化3】

に対応する。

【0041】

ニコチンアミドリボシドとは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はＮＡＤ^＋の前駆体として機能する、ビタミンＢ３に似たピリジンヌクレオシドを意味する。ＮＲの式は、

【化4】

である。

【0042】

本明細書において使用される「パーツのキット」という用語は、患者への同時投与又は逐次投与による併用療法において使用するのに有効成分が物理的に隔離されている組合せ調剤を指す。

【0043】

詳細な説明
幾つかの天然化合物は、放射線照射前に被験体に投与すると放射線防護効果を有することが知られている。図２Ａに示されるように、プテロスチルベン（ＰＴ）、没食子酸、ＥＧＣＧ等のような化合物は、スイスアルビノマウスにおいて放射線照射の６日後にほぼ１００％の生存率をもたらす。しかしながら、一部の化合物は長期間にわたってマウスを防護することができない。例えば、３０日後（図２Ｂ）、ルテオリンの生存率のパーセンテージは約４０％に低下し、６０日後（図２Ｃ）には生存率のパーセンテージは０％であった。したがって、長期間にわたって高レベルの防護を発揮することができる化合物が望まれる。

【0044】

これらの化合物を組み合わせて一緒に投与することはできるものの、この組合せにより得られる放射線防護を予測することはできない。場合によっては、或る化合物を別の化合物と組み合わせても、この化合物の放射線防護特性が変化しないこともある。例えば、図２Ｃに示されるように、ＰＴの投与により、放射線照射の６０日後に４０％のマウス生存率がもたらされる。デルフィニジンはおよそ１２％の生存率をもたらす。しかしながら、ＰＴをデルフィニジンと組み合わせると、得られる生存率はおよそ４０％のままであり、これはＰＴ化合物単独によってもたらされる生存率とほぼ同じである。この場合、デルフィニジンの効果はＰＴの効果に加算されない。

【0045】

その他の場合に、驚くべきことに、或る化合物の放射線防護効果は別の化合物の同時投与によって悪影響を受けることがある。これは図２Ｃに示されており、ＰＴの放射線防護効果は６０日後に４０％の生存率をもたらし、没食子酸はおよそ５％の防護をもたらす。しかしながら、両方の化合物を組み合わせると、全体の生存率はおよそ３５％であり、ＰＴ単独の投与よりも低下した放射線防護効果がもたらされる。

【0046】

その他の場合に、２種の化合物を組み合わせると、それらの放射線防護効果が合算され、これらの個々の効果を足し合わせて得られた防護がもたらされることがある。例えば、図２Ｃにおいて、ＰＴによってもたらされる防護はおよそ４０％であり、ゲニステインによってもたらされる防護はおよそ７％であることが示されている。したがって、両方の化合物を組み合わせると、得られる防護はおよそ４５％となり、これは、両方の化合物がそれらの効果を発揮しており、かつ全体的な防護が多かれ少なかれ両方の化合物の効果の合算であることを意味する。

【0047】

より興味深いことに、本発明の著者らは、驚くべきことに、２種の化合物の組合せが変化又は有害な若しくは累積的な防護をもたらし得ないだけでなく、非常にまれな場合に、２種の化合物の組合せがそれらの効果の単なる累積を超えた放射線防護特性の強化をもたらすことがあることも見出した。すなわち、特定の化合物の特定の組合せは、それらの個々の効果の累積によっては説明することができない防護の強化をもたらし、これは、それらの間に相乗効果があることを意味する。これは図２Ｂ及び図２Ｃに示されている。図２Ｃにおいて、シリビニン（ＳＩＬ）はおよそ１０％の生存率をもたらし、ＰＴはおよそ４０％の生存率をもたらすが、これらの両者の組合せは７０％を超える生存率をもたらす。これは、ＳＩＬ及びＰＴの組合せが単にそれらの放射線防護特性の相加効果をもたらすのではなく、放射線防護の強化を生ずる相乗効果をもたらすことも明確に示している。

【0048】

これらの知見は、放射線防護の強化を達成するのに、組み合わされる化合物に注意を払うべきであることを示唆している。それというのも、組合せによっては放射線防護を強化することができるものもあれば、好ましくない場合には、化合物を個別に投与する方が推奨されることとなるものもあるからである。

【0049】

したがって、放射線防護の強化を達成するのに、異なる放射線防護特性を有する化合物をただ手当たり次第に組み合わせることはできない。それというのも、この組合せが必ずしも全体的な放射線防護の強化をもたらすとは限らないからである。どの化合物を同時投与するかに応じて、結果として得られる放射線防護が悪化することもあれば、同じになることも、又は２種の化合物の合算になることもあるが、一部の化合物を一緒に組み合わせると、相乗効果がもたらされ、それらの放射線防護特性の単なる合算だけでは導き出されない防護の強化がもたらされる。

【0050】

本発明者らによって見出された別の見解は、ＰＴ及びＳＩＬの特定の組合せが長期間の防護をもたらすことである。上述のように、全ての化合物が３０日間を超えて放射線防護効果を発揮するわけではないため、これは驚くべきことである。例えば、図２ＢにおけるＥＧＣＧ、ケルセチン、ナリンゲリン、又はフロリジン化合物（３０日間）を参照のこと。ここでは、それらの放射線防護効果は６０日後に０％に低下している（図２Ｃ）。しかしながら、図３に示されるように、ＰＴ及びＳＩＬの組合せにより、３６０日目、すなわち１年後におよそ２５％の生存率（２０匹中５匹のマウスが生きている）がもたらされた。したがって、ＰＴ及びＳＩＬの組合せは、防護効果の相乗的な強化をもたらすだけでなく、この効果は継続的でもある。さらに、図１１Ｂに示されるように、ＰＴ及びＳＩＬをニコチンアミドリボシド（ＮＲ）又は線維芽細胞刺激性リポペプチド－１（ＦＳＬ－１）等の他の放射線緩和剤化合物と組み合わせると、１年後の生存率はなおも更に最大５０％～６０％まで増大し、注目すべきことに、４種の化合物（ＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１）を組み合わせると、これらは３６０日後に動物のほぼ完全な防護（９０％）をもたらす。

【0051】

結論として、本発明は２つの主要な知見を与える：一方では、放射線防護特性を有する２種の天然化合物であるＰＴ及びＳＩＬを同時投与すると、それらの対応する放射線防護効果の単なる累積だけでは導き出されない強化された持続的な相乗的な放射線防護がもたらされることが判明した。他方では、これら２種の化合物をＮＲ及び／又はＦＳＬ－１等の放射線緩和剤化合物と組み合わせると、放射線に対する防護が長期間にわたって１年間でさえも最大９０％の生存率まで更に強化され得ることも判明した。

【0052】

ＳＩＬ及びＰＴの相乗効果を詳細に研究するのに、著者らは、ＰＴ＋ＳＩＬの組合せによって引き起こされる防護効果に関与する可能性のある潜在的なシグナル伝達経路を更に調査した。図１５ａに示されるように、コントロールと比較して、ＰＴ及びＳＩＬはどちらも核Ｎｒｆ２を増加させ、一方で核ＮＦ－κＢレベルを減少させた。これらの効果は、全体として、ＮＦ－κＢ依存性炎症誘発応答を下方調節しながら抗酸化防御を促進するという協調的な効果を示唆している。ｐＰＧＣ－１αもＰＴによって増加した（図１５ａ）。興味深いことに、ＳＩＬ単独ではＳｉｒｔ１レベルに影響が及ぼされなかったが、２つのポリフェノールを組み合わせると、ＰＴ単独よりもＳｉｒｔ１レベルが増加した（図１５ａ）。これらの結果は、ＰＴＥ及びＳＩＬの相乗効果が、細胞内で生ずる酸化ストレス及びＤＮＡ損傷を和らげる際に両方の化合物が有する協調的な効果に基づくという結論につながり、両方の化合物を含む組成物を活用して、美容、栄養、栄養補強食品、及び医学の分野において使用することへの道を切り開く。

【0053】

電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減において使用されるプテロスチルベン
本発明の第１の態様は、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の処置、予防、改善、又は軽減において使用される、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体と組み合わされたスチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベン又はそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体に関する。好ましくは、使用されるスチルベノイドは、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩である。したがって、第１の態様において、本発明は、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の処置、予防、改善、又は軽減において使用される、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩と組み合わされたプテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩であって、投与は、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に行われ、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。特定の実施形態において、電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連する。好ましい実施形態において、電離放射線によって誘発される疾患は、急性放射線症候群及び／又は慢性放射線症候群である。別の実施形態において、上記疾患は、皮膚疾患、急性放射線症候群、癌、及び心血管疾患からなる群から選択される。

【0054】

本発明の第１の態様では、プテロスチルベンはシリビニンと組み合わせて使用される。ＰＴ及びＳＩＬを、単独の組成物において、又は別個の組成物において投与してもよい。

【0055】

好ましい実施形態において、プテロスチルベンはプテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩である。別の好ましい実施形態において、シリビニンはシリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である。

【0056】

上述のように、ＰＴ及びＳＩＬ、又はそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を組み合わせて投与して、被験体における電離放射線によって誘発される疾患を予防、改善、又は軽減する。好ましい実施形態において、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、被験体は人間である。

【0057】

投与計画及び投与経路
投与は、同時（同じ時点で）又は逐次的であり得る。本明細書において使用される「逐次的な投与」とは、ＰＴ又はそれを含む組成物の投与の少し前又は少し後のＳＩＬ又はそれを含む組成物の投与を指す。本明細書において使用される「少し前又は少し後」とは、１時間～２４時間、好ましくは１時間～１２時間、好ましくは１時間～３時間の間隔内、好ましくは２時間以内、より好ましくは１時間又はそれより短い範囲内、例えば４５分以内、３０分以内、１５分以内又はそれより短い範囲内であると理解される。一実施形態において、ＰＴを最初に投与し、続いてＳＩＬを投与する。別の実施形態において、ＳＩＬを最初に投与し、続いてＰＴを投与する。好ましい実施形態において、ＰＴ及びＳＩＬの投与を同時に行う。一実施形態において、ＰＴ及びＳＩＬを、単一の組成物の一部として、又は２つの異なる組成物の部分として、組み合わせて同時に投与する。

【0058】

一実施形態において、上記薬学的に許容可能な化合物及び組成物を、意図された投与経路に適合するように製剤化する。投与を達成する方法は当業者に知られている。これには、例えば、血管内、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳室内、硬膜外内（intraepidural）等のような非経口経路による注射だけでなく、経口、局所、鼻腔、眼内、直腸、又は局所も挙げられる。特に、デポー注射又は侵食性インプラント等の手段による徐放性投与も検討される。好ましい投与経路は非経口投与であり、これは本明細書においては１つ以上の血管内での投与として理解され、典型的には静脈内投与又は動脈内投与を含む。現在、最も好ましい投与経路は、非経口、経口、又は局所である。

【0059】

投与を１回だけ行うこともでき、又は２回以上投与することもできる。好ましい実施形態において、これらの化合物を数回投与する。特定の実施形態において、投与は、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、又はそれより多くの用量を含み得る。

【0060】

放射線照射前、放射線照射中、又は放射線照射後に投与を行うことができる。例えば、放射線照射が行われる少なくとも１０日前、９日前、８日前、７日前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前、１日前に投与を行うことができる。別の実施形態において、放射線照射後に投与を行う。一実施形態において、放射線照射後に行われる投与は、放射線照射の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、又は１０日を超える期間後に、例えば２０日後若しくは３０日後に、又は１ヶ月を超える期間後に、例えば２ヶ月後、３ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、８ヶ月後、９ヶ月後に行われる。特定の実施形態において、放射線照射が行われる日の同日、放射線照射前又は放射線照射後のいずれかで投与を行う。一実施形態において、投与は、放射線照射が行われる前、放射線照射の同日、及び／又は放射線照射が行われた後の数日間に投与される数回の用量からなる。好ましい実施形態において、プテロスチルベン及びシリビニン、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩を、放射線照射前及び／又は放射線照射後、又はその両方で、同時に又は逐次的に数回投与する。

【0061】

投与量
最適な用量は、既存の毒性データ及び有効性データを考慮して、投与経路、処置計画、及び／又は投与計画に従って選択されることになる。好ましい実施形態において、本発明の第１の態様により使用されるＰＴ及びＳＩＬは、放射線防護効果をもたらすことができる投与量で投与される。上記定義のように、「放射線防護」は、放射線によって引き起こされる直接的な損傷を軽減する能力として理解される。したがって、本発明において、ＰＴ及びＳＩＬの投与量は特に制限されない。

【0062】

さらに、本明細書に開示されるマウスモデルに適用される用量をヒトにおいて適用される等価用量に変換することは当業者には明らかであろう。そのために、当業者は、動物とヒトとの間の用量換算についてのよく知られた一般的な実践ガイドを照会することができる。例えば、Nair AB, Jacob S.著の「動物とヒトとの間の用量換算についての簡単な実践ガイド（A simple practice guide for dose conversion between animals and human.）」 J Basic Clin Pharma 2016;7:27-31を参照のこと。簡潔に言うと、マウスモデルにおける治療的用量を約１２．３で割ることによって、それをヒトに換算することができる。すなわち、１００ｍｇ／ｋｇの用量がマウスにおいて治療的効果を呈した場合、ヒト等価用量は８．１３ｍｇ／ｋｇとなる。

【0063】

一実施形態において、ＰＴ又はその薬学的に許容可能な塩を最大５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。ＰＴを３００ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与することができる。好ましくは、ＰＴを２００ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、又は１５０ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ＰＴを１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。一実施形態において、ＰＴ又はその薬学的に許容可能な塩を最大４０．６５ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。ＰＴを２４．３９ｍｇ／ｋｇ～２．４３ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量でヒトに投与することができる。好ましくは、ＰＴを１６．２ｍｇ／ｋｇ～３．２５ｍｇ／ｋｇ又は１２．１９ｍｇ／ｋｇ～３．２５ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。より好ましくは、ＰＴを８．１３ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。

【0064】

別の実施形態において、ＳＬ又はその薬学的に許容可能な塩を最大５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。ＳＩＬを２００ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与することができる。好ましくは、ＳＩＬを１５０ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ＰＴを７０ｍｇ／ｋｇの投与量又はヒトへの等価量で投与する。別の実施形態において、ＳＬ又はその薬学的に許容可能な塩を最大４０．６５ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。ＳＩＬを１６．２６ｍｇ／ｋｇ～２．８４ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量でヒトに投与することができる。好ましくは、ＳＩＬを１２．１９ｍｇ／ｋｇ～３．２５ｍｇ／ｋｇ又は８．１３ｍｇ／ｋｇ～４．０６ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。より好ましくは、ＰＴを５．６９ｍｇ／ｋｇの投与量又はヒトへの等価量でヒトに投与する。

【0065】

更なる化合物の投与
第１の態様の一実施形態において、上述の実施形態のいずれかに記載される使用は、少なくとも１種の更なる放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここで、本明細書に記載される使用は、本明細書において、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩、及びｃ）１種以上の放射線緩和剤化合物の上記被験体への同時の又は逐次的な投与として理解される。好ましい実施形態において、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドブースター（以下、ＮＡＤ^＋ブースターと呼ぶ）、及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド－１（以下、ＦＳＬ－１と呼ぶ）、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩を指す。本発明の文脈において、ＦＳＬ－１が好ましいが、ＦＳＬ－１は線維芽細胞刺激性リポペプチドの一種であるため、あらゆる他の線維芽細胞刺激性リポペプチドによって置き換えることができることに留意されたい。したがって、本発明の実施形態のいずれかで使用される「ＦＳＬ－１」という用語を、あらゆる他の適切な線維芽細胞刺激性によって置き換えることができる。

【0066】

上記定義のように、「放射線緩和剤」は、放射線が照射された後でも毒性を最小限に抑えることができる化合物である。したがって、第１の態様の一実施形態において、ＰＴとＳＩＬとの組合せの投与は、１種以上の放射線緩和剤化合物の投与を更に含む。ＰＴと、ＳＩＬと、１種以上の放射線緩和剤化合物との間の組合せは限定されない、すなわち、ＰＴを、単一の組成物においてＳＩＬ及び１種以上の放射線緩和剤と一緒に投与することができ、又はこれらを異なる組成物において個別に投与することができる。３種（又は４種以上）の化合物の可能な全ての組合せが本明細書に含まれる。

【0067】

上記の投与経路及び投与計画は、ＰＴ及びＳＩＬを１種以上の放射線緩和剤化合物と一緒に投与する場合にも適用される。

【0068】

好ましい実施形態において、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減におけるＰＴと、ＳＩＬ、それらの塩又はその誘導体との組合せの使用は、ＮＡＤ^＋ブースターの投与を更に含む。したがって、この実施形態において、少なくとも３種の化合物が一緒に投与され、これらは、同じ又は異なる組成物に含まれていてもよく、逐次的に又は同時に投与されてもよい。

【0069】

別の好ましい実施形態において、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減におけるＰＴと、ＳＩＬ、それらの塩又はその誘導体との組合せの使用はＦＳＬ－１の投与を更に含む。したがって、この実施形態において、少なくとも３種の化合物が一緒に投与され、これらは、同じ又は異なる組成物に含まれていてもよく、逐次的に又は同時に投与されてもよい。

【0070】

更により好ましい実施形態において、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減におけるＰＴと、ＳＩＬ、それらの塩又はその誘導体との組合せの使用はＮＡＤ^＋ブースター及びＦＳＬ－１の両方の投与を更に含む。したがって、この実施形態において、４種の化合物は、同じ又は異なる組成物に含まれていてもよく、逐次的に又は同時に投与されてもよい。

【0071】

より好ましい実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシド又は１－（β－Ｄ－リボフラノシル）ニコチンアミド（以下、ＮＲと呼ぶ）、それらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体である。

【0072】

更により好ましい実施形態において、被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減におけるＰＴと、ＳＩＬ、それらの塩又はその誘導体との組合せの使用はＮＲ及びＦＳＬ－１の投与を更に含む。したがって、この実施形態において、４種の化合物は１用量以上の用量で一緒に投与され、同じ又は異なる組成物に含まれており、放射線照射前、放射線照射中、又は放射線照射後に逐次的に又は同時に投与される。

【0073】

好ましい実施形態において、ＰＴ及びＳＩＬを、放射線照射前の数日間及び／又は放射線照射後の数日間、１日１回投与する。より好ましくは、ＰＴ及びＳＩＬを、放射線照射前の１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日間、好ましくは５日間、毎日投与する。別の実施形態において、ＰＴ及びＳＩＬを、放射線照射前から放射線照射後の最大５日まで、４日まで、３日まで、２日まで、１日まで毎日投与する。好ましくは、ＰＴ及びＳＩＬを、放射線照射前の先行する５日間、かつ放射線照射後の２日間、毎日投与する。

【0074】

別の実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースターを、放射線照射の同日に、かつ放射線照射後の翌月中に１日１回投与する。別の実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースターを、放射線照射の少なくとも６０分後に投与し、放射線照射後の次の３０日間に更に投与する。

【0075】

別の実施形態において、ＦＳＬ－１を、好ましくは放射線照射後に、より好ましくは放射線照射の少なくとも１日後に１回だけ投与する。

【0076】

一実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩を最大５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。一実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩を４００ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターを３００ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇ、又は２００ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターを１８５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。一実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩を最大４０．６５ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。一実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩を３２．５２ｍｇ／ｋｇ～８．１３ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターを２４．３９ｍｇ／ｋｇ～１２．１９ｍｇ／ｋｇ又は１６．２６ｍｇ／ｋｇ～１２．１９ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。より好ましくは、ＮＡＤ^＋ブースターを１５．０４ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。

【0077】

別の実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースターはニコチンアミドリボシド又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩であり、これを４００ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。好ましくは、ニコチンアミドリボシドを３００ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇ、又は２００ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ニコチンアミドリボシドを１８５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。別の実施形態において、ＮＡＤ^＋ブースターはニコチンアミドリボシド又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩であり、これを３２．５２ｍｇ／ｋｇ～８．１３ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。好ましくは、ニコチンアミドリボシドを２４．３９ｍｇ／ｋｇ～１２．１９ｍｇ／ｋｇ又は１６．２６ｍｇ／ｋｇ～１２．１９ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。より好ましくは、ニコチンアミドリボシドを１５．０４ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与する。

【0078】

一実施形態において、ＦＳＬ－１又はその薬学的に許容可能な塩を最大１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。別の実施形態において、ＦＳＬ－１化合物又はその薬学的に許容可能な塩を１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。好ましくは、ＦＳＬ－１化合物を０．７５ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、又は０．５ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ＦＳＬ－１化合物を０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。一実施形態において、ＦＳＬ－１又はその薬学的に許容可能な塩を最大０．０８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。別の実施形態において、ＦＳＬ－１化合物又はその薬学的に許容可能な塩を０．０８ｍｇ／ｋｇ～０．００８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。好ましくは、ＦＳＬ－１化合物を０．０６ｍｇ／ｋｇ～０．００８ｍｇ／ｋｇ、又は０．０４ｍｇ／ｋｇ～０．０８１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。より好ましくは、ＦＳＬ－１化合物を０．０２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。

【0079】

一実施形態において、電離放射線はガンマ（γ）線又はＸ線である。

【0080】

ＰＴ及びＳＩＬを含む組成物
第２の態様において、本発明は、ａ）スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベン又はそれらの塩若しくは誘導体と、ｂ）シリビニン又はその塩若しくは誘導体とを含む組成物に関する。好ましくは、スチルベノイドは、プテロスチルベン又はその塩である。したがって、本発明の第２の態様は、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は、医薬組成物、栄養補強食品組成物、美容組成物、又は食品組成物である。本発明の目的で、栄養補強食品という用語は、「食品薬（food-drug）」、すなわち、栄養成分と、有効性が証明され認識されている天然有効成分（この場合はＰＴ及びＳＩＬ）の治癒特性とを関連付ける健康食品を意味する。

【0081】

薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、及びエタノール等の液体が挙げられる。薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸の塩もそれに含まれ得る。ペプチド、タンパク質、又は他の同様の分子がワクチン組成物に含まれるべきであれば、特にこれらに対する安定剤として機能する薬学的に許容可能な賦形剤が調剤に含まれることも好ましい。適切な担体の例としては、限定されるものではないが、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が挙げられる。他の適切な担体としては、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤、添加剤、及び担体の詳細な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences（第22版、2012年）において得られる。

【0082】

医薬製剤、構造改変、及び送達系に関する様々な選択肢がＰＴＥ及びＳＩＬの経口投与を容易にするのを助けることができ、これらも本明細書に含まれる。幾つかの例としては、プロドラッグ（カルボキシエステル、スルホン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、アセタール、又はカルバミン酸塩若しくは炭酸塩）、ナノエマルジョン、ナノ粒子をカプセル化するポリイオン／ポリマーシェル、リポソーム、又はエキソソームが挙げられる。特に、ＰＴＥ及びＳＩＬのあらゆる薬学的に許容可能な製剤が本明細書に含まれる。

【0083】

第２の態様による１つ以上の組成物は、本発明の第１の態様において定義された投与量でＰＴ及びＳＩＬを含み、本発明の第１の態様で定義される投与経路及び投与計画に従って投与される。上記組成物の投与量、投与経路、及び投与計画に関する更なる詳細及び好ましい実施形態も本発明の第１の態様において提供される。

【0084】

上記組成物は、ＰＴ及びＳＩＬ、又はそれらのあらゆる塩若しくは誘導体を含み、本発明の第１の態様で定義される１種以上の放射線緩和剤化合物を更に含み得る。上述のように、一実施形態において、放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び／又はＦＳＬ－１であり得る。好ましい実施形態において、ＰＴ及びＳＩＬを含む組成物は、少なくとも２種の放射線緩和剤化合物、好ましくはＮＲ及びＦＳＬ－１を更に含む。

【0085】

好ましくは、上記１つ以上の組成物は、非経口投与、経口投与、又は局所投与に適した形態である。好ましい実施形態において、上記組成物は水性組成物、より好ましくは安定な水性組成物である。本明細書において使用される場合、「安定な組成物」とは、その中の有効成分が貯蔵時にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を本質的に保持する製剤を指し得る。

【0086】

第２の態様の１つ以上の組成物は、食品組成物であり得る。食品組成物は液体組成物又は固体組成物であり得る。本発明の文脈において、そのような液体組成物としては、限定されるものではないが、動物乳若しくは植物乳及び、例えばミルクシェイク、ヨーグルト、ケフィア等のようなそれらのあらゆる派生物、果物ジュース及び／又は野菜ジュース、静水若しくは炭酸水、又はフレーバー付き若しくは甘味を加えた水若しくは飲料（栄養性甘味料（ショ糖、果糖等）又は人工甘味料による）、シーズニング、あらゆる種類のアルコール飲料、紅茶、コーヒー、並びにあらゆる種類の清涼飲料若しくはソフトドリンク、又は栄養補給飲料からなる群から選択されるあらゆる飲料が挙げられる。

【0087】

食品組成物はまた固体組成物であり得る。このような固体組成物は、例えば、限定されるものではないが、チーズ、バター、マーガリン、及び豆腐等の動物乳若しくは植物乳の派生物、焼きたてのパン、包装されたパン、若しくは冷凍されたパン、スライスされたパン、全粒粉パン、スパイス入りパン、甘味のあるパン、塩味のあるパン等を含むあらゆる種類のパン、小麦粉若しくはセモリナ粉等のあらゆる穀粉から作製されたパスタ（マカロニ、スパゲッティ、麺等）、焼き菓子、飲料の準備用のばらでの若しくは小袋入りの煎じ物、紅茶、又はコーヒー、ゼリー、「ソフトフルーツキャンディ」としてより良く知られるグミキャンディを含むキャンディ、並びにあらゆる種類の固形シーズニング、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。

【0088】

最後に、食品組成物はまた、栄養の、食事の、又は食品の補助物又は補足物であり得る。これらの用語は、食事を補足することを意図した成分、本発明の場合にはＰＴ及びＳＩＬ、又はそれらの塩若しくは誘導体のいずれかを含む経口摂取される組成物に対して通常使用される。これらは、決して従来の食品の代わりになることも、又は食物若しくは食事の唯一の構成要素となることもない。組成物はまた、栄養補強食品組成物であってもよい。この組成物を更に、本明細書全体で定義されるように、機能性食品又はＰＴＥとＳＩＬとの組合せを添加すると追加の機能を有する食品の調製に使用することができる。栄養組成物、食事組成物、若しくは栄養補強食品組成物、又は食品補助物若しくは機能性食品は、香錠、丸剤、錠剤、カプセル剤、ソフトゼラチンカプセル剤、ゼラチンカプセル剤、ウェハー剤、発泡錠剤、液剤（溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤）、顆粒剤、及び粉剤等の様々な表現で見られ得る。これらは全て、本発明の範囲内の特定の実施形態として含まれる。栄養学的又は薬学的に許容可能な賦形剤は、上述の表現のいずれかを得ることに関して当業者には明らかであり、これらは本発明の範囲内に含まれる。

【0089】

本発明は更に、本発明の第１の態様において定義されるように使用される上記組成物に関する。

【0090】

ＰＴ及びＳＩＬを含むパーツのキット
第３の態様において、本発明は、少なくともａ）スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベン及びシリビニン又はそれらのあらゆる塩若しくは誘導体と、任意に少なくとも１種以上の上記定義の放射線緩和剤化合物とを含む少なくとも２つの受容器を含むパーツのキットに関する。好ましくは、パーツのキットに含まれるスチルベノイドはプテロスチルベンである。

【0091】

典型的には、２種以上の成分は、組成物として製剤化されて提供され、２つ以上の別個の受容器に提供される。例えば、ＰＴ及びＳＩＬを一方の受容器において組み合わせ、放射線緩和剤をもう一方の受容器において組み合わせることができる。一実施形態において、各化合物は別個の受容器に収容される。更なる実施形態において、放射線緩和剤化合物は、放射線緩和剤化合物と同様の受容器において存在する。

【0092】

好ましくは、上記組成物は、本発明の先の態様において定義したように、好ましくは電離放射線によって誘発される疾患の治療処置において本発明の先の態様において定義したように使用される。

【0093】

電離放射線によって誘発される疾患を予防、改善、又は軽減する方法
第４の態様において、本発明は、スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベン又はそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体と、シリビニン又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体との組合せを被験体に投与することを含む、被験体における電離放射線によって誘発される疾患を予防、処置（改善又は軽減を含む）する方法に関する。好ましくは、スチルベノイドは、プテロスチルベンである。したがって、第４の態様において、本発明は、プテロスチルベンと、シリビニン又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩との組合せを投与することを含む、被験体における電離放射線によって誘発される疾患を予防、処置（改善又は軽減を含む）する方法であって、上記投与は、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に行われ、ここでの組合せは、本明細書全体を通して定義されるａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩と、任意にｃ）少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物とを上記被験体に同時に又は逐次的に投与することと理解される、方法を提供する。本発明の第１の態様及び第２の態様において上記したのと同様に、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び／又はＦＳＬ－１であり得る。

【0094】

この第４の態様は、上記の第１の態様及び第２の態様に関連する。したがって、化合物及び医薬組成物、投与量、投与経路及び投与計画は、本発明の先の態様において提供され、本明細書に適用される。

【0095】

栄養補強食品分野において又は栄養補強食品組成物として使用されるプテロスチルベンとシリビニンとの組合せ
第５の態様において、本発明は更に、スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベンと、シリビニン若しくはそのあらゆる塩若しくは誘導体との組合せの使用、又は第２の態様による組成物の使用であって、栄養補強食品分野における又は栄養補強食品組成物としての使用に関する。好ましくは、使用されるスチルベノイドは、プテロスチルベンである。したがって、第５の態様は、栄養補強食品分野において又は栄養補強食品組成物として使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、組合せを提供する。

【0096】

好ましい実施形態において、栄養補強食品組成物としての使用は、電離放射線によって誘発される疾患の処置若しくは予防のため、神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝性障害、若しくは加齢関連障害の処置又は予防のため、及び／又はヒトの皮膚若しくは口唇に対する日光の有害効果の防護若しくは修復のためのものである。「ヒトの皮膚又は口唇に対する日光の有害効果の修復」という用語は、本明細書においては、限定されるものではないが、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大、セルライト形成、ニキビ形成、酒さ、乾癬、及び湿疹を含む、皮膚の欠損、欠陥、又は美観的に好ましくない状態を阻止する、逆転させる、改善する、減少させる、及び／又は軽減することを指すのに使用される。「皮膚」という用語には、顔又は身体の皮膚が含まれる。

【0097】

好ましくは、電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連する。より好ましくは、電離放射線によって誘発される疾患は、急性放射線症候群及び／又は慢性放射線症候群からなる群から選択される。

【0098】

好ましくは、栄養補強食品組成物は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される障害の処置において使用される。

【0099】

この第５の態様は、上記の第１の態様及び第２の態様に関連する。したがって、化合物及び医薬組成物、投与量、投与経路及び投与計画は、本発明の先の態様において提供され、本明細書に適用される。

【0100】

非治療的に美容組成物として使用されるプテロスチルベンとシリビニンとの組合せ
第６の態様において、本発明は更に、スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール又はプテロスチルベンと、シリビニン又はそのあらゆる塩若しくは誘導体との組合せの非治療的な美容的使用に関する。さらに、第６の態様はまた、第２の態様による組成物の非治療的な美容的使用に関する。好ましくは、使用されるスチルベノイドは、プテロスチルベンである。したがって、本発明の第６の態様は、非治療的に美容的使用される又は美容組成物としてのプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、組合せを提供する。

【0101】

本明細書において使用される場合、「非治療的な美容的使用」という表現は、人の外見を良くする、すなわち、外見を美しくするのに使用される方法を指す。美容における使用は、手術又は療法による処置を含まない。美容ケアとしては、処置される皮膚領域へのＰＴＥ及びＳＩＬの局所塗布が挙げられる。好ましくは、組成物の美容的使用は、洗浄し、美化し、魅力を付加し、外見を変え、又は皮膚若しくは毛髪を良好な状態に維持若しくは促進するという非治療的な目的を有する。上記目的は、美白すること、顔及び身体のシワの発生を最小限に抑えること、日光及び太陽光線から保護することでもあってもよい。一実施形態において、非治療的な美容的使用は、皮膚の老化の自然なプロセスを予防、軽減、及び／又は改善することである。

【0102】

好ましくは、非治療的な使用は、限定されるものではないが、加齢によるシミ、日焼け、紫外線によるシミ、しわ、小じわ、リンクル、目尻のしわ、クモ状静脈、皮膚線条、目のクマ、色素沈着過剰、色素沈着低下、変色、肌の色むら、くすみ、そばかす、吹き出物、ブレミッシュ、皮膚脆弱性、乾燥、まだら、触感上の荒れ、ひび割れ、たるみ、菲薄化、毛穴の拡大を含むヒトの皮膚及び口唇に対する日光の有害効果を防護、改善、及び／又は軽減することである。「皮膚」という用語には、顔又は身体の皮膚が含まれる。

【0103】

この第６の態様は、上記の第１の態様及び第２の態様に関連する。したがって、美容的使用に適合し、本発明の先の態様において提供された化合物及び組成物、投与量、投与経路及び投与計画も本明細書に適用される。

【0104】

細胞内サーチュインレベルを増加させるのに使用されるプテロスチルベンとシリビニンとの組合せ
図５～図８において報告されたデータに基づいて、ＰＴ＋ＳＩＬは誘発された酸化的損傷に対して防護を発揮することが明らかになった。さらに、図１５に示されるように、この機構は、サーチュイン（Ｓｉｒｔ）レベル、特にＳｉｒｔ１におけるＰＴＥ＋ＳＩＬによって引き起こされる相乗的増加に直接関連していることが判明した。サーチュインは、多くの重要な機能を制御するため代謝調節に関与し、また代謝性疾患、心血管疾患、肺疾患、神経変性障害、及び加齢関連障害、並びに癌等の幾つかの病理にも関与するシグナル伝達タンパク質のファミリーである。サーチュインは、炎症及びオートファジーのモジュレーターであることが明らかになっている。サーチュインを活性化する又は増加させる化合物が代謝機能不全、癌、及び加齢関連疾患を処置する治療的アプローチとしての将来性を示すことを示唆する証拠が相次いでいることから、上記疾患の処置又は予防における使用のためのＰＴＥとＳＩＬとの組合せの使用が強力に裏付けられる。特に、幾つかの研究により、神経保護における、特にアルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、筋萎縮性側索硬化症、及びその他の神経関連疾患等の神経変性障害におけるサーチュインの役割が明らかにされている（Kim D, et al.著の「ＳＩＲＴ１デアセチラーゼは、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症についてのモデルにおける神経変性から保護する（SIRT1 deacetylase protects against neurodegeneration in models for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis.）」 EMBO J. 2007;26(13):3169-3179、Donmez G et al.著の「ＳＩＲＴ１は、分子シャペロンを活性化することによってα－シヌクレインの凝集から保護する（SIRT1 protects against α-synuclein aggregation by activating molecular chaperones.）」 J Neurosci. 2012;32(1):124-132、Outeiro TF et al.著の「サーチュイン２阻害剤は、パーキンソン病モデルにおけるα－シヌクレイン媒介毒性を救済する（Sirtuin 2 inhibitors rescue alpha-synuclein-mediated toxicity in models of Parkinson's disease.）」 Science. 2007;317(5837):516-519、Pallos J et al.著の「特定のＨＤＡＣ及びサーチュインの阻害は、ハンチントン病のショウジョウバエモデルにおける病因を抑制する（Inhibition of specific HDACs and sirtuins suppresses pathogenesis in a Drosophila model of Huntington's disease.）」 Hum Mol Genet. 2008;17(23):3767-377、Luthi-Carter R et al.著の「ＳＩＲＴ２阻害は、ステロール生合成を減少させることにより神経保護を実現する（SIRT2 inhibition achieves neuroprotection by decreasing sterol biosynthesis.）」 Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(17):7927-7932、Shindler KS, et al.著の「ＳＩＲＴ１の活性化は、実験的視神経炎における神経保護をもたらす（SIRT1 activation confers neuroprotection in experimental optic neuritis.）」 Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48(8):3602-3609、Montie HL, et al.著の「ＳＩＲＴ１は、ＳＢＭＡの細胞モデルにおけるアンドロゲン受容体の脱アセチル化を通じて凝集及び毒性を調節する（SIRT1 modulates aggregation and toxicity through deacetylation of the androgen receptor in cell models of SBMA.）」 J Neurosci. 2011;31(48):17425-17436を参照のこと）。

【0105】

これを考慮して、第７の態様において、本発明は、増加を必要とする患者におけるサーチュインの細胞内レベルを増加させるのに使用されるスチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベンと、シリビニン若しくはそのあらゆる塩若しくは誘導体との組合せ、又は第２の態様による組成物であって、上記増加は、スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベンと、シリビニン若しくはそのあらゆる塩との組合せでの処置前の、又は第２の態様による組成物での処置前の同じ患者におけるサーチュインの細胞内レベルと比較したものである、組合せ又は組成物である。好ましくは、スチルベノイドは、プテロスチルベンである。好ましくは、細胞内レベルが増加するサーチュインは、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ２、又はＳｉｒｔ３、最も好ましくはＳｉｒｔ１である。未処置の患者と比較した細胞内サーチュインレベルの増加は、好ましくは統計的に有意な増加であり、限定されるものではないが、ブラッドフォードアッセイ、比色タンパク質測定ＢＣＡ、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の抗体ベースのアッセイ、ローリータンパク質アッセイ、蛍光ベースのアッセイ、タンパク質の質量分析ベースのアッセイ、ナノ粒子及びナノポアベースの方法等のようなタンパク質の量を測定することを目的としたあらゆる適切な技術によって測定することができる。

【0106】

「サーチュインの細胞内レベルの統計的に有意な増加」は、本明細書においては、上記タンパク質（この場合、サーチュイン）の発現レベル又は活性化レベルの増加が偶然だけでは説明することができないという分析者による決定としてみなされる。統計的仮説検定は、当業者がこの決定を下す方法である。この検定では、結果が本当に偶然のみによるものであると仮定して、データの結果と同じくらい極端な結果が観察される確率であるｐ値が得られる。本明細書においては、０．１以下（好ましくは０．０５、０．０１、０．００１以下）のｐ値が統計的に有意であるとみなされる。例えば、サーチュインの細胞内レベルの増加は、統計的検定を行って、サーチュインの細胞内レベルを参照細胞又は未処置の細胞におけるサーチュインの基底細胞内レベルと比較した場合に統計的に有意であり、その際、上記統計的検定の結果として得られるｐ値は、０．１以下、好ましくは０．０５、０．０１、０．００１以下である。

【0107】

好ましくは、それを必要とする患者は、サーチュインの細胞内レベルの低下、好ましくはＳｉｒｔ１の細胞内レベルの低下を特徴とする疾患又は障害を患っている。好ましくは、それを必要とする患者は、健康な人におけるサーチュインの細胞内レベルと比較して、サーチュイン、好ましくはＳｉｒｔ１の細胞内レベルの低下を特徴とする神経変性障害、心血管障害、肺障害、代謝障害、又は加齢関連障害を患っている。好ましくは、障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群から選択される。

【0108】

好ましくは、プテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せは、神経変性疾患の処置、予防、改善、又は軽減において使用され、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される。好ましくは、上記障害は、健康な人と比較して、サーチュイン、好ましくはＳｉｒｔ１の細胞内レベルの低下を特徴としている。一実施形態において、神経変性障害は、アルツハイマー型認知症若しくは他の認知症、又は加齢に伴う認知障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、腎臓疾患、脳血管疾患、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、筋萎縮性側索硬化症、及び糖尿病からなる群について選択される。一実施形態において、処置するとサーチュイン、好ましくはＳｉｒｔ１の細胞内レベルが増加する細胞は、神経組織由来である。好ましくは、この細胞はニューロン又は神経膠細胞である。

【0109】

さらに、サーチュインは糖尿病等の代謝障害の処置における潜在的な治療標的であることも知られている。幾つかの研究は、膵臓細胞におけるＳｉｒｔ１の過剰発現を使用して糖尿病患者における血糖値を制御することができることを示唆している（Nerurkar et al.著の「評判の良いＳｉｒ（２）：糖尿病の不思議な標的（Respected Sir(2): magic target for diabetes.）」 Cellscience. 2008;4(4):82-96、Moynihan et al.著の「膵臓ベータ細胞における哺乳動物Ｓｉｒ２の投与量の増加は、マウスにおけるグルコース刺激性インスリン分泌を促進する（Increased dosage of mammalian Sir2 in pancreatic beta cells enhances glucose-stimulated insulin secretion in mice.）」 Cell Metab. 2005;2(2):105-117、及びBordone et al.著の「Ｓｉｒｔ１は膵臓ベータ細胞におけるＵＣＰ２を抑制することによってインスリン分泌を調節する（Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in pancreatic beta cells.）」 PLoS Biol. 2006;4(2):e31を参照のこと）。これを考慮して、本明細書において与えられる知見に基づいて、スチルベノイド、好ましくはレスベラトロール若しくはプテロスチルベンとシリビニンとの組合せ、又は第２の態様による組成物を糖尿病の処置、予防、改善、又は軽減に使用することもできる。好ましくは、スチルベノイドは、プテロスチルベンである。したがって、好ましい実施形態において、本発明はまた、糖尿病の処置、予防、改善、又は軽減において使用されるプテロスチルベン又はその塩と、シリビニン又はその塩との組合せであって、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、組合せを提供する。

【0110】

この第７の態様は、上記の第１の態様及び第２の態様に関連する。したがって、化合物及び医薬組成物、投与量、投与経路及び投与計画は、本発明の先の態様において提供され、本明細書に適用される。

【0111】

第１の態様において定義したのと同様に、また第５の態様、第６の態様、及び第７の態様における実施形態としても含まれるが、ＰＴとＳＩＬとの組合せを単独の組成物又は別個の組成物において投与することができる。第５の態様、第６の態様、及び第７の態様の実施形態において、プテロスチルベンはプテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩である。上記態様の他の実施形態において、シリビニンはシリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である。上述の態様のいずれかに記載される使用は、ＰＴＥ及びＳＩＬと少なくとも１種の更なる放射線緩和剤化合物との組合せを投与することを更に含むことに留意し、ここで、本明細書に記載される使用は、ａ）プテロスチルベン又はその塩、ｂ）シリビニン又はその塩、及びｃ）１種以上の放射線緩和剤化合物の上記被験体への同時の又は逐次的な投与として理解される。好ましい実施形態において、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドブースター（以下、ＮＡＤ^＋ブースターと呼ぶ）、及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド－１（以下、ＦＳＬ－１と呼ぶ）、又はそれらのあらゆる塩を指す。

【0112】

第１の態様において定義したのと同様に、また第５の態様、第６の態様、及び第７の態様における実施形態としても含まれるが、ＰＴ及びＳＩＬ、又はそれらのあらゆる塩若しくは誘導体が被験体に投与される。好ましい実施形態において、被験体は哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、人間、又はイヌ、ネコ、若しくはウマ等の家畜である。より好ましくは、哺乳動物は人間である。

【0113】

本発明は更に、先の態様において記載したように、被験体におけるサーチュインの細胞内レベルを増加させて、低いレベルのサーチュイン又はサーチュイン活性化の低下を特徴とする疾患を予防、処置（改善又は軽減を含む）する方法を提供する。一実施形態において、上記方法は、プテロスチルベンと、シリビニン又はそのあらゆる塩との組合せを投与することを含み、ここでの組合せは、本明細書全体を通して定義されるａ）プテロスチルベン又はその塩と、ｂ）シリビニン又はその塩と、任意にｃ）少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物とを上記被験体に同時に又は逐次的に投与することと理解される。上記したのと同様に、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物はＮＡＤ^＋ブースター及び／又はＦＳＬ－１であり得る。重要なことには、第１の態様において定義された投与量及び投与経路は、第５の態様、第６の態様、及び第７の態様による使用にも適用される。

【0114】

本明細書において、本発明は、以下の項目又は実施形態も対象としていることに留意されたい。

【0115】

１．被験体における電離放射線によって誘発される疾患の予防、改善、又は軽減において使用される、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩と組み合わされたプテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩であって、投与は、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に行われ、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを上記被験体に任意の順序で同時に又は逐次的に投与することと理解される、プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩。

【0116】

２．プテロスチルベン及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、単独の医薬組成物又は別個の医薬組成物において投与される、項目１に記載の使用されるプテロスチルベン。

【0117】

３．プテロスチルベン及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩の投与は、局所、経口、又は非経口である、項目１又は２に記載の使用されるプテロスチルベン。

【0118】

４．プテロスチルベン及びシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、放射線照射前及び／又は放射線照射後、又はその両方で、同時に又は逐次的に数回投与される、項目１～３のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0119】

５．組合せは、放射線防護効果を提供することができる投与量で存在する、項目１～４のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0120】

６．プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩は、３００ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され、かつシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、２００ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇのシリビニン、好ましくは７０ｍｇ／ｋｇの投与量、又はヒトに換算した等価用量で投与される、項目１～５のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0121】

７．使用は、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩、及びｃ）少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩の上記被験体への同時の又は逐次的な投与として理解される、項目１～６のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0122】

８．少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である、項目７に記載の使用されるプテロスチルベン。

【0123】

９．使用は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物と組み合わせて投与することを更に含み、ここで、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である、項目７に記載の使用されるプテロスチルベン。

【0124】

１０．ＮＡＤ^＋ブースター又はそのあらゆる薬学的に許容可能な塩は、４００ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１８５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され、及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド又はその薬学的に許容可能な塩は、１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量、又はヒトに換算した等価用量で投与される、項目７～９のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0125】

１１．ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、項目８～１０のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0126】

１２．電離放射線によって誘発される疾患は、ＤＮＡ損傷、放射線誘発性の細胞毒性、遺伝毒性、及び／又は酸化的細胞損傷に関連する、項目１～１１のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0127】

１３．電離放射線によって誘発される疾患は、急性放射線症候群及び／又は慢性放射線症候群である、項目１～１２のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0128】

１４．電離放射線は、ガンマ線又はＸ線である、項目１～１３のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0129】

１５．プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、項目１～１４のいずれかに記載の使用されるプテロスチルベン。

【0130】

１６．ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを含む医薬組成物。

【0131】

１７．上記組成物中に存在するプテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩の投与量は、３００ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇであり、かつ上記組成物中に存在するシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩の投与量は、２００ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇのシリビニン、好ましくは７０ｍｇ／ｋｇ、又はヒトに換算した等価用量である、項目１６に記載の医薬組成物。

【0132】

１８．医薬組成物は、好ましくは、
ａ．ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、
ｂ．線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又は、
それらのあらゆる薬学的に許容可能な塩、
から選択される少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物を更に含む、項目１６又は１７に記載の医薬組成物。

【0133】

１９．医薬組成物は、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物を更に含み、ここで、少なくとも２種以上の放射線緩和剤化合物は、ＮＡＤ^＋ブースター及び線維芽細胞刺激性リポペプチド－１、又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩である、項目１８に記載の医薬組成物。

【0134】

２０．ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩は、上記組成物中に４００ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１８５ｍｇ／ｋｇの投与量で存在し、及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド－１又はその薬学的に許容可能な塩は、上記組成物中に１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量、又はヒトに換算した等価用量で存在する、項目１８又は１９に記載の医薬組成物。

【0135】

２１．ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、項目１８～２０のいずれかに記載の医薬組成物。

【0136】

２２．上記組成物は、薬学的に許容可能な担体、添加剤、及び／又は賦形剤を更に含む、項目１６～２１のいずれかに記載の医薬組成物。

【0137】

２３．プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、項目１６～２２のいずれかに記載の医薬組成物。

【0138】

２４．少なくともプテロスチルベン及びシリビニン又はそれらのあらゆる薬学的に許容可能な塩と、任意に少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物とを含む少なくとも２つの受容器を含むパーツのキット。

【0139】

２５．プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩は、３００ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇの投与量で存在し、かつシリビニン又はその薬学的に許容可能な塩は、２００ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇのシリビニン、好ましくは７０ｍｇ／ｋｇの投与量、又はヒトに換算した等価用量で存在する、項目２４に記載のパーツのキット。

【0140】

２６．任意の少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、
ａ．ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、
ｂ．線維芽細胞刺激性リポペプチド、又は、
それらのあらゆる薬学的に許容可能な塩、
の群から選択される、項目２４又は２５に記載のパーツのキット。

【0141】

２７．ＮＡＤ^＋ブースター又はその薬学的に許容可能な塩は、４００ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１８５ｍｇ／ｋｇの投与量で存在し、及び／又は線維芽細胞刺激性リポペプチド又はその薬学的に許容可能な塩は、１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量、又はヒトに換算した等価用量で存在する、項目２６に記載のパーツのキット。

【0142】

２８．ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、項目２６又は２７に記載のパーツのキット。

【0143】

２９．プテロスチルベンは、プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩であり、及び／又はシリビニンは、シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩である、項目２４～２７のいずれかに記載のパーツのキット。

【0144】

３０．プテロスチルベンと、シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩との組合せを投与することを含む、被験体における電離放射線によって誘発される疾患を予防、改善、又は軽減する方法であって、上記投与は、放射線照射前、又は放射線照射後、又は放射線照射中に行われ、ここでの組合せは、ａ）プテロスチルベン又はその薬学的に許容可能な塩と、ｂ）シリビニン又はその薬学的に許容可能な塩とを上記被験体に同時に又は逐次的に投与することと理解される、方法。

【0145】

３１．少なくとも１種の放射線緩和剤化合物を投与することを更に含み、ここで、少なくとも１種以上の放射線緩和剤化合物は、好ましくは、
ａ．ＮＡＤ^＋ブースター、及び／又は、
ｂ．線維芽細胞刺激性リポペプチド、又は、
それらのあらゆる薬学的に許容可能な塩、
から選択される、項目３０に記載の方法。

【0146】

３２．ＮＡＤ^＋ブースターは、ニコチンアミドリボシドである、項目３１に記載の方法。

【0147】

本実施例に記載される特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、実例として示されることが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で用いられ得る。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の手順について多くの等価物を認識する、又は確認することができる。かかる等価物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。

【実施例】

【0148】

実施例１：一般的な材料及び方法
本発明において使用される一般的な材料及び方法をここに開示する。詳細な手順を実施例２～実施例４のそれぞれに更に記載する。

【0149】

マウス及び処置手順
スイスアルビノマウス（雄、９週齢～１０週齢、３０ｇ～３２ｇ）をCharles River Laboratories（マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手した。この株は、放射線研究において最も一般的に使用される株のうちの１つである（Williams 2010）。マウスに栄養的に完全な食餌（標準食、ＳＤ）を与えた後に放射線照射を行った。これはPanlab（スペイン、バルセロナ）製のＡ０３であり、３２００ｋｃａｌ／ｋｇを有し、かつ以下の栄養組成：粗タンパク質２３．５％、粗脂肪４．３％、粗繊維３．７％、及び炭水化物５１．１％を有し、ビタミン及びミネラルをラット及びマウス用のＮＩＨ－７オープンフォーミュラと同様に供給した。この食餌は米国栄養研究所が成体マウスに推奨する栄養所要量を満たしている。動物には自由に給餌し、個別の代謝ケージに入れて飼育し、そこでは体重及び食物摂取を毎日監視した。動物室を１２時間明／１２時間暗のサイクルで２２℃に維持した。飲料水の自由摂取も許容した。照射されたマウスのケアは、ロバートウッドジョンソン医科大学（ニュージャージー州ピスカタウェイ）のマウス全身照射（方針１５）に関する勧告に従った。これには、ａ）飲料水中に抗生物質を使用すること（１３４ｍｇのアンピシリン／ｋｇ／日、４０ｍｇのベイトリル／ｋｇ／日、及び２２０ｍｇ／４２ｍｇのスルファメトキサゾール／トリメトプリム／ｋｇ／日）、ｂ）飲料水を容易に利用可能にすること、ｃ）Ｎａｐａ ｎｅｃｔａｒ（Systems Engineering Lab Group Inc.、カリフォルニア州ナパ）を最初の１４日間ケージの底部に設置し、毎日交換すること、ｄ）ケージの床に小さなペトリ皿に入れて柔らかくした食物を与えること、ｅ）免疫抑制に関連する感染症の可能性を避けるために、完全に滅菌環境（ケージ、食物、及び水）にすることが含まれる。動物の身体運動を促進するために、ケージ内部に自立式ホイールも備えていた。起こり得る概日変動を最小限に抑えるために、全ての実験を１０時００分に開始した。動物に関する手順は、国際法及び国際方針（ＥＥＣ指令８６／６０９、ＯＪ Ｌ ３５８．１、１９８７年１２月１２日、及びＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）、ＮＩＨ出版番号８５－２３、１９８５年）に準拠した。マウスを、ＢＩＯＢＥＡＭ ８０００（Gamma-Service Medical GmbH、ドイツ、ライプツィヒ）においてγ放射線（^１３７Ｃｓ）（全身照射、ＴＢＩ）に曝した。単回照射放射線療法（Single fraction radiotherapy）を、およそ５．０Ｇｙから１０．０Ｇｙまでの範囲の総線量で、およそ５．０Ｇｙ／分の速度にて施した。線源からの照射距離を１２ｃｍに限定した。放射線線量測定を、Bruker（マサチューセッツ州ビレリカ）製のアラニン線量計を使用して±０．０９Ｇｙの線量測定変動で制御した。経口投与の場合に、ＰＴＥＲ及びＳＩＬ（Merck Chemicals GmbH、ドイツ、ダルムシュタット）を２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン中に可溶化し、次いで０．３％のカルボキシメチルセルロース中に懸濁した。ＩＰ投与の場合に、ＰＴＥＲ塩（プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩、SYNCOM、オランダ、フローニンゲン）及びＳＩＬ塩（シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩、Rottapharm/Madaus、ドイツ、ケルン）をワクチン接種グレードの滅菌水中に溶解した。アッセイした他の全てのポリフェノール系植物化学物質（Merck Chemicals GmbH、及びCayman Chemical Co.、ミシガン州アナーバー）は、主要なフラボノイド及び非フラボノイド（Estrela 2017）、すなわち没食子酸（フェノール酸）、コーヒー酸（ヒドロキシ桂皮酸）、クルクミン（クルクミノイド）、没食子酸エピガロカテキン（フラバノール）、ゲニステイン（イソフラボン）、ケルセチン（フラボノール）、ルテオリン（フラボン）、ナリンゲニン（フラバノン）、デルフィニジン（アントシアニジン）、及びフロリジン（カルコン）に相当し、これらをＰＴＥＲ及びＳＩＬのように可溶化した後に経口投与した（Wani 2016）。ＮＲ（ニコチンアミドリボシド、３－アミノカルボニル－１－β－Ｄ－リボフラノシル－ピリジニウム、Elysium Health, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク）をワクチン接種グレードの水中に溶解し、溶液のｐＨを中和（ｐＨ７．０）した後に経口投与した（１８５ｍｇ／ｋｇ×日、Obrador 2020）。ＦＳＬ－１（InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）をワクチン接種グレードの滅菌水中に再懸濁し、ＩＰ投与した（０．２５ｍｇ／ｋｇ×日、投与容量は、Kurkjian 2017による推奨のようにマウスの体重に応じて５０ｍＬ～６０ｍＬであった）。医薬品グレードのアミフォスチン（エチオール）を、Cumberland Pharmaceuticals（テネシー州ナッシュビル）から５００ｍｇの滅菌凍結乾燥粉末バイアルとして入手し、生理的食塩水で再構成した後に使用した。

【0150】

病理学
死亡したマウス、瀕死のマウス、又は屠殺が予定されたマウスのいずれも研究から除外した。全てのマウスを剖検し、およそ３０個の組織又は器官だけでなく全ての肉眼的病変も収集して顕微鏡検査を行った。１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定した後に、全ての組織を慣例通りに処理し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して、組織病理学的評価を行った。

【0151】

照射から１４日後にマウスを安楽死させた後、大腿骨を摘出した。予冷したリン酸緩衝生理食塩水を用いて２６ゲージの針を使用して、摘出された大腿骨から骨髄細胞を洗い流した。洗い流した細胞を数回穏やかにピペッティングすることによって単一細胞懸濁液を調製し、血球計算盤（Neubauer、ドイツ、マリエンフェルト）を使用して生存骨髄有核細胞（ＢＭＮＣ）の数を計数し、×１０^６／大腿骨として表した。

【0152】

ロータロッド試験
試験の機能には、特に実験薬の効果の試験において、被験体のバランス、握力、及び運動協調性の評価が含まれる。この試験（ロータロッド、Harvard Apparatus、マサチューセッツ州ホリストン）では、各動物に３回の試験を行い、回転心棒（３．５ｃｍの直径、回転速度：１５ｒｐｍ）上で落下せずに留まることができた最大期間（秒）を測定した。各マウスには、１２００秒の任意の限界内で最大３回の試行を行い、最長期間を記録した。異なる群における経時的変化を毎週監視した。

【0153】

プテロスチルベンレベル
液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を、株式会社島津製作所のＬＣ－１０ＡＤｖｐポンプ及びＳＬＣ－１０ＡｖｐコントローラーシステムとともにＳＩＬ－１０ＡＤｖｐオートインジェクターを備えたＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ（商標）トリプル四重極質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を使用して、以前に記載されたように（Ferrer 2005）実施した。

【0154】

シリビニンレベル
測定は、Song et al. (2019)によって記載された方法論を基礎とした。簡潔に言うと、試料を、ＨＰＬＣ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００、Thermo Fisher Scientific）及びＭＳ／ＭＳ（WatersのＴＱ検出器トリプル四重極）システムを介してＨｙｐｕｒｉｔｙ（商標）Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×４．６ｍｍ）上で５μＬの注入容量を使用して分析した。移動相は水（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）からなっていた。勾配溶離系を以下のように最適化した：０分～３．０分 ２０％→１００％のＢ、３．０分～５．０分 １００％→１００％のＢ、５．０分～５．５分 １００％→２０％のＢ、５．５分～７．５分 ２０％のＢ。流速は０．５ｍＬ／分であった。ＭＳ／ＭＳデータ取得を負のエレクトロスプレーイオン化モードで実施した。多重反応モニタリングモードを使用して、ｍ／ｚ ４８１．３／１２５．０のプリカーサーイオンからプロダクトイオンへの遷移を伴うＳＩＬをモニタリングした。フラグメンター電圧は１５０Ｖであり、衝突エネルギーは１５ｅＶであった。組織試料の調製は、ＰＴＥＲレベル（上記）の決定について記載した通りであった。

【0155】

血中ＮＡＤ^＋レベル
全血中のＮＡＤ^＋レベルの測定を、Yoshino及びImai（Yoshino et al. 2013）によって記載された方法論に従ってＨＰＬＣによって実施した。この手順では、それぞれＳｕｐｅｌｃｏ ＬＣ－１８－Ｔカラム（１５ｃｍ×４．６ｃｍ、Sigma Aldrich）及びＨｙｐｅｒｃａｒｂカラム（１５ｃｍ×４．６ｃｍ、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を備えたＨＰＬＣシステム（株式会社島津製作所、日本、京都）を使用した。全血試料（０．５ｍｌ）を４℃でクエン酸ナトリウムチューブに収集した。次いで、０．１ｍｌの全血アリコートを、０．９ｍｌの０．５Ｍの氷冷過塩素酸を含むクライオバイアルに移して、全ての血球を溶解させた。試料を１００００ｇ×１０分間（４℃）で遠心分離した。上清は分析するまで－８０℃で貯蔵した。

【0156】

療法によって誘発されるｉｎ ｖｉｖｏ毒性の評価
これは、ＮＩＨの標準方法論に基づく血球計数及び化学反応を含んでいた。

【0157】

染色体異常及び二本鎖ＤＮＡ切断
本発明者らは、テロメア及びセントロメアの染色により、最適化されたハイブリダイゼーション条件及び間期染色体の融合捕捉を使用して、リンパ球における早期染色体凝縮の二動原体、環状染色体、及び無動原体染色体の簡単な検出が容易になるM'kacher et al. (2015)によって記載された技術に従った。採血後数時間以内に損傷が観察され得るため、このアプローチには大きな利点がある。手順（M'kacher 2015）において示唆されるように、したがってＤＮＡ修復並びに二動原体、環状染色体、及び無動原体染色体の発生の時間を考慮に入れて、照射８時間後に血液を収集した。

【0158】

末梢血リンパ球を本明細書で以下に記載されるように分離した。早期染色体凝縮（ＰＣＣ）を、以前に記載されたように（Pantelias 1983）ＣＨＯ細胞（ATCC）を使用して行った。凝縮されたヒト染色体と、ＣＨＯ染色体とを、それらの形態学的特徴に従って区別した（M'kacher 2015）。この手順にはおよそ４時間を要した。

【0159】

ＰＣＣ融合物のテロメア及びセントロメアを、Ｑ－ＦＩＳＨ技術を使用してテロメアのＴＴＡＧＧＧに特異的なＣｙ－３標識ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ及びセントロメア配列に特異的なフルオレセインイソチオシアネート標識ＰＮＡプローブ（M'kacher 2015）（両者とも、ThermoFisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム）製）を用いて染色した。テロメア及びセントロメアが染色された融合物を、Metasystems（ドイツ、アルトルスハイム）製のＡｕｔｏｃａｐｔソフトウェア及び高解像度ＣＣＤカメラ（Ｃ９１００２－２３Ｂ、浜松ホトニクス株式会社、ドイツ、ヘルシング）を使用して自動的に記録した。

【0160】

同じスライドにおいて、M'kacher et al. (2015)によって記載されるように、２つの異なる手動の手順を実施した。簡潔に言えば、最初に逆方向（reverse）４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを使用し、環染色体及び過剰な無動原体染色体をスコアリングする。次に、テロメア及びセントロメアの染色を使用して、テロメア染色を有しない間質欠失、末端欠失を表す１つだけのテロメアを有する無動原体染色体、及び二動原体又は環状断片の形成を伴う２つの無動原体染色体の融合から誘導される２つのテロメアを有する無動原体染色体から、二動原体、環状染色体、及び無動原体染色体をスコアリングする。結果として得られる二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を計算した（M'kacher 2015）。

【0161】

小核の形成
この目的のために、屠殺したマウスから大腿骨髄を収集し、塗抹標本を作製し、メタノールを使用して固定した。乾燥後、メイグリュンワルド・ギムザ染色を使用して二重染色を行った（Schmid 1975）。この方法によれば、多染性赤血球（ＰＣＥ）は赤みがかった青色に染色され、正染性赤血球（ＮＣＥ）は橙色に染色されたのに対して、核物質は濃い紫色であった。油浸下で２０００個の細胞から小核を有する多染性（ＭｎＰＣＥ）細胞及び正染性（ＭｎＮＣＥ）細胞を計数した。

【0162】

リンパ球、肝細胞、及び腸上皮細胞の分離及びインキュベーション
肝細胞の分離を、以前に報告された方法論（Berry 1969）に従って実施した。ヘパリン添加血液からＡｃｃｕｓｐｉｎ－Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）勾配遠心分離によって血液単核細胞を得た。単核細胞を２回洗浄し、０．３％のウシ血清アルブミンを含むクレブス－ヘンゼライト重炭酸媒体（ｐＨ７．４）中に１ｍｌ当たり２０×１０^６個の細胞の濃度で再懸濁した。単分散の免疫磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Dynal）によるリンパ球サブセットの更なる正の選択を、他の文献（Thornton 2003）の記述に従って４℃で実施した。肝細胞及びリンパ球の細胞体積を、以前に記載されたように（Estrela 1992）得た。

【0163】

分離した肝細胞を、フラスコ（１ｍｌ当たり約１０ｍｇの乾燥重量）において、１．３ｍＭのＣａＣｌ_２、５％の無脂肪ウシ血清アルブミンを含むクレブス－ヘンゼライト重炭酸媒体（ＫＨＢＭ、ｐＨ７．４）中で、グルコース（５ｍＭ）の存在下にて３７℃でインキュベートした。ガス雰囲気はＯ_２／ＣＯ_２（１９：１）であった。分離したリンパ球を、５％の無脂肪ウシ血清アルブミンを含むクレブスリンガー媒体中で、グルコース（５ｍＭ）及びグルタミン（２ｍＭ）の存在下にて３７℃でインキュベート（フラスコ当たり１０^６個の細胞）した。インキュベーション後に、０．２ｍｌの２５％の過塩素酸を加えて細胞を破壊した。遠心分離によりタンパク質を除去し、上清を２０ｍｌの４０％のＫＯＨ溶液及びトリス－（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＫＯＨ（０．５Ｍ～２．０Ｍ）溶液で中和して、代謝産物の測定を行った。

【0164】

Graves et al. (2014)から適合されたプロトコルを使用して初代腸上皮細胞（ＩＥＣ）を分離した。縦走筋層を除去し、１００Ｕのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及び０．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む氷冷したＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄することによって結腸組織を調製した。組織を小片に切断し、５０ｍｌのＨＢＳＳ洗浄溶液中に懸濁し、振盪し、内容物を２分間沈殿させた。上清を除去し、沈殿した内容物を３回洗浄した。沈殿した内容物を細かく刻み、ＨＢＳＳ中に懸濁した。得られた懸濁液を１０００μｍ^２のメッシュフィルターに通した。残りの組織を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich）中の７５Ｕ／ｍｌのＸＩ型コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）、２５μｇ／ｍｌのディスパーゼ中性プロテアーゼＩＩ（ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び２％（容量／容量）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ThermoFisher Scientific）を含むバッファー中で消化した。次いで、組織を含む消化バッファーを３７℃のインキュベーター内に置き、２００ｒｐｍで２時間振盪させた。得られた消化混合物を再び１０００μｍ^２のフィルターに通し、フィルター上の組織断片を２５ｍｌの完全成長培地（ＤＭＥＭ、８．５ｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム、２％（容量／容量）のＦＢＳ、０．２５Ｕ／ｍｌのインスリン、１００Ｕのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び２％（重量／容量）のＤ－ソルビトールを含む１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ）で洗浄した。フィルターに残った組織破片を廃棄し、増殖性陰窩構造物を含む流出液を２００ｇで４℃にて５分間遠心分離した。単離された腸陰窩を含む残りのペレットをＤＭＥＭ中に懸濁した。陰窩を完全成長培地中に懸濁し、１２ウェルのＩ型コラーゲンでコーティングされた培養皿（ThermoFisher Scientific）においておよそ２０００個の陰窩／ｍｌ／ウェルの密度でプレーティングし、３７℃、Ｏ_２／ＣＯ_２（１９：１）でインキュベートした。

【0165】

グルコース及びグルタミンの利用率を、以前に記載されたように（Newsholme 1987）測定した。

【0166】

細胞培養
分離した肝細胞を、ウィリアム完全培地中で１ｍＬ当たり１０^６個の細胞の濃度で培養した。分離したＣ２Ｄ^＋リンパ球をＰＢ－ＭＡＸ培地（GIBCO、ThermoFisher Scientific）中で１ｍＬ当たり２×１０^６個の細胞の濃度にて培養した。ＩＥＣ（１ｍＬ当たり１０^６個の細胞）を、１０％の熱不活化ＦＢＳ及び３００ｍｇ／ｍｌのＬ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を９５％の空気及び５％のＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７℃にて培養した。

【0167】

ＤＮＡの酸化
組織試料を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ中で均質化した。その後、最初にＲＮアーゼＡとともに３７℃で３０分間インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫとともに５５℃で一晩インキュベートした。これに続いて、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出を行った。１００μｇの単離されたＤＮＡの試料をヌクレアーゼＰ１及びアルカリホスファターゼでヌクレオシドに消化した（Crain 1990）。修飾ＤＮＡ塩基８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の分析を、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって行った。

【0168】

脂質過酸化反応
イソプロスタンの測定のために、組織試料を０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０．００５％のブチル化ヒドロキシトルエン中で均質化した。イソプロスタンを８－イソプロスタンＥＩＡキット（Cayman Chemical Co.）を使用し、製造業者のプロトコルに従って測定した。

【0169】

タンパク質のカルボニル化
不可逆的な酸化的損傷であるタンパク質のカルボニル化を、タンパク質カルボニル蛍光分析アッセイキット（Cayman Chemical Co.）を使用し、製造業者のプロトコルに従って測定した。

【0170】

酵素活性及び代謝産物レベル
分離した細胞を０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）中で４℃にて均質化した。γ－グルタミルシステインリガーゼ（ＧＣＬ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、並びにスーパーオキシドジスムターゼ１及びスーパーオキシドジムスターゼ２（ＳＯＤ１及びＳＯＤ２）の活性を、以前に詳細に記載されたように（Benlloch 2016）測定した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Thermo Fisher Scientific）で測定した。グルタチオン（γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニル－グリシン、ＧＳＨ）を、以前に報告されたように（Obrador 2014）ＬＣ／ＭＳによって測定した。公開された方法論に従って、ＧＳＨ自動酸化を防ぐために迅速なＮ－エチルマレイミド誘導体化を使用して（Asensi 1994）、細胞プロセシングを行った。分離された細胞中のＮＡＤ^＋及びＮＡＤＨを、MyBiosource（カリフォルニア州サンディエゴ）製のアッセイキットを使用して定量化した。

【0171】

ＲＴ－ＰＣＲ及びｍＲＮＡの検出
全ＲＮＡを、Invitrogen（カリフォルニア州サンディエゴ）製のＴＲＩｚｏｌキットを使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。ｃＤＮＡを、製造業者によって推奨されるランダムヘキサマープライマー及びＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素キット（Ｔａｑ－Ｍａｎ ＲＴ試薬；Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して取得した。ＰＣＲマスターミックス及びＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）を、以前に報告された（Benlloch 2016）プライマーに加えた。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対するｍＲＮＡのリアルタイム定量化を、以前に報告されたように（Benlloch 2016）実施した。

【0172】

コメットアッセイ
このアッセイは、細胞のＤＮＡ損傷を簡単に評価するための単一細胞ゲル電気泳動アッセイである。本発明者らは、Abcam製のアッセイキット（ａｂ２３８５４４）（英国、ケンブリッジ）を使用した。段階を追って製造業者の使用説明書に従った。

【0173】

ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性アッセイ
^１４Ｃ－ニコチンアミド（ＮＡＭ）（GE Healthcare Life Sciences、スウェーデン、ウプサラ、ビヨルクガタン）からの^１４Ｃ－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の形成を、濾紙上でのアセトン中の^１４Ｃ－ＮＭＮの沈殿及びシンチレーション計数によって測定することができる。細胞の分散をトリプシン処理（０．２％のトリプシン、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び５ｍＭのグルコースを補充したＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を含まないＰＢＳ中で、３７℃にて３分間）によって行った。細胞ペレットを遠心分離（４℃で８００ｇ×５分間）によって取得した後に、１００μｌのリン酸バッファー［プロテアーゼ阻害剤（Sigma-Aldrich）を含む０．０１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４バッファー（ｐＨ７．４）］を各細胞試料に加えた。試料を更に処理し、以前に記載されたように（Elliott GC, et al. 1980、及びSchuster S, et al. 2014）３０μｇのタンパク質に対してＮＡＭＰＴ活性を決定した。放射活性（１分当たりの崩壊）を、Perkin-Elmer製のＴｒｉ－Ｃａｒｂ（商標）液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。シンチレーション流体からの１分当たりのバックグラウンド崩壊を各測定値から差し引いた。

【0174】

骨髄内のコロニー形成細胞
マウスを無菌条件下で屠殺し、照射後７日目に大腿骨を摘出した。５％のウシ胎児血清を補充したリン酸緩衝生理食塩水（４℃）を用いて、摘出された大腿骨（上記を参照のこと）から骨髄細胞を洗い流した。単一細胞懸濁液を１００μｍのナイロンメッシュストレーナーに通し、破片及び集塊を除去した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（４℃）で２回洗浄し、血球計算盤を使用して計数した。製造業者のプロトコルに従って、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ ＧＦ Ｍ３４３４（Stemcell Technologies、カナダ、バンクーバー）成長培地中で３５ｍｍの細胞培養皿当たり５×１０^４個の細胞の濃度で細胞をｅｘ ｖｉｖｏでプレーティングし、３７℃、５％のＣＯ_２、９５％の湿度で１４日間インキュベートした。培養１４日目にコロニーを光学顕微鏡（ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃ５、Zeiss、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用して偏光下で視覚化し、６０ｍｍの格子付きスコアリングペトリ皿（Stemcell Technologies）においてスキャンした。造血コロニー形成細胞ＣＦＵ－ＧＭ及びＣＦＵ－ＧＥＭＭを定量化した。

【0175】

細胞、核、及びミトコンドリア抽出物の調製
細胞抽出物を、Sigma Aldrichの全細胞抽出キットを使用して調製した。ＮＥ－ＰＥＲ（商標）核及び細胞質抽出キット（ThermoFisher Scientific）により、哺乳動物の細胞又は組織から細胞質抽出物及び核抽出物の段階的な分離及び調製が可能となる。ミトコンドリア抽出物を、ThermoFisher Scientificによって標準化された細胞分画及びオルガネラ分離手順に従って調製した。

【0176】

遺伝子サイレンシング
Ambion Inc.（テキサス州オースティン）のＰＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１－Ｈ１線状ベクターを使用して、長期の遺伝子サイレンシングを達成した。マウスＮｆκｂｉｅを標的とするために、Origen（メリーランド州ロックビル）製のｓｉＲＮＡオリゴデュプレックス（遺伝子座ＩＤ １８０３７）を使用した。マウスのＮｆｅ２ｌ２（参照配列ＮＭ＿０１０９０２．３）、Ｐｐａｒｇｃ１（参照配列ＮＭ＿００８９０４．２）、Ｓｉｒｔ１（参照配列ＮＭ＿０１９８１２．２）、Ｓｉｒｔ３（参照配列ＭＮ＿０２２４３３．２）、Ｐａｒｐ１（参照配列ＮＭ＿００７４１５．２）、ＳＯＤ２（参照配列ＮＭ＿０１３６７１．３）、及びＧＰＸ１（参照配列ＮＭ＿００８１６０．６）を標的とするｓｉＲＮＡはInvitrogen製であった。全ての場合において、サイレンシング手順は製造業者の技術的推奨に従った。コントロール実験を、同じ塩基組成及び無作為化配列を有する等量の対応するセンスオリゴヌクレオチド及びスクランブルオリゴヌクレオチドを使用して実施した。サイレンシングをイムノブロッティングによって確認した。ｓｉＲＮＡの送達には、InvitrogenのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬及び製造業者のプロトコルを使用した。

【0177】

細胞死分析
アポトーシス性細胞死及び壊死性細胞死を、蛍光顕微鏡測定を使用することによって区別した。この目的のために、単離されたＭＮをＨｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（１０ｍＭ；全ての核を染色する）及びヨウ化プロピジウム（１０ｍＭ；原形質膜が破壊された細胞の核を染色する）とともに３分間インキュベートし、Ｄｉａｐｈｏｔ ３００蛍光顕微鏡（Nikon、日本、東京）を使用して３６０ｎｍでの励起で分析した。生存細胞、壊死細胞、及びアポトーシス細胞の核は、それぞれ青色の丸い核、ピンク色の丸い核、及び断片化された青色又はピンク色の核として観察された。毎回約１０００個の細胞を計数した。

【0178】

ウェスタンブロット
ウェスタンブロット分析を、以前に記載されたように（Benlloch M, et al. 2016）実施した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、特異的な抗ヒトモノクローナル抗体（OriGene、メリーランド州ロックビル、及びAbcam）を用いたウェスタンブロットに供した。西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体及び増強化学発光（ＥＣＬシステム；GE HealthCare Life Sciences）を使用して、ブロットを現像した。タンパク質バンドを、レーザー濃度測定を使用して定量化した。

【0179】

腫瘍異種移植片
ヒトＡ５４９細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ATCC（バージニア州マナッサス）製であった。１０％の熱不活化ＦＣＳ（Biochrom KG、ドイツ、ベルリン）、１００単位／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）（ｐＨ７．４）中で細胞を成長させた。細胞をプレーティングし（１ｃｍ^２当たり２００００個の細胞）、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気中で３７℃にて培養した。０．３ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で０．０５％（重量／容量）のトリプシン（Sigma Aldrich、ミズーリ州セントルイス）とともに５分間インキュベートし、続いて１０％のＦＣＳを添加してトリプシンを不活化することによって細胞を採取した。どの処理を加える前にも、細胞を１２時間付着させた。細胞数及び生存率を、BioRad（カリフォルニア州ハーキュリーズ）のＴＣ２０自動セルカウンターを使用して決定した。ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（雄、９週齢～１０週齢、Charles River Laboratories、マサチューセッツ州ウィルミントン）に標準食（Letica、ミシガン州ロチェスターヒルズ）を自由に与え、１２時間明／１２時間暗のサイクルで２２℃の室温において飼育した。手順は、国際法及び国際方針（ＥＥＣ指令８６／６０９、ＯＪ Ｌ ３５８．１、１９８７年１２月１２日、及びＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針、ＮＩＨ出版番号８５－２３、１９８５年）に準拠した。腫瘍細胞を０．０２％のＥＤＴＡに曝露（３７℃で５分間）することにより培養フラスコから採取し、ＤＭＥＭ中で２回洗浄し、同じ培養培地中に再懸濁し、動物の背中に皮下注射した（マウス当たり５×１０^６個の細胞）。局所腫瘍成長を処置２日目から開始して２日ごとにノギスを使用して測定した。

【0180】

統計
データは、異なる実験の数について平均値±ＳＤとして表される。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。

【0181】

Ｇ^＊Ｐｏｗｅｒ ３．１．９．２ソフトウェアを使用して標本サイズを決定した（ＡＮＯＶＡ検定、効果サイズ＝０．２１、α＝０．０５、β＝０．８０、及び示された群）。生存データを、カプラン－マイヤー曲線及びＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定を用いて分析した。

【0182】

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【0183】

実施例２：ＰＴ及び放射線防護効果
最初に、γ放射線の効果及びマウスの生存を研究した。全身γ線照射を受けたマウスを研究した（図１Ａ）。マウスに全身γ線照射（１回の単回線量；^１３７Ｃｓ、０．５Ｇｙ／分～０．６Ｇｙ／分；Ｂｉｏｂｅａｍ ８０００、GSM GmbH）を与えた。１Ｇｙ＝物質１ｋｇ当たり１Ｊのエネルギーの吸収。およそ７．２ＧｙのＬＤ５０／３０（放射線線量ごとにｎ＝２０）。

【0184】

次に、γ線（ＬＤ５０／３０）及びプテロスチルベン（ＰＴ）で処置されたマウスの３０日間生存率を分析した（図１Ｂ）。そのために、スイスアルビノマウス（Charles River、１群当たりｎ＝２０）を、アミフォスチン（２－（３－アミノプロピルアミノ）エチルスルファニルホスホン酸）（生理的食塩水中に溶解、照射３０分前に１回の単回経口投与、ヒトに推奨される２００ｍｇ／ｍ^２を、ＦＤＡのガイドラインに従ってマウスに適応させた）又はプテロスチルベン（２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン中に溶解した後に、０．３％のカルボキシメチルセルロース中に懸濁した；照射前の５日間及び照射後の２日間１日１回経口投与）で処置した。マウスに全身γ線照射（０．５Ｇｙ／分～０．６Ｇｙ／分で７．２Ｇｙの^１３７Ｃｓの１回の単回線量；機器＝Ｂｉｏｂｅａｍ ８０００、GSM GmbH）を与えた。１Ｇｙ＝物質１ｋｇ当たり１Ｊのエネルギーの吸収。データをＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定で分析した（^＊全ての群をビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している）。図１Ｂにおける結果は、生存の改善に対する最良の効果（６０日）が、１ｋｇ当たり１００ｍｇのプテロスチベンの用量によって発揮されることを示している。

【0185】

γ線（ＬＤ５０／３０）及びレスベラトロール（Ｒｅｓｖ）で処置されたマウスの生存率も分析し、これらの結果を図１Ｃに示す。スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）をＲｅｓｖｌ（２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン中に溶解した後に、０．３％のカルボキシメチルセルロース中に懸濁した；照射前の５日間及び照射後の２日間１日１回経口投与）で処置した。マウスに全身γ線照射（０．５Ｇｙ／分～０．６Ｇｙ／分で７．２Ｇｙの^１３７Ｃｓの１回の単回線量、Mortazavi SMJ et al. Dose-Response 11: 281-292, 2013；機器＝Ｂｉｏｂｅａｍ ８０００、GSM GmbH）を与えた。１Ｇｙ＝物質１ｋｇ当たり１Ｊのエネルギーの吸収。これらの結果により、Ｒｅｓｖの放射線防護効果がＰＴの放射線防護効果よりも低いことが明らかになった。

【0186】

マウスにプテロスチルベンを経口投与した後のその血漿レベル及び血管外レベルを研究した。マウスを体重１ｋｇ当たり２００ｍｇのＰｔｅｒで処置した。４匹又は５匹の動物の群を各時点で屠殺した。Ｐｔｅｒを２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン中に溶解した後に、０．３％のカルボキシメチルセルロース中に懸濁した。検出不能＝ｎ．ｄ．。^＊Ｐ＜０．１、１０分～１４４０分で得られたデータを５分で見られたデータに対して比較している。これらの結果を以下の表１に示す。

【0187】

【表1】

【0188】

これらの結果は、研究した全ての組織において、プテロスチルベンレベルが投与６０分後にピークに達することを示している。

【0189】

まとめると、上記の結果はＰＴＥＲの放射線防護剤としての可能性を裏付けている。

【0190】

実施例３：ＰＴ＋ＳＩＬの組合せ
プテロスチルベンを他のポリフェノールと組み合わせてより良好な放射線防護効果を達成することができるかどうかを解明するために、スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）をプテロスチルベン及び／又は他のポリフェノールで処置した。経口投与の場合に、ＰＴを２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン中に可溶化した後に、０．３％のカルボキシメチルセルロース中に懸濁した。アッセイした他の全てのポリフェノール系植物化学物質は、主要なフラボノイド及び非フラボノイド、すなわち没食子酸（フェノール酸）、コーヒー酸（ヒドロキシ桂皮酸）、クルクミン（クルクミノイド）、没食子酸エピガロカテキン（フラバノール）、ゲニステイン（イソフラボン）、ケルセチン（フラボノール）、ルテオリン（フラボン）、ナリンゲニン（フラバノン）、デルフィニジン（アントシアニジン）、及びフロリジン（カルコン）に相当し、これらをＰＴとして可溶化した後に経口投与した。公表された最大非毒性用量から各植物性化学物質の用量を選択した。データをＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定で分析した（^＊全ての群をビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している、^＋全ての群をＰＴだけで処置された群に対して比較している）（図２）。

【0191】

これらの結果により、ＰＴと様々なポリフェノールとの組合せが様々な効果をもたらすことが明らかになった：
ａ）幾つかの場合には、この組合せにより、ＰＴを個別に投与してもたらされる生存率よりも低い生存率が得られた。これは、例えば、照射６０日後のＰＴと没食子酸との組合せにおいて見られる。
ｂ）幾つかの場合には、２種の化合物の組合せにより得られる生存率は、ＰＴを単独で投与することによりもたらされた生存率と同様であったことから、他の化合物の添加が全生存率に殆ど影響を及ぼさないことを示している。これは、例えば、照射６０日後のＰＴとデルフィニジンとの組合せにおいて見られる。
ｃ）幾つかの他の場合には、得られる生存率は、２種の化合物を個別に投与することによって及ぼされる生存率の合計にほぼ等しくなる。これは、例えば、照射６０日後のＰＴとゲニステインとの組合せにおいて見られる。
ｄ）最後に、最も重要なことには、２種の化合物を組み合わせた結果として得られた生存率は相乗効果を生じ、これは個別に投与された２種の化合物の効果の合計からは導き出すことができない生存率の例外的な増加をもたらした。この最後の場合はシリビニン（ＳＩＬ）及びＰＴの組合せでのみ起こり、照射３０日後及び照射６０日後の両方で起こった。

【0192】

まとめると、これらの結果は、ＳＩＬ＋ＰＴの組合せが相乗的な放射線防護効果を発揮し、こうしてγ線照射３０日後及びγ線照射６０日後に高い生存率のパーセンテージを達成することを示している。

【0193】

この結果を考慮して、より長い期間にわたる生存率の向上及び放射線防護の強化を研究した。スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）を、ＰＴ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＩＬ（７０ｍｇ／ｋｇ）×７日間（γ線照射前の５日間及びγ線照射後の２日間）でＩＰ処置した。ＩＰ投与の場合に、ＰＴ塩（プテロスチルベンリン酸二ナトリウム塩、SYNCOM、オランダ、フローニンゲン）及びＳＩＬ塩（シリビニン－Ｃ－２’，３－二水素コハク酸二ナトリウム塩、Rottapharm/Madaus、ドイツ、ケルン）をワクチン接種グレードの滅菌水中に溶解した。図３Ａは、カプラン－マイヤー曲線、及びＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定（^＊ＰＴ＋ＳＩＬで処置された群をビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している）を示す。多数のマウスへの定期的な投与を容易にするのにＩＰ投与を選択した。図３Ａから分かるように、ＰＴ＋ＳＩＬの組合せにより、照射後１年間の時間後におよそ２５％（５／２０）の生存率で長期間の防護がもたらされた。これらの結果は、これら２種の化合物を組み合わせて投与した場合の相乗的な増強効果を裏付け、それらの組み合わせられた放射線防護効果が長期間持続することを実証している。

【0194】

さらに、図３Ｂは、γ線照射前又はγ線照射後のＰＴ＋ＳＩＬ投与間の比較を示す：スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）をＰＴ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＩＬ（７０ｍｇ／ｋｇ）×７日間（ＬＤ５０／３０のγ線照射前の５日間及びγ線照射後の２日間、明灰色のバー、又はγ線照射後の７日間、暗灰色のバー）でＩＰ処置した。データをＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定で分析した（^＊照射後に処置された群を照射前に処置された群に対して比較している）。これらの結果は、照射前にポリフェノールが投与されると生存率がより高いことを示している。

【0195】

次に、γ線照射（ＬＤ５０／３０）されたマウスの生存に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）の効果、並びに体重に対する効果：スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）を、ＰＴ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＩＬ（７０ｍｇ／ｋｇ）×７日間（γ線照射前の５日間及びγ線照射後の２日間）でＩＰ処置した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（^＊Ｐ＜０．０１、ＰＴ＋ＳＩＬをビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している）。これらの結果を図４Ａに示す。ここでは、ポリフェノールが放射線誘発性の体重減少を軽減することが理解され得る。

【0196】

マウスにおける全身放射線誘発性の神経運動機能の変化に対するプテロスチルベン（ＰＴ）及びシリビニン（ＳＩＬ）を組み合わせた投与の効果も研究した：スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）を、ＰＴ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＩＬ（７０ｍｇ／ｋｇ）×７日間（γ線照射前の５日間及びγ線照射後の２日間）でＩＰ処置した。神経運動機能を研究するのに、標準化されたロータロッド試験を以下のように実施した：試験の機能には、特に実験薬の効果の試験において、被験体のバランス、握力、及び運動協調性の評価が含まれる。この試験（ロータロッド、Harvard Apparatus、マサチューセッツ州ホリストン）では、各動物に３回の試験を行い、回転心棒（３．５ｃｍの直径、回転速度：１５ｒｐｍ）上で落下せずに留まることができた最大期間（秒）を測定した。各マウスには、１２００秒の任意の限界内で最大３回の試行を行い、最長期間を記録した。異なる群における経時的変化を毎週監視した。図４Ｂに示されるように、これらの結果により、神経運動機能が放射線及び／又はＰＴ及びＳＩＬの投与のいずれによっても大幅に変化しないことが明らかになった。

【0197】

次に、分離された細胞における様々な抗酸化防御関連の酵素活性の発現分析をＲＴ－ＰＣＲによって研究した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊ＰＴ＋ＳＩＬ＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスをビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している）。これらの結果を図５に示す。放射線は研究された全ての抗酸化防御関連分子の発現を減少させるのに対して、ＰＴ及びＳＩＬは放射線誘発性効果を打ち消すと結論付けられた。

【0198】

さらに、γ放射線誘発性の酸化的損傷に対するＰＴ及びＳＩＬの防護効果を様々な分子マーカーを評価することによって研究した。そのために、ＰＴ、ＳＩＬ、及びγ線を以前に示されたように以前に示された用量／線量（doses）で施し（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）、スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している）。図６に示されるように、ＰＴ及びＳＩＬは、放射線により誘発される様々な酸化ストレス関連のバイオマーカーの増加を打ち消す。

【0199】

ＰＴ及びＳＩＬを組み合わせて投与した場合の放射線防護効果の完全な分析を提供するために、ＧＣＬ及びＧＳＨによって媒介される抗酸化防御も測定した。したがって、ＰＴ、ＳＩＬ、及びγ線を以前に示したように以前に示した用量／線量で施し（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）、スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している）。図７に示されるように、ＰＴ及びＳＩＬは、放射線により誘発される様々なグルタチオン関連のバイオマーカーの減少を打ち消す。

【0200】

図８において、ＰＴ、ＳＩＬ、及びγ線を以前に示したように以前に示した用量／線量で施した場合のカタラーゼレベル及びグルタチオンペルオキシダーゼレベル（図８Ａ及び図８Ｂ）並びにスーパーオキシドジスムターゼレベル（図８Ｃ及び図８Ｄ）を測定した（分子、細胞型、及び処置ごとにｎ＝５）。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している）。これらの結果により、ＰＴ及びＳＩＬが、放射線により誘発される様々な抗酸化酵素活性の減少を打ち消すことが明らかになった。

【0201】

最後に、循環ＣＤ２^＋リンパ球におけるγ放射線誘発性の染色体異常及び小核形成に対するＰＴ及びＳＩＬの効果を研究した。未熟な染色体凝縮融合物のテロメア及びセントロメアを、Ｑ－ＦＩＳＨ技術を使用して染色した。テロメア及びセントロメアの染色を使用して、テロメア染色を有しない間質欠失、末端欠失を表す１つだけのテロメアを有する無動原体染色体、及び二動原体又は環状断片の形成を伴う２つの無動原体染色体の融合から誘導される２つのテロメアを有する無動原体染色体から、二動原体、環状染色体、及び無動原体染色体をスコアリングした。結果として得られる二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を計算した。骨髄において、メイグリュンワルド・ギムザ染色を使用して二重染色を行った。この方法によれば、多染性赤血球（ＰＣＥ）は赤みがかった青色に染色され、正染性赤血球（ＮＣＥ）は橙色に染色されたのに対して、核物質は濃い紫色であった。小核を有する多染性（ＭｎＰＣＥ）細胞及び正染性（ＭｎＮＣＥ）細胞を計数した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋γ線で処置されたマウスをγ線だけで処置されたマウスに対して比較している）。これらの結果を以下の表２に示す。

【0202】

【表2】

【0203】

表２から分かるように、ＰＴ及びＳＩＬは、全ての放射線誘発性の細胞遺伝学的変化、すなわち染色体の変化及び小核の形成を減少させる。

【0204】

実施例４：ＰＴ及びＳＩＬと放射線緩和剤との組合せ
次に、本発明者らは、放射線防護剤（放射線により引き起こされる直接的な損傷を軽減することができる分子）及び放射線緩和剤（放射線が照射された後でも毒性を最小限に抑える分子）の組合せがより長い生存に有利に働き得るかどうかを調べた。これを研究するために、ＰＴ及びＳＩＬをＮＡＤ^＋ブースターのニコチンアミドリボシド（ＮＲ）及びトール様受容体２／６アゴニストのＦＳＬ－１リポペプチド（ＦＳＬ－１）と組み合わせた。

【0205】

最初に、放射線緩和特性を確認するために、両方の分子単独の効果及びそれらを組み合わせた効果を研究した。そのために、ＮＲ（ニコチンアミドリボシド、３－アミノカルボニル－１－β－Ｄ－リボフラノシル－ピリジニウム、Elysium Health, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク）をワクチン接種グレードの水中に溶解し、溶液のｐＨを中性（ｐＨ７．０）した後に経口投与した（１８５ｍｇ／ｋｇ×日）。ＦＳＬ－１（線維芽細胞刺激性リポペプチド１、InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）をワクチン接種グレードの滅菌水中に再懸濁し、ＩＰ投与した（０．２５ｍｇ／ｋｇ×日、投与容量は、マウスの体重に応じて５０ｍＬ～６０ｍＬであった）。ＮＲを、照射後から開始して１日１回の単回用量で３０日間毎日投与した。ＦＳＬ－１を、照射２４時間後に１回だけ投与した。使用したマウスの総数は２０匹であった。これらの結果を図９に示す。ここで、これらの分子のそれぞれを単独で投与することによってもたらされるγ線照射６０日後の生存率は、ＮＲでは０％であり、ＦＳＬ－１では５％であり、ＮＲ＋ＦＳＬ－１の組合せでは１０％であることが観察される。

【0206】

次に、スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝６）を、事前に計画した通りに上記に示した用量にてＰＴ、ＳＩＬ、又はＮＲで処置し、スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を行った（Ｐ＜０．０１；^＊１２０分を３０分に対して比較している；^＋２日を０日に対して比較している；^＃３日又は１５日を０日に対して比較している）。これらの結果を図１０に示す。この図から分かるように、ＰＴ及びＳＩＬのレベルはそれらの投与から３０分後により高くなるが、ＮＲ誘発性のＮＡＤ^＋レベルは測定された２つの時点（３０分及び１２０分）で同様であることが判明した。

【0207】

次に、４種の化合物ＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１を、上記に示したように上記に示した用量で１群当たりｎ＝２０のマウスにおいて投与した。図１１Ａは、従った投与計画を示す。図１１Ｂは、カプラン－マイヤー曲線及びＬｏｇＲａｎｋ（マンテル－コックス）検定を示す（^＊全ての群をビヒクルで処置されたコントロールに対して比較している；^＋ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＳＬ－１で処置された群をＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲで処置された群又はＰＴ＋ＳＩＬ＋ＦＳＬ－１で処置された群に対して比較している）。驚くべきことに、ＮＲ及びＦＬＳ１をＰＴ及びＳＩＬと組み合わせた場合にも、マウスの生存が最長１年間延長されたので相乗効果が見られた。重要なことには、４種の成分の組合せにより、処置されたマウスの最大９０％の防護及び生存がもたらされたことから、これは４種の成分の組合せにより、照射されたマウスの長期生存が達成されることを示している。

【0208】

γ線照射されたマウス（ＬＤ５０／３０）における死因、及び４種の化合物を組み合わせた投与の効果を図１２に示されるように研究した。スイスアルビノマウス（１群当たりｎ＝２０）を、事前に計画した通りに上記に示した用量にてＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１で処置したところ、これらの結果によれば、完全な組合せ（ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＳＬ－１）により、ａ）消化管及び造血器のＡＲＳ、並びにｂ）腎症に関連する全ての死亡が回避されることが明らかになった。完全な組合せにより、骨髄性白血病及び感染症／炎症に関連する死亡も最小限に抑えられた。

【0209】

次に、γ放射線誘発性の毒性、並びにＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、及びＦＳＬ－１の組合せ（ＰＳＮＦと略す）により引き起こされる予防を研究した。これらの結果を以下の表３に示す：

【表3】

【0210】

表３から分かるように、完全な組合せ（ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＳＬ－１）による処置は、放射線誘発性の毒性を改善するのに役立つ。

【0211】

最後に、４種の組み合わせた化合物（ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋ＦＳＬ－１；ＰＳＮＦ）による処置が腫瘍異種移植片における抗癌放射線療法（Ｘ線）の治療有効性を妨げるかどうかを解明するために、雌のｎｕ／ｎｕヌードマウス（６週齢～８週齢）（１群当たりｎ＝５のマウス）に、マウス当たり５×１０^６個のＡ５４９（肺腺癌）細胞又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳癌）細胞を皮下接種した。腫瘍体積を、ノギスを使用して測定された２つの寸法に基づいて計算し、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である）に従って立方ミリメートルで表した。腫瘍には、Philips製の６－ｋｅＶ ＳＬ７５線形加速器を使用してＸ線（１０Ｇｙ）を照射した。単回照射放射線療法を、５．０Ｇｙ／分の速度で施した。ＰＳＮＦ投与についてのプロトコルは上記で説明したものと同一であり、放射線療法を２１日目に施した。統計分析をスチューデントのｔ検定を使用して実施した（Ｐ＜０．０１；^＊全ての群をコントロールに対して比較している；^＋γ線＋ＰＳＮＦで処置された群をγ線だけで処置された群に対して比較している）。

【0212】

これらの結果を図１３に示す。ここでは、４種の化合物の組合せがＸ線による抗癌処置の有効性を減じないことが分かり、こうして、上記放射線療法処置を受けている患者にこれらの化合物を使用する実現可能性が立証される。

【0213】

まとめると、これらの結果は、放射線によって引き起こされる損傷から防護し、緩和するための、少なくともＰＴ及びＳＩＬと、任意にＮＲ及びＦＳＬ－１とを含む組成物の使用を支持している。図３Ａ及び図１１Ｂに示されるように、これらの化合物の放射線防護効果が長期間（１年以上）延長されたことに留意することが重要である。

【0214】

実施例５：プテロスチルベン、シリビニン、及びニコチンアミドリボシドは細胞ＤＮＡ損傷を減少させ、ＦＳＬ－１リポペプチドは造血系の回復を促進する
図１４ａに示されるように、ＮＲ処置は、様々な細胞型においてＮＡＤ^＋含有量を増加させ、γ放射線によって誘発されるＮＡＤ^＋の減少も予防する。単独で投与されたＰＴ＋ＳＩＬは、研究したどの細胞においてもＮＡＤ^＋レベルに影響を与えず、ＮＲによって引き起こされる増加にも影響を与えなかった（結果は示していない）。ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の特異的非競合的阻害剤であるＦＫ８６６の投与は、ＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ又はＰＴ＋ＳＩＬ＋ＮＲ＋γ線で処置されたマウスにおいてＮＡＤ^＋レベルを減少させた（図１４ａ）。ＦＫ８６６によって誘発されるＮＡＤ^＋枯渇は、ＮＡＭＰＴ活性の劇的な減少と関連していた（図１４ｂ）（ＰＴ、ＳＩＬ、ＮＲ、ＦＳＬ－１、及び／又はγ放射線は、ＦＫ８６６によって誘発されるＮＡＭＰＴ活性の阻害の速度に影響を与えなかった（示していない））。重要なことには、図１４ｃに示されるように、ＤＮＡ損傷コメットアッセイに基づくと、ＰＴ＋ＳＩＬ又はＮＲがＤＮＡ回復に有利に働き、それらの組合せが最も有効であった（図１４ｃ）。恐らく、ポリフェノールの効果は抗酸化物質に関連した機構であるのに対して、ＮＲによって誘導されるＮＡＤ^＋の増加はＤＮＡ修復活性を直接的に促進する。図１４ｄに示されるように、ＦＳＬ－１は、造血コロニー形成細胞ＣＦＵ－ＧＭ（コロニー形成単位－顆粒球、マクロファージ）及びＣＦＵ－ＧＥＭＭ（コロニー形成単位－顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）を増加させる。したがって、照射後の造血回復の確認は、上記の表３における血液学に基づくデータによって示唆される。

【0215】

放射線防護機構におけるＮｒｆ２、ＮＦ－κＢ、ＰＧＣ－１α、及びＰＡＲＰ１の相互作用
分離された腸上皮細胞を使用して、ＰＴ＋ＳＩＬの組合せによって引き起こされる防護効果に関与し得る潜在的なシグナル伝達経路を調査した。図５～図８において報告されたデータに基づけば、ＰＴ＋ＳＩＬはγ放射線誘発性の酸化的損傷に対して防護を発揮する。恐らく、観察された防護は、Ｎｒｆ２（核因子赤血球２関連因子２）依存性の抗酸化防御の誘導によるものである（図５～図８）。両方のポリフェノールについて抗炎症特性が報告されていることから、ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー）依存性シグナル伝達の関与が示唆される。ＮＲによって誘発されるＮＡＤ^＋の増加はまた、ＰＡＲＰ１（ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ１）依存性のＤＮＡ修復、サーチュイン活性、及びＰＧＣ－１α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１α）の活性化にも有利に働くことになる。さらに、ＰＴはＰＧＣ－１α、Ｎｒｆ２活性化、及びＳｉｒｔ１発現を誘発し得る一方で、ＳＩＬはＳｉｒｔ３発現及びＰＡＲＰ１活性に影響を与える可能性がある。図１５ａに示されるように、コントロールと比較して、ＰＴ及びＳＩＬはどちらも核Ｎｒｆ２を増加させ、一方で核ＮＦ－κＢレベルを減少させた。Ｎｒｆ２の場合に、ＰＴの効果はＳＩＬによって発揮される効果よりも顕著である。これらの効果は、全体として、ＮＦ－κＢ依存性炎症誘発応答を下方調節しながら抗酸化防御を促進するという協調的な効果を示唆している。ｐＰＧＣ－１αもＰＴによって増加した（図１５ａ）。Ｓｉｒｔ１レベルはＰＴによって増加した。興味深いことに、ＳＩＬ単独ではＳｉｒｔ１レベルに影響が及ぼされなかったが、２種のポリフェノールを組み合わせると、ＰＴ単独よりもＳｉｒｔ１レベルが増加した（図１５ａ）。ＰＴ及びＳＩＬのどちらもＳｉｒｔ３レベルを増加させたが、Ｓｉｒｔ３に対するＳＩＬの効果はより強力であった（図１５ａ）。ＰＴ及びＳＩＬのどちらもＰＡＲＰ１を増加させた（図１５ａ）。図１５ｂは、これらのシグナル伝達カスケード間に考えられる分子相互関係と、ＰＴ及びＳＩＬがそれらの効果を発揮し得る段階とを概説している。どの特定の分子が放射線防護効果における決定要因となり得るかを更に調査するために、本発明者らは、分離されたＩＥＣ（図１１ａでのように、コントロール又はＰＴ＋ＳＩＬで処置されたマウスから）及び遺伝子サイレンシングに基づくアプローチを使用した。図１５ｃに示されるように、マウスのＮｆκｂｉｅ、Ｎｆｅ２ｌ２、Ｐｐａｒｇｃ１、Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ３、Ｐａｒｐ１、ＳＯＤ２、又はＧＰＸ１の遺伝子発現を標的とするｓｉＲＮＡは、遊離ＮＦ－κＢの増加及び他の全ての分子標的の下方調節を促進する。ｉｎ ｖｉｖｏで誘発される放射線防護的防御の保存を確実にする濃度のＰＴ＋ＳＩＬの不存在下又は存在下で（図１５のキャプションを参照のこと）、そして特定のｓｉＲＮＡの存在下で、分離されたＩＥＣを２４時間培養した。図１５ｄに示されるように、ＰＴ及びＳＩＬは、コントロール（ビヒクルで処置された）細胞において観察されたγ線照射誘発性細胞死を劇的に減少させた。γ線に曝された細胞における特定のＲＮＡの効果に基づく細胞死分析は、Ｎｒｆ２、ｐＰＧＣ－１α、ＳＯＤ２、及びＳｉｒｔ３が、ポリフェノールによる処置によって引き起こされる放射線防護効果の主たる要因であることを示している（図１５ｄ）。

【0216】

結論
ここで、本発明者らは、全身投与されたＰＴのγ放射線に対する効果を調査し、ＰＴ及びＳＩＬを組み合わせることによって高い生存率のパーセンテージが得られることを見出した。さらに、放射線誘発性損傷を減少させ、生存率を高める方略としての潜在的な放射線防護剤及び放射線緩和剤の関連性は、依然として未開発の分野である。本研究は、致死的（ＬＤ５０／３０）γ線照射を受けたマウスにおいて長期生存を達成することができる組合せの効力を示している。長期生存を実証するこの新規の方略は、今後のパラダイムとして役立つ可能性がある。したがって、放射線防護剤及び／又は放射線緩和剤として試験されている多数の分子を考慮すると、このパラダイムはこの分野を切り開く助けとなる可能性がある。ＰＴ及びＳＩＬは、様々な細胞型における抗酸化防御を上方調節し、γ放射線誘発性の酸化的損傷及び細胞遺伝学的変化（染色体異常及び小核形成）を減少させる。図１５に示されるように、ＰＴ及びＳＩＬによって引き起こされる防護には、相互に関連する異なるシグナル伝達機構が関与している可能性がある。酸化ストレス及び炎症は、細胞を有害な電離放射線に曝露することによって活性化される直接的な病態生理学的機構である。ＰＴ及びＳＩＬは、様々な細胞型において核Ｎｒｆ２及び抗酸化剤応答を増加させるのに対して（図１５）、これらは、ＮＦ－κＢ（図１５）及び恐らく放射線関連の炎症応答を減少させる。さらに、ＰＴはＳｉｒｔ１レベルを増加させ、それによりＰＧＣ－１αの脱アセチル化が促進される（図１５）。ＰＧＣ－１αはＳｉｒｔ３発現の誘導因子であり、図１５に示されるように、ＳＩＬ処置はＳｉｒｔ３レベルの増加とも関連している。ミトコンドリアのＳＯＤ２（Ｓｉｒｔ３によって脱アセチル化される）及びＧＳＨペルオキシダーゼ（サイトゾルからのＧＳＨの取り込みに依存する）は、ミトコンドリア由来のＲＯＳを減少させ、アポトーシスの活性化を防ぐように働くと考えられる。重要なことには、図１５ｃ及び図１５ｄに示されるように、遺伝子サイレンシングに基づくアプローチにより、ＰＴ及びＳＩＬによる組み合わせた処置によって引き起こされる放射線防護効果への手がかりとして、Ｎｒｆ２、Ｓｉｒｔ３、及びＳＯＤ２を結び付ける経路が特定された。さらに、ＮＲはＮＡＤ^＋を生成してＳｉｒｔ１及びＳｉｒｔ３の活性並びにＰＡＲＰ１依存性のＤＮＡ修復を支持する（図１５）。ＰＡＲＰ１活性も両方のポリフェノールによって誘導される（図１５）。ピリジン－ヌクレオシド形のビタミンＢ３であるＮＲは、他の形のＢ３（ニコチン酸及びニコチンアミド）に対して優れた薬物動態プロファイルを備えたＮＡＤ^＋の前駆体であるため、これは最適なＮＡＤ^＋ブースターに相当する。

【0217】

本研究は、２種の放射線防護剤であるプテロスチルベン及びシリビニンと、２種の放射線緩和剤であるニコチンアミドリボシド及び線維芽細胞刺激性リポタンパク質１との組合せが、マウスにおける致死線量の放射線に対する正常組織の長期間防護を与えることができることを実証している。これら４種の分子の確立された安全性プロファイルからも、この組合せをヒトへのその応用につなげる研究の継続が必要とされることは明らかである。理想的な放射線防護剤又は放射線緩和剤は、安定であり、容易に投与することができ、関連する全身毒性を有さず、放射線誘発性の損傷から正常組織を防護するべきである。提案された組合せはこれらの基準を満たしており、一方で、高い有効性が実証されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【配列表】

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【国際調査報告】