特表 2024-504651 脳の損傷の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-01

(54)【発明の名称】脳の損傷の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/06 20060101AFI20240125BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240125BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20240125BHJP

【ＦＩ】

A61K36/06 Z

A61P25/00

A61P37/04

A61P43/00 107

A61P35/00

A61P31/00

A61P9/10

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

C07K14/33 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023542964

(86)(22)【出願日】2022-01-14

(85)【翻訳文提出日】2023-09-06

(86)【国際出願番号】 GB2022050077

(87)【国際公開番号】W WO2022153057

(87)【国際公開日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】2100566.5

(32)【優先日】2021-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517340507

【氏名又は名称】イプセン バイオファーム リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＢＩＯＰＨＡＲＭ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カリニチェフ，ミハイル

【テーマコード（参考）】

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC68

4C087CA06

4C087MA56

4C087MA59

4C087MA65

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZB09

4C087ZB22

4C087ZB26

4C087ZB32

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA11

4H045DA83

4H045EA21

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、神経免疫応答を促進することによって患者の脳の障害を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経免疫応答を促進することによって患者の脳の障害を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項2】

神経免疫応答を促進することによって患者の脳組織損傷を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項3】

当該クロストリジウム神経毒素が当該脳におけるミクログリア細胞活性を促進する、請求項1または2に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項4】

当該クロストリジウム神経毒素が脳組織損傷の部位へのミクログリア細胞遊走を促進する、請求項1～3のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項5】

当該クロストリジウム神経毒素が脳組織損傷の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進する、請求項1～4のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項6】

当該クロストリジウム神経毒素が感染の部位へのミクログリア細胞遊走を促進する、請求項1～5のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項7】

当該クロストリジウム神経毒素が感染の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進する、請求項1～6のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項8】

当該神経免疫応答が当該クロストリジウム神経毒素の投与後に≦60分で促進される、請求項1～7のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項9】

当該神経免疫応答が当該クロストリジウム神経毒素の投与後に≦10分で促進される、請求項1～8のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項10】

当該神経免疫応答が脳組織損傷の生起後に≦48時間に亘って促進される、請求項1～9のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項11】

当該神経免疫応答が脳組織損傷の生起後に≦24時間に亘って促進される、請求項1～10のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項12】

当該クロストリジウム神経毒素が当該患者の頭部への局所投与によって投与される、請求項1～11のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項13】

当該クロストリジウム神経毒素が皮下または頭蓋内注射によって当該患者の頭部への局所投与によって投与される、請求項1～12のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項14】

当該クロストリジウム神経毒素が頭蓋内注射によって投与される、請求項1～13のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項15】

当該クロストリジウム神経毒素が脳組織損傷が生起する前に投与される、請求項1～14のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項16】

当該クロストリジウム神経毒素が、脳組織損傷が生起する≦4日前に投与される、請求項1～15のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項17】

当該クロストリジウム神経毒素が、脳組織損傷が生起する前の1～3日の間に投与される、請求項1～16のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項18】

当該クロストリジウム神経毒素が、脳組織損傷の生起の≦24時間後に投与される、請求項1～17のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項19】

当該クロストリジウム神経毒素が脳組織損傷の生起の≦2時間後に投与される、請求項1～18のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項20】

当該クロストリジウム神経毒素が脳組織損傷の生起の≦10分後に投与される、請求項1～19のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項21】

当該脳の障害が、外傷性脳損傷、癌、感染性疾患、卒中、神経変性障害、脳動脈瘤、多発性硬化症、無酸素性傷害、中毒性傷害、および/または代謝性傷害によって引き起こされる、請求項1～20のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項22】

当該脳の障害が非外傷性脳損傷によって引き起こされる、請求項1～21のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項23】

当該脳の障害が癌、感染性疾患、および/または卒中によって引き起こされる、請求項1～22のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項24】

当該脳の障害が感染性疾患によって引き起こされる、請求項1～23のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項25】

当該脳の障害が、脳炎、髄膜炎、および脳膿瘍から選択される感染性疾患によって引き起こされる、請求項1～24のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項26】

当該脳の障害が、脳炎および髄膜炎から選択される感染性疾患によって引き起こされる、請求項1～25のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項27】

当該脳の障害が卒中によって引き起こされる、請求項1～26のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項28】

当該脳の障害が、以下から選択される神経変性障害によって引き起こされる、請求項1～27のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素:アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、運動ニューロン疾患(例えば筋萎縮性側索硬化症)、プリオン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、運動失調、ハラーフォルデン・シュパッツ病、および前頭側頭葉変性症。

【請求項29】

当該クロストリジウム神経毒素が皮下、頭蓋内、髄腔内、または鼻腔内投与される、請求項1～28のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項30】

当該クロストリジウム神経毒素がボツリヌス神経毒素(BoNT)である、請求項1～29のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項31】

当該クロストリジウム神経毒素がボツリヌス神経毒素血清型A(BoNT/A)である、請求項1～30のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【請求項32】

当該クロストリジウム神経毒素がキメラ神経毒素である、請求項1～31のいずれか1項に記載の使用のためのクロストリジウム神経毒素。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は脳の障害の処置に関し、より具体的には、脳組織損傷の部位における神経免疫応答の活性を促進することによる。

【背景技術】

【0002】

脳の障害は典型的にはニューロン組織の損傷または傷害からもたらされ、かかる損傷は、神経学的な障害の背後にあるまたはそれを定義する症状の主因であり得る。例として、患者が卒中を患うときには、脳の血管は詰まるかまたは破裂する(例えば出血)。それゆえに、さもなければ健康な血液供給によって提供されたであろう酸素が枯渇化した脳組織の神経細胞が、傷害されるかまたは死に、神経細胞活性を損なう。神経活性のかかる欠如は、筋力低下、麻痺、体の片側の感覚脱失、構音障害、せん妄、視覚の問題、めまい、平衡感覚および協調運動の喪失、ならびにいくつかの出血性卒中における突然の重症の頭痛を包含する症状に至り得る。

【0003】

さらなる例において、脳の感染性疾患は、脳組織損傷の背後にある細胞死に至り得る。細菌性髄膜炎では、ストレプトコッカス・ニューモニエなどの細菌が髄膜(脳および脊髄組織を傷害から保護することを助ける膜)を侵襲し、髄膜の爾後の損傷が神経細胞死をもたらし得る。ウイルスが脳に達してそれを冒す場合には、神経組織損傷が、脳細胞に対するウイルスの溶解効果(例えばサイトメガロウイルスのケースにおいて)、誘導されたアポトーシス(例えば水疱性口内炎ウイルスVSVのケースにおいて)、またはグルタミン酸、DNA、および脳の損傷の他の誘導因子の放出を原因とする二次的損傷によって引き起こされ得る。

【0004】

脳の癌を患う患者では、腫瘍が、神経細胞を押して圧力をかけることによって脳の神経組織の物理的損傷を引き起こし得る。損傷は転移のケースでは腫瘍の動きによってもまた引き起こされ得る。

【0005】

かかる神経損傷から起こる患者症状を軽減するための処置オプションが存在するが、これらの比較的少しが神経組織の実際の損傷の修復を促進する(他には、前記の修復を易化する)やり方で機能する。例えば、卒中では、唯一の治療オプションは局所的再開通および全身的線溶である(これらは、神経損傷を和らげるために血流を復元することを狙う)。しかしながら、かかる治療オプションは全ての患者にとって好適なわけではなく、および/または尚さらなる損傷を引き起こし得る。

【0006】

本発明は上で言及された問題の1つ以上を解決する。

【発明の概要】

【0007】

より詳細には、本発明は、クロストリジウム神経毒素が、脳の障害によって誘導される神経系の組織の損傷を患う患者に投与されるときに、ニューロン組織損傷のエリアにおける免疫細胞(例えば神経免疫細胞)活性を促進するという驚くべき知見に基づく。換言すると、驚くべきことに、クロストリジウム神経毒素は、脳の障害を患う患者におけるニューロン組織の損傷を防止する/修復するための手段として、神経免疫活性を促進するために用いられ得る。

【0008】

より具体的には、本明細書においては、ミクログリア(脳組織損傷のエリアの近傍に位置付けられる)の活性が、ある用量のクロストリジウム神経毒素を受けた患者において促進されるということが実証される。ミクログリアは、損傷した神経組織および異物をクリアランスすることに関わる脳の鍵のマクロファージである。これは、下で導入されるクロストリジウム神経毒素の驚くべき有用性を表している。

【0009】

クロストリジウム綱の属の細菌は高度に強力なかつ特異的な蛋白質毒素を生成し、これらはそれらが送達されるニューロンおよび他の細胞の機能を(一時的に)損ない得る。かかるクロストリジウム毒素の例は、C.テタニ(TeNT)およびC.ボツリヌム(BoNT)血清型A～GおよびX(WO 2018/009903 A2参照)によって生成される神経毒素、ならびにC.バラティおよびC.ブチリカムによって生成されるものを包含する。

【0010】

公知の最も強力な毒素のいくつかはクロストリジウム神経毒素の仲間である。例として、ボツリヌス神経毒素は、血清型に依存して、0.5から5ng/kgの範囲であるマウスの半数致死量(LD₅₀)値を有する。破傷風およびボツリヌス毒素両方は、冒されたニューロンの機能、具体的には神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス毒素は神経筋接合部において作用し、末梢神経系におけるコリン作動性の伝達を阻害するが、破傷風毒素は中枢神経系において作用する。

【0011】

天然では、クロストリジウム神経毒素は一本鎖ポリペプチドとして合成され、これが蛋白質分解的な切断イベントによって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に接合された2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、多くの場合に活性化部位と言われる特異的な切断部位において生起し、これは鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置付けられる。毒素の活性な形態であるのはこの二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子質量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子質量を有する軽鎖(L鎖)と呼称される。H鎖はN末端の移行コンポーネント(H_Nドメイン)およびC末端の標的化コンポーネント(H_Cドメイン)を含む。切断部位はL鎖およびトランスロケーションドメインコンポーネントの間に位置付けられる。その標的ニューロンに対するH_Cドメインの結合とエンドソームを介する細胞内への結合した毒素の内在化との後に、H_NドメインはL鎖をエンドソーム膜を通してサイトゾルへと移行させ、L鎖はプロテアーゼ機能を提供する(非細胞毒性のプロテアーゼとしてもまた公知)。

【0012】

クロストリジウム神経毒素は非細胞毒性のプロテアーゼ活性を提供する。非細胞毒性のプロテアーゼは、SNARE蛋白質として公知の細胞内輸送蛋白質(例えばSNAP-25、VAMP、またはシンタキシン)を蛋白質分解的に切断することによって作用する。アクロニムのSNAREは用語の可溶性NSF接着受容体に由来し、ここで、NSFはN-エチルマレイミド感受性因子を意味する。SNARE蛋白質は、細胞内小胞融合にとって、それゆえに細胞からの小胞輸送による分子の分泌にとって不可欠である。プロテアーゼ機能は亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNARE蛋白質質に対する高い基質特異性を見せる。従って、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、非細胞毒性のプロテアーゼは標的細胞からの細胞性の分泌を阻害することができる。クロストリジウム神経毒素のL鎖プロテアーゼはSNARE蛋白質を切断する非細胞毒性のプロテアーゼである。

【0013】

SNARE蛋白質の遍在的性質に鑑みて、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム神経毒素は広い範囲の治療に首尾よく採用されている。本発明者は、神経免疫活性を促進することによって脳の障害を処置することにおけるクロストリジウム神経毒素の驚くべき有用性を実証した。

【0014】

脳の障害の普通の特徴は、ホスト自身の神経免疫応答が、脳組織損傷をクリアランスおよび/または防止することによって脳の障害の背後にある損害に反応するということである。感染性疾患のケースでは、(例えば)マクロファージ(例えばミクログリア)が感染の部位に遊走し、侵襲病原体を貪食する生得的な応答があり得る。マクロファージは、貪食と呼ばれるプロセスにおいて細胞デブリ、異物質、微生物、癌細胞、および他の非ホスト因子を呑食および消化する型の免疫系の白血球である。

【0015】

ニューロン細胞死が生起するときには、ミクログリアが病変(損傷)部位に遊走することによって反応し、そこでそれらは細胞デブリを貪食する。それゆえに、ミクログリアは、物理的損傷(例えば脳腫瘍)によって引き起こされる脳組織を除去することによって脳の障害に対して反応性であり得る。例えば、ミクログリア貪食は死細胞をクリアランスし得る。これらは、さもなければ有毒な物質をそれらの環境中に放出し、それによって組織損傷を悪化させ得る。ミクログリアは直接的に脳腫瘍に対する防御において役割を演ずるということもまた報告されている。さらにその上、ミクログリアは「シナプス刈り込み」に関わることが報告されている。これにおいては、それらはシナプス材料を呑食し、いくつかの神経発生障害において見られるシナプス異常を防止することを助ける。

【0016】

それゆえに、ニューロン組織損傷に応答した神経免疫活性を促進することによって、クロストリジウム神経毒素投与は有利には脳の障害を処置することにおいて有用性を見出す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の一般的な態様は次のいずれかを提供する:
-脳の障害を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素;
-患者の脳の障害を処置する方法であって、方法は患者にクロストリジウム神経毒素を投与することを含む;
-患者の脳の障害を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用。

【0018】

本発明の一般的な態様は次のいずれかを提供する:
-脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素;
-患者の脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法であって、方法は患者にクロストリジウム神経毒素を投与することを含む;
-患者の脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用。

【0019】

本発明の一般的な態様は次のいずれかを提供する:
-脳感染を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素;
-患者の脳感染を処置する方法であって、方法は患者にクロストリジウム神経毒素を投与することを含む;
-患者の脳感染を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用。

【0020】

クロストリジウム神経毒素は神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳の障害を処置するために、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置するために、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0021】

クロストリジウム神経毒素は、(例えばニューロン組織損傷に応答して)ミクログリア活性を促進することによって脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳の障害を処置するために、ミクログリア活性を促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は(例えばニューロン組織損傷に応答して)ミクログリア活性を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置するために、ミクログリア活性を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0022】

クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷の部位への(例えばニューロン組織損傷への)ミクログリア遊走を促進することによって脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷の部位へのミクログリア遊走を促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷の部位への(例えばニューロン組織損傷への)ミクログリア遊走を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷を処置するために、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位へのミクログリア遊走を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0023】

クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷を処置するために、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0024】

クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって、脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷を処置するために、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0025】

クロストリジウム神経毒素は、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳の障害を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳の障害を処置するために、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳の障害を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置するために、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を処置する方法における使用のためであり得る。

【0026】

クロストリジウム神経毒素は、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、神経免疫(例えばミクログリア)応答を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0027】

クロストリジウム神経毒素は、(例えば感染に応答して)ミクログリア細胞活性を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、ミクログリア細胞活性を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、ミクログリア細胞活性(例えば感染に応答して)を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、ミクログリア細胞活性を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0028】

クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位へのミクログリア細胞遊走を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位へのミクログリア細胞遊走を促進することによって、脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位へのミクログリア遊走を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、脳感染の部位へのミクログリア細胞遊走を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0029】

クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって、脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、脳感染の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0030】

クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって、脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、脳感染の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、脳感染の部位における細胞デブリのミクログリアクリアランスを促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0031】

クロストリジウム神経毒素は、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳の障害を処置するために、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。クロストリジウム神経毒素は、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳感染を処置し得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳感染を処置するために、感染に対するミクログリア応答を促進することによって脳感染を処置する方法における使用のためであり得る。

【0032】

1つの態様において、神経免疫応答を促進することによって、患者の脳の障害を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素が提供される。換言すると、1つの態様は、脳の障害を処置するために神経免疫応答を促進することにおける使用のためのクロストリジウム神経毒素を提供する。

【0033】

関係する態様において、神経免疫応答を促進することによって患者の脳の障害を処置する方法が提供され、方法はクロストリジウム神経毒素を患者に投与することを含む。換言すると、1つの態様は、患者の脳の障害を処置するために神経免疫応答を促進するための方法を提供し、方法はクロストリジウム神経毒素を患者に投与することを含む。

【0034】

さらなる態様において、神経免疫応答を促進することによって患者の脳の障害を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用が提供される。換言すると、1つの態様は、患者の脳の障害を処置するために神経免疫応答を促進するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用を提供する。

【0035】

それゆえに、本明細書に記載されるクロストリジウム神経毒素は神経免疫応答を促進する。そのため、クロストリジウム神経毒素(単数または複数)は脳の障害を処置することにおいて有用性を見出す。本明細書において用いられる用語「脳の障害」(これは本明細書においては用語「脳の損傷」と同義で用いられ得る)は、患者の神経免疫応答を促進することによって処置され得る障害である。脳の障害は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)によって引き起こされ得る。加えてまたは代替的には、脳の障害はニューロン組織損傷を引き起こし得る。そのため、神経免疫応答活性の促進は、ニューロン組織損傷の修復を促進し、それゆえに脳の障害からの回復を増強する効果を有し得る。

【0036】

用語「脳組織損傷」は本明細書においては用語「脳組織傷害」と同義で用いられ得る。類似に、用語「ニューロン組織損傷」は本明細書においては用語「ニューロン組織傷害」と同義で用いられ得る。

【0037】

1つの実施形態において、神経免疫応答はミクログリア応答として定義され得る。それゆえに、クロストリジウム神経毒素は脳におけるミクログリア活性を促進する。

【0038】

ミクログリアは、中枢神経系(特に脳)におけるマクロファージ様細胞の集団を表している。それらは、典型的には、強力な炎症性の応答を編成することができる免疫センチネルと考えられる。ミクログリアは、シナプス組織化、発生の間のニューロンの栄養サポート、発生する脳におけるアポトーシス細胞の貪食、ミエリンターンオーバー、ニューロン興奮性のコントロール、貪食的なデブリ除去、ならびに脳の保護および修復にもまた関わる。

【0039】

1つの態様において、(例えば脳において)ミクログリア活性を促進することによって患者の脳の障害を処置する方法に使用するためのクロストリジウム神経毒素が提供される。換言すると、1つの態様は、脳の障害を処置するために、(例えば脳において)ミクログリア活性を促進することにおける使用のためのクロストリジウム神経毒素を提供する。脳組織(例えばニューロン組織)損傷の文脈において、ミクログリア活性は、損傷した組織を修復する(またはクリアランスする)ように促進され得る。ミクログリア細胞(例えばマクロファージ)活性の限定しない例は、神経または脳組織損傷の部位における貪食活性(例えば細胞デブリのクリアランス)を包含する。

【0040】

それゆえに、理論によって拘束されることを欲することなしに、本発明が基づく1つの観察された効果は、ニューロン損傷(これは脳の障害によって引き起こされ得るかまたは実際にそれを引き起こす)に応答することにおける神経免疫応答の役割を促進して、かかる損傷をクリアランス/修復する能力である。それゆえに、当然のことながら、個体の内因的な神経免疫応答は既にニューロン損傷と戦闘するための作用および働きに携わり得るが、本発明は有利な「ブースト」をかかる応答に提供し、これは、損傷を処置することに向けて、神経免疫応答のより速い発生、ニューロン損傷の部位への神経免疫細胞の増大したリクルート、および/または神経免疫細胞の増大した活性と相関し得る。アウトカムとして、傷害(例えばニューロン組織傷害)からの増強された回復が後続し得る。

【0041】

かかる技術的な効果を実証するために、本発明者は、「2光子」イメージングおよびレーザーテクノロジーをトランスジェニックマウスモデルとカップリングし、直接的にインビボの脳の設定内で動物自身のミクログリア細胞の活性の高分解能の追跡を可能にした。動物モデル(CX3CR1-GFPマウス)はそれらのミクログリア細胞内でGFPを発現し、細胞が蛍光顕微鏡法によってイメージングおよび追跡されることを可能にする。

【0042】

本明細書に記載される「脳の障害」において(例えば脳感染において)生起するものに相当するニューロン損傷を誘導するために、本発明者は2光子顕微鏡法テクノロジーを採用して、脳におけるレーザーによって誘導される傷害の明確な焦点を提供した。より詳細には、マイクロメートルサイズ対象領域(ROI)が皮質表面から25～35マイクロメートルの深さの焦点面上に選択され、レーザー強度がこの焦点領域に適用されて、損傷した脳組織の局所的な明確な領域を提供した。脳組織損傷のかかる明確な領域は、(例えば卒中後の)脳の低酸素を原因として、成長して行く脳腫瘍を原因として、および/または感染後の腫脹(例えば脳炎)を原因として生起し得るものを模倣しながら、誘導された(induce)組織損傷の明確な空間をコントロールされたエリアの周りのミクログリア細胞の検討をもまた可能にする。

【0043】

例の項で実証される通り、ミクログリアは、損傷の特定の部位への遊走と、貪食活性と整合した表現型を採ることとによってこの損傷に応答した。しかしながら、驚くべきことに、かかる活性はクロストリジウム神経毒素(例えばBoNT/A)が投与されたマウスにおいて有意に増大し、脳の損傷に対する患者の神経免疫応答を促進することにおけるクロストリジウム神経毒素の予想されない技術的効果を実証した。

【0044】

それゆえに、クロストリジウム神経毒素は、脳(例えばニューロン組織)損傷からの回復を増強することにおいて有用性を見出し、それゆえに、脳の損傷の修復を要求する患者の明確な臨床サブセットを処置するために用いられ得る。有利には、かかる修復は患者自身の神経免疫応答によって編成され、これはクロストリジウム神経毒素の投与後に増強/促進される。この効果を提供することに向けたステップ(単数または複数)、つまり、皮質内注射などの経路によるクロストリジウム神経毒素の投与は、比較的(脳手術に対して)達成可能なかつ非侵襲的な技術である。それゆえに、複雑な外科的介入(脳手術)の必要が和らげられ得る。

【0045】

脳の損傷を患う患者は本発明による処置に特に適しているという指摘から続いて、かかる患者の尚さらなる臨床サブセット(またはサブ-サブセット)は、神経免疫応答活性の「内因的な」レベルが組織損傷を処置するためには不十分である患者によって表され得る。換言すると、クロストリジウム神経毒素の投与によって提供される本発明の実証される技術的効果(単数または複数)は、神経免疫応答の患者の内因的なレベルに依拠するときに後続するであろうものに対してそれらの予後を改善するために、(傷害に対する)それらの神経免疫応答の「ブースト」から利するであろう患者において、特定の臨床的有用性を提供する。

【0046】

かかる有用性は、脳の障害を処置するためにかかる神経毒素を採用する従来技術の方法におけるクロストリジウム神経毒素の主張される機能とは対照をなす。クロストリジウム神経毒素はSNARE蛋白質を切断するように機能し、神経伝達物質分泌を抑制するので(本明細書において他所で詳細に説明される通り)、従来技術の方法は、神経伝達物質放出の神経毒素によって媒介される防止を実現するために、クロストリジウム神経毒素の投与によって脳のニューロン活性を抑制することを求めてきた。例えば、てんかんにおいて「異常な」活性を示す脳の領域へと、さもなければ発作と相関し得るかかる異常な活性を抑制するために、神経毒素を標的化することが提案されている。他の従来技術は、さもなければ過活性な抑制性のコリン作動性ニューロン(例えば脳の線条体に存在する)を標的化して(かつ抑制して)運動障害と相関するニューロン活性を抑制することを提案している。

【0047】

しかしながら、かかる従来技術の方法には、組織損傷の修復は関わらなかった。ましてや、神経免疫細胞活性のクロストリジウム神経毒素によって誘導される促進にはよらない。ニューロン活性を抑制する代わりに、本発明は損傷したニューロンの除去/修復を対象とする。それゆえに、本発明は、脳組織損傷を処置することによって;より具体的には、かかる損傷を処置することにおいて神経免疫細胞活性を促進することによって、脳の障害を処置することを対象とする。

【0048】

それゆえに、本発明者は、クロストリジウム神経毒素の適用の新たな技術分野(すなわち、脳組織損傷に関連する脳の障害)を同定したのみならず、前記の分野における予想されない技術的効果(すなわち神経免疫応答の促進)をもまた同定した。関係する態様においては、(例えば脳の)ミクログリア活性を促進することによって患者の脳の障害を処置する方法が提供され、方法はクロストリジウム神経毒素を患者に投与することを含む。換言すると、1つの態様は、患者の脳の障害を処置するために(例えば脳の)ミクログリア活性を促進するための方法を提供し、方法はクロストリジウム神経毒素を患者に投与することを含む。

【0049】

さらなる態様においては、(例えば脳の)ミクログリア活性を促進することによって患者の脳の障害を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用が提供される。換言すると、1つの態様は、患者の脳の障害を処置するために、(例えば脳の)ミクログリア活性を促進するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用を提供する。

【0050】

それゆえに、本明細書に記載されるクロストリジウム神経毒素は神経免疫応答を促進する。そのため、クロストリジウム神経毒素(単数または複数)は、脳の障害を処置することにおいて有用性を見出す。本明細書において用いられる用語「脳の障害」(これは本明細書においては用語「脳の損傷」と同義で用いられ得る)は、患者の神経免疫応答を促進することによって処置され得る障害である。

【0051】

用語「神経免疫応答」は脳の障害に対する患者の神経免疫系の応答を言う。例えば、本明細書において用いられる用語「神経免疫応答」は、脳の脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)、脳の感染、および/または脳腫瘍に対する神経免疫系の応答を言い得る(前記のニューロン損傷は脳の感染および/または脳腫瘍によって引き起こされ得る)。神経免疫応答は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を防止することであり得る。加えてまたは代替的には、神経免疫応答は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を修復することであり得る。用語「神経免疫応答」は、感染に対する応答に限定されることは意図されず、加えて、代替的な障害(例えば卒中)によって引き起こされる脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)に対する神経免疫系の応答を包摂する。実際に、物理的傷害および壊死もまた神経免疫応答を引き起こし得る。脳の障害が感染性疾患である(またはそれによって引き起こされる)実施形態において、神経免疫応答は感染に対する応答であり得る。

【0052】

神経免疫系は、アストロサイト、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトを包含するグリア細胞から主としてなり、特にミクログリア細胞(例えばマクロファージ)は脳におけるこの系の鍵の免疫細胞を表している。上に記載されている通り、本明細書において言われる神経免疫応答はミクログリア応答として定義され得る。

【0053】

用語「神経免疫応答を促進する」は、本発明のクロストリジウム神経毒素(またはその断片)が、脳の障害を有する患者において神経免疫応答を開始するということを意味し得る。例えば、そこでは神経免疫応答が生起しようとしていなかったか、またはそこでは「内因的な」神経免疫応答が脳の障害(例えばニューロン組織損傷)を克服するために十分に強くはなかった。それゆえに、本発明は本明細書に記載される方法におけるクロストリジウム神経毒素の投与に基づくが、「神経免疫応答」(好ましくはミクログリア細胞)は例えば脳組織損傷の処置を実現すると言うことがより正確であり得る;この文脈において、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷を処置することにおける神経免疫応答(例えばミクログリア細胞)の役割を促進する。

【0054】

用語「神経免疫応答を促進する」は、本発明のクロストリジウム神経毒素が、脳の障害を有する患者において神経免疫応答の発生を加速させるということを意味し得る。例えば、そこでは、神経免疫応答が生起しようとしていなかった。好ましい実施形態において、用語「神経免疫応答を促進する」は、クロストリジウム神経毒素が神経免疫応答のレベルを増大させるということを意味し得る。前記の増大は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における神経免疫応答のレベルと比較したときの増大であり得る。1つの実施形態において、神経免疫応答は、損傷した脳組織(例えば損傷したニューロン組織または神経)を除去し、損傷したニューロン回路の再構築を可能にし、それによって、ニューロンのネットワークまたは集団における活性および/またはニューロン伝達を復元し得る。

【0055】

ある実施形態において、神経免疫応答は、以下によって測定されるミクログリア細胞(単数または複数)(例えばマクロファージ)の活性化を含む。本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下におけるミクログリア活性と比較したときの、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下における、1)脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞の密度の変化、2)脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位へのミクログリア細胞遊走のレベルの変化(例えば、ミクログリア細胞の球形度の変化)、3)脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位に向けてのミクログリア突起伸長のレベルの変化、および/または4)脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性(例えば細胞デブリのクリアランス)のレベルの変化。

【0056】

神経免疫細胞(特にミクログリア細胞)活性は、傷害後の中枢神経系修復におけるかかる細胞の役割と整合して、「無処置の」(例えば、クロストリジウム神経毒素などの薬剤によって無処置の)脳においてもまたニューロン組織損傷に応答して増大することが予想されるということが指摘されるべきである。これにもかかわらず、本願によって提供される「対照」実験(例えば基剤のみ対照)は、クロストリジウム神経毒素の投与が、(精確に同じ型の傷害の存在下においてさえも)さもなければ対象に内因的なレベルを超越する神経免疫細胞活性の傷害によって誘導される活性化のレベルを可能にするということを実証する。それゆえに、(損傷に応答する)神経免疫細胞活性を促進することにおいて、本発明は、脳の障害によって引き起こされる損傷に対して戦闘/修復するためのかかる細胞の活動を「ブースト」し、患者の治癒をさらに増強し、損傷した組織(例えば壊死材料)の存在によって引き起こされるさらなる損害を和らげるために利用され得る。例えば、本発明の方法は、(損傷に応答する)神経免疫細胞活性のその「正常な」(または「内因的な」)レベルが脳の障害の背後にある(またはそれによって引き起こされる)ニューロン組織傷害に対して戦闘/修復するためには不十分である患者を処置するために利用され得る。

【0057】

神経免疫応答を「促進」してその活性をある種のレベルだけ増大させることによって、「損傷修復」のレベルの付随する増大があり得る。正のアウトカムとして、回復(または生残)についての患者の予後の爾後の(例えば相関する)増大が後続し得る。例えば、神経免疫応答を「促進」してその活性を例えば5%だけ増大させることによって、「損傷修復」のレベルの付随する5%増大があり得る;回復(または生残)についての患者の予後の爾後の5%増大が後続し得る。

【0058】

例えば、神経免疫応答は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)神経免疫応答と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、もしくは10%(好ましくは少なくとも5%)、またはより多くだけ増大し得る。

【0059】

神経免疫応答は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)神経免疫応答と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも30%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、神経免疫応答は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)神経免疫応答と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも100%、150%、または200%だけ増大し得る。

【0060】

神経免疫応答はミクログリア活性を言い得る。例えば、本明細書において言われる神経免疫応答は、好ましくはミクログリア活性を含み得るかまたはそれからなり得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は脳におけるミクログリア活性を促進する。例えば、ミクログリア活性は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、もしくは10%(好ましくは少なくとも5%)、またはより多くだけ増大し得る。

【0061】

例えば、ミクログリア活性は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも30%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、ミクログリア活性は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも100%、150%、または200%だけ増大し得る。

【0062】

用いられる用語「ミクログリア(microglia)活性」(「ミクログリア細胞活性」または「ミクログリア(microglial)活性」としてもまた公知)は、脳組織損傷、感染、および/または腫瘍などの損害の存在に対してミクログリア細胞によって請け負われる機能を言う。ミクログリアはニューロン組織損傷に対して感受性であり、傷害/感染/神経毒性因子などによるかかる損傷は(例えば活性化されるように)ミクログリアを刺激し、これらは損傷の部位に遊走する。より強いミクログリア応答は、典型的には、傷害の部位におけるミクログリア細胞の密度が応答の率/レベルに合わせて増大し得るようにして、より高い数のミクログリア細胞が病変(損傷の部位)に遊走することと相関する。

【0063】

1つの実施形態において、ミクログリア活性は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞の密度に基づいて測定され得る。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)、例えば、本明細書に記載される脳の障害によって引き起こされる脳組織損傷の部位において、「ミクログリア細胞密度レベル」を促進し得る。

【0064】

用語「ミクログリア細胞密度レベル」は所与の部位/所与のエリアにおけるミクログリア細胞数を言い、増大して行く密度は増大して行く細胞数と相関する。

【0065】

クロストリジウム神経毒素は感染の部位(例えば、感染によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞密度レベルを促進し得る。クロストリジウム神経毒素は脳腫瘍の部位(または脳腫瘍によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞密度レベルを促進し得る。クロストリジウム神経毒素は卒中の部位(または卒中によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞密度レベルを促進し得る。例えば、ミクログリア細胞密度レベルは、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞密度レベルと比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、もしくは10%(好ましくは少なくとも5%)、またはより多くだけ増大し得る。

【0066】

例えば、前記のミクログリア細胞密度レベルは(本明細書に記載されるいずれかの実施形態において)、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞密度レベルと比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも30%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア細胞密度レベルは、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞密度と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも100%、150%、または200%だけ増大し得る。

【0067】

そのため、損傷(ニューロン傷害)の部位におけるミクログリア細胞密度レベルを増大させることによって、傷害に対して戦闘/修復するために「利用可能」であるミクログリア細胞の数が増大する。例えば、増大した数のミクログリアが損傷/傷害の部位に存在することを原因として、損傷した組織(および/または病原体)のミクログリア貪食の量が後続し得る。よって、(傷害の)修復のレベルの付随する増大が後続し得る。これに従って脳の障害の処置が提供される。

【0068】

1つの実施形態において、ミクログリア活性は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位への「ミクログリア細胞遊走」のレベルに基づいて測定され得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位へのミクログリア細胞遊走を促進する。クロストリジウム神経毒素は感染の部位(または感染によって引き起こされる脳組織損傷の部位)へのミクログリア細胞遊走を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は脳腫瘍の部位(または脳腫瘍によって引き起こされる脳組織損傷の部位)へのミクログリア細胞遊走を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は卒中の部位(または卒中によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞密度レベルを促進し得る。

【0069】

用語「ミクログリア細胞遊走」は、例えば死んで行く細胞からの刺激因子放出に応答する活発な(指向的な)動きのミクログリア細胞が本明細書に記載される部位(例えば、脳組織損傷、感染、腫瘍の部位)に向けて動くことを言う。用語「ミクログリア細胞遊走」は本明細書においては用語「ミクログリア遊走」と同義で用いられ得る。

【0070】

例えば、前記のミクログリア細胞遊走は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞密度レベルと比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、または10%(好ましくは少なくとも5%)だけ増大し得る。例えば、前記のミクログリア細胞遊走は(本明細書に記載されるいずれかの実施形態において)、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞遊走と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも30%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア細胞遊走は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞遊走と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも80%、90%、または100%だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア細胞遊走は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞遊走と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも110%、125%、または150%だけ増大し得る。

【0071】

本明細書に記載される部位(例えば、脳組織損傷、感染、腫瘍の部位)に向けてのミクログリア細胞遊走を増大させることによって、傷害(または感染)に対して戦闘/修復するために「利用可能」であるミクログリア細胞の数が増大する。例えば、増大した数のミクログリアが損傷/傷害の部位に存在することを原因として、損傷した組織(および/または病原体)のミクログリア貪食の量が後続し得る。よって、(傷害の)修復のレベルの付随する増大が後続し得る。これに従って脳の障害の処置が提供される。

【0072】

細胞遊走の好適な読み出しはミクログリア細胞の球形度である。それゆえに、ミクログリア細胞の球形度指数(より典型的には、ミクログリア細胞の平均球形度指数)が検出され得る。そこでは、球形度指数の減少はミクログリア細胞(単数または複数)の増大した伸長(伸長した形状)と相関する。なぜなら、例えば、それらは運動性になり、脳の損傷の部位の方向に遊走しているからである。球形度指数は、ミクログリア細胞によってカバーされた表面積(S)の3乗に対するミクログリア細胞の2乗された体積(V)の比率として定義され得る:
球形度=36πV²/S³
例えば、ミクログリア細胞(単数または複数)の球形度は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞(単数または複数)の球形度と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、または30%(好ましくは少なくとも10%)だけ減少し得る。いくつかの実施形態において、ミクログリア細胞(単数または複数)の球形度は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞(単数または複数)の球形度と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも35%、40%、または50%だけ減少し得る。

【0073】

ミクログリアはニューロンおよび非ニューロン細胞と相互作用する高度に動的な細胞である。ミクログリアは連続的な突起伸長および収縮によって脳実質をパトロールする。例えば、ミクログリアは、例えば損傷した組織から放出されるATPによる代謝型ATP受容体P2Y(12)の刺激に応答して、損傷したエリアに向けてそれらの突起を伸長させ得る。

【0074】

1つの実施形態において、ミクログリア活性は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位に向けてのミクログリア突起伸長のレベルに基づいて測定され得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位に向けてのミクログリア突起伸長を促進する。クロストリジウム神経毒素は感染の部位(または感染によって引き起こされる脳組織損傷の部位)に向けてのミクログリア突起伸長を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は、脳腫瘍の部位(または脳腫瘍によって引き起こされる脳組織損傷の部位)に向けてのミクログリア突起伸長を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は、卒中の部位(または卒中によって引き起こされる脳組織損傷の部位)に向けてのミクログリア突起伸長を促進し得る。

【0075】

用語「ミクログリア突起伸長」は、ミクログリア細胞の伸長した突起の長さの伸長を言い、前記の突起は、他の機能の中でも、細胞が例えば走化性によって遊走することを可能化する。例えば、ミクログリア突起の数および/または長さは本発明の方法において増大し得る。

【0076】

例えば、前記のミクログリア突起伸長は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞密度レベルと比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、または10%(好ましくは少なくとも5%)だけ増大し得る。例えば、前記のミクログリア突起伸長は(本明細書に記載されるいずれかの実施形態において)、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア突起伸長と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも60%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア突起伸長は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア突起伸長と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも80%、90%、または100%だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア突起伸長は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア突起伸長と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも125%、150%、または200%だけ増大し得る。

【0077】

1つの実施形態において、ミクログリア活性は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性のレベルに基づいて測定され得る。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は感染の部位(または感染によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞貪食活性を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は脳腫瘍の部位(または脳腫瘍によって引き起こされる脳組織損傷の部位)におけるミクログリア細胞貪食活性を促進し得る。クロストリジウム神経毒素は卒中(または卒中によって引き起こされる脳組織損傷の部位)の部位におけるミクログリア細胞貪食活性を促進し得る。

【0078】

用語「ミクログリア細胞貪食活性」(「ミクログリア貪食活性」としてもまた公知)は、ミクログリアによる細胞材料の呑食を言う(脳組織損傷後の細胞デブリおよび微生物などの異物の呑食を包摂する)。細胞デブリを呑食するときに、用語「ミクログリア細胞貪食活性」は本明細書においては用語「細胞デブリのミクログリアクリアランス」と同義で用いられ得る。貪食活性は、脳組織損傷の部位における細胞デブリのクリアランスを検出することによって測定され得る。

【0079】

用語「細胞デブリ」は、好ましくは、死んだニューロンから放出される細胞コンポーネントを言う。

【0080】

例えば、前記のミクログリア細胞貪食活性は(本明細書に記載されるいずれかの実施形態において)、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞貪食活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%(好ましくは少なくとも30%)だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア細胞貪食活性は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞貪食活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも80%、90%、または100%だけ増大し得る。いくつかの実施形態において、前記のミクログリア細胞貪食活性は、本発明のクロストリジウム神経毒素の不在下における(または代替的なポリペプチドの存在下における)ミクログリア細胞貪食活性と比較したときに、本発明のクロストリジウム神経毒素の存在下において少なくとも125%、150%、または200%だけ増大し得る。

【0081】

本発明者は、驚くべきことに、神経免疫応答のクロストリジウム神経毒素によって媒介される促進が迅速に生起し得る、すなわち損傷に対する応答の早い発生を促進し得るということを実証した。さらにその上、促進された応答は急性であり得る。例えば、ひとたび組織損傷/侵襲性の損害がクリアランスされると減弱し、長期的な「過活性な」応答のいずれかの負の効果を和らげる。

【0082】

1つの実施形態において、神経免疫応答は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の生起後に≦2分、≦4分、≦6分、≦8分、≦10分、≦12分、≦14分、≦16分、≦18分、または≦20分促進される。好ましい実施形態において、神経免疫応答は脳組織損傷の生起後に≦10分促進される。

【0083】

用語「脳組織損傷」(例えばニューロン組織損傷)は、本明細書に記載される脳の障害によって引き起こされる損傷であり得る。例えば、脳の障害が感染であるところでは、脳組織損傷が微生物感染によって引き起こされ得る。

【0084】

1つの実施形態において、神経免疫応答は、クロストリジウム神経毒素の投与後に≦2分、≦4分、≦6分、≦8分、≦10分、≦12分、≦14分、≦16分、≦18分、または≦20分促進される。好ましい実施形態において、神経免疫応答はクロストリジウム神経毒素の投与後に≦10分促進される。

【0085】

神経免疫応答は、脳組織損傷の生起後に≦48時間、≦36時間、≦24時間、または≦12時間(好ましくは≦24時間)促進され得る。例えば、前記の期間後に、神経免疫のクロストリジウム神経毒素によって媒介される促進はなくなり得る;換言すると、神経免疫応答のクロストリジウム神経毒素によって媒介される促進は、脳組織損傷の生起後に、48時間、36時間、24時間、または48時間(好ましくは24時間)後になくなり得る。かかる実施形態において、クロストリジウム神経毒素は急性の神経免疫応答を促進すると言われ得る。用語「クロストリジウム神経毒素によって媒介される促進なし」は、実質的に神経免疫応答の増大がないということを意味する。例えば、「実質的に増大なし」は、好適には、神経免疫応答の増大が5%未満、3%未満、または1%未満であり得るということを意味する(好ましくは0%。そこでは、神経免疫応答の増大は全くない)。

【0086】

上に記載された通り、本明細書において、脳の障害/脳の損傷は、患者の神経免疫応答を促進することによって処置され得る障害である。

【0087】

かかる障害は、脳内にまたは外に起因し、脳組織損傷を引き起こす体の損害に関連する障害を包含し得る。例として、卒中では、血管の詰まりが脳への血液の供給を妨害または縮減し、脳の酸素枯渇化およびそれゆえに神経細胞死に至り得る。それゆえに引き起こされる神経損傷は、前記の脳の障害を有する患者によって患われる症状の背後にあり得る。

【0088】

それゆえに、本発明のクロストリジウム神経毒素は、例えば神経免疫応答を促進することによって、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を引き起こす脳の障害を処置するためであり得る。

【0089】

本発明によって包摂される脳の障害の例は、外傷性脳損傷、癌(例えば脳腫瘍)、感染性疾患、卒中、神経変性障害、脳動脈瘤、多発性硬化症、無酸素性傷害、中毒性傷害、および代謝性傷害のいずれか1つ(以上)を包含する。

【0090】

「脳の障害」はより具体的には脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)を言い得る。かかるケースでは、脳の障害は外傷性脳損傷、癌(例えば脳腫瘍)、感染性疾患、卒中、神経変性障害、脳動脈瘤、多発性硬化症、無酸素性傷害、中毒性傷害、および代謝性傷害のいずれか1つ(以上)によって引き起こされるということが言われ得る。

【0091】

好ましい実施形態において、脳の障害は非外傷性脳損傷によって引き起こされる。非外傷性脳損傷は病気、低酸素化、代謝性障害、動脈瘤、および/または心停止の結果であり得る。非外傷性脳損傷は、典型的には脳の機能を遮断する頭部への物理的打撃もしくは衝撃または穿通性頭部傷害によって引き起こされる「外傷性脳損傷」(TBI)とは区別され得る。

【0092】

1つの実施形態において、脳の障害は「外傷性脳損傷」(TBI)によって引き起こされない。

【0093】

非外傷性脳損傷は、以下から選択される1つ以上によって定義され得る:癌(例えば脳腫瘍)、感染性疾患、卒中、神経変性障害、脳動脈瘤、多発性硬化症、無酸素性傷害、中毒性傷害、および代謝性傷害(好ましくは癌、感染性疾患、および卒中;より好ましくは感染性疾患)。

【0094】

本発明の脳の障害の好ましい例は、癌、感染性疾患、および卒中による脳の障害から選択され得る。換言すると、脳の障害は癌、感染性疾患、および/または卒中によって引き起こされ得る。

【0095】

特に好適な脳の障害は感染性疾患である。換言すると、脳の障害は感染性疾患によって引き起こされ得る。

【0096】

感染は脳の炎症(脳炎)を引き起こし得る。ウイルスは脳炎の最も普通の原因である。感染は脳をカバーする組織の層(髄膜)の炎症をもまた引き起こし得る。もたらされる状態は髄膜炎と呼ばれる。多くの場合に、細菌性髄膜炎は脳それ自体に広がり、脳炎を引き起こす。類似に、脳炎を引き起こすウイルス感染は多くの場合に髄膜炎をもまた引き起こす。脳および髄膜両方が感染するときには、障害は髄膜脳炎と呼ばれる。しかしながら、主に髄膜を冒す感染は通常は髄膜炎と呼ばれ、主に脳を冒す感染は通常は脳炎と呼ばれる。

【0097】

感染性疾患は、微生物、例えば細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、および原生生物から選択される(より好ましくは細菌および真菌から選択される)微生物による感染を言い得る。それゆえに、感染性疾患は、核酸(DNA、RNA、または両方)を含有する感染性因子によって引き起こされ得る。これはプリオン蛋白質感染の因子とは対照をなし得る。それゆえに、感染性疾患はプリオン病とは区別され得る。

【0098】

1つの実施形態において、感染性疾患は脳炎、髄膜炎、および脳膿瘍(好ましくは脳炎および髄膜炎)から選択される。それゆえに、1つの実施形態において、脳の障害は脳炎であり得る。1つの実施形態において、脳の障害は髄膜炎であり得る。

【0099】

1つの実施形態において、脳の障害は神経変性疾患によって引き起こされる。前記の神経変性疾患は以下から選択され得る:アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、運動ニューロン疾患(例えば筋萎縮性側索硬化症)、プリオン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、運動失調、ハラーフォルデン・シュパッツ病、および前頭側頭葉変性症。

【0100】

1つの実施形態において、脳の障害は卒中によって引き起こされる。前記の卒中は虚血性卒中(例えば、脳への血流の欠如)または出血性卒中(例えば脳内の出血)であり得る。

【0101】

本明細書において用いられる「患者」(これは用語「対象」と同義で用いられ得る)は、哺乳動物、例えばヒトまたは他の哺乳動物であり得る。好ましくは、「患者」はヒト対象を意味する。

【0102】

患者は、平均(基底)よりも低い神経免疫応答を有する患者、例えば、免疫系を抑制し得る化学療法などの代替的な治療を受けている患者であり得る。例えば、患者は免疫不全であり得る。患者は、いずれかの背後にある状態を原因としてまたは高齢状態(例えば>60または70歳の患者)を原因として免疫不全であり得る。加えてまたは代替的には、患者は代替的な治療(例えば、上で言及された通り、化学療法)の投与を原因として免疫不全であり得る。後者は、免疫不全である状態が「誘導」される患者の明確なサブセットを表しており、かかる患者は特に本明細書に記載される処置から利し得る。

【0103】

本明細書において用いられる用語「障害」は「疾患」をもまた包摂する。1つの実施形態において、障害は疾患である。

【0104】

本明細書において用いられる用語「処置する」または「処置すること」は、予防的処置(例えば、障害の発生を防止するための)および矯正的な処置(既に障害を患っている対象の処置)を包摂する。好ましくは、本明細書において用いられる「処置する」または「処置すること」は矯正的な処置を意味する。

【0105】

本明細書において用いられる用語「処置する」または「処置すること」は、障害および/またはその症状を言う。

【0106】

よって、本発明のクロストリジウム神経毒素は治療上有効量または予防上有効量で患者に投与され得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は治療上有効量で患者に投与される。

【0107】

「治療上有効量」は、前記の障害(またはその症状)を処置するために患者に単独でまたは別の薬剤との組み合わせで投与されるときに、障害またはその症状のかかる処置を実現するために十分であるクロストリジウム神経毒素の任意の量である。

【0108】

「予防上有効量」は、単独でまたは組み合わせで患者に投与されるときに、障害(またはその症状)の発生または再発を阻害または遅延させるクロストリジウム神経毒素の任意の量である。いくつかの実施形態において、予防上有効量は障害の発生または再発を完全に防止する。発生を「阻害する」は、障害(もしくはその症状)の発生の蓋然性を減らすことまたは発生を完全に防止することどちらかを意味する。

【0109】

本発明のクロストリジウム神経毒素は、対象への投与のためのいずれかの好適な様式で、例えば医薬組成物の一部として製剤され得る。それゆえに、1つの態様において、本発明は、本明細書に記載される処置のいずれかの方法のための医薬組成物を提供し、医薬組成物は、本発明のクロストリジウム神経毒素と薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、プロペラント、および/または塩とを含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は一本鎖鎖形態であり得るが、他の実施形態においては、クロストリジウム神経毒素は、例えば2つの鎖がジスルフィド架橋によって連結されている二本鎖形態であり得る。好ましくは、クロストリジウム神経毒素は二本鎖形態である。

【0111】

本発明のクロストリジウム神経毒素は、経口、非経口、連続輸注、吸入、または外用のために製剤され得る。注射にとって好適な組成物は、溶液、懸濁液、もしくはエマルション、または使用に先立って好適な基剤中に溶解もしくは懸濁される乾燥粉末の形態であり得る。

【0112】

局所送達されるべきクロストリジウム神経毒素のケースでは、クロストリジウム神経毒素はクリームとして(例えば外用のために)または真皮下注射のために製剤され得る。

【0113】

局所送達手段はエアロゾルまたは他のスプレー(例えばネブライザー)を包含し得る。これについて、クロストリジウム神経毒素のエアロゾル製剤は肺ならびに/あるいは他の鼻腔および/または気管支もしくは気道への送達を可能化する。

【0114】

本発明のクロストリジウム神経毒素は、冒された臓器の神経支配に関わる脊髄分節のレベルで、脊柱における髄腔内または硬膜外注射によって、対象に投与され得る。

【0115】

投与経路は局所的な注射によってであり得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、傷害の部位においてまたはその近くで、好ましくは傷害の部位において投与される。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素の投与経路はペリニューロン、ニューロン内、脊椎内、および/または髄腔内であり得る。

【0116】

クロストリジウム神経毒素は皮下および/または頭蓋内投与され得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は(例えば、ニューロン損傷が存在する脳のいずれかの適当な領域に)頭蓋内投与され得る。例えば、クロストリジウム神経毒素は皮質内投与(例えば皮質内注射)によって投与され得る。クロストリジウム神経毒素は体性感覚野に投与され得る。クロストリジウム神経毒素は前頭葉に投与され得る。

【0117】

頭蓋内投与(例えば頭蓋内注射)は脳への直接投与を可能にするために用いられ得る。

【0118】

本発明のクロストリジウム神経毒素の投与のための投与量範囲は、所望の治療および/または予防効果を生成するためのものである。要求される投与量範囲は、クロストリジウム神経毒素または組成物の精確な性質、投与経路、製剤の性質、対象の年齢、対象の状態の性質、程度、または重症度、何らかの禁忌、および担当医の判断に依存するということは了解されるであろう。これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験的な慣例を用いて調整され得る。

【0119】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素の投与量はフラットドーズである。フラットドーズは、50pgから250μg、好ましくは100pgから100μgの範囲であり得る。1つの実施形態において、フラットドーズは少なくとも50pg、100pg、500pg、1ng、50ng、100ng、500ng、1μg、または50μgであり得る。前記の用量は単一のフラットドーズであり得る。

【0120】

流体剤形は、典型的には、クロストリジウム神経毒素およびパイロジェンフリーの無菌の基剤を利用して調製される。クロストリジウム神経毒素は、用いられる基剤および濃度に依存して、基剤中に溶解され得るかまたは懸濁され得るかどちらかである。溶液を調製することにおいては、クロストリジウム神経毒素は基剤中に溶解され得る。溶液は、必要な場合には塩化ナトリウムの追加によって等張にされ、好適な無菌バイアルまたはアンプルへの充填および密封の前に、無菌技術を用いて無菌フィルターによる濾過によって滅菌される。代替的には、溶液の安定性が充分である場合には、その密封された容器中の溶液はオートクレーブによって滅菌され得る。有利には、添加剤、例えば緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存料もしくは殺菌剤、懸濁剤もしくは乳化剤、および/または局所麻酔剤が基剤中に溶解され得る。

【0121】

使用に先立って好適な基剤中に溶解または懸濁される乾燥粉末は、無菌エリアにおいて無菌技術を用いて無菌容器中に予め滅菌された成分を充填することによって調製され得る。代替的には、成分は、無菌エリアにおいて無菌技術を用いて好適な容器中に溶解され得る。それから、生成物はフリーズドライされ、容器は無菌的に密封される。

【0122】

本明細書に記載される投与経路にとって好適な非経口懸濁液は、無菌のコンポーネントが溶解される代わりに無菌基剤中に懸濁され、滅菌が濾過によって達成され得ないということを例外として、実質的に同じ様式で調製される。コンポーネントは無菌状態で単離され得るか、または代替的にはそれは単離後に例えばガンマ線によって滅菌され得る。

【0123】

有利には、懸濁剤、例えばポリビニルピロリドンが組成物(単数または複数)中に包含されて、コンポーネントの一様な分布を易化する。

【0124】

本発明に従う投与は、微粒子カプセル化または高圧エアロゾル衝撃を包含する種々の送達テクノロジーの利用をし得る。

【0125】

クロストリジウム神経毒素は、本明細書に記載される脳の障害によって引き起こされる脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の発生に先立って、同時に、または爾後に投与され得る。例えば、脳の障害が感染によって引き起こされるところでは、クロストリジウム神経毒素は、感染の神経免疫応答によって媒介されるクリアランスを促進するために、感染の検出の爾後に投与され得る。

【0126】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)に先立って投与され得る。換言すると、クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)が生起する前に投与され得る。

【0127】

「脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)が生起する前にクロストリジウム神経毒素を投与すること」と言うことは、脳組織損傷が先に生起した状況を包摂する。例えば、クロストリジウム神経毒素は、さらなる脳組織損傷を処置または防止するために神経免疫応答を促進するために投与され得る。これは、(さらなる)組織損傷が予期され得る本明細書に記載される脳の障害の文脈において有利である。

【0128】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の最高で4日前までに投与される。クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)が生起する前に1～3日の間に投与され得る。クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の3日前に投与され得る。好ましい実施形態において、クロストリジウム神経毒素は脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の≦24時間前に投与され得る。

【0129】

本発明者は、クロストリジウム神経毒素の投与が神経免疫応答の迅速な促進に至り得るということを実証した。それゆえに、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷が生起したおよび/または生起している(あるいは生起したおよび/または生起していることを疑われる)時に、損傷に応答するために神経免疫応答を促進するために投与され得る。

【0130】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、脳組織(例えばニューロン組織)損傷の生起後に48時間以内に(例えば、4h時間に等しいかまたは未満で)投与される。例えば、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の生起の≦10分、≦30分、≦1時間、≦2時間、≦5時間、≦12時間、≦34時間、≦3h時間、または≦48時間後に投与され得る。好ましくは、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の生起の≦2時間後に投与され得る。より好ましくは、クロストリジウム神経毒素は、脳組織損傷(例えばニューロン組織損傷)の生起後に1～10分以内に投与され得る。

【0131】

本開示において他所でより詳細に説明される通り、用語「クロストリジウム神経毒素」は、そのクロストリジウム神経毒素断片を包摂する。

【0132】

ここで、本発明における使用のためのクロストリジウム神経毒素および好適な神経毒素についてのさらなる情報が下で提供される。

【0133】

1つの実施形態において、本発明は、クロストリジウム神経毒素L鎖とクロストリジウム神経毒素H鎖とを含む全長クロストリジウム神経毒素の使用を包摂し、ただし、任意に、前記のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。

【0134】

用語「クロストリジウム神経毒素」は、C.ボツリヌム(ボツリヌス神経毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、およびX)、C.テタニ(破傷風神経毒素)、C.ブチリカム(ボツリヌス神経毒素血清型E)、およびC.バラティ(ボツリヌス神経毒素血清型F)によって生成される毒素、ならびに改変されたクロストリジウム神経毒素、または前述のいずれかに由来する誘導体を包摂する。

【0135】

ボツリヌス神経毒素(BoNT)は、いくつものアクセサリー蛋白質と複合体化したBoNTそれ自体からなる大きい蛋白質複合体の形態で、C.ボツリヌムによって生成される。現在、ボツリヌス神経毒素の8つの異なるクラス、つまり:ボツリヌス神経毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、およびXがあり、これらの全ては類似の構造および作用モードを共有する。異なる複数のBoNT血清型は、特異的な中和抗血清による不活性化に基づいて区別され得る。血清型によるかかる分類はアミノ酸レベルでのパーセンテージ配列同一性と相関する。アミノ酸のパーセンテージ配列同一性に基づいて、所与の血清型のBoNT蛋白質はさらに異なるサブタイプに分けられる。

【0136】

BoNTは胃腸管において吸収され、全身循環に入った後に、コリン作動性神経終末のシナプス前膜に結合し、それらの神経伝達物質アセチルコリンの放出を防止する。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、およびBoNT/Gはシナプトブレビン/小胞関連膜蛋白質(VAMP)を切断し;BoNT/C1、BoNT/A、およびBoNT/Eは25kDaのシナプトソーム関連蛋白質(SNAP-25)を切断し;BoNT/C1はシンタキシンを切断する。BoNT/XはSNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6、およびシンタキシン1を切断することが見出されている。

【0137】

破傷風毒素はC.テタニによって単一の血清型で生成される。C.ブチリカムはBoNT/Eを生成し、C.バラティはBoNT/Fを生成する。

【0138】

用語「クロストリジウム神経毒素」は、全長神経毒素(クロストリジウム神経毒素L鎖およびクロストリジウム神経毒素H鎖を含む)およびそれらの断片両方を包摂することを意図される。例えば、「クロストリジウム神経毒素」は、クロストリジウム神経毒素L鎖、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_N)、および/またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)ドメインを含むかまたはそれからなるポリペプチドを言い得る。「クロストリジウム神経毒素」は、クロストリジウム神経毒素L鎖、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_N)、および/またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)ドメインを含むかまたはそれからなるポリペプチドを言い得て、ポリペプチドがクロストリジウム神経毒素L鎖を含むときには、L鎖は触媒的に不活性である。

【0139】

有利には、クロストリジウム神経毒素断片の使用は、クロストリジウム神経毒素の非毒性の(または実質的に非毒性の)断片の使用を可能にする。これらは、(全長H鎖または全長クロストリジウム神経毒素と比較して)より小さいサイズから考えて、前記の断片を投与された対象において(断片に対する)有害な免疫応答を惹起することがより蓋然的ではない。その上、非毒性の(または実質的に非毒性の)断片は全長クロストリジウム神経毒素よりも製造することがより高額ではなく、および/またはより複雑ではない。加えて、非毒性の(または実質的に非毒性の)断片は全長クロストリジウム毒素よりも分かりやすい治療薬を構成し、ポリペプチドのより短い長さから考えて、例えばドメイン間のシステインシャッフリングの縮減された確率がある。

【0140】

クロストリジウム神経毒素の特定のドメインを参照する実施形態において、分子は便利には「ポリペプチド」と言われ得る。つまり、用語「クロストリジウム神経毒素」は用語「ポリペプチド」と置換され得る。

【0141】

それゆえに、本明細書において言われるクロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素軽鎖(L鎖)、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_Nドメイン)、および/またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_Cドメイン)を含む(またはそれからなる)ポリペプチドを言い得る。本明細書において言われるクロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素軽鎖(L鎖)、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_Nドメイン)、および/またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_Cドメイン)を含む(またはそれからなる)ポリペプチドを言い得て、ポリペプチドがクロストリジウム神経毒素L鎖を含むときには、L鎖は触媒的に不活性である。

【0142】

よって、本発明の態様は次のいずれかを提供するということになる:
-脳の障害を(例えば神経免疫応答を促進することによって)処置する方法に使用するためのポリペプチド;
-患者の脳の障害を(例えば神経免疫応答を促進することによって)処置する方法であって、方法はポリペプチドを患者に投与することを含む;
-患者の脳の障害を(例えば神経免疫応答を促進することによって)処置するための医薬の製造におけるポリペプチドの使用;
前記のペプチドはクロストリジウム神経毒素軽鎖(L鎖)、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_Nドメイン)、および/またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_Cドメイン)を含み(またはそれからなり);任意に、ポリペプチドがクロストリジウム神経毒素L鎖を含むときには、L鎖は触媒的に不活性である。

【0143】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または60のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または60のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または60のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0144】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つのクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。

【0145】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、または59(好ましくは配列番号51、52、53、54、55、56、57、または59)のいずれか1つに対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、または59(好ましくは配列番号51、52、53、54、55、56、57、または59)のいずれか1つに対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、または59(好ましくは配列番号51、52、53、54、55、56、57、または59)のいずれか1つのクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号51に対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号51に対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は配列番号51のクロストリジウム神経毒素配列を含み得る。

【0146】

用語「クロストリジウム神経毒素」は、改変されたクロストリジウム神経毒素およびそれらの誘導体をもまた包摂することを意図され、下に記載されるものを包含するが、これらに限定されない。改変されたクロストリジウム神経毒素または誘導体は、クロストリジウム神経毒素のネイティブな(未改変の)形態と比較して改変されている1つ以上のアミノ酸を含有し得るか、またはクロストリジウム神経毒素のネイティブな(未改変の)形態には存在しない1つ以上の挿入されたアミノ酸を含有し得る。例として、改変されたクロストリジウム神経毒素は、ネイティブな(未改変の)クロストリジウム神経毒素配列に対して相対的に改変されたアミノ酸配列を1つ以上のドメイン上に有し得る。かかる改変は、毒素の機能的な側面、例えば生物学的活性または残存性を改変し得る。それゆえに、1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、改変されたクロストリジウム神経毒素、または改変されたクロストリジウム神経毒素誘導体、またはクロストリジウム神経毒素誘導体である。

【0147】

改変されたクロストリジウム神経毒素は、重鎖のアミノ酸配列(例えば改変されたH_Cドメイン)上に1つ以上の改変を有し得て、前記の改変された重鎖は、ネイティブな(未改変の)クロストリジウム神経毒素よりも高いかまたは低い親和性で神経細胞を標的化するように結合する。H_Cドメイン上のかかる改変は、標的神経細胞のガングリオシド受容体および/または蛋白質受容体に対する結合を変調させるH_Cドメインのガングリオシド結合部位上のまたは蛋白質(SV2またはシナプトタグミン)結合部位上の残基を改変することを包含し得る。かかる改変されたクロストリジウム神経毒素の例はWO 2006/027207およびWO 2006/114308に記載され、これらの両方はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。

【0148】

改変されたクロストリジウム神経毒素は、軽鎖のアミノ酸配列上の1つ以上の改変、例えば、改変されたL鎖のSNARE蛋白質特異性を変調または改変し得る基質結合または触媒ドメイン上の改変を有し得る。かかる改変されたクロストリジウム神経毒素の例はWO 2010/120766およびUS 2011/0318385に記載され、これらの両方はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。

【0149】

改変されたクロストリジウム神経毒素は、改変されたクロストリジウム神経毒素の生物学的活性および/または生物学的残存性を増大または減少させる1つ以上の改変を含み得る。例えば、改変されたクロストリジウム神経毒素はロイシンまたはチロシンに基づくモチーフを含み得て、前記のモチーフは、改変されたクロストリジウム神経毒素の生物学的活性および/または生物学的残存性を増大または減少させる。好適なロイシンに基づくモチーフはxDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL、およびxExxxLMを包含する(式中、xはいずれかのアミノ酸である)。好適なチロシンに基づくモチーフはY-x-x-Hyを包含する(式中、Hyは疎水性アミノ酸である)。ロイシンおよびチロシンに基づくモチーフを含む改変されたクロストリジウム神経毒素の例はWO 2002/08268に記載され、これはその全体が参照によってここに組み込まれる。

【0150】

上に記載されている通り、改変されたクロストリジウム神経毒素(またはクロストリジウム神経毒素断片)は、クロストリジウム神経毒素の等電点を増大させる1つ以上の改変を、前記の1つ以上の改変を欠く同等の未改変のクロストリジウム神経毒素と比較したときに含むものであり得る。好適な改変されたクロストリジウム神経毒素は上ならびにWO 2015/004461 A1およびWO 2016/110662 A1に記載され、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。例示的な配列は本明細書に記載される配列番号61および42を包含する。

【0151】

改変されたクロストリジウム神経毒素は好ましくは配列番号61の配列を含み得るかまたはそれからなり得る。

【0152】

用語「クロストリジウム神経毒素」はハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒素を包摂することを意図される。ハイブリッドクロストリジウム神経毒素は、1つのクロストリジウム神経毒素またはそのサブタイプからの軽鎖の少なくともある部分と、別のクロストリジウム神経毒素またはクロストリジウム神経毒素サブタイプからの重鎖の少なくともある部分とを含む。1つの実施形態において、ハイブリッドクロストリジウム神経毒素は、1つのクロストリジウム神経毒素サブタイプからの軽鎖の軽鎖全体と別のクロストリジウム神経毒素サブタイプからの重鎖とを含有し得る。別の実施形態において、キメラクロストリジウム神経毒素は、1つのクロストリジウム神経毒素サブタイプの重鎖のある部分(例えば結合ドメイン)を含有し、重鎖の別の部分は別のクロストリジウム神経毒素サブタイプからであり得る。類似にまたは代替的には、治療的要素は異なるクロストリジウム神経毒素からの軽鎖部分を含み得る。かかるハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒素は、例えば、かかるクロストリジウム神経毒素の治療上の利益を、所与のクロストリジウム神経毒素サブタイプに対して免疫学的に耐性である対象に、平均よりも低い濃度の受容体を所与のクロストリジウム神経毒素重鎖結合ドメインに対して有し得る対象に、または膜もしくは小胞毒素基質(例えばSNAP-25、VAMP、およびシンタキシン)のプロテアーゼ耐性バリアントを有し得る対象に送達する手段として有用である。ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒素はUS 8,071,110に記載され、この公報はその全体が参照によってここに組み込まれる。それゆえに、1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素(またはその断片)はハイブリッドクロストリジウム神経毒素またはキメラクロストリジウム神経毒素である。

【0153】

特に好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、BoNT/A軽鎖およびトランスロケーションドメインとBoNT/B受容体結合ドメイン(H_Cドメイン)またはその部分とを含む(好ましくはそれからなる)キメラクロストリジウム神経毒素であり得る(例えばBoNT/AのLH_N-BoNT/BのH_C)。好適なキメラおよび/またはハイブリッドクロストリジウム神経毒素はWO 2017/191315 A1によって教示されるものであり得る。これは参照によって本明細書に組み込まれる。かかる好ましい配列は配列番号44、63、および64を包含する。

【0154】

例えば、キメラクロストリジウム神経毒素は、配列番号64の配列(これは触媒的に不活性なL鎖を含むと言われ得る)を含み(好ましくはそれからなり)得る。

【0155】

好ましい実施形態において、キメラクロストリジウム神経毒素は配列番号63の配列を含み(好ましくはそれからなり)得る。

【0156】

BoNT/AのLH_NドメインはBoNT/BのH_Cドメインに共有結合的に連結され得る。前記のキメラBoNT/Aは本明細書においては「BoNT/AB」または「BoNT/ABキメラ」ともまた言われる。

【0157】

LH_NドメインのC末端アミノ酸残基は、BoNT/AのLH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの第1のアミノ酸残基に対応し得る。H_CドメインのN末端アミノ酸残基は、BoNT/BのLH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの第2のアミノ酸残基に対応し得る。

【0158】

本明細書において、「BoNT/AのLH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの第1のアミノ酸残基」と言うことは、LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスのN末端残基を意味する。

【0159】

本明細書において、「BoNT/BのLH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの第2のアミノ酸残基」と言うことは、LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスのN末端残基に後続するアミノ酸残基を意味する。

【0160】

「3₁₀ヘリックス」は、αヘリックス、βシート、およびリバースターンと併せて蛋白質およびポリペプチド上に見出される型の二次構造である。3₁₀ヘリックス上のアミノ酸は右巻きのらせん構造で配置され、そこでは、各ターン全長は、3つの残基と、それらの間の分子間水素結合を分離する10個の原子とによって完成する。各アミノ酸は、ヘリックス上の120°のターン(すなわち、ヘリックスはターンあたり3つの残基を有する)とらせん軸に沿った2.0Å(=0.2nm)の並進とに対応し、水素結合を作ることによって形成される環上に10個の原子を有する。最も重要なことに、アミノ酸のN-H基は3残基前のアミノ酸のC=O基との水素結合を形成する;この繰り返しのi+3→i水素結合が3₁₀ヘリックスを定義する。3₁₀ヘリックスは構造生物学における標準的な概念であり、当業者はこれを熟知する。

【0161】

この3₁₀ヘリックスは、実際のヘリックスを形成する4つの残基と、これらの4つの残基の各端に1つの2つのキャップ(または接続)残基とに対応する。本明細書において用いられる用語「LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックス」はそれらの6残基からなる。

【0162】

構造分析および配列アライメントを実施することによって、LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスが同定された。この3₁₀ヘリックスは、そのN末端においては(すなわちLH_NドメインのC末端部においては)αヘリックスによって、そのC末端においては(すなわちH_CドメインのN末端部においては)βストランドによって取り巻かれている。3₁₀ヘリックスの第1の(N末端)残基(キャップまたは接続残基)もまたこのαヘリックスのC末端残基に対応する。

【0163】

LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスは、例えば、ボツリヌス神経毒素の公に利用可能な結晶構造、例えば3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)および1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)からそれぞれボツリヌス神経毒素A1およびB1について決定され得る。

【0164】

公に利用可能であるインシリコモデリングおよびアライメントツールもまた、他の神経毒素上のLH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの位置付けを決定するために用いられ得る。例えば、相同性モデリングサーバーLOOPP(ラーニング・オブザービング・アンド・アウトプッティング・プロテインパターンズ(Learning, Observing and Outputting Protein Patterns)、http://loopp.org)、PHYRE(プロテインホモロジー/アナロジー・リコグニションエンジン(Protein homology/analogY Recognition Engine)、http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)、およびRosetta(https://www.rosettacommons.org/)、蛋白質重ね合わせサーバーSuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、アライメントプログラムClustalオメガ(http://www.clustal.org/omega/)、ならびにインターネットリソーシズ・フォー・モレキュラーアンドセルバイオロジスツ(Internet Resources for Molecular and Cell Biologists)に列記されているいくつもの他のツール/サービス(http://molbiol-tools.ca/)である。特に、「H_N/H_CN」接続部の周りの領域は構造的に高度に保存され、これは、それを異なる複数の血清型を重ね合わせるための理想的な領域にする。

【0165】

例えば、次の方法論が、他の神経毒素上のこの3₁₀ヘリックスの配列を決定するために用いられ得る:
1.構造相同性モデリングツールLOOP(http://loopp.org)が、BoNT/A1結晶構造(3BTA.pdb)に基づいて他のBoNT血清型の予測される構造を得るために用いられた;
2.それゆえに得られた構造(pdb)ファイルは、H_CNドメインのN末端の端およびそれの前の約80残基(これらはH_Nドメインの一部である)のみを包含し、それによって、構造的に高度に保存されている「H_N/H_CN」領域を保持するように編集された;
3.蛋白質重ね合わせサーバーSuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)が、各血清型を3BTA.pdb構造上に重ね合わせるために用いられた;
4.重ね合わせられたpdbファイルは、BoNT/A1のH_Cドメインの始めの3₁₀ヘリックスを位置付けるために検分され、それから、他の血清型における対応する残基が同定された;
5.他のBoNT血清型配列は、対応する残基が正しいということをチェックするためにClustalオメガによってアライメントされた。

【0166】

この方法によって決定されたLH_N、H_C、および3₁₀ヘリックスドメインの例が下で提示される:

【表1】

【0167】

構造分析および配列アライメントを用いて、LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの後のβストランドは、全てのボツリヌスおよび破傷風神経毒素において保存された構造であり、LH_NおよびH_Cドメインを分離する3₁₀ヘリックスの第1の残基から始めるときには第8の残基において(例えば、BoNT/A1では残基879において)始まるということが見出された。

【0168】

BoNT/ABキメラは、BoNT/BからのH_Cドメインに共有結合的に連結されたBoNT/AからのLH_Nドメインを含み得て、
・LH_NドメインのC末端アミノ酸残基は、BoNT/AのH_Cドメインの始まり(N末)に位置付けられたβストランドのN末端の第8のアミノ酸残基に対応し、
・H_CドメインのN末端アミノ酸残基は、BoNT/BのH_Cドメインの始まり(N末)に位置付けられたβストランドのN末端の第7のアミノ酸残基に対応する。

【0169】

BoNT/ABキメラは、BoNT/BからのH_Cドメインに共有結合的に連結されたBoNT/AからのLH_Nドメインを含み得て、
・LH_NドメインのC末端アミノ酸残基は、BoNT/AのLH_Nドメインの終わり(C末)に位置付けられたαヘリックスのC末端アミノ酸残基に対応し、
・H_CドメインのN末端アミノ酸残基は、BoNT/BのLH_Nドメインの終わり(C末)に位置付けられたαヘリックスのC末端アミノ酸残基の直ちにC末端のアミノ酸残基に対応する。

【0170】

BoNT/ABキメラの設計プロセスの原理は、二次構造が毀損されないということを保証し、それによって各ドメインの三次構造および機能のいずれかの変化を最小化しようと努力することであった。理論によって拘束されることを欲することなしに、BoNT/ABキメラ上の3₁₀ヘリックスの4つの中心的なアミノ酸残基を遮断しないことによるものは、キメラ神経毒素にとって最適な立体配座を保証し、それによって、キメラ神経毒素がそれらの最大限までその機能を行使することを可能にするということが仮定される。

【0171】

BoNT/AからのLH_Nドメインは、配列番号62のアミノ酸残基1から872、または少なくとも70%の配列同一性をそれに対して有するポリペプチド配列に対応し得る。BoNT/AからのLH_Nドメインは、配列番号62のアミノ酸残基1から872、または少なくとも80%、90%、もしくは95%の配列同一性をそれに対して有するポリペプチド配列に対応し得る。好ましくは、BoNT/AからのLH_Nドメインは配列番号62のアミノ酸残基1から872に対応する。

【0172】

BoNT/BからのH_Cドメインは、配列番号52のアミノ酸残基860から1291、または少なくとも70%の配列同一性をそれに対して有するポリペプチド配列に対応し得る。BoNT/BからのH_Cドメインは、配列番号52のアミノ酸残基860から1291、または少なくとも80%、90%、もしくは95%の配列同一性をそれに対して有するポリペプチド配列に対応し得る。好ましくは、BoNT/BからのH_Cドメインは配列番号52のアミノ酸残基860から1291に対応する。

【0173】

好ましくは、BoNT/ABキメラはBoNT/AのLH_NドメインおよびBoNT/BのH_Cドメインを含む。より好ましくは、LH_NドメインはBoNT/A(配列番号62)のアミノ酸残基1から872に対応し、H_CドメインはBoNT/B(配列番号52)のアミノ酸残基860から1291に対応する。

【0174】

好ましくは、BoNT/BのH_Cドメインはさらに少なくとも1つのアミノ酸残基置換、追加、または欠失をH_CCサブドメイン上に含み、これは、天然BoNT/B配列と比較して、ヒトSytIIに対するBoNT/B神経毒素の結合親和性を増大させる効果を有する。BoNT/BのH_CCサブドメイン上の好適なアミノ酸残基置換、追加、または欠失はWO 2013/180799およびWO 2016/154534に開示されている(両方とも参照によって本明細書に組み込まれる)。

【0175】

BoNT/BのH_CCサブドメイン上の好適なアミノ酸残基置換、追加、または欠失は、以下からなる群から選択される置換変異を包含する:V1118M;Y1183M;E1191M;E1191I;E1191Q;E1191T;S1199Y;S1199F;S1199L;S1201V;E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、およびそれらの組み合わせ。

【0176】

BoNT/BのH_CCサブドメイン上の好適なアミノ酸残基置換、追加、または欠失は、さらに、以下からなる群から選択される2つの置換変異の組み合わせを包含する:E1191MおよびS1199L、E1191MおよびS1199Y、E1191MおよびS1199F、E1191QおよびS1199L、E1191QおよびS1199Y、E1191QおよびS1199F、E1191MおよびS1199W、E1191MおよびW1178Q、E1191CおよびS1199W、E1191CおよびS1199Y、E1191CおよびW1178Q、E1191QおよびS1199W、E1191VおよびS1199W、E1191VおよびS1199Y、またはE1191VおよびW1178Q。

【0177】

BoNT/BのH_CCサブドメイン上の好適なアミノ酸残基置換、追加、または欠失は、E1191M、S1199W、およびW1178Qである3つの置換変異の組み合わせをもまた包含する。

【0178】

好ましくは、BoNT/BのH_CCサブドメイン上の好適なアミノ酸残基置換、追加、または欠失は、E1191MおよびS1199Yである2つの置換変異の組み合わせを包含する。

【0179】

改変は、配列番号52として示される未改変のBoNT/Bと比較したときの改変であり得る。アミノ酸残基付番は配列番号52とのアライメントによって決定される。配列番号52の位置1におけるメチオニン残基の存在は任意であるので、当業者はアミノ酸残基付番を決定するときにメチオニン残基の存在/不在を考慮に入れるであろう。例えば、配列番号52がメチオニンを包含するところでは、位置付番は上で定義される通りであろう(例えばE1191は配列番号52のE1191であろう)。代替的には、メチオニンが配列番号52に不在であるところでは、アミノ酸残基付番は-1だけ改変されるべきである(例えばE1191は配列番号52のE1190であろう)。本明細書に記載される他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在する/不在であるときには、類似の考えが適用され、当業者は当分野において慣例の技術を用いて正しいアミノ酸残基付番を難なく決定するであろう。

【0180】

それゆえに、1つの態様において、本発明は、対象の神経免疫応答を促進することによって脳の障害を処置することにおける使用のためのクロストリジウム神経毒素を提供し、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0181】

関係する態様において、神経免疫活性を促進することによって対象の脳の障害を処置するための方法が提供され、方法はクロストリジウム神経毒素を対象に投与することを含み、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0182】

さらなる関係する態様において、神経免疫応答を促進することによって対象の脳の障害を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用が提供され、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するクロストリジウム神経毒素配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0183】

1つの態様において、本発明は、対象の脳の障害を処置することにおける使用のためのクロストリジウム神経毒素を提供し、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0184】

関係する態様において、対象の脳の障害を処置するための方法が提供され、方法はクロストリジウム神経毒素を対象に投与することを含み、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0185】

さらなる関係する態様において、対象の脳の障害を処置するための医薬の製造におけるクロストリジウム神経毒素の使用が提供され、クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、クロストリジウム神経毒素は少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含む)。

【0186】

1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号63または64に対して有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、配列番号63または64として示されるポリペプチド配列を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0187】

例えば、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号64に対して有するポリペプチド配列を含み得る。クロストリジウム神経毒素は配列番号64として示されるポリペプチド配列を含み(より好ましくはそれからなり)得る。

【0188】

好ましい実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号64に対して有するポリペプチド配列を含み得る。例えば、特に好適なクロストリジウム神経毒素は配列番号63として示されるポリペプチド配列を含み(より好ましくはそれからなり)得る。

【0189】

好ましくは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号63に対して有するポリペプチド配列を含むクロストリジウム神経毒素は、触媒的に不活性なL鎖、例えば配列番号64を含む。

【0190】

本発明における使用のためのキメラおよび/またはハイブリッドクロストリジウム神経毒素は、BoNT/Aポリペプチドのある部分およびBoNT/Bポリペプチドのある部分を含み得る。これの例は、配列番号44として本明細書に記載されるポリペプチドを包含する。

【0191】

好適なキメラクロストリジウム神経毒素はBoNT/FAを包含し得る。実際に、特に好ましい実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素(例えばキメラクロストリジウム神経毒素)はBoNT/FAまたはその断片を含み得る。BoNT/FAの触媒的に不活性な形態は配列番号26および34として本明細書に記載される。BoNT/FAの好適な断片もまた配列番号28、30、および32として本明細書に記載される。

【0192】

用語「クロストリジウム神経毒素」は、非クロストリジウム微生物によって発現される新たに発見されたボツリヌス神経毒素蛋白質ファミリー構成員をもまた包摂し得る。例えば、最も近い配列同一性をBoNT/Xに対して有するエンテロコッカスによってコードされる毒素、VAMP2をW89-W90で切断するBoNT/Woと呼ばれるワイセラ・オリゼーによってコードされる毒素(NCBIのRefSeq:WP_027699549.1)、VAMP2およびSNAP25を切断するエンテロコッカス・フェシウムによってコードされる毒素(GenBank:OTO22244.1)、ならびにクリセオバクテリウム・ピペロによってコードされる毒素(NCBIのRef.Seq:WP_034687872.1)。

【0193】

本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素の機能的なH_Cドメインを欠き得る。また、いずれかの機能的に同等の外来性のリガンド標的化部分(TM)を欠き得る。

【0194】

それゆえに、特に好ましい実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は再標的化されたクロストリジウム神経毒素ではない。再標的化されたクロストリジウム神経毒素では、クロストリジウム神経毒素は、標的化部分(TM)として公知の外来性のリガンドを包含するように改変される。TMは所望の標的細胞に対する結合特異性を提供するように選択され、再標的化プロセスの一部として、クロストリジウム神経毒素のネイティブな結合部分(例えばH_CドメインまたはH_CCドメイン)は除去され得る。再標的化テクノロジーは例えば以下に記載されている:EP-B-0689459;WO 1994/021300;EP-B-0939818;US 6,461,617;US 7,192,596;WO 1998/007864;EP-B-0826051;US 5,989,545;US 6,395,513;US 6,962,703;WO 1996/033273;EP-B-0996468;US 7,052,702;WO 1999/017806;EP-B-1107794;US 6,632,440;WO 2000/010598;WO 2001/21213;WO 2006/059093;WO 2000/62814;WO 2000/04926;WO 1993/15766;WO 2000/61192;およびWO 1999/58571;これらの全てはそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。

【0195】

上で論じられている通り、(全長)クロストリジウム神経毒素は、2つのポリペプチド鎖、およそ100kDaの分子質量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子質量を有する軽鎖(L鎖)から形成される。H鎖はC末端の標的化コンポーネント(受容体結合ドメインまたはH_Cドメイン)およびN末端の移行コンポーネント(H_Nドメイン)を含む。

【0196】

クロストリジウム神経毒素は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、およびTeNT(破傷風神経毒素)から選択され得る。好ましくは、クロストリジウム神経毒素は、ボツリヌス神経毒素、例えば、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、およびBoNT/Xから選択されるボツリヌス神経毒素である。

【0197】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Aであり得る。参照BoNT/A配列は配列番号51として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Bであり得る。参照BoNT/B配列は配列番号52として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Cであり得る。参照BoNT/C配列は配列番号53として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Dであり得る。参照BoNT/D配列は配列番号54として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Eであり得る。参照BoNT/E配列は配列番号55として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Fであり得る。参照BoNT/F配列は配列番号56として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Gであり得る。参照BoNT/G配列は配列番号57として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はTeNTであり得る。参照TeNT配列は配列番号58として示されている。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素はBoNT/Xであり得る。参照BoNT/X配列は配列番号59として示されている。

【0198】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はBoNT/Aの断片またはBoNT/Fの断片を含む。別の実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はBoNT/AまたはBoNT/Fの触媒的に不活性なL鎖を含む。例えば、本発明のクロストリジウム神経毒素はBoNT/Aの触媒的に不活性なL鎖を含み得る。

【0199】

本明細書に記載されるクロストリジウム神経毒素が精製のためのタグ(例えばHisタグ)および/またはリンカーを有する実施形態において、前記のタグおよび/またはリンカーは任意である。

【0200】

好適な全長クロストリジウム神経毒素が本明細書に記載される。

【0201】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つを含むポリペプチド配列を含み得る。ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。

【0202】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または60のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるものであり得る。ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または60のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるものであり、ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または60のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされるものであり、ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。

【0203】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み、ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または65のいずれか1つを含み、ただし、好ましくは、前記のクロストリジウム神経毒素のクロストリジウム神経毒素L鎖は触媒的に不活性である。

【0204】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、およびTeNTから選択される全長クロストリジウム神経毒素である。

【0205】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、およびTeNTから選択される全長クロストリジウム神経毒素である。

【0206】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号51～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号51～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも99%または99.9%の配列同一性を配列番号51～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号51～59、61、または63のいずれか1つを含むポリペプチド配列を含み(より好ましくはそれからなり)得る。

【0207】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号52～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号52～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも99%または99.9%の配列同一性を配列番号52～59、61、または63のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号52～59、61、または63のいずれか1つを含むポリペプチド配列を含み(より好ましくはそれからなり)得る。

【0208】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は全長の触媒的に活性なクロストリジウム神経毒素ではなく、例えば全長の触媒的に活性なBoNT/Aではない。

【0209】

本発明のクロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素の断片、例えば、本明細書に記載されるいずれかの全長クロストリジウム神経毒素の断片を含み(またはそれからなり)得る。

【0210】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列の断片を含み得る。1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列の断片を含み得る。好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素は、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または65のいずれか1つを含むポリペプチド配列の断片を含み得る。

【0211】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素L鎖またはその断片を含む(またはそれからなる)。クロストリジウム神経毒素L鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素L鎖の≦400、≦350、≦300、≦250、≦200、≦150、≦100、または≦50アミノ酸残基を有し得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素L鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素L鎖の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、または200アミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒素L鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素L鎖の20～400、50～300、または100～200アミノ酸残基を有し得る。

【0212】

L鎖参照配列の例は以下を包含する:
ボツリヌスA型神経毒素:アミノ酸残基1-448
ボツリヌスB型神経毒素:アミノ酸残基1-440
ボツリヌスC1型神経毒素:アミノ酸残基1-441
ボツリヌスD型神経毒素:アミノ酸残基1-445
ボツリヌスE型神経毒素:アミノ酸残基1-422
ボツリヌスF型神経毒素:アミノ酸残基1-439
ボツリヌスG型神経毒素:アミノ酸残基1-441
破傷風神経毒素:アミノ酸残基1-457

【0213】

最近同定されたBoNT/Xでは、L鎖はそのアミノ酸1～439に対応すると報告されており、L鎖の境界は可能性としておよそ25アミノ酸だけ変動する(例えば1～414または1～464)。

【0214】

軽微な変動が血清型サブタイプに従って生起し得るので、上で同定されている参照配列はガイドと考えられるべきである。例として、US 2007/0166332(その全体が参照によってここに組み込まれる)は軽微に異なるクロストリジウム配列を引用している:
ボツリヌスA型神経毒素:アミノ酸残基M1-K448
ボツリヌスB型神経毒素:アミノ酸残基M1-K441
ボツリヌスC1型神経毒素:アミノ酸残基M1-K449
ボツリヌスD型神経毒素:アミノ酸残基M1-R445
ボツリヌスE型神経毒素:アミノ酸残基M1-R422
ボツリヌスF型神経毒素:アミノ酸残基M1-K439
ボツリヌスG型神経毒素:アミノ酸残基M1-K446
破傷風神経毒素:アミノ酸残基M1-A457

【0215】

好適なクロストリジウム神経毒素L鎖が本明細書に記載される。

【0216】

クロストリジウム神経毒素L鎖は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号6、24、32、もしくは40のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素L鎖は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号6、24、32、もしくは40のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒素L鎖は、配列番号6、24、32、もしくは40のいずれか1つを含むポリペプチド配列、またはその断片を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0217】

クロストリジウム神経毒素L鎖は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号5、23、31、もしくは39のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素L鎖は、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号5、23、31、もしくは39のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。好ましくは、クロストリジウム神経毒素L鎖は、配列番号5、23、31、もしくは39のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。

【0218】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素H鎖の断片を含む(またはそれからなる)。クロストリジウム神経毒素H鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素H鎖の≦800、≦700、≦600、≦500、≦400、≦350、≦300、≦250、≦200、≦150、≦100、または≦50アミノ酸残基を有し得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素H鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素H鎖の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、または200アミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒素H鎖の断片は、クロストリジウム神経毒素H鎖の20～800、30～600、40～400、50～300、または100～200アミノ酸残基を有し得る。

【0219】

クロストリジウム神経毒素H鎖は2つの構造/機能ドメイン:トランスロケーションドメイン(H_N)および受容体結合ドメイン(H_C)を含む。

【0220】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインまたはその断片を含む(またはそれからなる)。クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの≦400、≦350、≦300、≦250、≦200、≦150、≦100、または≦50アミノ酸残基を有し得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、または200アミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインの20～400、50～300、または100～200アミノ酸残基を有し得る。

【0221】

トランスロケーションドメインは、H鎖のアミノ末端半分とおよそ同等のクロストリジウム神経毒素のH鎖の断片、またはインタクトなH鎖上のその断片に対応するドメインである。1つの実施形態において、H鎖のH_C機能はH_Cアミノ酸配列の欠失によって除去され得る(DNA合成レベルでまたは合成後のレベルでどちらかで、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼ処置による)。代替的には、H_C機能は化学的または生物学的処置によって不活性化され得る。それゆえに、いくつかの実施形態において、H鎖は、ネイティブなクロストリジウム神経毒素(すなわちホロ毒素)が結合する標的細胞上の結合部位に結合できないこともあり得る。

【0222】

好適な(参照)トランスロケーションドメインの例は以下を包含する:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(449-871)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(441-858)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(442-866)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(446-862)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(423-845)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(440-864)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(442-863)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(458-879)

【0223】

軽微な変動が血清型サブタイプに従って生起し得るので、上で同定されている参照配列はガイドと考えられるべきである。例として、US 2007/0166332(その参照によってここに組み込まれる)は軽微に異なるクロストリジウム配列を引用している:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(A449-K871)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(A442-S858)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(T450-N866)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(D446-N862)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(K423-K845)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(A440-K864)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(S447-S863)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(S458-V879)

【0224】

本発明の文脈においては、トランスロケーションドメインを含む種々のクロストリジウム神経毒素H_N領域が本発明の態様において有用であり得る。1つの実施形態において、これらの活性な断片は、細胞内小胞から標的細胞の細胞質中への非細胞毒性のプロテアーゼ(例えばクロストリジウムL鎖)の放出を易化し、それゆえに、クロストリジウム神経毒素が基質を蛋白質分解的に切断する総体的な細胞メカニズムを行使することに関与し得る。クロストリジウム神経毒素の重鎖からのH_N領域は長さがおよそ410～430アミノ酸であり、トランスロケーションドメインを含む。研究は、クロストリジウム神経毒素重鎖からのH_N領域の長さ全体はトランスロケーションドメインの移行活性に必要ではないということを示している。それゆえに、この実施形態の態様は、例えば少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒素H_N領域を包含し得る。この実施形態の他の態様は、例えば最大で350アミノ酸、最大で375アミノ酸、最大で400アミノ酸、最大で425アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒素H_N領域を包含し得る。

【0225】

クロストリジウム・ボツリヌムおよびC.テタニにおける毒素生成の遺伝学的な基礎についてのさらなる詳細は、Henderson et al (1997), The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press参照。

【0226】

用語H_Nは、天然に生起する神経毒素H_N部分、ならびに天然には生起しないアミノ酸配列および/または合成アミノ酸残基を有する改変されたH_N部分を包摂する。1つの実施形態において、前記の改変されたH_N部分は上で言及された移行機能を依然として実証する。

【0227】

好ましい実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)またはその断片を含む(またはそれからなる)。クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の断片は、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の≦350、≦300、≦250、≦200、≦150、≦100、または≦50アミノ酸残基を有し得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の断片は、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、または200アミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の断片は、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)の20～350、50～300、または100～200アミノ酸残基を有し得る。

【0228】

クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)参照配列の例は以下を包含する:
BoNT/A - N872-L1296
BoNT/B - E859-E1291
BoNT/C1 - N867-E1291
BoNT/D - S863-E1276
BoNT/E - R846-K1252
BoNT/F - K865-E1274
BoNT/G - N864-E1297
TeNT - I880-D1315

【0229】

最近同定されたBoNT/Xでは、H_Cドメインはそのアミノ酸893～1306に対応すると報告されており、ドメインの境界は可能性としておよそ25アミノ酸だけ変動する(例えば868～1306または918～1306)。

【0230】

クロストリジウム神経毒素H鎖はさらにトランスロケーション易化ドメインを含み得る。前記のドメインは標的細胞のサイトゾル中へのL鎖の送達を易化し、例えばWO 08/008803およびWO 08/008805に記載されている。これらのそれぞれはその参照によって本明細書に組み込まれる。

【0231】

例として、トランスロケーション易化ドメインはクロストリジウム神経毒素H_CNドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み得る。より詳細には、クロストリジウム神経毒素H_CNトランスロケーション易化ドメインは、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸の長さを有し得る。これについて、クロストリジウム神経毒素H_CNトランスロケーション易化ドメインは、好ましくは最大で200アミノ酸、最大で225アミノ酸、最大で250アミノ酸、または最大で275アミノ酸の長さを有する。具体(参照)例は以下を含む:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(872-1110)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(859-1097)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(867-1111)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(863-1098)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(846-1085)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(865-1105)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(864-1105)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(880-1127)

【0232】

上の配列位置は血清型/サブタイプに従って少し変動し得る。好適な(参照)クロストリジウム神経毒素H_CNドメインのさらなる例は以下を包含する:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(874-1110)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(861-1097)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(869-1111)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(865-1098)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(848-1085)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(867-1105)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(866-1105)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(882-1127)

【0233】

好適なクロストリジウム神経毒素H_Cドメインは本明細書に記載される。

【0234】

クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは50のいずれか1つを含むポリペプチド配列、またはその断片を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0235】

クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。好ましくは、クロストリジウム神経毒素H_Cドメインは、配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは49のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。

【0236】

1つの実施形態において、本発明における使用のためのクロストリジウム神経毒素H_CドメインはバリアントBoNT/AH_Cドメインである。前記のバリアントBoNT/AH_Cドメインは、Y1117、F1252、H1253、およびL1278から選択される1つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。例えば、バリアントBoNT/AH_Cドメインは次の改変Y1117V、F1252Y、H1253K、およびL1278FまたはL1278Hの1つ以上(好ましくは2つ以上)を含み得る。

【0237】

1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは次の改変を含む:Y1117VおよびH1253K;またはY1117V、F1252Y、H1253K、およびL1278F;またはY1117V、F1252Y、H1253K、およびL1278H。

【0238】

好ましくは、バリアントBoNT/AH_Cドメインは次の改変を含む:Y1117VおよびH1253K;またはY1117V、F1252Y、H1253K、およびL1278H。

【0239】

改変は、配列番号62として示される未改変のBoNT/Aと比較したときの改変であり得る。アミノ酸残基付番は配列番号62とのアライメントによって決定される。配列番号62の位置1のメチオニン残基の存在は任意であるので、当業者はアミノ酸残基付番を決定するときにメチオニン残基の存在/不在を考慮に入れるであろう。例えば、配列番号62がメチオニンを包含するところでは、位置付番は上で定義される通りであろう(例えばY1117は配列番号62のY1117に対してアライメントするであろう)。代替的には、メチオニンが配列番号62に不在であるところでは、アミノ酸残基付番は-1だけ改変されるべきである(例えばY1117は配列番号52のY1116に対してアライメントするであろう)。本明細書に記載される他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在する/不在であるときには、類似の考えが適用され、当業者は当分野において慣例の技術を用いて正しいアミノ酸残基付番を難なく決定するであろう。

【0240】

バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号46、48、もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み得る。ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号46、48、もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも99%もしくは99.9%の配列同一性を配列番号46、48、もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。好ましくは、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、配列番号46、48、もしくは50のいずれか1つを含むポリペプチド配列、またはその断片を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0241】

バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号46もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み得る。ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号46もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも99%もしくは99.9%の配列同一性を配列番号46もしくは50のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。好ましくは、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、配列番号46もしくは50のいずれか1つを含むポリペプチド配列、またはその断片を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0242】

バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号45、47、もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり得る。ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号45、47、もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも99%もしくは99.9%の配列同一性を配列番号45、47、もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。好ましくは、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、配列番号45、47、もしくは49のいずれか1つによってコードされるもの、またはその断片である。

【0243】

バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号45もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり得る。ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号45もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。1つの実施形態において、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、少なくとも99%もしくは99.9%の配列同一性を配列番号45もしくは49のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり、ただし、バリアントBoNT/AH_Cドメインは上に記載されている改変を含む。好ましくは、バリアントBoNT/AH_Cドメインは、配列番号45もしくは49のいずれか1つによってコードされるもの、またはその断片である。

【0244】

上に記載されている易化ドメインのいずれかは、本発明における使用にとって好適である先に記載されているトランスロケーションドメインペプチドのいずれかと組み合わせられ得る。それゆえに、例として、非クロストリジウムの易化ドメインは、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドとまたはクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせられ得る。代替的には、クロストリジウム神経毒素H_CNトランスロケーション易化ドメインは非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせられ得る。代替的には、クロストリジウム神経毒素H_CN易化ドメインはクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせられ得る。これらの例は以下を包含する:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(449-1110)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(442-1097)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(450-1111)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(446-1098)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(423-1085)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(440-1105)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(447-1105)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(458-1127)

【0245】

いくつかの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素の機能的なH_Cドメインを欠き得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、好ましくは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素の最後の50個のC末端アミノ酸を欠く。別の実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、好ましくは、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素の最後の100、好ましくは最後の150、より好ましくは最後の200、特に好ましくは最後の250、最も好ましくは最後の300個のC末端アミノ酸残基を欠く。代替的には、H_C結合活性は変異導入によって無効化/縮減され得る-例として、便宜のためにBoNT/Aを参照すると、ガングリオシド結合ポケット上の1つまたは2つのアミノ酸残基変異(W1266からLおよびY1267からF)の改変は、H_C領域がその受容体結合機能を失うことを引き起こす。相似の変異が非血清型Aクロストリジウムペプチドコンポーネントになされ得る。例えば、変異を有するボツリヌスB(W1262からLおよびY1263からF)またはボツリヌスE(W1224からLおよびY1225からF)に基づくコンストラクトである。活性部位の他の変異、例えばボツリヌスA型毒素のY1267Sおよび他のクロストリジウム神経毒素の対応する高度に保存された残基は、H_C受容体結合活性の同じ削減を達成する。これおよび他の変異の詳細はRummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634)に記載され、これはその参照によってここに組み込まれる。

【0246】

ネイティブなクロストリジウム神経毒素のH_Cペプチドはおよそ400～440アミノ酸残基を含み、各およそ25kDaの2つの機能的に明確なドメイン、つまりN末端領域(普通にはH_CNペプチドまたはドメインと言われる)およびC末端領域(普通にはH_CCペプチドまたはドメインと言われる)からなる。この事実は次の発表物によって確認され、これらのそれぞれはその全体がその参照によって本明細書に組み込まれる:Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792;Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204;Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192;Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364;Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902;Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90;Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759;およびRummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。その上、C末端160～200アミノ酸残基を構成するC末端領域(H_CC)は、その天然の細胞受容体に対する、つまり神経筋接合部の神経終末に対するクロストリジウム神経毒素の結合を担うということが良く立証されている-この事実もまた上の発表物によって確認される。それゆえに、本明細書において、重鎖がネイティブなクロストリジウム神経毒素が結合する細胞表面受容体に結合することができないようにして機能的な重鎖H_Cペプチド(またはドメイン)を欠くクロストリジウム重鎖と言うことは、クロストリジウム重鎖が単純に機能的なH_CCペプチドを欠くということを意味する。換言すると、神経筋接合部の神経終末に対するそのネイティブな結合能力を縮減するために、H_CCペプチド領域は、部分的にもしくは丸ごとどちらかで欠失または別様に(例えば、従来の化学的または蛋白質分解的処置によって)修飾され得る。

【0247】

それゆえに、1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素H_Nペプチドは、クロストリジウム神経毒素のC末端ペプチド部分(H_CC)の一部を欠き、それゆえに、ネイティブなクロストリジウム神経毒素のH_C結合機能を欠く。例として、1つの実施形態において、C末端伸長したクロストリジウムH_Nペプチドは、クロストリジウム神経毒素重鎖のC末端40アミノ酸残基、またはC末端60アミノ酸残基、またはC末端80アミノ酸残基、またはC末端100アミノ酸残基、またはC末端120アミノ酸残基、またはC末端140アミノ酸残基、またはC末端150アミノ酸残基、またはC末端160アミノ酸残基を欠く。別の実施形態において、本発明のクロストリジウムH_Nペプチドは、クロストリジウム神経毒素のC末端ペプチド部分全体(H_CC)を欠き、それゆえに、ネイティブなクロストリジウム神経毒素のH_C結合機能を欠く。例として、1つの実施形態において、クロストリジウムH_Nペプチドは、クロストリジウム神経毒素重鎖のC末端165アミノ酸残基、またはC末端170アミノ酸残基、またはC末端175アミノ酸残基、またはC末端180アミノ酸残基、またはC末端185アミノ酸残基、またはC末端190アミノ酸残基、またはC末端195アミノ酸残基を欠く。さらなる例として、本発明のクロストリジウムH_Nペプチドは、以下からなる群から選択されるクロストリジウムH_CC参照配列を欠く:
ボツリヌスA型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1111-L1296)
ボツリヌスB型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1098-E1291)
ボツリヌスC型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1112-E1291)
ボツリヌスD型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1099-E1276)
ボツリヌスE型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1086-K1252)
ボツリヌスF型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1106-E1274)
ボツリヌスG型神経毒素 - アミノ酸残基(Y1106-E1297)
破傷風神経毒素 - アミノ酸残基(Y1128-D1315)。

【0248】

軽微な変動が血清型サブタイプに従って生起し得るので、上で同定されている参照配列はガイドと考えられるべきである。

【0249】

好ましい実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素L鎖またはその断片およびクロストリジウム神経毒素H鎖の断片を含む(またはそれからなる)。例えば、クロストリジウム神経毒素は、クロストリジウム神経毒素L鎖またはその断片およびクロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメイン(H_N)を含み(またはそれからなり)得る。好ましくは、クロストリジウム神経毒素は、さらに、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメイン(H_C)またはクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメインの少なくともC末端部分(H_CC)を含まない。それゆえに、1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素受容体結合ドメインのC末端部分(H_CC)を欠く。有利には、かかるクロストリジウム神経毒素は内因的なクロストリジウム神経毒素受容体結合能を欠き、それゆえに、前記のクロストリジウム神経毒素を投与された対象においてより少しのオフターゲット効果を見せる。

【0250】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は、本質的に、クロストリジウム神経毒素L鎖もしくはその断片および/またはクロストリジウム神経毒素H鎖の断片からなる。この文脈において用いられる用語「から本質的になる」は、クロストリジウム神経毒素が、さらに、例えば対象に投与されるときにクロストリジウム神経毒素に追加の機能性を付与する1つ以上のアミノ酸残基を含まないということを意味する。換言すると、クロストリジウム神経毒素L鎖もしくはその断片および/またはクロストリジウム神経毒素H鎖の断片「から本質的になる」クロストリジウム神経毒素は、さらに1つ以上のアミノ酸残基を(クロストリジウム神経毒素L鎖もしくはその断片および/またはクロストリジウム神経毒素H鎖の断片のものに)含み得るが、前記の1つ以上のさらなるアミノ酸残基は、例えば対象に投与されるときにクロストリジウム神経毒素に追加の機能性を付与しない。追加の機能性は、何らかの酵素活性、結合活性、および/またはいずれかの生理活性を包含し得る。

【0251】

1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、いずれかのクロストリジウム神経毒素配列に加えて非クロストリジウム神経毒素配列を含み得る。非クロストリジウム神経毒素配列は、好ましくは、本発明のクロストリジウム神経毒素が神経免疫応答を促進する能力を遮断しない。好ましくは、非クロストリジウム神経毒素配列は、触媒活性、例えば酵素活性を有するものではない。好ましくは、非クロストリジウム配列は細胞の受容体に結合するものではない。換言すると、非クロストリジウム配列は細胞の受容体に対するリガンドではないということが最も好ましい。細胞の受容体は膜内在性蛋白質などの蛋白質性の細胞の受容体であり得る。細胞の受容体の例は、https://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reportsで利用可能なIUPHAR薬理学ガイドデータベース・バージョン2019.4(IUPHAR Guide to Pharmacology Database, version 2019.4)に見出され得る。非クロストリジウム神経毒素配列は、Hisタグなどの精製を補助するためのタグを包含し得る。前記のクロストリジウム神経毒素に含まれるいずれかのクロストリジウム神経毒素配列は、クロストリジウム神経毒素L鎖もしくはその断片および/またはクロストリジウム神経毒素H鎖の断片からなるということが好ましい。1つの実施形態において、前記のクロストリジウム神経毒素に含まれるクロストリジウム神経毒素配列は、クロストリジウム神経毒素L鎖からなり得る。1つの実施形態において、前記のクロストリジウム神経毒素に含まれるクロストリジウム神経毒素配列は、クロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインからなり得る。1つの実施形態において、前記のクロストリジウム神経毒素に含まれるクロストリジウム神経毒素配列は、クロストリジウム神経毒素受容体結合ドメインからなり得る。1つの実施形態において、前記のクロストリジウム神経毒素に含まれるクロストリジウム神経毒素配列は、クロストリジウム神経毒素L鎖およびクロストリジウム神経毒素トランスロケーションドメインからなり得る。

【0252】

クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)好適なクロストリジウム神経毒素が本明細書に記載される。

【0253】

クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号4、20、28、もしくは36のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含み得る。1つにおいて、クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号4、20、28、もしくは36のいずれか1つに対して有するポリペプチド配列、またはその断片を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、配列番号4、20、28、もしくは36のいずれか1つを含むポリペプチド配列またはその断片を含む(より好ましくはそれからなる)。

【0254】

クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号3、19、27、もしくは35のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片であり得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、もしくは98%の配列同一性を配列番号3、19、27、もしくは35のいずれか1つに対して有するヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。好ましくは、クロストリジウム神経毒素L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(またはそれからなる)クロストリジウム神経毒素は、配列番号3、19、27、もしくは35のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされるもの、またはその断片である。

【0255】

本発明のクロストリジウム神経毒素は、天然に生起するクロストリジウム神経毒素複合体に存在する複合体化蛋白質を不含であり得る。

【0256】

本発明のクロストリジウム神経毒素は組み換え核酸テクノロジーを用いて生成され得る。それゆえに、1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素(上に記載されている通り)は組み換えクロストリジウム神経毒素である。

【0257】

1つの実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素はクロストリジウム神経毒素L鎖を含む。L鎖は触媒的に不活性であるということが好ましい。

【0258】

活性なクロストリジウム神経毒素L鎖は非細胞毒性のプロテアーゼ活性を有する。具体的には、活性なクロストリジウム神経毒素L鎖はエンドペプチダーゼ活性を有し、標的細胞内のエキソサイトーシス系融合装置の蛋白質を切断することができる。エキソサイトーシス系融合装置の蛋白質は、好ましくはSNARE蛋白質、例えばSNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、またはシンタキシンである。

【0259】

クロストリジウム神経毒素L鎖について本明細書において用いられる用語「触媒的に不活性な」は、前記のL鎖が実質的に非細胞毒性のプロテアーゼ活性を見せないということを意味する。好ましくは、クロストリジウム神経毒素L鎖について本明細書において用いられる用語「触媒的に不活性な」は、前記のL鎖が非細胞毒性のプロテアーゼ活性を見せないということを意味する。1つの実施形態において、触媒的に不活性なクロストリジウム神経毒素L鎖は、標的細胞内のエキソサイトーシス系融合装置の蛋白質を切断しないものである。用語「実質的に非細胞毒性のプロテアーゼ活性なし」は、クロストリジウム神経毒素L鎖が、触媒的に活性なクロストリジウム神経毒素L鎖の非細胞毒性のプロテアーゼ活性の5%未満、例えば、触媒的に活性なクロストリジウム神経毒素L鎖の非細胞毒性のプロテアーゼ活性の2%未満、1%、または好ましくは0.1%未満を有するということを意味する。非細胞毒性のプロテアーゼ活性は、試験クロストリジウム神経毒素L鎖をSNARE蛋白質とインキュベーションすること、および同じ条件において触媒的に活性なクロストリジウム神経毒素L鎖によって切断されたSNARE蛋白質の量と比較したときに、試験クロストリジウム神経毒素L鎖によって切断されたSNARE蛋白質の量を比較することによって、インビトロで決定され得る。SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングなどの慣例の技術が、切断されたSNARE蛋白質の量を定量するために用いられ得る。好適なインビトロアッセイはWO 2019/145577 A1に記載され、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0260】

細胞に基づくおよびインビボのアッセイもまた、L鎖ならびに機能的な細胞結合およびトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒素が非細胞毒性のプロテアーゼ活性を有するかどうかを決定するために用いられ得る。指外転スコア(DAS)、後根神経節(DRG)アッセイ、脊髄ニューロン(SCN)アッセイ、およびマウス横隔神経半横隔膜(PNHD)アッセイなどのアッセイが当分野において慣例である。非細胞毒性のプロテアーゼ活性を決定するための好適なアッセイは、Donald et al (2018), Pharmacol Res Perspect, e00446, 1-14に記載されているものであり得る。これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0261】

触媒的に不活性なL鎖は、前記の触媒活性を不活性化する1つ以上の変異を有し得る。例えば、触媒的に不活性なBoNT/AL鎖は、活性部位残基、例えばHis223、Glu224、His227、Glu262、および/またはTyr366の変異を含み得る。位置付番は配列番号62のアミノ酸位置に対応し、ポリペプチドを配列番号62とアライメントすることによって決定され得る。配列番号62の位置1のメチオニン残基の存在は任意であるので、当業者はアミノ酸残基付番を決定するときにメチオニン残基の存在/不在を考慮に入れるであろう。例えば、配列番号62がメチオニンを包含するところでは、位置付番は上で定義される通りであろう(例えばHis223は配列番号62のHis223であろう)。代替的には、メチオニンが配列番号62に不在であるところでは、アミノ酸残基付番は-1だけ改変されるべきである(例えばHis223は配列番号62のHis222であろう)。本明細書に記載される他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在する/不在であるときには、類似の考えが適用され、当業者は当分野において慣例の技術を用いて正しいアミノ酸残基付番を難なく決定するであろう。

【0262】

特に好ましい実施形態において、本発明のクロストリジウム神経毒素は改変されたBoNT/Aまたはその断片(好ましくは、BoNT/AH_Cドメインまたはその断片)を含み得る。改変されたBoNT/Aまたはその断片は、以下から選択される1つ以上のアミノ酸残基(単数または複数)に改変を含むものであり得る:ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、およびTHR1277。かかる改変されたBoNT/Aまたはその断片は、公知のBoNT/Aの使用と比較して副作用の縮減または不在を実証し得る。本発明の改変されたBoNT/Aの増大した組織保持特性は、増大した力価および/または作用持続時間をもまた提供し得て、公知のクロストリジウム毒素治療薬と比較して縮減された投与量(またはいずれかの追加の有害作用なしに増大した投与量)が用いられることを可能にし、それゆえに、さらなる利点を提供し得る。

【0263】

改変は、配列番号62として示される未改変のBoNT/Aと比較したときの改変であり得る。アミノ酸残基付番は配列番号62とのアライメントによって決定される。配列番号62(および本明細書に記載される改変されたBoNT/Aポリペプチドまたはそれらの断片に対応する配列番号)の位置1のメチオニン残基の存在は任意であるので、当業者は、アミノ酸残基付番を決定するときにメチオニン残基の存在/不在を考慮に入れるであろう。例えば、配列番号62がメチオニンを包含するところでは、位置付番は上で定義される通りであろう(例えばASN886は配列番号62のASN886であろう)。代替的には、メチオニンが配列番号62に不在であるところでは、アミノ酸残基付番は-1だけ改変されるべきである(例えばASN886は配列番号62のASN885であろう)。本明細書に記載される他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在する/不在であるときには、類似の考えが適用され、当業者は当分野において慣例の技術を用いて正しいアミノ酸残基付番を難なく決定するであろう。

【0264】

上の改変を指示されるアミノ酸残基(単数または複数)は表面露出アミノ酸残基(単数または複数)である。

【0265】

改変されたBoNT/Aまたはその断片は以下から選択される1つ以上のアミノ酸残基(単数または複数)における改変を含み得る:ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、およびTHR1277。

【0266】

用語「1つ以上のアミノ酸残基(単数または複数)」は、改変されたBoNT/Aまたはその断片の文脈において用いられるときには、好ましくは、指示されているアミノ酸残基(単数または複数)の少なくとも2、3、4、5、6、または7つを意味する。それゆえに、改変されたBoNT/Aは、少なくとも2、3、4、5、6、または7つの(好ましくは7つの)改変を指示されているアミノ酸残基(単数または複数)に含み得る。改変されたBoNT/Aまたはその断片は1～30、3～20、または5～10個のアミノ酸改変を含み得る。より好ましくは、用語「1つ以上のアミノ酸残基(単数または複数)」は、改変されたBoNT/Aまたはその断片の文脈において用いられるときに、指示されているアミノ酸残基(単数または複数)の全てを意味する。

【0267】

好ましくは、指示されているアミノ酸残基(単数または複数)における1つ以上のアミノ酸改変(単数または複数)以外には、改変されたBoNT/Aまたはその断片は、配列番号62と比較したときにいずれかのさらなるアミノ酸改変を含有しない。

【0268】

改変は以下から選択され得る:
i.塩基性アミノ酸残基による酸性表面露出アミノ酸残基の置換;
ii.非荷電アミノ酸残基による酸性表面露出アミノ酸残基の置換;
iii.塩基性アミノ酸残基による非荷電表面露出アミノ酸残基の置換;
iv.塩基性アミノ酸残基の挿入;および
v.酸性の表面露出アミノ酸残基の欠失。

【0269】

上で指示されている改変は、対応する未改変のBoNT/Aまたはその断片と比較したときに、増大した正の表面電荷および増大した等電点を有する改変されたBoNT/Aまたはその断片をもたらす。

【0270】

等電点(pI)は所与の蛋白質の特異的な特性である。当分野において周知である通り、蛋白質はアミノ酸(蛋白質上のときはアミノ酸残基ともまた言われる)の特異的な配列から作られる。20の標準的なセットの各アミノ酸は異なる側鎖(またはR基)を有し、蛋白質上の各アミノ酸残基が異なる化学的特性、例えば電荷および疎水性を呈するということを意味する。これらの特性は、取り巻く化学的環境、例えば温度およびpHによって影響され得る。蛋白質の総体的な化学的特徴はこれらの種々の因子の総計に依存するであろう。

【0271】

ある種のアミノ酸残基(下で詳述される)は、取り巻くpHに依存して電荷を呈し得るイオン化可能な側鎖を所有する。かかる側鎖が所与のpHにおいて荷電しているか否かは該当するイオン化可能な部分のpKaに依存し、pKaは、共役塩基からの所定のプロトンについての酸解離定数(Ka)の負の対数である。

【0272】

例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基は、およそ4.1のpKa値を有する側鎖カルボン酸基を有する(精確なpKa値は温度、イオン強度、およびイオン化可能な基の微小環境に依存し得る)。それゆえに、これらの側鎖は7.4のpH(多くの場合には「生理的pH」と言われる)において負電荷を見せる。低いpH値においては、これらの側鎖はプロトン化され、それらの電荷を失うであろう。

【0273】

逆に、リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基はおよそ10～12のpKa値を有する窒素含有側鎖基を有する。よって、これらの側鎖は7.4のpHにおいては正電荷を見せる。これらの側鎖は高いpH値においては脱プロトン化されて、それらの電荷を失うであろう。

【0274】

よって、蛋白質分子の総体的な(正味)電荷は、蛋白質上に存在する酸性および塩基性残基の数(ならびにそれらの表面露出度)に、ならびに取り巻くpHに依存する。取り巻くpHを変化させることは、蛋白質上の総体的な電荷を変化させる。従って、蛋白質毎に、正および負電荷の数が等しく、蛋白質が総体的な正味電荷を呈さない所与のpHがある。この点は等電点(pI)として公知である。等電点は蛋白質生化学における標準的な概念であり、当業者はこれを熟知するであろう。

【0275】

よって、等電点(pI)は、蛋白質がゼロの正味電荷を呈するpH値として定義される。pIの増大は、より高いpH値が、蛋白質がゼロの正味電荷を呈するために要求されるということを意味する。それゆえに、pIの増大は所与のpHにおける蛋白質の正味正電荷の増大を表している。逆に、pIの減少は、より低いpH値が蛋白質がゼロの正味電荷を呈するために要求されるということを意味する。それゆえに、pIの減少は所与のpHにおける蛋白質の正味正電荷の減少を表している。

【0276】

蛋白質のpIを決定する方法は当分野において公知であり、当業者はこれを熟知するであろう。例として、蛋白質のpIは蛋白質上に存在する各アミノ酸の平均pKa値から計算され得る(「計算上のpI」)。かかる計算は、当分野において公知のコンピュータプログラム、例えばExPASyからのCompute-pI/MWツール(https://web.expasy.org/compute_pi/)を用いて行われ得る。これは本発明に従ってpIを計算するための好ましい方法である。異なる分子間のpI値の比較は、同じ計算技術/プログラムを用いてなされるべきである。

【0277】

適当なところでは、蛋白質の計算上のpIは、等電点電気泳動の技術を用いて実験的に確認され得る(「観察上のpI」)。この技術は電気泳動を用いて蛋白質をそれらのpIに従って分離する。等電点電気泳動は、典型的には、固定化されたpH勾配を有するゲルを用いて行われる。電場が印加されるときに、蛋白質は、それがそれがゼロの正味電荷を有するpHに達するまでpH勾配中を泳動する。この点は蛋白質のpIである。等電点電気泳動によって提供される結果は典型的には性質が比較的低分解能であり、それゆえに、本発明者は、計算上のpI(上に記載されている通り)によって提供される結果は用いることがより適当であると思料する。

【0278】

本明細書においては、別様に申し立てられない限り、「pI」は「計算上のpI」を意味する。

【0279】

蛋白質のpIは、その表面上に呈される塩基性および/または酸性基の数を変調させることによって増大または減少し得る。これは蛋白質の1つ以上のアミノ酸を改変することによって達成され得る。例えば、pIの増大は、酸性残基数を縮減することによってまたは塩基性残基数を増大させることによって提供され得る。

【0280】

本発明の改変されたBoNT/Aまたはその断片は、未改変のBoNT/A(例えば配列番号62)またはその断片のものよりも少なくとも0.2、0.4、0.5、または1pI単位高いpI値を有し得る。好ましくは、改変されたBoNT/Aまたはその断片は少なくとも6.6、例えば少なくとも6.8のpIを有し得る。

【0281】

20個の標準アミノ酸の特性が下の表において指示されている:

【表2】

【0282】

次のアミノ酸は荷電アミノ酸と考えられる:アスパラギン酸(負)、グルタミン酸(負)、アルギニン(正)、およびリジン(正)。

【0283】

7.4のpHにおいては、アスパラギン酸(pKa3.1)およびグルタミン酸(pKa4.1)の側鎖は負電荷を有し、アルギニン(pKa12.5)およびリジン(pKa10.8)の側鎖は正電荷を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は酸性アミノ酸残基と言われる。アルギニンおよびリジンは塩基性アミノ酸残基と言われる。

【0284】

次のアミノ酸は非荷電の極性の(それらが水素結合に関与し得るということを意味する)アミノ酸と考えられる:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、およびトリプトファン。

【0285】

次のアミノ酸は非荷電の疎水性のアミノ酸と考えられる:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、およびグリシン。

【0286】

アミノ酸挿入では、追加のアミノ酸残基(正常では存在しないもの)がBoNT/Aポリペプチド配列またはその断片上に組み込まれ、それゆえに前記の配列上のアミノ酸残基の総数を増大させる。アミノ酸欠失では、アミノ酸残基がクロストリジウム毒素アミノ酸配列から除去され、それゆえに前記の配列上のアミノ酸残基の総数を縮減する。

【0287】

好ましくは、改変は置換であり、これは有利には改変されたBoNT/Aまたはその断片上に同じ数のアミノ酸残基を維持する。アミノ酸置換では、BoNT/Aポリペプチド配列またはその断片の一部を形成するアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置き換えられる。置き換えアミノ酸残基は上に記載されている20個の標準アミノ酸の1つであり得る。代替的には、アミノ酸置換における置き換えアミノ酸は非標準アミノ酸(上に記載された20個の標準的なセットの一部ではないアミノ酸)であり得る。例として、置き換えアミノ酸は、塩基性の非標準アミノ酸、例えばL-オルニチン、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸、またはリジン、アルギニン、およびオルニチンのD-異性体であり得る)。蛋白質上に非標準アミノ酸を導入するための方法は当分野において公知であり、E.coli栄養要求性発現ホストを用いる組み換え蛋白質合成を包含する。

【0288】

1つの実施形態において、置換は以下から選択される:塩基性アミノ酸残基による酸性アミノ酸残基の置換、非荷電アミノ酸残基による酸性アミノ酸残基の置換、および塩基性アミノ酸残基による非荷電アミノ酸残基の置換。置換が非荷電アミノ酸残基による酸性アミノ酸残基の置換である1つの実施形態において、酸性アミノ酸残基はその対応する非荷電アミドアミノ酸残基によって置き換えられる(すなわち、アスパラギン酸はアスパラギンによって置き換えられ、グルタミン酸はグルタミンによって置き換えられる)。

【0289】

好ましくは、塩基性アミノ酸残基はリジン残基またはアルギニン残基である。換言すると、置換はリジンまたはアルギニンによる置換である。最も好ましくは、改変はリジンによる置換である。

【0290】

好ましくは、本発明における使用のための改変されたBoNT/Aまたはその断片は、クロストリジウム毒素H_CNドメイン上に位置付けられる4および40個の間のアミノ酸改変を含む。前記の改変されたBoNT/Aまたはその断片は好ましくは少なくとも6.6のpIをもまた有する。前記の改変されたBoNT/Aは、好ましくは、以下から選択される少なくとも4つのアミノ酸の改変を含む:ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、およびASN1052。前記の改変はリジン残基またはアルギニン残基によるアミノ酸の置換を含む。例えば、前記の改変されたBoNT/Aまたはその断片は、以下から選択される少なくとも5つのアミノ酸の改変を含み得る:ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、およびGLN1229。前記の改変はリジン残基またはアルギニン残基によるアミノ酸の置換を含む。

【0291】

アミノ酸残基の置換、挿入、または欠失によって蛋白質を改変するための方法は当分野において公知である。例として、アミノ酸改変は、ポリペプチドをコードする(例えば、未改変のBoNT/Aまたはその断片をコードする)DNA配列の改変によって導入され得る。これは、標準的な分子クローニング技術を用いて達成され得る。例えば、所望のアミノ酸(単数または複数)をコードするDNA(オリゴヌクレオチド)の短いストランドが用いられてポリメラーゼ酵素を用いて元々のコード配列を置き換える部位特異的変異導入によるか、または種々の酵素(例えばリガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ)によって遺伝子の一部を挿入/欠失することによる。代替的には、改変された遺伝子配列は化学合成され得る。

【0292】

1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号42に対して有するポリペプチドを含む。好ましくは、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は配列番号42として示されるポリペプチド配列を含む。

【0293】

1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号41に対して有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、配列番号41として示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。

【0294】

1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素(例えば、配列番号42を含むかまたは配列番号41によってコードされる)は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号61または65に対して有するポリペプチドのある部分であり得る。それゆえに、1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号61または65に対して有するポリペプチドを含み得る。好ましくは、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は配列番号61または65を含み(より好ましくはそれからなり)得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は触媒的に不活性なL鎖を含む(例えば配列番号65による)。

【0295】

1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素(例えば、配列番号42を含むかまたは配列番号41によってコードされる)は、少なくとも70%の配列同一性を配列番号60に対して有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。それゆえに、1つの実施形態において、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、少なくとも80%、90%、95%、または98%の配列同一性を配列番号60に対して有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。好ましくは、本発明に従う使用のためのクロストリジウム神経毒素は、配列番号60を含む(より好ましくはそれからなる)ヌクレオチド配列によってコードされ得る。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は触媒的に不活性なL鎖を含む。

【0296】

配列番号42は改変されたBoNT/A断片の例であり、配列番号61および65は、それぞれ触媒的に活性および不活性である改変されたBoNT/Aポリペプチドの例である。かかる改変されたBoNT/Aポリペプチドおよび断片は本発明における使用にとって特に好ましい。配列番号42、61、および62として示されるポリペプチドは野生型BoNT/Aと比較したときにいくつものアミノ酸改変(例えば置換)を有し、これらはポリペプチドの等電点を増大させる。理論によって拘束されることを欲することなしに、増大した正味の正電荷がポリペプチドおよびアニオン性の細胞外コンポーネントの間の静電的相互作用を促進し、それによってポリペプチドおよび細胞表面の間の結合を促進し、それゆえに投与の部位における保持および/または作用持続時間を増大させると思料される。それゆえに、配列番号42、61、および65の神経免疫応答促進特性は、前記の改変を欠く同等のポリペプチドと比較して改善されるであろうということが想定される。

【0297】

上に記載されている触媒的に活性な改変されたBoNT/Aポリペプチド(例えば配列番号61)について、これらの有利な特性(これらは治療指数の増大を表している)が定義され得る1つのやり方は、改変されたBoNT/Aの安全率の観点からである。これについて、クロストリジウム神経毒素の望まれない効果(投与部位からの毒素の拡散によって引き起こされる)は、該当する動物モデル(例えば、体重減少が投与の7日以内に検出されるマウス)におけるパーセンテージの体重減少を測定することによって実験的に評価され得る。逆に、クロストリジウム神経毒素の所望のオンターゲット効果は、筋肉麻痺の測定の指外転スコア(DAS)アッセイによって実験的に評価され得る。DASアッセイは、マウス腓腹筋/ヒラメ筋複合体へのゼラチンリン酸緩衝液中に製剤された20μlのクロストリジウム神経毒素の注射、次にAoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)の方法を用いる指外転スコアの評価によって行われ得る。DASアッセイでは、マウスは特徴的な驚愕反応を誘発するために尾で手短にぶら下げられる。これにおいては、マウスはその後肢を伸展し、その後肢指を外転する。クロストリジウム神経毒素注射後に、指外転の様々な度合いが5点スケールでスコア付けされる(指外転および足伸展の0=正常から4=最大の縮減)。

【0298】

それから、クロストリジウム神経毒素の安全率は、体重の10%降下(マウスにおいて、投薬後の最初の7日以内のピークの効果において測定される)に要求される毒素の量と2のDASスコアに要求される毒素の量との間の比率として表現され得る。よって、高い安全率スコアが望まれ、望まれないオフターゲット効果ほとんどなしに標的筋肉を有効に麻痺させる能力がある毒素を指示する。本発明の触媒的に活性な改変されたBoNT/Aは、同等の未改変の(ネイティブな)ボツリヌス毒素(例えば配列番号62)の安全率よりも高い安全率を有し得る。

【0299】

それゆえに、1つの実施形態において、本発明の触媒的に活性な改変されたBoNT/Aは少なくとも8(例えば、少なくとも8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、または50)の安全率を有し、安全率は以下として計算される:DASのED₅₀(pg/マウス)によって除算された-10%の体重変化に要求される毒素の用量(pg/マウス)[ED₅₀=2のDASスコアを生成するために要求される用量]。

【0300】

1つの実施形態において、本発明の触媒的に活性な改変されたBoNT/Aは少なくとも10の安全率を有する。1つの実施形態において、本発明の改変されたBoNT/Aまたはその断片は少なくとも15の安全率を有する。

【0301】

少なくとも70%の配列同一性を配列番号61に対して含むクロストリジウム神経毒素はWO 2015/004461 A1に記載され、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0302】

1つの実施形態において、少なくとも70%の配列同一性を配列番号42、61、もしくは65に対して有するポリペプチド配列を含むおよび/または少なくとも70%の配列同一性を配列番号41もしくは60に対して有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含むクロストリジウム神経毒素は、位置930、955、991、1026、1052、1229、および886の1つ以上に(好ましくは2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上、より好ましくは全てに)置換を含む。位置付番は配列番号62の位置に対応し、ポリペプチド配列を配列番号62(未改変の/野生型BoNT/A)とアライメントすることによって決定され得る。配列番号62の位置1のメチオニン残基の存在は任意であるので、当業者はアミノ酸残基付番を決定するときにメチオニン残基の存在/不在を考慮に入れるであろう。例えば、配列番号62がメチオニンを包含するところでは、位置付番は上で定義される通りであろう(例えば位置886は配列番号62のASN886であろう)。代替的には、メチオニンが配列番号62に不在であるところでは、アミノ酸残基付番は-1だけ改変されるべきである(例えば位置886は配列番号62のASN885であろう)。本明細書に記載される他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在する/不在であるときには、類似の考えが適用され、当業者は当分野において慣例の技術を用いて正しいアミノ酸残基付番を難なく決定するであろう。

【0303】

好ましくは、少なくとも70%の配列同一性を配列番号42、61、もしくは65に対して有するポリペプチド配列を含むおよび/または少なくとも70%の配列同一性を配列番号41もしくは60に対して有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含むクロストリジウム神経毒素は、リジンまたはアルギニン(より好ましくはリジン)を位置930、955、991、1026、1052、1229、および886の1つ以上に含む。1つの実施形態において、クロストリジウム神経毒素は、リジンまたはアルギニン(より好ましくはリジン)を位置930、955、991、1026、1052、1229、および886の最も小さい2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または全てに含む。最も好ましくは、クロストリジウム神経毒素はリジンまたはアルギニン(より好ましくはリジン)を位置930、955、991、1026、1052、1229、および886の全てに含む。

【0304】

本発明の種々の治療的な使用に関係する実施形態は、本発明の処置の方法、ポリペプチドに等しく適用されることが意図される。逆もまた同様である。

【0305】

配列相同性

【0306】

種々の配列アライメント方法のいずれかが、パーセントの同一性を決定するために用いられ得る。限定なしに、グローバル法、ローカル法、およびハイブリッド法、例えば、例えばセグメントアプローチ法を包含する。パーセントの同一性を決定するためのプロトコールは当業者の範囲内の慣例の手続きである。グローバル法は複数の配列を分子の始まりから終わりまでアライメントし、個々の残基ペアのスコアを合計することによっておよびギャップペナルティーを課すことによって最良のアライメントを決定する。限定しない方法は例えば以下を包含する。CLUSTAL-W、例えばJulie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照;および反復改善法、例えばOsamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Proteins. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)参照。ローカル法は、入力配列の全てによって共有される1つ以上の保存されたモチーフを同定することによって複数の配列をアライメントする。限定しない方法は例えば以下を包含する。Match-box、例えばEric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)参照;Gibbsサンプリング、例えばC. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)参照;Align-M、例えばIvo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)参照。

【0307】

それゆえに、パーセントの配列同一性は従来の方法によって決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992参照。手短には、下に示される通り、2つのアミノ酸配列が、10のギャップオープンペナルティー、1のギャップ延長ペナルティー、およびHenikoff and Henikoff(同書)の「blosum62」スコア付け行列を用いてアライメントスコアを最適化するようにアライメントされる(アミノ酸は標準的な1文字コードによって指示される)。

【0308】

2つ以上の核酸またはアミノ酸配列の間の「パーセントの配列同一性」は、複数の配列によって共有される同一の位置の数の関数である。それゆえに、%の同一性は、ヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除算される100によって乗算された同一のヌクレオチド/アミノ酸の数として計算され得る。%の配列同一性の計算は、2つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入されることを必要とするギャップの数および各ギャップの長さをもまた考慮に入れ得る。2つ以上の配列間の配列比較およびパーセントの同一性の決定は、BLASTなどの具体的な数理アルゴリズムを用いて実施され得る。当業者はこれを熟知するであろう。

【0309】

【数1】

【0310】

それから、パーセントの同一性が以下として計算される:
[同一のマッチの総数×100] / [より長い配列の長さプラス2つの配列をアライメントするためにより長い配列上に導入されるギャップの数]

【0311】

実質的に相同なポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、または追加を有するとしてキャラクタリゼーションされる。これらの変化は、好ましくは、小規模な性質、つまり、ポリペプチドの折りたたみまたは活性に有意には影響しない保存的アミノ酸置換(下参照)および他の置換;典型的には1から約30アミノ酸の小さい欠失;ならびに小さいアミノまたはカルボキシル末端延長、例えばアミノ末端メチオニン残基、最高で約20～25残基までの小さいリンカーペプチド、またはアフィニティータグである。

【0312】

保存的アミノ酸置換
塩基性:アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性:グルタミン酸、アスパラギン酸
極性:グルタミン、アスパラギン
疎水性:ロイシン、イソロイシン、バリン
芳香族性:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小:グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン

【0313】

20個の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、およびα-メチルセリン)が本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的なアミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸が、ポリペプチドアミノ酸残基と置換され得る。本発明のポリペプチドは天然に生起しないアミノ酸残基をもまた含み得る。

【0314】

天然に生起しないアミノ酸は、限定なしに、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロスレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に生起しないアミノ酸残基を蛋白質上に組み込むためのいくつかの方法が当分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異が抑圧されるインビトロ系が採用され得る。アミノ酸を合成およびtRNAをアミノアシル化するための方法は当分野において公知である。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写ならびに翻訳は、E.coliのS30抽出物ならびに商業的に利用可能な酵素および他の試薬を含む無細胞系において実施される。蛋白質はクロマトグラフィーによって精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991;Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991;Chung et al., Science 259: 806-9, 1993;およびChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993参照)。第2の方法では、翻訳が、変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによってゼノパス卵母細胞において実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996)。第3の方法では、E.coli細胞が、置き換えられるべき天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)の不在下においてかつ所望の天然に生起しないアミノ酸(単数または複数)(例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン)の存在下において培養される。天然に生起しないアミノ酸はその天然のカウンターパートの代わりにポリペプチド上に組み込まれる。Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994参照。天然に生起するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾によって天然に生起しない種に変換され得る。化学修飾は置換の範囲をさらに拡張するために部位特異的変異導入と組み合わせられ得る(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。

【0315】

限定された数の非保存的なアミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、天然に生起しないアミノ酸、および非天然アミノ酸が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。

【0316】

本発明のポリペプチド上の必須アミノ酸は、当分野において公知の手続き、例えば部位特異的変異導入またはアラニンスキャン変異導入に従って同定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物学的相互作用の部位もまた、推定上の接触部位アミノ酸の変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識などの技術によって決定される構造の物理的分析によって決定され得る。例えば、de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992;Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992参照。必須アミノ酸のアイデンティティは、本発明のポリペプチドの関係するコンポーネント(例えば、トランスロケーションまたはプロテアーゼコンポーネント)との相同性の分析からもまた推量され得る。

【0317】

複数のアミノ酸置換が、変異導入およびスクリーニングの公知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988)またはBowie and Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)によって開示されているものを用いてなされ、試験され得る。手短には、これらの著者は、同時に、ポリペプチド上の2つ以上の位置をランダム化し、機能的なポリペプチドをセレクションし、それから変異導入されたポリペプチドをシーケンシングして各位置における許され得る置換のスペクトルを決定するための方法を開示している。用いられ得る他の方法はファージディスプレイ(例えばLowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991;Ladner et al., U.S.特許No. 5,223,409;Huse, WIPO公報WO 92/06204)および領域特異的変異導入(Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986;Ner et al., DNA 7: 127, 1988)を包含する。

【0318】

複数のアミノ酸置換が、変異導入およびスクリーニングの公知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988)またはBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)によって開示されているものを用いてなされ、試験され得る。手短には、これらの著者は、同時に、ポリペプチド上の2つ以上の位置をランダム化し、機能的なポリペプチドをセレクションし、それから変異導入されたポリペプチドをシーケンシングして各位置における許され得る置換のスペクトルを決定するための方法を開示している。用いられ得る他の方法はファージディスプレイ(例えばLowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991;Ladner et al., U.S.特許No. 5,223,409;Huse, WIPO公報WO 92/06204)および領域特異的変異導入(Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986;Ner et al., DNA 7: 127, 1988)を包含する。

【0319】

別様に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本開示が属する分野の業者によって普通に理解される同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示において用いられる用語の多くの総合辞書を当業者に提供する。

【0320】

本開示は本明細書において開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似のまたは同等のいずれかの方法および材料は、本開示の実施形態の実施または試験に用いられ得る。数的範囲は範囲を画定する数を包含する。別様に指示されない限り、それぞれ、いずれかの核酸配列は左から右に5'から3'の向きで書かれる;アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの向きで書かれる。

【0321】

本明細書において提供される見出しは本開示の種々の態様または実施形態の限定ではない。

【0322】

アミノ酸は本明細書においてはアミノ酸の名称、3文字略称、または1文字略称を用いて言われる。本明細書において用いられる用語「蛋白質」は、蛋白質、ポリペプチド、およびペプチドを包含する。本明細書において用いられる用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および/または用語「蛋白質」と同義である。いくつかの場合には、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義である。いくつかの場合には、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義である。用語「蛋白質」および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられる。本開示および請求項においては、アミノ酸残基の従来の1文字および3文字コードが用いられ得る。アミノ酸の3文字コードは、生化学の命名法に関するIUPACIUB合同委員会(IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature)(JCBN)に従って定義される通りである。ポリペプチドは遺伝暗号の縮重を原因として1つよりも多くのヌクレオチド配列によってコードされ得るということもまた理解される。

【0323】

用語の他の定義が本明細書において現れ得る。例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、変形し得るということは理解されるべきである。本開示の範囲は添付される請求項のみによって定義されるので、本明細書において用いられる術語は特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、限定しようということを意図されないということもまた理解されるべきである。

【0324】

値の範囲が提供されるところでは、その範囲の上および下限の間の各介在値もまた、文脈が明瞭に別様に述べない限り下限の単位の十分の一まで具体的に開示されるということが理解される。申し立てられている範囲内のいずれかの申し立てられている値または介在する値とその申し立てられている範囲内のいずれかの他の申し立てられているまたは介在する値との間のより小さい各範囲は本開示に包摂される。これらのより小さい範囲の上および下限は独立して範囲に包含または除外され得る。申し立てられている範囲内のいずれかの具体的に除外される限度を条件として、どちらかもしくは両方の限度がより小さい範囲に包含されるかまたはどちらもされない各範囲もまた本開示に包摂される。申し立てられている範囲が限度の1つまたは両方を包含するところでは、それらの包含される限度のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた本開示に包含される。

【0325】

本明細書および添付の請求項において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明瞭に別様に述べない限り、複数のリファレントを包含するということが指摘されなければならない。それゆえに、例えば、「クロストリジウム神経毒素」と言うことは複数のかかる薬剤を包含し、「クロストリジウム神経毒素」と言うことは当業者に公知の1つ以上のクロストリジウム神経毒素およびそれらの同等物を言うことを包含するなどである。

【0326】

本明細書において論じられる発表物は単に本願の出願日に先立つそれらの開示から提供されている。本明細書のいかなることも、かかる発表物がそれに添付される請求項に対して先行技術を構成するという自認として解釈されるべきではない。

【0327】

ここで、本発明の実施形態が次の図および実施例の参照によって例としてのみ記載される。

【図面の簡単な説明】

【0328】

【図1】研究におけるイメージングエリアの位置付けの模式図。

【図2】エリア1におけるミクログリア密度のレーザー傷害によって誘導される変化を示すグラフ。Dysport処置マウスでは、より多くのミクログリアが病変部位に向けて遊走した(増大して行くミクログリア細胞密度)。

【図3】エリア1におけるミクログリアの平均球形度指数のレーザーによって誘導される活性化の変化を示すグラフ。活性化したミクログリアはより低い球形度指数を有する(細胞の細胞体形状がより伸長している)。

【図4】レーザーによって誘導されるミクログリア突起伸長の後の蛍光の変化を示すグラフ(外れ値は除去されている;エリア1に瘢痕形成):ミクログリア応答はDysport処置マウスの42分において有意に強かった。

【0329】

配列表

【0330】

最初のMetアミノ酸残基または対応する最初のコドンが次の配列番号のいずれかにおいて指示されているところでは、前記の残基/コドンは任意である。
配列番号1 - 組み換えの触媒的に不活性なBoNT/A(rBoNT/A(0))のヌクレオチド配列
配列番号2 - rBoNT/A(0)のポリペプチド配列
配列番号3 - rLH_N/Aのヌクレオチド配列(軽鎖プラストランスロケーションドメインのみ)
配列番号4 - rLH_N/Aのポリペプチド配列
配列番号5 - rL/Aのヌクレオチド配列(軽鎖のみ)
配列番号6 - rL/Aのポリペプチド配列
配列番号7 - rH_C/Aのヌクレオチド配列
配列番号8 - rH_C/Aのポリペプチド配列
配列番号9 - rBoNT/B(0)のヌクレオチド配列
配列番号10 - rBoNT/B(0)のポリペプチド配列
配列番号11 - rBoNT/C(0)のヌクレオチド配列
配列番号12 - rBoNT/C(0)のポリペプチド配列
配列番号13 - rBoNT/E(0)のヌクレオチド配列
配列番号14 - rBoNT/E(0)のポリペプチド配列
配列番号15 - rBoNT/F(0)のヌクレオチド配列
配列番号16 - rBoNT/F(0)のポリペプチド配列
配列番号17 - rBoNT/A(0)(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号18 - rBoNT/A(0)(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号19 - rLH_N/A(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号20 - rLH_N/A(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号21 - rH_C/A(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号22 - rH_C/A(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号23 - rLC/A(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号24 - rLC/A(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号25 - rBoNT/FA(0)(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号26 - rBoNT/FA(0)(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号27 - rLH_N/FA(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号28 - rLH_N/FA(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号29 - rH_C/FA(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号30 - rH_C/FA(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号31 - rLC/FA(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号32 - rLC/FA(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号33 - rBoNT/F(0)(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号34 - rBoNT/F(0)(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号35 - rL_HN/F(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号36 - rL_HN/F(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号37 - rH_C/F(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号38 - rH_C/F(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号39 - rLC/F(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号40 - rLC/F(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号41 - カチオン性rH_C/A(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号42 - カチオン性rH_C/A(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号43 - rH_C/AB(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号44 - rH_C/AB(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号45 - rH_C/AバリアントY1117V H1253K(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号46 - rH_C/AバリアントY1117V H1253K(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号47 - rH_C/AバリアントY1117V F1252Y H1253K L1278F(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号48 - rH_C/AバリアントY1117V F1252Y H1253K L1278F(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号49 - rH_C/AバリアントY1117V F1252Y H1253K L1278H(Hisタグ付き)のヌクレオチド配列
配列番号50 - rH_C/AバリアントY1117V F1252Y H1253K L1278H(Hisタグ付き)のポリペプチド配列
配列番号51 - BoNT/Aのポリペプチド配列 - UniProt P10845
配列番号52 - BoNT/Bのポリペプチド配列 - UniProt P10844
配列番号53 - BoNT/Cのポリペプチド配列 - UniProt P18640
配列番号54 - BoNT/Dのポリペプチド配列 - UniProt P19321
配列番号55 - BoNT/Eのポリペプチド配列 - UniProt Q00496
配列番号56 - BoNT/Fのポリペプチド配列 - UniProt A7GBG3
配列番号57 - BoNT/Gのポリペプチド配列 - UniProt Q60393
配列番号58 - TeNTのポリペプチド配列 - UniProt P04958
配列番号59 - BoNT/Xのポリペプチド配列
配列番号60 - mrBoNT/Aのヌクレオチド配列
配列番号61 - mrBoNT/Aのポリペプチド配列
配列番号62 - 未改変のBoNT/A1のポリペプチド配列
配列番号63 - mrBoNT/ABのポリペプチド配列
配列番号64 - mrBoNT/AB(0)のポリペプチド配列
配列番号65 - mrBoNT/A(0)のポリペプチド配列

【0331】

配列番号1 - ヌクレオチド配列,rBoNT/A(0)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATcAACTGATCtACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

【0332】

配列番号2 - ポリペプチド配列,rBoNT/A(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0333】

配列番号3 - ヌクレオチド配列,rLH_N/A
atggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGtgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat

【0334】

配列番号4 - ポリペプチド配列,rLH_N/A
MEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEAHHHHHHHHHH

【0335】

配列番号5 - ヌクレオチド配列,rL/A
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGggtctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat

【0336】

配列番号6 - ポリペプチド配列,rL/A
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLGLEAHHHHHHHHHH

【0337】

配列番号7 - ヌクレオチド配列,rH_C/A
ATGCATCATCACCATCACCACAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

【0338】

配列番号8 - ポリペプチド配列,rH_C/A
MHHHHHHKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0339】

配列番号9 - ヌクレオチド配列,rBoNT/B(0)
ATGCCGGTGACGATTAACAACTTCAACTACAACGACCCGATTGACAACAACAACATTATCATGATGGAACCGCCGTTTGCACGCGGCACGGGCCGTTATTACAAAGCGTTTAAAATCACCGATCGTATTTGGATTATCCCGGAACGCTACACGTTTGGTTATAAACCGGAAGACTTCAACAAAAGCTCTGGCATCTTCAACCGTGATGTTTGCGAATACTACGATCCGGACTACCTGAACACCAACGATAAGAAAAACATTTTTCTGCAAACGATGATCAAACTGTTCAATCGCATTAAAAGCAAACCGCTGGGTGAAAAACTGCTGGAAATGATTATCAATGGCATTCCGTATCTGGGTGATCGTCGCGTGCCGCTGGAAGAATTTAACACCAATATCGCGAGTGTTACGGTCAACAAACTGATTTCCAATCCGGGTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGCATCTTCGCCAACCTGATCATCTTCGGCCCGGGTCCGGTGCTGAACGAAAATGAAACCATTGATATCGGTATTCAGAACCATTTTGCCTCACGCGAAGGCTTCGGCGGTATTATGCAAATGAAATTTTGCCCGGAATATGTGTCGGTTTTCAACAATGTTCAGGAAAACAAAGGTGCAAGCATCTTTAATCGTCGCGGCTATTTCTCTGATCCGGCTCTGATCCTGATGCACcAACTGATTtATGTGCTGCACGGCCTGTATGGTATCAAAGTGGATGACCTGCCGATCGTTCCGAACGAGAAAAAATTTTTCATGCAGAGCACCGACGCAATTCAAGCTGAAGAACTGTATACGTTTGGCGGTCAGGACCCGTCTATTATCACCCCGAGCACCGACAAAAGCATCTACGATAAAGTGCTGCAAAACTTTCGTGGCATTGTTGACCGCCTGAATAAAGTCCTGGTGTGTATCTCTGATCCGAACATCAACATCAACATCTACAAAAACAAATTCAAAGACAAATACAAATTCGTTGAAGATTCTGAAGGCAAATATAGTATTGACGTCGAATCCTTTGATAAACTGTACAAAAGTCTGATGTTCGGTTTCACCGAAACGAACATCGCGGAAAACTACAAAATCAAAACCCGCGCCTCCTATTTCAGCGACTCTCTGCCGCCGGTTAAAATCAAAAATCTGCTGGATAACGAAATTTATACGATCGAAGAAGGTTTCAACATCAGCGATAAAGACATGGAAAAAGAATACCGTGGCCAGAATAAAGCAATCAACAAACAGGCGTATGAAGAAATTAGTAAAGAACATCTGGCGGTCTACAAAATTCAGATGTGCAAATCCGTGAAAGCCCCGGGTATTTGTATCGATGTTGACAATGAAGACCTGTTTTTCATCGCCGATAAAAACAGTTTTTCCGATGACCTGTCAAAAAATGAACGCATCGAATACAACACCCAATCGAACTACATCGAAAACGATTTCCCGATCAACGAACTGATTCTGGATACGGACCTGATTAGTAAAATCGAACTGCCGTCAGAAAACACCGAATCGCTGACGGACTTTAATGTTGATGTCCCGGTGTATGAAAAACAGCCGGCAATTAAGAAAATTTTTACCGATGAAAACACGATCTTCCAGTACCTGTACAGCCAAACCTTTCCGCTGGACATTCGCGATATCTCTCTGACGAGTTCCTTTGATGACGCACTGCTGTTCAGCAACAAAGTGTACTCCTTTTTCTCAATGGATTACATCAAAACCGCTAACAAAGTGGTTGAAGCGGGCCTGTTTGCCGGTTGGGTGAAACAGATCGTTAACGATTTCGTCATCGAAGCCAACAAAAGTAACACGATGGATAAAATTGCTGATATCTCCCTGATTGTCCCGTATATTGGCCTGGCACTGAATGTGGGTAACGAAACGGCGAAAGGCAATTTTGAAAACGCCTTCGAAATTGCAGGCGCTTCAATCCTGCTGGAATTTATTCCGGAACTGCTGATCCCGGTCGTGGGTGCGTTCCTGCTGGAATCTTACATCGACAACAAAAACAAAATCATCAAAACCATTGATAACGCGCTGACGAAACGTAACGAAAAATGGTCAGATATGTACGGCCTGATTGTTGCCCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACGCAATTTTACACCATCAAAGAAGGTATGTACAAAGCGCTGAATTATCAGGCGCAAGCCCTGGAAGAAATCATCAAATACCGCTACAACATCTACAGCGAAAAAGAAAAATCTAACATCAACATCGACTTTAATGATATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAACCAGGCAATCGATAACATCAACAACTTCATCAACGGCTGCTCAGTGTCGTATCTGATGAAGAAAATGATCCCGCTGGCTGTTGAAAAACTGCTGGATTTTGACAACACCCTGAAGAAAAACCTGCTGAACTACATCGATGAAAACAAACTGTACCTGATCGGCTCAGCCGAATACGAAAAATCGAAAGTGAACAAATACCTGAAAACCATCATGCCGTTTGACCTGAGTATTTACACCAACGATACGATCCTGATCGAAATGTTCAACAAATACAACTCCGAAATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAGAGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTAGCGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAA

【0340】

配列番号10 - ポリペプチド配列,rBoNT/B(0)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHQLIYVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

【0341】

配列番号11 - ヌクレオチド配列,rBoNT/C(0)
ATGCCGATCACGATTAATAATTTCAACTATAGCGATCCGGTGGACAATAAGAATATTCTGTATCTGGATACTCATCTGAATACGCTGGCTAACGAACCGGAGAAAGCGTTCCGCATCACAGGCAACATCTGGGTTATTCCCGATCGCTTTTCACGCAACAGCAACCCTAATCTGAACAAACCTCCTCGTGTCACCAGTCCTAAATCCGGTTATTACGACCCAAACTATCTGAGTACGGATAGCGATAAAGATCCCTTTCTGAAAGAGATCATTAAGCTGTTCAAACGCATTAACTCTCGCGAAATTGGGGAAGAGCTGATCTATCGGCTTTCGACAGATATCCCGTTCCCAGGTAACAATAATACCCCGATTAATACTTTCGACTTTGATGTTGATTTCAATTCTGTGGATGTGAAAACGCGTCAAGGCAATAATTGGGTGAAAACTGGTAGCATTAACCCGAGTGTAATTATCACAGGTCCCCGTGAGAACATCATCGACCCGGAAACCTCTACCTTCAAGCTGACGAACAACACGTTTGCTGCACAGGAAGGGTTTGGTGCCCTGTCAATCATTTCCATCTCACCGCGTTTCATGTTAACCTACTCCAATGCCACAAATGATGTTGGCGAAGGACGTTTTAGCAAATCAGAATTTTGCATGGACCCAATTCTCATTCTGATGggCacGCTGAACaATGCGATGCACAACTTGTATGGCATTGCTATTCCAAACGATCAAACCATTAGCTCCGTTACCAGTAATATCTTCTATAGCCAGTATAATGTCAAATTGGAGTATGCCGAAATTTACGCCTTTGGAGGCCCGACCATTGACCTGATTCCGAAATCTGCACGCAAATACTTCGAAGAAAAGGCGTTAGATTACTATCGCAGCATCGCGAAACGCCTGAACTCGATTACCACGGCCAATCCGTCGTCGTTCAACAAATACATTGGTGAATATAAACAGAAACTGATTCGCAAATATCGGTTTGTCGTAGAAAGCTCTGGTGAAGTGACTGTAAACCGCAACAAATTTGTCGAACTCTACAACGAGTTGACCCAAATCTTTACCGAGTTTAACTACGCAAAGATCTATAACGTACAGAACCGCAAGATTTATCTTAGCAATGTATACACACCGGTTACTGCGAACATCTTAGACGACAATGTGTATGATATTCAGAATGGCTTTAACATCCCGAAATCAAATCTGAACGTTCTGTTTATGGGCCAGAACCTGAGTCGTAATCCAGCACTGCGTAAAGTGAACCCGGAAAATATGCTCTACTTGTTTACCAAATTTTGCCACAAAGCGATTGATGGCCGCTCTCTCTATAACAAAACGCTGGATTGTCGTGAGTTACTTGTGAAGAACACTGATTTACCGTTCATTGGGGATATCTCCGACGTGAAAACCGATATCTTCCTGCGCAAAGACATTAATGAAGAAACGGAAGTCATCTATTACCCCGACAATGTGAGCGTTGATCAGGTCATTTTATCGAAGAACACCTCCGAACATGGTCAGTTGGATTTGCTGTACCCTAGCATTGACTCGGAGAGTGAAATCCTTCCGGGCGAAAATCAAGTGTTTTACGACAACCGTACCCAAAATGTTGATTATTTGAATTCTTATTACTACCTGGAATCTCAGAAATTGAGCGACAATGTGGAAGATTTCACGTTCACACGCTCCATTGAGGAAGCGCTGGATAATAGCGCGAAAGTGTATACGTATTTCCCTACCTTGGCGAATAAAGTAAATGCTGGTGTCCAGGGAGGCTTATTTCTGATGTGGGCGAATGATGTGGTAGAAGATTTTACGACCAATATTTTGCGTAAGGACACCTTAGATAAAATTAGCGATGTTAGCGCCATCATCCCCTATATTGGCCCAGCACTGAATATCTCGAACTCTGTGCGTCGCGGAAACTTCACCGAAGCATTTGCGGTGACCGGGGTTACTATTCTGTTGGAAGCCTTTCCGGAGTTTACTATTCCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATTTATTCGAAAGTACAAGAACGCAATGAAATTATCAAAACCATCGATAATTGCCTGGAACAACGCATTAAACGCTGGAAGGATTCTTATGAATGGATGATGGGCACCTGGTTATCCCGTATTATCACACAGTTTAACAACATCTCGTATCAGATGTACGATTCACTGAACTACCAAGCAGGGGCGATCAAAGCCAAGATCGACTTAGAATACAAGAAATATTCAGGTAGCGATAAAGAGAATATTAAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAGAACTCTCTGGATGTCAAAATTTCAGAGGCTATGAACAACATTAACAAATTTATCCGCGAATGTAGCGTCACGTATCTGTTTAAAAACATGCTCCCGAAAGTGATTGATGAGCTCAACGAGTTTGATCGCAACACAAAGGCCAAACTGATTAACCTGATTGATAGTCACAATATTATTTTAGTCGGTGAAGTTGACAAGCTGAAGGCTAAGGTCAATAACAGCTTTCAGAACACTATTCCGTTTAATATTTTCTCCTATACGAACAATAGTCTGCTGAAAGACATTATCAACGAATACTTCAACAATATTAATGACAGCAAAATTCTGAGCCTGCAGAATCGTAAGAATACGCTGGTAGATACCAGTGGATATAATGCGGAAGTCTCAGAAGAGGGTGATGTACAGCTGAACCCGATCTTTCCGTTCGACTTTAAACTGGGGTCTAGTGGTGAAGATCGCGGTAAAGTGATCGTTACCCAAAACGAGAACATTGTGTATAACAGCATGTACGAGAGTTTCTCAATTTCTTTCTGGATTCGCATCAATAAATGGGTTTCTAATTTGCCTGGCTATACCATCATTGATAGCGTCAAAAACAACTCGGGCTGGTCGATTGGCATTATTAGCAACTTTCTGGTGTTTACCCTGAAACAGAATGAGGATTCGGAACAGAGCATTAACTTCTCCTACGACATCAGCAACAATGCACCAGGGTATAACAAATGGTTCTTCGTAACGGTGACGAACAATATGATGGGCAATATGAAAATCTACATTAACGGGAAACTTATCGACACCATTAAAGTGAAAGAGCTTACTGGGATCAATTTTAGTAAAACCATTACCTTTGAGATCAACAAAATTCCGGACACGGGTCTGATTACCTCCGATTCGGATAATATCAATATGTGGATTCGCGACTTTTATATCTTCGCCAAAGAACTTGATGGCAAAGATATCAACATTTTGTTTAATTCCCTGCAGTATACCAATGTCGTTAAGGACTATTGGGGCAATGATCTCCGCTACAATAAAGAATACTACATGGTTAACATCGACTATCTCAATCGCTACATGTATGCTAACTCGCGTCAAATTGTGTTTAACACACGTCGTAACAACAACGATTTTAACGAAGGTTATAAAATCATTATCAAACGGATCCGCGGCAATACGAACGATACTCGTGTTCGTGGCGGTGACATTCTGTATTTCGACATGACGATTAATAATAAAGCGTACAATCTGTTCATGAAGAACGAAACCATGTACGCCGATAACCATTCCACTGAAGATATCTACGCAATCGGACTTCGCGAACAGACCAAAGACATTAACGACAACATCATCTTTCAGATTCAACCGATGAATAATACCTACTACTATGCCTCCCAGATCTTCAAAAGTAATTTCAACGGCGAAAACATTTCAGGCATTTGCTCAATCGGCACTTATCGGTTCCGGTTAGGTGGTGATTGGTATCGTCACAACTACCTTGTTCCCACAGTGAAACAAGGCAACTATGCATCGCTCTTAGAAAGCACATCTACGCATTGGGGTTTTGTGCCAGTCAGTGAA

【0342】

配列番号12 - ポリペプチド配列,rBoNT/C(0)
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMGTLNNAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

【0343】

配列番号13 - ヌクレオチド配列,rBoNT/E(0)
atgccgaaaatcaactctttcaactacaacgacccggttaacgaccgtaccatcctgtatatcaaaccgggtggttgccaggagttctacaaatctttcaacatcatgaaaaacatctggatcatcccggaacgtaacgttatcggtaccaccccgcaggacttccacccgccgacctctctgaaaaacggtgactcttcttactacgacccgaactacctccagtctgacgaagaaaaagaccgtttcctgaaaatcgttaccaaaatcttcaaccgtatcaacaacaacctgtctggtggtatcctgctggaagaactgtctaaagctaacccgtacctgggtaacgacaacaccccggacaaccagttccacatcggtgacgcttctgctgttgaaatcaaattctctaacggttctcaggacatcctgctgccgaacgttatcatcatgggtgctgaaccggacctgttcgaaaccaactcttctaacatctctctgcgtaacaactacatgccgtctaaccacggtttcggttctatcgctatcgttaccttctctccggaatactctttccgtttcaacgacaacagcatgaacgagttcatccaggacccggctctgaccctgatgcaccaactgatctactctctgcacggtctgtacggtgctaaaggtatcaccaccaaatacaccatcacccagaaacagaacccgctgatcaccaacatccgtggtaccaacatcgaagagttcctgaccttcggtggtaccgacctgaacatcatcacctctgctcagtctaacgacatctacaccaacctgctggctgactacaaaaaaatcgcttctaaactgtctaaagttcaggtttctaacccgctgctgaacccgtacaaagacgttttcgaagctaaatacggtctggacaaagacgcttctggtatctactctgttaacatcaacaaattcaacgacatcttcaaaaaactgtactctttcaccgagttcgacctggcgaccaaattccaggttaaatgccgtcagacctacatcggtcagtacaaatacttcaaactgtctaacctgctgaacgactctatctacaacatctctgaaggttacaacatcaacaacctgaaagttaacttccgtggtcagaacgctaacctgaacccgcgtatcatcaccccgatcaccggtcgtggtctggttaaaaaaatcatccgtttctgcAAGAATATTGTAAGCGTTAAAGGAATAAGAAAAAGTATCtgcatcgaaatcaacaacggtgaactgttcttcgttgcttctgaaaactcttacaacgacgacaacatcaacaccccgaaagaaatcgacgacaccgttacctctaacaacaactacgaaaacgacctggaccaggttatcctgaacttcaactctgaatctgctccgggtctgtctgacgaaaaactgaacctgaccatccagaacgacgcttacatcccgaaatacgactctaacggtacctctgacatcgaacagcacgacgttaacgaactgaacgttttcttctacctggacgctcagaaagttccggaaggtgaaaacaacgttaacctgacctcttctatcgacaccgctctgctggaacagccgaaaatctacaccttcttctcttctgagttcatcaacaacgttaacaaaccggttcaggctgctctgttcgtttcttggattcagcaggttctggttgacttcaccaccgaagctaaccagaaatctaccgttgacaaaatcgctgacatctctatcgttgttccgtacatcggtctggctctgaacatcggtaacgaagctcagaaaggtaacttcaaagacgctctggaactgctgggtgctggtatcctgctggagttcgaaccggaactgctgatcccgaccatcctggttttcaccatcaaatctttcctgggttcttctgacaacaaaaacaaagttatcaaagctatcaacaacgctctgaaagaacgtgacgaaaaatggaaagaagtttactctttcatcgtttctaactggatgaccaaaatcaacacccagttcaacaaacgtaaagaacagatgtaccaggctctccagaaccaggttaacgctatcaaaaccatcatcgaatctaaatacaactcttacaccctggaagaaaaaaacgaactgaccaacaaatacgacatcaaacagatcgaaaacgaactgaaccagaaagtttctatcgctatgaacaacatcgaccgtttcctgaccgaatcttctatctcttacctgatgaaactcatcaacgaagttaaaatcaacaaactgcgtgaatacgacgaaaacgttaaaacctacctgctgaactacatcatccagcacggttctatcctgggtgaatctcagcaggaactgaactctatggttaccgacaccctgaacaactctatcccgttcaaactgtcttcttacaccgacgacaaaatcctGATCTCTTACTTCAACAAATTCTTTAAAcgcATTAAGAGTTCATCGGTTctgaatATGCGGTACAAAAATGATAAAtatGTCGATACTTCTGGATATgatAGCAATATCAACATTAACGGCGACGTGTATAAATATccgACAAATAAAAACCAGTTTGGGATATATAACGACAAGctgTCGGAGGTCAATattTCTCAAAACGACtatATCattTACGATAATaaaTATAAAAACTTTAGCATTAGTtttTGGGTTcgtATACCTAATtatGACAATaaaattGTAAATGTGAATAACGAGTATACCATTATAAACTGTATGcgcGACAATAACAGTGGTTGGAAGGTATCGctgAACCATAATGAGATTATCTGGACCctgcagGATAATgcaGGTATAAACCAGAAACTGGCTTTTAACTATGGAAACGCAAATGGGATCTCAGATTACATTaataaaTGGatttttGTTaccATTACGAACGATcgcTTAGGCGACTCAAAACTTTATATTAATggcAATctgATAGATCAGAAATCAATCTTAAATTTGGGCAATATTCATGTCTCTgatAACATCTTGTTCAAGATCGTTAATTGCAGTTACACTcgtTATATTGGCATTCGTTACTTTAATATCTTCgataaaGAActgGACGAGACGGAAATCcagACTCTGTATTCAAACGAGCCCAATACTAATATATTGAAAGATTTTTGGGGTAACTATCTTTTATATGATAAAGAATACTATCTCCTGaatGTATTGAAGCCAAACAATTTCATAGATAGACGCAAGGATAGCACATTAAGTATCAACAATATCAGATCTACTATActgttaGCAAATCGCCTcTACTCCggtATTAAAGTGAAGATTcagCGGGTTAATAACTCCAGTACCAATGATAATCTGGTCCGTAAGAACGATCAGGTATACATCaatTTCGTCGCGAGCAAAACTcatCTCTTCCCGCTTTACGCCgatACAGCTACGACAAACAAGGAAAAAACCATAAAAATTTCCAGCTCCGGAAACAGATTCAATCAAGTAGTTGTAATGAACTCTGTGGGTaatAATTGTACGATGAACTTTaagAATAACAATGGGAACAATattGGACTTTTGGGCTTcAAAGCCGACACAGTGGTGGCGTCCACCTGGTATTACACGcacATGcggGACCATACGAATTCGAACGGTTGCTTCTGGAACTTTATCTCGGAAgaaCACGGGTGGCAAGAAAAA

【0344】

配列番号14 - ポリペプチド配列,rBoNT/E(0)
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHQLIYSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

【0345】

配列番号15 - ヌクレオチド配列,rBoNT/F(0)
ATGCCGGTGGTCATCAACAGCTTCAACTACAACGACCCAGTAAACGACGACACGATCCTGTATATGCAAATCCCGTATGAAGAGAAGAGCAAGAAGTACTATAAGGCCTTTGAAATCATGCGCAATGTGTGGATTATTCCGGAGCGTAATACGATTGGTACTGACCCAAGCGACTTCGATCCACCTGCGTCTTTGGAAAACGGCTCGTCCGCATATTACGACCCGAATTACCTGACCACCGATGCGGAGAAAGATCGTTATTTGAAAACCACCATCAAGCTGTTCAAACGCATTAACAGCAATCCGGCAGGTGAGGTCCTGCTGCAAGAGATTAGCTACGCAAAGCCTTATCTGGGTAATGAGCATACGCCTATTAACGAGTTTCACCCGGTTACCCGCACTACCAGCGTTAACATCAAGTCCTCGACCAACGTGAAGTCTAGCATTATCCTGAACCTGCTGGTTCTGGGTGCCGGTCCGGACATCTTCGAAAACTCTAGCTACCCGGTGCGTAAACTGATGGATAGCGGCGGTGTTTATGACCCGAGCAATGACGGTTTTGGCAGCATCAATATCGTGACGTTTAGCCCGGAGTACGAGTACACCTTCAATGATATCAGCGGTGGTTACAATTCTTCTACCGAGAGCTTCATCGCCGACCCGGCGATCAGCCTGGCACACCAACTGATCTATGCATTGCATGGCTTGTACGGTGCCCGTGGTGTGACGTATAAAGAGACTATCAAGGTTAAGCAGGCACCTCTGATGATTGCGGAAAAGCCGATTCGCCTGGAAGAGTTCCTGACCTTCGGCGGTCAAGATTTGAACATCATTACCTCGGCCATGAAAGAGAAAATCTATAACAATTTGCTGGCCAACTATGAAAAGATTGCAACGCGCTTGTCTCGTGTTAACTCCGCTCCGCCGGAATACGACATTAATGAGTACAAAGACTACTTTCAATGGAAATATGGCCTGGACAAAAATGCGGATGGTTCTTATACCGTGAATGAAAACAAATTCAATGAAATCTACAAGAAACTGTACAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCGAACAAGTTCAAAGTCAAATGTCGTAATACCTACTTCATCAAATATGGCTTCCTGAAAGTCCCGAACCTGCTGGACGATGACATCTATACCGTCAGCGAAGGCTTCAACATCGGCAATCTGGCCGTGAATAATCGTGGTCAGAACATCAAACTGAATCCGAAAATCATTGACTCCATCCCAGACAAGGGCCTGGTTGAGAAAATCGTGAAGTTCTGCAAAAGCGTTATTCCGCGTAAAGGTACGAAAGCACCGCCTCGCCTGTGCATTCGCGTTAACAACCGTGAGTTGTTCTTTGTGGCATCTGAAAGCAGCTACAACGAGAACGACATCAACACCCCTAAAGAAATTGATGATACCACGAACCTGAATAACAATTATCGCAACAATCTGGACGAGGTGATCCTGGATTACAATTCGGAAACCATTCCGCAAATTAGCAATCAGACGCTGAACACCCTGGTTCAGGACGATAGCTACGTTCCGCGTTACGACTCCAATGGTACTAGCGAGATTGAAGAACACAACGTAGTGGACTTGAACGTTTTCTTTTATCTGCACGCCCAGAAGGTTCCGGAGGGCGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCTCGATCGACACCGCGCTGTCTGAGGAGAGCCAAGTCTACACCTTTTTCAGCAGCGAGTTTATCAACACTATTAACAAGCCAGTTCATGCTGCATTGTTTATCTCTTGGATTAACCAGGTGATTCGCGACTTTACGACGGAGGCGACCCAGAAGTCTACCTTCGACAAAATTGCAGACATCTCCCTGGTCGTCCCATACGTCGGCCTGGCGTTGAATATTGGCAATGAAGTTCAAAAAGAGAACTTCAAAGAAGCGTTCGAGCTGCTGGGTGCAGGCATCCTGCTGGAGTTCGTGCCGGAACTGTTGATCCCGACCATCCTGGTGTTCACCATTAAGAGCTTCATTGGATCCTCCGAGAATAAGAACAAGATCATCAAGGCGATCAATAACAGCCTGATGGAGCGTGAAACGAAGTGGAAAGAAATCTATAGCTGGATTGTTAGCAATTGGCTGACTCGTATTAACACGCAATTCAACAAGCGTAAAGAGCAAATGTACCAAGCCCTGCAAAACCAAGTTGACGCCATCAAAACGGTAATTGAATACAAGTACAACAATTACACGAGCGATGAGCGCAACCGCCTGGAAAGCGAATACAACATCAACAACATTCGCGAAGAATTGAACAAGAAAGTGAGCCTGGCGATGGAGAACATTGAGCGTTTTATCACCGAAAGCAGCATCTTTTACCTGATGAAATTGATTAATGAGGCGAAAGTCTCGAAACTGCGTGAGTACGACGAAGGTGTGAAAGAGTATCTGCTGGATTACATTAGCGAGCACCGTAGCATCTTGGGTAACTCGGTTCAGGAGCTGAACGATCTGGTGACCTCTACCCTGAACAATAGCATCCCGTTCGAACTGAGCAGCTATACCAATGACAAGATTCTGATTCTGTATTTCAATAAACTGTATAAGAAGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGTTACGAAAACAATAAGTTTATCGACATTTCTGGTTACGGCAGCAACATTTCCATCAATGGCGATGTCTACATCTACAGCACCAATCGCAACCAGTTCGGCATCTACTCTAGCAAACCGAGCGAAGTTAACATCGCACAGAACAATGATATTATTTATAACGGTCGTTATCAAAACTTCTCTATCAGCTTTTGGGTCCGTATCCCGAAGTACTTCAATAAAGTCAATCTGAATAATGAATACACGATCATCGACTGCATTCGCAATAACAACAGCGGTTGGAAAATCAGCCTGAATTACAACAAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACGGCGGGTAACAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACGCAAATGATCAGCATTTCTGACTATATCAACAAGTGGATCTTTGTTACCATCACCAATAATCGTCTGGGCAATAGCCGTATTTACATCAACGGTAACCTGATTGATGAGAAAAGCATCAGCAACCTGGGCGATATTCACGTCAGCGACAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGTTGTAACGATACCCGTTACGTCGGCATCCGTTATTTCAAGGTTTTCGATACGGAGCTGGGTAAAACGGAAATCGAAACGTTGTACTCCGATGAACCAGATCCGAGCATTCTGAAGGACTTTTGGGGTAACTACTTGCTGTACAATAAACGTTACTATCTGCTGAATCTGTTGCGCACCGACAAGAGCATTACCCAAAACAGCAATTTCCTGAACATTAATCAGCAACGCGGCGTATACCAAAAACCGAACATCTTCAGCAATACGCGCCTGTATACTGGTGTTGAAGTGATCATTCGTAAGAACGGTAGCACCGACATTAGCAACACGGACAATTTCGTCCGTAAGAATGACCTGGCGTACATTAACGTCGTGGACCGTGATGTCGAGTATCGTCTGTACGCAGACATCAGCATTGCGAAACCGGAAAAGATTATCAAGCTGATCCGTACCAGCAACAGCAACAACAGCCTGGGTCAGATCATTGTGATGGACAGCATTGGTAATAACTGCACGATGAACTTCCAGAACAACAATGGTGGTAATATCGGTCTGCTGGGTTTTCACAGCAATAATCTGGTTGCTTCCAGCTGGTACTACAATAACATTCGTAAAAACACGTCTAGCAATGGTTGTTTTTGGAGCTTTATCAGCAAAGAGCACGGCTGGCAAGAAAAT

【0346】

配列番号16 - ポリペプチド配列,rBoNT/F(0)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHQLIYALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

【0347】

配列番号17 - ヌクレオチド配列,rBoNT/A(0) (Hisタグ付き)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAAAGCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCCATTAATCCGAATCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCCTATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGAGTTTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCTTTACCGAATACATTAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGTATCCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGCTGGAAAGTTAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTTTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAGTACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAACAGCGGTATTCTGAAGGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGGAAAACCTGTATTTTCAAGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA

【0348】

配列番号18 - ポリペプチド配列,rBoNT/A(0) (Hisタグ付き)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLENLYFQGASHHHHHHHH

【0349】

配列番号19 - ヌクレオチド配列,rLH_N/A (Hisタグ付き)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA

【0350】

配列番号20 - ポリペプチド配列,rLH_N/A (Hisタグ付き)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTENLYFQGASHHHHHHHH

【0351】

配列番号21 - ヌクレオチド配列,rH_C/A (Hisタグ付き)
atgcatcatcaccatcaccacGAAAATCTATACTTCCAAGGAaaaaacatcatcaatactagcattctgaacctgcgttacgagagcaatcatctgattgatctgagccgttatgcaagcaagatcaacatcggtagcaaggtcaattttgacccgatcgataagaaccagatccagctgtttaatctggaatcgagcaaaattgaggttatcctgaaaaacgccattgtctacaactccatgtacgagaatttctccaccagcttctggattcgcatcccgaaatacttcaacagcattagcctgaacaacgagtatactatcatcaactgtatggagaacaacagcggttggaaggtgtctctgaactatggtgagatcatttggaccttgcaggacacccaagagatcaagcagcgcgtcgtgttcaagtactctcaaatgatcaacatttccgattacattaatcgttggatcttcgtgaccattacgaataaccgtctgaataacagcaagatttacatcaatggtcgcttgatcgatcagaaaccgattagcaacctgggtaatatccacgcaagcaacaacattatgttcaaattggacggttgccgcgatacccatcgttatatctggatcaagtatttcaacctgtttgataaagaactgaatgagaaggagatcaaagatttgtatgacaaccaatctaacagcggcattttgaaggacttctggggcgattatctgcaatacgataagccgtactatatgctgaacctgtatgatccgaacaaatatgtggatgtcaataatgtgggtattcgtggttacatgtatttgaagggtccgcgtggcagcgttatgacgaccaacatttacctgaactctagcctgtaccgtggtacgaaattcatcattaagaaatatgccagcggcaacaaagataacattgtgcgtaataacgatcgtgtctacatcaacgtggtcgtgaagaataaagagtaccgtctggcgaccaacgcttcgcaggcgggtgttgagaaaattctgagcgcgttggagatccctgatgtcggtaatctgagccaagtcgtggttatgaagagcaagaacgaccagggtatcactaacaagtgcaagatgaacctgcaagacaacaatggtaacgacatcggctttattggtttccaccagttcaacaatattgctaaactggtagcgagcaattggtacaatcgtcagattgagcgcagcagccgtactttgggctgtagctgggagtttatcccggtcgatgatggttggggcgaacgtccgctgtaa

【0352】

配列番号22 - ポリペプチド配列,rH_C/A (Hisタグ付き)
MHHHHHHENLYFQGKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0353】

配列番号23 - ヌクレオチド配列,rLC/A (Hisタグ付き)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTTGAAGAGAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA

【0354】

配列番号24 - ポリペプチド配列,rLC/A (Hisタグ付き)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEENLYFQGASHHHHHHHH

【0355】

配列番号25 - ヌクレオチド配列,rBoNT/FA(0) (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCACCAGCTGATTTATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATCACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTTCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACCGAAAGCAGCATTGCCTATCTGATCAATATCATCAACAACGAAACGATCCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAACTGAAGTACAACTGCATTCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGACAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGTACAGGCGTCAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAAGTGCAGCTGAGCAATCTGGAATCCAGCAAAATTGAAGTCATTCTGAATAACGGCGTCATCTATAACAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAATAACGAGTACAAGATCATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTGAGCCTGAATTTTAGCAATATGAACTCGAAAATCATCTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATTAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACAAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAAATCTACATTAATGGTCGCCTGATCAACGAAGAAAGCATTAGCGATCTGGGTAATATCCATGCCAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATCCGCATCGTTATATCTGGATTAAATACTTTAACCTGTTTGACAAAGAGCTGAACAAGAAAGAAATTAAAGATCTGTACGACAACCAGAGCAATAGCGGTATTCTGAAAGATTTCTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTATGACCCGAATAAGTATCTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTGACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATTAACGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATCCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAGTGTAAAATGAATCTGCAAGACAATAACGGCAACGATATTGGCTTTATCGGCTTTCACCAGTTTAATAACATTGCAAAACTGGTGGCCAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA

【0356】

配列番号26 - ポリペプチド配列,rBoNT/FA(0) (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHQLIYVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGELKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH

【0357】

配列番号27 - ヌクレオチド配列,rLH_N/FA (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACAGAAAGCAGCATTGCCTACCTGATCAATATCATCAACAACGAAACCATTCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAAGAGAACCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA

【0358】

配列番号28 - ポリペプチド配列,rLH_N/FA (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGEENLYFQGASHHHHHHHH

【0359】

配列番号29 - ヌクレオチド配列,rH_C/FA (Hisタグ付き)
ATGCTGAAGTATAACTGCATCCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGATAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGCACCGGTGTGAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAGGTGCAGCTGAGCAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAATAACGGCGTGATCTACAATAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTCTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAACAACGAGTACAAGATTATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTTAGCCTGAATTTCAGCAATATGAACAGCAAAATCATTTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATCAGCGATTACATTAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTAACGAAGAGAGCATTAGCGATCTGGGTAATATTCATGCCAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATCCGCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACAAAAAAGAAATCAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAATAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTACATGCTGAATCTGTACGATCCGAACAAATATCTGGATGTGAATAATGTGGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTTACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATCAATGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGTCTGGCCACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAACATTGCAAAACTGGTGGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA

【0360】

配列番号30 - ポリペプチド配列,rH_C/FA (Hisタグ付き)
MLKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH

【0361】

配列番号31 - ヌクレオチド配列,rLC/FA (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA

【0362】

配列番号32 - ポリペプチド配列,rLC/FA (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSENLYFQGASHHHHHHHH

【0363】

配列番号33 - ヌクレオチド配列,rBoNT/F(0) (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAGATCAAGGACAACAGCATACTGGATATGCGCTATGAAAACAACAAGTTCATTGATATCAGCGGCTATGGTAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGCAATCAGTTTGGTATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCGCAGAATAACGATATCATCTACAACGGTCGCTATCAGAACTTTAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTTAACAAGGTGAACCTGAACAACGAGTACACCATTATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATCAGCCTGAACTATAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACAATCGTCTGGGTAACAGCCGCATTTATATCAATGGCAATCTGATCGACGAAAAAAGCATTTCAAATCTGGGCGATATTCACGTGAGCGATAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGCTGCAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGTTACTTCAAAGTGTTTGATACGGAACTGGGCAAAACGGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAACCTGCTGCGTACCGATAAAAGCATTACACAGAATAGCAACTTTCTGAACATCAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAACGGTAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTGCGTAAAAATGACCTGGCCTATATTAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAGTATCGTCTGTATGCGGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAGATTATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATCGTGATGGACAGCATTGGTAACAATTGCACCATGAATTTCCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGCCTGCTGGGCTTTCATAGCAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTACAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGTAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATCAGTAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA

【0364】

配列番号34 - ポリペプチド配列,rBoNT/F(0) (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHQLIYALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQENENLYFQGASHHHHHHHH

【0365】

配列番号35 - ヌクレオチド配列,rL_HN/F (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAAGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGCCATCATCACCACCATCACCATCATTAA

【0366】

配列番号36 - ポリペプチド配列,rL_HN/F (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKENLYFQGASHHHHHHHH

【0367】

配列番号37 - ヌクレオチド配列,rH_C/F (Hisタグ付き)
ATGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGCTATGAGAACAACAAATTCATTGATATTAGCGGCTATGGCAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGTAATCAGTTTGGCATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCCCAGAACAACGATATCATCTATAACGGTCGCTATCAGAACTTCAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTCAATAAGGTGAACCTGAACAACGAGTATACCATCATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATTAGCCTGAACTACAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGGGTAATAGCCGCATTTATATCAATGGTAACCTGATCGATGAGAAAAGCATTAGCAATCTGGGTGATATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTTAAAATCGTGGGTTGTAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGCTACTTCAAAGTGTTTGATACCGAACTGGGTAAAACCGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAATCTGCTGCGTACCGATAAATCAATTACCCAGAATAGCAACTTCCTGAACATTAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAATGGCAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTTCGCAAAAATGATCTGGCGTATATCAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAATATCGTCTGTATGCCGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAAATCATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATTGTGATGGATAGCATTGGTAATAACTGCACCATGAACTTTCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGTCTGCTGGGCTTTCATAGTAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTATAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGCAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATTAGCAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA

【0368】

配列番号38 - ポリペプチド配列,rH_C/F (Hisタグ付き)
MIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQENENLYFQGASHHHHHHHH

【0369】

配列番号39 - ヌクレオチド配列,rLC/F (Hisタグ付き)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA

【0370】

配列番号40 - ポリペプチド配列,rLC/F (Hisタグ付き)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSENLYFQGASHHHHHHHH

【0371】

配列番号41 - ヌクレオチド配列,陽イオン性 rH_C/A (Hisタグ付き)
ATGATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAAACATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAAAGCGATCGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATCCCGAAATACTTTAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACCATCATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTCAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCAAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGGCTGAACAAGAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAAAATCATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGATAACCAGAGCAATAGCGGCATACTGAAAGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTTAATAATGTGGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATAAAGGCATCACCAACAAATGCAAGATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAATGATATTGGCTTCATTGGCTTTCACCAGTTTAACAACATTGCAAAACTGGTTGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

【0372】

配列番号42 - ポリペプチド配列,陽イオン性 rH_C/A (Hisタグ付き)
MIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLKLAAALEHHHHHH

【0373】

配列番号43 - ヌクレオチド配列,rH_C/AB (Hisタグ付き)
ATGATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAATGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTTACGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

【0374】

配列番号44 - ポリペプチド配列,rH_C/AB (Hisタグ付き)
MILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEKLAAALEHHHHHH

【0375】

配列番号45 - ヌクレオチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V H1253K (Hisタグ付き)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcatcaccatCaCcatT

【0376】

配列番号46 - ポリペプチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V H1253K (Hisタグ付き)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHHHHHH

【0377】

配列番号47 - ヌクレオチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付き)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTaCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTtGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcatcaccatCaCcatTAA

【0378】

配列番号48 - ポリペプチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付き)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGYKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHHHHHH

【0379】

配列番号49 - ヌクレオチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付き)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTaCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTcatGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcat

【0380】

配列番号50 - ポリペプチド配列,rH_C/A バリアント Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付き)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGYKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTHGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHH

【0381】

配列番号51 - ポリペプチド配列,BoNT/A - UniProt P10845
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE
ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0382】

配列番号52 - ポリペプチド配列,BoNT/B - UniProt P10844
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

【0383】

配列番号53 - ポリペプチド配列,BoNT/C - UniProt P18640
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

【0384】

配列番号54 - ポリペプチド配列,BoNT/D - UniProt P19321
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

【0385】

配列番号55 - ポリペプチド配列,BoNT/E - UniProt Q00496
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

【0386】

配列番号56 - ポリペプチド配列,BoNT/F - UniProt A7GBG3
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

【0387】

配列番号57 - ポリペプチド配列,BoNT/G - UniProt Q60393
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE

【0388】

配列番号58 - ポリペプチド配列,TeNT - UniProt P04958
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND

【0389】

配列番号59 - ポリペプチド配列,BoNT/X
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNT
NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP
LPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEG
TLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGIS
NRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISE
RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR
KHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFI
KICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISN
KDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELY
EPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPF
KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI
GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAK
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK
FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL
GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF
SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI
AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL
DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG
ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS
KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED

【0390】

配列番号60 - ヌクレオチド配列,mrBoNT/A
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

【0391】

配列番号61 - ポリペプチド配列,mrBoNT/A
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0392】

配列番号62 - ポリペプチド配列,未修飾 BoNT/A1
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【0393】

配列番号63 - ポリペプチド配列,mrBoNT/AB
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

【0394】

配列番号64 - ポリペプチド配列,mrBoNT/AB(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

【0395】

配列番号65 - ポリペプチド配列,mrBoNT/A(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDT
FTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYS
TDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELN
LVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESL
EVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAY
YEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYT
EDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAAN
FNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKAL
NDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQ
QYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTM
FHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKD
DFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALS
KRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQ
YNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSM
IPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIP
FQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIP
KYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFK
YSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHAS
NKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDF
WGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYL
NSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFI
GFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

【実施例】

【0396】

材料および方法

【0397】

動物

【0398】

6匹の野生型(WT)マウスをパイロット研究に用いた;24匹のCX3CR1-GFPマウス(繁殖ペアはJAXラボラトリー、USAから購入した)を主研究に用いた;12匹のマウスをイメージング研究に用いた。マウスはイメージングの始めに3～5ヶ月齢であった。イメージング実験のためには、マウスにアクセスポートを有する頭蓋窓を取り付けて、イメージングおよび神経毒素注射を可能にした(より詳細は下)。

【0399】

CX3CR1-GFPマウスは他所に記載されている。参照によって本明細書に組み込まれるNimmerjahn et al. (Science. 2005 May 27; 308 (5726): 1314-8)参照。

【0400】

ボツリヌス神経毒素(BoNT)および対照注射

【0401】

2μL生理食塩水中に溶解されたBoNT/A、つまりDysport(aboボツリヌス毒素A(aboBoNT-A))を用いた。対照実験では、基剤のみ(2μL生理食塩水)溶液を用いた。

【0402】

皮質内投与されたDysportは良く忍容された:3匹のWTマウス(パイロット研究)に0.5U/動物のDysport(2μLの生理食塩水中に溶解された)を、3匹のWTマウスに基剤溶液を投与し、臨床的徴候について観察し、それらの体重を2日に亘って測定した。神経毒性作用に関連する臨床的徴候または行動の変化はなく、処置群間の重量の有意な違いはなく、それゆえに、0.5U/動物の用量は主研究のために承認された。

【0403】

主研究では、0.5UのDysport(2μL生理食塩水中に溶解された)または基剤(2μL生理食塩水)溶液を(第1のイメージングセッションの間に)(頭蓋窓の)シリコーンアクセスポートからマウスの体性感覚野に注射した。溶液は2nL/秒の速度で注射した。

【0404】

実験のセットアップ

【0405】

Dysport注射の30日前に(第-30日)、マウスにアクセスポートを有する頭蓋窓を取り付けた(30日がさらなる実験作業の前に経過することを可能にして、脳/神経免疫応答活性および行動が頭蓋窓の設置後に正常化するための時間を提供した)。研究の過程において、動物はいくつかの時点でイメージングした。第0日(Dysportまたは基剤どちらかの皮質注射の日)に、レーザー傷害の直前にならびに傷害の6、18、30、および42分後に、イメージングをした。加えて、イメージングを第1日に(注射の24時間後に/レーザー傷害の23.5時間後に)および第2日に(注射の48時間後に/レーザー傷害の47.5時間後に)した。注射日(第0日)に、ベースラインイメージング(イメージングセッション#1)を注射の直ちに前に実施した。イメージングセッション#2を注射の1日後に実施した(第1日)。イメージングセッション#3を注射の2日後に実施した(第2日)。

【0406】

開頭術およびガラスプレートの設置

【0407】

アクセスポートを有する頭蓋窓のインプラントのために(インプラントは頭蓋骨の小片を置き換えて脳のイメージングおよびそれへのアクセスを可能にする)、マウスをケタミン/キシラジンによって麻酔した。頭蓋窓を次の座標で体性感覚野上に挿入した:ブレグマからAP-1.8、ML-2.0。歯科用ドリル(HP4-917、Foredom)を用いて、頭蓋骨の丸型形状の(d=4mm)小片を除去し、骨中の穴を丸型カバーガラス(d=5mm;#72296-05、エレクトロンマイクロスコピーサイエンシズ(Electron Microscopy Sciences))によってカバーした。カバーガラスのインプラント前に、小さい偏心的に位置付けられた穴をガラス中に穿孔し、シリコーン(Sylgard184)を充填して、常置頭蓋窓上の皮質内注射のためのアクセスポートを作り出した。ヘッドプレートをカバーガラス上に置き、シアノアクリレート糊(ロックタイト401;ヘンケル)と混合された歯科用セメント(ラピッドリペア;デンツプライ)によって頭蓋骨表面に固定した。

【0408】

画像取り込みのセットアップ

【0409】

照明:900nm、フェムト秒レーザーMai-TaiブロードバンドDeepSee。

【0410】

吸収フィルター:チャンネル2-増強緑色蛍光蛋白質(EGFP)蛍光のためのバンドパス468～552nm。

【0411】

60画像のスタックを2μmの垂直方向ステップ(スタックの総イメージング深さ:120μm)で少なくとも2つのイメージングエリアにおいて収集した。各イメージングエリアはxy座標で500×500μm²の空間をカバーした。

【0412】

エリア1においてレーザー傷害を誘導するために(イメージングエリアの位置付けの模式図は図1参照)、マイクロメートルサイズ対象領域(ROI)を皮質表面から25～35マイクロメートルの深さの焦点面で選択し、100%強度の赤外レーザーを皮質内注射後の最初の1時間の間に5秒に亘って適用した。光(レーザー)強度を脳の特定の領域に標的化してレーザーによって誘導される傷害の明確な焦点を提供するために、2光子顕微鏡法テクノロジーを採用した。第1のイメージングセッションの間の不首尾なレーザー傷害誘導の稀な事例では、傷害誘導を24時間後に繰り返した。

【0413】

イメージングセッション

【0414】

研究の過程において、動物はいくつかの時点においてイメージングした。第0日(Dysportまたは基剤どちらかの皮質注射の日)に、レーザー傷害の直前にならびに傷害の6、18、30、および42分後に、イメージングをした。加えて、第1日に(注射の24時間後に/レーザー傷害の23.5時間後に)および第2日に(注射の48時間後に/レーザー傷害の47.5時間後に)イメージングをした。

【0415】

データ処理および解析

【0416】

取り込み後に、画像スタックをFiji/ImageJソフトウェアによってアライメントした。x、y、およびz方向の組織のずれはFijiソフトウェアのプラグインを用いて補償した。アライメントされた画像スタックを、下に記載されるプラグインのセットを用いるミクログリア細胞の密度、形態学、およびレーザーによって誘導される突起伸長の分析に用いた。

【0417】

ミクログリア密度および形態学の変化の分析には、INRA-IJPBモデリングおよびデジタルイメージングラボで作り出されたImageJのための一連の数理形態学方法およびプラグイン:「MorphoLibJ」を用いた。40マイクロメートルの厚さを有する画像スタックをエリア1(レーザー傷害の位置付けを有するスライスから±20マイクロメートル)およびエリア2(最も表層の40マイクロメートル)のデータ解析に包含した。

【0418】

ステップの次のシークエンスをMorphoLibJプラグインで実装した:
1)アライメントされた画像スタックをグレースケールおよび3D形態学フィルターを用いてフィルター処理して、細胞および取り巻く組織の間のコントラストを増強した;
2)自動大津2値化を全ての画像に適用して、細胞のバイナリマスクを作り出した(最小サイズ閾値20ピクセル、最大閾値なし);
3)「粒子解析3D」および「強度測定3d」プラグインを画像スタックに適用して、数値結果を得た。

【0419】

細胞のオブジェクト数(細胞の密度を計算するため)、総体積、および平均体積、細胞の球形度指数、ならびに細胞の平均蛍光強度を計算した。この研究に用いられた3D解析では、球形度指数は、表面積(S)の3乗に対する2乗された体積(V)の比率として定義され得る:
球形度=36πV²/S³

【0420】

レーザー傷害に向けてのミクログリア突起伸長の測定には、25(小さい円=s.c.)および50マイクロメートル(大きい円=b.c.)の直径の2つの円を傷害部位の中心点の周りに描き、大きい円からより小さい円への蛍光の再分布を測定した。ミクログリア突起伸長を次の等式を用いて計算した:
ミクログリア突起伸長=[蛍光s.c.(tx)-蛍光s.c.(t0)]/[蛍光b.c.(t0)]
式中、tx=時点x、t0=時点0(ベースライン)

【0421】

それから、数値データを統計分析およびグラフのプロットのためにマイクロソフトエクセル、マイクロカルオリジン、およびグラフパッドプリズムソフトウェアに移した。処置群間の統計的な比較には、スチューデントのt検定(正規データ分布のケース)またはマン・ホイットニーのノンパラメトリック検定(データが正規分布でないケース)どちらかを用いた。ベースラインに対する統計的な比較には、対応のあるスチューデントのt検定(正規データ分布のケース)またはウィルコクソンの符号順位検定(データが正規分布でないケース)どちらかを用いた。分布の正規性の検定には、シャピロ-ウィルコクソン正規性検定を用いた。

【0422】

例1-クロストリジウム神経毒素はミクログリア密度の有意な増大、細胞体の球形度の減少、および突起の伸長の増強を誘導する

【0423】

本発明者は、ニューロン組織損傷の爾後の神経免疫応答の活性に対するクロストリジウム神経毒素投与の効果を検討するためのロバストな対照実験系を確立した。系は脳における精確なニューロン損傷の誘導を可能にし、かかるニューロン損傷は本明細書に記載される脳の障害によって引き起こされるもの(例えば、例えば脳腫瘍もしくは感染の存在によって引き起こされるニューロン組織損傷、または死後の酸素枯渇化を原因とする神経死)を表している。

【0424】

系は、神経免疫応答の鍵の免疫細胞(ミクログリア)が特異的にGFPを発現するトランスジェニックマウスを採用し、ニューロン損傷に応答したそれらの活性がクロストリジウム神経毒素投与の存在下または不在下どちらかにおいて追跡および分析され得るようにして前記の免疫細胞のタイムラプスイメージングを可能にする。系(先端光学顕微鏡法を採用する)のさらなる利点は、それがニューロン損傷の精確なエリアを誘導するためのレーザーとカップリングされ得るということである。系の詳しい詳細は材料および方法の項(上)で提供される。

【0425】

2つのイメージングエリアを全ての動物でイメージングした(図解は図1参照):注射部位により近いエリア1(エリアの縁から注射部位までの距離範囲600～1000マイクロメートル)、エリア2(距離少なくとも1000マイクロメートル)。

【0426】

全ての分析されたマウスにおいて、ミクログリア細胞の形態学と整合したGFPの明瞭な発現パターンが観察された。レーザー傷害をエリア1において第0日にDysportの皮質内注射後の1時間以内に導入した(図1および2参照)。アクセスポートを有する常置窓は、CX3CR1-GFPマウス系統における反復的な注射後イメージングのための確かなモデルとして確認された。最適なイメージングのために、表層の皮質層をレーザー傷害およびイメージングした。レーザー傷害は全ての12匹のマウスにおいて首尾よく誘導された。

【0427】

エリア1におけるミクログリアの密度および形態学のレーザー傷害によって誘導される変化を分析した(分析結果は図2および3参照)。第1に、ミクログリアの密度の統計的に有意な増大が、フォーカルレーザー傷害後に、基剤処置マウスではなくDysport処置マウスにおいて観察された(図2;Dysport群では、18分から始めて全ての時点についてベースラインに対してp<0.05;基剤群では全ての時点についてベースラインに対してp>0.05)。傷害後の最初の1時間の間に、群間における病変エリアのミクログリア密度の違いは統計的有意性のレベルに達した(18および42分に処置群間においてp<0.05)。これらの観察は、病変後の最初の1時間のDysport処置マウスにおける病変エリアへのミクログリアの増大した遊走を示唆する。

【0428】

次に、ミクログリア活性化の徴候を見出すために、病変含有エリア1におけるミクログリアの形態学の変化を分析した。これのためには、3つのパラメータを分析した:平均体積、平均表面積、および平均球形度指数(図3)。最初の2つのパラメータでは、活性化状態へのミクログリアの変質は値の増大と関連し(ミクログリア細胞体が腫脹し、大きくなる)、球形度指数では、活性化は値の減少(より伸長した形状)を伴う。

【0429】

平均体積および平均表面積の両方では、レーザー傷害後に、より活性化したミクログリア形状に特徴的な値の徐々の増大があるということが見出された。興味深いことに、処置群間の違いが細胞の平均球形度について観察された(図3参照)。まとめると、これらのデータは、Dysportが、体積および細胞表面積ではなく、ミクログリアの密度および球形度の病変後の変化に影響するということを示唆する。換言すると、Dysportは、活性化に関係する形態学的変化ではなく、病変部位に向けてのミクログリア細胞の遊走をおおむね増強し得る。

【0430】

次に、レーザーによって誘導されるミクログリア突起伸長および瘢痕形成に対するDysport注射の効果を検討した(図4参照)。この分析では、病変スポットの直ちに近傍(50μm)を分析した。瘢痕蛍光の急速な高輝度化が観察され、これはレーザー傷害誘導の大体40分後にピークになった(図4)。1回のグラブス外れ値検定を用いていずれかの外れ値を除去した。統計的に有意な違い(Dysport処置対基剤のみ対照)が傷害誘導の42分後の時点で観察された(図7、マン・ホイットニーの検定で0.0303のp値)。この時点で、瘢痕蛍光はDysport処置マウスにおいてより強かった。これはDysportが病変部位に向けてミクログリア突起伸長を増強するという見解と整合する。

【0431】

最後に、レーザー傷害が誘導されなかったエリア2におけるミクログリアの密度および形態学を分析した(例えば、対照エリアを提供するエリア2)。手短には、密度の観点からは、処置群間の統計的に有意な違いは観察されなかった。このエリア2において、イメージングが、4つの時点において:第0日に皮質内注射の前および後に、第1日(24時間)に、ならびに第2日(48時間)に執り行われた。エリア2における球形度指数の低下が観察され、エリア1におけるミクログリア活性化および例えば傷害に向けての遠ざかる遊走を示唆した。

【0432】

まとめると、レーザー傷害の観点からはインタクトなままであったエリア2において、ミクログリアに対するDysport注射の有意な効果は観察されなかった。これは、Dysportの効果が傷害の部位に応答して生起するということを実証している。

【0433】

結果の概要

【0434】

ミクログリアは神経保護およびニューロン細胞死を制御することにおける主要な演者である。ここでは、本発明者は、傷害によって誘導されるミクログリア活性化に対するクロストリジウム神経毒素投与の影響を検討した。

【0435】

繰り返しのインビボ2光子イメージングにとって好適な常置頭蓋ガラス窓(注射アクセスポートを備える)をインプラントする前に、成体の雌のCX3CR1-GFPヘテロ接合C57BL/6JCRLマウス(n=24)を麻酔した。7日後に、隣接するエリアがミクログリア活性化を誘導するためのμmサイズ赤外レーザー照射傷害を受ける～1h前に、体性感覚野におけるaboBoNT-A(0.5Uを2μL中に溶解)またはその基剤(生理食塩水)の注射に先立って、イメージング研究のために選択された15匹の動物を麻酔した。イメージングセッションを、ベースラインにおいて、aboBoNT-A注射後に(照射前に)およびレーザー傷害後に10min間隔で最初の40minの間に、ならびに再び傷害の24および48h後に行った。

【0436】

マウスにおけるaboBoNT-A0.5Uの皮質内注射は安全であり、行動または体重増加に影響せず、レーザー傷害前にはミクログリアに対する実質的に観察可能な効果を有さなかった。レーザー傷害後に、aboBoNT-Aは、傷害の10～40min後のミクログリア密度の15および50%の間の増大(p<0.05)、細胞体の球形度の減少、および突起の伸長の増強を、基剤注射群と比較して誘導した。本発明者は、インタクトで、すなわちレーザー傷害によって影響されずに残された同じ脳(体性感覚野)の「対照」エリアにおいては、基剤およびaboBoNT-A群の間でミクログリア密度の有意な違いを観察しなかった。

【0437】

まとめると、ミクログリアの形態学および密度はレーザー傷害の不在下においてはaboBoNT-Aによって観察可能には変化しなかったが、aboBoNT-Aはレーザー傷害によって誘導されるミクログリア細胞遊走および突起伸長を有意に増強した(促進した)。それゆえに、aboBoNT-Aはミクログリア活性化の上方制御を媒介するために採用され得る。

【0438】

上の明細書において言及された全ての発表物は参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から外れることなしに当業者には明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態とのつながりで記載されたが、請求される通りの本発明はかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないということは理解されるべきである。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関係する分野の業者には自明である本発明を実施するための記載されたモードの種々の改変は、次の請求項の範囲内であることが意図される。

【符号の説明】

【0439】

[図1]
cover glass edge: カバーガラスの縁
cranial window edge: 頭蓋窓の縁
injection site: 注射部位
Area: エリア
Laser injury: レーザー傷害
intact: インタクト
[図2]
Microglia density: ミクログリア密度
time post injury: 傷害後の時間
minutes: 分
Vehicle: 基剤
[図3]
Normalized mean sphericity: 正規化された平均球形度
time post injury: 傷害後の時間
minutes: 分
Vehicle: 基剤
[図4]
Microglia laser injury process response: ミクログリアレーザー傷害突起応答
normalized: 正規化
time post injury: 傷害後の時間
minutes: 分
Vehicle: 基剤

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024504651000001.app

【国際調査報告】