特表 2024-504698 ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）を含む組成物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-01

(54)【発明の名称】ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）を含む組成物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20240125BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 27/04 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240125BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240125BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240125BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P21/00

A61P9/00

A61P17/14

A61P19/02

A61P17/00

A61P1/16

A61P27/04

A61P9/10

A61K9/08

A61K47/04

A61K47/10

A61K47/26

C07K14/47 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023544246

(86)(22)【出願日】2022-01-24

(85)【翻訳文提出日】2023-09-12

(86)【国際出願番号】 US2022013547

(87)【国際公開番号】W WO2022159829

(87)【国際公開日】2022-07-28

(31)【優先権主張番号】63/140,851

(32)【優先日】2021-01-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519124338

【氏名又は名称】ブリム バイオテクノロジー インク

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＭ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】８Ｆ， Ｎｏ．１， Ａｌｌｅｙ ３０， Ｌａｎｅ ３５８ Ｒｕｉｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｎｅｉｈｕ Ｄｉｓｔ． Ｔａｉｐｅｉ， １１４９２ （ＴＷ）

(74)【代理人】

【識別番号】100116850

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 隆行

(74)【代理人】

【識別番号】100165847

【弁理士】

【氏名又は名称】関 大祐

(72)【発明者】

【氏名】リー フランク ウェン－チー

(72)【発明者】

【氏名】リャウ ウェイン ウェイ－チェン

(72)【発明者】

【氏名】ファン ジェイソン ピン－イン

(72)【発明者】

【氏名】ワン エミリー シャオ－ハン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076CC09

4C076CC10

4C076CC18

4C076DD22

4C076DD38D

4C076DD67D

4C076FF14

4C076FF63

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084NA03

4C084NA05

4C084ZA33

4C084ZA36

4C084ZA75

4C084ZA89

4C084ZA92

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZC52

4H045AA10

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045CA40

(57)【要約】

水性製剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、５、６、８または９の何れかの配列を有するＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）と、０．０１ｍＭ～９２３ｍＭの濃度のホウ酸と、非イオン性等張化剤を含む。ｐＨ値は約５．５～８．４である。非イオン性等張化剤は、グリセリン、スクロース、マンニトールまたはソルビトールである。ＰＤＳＰの濃度は０．０１％～１％ｗ／ｖである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、５、６、８、または９の配列を有するＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）と、
０．０１ｍＭ～９２３ｍＭの濃度のホウ酸と、
非イオン性等張化剤と、
を含む水性製剤。

【請求項2】

前記ホウ酸の濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭである、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項3】

前記ホウ酸の濃度が２０ｍＭ～５０ｍＭである、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項4】

ｐＨ値が約５．５～８．４である、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項5】

ｐＨ値が約６．５～７．５である、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項6】

前記非イオン性等張化剤がグリセリン、スクロース、マンニトールまたはソルビトールである、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項7】

前記非イオン性等張化剤がグリセリンである、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項8】

グリセリンの濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭである、請求項７に記載の水性製剤。

【請求項9】

グリセリンの濃度が３００ｍＭ～３５０ｍＭである、請求項７に記載の水性製剤。

【請求項10】

前記非イオン性等張化剤がソルビトールである、請求項１に記載の水性製剤。

【請求項11】

ソルビトールの濃度が１００ｍＭ～４００ｍＭである、請求項１０に記載の水性製剤。

【請求項12】

ソルビトールの濃度が３００ｍＭ～３５０ｍＭである、請求項１０に記載の水性製剤。

【請求項13】

前記ＰＤＳＰがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の前記配列を有する、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の水性製剤。

【請求項14】

前記ＰＤＳＰの濃度が０．０１％～１％ｗ／ｖである、請求項１３に記載の水性製剤。

【請求項15】

前記ＰＤＳＰの濃度が０．０３％ｗ／ｖである、請求項１３に記載の水性製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＥＤＦ由来の短いペプチドの組成物に関し、詳細には、そのようなペプチドの製剤及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、約５０ｋＤａの分子量を有する４１８個のアミノ酸からなる分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、多くの生物学的機能を有する多機能タンパク質である（米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号明細書を参照されたい）。ヒトＰＥＤＦの異なるペプチド領域は、異なる機能を担うことが分かっている。例えば、３４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基４４～７７）は抗血管新生活性を有することが確認されており、一方、４４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基７８～１２１）は神経栄養特性を有することが確認されている。

【0003】

ヒトＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）は、様々な疾患又は障害を治療又は予防するための有望な治療薬であることが分かっている。例えば、ＰＤＳＰは、筋肉再生又は動脈形成の促進（米国特許第９，８８４，０１２号明細書）、脱毛症及び／又は脱毛症の治療（米国特許第９，９３８，３２８号明細書）、変形性関節症の治療（米国特許第９，７７７，０４８号）、皮膚老化の予防又は改善（米国特許第９，８１５，８７８号明細書）、肝硬変の治療（米国特許第８，５０７，４４６号明細書）、又は様々な眼の疾患又は状態の治療（例えば、網膜変性、マイボーム腺疾患、ドライアイ）に有効であることが分かっている。対応するマウスＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ｍｏＰＤＳＰ）も、同じ治療効果を有することが分かっている。しかしながら、これらのペプチドの調製物は、長期安定性を欠くことが見出された。したがって、この有望なバイオ医薬品としての良好な製剤が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本発明の実施形態は、配列番号１（３９ｍｅｒ）、配列番号２（３４ｍｅｒ）、配列番号３（２９ｍｅｒ）、配列番号５（２４ｍｅｒ）、配列番号６（２０ｍｅｒ）、配列番号８（ｍｏ２９ｍｅｒ）、及び配列番号９（ｍｏ２０ｍｅｒ）を含む、ＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）の製剤に関し、ここで、ｍｏ２９ｍｅｒ及びｍｏ２０ｍｅｒは、それぞれヒト２９ｍｅｒ及び２０ｍｅｒに対応するマウスＰＤＳＰである。

【0005】

本発明の１つの態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、５、６、８、または９のうちの１つの配列を有するＰＤＳＰ、ホウ酸緩衝剤および等張化剤を含む水性製剤に関する。等張化剤は好ましくは非イオン性等張化剤である。非イオン性等張化剤は、グリセリン、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであってもよい。

【0006】

本発明のいくつかの実施形態によれば、水性製剤のｐＨ値は約５－９、好ましくは約５．５－８．４、より好ましくは約６．５－７．５であってもよい。等張化剤は好ましくはグリセリンであり、その濃度は１０ｍＭ－５００ｍＭ、好ましくは２００－４００ｍＭ、より好ましくは３００－３５０ｍＭである。ＰＤＳＰの濃度は、０．０１％－１％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１－０．１％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．０３％とすることができる。

【0007】

本発明の他の態様は、以下の説明及び添付の図面から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、ＰＤＳＰ溶液の様々な製剤の安定性を評価するための試験プロトコルを示す概略図を示している。異なるＰＤＳＰ溶液を試験デザインに従って調製した。ＰＤＳＰ溶液のｐＨ値を１ＮのＨＣｌまたは２ＮのＮａＯＨで調整し、０．２μｍのシリンジフィルターでろ過し、それぞれを５０ｍｌのガラス瓶に入れた。ろ過したＰＤＳＰ溶液を室温で１，１５０ＲＰＭで攪拌した。４００μｌのＰＤＳＰ溶液の分取量を異なる時点（最初の７時間は３０分ごと）で分取し、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿の有無を観察した。さらにＰＤＳＰ溶液の攪拌を続け、攪拌開始から１０時間と２４時間の時点で沈殿の有無を調べた。浮遊物、沈殿および濁りが現れた時刻を記録した。

【0009】

【図2】図２は、異なる賦形剤とｐＨ値の１０ｍＭクエン酸緩衝液中で、連続攪拌条件下で調製したＰＤＳＰ製剤の安定性試験の結果を示している。（Ａ）０．８５％ＮａＣｌまたは３３４ｍＭグリセリンを加えた１０ｍＭクエン酸中で、ｐＨ６．０で調製したＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）。（Ｂ）３３４ｍＭグリセリンを加えた１０ｍＭクエン酸中で、ｐＨ７．０調製したＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）。これらの溶液をろ過後、室温で１，１５０ＲＰＭで攪拌し、最初の７時間は３０分ごとに、そして１０時間後と２４時間後にも調査した。沈殿と濁りが現れた時間を表２に記録した。

【0010】

【図3】図３は、異なる濃度のホウ酸（ＢＡ）と３０３ｍＭのグリセリンを用いて調製したＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）製剤の連続攪拌条件下における安定性試験の結果を示している。１５種類の異なる配合で調製したＰＤＳＰをそれぞれろ過後５０ｍＬビーカーに入れ、室温で１，１５０ｒｐｍで攪拌した。これらの溶液を、最初の７時間は３０分ごとに、そして１０時間後、１２．５時間後と２４時間後にも調査した。沈殿と濁りが現れた時間を記録した。

【0011】

【図4】図４は、異なる濃度のＢＡと３０３ｍＭのグリセリンを用いて調製したＰＤＳＰ製剤において、連続攪拌条件下で浮遊物、沈殿および濁りが現れた時間を示している。曲線１：浮遊物が現れた時間。曲線２：目に見える沈殿が現れた時間。曲線３：溶液の濁りが見られた時間。アスタリスク：４０ｍＭのＢＡと３０３ｍＭのグリセリンで調製したＢＲＭ４２１では、この試験期間中（２４時間）、浮遊物、沈殿および濁りは観察されなかった。観察は、７時間の攪拌中、３０分ごとに行った。そして７時間後、１０時間後、１２．５時間後と２４時間後にも観察を行った。７時間後、各現象が最初に観察された時間を記録した。

【0012】

【図5】図５は、連続攪拌条件下で、ＢＡ／グリセリンの異なる組み合わせで調製したＤＰＳＰ溶液の安定性試験の結果を示している。８つの異なる濃度のＢＡ／グリセリン溶液および２つのＢＡのみの溶液で調製したＤＰＳＰを、それぞれろ過後に５０ｍＬビーカーに入れ、室温で１，１５０ｒｐｍで攪拌した。これらの溶液を、最初の１０時間は３０分ごとに、そして２４時間後にも調査した。

【0013】

【図6】図６は、異なるＢＡ／グリセリン溶液の組み合わせで調製したＰＤＳＰ溶液について、連続攪拌条件下で浮遊物、沈殿および濁りが現れた時間を示している。曲線１：浮遊物が現れた時間。曲線２：目に見える沈殿が現れた時間。曲線３：溶液の濁りが見られた時間。最初の１０時間は３０分ごとに観察した。１０時間後、２４時間後にも再度観察を行った。

【0014】

【図7】図７は、連続攪拌条件下で、９．４６％のスクロースを含む異なる濃度のＢＡで調製したＰＤＳＰ溶液の安定性試験の結果を示す。（Ａ）４つの異なる配合で調製したＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）をそれぞれろ過後５０ｍＬビーカーに入れ、室温で１，１５０ＲＰＭで攪拌した。これらの溶液を、最初の７時間は３０分ごとに、そして１０時間および２４時間攪拌した後にも調査した。（Ｂ）連続攪拌条件下で、浮遊物、沈殿および濁りが現れた時間の折れ線グラフ。

【0015】

【図8】図８は、異なる濃度のホウ酸（ＢＡ）と４．２９％のマンニトールで調製したＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）の連続攪拌条件下での安定性試験結果を示す。（Ａ）４つの異なる配合で調製したＰＤＳＰをそれぞれろ過後５０ｍＬビーカーに入れ、室温で１，１５０ｒｐｍで攪拌した。これらの溶液を、最初の７時間は３０分ごとに、そして１０時間と２４時間攪拌した後にも調査した。（Ｂ）剪断力下で浮遊物、沈殿および濁りが現れる時間のチャート。

【0016】

【図9A】図９Ａは、４０ｍＭのホウ酸（ＢＡ）と様々な濃度のソルビトール中のＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）の剪断力下における安定性試験の結果を示している。これらの溶液を室温で１１５０ＲＰＭで攪拌し、３０分ごとに９時間まで調べた。９時間後、ＢＲＭ４２１を連続的に攪拌し、２４時間後と３３時間後にも濁りを調べた。３２６ｍＭと３３６ｍＭのソルビトールを加えた４０ｍＭのホウ酸中のＢＲＭ４２１の安定性を、攪拌後１１時間から２０時間までさらに調べた。浮遊物、沈殿および濁りが現れる時間を記録した。２０ｍＭヒスチジン／３５０ｍＭニコチンアミド中のＢＲＭ４２１を参照コントロールとして用いた。

【0017】

【図9B】図９Ｂは、図９Ａの試験による浮遊物、沈殿および濁りの出現時間を示すチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の実施形態は、安定性が向上したＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）の製剤に関する。様々なヒトＰＤＳＰは、筋肉再生若しくは動脈形成、脱毛症及び／若しくは脱毛、変形性関節症、皮膚老化、肝硬変、又は眼の疾患若しくは状態を含む様々な疾患又は障害を治療又は予防するための有望な治療薬であることが見出された。そのようなＰＤＳＰの例として、表１に示すものを挙げることができる。

表１：ＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の例

【表1】

【0019】

本発明の実施形態によれば、ＰＤＳＰは、配列番号１、２、３、５、６、８、又は９であり得る。さらに、これらのペプチドのＮ末端は、任意選択でアシル化（例えば、アセチル又はプロピオニル）で保護されていてもよく、Ｃ末端は、任意選択でアミドとして保護されていてもよい。

【0020】

これらのＰＤＳＰはクエン酸緩衝液中で調製され、様々な前臨床研究において治療目的に有効であることが分かっている。しかしながら、これらの短いペプチドの調製物（例えば、ＢＲＭ４２１、０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の２９ｍｅｒＰＤＳＰ（配列番号３））は、（数ヶ月にわたる）長期安定性を欠くことが見出された。

【0021】

化学的ストレス（例えば、酸化、加水分解など）及び物理的ストレス（例えば、温度、光、及び撹拌）を含む多くの要因が、特に長期保存におけるバイオ医薬品の品質及び安定性に影響を及ぼす可能性がある。異なる製剤のＰＤＳＰの安定性を調査するために、加速安定性試験を実施した。具体的には、最適な製剤を同定するために、ストレス条件下、特に剪断応力下で様々な製剤を試験した。広範な試験後、ホウ酸緩衝液内の製剤が、予想外にも、元のクエン酸緩衝製剤よりも非常に優れた長期安定性を有することが見出された。

【0022】

ホウ酸には穏やかな抗生物質特性があり、真菌や細菌感染の治療に使用できる。ホウ酸は、眼を洗浄または灌流するための洗眼薬として点眼液に使用されてきた。ホウ酸は目の炎症を和らげる効果もある。さらに、ホウ酸は、点眼液の緩衝剤および／または等張化剤としても機能する。本発明の実施形態は、ホウ酸のこれらの有益な効果、ならびにＰＤＳＰ製剤の長期安定性を促進する予期せぬ能力を利用する。

【0023】

以下では、本発明の実施形態を説明するための具体例について説明する。しかしながら、当業者は、これらの特定の例が例示のためのものに過ぎず、本発明の範囲から逸脱することなく他の変更及び変形が可能であることを理解するであろう。例えば、以下の例では説明のためにＢＲＭ４２１ ＤＰ （２９ｍｅｒ ＰＤＳＰ；配列番号３）を使用しているが、代わりに他のＰＤＳＰを使用してもよい。
１．クエン酸緩衝液（０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭ作業クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）

【0024】

１．クエン酸緩衝液（０．８５％ｗ／ｖＮａＣｌを含む１０ｍＭ実効クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）
クエン酸緩衝液は、所望の緩衝能とｐＨ値を得るために、クエン酸およびクエン酸三ナトリウムから調製した。例えば、クエン酸一水和物（分子量２１０．１４Ｄａ）（Ｍｅｒｃｋ社製）とクエン酸三ナトリウム二水和物（分子量２９４．１２Ｄａ）（ＢｉｏＳｈｏｐ社製）を用いて、溶液Ａと溶液Ｂをそれぞれ調製した。この２つの溶液を用いて、所望の濃度とｐＨ値のクエン酸緩衝液を調製する。溶液Ａと溶液Ｂの配合は、例えば以下の通りである。
溶液Ａ（０．１Ｍクエン酸一水和物）（１０ｍｌ）：２１０．１４Ｄａ×１０／１０００×０．１＝０．２１ｇクエン酸一水和物。クエン酸一水和物０．２１ｇを量り、１０ｍｌの再蒸留水に溶かし、１０ｍｌの溶液Ａのストックを作る。
溶液Ｂ（０．１Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物）（１０ｍｌ）：２９４．１２Ｄａ×１０／１０００×０．１＝０．２９４ｇクエン酸三ナトリウム二水和物。クエン酸三ナトリウム二水和物０．２９４ｇを量り、１０ｍｌの再蒸留水に溶かし、１０ｍｌの溶液Ｂのストックを作る。

【0025】

例として、１０倍のｐＨ６．０のクエン酸緩衝液ストックを調製するために、１．１５ｍｌの溶液Ａと８．８５ｍｌの溶液Ｂを混合し、０．１Ｍクエン酸緩衝液１０ｍＬを得た。次に、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液ストックを９０ｍｌの再蒸留水で希釈し、１０ｍＭの実効クエン酸緩衝液１００ｍｌ（１倍溶液）を調製した。０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液を調製するため、０．８５ｇのＮａＣｌを１０ｍＭの実効クエン酸緩衝液１００ｍｌに添加した。使用前にｐＨを測定し、試験デザインに基づいて調整した。

【0026】

２．ホウ酸緩衝液（０．７７％ｗ／ｖＮａＣｌまたは３０３ｍＭグリセリンまたは９．４６％ｗ／ｖスクロースまたは４．２９％ｗ／ｖマンニトールを含む、１～９２３ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０）。
本発明の製剤は、様々なホウ酸緩衝液中で調製される。試験のためにｐＨ７．０で様々な濃度の２０ｍＬのホウ酸緩衝液を調製するには、以下の式を使用して必要なホウ酸の量を計算することができる。６１．８３（Ｄａ）×０．０００００１×Ｘ（ｍＭ）×Ｙ（最終溶液ｍＬ）＝ＢＡ（ｇ）。具体的には、以下のホウ酸緩衝液を準備した。０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、５００ｍＭ、８００ｍＭおよび９２３ｍＭ（９２３ｍＭは２５℃の水中におけるＢＡの飽和濃度）。

【0027】

眼科用製剤には、ＮａＣｌ、スクロース、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど、さまざまな等張化剤が使用されてきた。例えば、このような等張化剤を用いて２０ｍＬのｐＨ７．０のホウ酸（ＢＡ）溶液を調製するために、異なる量のＢＡを１５ｍＬの再蒸留水に溶解し、５１２．６μｌの８７％グリセリン、または０．１５４ｇのＮａＣｌ、または１．８９２ｇのスクロース、または０．８５８ｇのマンニトールをＢＡ溶液に添加し、それぞれ３０３ｍＭのグリセリン、０．７７％のＮａＣｌ、９．４６％のスクロース、４．２９％のマンニトールを含むホウ酸緩衝液を調製した。緩衝液のｐＨ値は、２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整した。ｐＨ値調整のための２ＮのＮａＯＨの容量を記録し、その後再蒸留水を合計２０ｍｌ加えた。

【0028】

３．異なる濃度のホウ酸（０．０１～２８０ｍＭ）とグリセリンを用いたｐＨ７．０のＢＡ／グリセリン緩衝液の調製
グリセリンは等張化剤であり、眼科製剤の潤滑剤としても使用される。そこで、異なる濃度のホウ酸緩衝液中のグリセリンを調製し、ＢＲ４２１ＤＰ製剤の安定性を検討した。これらのホウ酸緩衝液において、グリセリンの量は実質的に同じ張度を維持するように以下のように調整した。ＸｍＭのホウ酸緩衝液に必要なグリセリンの濃度（％）は、以下の式を用いて計算することができる。
｛１００－［（Ｘ（ｍＭ）÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝グリセリン％
例：（この研究で使用したグリセリンは８７％溶液である）
０．０１ｍＭＢＡ／３５３ｍＭグリセリン：｛１００－［（０．０１÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝２．５９９９０７７％
グリセリン＝５９７．６８μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで２．５９９９０７７％グリセリンを得るためには、５９７．６８μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
１０ｍＭＢＡ／３４１ｍＭグリセリン：｛１００－［（１０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝２．５０７７％
グリセリン＝５７６．４８μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで２．５０７７％のグリセリンを得るためには、５７６．４８μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
２０ｍＭＢＡ／３２８ｍＭグリセリン：｛１００－［（２０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝２．４１５４％
グリセリン＝５５５．２６μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで２．４１５４％のグリセリンを得るためには、５５５．２６μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
３０ｍＭＢＡ／３１６ｍＭグリセリン：｛１００－［（３０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝２．３２３１％
グリセリン＝５３４．０５μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで２．３２３１％のグリセリンを得るためには、５３４．０５μｌの８７％グリセリン溶液が必要である。）
５０ｍＭＢＡ／２９１ｍＭグリセリン：｛１００－［（５０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝２．１３８５％
グリセリン＝４９１．６１μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで２．１３８５％のグリセリンを得るためには、４９１．６１μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
８０ｍＭＢＡ／２５３ｍＭグリセリン：｛１００－［（８０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝１．８６１６％
グリセリン＝４２７．９５μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで１．８６１６％のグリセリンを得るためには、４２７．９５μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
１００ｍＭ ＢＡ／２２８ｍＭグリセリン：｛１００－［（１００÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝１．６７７％
グリセリン＝３８５．５２μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで１．６７７％のグリセリンを得るためには、３８５．５２μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）
２８０ｍＭＢＡ／２ｍＭグリセリン：｛１００－［（２８０÷４０）×１４．２］｝÷１００×２．６＝０．０１５６％
グリセリン＝３．５９μｌ／２０ｍｌ（すなわち、総量２０ｍｌで０．０１５６％のグリセリンを得るためには、３．５９μｌの８７％グリセリン溶液が必要である）

【0029】

２０ｍＬのｐＨ７．０のＢＡ緩衝液を調製するため、異なる量のＢＡ（上述の通り）と異なる量のグリセリンを、上述の通り１５ｍＬの再蒸留水に溶解した。この緩衝液のｐＨ値を２ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整した。ｐＨ値調整のための２ＮのＮａＯＨの容量を記録し、その後再蒸留水を合計２０ｍＬ加えた。

【0030】

４．異なる配合のＰＤＳＰ（ＢＭ４２１ＤＰ）の調製
これらの実施例で用いたＰＤＳＰはＢＲＭ４２１で、Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された短い合成ペプチド（２９ｍｅｒ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。他のＰＤＳＰも同様に調製することができる。ＢＭ４２１ペプチドはＢａｃｈｅｍ社（カリフォルニア州トーランス、ロット：７００３９４５、ペプチド含量８８．６％）によって合成され、特性が評価された。ＢＲＭ４２１の分子量は３２４３．６Ｄａである。例として、以下の研究のためのＢＲＭ４２１ＤＰ溶液中のＢＲＭ４２１濃度は、上記の緩衝液／溶液中０．０３％ｗ／ｖである。２０ｍＬ溶液の計算式は以下の通りである。
０．０３％ＢＲＭ４２１＝０．０３ｇ／１００ｍｌ＝０．０００３ｇ／ｍｌ
０．０００３ｇ÷ペプチド含有率８８．６％＝０．０００３３８６ｇ
０．０００３３８６×２０＝０．００６７７２ｇ
例：２０ｍｌＢＡ緩衝液またはクエン酸緩衝液＋０．００６７７２ｇＢａｃｈｅｍＢＲＭ４２１＝２０ｍｌ、０．０３％ＢＲＭ４２１ＤＰ

【0031】

ＢＲＭ４２１ＤＰのｐＨ値をＢＲＭ４２１が溶液中に完全に溶解した後に測定し、試験デザインに従って７．０または６．０に調整した。試験で使用する前に、ＢＲＭ４２１ＤＰを０．２μｍのシリンジフィルターでろ過する必要がある。異なる濃度のＰＤＳＰも同様に調製することができる。

【0032】

５．異なる配合で調製したＢＲＭ４２１ＤＰの剪断力に対する耐性評価
本発明者らは、クエン酸緩衝液中のＰＤＳＰの以前の製剤が（数ヶ月にわたる）長期保存において安定ではないことに気付いた。安定性に対する異なる製剤の効果を試験するために、様々なＰＤＳＰ製剤を、変化を早めるべく、ストレス条件（例えば、せん断応力）

【0033】

これらの試験のために、異なる緩衝液と賦形剤（表２に示す）で調製した２０ミリリットルのＰＤＳＰ（ＢＲＭ４２１）を、それぞれろ過後に５０ｍＬビーカーに入れた。そして、溶液を室温で１，１５０ＲＰＭで攪拌し、観察した。ＰＤＳＰ溶液を４００μｌずつ、３０分毎に７時間まで１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分取した。回収したサンプルを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿の有無を評価した。連続観察後、２４時間までＰＤＳＰ溶液の攪拌を続け、沈殿の有無を調べた。１０時間攪拌後と２４時間攪拌後の溶液の外観と生じうる沈殿を調べた。浮遊物、沈殿、濁りが現れた時刻を記録した。実験手順を図１に示す。
表２：本研究で試験した製剤のリスト

【表2-1】

【表2-2】

【0034】

結果
１．０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含むｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＰＤの剪断力に対する耐性
ＢＲＭ４２１ＤＰの当初の配合は、０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液であった。この配合は、様々な前臨床試験においては問題が無かった。しかし、この配合では長期間（何ヶ月も）保存すると濁りが生じた。そこで、強制凝集法を用いてその安定性を調べ、剪断力に対する耐性を明らかにした。図２に示すように、攪拌前の溶液は濁りが無く透明であった（図２上段）。この配合では、攪拌開始から１時間前後で浮遊物が見られた（図２左図および表３）。攪拌開始から１．５時間後と２．５時間後に、それぞれ沈殿と濁液が観察された。これらの観察は、他の製剤との比較のためのベースラインとして使用される。
表３：異なる配合で調製されたＢＲＭ４２１ＤＰの攪拌条件下における安定性

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

^＠この２組の研究は、結果を確認するために２回実施され、どちらの研究からも同じ結果が得られた。

【0035】

２．ＢＡ系緩衝液とクエン酸系緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰの剪断力に対する耐性
攪拌条件下でＢＡ緩衝液とクエン酸緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰの安定性を評価するために、３３４ｍＭグリセリンを含む１０ｍＭ、ｐＨ６．０またはｐＨ７．０のクエン酸緩衝液と、３０３ｍＭグリセリンを含む４０ｍＭ、ｐＨ７．０のＢＡ緩衝液を比較のために選択した。これら２つの製剤間のグリセリン濃度の違いは、ＢＡ緩衝液とクエン酸緩衝液の浸透圧が異なるためであり、すなわち、同じ張度を保つためには異なる量のグリセリンが必要であるためである。クエン酸系緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰでは、どのようなｐＨ値であっても、攪拌後４．５～５時間以内に浮遊物と沈殿が見られた（図２Ｂおよび表３）。しかし、ＢＡ系緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰでは、２４時間攪拌しても浮遊物も沈殿も観察されなかった（図３および表３）。これらのデータは、ＢＡがＢＲＭ４２１ＤＰにより適したベース緩衝液であることを示している。

【0036】

３．３０３ｍＭグリセリンと異なる濃度のＢＡ溶液中で調製したＢＲＭ４２１ＤＰの剪断力に対する耐性
どの濃度のＢＡが安定性により優れているかを調べるため、ＢＲＭ４２１ＤＰ製剤を、３０３ｍＭのグリセリンとともに１５種類の異なる濃度のＢＡ（０．０１～９２３ｍＭ）で調製して試験を行った（表３）。０．０１－、０．１－、１－、１０－、２０－、３０－、４０－、４５－、５０－、８０－、１００－、２９０－、５００－、８００－および９２３ｍＭのＢＡ／３０３ｍＭのグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤について、それぞれ攪拌後３、３．５、５．５、５、６．５、７－１０、＞２４、１２－２４、７－１０、６．５、６、５．５、６、および６時間後に浮遊物が観察された。（図３、４および表３）。

【0037】

我々の以前の研究では、１０ｍＭクエン酸緩衝液／０．８５％ＮａＣｌで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤中の浮遊物は粗く、解剖顕微鏡下で小さな粒子や繊維として確認できることが分かった。しかし、ＢＡ緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤中の浮遊物は微細であり、解剖顕微鏡下でも粒子が見えず、溶液の透明性を低下させるだけであった。

【0038】

浮遊物が出現したときにも沈殿が観察されたかどうかを評価するために、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５分間）を行うべく、各ＢＲＭ４２１ＤＰ製剤４００μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに採取した。図３に示すように、０．０１－、０．１－、１－、１０－、２０－、３０－、４０－、４５－、５０－、８０－、１００－、２９０－、５００－、８００－、および９２３－ｍＭＢＡ／３０３ｍＭグリセリンでそれぞれ調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の遠心分離開始後０．５、３．５、６、５、６．５、７－１０、＞２４、１２－２４、７－１０、６．５、６、５．５、５、６および６時間後に、目に見える沈殿が観察された（図３中段、図４および表３）。

【0039】

ＢＲＭ４２１ＤＰ溶液を、浮遊物または沈殿が観察された後、溶液が濁るまで攪拌し続けた。図３に示すように、０．０１－、０．１－、１－、１０－、２０－、３０－、４０－、４５－、５０－、８０－、１００－、２９０－、５００－、８００－および９２３ｍＭＢＡ／３０３ｍＭグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤が、５．５、５．５、７－１０、７－１０、７－１０、＞２４、１２－２４、１０－１２．５、１０－２４、８．５、８．５、１０－２４および７－１０時間後にそれぞれ濁った。（図３下段、図４、表３）。

【0040】

これらの製剤の中で、４０ｍＭＢＡ／３０３ｍＭのグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤は、唯一２４時間攪拌しても透明なままであった。（図３、４および表３）。

【0041】

これらの結果を総合すると、ＢＲＭ４２１ＤＰ製剤に最も安定性を付与できる最適なＢＡ濃度範囲は、約３０３ｍＭのグリセリン存在下で約３０～１００ｍＭであることが示唆される。

【0042】

４．グリセリン／ＢＡ溶液の組み合わせにより調製したＢＲＭ４２１ＤＰの剪断力に対する耐性
浸透圧が剪断力に対する耐性に影響するかどうかを評価するため、８種類のＢＡ／グリセリンの組み合わせ、および２種類のＢＡのみの緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤を検討した（表２）。図５に示すように、攪拌前の溶液はすべて濁りが無く透明であった（図５上段）。０．０１／３５３－、１０／３４１－、２０／３２８－、３０／３１６－、５０／２９１－、８０／２５３－、１００／２２８－および２８０／２－ｍＭのＢＡ／グリセリン緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ溶液では、攪拌後、それぞれ２．５、５、６．５、７．５、６．５、４．５および４時間で浮遊物と沈殿が観察された。２９０ｍＭおよび５００ｍＭのＢＡのみの緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰでは、攪拌後それぞれ５時間および４時間で浮遊物および沈殿が観察された（図５、６および表３）。

【0043】

０．０１／３５３－、１０／３４１－、２０／３２８－、３０／３１６－、５０／２９１－、８０／２５３－、１００／２２８－および２８０／２－ｍＭＢＡ／グリセリン緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、それぞれ攪拌後７、８．５、１０、２４、１０、１０および１０時間で溶液が濁った。２９０ｍＭおよび５００ｍＭのＢＡのみの緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、溶液は攪拌後それぞれ８．５時間および８時間で濁った（図５下段、図６および表３）。これらの結果は、３０ｍＭ付近のＢＡおよび３１６ｍＭ付近のグリセリン緩衝液組成物が、最良の安定性を提供することを示している。

【0044】

５．異なる賦形剤を添加したＢＡ緩衝液中で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の剪断力に対する耐性
他の賦形剤（グリセリン以外）もＢＡ緩衝液と作用して製剤の安定性を改善できるかどうかを評価するために、ＮａＣｌ、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを賦形剤とする４０ｍＭのＢＡ系の緩衝液でＢＲＭ４２１ＤＰ製剤を調製した。

【0045】

図７および表３に示すように、９．４６％のスクロースを含む１０－、４０－、５０－および１００－ｍＭのＢＡ緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、浮遊物はそれぞれ攪拌後７、１０、７および７時間で認められた。また、４．２９％マンニトールを含む１０－、４０－、５０－および１００－ｍＭＢＡ緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、浮遊物はそれぞれ攪拌後５、４．５、３．５および２時間で認められた（図８および表３）。ＢＡ／スクロースおよびＢＡ／マンニトールのいずれにおいても、４０ｍＭＢＡ／３０３ｍＭグリセリンよりも浮遊物が出現する時間が早く、これらの賦形剤はＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の安定化にはあまり適していないことが示唆された。

【0046】

図９Ａおよび図９Ｂおよび表３に示すように、４０ｍのＭＢＡとソルビトール（１８０ｍＭ～３８０ｍＭ）で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、ソルビトール濃度が３１６～３４６ｍＭ付近、特に約３２６ｍＭのソルビトールが最も安定な製剤であることが見出された。例えば、３２６ｍＭのソルビトールと４０ｍＭのＢＡでは、攪拌後１２時間頃に溶液中に浮遊物が見られ、攪拌後３３時間頃に沈殿が観察され、攪拌後３３時間頃に濁りが観察された。

【0047】

これらの結果を総合すると、ホウ酸緩衝液中のＢＲＭ４２１にはイオン性等張化剤よりも非イオン性等張化剤の方が適しており、ＢＲＭ４２１ＤＰの賦形剤としてはスクロースやマンニトールよりもソルビトールやグリセリンの方が適していることが示唆される。

【0048】

上記の例は、ソルビトール、グリセリンまたはその他の等張化剤を含むホウ酸系緩衝液を添加したＰＤＳＰの製剤が、クエン酸系緩衝液を添加した元の製剤と比較して、安定性を劇的に改善できることを明確に示している。例えば、１０ｍＭクエン酸／０．８５％ＮａＣｌで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤は攪拌後１時間以内に沈殿が生じたが、０．７７％ＮａＣｌを含む４０ｍＭＢＡで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤は５時間攪拌後に沈殿が観察された。

【0049】

ＮａＣｌ（等張化剤）を非イオン性等張化剤（例えば、ソルビトールまたはグリセリン）に置き換えると、製剤の安定性は大幅に改善された。例えば、１０ｍＭクエン酸／３３４ｍＭグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤（４．５時間）と０．０１ｍＭＢＡ／３０３ｍＭグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤（３時間）では、０．０１ｍＭＢＡは緩衝力が極めて低く、沈殿が出現するまでの時間は同様であった。４０ｍＭＢＡ／３０３ｍＭグリセリンで調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤では、室温で２４時間攪拌しても浮遊物も沈殿も観察されなかった。これらのデータから、ＢＲＭ４２１ＤＰ製剤のベース緩衝液としては、クエン酸塩よりもＢＡの方が格段に優れていることが示された。

【0050】

異なる濃度の等張化剤（例えばグリセリン）がＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の安定性に影響を与えるかどうかをさらに評価するために、同じ浸透圧になるようにＢＡとグリセリンの異なる組み合わせを選択し、これらの緩衝液中におけるＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の安定性を攪拌により試験した。ＢＡとグリセリンのすべての組み合わせの中で、２０～１００ｍＭＢＡと２２８～３２８ｍＭグリセリンの組み合わせがより安定であった。特に、ＢＡと３０３ｍＭグリセリンを組み合わせた製剤は、沈殿が出現した時間から見て最も安定性が高かったが、他の組み合わせでは沈殿がすぐに出現するか、ほぼ同時に出現した。この観察から、ＢＡ緩衝液で調製したＢＲＭ４２１ＤＰ製剤については、３０３ｍＭ付近のグリセリンがより良い選択であることがさらに確認された。同様に、４０ｍＭＢＡと３１６～３３６ｍＭソルビトールでは、より安定した製剤が得られることがわかった。特に、約３２６ｍＭソルビトールと４０ｍＭＢＡでは、非常に安定した製剤が得られた。

【0051】

ベースとなる緩衝液に加えて、グリセリン以外の賦形剤の種類と濃度についても、ＢＲＭ４２１ＤＰ製剤の安定性を促進する能力について検討した。調査した３８製剤のうち、９．４６％スクロース緩衝液で懸濁物が現れるまでの平均時間は少なくとも７時間であり、これはマンニトールやＮａＣｌよりも良好であったが、グリセリンよりも悪かった。４０ｍＭＢＡ／０．７７％ｗ／ｖＮａＣｌの結果と比較すると、グリセリン、ソルビトール、スクロース、マンニトールなどの非イオン性等張化剤は、イオン性等張化剤よりも良好な結果を示した。これらの結果から、本発明の実施形態では、好ましくは非イオン性等張化剤、例えばグリセリン、スクロース、ソルビトール、マンニトールを使用する。

【0052】

本発明の実施形態は、限られた数の例を用いて例示されている。当業者は、これらの実施例が例示のみのためであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の変更及び変形が可能であることから、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】