(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-01
(54)【発明の名称】ＭＵＬＴＡＢＯＤＹ構築物、組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240125BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240125BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240125BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20240125BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240125BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240125BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240125BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240125BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240125BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240125BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240125BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240125BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240125BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20240125BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K16/00 ZNA
C07K19/00
C07K16/08
C07K14/47
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/20
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 E
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 R
A61K39/395 T
A61P31/18
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023545809
(86)(22)【出願日】2022-01-28
(85)【翻訳文提出日】2023-09-11
(86)【国際出願番号】 CA2022050122
(87)【国際公開番号】W WO2022160057
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】63/142,704
(32)【優先日】2021-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501181075
【氏名又は名称】ザ・ホスピタル・フォー・シック・チルドレン
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＦＯＲ ＳＩＣＫ ＣＨＩＬＤＲＥＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジュリアン， ジャン－フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】ルハス ディエス， エドゥルネ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB42
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
態様において、融合タンパク質は、Ｆｃ単量体に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含み、複数の前記融合タンパク質は、自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成することができる。態様において、融合タンパク質は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でＦｃ単量体またはｓｃＦｃ断片に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含み、複数の融合タンパク質は、自己集合してナノケージを形成することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃ単量体に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の前記融合タンパク質が自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成することができる融合タンパク質。
【請求項2】
前記Ｆｃ単量体が、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端で、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記サブユニットが、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、前記Ｎサブユニットおよび前記Ｃサブユニットが自己集合してナノケージ単量体を形成することができる、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記Ｆｃ単量体が、前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端で前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは前記Ｆｃ単量体がＣ末端で前記Ｃサブユニットに連結されている、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、第１の生物活性部分にさらに連結されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記第１の生物活性部分が、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記第１の生物活性部分が、前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端で前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは前記第１の生物活性部分がＣ末端で前記Ｎサブユニットに連結されている、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記第１の生物活性部分が、前記組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する、請求項５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記第１の生物活性部分が第１の抗原結合部分を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記第１の抗原結合部分が抗体またはその断片を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記第１の抗原結合部分がＦａｂ断片を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記抗体またはその断片が、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記抗体またはその断片がＦａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記第１の抗原結合部分が、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項５～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記第１の抗原結合部分がＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分が、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分が、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来のＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記融合タンパク質が、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端で前記Ｆｃ単量体に連結され、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端で前記第１の生物活性部分に連結された前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記融合タンパク質が、前記ＣサブユニットのＣ末端で前記Ｆｃ単量体に連結され、前記ＣサブユニットのＮ末端で前記第１の生物活性部分に連結された前記Ｃサブユニットを含む、請求項５～１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
ＮサブユニットまたはＮサブユニットを含む融合タンパク質と組み合わせた、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記Ｎサブユニットが、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で第２の生物活性部分に連結されている、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
前記第２の生物活性部分が第２の抗原結合部分を含み、前記第１の生物活性部分が前記第１の抗原結合部分を含む場合、前記第２の抗原結合部分は前記第１の抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記第２の抗原結合部分が抗体またはその断片を含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記第２の抗原結合部分がＦａｂ断片を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記抗体またはその断片が、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
前記抗体またはその断片がＦａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記Ｎサブユニットが、前記ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端でＦｃ単量体にさらに連結されている、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記Ｆｃ単量体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである、請求項１～２８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記Ｆｃ単量体が、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記Ｆｃ単量体がＩｇＧ１ Ｆｃ単量体である、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
前記Ｆｃ単量体が、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの前記融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
前記Ｆｃ単量体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個のナノケージ単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットが、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる、請求項１～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである、請求項３５に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
前記融合タンパク質が、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、前記第１のアポフェリチンサブユニットが、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる、請求項３６または３７に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
前記第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットが、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記アポフェリチンの「Ｎ」領域が、以下：【化29】
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記アポフェリチンの「Ｃ」領域が、以下：【化30】
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項３９または４０に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
前記Ｆｃ単量体が、リンカーを介して前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項１～４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
前記第１の生物活性部分が、リンカーを介して前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項５～４２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項44】
前記第２の生物活性部分が、リンカーを介して前記Ｎサブユニットに連結されている、請求項２２～４３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項45】
前記リンカーが柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項46】
前記リンカーがＧＳドメインを含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項47】
前記ＧＳドメインが、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳ（配列番号１１）リピートおよび／またはＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピートを含む、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項48】
前記リンカーが、以下：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG（配列番号４）
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項49】
前記リンカーが、以下：GGSGGSGGSGGSGGGSGGSGGSGGSG（配列番号５）
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項50】
請求項１～４９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、前記融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージ。
【請求項51】
前記融合タンパク質が第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、前記第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットが第２のナノケージ単量体サブユニットであり、前記第２のナノケージ単量体サブユニットが前記融合タンパク質と自己集合して前記ナノケージ単量体を形成する、請求項５０に記載のナノケージ。
【請求項52】
前記ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、請求項１～３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質内に含まれる、請求項５０または５１に記載のナノケージ。
【請求項53】
各ナノケージ単量体またはそのサブユニットが、請求項１～４９のいずれか１項に記載の融合タンパク質内に含まれる、請求項５２に記載のナノケージ。
【請求項54】
１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む、請求項５０～５３のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項55】
前記ナノケージが多価である、請求項５０～５４のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項56】
前記ナノケージが多重特異性である、請求項５０～５５のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項57】
少なくとも１つの生物活性部分が前記ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのＦｃ二量体が前記ナノケージの外面を装飾する、請求項５０～５６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項58】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分が前記ナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のＦｃ二量体が前記ナノケージの外面を装飾する、請求項５７に記載のナノケージ。
【請求項59】
請求項５０～５８のいずれか１項に記載のナノケージであって、（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてＦｃ単量体に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含むナノケージ。
【請求項60】
各抗原結合部分が前記ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、前記Ｆｃ単量体が前記ＣサブユニットのＣ末端に連結されている、請求項５９に記載のナノケージ。
【請求項61】
前記抗原結合部分が、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項５０～６０のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項62】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する、請求項６１に記載のナノケージ。
【請求項63】
各抗原結合部分が異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである、請求項６２に記載のナノケージ。
【請求項64】
前記ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂが、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する、請求項６３に記載のナノケージ。
【請求項65】
前記ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂが、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、および／またはＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む、請求項６４に記載のナノケージ。
【請求項66】
ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、およびＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む、請求項６５に記載のナノケージ。
【請求項67】
少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む、請求項５０～６６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項68】
少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のＦｃ単量体を含む、請求項５０～６７のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項69】
医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する、請求項５０～６８のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項70】
前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されず、前記ナノケージに内部に含まれるか、または前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかで前記ナノケージに結合する、請求項６９に記載のナノケージ。
【請求項71】
前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記カーゴ分子が前記ナノケージに内部に含有されるように前記融合タンパク質に融合されている、請求項６９に記載のナノケージ。
【請求項72】
前記カーゴ分子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む、請求項６９～７１のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項73】
前記ナノケージが汎ウイルス中和幅を示す、請求項５０～７２のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項74】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項５０～７３のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項75】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項５０～７４のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項76】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項５０～７５のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項77】
第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結された前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成することができる、融合タンパク質。
【請求項78】
前記サブユニットが、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、前記Ｎサブユニットおよび前記Ｃサブユニットが自己集合してナノケージ単量体を形成することができる、請求項７７に記載の融合タンパク質。
【請求項79】
前記ｓｃＦｃ断片が、前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端において前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されている、請求項７８に記載の融合タンパク質。
【請求項80】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、第１の生物活性部分にさらに連結されている、請求項７７～７９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項81】
前記第１の生物活性部分が、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項８０に記載の融合タンパク質。
【請求項82】
前記第１の生物活性部分が、前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端で前記ＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは前記第１の生物活性部分がＮ末端で前記Ｃサブユニットに連結されている、請求項８１に記載の融合タンパク質。
【請求項83】
前記第１の生物活性部分が、前記組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項84】
前記第１の生物活性部分が第１の抗原結合部分を含む、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項85】
前記第１の抗原結合部分が抗体またはその断片を含む、請求項８４に記載の融合タンパク質。
【請求項86】
前記第１の抗原結合部分がＦａｂ断片を含む、請求項８５に記載の融合タンパク質。
【請求項87】
前記抗体またはその断片が、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む、請求項８５または８６に記載の融合タンパク質。
【請求項88】
前記抗体またはその断片がＦａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む、請求項８５に記載の融合タンパク質。
【請求項89】
前記第１の抗原結合部分が、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項７７～８８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項90】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する、請求項８９に記載の融合タンパク質。
【請求項91】
前記第１の抗原結合部分がＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む、請求項９０に記載の融合タンパク質。
【請求項92】
前記ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分が、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する、請求項９１に記載の融合タンパク質。
【請求項93】
前記ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分が、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来のＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む、請求項９２に記載の融合タンパク質。
【請求項94】
前記融合タンパク質が、前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端で前記ｓｃＦｃ断片に連結され、前記ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結された前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む、請求項７７～９３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項95】
前記融合タンパク質が、前記ＣサブユニットのＣ末端で前記ｓｃＦｃ断片に連結され、前記ＣサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結された前記Ｃサブユニットを含む、請求項７９～９４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項96】
ＮサブユニットまたはＮサブユニットを含む融合タンパク質と組み合わせた、請求項９５に記載の融合タンパク質。
【請求項97】
前記Ｎサブユニットが、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で第２の生物活性部分に連結されている、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項98】
前記第２の生物活性部分が第２の抗原結合部分を含み、前記第１の生物活性部分が前記第１の抗原結合部分を含む場合、前記第２の抗原結合部分は、前記Ｃサブユニットに連結された前記抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい、請求項９７に記載の融合タンパク質。
【請求項99】
前記第２の抗原結合部分が抗体またはその断片を含む、請求項９８に記載の融合タンパク質。
【請求項100】
前記第２の抗原結合部分がＦａｂ断片を含む、請求項９９に記載の融合タンパク質。
【請求項101】
前記抗体またはその断片が、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む、請求項９９または１００に記載の融合タンパク質。
【請求項102】
前記抗体またはその断片がＦａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む、請求項９９に記載の融合タンパク質。
【請求項103】
前記Ｎサブユニットが、前記ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端で第２のｓｃＦｃ断片にさらに連結されている、請求項９６～１０２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項104】
前記ｓｃＦｃ断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである、請求項７７～１０３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項105】
前記ｓｃＦｃ断片が、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する、請求項１０４に記載の融合タンパク質。
【請求項106】
前記ｓｃＦｃ断片が、ＩｇＧ１ ｓｃＦｃ断片である、請求項１０５に記載の融合タンパク質。
【請求項107】
前記ｓｃＦｃ断片が、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの前記融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む、請求項７７～１０６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項108】
前記ｓｃＦｃ断片が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１０７に記載の融合タンパク質。
【請求項109】
約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個のナノケージ単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットが、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる、請求項７７～１０８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項110】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される、請求項７７～１０９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項111】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである、請求項１１０に記載の融合タンパク質。
【請求項112】
前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である、請求項１１１に記載の融合タンパク質。
【請求項113】
前記融合タンパク質が、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、前記第１のアポフェリチンサブユニットが、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる、請求項１１１または１１２に記載の融合タンパク質。
【請求項114】
前記第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットが、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む、請求項１１３に記載の融合タンパク質。
【請求項115】
前記アポフェリチンの「Ｎ」領域が、以下：【化31】
【化32】
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項１１４に記載の融合タンパク質。
【請求項116】
前記アポフェリチンの「Ｃ」領域が、以下：【化33】
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項１１４または１１５に記載の融合タンパク質。
【請求項117】
前記ｓｃＦｃ断片が、リンカーを介して前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項７７～１１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項118】
前記第１の生物活性部分が、リンカーを介して前記第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている、請求項８０～１１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項119】
前記第２の生物活性部分が、リンカーを介して前記Ｎサブユニットに連結されている、請求項９７～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項120】
前記リンカーが柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む、請求項１１７～１１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項121】
前記リンカーがＧＳドメインを含む、請求項１１７～１２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項122】
前記ＧＳドメインが、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳ（配列番号１１）リピートおよび／またはＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピートを含む、請求項１２１に記載の融合タンパク質。
【請求項123】
前記リンカーが、以下：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG（配列番号４）
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項１２２に記載の融合タンパク質。
【請求項124】
前記リンカーが、以下：GGSGGSGGSGGSGGGSGGSGGSGGSG（配列番号５）
と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる、請求項１２２に記載の融合タンパク質。
【請求項125】
請求項７７～１２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、前記融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージ。
【請求項126】
前記融合タンパク質が第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、前記第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットが第２のナノケージ単量体サブユニットであり、前記第２のナノケージ単量体サブユニットが前記融合タンパク質と自己集合して前記ナノケージ単量体を形成する、請求項１２５に記載のナノケージ。
【請求項127】
前記ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、請求項７７～１２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質内に含まれる、請求項１２５または１２６に記載のナノケージ。
【請求項128】
各ナノケージ単量体またはそのサブユニットが、請求項７７～１２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質内に含まれる、請求項１２５または１２６に記載のナノケージ。
【請求項129】
１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む、請求項１２５～１２８のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項130】
前記ナノケージが多価である、請求項１２５～１２９のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項131】
前記ナノケージが多重特異性である、請求項１２５～１３０のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項132】
少なくとも１つの生物活性部分が前記ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのｓｃＦｃ断片が前記ナノケージの外面を装飾する、請求項１２５～１３１のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項133】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分が前記ナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のｓｃＦｃ断片が前記ナノケージの外面を装飾する、請求項１３２に記載のナノケージ。
【請求項134】
請求項１２５～１３３のいずれか１項に記載のナノケージであって、（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてｓｃＦｃ断片に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含むナノケージ。
【請求項135】
各抗原結合部分が前記ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、前記ｓｃＦｃ断片が前記ＣサブユニットのＣ末端に連結されている、請求項１３４に記載のナノケージ。
【請求項136】
前記第１および／または第２の抗原結合部分が、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項１３４または１３５に記載のナノケージ。
【請求項137】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する、請求項１３６に記載のナノケージ。
【請求項138】
各抗原結合部分が異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである、請求項１３７に記載のナノケージ。
【請求項139】
前記ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂが、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する、請求項１３８に記載のナノケージ。
【請求項140】
前記ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂが、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、および／またはＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む、請求項１３９に記載のナノケージ。
【請求項141】
ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、およびＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む、請求項１４０に記載のナノケージ。
【請求項142】
少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む、請求項１２５～１４１のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項143】
少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のｓｃＦｃ断片を含む、請求項１２５～１４２のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項144】
医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する、請求項１２５～１４３のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項145】
前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されず、前記ナノケージに内部に含まれるか、または前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかで前記ナノケージに結合する、請求項１４４に記載のナノケージ。
【請求項146】
前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記カーゴ分子が前記ナノケージに内部に含有されるように前記融合タンパク質に融合されている、請求項１４４に記載のナノケージ。
【請求項147】
前記カーゴ分子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む、請求項１４４～１４６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項148】
前記ナノケージが汎ウイルス中和幅を示す、請求項１２５～１４７のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項149】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項１２５～１４８のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項150】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項１２５～１４９のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項151】
前記ナノケージが、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す、請求項１２５～１５０のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項152】
請求項５０～７６および請求項１２５～１５１のいずれか１項に記載のナノケージを含む治療用または予防用組成物。
【請求項153】
前記組成物が、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状を処置および／または予防するためのものである、請求項１５２に記載の組成物。
【請求項154】
前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項155】
ＨＩＶ－１関連症状を処置および／または予防するためのものである、請求項１５４に記載の組成物。
【請求項156】
請求項１～４９および７７～１２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項157】
請求項１５６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項158】
請求項１５７に記載のベクターを含み、請求項１～４９および請求項７７～１２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する宿主細胞。
【請求項159】
症状を処置および／または予防する方法であって、請求項５０～７６および請求項１２５～１５１のいずれか１項に記載のナノケージまたは請求項１５２～１５５のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項160】
前記症状がＨＩＶ－１関連症状である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項161】
症状を処置および／または予防するための、請求項５０～７６および請求項１２５～１５１のいずれか１項に記載のナノケージまたは請求項１５２～１５５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項162】
前記症状がＨＩＶ－１関連症状である、請求項１６１に記載の使用。
【請求項163】
症状の処置および／または予防における使用ための、請求項５０～７６および請求項１２５～１５１のいずれか１項に記載のナノケージまたは請求項１５２～１５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項164】
前記症状がＨＩＶ－１関連症状である、請求項１６３に記載のナノケージ。
【請求項165】
前記ナノケージがフェリチン重鎖を含まない、請求項５０～７６、請求項１２５～１５１、または請求項１６３～１６４のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項166】
前記ナノケージが、フェロキシダーゼ活性が可能な任意の成分を含まない、請求項５０～７６、請求項１２５～１５１、または請求項１６３～１６４のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項167】
前記ナノケージが、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体の数との比が６：１である、請求項５０～７６または請求項１６３～１６６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項168】
前記ナノケージが、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とｓｃＦｃの数との比が３：１である、請求項１２５～１５１または請求項１６３～１６６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項169】
前記ナノケージが、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体またはｓｃＦｃの数との比が少なくとも７：１である、請求項５０～７６または請求項１６３～１６６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【請求項170】
前記ナノケージが、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体またはｓｃＦｃの数との比が少なくとも４：１である、請求項１２５～１５１または請求項１６３～１６６のいずれか１項に記載のナノケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１４２，７０４号に基づく利益および優先権を主張し、その全内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１４２，７０４号に基づく利益および優先権を主張し、その全内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【0002】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１月２８日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ Ｊａｎ－２０２２ ３２０６－５０４８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズが８１００バイトである。
分野
分野
【0003】
本発明は、ポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙポリペプチドならびに関連する構築物、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
ナノ粒子は、様々な分野の進歩に寄与してきた。それらの使用は、標的送達を付与する可能性を有し、触媒プロセスのための順序付けられたマイクロアレイ、徐放およびケージ化されたマイクロ環境の操作を可能にする。
ナノ粒子は、様々な分野の進歩に寄与してきた。それらの使用は、標的送達を付与する可能性を有し、触媒プロセスのための順序付けられたマイクロアレイ、徐放およびケージ化されたマイクロ環境の操作を可能にする。
【0005】
感受性タンパク質および準安定性タンパク質を含有するナノ粒子の作製のために、タンパク質自己集合は魅力的な方法である。実際、自己集合したナノ粒子は、非共有結合相互作用を介して生理学的条件下で形成され、均一でしばしば対称的なナノカプセルまたはナノケージを確実に生じる。自己集合タンパク質ナノ粒子は、３つの異なる表面：外面、内面およびサブユニット間表面を有しており、これらは全て、付加された機能性を伝えるように調整され得る。
【0006】
自己集合タンパク質を含む融合タンパク質が記載されている。例えば、ワクチンとして使用するために、組み立てられたナノケージの外面に抗原を表示することが知られている。
【0007】
ナノ粒子を設計し、疾患を処置および／または予防するための改善された構築物、組成物、および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
本発明の要旨
一態様によれば、Ｆｃ単量体に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成することができる融合タンパク質が提供される。
一態様によれば、Ｆｃ単量体に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成することができる融合タンパク質が提供される。
【0009】
一態様では、Ｆｃ単量体は、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端で、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0010】
一態様では、サブユニットは、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、自己集合してナノケージ単量体を形成することができる。
【0011】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは、Ｆｃ単量体は、Ｃ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0012】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第１の生物活性部分にさらに連結されている。
【0013】
一態様では、第１の生物活性部分は、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0014】
一態様では、第１の生物活性部分は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは第１の生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0015】
一態様では、第１の生物活性部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する。
【0016】
一態様では、第１の生物活性部分は第１の抗原結合部分を含む。
【0017】
一態様では、第１の抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0018】
一態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0019】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0020】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0021】
一態様では、第１の抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0022】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0023】
一態様では、第１の抗原結合部分は、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。
【0024】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0025】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来のＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。
【0026】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でＦｃ単量体に連結され、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む。
【0027】
一態様では、融合タンパク質は、ＣサブユニットのＣ末端でＦｃ単量体に連結され、ＣサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結されたＣサブユニットを含む。
【0028】
一態様では、融合タンパク質は、ＮサブユニットまたはＮサブユニットを含む融合タンパク質と組み合わせて提供される。
【0029】
一態様では、Ｎサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で第２の生物活性部分に連結されている。
【0030】
一態様では、第２の生物活性部分は第２の抗原結合部分を含み、第１の生物活性部分が第１の抗原結合部分を含む場合、第２の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい。
【0031】
一態様では、第２の抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0032】
一態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0033】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0034】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0035】
一態様では、Ｎサブユニットは、ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端でＦｃ単量体にさらに連結されている。
【0036】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである。
【0037】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。
【0038】
一態様では、Ｆｃ単量体はＩｇＧ１ Ｆｃ単量体である。
【0039】
一態様では、Ｆｃ単量体は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む。
【0040】
一態様では、Ｆｃ単量体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む。
【0041】
一態様では、約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個のナノケージ単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットは、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる。
【0042】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。
【0043】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである。
【0044】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である。
【0045】
一態様では、融合タンパク質は、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる。
【0046】
一態様では、第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットは、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む。
【0047】
一態様では、アポフェリチンの「Ｎ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化1】
【0048】
一態様では、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化2】
【0049】
一態様では、Ｆｃ単量体は、リンカーを介して第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0050】
一態様では、第１の生物活性部分は、リンカーを介して第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0051】
一態様では、第２の生物活性部分は、リンカーを介してＮサブユニットに連結されている。
【0052】
一態様では、リンカーは、柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む。
【0053】
一態様では、リンカーはＧＳドメインを含む。
【0054】
一態様では、ＧＳドメインは、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳ（配列番号１１）リピートおよび／またはＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピートを含む。
【0055】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号４）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号４）
【0056】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号５）
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号５）
【0057】
一態様によれば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージが提供される。
【0058】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第２のナノケージ単量体サブユニットであり、第２のナノケージ単量体サブユニットは、融合タンパク質と自己集合してナノケージ単量体を形成する。
【0059】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、本明細書に記載の融合タンパク質内に含まれる。
【0060】
一態様では、各ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、本明細書に記載の融合タンパク質内に含まれる。
【0061】
一態様では、ナノケージは、１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む。
【0062】
一態様では、ナノケージは多価である。
【0063】
一態様では、ナノケージは多重特異性である。
【0064】
一態様では、少なくとも１つの生物活性部分は、ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのＦｃ二量体は、ナノケージの外面を装飾する。
【0065】
一態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分がナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のＦｃ二量体がナノケージの外面を装飾する。
【0066】
一態様では、ナノケージは、
（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてＦｃ単量体に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてＦｃ単量体に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
【0067】
一態様では、各抗原結合部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、Ｆｃ単量体は、ＣサブユニットのＣ末端に連結されている。
【0068】
一態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0069】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0070】
一態様では、各抗原結合部分は、異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである。
【0071】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0072】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、および／またはＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む。
【0073】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、およびＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む。
【0074】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む。
【0075】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のＦｃ単量体を含む。
【0076】
一態様では、ナノケージは、医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する。
【0077】
一態様では、カーゴ分子は、融合タンパク質に融合されずナノケージに内部に含まれるか、またはカーゴ分子は、融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかでナノケージに結合する。
【0078】
一態様では、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子はナノケージに内部に含有されるように融合タンパク質に融合されている。
【0079】
一態様では、カーゴ分子は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む。
【0080】
一態様では、ナノケージは、汎ウイルス中和幅を示す。
【0081】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0082】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0083】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0084】
一態様によれば、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成することができる、融合タンパク質が提供される。
【0085】
一態様では、サブユニットは、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、自己集合してナノケージ単量体を形成することができる。
【0086】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端においてＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されている。
【0087】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第１の生物活性部分にさらに連結されている。
【0088】
一態様では、第１の生物活性部分は、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0089】
一態様では、第１の生物活性部分は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは第１の生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0090】
一態様では、第１の生物活性部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する。
【0091】
一態様では、第１の生物活性部分は第１の抗原結合部分を含む。
【0092】
一態様では、第１の抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0093】
一態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0094】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0095】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0096】
一態様では、第１の抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0097】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0098】
一態様では、第１の抗原結合部分は、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。
【0099】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0100】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来のＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。
【0101】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結され、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結された第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む。
【0102】
一態様では、融合タンパク質は、ＣサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結され、ＣサブユニットのＮ末端で第１の生物活性部分に連結されたＣサブユニットを含む。
【0103】
一態様では、融合タンパク質は、ＮサブユニットまたはＮサブユニットを含む融合タンパク質と組み合わせて提供される。
【0104】
一態様では、Ｎサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で第２の生物活性部分に連結されている。
【0105】
一態様では、第２の生物活性部分が第２の抗原結合部分を含み、第１の生物活性部分が第１の抗原結合部分を含む場合、第２の抗原結合部分は、Ｃサブユニットに連結された抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい。
【0106】
一態様では、第２の抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0107】
一態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0108】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0109】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0110】
一態様では、Ｎサブユニットは、ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端で第２のｓｃＦｃ断片にさらに連結されている。
【0111】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである。
【0112】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。
【0113】
一態様では、ｓｃＦｃ断片はＩｇＧ１ ｓｃＦｃ断片である。
【0114】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの前記融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む。
【0115】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む。
【0116】
一態様では、約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個のナノケージ単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットは、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる。
【0117】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。
【0118】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである。
【0119】
一態様では、第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である。
【0120】
一態様では、融合タンパク質は、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる。
【0121】
一態様では、第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットは、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む。
【0122】
一態様では、アポフェリチンの「Ｎ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化3】
【0123】
一態様では、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化4】
【0124】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、リンカーを介して第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0125】
一態様では、第１の生物活性部分は、リンカーを介して第１のナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0126】
一態様では、第２の生物活性部分は、リンカーを介してＮサブユニットに連結されている。
【0127】
一態様では、リンカーは、柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む。
【0128】
一態様では、リンカーはＧＳドメインを含む。
【0129】
一態様では、ＧＳドメインは、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳ（配列番号１１）リピートおよび／またはＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピートを含む。
【0130】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号４）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号４）
【0131】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号５）
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号５）
【0132】
一態様によれば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージが提供される。
【0133】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第２のナノケージ単量体サブユニットであり、第２のナノケージ単量体サブユニットは、融合タンパク質と自己集合してナノケージ単量体を形成する。
【0134】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、本明細書に記載の融合タンパク質内に含まれる。
【0135】
一態様では、各ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、本明細書に記載の融合タンパク質内に含まれる。
【0136】
一態様では、ナノケージは、１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む。
【0137】
一態様では、ナノケージは多価である。
【0138】
一態様では、ナノケージは多重特異性である。
【0139】
一態様では、少なくとも１つの生物活性部分は、ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのｓｃＦｃ断片は、ナノケージの外面を装飾する。
【0140】
一態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分がナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のｓｃＦｃ断片がナノケージの外面を装飾する。
【0141】
一態様では、ナノケージは、
（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてｓｃＦｃ断片に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
（ａ）Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、
（ｂ）Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、
（ｃ）少なくとも１つのＣサブユニットであって、
（ｉ）一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し、
（ｉｉ）他方の末端においてｓｃＦｃ断片に融合した、少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
【0142】
一態様では、各抗原結合部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、ｓｃＦｃ断片は、ＣサブユニットのＣ末端に連結されている。
【0143】
一態様では、第１および／または第２の抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0144】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0145】
一態様では、各抗原結合部分は、異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである。
【0146】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0147】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、および／またはＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む。
【0148】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００ Ｆａｂ、１０Ｅ８ｖ４ Ｆａｂ、およびＮ４９Ｐ７ Ｆａｂを含む。
【0149】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む。
【0150】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のｓｃＦｃ断片を含む。
【0151】
一態様では、ナノケージは、医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する。
【0152】
一態様では、カーゴ分子は、融合タンパク質に融合されずナノケージに内部に含まれるか、またはカーゴ分子は、融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかでナノケージに結合する。
【0153】
一態様では、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子はナノケージに内部に含有されるように融合タンパク質に融合されている。
【0154】
一態様では、カーゴ分子は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む。
【0155】
一態様では、ナノケージは、汎ウイルス中和幅を示す。
【0156】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0157】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0158】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0159】
一態様では、本明細書に記載のナノケージを含む治療用または予防用組成物が提供される。
【0160】
一態様では、組成物は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状を処置および／または予防するためのものである。
【0161】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0162】
一態様では、組成物は、ＨＩＶ－１関連症状を処置および／または予防するためのものである。
【0163】
一態様によれば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。
【0164】
一態様によれば、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターが提供される。
【0165】
一態様によれば、本明細書に記載のベクターを含み、本明細書に記載の融合タンパク質を産生する宿主細胞が提供される。
【0166】
一態様によれば、症状を処置および／または予防する方法であって、本明細書に記載のナノケージまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【0167】
一態様では、症状はＨＩＶ－１関連症状である。
【0168】
一態様によれば、症状を処置および／または予防するための本明細書に記載のナノケージまたは組成物の使用が提供される。
【0169】
一態様では、症状はＨＩＶ－１関連症状である。
【0170】
一態様によれば、症状の処置および／または予防における使用のための本明細書に記載のナノケージまたは組成物が提供される。
【0171】
一態様では、症状はＨＩＶ－１関連症状である。
【0172】
一態様では、ナノケージはフェリチン重鎖を含まない。
【0173】
一態様では、ナノケージは、フェロキシダーゼ活性が可能な任意の成分を含まない。
【0174】
一態様では、ナノケージは、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体の数との比は６：１である。
【0175】
一態様では、ナノケージは、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とｓｃＦｃの数との比は３：１である。
【0176】
一態様では、ナノケージは、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体またはｓｃＦｃの数との比は少なくとも７：１である。
【0177】
一態様では、ナノケージは、抗体またはその抗原結合断片を含む少なくとも１つの生物活性部分を含み、生物活性部分の総数とＦｃ二量体またはｓｃＦｃの数との比は少なくとも４：１である。
【0178】
一態様によれば、Ｆｃ単量体に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成する、融合タンパク質が提供される。
【0179】
一態様では、サブユニットは、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、自己集合してナノケージ単量体を形成することができる。
【0180】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端で、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0181】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは、Ｆｃ単量体は、Ｃ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0182】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、生物活性部分にさらに連結されている。
【0183】
一態様では、生物活性部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0184】
一態様では、生物活性部分は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0185】
一態様では、抗原結合部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する。
【0186】
一態様では、生物活性部分は抗原結合部分を含む。
【0187】
一態様では、抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0188】
一態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0189】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0190】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0191】
一態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0192】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0193】
一態様では、抗原結合部分は、ＨＩＶ－１抗原結合部分を含む。
【0194】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0195】
一態様では、ＨＩＶ－１抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７を含む。
【0196】
一態様では、融合タンパク質は、ナノケージ単量体のＣ末端でＦｃ単量体に連結され、ナノケージ単量体のＮ末端で生物活性部分に連結されたナノケージ単量体を含む。
【0197】
一態様では、融合タンパク質は、ＣサブユニットのＣ末端でＦｃ単量体に連結され、ＣサブユニットのＮ末端で生物活性部分に連結されたＣサブユニットを含む。
【0198】
一態様では、Ｃサブユニットは、Ｎサブユニットと組み合わせて提供される。
【0199】
一態様では、Ｎサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で生物活性部分に連結されている。
【0200】
一態様では、生物活性部分は、Ｃサブユニットに連結された抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい抗原結合部分を含む。
【0201】
一態様では、抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0202】
一態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0203】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0204】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0205】
一態様では、Ｎサブユニットは、ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端でＦｃ単量体にさらに連結されている。
【0206】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである。
【0207】
一態様では、Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。
【0208】
一態様では、Ｆｃ単量体はＩｇＧ１ Ｆｃ単量体である。
【0209】
一態様では、Ｆｃ単量体は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む。
【0210】
一態様では、Ｆｃ単量体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ、および／またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む。
【0211】
一態様では、約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個の単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットは、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる。
【0212】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。
【0213】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである。
【0214】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である。
【0215】
一態様では、融合タンパク質は、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる。
【0216】
一態様では、第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットは、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む。
【0217】
一態様では、アポフェリチンの「Ｎ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ
【0218】
一態様では、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ
【0219】
一態様では、Ｆｃ単量体および／または生物活性部分は、リンカーを介してナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0220】
一態様では、リンカーは、柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む。
【0221】
一態様では、リンカーはＧＳドメインを含む。
【0222】
一態様では、ＧＳドメインは、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳリピートおよび／またはＧＧＧＧＳリピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳリピートを含む。
【0223】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ
【0224】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ
【0225】
一態様によれば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージが提供される。
【0226】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第２のナノケージ単量体サブユニットであり、第２のナノケージ単量体サブユニットは、融合タンパク質と自己集合してナノケージ単量体を形成する。
【0227】
一態様では、各ナノケージ単量体は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【0228】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【0229】
一態様では、ナノケージは、１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む。
【0230】
一態様では、ナノケージは多価である。
【0231】
一態様では、ナノケージは多重特異性である。
【0232】
一態様では、少なくとも１つの生物活性部分は、ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのＦｃ二量体は、ナノケージの外面を装飾する。
【0233】
一態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分がナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のＦｃ二量体がナノケージの外面を装飾する。
【0234】
一態様では、ナノケージは、Ｆａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、Ｆａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、少なくとも１つのＣサブユニットであって一方の末端においてＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し他方の末端においてＦｃ単量体に融合した少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
【0235】
一態様では、各抗原結合部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、Ｆｃ単量体は、ＣサブユニットのＣ末端に連結されている。
【0236】
一態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0237】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0238】
一態様では、各抗原結合部分は、異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである。
【0239】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0240】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７を含む。
【0241】
一態様では、ナノケージは、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４およびＮ４９Ｐ７を含む。
【0242】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む。
【0243】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のＦｃ単量体を含む。
【0244】
一態様では、ナノケージは、医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する。
【0245】
一態様では、カーゴ分子は、融合タンパク質に融合されずナノケージに内部に含まれるか、またはカーゴ分子は、融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかでナノケージに結合する。
【0246】
一態様では、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子はナノケージに内部に含有されるように融合タンパク質に融合されている。
【0247】
一態様では、カーゴ分子は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む。
【0248】
一態様では、ナノケージは、汎ウイルス中和幅を示す。
【0249】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0250】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0251】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0252】
一態様によれば、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含む融合タンパク質であって、複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成する、融合タンパク質が提供される。
【0253】
一態様では、サブユニットは、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体にそれぞれ実質的に対応するＮサブユニットまたはＣサブユニットを含み、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、自己集合してナノケージ単量体を形成することができる。
【0254】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ナノケージ単量体のＣ末端でナノケージ単量体に連結されている。
【0255】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＣ末端においてＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されている。
【0256】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、生物活性部分にさらに連結されている。
【0257】
一態様では、生物活性部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0258】
一態様では、生物活性部分は、ＮサブユニットまたはＣサブユニットのＮ末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結されており、好ましくは生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0259】
一態様では、抗原結合部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面、好ましくは外面を装飾する。
【0260】
一態様では、生物活性部分は抗原結合部分を含む。
【0261】
一態様では、抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0262】
一態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0263】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0264】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0265】
一態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0266】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0267】
一態様では、抗原結合部分は、ＨＩＶ－１抗原結合部分を含む。
【0268】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0269】
一態様では、ＨＩＶ－１抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７を含む。
【0270】
一態様では、融合タンパク質は、ナノケージ単量体のＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結され、ナノケージ単量体のＮ末端で生物活性部分に連結されたナノケージ単量体を含む。
【0271】
一態様では、融合タンパク質は、ＣサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結され、ＣサブユニットのＮ末端で生物活性部分に連結されたＣサブユニットを含む。
【0272】
一態様では、Ｃサブユニットは、Ｎサブユニットと組み合わせて提供される。
【0273】
一態様では、Ｎサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端で生物活性部分に連結されている。
【0274】
一態様では、生物活性部分は、Ｃサブユニットに連結された抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよい抗原結合部分を含む。
【0275】
一態様では、抗原結合部分は、抗体またはその断片を含む。
【0276】
一態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片を含む。
【0277】
一態様では、抗体またはその断片は、ｓｃＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、ＶＨＨドメインまたはそれらの組み合わせを含む。
【0278】
一態様では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0279】
一態様では、Ｎサブユニットは、ＮサブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端でｓｃＦｃ断片にさらに連結されている。
【0280】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来し、好ましくはヒトである。
【0281】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。
【0282】
一態様では、ｓｃＦｃ断片はＩｇＧ１ ｓｃＦｃ断片である。
【0283】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの前記融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含む。
【0284】
一態様では、ｓｃＦｃ断片は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ、および／またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含む。
【0285】
一態様では、約３～約１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、４８、もしくは６０個の単量体、または約４～約２００個のナノケージ単量体サブユニット、例えば４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、またはそれを超えるナノケージ単量体サブユニットは、必要に応じて１またはそれを超えるナノケージ単量体全体と組み合わせて、自己集合してナノケージを形成することができる。
【0286】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。
【0287】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン、必要に応じてヒトアポフェリチンである。
【0288】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、アポフェリチン軽鎖、必要に応じてヒトアポフェリチン軽鎖である。
【0289】
一態様では、融合タンパク質は、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて第１のヒトアポフェリチンサブユニットを含み、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニットと自己集合することができる。
【0290】
一態様では、第１および第２のアポフェリチン単量体サブユニットは、アポフェリチンの「Ｎ」および「Ｃ」領域を交換可能に含む。
【0291】
一態様では、アポフェリチンの「Ｎ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ
【0292】
一態様では、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ
【0293】
一態様では、ｓｃＦｃ断片および／または生物活性部分は、リンカーを介してナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0294】
一態様では、リンカーは、柔軟性または剛性であり、約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基を含む。
【0295】
一態様では、リンカーはＧＳドメインを含む。
【0296】
一態様では、ＧＳドメインは、ＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳリピートおよび／またはＧＧＧＧＳリピート、例えば１、２、３、４またはそれを超えるＧＧＧＧＳリピートを含む。
【0297】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ
【0298】
一態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ
ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ
【0299】
一態様によれば、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、融合タンパク質と自己集合する少なくとも１つの第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージが提供される。
【0300】
一態様では、融合タンパク質は、第１のナノケージ単量体サブユニットを含み、第２のナノケージ単量体またはそのサブユニットは、第２のナノケージ単量体サブユニットであり、第２のナノケージ単量体サブユニットは、融合タンパク質と自己集合してナノケージ単量体を形成する。
【0301】
一態様では、各ナノケージ単量体は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【0302】
一態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットの約１％～約１００％、例えば約１％、４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％～約４％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば約２０％～約８０％が、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。
【0303】
一態様では、ナノケージは、１個の生物活性部分または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の異なる生物活性部分、例えば２または３個の異なる生物活性部分を含む。
【0304】
一態様では、ナノケージは多価である。
【0305】
一態様では、ナノケージは多重特異性である。
【0306】
一態様では、少なくとも１つの生物活性部分は、ナノケージの外面を装飾し、少なくとも１つのｓｃＦｃ断片は、ナノケージの外面を装飾する。
【0307】
一態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の生物活性部分がナノケージの外面を装飾し、少なくとも２個のｓｃＦｃ断片がナノケージの外面を装飾する。
【0308】
一態様では、ナノケージは、ｓｃＦａｂなどの第１の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのナノケージ単量体と、ｓｃＦａｂなどの第２の抗原結合部分に融合した少なくとも１つのＮサブユニットと、少なくとも１つのＣサブユニットであって一方の末端においてｓｃＦａｂなどの第３の抗原結合部分に融合し他方の末端においてｓｃＦｃ断片に融合した少なくとも１つのＣサブユニットとを、含む。
【0309】
一態様では、各抗原結合部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端に連結され、ｓｃＦｃ断片は、ＣサブユニットのＣ末端に連結されている。
【0310】
一態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。
【0311】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0312】
一態様では、各抗原結合部分は、異なるＨＩＶ－１特異的Ｆａｂである。
【0313】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合する。
【0314】
一態様では、ＨＩＶ－１特異的Ｆａｂは、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７を含む。
【0315】
一態様では、ナノケージは、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４およびＮ４９Ｐ７を含む。
【0316】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個の抗原結合部分を含む。
【0317】
一態様では、ナノケージは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８個のＦｃ単量体を含む。
【0318】
一態様では、ナノケージは、医薬品、診断薬、および／または造影剤などのカーゴ分子を担持する。
【0319】
一態様では、カーゴ分子は、融合タンパク質に融合されずナノケージに内部に含まれるか、またはカーゴ分子は、融合タンパク質に連結されるか、または内部もしくは外部のいずれかでナノケージに結合する。
【0320】
一態様では、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子はナノケージに内部に含有されるように融合タンパク質に融合されている。
【0321】
一態様では、カーゴ分子は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含む。
【0322】
一態様では、ナノケージは、汎ウイルス中和幅を示す。
【0323】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0324】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0325】
一態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0326】
一態様によれば、本明細書に記載のナノケージを含む治療用または予防用組成物が提供される。
【0327】
一態様では、組成物は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状を処置および／または予防するためのものである。
【0328】
一態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連する。
【0329】
一態様では、組成物は、ＨＩＶ－１を処置および／または予防するためのものである。
【0330】
一態様によれば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。
【0331】
一態様によれば、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターが提供される。
【0332】
一態様によれば、本明細書に記載のベクターを含み、本明細書に記載の融合タンパク質を産生する宿主細胞が提供される。
【0333】
一態様によれば、症状を処置および／または予防する方法であって、本明細書に記載のナノケージまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。
【0334】
一態様では、症状はＨＩＶ－１である。
【0335】
一態様によれば、症状を処置および／または予防するための本明細書に記載のナノケージまたは組成物の使用が提供される。
【0336】
一態様では、症状はＨＩＶ－１である。
【0337】
一態様では、使用は、症状を処置および／または予防するためのものである。
【0338】
一態様では、症状はＨＩＶ－１である。
【0339】
本発明の新規な特徴は、本発明の以下の詳細な説明を検討することによって当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の詳細な説明および提示された特定の実施例は、本発明の特定の態様を示しているが、本発明の思想および範囲内の様々な変更および改変が本発明の詳細な説明および以下の特許請求の範囲から当業者に明らかになるので、例示目的でのみ提供されることを理解されたい。
【0340】
本発明は、図面を参照して以下の説明からさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0341】
【図1】ＨＩＶ－１ ｂＮＡｂ多量体化は中和効力の増加を推進する。（ａ）アポフェリチン（２４サブユニット）および（ｂ）一本鎖Ｆａｂ－アポフェリチン融合物の、自己集合の概略図。Ｆａｂ軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）は、それぞれ明るいピンク色および暗いピンク色で示されており、ＧＧＳ様の柔軟性リンカー（暗い）を介してヒトアポフェリチン（灰色）の軽鎖のＮ末端に連結されている。（ｃ）ヒトアポフェリチン上に示される異なるＦａｂ密度の概略図。ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチンをコードするプラスミドと非コンジュゲートアポフェリチンを１：４（暗黄色）、１：１（黒色）、４：１（青色）および１：０（赤色）の比で共トランスフェクションすると、サイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける、より早期の溶出体積およびより少ない非コンジュゲートアポフェリチンによって確認されるように、異なるｓｃＦａｂ価を有する分子が得られた。最低および最高の原子価を有する試料の陰性染色電子顕微鏡写真を示す。（ｄ）５つのＰｓＶパネル（ＰＶＯ．０４、ＪＲＣＳＦ、ＢＧ５０５ Ｔ３３２Ｎ、ＴＨＲＯ４１５６．１８およびｔ２７８－５０）に対する５つのｂＮＡｂの中和に対する結合活性効果。以下の場合：Ｎ４９Ｐ７－ｔ２７８－５０、ＶＲＣ０１－Ｔ２７８－５０および１０－１０７４－ＴＨＲＯ４１５６．１８では、中和耐性のため、ＩＣ５０倍増加分析を省略した。効力の倍数増加を、親ＩｇＧのＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）をＦａｂ－アポフェリチン融合物のＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）で割ったものとして計算した。バー（±ＳＤ）は、ｎ＝３の生物学的に独立した試料からの平均値を表す。
【0342】
【図2】ｓｃＦａｂ－アポフェリチン融合物の特徴付け。（ａ）ｓｃＦａｂ－アポフェリチンおよび非コンジュゲートアポフェリチンに対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用してデンシトメトリによって定量した。各レーン（黄色のボックス）のバンドの強度プロットを示す（ｂ）。（ｃ）粒子上に表示されたｓｃＦａｂのおおよその数を以下のように計算した：ｓｃＦａｂバンドの強度／総強度、および同時トランスフェクションに使用したＤＮＡ比から推測される理論数と比較した。
【0343】
【図3-1】３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの設計、組み立ておよび生物物理学的特徴付け。（ａ）ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチンサブユニットのヘテロ二量体化を促進するヒトアポフェリチン分割設計の概略図。自己集合を推進するために必要なヘテロオリゴマー化に基づいて、４つの成分：プロテインＡ（Ｆｃ結合）およびプロテインＬ（ＰＧＤＭ１４００結合）を用いたＭｕｌｔａｂｏｄｙの精製を２段階精製によって達成することができる。（ｂ）３２－Ｎの陰性染色電子顕微鏡写真。（ｃ）２４マーのＰＧＤＭ１４００（黒色）および３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ（濃マゼンタ）の多角度光散乱に則したサイズ排除クロマトグラフィ。各溶出ピーク（ＵＶ吸光度の下の線）のモル質量は、試料が単分散であり、この設計における追加の抗体断片のために、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙのサイズが２４マーのフォーマットよりも大きいことを示す。（ｄ）３２－Ｎ、１２マーのＭｕｌｔａｂｏｄｙおよび親ＩｇＧのＴｍおよびＴａｇｇ温度の比較。（ｅ）複数のエピトープへの３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの結合についての濃度応答曲線。ＰＧＤＭ１４００、Ｎ４９Ｐ７および１０Ｅ８ｖ４結合部位は、ＨＩＶ Ｅｎｖ（灰色）の表面表示においてそれぞれ赤色、青色およびピンク色である。ｐＨ７．５およびｐＨ５．６で結合を測定することによって、ヒトＦｃＲｎへのＦｃの機能的結合を試験した。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４＿Ｄ３６８Ｒ三量体および９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０単量体を、それぞれＰＧＤＭ１４００およびＮ４９Ｐ７のエピトープ特異的リガンドとして選択した。
【図3-2】同上。
【図3-3】同上。
【図3-4】同上。
【図3-5】同上。
【0344】
【図4】ｂＮＡｂｓ ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４およびＮ４９Ｐ７の結合プロファイル。Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサ上に固定化された９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４＿Ｄ３６８ＲおよびＭＰＥＲ Ｈｉｓタグ化抗原に結合するＩｇＧのＢＬＩ応答曲線。
【0345】
【図5】１４－シュードウイルスパネルに対する３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの中和特性。（ａ）３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ（赤色菱形）、親ｂＮＡｂ（黒丸）およびＩｇＧの組み合わせ（青色三角）の幅およびＩＣ５０中央値（μｇ／ｍＬ）。ＩｇＧカクテルは、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ試料と同様に、それぞれの親抗体を含んでいた（すなわち、ＰＧＤＭ１４００、Ｎ４９７および１０Ｅ８ｖ４）。１４－ＰｓＶパネルを、親ＩｇＧに対する感受性および耐性に基づいて選択した。（ｂ）各ＰｓＶ変異体に対するＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）。
【0346】
【0347】
【図7】第２世代のＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョン３（ＭＢ．ｖ３）の概略図。（ａ）アポフェリチンプロトマーのＣ末端（特にフェリチンのＣ半分体）に融合した一本鎖Ｆｃ領域（緑色）を単量体Ｆｃ鎖に戻した。（ｂ）機能性Ｆｃ断片の折り畳みは、アポフェリチンナノケージの４回対称軸で２つの独立したフェリチンサブユニットのＣ末端に融合した２つのＦｃ鎖のホモ二量体化から生じる。
【0348】
【図8-1】最適化されたＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョンの特徴付け。（ａ）３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２および３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３の陰性染色電子顕微鏡写真。３つの異なるバージョンの、Ｔａｇｇ温度（ｂ）および温度のストレス条件下での経時的安定性（ｃ）の比較。加速熱安定性アッセイの前後に活性なＭｕｌｔａｂｏｄｙを評価するための機能的中和アッセイ。複数のエピトープ（ｄ）およびＦｃ受容体（ｅ～ｆ）への結合についての濃度－応答曲線。Ｆｃ半減期延長突然変異ＬＳを有する３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３をアッセイに組み込んだ。
【図8-2】同上。
【図8-3】同上。
【図8-4】同上。
【図8-5】同上。
【0349】
【図9-1】３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙバージョン２および３の中和特性。（ａ）ＰＧＤＭ１４００中和に耐性の４４％のＰｓＶ変異体を含む２５－ＰｓＶパネルに対する３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙバージョン（異なる色調の赤い菱形）およびＩｇＧ混合物（青い三角形）の幅およびＩＣ５０中央値（μｇ／ｍＬ）の比較。各ＰｓＶに対するＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）を示す。（ｂ）３つの３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙバージョンならびに親ＩｇＧおよびＩｇＧ混合物を１１８ ＰｓＶの拡張マルチクレードパネルに対してグラムおよびモル量で比較した強度－帯域曲線。
【図9-2】同上。
【0350】
【図10】免疫不全マウスにおける３２－Ｎ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ ｖ３のインビボ曝露。１群あたり３匹の雌ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＣＧ）マウスを使用して、Ｆｃ改変（ＬＳ突然変異）および親ＩｇＧ混合物（比較のため）を含む５ｍｇ／ｋｇの３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３の皮下投与後の血液中のＭｕｌｔａｂｏｄｙ循環を評価した。
【発明を実施するための形態】
【0351】
特定の態様の詳細な説明
本明細書には、複数の自己集合ナノケージ単量体から形成されたナノケージプラットフォームが記載されている。これらは「Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ」プラットフォームと呼ばれ、例えばナノケージ内の融合分子の数または比を制御することによって、ナノケージの結合および薬物動態学的特徴の調節を可能にする。
本明細書には、複数の自己集合ナノケージ単量体から形成されたナノケージプラットフォームが記載されている。これらは「Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ」プラットフォームと呼ばれ、例えばナノケージ内の融合分子の数または比を制御することによって、ナノケージの結合および薬物動態学的特徴の調節を可能にする。
【0352】
ナノケージの各モノマーは、独立してそのまま発現されてもよく、またはｓｃＦｃ断片もしくはＦｃ単量体などの別の部分に融合されてもよい。多価および／または多重特異性であるナノケージを得るために、抗体またはその断片、例えばＦａｂ断片などの生物活性部分を１またはそれを超えるまたは全ての単量体に融合してもよい。さらに、各単量体は、各サブユニットが単量体の約半分を含むように、サブユニットに独立して分割されてもよく、ｓｃＦｃ断片、Ｆｃ単量体、および／または生物活性部分のさらなるレベルまたは対照および表示源を提供する。
【0353】
ここでは、Ｆｃ単量体またはｓｃＦｃ断片と組み合わせたＭｕｌｔａｂｏｄｙプラットフォーム上でのＨＩＶ－１標的化Ｆａｂの多量体化が、ＨＩＶ－１ウイルスを中和する有意により大きな能力をもたらすことが実証されている。本明細書で実証されるように、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの効力および汎中和能の増加は、単に１：１の比で増加するのではなく、価数の倍増は効力の倍増をもたらす。代わりに、効力は、態様において少なくとも１０倍、いくつかの態様においては、はるかに大きく、相乗的に増大する。この操作された分子の治療可能性は、ＭＢ効力をもたらすＦａｂ特異性および１１８ ＰｓＶの拡張マルチクレードパネルに耐性の４４％のＰｓＶ変異体を含む２５－ＰｓＶパネルを使用して実証された。
定義
定義
【0354】
他に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（発行：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見いだされ得る。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実施に使用することができるが、典型的な材料および方法を本明細書に記載する。本発明の説明および特許請求において、以下の用語が使用される。
【0355】
本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書では、記載された態様の理解を助けるために、多くの特許出願、特許、および刊行物が参照される。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0356】
本出願の範囲を理解する際に、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、１またはそれを超える要素があることを意味することを意図している。さらに、本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその派生語は、記載された特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を指定するが、他の記載されていない特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を排除しないオープンエンドの用語であることを意図している。上記は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの派生語などの同様の意味を有する単語にも適用される。
【0357】
特定の成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載される任意の態様はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」であってもよく、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、クローズドエンドまたは制限的な意味を有し、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、指定された成分を含むが、不純物として存在する材料、成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する不可避の材料、および本発明の技術的効果を達成すること以外の目的で追加される成分を除く他の成分を除外することを意味することが理解されよう。例えば、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句を使用して定義される組成物は、任意の既知の許容され得る添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。典型的には、一組の成分から本質的になる組成物は、５重量％未満、典型的には３重量％未満、より典型的には１重量％未満、さらにより典型的には０．１重量％未満の特定されていない成分を含む。
【0358】
本明細書に含まれると定義される任意の成分は、条件または否定的な限定によって特許請求される発明から明示的に除外され得ることが理解されよう。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載のナノケージおよび／または融合タンパク質は、フェリチン重鎖を除外してもよく、および／または鉄結合成分を除外してもよい。
【0359】
さらに、本明細書で与えられるすべての範囲は、明示的に述べられているか否かにかかわらず、範囲の端部および任意の中間範囲点も含む。
【0360】
本明細書で使用される「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの程度の用語は、最終結果が大きく変化しないように、修飾された用語の妥当な逸脱量を意味する。これらの程度の用語は、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである（修飾する単語の意味をこの偏差が否定しない場合）。
【0361】
略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」または「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」と同義である。「または」という単語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。
【0362】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物界の任意のメンバー、典型的には哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒト、他の高等霊長類、家畜および農耕動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【0363】
「タンパク質ナノ粒子」、「ナノケージ」、および「Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、複数のナノケージ単量体から作製されたタンパク質ベースの多面体形状の構造を指す。これらのナノケージ単量体またはそのサブユニットはそれぞれ、タンパク質またはポリペプチド（例えば、グリコシル化ポリペプチド）、ならびに必要に応じて、核酸、補欠分子族、有機および無機化合物の単一または複数の特徴で構成される。タンパク質ナノ粒子の非限定的な例としては、ナノ粒子に封入されたフェリチンナノ粒子（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ，Ｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１２：５４０６－５４２１，２０１１を参照）、エンカプスリンナノ粒子（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ，ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：９３９－９４７，２００８を参照）、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ（ＳＯＲ）ナノ粒子（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１１：９９６－１０００，２００６を参照）、ルマジンシンターゼナノ粒子（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０６：１０９９－１１１４，２００１を参照）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＩｚａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９６：１２４０－１２４５，１９９９を参照）が挙げられる。フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼは、場合によってはそれぞれ２４個、６０個、２４個、６０個、および６０個のタンパク質サブユニットからなる球状タンパク質複合体に自己集合する単量体タンパク質である。フェリチンおよびアポフェリチンは、一般に、本明細書では交換可能に言及され、両方とも本明細書に記載の融合タンパク質、ナノケージおよび方法での使用に適していると理解される。カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２ＰおよびＭＳ２コートタンパク質もまた、ナノケージを生成し、本明細書で使用することが企図される。さらに、完全または部分的に合成された自己集合単量体も、本明細書での使用が企図される。
【0364】
各ナノケージ単量体は、機能性ナノケージ単量体に自己集合する２またはそれを超えるサブユニットに分割され得ることが理解されよう。例えば、フェリチンまたはアポフェリチンは、ＮサブユニットおよびＣサブユニット、例えば、全長フェリチンを実質的に半分体に分割することによって得られるＮサブユニットおよびＣサブユニットに分割されてもよく、その結果、各サブユニットは、その後のナノケージ単量体およびナノケージへの自己集合のために、異なるｓｃＦｃ断片またはＦｃ単量体または生物活性部分（例えば、Ｆａｂ断片）に別々に結合され得る。各サブユニットは、態様において、同一または異なる両方の末端でｓｃＦｃおよび／またはＦｃ単量体および／または生物活性部分に連結され得る。「機能性ナノケージ単量体またはそのサブユニット」とは、ナノケージ単量体またはそのサブユニットが、相補的な単量体またはサブユニットと自己集合して本明細書に記載のナノケージになることができることを意図する。
【0365】
「フェリチン」および「アポフェリチン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一般に、典型的には２４個のタンパク質サブユニットを含むフェリチン複合体に集合することができるポリペプチド（例えば、フェリチン鎖）を指す。フェリチンは任意の種に由来し得ることが理解されよう。典型的には、フェリチンはヒトフェリチンである。いくつかの実施形態では、フェリチンは野生型フェリチンである。例えば、フェリチンは、野生型ヒトフェリチンであってもよい。いくつかの実施形態では、フェリチン軽鎖がナノケージ単量体として使用され、および／またはフェリチン軽鎖のサブユニットがナノケージ単量体サブユニットとして使用される。いくつかの実施形態では、組み立てられたナノケージは、フェリチン重鎖または鉄に結合することができる他のフェリチン成分を含まない。
【0366】
本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、少なくとも２つの異なる結合パートナー、例えば抗原または受容体（例えば、Ｆｃ受容体）が結合することができる少なくとも２つの結合部位を有する特徴を指す。例えば、少なくとも２つのＦａｂ断片を含み、２つのＦａｂ断片のそれぞれが異なる抗原に結合するナノケージは、「多重特異性」である。さらなる例として、Ｆｃ断片（Ｆｃ受容体に結合することができる）およびＦａｂ断片（抗原に結合することができる）を含むナノケージは「多重特異性」である。
【0367】
本明細書で使用される「多価」という用語は、結合パートナー、例えば抗原または受容体（例えば、Ｆｃ受容体）が結合することができる少なくとも２つの結合部位を有する特徴を指す。少なくとも２つの結合部位に結合することができる結合パートナーは、同じであっても異なっていてもよい。
【0368】
本明細書で使用される、当技術分野において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれる「抗体」という用語は、対になった重および軽ポリペプチド鎖から構築されたタンパク質を指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのＩｇＧ、ならびにＩｇＭを含む様々なＩｇアイソタイプが存在する。抗体は、ヒト、マウス、ラット、サル、ラマ、またはサメを含む任意の種に由来し得ることが理解されよう。抗体が正しく折り畳まれると、各鎖は、より直鎖状のポリペプチド配列によって連結されたいくつかの異なる球状ドメインに折り畳まれる。例えば、ＩｇＧの場合、免疫グロブリン軽鎖は可変（ＶＬ）ドメインおよび定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれ、重鎖は可変（ＶＨ）ドメインおよび３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインに折り畳まれる。重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。各ドメインは、当業者によく知られている十分に確立された構造を有する。
【0369】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、標的抗原の結合に関与し、したがって、抗体間で有意な配列多様性を示すことができる。定常領域は、より少ない配列多様性を示し、重要な免疫学的事象を誘発するためにいくつかの天然タンパク質に結合する役割を果たす。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列可変性の大部分は、可変重鎖および可変軽鎖あたりそれぞれ３つの６つの超可変領域で起こる。超可変領域が組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合および認識に寄与する。その抗原に対する抗体の特異性および親和性は、超可変領域の構造、ならびにそれらが抗原に提示する表面のサイズ、形状および化学によって決定される。
【0370】
本明細書で言及される「抗体断片」は、当技術分野で公知の任意の適切な抗原結合抗体断片を含み得る。抗体断片は、天然に存在する抗体断片であってもよく、または天然に存在する抗体の操作によって、または組換え方法を使用することによって得られてもよい。例えば、抗体断片は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで結合したＶＬおよびＶＨからなる分子）、Ｆｃ、一本鎖Ｆｃ（例えば、例えばアミノ酸リンカーなどのリンカーを介して互いに連結された２つのＦｃ単量体を含むポリペプチド）、Ｆｃ単量体（例えば、正確に１つのＣＨ２ドメインおよび正確に１つのＣＨ３ドメインを含む単一のＦｃ鎖（これは、典型的には別のＦｃ単量体と二量体化することができる））、Ｆａｂ、一本鎖Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単一のＶＬまたはＶＨから構成される断片）、およびこれらのいずれかの多価提示を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」は、標的抗原に特異的に結合する抗体または抗体の一部を指す。
【0371】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能であって当技術分野で周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【0372】
本明細書で使用される「抗体によって予防可能」および「抗体によって処置可能」な症状という語句は、一般に、少なくとも１つの抗原の発現または存在に関連することが知られている症状を指す。例えば、感染性疾患との関連において、抗原は感染性疾患因子上の抗原であり得、抗原は感染細胞によって発現され得、および／または抗原は感染に対する免疫応答に関与する細胞によって発現され得る。「抗体によって予防可能な症状」は、一般に、症状が確立されるのを防ぐために抗体を使用することができる症状である。「抗体によって処置可能な症状」は、一般に、確立された症状を処置するために抗体を使用することができる症状である。
【0373】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指す。エピトープは、抗原性である、すなわち特異的免疫応答を誘発する分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、例えばポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理時に失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的立体配座で少なくとも３個、より通常的には少なくとも５個、約９個、約１１個または約８個～約１２個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）の方法の「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」を参照されたい。
【0374】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫担当細胞の活性化、またはその両方を含み得る。当業者は、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、その用語が本明細書で使用される場合、「抗原」をコードすることを当業者は理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本明細書に記載される態様は、１よりも多くの遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列を様々な組み合わせで配置して所望の免疫応答を誘発することができることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が合成され得るか、または生物学的試料に由来し得ることは容易に明らかである。そのような生物学的試料は、組織試料、細胞、または生物学的流体を含むことができるが、これらに限定されない。
【0375】
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。
【0376】
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
【0377】
語句「ＨＩＶ－１関連症状」は、本明細書で使用する場合、ＨＩＶ－１感染の症状（一次感染、潜伏感染を含む）および／またはＨＩＶ－１感染に起因する症状（例えば、後天性免疫不全症候群）を指す。
【0378】
「単離」は、天然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」ではなく、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
【0379】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部のバージョンではイントロン（複数可）を含み得る程度に、イントロンも含み得る。
【0380】
本明細書で使用される「調節すること」という用語は、処置または化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが未処置の対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナルまたは応答を撹乱および／または影響させ、それによって対象、典型的にはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
【0381】
「作動可能に連結される」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠内にある。
【0382】
組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射もしくは注入技術が含まれる。吸入および鼻腔内投与も含まれる。
【0383】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸が、単量体「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定するものではないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲなどを使用した組換えライブラリまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない当技術分野で利用可能な任意の手段によって、および合成手段によって得られる全ての核酸配列が含まれる。
【0384】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２またはそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、その多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0385】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体は、１またはそれを超える種由来のその抗原にも結合し得る。しかし、そのような交差種反応性は、それ自体抗体の特異的な分類を変更しない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性は、それ自体抗体の特異的な分類を変更しない。いくつかの例では、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、一般にタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応において、エピトープＡを含有する分子（または遊離の非標識Ａ）の存在は、抗体に結合した標識されたＡの量を減少させる。
【0386】
本明細書で使用される場合、症状（例えば、ＨＩＶ－１などの本明細書に記載の症状）を「処置する」または症状の「処置」は、臨床結果などの有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の結果には、１またはそれを超える症候または症状の緩和または改善；疾患、障害または症状の程度の減少；疾患、障害、または症状の安定化された（すなわち、悪化しない）状態；疾患、障害、または症状の拡大を防止すること；疾患、障害、または症状の進行を遅延または遅らせること；疾患、障害または症状の改善または軽減；検出可能であろうと検出不能であろうと、（部分的であろうと全体的であろうと）寛解が含まれ得るが、これらに限定されない。疾患、障害、または症状を「軽減する」とは、処置なしの場合の程度または時間経過と比較して、疾患、障害、または症状の程度および／または望ましくない臨床症状が減少され、および／または進行の時間経過が遅くなるかまたは長くなることを意味する。本明細書で使用される場合、「予防」または「予防法」という用語は、疾患もしくは障害、例えばＨＩＶ－１を獲得もしくは発症するリスクの減少、または、疾患もしくは障害、例えばＨＩＶ－１の再発の減少もしくは阻害を指す。したがって、ＨＩＶ－１治療用または予防用組成物は、本明細書に記載の組み立てられたナノケージ、またはナノケージに組み立てることができ、対象に投与された場合にＨＩＶ－１を処置および／または予防することができる本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物を指す。
【0387】
「治療有効量」、「有効量」または「十分な量」という用語は、哺乳動物を含む対象、例えばヒトに投与した場合、所望の結果を達成するのに十分な量、例えば細胞死を引き起こすのに有効な量を意味する。本明細書に記載される化合物の有効量は、分子、対象の年齢、性別、種および体重などの因子によって異なり得る。当業者によって理解されるように、投与量または処置計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、治療有効量の本明細書に記載の融合タンパク質の投与は、いくつかの態様では、ＨＩＶ－１を処置および／または予防するのに十分である。さらに、治療有効量での対象の処置計画は、単回投与からなり得るか、または代替的に一連の適用を含み得る。処置期間の頻度および長さは、分子、対象の年齢、薬剤の濃度、薬剤に対する患者の応答性、またはそれらの組み合わせなどの様々な要因に依存する。処置に使用される薬剤の有効投与量は、特定の処置計画の経過にわたって増加または減少し得ることも理解されよう。投与量の変化は、当技術分野で公知の標準的な診断アッセイによって生じ、明らかになり得る。本明細書中に記載される融合タンパク質は、態様において、問題となっている疾患または障害のための従来の治療による処置の前、間または後に投与され得る。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＨＩＶ－１の従来の処置と組み合わせて特定の用途を見出すことができる。
【0388】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
【0389】
「転写制御下」または「作動可能に連結される」という語句は、本明細書で使用される場合、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して正しい位置および向きにあることを意味する。
【0390】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0391】
１またはそれを超えるさらなる治療剤と「組み合わせて」投与することは、任意の順序での同時（共に）および連続投与を含む。
【0392】
「薬学的に許容され得る」という用語は、化合物または化合物の組み合わせが医薬用途の製剤の残りの成分と適合性であり、米国食品医薬品局によって公布されたものを含む確立された政府基準に従ってヒトに投与するのが一般に安全であることを意味する。
【0393】
「薬学的に許容され得る担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および／または吸収遅延剤などを含むが、これらに限定されない。薬学的に許容され得る担体の使用は周知である。
【0394】
「変異体」は、比較配列内の１またはそれを超えるアミノ酸残基の挿入、欠失、改変および／または置換によって比較配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性な融合タンパク質、抗体またはそれらの断片である。変異体は、一般に、比較配列と１００％未満の配列同一性を有する。しかしながら、通常、生物学的に活性な変異体は、比較配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。変異体は、比較配列の生物学的活性のある程度のレベルを保持する少なくとも１０アミノ酸のペプチド断片を含む。変異体はまた、１またはそれを超えるアミノ酸残基が比較配列のＮ末端またはＣ末端に、または比較配列内に付加されているポリペプチドを含む。変異体はまた、多数のアミノ酸残基が欠失されている、および／または１またはそれを超えるアミノ酸残基によって必要に応じて置換されているポリペプチドを含む。変異体はまた、例えば天然に存在するアミノ酸以外の部分での置換によって、またはアミノ酸残基を改変して天然に存在しないアミノ酸を産生することによって共有結合的に改変され得る。
【0395】
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、本明細書では、配列を整列させ、必要に応じて最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、本発明のポリペプチドなどの目的の配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。候補配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部伸長、欠失または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、「ＢＬＡＳＴ」など、当技術分野で周知である。
【0396】
本明細書の目的のための「活性な」または「活性」は、本明細書に記載の融合タンパク質の生物学的および／または免疫学的活性を指し、「生物学的」活性は、融合タンパク質によって引き起こされる生物学的機能（阻害性または刺激性のいずれか）を指す。
【0397】
本明細書に記載の融合タンパク質は、改変を含み得る。そのような改変としては、限定されないが、エフェクター分子へのコンジュゲーションが挙げられる。改変にはさらに、検出可能なレポーター部分へのコンジュゲーションが含まれるが、これらに限定されない。半減期を延長する改変（例えば、ペグ化）も含まれる。脱免疫化のための改変も含まれる。タンパク質および非タンパク質剤は、当技術分野で公知の方法によって融合タンパク質にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーション方法には、直接連結、共有結合したリンカーを介した連結、および特異的結合対メンバー（例えば、アビジン－ビオチン）が含まれる。そのような方法には、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０，６６００－６６０７（１９９０）によって記載されたもの、ならびにＡｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３，７９－９０（１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａ ｅｔ ａｌ，ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５，５０８－５１４（１９９１）（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されたものを含む。
Ｆｃ単量体を含む融合タンパク質
Ｆｃ単量体を含む融合タンパク質
【0398】
融合タンパク質が本明細書に記載される。態様において、融合タンパク質は、Ｆｃ単量体に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含み、複数の融合タンパク質が自己集合して、１またはそれを超えるＦｃ二量体を含むナノケージを形成する。このようにして、組み立てられた１またはそれを超えるＦｃ二量体は、組み立てられたナノケージの内面、組み立てられたナノケージの外面、またはその両方を装飾し得る。いくつかの実施形態では、組み立てられた１またはそれを超えるＦｃ二量体は、組み立てられたナノケージの外面を装飾する。Ｆｃ二量体を単量体成分に分割することにより、ナノケージ設計においてさらなる制御が得られる。Ｆｃ単量体は、ナノケージを組み立て、生物活性部分などの他の連結成分の比をより厳密に制御するのを助ける。
【0399】
いくつかの態様では、完全なナノケージ単量体の代わりにナノケージ単量体サブユニットが融合タンパク質に使用される。ナノケージ単量体は２つの部分に分けることができ、その一方は「Ｎサブユニット」と呼ばれるナノケージ単量体のＮ末端を含み、他方は「Ｃサブユニット」と呼ばれるナノケージ単量体のＣ末端を含む。ＮサブユニットまたはＣサブユニットは、それぞれ、ナノページ単量体の実質的に半分体を表し得るか、または不均一に分割され得る。典型的には、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、それぞれ、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体に実質的に対応する。ＮサブユニットおよびＣサブユニットは自己集合してナノケージ単量体を形成することができ、それ自体が、上記のように自己集合してナノケージを形成することができる。
【0400】
各ナノケージ単量体ならびに各ＮおよびＣサブユニットは、Ｎ末端およびＣ末端を含むことが理解されよう。Ｆｃ単量体は、一方または両方の末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結することができる。典型的には、Ｆｃ単量体は、Ｃ末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。同様に、Ｆｃ単量体は、Ｎサブユニットおよび／またはＣサブユニットのいずれかまたは両方の末端に連結され得る。典型的には、Ｆｃ単量体は、Ｃ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0401】
典型的な態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、生物活性部分にさらに連結されている。Ｆｃ単量体と同様に、生物活性部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結することができ、典型的にはＮ末端で連結される。ナノケージ単量体サブユニットが使用される場合、生物活性部分は同様に、いずれかの末端、典型的にはＦｃ単量体とは反対の末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結され得る。典型的には、生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結される。
【0402】
抗原結合部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面を装飾し、典型的には組み立てられたナノケージの外面を装飾するように、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結される。
【0403】
生物活性部分は、典型的には、抗原標的に特異的に結合する抗体またはその断片である。抗体またはその断片は、例えば、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含み得るか、またはそれらからなり得ることが理解されよう。抗体またはその断片は、例えば、Ｆａｂ（例えば、ｓｃＦａｂ）断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、および／またはＶＨＨ領域を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含まない。本明細書に記載の融合タンパク質には、任意の抗体またはその断片が使用され得ることが理解されよう。
【0404】
一般に、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖と会合しており、Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖は、融合タンパク質とは別個にまたは連続して産生され得る。
【0405】
典型的な態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。例えば、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連し得る。
【0406】
例示的な態様では、抗原結合部分は、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、例えば、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合し得る。具体的な例では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来の抗原結合部分を含む。
【0407】
特定の態様では、本明細書に記載のナノケージ単量体は、Ｆｃ単量体または生物活性モチーフ（例えば、Ｆａｂ断片）に連結されたＮサブユニットまたはＣサブユニットを含む。ＮまたはＣサブユニットは、相補的なＣまたはＮサブユニットと自己集合して完全なナノケージ単量体を形成することができ、その複数が自己集合してナノケージを形成し、したがって複数のＦｃ単量体および／または他の部分が１つのナノケージに自己集合することを可能にする。各異なる成分の量は、遺伝子および発現比を制御することによって制御される。これらのナノケージ単量体サブユニットは、単独または組み合わせて使用することができる。
【0408】
例えば、Ｆｃ単量体または生物活性部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、分割されたアポフェリチン単量体（ＮサブユニットまたはＣサブユニット（これらはそれぞれ、典型的には、全長アポフェリチン単量体の約半分体である））に連結することができる。Ｆｃ単量体または生物活性部分（例えば、Ｆａｂ断片）に融合した各サブユニットは、アポフェリチン単量体に自己集合し、次いで、他のアポフェリチン単量体（完全なアポフェリチンまたはＮおよびＣサブユニットから形成された組み立てられたアポフェリチンのいずれか）と自己集合してナノケージを形成する。
【0409】
全長ナノケージ単量体が使用される場合、ナノケージ単量体は、典型的には、ナノケージ単量体のＣ末端に連結されたＦｃ単量体と、ナノケージ単量体のＮ末端に連結された生物活性部分とを含む。ナノケージ単量体サブユニットが使用される場合、サブユニットは、典型的には、サブユニットのＣ末端に連結されたＦｃ単量体と、サブユニットのＮ末端に連結された生物活性部分とを含む。典型的には、Ｃサブユニットは、Ｆｃ単量体がＣサブユニットのＣ末端に連結され、生物活性部分がＣサブユニットのＮ末端に連結された、本明細書に記載の融合タンパク質に使用される。
【0410】
本明細書に記載されるＮまたはＣサブユニットは、態様において、ＮまたはＣサブユニットが自己集合することができる相補的なＣまたはＮサブユニットと組み合わせて提供される。相補的なＣまたはＮサブユニットは、融合タンパク質であってもよいし、融合タンパク質でなくてもよい。いくつかの態様では、相補的ＣまたはＮサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端で、典型的にはＮ末端で生物活性部分に連結される。生物活性部分は、例えば、ＮまたはＣサブユニットに連結された任意の生物活性部分または抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよいＦａｂ断片などの抗原結合部分であってもよい。相補的なＣまたはＮサブユニットは、そのＮ末端またはＣ末端で、典型的にはＣ末端でＦｃ単量体に連結され得る。典型的には、ナノケージの４倍軸を利用し、それによって他の半分体を満たすために、Ｆｃ単量体がフェリチンのＣサブユニットのＣ末端に融合されることが理解されよう。
【0411】
例えば、いくつかの態様では、融合タンパク質は、Ｃ末端でＦｃ単量体に連結されてＮ末端でＦａｂ断片に連結されたＣサブユニットを含む。使用時に、Ｃサブユニットは、そのＮ末端でＦａｂ断片（Ｃサブユニットに連結されたＦａｂ断片と同じであっても異なっていてもよい）に連結されたＮサブユニットと自己集合してナノケージ単量体を形成する。上述のように、複数のナノケージ単量体は、自己集合してナノケージを形成する。ナノケージ単量体サブユニットは、単独または組み合わせて提供されてもよく、それに融合された同じまたは異なる生物活性部分を有してもよい。
【0412】
Ｆｃ単量体は、任意の抗体タイプまたは種に由来する任意のＦｃ単量体であり得る。典型的には、Ｆｃ単量体はヒトであり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する。例えば、Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し得る（例えばＩｇＧ１ Ｆｃ単量体）。
【0413】
Ｆｃ単量体は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含んでもよい。例えば、Ｆｃ単量体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【0414】
さらに、Ｆｃ配列改変および他の薬剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンペプチド配列、ならびにヒト血清アルブミンを標的とするＦａｂおよび／またはナノボディなどの抗体）の添加を含む、本明細書に記載の融合タンパク質およびナノケージにおける他の置換が企図され、これらはバイオアベイラビリティの変化を可能にし、当業者によって理解されるであろう。さらに、本明細書に記載の融合タンパク質およびナノケージは、免疫原性および抗薬物応答をミュートするために、配列において、または他の薬剤の添加によって調節することができる（治療法、例えば宿主への配列の適合、または免疫抑制療法の追加［例えば、関節リウマチの処置のためにインフリキシマブを投与する際のメトトレキサートや、ＦＶＩＩＩに対するインヒビターの発生率を減少させる主要な戦略である新生児寛容の誘導など］（総説：ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ ＤＭ，Ｈｏｏｔｓ ＷＫ，Ｐｉｐｅ ＳＷ，Ｒｉｖａｒｄ ＧＥ，Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏ Ｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２００７；１３：１－２２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］）。
【0415】
本明細書に記載されるように、ナノケージ単量体はサブユニットから形成され得る。したがって、ナノケージ単量体サブユニットは、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて、第１のヒトアポフェリチンサブユニット、例えば、アポフェリチンＮまたはＣサブユニットを含んでもよく、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニット、例えば、相補的ＣまたはＮサブユニットと自己集合することができる。他のナノケージ単量体は、本明細書に記載のアポフェリチンとよく似た二成分サブユニットに分割することができ、その結果、サブユニットは自己集合し、それぞれ生物活性部分と融合しやすいことが理解されよう。
【0416】
アポフェリチンの「Ｎ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１）
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１）
【0417】
アポフェリチンの「Ｎ」領域が単独でまたは別の融合タンパク質の成分として完全にまたは部分的に記載されている本明細書のどこかで、配列ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１）が、ＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１５）で置換され得ることが理解されよう。したがって、態様において、アポフェリチンの「Ｎ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１５）
ＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１５）
【0418】
アポフェリチンの「Ｃ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ（配列番号２）
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ（配列番号２）
【0419】
アポフェリチンの「Ｃ」領域が単独でまたは別の融合タンパク質の成分として完全にまたは部分的に記載されている本明細書のどこかで、配列ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ（配列番号２）が、
で置換され得ることが理解されよう。したがって、態様において、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる：
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＫＨＤ（配列番号１６）
【化5】
で置換され得ることが理解されよう。したがって、態様において、アポフェリチンの「Ｃ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる：
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＫＨＤ（配列番号１６）
【0420】
抗体またはその断片が第１および第２の鎖、または重鎖および軽鎖などの２本の鎖を含む場合、２本の鎖は、必要に応じてリンカーによって分離される。リンカーは、柔軟性または剛性であり得るが、典型的には、鎖を適切に折り畳むことができるように可撓性である。同様に、Ｆｃ単量体および／または生物活性部分は、典型的には、リンカーを介してナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0421】
リンカーは、一般に、融合タンパク質にある程度の柔軟性を付与するのに十分な長さであるが、リンカーの長さは、ナノケージ単量体またはそのサブユニットおよびＦｃ単量体および生物活性部分の配列ならびに融合タンパク質の三次元立体配座に応じて変化することが理解されよう。したがって、リンカーは、典型的には約１～約１３０アミノ酸残基、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５～約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、または１３０アミノ酸残基、または約５０～約９０アミノ酸残基、例えば７０アミノ酸残基、または約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基である。
【0422】
リンカーは、任意のアミノ酸配列のものであってもよく、１つの典型的な例では、リンカーは、ＧＳドメイン、または一連のＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳリピートおよび／またはＧＧＧＧＳリピートなどの一連のＧおよびＳアミノ酸を含む。典型的には、リンカーはＧＧＧＧＳおよび／またはＧＧＧＳリピートを含み、より典型的には、リンカーは少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＧＳおよび／またはＧＧＧＧＳリピート、例えば約５個のＧＧＧＳリピートおよび／または約１４個のＧＧＧＧＳリピートを含む。特定の態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化6】
【0423】
典型的な態様では、抗体またはその断片は、ＨＩＶ－１に関連する抗原に特異的に結合する。
【0424】
態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、以下の配列の１またはそれを超えるものと少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなり、フェリチンサブユニットは太字であり、リンカーには下線が引かれている。これらの場合のそれぞれにおいて、完全なフェリチン単量体が示されているか（（
）
、またはＮ－もしくはＣ－フェリチン単量体が示されている（Ｎ－フェリチンの場合（
(
）およびＣ－フェリチンの場合（
））のいずれかであるが、これらは交換可能に使用することができ、または別の単量体もしくはその一部をその代わりに使用することができることが理解されよう。
【化7】
）
、またはＮ－もしくはＣ－フェリチン単量体が示されている（Ｎ－フェリチンの場合（
(
【化8】
）およびＣ－フェリチンの場合（
【化9】
））のいずれかであるが、これらは交換可能に使用することができ、または別の単量体もしくはその一部をその代わりに使用することができることが理解されよう。
【0425】
３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３：
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ１（配列番号９）
３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３ ＬＳ：
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ１－ＬＳ（配列番号１０）
またはそれらの組み合わせ。
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
【化10】
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
【化11】
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ１（配列番号９）
【化12】
３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３ ＬＳ：
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
【化13】
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
【化14】
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ１－ＬＳ（配列番号１０）
【化15】
またはそれらの組み合わせ。
【0426】
さらなる態様では、融合タンパク質は、検出可能部分（例えば、小分子、蛍光分子、放射性同位体、または磁性粒子）、医薬品、診断薬、またはそれらの組み合わせなどのさらなる部分にコンジュゲートまたは会合し、例えば抗体－薬物コンジュゲートを含み得る。
【0427】
さらなる部分が検出可能な部分である態様では、検出可能な部分は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含み得る。
【0428】
さらなる部分が医薬品である態様では、医薬品は、例えば、小分子、ペプチド、脂質、炭水化物、または毒素を含み得る。
【0429】
典型的な態様では、本明細書に記載の融合タンパク質から組み立てられたナノケージは、約３～約１００個のナノケージ単量体からなり、そのうちのいずれも、二成分ナノケージ単量体サブユニット、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、または９８～約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、または１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、または６０個のナノケージ単量体として提供され得ないか、そのうちの一部またはすべてがそのようなナノケージ単量体として提供され得る。ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、任意の公知のナノケージ単量体、天然、合成、または部分的に合成であってもよく、態様では、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。典型的には、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチンまたはアポフェリチンまたはそのサブユニットである。
【0430】
各対が自己集合してナノケージ単量体を形成し、第１および第２のナノケージ単量体サブユニットが本明細書に記載の異なる生物活性部分に融合されている、上記の融合タンパク質の対も本明細書に記載される。これは、サブユニットの対から組み立てられた単一のナノケージ単量体に多価性および／または多重特異性を提供する。
Ｃ末端ｓｃＦｃ断片を含む融合タンパク質
Ｃ末端ｓｃＦｃ断片を含む融合タンパク質
【0431】
融合タンパク質が本明細書に記載される。態様において、融合タンパク質は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結されたナノケージ単量体またはそのサブユニットを含み、複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成する。このようにして、ｓｃＦｃ断片は、組み立てられたナノケージの内面、組み立てられたナノケージの外面、またはその両方を装飾し得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｃ断片は、組み立てられたナノケージの外面を装飾する。ｓｃＦｃ断片をナノケージ単量体またはそのサブユニットのＣ末端に配置することによって、驚くべきことに、改善された効力および中和効率が観察された。
【0432】
いくつかの態様では、完全なナノケージ単量体の代わりにナノケージ単量体サブユニットが融合タンパク質に使用される。ナノケージ単量体は２つの部分に分けることができ、その一方は「Ｎサブユニット」と呼ばれるナノケージ単量体のＮ末端を含み、他方は「Ｃサブユニット」と呼ばれるナノケージ単量体のＣ末端を含む。ＮサブユニットまたはＣサブユニットは、それぞれ、ナノページ単量体の実質的に半分体を表し得るか、または不均一に分割され得る。典型的には、ＮサブユニットおよびＣサブユニットは、それぞれ、ナノケージ単量体のＮ末端半分体およびナノケージ単量体のＣ末端半分体に実質的に対応する。ＮサブユニットおよびＣサブユニットは自己集合してナノケージ単量体を形成することができ、それ自体が、上記のように自己集合してナノケージを形成することができる。
【0433】
各ナノケージ単量体ならびに各ＮおよびＣサブユニットは、Ｎ末端およびＣ末端を含むことが理解されよう。ｓｃＦｃ断片は、一方または両方の末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結することができる。典型的には、ｓｃＦｃ断片は、Ｃ末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。同様に、ｓｃＦｃ断片は、Ｎサブユニットおよび／またはＣサブユニットのいずれかまたは両方の末端に連結され得る。典型的には、ｓｃＦｃ断片は、Ｃ末端でＣサブユニットに連結されている。
【0434】
典型的な態様では、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、生物活性部分にさらに連結されている。ｓｃＦｃ断片と同様に、生物活性部分は、ナノケージ単量体またはそのサブユニットのＮ末端またはＣ末端でナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結することができ、典型的にはＮ末端で連結される。ナノケージ単量体サブユニットが使用される場合、生物活性部分は同様に、いずれかの末端、典型的にはｓｃＦｃ断片とは反対の末端でＮサブユニットまたはＣサブユニットに連結され得る。典型的には、生物活性部分は、Ｎ末端でＣサブユニットに連結される。
【0435】
抗原結合部分は、組み立てられたナノケージの内面および／または外面を装飾し、典型的には組み立てられたナノケージの外面を装飾するように、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結される。
【0436】
生物活性部分は、典型的には、抗原標的に特異的に結合する抗体またはその断片である。抗体またはその断片は、例えば、Ｆａｂ断片の重鎖および／または軽鎖を含み得るか、またはそれらからなり得ることが理解されよう。抗体またはその断片は、例えば、Ｆａｂ（例えば、ｓｃＦａｂ）断片、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂ断片、および／またはＶＨＨ領域を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含まない。本明細書に記載の融合タンパク質には、任意の抗体またはその断片が使用され得ることが理解されよう。
【0437】
一般に、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖と会合しており、Ｆａｂ軽鎖および／または重鎖は、融合タンパク質とは別個にまたは連続して産生され得る。
【0438】
典型的な態様では、抗原結合部分は、抗体によって予防可能および／または抗体によって処置可能な症状に関連する抗原に特異的に結合する。例えば、抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、もしくは酵母を含む感染因子、癌、または自己免疫疾患を含む免疫疾患に関連し得る。
【0439】
例示的な態様では、抗原結合部分は、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分を含む。ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、例えば、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ＿Ｄ３６８Ｒ、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０、および／またはＭＰＥＲペプチドに結合し得る。具体的な例では、ＨＩＶ－１特異的抗原結合部分は、ＰＧＤＭ１４００、１０Ｅ８ｖ４、および／またはＮ４９Ｐ７由来の抗原結合部分を含む。
【0440】
特定の態様では、本明細書に記載のナノケージ単量体は、ｓｃＦｃ断片または生物活性モチーフ（例えば、Ｆａｂ断片）に連結されたＮサブユニットまたはＣサブユニットを含む。ＮまたはＣサブユニットは、相補的なＣまたはＮサブユニットと自己集合して完全なナノケージ単量体を形成することができ、その複数が自己集合してナノケージを形成し、したがって複数のｓｃＦｃ断片および／または他の部分が１つのナノケージに自己集合することを可能にする。各異なる成分の量は、遺伝子および発現比を制御することによって制御される。これらのナノケージ単量体サブユニットは、単独または組み合わせて使用することができる。
【0441】
例えば、ｓｃＦｃ断片または生物活性部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、分割されたアポフェリチン単量体（ＮサブユニットまたはＣサブユニット（これらはそれぞれ、典型的には、全長アポフェリチン単量体の約半分体である））に連結することができる。ｓｃＦｃ断片または生物活性部分（例えば、Ｆａｂ断片）に融合した各サブユニットは、アポフェリチン単量体に自己集合し、次いで、他のアポフェリチン単量体（完全なアポフェリチンまたはＮおよびＣサブユニットから形成された組み立てられたアポフェリチンのいずれか）と自己集合してナノケージを形成する。
【0442】
全長ナノケージ単量体が使用される場合、ナノケージ単量体は、典型的には、ナノケージ単量体のＣ末端に連結されたｓｃＦｃ断片と、ナノケージ単量体のＮ末端に連結された生物活性部分とを含む。ナノケージ単量体サブユニットが使用される場合、サブユニットは、典型的には、サブユニットのＣ末端に連結されたｓｃＦｃ断片と、サブユニットのＮ末端に連結された生物活性部分とを含む。典型的には、Ｃサブユニットは、ｓｃＦｃ断片がＣサブユニットのＣ末端に連結され、生物活性部分がＣサブユニットのＮ末端に連結された、本明細書に記載の融合タンパク質に使用される。
【0443】
本明細書に記載されるＮまたはＣサブユニットは、態様において、ＮまたはＣサブユニットが自己集合することができる相補的なＣまたはＮサブユニットと組み合わせて提供される。相補的なＣまたはＮサブユニットは、融合タンパク質であってもよいし、融合タンパク質でなくてもよい。いくつかの態様では、相補的ＣまたはＮサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端で、典型的にはＮ末端で生物活性部分に連結される。生物活性部分は、例えば、ＮまたはＣサブユニットに連結された任意の生物活性部分または抗原結合部分と同じであっても異なっていてもよいＦａｂ断片などの抗原結合部分であってもよい。相補的なＣまたはＮサブユニットは、そのＮ末端またはＣ末端で、典型的にはＣ末端でｓｃＦｃ断片に連結され得る。
【0444】
例えば、いくつかの態様では、融合タンパク質は、Ｃ末端でｓｃＦｃ断片に連結されてＮ末端でＦａｂ断片に連結されたＣサブユニットを含む。使用時に、Ｃサブユニットは、そのＮ末端でＦａｂ断片（Ｃサブユニットに連結されたＦａｂ断片と同じであっても異なっていてもよい）に連結されたＮサブユニットと自己集合してナノケージ単量体を形成する。上述のように、複数のナノケージ単量体は、自己集合してナノケージを形成する。ナノケージ単量体サブユニットは、単独または組み合わせて提供されてもよく、それに融合された同じまたは異なる生物活性部分を有してもよい。
【0445】
ｓｃＦｃ断片は、任意の抗体タイプまたは種に由来する任意のｓｃＦｃ断片であり得る。典型的には、ｓｃＦｃ断片はヒトであり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する。例えば、ｓｃＦｃ断片は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し得る（例えばＩｇＧ１ ｓｃＦｃ断片）。
【0446】
ｓｃＦｃ断片は、例えば数分または数時間から数日、数週間または数ヶ月までの融合タンパク質の半減期を調節する１またはそれを超える突然変異または突然変異のセットを含んでもよい。例えば、ｓｃＦｃ断片は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｍ４２８、Ｎ４３４、またはそれらの組み合わせ（番号付けはＥＵインデックスに従う）のうちの１またはそれを超えるものにおける突然変異、例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）；Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）；Ｉ２５３Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰ」）；Ｇ２３６Ｒ；Ｇ２３７Ａ；および／またはＡ３３０Ｌまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【0447】
さらに、Ｆｃ配列改変および他の薬剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンペプチド配列、ならびにヒト血清アルブミンを標的とするＦａｂおよび／またはナノボディなどの抗体）の添加を含む、本明細書に記載の融合タンパク質およびナノケージにおける他の置換が企図され、これらはバイオアベイラビリティの変化を可能にし、当業者によって理解されるであろう。さらに、本明細書に記載の融合タンパク質およびナノケージは、免疫原性および抗薬物応答をミュートするために、配列において、または他の薬剤の添加によって調節することができる（治療法、例えば宿主への配列の適合、または免疫抑制療法の追加［例えば、関節リウマチの処置のためにインフリキシマブを投与する際のメトトレキサートや、ＦＶＩＩＩに対するインヒビターの発生率を減少させる主要な戦略である新生児寛容の誘導など］（総説：ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ ＤＭ，Ｈｏｏｔｓ ＷＫ，Ｐｉｐｅ ＳＷ，Ｒｉｖａｒｄ ＧＥ，Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏ Ｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２００７；１３：１－２２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］）。
【0448】
本明細書に記載されるように、ナノケージ単量体はサブユニットから形成され得る。したがって、ナノケージ単量体サブユニットは、第１のアポフェリチンサブユニット、必要に応じて、第１のヒトアポフェリチンサブユニット、例えば、アポフェリチンＮまたはＣサブユニットを含んでもよく、第１のアポフェリチンサブユニットは、第２のアポフェリチンサブユニット、例えば、相補的ＣまたはＮサブユニットと自己集合することができる。他のナノケージ単量体は、本明細書に記載のアポフェリチンとよく似た二成分サブユニットに分割することができ、その結果、サブユニットは自己集合し、それぞれ生物活性部分と融合しやすいことが理解されよう。
【0449】
アポフェリチンの「Ｎ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１）
ＭＳＳＱＩＲＱＮＹＳＴＤＶＥＡＡＶＮＳＬＶＮＬＹＬＱＡＳＹＴＹＬＳＬＧＦＹＦＤＲＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲＥＬＡＥＥＫＲＥＧＹＥＲＬＬＫＭＱＮＱＲＧＧＲＡＬＦＱＤＩＫＫＰＡＥＤＥＷ（配列番号１）
【0450】
アポフェリチンの「Ｃ」領域は、典型的には、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ（配列番号２）
ＧＫＴＰＤＡＭＫＡＡＭＡＬＥＫＫＬＮＱＡＬＬＤＬＨＡＬＧＳＡＲＴＤＰＨＬＣＤＦＬＥＴＨＦＬＤＥＥＶＫＬＩＫＫＭＧＤＨＬＴＮＬＨＲＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲＬＴＬＲＨＤ（配列番号２）
【0451】
抗体またはその断片が第１および第２の鎖、または重鎖および軽鎖などの２本の鎖を含む場合、２本の鎖は、必要に応じてリンカーによって分離される。リンカーは、柔軟性または剛性であり得るが、典型的には、鎖を適切に折り畳むことができるように可撓性である。同様に、ｓｃＦｃ断片および／または生物活性部分は、典型的には、リンカーを介してナノケージ単量体またはそのサブユニットに連結されている。
【0452】
リンカーは、一般に、融合タンパク質にある程度の柔軟性を付与するのに十分な長さであるが、リンカーの長さは、ナノケージ単量体またはそのサブユニットおよびｓｃＦｃ断片および生物活性部分の配列ならびに融合タンパク質の三次元立体配座に応じて変化することが理解されよう。したがって、リンカーは、典型的には約１～約１３０アミノ酸残基、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５～約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、または１３０アミノ酸残基、または約５０～約９０アミノ酸残基、例えば７０アミノ酸残基、または約１～約１００アミノ酸残基、例えば約１～約７０アミノ酸残基、例えば約１～約３０アミノ酸残基、例えば約８～約１６アミノ酸残基である。
【0453】
リンカーは、任意のアミノ酸配列のものであってもよく、１つの典型的な例では、リンカーは、ＧＳドメイン、または一連のＧＳリピート、ＧＧＳリピート、ＧＧＧＳリピートおよび／またはＧＧＧＧＳリピートなどの一連のＧおよびＳアミノ酸を含む。典型的には、リンカーはＧＧＧＧＳおよび／またはＧＧＧＳリピートを含み、より典型的には、リンカーは少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＧＧＧＳ（配列番号１１）および／またはＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピート、例えば約５個のＧＧＧＳ（配列番号１１）リピートおよび／または約１４個のＧＧＧＧＳ（配列番号１２）リピートを含む。特定の態様では、リンカーは、以下と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなる。
【化16】
【0454】
典型的な態様では、抗体またはその断片は、ＨＩＶ－１に関連する抗原に特異的に結合する。
【0455】
態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、以下の配列の１またはそれを超えるものと少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一の配列を含むか、またはこれからなり、フェリチンサブユニットは太字であり、リンカーには下線が引かれている。これらの場合のそれぞれにおいて、完全なフェリチン単量体が示されているか（(
）、またはＮ－もしくはＣ－フェリチン単量体が示されている（Ｎ－フェリチンの場合（(
）およびＣ－フェリチンの場合（
））のいずれかであるが、これらは交換可能に使用することができ、または別の単量体もしくはその一部をその代わりに使用することができることが理解されよう。
【化17】
）、またはＮ－もしくはＣ－フェリチン単量体が示されている（Ｎ－フェリチンの場合（(
【化18】
【化19】
）およびＣ－フェリチンの場合（
【化20】
））のいずれかであるが、これらは交換可能に使用することができ、または別の単量体もしくはその一部をその代わりに使用することができることが理解されよう。
【0456】
３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２：
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ（配列番号１３）
またはそれらの組み合わせ。
Ｎ４９Ｐ７＿Ｎ－フェリチン（配列番号７）
【化21】
ＰＧＤＭ１４００＿ｈフェリチン（配列番号８）
【化22】
１０Ｅ８ｖ４＿Ｃ－フェリチン＿Ｆｃ（配列番号１３）
【化23】
【化24】
またはそれらの組み合わせ。
【0457】
さらなる態様では、融合タンパク質は、検出可能部分（例えば、小分子、蛍光分子、放射性同位体、または磁性粒子）、医薬品、診断薬、またはそれらの組み合わせなどのさらなる部分にコンジュゲートまたは会合し、例えば抗体－薬物コンジュゲートを含み得る。
【0458】
さらなる部分が検出可能な部分である態様では、検出可能な部分は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および／またはｉＬＯＶなどのＬＯＶタンパク質などのフラビン系の蛍光タンパク質を含み得る。
【0459】
さらなる部分が医薬品である態様では、医薬品は、例えば、小分子、ペプチド、脂質、炭水化物、または毒素を含み得る。
【0460】
典型的な態様では、本明細書に記載の融合タンパク質から組み立てられたナノケージは、約３～約１００個のナノケージ単量体からなり、そのうちのいずれも、二成分ナノケージ単量体サブユニット、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、または９８～約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、または１００個のナノケージ単量体、例えば２４、３２、または６０個のナノケージ単量体として提供され得ないか、そのうちの一部またはすべてがそのようなナノケージ単量体として提供され得る。ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、任意の公知のナノケージ単量体、天然、合成、または部分的に合成であってもよく、態様では、フェリチン、アポフェリチン、エンカプスリン、ＳＯＲ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ヴォールトタンパク質、ＧｒｏＥＬ、熱ショックタンパク質、Ｅ２Ｐ、ＭＳ２コートタンパク質、それらの断片、およびそれらの変異体から選択される。典型的には、ナノケージ単量体またはそのサブユニットは、フェリチンまたはアポフェリチンまたはそのサブユニットである。
【0461】
各対が自己集合してナノケージ単量体を形成し、第１および第２のナノケージ単量体サブユニットが本明細書に記載の異なる生物活性部分に融合されている、上記の融合タンパク質の対も本明細書に記載される。これは、サブユニットの対から組み立てられた単一のナノケージ単量体に多価性および／または多重特異性を提供する。
ナノケージ
ナノケージ
【0462】
本明細書には、本明細書に開示される少なくとも１つの融合タンパク質を含むナノケージも開示され、ナノケージは、少なくとも１つの融合タンパク質ならびに追加の融合タンパク質（複数可）および／またはナノケージ単量体（複数可）またはそのサブユニット、例えばフェリチン鎖（複数可）（例えば、ヒトフェリチン軽鎖）から自己集合する。
【0463】
本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、融合タンパク質と自己集合してナノケージを形成する少なくとも１つのナノケージ単量体またはそのサブユニットとを含むナノケージも本明細書に記載される。さらに、融合タンパク質の対が本明細書に記載されており、この対は、自己集合してナノケージ単量体を形成し、第１および第２のナノケージ単量体サブユニットは異なる生物活性部分に融合されている。
【0464】
ナノケージは、複数の同一の融合タンパク質から、複数の異なる融合タンパク質から（したがって、多価および／または多重特異性である）、融合タンパク質と野生型タンパク質との組み合わせから、およびそれらの任意の組み合わせから、自己集合し得ることが理解されよう。例えば、ナノケージは、少なくとも１つのＦｃ単量体および／またはｓｃＦｃ断片と組み合わせて、本明細書に記載の融合タンパク質の少なくとも１つで内部および／または外部で装飾され得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＦｃ単量体および／またはｓｃＦｃ断片および少なくとも１つのＦａｂ断片は、ナノケージの外面を装飾する。いくつかの態様では、少なくとも２つのＦｃ単量体および／またはｓｃＦｃ断片および少なくとも２つのＦａｂ断片は、ナノケージの外面を装飾する。
【0465】
典型的な態様では、約２０％～約８０％のナノケージ単量体またはそのサブユニットが、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。本明細書に記載のモジュール式溶液を考慮すると、ナノケージは、理論的には、各ナノケージ単量体が２つのサブユニットに分けられ得、その各々が各末端で異なる生物活性部分に独立して結合することができるので、ナノケージ中に単量体が存在するのと最大３または４倍の数の生物活性部分、例えば抗体断片および／またはＦｃ単量体／ｓｃＦｃ断片を含むことができる。これにもかかわらず、立体障害を回避するために、より低い数が通常使用される。このモジュール性を利用して、任意の所望の比の生物活性部分を達成することができることが理解されよう。
【0466】
いくつかの例では、本明細書に記載のナノケージは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８個またはそれを超える同一もしくは実質的に同一もしくは機能的に等価なＦｃ単量体またはｓｃＦｃ断片のコピーを含み得る。追加または代替の例では、本明細書に記載のナノケージは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８個またはそれを超える同一もしくは実質的に同一もしくは機能的に等価なＦａｂ断片などの生物活性部分のコピーを含み得る。追加または代替の例では、本明細書に記載のナノケージは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８個の異なるＦｃ単量体および／またはｓｃＦｃ断片および／または他の生物活性部分を含み得る。このようにして、ナノケージは多価および／または多重特異性であり得、この程度は本明細書に記載のシステムで比較的容易に制御することができる。いくつかの実施形態では、ナノケージは多価および多重特異性の両方である。
【0467】
いくつかの態様では、本明細書に記載のナノケージは、ナノケージ単量体サブユニットに連結されているものとして本明細書に記載の生物活性部分と同じであっても異なっていてもよい生物活性部分に必要に応じて融合した少なくとも１つの全ナノケージ単量体をさらに含み得る。
【0468】
いくつかの態様では、本明細書に記載のナノケージは、各々がナノケージ単量体またはそのサブユニットに融合した異なる抗原結合部分を含む第１および第２の融合タンパク質と、必要に応じて、ナノケージ単量体またはそのサブユニットに融合したＦｃ単量体またはｓｃＦｃ断片を含む第３の融合タンパク質とを含む。
【0469】
いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の融合タンパク質はそれぞれ、ＮまたはＣ半フェリチンに融合された生物活性部分またはその部分を含み、第１、第２、および第３の融合タンパク質の少なくとも１つはＮ半フェリチンに融合され、第１、第２、および第３の融合タンパク質の少なくとも１つはＣ半フェリチンに融合され、Ｆｃ単量体またはｓｃＦｃ断片はＣ半フェリチンのＣ末端に融合される。
【0470】
いくつかの実施形態では、第１および必要に応じて第２の融合タンパク質はそれぞれ、完全なアポフェリチンに融合した抗原結合部分を含む。同様に、いくつかの実施形態では、第３のタンパク質は、完全なアポフェリチンに融合した生物活性部分を含む。本明細書に記載のモジュール式ナノケージでの使用のために、完全なナノケージ単量体とナノケージ単量体のサブユニットとの組み合わせが企図されることが理解されよう。
【0471】
典型的には、そのＮ末端でＦａｂなどの生物活性部分に結合した少なくとも１つの完全なナノケージ単量体が、本明細書に記載のナノケージで使用されることが理解されよう。典型的には、Ｎ－およびＣ－フェリチンサブユニットの対あたり１つのそのような完全なナノケージ単量体が存在する。これは、ナノケージが過剰な立体障害なしに適切に多量体化することを可能にし、また、望ましくない過剰な結合活性をもたらし得るナノケージ上のＦｃ単量体および／またはｓｃＦｃ断片の数を減少させる。
【0472】
タンパク質は任意の数または比の融合タンパク質を含むことができるが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノケージは、それぞれが同じ疾患に関連する異なる抗原に特異的な３つのＦａｂと、必要に応じてＦａｂ１：Ｆａｂ２：Ｆａｂ：Ｆｃ単量体／ｓｃＦｃ比が２：２：２：１のＦｃ単量体またはｓｃＦｃ断片とを含む。
【0473】
治療用または予防用組成物などのナノケージを含む組成物も本明細書に記載される。ＨＩＶ－１を処置および／または予防するための関連する方法および使用も記載され、その方法または使用は、本明細書に記載のナノケージまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0474】
ＨＩＶ－１に関する特定の実施形態では、ナノケージは、態様では、汎ウイルス中和幅を示す。追加または代替の態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約０．１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．０１ｕｇ／ｍＬ未満、例えば約０．００１ｕｇ／ｍＬ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。追加または代替の態様では、ナノケージは、１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対して、約４２ｐＭ未満、例えば約４．２ｐＭ未満、例えば約０．４２ｐＭ未満の平均ＩＣ５０中央値を示す。追加または代替の態様では、ナノケージは、１１８ ＰｓＶ のマルチクレードパネルに対して、質量および／またはモルベースで、対応するｂＮＡｂのカクテルよりも少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００より強力である平均ＩＣ５０中央値を示す。
【0475】
本明細書に記載のポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドも企図されることが理解されよう。実質的に同一の配列は、１またはそれを超える保存的アミノ酸突然変異を含み得る。参照配列に対する１またはそれを超える保存的アミノ酸突然変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的または機能的特性に実質的な変化がない変異ペプチドをもたらし得ることは、当技術分野で公知である。そのような場合、参照配列および変異配列は「実質的に同一」ポリペプチドとみなされるであろう。保存的アミノ酸突然変異は、アミノ酸の付加、欠失または置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、本明細書では、類似の化学的特性（例えば、サイズ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換として定義される。
【0476】
非限定的な例では、保存的突然変異はアミノ酸置換であり得る。そのような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性または酸性アミノ酸を同じ基の別のものと置換し得る。「塩基性アミノ酸」という用語は、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味し、これは典型的には生理学的ｐＨで正に帯電している。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびリジン（ＬｙｓまたはＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」でもある）という用語は、生理学的ｐＨでは帯電していないが、２つの原子によって共通して共有される電子対が原子の１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」でもある）という用語は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の正規化コンセンサス疎水性スケールに従って０より大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）およびグリシン（ＧｌｙまたはＧ）が含まれる。
【0477】
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指し、これは典型的には生理学的ｐＨで負に帯電している。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）およびアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）が含まれる。
【0478】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用される。２つの配列が残基位置間の最大対応関係についてアラインメントされたときに同じである残基のパーセントを計算することによって決定される。任意の既知の方法を使用して配列同一性を計算することができる。例えば、コンピュータソフトウェアが配列同一性を計算するために利用可能である。限定することを望むものではないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって維持される（およびｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／に見られる）ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、Ｂｌａｓｔ－ＮもしくはＦＡＳＴＡ－Ｎなどのソフトウェア、または当技術分野で公知の任意の他の適切なソフトウェアによって計算することができる。
【0479】
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも８５％同一であり得る。別の例では、実質的に同一の配列は、本明細書に記載の配列とアミノ酸レベルで少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一であり得る。特定の態様では、実質的に同一の配列は、参照配列の活性および特異性を保持する。非限定的な実施形態では、配列同一性の差は、保存的アミノ酸突然変異（複数可）に起因し得る。
【0480】
本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、それらの発現、検出、精製、またはトランスサイトーシスを阻害するペプチドなどの任意の他の所望の特性を助けるための追加の配列を含み得る。当業者に公知の任意のそのような配列またはタグを使用することができる。例えば、限定することを望まないが、融合タンパク質は、標的化配列もしくはシグナル配列（例えば、これに限定されないが、ｏｍｐＡ）、検出タグ、Ｓｔｒｅｐタグを含む例示的なタグカセット、またはそれらの任意の変異体（例えば、米国特許第７，９８１，６３２号を参照）、Ｈｉｓタグ、配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）を有するＦｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｖ５タグ、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、チオレドキシンタグ、またはそれらの任意の組み合わせ；精製タグ（例えば、限定されないが、Ｈｉｓ５またはＨｉｓ６）、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【0481】
別の例では、追加の配列は、国際公開第１９９５／００４０６９号のＣｒｏｎａｎら、または国際公開第２００４／０７６６７０号のＶｏｇｅｓらによって記載されているようなビオチン認識部位であり得る。当業者にも知られているように、リンカー配列は、追加の配列またはタグと共に使用され得る。
【0482】
より具体的には、タグカセットは、高い親和性または結合活性で抗体に特異的に結合することができる細胞外成分を含み得る。一本鎖融合タンパク質構造内では、タグカセットは、（ａ）コネクタ領域のすぐアミノ末端に、（ｂ）リンカーモジュールの間に介在して接続し、（ｃ）結合ドメインのすぐカルボキシ末端に、（ｄ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）の間に介在して接続し、（ｅ）結合ドメインのサブユニットの間に介在して接続し、または（ｆ）一本鎖融合タンパク質のアミノ末端に配置され得る。特定の実施形態では、１またはそれを超える接合アミノ酸は、タグカセットと疎水性部分との間に配置されて接続するか、タグカセットとコネクタ領域との間に配置されて接続するか、タグカセットとリンカーモジュールとの間に配置されて接続するか、タグカセットと結合ドメインとの間に配置されて接続し得る。
【0483】
様々な方法論を使用して表面に固定化された単離または精製融合タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの断片も本明細書に包含される。例えば、限定することを望むものではないが、ポリペプチドは、Ｈｉｓ－タグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面に連結またはカップリングされ得る。固体表面は、任意の適切な表面、例えば、限定はしないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、膜、ビーズ（磁気ベースもしくはセファロースベースのビーズまたは他のクロマトグラフィ樹脂など）、ガラス、フィルム、または任意の他の有用な表面であり得る。
【0484】
他の態様では、融合タンパク質は、カーゴ分子に連結され得る。融合タンパク質は、カーゴ分子を所望の部位に送達し得、当技術分野で公知の任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーション、キレート化など）を用いてカーゴ分子に連結され得る。カーゴ分子は、治療薬または診断薬などの任意の種類の分子であり得る。
【0485】
いくつかの態様では、カーゴ分子はタンパク質であり、カーゴ分子はナノケージに内部または外部に含有されるように融合タンパク質に融合されている。他の態様では、カーゴ分子は融合タンパク質に融合されず、ナノケージに内部に含含有される。カーゴ分子は、典型的には、タンパク質、小分子、放射性同位体または磁性粒子である。
【0486】
本明細書に記載の融合タンパク質は、それらの標的に特異的に結合する。本明細書に記載の抗体または断片の、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す抗体特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。親和性は、抗原と抗体との解離の平衡定数（ＫＤ）によって表され、抗原決定基（エピトープ）と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。結合活性は、抗体とその抗原との結合の強さの尺度である。抗体は、典型的には、１０－５～１０－１１ＭのＫＤで結合する。１０－４Ｍを超えるＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗体結合部位との結合強度が強くなる。態様において、本明細書に記載される抗体は、１０－４ Ｍ、１０－５ Ｍ、１０－６ Ｍ、１０－７ Ｍ、１０－８ Ｍ、１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ、１０－１１ Ｍ、１０－１２ Ｍ、１０－１３ Ｍ、１０－１４ Ｍ、または１０－１５ Ｍ未満のＫＤを有する。
【0487】
本明細書に記載される融合タンパク質およびポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに核酸分子を含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞も本明細書に記載される。
【0488】
本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列と実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じ」核酸配列は、本明細書では、２つの配列が（適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って）最適にアライメントされ、２つの配列間のヌクレオチドの正確な一致を決定するために比較される場合、別の核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性を有する配列として定義される。
【0489】
抗体の断片をコードするポリヌクレオチドの適切な供給源には、全長抗体を発現する任意の細胞、例えばハイブリドーマおよび脾臓細胞が含まれる。断片は、抗体等価物として単独で使用されてもよく、または上記のように等価物に再結合されてもよい。このセクションに記載されるＤＮＡの欠失および組換えは、公知の方法、例えば、上記の「抗体の機能的等価物（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と題されたセクションに列挙された公開特許出願に記載される方法、および／または他の標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば、以下に記載されるものによって行われ得る。ＤＮＡの別の供給源は、当技術分野で公知のように、ファージディスプレイライブラリーから産生される一本鎖抗体である。
【0490】
さらに、発現配列、プロモーターおよびエンハンサー配列に作動可能に連結された前述のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターが提供される。原核生物、例えば細菌および真核生物系（酵母および哺乳動物細胞培養系を含むがこれらに限定されない）における抗体ポリペプチドの効率的な合成のための様々な発現ベクターが開発されている。本発明のベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【0491】
任意の適切な発現ベクターを使用することができる。例えば、原核生物クローニングベクターには、大腸菌由来のプラスミド、例えばｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４が含まれる。原核生物ベクターはまた、Ｍｌ３および他の糸状一本鎖ＤＮＡファージなどのファージＤＮＡの誘導体を含む。酵母において有用なベクターの例は、２μプラスミドである。哺乳動物細胞における発現のための好適なベクターには、ＳＶ－４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列の周知の誘導体、および機能性哺乳動物ベクター（例えば、上記のもの）と機能性プラスミドおよびファージＤＮＡとの組み合わせに由来するシャトルベクターが含まれる。
【0492】
さらなる真核生物発現ベクターは当技術分野で公知である（例えば、Ｐ Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，１：３２７－３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１：８５４－８６４（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎ＆Ｓｈａｒｐ，「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５９：６０１－６２１（１９８２）；Ｋａｕｆｍａｎ＆Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１５９：６０１－６６４（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８０：４６５４－４６５９（１９８３）；Ｕｒｌａｕｂ＆Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０，（１９８０）（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる））。
【0493】
発現ベクターは、典型的には、発現されるＤＮＡ配列または断片に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む。クローン化ＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、制御配列をベクターに挿入する。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ－接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびシミアンウイルスに由来するプロモーター、例えば初期および後期プロモーターまたはＳＶ４０、ならびに原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列である。
【0494】
本明細書には、前述の発現ベクターを含む組換え宿主細胞も記載される。本明細書に記載の融合タンパク質は、ハイブリドーマ以外の細胞株で発現され得る。本発明によるポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【0495】
特に好ましい細胞株は、高レベルの発現、目的のタンパク質の構成的発現、および宿主タンパク質からの最小限の汚染に基づいて選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、多くの不死化細胞株、例えば、限定されないが、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などが挙げられる。好適なさらなる真核細胞としては、酵母および他の真菌が挙げられる。有用な原核生物宿主としては、例えば、大腸菌ＳＧ－９３６，大腸菌ＨＢ １０１，大腸菌Ｗ３１１０，大腸菌Ｘ１７７６，大腸菌Ｘ２２８２，大腸菌ＤＨＩ，大腸菌Ｔ７ Ｓｈｕｆｆｌｅおよび大腸菌ＭＲＣ１などの大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。
【0496】
これらの本組換え宿主細胞は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養し、宿主細胞または宿主細胞を取り囲む培地からポリペプチドを精製することによって融合タンパク質を産生するために使用することができる。組換え宿主細胞における分泌のための発現ポリペプチドの標的化は、目的の抗体コード遺伝子の５’末端にシグナルまたは分泌リーダーペプチドコード配列（Ｓｈｏｋｒｉ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（６）：６５４－６６４，Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１０：１－６（１９９７）；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：４６８３－４６９０（１９８６）を参照のこと。その全てが参照により本明細書に組み込まれる）を挿入することによって促進することができる。これらの分泌リーダーペプチドエレメントは、原核生物配列または真核生物配列のいずれかに由来し得る。したがって、適切には、宿主細胞サイトゾルからのポリペプチドの移動および培地への分泌を指示するためにポリペプチドのＮ末端に結合したアミノ酸である分泌リーダーペプチドが使用される。
【0497】
本明細書に記載の融合タンパク質は、追加のアミノ酸残基に融合することができる。そのようなアミノ酸残基は、例えば、単離を容易にするためのペプチドタグであり得る。抗体を特定の器官または組織にホーミングするための他のアミノ酸残基も企図される。
【0498】
例えば、フェリチン鎖（例えば、フェリチン軽鎖）に融合したＦａｂ重鎖を含む融合タンパク質をコードするものと、Ｆａｂ軽鎖をコードする別のものとのプラスミドの同時トランスフェクションによって、Ｆａｂナノケージを生成できることが理解されよう。典型的には、構築物は、ＬＣ－リンカー－ＨＣ－リンカー－ナノケージ単量体／サブユニットとして配置されるが、ＨＣ－リンカー－ＬＣ－リンカー－ナノケージ単量体／サブユニットとして配置することもできる。本明細書に記載されるように、ｓｃＦｖまたは任意の他の抗原結合部分を使用することができる。あるいは、１つのプラスミドのトランスフェクション（例えば、Ｆａｂ軽鎖、Ｆａｂ重鎖およびフェリチン鎖（例えば、フェリチン軽鎖）を含む融合タンパク質をコードするプラスミドを使用する）のみを必要とする一本鎖Ｆａｂ－フェリチンナノケージを使用することができる。これは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖との間の異なる長さのリンカー、例えば６０または７０アミノ酸を用いて行うことができる。一本鎖Ｆａｂを使用する場合、重鎖と軽鎖が対になっていることを確実にすることができる。タグ（例えば、Ｆｌａｇ、ＨＡ、ｍｙｃ、Ｈｉｓ６ｘ、Ｓｔｒｅｐなど）はまた、上記のように精製を容易にするために、構築物のＮ末端またはリンカー内に付加することができる。さらに、タグシステムを使用して、異なるＦａｂナノ粒子プラスミドを同時トランスフェクトする場合、連続／付加アフィニティークロマトグラフィ工程を使用して、同じナノ粒子上に多くの異なるＦａｂが存在することを確実にすることができる。これは、ナノ粒子に多重特異性を提供する。プロテアーゼ部位（例えば、ＴＥＶ、３Ｃなど）は、必要に応じて、発現および／または精製後にリンカーおよびタグを切断するために挿入することができる。
【0499】
本明細書に記載の融合タンパク質を投与するために、任意の適切な方法または経路を使用することができる。投与経路としては、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与が挙げられる。
【0500】
本明細書に記載の融合タンパク質は、予防または処置の目的で哺乳動物において使用される場合、薬学的に許容され得る担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが理解される。適切な薬学的に許容され得る担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせの１またはそれを超えるものが挙げられる。薬学的に許容され得る担体は、結合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含み得る。注射の組成物は、当技術分野で周知のように、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速な、持続的なまたは遅延的な放出を提供するように製剤化され得る。
【0501】
本明細書に記載の融合ペプチドおよびＭｕｌｔａｂｏｄｙは、ヒトへの投与に特に有用であるが、他の哺乳動物にも投与することができる。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、実験動物、家庭用ペットおよび家畜を含むことが意図されているが、これらに限定されない。
【0502】
上記の開示は、本発明を一般的に説明している。以下の具体例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、例示のみを目的として提供されており、特に明記しない限り、限定することを意図しない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【0503】
以下の実施例は、ベクターおよびプラスミドの構築、そのようなベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、または宿主細胞へのプラスミドの導入に使用されるものなどの従来の方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを含む多数の刊行物に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0504】
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製および利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の典型的な態様を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0505】
実施例１
要約
ＨＩＶの急速な進化は、予防および処置のための治療薬の開発に対する主要な障壁であり続けている。ここで、本発明者らは、標的の３つの独立したエピトープ、この場合はＨＩＶエンベロープとの複数の同時の相互作用を確立することができる単一分子の形成を可能にする、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ２（ＭＢ．ｖ２）およびＭｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ３（ＭＢ．ｖ３）と呼ばれる第２世代抗体プラットフォームの設計を記載する。この技術の多価性および多重特異性の特性は、最も強力な抗ＨＩＶ ｂｎＡｂのものを上回る並外れた効力および様々な多様なＨＩＶ－１株の完全な汎中和につながる。したがって、これらの新しいＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３プラットフォームは、ＨＩＶ－１に対する予防および治療の可能性を有する。
序論
要約
ＨＩＶの急速な進化は、予防および処置のための治療薬の開発に対する主要な障壁であり続けている。ここで、本発明者らは、標的の３つの独立したエピトープ、この場合はＨＩＶエンベロープとの複数の同時の相互作用を確立することができる単一分子の形成を可能にする、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ２（ＭＢ．ｖ２）およびＭｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ３（ＭＢ．ｖ３）と呼ばれる第２世代抗体プラットフォームの設計を記載する。この技術の多価性および多重特異性の特性は、最も強力な抗ＨＩＶ ｂｎＡｂのものを上回る並外れた効力および様々な多様なＨＩＶ－１株の完全な汎中和につながる。したがって、これらの新しいＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３プラットフォームは、ＨＩＶ－１に対する予防および治療の可能性を有する。
序論
【0506】
数十年の研究にもかかわらず、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ－１）に対する有効なワクチンまたは治療法は存在しない。しかしながら、ごく一部のＨＩＶ－１感染個体が循環ＨＩＶ－１分離株にわたって並外れた中和効力を有する抗体を生じているという事実は、ＨＩＶ－１の抗体媒介制御の可能性を強調している。第１世代の広域中和抗体（ｂＮＡｂ）２Ｆ５（１）、４Ｅ１０（２、３）、２Ｇ１２（４）およびｂ１２（５、６）が発見されたので、ｂＮＡｂのカタログは、Ｅｎｖ特異的単一Ｂ細胞選別（７～９）、抗体クローニングおよびハイスループット中和アッセイ（１０～１３）、およびより最近ではプロテオーム逆畳み込み（１４）の新しい技術の実施のために劇的に増加した。三量体頂点のＶ１／Ｖ２ループ、Ｖ３ループグリカン、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）、ｇｐ１２０－ｇ４１界面、融合ペプチドおよび膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）を含む、三量体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）上の６つの保存部位を標的とするいくつかの数十のＨＩＶ ｂＮＡｂが現在記載されている（７、９、１０、１２～１９）。
【0507】
ＨＩＶ－１との戦いにおける治療分子としてのｂＮＡｂの関心は、マカク（２０～２３、２３）およびヒト化マウス（２４～２７）における攻撃試験で観察された強力な抗ウイルス活性、ならびにｂＮＡｂの注入後に感染したヒトで達成されるウイルス血症の減少から生じる（２８～３２）。さらに、抗体は、経口抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）と比較して重要な利点を有する：抗体は、より長い循環半減期を有し、ウイルスに対する宿主免疫を増強する免疫複合体を形成することができる。これらの観察は、ｂＮＡｂの受動的投与を介してＨＩＶ－１に対する防御を付与するための抗体ベースの治療の臨床評価、ならびに感染個体においてＨＩＶ－１を制御および／または排除する努力をもたらした。
【0508】
ｂＮＡｂの臨床使用に対する主な制限の１つは、中和耐性ウイルス集団の急速な進化である（２９～３１、３３、３４）。ＨＩＶ－１などのＲＮＡウイルスは、ウイルスがｍＡｂ認識を逃れるための耐性突然変異を発生させることを可能にする並外れた遺伝的多様性を示す（３５）。しかしながら、特定のｂＮＡｂへの結合を抑止する突然変異は、ウイルス適合性において有意なペナルティを伴い得る（３６～３８）。ＨＩＶ－１処置レジメンにおける異なる薬物の組み合わせと同様に、この観察は、ＨＩＶ－１に対する成功した抗体ベースの治療がｂＮＡｂ特異性の組み合わせを含むべきであることを示唆している。結果として、Ｅｎｖに対する二重特異性（３９～４１）または三重特異性（４２～４４）を有する抗体様分子の様々なフォーマットの開発が最近検討されている。さらなる考慮事項は、インビボ有効性に必要な抗体の量である。実際、構造ガイド設計または生物情報学的アプローチを使用してｂＮＡｂを操作してその効力を改善するための広範な取り組みが行われてきたが（例えば、ＶＲＣ０１（４５）、１０Ｅ８（４６、４７）およびＮＩＨ４５－４６（４８））、これまでのところ、ある程度の成功を収めている。Ｅｎｖ中の複数のエピトープを標的とする二重特異性および三重特異性抗体の場合、効力は一般にそれらの親ｍＡｂの効力によって制限される。その結果、中和幅の有意な改善が達成されたが、抗ウイルス効力はこれまでに比較的ほとんど達成されていない４０，４３，（４３），４５。
【0509】
本発明者らは最近、抗体断片のオリゴマー化を推進し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする抗体を非常に強力な中和剤に変換するためのＭＵＬＴＩ特異的マルチアフィニティー抗ＢＯＤＹ（Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ）プラットフォームを記載した（４９）。このプラットフォームを利用して、本発明者らはここで、ＨＩＶ－１に対する３つの最良のｂＮＡｂの複数コピーとＩｇＧ１由来の結晶化可能断片（Ｆｃ）とを単一分子内で組み合わせた。粒子内のＦａｂの数を最大化するようにＭｕｌｔａｂｏｄｙをさらに操作することにより、発明者らは、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ技術によって達成される効力、幅および均一性を有意に改善した。得られた抗ＨＩＶ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ３は、現在最もよく知られているｂＮＡｂで作製されたカクテルと比較して、それぞれ、質量およびモル濃度が３２倍および４６０倍低い、０．０００９μｇ／ｍＬ（０．４ｐＭ）の１１８シュードウイルス（ＰｓＶ）のマルチクレードパネルに対する完全な汎ウイルス中和幅および平均ＩＣ５０中央値を示した。本明細書に記載のＭｕｌｔａｂｏｄｙ．ｖ３設計は、ＨＩＶ－１に対する次世代生物製剤の開発のための堅牢で強力なプラットフォームを表す。
材料および方法
材料および方法
【0510】
Ｆａｂのみのアポフェリチンに基づく多量体の発現および精製。ヒトアポフェリチンの軽鎖およびｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチン融合物をコードする遺伝子を合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってｐＨＬｓｅｃ発現ベクターにクローニングした。２００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地に０．８ １０６細胞／ｍＬの密度で播種し、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｐｒｏシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中、３７°Ｃ、８％ ＣＯ２および湿度７０％で１２５ｒｐｍの振動と共にインキュベートした。播種後２４時間以内に、トランスフェクション試薬ＦｅｃｔｏＰＲＯ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を用いて室温（ＲＴ）で１０分間プレインキュベーションした５０μｇの濾過ＤＮＡを１：１の比で用いて細胞を一過性にトランスフェクトした。ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチンおよびヒトアポフェリチンをコードするプラスミドを１：４、１：１、４：１および１：０の比で混合して、それぞれ２０％、５０％、８０％および１００％のｓｃＦａｂ結合価ナノ粒子を得た。６～７日後、細胞懸濁液を５０００×ｇで１５分間の遠心分離によって回収し、上清を０．２２μｍのＳｔｅｒｉｔｏｐフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過した。ナノ粒子をＦａｂに対するアフィニティークロマトグラフィによって精製し、洗浄後に溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【0511】
３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２、および３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３ Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの設計、発現、および精製。ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ突然変異誘発キット（東洋紡、大阪、日本）を使用して、ヒトアポフェリチンの軽鎖の残基１～９５（フェリチンのＣ末端部分を残す、「Ｃ－フェリチン」）または残基９５～１７５（フェリチンのＮ末端部分を残す、「Ｎ－フェリチン」）を欠失させることによって、半フェリチンに連結されたｓｃＦａｂ、ｓｃＦｃおよびＦｃ断片をコードする遺伝子を生成した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１の一過性トランスフェクションを、６７μｇのプラスミドＰＧＤＭ１４００ ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチン：ｓｃＦｃＮ－フェリチン：Ｎ４９Ｐ７ ｓｃＦａｂ－Ｃ－フェリチン：１０Ｅ８ｖ４ ｓｃＦａｂ－Ｃ－フェリチンを４：２：１：１の比で混合することによって得た。３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２の場合、５：１：１の比のプラスミドＰＧＤＭ１４００ ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチン：Ｎ４９Ｐ７ ｓｃＦａｂ－Ｎ－フェリチン：１０Ｅ８ｖ４ ｓｃＦａｂ－Ｃ－フェリチン－ｓｃＦｃを５９μｇ使用し、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３の場合、３：１：１の比のプラスミドＰＧＤＭ１４００ ｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチン：Ｎ４９Ｐ７ ｓｃＦａｂ－Ｎ－フェリチン：１０Ｅ８ｖ４ ｓｃＦａｂ－Ｃ－フェリチン－Ｆｃを６３μｇ使用した。本実施例で使用した様々な構築物の特性を以下の表１に要約する。
【0512】
表１：Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ構築物の特性。
【表1】
【0513】
ＤＮＡ混合物を濾過し、ＦｅｃｔｏＰＲＯと１：１の比でＲＴでインキュベートした後、細胞培養物に添加した。最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３Ｍ ＭｇＣｌ２および１０％グリセロール溶出緩衝液を含むＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するアフィニティークロマトグラフィによって、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙを精製した。ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた緩衝液交換後、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた第２のアフィニティークロマトグラフィにより、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙをさらに精製した。タンパク質を含有する画分を濃縮し、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル濾過によってさらに精製した。
【0514】
陰性染色電子顕微鏡法。およそ０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度の３μＬのＭｕｌｔａｂｏｄｙを炭素被覆銅グリッドに３０秒間添加し、３μＬの２％ギ酸ウラニルで染色した。Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１濾紙を使用して、染色した過剰物を直ちにグリッドから除去し、さらに３μＬの２％ギ酸ウラニルを２０秒間添加した。グリッドは、２００ｋＶで動作し、Ｏｒｉｕｓ電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．）を備えた電界放出ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０電子顕微鏡を使用して画像化した。
【0515】
バイオレイヤー干渉法。結合動態測定を、ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０１％ ＢＳＡおよび０．００２％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ ＢＬＩシステム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して行った。各Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ成分に対する固有のＨｉｓタグ化リガンドを選択し、Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサにロードして、０．８ｎｍのシグナル応答に達した。会合速度を、ロードしたバイオセンサを、それぞれ、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの連続希釈液（５０－２５－１２．５－６．２５－３．１－１．５ ｎＭ）を含むウェルおよび緩衝液含有ウェルに移すことによって測定した。解離速度は、バイオセンサを緩衝液含有ウェルに浸漬することによって測定した。これらの２つの工程の持続時間はそれぞれ１８０秒であった。ＰＧＤＭ１４００への選択的結合を達成するために、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体のＣＤ４ｂｓ中のＤ３６８Ｒ突然変異を導入し、その結果、この抗原へのＮ４９Ｐ７の結合を破壊した。同様に、ｇｐ１２０サブユニット９３ＴＨ０５７、ＭＰＥＲペプチドおよびＦｃ受容体（β２－ミクログロブリンと複合体を形成したＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびｈＦｃＲｎ）を、それぞれＮ４９Ｐ７、１０Ｅ８およびＦｃ結合のためのリガンドとして産生した。生理学的ｐＨ（７．５）および酸性ｐＨ（５．６）でｈＦｃＲｎβ２－ミクログロブリン複合体へのそれらの結合を測定することによって、エンドソーム再利用を受けるＭｕｌｔａｂｏｄｙの能力を試験した。
【0516】
多角度光散乱に則したサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）。ＭｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳおよびＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ屈折計（Ｗｙａｔｔ）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣに則して使用した。５０μｇの２４マーＰＧＤＭ１４００ ｓｃＦａｂ多量体およびＭｕｌｔａｂｏｄｙ ３２－Ｎを、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。データ収集および分析は、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ）を使用して行った。
【0517】
融解および凝集温度の測定。Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ、親ＩｇＧならびに１２マーのホモオリゴマーＦａｂおよびＦｃの融解温度（Ｔｍ）および凝集温度（Ｔａｇｇ）を、ＵＮｉｔシステム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて決定した。Ｔｍは、重心平均蛍光を測定することによって得られ、一方、Ｔａｇｇは、ベースラインに対して２６６ｎｍの波長での静的光散乱の５０％の増加が観察される温度として決定された。試料を１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１°Ｃずつ２５から９５°Ｃまで温度勾配に供した。３つの独立した測定の平均および標準誤差を、ＵＮｉｔ解析ソフトウェアを使用して計算した。
【0518】
加速熱安定性アッセイ。異なるＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョンを、４週間連続して温度および濃度の極端な条件に供した。１０ｍｇ／ｍｌの各試料を４０°Ｃでインキュベートし、適切に折り畳まれたタンパク質のパーセンテージを毎週計算し、１０μＬの試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードしたときのサイズ排除クロマトグラフィによって得られた各ピークの面積を分析した。この分析に機能アッセイ、この場合は中和アッセイを追加して、実験の開始時（０週目）および終了時（４週目）の活性タンパク質の量を決定した。
【0519】
ウイルス産生およびＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイ。以前に記載されたように（５０）、ＨＩＶ－１サブタイプＢ骨格ＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅプラスミド（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ））と全長Ｅｎｖクローンをコードするプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることにより、２５ ＨＩＶ－１シュードタイプウイルスのパネルを作成した。ＨＩＶ単離株Ｘ２０８８、ＺＭ１０６．９、ＮＬ４．３および３８１７はＡＩＤＳ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのための協力（ＣＡＶＤ）によって、ＳＦ１６２はＪ．Ｌ．Ｎｉｅｖａ．（Ｂｉｏｆｉｓｉｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から、ｐＣＮＥ８、１６３２、ＴＨＲＯ、２７８、ＺＭ１９７、ＪＲＣＳＦ、ｔ２５７、Ｄｕ４２２、ＢＧ５０５、ｐ１０５４．ＴＣ４．１４９９、６５３５、ＺＭ２１４Ｍ．ＰＬ１５、ＡＣ１０．２９、ｐ１６８４５、Ｐ６２４４＿１３．Ｂ５．４５７６、ｐＭ２４６Ｆ＿Ｃ１Ｇ、ＴＲＪＯ４５５１、ＱＨ０６９２およびｐＣＡＡＮ５３４２はＮＩＨ ＡＲＲＲＰから提供された。中和は、標準的なＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイを使用して、１サイクルの中和アッセイで決定した。簡潔には、抗体および抗体ベースの粒子を、ＴＺＭ－ｂｌ細胞との４４～７２時間のインキュベーションの前に、１０～１５％組織培養感染量のシュードウイルスと共に３７°Ｃで１時間インキュベートした。ウイルス中和を、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ ｐｌｕｓ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を細胞に添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ａｓｓａｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して相対光単位（ＲＬＵ）で発光を測定することによって監視した。標準プロトコルに従って、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｅａｍａｎによって、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈで、１１８ ＰｓＶの拡張マルチクレードパネルを実施した。１０μｇ／ｍＬのカットオフ限界を使用して抗体幅を決定した。
【0520】
薬物動態。雌ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＣＧ）を用いて、インビボ試験を行った。抗体ＰＧＤＭ１４００、Ｎ４９Ｐ７および１０Ｅ８ｖ４のｓｃＦａｂと、半減期延長突然変異（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むＩｇＧ１ ＦｃのｓｃＦｃ断片とで構成される３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３を研究に使用した。２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の５ｍｇ／ｋｇのＭｕｌｔａｂｏｄｙまたは対照試料（ＭｕｌｔａｂｏｄｙのＦａｂ特異性と一致するＩｇＧ混合物）の単回注射を皮下注射した。血液試料を複数の時点で収集し、血清試料をＥＬＩＳＡによって循環抗体のレベルについて評価した。簡潔には、９６ウェルＰｉｅｒｃｅニッケル被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４＿Ｄ３６８Ｒ三量体、ｇｐ１２０サブユニット９３ＴＨ０５７およびＭＰＥＲペプチドによって認識されるＨｉｓ６ｘタグ化抗原のそれぞれ０．５μｇ／ｍｌで５０μＬで被覆して、ＩｇＧおよびＭｕｌｔａｂｏｄｙに対する試薬特異的標準曲線を使用して循環試料濃度を決定した。ＨＲＰ－プロテインＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を二次分子として使用し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ａｓｓａｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて化学発光シグナルを定量した。
【0521】
結果
ＨＩＶ－１ ｂＮＡｂの効力は結合活性で増強することができる
アポフェリチンは、２４個の同一のサブユニットの自己オリゴマー化によって形成される流体力学的半径およそ６ｎｍの球状ナノケージである（図１ａ）。中和効力に対する多価の影響を調べるために、本発明者らは、ヒトアポフェリチンの軽鎖の自己集合特性を使用して、異なるＨＩＶ－１ Ｅｎｖエピトープを標的とする最も強力で広範なＨＩＶ－１ ｂＮＡｂに由来する抗原結合（Ｆａｂ）の断片を多量体化した。アポフェリチンサブユニットを一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に遺伝的に融合した。正しいＦａｂヘテロ二量体化を確実にするために、軽鎖と重鎖との間の柔軟性リンカーを使用してｓｃＦａｂを生成した。アポフェリチン自己集合はｓｃＦａｂの多量体化を促進し、ナノケージ周辺に抗体断片を表示した（図１ｂ）。異なる比率の非遺伝子改変ヒトアポフェリチンと共にｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチンをコードするプラスミドの同時トランスフェクションによって、異なる密度の多量体化Ｆａｂを達成した（図１ｃおよび図３）。ｓｃＦａｂ－アポフェリチン融合物がＨＩＶ－１感染を阻止する能力を、小型ＨＩＶ－１シュードウイルス（ＰｓＶ）パネルを使用して対応するＩｇＧと比較した（図１ｄ）。驚くべきことに、これまでに記載された最も強力な抗ＨＩＶ ｂＮＡｂの１つであるＰＧＤＭ１４００は、アポフェリチンの軽鎖を介して多量体化された場合、その従来のＩｇＧフォーマットと比較して１０～４０倍高い中和効力を示した。ｂＮＡｂ １０－１０７４はまた、中和効力におけるかなりの改善（４～４０倍）を示し、これに対して、ｂＮＡｂ １０Ｅ８、Ｎ４９Ｐ７およびＶＲＣ０１は、影響を何ら示さず、または、より穏やかな増強を示した。
ＨＩＶ－１ ｂＮＡｂの効力は結合活性で増強することができる
アポフェリチンは、２４個の同一のサブユニットの自己オリゴマー化によって形成される流体力学的半径およそ６ｎｍの球状ナノケージである（図１ａ）。中和効力に対する多価の影響を調べるために、本発明者らは、ヒトアポフェリチンの軽鎖の自己集合特性を使用して、異なるＨＩＶ－１ Ｅｎｖエピトープを標的とする最も強力で広範なＨＩＶ－１ ｂＮＡｂに由来する抗原結合（Ｆａｂ）の断片を多量体化した。アポフェリチンサブユニットを一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に遺伝的に融合した。正しいＦａｂヘテロ二量体化を確実にするために、軽鎖と重鎖との間の柔軟性リンカーを使用してｓｃＦａｂを生成した。アポフェリチン自己集合はｓｃＦａｂの多量体化を促進し、ナノケージ周辺に抗体断片を表示した（図１ｂ）。異なる比率の非遺伝子改変ヒトアポフェリチンと共にｓｃＦａｂ－ヒトアポフェリチンをコードするプラスミドの同時トランスフェクションによって、異なる密度の多量体化Ｆａｂを達成した（図１ｃおよび図３）。ｓｃＦａｂ－アポフェリチン融合物がＨＩＶ－１感染を阻止する能力を、小型ＨＩＶ－１シュードウイルス（ＰｓＶ）パネルを使用して対応するＩｇＧと比較した（図１ｄ）。驚くべきことに、これまでに記載された最も強力な抗ＨＩＶ ｂＮＡｂの１つであるＰＧＤＭ１４００は、アポフェリチンの軽鎖を介して多量体化された場合、その従来のＩｇＧフォーマットと比較して１０～４０倍高い中和効力を示した。ｂＮＡｂ １０－１０７４はまた、中和効力におけるかなりの改善（４～４０倍）を示し、これに対して、ｂＮＡｂ １０Ｅ８、Ｎ４９Ｐ７およびＶＲＣ０１は、影響を何ら示さず、または、より穏やかな増強を示した。
【0522】
ｓｃＦａｂ－アポフェリチン融合物の特徴付け。
ｓｃＦａｂ－アポフェリチンおよび非コンジュゲートアポフェリチンに対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用してデンシトメトリによって定量した（図２ａ）。各レーン（黄色のボックス）のバンドの強度プロットを図２ｂに示す。粒子上に表示されたｓｃＦａｂのおおよその数を以下のように計算した：ｓｃＦａｂバンドの強度／総強度、および同時トランスフェクションに使用したＤＮＡ比から推測される理論数と比較した（図２ｃ）。
ｓｃＦａｂ－アポフェリチンおよび非コンジュゲートアポフェリチンに対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用してデンシトメトリによって定量した（図２ａ）。各レーン（黄色のボックス）のバンドの強度プロットを図２ｂに示す。粒子上に表示されたｓｃＦａｂのおおよその数を以下のように計算した：ｓｃＦａｂバンドの強度／総強度、および同時トランスフェクションに使用したＤＮＡ比から推測される理論数と比較した（図２ｃ）。
【0523】
ＭｕｌｔａｂｏｄｙはＨＩＶ－１を強力かつ広範に中和する
これらの結果を考慮して、本発明者らは、アポフェリチン分割設計に基づく本発明者らの前述のＭｕｌｔａｂｏｄｙプラットフォームを使用して、ＰＧＤＭ１４００のカバレッジを増加させようとした（４９）。この戦略は、４つのヘリックスアポフェリチンサブユニットを２つの半分体（Ｎ－フェリチンおよびＣ－フェリチン）に分離し、それらのＮ末端を異なる特異性のｓｃＦａｂに融合することからなる（図３ａ）。このアプローチは、ナノケージの表面上により多数のＦａｂを含めることを可能にし、より高い結合活性を有する最終分子をもたらす。さらに、この設計は、３つの異なる抗体特異性ならびに断片結晶化可能（Ｆｃ）の効率的な組み合わせを可能にして、プロテインＡ親和性を活用する精製の容易さなどのＩｇＧ様特性を分子に付与する。具体的には、本発明者らは、ｓｃＦａｂ ＰＧＤＭ１４００を、近汎（ｎｅａｒ－ｐａｎ）中和抗体１０Ｅ８ｖ４（溶解度が改善された改変１０Ｅ８（５１））およびＮ４９Ｐ７のｓｃＦａｂならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ断片と組み合わせた（図３ａ）。予想通り、３２－Ｎと呼ばれる得られたＭｕｌｔａｂｏｄｙは、対応するＩｇＧと同様の生物物理学的および機能的特性を有する高度に装飾された均質な粒子（図３ｂおよびｃ）を形成した（図３ｄ）。三重特異的Ｍｕｌｔａｂｏｄｙによるエピトープ結合を、エピトープ特異的分子：ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ（ＰＧＤＭ１４００）、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０（Ｎ４９Ｐ７）、ＭＰＥＲペプチド（１０Ｅ８ｖ４）およびヒトＦｃ受容体（ＦｃＲｎおよびＦｃγＲ）（Ｆｃ）を使用する結合動態実験において評価した（図３ｅ）。高い見かけの結合親和性を有し、検出可能な解離を有さない３つのエピトープ特異的抗原への結合は、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙにおけるすべての特異性の存在を確認する。個々のＩｇＧ分子は、すべての抗原に結合する能力を有していなかった（図４）。
これらの結果を考慮して、本発明者らは、アポフェリチン分割設計に基づく本発明者らの前述のＭｕｌｔａｂｏｄｙプラットフォームを使用して、ＰＧＤＭ１４００のカバレッジを増加させようとした（４９）。この戦略は、４つのヘリックスアポフェリチンサブユニットを２つの半分体（Ｎ－フェリチンおよびＣ－フェリチン）に分離し、それらのＮ末端を異なる特異性のｓｃＦａｂに融合することからなる（図３ａ）。このアプローチは、ナノケージの表面上により多数のＦａｂを含めることを可能にし、より高い結合活性を有する最終分子をもたらす。さらに、この設計は、３つの異なる抗体特異性ならびに断片結晶化可能（Ｆｃ）の効率的な組み合わせを可能にして、プロテインＡ親和性を活用する精製の容易さなどのＩｇＧ様特性を分子に付与する。具体的には、本発明者らは、ｓｃＦａｂ ＰＧＤＭ１４００を、近汎（ｎｅａｒ－ｐａｎ）中和抗体１０Ｅ８ｖ４（溶解度が改善された改変１０Ｅ８（５１））およびＮ４９Ｐ７のｓｃＦａｂならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ断片と組み合わせた（図３ａ）。予想通り、３２－Ｎと呼ばれる得られたＭｕｌｔａｂｏｄｙは、対応するＩｇＧと同様の生物物理学的および機能的特性を有する高度に装飾された均質な粒子（図３ｂおよびｃ）を形成した（図３ｄ）。三重特異的Ｍｕｌｔａｂｏｄｙによるエピトープ結合を、エピトープ特異的分子：ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ Ｄ３６８Ｒ（ＰＧＤＭ１４００）、９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０（Ｎ４９Ｐ７）、ＭＰＥＲペプチド（１０Ｅ８ｖ４）およびヒトＦｃ受容体（ＦｃＲｎおよびＦｃγＲ）（Ｆｃ）を使用する結合動態実験において評価した（図３ｅ）。高い見かけの結合親和性を有し、検出可能な解離を有さない３つのエピトープ特異的抗原への結合は、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙにおけるすべての特異性の存在を確認する。個々のＩｇＧ分子は、すべての抗原に結合する能力を有していなかった（図４）。
【0524】
標準化されたインビトロＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイにおいて、１４－ＰｓＶのパネルに対して、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ ３２－Ｎの中和効力および幅を評価した（５０）。１４－ＰｓＶパネルは、評価される各ｂＮＡｂについて最小で１つの耐性ＰｓＶを有する低感度ＰｓＶを含むように設計された（カットオフＩＣ５０を１０μｇ／ｍＬに設定）。ＭｕｌｔａｂｏｄｙのＩＣ５０値および幅を、個々のＩｇＧおよびＭｕｌｔａｂｏｄｙ中に存在するＩｇＧの同じ相対量を含有するＩｇＧカクテルと比較した。３２－Ｎ ＭＢのＩＣ５０中央値は０．００７１μｇ／ｍＬ（３ｐＭ）であった（図５）。しかしながら、親ＩｇＧの混合物に関して達成された１２倍の改善された効力にもかかわらず、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙは、このパネルに対して１００％の中和に達することができなかった（１０μｇ／ｍＬのカットオフ限界で９３％の幅）。さらに、個々のＩＣ５０値の検査により、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙは、ＰＧＤＭ１４００中和に耐性のＰｓＶに対して低い効力を示すことが明らかになった（図５ｂ）。このデータは、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの中和特性が、粒子内の３つの抗体特異性のうちの１つ、この場合はＰＧＤＭ１４００に大きく依存することを示唆している。
【0525】
アポフェリチン足場の操作
Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの中和特性をさらに改善するために、その設計にいくつかの改変を導入し、第２世代バージョンを作成した（ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３）。元のＭｕｌｔａｂｏｄｙ（以下、ＭＢ．ｖ１と呼ぶ）では、ｓｃＦｃはＮ－フェリチン半分体のＮ末端に位置し、各機能性Ｆｃホモ二量体あたり１つのＦａｂのみ（Ｆａｂ２またはＦａｂ３）がＭｕｌｔａｂｏｄｙに組み込まれる（図６の最上段）。
Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの中和特性をさらに改善するために、その設計にいくつかの改変を導入し、第２世代バージョンを作成した（ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３）。元のＭｕｌｔａｂｏｄｙ（以下、ＭＢ．ｖ１と呼ぶ）では、ｓｃＦｃはＮ－フェリチン半分体のＮ末端に位置し、各機能性Ｆｃホモ二量体あたり１つのＦａｂのみ（Ｆａｂ２またはＦａｂ３）がＭｕｌｔａｂｏｄｙに組み込まれる（図６の最上段）。
【0526】
これと比較して、最適化されたＭＢ．ｖ２では、Ｆｃ断片はＣ－フェリチン半分体のＣ末端に位置する。分割されたアポフェリチン相補性によって駆動され、２つの異なるＦａｂ（Ｆａｂ２およびＦａｂ３）と１つのＦｃドメインとが、１：１：１の比で、互いに対して規定された位置で自己会合する（図６；底列；「ＭＢ．ｖ２フォーマット」を参照のこと）。
【0527】
ＭＢ．ｖ３の場合、この最適化されたバージョンは、Ｆｃホモ二量体あたりより多くのＦａｂを含む。この設計では、二量体Ｆｃあたり２つのＦａｂ２および２つのＦａｂ３がＭｕｌｔａｂｏｄｙに組み込まれる。これを達成するために、単量体Ｆｃ断片（すなわち、１つのＦｃ鎖）およびｓｃＦａｂをそれぞれＣ－フェリチン半分体のＣ末端およびＮ末端に配置する（図７ａ）。結果として、機能性Ｆｃホモ二量体の二量体化は、分割フェリチン相補性およびフェリチンサブユニットオリゴマー化と共にＭＢ．ｖ３粒子の組み立てを駆動する（図７ｂ）。
【0528】
重要なことに、これらの設計は、ＰＧＤＭ１４００とは異なるより多数のＦａｂの組み立てを確実にし（すなわち、Ｆａｂ２およびＦａｂ３）、したがって、完全に組み立てられたＭｕｌｔａｂｏｄｙにおける３つのＦａｂのそれぞれについて、よりバランスのとれた結合活性を支持する。
【0529】
得られたＭｕｌｔａｂｏｄｙ粒子（ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３）は、異なるＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョン間で形態および生物物理学的特性に有意差はなく、非常に安定した良好に形成された球状粒子に集合した（図８ａ～図８ｃ）。抗原（図８ｄ）およびＦｃ受容体結合（図８ｅ）により、ＭＢ．ｖ３の場合のＦｃ断片の適切な二量体化を含む、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙの適切な折り畳みが確認された。ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３フォーマットでは、フェリチンのＣ末端にＦｃを配置すると、反転したより離れて位置するＦｃドメインを有する粒子が形成され、その結果、Ｆｃ結合活性が低下する。したがって、酸性ｐＨでのＦｃγＲＩおよびＦｃＲｎへのこれらのＭｕｌｔａｂｏｄｙの結合は、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１と比較して減少し（図３ｅおよび図８ｅ）、酸性ｐＨでのＦｃＲｎへの結合は、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３ ＬＳ変異体（図８ｆ）について示されるように、半減期延長突然変異ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）の存在下でさえ、測定可能なＫｏｆｆをもたらした。
【0530】
第２世代のＭｕｌｔａｂｏｄｙ粒子によって達成される非常に優れた効力および汎中和幅
次に、本発明者らは、本発明者らの以前のパネルにＰＧＤＭ１４００に高耐性の１１ ＨＩＶ－１株を添加することによって生成されたＰｓＶパネルに対する最適化されたＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョン（ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３）の中和効力を評価した。得られた２５－ＰｓＶパネルは、ＰＧＤＭ１４００中和に耐性の５６％のＰｓＶ変異体（カットオフＩＣ５０を１０μｇ／ｍＬに設定）を含む（図９ａ）。予想通り、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１の幅および効力は、ＰＧＤＭ１４００耐性ＰｓＶ（図９ａ）の存在下で大きく影響された。しかしながら、操作されたように、抗体Ｎ４９Ｐ７および１０Ｅ８ｖ４の中和プロファイルは、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２および３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３においてより優勢であり、この最適化されたＭｕｌｔａｂｏｄｙが、このタイプの分子について以前に観察された増強された中和効力を維持しながら汎中和を達成することを可能にした（図９ａ）。１１８ ＰｓＶの拡張マルチクレードパネルに対して試験した場合、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３は、対応するＩｇＧカクテル（１００％ウイルス・カバレッジ、カットオフＩＣ５０を１０μｇ／ｍＬに設定）の汎中和幅と一致したが、顕著な中和効力を示した（図９ｂ）。具体的には、ＩｇＧカクテルおよび３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１は、それぞれ０．００１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で９％および８％のＰｓＶを中和することしかできなかったが、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３の場合、依然としてわずか０．００１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で５０％のＰｓＶが中和された（図９ｂ）。注目すべきことに、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３は、わずか０．０００９μｇ／ｍＬ（０．４ｐＭ）のＩＣ５０中央値を達成し、したがってＩｇＧカクテルと比較して、質量およびモル濃度でそれぞれ３２倍および４９０倍強力に汎中和を達成した（図９ｂ）。
次に、本発明者らは、本発明者らの以前のパネルにＰＧＤＭ１４００に高耐性の１１ ＨＩＶ－１株を添加することによって生成されたＰｓＶパネルに対する最適化されたＭｕｌｔａｂｏｄｙバージョン（ＭＢ．ｖ２およびＭＢ．ｖ３）の中和効力を評価した。得られた２５－ＰｓＶパネルは、ＰＧＤＭ１４００中和に耐性の５６％のＰｓＶ変異体（カットオフＩＣ５０を１０μｇ／ｍＬに設定）を含む（図９ａ）。予想通り、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１の幅および効力は、ＰＧＤＭ１４００耐性ＰｓＶ（図９ａ）の存在下で大きく影響された。しかしながら、操作されたように、抗体Ｎ４９Ｐ７および１０Ｅ８ｖ４の中和プロファイルは、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ２および３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３においてより優勢であり、この最適化されたＭｕｌｔａｂｏｄｙが、このタイプの分子について以前に観察された増強された中和効力を維持しながら汎中和を達成することを可能にした（図９ａ）。１１８ ＰｓＶの拡張マルチクレードパネルに対して試験した場合、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３は、対応するＩｇＧカクテル（１００％ウイルス・カバレッジ、カットオフＩＣ５０を１０μｇ／ｍＬに設定）の汎中和幅と一致したが、顕著な中和効力を示した（図９ｂ）。具体的には、ＩｇＧカクテルおよび３２－Ｎ ＭＢ．ｖ１は、それぞれ０．００１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で９％および８％のＰｓＶを中和することしかできなかったが、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３の場合、依然としてわずか０．００１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で５０％のＰｓＶが中和された（図９ｂ）。注目すべきことに、３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３は、わずか０．０００９μｇ／ｍＬ（０．４ｐＭ）のＩＣ５０中央値を達成し、したがってＩｇＧカクテルと比較して、質量およびモル濃度でそれぞれ３２倍および４９０倍強力に汎中和を達成した（図９ｂ）。
【0531】
Ｍｕｌｔａｂｏｄｙのインビボ薬物動態は、対応するＩｇＧと類似している
次に、本発明者らは、ＬＳ突然変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含む３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３のインビボでのバイオアベイラビリティを調べた。５ｍｇ／ｋｇの単回用量をＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＣＧ）に皮下投与し、血清中のＭｕｌｔａｂｏｄｙのレベルを２日ごとに１５日間連続して検出した。Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ投与は、体重の減少も毒性の目に見える徴候もなく、忍容性が高かった。さらに、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙは、親ＩｇＧカクテルと同様の崩壊率で数日間のインビボ曝露を示した（図１０）。このデータは、バイオアベイラビリティ特性を有する分子を生成し、その開発可能性についての初期インビボ検証の有望なセットを提供するためのＭｕｌｔａｂｏｄｙプラットフォームの実現可能性を実証している。
次に、本発明者らは、ＬＳ突然変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含む３２－Ｎ ＭＢ．ｖ３のインビボでのバイオアベイラビリティを調べた。５ｍｇ／ｋｇの単回用量をＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＣＧ）に皮下投与し、血清中のＭｕｌｔａｂｏｄｙのレベルを２日ごとに１５日間連続して検出した。Ｍｕｌｔａｂｏｄｙ投与は、体重の減少も毒性の目に見える徴候もなく、忍容性が高かった。さらに、Ｍｕｌｔａｂｏｄｙは、親ＩｇＧカクテルと同様の崩壊率で数日間のインビボ曝露を示した（図１０）。このデータは、バイオアベイラビリティ特性を有する分子を生成し、その開発可能性についての初期インビボ検証の有望なセットを提供するためのＭｕｌｔａｂｏｄｙプラットフォームの実現可能性を実証している。
【0532】
参考文献
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】